ES2865484T3

ES2865484T3 - Composición de células dendríticas

Info

Publication number: ES2865484T3
Application number: ES16825765T
Authority: ES
Inventors: Slavoljub Milosevic; Christian Ellinger; Carina Wehner; Dolores Schendel
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH; Medigene Immunotherapies GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH; Medigene Immunotherapies GmbH
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: JP2018537999A; KR20200085362A; JP2018538001A; TWI752930B; US10882891B2; CA3009564A1; EA201891460A1; PH12018501336A1; EP3394248A1; PH12018501335A1; TW201736594A; TWI772282B; AU2016374874A1; CN108603171A; KR102319839B1; WO2017109109A1; EP3394248B1; KR20180093954A; CA3009542A1; EP3394247B1

Abstract

Composición de células dendríticas, que comprende (i) células dendríticas que expresan al menos una proteína de fusión que comprende - al menos un antígeno o un fragmento del mismo, - una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y - un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno, y (ii) células dendríticas que expresan al menos un antígeno o un fragmento del mismo sin - una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo, ni - un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo, en la que el antígeno de (i) y (ii) es el mismo antígeno, en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de células dendríticas

Campo de la invención

La presente invención contempla composiciones de células dendríticas. Las composiciones de células dendríticas emplean señales de direccionamiento de CMH de clase II fusionadas con un antígeno o fragmento del mismo para obtener la presentación de CMH-II del antígeno o fragmento del mismo.

En particular, la invención se refiere a una vacuna de células dendríticas que comprende células dendríticas que expresan una señal de direccionamiento de CMH de clase II fusionada con un antígeno o fragmento del mismo. También se describen vacunas de células dendríticas para la estimulación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a melanoma.

Antecedentes de la invención

Las células dendríticas representan un agente muy potente en inmunoterapia porque pueden sensibilizar de manera eficiente células T indiferenciadas durante el desarrollo de inmunidad mediada por células T y estimular respuestas inmunitarias adaptativas. Las células dendríticas tienen la capacidad de activar respuestas inmunitarias no sólo contra patógenos, sino también contra células malignas. In vivo, las células dendríticas en estado inmaduro intermedio patrullan los tejidos periféricos para capturar y procesar antígenos. Bajo la influencia de citocinas locales y señales de peligro, las células dendríticas experimentan procesos de maduración complejos y migran a los ganglios linfáticos regionales, donde forman sinapsis inmunológicas con células T y presentan péptidos derivados de antígenos recogidos en contexto con moléculas de CMH de clase I o II. La activación de células T CD4+ depende de la unión del complejo CMH-II, mientras que la interacción CD8+ depende de la unión de CMH-I.

El modelo de autorización de células dendríticas describe una ayuda indirecta por parte de células T CD4+ a las células T CD8+ mediante la activación mediada por interacción que permite a las células dendríticas proporcionar señales coestimuladoras. Por tanto, para una respuesta inmunitaria eficiente contra tumores, la ayuda por parte de células T CD4+ ha adquirido un papel esencial a medida que se conoce cada vez más sobre su importante papel para la expansión y generación de memoria de células T CD8+ específicas de antígeno. Además, dado que los antígenos tumorales son en su mayoría autoantígenos que no proporcionan ninguna “señal de peligro” como antígenos patógenos (por ejemplo, PAMP: patrones moleculares asociados a patógenos), la ayuda por parte de células T CD4+ es crucial para la inducción de una memoria de células T CD8+.

Kavanagh et al. (Blood, 107(5): 1963-1969) describen la expansión de células T CD4+ y CD8+ específicas de VIH mediante células dendríticas transfectadas con ARNm que codifica para Nef dirigido al citoplasma o al lisosoma.

El documento US 2005/112141 A1 se refiere a composiciones y a métodos para tratar un tumor o una enfermedad neoplásica en un huésped empleando conjugados que comprenden polipéptidos o ácidos nucleicos superantigénicos con otras estructuras que se unen preferentemente a células tumorales.

El documento EP 2700708 A2 describe métodos de potenciación in vitro e in vivo de la capacidad estimuladora de células T de DC humanas y el uso de los mismos en la vacunación contra el cáncer.

Como consecuencia, son necesarias vacunas de células dendríticas mejoradas que faciliten que el sistema inmunitario de un paciente pueda atacar a sus propias células tumorales y desarrollar inmunidad de larga duración. Se desea que la vacuna induzca una mayor proliferación de células T, una secreción de IFN-y inducida por la activación potenciada de las células T y una mayor capacidad de destrucción tumoral de las células T. Objetivos y sumario de la invención

Por tanto, un objetivo de la invención es proporcionar una vacuna de células dendríticas avanzada que permita la presentación del antígeno en el complejo c MH-II.

Por tanto, un primer aspecto de la invención contempla una composición de células dendríticas que comprende (i) células dendríticas que expresan al menos una proteína de fusión que comprende

- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno,

y

(ii) células dendríticas que expresan al menos un antígeno o un fragmento del mismo sin

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo, ni

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo,

en la que el antígeno de (i) y (ii) es el mismo antígeno,

en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y

en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.

Además, se desea la estimulación adicional de células T CD8+ específicas de antígeno para una respuesta inmunitaria mejorada.

Habitualmente, la proteína de fusión y el antígeno (que no está fusionado con una secuencia señal de direccionamiento) se expresan de manera transitoria o estable, preferiblemente se expresan de manera estable. Por ejemplo, la expresión transitoria puede llevarse a cabo mediante la introducción de ivt-ARN.

En algunas realizaciones, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica se deriva de DC-LAMP. Preferiblemente, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humana. Una realización se refiere a una composición de células dendríticas tal como se describe en el presente documento, en la que la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma. En una realización específica, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende la secuencia SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma.

La secuencia señal de translocación en el RE puede derivarse de una proteína asociada endosómica/lisosómica. Preferiblemente, la secuencia señal de translocación en el RE se deriva de LAMP1. Más preferiblemente, la secuencia señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma. En algunas realizaciones, las células dendríticas son células dendríticas maduras generadas mediante un método que comprende las siguientes etapas:

(i) suministro de monocitos;

(ii) incubación de los monocitos de la etapa i) con IL-4 y GM-CSF;

(iii) incubación de los monocitos de la etapa ii) con IL-4 y GM-CSF en combinación con un cóctel de maduración.

Por ejemplo, el cóctel de maduración comprende una combinación de IL-p, TNF-a, IFN-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y agonista de TLR3. La incubación de la etapa ii) puede durar al menos 2 días. La incubación de la etapa iii) puede durar al menos 12 horas, preferiblemente 24 horas. Preferiblemente, el agonista de TLR7/8 es R848 y el agonista de TLR3 es poli(I:C).

En realizaciones específicas, el antígeno es MELAN-A.

Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna de células dendríticas que comprende la composición de células dendríticas tal como se describe en el presente documento. Preferiblemente, las células dendríticas son células autólogas.

Normalmente, la composición de células dendríticas y la vacuna de células dendríticas son composiciones fluidas farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición de células dendríticas según la invención o a una vacuna de células dendríticas según la invención para su uso como medicamento.

Una realización de la invención se refiere a una vacuna de células dendríticas tal como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de cáncer.

Realizaciones específicas se refieren a una composición de células dendríticas o a una vacuna de células dendríticas según la invención para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a melanoma. En una realización específica, el antígeno asociado a melanoma es MELAN-A.

Leyendas de las figuras

Figura 1: visión general experimental del procedimiento de vacunación.

El día 1, se injertaron cada uno de los 16 ratones divididos en cuatro grupos diferentes con 10 * 106 millones de PBMC humanas de un donante sano positivo para HLA-A*02:01. Se reconstituyó el repertorio de células T periféricas en el plazo de los siguientes 14 días. Se aplicó la vacunación el día 14 y el día 21, administrando 1 * 106 células dendríticas maduras transfectadas o bien con ivt-ARN convencional (2) o bien con CrossTAg-ivt-ARN (3). Además, un grupo recibió una mezcla 1:1 de células dendríticas maduras transfectadas o bien con CrossTAg o bien con ivt-ARN convencional (4). El grupo de control no se vacunó (1). El día 28, se aislaron células esplénicas y se seleccionaron para detectar células T CD8+ específicas de Melan-A mediante tinción con multímero usando un multímero de específico de HLA-A*02:01-Melan-A. Las células esplénicas restantes se reestimularon in vitro con células dendríticas apropiadas y se expandieron durante otros 10 días. Las células esplénicas aisladas del grupo de control recibieron sólo IL-2 humana durante el cultivo in vitro adicional. El día 38, se llevaron a cabo la cuantificación de células T CD8+ específicas de Melan-A y pruebas de funcionalidad, como ensayos de secreción de IFN-y y ensayos de citotoxicidad.

Figura 2: maduración y electroporación de células dendríticas.

Las células dendríticas maduras usadas para la vacunación el día 14 (1. vacunación) y el día 21 (2. vacunación) se generaron mediante el aislamiento de monocitos de un donante sano de sangre HLA-A*02:01 que luego se maduraron siguiendo el protocolo de DC de 3 d que comprende IL,-p, TNF-a, IFN-y, el agonista de TLR7/8 R848, PGE2 y TLR3. (A) Para verificar el estado de maduración, se tiñeron las células dendríticas con anticuerpos monoclonales que se unen a diferentes marcadores de superficie específicos para células o bien maduras (CD80, CD83, CD86, CD40, CCR7, CD209 y HLA-DR) o bien inmaduras (Cd 14) y se analizaron mediante análisis de FACS. Los anticuerpos de control de isotipo sirvieron como control negativo. (B) Antes de la administración, se transfectaron las células dendríticas maduras o bien con CrossTAg-Melan-A o bien con Melan-A-ivt-ARN convencional. Después de 6 horas de incubación, se validó la expresión de Melan-A mediante tinción intracelular (CPA) de la proteína Melan-A.

Figura 3: tinción con multímero de esplenocitos expandidos in vitro aislados.

(A) Ilustración esquemática de tinciones con multímero: las moléculas de CMH (HLA-A*02:01) están unidas entre sí y marcadas mediante un marcador de fluorescencia (ficoeritrina, PE). Para comparar la eficiencia de inducción de las diferentes vacunas de DC, se tuvieron en cuenta células doblemente positivas para CD8 y multímero. Se midió el número de células T CD8+ específicas de Melan-A en poblaciones esplénicas (B) ex vivo y después de (C) expansión in vitro durante otros 10 días con células dendríticas correspondientes e IL-2 (el grupo de control sólo se trató con IL-2). Se tiñeron las células con HLA-A*02:01-Melan-A-multímero y anticuerpos monoclonales contra CD8. Cada gráfico resume el porcentaje de células T CD8+ específicas de Melan-A de cada receptor NSG en un experimento a modo de ejemplo. Se analizaron 3 experimentos individuales con un total de 16 ratones por experimento.

Figura 4: capacidad de secreción de citocinas por células T CD8+ específicas de Melan-A.

(A) Se investigó la reactividad de células T CD8+ específicas de Melan-A mediante la secreción de IFN-y 10 días después de la reestimulación in vitro de los esplenocitos. Se cultivaron conjuntamente los esplenocitos expandidos a una razón 1:1 con células diana durante 24 horas. Las células diana aplicadas fueron células K562 (negativas para CMH-I y CMH-II), K562-A2 (HLA-A02:01+) incubadas con o sin Melan-A-péptido durante 2 horas y Mel624.38 (HLA-A02:01+, Melan-A+). Se detectó el número de puntos de IFN-y con un lector de ELISpot (C.T.L.). Cada punto de dato mostrado en el gráfico representa el número de puntos de FN-g de células T activadas derivadas de un ratón. Se analizaron tres experimentos individuales con un total de 16 ratones en cada experimento (se muestra un experimento a modo de ejemplo). (B) Se analizó la expresión de CMH-I y CMH-II en la línea de células diana Mel624.38 usando anticuerpos monoclonales panCMH-I o panCMH-II. La línea celular linfoblastoidea (mLCL) transformada con mini-virus Epstein-Barr (VEB) sirvió como control positivo, las células sin tinción funcionaron como control negativo.

Figura 5: capacidad de destrucción de esplenocitos expandidos.

Se marcaron las células diana con cromo radiactivo, que puede detectarse en el sobrenadante si las células se lisaron. Se usaron diferentes líneas celulares tumorales como células diana. Se cultivaron conjuntamente los esplenocitos expandidos a diferentes razones con células diana (esplenocitos:CPA = 80:1; 40:1; 20:1; 10:1) durante 4 horas antes de medir el cromo radiactivo liberado en los sobrenadantes. Se aplicaron diversas células diana: para visualizar la actividad de células NK dentro de la población de esplenocitos, se eligieron K562 (CMH-I-/-II-). Como controles positivos se usaron K562-A2 (Melan-A-, HLA-A*02:01+) cargadas con Melan-A-péptido o Mel624.38 (Melan A+, HLA-A*02:01+). MelA375 (Melan A-, HLA-A*02:01+) sirvió como control negativo. Cada punto de dato mostrado en el gráfico representa el valor medio mostrado con desviación estándar calculado a partir de dos valores medidos. Se analizaron tres experimentos individuales con un total de 16 ratones en cada experimento (se muestra un experimento a modo de ejemplo).

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la invención con detalle con respecto a algunas de sus realizaciones preferidas, se proporcionan las siguientes definiciones generales.

La presente invención, tal como se describe de manera ilustrativa a continuación, puede practicarse de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no dados a conocer específicamente en el presente documento.

