ES2864013T3 - Conjugados de fármaco y anticuerpo activable anti-CD71 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

Conjugados de fármaco y anticuerpo activable anti-CD71 y métodos de uso de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal del mismo: **(Ver fórmula)** (a) en donde (i) AB es un anticuerpo que se une específicamente a CD71 humano y comprende i. una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de CDRH1 que comprende la SEQ ID NO: 9, una secuencia de CDRH2 que comprende la SEQ ID NO: 10 y una secuencia de CDRH3 que comprende la SEQ ID NO: 11; y ii. una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de CDRL1 que comprende la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13, una secuencia de CDRL2 que comprende la SEQ ID NO: 14 y una secuencia de CDRL3 que comprende la SEQ ID NO: 15; (ii) MM es un resto de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde MM inhibe la unión del AB al CD71 humano cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado no escindido; (iii) LP1 es un primer resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM es un resto escindible que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 156, en donde el CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa; y (v) LP2 es un segundo resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y (b) en donde "n" es 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de fármaco y anticuerpo activable anti-CD71 y métodos de uso de los mismos
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere generalmente a conjugados de fármaco y anticuerpo activable (AADC) que se unen a CD71 en un estado activado, y métodos para fabricar y usar estos anticuerpos activables conjugados anti-CD71 en una variedad de indicaciones terapéuticas, diagnósticas y profilácticas.
Antecedentes de la invención
Las terapias basadas en anticuerpos han demostrado ser tratamientos eficaces para varias enfermedades, pero en algunos casos, las toxicidades debidas a la amplia expresión de la diana han limitado su eficacia terapéutica. Además, los agentes terapéuticos basados en anticuerpos han presentado otras limitaciones, como la eliminación rápida de la circulación después de la administración.
En el ámbito de la terapéutica con moléculas pequeñas, se han desarrollado estrategias para proporcionar profármacos de una entidad química activa. Tales profármacos se administran en una forma relativamente inactiva (o significativamente menos activa). Una vez administrado, el profármaco se metaboliza in vivo en el compuesto activo. Tales estrategias de profármacos pueden proporcionar una mayor selectividad del fármaco para su diana prevista y una reducción de los efectos adversos.
Por consiguiente, existe una necesidad continua en el campo de las terapias basadas en anticuerpos de anticuerpos que imiten las características deseables del profármaco de molécula pequeña.
El documento WO 2016/179257 se refiere en general a anticuerpos que se unen a CD71, anticuerpos activables que se unen específicamente a CD71 y métodos para fabricar y usar los mismos.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos activables conjugados que se unen específicamente a CD71, también conocida como proteína receptora de transferrina 1 (TfR1), definiéndose los anticuerpos activables conjugados como sigue.
La presente invención proporciona un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal de la misma:
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(a) en donde (i) AB es un anticuerpo que se une específicamente al CD71 humano y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de CDRH1 que comprende la SEQ ID NO: 9, una secuencia de CDRH2 que comprende la SEQ ID NO: 10, y una secuencia de CDRH3 que comprende la SEQ ID NO: 11; y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia CDRL1 que comprende la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13, una secuencia CDRL2 que comprende la SEQ ID NO: 14 y una secuencia CDRL3 que comprende la SEQ ID NO: 15; (ii) MM es un resto de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde MM inhibe la unión del AB al CD71 humano cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado no escindido; (iii) LP1 es un primer resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM es un resto escindible que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 156, en donde CM es un polipéptido que funciona como un sustrato para una proteasa; y (v) LP2 es un segundo resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y (b) en donde "n" es 2. En algunas modalidades, el AB comprende un isotipo IgG1. En algunas modalidades, el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada y en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina. En algunas modalidades, el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En un aspecto relacionado de la invención, el presente documento proporciona un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal de la misma en donde (i) AB es un anticuerpo que se une específicamente al CD71 humano y comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 7; (ii) MM es un residuo de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde MM inhibe la unión del AB al CD71 humano cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado no escindido; (iii) LP1 es un primer resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM es un resto escindible que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 156, en donde CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa; y (v) LP2 es un segundo resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y (b) en donde "n" es 2. En algunas modalidades, el AB comprende un isotipo IgG1. En algunas modalidades, el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada y en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina. En algunas modalidades, el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En un aspecto relacionado de la invención, aquí se proporciona un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal de la misma en donde (i) AB es un anticuerpo que se une específicamente al CD71 humano y comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 19; (ii) MM es un residuo de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde el MM inhibe la unión del AB al CD71 humano cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado no escindido; (iii) LP1 es un primer resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM es un resto escindible que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 156, en donde CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa; y (v) LP2 es un segundo resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y (b) en donde "n" es 2. En algunas modalidades, el AB comprende un isotipo IgG1. En algunas modalidades, el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada y en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina. En algunas modalidades, el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En un aspecto relacionado de la invención, el presente documento proporciona un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal de la misma en donde MM-LP1-CM-LP2-AB es un anticuerpo activable, en donde AB es un anticuerpo que específicamente se une al CD71 humano, en donde el anticuerpo activable comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 169, y en donde "n" es 2. En algunas modalidades, el AB comprende un isotipo IgG1. En algunas modalidades, el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada y en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina. En algunas modalidades, el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En un aspecto relacionado de la invención, el presente documento proporciona un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal de la misma en donde MM-LP1-CM-LP2-AB es un anticuerpo activable, en donde AB es un anticuerpo que específicamente se une al CD71 humano, en donde el anticuerpo activable comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 170 en donde "n" es 2. En algunas modalidades, el AB comprende un isotipo IgG1. En algunas modalidades, el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada y en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina. En algunas modalidades, el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En otro aspecto de la divulgación la cual no es parte de la invención reivindicada, se proporcionan en el presente documento métodos de fabricación de un anticuerpo activable conjugado según se reivindica, el método comprende (i) reducir un anticuerpo activable que comprende MM-LP1-CM-LP2-AB con un agente reductor; y (ii) conjugar dos vcMMAE con el anticuerpo activable reducido.
En otro aspecto de la divulgación, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la divulgación el cual no es parte de la invención reivindicada, en el presente documento se proporcionan métodos para tratar, aliviar un síntoma, o retrasar la progresión de un cáncer en un sujeto, el método comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado activable anticuerpo de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones y, opcionalmente, un transportador farmacéuticamente aceptable, para un sujeto que necesite el mismo para un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células no-pequeñas, cáncer de mama ER+, cáncer de mama triple negativo, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de próstata, mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células pequeñas de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, mesotelioma, linfoma no-Hodgkin, carcinoma hepatocelular y glioblastoma.
En otro aspecto de la divulgación el cual no es parte de la invención reivindicada, el presente documento proporciona un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones, o una composición farmacéutica que comprende el mismo para su uso como medicamento.
En otro aspecto de la divulgación el cual no forma parte de la invención reivindicada, el presente documento proporciona un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones, o una composición farmacéutica que comprende el mismo para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde opcionalmente el cáncer se selecciona del grupo compuesto por: cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de esófago, cáncer de pulmón de células nopequeñas, cáncer de mama ER+, cáncer de mama triple negativo, cáncer colorrectal, melanoma, cáncer de próstata, mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes, carcinoma de células pequeñas de cabeza y cuello, cáncer de páncreas, mesotelioma, linfoma no-Hodgkin, carcinoma hepatocelular y glioblastoma.
En otro aspecto de la divulgación, el presente documento proporciona un kit que comprende al menos un anticuerpo activable según se reivindica. El kit puede comprender además uno o más vcMMAE y/o un agente reductor.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1, como se discute en el Ejemplo 5, representa ensayos inmunohistoquímicos (IHC) ilustrativos para determinar los niveles de expresión del CD71 en varios tipos de tejido de cáncer primario y metastásico. Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo mostraron que el CD71 se expresa a niveles altos en tumores primarios de una variedad de cánceres humanos.
La Figura 2, como se discute en el Ejemplo 5, representa estudios del nivel de expresión del CD71 en múltiples muestras de cáncer metastásico derivadas de pacientes. Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo mostraron que el CD71 se expresa a niveles altos en tumores metastásicos en una variedad de cánceres humanos.
Las Figuras 3A y 3B, como se discute en el Ejemplo 4, representan un ensayo in vitro ilustrativo de la capacidad de anticuerpos activables anti-CD71 conjugados y no conjugados de la divulgación para unirse al CD71 recombinante humano o cynomolgus cuando el anticuerpo activable está intacto o activado proteolíticamente (indicado como "ACT"). Los resultados ilustrativos mostrados en estas figuras y el ejemplo mostraron que el anticuerpo activable conjugado anti-CD71 se unía a CD71 a niveles comparables a su homólogo de anticuerpo activable anti-CD71 no conjugado, y también ambos se unían al CD71 con una afinidad aumentada equivalente tras la activación de la proteasa.
Las Figuras 3C y 3D, como se discute en el Ejemplo 4, representan un ensayo in vitro ilustrativo de la capacidad de anticuerpos activables anti-CD71 conjugados y no conjugados de la divulgación para unirse al CD71 humano o cynomolgus en una superficie celular cuando el anticuerpo activable está intacto o activado proteolíticamente (indicado como "ACT"). Los resultados ilustrativos mostrados en estas figuras y el ejemplo mostraron que el anticuerpo activable conjugado anti-CD71 se unía al CD71 de la superficie celular a niveles comparables a su contraparte del anticuerpo activable anti-CD71 no conjugado, y también ambos se unían al CD71 de la superficie celular con una afinidad aumentada equivalente tras la activación de la proteasa.
Las Figuras 4A, 4B y 4C, como se discute en el Ejemplo 6, representan estudios de eficacia ilustrativos de anticuerpos activables conjugados anti-CD71 (AADC) de la presente divulgación en un modelo de xenoinjerto en ratón (anti-CD71 TF01-3011-MMAE vs. anti-CD71 TF02.13-2011-MMAE). Estos resultados ilustrativos muestran en estas figuras y el ejemplo que un AADC con el residuo de enmascaramiento de afinidad más baja (TF02.13) demostró una eficacia más alta que un AADC con un residuo de enmascaramiento de afinidad más alta (TF01). La Figura 5, como se discute en el Ejemplo 7, representa un estudio de eficacia ilustrativo de anticuerpos activables conjugados (AADC) anti-CD71 de la presente divulgación en un modelo de xenoinjerto en ratón. Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo demuestran que la eficacia del AADC indicado (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE) con un sustrato menos escindible es sustancialmente la misma que la eficacia del AADC (anti-CD71 TF02. 13-3011-vcMMAE) con un sustrato más escindible mostrado en las Figuras 4B y 4C.
Las Figuras 6A, 6B, 6C y 6D, como se discutió en el Ejemplo 8, representan estudios de eficacia ilustrativos de anticuerpos activables conjugados anti-CD71 (AADC) con diferentes DAR (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE con un DAR ~ 3 vs. anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2 con un DAR ~ 2) de la presente divulgación en un modelo de xenoinjerto en ratón. Los resultados ilustrativos mostrados en estas figuras y el ejemplo demuestran que la eficacia de los AADC de dosis equiparada (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE) que tienen diferentes DAR muestran una eficacia comparable.
Las Figuras 7A, 7B y 7C, como se discute en el Ejemplo 9, muestran flujos de trabajo esquemáticos ilustrativo para analizar productos metabólicos resultantes de la administración de anticuerpos activables conjugados anti-CD71 (AADC) de la presente divulgación.
Las Figuras 8A, 8B, 9A, 9B, 10 y 11, como se discute en los Ejemplos 11-14, representan cursos de tiempo ilustrativo de subproductos metabólicos después de la administración de anticuerpos activables conjugados anti-CD71 (AADC) de la presente divulgación en un modelo animal. Los resultados ilustrativos mostrados en estas figuras y el ejemplo demuestran que la cantidad de AADC total e intacta de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) se mantiene en los animales durante la dosificación en una cantidad proporcional a la dosis, y la cantidad de MMAE que se conjuga con el anticuerpo activable es sustancialmente mayor que la cantidad de MMAE no conjugado durante la dosificación y en todos los niveles de dosificación.
La Figura 12, como se discutió en el Ejemplo 17, representa una titulación ilustrativa de los artículos de prueba indicados al fragmento de la proteína iC3b, que representa su capacidad para activar la cascada del complemento. Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo demuestran que el AADC de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) demostró una menor capacidad para la activación del complemento en comparación con su anticuerpo activable no conjugado.
La Figura 13, como se discutió en el Ejemplo 19, representa la eficacia ilustrativa del AADC de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) en un modelo de xenoinjerto en ratón mediante el uso de líneas celulares colorrectales humanas. Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo demuestran que el AADC de la presente divulgación mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral en todas las dosis, observándose una regresión completa en las dosis más altas.
La Figura 14, como se discute en el Ejemplo 20, representa una eficacia ilustrativa del AADC de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) en un modelo de xenoinjerto en ratón mediante el uso de tumores humanos derivados de pacientes (DLBCL). Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo demuestran que el AADC de la presente divulgación mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral después de una sola administración, observándose respuestas completas en algunos casos.
Las Figuras 15A, 15B y 15C, como se discute en el Ejemplo 21, representa una eficacia ilustrativa del AADC de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) en modelos de xenoinjerto en ratón derivado de pacientes (PDX). Los resultados ilustrativos mostrados en estas figuras y el ejemplo demuestran que el AADC de la presente divulgación demostró eficacia, incluidas respuestas completas en algunos casos, en modelos PDX derivados de una variedad de tipos de cáncer humano.
La Figura 16, como se discutió en el Ejemplo 22, representa una eficacia ilustrativa del AADC de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) en un modelo de xenoinjerto derivado de paciente en ratón. Los resultados ilustrativos mostrados en esta figura y el ejemplo demuestran que el AADC de la presente divulgación demostró eficacia, incluidas respuestas completas en algunos casos, en el modelo de cáncer de páncreas PDX. La Figura 17, como se discute en el Ejemplo 10, resume los resultados que muestran que los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) son bien tolerados y estables en monos cynomolgus, incluso a dosis relativas más altas, en comparación con el correspondiente conjugado de fármaco y anticuerpo (ADC) anti-CD71 parental, el AADC que tiene un sustrato con mayor capacidad de escisión y el AADC que tiene un DAR más alto
Las Figuras 18A, 18B y 18C, como se discutió en el Ejemplo 27, muestra el perfil separado por HIC de especies presentes en anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE no purificado y anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 purificado, así como su tasa de eliminación en ratones. Estas figuras y el ejemplo muestran que el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 migra como una única especie de conjugado y tiene una tasa de aclaramiento más baja.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona anticuerpos activables conjugados anti-CD71 que se unen específicamente al CD71 en un estado activado. El CD71 también se conoce como proteína receptora de la transferrina 1 (TfR1). Generalmente, la presente divulgación está dirigida a un anticuerpo activable conjugado anti-CD71 que comprende un residuo de máscara, un resto escindible, un enlazador vc y una toxina MMAe . El residuo de máscara (MM) reduce la capacidad del sitio de unión del anticuerpo para unirse a su antígeno diana CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido; el resto escindible (CM) es un sustrato activable por proteasa que se escinde en el microambiente del tumor lo que da como resultado la eliminación del residuo de máscara y la activación concomitante de los CDR anti-CD71. Específicamente, la presente divulgación describe la selección de un anticuerpo monoclonal activable conjugado anti-CD71 que tiene una eficacia y tolerabilidad superiores a otros anticuerpos monoclonales activables conjugados anti-CD71 conocidos de otra manera en la técnica, debido a que tiene la combinación única de un residuo de máscara de menor afinidad, un sustrato de residuo menos escindible, y una baja carga de fármaco de 2 lo cual, en conjunto, dan como resultado una eficacia y tolerabilidad significativamente mejoradas en modelos tumorales en ratón. Además, el anticuerpo monoclonal activable conjugado anti-CD71 también carece sorprendentemente de la capacidad de unirse al receptor inhibidor FcyRIIb, a diferencia de otros anticuerpos que contienen un Fc IgG1 de tipo salvaje, los cual es importante porque se sabe que la unión a tales receptores inhibe los procesos dependientes de calcio tales como desgranulación, fagocitosis, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), liberación de citocinas y activación proinflamatoria, todo lo cual se esperaría que resultara en una disminución de la eficacia si se activara el receptor FcyRIIb.
El CD71 es un receptor de la superficie celular que se expresa en las células en división, incluidas las cancerosas. Este se expresa en altos niveles en una amplia variedad de tipos de células cancerosas, y el CD71 se internaliza, por lo tanto se convierte en una diana atractiva para la terapia dirigida contra el cáncer mediante el uso de toxinas conjugadas dirigidas por anticuerpos. Los residuos de enmascaramiento (MM) que tienen afinidades más altas y más bajas, así como los residuos escindibles (CM) que tienen una capacidad de escisión menor o mayor, se identificaron y se usaron para construir una variedad de anticuerpos activables y luego anticuerpos conjugados con vcMMAE (es decir, conjugados de fármaco y anticuerpo activable o AADC). Estudios de eficacia ilustrativos de estos anticuerpos activables conjugados en un modelo de xenoinjerto en ratón mostraron que los AADC con residuos de enmascaramiento de mayor afinidad (por ejemplo, el CD71-TF01-3011-vcMMAE) demostraron una menor eficacia que aquellos con máscaras de menor afinidad (por ejemplo, el CD71-TF02.13-3011-vcMMAE). Por otra parte, otros estudios de eficacia mediante el uso del AADC que tenían la misma máscara de menor afinidad pero con sustratos de diferente capacidad de escisión mostraron que, si bien la eficacia era la misma, en primates no humanos el AADC con el sustrato menos escindible (CD71-TF02.13-2011-vcMMAE) fue mejor tolerado y con niveles más bajos del AADC circulante en forma activada en comparación con el AADC con el sustrato más escindible (CD71-TF02.13-3011-vcMMAE), por lo tanto proporciona un índice terapéutico más alto. Otros estudios demostraron que los AADC que tienen una menor proporción de fármaco respecto al anticuerpo activable (por ejemplo, el CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2, donde DAR es 2) eran más tolerados en dosis más altas en comparación con el mismo anticuerpo activable conjugado, con DAR más alto (es decir, DAR ~ 3). Por otra parte, el CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2 mostró una eficacia equivalente con dosificaciones emparejadas al AADc con DAR más alta en una variedad de modelos CDX y PDX de cánceres humanos en ratones. Finalmente, el CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2 mostró una tolerabilidad significativa con su contraparte desenmascarada, el cual fue tolerado ni siquiera en dosis bajas.
En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales activables conjugados son internalizados por células que contienen CD71. Se pretende que el uso del término "CD71" cubra cualquier variación del mismo, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD-71 y/o CD 71, y todas las variaciones que se usan en el presente documento indistintamente.
El CD71 es una glicoproteína de transmembrana que se une principalmente a la transferrina. El CD71 es esencial para la homeostasis celular. El CD71 se recicla continuamente a través de endocitosis mediada por ligando, donde el ligando principal es la transferrina. También se sabe que el CD71 se expresa de forma ubicua en las células en división.
La expresión y/o actividad aberrante del CD71 y la señalización relacionada con el CD71 se han implicado en la patogénesis de muchas enfermedades y trastornos, como el cáncer. El CD71 se sobreexpresa en muchos cánceres, incluidos los cánceres sólidos y hematológicos. El CD71 tiene una amplia expresión en la superficie celular. El CD71 en las células malignas media una mayor captación de hierro necesaria para la división celular. El CD71 también se asocia con un mal pronóstico en las leucemias. El CD71 es una diana deseable porque prevalece en múltiples indicaciones de cáncer.
La divulgación proporciona anticuerpos anti-CD71 activables conjugados que se usan en métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante del CD71. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71 activables se usan en métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión, mejorar y/o aliviar un síntoma del cáncer u otra afección neoplásica.
La divulgación proporciona anticuerpos anti-CD71 activables anti conjugados que se usan en métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión, mejorar y/o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan el CD71. En algunas modalidades, las células están asociadas con una expresión y/o actividad del CD71 aberrante. En algunas modalidades, las células están asociadas con la expresión y/o actividad normal del CD71. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71 activables se usan en métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión, mejorar y/o aliviar un síntoma del cáncer u otra afección neoplásica.
La divulgación proporciona anticuerpos anti-CD71 activables conjugados que se usan en métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión, mejorar y o aliviar un síntoma de una enfermedad o trastorno en el cual las células enfermas expresan el CD71. En algunas modalidades, las células enfermas están asociadas con una expresión y/o actividad aberrante del CD71. En algunas modalidades, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o actividad normal del CD71. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD71 activables se usan en métodos para tratar, prevenir, retrasar la progresión, mejorar y/o aliviar un síntoma del cáncer u otra afección neoplásica.
Los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados incluyen un anticuerpo que se une específicamente al CD71 acoplado a un residuo de enmascaramiento (MM), de tal manera que el acoplamiento del MM reduce la capacidad del anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse al CD71. El MM se acopla a través de una secuencia que incluye un sustrato para una proteasa, por ejemplo, una proteasa que está colocalizada con el CD71 en un sitio de tratamiento en un sujeto.
Los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados ilustrativos de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos activables que incluyen una cadena pesada y una cadena ligera que son, o se derivan de, las secuencias variables de la cadena pesada y de la cadena ligera que se muestran a continuación (se muestran las secuencias de CDR en negrita y subrayado):
muM21 VH:
EVQLQESGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSETGYNQNFKGKAKLTAV
TSASTAYMDLSSLTNEDSAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLITVSA (SEQ IDNO: 1)
muM21 VL:
DIVMTQTPAIMSASPGEKVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLT
ISRMEAEDAATYYCQQRRNYPYTFGGGTKLEIKRA (SEQ IDNO: 2)
cadena pesada variable hu2vHa
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGNSETGYAQKFQGRVTMTRD
TSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARENWDPGFAFVJGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 3)
cadena pesada variable hu2vHb
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGRATLTAD
TSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLVTVSS (SEQIDNO: 4)
cadena pesada variable hu2vHc
QVQLVQSGAEVKKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKFQGRATLTAD
TSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRENWDPGFAFVJGQGTLITVSS (SEQ IDNO: 5)
cadena ligera variable hu21vKa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ IDNO: 6)
cadena ligera variable hu21vKb
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLT
ISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ IDNO: 7)
cadena ligera variable hu21vKc
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLT
ISSMQPEDFATYYCQQRRNYPYTFGQGTKLEIK (SEQ IDNO: 8)
Los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados ilustrativos de la invención incluyen anticuerpos activables que incluyen una combinación de una secuencia de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena pesada variable (VH CDR1, también denominada en el presente documento como CDRH1), una secuencia de la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena pesada variable (VH CDR2), también denominada en el presente documento como CDRH2), una secuencia de la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena pesada variable (VH CDR3, también denominada en el presente documento como CDRH3), una secuencia de la región determinante de la complementariedad 1 de la cadena ligera variable (VL CDR1, también denominada en el presente documento como CDRL1), una secuencia de la región determinante de la complementariedad 2 de la cadena ligera variable (VL CDR2, también denominada en el presente documento como CDRL2), y una secuencia de la región determinante de la complementariedad 3 de la cadena ligera variable (VL CDR3, también denominada en el presente documento como CDRL3).
