ES2863733T3 - Generación novedosa de TCR específicos de antígeno - Google Patents

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ES2863733T3 ES16825764T ES16825764T ES2863733T3 ES 2863733 T3 ES2863733 T3 ES 2863733T3 ES 16825764 T ES16825764 T ES 16825764T ES 16825764 T ES16825764 T ES 16825764T ES 2863733 T3 ES2863733 T3 ES 2863733T3
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Carina Wehner
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Abstract

Método para generar linfocitos T específicos de antígeno humano, que comprende las siguientes etapas: A) expresión de al menos una proteína de fusión, que comprende - al menos un antígeno o un fragmento del mismo, - una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y - un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno, en células presentadoras de antígeno; y B) exposición de una población de células que comprende linfocitos T a las células presentadoras de antígeno de la etapa A) in vitro para activar linfocitos T específicos de antígeno específicos para el antígeno expresado por la célula presentadora de antígeno; en el que la proteína de fusión comprende al menos dos antígenos o fragmentos de los mismos diferentes, en el que el fragmento tiene una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Generación novedosa de TCR específicos de antígeno
Campo de la invención
La presente invención contempla métodos para la generación de linfocitos T específicos de antígeno humano. Los métodos emplean señales de direccionamiento de CMH de clase II fusionadas con un antígeno o fragmento del mismo para obtener la presentación de CMH de las clases I y II de proteínas codificadas por ARN. Por consiguiente, la presente invención se refiere a vectores de expresión que comprenden señales de direccionamiento de CMH de clase II y al menos un antígeno o fragmento del mismo y a su uso para la generación in vitro de linfocitos T específicos de antígeno. También se describen clones de células T y receptores de células T (TCR) específicos para antígenos tumorales o antígeno virales.
Antecedentes de la invención
La transferencia adoptiva de células T usa respuestas citotóxicas basadas en células T para controlar las infecciones víricas crónicas y los tumores. Las células T que tienen una reactividad natural o modificada por ingeniería genética frente al cáncer de un paciente se generan in vitro y luego se transfieren de nuevo al paciente. La transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) autólogos se han usado para tratar con éxito a pacientes con tumores avanzados. Las principales limitaciones de la terapia con TIL para su amplia aplicación en la clínica son la inmunogenicidad a veces deficiente de los tumores así como los mecanismos de la selección negativa de células T en el timo que eliminan de manera eficiente células T con especificidad de antígeno propia. Por tanto, en muchos casos, ni las células T con alta avidez para antígenos específicos de tumor ni las células T con la especificidad deseada pueden aislarse a partir de la sangre o de resecciones tumorales del paciente. Por esto, la transferencia de linfocitos de sangre periférica (PBL) genéticamente redirigidos ofrece una posibilidad de superar estas limitaciones.
Además, en infecciones cancerosas y crónicas, los linfocitos T pierden su función y se agotan.
Con la ayuda de la terapia génica con receptores de células T (TCR), pueden generarse rápidamente millones de células T reactivas a tumores a partir de la sangre del paciente. La terapia génica con TCR allana el camino hacia un método flexible para transferir especificidad tumoral a subpoblaciones de células T expandibles y funcionalmente prometedoras. Comprende la transferencia de genes de TCR aislados de clones de células T específicos de antígeno definidos a linfocitos T receptores de donantes compatibles con antígeno leucocitario humano (HLA) para equiparlos con las especificidades de antígeno requeridas.
La terapia adoptiva de células T con linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ es una inmunoterapia prometedora para enfermedades cancerosas o víricas. Para aumentar las respuestas clínicas, la transferencia complementaria de células T cooperadoras CD4+ ofrece una posibilidad de potenciar las respuestas de CTL CD8+. Se sabe que los linfocitos T CD4+ proporcionan una ayuda fundamental a los CTL CD8+, así como que tienen un efecto crítico sobre la generación de células T de memoria CD8+ de larga duración. Por tanto, es importante el aislamiento y la caracterización rápidos y eficientes de los linfocitos T CD4+ y CD8+ específicos de antígeno tumoral.
Muchos tumores expresan moléculas de CMH de clase II y, por tanto, los TCR de células T CD4+ son particularmente útiles para atacar directamente a estos tumores.
Para aumentar la capacidad de uso de la terapia celular adoptiva (ACT) para tratar a pacientes con tumores de crecimiento más rápido o enfermedades víricas crónicas, un objetivo es transferir células T efectoras enriquecidas, específicas de péptido (tanto células T CD4 cooperadoras como linfocitos T citotóxicos) que se han seleccionado por sus especificidades de ligando para atacar eficazmente a virus o células tumorales a la vez que se evita el grave ataque a tejidos normales. Estas células se expandirán rápidamente hasta grandes números ex vivo y luego se usarán para la ACT. Alternativamente, los receptores de células T (TCR) de tales células T específicas de ligando pueden clonarse y expresarse como transgenes de TCR en linfocitos activados, o bien usando linfocitos de sangre periférica receptores o bien clones de células T activados con especificidades definidas que crecen bien y no tienen la capacidad de atacar a tejidos normales del huésped.
Ellinger et al. (resumen de CIMT Cancer Immunotherapy, mayo de 2013) se refieren generalmente al direccionamiento de la expresión de CMH de clase II para la generación de CD4 específica de antígeno tumoral. Kavanagh et al. (Blood, 107(5): 1963-1969) describen la expansión de células T CD4+ y CD8+ específicas de VIH mediante células dendríticas transfectadas con ARNm que codifica para Nef dirigido al citoplasma o al lisosoma.
Wehner et al. (J. Immunotherapy of Cancer vol. 2, supl. 3), pág. 65, describen la generación de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno tumoral mediante la presentación simultánea de epítopos de CMH I y II in vitro e in vivo.
El documento US 2005/1124141 A1 describe composiciones y métodos para tratar un tumor o una enfermedad neoplásica en un huésped, que emplean conjugados que comprenden polipéptidos o ácidos nucleicos superantigénicos con otras estructuras que se unen preferentemente a una célula tumoral y que son capaces de inducir la apoptosis.
El documento EP 2 700 708 A2 se refiere a métodos de potenciación in vitro e in vivo de la capacidad estimuladora de células T de DC humanas y al uso de los mismos en la vacunación contra el cáncer.
Van Nuffel et al. (Molecular Therapy 20(5): 1063-1074 describen que células dendríticas cargadas con ARNm que codifica para antígenos tumorales de longitud completa sensibilizan células T CD4+ y CD8+ en pacientes con melanoma.
Como consecuencia, son necesarios TCR específicos de antígeno y métodos eficientes para el aislamiento de estos TCR.
Objetivos y sumario de la invención
Por tanto, un objetivo de la invención es proporcionar métodos eficientes para el aislamiento de células T con TCR específicos de antígeno. Sería deseable proporcionar un método para la generación de TCR CD4 y/o TCR CD8. Además, un objetivo de la invención es proporcionar TCR o partes funcionales de los mismos, tales como regiones CDR3. Sería ventajoso lograr que los TCR mostraran una afinidad alta y/u óptima contra antígenos tumorales.
Por tanto, un primer aspecto de la invención contempla un método para generar linfocitos T específicos de antígeno humano, que comprende las siguientes etapas:
A) expresión de al menos una proteína de fusión, que comprende
- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,
- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y
- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno,
en células presentadoras de antígeno; y
B) exposición de una población de células que comprende linfocitos T a las células presentadoras de antígeno de la etapa A) in vitro para activar linfocitos T específicos de antígeno específicos para el antígeno expresado por la célula presentadora de antígeno,
en el que la proteína de fusión comprende al menos dos antígenos o fragmentos de los mismos diferentes, en el que los fragmentos tienen una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.
La fusión de la secuencia de direccionamiento, en particular en combinación con la secuencia señal de translocación en el RE, con el antígeno o fragmento del mismo deseado permite la carga eficiente de complejos CMH de clase II, también para proteínas celulares que se presentan habitualmente por medio del complejo c Mh de clase I. Además, la carga de los complejos CMH de clase I se logra mediante el método descrito anteriormente. Por tanto, el método permite la generación de TCR CD4+ así como TCR CD8+.
La expresión de la al menos una proteína de fusión en la etapa A) puede ser una expresión transitoria o expresión estable, preferiblemente una expresión transitoria, por ejemplo, mediante la introducción de ivt-ARN que codifica para la al menos una proteína de fusión. La expresión de ivt-ARN tiene la ventaja de que puede producirse rápidamente ivt-ARN de calidad controlada y que no porta ningún contaminante proteico inmunogénico.
En algunas realizaciones, el método puede comprender además la etapa de enriquecimiento de linfocitos T activados. Esta etapa de enriquecimiento comprende normalmente las siguientes etapas:
(a) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con al menos una molécula de unión que se une específicamente a al menos una proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados;
(b) aislar linfocitos T a los que se une al menos una molécula de unión.
En realizaciones preferidas, la al menos una proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados se selecciona del grupo que comprende Ox40, CD137, CD40L, PD-1, receptor de IL-2, interferón-y, IL-2, GM-CSF y TNF -a. Además, en la etapa (a), las células pueden ponerse en contacto además con una molécula de unión que se une específicamente a CD4 y/o con una molécula de unión que se une específicamente a CD8. En realizaciones específicas, la selección de células T CD4 activadas comprende las siguientes etapas:
(a1) poner en contacto la población de células de la etapa B) con un anticuerpo contra CD40 para bloquear la interacción entre CD40-CD40L de las células presentadoras de antígeno y los linfocitos T específicos de antígeno y acumular CD40L en la superficie de los linfocitos T;
(a2) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con un anticuerpo anti-CD40L;
(b) aislar los linfocitos T marcados con un anticuerpo anti-CD40L y un anticuerpo anti-CD4.
Otra realización se refiere al método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además la etapa C2) identificación de linfocitos T específicos de antígeno, que comprende las siguientes etapas:
a) incubación de clones celulares expandidos de la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con
(i) células presentadoras de antígeno tal como se define en la etapa A), y
(ii) células presentadoras de antígeno de control;
b) comparación del perfil de activación de la incubación con (i) y (ii) para cada clon celular;
c) identificación de clones celulares específicos de antígeno basándose en la comparación de b); en el que la activación mediante (i), pero no mediante (ii), indica que el clon celular es específico de antígeno; la activación mediante (i) y mediante (ii) indica que el clon celular es inespecífico de antígeno; la activación ni mediante (i) ni mediante (ii) indica que el clon celular no está activado.
En la etapa B), las células presentadoras de antígeno se añaden a la población de células que comprende linfocitos T al menos una vez, o al menos dos veces o al menos tres veces, o tres veces. El intervalo de tiempo entre adiciones repetidas de células presentadoras de antígeno puede ser de 7 a 21 días, de 12 a 16 días o de 13 a 15 días, o 14 días.
La secuencia señal de translocación en el RE se deriva de una proteína asociada endosómica/lisosómica. La proteína asociada endosómica/lisosómica puede seleccionarse del grupo que consiste en LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, CD68 o CD1b, preferiblemente la proteína asociada endosómica/lisosómica es LAMP1. Preferiblemente, la secuencia señal de translocación en el RE es humana. En realizaciones específicas, la secuencia señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma. En realizaciones más específicas, la secuencia señal de translocación en el RE consiste en la siguiente secuencia SEQ ID NO: 33.
El dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMP, preferiblemente DC-LAMP. Preferiblemente, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humano.
Normalmente, las células presentadoras de antígeno se seleccionan de células dendríticas, células B activadas, monocitos, macrófagos, líneas celulares linfoblastoideas transformadas con VEB, preferiblemente células dendríticas, más preferiblemente células dendríticas derivadas de monocitos.
Habitualmente, la población de células que comprende linfocitos T es una población de linfocitos de sangre periférica. La población de células que comprende linfocitos T puede ser una población de linfocitos de sangre periférica sin separar. La población de células puede enriquecerse en linfocitos T, preferiblemente linfocitos T CD8+ y/o CD4+ mediante medios conocidos por el experto en la técnica.