La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y con referencia a determinadas figuras, sin embargo, la invención no se limita a las mismas, sino únicamente por las reivindicaciones.

Cuando se usa el término “que comprende” en la presente descripción y las reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente invención, se considera que el término “que consiste en” es una realización preferida del término “que se compone de”. Si a continuación en el presente documento se define un grupo para comprender al menos un determinado número de realizaciones, también debe entenderse que esto da a conocer un grupo que consiste preferiblemente sólo en estas realizaciones.

Cuando se usa un artículo indefinido o definido cuando se hace referencia a un sustantivo en singular, por ejemplo, “un”, “uno/una” o “el/la”, este incluye el plural de ese sustantivo a menos que se indique específicamente algo más.

Tal como se usa en el presente documento, el término “expresión” se refiere al proceso mediante el cual se produce un polipéptido basándose en la secuencia de ácido nucleico de un gen. Por consiguiente, el término proteína o polipéptido “expresado” comprende, sin limitación, proteínas o polipéptidos intracelulares, transmembrana y secretados.

Los términos técnicos se usan por su sentido común. Si se transmite un significado específico a determinados términos, se proporcionarán las definiciones de los términos a continuación en el contexto en el que se usan los términos.

Un aspecto de la presente invención se refiere a una composición de células dendríticas que comprende células dendríticas que expresan un antígeno o fragmento del mismo, en la que el antígeno o fragmento del mismo está fusionado con una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II del antígeno o fragmento del mismo.

Más específicamente, la presente invención se refiere a una composición de células dendríticas que comprende (i) células dendríticas que expresan al menos una proteína de fusión que comprende

- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo, y

y

en la que el antígeno de (i) y (ii) es el mismo antígeno,

en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y

en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.

El fragmento puede ser una secuencia del antígeno que es específica para este antígeno, es decir, no se produce en otra proteína ni en otro péptido de un mamífero, especialmente de un ser humano. El fragmento puede ser más corto que la secuencia del antígeno, tal como al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 30%, al menos el 50%, al menos el 70%, al menos el 90% más corta que el antígeno. El fragmento tiene una longitud de al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o más aminoácidos.

La administración de una composición de células dendríticas que comprende células dendríticas que expresan el antígeno fusionado con una secuencia señal de direccionamiento conduce a un aumento de células T CD8+ específicas de antígeno en comparación con la administración de una composición de células dendríticas que comprende células dendríticas que expresan el antígeno convencional sin fusión a una secuencia señal de direccionamiento. Por tanto, las células dendríticas que expresan el antígeno fusionado con una secuencia señal de direccionamiento proporcionan una capacidad de inducción superior, una capacidad mejorada de secreción de IFN-y tras la estimulación y una alta capacidad de destrucción en comparación con las células dendríticas que expresan únicamente el antígeno convencional sin fusión a una secuencia señal de direccionamiento.

En una realización preferida, el antígeno de (i) y (ii) es el mismo antígeno. Por ejemplo, esto significa que una realización específica de la invención se refiere a una composición de células dendríticas que comprende (i) células dendríticas que expresan al menos una proteína de fusión que comprende

- antígeno MELAN-A o un fragmento del mismo,

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno MELAN-A o un fragmento del mismo, y

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno MELAN-A o un fragmento del mismo, y (ii) células dendríticas que expresan el antígeno MELAN-A o un fragmento del mismo sin

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno MELAN-A o fragmento del mismo, ni

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno MELAN-A o fragmento del mismo. La administración de una mezcla de células dendríticas que expresan el antígeno fusionado con una secuencia señal de direccionamiento y células dendríticas que expresan el antígeno sin fusión a una secuencia señal de direccionamiento conduce a un aumento de células T CD8+ específicas de antígeno. Por tanto, dicha mezcla proporciona una capacidad de inducción superior en comparación con células dendríticas que expresan únicamente el antígeno sin fusión a una secuencia señal de direccionamiento o células dendríticas que expresan únicamente el antígeno con fusión a una secuencia señal de direccionamiento. La mezcla también mostró una alta capacidad de secreción de IFN-y tras la estimulación y una alta capacidad de destrucción.

El antígeno, ya sea con o sin fusión a una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II puede introducirse en las células dendríticas, por ejemplo, por medio de expresión transitoria o expresión estable. Dicho de otro modo, la expresión del antígeno, que tiene o no fusión a una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II, puede tener expresión transitoria o expresión estable. En realizaciones preferidas, la expresión es expresión transitoria, por ejemplo, mediante la introducción de ivt-ARN que codifica para la al menos una proteína de fusión. La expresión de ivt-ARN tiene la ventaja de que puede producirse rápidamente ivt-ARN con calidad controlada y no porta contaminantes proteicos inmunogénicos.

La secuencia señal de translocación en el RE puede derivarse de una proteína asociada endosómica/lisosómica. La secuencia señal de translocación en el RE usada en el método dado a conocer puede ser la secuencia de clasificación de una proteína ubicada endosómica/lisosómica. Las proteínas ubicadas endosómicas/lisosómicas, tal como se usa en el presente documento, se refieren a proteínas que se ubican en la membrana o la luz de los endosomas y/o los lisosomas de una célula.

Los ejemplos de proteínas ubicadas endosómicas o lisosómicas son glicosidasas tales como, alfa-galactosidasa A/GLA, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa H/Endo H, alfa-N-acetilgalactosaminidasa/NAGA, galactosilceramidasa/GALC, alfa-N-acetilglucosaminidasa/NAGLU, glucosilceramidasa/GBA, alfagalactosidasa/a-Gal, heparanasa/HPSE, alfa-L-fucosidasa, heparinasa I, alfa-L-fucosidasa tisular/FUCAl, heparinasa II, beta-galactosidasa-1/GLB1, heparinasa III, beta-glucuronidasa/GUSB, hexosaminidasa A/HEXA, beta (1-3)-galactosidasa, hialuronato liasa, beta (1-4)-galactosidasa, hialuronidasa 1/HYAL1, quitinasa 1 similar a 3, hialuronidasa 4/HYAL4, quitinasa 2 similar a 3, alfa-L-iduronidasa/IDUA, quitinasa 3 similar a 3/ECF-L, quitobiasa/CTBS, quitotriosidasa/CHIT1, proteína similar a lactasa/LCTL, condroitina B liasa/condroitinasa B, alfa-glucosidasa lisosómica, condroitinasa ABC, MBD4, condroitinasa AC, NEU-1/sialidasa-1, beta-glucosidasa citosólica/GBA3, O-GlcNAcasa/OGA, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa F1/Endo F1, PNGasa F, endo-beta-N-acetilglucosaminidasa F3/Endo F3, SPAM1; proteasas lisosómicas tales como, AMSH/STAMBP, catepsina H, catepsina 3, catepsina K, catepsina 6, catepsina L, catepsina 7/catepsina 1, catepsina O, catepsina A/carboxipeptidasa A lisosómica, catepsina S, catepsina B, catepsina V, catepsina C/DPPI, catepsina X/Z/P, catepsina D, galactosilceramidasa/GALC, catepsina F, oegumaína/asparaginilendopeptidasa; sulfatasas tales como arilsulfatasa A/ARSA, iduronato 2-sulfatasa/IDS, arilsulfatasa B/ARSB, N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa/GALNSv, arilsulfatasa G/ARSG, sulfamidasa/SGSH, glucosamina (N-acetil)-6-sulfatasa/GNS, sulfatasa-2/SULF2; u otras proteínas lisosómicas tales como BAD-LAMP/LAMP5; hialuronidasa 1/HYAL1; CD63; LAMP1/CD107a; CD-M6PR; LAMP2/CD107b; cadena pesada 1 de clatrina/CHC17; Rab27a; cadena pesada 2 de clatrina/CHC22; UNC13D, CD68, CD1b o DC-LAMP.