En la presente invención, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado comprende una combinación de una secuencia VH CDR1, una secuencia Vh CDR2, una secuencia VH c DR3, una secuencia VL CDR1, una secuencia VL CDR2 y una secuencia VL CDR3, en donde la secuencia VH CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 9); la secuencia de VH CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos AIYPGNSETG (SEQ ID NO: 10); la secuencia de VH CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos ENWDPGFAF (SEQ ID NO: 11); la secuencia de VL CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos SASSSVYYMY (SEQ iD NO: 12) o CRASSSVYYMY (SEQ ID NO: 13); la secuencia de VL CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos STSNLAS (SEQ ID NO: 14); y la secuencia de VL CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos QQRRNYPYT (SEQ ID NO: 15).
En la presente invención, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado se une específicamente al CD71. En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado incluye un anticuerpo monoclonal que se une al CD71. En algunas modalidades, tal anticuerpo monoclonal que se une al CD71 es un anticuerpo monoclonal humanizado o completamente humano.
En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 7.
En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1 y 3­ 5, y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7.
En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 5, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7.
En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo del anticuerpo activable conjugado de la presente divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 5, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 7.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para producir un anticuerpo activable de un anticuerpo activable conjugado de la divulgación mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, en donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico de la divulgación o un vector de la divulgación.
Los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados proporcionados en el presente documento, también denominados en el presente documento indistintamente como anticuerpos activables conjugados anti-CD71 o anticuerpos activables conjugados con CD71, son estables en circulación, activados en los sitios previstos de terapia y/o diagnóstico pero no en condiciones normales, por ejemplo, tejido sano u otro tejido no diana para el tratamiento y/o diagnóstico y, cuando se activa, exhibe unión a CD71 que es al menos comparable al anticuerpo no modificado correspondiente, también denominado en el presente documento como anticuerpo parental.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, son métodos para tratar, prevenir y/o retrasar la aparición o progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la expresión y/o actividad aberrante del CD71 en un sujeto mediante el uso de anticuerpos activables conjugados de las reivindicaciones.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, prevenir y/o retrasar la aparición o progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de las células que expresan el CD71 o expresan el CD71 de forma aberrante en un sujeto mediante el uso de los anticuerpos activables conjugados de las reivindicaciones.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, prevenir y/o retrasar la aparición o progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de las células que expresan CD71 en un sujeto mediante el uso de los anticuerpos activables conjugados de las reivindicaciones.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, prevenir y/o retrasar la aparición o progresión de, o aliviar un síntoma asociado con la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de las células que expresan el CD71 de forma aberrante en un sujeto mediante el uso de los anticuerpos activables conjugados de las reivindicaciones.
Los anticuerpos activables conjugados en un estado activado se unen al CD71 e incluyen (i) un anticuerpo (AB) que se une específicamente al CD71; (ii) un residuo de enmascaramiento (MM) que, cuando el anticuerpo activable está en un estado no escindido, inhibe la unión del AB al CD71; y (c) un resto escindible (CM) acoplado al AB, en donde el CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa.
En la presente invención, el anticuerpo activable conjugado comprende un péptido de enlace entre el MM y el CM y un péptido de enlace entre el CM y el AB.
Por lo tanto, en la presente invención, el anticuerpo activable conjugado comprende un primer péptido de enlace (LP1) y un segundo péptido de enlace (LP2), en donde el anticuerpo activable conjugado en el estado no escindido tiene la disposición estructural desde el extremo N al extremo C de la siguiente manera: MM-LP1-CM-LP2-AB. En la presente invención, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos GGGSSGGS (SEQ ID NO: 207).
En la presente invención, LP2 comprende la secuencia de aminoácidos GGGS (SEQ ID NO: 38).
En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 100 nM o menos para unirse al CD71 de mamífero. En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 10 nM o menos para unirse al CD71 de mamífero. En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 5 nM o menos para unirse al CD71. En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 1 nM o menos para unirse al CD71. En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 0,5 nM o menos para unirse al CD71. En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de aproximadamente 0,1 nM o menos para unirse al CD71. En algunas modalidades, el AB tiene una constante de disociación de 0,01 nM a 100 nM, 0,01 nM a 10 nM, 0,01 nM a 5 nM, 0,01 nM a 1 nM, 0,01 a 0,5 nM, 0,01 nm a 0,1 nM, 0,01 nm a 0,05 nM, 0,05 nM a 100 nM, 0,05 nM a 10 nM, 0,05 nM a 5 nM, 0,05 nM a 1 nM, 0,05 a 0,5 nM, 0,05 nm a 0,1 nM, 0,1 nM a 100 nM, 0,1 nM a 10 nM, 0,1 nM a 5 nM, 0,1 nM a 1 nM, 0,1 a 0,5 nM, 0,5 nM a 100 nM, 0,5 nM a 10 nM, 0,5 nM a 5 nM, 0,5 nM a 1 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 10 nM o 10 nM a 100 nM, para la unión al CD71 de mamífero.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado en un estado no escindido se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación menos que o igual a 1 nM, menos que o igual a 5 nM, menos que o igual a 10 nM, menos que o igual a 15 nM, menos que o igual a 20 nM, menos que o igual a 25 nM, menos que o igual a 50 nM, menos que o igual a 100 nM, menos que o igual a 150 nM, menos que o igual a 250 nM, menos que o igual a 500 nM, menos que o igual a 750 nM, menos que o igual a 1000 nM y/o menos que o igual a 2000 nM.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado en un estado no escindido se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación en el intervalo de 1 nM a 2000 nM, 1 nM a 1000 nM, 1 nM a 750 nM, 1 nM a 500 nM, 1 nM a 250 nM, 1 nM a 150 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 50 nM, 1 nM a 25 nM, 1 nM a 15 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 5 nM a 2000 nM, 5 nM a 1000 nM, 5 nM a 750 nM, 5 nM a 500 nM, 5 nM a 250 nM, 5 nM a 150 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 50 nM, 5 nM a 25 nM, 5 nM a 15 nM, 5 nM a 10 nM, 10 nM a 2000 nM, 10 nM a 1000 nM, 10 nM a 750 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 250 nM, 10 nM a 150 nM, 10 nM a 100 nM, 10 nM a 50 nM, 10 nM a 25 nM, 10 nM a 15 nM, 15 nM a 2000 nM, 15 nM a 1000 nM, 15 nM a 750 nM, 15 nM a 500 nM, 15 nM a 250 nM, 15 nM a 150 nM, 15 nM a 100 nM, 15 nM a 50 nM, 15 nM a 25 nM, 25 nM a 2000 nM, 25 nM a 1000 nM, 25 nM a 750 nM, 25 nM a 500 nM, 25 nM a 250 nM, 25 nM a 150 nM, 25 nM a 100 nM, 25 nM a 50 nM, 50 nM a 2000 nM, 50 nM a 1000 nM, 50 nM a 750 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 250 nM, 50 nM a 150 nM, 50 nM a 100 nM, 100 nM a 2000 nM, 100 nM a 1000 nM, 100 nM a 750 nM, 100 nM a 500 nM, 100 nM a 250 nM, 100 nM a 150 nM, 150 nM a 2000 nM, 150 nM a 1000 nM, 150 nM a 750 nM, 150 nM a 500 nM, 150 nM a 250 nM, 250 nM a 2000 nM, 250 nM a 1000 nM, 250 nM a 750 nM, 250 nM a 500 nM, 500 nM a 2000 nM, 500 nM a 1000 nM, 500 nM a 750 nM, 500 nM a 500 nM, 500 nM a 250 nM, 500 nM a 150 nM, 500 nM a 100 nM, 500 nM a 50 nM, 750 nM a 2000 nM, 750 nM a 1000 nM o 1000 nM a 2000 nM.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado en un estado activado se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación menos que o igual a 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM o 10 nM.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado en un estado activado se une específicamente al CD71 de mamífero con una constante de disociación en el intervalo de 0,01 nM a 100 nM, 0,01 nM a 10 nM, 0,01 nM a 5 nM, 0,01 nM a 1 nM, 0,01 a 0,5 nM, 0,01 nm a 0,1 nM, 0,01 nm a 0,05 nM, 0,05 nM a 100 nM, 0,05 nM a 10 nM, 0,05 nM a 5 nM, 0,05 nM a 1 nM, 0,05 a 0,5 nM, 0,05 nm a 0,1 nM, 0,1 nM a 100 nM, 0,1 nM a 10 nM, 0,1 nM a 5 nM, 0,1 nM a 1 nM, 0,1 a 0,5 nM, 0,5 nM a 100 nM, 0,5 nM a 10 nM, 0,5 nM a 5 nM, 0,5 nM a 1 nM, 1 nM a 100 nM, 1 nM a 10 nM, 1 nM a 5 nM, 5 nM a 100 nM, 5 nM a 10 nM o 10 nM a 100 nM.
En la presente invención el CD71 de mamífero es el CD71 humano. En algunas modalidades, el AB se une específicamente al CD71 humano con una constante de disociación menor de 1 nM.
En algunas modalidades, los AB bloquea la capacidad de un ligando natural para unirse al CD71 de mamífero con una EC50 de menos que o igual a 5 nM, menos que o igual a 10 nM, menos que o igual a 50 nM, menos que o igual a 100 nM, menos que o igual a 500 nM, y/o menos que o igual a 1000 nM. En algunas modalidades, el AB bloquea la capacidad de una transferrina para unirse al CD71 de mamífero con una CE50 menos que o igual a 5 nM, menos que o igual a 10 nM, menos que o igual a 50 nM, menos que o igual a 100 nM, menos que o igual a 500 nM, y/o menos que o igual a 1000 nM. En algunas modalidades, el ligando natural de CD71 es la transferrina.
En algunas modalidades, el AB bloquea la capacidad de un ligando natural para unirse al CD71 de mamífero con una CE50 de 5 nM a 1000 nM, 5 nM a 500 nM, 5 nM a 100 nM 5 nM a 50 nM, 5 nM a 10 nM, 10 nM a 1000 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 100 nM 10 nM a 50 nM, 50 nM a 1000 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 100 nM, 100 nM a 1000 nM, 100 nM a 500 nM, 500 nM a 1000 nM. En algunas modalidades, los AB bloquea la capacidad de una transferrina de unirse al CD71 de mamífero con una CE50 de 5 nM a 1000 nM, 5 nM a 500 nM, 5 nM a 100 nM 5 nM a 50 nM, 5 nM a 10 nM, 10 nM a 1000 nM, 10 nM a 500 nM, 10 nM a 100 nM 10 nM a 50 nM, 50 nM a 1000 nM, 50 nM a 500 nM, 50 nM a 100 nM, 100 nM a 1000 nM, 100 nM a 500 nM, 500 nM a 1000 nM. En algunas modalidades, el ligando natural de CD71 es la transferrina.
En algunas modalidades, el AB de la presente divulgación inhibe o reduce el crecimiento, proliferación y/o metástasis de células que expresan el CD71 de mamífero. Sin pretender atarse a ninguna teoría, el AB de la presente divulgación puede inhibir o reducir el crecimiento, proliferación y/o metástasis de células que expresan el CD71 de mamífero mediante la unión específica al CD71 e inhibir, bloquear y/o prevenir la unión de un ligando natural para el CD71 de mamífero. En algunas modalidades, el ligando natural del CD71 de mamífero es la transferrina.
En algunas modalidades, el MM tiene una constante de disociación para unirse al AB que es mayor que la constante de disociación del AB al CD71.
En algunas modalidades, el MM tiene una constante de disociación para unirse al AB que no es más que la constante de disociación del AB al CD71.
En algunas modalidades, el MM tiene una constante de disociación para unirse al AB que es menos que la constante de disociación del AB al CD71.
En algunas modalidades, la constante de disociación (Kd) de la MM hacia el AB no es más que 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 veces o más, o entre 1-5, 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1 000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10 000, 100-100000, 100-1 000000, 100-10000 000, 1000-10 000, 1000-100 000, 1000-1 000 000, 1000-10 000000, 10000-100000, 10000-1 000000, 10000-10000000, 100000-1 000000, o 100000-10000000 veces o más que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas modalidades, el MM no interfiere ni compite con el AB por unirse al CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado escindido.
En algunas modalidades, el MM es un polipéptido de aproximadamente 2 a 40 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el MM es un polipéptido de hasta aproximadamente 40 aminoácidos de longitud.
En algunas modalidades, la secuencia del polipéptido MM es diferente de la del CD71. En algunas modalidades, la secuencia del polipéptido MM no es más que 50 % idéntica a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, la secuencia del polipéptido MM es diferente de la del CD71 y no es más que 40 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % o 10 % idéntica a cualquier ligando de unión natural del AB.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia el CD71 es al menos dos veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el c D71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia el CD71 es al menos cinco veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el CD71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia el CD71 es al menos 10 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el CD71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia el CD71 es al menos 20 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el CD71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia CD71 es al menos 40 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el CD71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de manera que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al m M hacia el CD71 es al menos 100 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el c D71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia el CD71 es al menos 1000 veces mayor que el Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el CD71.
En algunas modalidades, el acoplamiento del MM al AB reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 de modo que la constante de disociación (Kd) del AB cuando se acopla al MM hacia el CD71 es al menos 10000 veces mayor que la Kd del AB cuando no está acoplado al MM hacia el CD71.
En algunas modalidades, en presencia del CD71, el MM reduce la capacidad del AB para unirse al CD71 en al menos un 90 % cuando el CM no está escindido, en comparación con cuando el CM se escinde cuando se ensaya in vitro mediante el uso de un ensayo de desplazamiento de diana como, por ejemplo, el ensayo descrito en la publicación PCT No. WO 2010/081173.
En la presente invención, MM comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En algunas modalidades, la proteasa que escinde el CM es activa, por ejemplo, regulada positivamente o de otra manera no regulada, en el tejido enfermo, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa.
En algunas modalidades, la proteasa se colocaliza con el CD71 en un tejido, y la proteasa escinde el CM en el anticuerpo activable conjugado cuando el anticuerpo activable se expone a la proteasa.
En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de tal manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado sin escindir, la unión del anticuerpo activable conjugado al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos dos veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une al CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado escindido), el AB se une al CD71.
En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de tal manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable al c D71 se reduce para ocurrir con una constante de disociación que es al menos cinco veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une al CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado escindido), el AB se une al CD71.
En algunas no modificado, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de tal manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos 10 veces mayor que la constante de disociación de un AB no modificado que se une al CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado escindido), el AB se une al CD71.
En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de tal manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable conjugado al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos 20 veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une al CD71, mientras que en el estado escindido (es decir, cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado escindido), el AB se une al CD71.
En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de tal manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable conjugado al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos 40 veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une al CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une al CD71. En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable conjugado al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos 50 veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une al CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une al CD71.
En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de tal manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable conjugado al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos 100 veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une a CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une al CD71. En algunas modalidades, el CM se coloca en el anticuerpo activable conjugado de manera que cuando el anticuerpo activable conjugado está en el estado no escindido, la unión del anticuerpo activable conjugado al CD71 se reduce para que ocurra con una constante de disociación que es al menos 200 veces mayor que la constante de disociación de un AB sin modificar que se une al CD71, mientras que en el estado escindido, el AB se une al CD71.
En algunas modalidades, la CM es un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunas modalidades, el CM es un polipéptido que incluye un primer resto escindible (CM1) que es un sustrato para al menos una metaloproteasa de matriz (MMP) y un segundo resto escindible (CM2) que es un sustrato para al menos una serina proteasa (SP). En algunas modalidades, cada una de la secuencia del sustrato CM1 y la secuencia del sustrato CM2 del sustrato CM1-CM2 es independientemente un polipéptido de hasta 15 aminoácidos de longitud.
En algunas modalidades, la CM es un sustrato para al menos una proteasa que está o se cree que está regulada positivamente o de otra manera no regulada en el cáncer.
En algunas modalidades, la CM es un sustrato para al menos una proteasa seleccionada del grupo que consiste en una metaloproteasa de matriz (MMP), trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, legumaína y una serina proteasa, tal como matriptasa (MT-SP1) y uroquinasa (uPA). Sin estar atado por la teoría, se cree que estas proteasas están reguladas positivamente o reguladas de otra manera en al menos uno de los cánceres.
En algunas modalidades, el CM se selecciona para su uso con una proteasa específica, por ejemplo, una proteasa que se sabe que está colocalizada con la diana del anticuerpo activable.
En algunas modalidades, la CM es un sustrato para al menos una MMP. En algunas modalidades, el CM es un sustrato para una proteasa seleccionada del grupo que consiste en NIW 9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 y Mm P19. En algunas modalidades, el CM es un sustrato para MMP9. En algunas modalidades, el CM es un sustrato para MMP14.
En la presente invención, el CM comprende la secuencia de aminoácidos ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 156) que también se denomina en el presente documento sustrato 2011.
En algunas modalidades, el CM es un sustrato para al menos dos proteasas. En algunas modalidades, la CM es un sustrato para al menos dos proteasas seleccionadas del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado incluye al menos un primer CM y un segundo CM. En algunas modalidades, el primer CM y el segundo CM son cada uno polipéptidos de no más que 15 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, al menos uno del primer CM y el segundo CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa seleccionada del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa. En algunas modalidades, el primer CM es escindido por un primer agente de escisión seleccionado del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa en un tejido diana y el segundo MC es escindido por un segundo agente de escisión en un tejido diana. En algunas modalidades, la otra proteasa se selecciona del grupo que consiste en los que se muestran en la Tabla (I). En algunas modalidades, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada del grupo que consiste en una MMP, trombina, una elastasa de neutrófilos, una cisteína proteasa, uPA, legumaína y matriptasa, y la primera CM y la segunda CM son diferentes sustratos para la enzima. En algunas modalidades, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son la misma proteasa seleccionada del grupo que consiste en aquellos mostrados en la Tabla (I). En algunas modalidades, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión son proteasas diferentes. En algunas modalidades, el primer agente de escisión y el segundo agente de escisión se colocan conjuntamente en el tejido diana. En algunas modalidades, el primer CM y el segundo CM se escinden por al menos un agente de escisión en el tejido diana.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado se expone y escinde por una proteasa de modo que, en el estado activado o escindido, el anticuerpo activado conjugado incluye una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera que incluye al menos una porción de la secuencia LP2 y/o CM después que la proteasa haya escindido el CM.
En la presente invención, el anticuerpo activable se conjuga con dos equivalentes del agente. En algunas modalidades de la divulgación, el anticuerpo activable es parte de una mezcla de anticuerpos activables que tienen un número homogéneo de equivalentes de agentes conjugados. En algunas modalidades, el anticuerpo activable es parte de una mezcla de anticuerpos activables que tienen un número heterogéneo de equivalentes de agentes conjugados. En algunas modalidades, la mezcla de anticuerpos activables es tal que el número medio de agentes conjugados con cada anticuerpo activable está entre cero y uno, entre uno y dos, entre dos y tres, o entre tres y cuatro. En algunas modalidades, la mezcla de anticuerpos activables es tal que el número promedio de agentes conjugados con cada anticuerpo activable es uno, dos, tres o cuatro.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable comprende una o más modificaciones de la secuencia de aminoácidos sitio-específicas de tal manera que el número de residuos de lisina y/o cisteína aumenta o disminuye con respecto a la secuencia de aminoácidos original del anticuerpo activable, por lo tanto, en algunas modalidades correspondientemente aumenta o disminuye el número de agentes que pueden conjugarse con el anticuerpo activable, o en algunas modalidades se limita la conjugación de los agentes con el anticuerpo activable de una manera sitio-específica. En algunas modalidades, el anticuerpo activable modificado se modifica con uno o más aminoácidos no naturales de una manera sitio-específica, por lo tanto en algunas modalidades se limita la conjugación de los agentes a solo los sitios de los aminoácidos no naturales.
El término "carga de fármaco" o "carga de fármaco" se refiere a la proporción molar de moléculas de fármaco por anticuerpo en un anticuerpo activable conjugado individual. En la presente invención, la carga de fármaco es de 2 moléculas de fármaco.
Para los propósitos de la presente invención, un experto en la técnica comprenderá que "carga de fármaco" y "proporción de fármaco respecto al anticuerpo" (también denominada DAR) no son lo mismo. DAR se refiere a la proporción molar promedio de moléculas de fármaco por anticuerpo en una población de al menos dos moléculas de anticuerpo activables conjugadas, mientras que la carga de fármaco se refiere a la proporción molar de moléculas de fármaco por anticuerpo en una molécula de anticuerpo activable conjugado individual. La carga de fármaco tiene relevancia principalmente para la construcción y diseño de un anticuerpo activable conjugado, mientras que DAR tiene relevancia principalmente para la composición farmacéutica de anticuerpo activable conjugado terapéutico que se administrará a los pacientes.
En algunas modalidades, los anticuerpos activables de la presente invención pueden conjugarse para generar preparaciones relativamente homogéneas de anticuerpos activables conjugados que tienen una distribución DAR estrecha. En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado puede ser sustancialmente homogénea con respecto a su distribución de DAR, lo que significa que dentro de la preparación hay una especie predominante de ADC sitio-específico con un DAR particular (por ejemplo, un DAR de 2 y/o 4). En algunas modalidades, la preparación de anticuerpo activable conjugado sustancialmente homogénea también puede ser uniforme con respecto al sitio de carga (es decir, en las cisteínas libres).