Otro aspecto de la solicitud es un linfocito T que puede obtenerse mediante los métodos descritos en el presente documento.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un vector de expresión, que comprende:
- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana, y
- un dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica,
- una secuencia que codifica para al menos dos antígenos diferentes, o fragmentos de los mismos, que se inserta entre la secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica;
en el que cada uno de los fragmentos tiene una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.
El vector puede comprender un promotor para la transcripción de ARNm in vitro. La secuencia señal de translocación en el RE se deriva de una proteína asociada endosómica/lisosómica, por ejemplo, LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, CD68, CD1b, lo más preferiblemente LAMP1. Preferiblemente, la secuencia señal de translocación en el RE es humana. En realizaciones específicas, la secuencia señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma. En realizaciones más específicas, la secuencia señal de translocación en el RE consiste en la siguiente secuencia SEQ ID NO: 34.
La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMP, preferiblemente DC-LAMP. La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es normalmente una parte de un dominio transmembrana y citoplásmico. Por tanto, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMp , preferiblemente DC-LAMP. Preferiblemente, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica y/o lisosómica es humano. Normalmente, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende el motivo Y-XX (X representa cualquier aminoácido natural) seguido por un aminoácido hidrófobo (SEQ ID NO: 38). Preferiblemente, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es YQRI (SEQ ID NO: 39). El dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 54 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende además sitios de restricción entre la secuencia señal de translocación en el RE y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica. En otras realizaciones, el vector comprende además al menos un antígeno, o un fragmento del mismo, que se inserta entre la secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica.
En algunas realizaciones, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de longitud completa de un antígeno. Alternativamente, el vector comprende un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de un antígeno.
Normalmente, el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral. El antígeno tumoral puede seleccionarse del grupo que consiste en antígeno tumoral viral, antígeno específico de tumor, antígeno asociado al tumor y un antígeno que porta mutaciones específicas del paciente y que se expresa en células tumorales del paciente. El antígeno tumoral es un antígeno asociado al tumor, preferiblemente el antígeno asociado al tumor es un antígeno de cáncer de testículo (antígeno C/T). El antígeno C/T puede seleccionarse del grupo que comprende miembros de la familia MAGE, por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, pero sin limitarse a los mismos, antígenos tumorales que comprenden mutaciones puntuales, NY-ESO1, antígeno de tumor de testículo 1B, GAGE-1, SSX-4, XAGE-1, BAGE, GAGE, SCP-1, SSX-2, SSX-4, CTZ9, CT10, SAGE y CAGE. Preferiblemente, el antígeno C/T puede seleccionarse del grupo que consiste en GAGE-1, SSX-4 y XAGE-1.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del vector de expresión tal como se describe en el presente documento para la generación in vitro de linfocitos T específicos de antígeno.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a T-linfocitos para su uso en un método de prevención o tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un mamífero los linfocitos T generados mediante los métodos tal como se describen en el presente documento.
Otro aspecto se refiere a un método para generar un TCR específico de antígeno, que comprende las etapas de los métodos descritos anteriormente y que comprende además la etapa de aislar un TCR a partir del linfocito específico de antígeno activado generado mediante los métodos tal como se describen en el presente documento.
Otro aspecto se refiere a TCR específicos para GAGE-1, SSX-4 y XAGE-1, respectivamente.
Leyendas de las figuras
Figura 1: presentación dirigida de CMH de clase II para la activación y el aislamiento de células T CD4+ específicas de antígeno. (a) Representación esquemática de los diversos constructos de EBNA-3C usados para validar la funcionalidad y necesidad de la señal CrossTAg. Se representan el ORF (ATG a PARADA), los diferentes componentes de la señal CrossTAg (LAMP1 y DC-LAMP), el epítopo de EBNA-3C restringido por HLA-DR11 (3H10) y el tramo poliA120. (b) La señal CrossTAg facilita la presentación cruzada eficiente de CMH de clase II. La secreción de IFN-y del clon de células T CD4+ específico de EBNA-3C, 3H10, a las 16 h de cultivo conjunto con CPA transfectadas con ivt-ARN (DC derivadas de monocitos preparada en tres días (3d-mDC) o líneas celulares linfoblastoideas (mLCL) transformadas con mini-virus de Epstein-Barr (VEB)). Los valores se presentan como la media DE de triplicados. (c) La expresión del marcador de activación CD40L es adecuada para el aislamiento de células T CD4+ específicas de antígeno. Se mezclaron células 3H10 marcadas con violeta CellTrace™ con PBL autólogos en concentraciones decrecientes y se cultivaron conjuntamente con mDC transfectadas con ivt-ARN y EBNA-3C-CrossTAg (CPA) del donante autólogo. Se evaluó la expresión de CD40L inducida por la activación en células T CD4+ a las 6 h de cultivo conjunto.
Figura 2: inducción y enriquecimiento de células T CD4+ específicas de antígeno C/T a partir de PBL sin separar. (a) Expresión en superficie de CD40L y CD137 inducida por la activación en células T CD4+ a partir de PBL sensibilizados con antígeno C/T. Se midió la expresión del marcador de activación 6 h después de la reestimulación específica del cultivo in vitro de PBL el día 13 y 27, respectivamente. (b) Comparación directa de la capacidad proliferativa de líneas de células T CD4+ CD40Lpositivo y CD40Lnegativo en masa. El día 28, se separaron las células T CD4+ del cultivo de PBL sensibilizados según su expresión de CD40L. Se evaluaron los números de células totales después de la separación mediante FACS (día 0) y al final del intervalo de 14 días tras la reestimulación específica (día 14). Se representa la proliferación en x veces en relación con el día 0. (c) Comparación de la secreción de citocinas inducidas tras la reestimulación específica de antígeno. Se midió la secreción de IFN-y de líneas de células T CD4+ CD40Lpositivo y CD40Lnegativo en masa a las 16 h de cultivo conjunto con mDC transfectadas con ivt-ARN y CrossTAg-antígeno. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Figura 3: selección de clones de células T CD4+ específicos de antígeno C/T. (a) Datos de selección a modo de ejemplo de clones derivados del cultivo de PBL sensibilizados con antígeno C/T. Se evaluó la secreción de IFN-y a las 16 h de cultivo conjunto con mDC transfectadas con ivt-ARN y CrossTAg-antígeno (mezcla de 4 antígenos). Las barras representan valores individuales. (b) Validación de la reactividad al antígeno C/T de clones de células T seleccionados. Se evaluó la secreción de citocinas (IFN-y y GM-CSF) después del cultivo conjunto con mLCL transfectadas con ivt-ARN (mezcla de 4 antígenos). Los datos se representan como valores individuales. (c) Confirmación de la expresión del correceptor de CD4. Se muestran clones a modo de ejemplo.
Figura 4: evaluación de la especificidad de antígeno. Datos a modo de ejemplo para clones de células T CD4+ que se encontró que mostraban especificidad de antígeno C/T individual. Se midió la secreción de IFN-y después del cultivo conjunto con mLCL transfectadas con ivt-ARN. Los valores se presentan como la media DE de duplicados o como puntos de datos individuales cuando se indica (*).
Figura 5: necesidad de señal CrossTAg y reconocimiento de proteínas. (a) Necesidad de la señal CrossTAg para la activación de clones de células T CD4+ basada en ivt-ARN. (b) Reconocimiento de proteínas recombinantes exógenas fisiológicamente procesadas. La capacidad estimuladora de CPA transfectadas con ivt-ARN y antígeno-CrossTAg (mLCL) en comparación directa con mLCL transfectadas con antígeno-ivt-ARN que carece de la señal CrossTAg (a) o mLCL cargadas con proteína recombinante (b) tal como se mide mediante la secreción de IFN-y de clones de células T CD4+ aislados que portan TCR únicos. CPA con simulación y células T solas sirvieron como controles. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Figura 6: definición de secuencias de núcleo de epítopos de CMH de clase II. Se validaron fragmentos de péptido encontrados mediante la identificación directa de epítopos de CMH de clase II (DEPI) (caja con línea discontinua) usando constructos cortos de CrossTAg-ivt-ARN. Se cultivaron conjuntamente células T 3H10 transgénicas GAGE-1-TCR-2 (a) o células T XAGE-1-TCR-1 y -TCR-2 (b), o bien con constructo corto de CrossTAg-ivt-ARN solapante (indicado como barras negras) o bien con CPA transfectadas con ivt-ARN y antígeno-CrossTAg (mLCL) de longitud completa. Se evaluó la secreción de IFN-y a las 16 h de cultivo conjunto y se representan las secuencias de núcleo de epítopos reconocidos (caja con línea continua).
Cultivos conjuntos con CPA transfectadas con simulación o células T solas sirvieron como controles. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Figura 7: expresión transgénica de receptores de células T CD4+ específicos de antígeno C/T. Se transfectaron células T 3H10 con ivt-ARN que codifica para las cadenas TCR-a y -p correspondientes de los clones de células T CD4+ GAGE-1-TCR-1, Xa Ge-1-TCR-1 o -TCR-2. Se cultivaron conjuntamente TCR-células 3H10 transgénicas con CPA cargadas con antígeno (mLCL) y se detectó la secreción de IFN-y a las 16 h de cultivo conjunto. Cultivos conjuntos con CPA transfectadas con simulación o células T solas sirvieron como controles. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Figura 8: la señal CrossTAg facilita la carga de CMH de clase II a través de las rutas de presentación internas [endógenas] de células. Se transfectaron DC positivas para HLA-DRB1*11:01 y negativas para HLA-DRB1*11:01 con ivt-ARN y EBNA-3C-CrossTAg. Se incubaron conjuntamente DC transfectadas y sin transfectar en todas las posibles combinaciones y se cultivaron conjuntamente 12 h después con clones de células T CD4+ específicos de EBNA-3C, 3H10. Se midió la secreción de IFN-y de células 3H10 a las 16 h de cultivo conjunto con DC. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Figura 9: caracterización de 3d-mDCs para la sensibilización de PBL. (a) Expresión de marcadores de superficie tal como se detecta mediante tinción con anticuerpos monoclonales (curvas abiertas) y controles de isotipo coincidentes (curvas grises rellenas). (b) Niveles de ARNm de antígenos de mDC transfectadas con ivt-ARN. Se representa el aumento en x veces de los números de copia de ARNm de antígenos en relación con mDC sin transfectar. Se evaluaron los números de copia de ARNm de antígeno mediante qRT-PCR usando específico de antígeno cebadores.
Figura 10: estrategia de regulación de la clasificación basada en CD40L de células T CD4+ específicas de antígeno C/T. Se seleccionaron linfocitos según su dispersión hacia delante (FSC; FSC-A: área de dispersión hacia delante; FSC-H: altura de dispersión hacia delante) y hacia los lados (SSC-A). Se usó DAPI para la exclusión de células muertas. Posteriormente, se clasificaron las células positivas para CD4-de la fracción individual de células (FSC-A/FSC-H) según su expresión de CD40L y se establecieron como líneas de células T CD4+ CD40Lpositivo y CD40Lnegatlve en masa. Además, se clasificaron las células T CD4+ CD40Lpositivo en placas de 96 pocillos basándose en células individuales.