La secuencia señal de translocación en el RE puede derivarse de una proteína asociada endosómica/lisosómica. La proteína asociada endosómica/lisosómica puede ser LAMP1, LAMP2, DC-LAMP, CD68 o CD1b, preferiblemente LAMP1. Preferiblemente, la señal de translocación en el RE es humana. La secuencia señal de translocación en el RE puede comprender la secuencia de al menos una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, la secuencia señal de translocación en el RE puede comprender la secuencia de al menos una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, la secuencia señal de translocación en el RE puede consistir en una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13. En realizaciones específicas, la secuencia señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma. En más realizaciones específicas, la secuencia señal de translocación en el RE consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2.

La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMP, preferiblemente DC-LAMP. La secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es normalmente una parte de un dominio transmembrana y citoplásmico. Por tanto, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede derivarse de LAMP1 o DC-LAMp , preferiblemente DC-LAMP. Preferiblemente, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humana. Normalmente, la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende el motivo Y-XX seguido por un aminoácido hidrófobo (SEQ ID NO: 4). Preferiblemente, la secuencia señal de direccionamiento endosómica/lisosómica es YQRI (SEQ ID NO: 5). Por ejemplo, el dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma.

Un experto conoce bien el término aminoácido hidrófobo. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos son Ala, Ile, Leu, Phe, Val, Pro, Gly, Met, Trp, Tyr, Pro, Cys.

Las células dendríticas pueden comprender diferentes poblaciones de células presentadoras de antígeno, expresando cada población una proteína de fusión de antígeno diferente.

Normalmente, las células dendríticas son células dendríticas maduras generadas mediante un método que comprende las siguientes etapas: i) suministro de monocitos; ii) incubación de los monocitos de la etapa i) con IL-4 y GM-CSF; iii) incubación de los monocitos de la etapa ii) con IL-4 y GM-CSF en combinación con un cóctel de maduración.

El cóctel de maduración puede comprender al menos uno de los componentes seleccionados del grupo que consiste en IL-p, TNF-a, IFN-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y agonista de TLR3, o una combinación de los mismos. El agonista de TLR7/8 puede ser R848 o CL075. El agonista de TLR3 puede ser poli(I:C). Por ejemplo, el cóctel de maduración puede comprender una combinación de IFN-y, agonista de TLR7/8, PGE2, tal como una combinación de IFN-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y agonista de TLR3. En una realización específica, el cóctel de maduración puede comprender una combinación de IL-p, TNF-a, IFN-y, agonista de TLR7/8 y PGE2. En otra realización específica, el cóctel de maduración puede comprender una combinación de IL-p, TNF-a, IFN-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y agonista de TLR3. La invención también se refiere a cócteles de maduración tal como se describe en el presente documento. Además, la invención también se refiere a la maduración in vitro de al menos una célula dendrítica inmadura, que comprende la estimulación de al menos una célula dendrítica inmadura con los cócteles de maduración tal como se describe en el presente documento.

La incubación de la etapa ii) puede durar al menos 2 días. La incubación de la etapa iii) puede durar al menos 12 horas, preferiblemente 24 horas.

El antígeno tumoral puede seleccionarse del grupo que consiste en antígeno tumoral viral, antígeno específico de tumor, antígeno asociado a tumor y un antígeno que porta mutaciones específicas del paciente y que se expresa en células tumorales del paciente. Preferiblemente, el antígeno que porta mutaciones específicas del paciente y que se expresa en células tumorales del paciente no se expresa en células no cancerosas del paciente.

Los antígenos tumorales virales, que también se denominan antígenos virales oncogénicos, son antígenos de virus oncogénicos, tales como los virus oncogénicos del ADN, por ejemplo, virus tales como el virus de la hepatitis B, el virus del herpes y el virus del papiloma, y virus oncogénicos del ARN. Los antígenos específicos de tumor se refieren a mutaciones asociadas a tumor que se expresan exclusivamente por células tumorales. El grupo de antígenos asociados a tumor comprende, por ejemplo, antígenos de cáncer de testículo específicos de tejido o antígenos de diferenciación tisular tales como MART-1 (MELAN-A), tirosinasa o CD20. El antígeno tumoral puede ser un antígeno asociado a tumor, opcionalmente el antígeno asociado a tumor es un antígeno de cáncer de testículo (antígeno C/T). El antígeno C/T puede seleccionarse del grupo que comprende miembros de la familia MAGE, por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, pero sin limitarse a los mismos, antígenos tumorales que comprenden mutaciones puntuales, NY-ESO1, antígeno de tumor de testículo 1B, GAGE-1, SSX-4, XAGE-1, BAGE, GAGE, SCP-1, SSX-2, SSX-4, CTZ9, CT10, SAGE y CAGE. Preferiblemente, el antígeno C/T puede seleccionarse del grupo que consiste en GAGE-1, SSX-4 y XAGE-1. Preferiblemente, el antígeno tumoral es un antígeno de diferenciación tisular tal como MART-1, tirosinasa o CD20.

Más preferiblemente, el antígeno tumoral es MART-1, que también se conoce como MELAN-A. Por tanto, en realizaciones específicas, la invención se refiere a una composición de células dendríticas que comprende células dendríticas que expresan al menos una proteína de fusión que comprende

- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo; en la que la proteína de fusión es MELAN-A.

Realizaciones específicas de la invención se refieren a una composición de células dendríticas que comprende células dendríticas que expresan al menos un antígeno o un fragmento del mismo, en la que el antígeno no está fusionado con una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II del antígeno o fragmento del mismo, en la que dichas células dendríticas no expresan un antígeno o fragmento del mismo, en la que el antígeno está fusionado con una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II del antígeno o fragmento del mismo, en la que el antígeno es MELAN-A.