En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación será de aproximadamente 2 y/o 4. En este contexto, el término "aproximadamente" debe interpretarse en el sentido de una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más de 80 % de dos especies primarias en conjunto que tiene un DAR igual a 2 y 4 con una distribución aproximadamente igual (por ejemplo, más de 40 % cada una), y el residuo consiste en otras especies DAR.
En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2. En este contexto, el término "aproximadamente" debe interpretarse como una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más de aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %.
En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2, interpretándose el término "aproximadamente" para significar una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más que aproximadamente 94 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %. En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2, interpretándose el término "aproximadamente" para significar una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más que aproximadamente 95 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %. En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2, interpretándose el término "aproximadamente" para significar una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más que aproximadamente 96 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %. En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2, interpretándose el término "aproximadamente" para significar una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más que aproximadamente 97 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %. En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2, interpretándose el término "aproximadamente" para significar una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más que aproximadamente 98 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %. En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se enriquecerá hasta aproximadamente 2, interpretándose el término "aproximadamente" para significar una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más que aproximadamente 99 % ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 %. En algunas modalidades, el DAR de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación será de aproximadamente 2 y/o 4. En este contexto, el término "aproximadamente" debe interpretarse en el sentido de una preparación de anticuerpo activable conjugado que contiene más de 80 % de dos especies primarias en conjunto que tiene un DAR igual a 2 y 4 con una distribución aproximadamente igual (por ejemplo, más de 40 % cada una), y el residuo consiste en otras especies DAR.
En algunas modalidades, es posible lograr la homogeneidad deseada mediante el uso de anticuerpos activables sitio-específicos y/o reducción y conjugación selectiva. En algunas modalidades, la homogeneidad deseada puede lograrse mediante el uso de construcciones sitio-específicas en combinación con la reducción selectiva. En algunas modalidades, las preparaciones pueden purificarse más, por ejemplo, mediante el uso de técnicas de cromatografía analítica o preparativa. En estas modalidades, la homogeneidad de la preparación de anticuerpo activable conjugado puede analizarse mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica que incluyen, entre otras, espectrometría de masas, HPLC (por ejemplo, HPLC de exclusión por tamaño, RP-HPLC, HIC-HPLC, etc.) o electroforesis capilar.
Con respecto a la purificación de preparaciones de anticuerpo activable conjugado, se apreciará que pueden emplearse métodos de preparación farmacéutica estándar para obtener la pureza deseada. Como se discute en el presente documento, los métodos de cromatografía líquida, como la cromatografía de fase inversa (RP) y la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), pueden separar compuestos en la mezcla mediante el valor de carga de fármaco. En algunos casos, también puede usarse la cromatografía de intercambio iónico (IEC) o de modo mixto (MMC) para aislar especies con una carga de fármaco específica.
En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado de la divulgación que tiene un DAR dado con un nivel relativamente alto de homogeneidad de carga de fármaco puede comprender en realidad una mezcla de conjugados con un rango o distribución de cargas de fármaco, pero donde la distribución de cargas de fármaco en la mezcla se centran alrededor (o tienen un promedio ponderado de) el valor DAR medio. Por lo tanto, en algunas modalidades, las preparaciones de anticuerpos activables conjugados incluirán una mezcla de conjugados en la que el DAR promedio de la mezcla es aproximadamente 1, 2 o 3, cada uno /- 0,5. Se apreciará que el intervalo o desviación puede ser menos que 0,4 en ciertas modalidades preferentes. Por lo tanto, en otras modalidades, las composiciones comprenderán un DAR promedio de 1, 2 o 3, cada uno /- 0,3.
En algunas modalidades, la distribución de fármacos por anticuerpo en preparaciones de anticuerpos activables conjugados de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectrofotometría UV-Vis, HPLC de fase inversa, HIC, espectroscopía de masas, ELISA y electroforesis.
En algunas modalidades, una mezcla de anticuerpos activables conjugados de la divulgación que incluye una mezcla de conjugados que tienen diferentes cargas de fármaco puede purificarse o enriquecerse para una o más especies de conjugado que tienen una carga de fármaco específica. Por ejemplo, una mezcla de anticuerpo activable conjugado que incluye una mezcla de AADC que tienen una carga de fármaco de 0, 2, 4, 6 y 8 puede enriquecerse o purificarse para los anticuerpos activables conjugados que tienen una carga de fármaco de 2. Como se usa en el presente documento, una preparación o purificación o anticuerpo activable conjugado que tiene una preparación relativamente homogénea de especies de especies conjugadas que tienen una carga de fármaco de 2 se denomina "E2", el cual tiene un DAR de aproximadamente 2. Como se usa en el presente documento, una preparación o purificación o un anticuerpo activable conjugado que tiene una mezcla de especies conjugadas que tienen una carga de fármaco de 2 o 4 denominada "DE" (enriquecida en DAR), que tiene una DAR de aproximadamente 3. En este contexto, el término "aproximadamente" se interpreta que significa /- 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 de la cantidad prescrita.
En algunas modalidades, una preparación de un anticuerpo activable conjugado que se purifica o enriquece para una determinada especie de conjugado con una carga de fármaco específica incluye al menos un cierto porcentaje de la especie de carga de fármaco dada. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye al menos el 50 % de la preparación el anticuerpo activable conjugado que tiene una carga de fármaco de 2. En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye al menos el 75 % del anticuerpo activable conjugado que tiene una carga de fármaco de 2.
En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye al menos un 85 % del anticuerpo activable conjugado que tiene una carga de fármaco de 2. En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye al menos el 90 % del anticuerpo activable conjugado que tiene una carga de fármaco de 2. En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye al menos el 95 % del anticuerpo activable conjugado que tiene una carga de fármaco de 2. En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye al menos el 98 % del anticuerpo activable conjugado que tiene una carga de fármaco de 2.
En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado que se purifica o enriquece para una determinada especie de carga de fármaco incluye más equivalentes molares de la especie de carga de fármaco dada que los equivalentes molares totales de todas las demás especies de carga de fármaco combinadas. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado E2 es tal que los equivalentes combinados de cada una de las especies de anticuerpo activable conjugado de la composición en la cual la carga de fármaco no es 2 es menos que los equivalentes del anticuerpo activable conjugado con una carga de fármaco de 2.
En algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado que se purifica o enriquece para especies de DAR determinadas (por ejemplo, E2 como se describe en el presente documento) incluye menos de un cierto porcentaje del anticuerpo activable conjugado que no es la especie de carga de fármaco dada. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye menos de 50 % del anticuerpo activable conjugado que no es la carga de fármaco de 2 especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye menos de 25 % del anticuerpo activable conjugado que no es la carga de fármaco de 2 especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye menos de 15 % del anticuerpo activable conjugado que no es la carga de fármaco de 2 especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye menos de 10 % del anticuerpo activable conjugado que no es la carga de fármaco de 2 especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye menos de 5 % del anticuerpo activable conjugado que no es la carga de fármaco de 2 especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, una preparación de anticuerpo activable conjugado con E2 incluye menos de 2 % del anticuerpo activable conjugado que no es la carga de fármaco de 2 especies. En algunas otras modalidades, o las preparaciones enriquecidas o purificadas (por ejemplo, E4 o DE) pueden tener menos de 50 %, menos de 25 %, menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 2 % que es no la correspondiente especie de carga de fármaco en la composición de anticuerpo activable conjugado enriquecido o purificado.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado también incluye un residuo detectable. En algunas modalidades, el residuo detectable es un agente de diagnóstico.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado también incluye un péptido señal. En algunas modalidades, el péptido señal se conjuga con el anticuerpo activable mediante un espaciador. En algunas modalidades, el espaciador se conjuga con el anticuerpo activable en ausencia de un péptido señal. En algunas modalidades, el espaciador se une directamente al MM del anticuerpo activable. Un ejemplo de un espaciador unido directamente al extremo N-terminal de MM del anticuerpo activable es QGQSGQ (SEQ ID NO: 109). Otros ejemplos de un espaciador unido directamente al extremo N-terminal de MM del anticuerpo activable incluyen QGQs Gq G (SEQ ID NO: 138), QGQSG (SEQ ID NO: 139), QGQS (SEQ ID NO: 140), QGQ, QG, y Q. Otros ejemplos de un espaciador unido directamente al extremo N-terminal de MM del anticuerpo activable incluyen GQSGQG (SEQ ID NO: 143), QSGQG (SEQ ID NO: 144), SGQG (SEQ ID NO: 145), GQG y G. En algunas modalidades, no se une ningún espaciador al extremo N-terminal del MM. En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQ (SEQ ID NO: 109). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSGQG (SEQ ID NO: 138). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQSG (SEQ ID NO: 139). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQS (SEQ ID NO: 140). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QGQ. En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QG. En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos el residuo de aminoácido Q. En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQSGQG (SEQ ID NO: 143). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos QSGQG (SEQ ID NO: 144). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos SGQG (SEQ ID NO: 145). En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos GQG. En algunas modalidades, el espaciador incluye al menos la secuencia de aminoácidos G. En algunas modalidades, el espaciador está ausente.
En algunas modalidades, el AB del anticuerpo activable conjugado contiene naturalmente uno o más enlaces disulfuro. En algunas modalidades, el AB puede diseñarse para incluir uno o más enlaces disulfuro.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de la divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades, el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de la divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de la divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, y una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de la divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5. En algunas modalidades el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de la divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo activable del anticuerpo activable conjugado de la divulgación está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5, y una secuencia de ácido nucleico que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para producir un anticuerpo activable de la divulgación mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, en donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico de la divulgación o un vector de la divulgación.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos de fabricación de un anticuerpo activable que, en un estado activado, se une al CD71, el método comprende: (a) cultivar una célula que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica el anticuerpo activable en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo activable, en donde el anticuerpo activable comprende un anticuerpo activable de la divulgación; y (b) recuperar el anticuerpo activable.
En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es más larga que la del anticuerpo correspondiente; por ejemplo, el pK del anticuerpo activable conjugado es más largo que el del anticuerpo correspondiente. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es similar a la del anticuerpo correspondiente. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 15 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 12 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 11 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 10 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 9 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 8 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable conjugado es de al menos 7 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 5 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 2 días cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 24 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 20 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 18 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 16 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 14 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 12 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 10 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 8 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 6 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 4 horas cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, la vida media en suero del anticuerpo activable es de al menos 3 horas cuando se administra a un organismo.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para producir un anticuerpo anti-CD71 y/o un polipéptido de anticuerpo anti-CD71 activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del polipéptido, en donde la célula comprende un molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo y/o un anticuerpo activable descrito el presente documento, y/o vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas. La divulgación proporciona métodos para producir un anticuerpo y/o anticuerpo activable mediante el cultivo de una célula en condiciones que conducen a la expresión del anticuerpo y/o anticuerpo activable, en donde la célula comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un anticuerpo y/o un anticuerpo activable descritos en el presente documento, y/o vectores que incluyen estas secuencias de ácido nucleico aisladas.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, son también métodos para prevenir, retrasar la progresión del tratamiento, aliviar un síntoma de, o mejorar de otra manera una enfermedad mediada por el CD71 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de las reivindicaciones.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para prevenir, retrasar la progresión, tratar, aliviar un síntoma o mejorar de otra manera el cáncer en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de las reivindicaciones a un sujeto que lo necesite. Se sabe que el CD71 se expresa en una variedad de cánceres, tales como, a modo de ejemplo no limitativo, adenocarcinoma, cáncer de vías biliares (biliares), cáncer de vejiga, cáncer de mama, por ejemplo, cáncer de mama triple negativo y cáncer de mama Her2 negativo; cáncer carcinoide; cáncer de cuello uterino; colangiocarcinoma; colorrectal; endometrial glioma; cáncer de cabeza y cuello, por ejemplo, cáncer de células escamosas de cabeza y cuello; leucemia; cáncer de hígado; cáncer de pulmón, por ejemplo, NSCLC, SCLC; linfoma melanoma; cáncer de osofaringe; cáncer de ovarios; cáncer de páncreas; cáncer de próstata, por ejemplo, carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración; cáncer de riñón; cáncer de piel; cáncer de células escamosas, cáncer de estómago; cáncer de testículo; cáncer de tiroides; y cáncer de urotelio.
En algunas modalidades, el cáncer está asociado con un tumor que expresa el CD71. En algunas modalidades, el cáncer se debe a un tumor que expresa el CD71.
Un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado usado en cualquiera de las modalidades de estos métodos y usos puede administrarse en cualquier etapa de la enfermedad. Por ejemplo, tal anticuerpo anti-CD71 activable conjugado puede administrarse a un paciente que padece cáncer en cualquier estadio, desde temprano hasta metastásico. Los términos sujeto y paciente se usan indistintamente el presente documento.
En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero, como un primate humano o no humano.
El anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de las reivindicaciones y sus formulaciones terapéuticas se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante del CD71. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante del CD71 se identifica mediante el uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado de las reivindicaciones a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante del CD71 se considera satisfactoria si se logra cualquiera de una variedad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante del CD71 se considera satisfactoria si uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno se alivian, reducen, inhiben o no progresan a un estado posterior, es decir, peor. La administración de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con una expresión y/o actividad aberrante del CD71 se considera satisfactoria si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es decir, peor.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y las formulaciones terapéuticas del mismo se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno, como sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica, en los que las células enfermas del sujeto expresan el CD71. En algunas modalidades, las células enfermas están asociadas con una expresión y/o actividad aberrante del CD71. En algunas modalidades, las células enfermas están asociadas con la expresión y/o actividad normal del CD71. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno en donde las células enfermas del sujeto expresan el CD71 se identifica mediante el uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD71 activable conjugado y las formulaciones terapéuticas del mismo se administran a un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan el CD71 o la presencia, crecimiento, proliferación, metástasis y/o actividad de tales células, tales como sujetos que padecen cáncer u otras afecciones neoplásicas. En algunas modalidades, las células están asociadas con una expresión y/o actividad del CD71 aberrante. En algunas modalidades, las células están asociadas con la expresión y/o actividad normal del CD71. Un sujeto que padece o es susceptible a una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan el CD71 se identifica mediante el uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sujetos que padecen cáncer u otra afección neoplásica se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y análisis de sangre, orina y/o heces para evaluar el estado de salud. Por ejemplo, los sujetos que padecen inflamación y/o un trastorno inflamatorio se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de pruebas clínicas y/o de laboratorio tales como examen físico y/o análisis de fluidos corporales, por ejemplo, análisis de sangre, orina y/o heces, para evaluar el estado de salud.
La administración de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan el CD71 se considera satisfactoria si se logra cualquiera de una variedad de objetivos clínicos o de laboratorio. Por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan el CD71 se considera satisfactoria si uno o más de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno se alivian, reducen, inhiben o no progresan a un estado posterior, es decir, peor. La administración de un anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con células que expresan el CD71 se considera satisfactoria si la enfermedad o trastorno entra en remisión o no progresa a un estado posterior, es decir, peor.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, aliviar un síntoma o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad en el cual las células enfermas expresan el CD71 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado de la reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones para un sujeto que lo necesite.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, aliviar un síntoma o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan el CD71 que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones para un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el trastorno o enfermedad asociada con las células que expresan el CD71 es el cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer de vías biliares (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de huesos, un cáncer de mama, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer carcinoide, un cáncer de cuello uterino cáncer, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de células no pequeñas cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma, melanoma, cáncer de orofaringe, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, cáncer de riñón, sarcoma, cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital o un cáncer urotelial. En algunas modalidades, el ligando natural es la transferrina. En algunas modalidades, la expresión y/o actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas modalidades, el método comprende administrar un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para inhibir o reducir el crecimiento, proliferación o metástasis de células que expresan el CD71 de mamífero que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones para un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el ligando natural es la transferrina. En algunas modalidades, la expresión y/o actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas modalidades, el método comprende administrar un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para inhibir, bloquear o prevenir la unión de un ligando natural al CD71 de mamífero, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo conjugado de las reivindicaciones a un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el ligando natural es la transferrina. En algunas modalidades, la expresión y/o actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas modalidades, el método comprende administrar un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, aliviar un síntoma o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad en la que las células enfermas expresan el CD71 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones para un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el trastorno o enfermedad es el cáncer.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para tratar, aliviar un síntoma o retrasar la progresión de un trastorno o enfermedad asociada con células que expresan el CD71 que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activable conjugado de la reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones para un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el trastorno o enfermedad asociada con las células que expresan el CD71 es el cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es un adenocarcinoma, un cáncer de vías biliares (biliar), un cáncer de vejiga, un cáncer de huesos, un cáncer de mama, un cáncer de mama triple negativo, un cáncer de mama Her2 negativo, un cáncer carcinoide, un cáncer de cuello uterino cáncer, un colangiocarcinoma, un cáncer colorrectal, un cáncer de colon, un cáncer de endometrio, un glioma, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de células escamosas de cabeza y cuello, una leucemia, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de células no pequeñas cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma, melanoma, cáncer de orofaringe, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, carcinoma de próstata metastásico resistente a la castración, cáncer de riñón, sarcoma, cáncer de piel, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un cáncer de testículo, un cáncer de tiroides, un cáncer urogenital o un cáncer urotelial. En algunas modalidades, el ligando natural es la transferrina. En algunas modalidades, la expresión y/o actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas modalidades, el método comprende administrar un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, son también métodos para inhibir o reducir el crecimiento, la proliferación o metástasis de células que expresan el CD71 de mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones a un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el ligando natural es la transferrina. En algunas modalidades, la expresión y/o actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas modalidades, el método comprende administrar un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
Parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, también son métodos para inhibir, bloquear o prevenir la unión de un ligando natural al CD71 de mamífero, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones o una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones para un sujeto que lo necesite. En algunas modalidades, el ligando natural es la transferrina. En algunas modalidades, la expresión y/o actividad del CD71 de mamífero es aberrante. En algunas modalidades, el método comprende administrar un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
En algunas modalidades de estos métodos y kits, el anticuerpo activable conjugado anti-CD71 incluye una etiqueta detectable. En algunas modalidades de estos métodos y kits, la etiqueta detectable incluye un agente de formación de imágenes, un agente de contraste, una enzima, una etiqueta fluorescente, un cromóforo, un tinte, uno o más iones metálicos o una etiqueta basada en ligando. En algunas modalidades de estos métodos y kits, el agente de formación de imágenes comprende un radioisótopo. En algunas modalidades de estos métodos y kits, el radioisótopo es indio o tecnecio. En algunas modalidades de estos métodos y kits, el agente de contraste comprende yodo, gadolinio u óxido de hierro. En algunas modalidades de estos métodos y kits, la enzima comprende peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa. En algunas modalidades de estos métodos y kits, la etiqueta fluorescente comprende proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente cian (CFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente roja modificada (mRFP), tdimer2 de proteína fluorescente roja (tdimer2 RFP), HCRED o un derivado de europio. En algunas modalidades de estos métodos y kits, la etiqueta luminiscente comprende un derivado de N-metilacridio. En algunas modalidades de estos métodos, la etiqueta comprende un marcador de Alexa Fluor®, tal como Alex Fluor® 680 o Alexa Fluor® 750. En algunas modalidades de estos métodos y kits, la etiqueta basada en ligando comprende biotina, avidina, estreptavidina o uno o más haptenos.
En algunas modalidades de estos métodos y kits, el sujeto es un mamífero. En algunas modalidades de estos métodos, el sujeto es un humano. En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero no humano, tal como un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, un gato, un perro, un caballo), un animal de granja, un animal de trabajo o un animal de zoológico. En algunas modalidades, el sujeto es un roedor.
En algunas modalidades de estos métodos y kits, el método es un método in vivo. En algunas modalidades de estos métodos, el método es un método in situ. En algunas modalidades de estos métodos, el método es un método ex vivo. En algunas modalidades de estos métodos, el método es un método in vitro.
En algunas modalidades de los métodos y kits, el método se usa para identificar o refinar de otra manera una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable conjugado anti-CD71 de las reivindicaciones, seguido por el tratamiento administrando ese anticuerpo anti-CD71 activable conjugado a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana (por ejemplo, CD71) como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable anti-CD71 que se prueba en estos métodos se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable anti-CD71 que comprende tal CM, y luego se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD71 activable conjugado que se probó. Asimismo, los pacientes que dan negativo en una o ambas de las diana (por ejemplo, CD71) y la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se prueba mediante el uso de estos métodos podrían identificarse como candidatos adecuados para otra forma de terapia. En algunas modalidades, estos pacientes pueden probarse con otros anticuerpos activables anti-CD71 hasta que se identifique un anticuerpo activable anti-CD71 adecuado para el tratamiento (por ejemplo, un anticuerpo activable anti-CD71 que comprende un CM que es escindido por el paciente en el sitio de enfermedad). En algunas modalidades, luego se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti-CD71 activable y/o conjugado para el cual el paciente dio positivo.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden incluir el anticuerpo de las reivindicaciones y opcionalmente un transportador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas pueden incluirse en kits como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones y, opcionalmente, un transportador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende un agente adicional. En algunas modalidades, el agente adicional es un agente terapéutico.
Los AB en los anticuerpos activables de la invención se unen específicamente al CD71 humano.
Los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados de la presente invención incluyen un residuo de enmascaramiento. En la presente invención, el residuo de enmascaramiento es una secuencia de aminoácidos que está acoplada o unida de otra manera al anticuerpo anti-CD71 y se coloca dentro de la construcción del anticuerpo anti-CD71 activable de manera que el residuo de enmascaramiento reduce la capacidad del anticuerpo anti-CD71 para unir específicamente al CD71. Los residuos de enmascaramiento adecuados se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los residuos de enmascaramiento de péptidos se identifican mediante el uso de los métodos descritos en la publicación PCT No. WO 2009/025846 de Daugherty y otros. El residuo de enmascaramiento de los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 18.