Figura 11: secuencias de señal de translocación en el RE alternativas
(a) Representación esquemática de constructos de vectores usados para la producción de ivt-ARN. Se clonó el antígeno diana del clon de células T CD4+ caracterizado, 3H10 (específico de EBNA-3C, restringido por HLA-DRB1*11:01) en el sistema de vectores pGEM que comprende combinaciones de señales de translocación en el RE de LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, Cd68 o CDlb humanas (5' con respecto a la secuencia del antígeno) y la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica de DC-LAMP humana (3' con respecto a la secuencia del antígeno), la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica de DC-LAMP sola o sin translocación y la secuencia de direccionamiento. Además, se representan las secuencias de aminoácidos de las secuencias de péptido señal empleadas (señales de translocación en el RE) que indican sitios de escisión de peptidasa predichos. (b) Se cultivaron conjuntamente células del clon de células T CD4+, 3H10, con CPA transfectadas con especies de ivt-ARN individuales (mLCL). Cultivos conjuntos con CPA transfectadas con simulación sirvieron como controles. Se detectó la secreción de IFN-y mediante ELISA de IFN-y convencional 16 h después del inicio del cultivo conjunto. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Figura 12: presentación simultánea de CMH de clase II y CMH de clase I usando la señal de direccionamiento CrossTAg. (a) Representación esquemática de los constructos de vectores usados para la producción de ivt-ARN. Se clonaron los antígenos diana de un clon de células T CD4+ caracterizado, 3H10 (específico de EBNA-3C, restringido por HLA-DRB1*11:01) y un clon de células T CD8+ caracterizado, IVSB (específico de tirosinasa, restringido por HLA-A2*01:01) en el sistema de vectores pGEM con o sin las secuencias de direccionamiento CrossTAg. Se clonó EBNA-3C como un fragmento de 1 kb (aa 421-780) de la secuencia génica completa y contiene el epítopo para el clon 3H10. Para la generación del constructo IVSB-3H10(epítopo)-CrossTAg, en lugar de una secuencia de antígeno completa, se clonaron secuencialmente mini-genes que comprenden los epítopos del clon 3H10 (EBNA-3C, aa 628-641, VVRMFMRERQLPQS; SEQ ID NO: 36) y del clon IVSB (tirosinasa, aa 369-377, YMdGt MSQV; SEQ ID NO: 37) en la estructura principal del vector pGEM-CrossTAg. Para facilitar la estabilización de especies de ivt-ARN transcritas en el citoplasma, todos los constructos de vectores pGEM portan una cola poli-A que comprende 120 pares de bases de adenina (poli-A120) en 3' del marco de lectura abierto (ORF). (b) Se transfectaron fracciones separadas de DC maduras (mDC) de un donante doble positivo para HLA-A2*01:01 y HLA-DRB1*11:01 con especies de ivt-ARN individuales enumeradas en (a). Siete horas después de la transfección, se cultivaron conjuntamente 1 *105 células de las distintas poblaciones de mDC con 1*105 células del clon de células T CD4+, 3H10, o del células del clon de células T CD8+, IVSB (razón 1:1). Cultivos conjuntos con mDC transfectadas con simulación (H2O) o células T solas sirvieron como controles. Se detectó la secreción de IFN-y mediante ELISA de IFN-y convencional 16 h después del inicio del cultivo conjunto. Los valores se presentan como la media DE de triplicados.
Descripción detallada de la invención
Antes de describir la invención con detalle con respecto a algunas de sus realizaciones preferidas, se proporcionan las siguientes definiciones generales.
La presente invención, tal como se describe de manera ilustrativa a continuación, puede practicarse de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no dados a conocer específicamente en el presente documento.
La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a determinadas figuras, sin embargo, la invención no se limita a las misma, sino únicamente por las reivindicaciones.
Cuando se usa el término “que comprende” en la presente descripción y las reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente invención, se considera que el término “que consiste en” es una realización preferida del término “que se compone de”. Si a continuación en el presente documento se define un grupo para comprender al menos un determinado número de realizaciones, también debe entenderse que esto da a conocer un grupo que consiste preferiblemente sólo en estas realizaciones.
Cuando se usa un artículo indefinido o definido cuando se hace referencia a un sustantivo en singular, por ejemplo, “un”, “uno/una” o “el/la”, este incluye el plural de ese sustantivo a menos que se indique específicamente algo más.
Tal como se usa en el presente documento, el término “expresión” se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un gen. Por consiguiente, el término proteína o polipéptido “expresado” comprende, sin limitación, proteínas o polipéptidos intracelulares, transmembrana y secretados.
Los términos técnicos se usan por su sentido común. Si se transmite un significado específico a determinados términos, se proporcionarán las definiciones de los términos a continuación en el contexto en el que se usan los términos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para generar linfocitos T específicos de antígeno humano, que comprende las siguientes etapas:
A) expresión de al menos una proteína de fusión, que comprende
- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,
- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y
- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno,
en células presentadoras de antígeno; y
B) exposición de una población de células que comprende linfocitos T a las células presentadoras de antígeno de la etapa A) in vitro para activar linfocitos T específicos de antígeno específicos para el antígeno expresado por la célula presentadora de antígeno,
en el que la proteína de fusión comprende al menos dos antígenos o fragmentos de los mismos diferentes, en el que el fragmento tiene una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.
El fragmento puede ser una secuencia del antígeno que es específica para este antígeno, es decir, que no se produce en otra proteína u otro péptido de un mamífero, especialmente de un ser humano. El fragmento puede ser más corto que la secuencia del antígeno, tal como al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 30%, al menos el 50%, al menos el 70%, al menos el 90% más corto que el antígeno. El fragmento puede tener una longitud de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o más aminoácidos.
La proteína de fusión puede comprender al menos tres, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 antígenos o fragmentos de los mismos. La proteína de fusión puede comprender menos de 100, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10 antígenos o fragmentos de los mismos.
El término “activar linfocitos T específicos de antígeno” se refiere a la activación de células T indiferenciadas (inducción de novo) y a la activación de linfocitos T de memoria (reactivación).
Normalmente, las células presentadoras de antígeno y la población de células que comprende linfocitos T son del mismo donante. Además, se contemplan configuraciones alorrestringidas tal como se describen en el documento EP1910521, en las que un ácido nucleico que codifica para una molécula de CMH se expresa en las células presentadoras de antígeno del donante que no porta el gen de CMH correspondiente a dicha molécula de CMH que se transfiere.
La expresión de la al menos una proteína de fusión en la etapa A) puede ser expresión transitoria o expresión estable. En realizaciones preferidas, la expresión es expresión transitoria, por ejemplo, mediante la introducción de ivt-ARN que codifica para la al menos una proteína de fusión. La expresión de ivt-ARN tiene la ventaja de que puede producirse rápidamente ivt-ARN de calidad controlada y que no porta ningún contaminante proteico inmunogénico.
Mediante la exposición de los linfocitos T, también denominada sensibilización, surgen varias poblaciones de linfocitos activados diferentes in vitro. Normalmente, la exposición en la etapa B) es cultivar conjuntamente las células presentadoras de antígeno con una población de células que comprende linfocitos T. Se activan las células T que reconocen los complejos de CMH:epítopo de las células presentadoras de antígeno, una fracción de las cuales son específicas para los complejos de moléculas de CMH que presentan un epítopo del antígeno expresado en la etapa A). Estas células T buscadas deben separarse de las células T que reconocen moléculas de CMH independientemente del péptido o moléculas de CMH que presentan epítopos que no se derivan del antígeno expresado en la etapa A).
Para la exposición de las células presentadoras de antígeno en la etapa B), las células presentadoras de antígeno se añaden a una población que comprende linfocitos T al menos una vez. La primera adición de las células presentadoras de antígeno también se denomina sensibilización. Las células presentadoras de antígeno pueden añadirse varias veces, por ejemplo, al menos dos veces o al menos tres veces. La segunda adición y cada adición posterior de células presentadoras de antígeno también se denomina reestimulación, ya que en estas etapas los linfocitos T ya activados reciben un estímulo adicional para su posterior proliferación. En determinadas realizaciones, las células presentadoras de antígeno se añaden una vez. En otras realizaciones, las células presentadoras de antígeno se añaden dos veces. En otra realización, las células presentadoras de antígeno se añaden tres veces. Realizaciones adicionales se refieren a métodos en los que las células presentadoras de antígeno se añaden tres o más veces. Las nuevas CPA pueden añadirse a los cultivos de células T cada de 7 a 21 días, o cada de 12 a 16 días, o cada de 13 a 15 días, o cada 14 días. El experto entiende que las células se proporcionan con medio de cultivo nuevo de forma regular que contiene citocinas complementarias.
La exposición de la población de células que comprende linfocitos T a las células presentadoras de antígeno in vitro significa que la exposición no se produce en un organismo, tal como un mamífero, sino que la exposición tiene lugar en un cultivos de células in vitro. El experto conoce las condiciones del cultivo de células y comprenden la adición de citocinas, por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-7 y/o IL-15, entre otras, dependiendo del tipo de célula T que se genere (Schendel, DJ. et al. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. En: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) págs. 670-690.; Regn, S., et al. 2001. The generation of monospecific y bispecific anti­ viral cytotoxic T lymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64; Su, Z. et al. Antigen presenting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specific cytotoxic T lymphocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-62.).
En algunas realizaciones, el método puede comprender además la etapa de enriquecimiento de linfocitos T activados y/o específicos de antígeno. Esta etapa de enriquecimiento comprende normalmente las siguientes etapas:
(a) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con al menos una molécula de unión que se une específicamente a una proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados o con al menos una molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado;
(b) aislar linfocitos T a los que se une la al menos una molécula de unión o la al menos una molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado.
En realizaciones particulares, el método puede comprender la etapa de enriquecimiento de linfocitos T activados. Esta etapa de enriquecimiento comprende normalmente las siguientes etapas:
(a) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con al menos una molécula de unión que se une específicamente a una proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados;
(b) aislar linfocitos T a los que se une la al menos una molécula de unión.
En otras realizaciones específicas, el método puede comprender la etapa de enriquecimiento de linfocitos T que son específicos para el antígeno deseado. Esta etapa de enriquecimiento comprende normalmente las siguientes etapas:
(a) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con una molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado;
(b) aislar linfocitos T a los que se une la al menos una molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado.
El enriquecimiento de linfocitos T activados basado en proteínas marcadoras expresadas específicamente por linfocitos T activados permite el enriquecimiento de un amplio espectro de células T activadas independientemente de la restricción y del epítopo específico. La molécula de unión que se une específicamente a la proteína marcadora puede ser, sin limitación, un anticuerpo, un derivado de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o un conjugado de los mencionados anteriormente con un molécula adicional. La proteína de unión puede marcarse, por ejemplo, para facilitar los procedimientos de clasificación, tales como FACS o MACS.
La proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados puede ser cualquier proteína de superficie o proteína secretada que se exprese por linfocitos T activados y que no se exprese sustancialmente por linfocitos T inactivados. En realizaciones preferidas, la al menos una proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados se selecciona del grupo que comprende Ox40, CD137, CD40L, PD-1, receptor de IL-2, interferón-y, IL-2, GM-CSF y TNF-a. El uso de estos marcadores permite el enriquecimiento de linfocitos T activados independientemente del epítopo específico presentado por el TCR. Este método facilita el aislamiento de células T que reconocen todos los epítopos inmunogénicos potenciales de un antígeno seleccionado y, por ejemplo, es particularmente útil para antígenos escasamente definidos.
En la etapa de enriquecimiento, las células seleccionadas pueden agruparse en subpoblaciones o aislarse directamente como clones celulares individuales. En realizaciones específicas, las células se agrupan en una primera etapa de enriquecimiento y se separan en una etapa de enriquecimiento adicional en clones individuales. La separación de clones individuales puede producirse, sin limitación, mediante dilución limitada o clasificación automatizada de células individuales empleando FACS o MACS. Preferiblemente, la clasificación de células individuales se lleva a cabo mediante FACS.
En realizaciones específicas, la selección de células T CD4 activadas comprende las siguientes etapas:
(a1) poner en contacto las células presentadoras de antígeno que expresan al menos una proteína de fusión de la etapa A) con un anticuerpo contra CD40 para bloquear la interacción entre CD40-CD40L de las células presentadoras de antígeno y los linfocitos T específicos de antígeno y acumular CD40L en la superficie de los linfocitos T;
(a2) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con un anticuerpo anti-CD40L;
(b) aislar los linfocitos T marcados con un anticuerpo anti-CD40L y un anticuerpo anti-CD4.
Con el fin de emplear la selección de células T activadas por proteínas secretadas, por ejemplo, citocinas como interferón-y, moléculas biespecíficas que reconocen marcadores de superficie de células T y citocinas dirigidas capturan la citocina secretada en la superficie celular, que luego puede detectarse mediante un anticuerpo de detección marcado tal como se describe en Becker et al. (Becker, C et al. 2001. Adoptive tumor therapy with T lymphocytes enriched through an IFN capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162.).
Además, en la etapa (a), las células pueden ponerse en contacto además con una molécula de unión que se une específicamente a CD4 y/o con una molécula de unión que se une específicamente a CD8.