En realizaciones específicas, la composición de células dendríticas comprende (i) células dendríticas que expresan al menos un antígeno que está fusionado con una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II del antígeno o fragmento del mismo y (ii) células dendríticas que expresan al menos un antígeno o fragmento del mismo que no está fusionado con una secuencia señal de direccionamiento que fomenta la presentación de CMH-II del antígeno o fragmento del mismo y células dendríticas, en la que el antígeno es MELAN-A.

Por tanto, la invención también se refiere a la composición de células dendríticas para su uso como medicamento. También se contempla una vacuna de células dendríticas para su uso como medicamento.

Otro aspecto de la invención se refiere a la composición de células dendríticas para su uso en el tratamiento de cáncer. Realizaciones específicas se refieren a la composición de células dendríticas para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a melanoma.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a la vacuna de células dendríticas para su uso en el tratamiento de cáncer. Realizaciones específicas se refieren a la vacuna de células dendríticas para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a melanoma.

El perfil de activación del tratamiento con la composición de la invención puede determinarse, por ejemplo, midiendo la liberación de citocinas inducida por activación o la capacidad de destrucción dirigida a antígeno de células T aisladas de un organismo al que se le administra la composición de células dendríticas de la invención. Para medir la secreción de citocinas inducida por activación, las células T pueden cultivarse conjuntamente con células dendríticas cargadas con antígeno. Pueden emplearse diferentes razones de células efectoras con respecto a células diana (E:T). Pueden usarse células T incubadas con presentación de antígeno de control, es decir, CPA transfectadas con simulación, o en ausencia de células estimulantes como controles negativos. Los sobrenadantes de cultivo se evalúan mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) convencional. Los ejemplos de marcadores son, sin limitación, la secreción de factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón-y (IFN-y), IL-2 y TNF-a. La secreción de IFN-y, IL-2 y TNF-a tras el encuentro con el antígeno se correlaciona con una función antitumoral potenciada y, por tanto, es particularmente útil cuando se mide la secreción de citocinas inducida por antígenos de células T citotóxicas CD8+. Además, IFN-y y el factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) son citocinas bien definidas para la evaluación de clones de células T polarizadas con células T cooperadoras 1 (Th1) CD4+ específicas de antígeno.

La actividad citotóxica de células T activadas por la población de células dendríticas de la invención puede medirse, por ejemplo, mediante ensayos de liberación de cromo. En tales ensayos, se marcan células diana con cromo radiactivo y se exponen a células T. Tras la destrucción, se libera cromo radiactivo en el sobrenadante y puede detectarse en el plazo de 4 horas después del inicio del cultivo conjunto. La liberación específica de cromo se normaliza con respecto a la liberación espontánea evaluada incubando células diana en ausencia de células efectoras. Por consiguiente, altas cantidades de cromo en el sobrenadante se correlacionan con una excelente actividad de células T citolíticas. Los ensayos de liberación de cromo se realizan preferiblemente para seleccionar células T CD8+ específicas de antígeno tumoral.

Las células presentadoras de antígeno derivadas de donante pueden ser, por ejemplo, monocitos aislados que se maduran para dar células dendríticas. Las células dendríticas maduradas muestran una capacidad de activación óptima.

Normalmente, las células dendríticas son células autólogas, es decir, células obtenidas de un paciente que se tratan según las enseñanzas de la invención y luego se administran al mismo paciente. Por ejemplo, los monocitos se aíslan de un paciente, se maduran para dar células dendríticas y se tratan tal como se describe en el presente documento para expresar el antígeno deseado y luego se administran al mismo paciente.

La presente invención también se refiere a una vacuna de células dendríticas que comprende la composición de células dendríticas tal como se describe en el presente documento.

Los componentes activos de la presente invención, tal como la composición de células dendríticas, se usan preferiblemente en una composición farmacéutica, en dosis mezcladas con un portador o material portador aceptable, para que la enfermedad pueda tratarse o al menos aliviarse. Una composición de este tipo puede incluir (además del componente activo y el portador) material de carga, sales, tampón, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales, que se conocen en el estado de la técnica.

El término “farmacéuticamente aceptable” define un material no tóxico, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del componente activo, es decir, las células dendríticas de la invención. La elección del portador depende de la aplicación.

La composición farmacéutica puede contener componentes adicionales que potencian la actividad del componente activo o que complementan al tratamiento. Tales componentes y/o factores adicionales pueden formar parte de la composición farmacéutica para lograr efectos sinérgicos o para minimizar efectos adversos o no deseados.

Las técnicas para la formulación o preparación y aplicación/medicación de componentes activos de la presente invención se publican en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, edición más reciente. Una aplicación apropiada es una aplicación parenteral, por ejemplo, inyecciones intradérmicas, intramusculares, subcutáneas, intramedulares así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraganglionares, intraperitoneales o intratumorales. La inyección intravenosa es el tratamiento preferido de un paciente.

La composición farmacéutica puede ser una composición inyectable, es decir, una composición fluida farmacéuticamente aceptable que comprende al menos un principio activo, por ejemplo, una composición de células dendríticas de la invención. El principio activo se disuelve o suspende habitualmente en un portador fisiológicamente aceptable y la composición puede comprender adicionalmente cantidades menores de una o más sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes emulsionantes, conservantes y agentes reguladores del pH, y similares. Tales composiciones inyectables que son útiles para su uso con las células dendríticas de esta divulgación son convencionales; los expertos habituales en la técnica conocen bien las formulaciones apropiadas.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por las vías intraarticular (en las extremidades), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intracutánea, intraperitoneal y subcutánea (preferiblemente intradérmica, intraganglionar, intracutánea o subcutánea) incluyen disoluciones de inyección estériles isotónicas acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos, que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. La administración intradérmica, intracutánea, subcutánea o intraganglionar son el método de administración preferido para las células dendríticas de la invención.

La dosis de las células dendríticas administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica beneficiosa en el paciente con el tiempo, o para inhibir el crecimiento de células cancerosas, o para inhibir una infección. Por tanto, las células se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta de CTL eficaz al virus o al antígeno tumoral y/o para aliviar, reducir, curar o al menos detener parcialmente los síntomas y/o las complicaciones de la enfermedad o infección. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como “dosis terapéuticamente eficaz”. La dosis se determinará por la actividad producida por la célula dendrítica y el estado del paciente. El tamaño de la dosis también se determinará por la existencia, la naturaleza y el grado de cualquier efecto secundario adverso que acompañe a la administración de una célula particular en un paciente particular. En la determinación de la cantidad eficaz de la célula que va a administrarse en el tratamiento o la profilaxis de enfermedades tales como cáncer, el médico necesita evaluar la toxicidad de CTL, la progresión de la enfermedad y la inducción de respuesta inmunitaria contra cualquier tipo de célula introducida.