Los anticuerpos anti-CD71 activables conjugados de la presente invención incluyen un resto escindible. En la presente invención, el resto escindible incluye una secuencia de aminoácidos que es un sustrato para una proteasa, normalmente una proteasa extracelular. Los sustratos adecuados se identifican mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. Por ejemplo, los sustratos de péptidos se identifican mediante el uso de los métodos descritos en la Patente de Estados Unidos No. 7,666,817 de Daugherty y otros; en la patente de EE.UU. No. 8,563,269 de Stagliano y otros; y en la publicación PCT No. WO 2014/026136 de La Porte y otros (véase también Boulware y otros, "Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics." Biotechnol. Bioeng. 106.3 (2010): 339-46. De acuerdo con la invención, el resto escindible comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156.
Los sustratos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, sustratos escindibles por una o más de las siguientes enzimas o proteasas enumeradas en la Tabla (I).
Tabla (I): Proteasas y/o enzimas ilustrativas
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Los anticuerpos anti-CD71 activables descritos en el presente documento superan una limitación de las terapias de anticuerpos, en particular las terapias de anticuerpos que se sabe que son tóxicas al menos en cierto grado in vivo.
La toxicidad mediada por la diana constituye una limitación importante para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos anti-CD71 activables proporcionados en el presente documento están diseñados para abordar la toxicidad asociada con la inhibición de la diana en tejidos normales por anticuerpos terapéuticos tradicionales. Estos anticuerpos anti-CD71 activables permanecen enmascarados hasta que se activan proteolíticamente en el sitio de la enfermedad. Comenzando con un anticuerpo anti-CD71 como anticuerpo terapéutico parental, los anticuerpos anti-CD71 activables de la invención se diseñaron mediante el acoplamiento del anticuerpo a una máscara inhibidora a través de un enlazador que incorpora un sustrato de proteasa.
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM o la unión específica del AB parental a la diana.
La Kd del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10 000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1 000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1 000000, 100-10 000 000, 1000-10 000, 1000-100 000, 1000-1 000 000, 1000-10 000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10000000, 100000-1 000000 o 100000-10000000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificado con un MM hacia la diana es al menos 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5 000000, 10000000, 50000000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000000, 10-10 000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1 000000, 100-10000000, 1000-10000, 1000-100000, 1000-1 000000, 1000-10000000, 10000-100000, 10000-1 000000, 10000-10000000, 100000-1 000000 o 100000-10 000000 veces menor que la afinidad de unión del AB no modificado con un MM o del AB parental hacia la diana. La constante de disociación (Kd) del MM hacia el AB es generalmente mayor que la Kd del AB hacia la diana. La Kd del MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 100000, 1000000 o incluso 10000000 veces mayor que la Kd del AB hacia la diana. A la inversa, la afinidad de unión del MM hacia el AB es generalmente menor que la afinidad de unión del AB del AB hacia la diana. La afinidad de unión de MM hacia el AB puede ser al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 100000, 1000000 o incluso 10 000000 veces menor que la afinidad de unión del AB hacia la diana.
En algunas modalidades, la constante de disociación (Kd) de la MM hacia el AB es aproximadamente igual a la Kd de la AB hacia la diana. En algunas modalidades, la constante de disociación (Kd) de la MM hacia el AB no es más que de la constante de disociación de la AB hacia la diana.
En algunas modalidades, la constante de disociación (Kd) de la MM hacia el AB es menos que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas modalidades, la constante de disociación (Kd) de la MM hacia el AB es mayor que la constante de disociación del AB hacia la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que no es más que la Kd de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que no es menos que la Kd de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que es aproximadamente igual a la Kd de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que es menos que la Kd de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que es mayor que la Kd de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que no es más que 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o 1000 veces mayor que la Kd de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una Kd de unión al AB que está entre 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1000, 20-100, 20-1000 o 100-1000 veces mayor que la Kd de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que es menos que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que no es más que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que es aproximadamente igual a la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que no es menos que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que es mayor que la afinidad de unión del AB a la diana.
En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que es 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 o 1000 menos que la afinidad de unión de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que está entre 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1000, 20-100, 20-1000 o 100-1000 veces menos que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, el MM tiene una afinidad de unión al AB que es de 2 a 20 veces menos que la afinidad de unión del AB a la diana. En algunas modalidades, un MM no unido covalentemente al AB y en una concentración equimolar al AB no inhibe la unión del AB a la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y está en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe, en comparación con la unión específica del AB no modificada con un MM o la unión específica del
AB parental a la diana. Cuando se compara la unión del AB no modificado con un MM o la unión del AB parental a la diana, la capacidad del AB de unirse a la diana cuando se modifica con un MM puede reducirse al menos en 50 %,
60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días, o 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
El MM inhibe la unión del AB a la diana. El MM se une al dominio de unión al antígeno del AB e inhibe la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir estéricamente la unión del AB a la diana. El MM puede inhibir alostéricamente la unión del AB a su diana. En estas modalidades, cuando el AB está modificado o acoplado a un MM y en presencia de la diana, no hay unión o no hay unión sustancial del AB a la diana, o no más del 0,001 %, 0,01 %, 0,1 %, 1 %, 2
%, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % o 50 % de unión del AB a la diana, en comparación con la unión del AB no modificado con un MM, el AB parental o el AB no acoplado a un MM a la diana, durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas, o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120,
150 o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
Cuando un AB está acoplado o modificado por un MM, el MM "enmascara" o reduce o inhibe de otra manera la unión específica del AB a la diana. Cuando un AB está acoplado o modificado por un MM, tal acoplamiento o modificación puede efectuar un cambio estructural que reduce o inhibe la capacidad del AB para unirse específicamente a su diana.
En determinadas modalidades, el MM no es un ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no contiene o no contiene homología sustancial con ningún ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el
MM no es más de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80
% similar a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más de 5 %, 10 %, 15
%, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más de 25 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más del 50 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del
AB. En algunas modalidades, el MM no es más del 20 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más del 10 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB.
En la presente invención, los anticuerpos activables incluyen un AB que está modificado por un MM y también incluye uno o más residuos escindibles (CM). Dichos anticuerpos activables exhiben unión activable/conmutable a la diana del AB. Los anticuerpos activables generalmente incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (AB), modificado o acoplado a un residuo de enmascaramiento (MM) y un residuo modificable o escindible (CM). En la presente invención, la CM contiene una secuencia de aminoácidos que sirve como sustrato para al menos una proteasa.
Los elementos de los anticuerpos activables están dispuestos de modo que el MM y el CM se coloquen de tal manera que en un estado escindido (o relativamente activo) y en presencia de una diana, el AB se una a una diana mientras que el anticuerpo activable está en un estado no escindido (o relativamente inactivo) en presencia de la diana, la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe. La unión específica del AB a su diana puede reducirse debido a la inhibición o enmascaramiento de la capacidad del AB para unirse específicamente a su diana por el MM
La Kd del AB modificado con un MM y un CM hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000, 500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 o mayor, o entre 5-10, 10­
100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1 000000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1 000
000, 100-10000 000, 1000-10 000, 1,000-100 000, 1,000-1,000,000, 1000-10 000 000, 10000-100 000, 10000-1
000000, 10,000-10000000, 100000-1 000000 o 100000-10000000 veces mayor que la Kd del AB no modificado con un MM y un CM o del AB parental hacia la diana. Por el contrario, la afinidad de unión del AB modificado con un
MM y un c M hacia la diana es al menos 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 50000, 100000,
500000, 1000000, 5000000, 10000000, 50000000 o más, o entre 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100 000, 10-1 000 000, 10-10000000, 100-1000, 100-10000, 100-100 000, 100-1 000 000, 100-10000000, 1000-10 000, 1000-100000, 1000-1 000000, 1000-10000000, 10000-100000, 10000-1 000000, 10000-10000000, 100 000-1 000000 o 100000-10000000 veces más bajo que la afinidad de enlace del AB no modificado con un MM y un CM o del AB parental hacia la diana.
Cuando el AB se modifica con un MM y un CM y está en presencia de la diana pero no en presencia de un agente modificador (por ejemplo al menos una proteasa), la unión específica del AB a su diana se reduce o inhibe en comparación con la unión específica del AB no modificado con un MM y un CM o del AB parental a la diana. Cuando se compara con la unión del AB parental o la unión de un AB no modificado con un Mm y un CM a su diana, la capacidad del AB para unirse a la diana cuando se modifica con un MM y un CM puede reducirse al menos en un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % e incluso 100 % durante al menos 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 o 96 horas o 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 o 180 días, o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses o más cuando se mide in vivo o en un ensayo in vitro.
Como se usa en el presente documento, el término estado de escisión se refiere al estado de los anticuerpos activables después de la modificación del CM por al menos una proteasa. El término estado no escindido, como se usa en el presente documento, se refiere al estado de los anticuerpos activables en ausencia de escisión del CM mediante una proteasa. Como se discutió anteriormente, el término "anticuerpos activables" se usa en el presente documento para referirse a un anticuerpo activable tanto en su estado no escindido (nativo), así como en su estado escindido. Resultará evidente para el experto en la materia que, en algunas modalidades, un anticuerpo activable escindido puede carecer de un MM debido a la escisión del CM por la proteasa, lo resulta en la liberación de al menos el Mm (por ejemplo, cuando el MM no está unido al anticuerpo activable mediante un enlace covalente (por ejemplo, un enlace disulfuro entre residuos de cisteína).
Por activable o conmutable se entiende que el anticuerpo activable exhibe un primer nivel de unión a una diana cuando el anticuerpo activable está en un estado inhibido, enmascarado o sin escindir (es decir, una primera conformación), y un segundo nivel de unión a la diana en el estado desinhibido, desenmascarado y/o escindido (es decir, una segunda conformación), donde el segundo nivel de unión a la diana es mayor que el primer nivel de unión. En general, el acceso de la diana al AB del anticuerpo activable es mayor en presencia de un agente de escisión capaz de escindir el CM, es decir, una proteasa, que en ausencia de dicho tal agente de escisión. Por lo tanto, cuando el anticuerpo activable está en el estado no escindido, el AB se inhibe de la unión a la diana y puede enmascararse de la unión a la diana (es decir, la primera conformación es tal que el AB no puede unirse a la diana), y en el estado escindido, el AB es no se inhibe o se desenmascara a la unión de la diana.
El CM y el AB de los anticuerpos activables se seleccionan de modo que el AB represente un residuo de unión para una diana dada y el CM representa un sustrato para una proteasa. En algunas modalidades, la proteasa se colocaliza con la diana en un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico en un sujeto. Como se usa en el presente documento, colocalizado se refiere a estar en el mismo sitio o relativamente cerca. En algunas modalidades, una proteasa escinde un CM mediante la producción de un anticuerpo activado que se une a una diana ubicada cerca del sitio de escisión. Los anticuerpos activables descritos en el presente documento encuentran un uso particular cuando, por ejemplo, una proteasa capaz de escindir un sitio en el CM, es decir, una proteasa, está presente en niveles relativamente más altos en el tejido que contiene la diana en un sitio de tratamiento o sitio de diagnóstico que en tejido de sitios sin tratamiento (por ejemplo en tejido sano). En algunas modalidades, un CM de la divulgación también se escinde por una o más de otras proteasas. En algunas modalidades, es una o más proteasas la que está colocalizada con la diana y es la responsable de la escisión de la CM in vivo.
En algunas modalidades, los anticuerpos activables proporcionan toxicidad reducida y/o efectos secundarios adversos que de otra manera podrían resultar de la unión del AB a sitios sin tratamiento si el AB no estuviera enmascarado o inhibido de otra manera de unirse a la diana.
En general, puede diseñarse un anticuerpo activable al seleccionar un AB de interés y construir el resto del anticuerpo activable de modo que, cuando esté restringido conformacionalmente, el MM proporcione enmascaramiento del AB o reduzca la unión del AB a su diana. Pueden tenerse en cuenta los criterios de diseño estructural para proporcionar esta característica funcional.
Se proporcionan anticuerpos activables que exhiben un fenotipo conmutable de un rango dinámico deseado para la unión a la diana en una conformación inhibida frente a una no inhibida. El rango dinámico generalmente se refiere a una proporción de (a) un nivel máximo detectado de un parámetro bajo un primer conjunto de condiciones respecto a (b) un valor mínimo detectado de ese parámetro bajo un segundo conjunto de condiciones. Por ejemplo, en el contexto de un anticuerpo activable, el rango dinámico se refiere a la proporción de (a) un nivel máximo detectado de unión de la proteína diana respecto a un anticuerpo activable en presencia de al menos una proteasa capaz de escindir la CM de los anticuerpos activables con respecto a (b) un nivel mínimo detectado de unión de la proteína diana a un anticuerpo activable en ausencia de la proteasa. El rango dinámico de un anticuerpo activable puede calcularse como la proporción de la constante de disociación de un tratamiento con agente de escisión de anticuerpo activable (por ejemplo, enzima) respecto a la constante de disociación del tratamiento con agente de escisión de anticuerpos activables. Cuanto mayor sea el rango dinámico de un anticuerpo activable, mejor será el fenotipo conmutable del anticuerpo activable. Los anticuerpos activables que tienen valores de rango dinámico relativamente más altos (por ejemplo, mayores que 1) exhiben fenotipos de cambio más deseables, de modo que la unión a la proteína diana por los anticuerpos activables se produce en mayor medida (por ejemplo, ocurre predominantemente) en presencia de un agente de escisión (por ejemplo, enzima) capaz de escindir el CM de los anticuerpos activables que en ausencia de un agente de escisión.
En determinadas modalidades, el MM no es un ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no contiene o no contiene homología sustancial con ningún ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % similar a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más del 50 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más de 25 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más del 20 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB. En algunas modalidades, el MM no es más del 10 % idéntico a cualquier ligando de unión natural del AB.
En muchas modalidades, puede ser deseable insertar uno o más enlazadores, por ejemplo, enlazadores flexibles, en la construcción de anticuerpo activable para proporcionar flexibilidad a una o más de la unión MM-CM, la unión CM-AB o ambas. Por ejemplo, AB, MM y/o CM pueden no contener un número suficiente de residuos (por ejemplo, Gly, Ser, Asp, Asn, especialmente Gly y Ser, particularmente Gly) para proporcionar la flexibilidad deseada. Como tal, el fenotipo conmutable de tales construcciones de anticuerpos activables puede beneficiarse de la introducción de uno o más aminoácidos para proporcionar un enlazador flexible. Además, como se describe a continuación, cuando el anticuerpo activable se proporciona como una construcción constreñida conformacionalmente, puede insertarse operativamente un enlazador flexible para facilitar la formación y el mantenimiento de una estructura cíclica en el anticuerpo activable no escindido.
En la presente invención, el anticuerpo activable comprende las siguientes fórmulas (donde la fórmula más abajo representa una secuencia de aminoácidos en la dirección N- a C-terminal o en la dirección C- a N-terminal):
(MM)-LP1-(CM)-LP2-(AB)
Además, las fórmulas anteriores proporcionan secuencias de aminoácidos adicionales que pueden colocarse en el extremo N-terminal o C-terminal de los elementos de anticuerpos activables. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, residuos dirigidos (por ejemplo, un ligando para un receptor de una célula presente en un tejido diana) y residuos que prolongan la semivida en suero (por ejemplo, polipéptidos que se unen a proteínas del suero, tal como inmunoglobulina (por ejemplo, IgG) o albúmina sérica (por ejemplo, albúmina sérica humana (HAS)).
El CM se escinde específicamente por al menos una proteasa a una velocidad de aproximadamente 0,001-1500 x 104 M'1 S'1 o al menos 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 o 1500 x 104 M_1 S-1. En algunas modalidades, el CM se escinde específicamente a una velocidad de aproximadamente 100000 M_1 S-1. En algunas modalidades, el CM se escinde específicamente a una tasa de aproximadamente 1x10E2 a aproximadamente 1x10E6 M_1 S_1 (es decir, de aproximadamente 1x102 a aproximadamente 1x106 M_1 S_1).
Para la escisión específica por una enzima, se establece el contacto entre la enzima y el CM. Cuando el anticuerpo activable comprende un AB acoplado a un MM y un CM está en presencia de una diana y de suficiente actividad enzimática, el CM puede escindirse. Una actividad enzimática suficiente puede referirse a la capacidad de la enzima para hacer contacto con el CM y efectuar la escisión. Puede imaginarse fácilmente que una enzima puede estar en las proximidades de la CM pero no puede escindirse debido a otros factores celulares o modificación de la proteína de la enzima.
Los enlazadores adecuados para su uso en la presente invención son generalmente aquellos que proporcionan flexibilidad del AB modificado o de los anticuerpos activables para facilitar la inhibición de la unión del AB a la diana. Estos enlazadores se denominan generalmente enlazadores flexibles. Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden ser de cualquiera de los adecuados de diferentes longitudes. En la presente invención, LP1 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 207 y LP2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38.
El experto en la materia reconocerá que el diseño de anticuerpos activables puede incluir enlazadores que son total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador puede incluir un enlazador flexible así como una o más porciones que confieren una estructura menos flexible para proporcionar una estructura de anticuerpos activable deseada. La divulgación también proporciona composiciones y métodos que incluyen el anticuerpo activable conjugado de las reivindicaciones. Las composiciones y métodos proporcionados aquí permiten la unión de dos agentes a dos residuos de cisteína en el Ab sin comprometer la actividad (por ejemplo, la actividad de enmascaramiento, activación o unión) del anticuerpo anti-CD71 activable. En algunas modalidades, las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento permiten la unión de dos agentes a dos residuos de cisteína en el AB sin reducir o alterar de otra manera uno o más enlaces disulfuro dentro del MM. Las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento producen un anticuerpo anti-CD71 activable que se conjuga con dos agentes, como se define en las reivindicaciones. Las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento producen anticuerpos anti-CD71 activables conjugados en los que el MM conserva la capacidad de enmascarar de forma eficaz y eficiente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. Las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento producen anticuerpos anti-CD71 activables conjugados en los cuales el anticuerpo activable todavía está activado, es decir, escindido, en presencia de una proteasa que puede escindir el CM.
Los anticuerpos anti-CD71 activables tienen dos puntos de conjugación para un agente. En algunas modalidades, los puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro. En algunas modalidades, los puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro entre cadenas. En algunas modalidades, los puntos de conjugación son átomos de azufre implicados en enlaces sulfuro entre cadenas, pero no átomos de azufre implicados en enlaces disulfuro intracatenarios. En algunas modalidades, los puntos de conjugación son átomos de azufre de cisteína u otros residuos de aminoácidos que contienen un átomo de azufre. Dichos residuos pueden aparecer de forma natural en la estructura del anticuerpo o pueden incorporarse al anticuerpo mediante mutagénesis sitio-dirigida, conversión química o incorporación errónea de aminoácidos no naturales.
También forman parte de la presente divulgación, pero no de la invención reivindicada, los métodos para preparar un conjugado de un anticuerpo anti-CD71 activable que tiene uno o más enlaces disulfuro intercadena en el AB y uno o más enlaces disulfuro intracadena en el MM, y un fármaco reactivo con tioles libres. El método generalmente incluye reducir parcialmente los enlaces disulfuro entre cadenas en el anticuerpo activable con un agente reductor, tal como, por ejemplo, TCEP; y conjugar el fármaco reactivo con tioles libres con el anticuerpo activable parcialmente reducido. Como se usa en el presente documento, el término reducción parcial se refiere a situaciones donde anticuerpo anti-CD71 activable se pone en contacto con un agente reductor y se reducen menos que todos los enlaces disulfuro, por ejemplo, menos que todos los sitios posibles de conjugación. En algunas modalidades, menos que 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20%, 15 %, 10 % o menos que 5 % de todos los posibles sitios de conjugación se reducen.
En otros aspectos de la presente divulgación que no forman parte de la invención reivindicada, se proporciona un método para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo anti-CD71 activable que da como resultado una selectividad en la colocación del agente. El método generalmente incluye reducir parcialmente el anticuerpo anti-CD71 activable con un agente reductor de manera que no se reduzcan los sitios de conjugación en el residuo de enmascaramiento u otra porción diferente al AB del anticuerpo activable, y conjugar el agente con tioles intercatenarios en el AB. El (los) sitio (s) de conjugación se seleccionan para permitir la colocación deseada de un agente para permitir que ocurra la conjugación en un sitio deseado. El agente reductor es, por ejemplo, TCEP. Las condiciones de la reacción de reducción tales como, por ejemplo, la proporción del agente reductor respecto al anticuerpo activable, la duración de la incubación, la temperatura durante la incubación, el pH de la solución de reacción reductora, etc., se determinan mediante la identificación de las condiciones que producen un anticuerpo activable conjugado en el cual el MM conserva la capacidad de enmascarar de forma eficaz y eficiente el AB del anticuerpo activable en un estado no escindido. La proporción del agente de reducción respecto al anticuerpo anti-CD71 activable variará en dependencia del anticuerpo activable. En algunas modalidades, la proporción del agente reductor respecto al anticuerpo anti-CD71 activable estará en un rango de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3: 1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3: 1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1,5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas modalidades, la proporción está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas modalidades, la proporción está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas modalidades, la proporción está en un rango de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas modalidades, la proporción está en un rango de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas modalidades, la proporción está en un rango de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, la proporción está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
En algunos aspectos que no forman parte de la invención reivindicada, un método para reducir los enlaces disulfuro entre cadenas en el AB de un anticuerpo anti-CD71 activable y conjugar un agente, por ejemplo, un agente que contiene tiol, como un fármaco, lo que resulta en tioles intercadena para localizar selectivamente agente (s) en el AB. El método generalmente incluye reducir parcialmente el AB con un agente reductor para formar al menos dos tioles intercatenarios sin formar todos los tioles intercatenarios posibles en el anticuerpo activable; y conjugar el agente con los tioles intercatenarios del AB parcialmente reducido. Por ejemplo, el AB del anticuerpo activable se reduce parcialmente durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 37 °C en una proporción deseada del agente reductor:anticuerpo activable. En algunas modalidades, la proporción del agente reductor respecto al anticuerpo activable estará en un rango de aproximadamente 20:1 a 1:1, de aproximadamente 10:1 a 1:1, de aproximadamente 9:1 a 1:1, de aproximadamente 8:1 a 1:1, de aproximadamente 7:1 a 1:1, de aproximadamente 6:1 a 1:1, de aproximadamente 5:1 a 1:1, de aproximadamente 4:1 a 1:1, de aproximadamente 3:1 a 1:1, de aproximadamente 2:1 a 1:1, de aproximadamente 20:1 a 1:1,5, de aproximadamente 10:1 a 1:1,5, de aproximadamente 9:1 a 1:1,5, de aproximadamente 8:1 a 1:1,5, de aproximadamente 7:1 a 1:1,5, de aproximadamente 6:1 a 1:1,5, de aproximadamente 5:1 a 1:1,5, de aproximadamente 4:1 a 1:1,5, de aproximadamente 3:1 a 1:1,5, de aproximadamente 2:1 a 1:1,5, de aproximadamente 1,5:1 a 1:1. 5, o de aproximadamente 1:1 a 1:1,5. En algunas modalidades, la proporción está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1:1. En algunas modalidades, la proporción está en un intervalo de aproximadamente 5:1 a 1,5:1. En algunas modalidades, la proporción está en un rango de aproximadamente 4:1 a 1:1. En algunas modalidades, la proporción está en un rango de aproximadamente 4:1 a 1,5:1. En algunas modalidades, la proporción está en un rango de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 1:1. En algunas modalidades, la proporción está en un intervalo de aproximadamente 2,5:1 a 1:1.