Alternativamente, el enriquecimiento puede llevarse a cabo empleando moléculas de CMH que presentan un epítopo del antígeno deseado (es decir, el antígeno expresado de manera exógena por la célula presentadora de antígeno de la etapa A). Las moléculas de CMH pueden marcarse, por ejemplo, para facilitar los procedimientos de clasificación, tales como FACS o MACS. La interacción de baja afinidad entre el TCR y los complejos de péptido:CMH correspondientes puede superarse mediante el ensamblaje de multímeros solubles de péptido:moléculas de CMH tal como se describe en Wilde et al. (Dendritic cells pulsed with RNA encoding allogeneic MHC and antigen induce T cells with superior antitumor activity and higher TCR functional avidity. Blood 114(10): 2131-2139; 2009), tales como, sin limitación, dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, heptámeros u octámeros. Además, pueden emplearse los denominados estreptámeros de péptido:CMH que se unen de manera reversible a los TCR y, por tanto, permiten el aislamiento de TCR de alta afinidad sin el riesgo de inducir cambios funcionales ni la muerte celular inducida por activación (Knabel et al. (2002) Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Nature Medicine, 8(6), 631-7.). Las propiedades reversibles de la interacción entre célula T:estreptámero se basan en un forma modificada de estreptavidina (Strep-Tactin) que actúa como la cadena principal del estreptámero.
Este enfoque permite el enriquecimiento dirigido de TCR específicos de epítopo con una restricción específica. El aislamiento de los linfocitos T activados y/o específicos de antígeno puede llevarse a cabo mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), así como clasificación celular activada por de forma magnética (MACS). Para FACS, la molécula de unión que se une específicamente a la proteína marcadora o la molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado se marca con un colorante fluorescente. FACS es particularmente útil para el aislamiento de números pequeños con alta pureza. Para MACS, la molécula de unión que se une específicamente a la proteína marcadora o la molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado se marca con una partícula magnética, tal como una perla magnética. MACS es particularmente adecuada para la rápida clasificación de cultivos en masa.
Además, en la etapa (a), las células pueden ponerse en contacto además con una molécula de unión que se une específicamente a CD4 para enriquecerse adicionalmente en CD4 y/o con una molécula de unión que se une específicamente a CD8.
Otra realización se refiere al método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además la etapa C2) identificación de linfocitos T específicos de antígeno, que comprende las siguientes etapas:
a) incubación de clones celulares expandidos de la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con
(i) células presentadoras de antígeno tal como se define en la etapa A), y
(ii) células presentadoras de antígeno de control;
b) comparación del perfil de activación de la incubación con (i) y (ii) para cada clon celular;
c) identificación de clones celulares específicos de antígeno basándose en la comparación de b); en el que la activación mediante (i), pero no mediante (ii), indica que el clon celular es específico de antígeno.
La etapa C2) identificación de linfocitos T específicos de antígeno puede llevarse a cabo después de la etapa C1) enriquecimiento de linfocitos T activados, o alternativamente puede llevarse a cabo después de la etapa B) exposición de la población de células que comprende linfocitos T a las células presentadoras de antígeno sin la etapa de enriquecimiento C1).
Una realización adicional se refiere al método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además la etapa C2) identificación de linfocitos T específicos de antígeno, que comprende las siguientes etapas:
a) incubación de al menos una fracción de células de la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con
(i) células presentadoras de antígeno tal como se define en la etapa A), y
(ii) células presentadoras de antígeno de control o en ausencia de células presentadoras de antígeno; b) comparación del perfil de activación de la incubación con (i) y (ii) para la al menos una fracción de células;
c) identificación de una fracción de células que es específica de antígeno basándose en la comparación de b);
en el que la activación mediante (i), pero no mediante (ii), indica que la fracción de células es específica de antígeno.
Otra realización se refiere al método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además la etapa C2) identificación de linfocitos T específicos de antígeno, que comprende las siguientes etapas:
a) incubación de clones de células T expandidos de la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con
(i) células presentadoras de antígeno tal como se define en la etapa A), y
(ii) células presentadoras de antígeno de control o en ausencia de células presentadoras de antígeno; b) comparación del perfil de activación de la incubación con (i) y (ii) para cada clon celular;
c) identificación de clones celulares específicos de antígeno basándose en la comparación de b);
en el que la activación mediante (i), pero no mediante (ii), indica que el clon celular es específico de antígeno. El perfil de activación de los linfocitos T puede determinarse, por ejemplo, midiendo la liberación de citocinas inducida por activación o la capacidad de destrucción dirigida por antígeno.
Para medir la secreción de citocinas inducida por activación, las células T pueden cultivarse conjuntamente con CPA cargadas con antígeno. Pueden emplearse diferentes razones de célula efectora con respecto a célula diana (E:T). Pueden usarse células T incubadas con células presentadoras de antígeno de control, es decir, CPA transfectadas con simulación, o en ausencia de células estimulantes como controles negativos. Los sobrenadantes de cultivo se evalúan mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) convencional. Los ejemplos de marcadores son, sin limitación, la secreción de factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), interferón-y (IFN-y), IL-2 y TNF-a. La secreción de IFN-y, IL-2 y TNF-a tras el encuentro con el antígeno se correlaciona con una función antitumoral potenciada y, por tanto, es particularmente útil cuando se mide la secreción de citocinas inducida por antígenos de células T citotóxicas CD8+. Además, IFN-y y el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) son citocinas bien definidas para la evaluación de clones de células T polarizadas con células T cooperadoras 1 (Th1) CD4+ específicos de antígeno.
Si se usan múltiples antígenos de manera simultánea para la inducción de células T primarias, pueden mezclarse poblaciones de CPA individuales que expresen cada antígeno de sensibilización en proporciones iguales y usarse en cultivos conjuntos de células T. Por tanto, Los ensayos de selección iniciales realizados para evaluar únicamente la especificidad permiten la predicción de la reactividad al antígeno global con respecto a los antígenos diana desplegados totales. La evaluación de las especificidades de antígeno individuales requiere el posterior cultivo conjunto de células T reactivas al antígeno con CPA transfectadas con ivt-ARN de especies individuales.
Además, la actividad citotóxica de los clones de células T individuales puede medirse, por ejemplo, mediante ensayos de liberación de cromo. En tales ensayos, se marcan las células diana con cromo radiactivo y se exponen a células T. Tras la destrucción, se libera el cromo radiactivo en el sobrenadante y puede detectarse en el plazo de 4 horas después del inicio del cultivo conjunto. La liberación específica de cromo está normalizada con respecto a la liberación espontánea evaluada mediante la incubación de células diana en ausencia de células efectoras. Por consiguiente, altas cantidades de cromo en el sobrenadante se correlacionan con una excelente actividad citolítica de células T. Los ensayos de liberación de cromo se realizan preferiblemente para seleccionar células T CD8+ específicas de antígeno tumoral.
Las células presentadoras de antígeno adecuadas para su uso en la identificación de linfocitos T específicos de antígeno pueden ser, por ejemplo, líneas de células tumorales que expresan el antígeno deseado y las moléculas de CMH requeridas, líneas de células presentadoras de antígeno establecidas que expresan moléculas de CMH habituales o células presentadoras de antígeno derivadas del mismo donante que la población que comprende linfocitos T.
Un ejemplo de un línea de células presentadoras de antígeno establecida es la línea celular T2 linfoidea humana que expresa el frecuente alelo HLA-A*02:01, que muestra presentación de epítopo intrínseca defectuosa y puede cargarse de forma externa con péptidos cortos, por ejemplo, péptidos sintéticos. Esta línea celular puede usarse para la selección de linfocitos T CD8+ restringidos por HLA-A*02:01. Otro ejemplo es la línea celular K562 humana, que carece de expresión de HLA de clase I y II, en la que cualquier molécula de HLA de interés puede introducirse de manera estable o transitoria y, por tanto, puede servir tanto para la selección de linfocitos T CD8+ como de linfocitos T CD4+.
Las células presentadoras de antígeno derivadas del donante pueden ser, por ejemplo, monocitos aislados que maduran para formar células dendríticas. Las células dendríticas maduras muestra una óptima capacidad de activación.
Un ejemplo adicional para CPA derivadas del donante útiles son linfocitos B inmortalizados con virus de Epstein-Barr (VEB), denominados líneas celulares linfoblastoideas (LCL). Dado que las LCL se originan de manera natural a partir de células B, estas CPA presentan un función competente en el procesamiento y la presentación de antígenos. Además, las LCL expresan moléculas coestimuladoras como B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86), así como moléculas de adhesión apropiadas que ayudan a potenciar su capacidad estimuladora. Pueden usarse cepas de VEB mutante con genoma reducido (mini-VEB) para generar células B transformadas con mini-VEB (mLCL) que carecen de la mayoría de los genes del ciclo lítico que, por consiguiente, reducen la activación dependiente de VEB de linfocitos T (Kempkes, B.et al. (1995) Immortalization of human B lymphocytes by a plasmid containing 71 kilobase pairs of Epstein-Barr virus DNA. J Virol 69(1): 231-238., 1995; Moosmann, et al. (2002) B cells immortalized by a mini-Epstein-Barr virus encoding a foreign antigen efficiently reactivate specific cytotoxic T cells. Blood 100(5): 1755-1764).
Pueden usarse LCL derivadas de donante/mLCL para evaluar la especificidad de células T, particularmente cuando es necesario evaluar grandes números de clones de células T aislados. La carga con antígeno de LCL/mLCL puede lograrse, por ejemplo, mediante transducción retroviral, de transfección ivt-ARN y suministro externo de péptidos o proteínas.
El aislamiento de los linfocitos T específicos de antígeno se basa en la comparación del perfil de activación de los linfocitos T incubados (i) con células presentadoras de antígeno que expresan el antígeno deseado y (ii) con células presentadoras de antígeno de control o en ausencia de células presentadoras de antígeno.
La activación mediante (i) células presentadoras de antígeno que expresan el antígeno deseado, y no mediante (ii) células presentadoras de antígeno de control o en ausencia de células presentadoras de antígeno, indica que el clon de células T es específico de antígeno. Activado en comparación con inactivado significa que existe una reducción de al menos el 30%, de al menos el 40%, de al menos el 50%, de al menos el 60%, de un mínimo del 70%, de al menos el 80% del valor (es decir, la secreción de IFN-y) de los linfocitos T incubados con células presentadoras de antígeno que expresan el antígeno deseado.
La secuencia señal de translocación en el RE puede derivarse de una proteína asociada endosómica/lisosómica. La secuencia señal de translocación en el RE usada en el método dado a conocer puede ser la secuencia de clasificación de una proteína ubicada endosómica/lisosómica. Las proteínas ubicadas endosómicas/lisosómicas, tal como se usa en el presente documento, se refieren a proteínas que se ubican en la membrana o la luz de los endosomas y/o los lisosomas de una célula.