Antes de la administración, se obtienen muestras de sangre y se guardan para su análisis. Generalmente, se administran de aproximadamente 104 a 106 y más preferiblemente de 106 a 1010 células a un paciente de 70 kg en forma de un única dosis o múltiples dosis mediante inyección intracutánea, intraganglionar, subcutánea o intradérmica. Preferiblemente, se usan números de células de al menos 2*106-107 por vacunación. Las inyecciones pueden administrarse una vez a la semana durante un periodo de 4 semanas seguido por 1 administración/inyección al mes y deben administrarse preferiblemente cerca de los ganglios linfáticos, directamente en los ganglios linfáticos o mediante inyecciones intradérmicas, intracutáneas o subcutáneas. Pueden realizarse adicionalmente inyecciones de refuerzo. Tal como se indica, las reinfusiones de células se repiten preferiblemente cada mes durante un total de 10-12 tratamientos en un periodo de un año. Después del primer tratamiento, las infusiones pueden realizarse de forma ambulatoria a criterio del médico. Si la reinfusión se administra de forma ambulatoria, el participante se monitoriza durante al menos 4 horas tras la terapia.

La composición de células dendríticas/vacuna de células dendríticas puede administrarse al menos una vez, al menos dos veces, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10 veces. La vacuna puede administrarse no más de 15 veces, 18 veces, 20 veces, 25 veces, 30 veces. El intervalo entre las administraciones es de al menos 3 días, al menos 7 días, al menos 14 días o al menos 4 semanas. Preferiblemente, la vacuna se administra una vez a la semana durante un periodo de 4 semanas seguido por 1 administración al mes durante un total de 10 a 12 tratamientos.

Para la administración, las células de la presente invención pueden administrarse a una tasa determinada por la DL-50 (u otra medición de toxicidad) del tipo de célula y los efectos secundarios del tipo de célula a diversas concentraciones, según se aplique para la masa y la salud general del paciente. La administración puede lograrse mediante dosis únicas o divididas. Las células de esta invención pueden complementar a otros tratamientos para un estado mediante terapia convencional conocida, incluyendo agentes citotóxicos, análogos de nucleótidos y modificadores de la respuesta biológica. De manera similar, se añaden opcionalmente modificadores de la respuesta biológica para el tratamiento mediante las células dendríticas.

La invención también se refiere a una composición, que comprende

a) un vector de expresión que codifica para un polipéptido que comprende

- una secuencia señal de translocación en el RE humana precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo,

- un dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo, y

- al menos un antígeno o fragmento del mismo; y

b) un vector de expresión que codifica para un polipéptido que comprende al menos un antígeno o fragmento del mismo, sin

en la que el antígeno de (a) y (b) es el mismo antígeno,

en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y

en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.

La invención se refiere además a un kit, que comprende:

a) un vector de expresión que codifica para un polipéptido que comprende

- al menos un antígeno o fragmento del mismo; y

b) un vector de expresión que comprende al menos un antígeno o fragmento del mismo sin

en la que el antígeno de (a) y (b) es el mismo antígeno,

en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y

en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.

Un “vector” es cualquier molécula o composición que tiene la capacidad de transportar una secuencia de ácido nucleico a una célula huésped adecuada en la que puede tener lugar la síntesis del polipéptido codificado. Normalmente, y preferiblemente, un vector es un ácido nucleico que se ha modificado por ingeniería usando técnicas de ADN recombinante que se conocen en la técnica para incorporar una secuencia de ácido nucleico deseada (por ejemplo, un ácido nucleico de la invención). El vector puede comprender ADN o ARN y/o comprender liposomas. El vector puede ser un plásmido, vector lanzadera, fagémido, cósmido, vector de expresión, vector retroviral, vector adenoviral o una partícula y/o un vector que va a usarse en terapia génica. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionable y otros elementos genéticos conocidos por los expertos habituales en la técnica. Un vector es preferiblemente un vector de expresión que incluye un ácido nucleico según la presente invención unido operativamente a secuencias que permiten la expresión de dicho ácido nucleico.

Ejemplos

1.1 Activación de células T CD8+ específicas de Melan-A en un modelo de ratón NSG

Para desarrollar un modelo de ratón humanizado para estudiar la vacunación con DC in vivo, se usaron ratones NOD-scid/ N2ry-/-(NSG) xenoinjertados con PBMC humanas. Dado que los ratones NSG son inmunodeficientes (carecen de células NK, T y B) (SPRANGER, S. et al. 2012. NOD/scid IL-2Rg(null) mice: a preclinical model system to evaluate human dendritic cell-based vaccine strategies in vivo. J Transl Med, 10, 30.), el nicho resultante en la población de células inmunitarias permite un injerto muy eficiente con PBMC humanas (SHULTZ, et al. 2007. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Rev Immunol, 7, 118-30.).

Se dividieron 16 ratones NSG receptores en cuatro grupos y se les injertó con PBMC HLA-A*02:01 humanas a lo largo de 14 días. La vacunación de los ratones en los diferente grupos consistió en dos inyecciones intravenosas de células dendríticas maduras autólogas recién preparadas sometidas a electroporación o bien con CrossTAg-Melan-A-ivt-ARN, con Melan-A-ivt-ARN convencional o bien mezcladas con ivt-ARN administradas dos veces con un intervalo de una semana entre inyecciones. Después de siete días adicionales y después de una reestimulación in vitro posterior, se analizaron las poblaciones esplénicas mediante FACS para enumerar las células T CD8+ específicas de Melan-A. También se analizaron la citotoxicidad y la capacidad de secretar IFN-y de células T específicas de Melan-A de los 4 grupos mediante ensayos de liberación de cromo y ELISpot (figura 1).

1.2 Estado de maduración y expresión de Melan-A de células dendríticas maduras transfectadas

Se aislaron monocitos derivados de un donante HLA-A*02:01 sano y se maduraron tal como se describe en Spranger et al. (2010. Generation of Thl-polarizing dendritic cells using the TLR7/8 agonist CL075. J Immunol, 185, 738-47) in vitro en el plazo de 3 días. Para verificar la maduración in vitro de células dendríticas para la última administración a ratones humanizados in vivo, se determinó la expresión de moléculas de la superficie celular expresadas normalmente en células dendríticas inmaduras y en células dendríticas maduras mediante análisis de FACS (Burdek et al. 2010. Three-day dendritic cells for vaccine development: antigen uptake, processing and presentation. J Transl Med, 8, 90). Las células dendríticas analizadas expresaron un fenotipo maduro (figura 2A). Se transfectaron las células dendríticas maduras o bien con CrossTAg-Melan-A o bien con Melan-A-ivt-ARN convencional tras las condiciones de electroporación para células dendríticas maduras de 3 d (Burdek et al., 2010). Se examinó la eficiencia de transfección (6 horas después de la electroporación) mediante tinción intracelular de proteína Melan-A con anticuerpos monoclonales (figura 2B).