El reactivo que contiene tiol puede ser, por ejemplo, cisteína o N-acetilcisteína. El agente reductor puede ser, por ejemplo, TCEP. En algunas modalidades, el anticuerpo activable reducido puede purificarse antes de la conjugación, mediante el uso, por ejemplo, de cromatografía en columna, diálisis o diafiltración. Alternativamente, el anticuerpo reducido no se purifica después de la reducción parcial y antes de la conjugación.
En otros aspectos que no forman parte de la invención reivindicada, un método para reducir y conjugar un agente, por ejemplo, un fármaco, con un anticuerpo anti-CD71 activable que da como resultado una selectividad en la colocación del agente al proporcionar un anticuerpo anti-CD71 activable con un número y posiciones definidos de residuos de lisina y/o cisteína. En algunas modalidades, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína es mayor o menor que el número de residuos correspondientes en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original o el anticuerpo activable. En algunas modalidades, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína puede dar como resultado un número definido de equivalentes de agente que pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo anti-CD71 activable. En algunas modalidades, el número definido de residuos de lisina y/o cisteína puede dar como resultado un número definido de equivalentes de agente que pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo anti-CD71 activable de una manera sitio-específica. En algunas modalidades, el anticuerpo activable modificado se modifica con uno o más aminoácidos no naturales de una manera sitioespecífica, por lo tanto en algunas modalidades se limita la conjugación de los agentes a solo los sitios de los aminoácidos no naturales. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CD71 o el anticuerpo anti-CD71 activable con un número y posiciones definidos de residuos de lisina y/o cisteína pueden reducirse parcialmente con un agente reductor como se describe en el presente documento, de modo que cualquier sitio de conjugación en el residuo de enmascaramiento u otra porción diferente al AB del anticuerpo activable no se reduce y se conjuga el agente con tioles intercatenarios en el AB.
La presente invención se refiere a un anticuerpo activable conjugado que comprende la siguiente estructura, o una sal del mismo:
Figure imgf000027_0001
(a) en donde
(i) AB es un anticuerpo que se une específicamente al CD71 humano y comprende
i. una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de CDRH1 que comprende la SEQ ID NO: 9, una secuencia de CDRH2 que comprende la SEQ ID NO: 10 y una secuencia de CDRH3 que comprende la SEQ ID NO: 11; y
ii. una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de CDRL1 que comprende la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13, una secuencia de CDRL2 que comprende la SEQ ID NO: 14 y una secuencia de CDRL3 que comprende la SEQ ID NO: 15;
(ii) MM es un residuo de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en la que MM inhibe la unión del AB al CD71 humano cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado no escindido;
(iii) LP1 es un primer resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207;
(iv) CM es un resto escindible que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 156, en la que CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa; y
(v) LP2 es un segundo resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y
(b) en donde "n" es 2.
En la presente invención, el agente, monometil auristatina E (MMAE), se une al AB mediante el uso de un enlazador maleimida caproil-valina-citrulina, y esta construcción de carga útil del enlazador se denomina aquí como "vc-MMAE". La estructura de vc-MMAE se muestra a continuación:
vc-MMAE
Figure imgf000028_0001
En algunas modalidades, el AB comprende un isotipo IgG1. En algunas modalidades, el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada, en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina. En algunas modalidades, el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En algunas modalidades de anticuerpos activables conjugados de la presente invención, AB incluye una región variable de la cadena pesada que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región variable de la cadena ligera que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 7.
En algunas modalidades de la presente invención, AB incluye una cadena pesada que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 19.
En algunas modalidades de la presente invención, AB incluye una cadena pesada que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 169. En algunas modalidades de la presente invención, AB incluye una cadena pesada que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que incluye una secuencia de SEQ ID NO: 201.
El acoplamiento puede realizarse mediante cualquier reacción química que se una a las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el otro residuo conserven sus respectivas actividades. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y acomplejamiento. En algunas modalidades, la unión es, sin embargo, una unión covalente. La unión covalente puede lograrse mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de enlace bivalente o polivalente son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente divulgación, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que, más bien, es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes. (Véase Killen y Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen y otros, Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitetta y otros, Science 238:1098 (1987).
En algunas modalidades, además de las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento, el anticuerpo activable conjugado también puede modificarse para la conjugación específica de sitio a través de secuencias de aminoácidos modificadas insertadas o incluidas de otra manera en la secuencia de anticuerpo activable. Estas secuencias de aminoácidos modificadas están diseñadas para permitir la colocación y/o dosificación controladas del agente conjugado dentro de un anticuerpo activable conjugado. Por ejemplo, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir sustituciones de cisteína en posiciones de las cadenas ligeras y pesadas que proporcionan grupos tiol reactivos y no impactan negativamente en el plegamiento y ensamblaje de proteínas, ni alteran la unión del antígeno. En algunas modalidades, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir o introducir de otra manera uno o más residuos de aminoácidos no naturales dentro del anticuerpo activable para proporcionar sitios adecuados para la conjugación. En algunas modalidades, el anticuerpo activable puede diseñarse para incluir o introducir de otra manera secuencias de péptidos activables enzimáticamente dentro de la secuencia de anticuerpos activables.
Los enlazadores adecuados se describen en la bibliografía. (Véase, por ejemplo, Ramakrishnan, S. y otros, Cancer Res. 44:201-208 (1984) que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también la Patente de e E.UU. No 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetilhidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopéptido. En algunas modalidades, los enlazadores adecuados incluyen: (i) EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida; (ii) SMPT(4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., cat. #24510) conjugado con EDC. Los enlazadores adicionales incluyen, entre otros, SMCC ((succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato), SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio) butanoato) o sulfo-SPDB (N-succinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoato).
Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen éster NHS son menos solubles que los ésteres sulfo-NHS. Además, el conector SMPT contiene un enlace disulfuro impedido estéricamente y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro son, en general, menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escinde in vitro, lo que da como resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodimida. Los acoplamientos de carbodimida (como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida sola.
En algunas modalidades, los enlazadores pueden escindirse. En algunas modalidades, los enlazadores no pueden escindirse. En algunas modalidades, están presentes dos o más enlazadores. Los dos o más enlazadores son todos iguales, es decir, escindibles o no escindibles, o los dos o más enlazadores son diferentes, es decir, al menos uno escindible y al menos uno no escindible.
La presente divulgación utiliza varios métodos para unir agentes a los AB: (a) unión a los residuos carbohidrato del AB, o (b) unión a grupos sulfhidrilo del AB, o (c) unión a grupos amino del AB, o (d) unión a grupos carboxilato del AB. Según la divulgación, los AB pueden unirse covalentemente a un agente a través de un enlazador intermedio que tiene al menos dos grupos reactivos, uno para reaccionar con AB y otro para reaccionar con el agente. El enlazador, que puede incluir cualquier compuesto orgánico compatible, puede elegirse de manera que la reacción con AB (o el agente) no afecte negativamente a la reactividad y selectividad de AB. Además, es posible que la conexión del enlazador al agente no destruya la actividad del agente. Los enlazadores adecuados para la reacción con anticuerpos oxidados o fragmentos de anticuerpos oxidados incluyen aquellos que contienen una amina seleccionada del grupo que consiste en grupos amina primaria, amina secundaria, hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, fenilhidrazina, semicarbazida y tiosemicarbazida. Tales grupos funcionales reactivos pueden existir como parte de la estructura del enlazador, o pueden introducirse mediante la modificación química adecuada de enlazadores que no contienen tales grupos.
Según la presente divulgación, los enlazadores adecuados para la unión a los AB reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos reactivos capaces de reaccionar con un grupo sulfhidrilo de un fragmento o anticuerpo reducido. Dichos grupos reactivos incluyen, pero no se limitan a: grupos haloalquilo reactivos (se incluyen, por ejemplo, grupos haloacetilo), grupos p-mercuribenzoato y grupos capaces de reacciones de adición de tipo Michael (se incluyen, por ejemplo, maleimidas y grupos del tipo descrito por Mitra y Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110).
Según la presente divulgación, los enlazadores adecuados para la unión a los Ab no oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos amino primarios presentes en los residuos de lisina no modificados en el Ab. Dichos grupos reactivos incluyen, pero no se limitan a, ésteres carboxílicos o carbónicos de NHS, ésteres carboxílicos o carbónicos de sulfo-NHS, ésteres 4-nitrofenilcarboxílicos o carbónicos, ésteres pentafluorofenilcarboxílicos o carbónicos, acilimidazoles, isocianatos e isotiocianatos.
Según la presente divulgación, los enlazadores adecuados para la unión a los Ab no oxidados ni reducidos incluyen aquellos que tienen ciertos grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos de ácido carboxílico presentes en los residuos de aspartato o glutamato en el Ab, que se han activado con reactivos adecuados. Los reactivos de activación adecuados incluyen EDC, con o sin NHS o sulfo-NHS añadido, y otros agentes deshidratantes utilizados para la formación de carboxamidas. En estos casos, los grupos funcionales presentes en los conectores adecuados incluirían aminas primarias y secundarias, hidrazinas, hidroxilaminas e hidrazidas.
El agente puede adjuntarse al enlazador antes o después de que el enlazador se adjunte al AB. En ciertas aplicaciones, puede ser deseable producir primero un intermedio de enlazador AB en el cual el enlazador esté libre de un agente asociado. En dependencia de la aplicación particular, un agente específico puede unirse covalentemente al enlazador. En algunas modalidades, el AB se une primero al MM, CM y enlazadores asociados y luego se une al enlazador con fines de conjugación.
Enlazadores ramificados: en modalidades específicas, se usan engarces ramificados que tienen múltiples sitios para la unión de agentes. Para los enlazadores de sitios múltiples, una sola unión covalente a un AB daría como resultado un intermediario de enlazador AB capaz de unir un agente en varios sitios. Los sitios pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo o cualquier sitio químico al que se puedan unir agentes.
En algunas modalidades, puede lograrse una actividad específica más alta (o una proporción más alta de agentes a AB) mediante la unión de un enlazador de un solo sitio en una pluralidad de sitios en el AB. Esta pluralidad de sitios puede introducirse en el AB mediante cualquiera de dos métodos. Primero, pueden generarse múltiples grupos aldehído y/o grupos sulfhidrilo en el mismo a B. En segundo lugar, puede unirse a un aldehído o sulfhidrilo del AB un "enlazador ramificado" que tiene múltiples sitios funcionales para la unión posterior a enlazadores. Los sitios funcionales del enlazador ramificado o del enlazador de sitios múltiples pueden ser grupos aldehído o sulfhidrilo, o pueden ser cualquier sitio químico al que puedan unirse enlazadores. Pueden obtenerse actividades específicas aún más altas al combinar estos dos enfoques, es decir, adjuntando múltiples enlazadores de sitios en varios sitios del AB.
Enlazadores escindióles: los engarces peptídicos que son susceptibles a la escisión por enzimas del sistema del complemento, tales como, entre otros, el activador del u-plasminógeno, el activador del plasminógeno tisular, la tripsina, la plasmina u otra enzima que tenga actividad proteolítica pueden usarse en una modalidad de la presente divulgación. De acuerdo con un método de la presente divulgación, un agente se une a través de un enlazador susceptible de escindirse por el complemento. El anticuerpo se selecciona de una clase que puede activar el complemento. El conjugado anticuerpo-agente, por lo tanto, activa la cascada del complemento y libera el agente en el sitio diana. De acuerdo con otro método de la presente divulgación, se une un agente mediante un enlazador susceptible de escindirse por enzimas que tienen una actividad proteolítica tal como un activador de uplasminógeno, un activador de plasminógeno tisular, plasmina o tripsina.
En la Tabla (II) se proporcionan ejemplos no limitantes de secuencias enlazadoras escindibles.
Tabla (II): Secuencias ilustrativas de enlazador para la conjugación
Tipos de secuencias escindibles Secuencia de aminoácidos
Secuencias escindibles de plasmina
Prouroquinasa PRFKIIGG (SEQ ID NO: 110)
PRFRIIGG (SEQ ID NO: 111)
TGFp SSRHRRALD (SEQ ID NO: 112)
Plasminógeno RKSSIIIRMRDVVL (SEQ ID NO: 113)
Estafiloquinasa SSSFDKGKYKKGDDA (SEQ ID NO: 114)
SSSFDKGKYKRGDDA (SEQ ID NO: 115)
Secuencias escindibles del Factor Xa IEGR (SEQ ID NO: 116)
IDGR (SEQ ID NO: 117)
GGSIDGR (SEQ ID NO: 118)
Secuencias escindibles de MMP
Gelatinasa A PLGLWA (SEQ ID NO: 119)
Secuencias escindibles de colagenasa
Colágeno de piel de becerro (cadena a1(I)) GPQGIAGQ (SEQ ID NO: 120)
Colágeno de piel de becerro (cadena a2(I)) GPQGLLGA (SEQ ID NO: 121)
Colágeno de cartílago bovino (cadena a1(II)) GIAGQ (SEQ ID NO: 122)
Colágeno de hígado humano (cadena a1(III)) GPLGIAGI (SEQ ID NO: 123)
a2M humano GPEGLRVG (SEQ ID NO: 124)
PZP humano YGAGLGVV (SEQ ID NO: 125)
AGLGVVER (SEQ ID NO: 126)
AGLGISST (SEQ ID NO: 127)
AiM de rata EPQALAMS (SEQ ID NO: 128)
QALAMSAI (SEQ ID NO: 129)
Rata a2M AAYHLVSQ (SEQ ID NO: 130)
MDAFLESS (SEQ ID NO: 131)
Rata a1I3(2J) ESLPVVAV (SEQ ID NO: 132)
Rata a1b(27J) SAPAVESE (SEQ ID NO: 133)
Colagenasa de fibroblastos humanos DVAQFVLT (SEQ ID NO: 134)
(escisiones autolíticas) VAQFVLTE (SEQ ID NO: 135)
AQFVLTEG (SEQ ID NO: 136)
PVQPIGPQ (SEQ ID NO: 137)
Además, los agentes pueden unirse mediante enlaces disulfuro (por ejemplo, los enlaces disulfuro en una molécula de cisteína) al AB. Dado que muchos tumores liberan de forma natural altos niveles de glutatión (un agente reductor), esto puede reducir los enlaces disulfuro con la posterior liberación del agente en el sitio de administración. En algunas modalidades, el agente reductor que modificaría un CM también modificaría el enlazador del anticuerpo activable conjugado.
Espaciadores y elementos escindióles: en algunas modalidades, puede ser necesario construir el enlazador de tal manera que se optimice el espaciamiento entre el agente y el Ab del anticuerpo activable. Esto puede lograrse mediante el uso de un enlazador de la estructura general:
W -(CH2)n - Q
en donde
W es --NH--CH2-- or --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un número entero de 0 a 20.
En algunas modalidades, el enlazador puede comprender un elemento espaciador y un elemento escindible. El elemento espaciador sirve para colocar el elemento escindible lejos del núcleo del Ab de modo que el elemento escindible sea más accesible a la enzima responsable de la escisión. Algunos de los enlazadores ramificados descritos anteriormente pueden servir como elementos espaciadores.
A lo largo de esta discusión, debe entenderse que la unión del enlazador al agente (o del elemento espaciador al elemento escindible, o del elemento escindible al agente) no necesita ser un modo particular de unión o reacción. Es aceptable cualquier reacción que proporcione un producto de estabilidad y compatibilidad biológica adecuadas. Complemento sérico y selección de enlazadores: de acuerdo con un método de la presente divulgación, cuando se desea la liberación de un agente, se usa un AB que es un anticuerpo de una clase que puede activar el complemento. El conjugado resultante conserva tanto la capacidad de unirse al antígeno como de activar la cascada del complemento. Por lo tanto, de acuerdo con esta realización de la presente divulgación, un agente se une a un extremo del enlazador escindible o elemento escindible y el otro extremo del grupo enlazador se une a un sitio específico en el AB. Por ejemplo, si el agente tiene un grupo hidroxi o un grupo amino, puede unirse al terminal carboxi de un péptido, aminoácido u otro enlazador elegido adecuadamente mediante un enlace éster o amida, respectivamente. Por ejemplo, tales agentes pueden unirse al péptido enlazador mediante una reacción de carbodimida. Si el agente contiene grupos funcionales que interferirían con la unión al enlazador, estos grupos funcionales que interfieren pueden bloquearse antes de la unión y desbloquearse una vez que se prepara el producto conjugado o intermedio. El extremo opuesto o amino del enlazador se usa luego directamente o después de una modificación adicional para unirse a un AB que es capaz de activar el complemento.
Los enlazadores (o elementos espaciadores de enlazadores) pueden tener cualquier longitud deseada, un extremo de los cuales puede unirse covalentemente a sitios específicos en el AB del anticuerpo activable. El otro extremo del enlazador o elemento espaciador puede unirse a un engarce de aminoácido o péptido.
Por lo tanto, cuando estos conjugados se unen al antígeno en presencia de complemento, el enlace amida o éster que une el agente al enlazador se escindirá, lo que resulta en la liberación del agente en su forma activa. Estos conjugados, cuando se administran a un sujeto, lograrán la administración y liberación del agente en el sitio diana. Enlazadores para liberación sin activación del complemento: en otra aplicación más de administración dirigida, se desea la liberación del agente sin activación del complemento, ya que la activación de la cascada del complemento finalmente lisará la célula diana. Por lo tanto, este enfoque es útil cuando la administración y liberación del agente deben lograrse sin matar la célula diana. Estos conjugados pueden prepararse al unir el agente a un AB que no es capaz de activar el complemento a través de un enlazador que es levemente susceptible a la escisión por las proteasas del suero. Cuando este conjugado se administra a un individuo, los complejos antígeno-anticuerpo se formarán rápidamente mientras que la escisión del agente se producirá lentamente, por lo tanto resulta en la liberación del compuesto en el sitio diana.
Reticuladores bioquímicos: en algunas modalidades, el anticuerpo activable puede conjugarse con los agentes terapéuticos mediante el uso de ciertos reticulantes bioquímicos. Los reactivos de reticulación forman puentes moleculares que unen grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para unir dos proteínas diferentes de manera escalonada, pueden usarse reticuladores heterobifuncionales que eliminan la formación de homopolímeros no deseados.
Los enlazadores peptidílicos que pueden escindirse mediante proteasas lisosomales también son útiles, por ejemplo, Val-Cit, Val-Ala u otros dipéptidos. Además, pueden usarse enlazadores lábiles a los ácidos que pueden escindirse en el entorno de pH bajo del lisosoma, por ejemplo: éter bissialílico. Otros enlazadores adecuados incluyen sustratos lábiles a catepsina, particularmente aquellos que muestran una función óptima a un pH ácido.
En la Tabla (III) se hace referencia a reticuladores heterobifuncionales ilustrativos.
Tabla (III): Reticuladores heterobifuncionales ilustrativos
HETERO- RETICULADORES
BIFUNCIONAL
Conectores Reactivo hacia Ventajas y aplicaciones Longitud del brazo espaciador después de la reticulación (Angstroms)
SMPT Aminas primarias
sulfhidrílicas Mayor estabilidad 11,2 A
SPDP Aminas primarias Reticulación de tiolación escindible 6,8 A
sulfhidrílicas
LC-SPDP Aminas primarias Brazo espaciador extendido 15,6 A
sulfhidrílicas
Aminas primarias Brazo espaciador extensor soluble en 15,6 A
Sulfo-LC-SPDP sulfhidrílicas agua
SMCC Aminas primarias Grupo reactivo de maleimida estable 11,6 A
Sulfhidrilos Conjugación enzima-anticuerpo
Conjugación hapteno-proteína
transportadora
Sulfo-SMCC Aminas primarias Grupo reactivo de maleimida estable 11,6 A
sulfhidrílicas soluble en agua
Conjugación enzima-anticuerpo
MBS Aminas primarias Conjugación enzima-anticuerpo 9,9 A
Sulfo-MBS Sulfhidrílicas aminas Conjugación proteína transportadora- primarias sulfhidrílicas hapteno soluble en agua 9,9 A
SIAB Aminas primarias Conjugación enzima-anticuerpo 10,6 A sulfhidrílicas
Sulfo-SIAB Aminas primarias Agua soluble 10,6 A sulfhidrílicas
SMPB Aminas primarias Brazo espaciador extendido 14,5 A sulfhidrílicas conjugación enzima-anticuerpo
Sulfo-SMPB Aminas primarias Brazo espaciador extendido Soluble en 14,5 A sulfhidrílicas agua
Aminas primarias Conjugación hapteno-transportador 0EDE/Sulfo-NHS grupos carboxilo
ABH Carbohidratos no Reacciona con grupos de azúcar 11,9 A selectivos
Enlazadores no escindibles o de unión directa: en algunas modalidades de la divulgación, el conjugado puede diseñarse para que el agente se administre a la diana pero no se libere. Esto puede lograrse mediante la unión de un agente a un AB directamente o mediante un enlazador no escindible.
Estos enlazadores no escindibles pueden incluir aminoácidos, péptidos, D-aminoácidos u otros compuestos orgánicos que pueden modificarse para incluir grupos funcionales que posteriormente pueden usarse en la unión a los AB mediante los métodos descritos en el presente documento. Una fórmula general para tal enlazador orgánico podría ser
W -(CH2)n - Q
en donde
W es --NH--CH2-- o --CH2--;
Q es un aminoácido, péptido; y
n es un número entero de 0 a 20.