Los ejemplos de proteínas ubicadas endosómicas o lisosómicas son glicosidasas tales como, alfa-galactosidasa A/GLA, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa H/Endo H, alfa-N-acetilgalactosaminidasa/NAGA, galactosilceramidasa/GALC, alfa-N-acetilglucosaminidasa/NAGLU, glucosilceramidasa/GBA, alfagalactosidasa/a-Gal, heparanasa/HPSE, alfa-L-fucosidasa, heparinasa I, alfa-L-fucosidasa tisular/FUCAl, heparinasa II, beta-galactosidasa-1/GLB1, heparinasa III, beta-glucuronidasa/GUSB, hexosaminidasa A/HEXA, beta (1-3)-galactosidasa, hialuronato liasa, beta (1-4)-galactosidasa, hialuronidasa 1/HYAL1, quitinasa 1 similar a 3, hialuronidasa 4/HYAL4, quitinasa 2 similar a 3, alfa-L-iduronidasa/IDUA, quitinasa 3 similar a 3/ECF-L, quitobiasa/CTBS, quitotriosidasa/CHIT1, proteína similar a lactasa/LCTL, condroitina B liasa/condroitinasa B, alfa-glucosidasa lisosómica, condroitinasa ABC, MBD4, condroitinasa AC, NEU-1/sialidasa-1, beta-glucosidasa citosólica/GBA3, O-GlcNAcasa/OGA, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa F1/Endo F1, PNGasa F, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa F3/Endo F3, SPAM1; proteasas lisosómicas tales como, AMSH/STAMBP, catepsina H, catepsina 3, catepsina K, catepsina 6, catepsina L, catepsina 7/catepsina 1, catepsina O, catepsina A/carboxipeptidasa A lisosómica, catepsina S, catepsina B, catepsina V, catepsina C/DPPI, catepsina X/Z/P, catepsina D, galactosilceramidasa/GALC, catepsina F, oegumaína/asparaginilendopeptidasa; sulfatasas tales como arilsulfatasa A/ARSA, iduronato 2-sulfatasa/IDS, arilsulfatasa B/ARSB, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa/GALNSv, arilsulfatasa G/ARSG, sulfamidasa/SGSH, glucosamina (N-acetil)-6-sulfatasa/GNS, sulfatasa-2/SULF2; u otras proteínas lisosómicas tales como BAD-LAMP/LAMP5; hialuronidasa 1/HYAL1; CD63; LAMP1/CD107a; CD-M6PR; LAMP2/CD107b; cadena pesada 1 de clatrina/CHC17; Rab27a; cadena pesada 2 de clatrina/CHC22; UNC13D, CD68, CDlb o DC-LAMP.
La secuencia señal de translocación en el RE se deriva de una proteína asociada endosómica/lisosómica. La proteína asociada endosómica/lisosómica puede ser LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, CD68 o CD1b, preferiblemente LAMP1. Preferiblemente, la señal de translocación en el RE es humana. La secuencia señal de translocación en el RE puede comprender la secuencia de al menos una de SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, la secuencia señal de translocación en el RE puede consistir en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47. En realizaciones específicas, la secuencia señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma. En realizaciones más específicas, la secuencia señal de translocación en el RE consiste en la siguiente secuencia SEQ ID NO: 34.
La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMP, preferiblemente DC-LAMP. La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es normalmente una parte de un dominio transmembrana y citoplásmico. Por tanto, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMp , preferiblemente DC-LAMP. Preferiblemente, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humano. Normalmente, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende el motivo Y-XX seguido por un aminoácido hidrófobo. Preferiblemente, la secuencia señal de direccionamiento endosómica/lisosómica es YQRI. El dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 54 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma.
Un experto conoce bien el término aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos son Ala, Ile, Leu, Phe, Val, Pro, Gly, Met, Trp, Tyr, Pro, Cys.
Normalmente, las células presentadoras de antígeno se seleccionan de células dendríticas, células B activadas, monocitos, macrófagos, líneas celulares linfoblastoideas transformadas con VEB, preferiblemente células dendríticas, más preferiblemente células dendríticas derivadas de monocitos.
Las células presentadoras de antígeno pueden comprender diferentes poblaciones de células presentadoras de antígeno, expresando cada población una proteína de fusión de antígeno diferente.
En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígeno son células dendríticas maduras generadas mediante un método que comprende las siguientes etapas: i) suministro de monocitos; ii) incubación de los monocitos de la etapa i) con IL-4 y GM-CSF; iii) incubación de los monocitos de la etapa ii) con IL-4 y GM-CSF en combinación con un cóctel de maduración. El cóctel de maduración puede comprender al menos uno de los componentes seleccionados del grupo que consiste en IL-p, TNF-a, INF-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y agonista de TLR3, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, el agonista de TLR7/8 puede ser R848 y/o el agonista de TLR3 puede ser poli(I:C). La incubación de la etapa ii) puede durar al menos 2 días. La incubación de la etapa iii) puede durar al menos 12 horas, preferiblemente 24 horas.
Habitualmente, la población de células que comprende linfocitos T es una población de linfocitos de sangre periférica. La población de células que comprende linfocitos T puede ser una población de linfocitos de sangre periférica sin separar. La población de células puede estar enriquecida en linfocitos T, preferiblemente linfocitos T CD8+ y/o CD4+.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un vector de expresión, que comprende:
- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana, y
- un dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica,
- una secuencia que codifica para al menos dos antígenos diferentes, o fragmentos de los mismos, que se inserta entre la secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica;
en el que cada uno de los fragmentos tiene una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.
El vector puede comprender un promotor para la transcripción de ARNm in vitro. La secuencia señal de translocación en el RE se deriva de una proteína asociada endosómica/lisosómica, por ejemplo, LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, CD68, CD1b, preferiblemente LAMP1. Preferiblemente, la señal de translocación en el RE es humana. En realizaciones específicas, la señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 33 o un fragmento de la misma. En realizaciones más específicas, la señal de translocación en el RE consiste en la siguiente secuencia SEQ ID NO: 34.
La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMP, preferiblemente DC-LAMP. La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es normalmente una parte de un dominio transmembrana y citoplásmico. Por tanto, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMp , preferiblemente DC-LAMP. Preferiblemente, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humano.
Normalmente, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende el motivo Y-XX seguido por un aminoácido hidrófobo (X representa cualquier aminoácido natural). Preferiblemente, la señal de direccionamiento endosómica/lisosómica es YQRI. El dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 54 o un fragmento de la misma. Por ejemplo, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 35 o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, el vector de expresión comprende además sitios de restricción entre la señal de translocación en el RE y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica. En otras realizaciones, el vector comprende además al menos un antígeno, o un fragmento del mismo, que se inserta entre la señal de translocación en el retículo endoplásmico RE humana y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica.
El vector puede comprender una secuencia que codifica para al menos tres, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 antígenos o fragmentos de los mismos. El vector puede comprender una secuencia que codifica para menos de 100, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, menos de 10 antígenos o fragmentos de los mismos.
En algunas realizaciones, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de longitud completa de un antígeno. Alternativamente, el vector comprende un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de un antígeno. Tal como se muestra en la figura 12, células presentadoras de antígeno en las que se ha introducido un vector que comprende fragmentos de dos antígenos diferentes pueden inducir la activación de TCR específicos diferentes para los dos antígenos.
Normalmente, el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral. El antígeno tumoral puede seleccionarse del grupo que consiste en antígeno tumoral viral, antígeno específico de tumor, antígeno asociado al tumor y un antígeno que porta mutaciones específicas del paciente y que se expresa en células tumorales del paciente. Los antígenos tumorales virales, que también se denominan antígenos virales oncogénicos, son antígenos de virus oncogénicos, tales como los virus oncogénicos del ADN, por ejemplo, virus tales como el virus de la hepatitis B, el virus del herpes y el virus del papiloma, y virus oncogénicos del ARN. Los antígenos específicos de tumor se refieren a mutaciones asociadas al tumor que se expresan exclusivamente por células tumorales. El grupo de antígenos asociados al tumor comprende, por ejemplo, antígenos de cáncer de testículo específicos de tejido o antígenos de diferenciación de tejido tales como MART-1, tirosinasa o CD20. Preferiblemente, el antígeno tumoral es un antígeno asociado al tumor, más preferiblemente el antígeno asociado al tumor es un antígeno de cáncer de testículo (antígeno C/T). El antígeno C/T puede seleccionarse del grupo que comprende miembros de la familia MAGE, por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, pero sin limitarse a los mismos, antígenos tumorales que comprenden mutaciones puntuales, NY-ESO1, antígeno de tumor de testículo 1B, GAGE-1, SSX-4, XAGE-1, BAGE, GAGE, SCP-1, SSX-2, SSX-4, CTZ9, CT10, SAGE y CAGE. Preferiblemente, el antígeno C/T puede seleccionarse del grupo que consiste en GAGE-1, SSX-4 y XAGE-1. Preferiblemente, el antígeno que porta mutaciones específicas del paciente y que se expresa en células tumorales del paciente no se expresa en células no cancerosas del paciente.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, que expresa al menos una proteína de fusión que comprende
- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,
- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y
- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del vector de expresión, tal como se describe en el presente documento, para la generación in vitro de linfocitos T específicos de antígeno.
Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a T-linfocitos para su uso en un método de prevención o tratamiento de cáncer, que comprende administrar a un mamífero los linfocitos T generados mediante los métodos tal como se describen en el presente documento.
Otro aspecto se refiere a un método para generar un TCR específico de antígeno que comprende las etapas de los métodos descritos anteriormente y que comprende además la etapa de aislar un TCR a partir del linfocito específico de antígeno activado generado mediante los métodos tal como se describen en el presente documento. El aislamiento del TCR y el posterior análisis de la secuencia se describe, por ejemplo, en Steinle et al. (In vivo expansion of HLA-B35 alloreactive T cells sharing homologous T cell receptors: evidence for maintenance of an oligoclonally dominated allospecificity by persistent stimulation with an autologous MHC/peptide complex. The Journal of Experimental Medicine, 181(2), 503-13; 1995). El análisis de la secuencia puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante PCR o mediante métodos de secuenciación de la siguiente generación. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para identificar la secuencia de un ácido nucleico.
El TCR se compone de dos cadenas de proteína diferentes, a y b. La cadena a de TCR comprende las regiones variable (V), de unión (J) y constante (C). La cadena a de TCR comprende las regiones variable (V), de diversidad (D), de unión (J) y constante (C). Las regiones V(D)J reorganizadas tanto de la cadena a de TCR como de la cadena p de TCR contienen regiones hipervariables (CDR, regiones determinantes de complementariedad), entre las que la región CDR3 determina el reconocimiento específico del epítopo.
Un aspecto de la invención se refiere a un TCR específico para GAGE-1. En una realización, el TCR específico para GAGE-1 reconoce específicamente al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO:49, o fragmentos de las mismas. El fragmento puede tener una longitud de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o más aminoácidos. El TCR puede unirse específicamente a al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO:49, o fragmentos de las mismas.
El TCR específico para GAGE-1 puede comprender una cadena a de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 7 y una cadena p de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 8.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una cadena p de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 7 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 8 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 7 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 8 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 4.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 5 y una cadena p de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 6.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 y una cadena p de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 5 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 6 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para GAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 5 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 6 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 2.
Otro aspecto de la solicitud se refiere a un TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 15 y una cadena p de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 16.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una cadena p de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 15 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ iD NO: 11;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 16 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 15 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 11;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 16 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 12.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 13 y una cadena p de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 14.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 13 y una cadena p de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 14.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 13 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 14 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 10.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para SSX-4 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 13 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 9;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 14 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 10.
Un aspecto de la divulgación se refiere a un TCR específico para XAGE-1. En una realización, el TCR específico para XAGE-1 reconoce específicamente al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51, o fragmentos de las mismas. El fragmento puede tener una longitud de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o más aminoácidos. El TCR puede unirse específicamente a al menos una de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51, o fragmentos de las mismas.
El TCR específico para XAGE-1 puede comprender una cadena a de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 23 y una cadena p de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 24.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 y una cadena p de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 23 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ iD NO: 19;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 24 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 20.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 23 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 19;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 24 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 20.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 21 y una cadena p de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 22.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 21 y una cadena p de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 22.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 21 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 17;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 22 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 18.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 21 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 17;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 22 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 18.
Otro aspecto de la solicitud se refiere a un TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 31 y una cadena p de TCR que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 32.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 y una cadena p de TCR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 31 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ iD NO: 27;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 32 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 28.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 31 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 27;
- la cadena p de TCR comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 32 y comprende una CDR3 que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 28.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 29 y una cadena p de TCR codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 30.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 29 y una cadena p de TCR codificada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 30.
Además, la solicitud se refiere a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 29 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 25;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos el 80% idéntica a SEQ ID NO: 30 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 26.
Determinadas realizaciones se refieren a un receptor TCR específico para XAGE-1 que comprende una cadena a de TCR y una cadena p de TCR, en el que
- la cadena a de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos e
Figure imgf000020_0001
50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 29 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 25;
- la cadena p de TCR está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos e
Figure imgf000020_0002
50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% idéntica a SEQ ID NO: 30 y comprende una región CDR3 codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 26.
La presente solicitud también se refiere a las moléculas de ácido nucleico que codifican para los TCR tal como se definieron anteriormente.