1.3 Cuantificación de células T CD8+ específicas de Melan-A

Se vacunaron dos veces ratones reconstituidos, con un intervalo de una semana, antes de aislar y analizar las células esplénicas. Para comparar la eficiencia de inducción de las diferentes vacunas de DC, se detectó el número de células T CD8+ específicas de Melan-A mediante un multímero HLA-A*02:01 marcado con fluorescencia cargado con un epítopo de Melan-A (figura 3A).

El análisis ex vivo de células esplénicas ya reveló un mayor número de células T CD8+ específicas de Melan-A en el grupo de CrossTAg-DC o grupo mixto en comparación con el grupo de DC convencionales, que sólo mostró un número ligeramente mayor de células específicas en comparación con el grupo de control. Además, se detectó un porcentaje significativamente mayor de células T CD8+ en el grupo de CrossTAg en comparación con el grupo convencional (figura 3B). Posteriormente, se expandieron adicionalmente los esplenocitos restantes in vitro mediante células dendríticas transfectadas con Melan-A y hIL-2, mientras que el grupo de control sólo se trató con hIL-2. El reanálisis de células expandidas demostró una discrepancia incluso más clara entre células dendríticas que contienen CrossTAg-Melan-A y células dendríticas con Melan-A convencionales en cuanto al número promedio de células T CD8+ específicas de Melan-A. Pudo observarse un número significativamente más grande de células T CD8+ específicas de Melan-A en el grupo de CrossTAg en comparación con el grupo convencional (figura 3C). Por tanto, la vacunación con células dendríticas cargadas con CrossTAg-Melan-A-ivt-ARN dio como resultado una capacidad de inducción superior, demostrada por la mayor proliferación de células T CD8+ específicas de Melan-A. Se demuestra una capacidad de inducción incluso más fuerte para la vacunación con una combinación de células dendríticas cargadas con CrossTAg-Melan-A-ivt-ARN y células dendríticas cargadas con Melan-A-ivt ARN sin fusión con CrossTAg.

1.4 Análisis funcional de células T CD8+ específicas de Melan-A inducidas

Se demostró una eficiencia de inducción superior de células T CD8+ específicas de antígeno por células dendríticas transfectadas con CrossTAg, lo que indica un claro beneficio de constructos de ARN que incluyen secuencias de CrossTAg flanqueantes con el antígeno diana. Para el establecimiento de una memoria de células T CD8+ así como para una regresión tumoral exitosa se ha mostrado previamente un papel fundamental de las células T CD4+ (Mortenson, et al. 2013. Effective anti-neu-initiated antitumor responses require the complex role ot CD4+ T cells. Clin Cancer Res, 19, 1476-86; Rosenberg et al. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat Med, 10, 909-15). Por tanto, la respuesta inmunitaria potenciada inducida en ratones NSG vacunados con células dendríticas que contienen CrossTAg-Melan-A podría explicarse por la ayuda por parte de células T CD4+ habilitada proporcionada por las secuencias de CrossTAg que conducen a la presentación de Melan-A en CMH-I y CMH-II.

Para examinar adicionalmente la funcionalidad de las células T inducidas, la siguiente cuestión importante a aclarar fue si las células T CD8+ específicas de Melan-A inducidas también podían secretar IFN-y, que es crítico para una respuesta inmunitaria apropiada. Por tanto, se analizó la capacidad de células T CD8+ específicas de Melan-A para secretar IFN-y tras la estimulación. Se cultivaron conjuntamente esplenocitos expandidos in vitro con diversas líneas celulares tumorales como células estimulantes para evaluar la secreción de IFN-y. Se encontró que los esplenocitos sin estimular no eran reactivos en absoluto. Se determinó la actividad de células NK, dentro de la población de esplenocitos, usando la línea celular tumoral negativa para HLA, K562, dado que las células NK se activan por células diana que carecen de cualquier molécula de CMH. No se detectó actividad de células NK. Sólo las células estimuladoras que expresaban Melan-A o cargadas con péptido específico condujeron a una fuerte activación de esplenocitos, mientras que las células negativas para Melan-A no estimularon los esplenocitos. En promedio, pudieron detectarse más puntos de IFN-y a partir de células T CD8+ aisladas del grupo de CrossTAg o mixto en comparación con el grupo convencional o el grupo de control (figura 4A).

Para abordar la cuestión de si la reactividad observada en el ensayo ELISpot podía rastrearse de nuevo también para células T CD8+ y no para células T CD4+, se examinó la expresión de CMH-II en las células estimuladoras. La línea de células estimuladoras era positiva para CMH-I pero no para CMH-II (figura 4B). Incluso después del tratamiento con IFN-y de células estimuladoras durante la noche no condujo a una expresión inducida de moléculas de CMH-II (datos no mostrados). Por tanto, sólo pudieron activarse células T restringidas por CMH-I, lo que indica que la reactividad observada procedía de células T CD8+ activadas, dado que las células T CD4+ requerirían una presentación de antígeno en CMH-II para activarse.

También es importante para las células T CD8+ que sean citotóxicas con el fin de poder destruir las células tumorales. Por tanto, se evaluó la capacidad citotóxica de células T específicas de Melan A mediante un ensayo de liberación de cromo (figura 5). Los resultados de citotoxicidad demostraron que los esplenocitos expandidos lisan específicamente sólo las células presentadoras de Melan-A-péptido pero no la línea celular de control que era negativa para el antígeno diana. Las células del grupo de control no mostraron ninguna actividad de destrucción. La actividad de células NK también fue muy baja dentro de los esplenocitos en todos los grupos. De manera notable, las células del grupo de CrossTAg-DC y del grupo mixto mostraron una capacidad de destrucción mucho mayor en comparación con los esplenocitos del grupo de DC convencionales.

Métodos

Constructos genéticos

Se usó el vector pGEM-eGFP-A120 como constructo de partida para el CrossTAg-vector (S. Milosevic). Esta variante poliA120 del vector pGEM original produce ARN transcrito con mayor estabilidad y condujo a una expresión de proteínas mejorada. El plásmido contenía además un sitio Agel único en el extremo 5' del ADNc de eGFP, así como un sitio EcoRI único en el extremo 3'. La cola poli-A está seguida por un sitio SpeI que permite la linealización del plásmido para la producción de ivt-ARN.

Se clonó el plásmido pGEM-CrossTAg-A120 reemplazando eGFP por ADNc que codifica para la señal de direccionamiento CrossTAg. La secuencia de CrossTAg consiste en la señal de translocación en el RE de la proteína 1 de membrana asociada a lisosomas humana (LAMP-1, n.° de registro: NP_005552, aa 1-28) fusionada en 5' con el dominio transmembrana y citoplásmico de DC-LAMP (n.° de registro: NP_055213, aa 376 416). Para la inserción de ADNc que codifica para antígeno, las distintas secuencias de CrossTAg se separan mediante un espaciador de 18 pb que contiene los sitios de restricción NheI, KpnI y PstI sin alterar el marco de lectura abierto (ORF) de LAMP1. La secuencia de CrossTAg con codones optimizados se diseñó prácticamente usando software de clonación computacional y la sintetizó GeneArt (Regensburg, Alemania). Posteriormente, se cortó la secuencia de CrossTAg completa del ADN del plásmido usando los sitios de restricción Agel (extremo 5') y EcoRI (extremo 3') y se ligó en el MCS del vector pGEM-A120 digerido del mismo modo.