Conjugados no escindibles: en algunas modalidades, puede unirse un compuesto a AB que no activa el complemento. Cuando se usan los AB que son incapaces de activar el complemento, esta unión puede lograrse mediante el uso de enlazadores que son susceptibles a la escisión por complemento activado o mediante el uso de enlazadores que no son susceptibles de la escisión por complemento activado.
Definiciones:
A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos en la técnica. El término "una" entidad o "una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad. Por ejemplo, un compuesto se refiere a uno o más compuestos. Como tal, los términos "un", "una", "uno o más" y "al menos uno" pueden usarse indistintamente. Además, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, los términos singulares incluirán las pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular, y química e hibridación de proteínas y oligos o polinucleótidos descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Se usan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, o como se realiza comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente descripción. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2da ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas usadas en relación con los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal, descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar se usan para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y suministro, y tratamiento de pacientes.
Según se usa de acuerdo con la presente divulgación, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tienen los siguientes significados:
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a un antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Por "unirse específicamente" o "inmunorreacciona con" o "unirse inmunoespecíficamente" se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une con una afinidad mucho menor (Kd > 10-6).
Se sabe que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpos obtenidas de humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que se diferencian entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, como IgG1, IgG2 y otras. Además, en los seres humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un producto génico de la cadena ligera único y un producto génico de la cadena pesada único. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los mAb contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única por este.
El término "sitio de unión al antígeno" o "porción de unión" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables N-terminales ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominados "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia y otros, Nature 342:878-883 (1989).
Como se usa en el presente documento, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv, o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, pueden generarse anticuerpos contra péptidos N-terminales o C-terminales de un polipéptido. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es < 1 pM; en algunas modalidades, < 100 nM y en algunas modalidades, < 10 nM
Como se usa en el presente documento, los términos "unión específica", "unión inmunológica" y "propiedades de unión inmunológica" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se produce entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en la que una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica. Uno de estos métodos implica medir las tasas de formación y disociación del complejo antígeno/sitio de unión al antígeno, en donde esas tasas dependen de las concentraciones de los componentes del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Así, tanto la "constante de asociación" (Kon) y la "constante de disociación" (Koff) pueden determinarse mediante el cálculo de las concentraciones y las tasas reales de asociación y disociación. (Véase Nature 361:186-87 (1993)). La proporción de Koff/Kon permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación Kd. (Véase, en general, Davies y otros (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Se dice que un anticuerpo de la presente divulgación se une específicamente a la diana, cuando la constante de unión (Kd) es < 1 pM, en algunas modalidades < 100 nM, en algunas modalidades < 10 nM, y en algunas modalidades < 100 pM a aproximadamente 1 pM, medido mediante ensayos tales como ensayos de unión de radioligando o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
El término "polinucleótido aislado", como se usa en el presente documento, significará un polinucleótido genómico, ADNc o de origen sintético, o alguna combinación de los mismos, el cual en virtud de su origen, el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todos o una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está operativamente enlazado a un polinucleótido al cual no está enlazado en la naturaleza, o (3) no existe en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos de acuerdo con la divulgación incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada mostradas en el presente documento, y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera mostradas en el presente documento.
El término "proteína aislada" al que se hace referencia en el presente documento significa una proteína de ADNc, ARN recombinante o de origen sintético o alguna combinación de los mismos, el cual en virtud de su origen, o fuente de derivación, la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas murinas, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no existe en la naturaleza.
El término "polipéptido" se usa en el presente documento como un término genérico para referirse a proteínas nativas, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por tanto, los fragmentos de proteínas nativas y los análogos son especies del género polipéptido. Los polipéptidos de acuerdo con la divulgación comprenden las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada que se muestran en el presente documento y las moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera que se muestran en el presente documento, así como moléculas de anticuerpos formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de la cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera, como las moléculas de inmunoglobulina de la cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.
El término "de origen natural", como se usa en el presente documento, aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otra manera es de origen natural.
El término "operativamente enlazado" como se usa en el presente documento se refiere a las posiciones de los componentes así descritos que están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia de control "operativamente unida" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
El término "secuencia de control" como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de las secuencias codificantes a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere en dependencia del organismo huésped, en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen el promotor, el sitio de unión al ribosoma y la secuencia de terminación de la transcripción, en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, al menos, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias asociadas a la fusión. El término "polinucleótido" como se hace referencia en el presente documento significa nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenario y bicatenario.
El término oligonucleótido referido en el presente documento incluye nucleótidos de origen natural y nucleótidos modificados enlazados entre sí por enlaces de oligonucleótidos de origen natural y no natural. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que generalmente comprende una longitud de 200 bases o menos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos tienen una longitud de 10 a 60 bases y, en algunas modalidades, una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 a 40 bases. Los oligonucleótidos son habitualmente monocatenarios, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la divulgación son oligonucleótidos con sentido o antisentido.
El término "nucleótidos de origen natural" al que se hace referencia en el presente documento incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" al que se hace referencia en el presente documento incluye nucleótidos con grupos de azúcares modificados o sustituidos y similares. El término "enlaces oligonucleotídicos" al que se hace referencia en el presente documento incluye enlaces oligonucleotídicos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforraniladato, fosforonmidato y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche y otros, Nucl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec y otros, J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein y otros, Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon y otros, Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon y otros, Oligonucleótidos y análogos: un enfoque práctico, págs. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec y otros, Patente de EE.Uu . No 5.151.510; Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta para la detección, si se desea.
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2da edición, ES Golub y D.R Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, los aminoácidos no naturales tales como los aminoácidos a-, a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente divulgación. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, y -carboxiglutamato, s-N, N, N-trimetilisina, s-N-acetilsina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica usada aquí, la dirección de la izquierda es la dirección del terminal amino y la dirección de la derecha es la dirección del terminal carboxilo, de acuerdo con el uso y la convención estándar.
De manera similar, a menos que se especifique de otra manera, el extremo izquierdo de las secuencias polinucleotídicas monocatenarias es el extremo 5'; la dirección izquierda de las secuencias polinucleotídicas bicatenarias se denomina dirección 5'. La dirección de la adición 5' a 3' de del transcripto de ARN nacientes se refiere como las regiones de secuencia de la dirección de la transcripción en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en el extremo 5' hasta el extremo 5' del transcripto de ARN, referida como "secuencias aguas arriba", las regiones de secuencia en la hebra de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en el extremo 3' hasta el extremo 3' del transcripto de ARN se denominan "secuencias aguas abajo".
En lo que respecta a los polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean de manera óptima, como en los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de huecos predeterminados, comparten al menos un 80 por ciento de identidad de secuencia, en algunas modalidades, al menos un 90 por ciento de identidad de secuencia, en algunas modalidades, al menos 95 por ciento de identidad de secuencia, y en algunas modalidades, al menos 99 por ciento de identidad de secuencia.
En algunas modalidades, las posiciones de los residuos que no son idénticos se diferencian por sustituciones conservadoras de aminoácidos.
El término "fragmento de polipéptido" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino terminal y/o carboxi-terminal y/o una o más deleciones internas, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de origen natural deducida, por ejemplo, de una secuencia de ADNc de longitud completa. Los fragmentos típicamente tienen al menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de longitud, en algunas modalidades, al menos 14 aminoácidos de longitud, en algunas modalidades, al menos 20 aminoácidos de longitud, usualmente al menos 50 aminoácidos de longitud, y en algunas modalidades, al menos 70 aminoácidos de longitud. El término "análogo" como se usa en el presente documento se refiere a polipéptidos que están compuestos por un segmento de al menos 25 aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos deducida y que tiene unión específica a la diana, bajo condiciones de unión adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptidos comprenden una sustitución conservadora de aminoácidos (o adición o deleción) con respecto a la secuencia de origen natural. Los análogos tienen típicamente al menos 20 aminoácidos de longitud, en algunas modalidades, al menos 50 aminoácidos de longitud o más, y frecuentemente pueden ser tan largos como un polipéptido natural de longitud completa.
El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos.
Como se usa en el presente documento, el término "etiqueta" o "etiquetado" es un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de residuos biotinilados que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). En determinadas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutica. Se conocen en la técnica y pueden usarse varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I); etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); quimioluminiscentes; grupos biotinilados; epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pareadas de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En algunas modalidades, las etiquetas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente farmacéutico o fármaco" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
Otros términos químicos en el presente documento se usan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica en el Diccionario de Términos Químicos de McGraw-Hill (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
Como se usa en el presente documento, "sustancialmente pura" significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y en algunas modalidades, una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más que aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, en algunas modalidades, más que aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y 99 %. En algunas modalidades, la especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular. El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
Uso de anticuerpos activables conjugados
Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la divulgación se administrará con transportadores, excipientes y otros agentes farmacéuticamente aceptables adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una transferencia, liberación, tolerancia y similares mejoradas.
Las formulaciones terapéuticas de la divulgación, las cuales incluyen un anticuerpo activable conjugado, se usan para prevenir, tratar o mejorar de otra manera una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de la diana. Por ejemplo, las formulaciones terapéuticas de la divulgación, que incluyen un anticuerpo activable conjugado, se usan para tratar o mejorar de otra manera un cáncer u otra afección neoplásica, inflamación, trastorno inflamatorio y/o enfermedad autoinmune. En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido o una neoplasia maligna hematológica donde se expresa la diana. En algunas modalidades, el cáncer es un tumor sólido donde se expresa la diana. En algunas modalidades, el cáncer es una neoplasia maligna hematológica donde se expresa la diana. En algunas modalidades, la diana se expresa en el parénquima (por ejemplo, en el cáncer, la porción de un órgano o tejido que frecuentemente realiza funciones del órgano o tejido). En algunas modalidades, la diana se expresa en una célula, tejido u órgano. En algunas modalidades, la diana se expresa en el estroma (es decir, el marco de soporte conectivo de una célula, tejido u órgano). En algunas modalidades, la diana se expresa en un osteoblasto. En algunas modalidades, la diana se expresa en el endotelio (vasculatura). En algunas modalidades, la diana se expresa en una célula madre cancerosa. En algunas modalidades, el agente al cual se conjuga el anticuerpo y/o el anticuerpo activable es un inhibidor de microtúbulos. En algunas modalidades, el agente al cual se conjuga el anticuerpo y/o el anticuerpo activable es un agente que daña el ácido nucleico.
La eficacia de la prevención, mejora o tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad de la diana, tal como, por ejemplo, la expresión y/o actividad aberrante de la diana. Prolongar la supervivencia de un sujeto o de otra manera retrasar la progresión de la enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad de la diana, por ejemplo, expresión y/o actividad aberrante de la diana en un sujeto indica que el anticuerpo, el anticuerpo conjugado, el anticuerpo activable y/o el anticuerpo activable conjugado confiere un beneficio clínico.
Puede administrarse un anticuerpo activable conjugado en forma de composiciones farmacéuticas.
Las formulaciones que se usarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.
En algunas modalidades, el anticuerpo activable conjugado contiene un marcador detectable. Se usa un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv o F(ab)2). El término "etiquetado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo de la sonda o el anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, mediante el enlace físico) de una sustancia detectable a la sonda o el anticuerpo, así como el etiquetado indirecto de la sonda o el anticuerpo mediante la reactividad con otro reactivo directamente etiquetado. Los ejemplos de etiquetado indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario mediante el uso de un anticuerpo secundario etiquetado con fluorescencia y el etiquetado final de una sonda de ADN con biotina de manera que pueda detectarse con estreptavidina etiquetada con fluorescencia. El término "muestra biológica" pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Incluido dentro del uso del término "muestra biológica", por lo tanto, está la sangre y una fracción o componente de la sangre que incluye suero sanguíneo, plasma sanguíneo o linfa. Es decir, el método de detección de la divulgación puede usarse para detectar un analito tipo ARNm, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de un analito tipo ARNm incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de un analito tipo proteína incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones, tinción inmunoquímica e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de un analito tipo ADN genómico incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", vol. 42, J.R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, Nueva Jersey, 1995; " Immunoassay ", E. Diamandis y T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicas in vivo para la detección de un analito tipo proteína incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-proteína analito etiquetado. Por ejemplo, el anticuerpo puede etiquetarse con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto puede detectarse mediante técnicas estándar de formación de imágenes. Los anticuerpos activables conjugados de la divulgación también son útiles en una variedad de formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una modalidad, se administra un anticuerpo activable conjugado a pacientes que tienen riesgo de desarrollar uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente puede determinarse mediante el uso de marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunas modalidades de la divulgación, se administra un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Un anticuerpo activable conjugado de la divulgación también es útil en la detección de una diana en muestras de pacientes y, en consecuencia, es útil como diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar los niveles de la diana en una muestra de paciente.
En una modalidad, un anticuerpo activable conjugado de la divulgación se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el (los) pocillo (s) de una placa de microtitulación). El anticuerpo activable conjugado inmovilizado sirve como anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo activable conjugado inmovilizado con una muestra de paciente, el soporte sólido se enjuaga y se trata con un agente bloqueante tal como proteína de la leche o albúmina para prevenir la adsorción inespecífica del analito.
Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el antígeno o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Una muestra de este tipo es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto sospechoso de tener niveles de antígeno circulante que se consideran diagnósticos de una patología. Después de enjuagar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que está etiquetado de forma detectable. El segundo anticuerpo etiquetado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel detectable de la etiqueta y se determina la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba por comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que en base a los resultados obtenidos mediante el uso de los anticuerpos activables conjugados de la divulgación en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto en base a los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad determinada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados que se encuentran en diversas etapas de la progresión de la enfermedad y/o en varios puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Mediante el uso de una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada etapa de progresión o terapia, se designa un rango de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada etapa.
También puede usarse un anticuerpo activable conjugado en métodos de diagnóstico y/o de imágenes. En algunas modalidades, tales métodos son métodos in vitro. En algunas modalidades, tales métodos son métodos in vivo. En algunas modalidades, tales métodos son métodos in situ. En algunas modalidades, tales métodos son métodos ex vivo. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos activables que tienen un CM escindible enzimáticamente para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas modalidades, un entorno de mayor potencial de reducción tal como el cual puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una determinada célula o tejido de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado en dependencia de la naturaleza de la m C) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse para ser sustrato para al menos una proteasa que se encuentra en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, tal como en un absceso, en un órgano, y similares) y similares. El AB puede ser uno que se une a un antígeno diana. Mediante el uso de métodos como se describe en el presente documento, o cuando sea apropiado, métodos familiares para un experto en la técnica, un marcador detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente o etiqueta radiactiva o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo y/o activable. Las etiquetas detectables adecuadas se discuten en el contexto de los métodos de cribado anteriores y se proporcionan ejemplos específicos adicionales más abajo. Mediante el uso de un AB específico para una proteína o péptido del estado patológico, junto con al menos una proteasa cuya actividad está elevada en el tejido patológico de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido patológico en relación con los tejidos donde la enzima específica al CM no está presente a un nivel detectable o está presente a un nivel más bajo que en el tejido enfermo o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las pequeñas proteínas y péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y porque la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles más bajos en tejidos no enfermos o está presente en la conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido enfermo aumenta en relación con los tejidos no enfermos.
Los extremos N y C de las cadenas polipeptídicas de anticuerpos de la presente invención pueden diferir de las secuencias descritas en el presente documento debido a modificaciones postraduccionales comúnmente observadas. Por ejemplo, los residuos de lisina C-terminal frecuentemente faltan en las cadenas pesadas de anticuerpos. Dick y otros, (2008) Biotechnol. Bioeng. 100:1132. Los residuos de glutamina N-terminales y, en menor medida, los residuos de glutamato, se convierten con frecuencia en residuos de piroglutamato en las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos terapéuticos. Dick y col. (2007) Biotechnol. Bioeng. 97:544; Liu y otros, (2011) JBC 28611211; Liu y otros, (2011) J. Biol. Chem. 286:11211. En consecuencia, el anticuerpo activable conjugado de la Fórmula (I) puede tener un anticuerpo (AB) donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada carece de uno o más aminoácidos en el extremo, carece de lisina C-terminal, tiene la lisina C-terminal eliminada debido al procesamiento postraduccional, o la lisina C-terminal es un aminoácido distinto de la lisina. Si el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada es un aminoácido distinto de lisina, en una modalidad, es un aminoácido que generalmente no es susceptible de formar un enlace disulfuro o de otra manera no es susceptible de conjugarse con un agente citotóxico.
En ciertas modalidades, el anticuerpo activable conjugado de la Fórmula (I) puede tener un anticuerpo (AB) en el cual el glutamato N-terminal en la cadena pesada y/o la cadena ligera es opcionalmente piroglutamato o postraduccionalmente modificado a piroglutamato.
En determinadas modalidades, la región constante de la cadena pesada del anticuerpo activable conjugado de la Fórmula (I) comprende una lisina u otro aminoácido en el extremo C-terminal, por ejemplo, comprende los siguientes últimos aminoácidos: PGK para la cadena pesada. En determinadas modalidades, la región constante de la cadena pesada carece de uno o más aminoácidos en el extremo C-terminal y tiene, por ejemplo, la secuencia C-terminal PG o P.
En ciertas modalidades, las regiones variables de la cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo activable conjugado de la Fórmula (I) comprenden un aminoácido glutamato o piroglutamato en el extremo N, por ejemplo, comprende los siguientes últimos aminoácidos: pQGQ para la cadena ligera y/o pQVQ para la cadena pesada, donde "pQ" representa piroglutamato.
Los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se usan en formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una modalidad, se administra un anticuerpo activable a pacientes que tienen riesgo de desarrollar una o más de las inflamaciones, trastornos inflamatorios, cáncer u otros trastornos mencionados anteriormente.
La predisposición de un paciente u órgano a uno o más de los trastornos mencionados anteriormente puede determinarse mediante el uso de marcadores genotípicos, serológicos o bioquímicos.
En algunas modalidades de la divulgación, se administra un anticuerpo activable conjugado a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con uno o más de los trastornos mencionados anteriormente. Tras el diagnóstico, se administra un anticuerpo activable conjugado para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica.
Los anticuerpos activables conjugados de la divulgación también son útiles en la detección de la diana en muestras de pacientes y, en consecuencia, son útiles como diagnósticos. Por ejemplo, los anticuerpos activables conjugados de la divulgación se usan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar los niveles de la diana en una muestra de paciente.
En una modalidad, un anticuerpo activable de la divulgación se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, el (los) pocillo (s) de una placa de microtitulación). El anticuerpo inmovilizado y/o el anticuerpo activable sirven como un anticuerpo de captura para cualquier diana que pueda estar presente en una muestra de prueba. Antes de poner en contacto el anticuerpo activable inmovilizado con una muestra de paciente, el soporte sólido se enjuaga y se trata con un agente bloqueante como proteína de la leche o albúmina para evitar la adsorción inespecífica del analito. Posteriormente, los pocillos se tratan con una muestra de prueba que se sospecha que contiene el antígeno o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Una muestra de este tipo es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto sospechoso de tener niveles de antígeno circulante que se consideran diagnósticos de una patología. Después de enjuagar la muestra de prueba o el estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que está etiquetado de forma detectable. El segundo anticuerpo etiquetado sirve como anticuerpo de detección. Se mide el nivel detectable de la etiqueta y se determina la concentración de antígeno diana en la muestra de prueba por comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándar.
Se apreciará que en base a los resultados obtenidos mediante el uso de los anticuerpos activables de la divulgación en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible estadificar una enfermedad en un sujeto en base a los niveles de expresión del antígeno diana. Para una enfermedad determinada, se toman muestras de sangre de sujetos diagnosticados que se encuentran en diversas etapas de la progresión de la enfermedad y/o en varios puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Mediante el uso de una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada etapa de progresión o terapia, se designa un rango de concentraciones del antígeno que puede considerarse característico de cada etapa.
Los anticuerpos activables conjugados también pueden usarse en métodos de diagnóstico y/o de imágenes. En algunas modalidades, tales métodos son métodos in vitro. En algunas modalidades, tales métodos son métodos in vivo. En algunas modalidades, tales métodos son métodos in situ. En algunas modalidades, tales métodos son métodos ex vivo. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos activables que tienen un CM escindible enzimáticamente para detectar la presencia o ausencia de una enzima que es capaz de escindir el CM. Dichos anticuerpos activables pueden usarse en diagnósticos, que pueden incluir la detección in vivo (por ejemplo, cualitativa o cuantitativa) de la actividad enzimática (o, en algunas modalidades, un entorno de mayor potencial de reducción tal como el cual puede proporcionar la reducción de un enlace disulfuro) a través de la acumulación medida de anticuerpos activados (es decir, anticuerpos resultantes de la escisión de un anticuerpo activable) en una determinada célula o tejido de un organismo huésped dado. Tal acumulación de anticuerpos activados indica no solo que el tejido expresa actividad enzimática (o un potencial de reducción aumentado en dependencia de la naturaleza de la m C) sino también que el tejido expresa la diana a la que se une el anticuerpo activado.
Por ejemplo, el CM puede seleccionarse para ser un sustrato de proteasa para una proteasa que se encuentra en el sitio de un tumor, en el sitio de una infección viral o bacteriana en un sitio biológicamente confinado (por ejemplo, como en un absceso, en un órgano, y similares), y similares. Mediante el uso de métodos familiares para un experto en la técnica, una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta fluorescente o etiqueta radiactiva o radiotrazador) puede conjugarse con un AB u otra región de un anticuerpo activable. Más abajo se proporcionan ejemplos específicos. Mediante el uso de un AB específico para una proteína o péptido del estado patológico, junto una proteasa cuya actividad está elevada en el tejido patológico de interés, los anticuerpos activables exhibirán una mayor tasa de unión al tejido patológico en relación con los tejidos donde la enzima específica al CM no está presente a un nivel detectable o está presente a un nivel más bajo que en el tejido enfermo o está inactiva (por ejemplo, en forma de zimógeno o en complejo con un inhibidor). Dado que las pequeñas proteínas y péptidos se eliminan rápidamente de la sangre por el sistema de filtración renal, y porque la enzima específica para el CM no está presente en un nivel detectable (o está presente en niveles más bajos en tejidos no enfermos o está presente en la conformación inactiva), la acumulación de anticuerpos activados en el tejido enfermo aumenta en relación con los tejidos no enfermos.