Los cambios útiles en la secuencia de ácido nucleico global pueden ser para la optimización de codones. Pueden realizarse alteraciones que conduzcan a sustituciones conservadoras dentro de la secuencia de aminoácidos expresada. Estas variaciones pueden realizarse en regiones determinantes de complementariedad y no determinantes de complementariedad de la secuencia de aminoácidos de la cadena de TCR que no afectan a la función. Habitualmente, no deben realizarse adiciones ni deleciones en la región CDR3.
El experto en la técnica entiende el concepto de “sustituciones conservadoras de aminoácido” y, preferiblemente, significa que los codones que codifican para residuos con carga positiva (H, K y R) se sustituyen por codones que codifican para residuos con carga positiva, los codones que codifican para residuos con carga negativa (D y E) se sustituyen por codones que codifican para con residuos carga negativa, los codones que codifican para residuos polares neutros (C, G, N, Q, S, T e Y) se sustituyen por codones que codifican para residuos polares neutros y los codones que codifican para residuos apolares neutros (A, F, I, L, M, P, V y W) se sustituyen por codones que codifican para residuos apolares neutros. Estas variaciones pueden producirse de manera espontánea, introducirse mediante mutagénesis al azar o introducirse mediante mutagénesis dirigida. Estos cambios pueden realizarse sin destruir las características esenciales de estos polipéptidos. El experto habitual en la técnica puede seleccionar fácilmente y de manera rutinaria aminoácidos variantes y/o los ácidos nucleicos que codifican para los mismos para determinar si estas variaciones reducen o destruyen sustancialmente la capacidad de unión al ligando mediante métodos conocidos en la técnica.
Las etiquetas de epítopo son tramos cortos de aminoácidos en los que puede generarse un anticuerpo específico que, en algunas realizaciones, permite identificar específicamente y rastrear la proteína etiquetada que se ha añadido a un organismo vivo o a células cultivadas. La detección de la molécula etiquetada puede lograrse usando varias técnicas diferentes. Los ejemplos de tales técnicas incluyen: inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, ELISA, inmunotransferencia (“Western”) y cromatografía de afinidad. Las etiquetas de epítopo añaden un epítopo conocido (sitio de unión a anticuerpo) en la proteína sujeto para proporcionar la unión de un anticuerpo conocido y, a menudo, de alta afinidad, y permitiendo de ese modo identificar específicamente y rastrear la proteína etiquetada que se ha añadido a un organismo vivo o a células cultivadas.
En el contexto de la presente invención, una proteína de fusión de cadena a y/o p de TCR “funcional” significará un TCR o una variante de TCR, por ejemplo, modificado mediante la adición, deleción o sustitución de aminoácidos, que mantiene al menos una actividad biológica sustancial. En el caso de la cadena a y/o p de un TCR, esto significará que ambas cadenas siguen siendo capaces de formar un receptor de células T (o bien con una cadena a y/o p no modificada o bien con otra cadena a y/o p de una proteína de fusión de la invención) que ejerce su función biológica, en particular la unión al complejo de péptido-CMH específico de dicho TCR y/o la transducción de señales funcionales tras la interacción específica entre péptido:CMH.
En realizaciones específicas, el TCR puede modificarse para ser una proteína de fusión de cadena a y/o p de receptor de células T (TCR) funcional, en el que dicha etiqueta de epítopo tiene una longitud de entre 6 y 15 aminoácidos, preferiblemente de 9 a 11 aminoácidos. En otra realización, el TCR puede modificarse para ser una proteína de fusión de cadena a y/o p de receptor de células T (TCR) funcional, en el que dicha proteína de fusión de cadena a y/o p de receptor de células T (TCR) comprende dos o más etiquetas de epítopo, o bien espaciadas entre sí o bien directamente en tándem. Las realizaciones de la proteína de fusión pueden contener 2, 3, 4, 5 o incluso más etiquetas de epítopo, siempre que la proteína de fusión mantenga su(s) actividad(es) biológica(s) (“funcional(es)”).
Se prefiere una proteína de fusión de cadena a y/o p de receptor de células T (TCR) funcional según la presente invención, en la que dicho etiqueta de epítopo se selecciona de, pero sin limitarse a, etiquetas CD20 o Her2/neu u otras etiquetas convencionales tales como etiqueta myc, etiqueta FLAG, etiqueta T7, etiqueta HA (hemaglutinina), etiqueta His, etiqueta S, etiqueta GST o etiqueta GFP. Las etiquetas myc, T7, GST, GFP son epítopos derivados de moléculas existentes. En cambio, FLAG es una etiqueta de epítopo sintético diseñada por su alta antigenicidad (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 4.703.004 y 4.851.341). La etiqueta myc puede usarse preferiblemente debido a que están disponibles para su uso reactivos de alta calidad para su detección. Las etiquetas de epítopo pueden tener, por supuesto, una o más funciones adicionales, más allá del reconocimiento por un anticuerpo. Las secuencias de estas etiquetas se describen en la bibliografía y el experto en la técnica las conoce bien.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a una célula T que expresa un TCR tal como se definió anteriormente. Además, la divulgación se refiere a un vector que comprende una o más de las secuencias de ácido nucleico que codifican para un TCR tal como se definió anteriormente. El vector es preferiblemente un plásmido, vector lanzadera, fagémido, cósmido, vector de expresión, vector retroviral, vector adenoviral o una partícula y/o un vector que va a usarse en terapia génica.
Un “vector” es cualquier molécula o composición que tiene la capacidad de transportar una secuencia de ácido nucleico a una célula huésped adecuada en la que puede tener lugar la síntesis del polipéptido codificado. Normalmente, y preferiblemente, un vector es un ácido nucleico que se ha diseñado por ingeniería usando técnicas de ADN recombinante que se conocen en la técnica para incorporar una secuencia de ácido nucleico deseada (por ejemplo, un ácido nucleico de la invención). El vector puede comprender ADN o ARN y/o comprender liposomas. El vector puede ser un plásmido, vector lanzadera, fagémido, cósmido, vector de expresión, vector retroviral, vector adenoviral o una partícula y/o un vector que va a usarse en terapia génica. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionable y otros elementos genéticos conocidos por los expertos habituales en la técnica. Un vector es preferiblemente un vector de expresión que incluye un ácido nucleico según la presente invención unido operativamente a secuencias que permiten la expresión de dicho ácido nucleico.
En otro aspecto de la divulgación, se proporciona una célula en la que se ha introducido la secuencia de ácido nucleico anterior que codifica para un TCR tal como se describió anteriormente. En la célula T, puede introducirse el vector descrito anteriormente que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el TCR descrito anteriormente o puede introducirse ARN transcrito in vitro que codifica para dicho TCR. La célula puede ser un linfocito de sangre periférica, tal como una célula T. El método de clonación y expresión exógena del TCR se describe, por ejemplo, en Engels et al. (Relapse or eradication of cancer is predicted by peptidemajor histocompatibility complex affinity. Cáncer Cell, 23(4), 516-26. 2013).
Otro aspecto de la solicitud se refiere a los TCR o a las células que expresan un TCR, tal como se definió anteriormente, para su uso como medicamento. Por tanto, la presente solicitud también contempla una composición farmacéutica que comprende los TCR o las células que expresan un TCR, tal como se describió anteriormente, y un portador farmacéuticamente aceptable. Determinadas realizaciones se refieren a los TCR o a las células que expresan un TCR, tal como se definió anteriormente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad que implica células malignas que expresan GAGE-1, SSX-4, XAGE-1 o una mezcla de los mismos. Por tanto, la solicitud también se refiere a los TCR, tal como se definió anteriormente, para su uso en el tratamiento de cáncer. Por consiguiente, la solicitud se refiere a un método de tratamiento de un paciente que necesita terapia celular adoptiva, comprendiendo dicho método administrar a dicho paciente una composición farmacéutica tal como se define en el presente documento. El paciente puede padecer enfermedades que implican células malignas que expresan GAGE-1, SSX-4, XAGE-1 o una mezcla de los mismos.
Los componentes activos de la presente invención se usan preferiblemente en una composición farmacéutica de este tipo en dosis mezcladas con un portador o material portador aceptable, para que la enfermedad pueda tratarse o al menos aliviarse. Una composición de este tipo puede incluir (además del componente activo y el portador) material de carga, sales, tampón, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales, que se conocen en el estado de la técnica.
El término “farmacéuticamente aceptable” define un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del componente activo. La elección del portador depende de la aplicación.
La composición farmacéutica puede contener componentes adicionales que potencien la actividad del componente activo o que complementen el tratamiento. Tales componentes y/o factores adicionales pueden formar parte de la composición farmacéutica para lograr efectos sinérgicos o minimizar los efectos adversos o no deseados.
En “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, edición más reciente, se publican técnicas para la formulación o preparación y aplicación/medicación de los componentes activos de la presente invención. Una aplicación apropiada es una aplicación parenteral, por ejemplo, inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraganglionares, intraperitoneales o intratumorales. La inyección intravenosa es el tratamiento preferido de un paciente.
Según una realización preferida, la composición farmacéutica es una infusión o una inyección.
Una composición inyectable es una composición fluida farmacéuticamente aceptable que comprende al menos un principio activo, por ejemplo, una población de células T expandida (por ejemplo, autóloga o alogénica para el paciente que va a tratarse) que expresa un TCR. El principio activo se disuelve o suspende habitualmente en un portador fisiológicamente aceptable, y la composición puede comprender además cantidades menores de una o más sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes emulsionantes, conservantes y agentes reguladores del pH, y similares. Tales composiciones inyectables que son útiles para su uso con las proteínas de fusión de esta divulgación son convencionales; los expertos habituales en la técnica conocen bien las formulaciones apropiadas.
Ejemplos
Validación de la presentación cruzada eficiente de CMH de clase II mediante el vector CrossTAg
Para obtener la presentación cruzada de CMH de clase II de proteínas codificadas por ARN, se acoplaron secuencias de ADN de antígeno seleccionadas con una señal de direccionamiento de CMH de clase II (CrossTAg). Con este fin, se fusionó la señal de translocación en el RE de la proteína 1 de membrana asociadas a lisosomas humana (LAMP-1) en 5' con los dominios transmembrana y citoplásmicos de DC-LAMP humana. Se separaron estos dos componentes de señal por sitios de restricción únicos que permiten la integración de secuencias de antígeno seleccionadas en marco con CrossTAg. El péptido señal LAMP-1 se usó para facilitar la translocación cotraduccional de proteínas recién sintetizadas en el RE. Tras la translocación, la señal de direccionamiento de DC-LAMP citoplásmica (motivo YXX^; X representa cualquier aminoácido natural; ^ representa cualquier aminoácido hidrófobo; SEQ ID NO: 38) debe garantizar un transporte eficiente de proteínas al compartimento endosómico/lisosómico.
Se integró una secuencia de codificación parcial del antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr (EBNA)-3C, que codifica para un fragmento de 1 kb que contiene el epítopo conocido para el clon de células T CD4+ específico de EBNA-3C, 3H10 (descrito en Xiaojun Yu, et al.: Antigen-armed antibodies targeting B lymphoma cells effectively activate antigen-specific CD4+ T cells. Blood 5 de marzo de 2015; 125(10):1601-10.; http://www.iedb.org/assayId/2445148) que está restringido por HLA-DRB1*11:01. Se usaron constructos adicionales que comprendían sólo una o ninguna de las dos señales para evaluar la necesidad de cada secuencia para la presentación cruzada de CMH de clase II deseada (figura 1a). Posteriormente, se transcribió el ARN in vitro a partir de plásmidos linealizados y se transfectó en diferentes CPA que expresan el elemento de restricción requerido HLA-DRB1*11:01. La medición de la producción de IFN-y tras el reconocimiento específico de antígeno por el clon 3H10 permitió la detección de la presentación cruzada eficiente de CMH de clase II de proteína traducida y procesada de manera endógena en experimentos de cultivo conjunto con DC, así como líneas celulares linfoblastoideas (mLCL) transformadas con mini-VEB, transfectadas con EBNA-3C-CrossTAg-ARN (figura 1b). Sólo ivt-ARN que contenía la señal de translocación en el RE de LAMP-1 condujo a una activación de células T detectable. En comparación con la presentación de CMH de clase II pronunciada lograda con EBNA-3C-CrossTAg-ARN, el péptido señal LAMP-1 solo confirió una menor capacidad de presentación cruzada. Se confirmaron estos datos usando un clon de células T CD4+ adicional específico para un epítopo restringido por HLA-DRB1*15:01 del antígeno BNRF1 del VEB (datos no mostrados).