Para la clonación de diversos constructos de antígeno C/T-CrossTAg (pGEM-GAGE-1-CrossTAg-A120, pGEM-MAGE-A4-CrossTAg-A120, pGEM-NY-ESO-1 -CrossTAg-A120, pGEM-SSX-4-CrossTAg-A120, pGEM-XAGE-1-CrossTAg-A120), se amplificó ADNc de antígeno a partir de plásmidos mediante PCR (n.os de registro: GAGE-1, U19142; MAGE-A4, NM_001011550; NY-ESO1, AJ003149; SSX-4, U90841; XAGE-1, AF251237) usando cebadores directos e inversos específicos del gen y se ligaron mediante los sitios de restricción NheI y PstI/NotI. Todas las secuencias de antígeno se insertaron en la señal CrossTAg de división de pGEM-CrossTAg-A120 sin alterar el ORF inicial.

Para la validación de epítopos de células T CD4+, se sintetizaron oligonucleótidos complementarios (Metabion, Planegg, Alemania) y se aparearon. Se usaron extremos cohesivos, generados tras el apareamiento, para la ligación directa de estas secuencias de antígeno cortas en el vector CrossTAg.

Producción de ivt-ARN

Tras la linealización con SpeI, se usaron pGEM-plásmidos como moldes para la producción de especies individuales de ivt-ARN (a Rn transcrito in vitro) usando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Para el control de calidad, se analizó la longitud del producto ivt-ARN mediante electroforesis en gel de agarosa. Se determinaron la concentración y la pureza por medio del espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific, Massachusetts).

Cultivo de células

Claims

REIVINDICACIONES

i. Composición de células dendríticas, que comprende

(i) células dendríticas que expresan al menos una proteína de fusión que comprende

- al menos un antígeno o un fragmento del mismo,

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno, y

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno, y

(ii) células dendríticas que expresan al menos un antígeno o un fragmento del mismo sin

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo, ni

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo, en la que el antígeno de (i) y (ii) es el mismo antígeno,

en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y

en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.
2. Composición de células dendríticas según la reivindicación 1, en la que la proteína de fusión y el antígeno se expresan de manera transitoria o estable, preferiblemente se expresan de manera estable.
3. Composición de células dendríticas según la reivindicación 2, en la que la expresión transitoria se lleva a cabo mediante la introducción de ivt-ARN.
4. Composición de células dendríticas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica se deriva de DC-LAMP y/o en la que la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica es humana.
5. Composición de células dendríticas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma, preferiblemente en la que la secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica comprende la secuencia SEQ ID NO: 14 o un fragmento de la misma.
6. Composición de células dendríticas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia señal de translocación en el RE se deriva de una proteína asociada endosómica/lisosómica, preferiblemente en la que la proteína asociada endosómica/lisosómica se selecciona del grupo que comprende LAMP1, LAMP2, DC-LAP, CD68 y CD1b.
7. Composición de células dendríticas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la secuencia señal de translocación en el RE se deriva de LAMP1, preferiblemente en la que la secuencia señal de translocación en el RE comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma.
8. Composición de células dendríticas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las células dendríticas son células dendríticas maduras generadas mediante un método que comprende las siguientes etapas:

(i) suministro de monocitos;

(ii) incubación de los monocitos de la etapa i) con IL-4 y GM-CSF;

(iii) incubación de los monocitos de la etapa ii) con IL-4 y GM-CSF en combinación con un cóctel de maduración.
9. Composición de células dendríticas según la reivindicación 8, en la que el cóctel de maduración comprende una combinación de IFN-y, agonista de TLR7/8, PGE2 y opcionalmente agonista de TLR3, preferiblemente en la que el cóctel de maduración comprende una combinación de IL-p, TNF-a, IFN-y, agonista de TLR7/8, pGE2 y agonista de TLR3, más preferiblemente en la que el agonista de TLR7/8 es R848 y en la que el agonista de TLR3 es poli(l:C).
10. Composición de células dendríticas según la reivindicación 8 a 9, en la que la incubación de la etapa ii) dura al menos 2 días y/o en la que la incubación de la etapa iii) dura al menos 12 horas, preferiblemente 24 horas.
11. Composición de células dendríticas según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el antígeno es MELAN-A.
12. Vacuna de células dendríticas que comprende la composición de células dendríticas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, preferiblemente en la que las células dendríticas son células autólogas, más preferiblemente en la que la vacuna de células dendríticas es una composición fluida farmacéuticamente aceptable.
13. Composición de células dendríticas según las reivindicaciones 1 a 11 o vacuna de células dendríticas según la reivindicación 12, para su uso como medicamento.
14. Composición de células dendríticas según las reivindicaciones 1 a 11 o vacuna de células dendríticas según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de cáncer.
15. Composición de células dendríticas según las reivindicaciones 1 a 11 o vacuna de células dendríticas según la reivindicación 12, para su uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra un antígeno asociado a melanoma, preferiblemente en la que el antígeno asociado a melanoma es MELAN-A.
16. Composición, que comprende

a) un vector de expresión que codifica para un polipéptido que comprende

- una secuencia señal de translocación en el RE humana precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo,

- un dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo, y

- al menos un antígeno o fragmento del mismo; y

b) un vector de expresión que codifica para un polipéptido que comprende al menos un antígeno o fragmento del mismo sin

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo, ni

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo,

en la que el antígeno de (a) y (b) es el mismo antígeno,

en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral, y

en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.
17. Kit, que comprende

a) un vector de expresión que codifica para un polipéptido que comprende

- una secuencia señal de translocación en el RE humana precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo,

- un dominio transmembrana y citoplásmico humano que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo, y

- al menos un antígeno o fragmento del mismo, y

b) un vector de expresión que comprende al menos un antígeno o fragmento del mismo sin

- una secuencia señal de translocación en el retículo endoplásmico (RE) precedente al extremo N-terminal del antígeno o fragmento del mismo, ni

- un dominio transmembrana y citoplásmico que comprende una secuencia de direccionamiento endosómica/lisosómica tras el extremo C-terminal del antígeno o fragmento del mismo,

en la que el antígeno de (a) y (b) es el mismo antígeno, en la que el antígeno es un antígeno tumoral o un antígeno viral y en la que el fragmento tiene una longitud de al menos 9 aminoácidos.