El marcador detectable puede ser un tinte fluorescente (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de rodamina (TRITC), un tinte del infrarrojo cercano (NIR) (por ejemplo, nanocristales Qdot®), un metal coloidal, un hapteno, un marcador radiactivo, biotina y un reactivo de amplificación tal como estreptavidina, o una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina).
La detección del marcador en una muestra que ha sido incubada con el anticuerpo activable etiquetado indica que la muestra contiene la diana y contiene una proteasa que es específica para el CM del anticuerpo activable.
En algunas modalidades, las imágenes in situ se usa para identificar o refinar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se prueba (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Del mismo modo, los pacientes que dan negativo para la diana y/o la proteasa que escinde el sustrato en el CM en el anticuerpo activable que se prueba mediante el uso de estos métodos se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se prueba). En algunas modalidades, las imágenes in vivo se usan para identificar o refinar de otro modo una población de pacientes adecuada para el tratamiento con un anticuerpo activable de la divulgación. Por ejemplo, los pacientes que dan positivo tanto para la diana como para una proteasa que escinde el sustrato en el resto escindible (CM) del anticuerpo activable que se prueba (por ejemplo, acumulan anticuerpos activados en el sitio de la enfermedad) se identifican como candidatos adecuados para el tratamiento con tal anticuerpo activable que comprende tal CM. Asimismo, los pacientes que son negativos en la prueba se identifican como candidatos adecuados para otra forma de terapia (es decir, no adecuados para el tratamiento con el anticuerpo activable que se está probando).
Composiciones farmacéuticas
Los anticuerpos activables conjugados de la divulgación (también denominados en el presente documento "compuestos activos") pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La descripción para las formas de unidad de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se va a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, empaque o dispensador junto con las instrucciones de administración.
La invención se describirá adicionalmente en las siguientes modalidades y ejemplos enumerados, los cuales no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1. Anticuerpos activables conjugados anti-CD71 (AADC)
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para producir algunos de los anticuerpos activables conjugados anti-CD71 de la divulgación.
Como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. No. US 2016/0355599 A1, se obtuvo un anticuerpo monoclonal M21 anti-CD71 mediante el uso de la tecnología de hibridoma de ratón de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica. Los ratones se inmunizaron con el dominio extracelular (ECD) del CD71 humano y los hibridomas posteriores se examinaron mediante el uso de un ensayo de citotoxicidad piggyback, y se confirmó mediante ELISA que los clones positivos de citotoxicidad de este ensayo se unían al polipéptido ECD del CD71 humano y se confirmó que se unían a las superficies celulares mediante FACS. El anticuerpo monoclonal M21 antiCD71 incluye una región variable de la cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 1 y una región variable de la cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 2.
También se probaron los siguientes anticuerpos anti-CD71 humanizados, que se basaron en el anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD71 M21: Ab21.10 LcB: HcA (VH de SEQ ID NO: 3 y VL de SEQ ID NO: 7), Ab21.11 LcB: HcB (VH de SEQ ID NO: 4 y VL de SEQ ID NO: 7), Ab21.12 LcB: HcC (VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) y M21 (VH de SEQ ID NO: 1 y VL de SEQ ID NO: 2). La capacidad de varios anticuerpos anti-CD71 de la divulgación para unirse al CD71 de la superficie celular fue confirmada por FACS.
Todos los anticuerpos anti-CD71 humanizados mostraron unión al CD71 humano y de cynomolgus que era comparable a la unión demostrada por el anticuerpo de ratón M21 al CD71. La unión de los anticuerpos anti-CD71 humanizados se confirmó en la línea celular BxPC3 mediante FACS. Brevemente, las células BxPC3 se etiquetaron con un anticuerpo monoclonal de ratón Mab21 o huCD71 (Ab21.10, Ab21.11 y Ab21.12) a las concentraciones indicadas y posteriormente se detectaron con un anticuerpo de cabra anti-ratón etiquetado con Alexa Fluor 647 o anti-humano IgG etiquetado con Alexa Fluor 647, respectivamente.
En un estudio ilustrativo, la actividad de unión del anti-CD71 Ab21.12 LcB:HcC (VH de SEQ ID NO: 5 y VL de SEQ ID NO: 7) al CD71 recombinante (mediante el uso de ELISA) y células que expresan el CD71 (mediante el uso de citometría de flujo) de fuentes humanas, de mono cynomolgus, de ratón y de rata. Como se muestra en los resultados ilustrativos de la Tabla 1, el anticuerpo anti-CD71 se unió al CD71 recombinante humano y de mono con una afinidad equivalente medida por ELISA, y que eran equivalentes a la afinidad de la holo-transferrina humana por la CD71 humana. El anticuerpo se unió a las líneas celulares que expresan el CD71 humano y de mono (células de cáncer de páncreas BxPC3 humanas y células epiteliales primarias de riñón de mono cynomolgus, respectivamente) con una afinidad equivalente medida por citometría de flujo. No se midió una unión significativa del anticuerpo anti-CD71 al CD71 de ratón recombinante o una línea celular que expresa el CD71 de rata (células de hepatoma de tasa H-4-11-E).
Tabla 1: Unión del anti-CD71 al CD71 humano, de mono, de rata y de ratón por ELISA y citometría de flujo, y unión de holo-transferrina al CD71 humano por ELISA
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Ejemplo 2. Descubrimiento de la máscara
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para identificar y caracterizar residuos de enmascaramiento para su uso en los anticuerpos anti-CD71 activables de la divulgación.
Como se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2016/0355599 A1, el anticuerpo 21.12 anti-CD71, que comprende un VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 7, se usó para cribar una biblioteca de péptidos X15 aleatoria con una diversidad total de 6x1010, donde X es cualquier aminoácido, mediante el uso de un método similar al descrito en la publicación internacional PCT número WO 2010/081173, publicada el 15 de julio de 2010. El cribado consistió en una ronda de separación por MACS y cinco rondas por FACS. La separación inicial por MACS se realizó con Dynabeads de proteína A (Invitrogen) y el anticuerpo 21.12 anti-CD71 a una concentración de 200 nM. Para MACS, se seleccionaron aproximadamente 1 x 1012 células para determinar la unión y se recogieron 1 x 107 células. Se conjugó el 21.12 anti-CD71 con DyLight-488 (ThermoFisher), se confirmó la actividad de unión al CD71 y se usó el 21.12-488 anti-CD71 como sonda fluorescente para todas las todas las rondas por FACS. Las células bacterianas se tiñeron y se recogieron los clones positivos de la siguiente manera: 20 nM del 21.12-488 anti-CD71 con 1x106 células colectadas por FACS en la ronda 1, 5 nM del 21.12-488 anti-CD71 con 6.2x104 células colectadas por FACS en la ronda 2 y 5 nM del 21.12-488 anti-CD71 con 5x103 células y 1 nM del 21.12-488 anti-CD71 con 5x102 células colectadas por FACS en la ronda 3, 1 nM del 21.12-488 anti-CD71 con 2x102 células recolectadas por FACS en las rondas 4 y 5. Se verificó que la población positiva de la segunda ronda de FACS inhibía la unión del anticuerpo 21.12-488 anti-CD71 a la proteína CD71 recombinante. Los clones de péptidos individuales se identificaron mediante análisis de secuencia de 5 nM de los aglutinantes de la ronda 3 de FACS y 1 nM los aglutinantes de las rondas 3, 4 y 5 de FACS.
Los residuos de enmascaramiento identificados incluyen TF01 (QFCPWSYYLIGDCDI; SEQ ID NO: 16) y TF02 (NLCTEHS-FALDCRSY; SEQ ID NO: 17). Las máscaras TF01 y Tf02 se truncaron y se barrieron con alanina para generar familias de anticuerpos activables con diferentes eficiencias de enmascaramiento, incluido el residuo de enmascaramiento TF02.13 (NLCTEHSAALDCRSY; SEQ ID NO: 18).
Estos péptidos enmascaradores se usaron para generar los anticuerpos activables anti-CD71 de la divulgación. Las secuencias de algunos de estos anticuerpos activables anti-CD71 se muestran a continuación en la Tabla A. En algunas modalidades, estos anticuerpos activables anti-CD71 incluyen el resto escindible 2001 (ISSGLLSGRSDNH; SEQ ID NO: 91), el resto escindible 3001 (AVGLLAPPGGLSGRSDNH; SEQ ID NO: 97), el resto escindible 2011 (ISSGLLSGRSDNP; SEQ ID NO: 156) o el resto escindible 3011 (AVGLLAPPGGLSGRSDNP; SEQ ID NO: 164) como se indica.
Mientras ciertas secuencias que se muestran a continuación incluyen la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 138, los expertos en la técnica apreciarán que los anticuerpos anti-CD71 activables de la divulgación pueden incluir cualquier secuencia espaciadora adecuada, tal como, por ejemplo, una secuencia espaciadora del grupo que consiste en QGQSGQG (SEQ ID NO: 138), QGQSGQ (SEQ ID NO: 109), QGQSG (SEQ ID NO: 139), QGQS (SEQ ID NO: 140), QGQ, QG, GQSGQG (SEQ ID NO: 143), QSGQG (SEQ ID NO: 144), SGQG (SEQ ID NO: 145), GQG, G o Q. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CD71 activables de la divulgación pueden no tener una secuencia espaciadora unida a su N-terminal.
Tabla A. Secuencias de anticuerpos activables anti-CD71
Región variable de la cadena pesada del HuCD71_HcC
Secuencia de aminoácidos
QVQLVQSGAEVKKPGASVKKSCEiASGYTFTSYWMHWVRCAPGQGLEWIGAIYPGNSETGYAQKF^GRATIGAD TSTSrflYMELSSLPSEDTAVYYCTRENWDPGFAFWGQGTLirvsS (SEQ ID CTQ: 5)
(continuación)
Secuencia de nucleótidos CAGGTGCAGCTGGTQCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCrGGCGCCTCCGTGAAGATGT'CCTGCAAGGCCI CCGGCTACACCTTCACCAGCTAGTGGArGCACT GGGTGCGACAGGC TCCAGGCCAGGGOCTCGAATGGATCGf CGCCATCT ACCCCGGC AACTCCG AGACAGGCTAC GCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCC ACCCTGACC GCCGAií ACCTCCACCT C CACCGCC TACA T GGAAC7GT CCAGCC T GCGGAGC GAGGAC ACCGC C GTGTAC TACTGCACCÍ GAGAGAACTGGGACCCCGGCTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGTCCTCC (SEQ ID NO; 206)
Cadera pesada HuCD71_HcC-des
Secuencia de aminoácidos
QVQLVQSGAEVK K PGASV KMSCK ASGY T FTSYWMHWV RQAPG<2GLEW IGAIY PGN SETGYAQK FGGEIATLTAI TSTSTAYMELSSLR3EDTAVYYCTPENWDPGFAE'WG0GTLITVSSASTKGPSVFPLAPSSKS'rSGGTAALGCJ VKDYFPEPVTVSWHSGALTSOTHTFPAVLQSSGLYSlSSVV'TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKYEPs SC DKTHTC PPC PAPELLGGP SV F1 FPFKPK DT LMISFT PEVTC WVD VSHED PE VK ETí WYVDGVEVHNAKTKí R E EQY MSTY PVVSVLTVLHQDWLNG EíEYKC EÍVSNKAL PAPIE KT13 KA KGQ P PE PQVYT1PPSE E EMT KMQ'V í LTCLVKGFYPSDIAVEWESHGQFENNYKTTPFVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWaQGNVFSCSVMHEALHNHY' QtfSLSLGPG (G&Q ID MOí 167)
Secuencia de nucleótidos CAGGTGCAffiTTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCC1 CCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGArGCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCTCGAATGGATCGt CGCCATCTACCCCGQCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGAOCGCCGAí ACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCÍ GAGAGAACTGGGACCCCGGCTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGATCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAJ GGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCrTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCACAGCTGCCCTGGGCTGCCTí GT GAAAGAC TAC T TCCCCGAGCCCGT GACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGT GC AC ACC'. TCOCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCrGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCrCCAGCCTGGC CACCCAGACCTACATCrGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAf TCCTGCGAC AAGACCCñCACC TGTCCTCCCTGCCCTGCCCC TGAACTGCTGGGCGGACC TTCCGT GT TTCTGl TCCCCCCAAAGCCCAAGGfiCACCCrGATGArcrCCCGGflCCCCCGAAGTGfiCCTGCGrGGTGGTGGACGTGTÍ CCAiCGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCC AGAGAGGAACAGTACAACTCCACCrACCGGG’FGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGGACCAGGACTGGCTGAACt GCAAAG AGTACAAGTGCAAGGT GTCC AAC AAGGCCCTGCC TGCCCCCATCGAAAAG ACCATCTCCAAGGCC AJ
G&QCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGrGTACACACTGCCACCTAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCC CTGACCTGTCTGGTGAAAGGCT TCTACCCC TCCGATArCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGJ ACAACTACAaGACCACCCCACC TGTGCTGGACTCC GaCGGCTCATTCTTCCTGTaCTCCAA'GCTGACC GTGGÍ CAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGT TCTCC TGCAGCGTGATGCAC GAGGCOCTGCACAACCACTACACÍ CAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGC {SEO ID NO¡ 16$)
Cadera pesada HuCD71_HcC
(continuación)
Secuencia de aminoácidos
QVQLVQSGAEVKKPCASVKMSC KASGYTFT SYWMH WRQAPGQGLEWIGAIY PGN S ET GYAjQKFQGRATLTA! X STS TAYM E LSSL RS EDXAVYYCTRENWDPG EA FYÍÍKíGrLITVS Sñ£X KGPSV FFLAPSSK5X S GGXAAIvGC] VKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV1QSSGLYSISS WTVPSSSLGTQTYICNVHKKP5NTKVDKKVEP] 5C DKTHTC P PC PAP ELLGG P SVFL FP PKPKDTLPfT EPT P EVTCVW DVS HEDP EVKFtTHY V DGVSVHNAKTKI ftEEQY NSTY R W 5 V I/TVLHQDWLNGK EY KC KVSN KALPA P IE K*T ISKA KGQ PEE PQV Y TI, P P S REEMT KNQV! LTCLVKG FY PSD IAVEWESKGQPENNY KTT PPVLDS DGS FFLY 3 KLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNH YT. GKSLSLSPGK {SEC ID SC : 20 )
Secuencia de nucleótidos CAGGrGCAGCrGGTGCAGrCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCC1-CCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCC'] CCGGGTACACCTTCACCAGCTACXGGATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCCAGGGCCTCGAATGGATCGC CGCCATCTACCCCGGCAACTCCGAGACAGGCTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGAGCCACCCTGACCGCCGAC ACCTCCACCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCJ GAGAGAACTGGGACCCCGGCTTCGCCTTCTGGGGCCAGGGCACCCTGA'TCACCGTGTCCTCCGCCAGCACCA; GGGCCCCXCCGr6TTCCCTCT&GOCCCTTCCAGCAAGTCCACCXCTGGCGGCACAGCr6CCCTGGGCTGCCTC GTGAAAGACrñCTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCACACC: TCCCTGCCGTGCTGCAGrCCTCCGGCCTGTACXCCCT GTCCTCCGTGGrGACAGTGCCCTCCTCCAGCCTGGÍ CACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAC TCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCXCCCTGCCCXGCCGCrGAACTGCXGGGCGGACCXtCCGXGXXTCTG'i TOCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGñTGATCTCCCGGACCCCCGAAGrGACCTGCGTGGrGGXGGACGrGXÍ CCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGXGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCC AGAGAGGAACAGXACAACtCCACCTACCGGGXGGXGTCCGrGCXGACCGTGCTGCAOCAGGACTGGCXGAACC GCAAAGAGTACAAGTGCAAGGT GTCCAACAAGGCCCTGCCrGCCOCCATC GAAAAGACCATCTCCAAGGCCAj GGGCCñGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCACCrAGCCGGGAAGAGAXGACCAAGAACCñGGTGTCÍ CTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCXCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGj ACAACTACAAGACCACCCCACCXGTGCTGGACrCCGACGGCTCATrCTTCCrGTACrCCAAGCTGñCCGTGGi CAAGTCCCGGrGGCAGCAGGGCAACGTGTTC1-CCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCrGCACAACCACTkCACÍ CAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG (SEQ ID HO: 21 )
HuCD71_LcB
Secuencia de aminoácidos
DI<2lXQSPSSLSASVGDRVTITCSAS5SVYYHYMPOQKPGKAPfcLWÍYSTSHLASGVPSftfSGSGSGTDYT U r SSMQPEDFATYYCQQARNYPYt fgqgt kleikhtvaapsvFIfppsd EQLESGTASWCLLMHFYprEAKVf WKVDtíñLQSGtíSCESVTEQDSKDSTYSLSSXLT1SFADYEKHKVYACEVTW2GL55PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 19)
HuCD71_LcB
(continuación)
Secuencia de nucleótidos
GACATCCAGRTGACCCAGTCCCCATCCAGCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACAATCACCTGTTCC< CCAGCTCCTCCGTGrACTACArGTACTGGrTCCAGCAGAAGCCCGGÍIAAGGCCCCCAAOCTGTGGATCTACrí CACCTCCAACCTGGCCTCCGGCGTGOCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTOCGGCACCGACTACACCCTGACÍ ATCTCCAGCATGCAGCCCGAGGACTTCQCCACCTACTACrGCCAGCAGCGGCGGAACTACCCCTACACCTTCC GCCAGGGCACCAAGCTGGAAA’rCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCCAGCGTGT'rCATCTTCCCñCCCTCCGACGÍ GCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCOCGCGAGGCCAAGGTGCAí TGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCJ CCTACTCCCTGTCCTCCACCCrGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGrACGCCTGCGMflO GACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGflCCAAGTCCTTCAACCQCGGCGAGTGC (SE Q ID NO: 2OS) Cadena ligera del anticuerpo aclivable anti-CD71-TF01-2001 [espaciador (SEQ ID NO: 13SJ] [huCD71 Lc_TF01 _2001 (SEQ ID NO: 141)] ' " Secuencia de aminoácidos
[ OGOSGQG) [QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSIS5GLL5GRSDNHGGGSDIQMTQSP55LSASVGDRVTITí SASSSVYYMYWPQQKPGKAFKLWlYSTSNLASGV(*SRFSGSGÍGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNY(*Y' FGQGTKLEIKRTVAAP5VFIFPPSDEQLKSGTASWC LLNNFYPREAKVQWKVENALQSGNSQESVTEQDSE[ STYSLSSTLTLSKADYEEÍFfKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNBjGEC] (SEQ ID NO: 22)
Cadena ligera del anticuerpo activable an1i-CD71-TF02.13-2001
[espaciador{SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TFÜ2.13_2Ü01 [SEQ ID NO: 142)]
Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITÍ SASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPY PGQGTKLElKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAEÍVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKi STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNftGEC] (SEQ ID NO: 23)
Cadena ligera del anticuerpo aclrjable anti-CD71-TF02.13-3011
[espaciador {SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TFÜ2.13_3011 [SEQ ID NO: 146)]
Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSAVGILAPPGGLSGFSDNPGGSDIQMTQSPSSLSASVGDR1 T ITCSAS5SVYYMYWFQQfíPGKAPKLWIYSTSNLASGVPSflFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQftftl YPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDMALQSGNSQE5VTEÍ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KH KVYACEVTKQGI3SPVTKSFNPGEC] (SEQ ID NO: 147) Cadena ligera del anticuerpo actrjable anti-CD71-TF02.13-2011
[espaciador{SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TFÜ2.13_2Ü11 [SEQ ID NO: 169)]
Secuencia de aminoácidos [QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNPGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITí SAS SSVYYMYH FQQK PGKAPKLWIY S TSHLASGV PS RFSGSG SGTDYTLTIS5MQFÉ DFATYYCQQRRNY PY PGQGTKLEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAEÍVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK[ ST Y S LSSTLTLS KADYE K H KVYAC EVTHQGLSSPVT KS FNRGEC] (SEQ ID NO: 170)
Cadena ligera del anticuerpo activable an1i-CD71-TF01-3011
[espaciador{SEQ ID NO: 138)] [huCD71Lc_TF01_3011 [SEQ ID NO: 173)]
(continuación)
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDTGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSPS5LSASVGDR'
TITCSASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIYST5NLASGVPSRFSGSGSGTDYT1TISSMQPEDFATYYCQQRRI
YPYTFGQGTELEIKRCVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLHtlFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEíj
DSKDSTYSLSSTLTL5KADYEKHKVYACEVTHQGLS5PVTKSFNRGEC] (SEQIBNO: 174}
Región variable de la cadena ligera del anticuerpo activable anti-CD71-TF0213-2001
[espaciador {SEQ I0 NO: 133); [huCD71Lc_TF02.13_20Ü1 VLdomain (SEQ ID NO: 197)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][NLCTEHSAALDCRSYGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQMTQSPS3LSASVGDRVTITÍ
5ASSSVYYMYHFQQKPGKAPKLHiYSTSilLASGVPSRF5GSGSGTDYT1TISSWQPEDFATYYCQQfiPlIYPY’
FGQGTKLEIK] (SEQ[D NO: I9S)
Región variable de la cadena ligera del anticuerpo activable anti-CD71-TF0213-3011
[espaciador{SEQ ID NO: 133); [huCD71Lc_TF02.13_3011 VLdomain (SEQ ID NO: 199)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQ5GQG](NLCTEHSAALDCR5YOG5SSGGSAVGLLAPFGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSP5SL5A5VGDR1
TI TCSASSSVYYMYWBQQKPGXAPKLVÍIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTI S SMQPEDFATYYCQQRRI
YPYTFGQGTKLEIK](SBQIDNÜ 200)
Acüva!Región variable de la cadena ligera del anticuerpo activable anti-CD71-TF0213-2011
ppMKÍespaci ador {SEQ ID NO: 133); [huCD71Lc_TF02.13_2011 VLdomain (SEQ ID NO: 201)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG](NLCTEHSAALDCRSYGEGSSGGSISSGLLSGHSEN'PGGGSDIQHTQSPSSLSASVGDRVTITÍ
SASSSVYYMYWFQQKPGKAPKLWIY3TSNLASGVPSRF3GSGSGTDYTLTISSKQPEDFATYYCQQRRNYPY1
FGQGTKLEIK] (SEQID NO: 202)
Región variable de la cadena ligera del anticuerpo activable anti-CD71-TF01-2ÜÜ1
[espaciador {SEQ ID NO: 133); [huCD71 Lc_TF01_2001 dominio VL {SEQ ID NO: 195)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPUSYYLIGDCDIGGGSSGGSISSGLLSGRSDNHGGGSDIQHTQSPSSLSA5VGDRVTIT(
SASSSVYYMYHFQQKPGKAPKLWIY3TSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSMQPEDFATYYCQQRRNYPY'
FGQGTKLEIK] (SEQIDNQ; 196)
Región variable de la cadena ligera del anticuerpo activable anti-CD71-TFO1-3011
[espaciador{SEQ ID NO: 133)] [huCD71Lc_TF01_3011 VLdomain (SEQ ID NO: 203)]
Secuencia de aminoácidos
[QGQSGQG][QFCPWSYYLIGDCDIGGGSSGGSAVGLLAPPGGLSGRSDNPGGSDIQMTQSFSSLSASVGDR1
TITCSASS3VYYMYWFQQKFGKAPKLWIYSTSNLASGVFSRFSGSGSGTDYTLT155MQPEDFATYYCQQRRI
YFYTFGQGTKLEIK] (SEQIDNO 204)
Ejemplo 3. Generación y caracterización de anticuerpos activables anti-CD71 activables y anticuerpos activables conjugados anti-CD71
Los estudios proporcionados en el presente documento se diseñaron para generar algunos anticuerpos activables anti-CD71 de la divulgación.