A continuación, se usaron células T 3H10 para dilucidar si la señal CrossTAg conducía a la presentación de CMH de clase II mediante 1) secreción y recaptación de proteínas o 2) rutas de presentación internas de células. Para esto, se transfectaron DC positivas para HLA-DRB1*11:01 o negativas para HLA-DRB1*11:01 con EBNA-3C-CrossTAg-ARN. Se incubaron conjuntamente DC transfectadas y sin transfectar en todas las posibles combinaciones (positivas/negativas para HLA-DRB1*11:01) y después se cultivaron conjuntamente con células 3H10. El reconocimiento de CPA sólo se detectó cuando se transfectaron DC positivas para HLA-DRB1*11:01 con antígeno-CrossTAg-ARN. No se detectó el reconocimiento de DC positivas para HLA-DRB1*11:01 sin transfectar que potencialmente hubieran captado y procesado antígeno secretado por DC negativas para HLA-DRB1*11:01 (figura 8).
Expresión de CD40L inducida por antígeno-CrossTAg
Para desarrollar un método rápido para el enriquecimiento selectivo de células T CD4+ específicas de antígeno, se evaluó la capacidad de DC transfectadas con antígeno-CrossTAg-ARN para inducir la expresión de CD40L en células T CD4+ con respuesta. Para esto, se tiñeron células T 3H10 con un colorante de rastreo fluorescente y se mezclaron con PBL autólogos hasta concentraciones finales del 10%, el 5%, el 1% o el 0,1% de las células totales (figura 1c). Se cultivaron conjuntamente estas diferentes fracciones con DC autólogas transfectadas con ivt-ARN y EBNA-3C-CrossTAg y se tiñeron para la expresión de CD40L. A las 6 h de cultivo conjunto, se detectó una expresión sustancial de CD40L en células 3H10 específicas de EBNA-3C, sin embargo, sólo se observó una expresión marginal de CD40L en PBL autólogos. Incluso a la concentración más baja de células 3H10 (0,1%), la posterior clasificación de células T CD4+ positivas para CD40L dio como resultado una población del 66% de células 3H10.
Secuencias de señal de translocación en el RE alternativas
Al medir la producción de IFN-y tras el reconocimiento específico de antígeno por el clon 3H10, pudo detectarse la presentación cruzada eficiente de CMH de clase II de proteína traducida y procesada de manera endógena en experimentos de cultivo conjunto con CPA, transfectada con diferentes EBNA-3C etiquetados con CrossTAga Rn y diferentes alternativas a CrossTAg-ARN (figura 11).
Presentación eficiente de CMH de clase II y CMH de clase I
Se mostró que el uso de la señal CrossTAg facilita no sólo la presentación de CMH de clase II, sino también la presentación de CMH de clase I (figura 12).
Presentaciones eficientes de varios antígenos codificados por la misma molécula de ivt-ARNm
Además, pudo establecerse un enfoque eficiente de presentación de varios epítopos procedentes de antígenos diferentes por el mismo ivt-ARNm. Tal como se muestra en la figura 12, las células presentadoras de antígeno que expresan el constructo, que comprende dos epítopos procedentes de antígenos diferentes, activan el clon específico de EBNA-3C, 3H10, así como el clon específico de tirosinasa, IVSB. Por tanto, el constructo ivt que tiene dos epítopos diferentes facilita la presentación de ambos epítopos.
Activación de PBL con DC pulsadas por ARN
En la búsqueda de un enfoque de alto rendimiento, se exploró el potencial de usar múltiples antígenos candidatos en paralelo para la sensibilización de células T CD4+. Por tanto, se activaron las células T CD4+ presentes en PBL sin separar usando DC transfectadas con especies de ivt-ARN que codifican para cuatro antígenos C/T diferentes (GAGE-1, MAGE-A4, SSX-4 y XAGE-1), que se fusionaron con la señal CrossTAg. Se transfectaron las DC con cada ivt-ARN individualmente mediante electroporación, tal como se describe (Javorovic, M.et al. (2008) Inhibitory effect of RNA pool complexity on stimulatory capacity of RNA-pulsed dendritic cells. J Immunother 31(1): 52-62.). Se midió el estado de maduración de las Dc transfectadas mediante los niveles de expresión de moléculas coestimuladoras mediante citometría de flujo. Las DC mostraron un fenotipo maduro con alta expresión de moléculas coestimuladoras (CD80, CD83, CD86) y HLA de clase II (figura 9a). Para evaluar la eficiencia de transfección, se analizó ADNc de antígeno, derivado de ARNm extraído de las DC transfectadas, mediante RT-PCR cuantitativa. Los datos adquiridos mostraron un intervalo de aumento en 1,5*105 a 2*107 veces los números de copia de ARNm de antígeno C/T después de la electroporación (figura 9b). Además, aproximadamente el 68% de las DC expresó proteína fluorescente verde potenciada (eGFP), tal como se detectó mediante citometría de flujo 12 horas después de la transfección con eGFP-ivt-ARN de control (datos no mostrados).
Después de la transfección con ARN y antígeno-CrossTAg, se agruparon las cuatro poblaciones de DC independientes y se usaron simultáneamente para sensibilizar PBL autólogos sin separar de un donante sano. El posterior procedimiento de expansión incluyó dos rondas de estimulación de las CPA. Se descongelaron alícuotas congeladas de las preparaciones de DC iniciales y se usaron para los cultivos de reestimulación.
Aislamiento de células T CD4+ activadas
Después de cada intervalo de 14 días de cultivo conjunto de DC, los PBL autólogos sensibilizados presentaban un aumento global de 3-4 veces en los números de células. Se midieron los cambios en las razones de CD4:CD8 en múltiples puntos de tiempo para rastrear la expansión de células T CD4+ activadas. Además, se incubaron conjuntamente muestras de PBL con DC cargadas con antígeno en presencia de anticuerpo bloqueante de CD40 y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo usando AcM específicos para CD4, CD137 y CD40L (figura 2a). A lo largo del periodo monitorizado, la razón de CD4:CD8 se invirtió desde 1,7 el día 0 hasta 0,7 el día 27, reflejando una proliferación potenciada de células T CD8+ (datos no mostrados). Sin embargo, dentro de la población de células T CD4+, el porcentaje de células T positivas para CD40L aumentó desde el 4,6% el día 13 hasta más del 30% el día 27. En cambio, el número de supuestas células T reguladoras (Treg), que se describen como células T CD4+ monopositivas para CD137 (Schoenbrunn et al., A converse 4-1BB and CD40 ligand expression pattern delineates activated regulatory T cells (Treg) and conventional T cells enabling direct isolation of alloantigen-reactive natural Foxp3+ Treg. J Immunol. 2012;189(12):5985-94.), disminuyó en aproximadamente el 36%.
Después del tercer ciclo de estimulación, se enriquecieron células T CD4+ positivas para CD40L del cultivo de PBL y se clonaron directamente en placas de 96 pocillos mediante FACS (figura 10). Se expandieron las células T CD4+ clonadas. Las células en exceso del procedimiento de clonación se establecieron como líneas de células T CD4+ positivas para CD40L (CD40Lpos) y negativas para CD40L (CD40Lneg) en masa. Su análisis indicó un enriquecimiento exitoso de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno C/T, dado que las células T CD4+ clasificadas como CD40Lpos proliferaron en casi cuatro veces durante 14 días tras la reestimulación específica de antígeno C/T y liberaron cantidades significativamente mayores de IFN-y después del cultivo conjunto con CPA transfectadas con ARN en comparación con las células T CD40Lneg (figura 2b, c).
Selección de clones de células T CD4+ reactivos al antígeno C/T
Se sometieron a prueba clones de células T que se expandieron en cultivos de 96 pocillos para determinar la reactividad al antígeno en ensayos de liberación de IFN-y comenzando 12 días después de la clonación mediante FACS (figura 3a). Los cultivos conjuntos usando una mezcla de las DC cargadas con ARN y cuatro antígenos-CrossTAg indicaron que, junto a los clones de células T no reactivos e inespecíficos, estaban presentes múltiples clones de células T reactivos al antígeno. Con pocas excepciones, los clones de células T reactivos al antígeno no mostraron activación de fondo en el cultivo conjunto con DC transfectadas con simulación.
Para validar estas observaciones, volvieron a someterse a prueba clones seleccionados un día después usando mLCL transfectadas con ivt-ARN como fuente alternativa de CPA. Los ensayos de liberación de IFN-y y GM-CSF confirmaron los hallazgos previos con DC (figura 3b). Además, se tiñeron clones de células T seleccionados para determinar la expresión en superficie de CD4 y CD8 y se encontró que todos expresaban el correceptor CD4 (figura 3c).
Caracterización molecular y funcional de clones de células T CD4+ específicos de antígeno
Para analizar las especificidades de antígeno individual de clones de células T CD4+ reactivos al antígeno, posteriormente se cultivaron conjuntamente clones individuales con distintas poblaciones de CPA transfectadas con especies individuales de ARN y antígeno-CrossTAg. Se midieron las respuestas mediante la secreción de IFN-y usando un ELISA convencional (figura 4). Se detectaron clones de células T CD4+ específicos de antígeno que reconocían cada uno de los cuatro antígenos C/T usados para la sensibilización. Los clones de células T no mostraron activación de fondo por las CPA transfectadas con simulación ni ninguna reactividad cruzada detectable a los otros antígenos a los que se expusieron durante la sensibilización.
Usando análisis de repertorios de TCR, se identificaron 4 secuencias de receptor de células T únicas a partir de la multitud de clones aislados. Los ensayos de restricción de CMH mostraron que las diferentes células T reconocían epítopos presentados por diferentes alotipos de CMH de clase II (datos no mostrados).
Se demostró la importancia de tener el antígeno fusionado con la señal CrossTAg por el hecho de que las DC proporcionadas con ivt-ARN sin esta señal no pudieron inducir la secreción de IFN-y por clones de células T CD4+ aislados (figura 5a). La secreción de IFN-y inducida por la activación sólo se provocó cuando se cultivaron conjuntamente clones de células T CD4+ con CPA transfectadas con ARN y antígeno-CrossTAg. Una excepción fue el clon de células T que expresa GAGE-1-TCR-2, que también reconoció CPA transfectadas con ARN que carece de las señales de clasificación respectivas, aunque a niveles sustancialmente más bajos.
Para confirmar la especificidad de antígeno de los clones de células T CD4+ aislados, se cargaron CPA con proteínas recombinantes. Los clones de células T CD4+ mostraron una secreción de IFN-y positiva para CPA cargadas con proteína que fue comparable a la activación observada en el cultivo conjunto con CPA transfectadas con ARN y antígeno-CrossTAg (figura 5b).
Identificación directa de epítopos de CMH de clase II
Para estos 4 clones, se usó un método para el mapeo directo de epítopos de CMH de clase II (DEPI) (Milosevic, S. et al. (2006) Identification of major histocompatibility complex class II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr virus) para definir los epítopos que reconocen en asociación con moléculas de CMH de clase II. Se validó el reconocimiento de fragmentos de antígeno aislados con constructos CrossTAg-ARN solapantes cortos y se usaron estos para consignar adicionalmente las secuencias de epítopo mínimas (figura 6a, b). Por tanto, se encontró que GAGE-1-TCR-1 reconocía el epítopo GAGE-176-98 presentado por HLA-DRB5*01:01. De manera interesante, los dos clones de células T CD4+ específicos de XAGE-1 reconocieron un epítopo XAGE-137-49 idéntico presentado por dos alotipos de CMH de clase II diferentes (HLA-DRB1*13:02 y HLA-DRB5*01:01). Expresión transgénica de TCR específicos de antígeno C/T
Tras el análisis del repertorio de TCR, volvieron a construirse secuencias de TCR aisladas usando vectores de expresión de TCR. Se transfectaron células T CD4+ del clon 3H10 (específico de EBNA-3C y restringido por HLA-DRB1*11:01) con las cadenas a y p de TCR correspondientes de los clones de células T CD4+ GAGE-1-TCR-2, XAGE-1-TCR-1 o -TCR-2. Se cultivaron conjuntamente células 3H10 modificadas por ingeniería con TCR con CPA cargadas con antígeno C/T (figura 7). Midiendo la secreción de IFN-y, se mostró que las especificidades de todos los clones de células T CD4+ se transfirieron con éxito a las células3H10, sin alterar su TCR específico de VEB endógeno. Por tanto, después de la transfección de los TCR, las células 3H10 reconocían CPA transfectadas con ivt-ARN y EBNA-3C-CrossTAg, así como CPA transfectadas con el ivt-ARN y antígeno C/T-CrossTAg correspondiente.
Métodos
Constructos genéticos
Se usó el vector pGEM-eGFP-A120 como constructo de partida para el CrossTAg-vector (S. Milosevic). Esta variante poliA120 del vector pGEM original produce ARN transcrito con mayor estabilidad y condujo a una expresión de proteínas mejorada. El plásmido contenía además un sitio Agel único en el extremo 5' del ADNc de eGFP, así como un sitio EcoRI único en el extremo 3'. La cola poli-A está seguida por un sitio SpeI que permite la linealización del plásmido para la producción de ivt-ARN.
Se clonó el plásmido pGEM-CrossTAg-A120 reemplazando eGFP por ADNc que codifica para la señal de direccionamiento CrossTAg. La secuencia de CrossTAg consiste en la señal de translocación en el RE de la proteína 1 de membrana asociada a lisosomas humana (LAMP-1, n.° de registro: NP_005552, aa 1-28) fusionada en 5' con el dominio transmembrana y citoplásmico de DC-LAMP (n.° de registro: NP_055213, aa 376­ 416). Para la inserción de ADNc que codifica para antígeno, las distintas secuencias de CrossTAg se separan mediante un espaciador de 18 pb que contiene los sitios de restricción NheI, KpnI y PstI sin alterar el marco de lectura abierto (ORF) de LAMP1. La secuencia de CrossTAg con codones optimizados se diseñó prácticamente usando software de clonación computacional y la sintetizó GeneArt (Regensburg). Posteriormente, se cortó la secuencia de CrossTAg completa del ADN del plásmido usando los sitios de restricción Agel (extremo 5') y EcoRI (extremo 3') y se ligó en el MCS del vector pGEM-A120 digerido del mismo modo.
Para la clonación de diversos constructos de antígeno C/T-CrossTAg (pGEM-GAGE-1-CrossTAg-A120, pGEM-MAGE-A4-CrossTAg-A120, pGEM-NY-ESO-1 -CrossTAg-A120, pGEM-SSX-4-CrossTAg-A120, pGEM-XAGE-1-CrossTAg-A120), se amplificó ADNc de antígeno a partir de plásmidos mediante PCR (n.os de registro: GAGE-1, U19142; MAGE-A4, NM_001011550; NY-ESO1, AJ003149; SSX-4, U90841; XAGE-1, AF251237) usando cebadores directos e inversos específicos del gen y se ligaron mediante los sitios de restricción NheI y PstI/NotI. Los cebadores usados para las reacciones de PCR están todos disponibles bajo petición. Todas las secuencias de antígeno se insertaron en la señal CrossTAg de división de pGEM-CrossTAg-A120 sin alterar el ORF inicial.
Para la validación de epítopos de células T CD4+, se sintetizaron oligonucleótidos complementarios (Metabion) y se aparearon. Se usaron extremos cohesivos, generados tras el apareamiento, para la ligación directa de estas secuencias de antígeno cortas en el vector CrossTAg.
Producción de ivt-ARN
Tras la linealización con SpeI, se usaron pGEM-plásmidos como moldes para la producción de especies individuales de ivt-ARN (Ar N transcrito in vitro) usando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (Ambion), según las instrucciones del fabricante. Para el control de calidad, se analizó la longitud del producto ivt-ARN mediante electroforesis en gel de agarosa. Se determinaron la concentración y la pureza por medio del espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific).
Cultivo de células
Se generaron y transfectaron 3d-mDC derivadas de monocitos tal como se describe en Bürdek et al. (Journal of Translational Medicine 2010, 8:90). La transfección de ARN de mDC y líneas celulares linfoblastoideas (mLCL) transformadas con mini-virus de Epstein-Barr (VEB) se logró mediante electroporación tal como se describe en Bürdek et al (Three-day dendritic cells for vaccine development: Antigen uptake, processing and presentation. Journal of Translational Medicine 2010, 8:90).
Se hicieron crecer mLCL como cultivos en suspensión en medio LCL tal como se describió previamente (Milosevic, S.et al. (2006) Identification of major histocompatibility complex class II-restricted antigen and epitopes of the Epstein-Barr virus). La carga de mLCL con proteínas se logró cultivando 2*106 células en placas de 24 pocillos en 2 ml de medio LCL durante 16 h en presencia de 25 pg de proteína humana recombinante GAGE-1, MAGE-A4, SSX-4 o XAGE-1 (enriquecidas mediante 6x-etiqueta cHis después de la expresión en células HEK-293T). Al final del periodo de incubación, se lavaron las células dos veces usando RPMI 1640 y se cultivaron conjuntamente con clones de células T CD4+ específicos.
RT-PCR cuantitativa
Se aisló ARN celular de DC transfectadas y sin transfectar y se sintetizó el ADNc correspondiente con cebadores oligo-dT usando el kit de síntesis de ADN de primera cadena para la RT-PCR (AMV) (Roche). Las diferencias en los número de molde del antígeno se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) usando el kit LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche), según el manual del fabricante. Los cebadores específicos del gen (aEnolasa, GAGE-1, MAGE-A4, SSX-4 y XAGE-1) usados para las reacciones de RT-PCR están todos disponibles bajo petición. Las mediciones se normalizaron con respecto al gen constitutivo aEnolasa y se analizaron según el método AACP.
Fenotipado de superficie de células T y DC
Se detectaron los marcadores de superficie expresados por células T y DC con los siguientes anticuerpos: anticuerpo específico contra CCR7 conjugado con PE (3D12) (eBioscience), anticuerpo específico contra CD4 conjugado con Hz450 (RPA-T4), anticuerpo específico contra CD8 conjugado con Hz500 (RPA-T8), anticuerpo específico contra CD14 conjugado con FITC (M5E2), anticuerpo específico contra CD40 conjugado con Pe (5C3), anticuerpo específico contra CD40L conjugado con PE (TRAP1), anticuerpo específico contra CD80 conjugado con PE (L307.4), anticuerpo específico contra CD83 conjugado con FITC (HB15e), anticuerpo específico contra CD86 conjugado con FITC (2331), anticuerpo específico contra CD137 conjugado con CPA (4B4-1), anticuerpo específico contra DC-SIGN conjugado con FITC (DCN46), anticuerpo específico contra HLA-DR conjugado con PE (G46-6) (todos de BD Biosciences). Después del lavado, se tiñeron las células durante 30 min a 4°C y se añadió yoduro de propidio (2 pg/ml) para la exclusión de células muertas. Se analizó la expresión de todos los marcadores de superficie mediante citometría de flujo (LSRII, BD). Se realizó el análisis de datos posterior a la adquisición usando el software FlowJo 8 (TreeStar). El análisis de la expresión en superficie de CD40L en células T se realizó tal como se describe (Frentsch, M. et al. (2005) Direct access to c D4+ T cells specific for defined antigens according to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118-1124) usando 2 pg/ml de anticuerpo aCD40 (clon G28.5, proporcionado por M. Frentsch, Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies) y se evaluó 6 h después del inicio del cultivo conjunto de células T:CPA.
Sensibilización de novo de PBL con DC transfectadas con ARN
Se transfectaron 3d-mDC de un donante sano en poblaciones independientes con 2 especies individuales de CrossTAg-ARN que codifica para los antígenos C/T GAGE-1, MAGE-A4, SSX-4 y XAGE-1. Después de la electroporación, se recogieron las mDC transfectadas y se cultivaron conjuntamente las mDC mezcladas de esta mezcla a una razón de 1:2 con linfocitos de sangre periférica (PBL), que no fueron adherentes durante la adherencia plástica de PBMC en el procedimiento de generación de mDC. Se cultivaron las células a 37°C en

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Método para generar linfocitos T específicos de antígeno humano, que comprende las siguientes etapas:
    A) expresión de al menos una proteína de fusión, que comprende
    - al menos un antígeno o un fragmento del mismo,
    - una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y
    - un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno, en células presentadoras de antígeno; y
    B) exposición de una población de células que comprende linfocitos T a las células presentadoras de antígeno de la etapa A) in vitro para activar linfocitos T específicos de antígeno específicos para el antígeno expresado por la célula presentadora de antígeno;
    en el que la proteína de fusión comprende al menos dos antígenos o fragmentos de los mismos diferentes,
    en el que el fragmento tiene una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además la etapa C1) enriquecimiento de linfocitos T activados y/o específicos de antígeno, que comprende las siguientes etapas:
    (a) poner en contacto la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados con una molécula de unión que se une específicamente a una proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados o con moléculas de CMH que presentan un epítopo del antígeno deseado;
    (b) aislar linfocitos T a los que se une la molécula de unión o la molécula de CMH que presenta un epítopo del antígeno deseado.
  3. 3. Método según la reivindicación 2, en el que la proteína marcadora expresada específicamente por linfocitos T activados se selecciona del grupo que consiste en Ox40, CD137, CD40L, PD-1, receptor de IL-2, interferón-y, IL-2, GM-CSF y TNF-a.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el método comprende además la etapa C2) identificación de linfocitos T específicos de antígeno, que comprende las siguientes etapas:
    a) incubación de clones celulares expandidos de la población de células que comprende linfocitos T específicos de antígeno activados
    con
    (i) células presentadoras de antígeno tal como se define en la etapa A), y (ii) células presentadoras de antígeno de control o en ausencia de células presentadoras de antígeno;
    b) comparación del perfil de activación de la incubación con (i) y (ii) para cada clon celular; c) identificación de clones celulares específicos de antígeno basándose en la comparación de b); en el que la activación mediante (i), pero no mediante (ii), indica que el clon celular es específico de antígeno.
  5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia señal de translocación en el RE se deriva de una proteína asociada endosómica/lisosómica, y en el que la proteína asociada endosómica/lisosómica se selecciona del grupo que comprende LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, CD68 y CD1b, preferiblemente LAMP1.
  6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica se deriva de LAMP1 o DC-LAMP, preferiblemente DC-LAMP.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia señal de translocación en el RE es humana y en el que el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humano.
  8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células presentadoras de antígeno comprenden diferentes poblaciones de células presentadoras de antígeno, expresando cada población una proteína de fusión de antígeno diferente.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células presentadoras de antígeno son células dendríticas maduras generadas mediante un método que comprende las siguientes etapas:
    i) suministro de monocitos;
    ii) incubación de los monocitos de la etapa i) con IL-4 y GM-CSF;
    iii) incubación de los monocitos de la etapa ii) con IL-4 y GM-CSF en combinación con un cóctel de maduración, en el que el cóctel de maduración comprende opcionalmente una combinación de IL-P, TNF-a, INF-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y agonista de TLR3.
  10. 10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población de células que comprende linfocitos T es una población de linfocitos de sangre periférica sin separar.
  11. 11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población de células que comprende linfocitos T está enriquecida en linfocitos T, preferiblemente linfocitos T CD8+ y/o CD4+.
  12. 12. Método para generar un TCR específico de antígeno, que comprende las etapas del método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y que comprende además la etapa de aislar un TCR a partir del linfocito específico de antígeno activado.
  13. 13. Vector de expresión, que comprende:
    - una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana, y - un dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica,
    - una secuencia que codifica para al menos dos antígenos diferentes, o fragmentos de los mismos, que se inserta entre la secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) humana y el dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica; en el que cada uno de los fragmentos tiene una longitud de un mínimo de 9 aminoácidos.
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