Se generaron anticuerpos activables anti-CD71 con diferentes eficiencias de enmascaramiento (es decir, una medida de la capacidad del MM del anticuerpo activable para bloquear la unión del AB del anticuerpo activable a su diana). Los péptidos TF01 y TF02 se mutaron mediante truncamiento y barrido con alanina como se describe en el Ejemplo 2, y estas variantes de péptidos enmascaradores se usaron para generar familias de anticuerpos activables anti-CD71 de la presente divulgación con una gama de eficiencias de enmascaramiento.
Se evaluó la unión de anticuerpos activables anti-CD71 de la presente divulgación a la línea celular NC1H292 (también denominada en el presente documento como H292) mediante el uso de FACS. Brevemente, las células se marcaron con el anticuerpo huCD71 o el anticuerpo activable en un intervalo de concentraciones y posteriormente se detectaron con un anticuerpo secundario IgG antihumano de cabra etiquetado con Alexa Fluor 647 para determinar una curva de unión. Como se resume en los datos de unión ilustrativos más abajo en la Tabla 2, los anticuerpos activables anti-CD71 de la presente divulgación muestran un intervalo de eficiencia de enmascaramiento comparable con el anticuerpo anti-CD71 parental (huCD71 21.12 Ab).
Tabla 2: Eficiencias de enmascaramiento de residuos de enmascaramiento
Figure imgf000047_0001
Estos datos ilustrativos de la Tabla 2 muestran que ambas máscaras (TF01 y TF02.13) inhiben la unión del anticuerpo anti-CD71 al CD71 cuando el anticuerpo activable está en un estado intacto o sin escindir. Estos datos ilustrativos también demuestran que el residuo de enmascaramiento TF01 demuestra una mayor eficiencia de enmascaramiento que el residuo de enmascaramiento TF02.13.
Ejemplo 4: Caracterización de la actividad de unión del anticuerpo activable al CD71 y del anticuerpo activable conjugado al CD71
Este ejemplo muestra que los anticuerpos activables anti-CD71 y los anticuerpos activables conjugados anti-CD71 de la presente divulgación demostraron una afinidad de unión más baja a la proteína CD71 recombinante y humana de superficie celular y de cynomolgus cuando están en su forma intacta sin escindir, en comparación con sus formas correspondientes escindidas por proteasa.
Como se muestra en las FIGURAS 3A y 3B, se usó un ensayo de unión en fase sólida (ELISA) para demostrar la afinidad de unión de los anticuerpos activables anti-CD71 y de los anticuerpos activables conjugados anti-CD71 de la presente divulgación al CD71 recombinante, tanto en sus formas intactas, no escindidas como en sus formas escindidas activadas por proteasa. En estos ejemplos, se revistió la proteína recombinante CD71 (R&D Systems) de cynomolgus (Figura 3B) o humana (Figura 3A) en placas de ELISA a una concentración de 1 pg ml, y luego se incubó con la concentración indicada del anticuerpo activable anti-CD71 ("anti-CD71-TF02.13-2011") de la presente divulgación, o el anticuerpo activable conjugado anti-CD71 ("anti-CD71-TF02.13 -2011-vc-MMAE E2 ") E2 intacto, sin escindir (es decir, que tiene un DAR de ~ 2) de la presente divulgación. También se ensayaron el anticuerpo activable anti-CD71 ("anti-CD71-TF02.13-2011 (Act)") o el anticuerpo activable conjugado anti-CD71 ("anti-CD71-TF02. 13-2011 (Act)") E2 (es decir, que tiene un DAR de ~ 2) de la presente divulgación, después del tratamiento con una proteasa que escindió el resto escindible del componente de anticuerpo activable.
Como se discute en el presente documento, "E2" se refiere a una composición de un anticuerpo activable conjugado anti-CD71 dado de la presente divulgación que incluye esencialmente solo la especie del anticuerpo activable conjugado donde la carga de fármaco es 2 moléculas de fármaco por cada molécula de anticuerpo activable, y esencialmente no incluye ninguna o cantidades mínimas de las otras especies posibles (es decir, donde la carga de fármaco es 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, etc.) Como se discute en el presente documento, "DAR" se refiere a la proporción promedio entre el fármaco (en este caso, MMAE) y el anticuerpo activable (es decir, CD71-TF02.13-2011) en una población de tales anticuerpos activables conjugados. Así, en este ejemplo, anti-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2 se refiere a una composición que incluye solo anticuerpo activable anti-CD71-TF02.13-2011 en el cual cada anticuerpo activable tenía una carga de fármaco de 2 equivalentes de vc-MMAE y un DAR de aproximadamente 2 como se describe en el Ejemplo 26.
La cantidad de anticuerpo unido en cada muestra se detectó mediante incubación y detección mediante anticuerpo antihumano de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante y detección de Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific). Más abajo se muestra un resumen de las afinidades de unión:
Tabla 3A: Actividad de unión ilustrativa observada al CD71 de anticuerpos activables anti-CD71 no escindidos y escindidos y anticuerpos activables conjugados anti-CD71
Figure imgf000047_0002
Las Figuras 3C y 3D muestran en un ensayo FACS los resultados ilustrativos de que los anticuerpos activables anti-CD71 de la presente divulgación y los anticuerpos activables conjugados anti-CD71 de la presente divulgación se unen a células que expresan el c D71 humano (Figura 3C) y el CD71 de cynomolgus (Figura 3D) con una constante de disociación más alta y una afinidad más baja que la del correspondiente anticuerpo activable anti-CD71 activado por proteasa o el anticuerpo activable conjugado anti-CD71 activado por proteasa de la presente divulgación. Estos resultados ilustrativos muestran que la afinidad de unión de los anticuerpos anti-CD71 activados por proteasa escindidos de la presente divulgación y los anticuerpos activables conjugados anti-CD71 activados por proteasa escindidos de la presente divulgación se unieron a las células con una afinidad similar al anticuerpo anti-CD71 parental, por lo tanto se demuestra el efecto del residuo de enmascaramiento en la inhibición de la unión del anti-CD71 a su diana en el anticuerpo activable intacto o en el anticuerpo activable conjugado intacto.
En el estudio ejemplar mostrado en las Figuras 3C y 3D, la unión de los anticuerpos de la presente divulgación a las líneas celulares indicadas se realizó mediante el uso de un método estándar de etiquetado por FACS. Brevemente, las células se etiquetaron con los anticuerpos indicados o los anticuerpos activables de la presente divulgación: un anticuerpo de control (AB095), un anticuerpo anti-CD71 humano (Ab 21.12, que tiene un v H de SEQ ID NO: 5 y un VL de SeQ ID NO: 7), un anticuerpo activable anti-CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011), o un anticuerpo activable conjugado E2 (es decir, que tiene un DAR de ~2) anti-CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2). Además, las afinidades de unión del anticuerpo activable anti-CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011 (Act)) y del anticuerpo activable conjugado E2 (es decir, que tiene un DAR de ~2) anti-cD71 (anti-CD71 TF02. 13-2011-vcMMAE E2 (Act)) también se ensayaron después de la activación de la proteasa que escindió el resto escindible de la misma. Cada artículo de prueba se aplicó a las concentraciones indicadas y posteriormente se detectó con un anticuerpo secundario IgG anti­ humano de cabra etiquetado con Alexa Fluor 647.
La Tabla 3B muestra más abajo los valores de CE50 basados en las curvas de unión representadas en las Figuras 3C a 3D. Estos resultados muestran que el anticuerpo activable intacto y el anticuerpo activable conjugado intacto se unieron a su diana con menor afinidad que sus homólogos activados por proteasa, y que los anticuerpos activables activados por proteasa se unieron con una afinidad similar a la del anticuerpo anti-CD71 parental.
Tabla 3B: Actividad de unión al CD71 ilustrativa observada en aglutinantes anti-CD71
Figure imgf000048_0001
En un estudio ejemplar similar, se usaron ELISA y ensayos de citometría de flujo para demostrar la afinidad de unión de anticuerpos anti-CD71, anticuerpos conjugados anti-CD71, anticuerpos activables anti-CD71 (forma intacta, no escindida y forma escindida activada por proteasa) y anticuerpos activables conjugados anti-CD71 (forma intacta, no escindida y forma escindida activada por proteasa) de la presente divulgación al CD71 recombinante al CD71 recombinante humano y de cynomolgus y a líneas celulares que expresan el CD71 humano y de cynomolgus. Los artículos de prueba fueron el anticuerpo anti-CD71 Ab21.12 (VH de SEQ ID NO: 5 y un VL de SEQ ID NO: 7), el anticuerpo conjugado E2 (es decir, que tiene un DAR de ~2) anti-CD71 Ab21.12-vcMMAE, el anticuerpo activable anti-CD71-TF02.13-2011 y el anticuerpo activable conjugado E2 con DAR (es decir, que tiene un DAR de ~2) anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE.
En los ejemplos de ELISA, se recubrieron placas de ELISA con proteínas recombinantes ECD CD71 de cynomolgus o humanas, y luego se incubaron con un intervalo de concentraciones de los artículos de prueba de la presente divulgación, seguido de la medición de la cantidad del artículo de prueba unido con un anticuerpo secundario. Los artículos de prueba que se activaron se incubaron con la enzima proteasa matriptasa. Los valores de Kd aparentes ilustrativos para cada artículo de prueba se muestran en la Tabla 3C.
En el estudio ilustrativo que también se muestra en la Tabla 3C, la unión de los anticuerpos de la presente divulgación a las líneas celulares indicadas se realizó mediante el uso de un método estándar de etiquetado por FACS. Los resultados de la citometría de flujo reflejan el Kapp promedio medido en cuatro líneas celulares humanas (cáncer de mama humano HCC1806, cáncer colorrectal humano HT-29, cáncer de pulmón humano NCI-H292 y cáncer de pulmón humano NCI-H520) y una línea celular CHO-K1 que expresa el CD71 de mono cynomolgus. Los valores de Kd aparentes ilustrativos para cada artículo de prueba se muestran en la Tabla 3C.
Tabla 3C: Actividad de unión al CD71 ilustrativa observada de anticuerpos anti-CD71, anticuerpos conjugados anti-CD71, anticuerpos activables anti-CD71 no escindidos y escindidos y anticuerpos activables conjugados anti-CD71
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Estos resultados ilustrativos muestran que los anticuerpos activables intactos y los anticuerpos activables conjugados intactos mostraron una afinidad aparente más baja por el CD71 en comparación con sus homólogos activados o sus anticuerpos parentales.
Ejemplo 5: Expresión de CD71 en múltiples tumores primarios y metastásicos derivados de pacientes Este ejemplo muestra que el CD71 se expresa en una gran variedad de tipos de tumores primarios y metastásicos mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) mediante el uso de un anticuerpo anti-CD71.
Las Figuras 1 y 2 muestran que el CD71 se expresa altamente en un gran número de muestras de tumores primarios y metastásicos, mediante el uso de tinción IHC con un anticuerpo anti-CD71 adquirido comercialmente en múltiples tumores primarios derivados del paciente y micromatrices de tejido metastásico derivado del paciente (TMA). La Figura 1 muestra una tinción IHC del CD71 en cáncer de cabeza y cuello (1), cáncer de cuello uterino (2), cáncer de mama (3), linfoma no Hodgkin (LNH) en los ganglios linfáticos (4), cáncer de pulmón (5), un cáncer de vejiga (6), un cáncer de ovario (7) y un cáncer de esófago (8). La Figura 2 muestra una tinción IHC del CD71 en un micromatriz de tejido (TMA) que consta de núcleos de tumores metastásicos que demostraron un nivel de expresión del CD71 de moderado a alto en la mayoría de los núcleos. En la Tabla 4A se muestra un resumen de la expresión del CD71 en muestras de tumores humanos mediante inmunohistoquímica (IHC).
T a b la 4A : R e su m e n d e la e x p re s ió n del CD 71 en m u es tra s d e tu m o re s h u m an o s p o r IH C
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E je m p lo 6 : E fic ie n c ia d e e n m a s c a ra m ie n to y e fic a c ia in vivo del a n ti-C D 71 -A A D C a c tiv a b le en el m o d e lo d e x e n o in je rto en C R C
Este ejemplo muestra que la eficiencia de enmascaramiento de los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación es un factor en su eficacia en un modelo de xenoinjerto en ratón de cáncer colorrectal (CRC) HT29.
En estos estudios, los tumores HT29 del xenoinjerto en ratones se hicieron crecer hasta un volumen promedio de 150 mm3. A continuación, los ratones se aleatorizaron en grupos y el día 1 recibieron una dosis de 3 mg/kg (o indicado de otra manera) de cada artículo de prueba indicado. Se representó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
La Figura 4A muestra que un anti-CD71 AADC ilustrativo de la presente divulgación (anti-CD71 TF01-3011-vc-MMAE) con una máscara de mayor afinidad mostró cierta inhibición del crecimiento tumoral en relación con un control de vehículo después de una dosis única de 3 mg/kg. En comparación, la Figura 4B mostró un anti-CD71 AADC ilustrativo de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) con una máscara de menor afinidad pero con el mismo sustrato escindible mostró una regresión esencialmente completa del xenoinjerto después de una sola dosis de 3 mg/dosis kg. La Figura 4C muestra un anti-CD71 AADC ilustrativo de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) con la máscara de menor afinidad pero con el mismo sustrato escindible también mostró una regresión esencialmente completa del xenoinjerto HT29 en una sola dosis de 2 mg/kg o de 3 mg/kg. Estos resultados ilustrativos muestran que un AADC con el residuo de enmascaramiento de afinidad más baja demostró una mayor eficacia que un AADC con un residuo de enmascaramiento de afinidad más alta.
E je m p lo 7 : S u s tra to s e s c in d ib le s y e fic a c ia in vivo d e l A n ti-C D 71 -A A D C a c tiv a b le en m o d e lo s d e x e n o in je rto d e C R C
Este ejemplo muestra el efecto del sustrato escindible sobre la eficacia de anticuerpos activables conjugados (AADC) anti-CD71 humano ilustrativos de la presente divulgación en un modelo de xenoinjerto en ratón.
En estos estudios, los tumores de xenoinjerto HT29 (derivados del cáncer colorrectal) en ratones se hicieron crecer hasta un volumen promedio de 150 mm3. A continuación, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos y se dosificaron el día 1 con la cantidad indicada del artículo de prueba indicado. Se representó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
La Figura 5 muestra que un anti-CD71 AADC ilustrativo de la presente invención (CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) muestra una regresión completa o casi completa en el modelo de xenoinjerto en ratón a dos dosis diferentes. Estos datos ilustrativos demuestran que la eficacia del AADC indicado (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) con un sustrato menos escindible es sustancialmente la misma que la eficacia del AADC (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) con un sustrato más escindible mostrado en las Figuras 4B y 4C.
E je m p lo 8 : E fic a c ia in vivo d e a n ti-C D 71 -A A D C a c tiv a b le en m ú ltip le s m o d e lo s d e x e n o in je rto
Este ejemplo muestra la eficacia del anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE AADC de la presente divulgación en dos proporciones de fármaco a anticuerpo (DAR) diferentes en varios modelos de xenoinjerto en ratón.
En estos estudios, se crecieron hicieron crecer en ratones tumores de xenoinjerto de cáncer de ovario (OV-90; Figura 6B), cáncer de estómago (NCI-N87; Figura 6A), cáncer de mama ER+ (BT474; Figura 6C) o cáncer de mama triple negativo (HCC-70; la Figura 6D) hasta un volumen promedio de 150 mm3' A continuación, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos y se dosificaron el día 1 con el artículo de prueba indicado. La cantidad de cada AADC que se administró se emparejó con la dosis en función de la cantidad de toxina MMAE, de tal modo que el anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE (que tiene un DAR promedio de ~ 3) se administró a 3 mg/kg y el anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (que tiene un DAR promedio de ~ 2) se administró a 4,3 mg/kg. Se representó gráficamente el volumen tumoral medio ± SEM para cada punto de tiempo.
Las Figuras 6A-6B muestran que un anti-CD71 AADC ilustrativo de la presente divulgación (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) muestra una regresión completa o casi completa en un modelo de xenoinjerto en ratón de cáncer de ovario y estómago. El anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (es decir, que tiene un DAR de ~ 2), que incluía AADC purificados cada uno con dos equivalentes de toxina MMAE, también mostró regresiones completas en los mismos modelos. En todos los casos, como se muestra en las Figuras 6C y 6D, incluso cuando no se observó una regresión completa o casi completa, las actividades del E2 (es decir, con un DAR de ~ 2) y los AADC de DAR más altos fueron equivalentes o casi equivalentes. Estos datos ilustrativos demuestran que la eficacia equiparada en dosis del AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2) E2 (es decir, que tiene un DAR de ~ 2) es comparable al DAR AADC correspondiente más alto.
Como se muestra en la Tabla 4B, la eficacia del anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC que tiene un DAR de ~ 2 se probó contra una variedad de líneas celulares derivadas de paciente (PDX) o de líneas celulares de cáncer (CDX) en un modelo de xenoinjerto en ratón, y se les administró una dosis menor o igual a 6 mg/kg, una o dos veces. Los resultados, que se resumen más abajo, muestran que el AADC demostró al menos alguna eficacia, con un intervalo desde regresión a la estasis hasta la inhibición del crecimiento tumoral en casi todos los modelos probados.
T a b la 4B : E fic a c ia d e l an ti-C D 71 T F 02.13 -2011 -v c -M M A E E2 en x e n o in je rto s d e riv a d o s d e lín eas ce lu la re s
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Ejemplo 9: Ensayos bioanalíticos para determinar los niveles de toxina conjugada y libre en AADC intacta y total en muestras de animales tratados
Este ejemplo muestra flujos de trabajo ilustrativos para ensayos donde se miden los niveles de metabolitos en muestras de prueba, incluidos los niveles de toxina conjugada y libre, y los niveles de anticuerpos activables conjugados intactos y totales.
Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran los flujos de trabajo esquemáticos para los ensayos bioanalíticos ilustrativos para determinar la cantidad del anticuerpo activable intacto y total (es decir, combinado intacto y escindido) en los monos tratados, así como la cantidad de AADC intacto (con toxina no escindida) y toxina escindida en los monos tratados. Mediante el uso del protocolo de ensayo ilustrativo representado en la Figura 7A, la cantidad total del anticuerpo activable intacto y escindido (por ejemplo, anti-CD71 TF02.13-3001) en la muestra puede capturarse mediante perlas magnéticas de proteína A y, posteriormente, desnaturalizarse (RapiGest™), reducirse con ditiotreitol, alquilarse y digerirse con tripsina. Los fragmentos de péptidos resultantes pueden analizar se mediante el uso de LCMS/MS de fase inversa para identificar y cuantificar los fragmentos de péptidos característicos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. En este ensayo en particular, uno o más péptidos que son característicos de la porción de anticuerpo del anticuerpo activable o del anticuerpo activable conjugado pueden identificarse y cuantificarse mediante el uso de LC-MS/MS de fase inversa para determinar la cantidad total del anticuerpo activable intacto y escindido, por lo tanto, medir la cantidad de anticuerpo activable intacto y escindido total en la muestra.
En el mismo ensayo, uno o más péptidos que son característicos de la porción escindible (CM) no escindida y de la porción de residuo enmascaradora (MM) del anticuerpo activable (por ejemplo, del extremo N-terminal de la cadena ligera de anti-CD71TF02.13-2011) puede identificarse y cuantificarse mediante el uso de LC-MS/MS de fase inversa para determinar la cantidad total del anticuerpo activable intacto, lo que permite medir la cantidad del anticuerpo activable intacto en la muestra.
Mediante el uso del protocolo de ensayo ilustrativo representado en la Figura 7B, puede determinarse la cantidad total de AADC (por ejemplo, anti-CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE) que permanece conjugado con su toxina (MMAE) en la muestra. En este ensayo, la cantidad total del anticuerpo activable, tanto conjugado como no conjugado, es capturado por proteína A MabSelect®. Esta fracción se trata con una cisteína proteasa para escindir la toxina enlazadora, lo que libera cualquier toxina que permaneciera conjugada con su anticuerpo activable. Mediante el uso de LC-MS/MS de fase inversa para analizar la fracción escindida por la cisteína proteasa, la toxina característica (por ejemplo, MMAE) que permaneció conjugada con el anticuerpo activable capturado puede identificarse y cuantificarse, lo que permite medir la cantidad de toxina conjugada en la muestra.
Mediante el uso del protocolo de ensayo ejemplar representado en la Figura 7C, puede determinarse la cantidad total de toxina en la muestra, que incluye toxinas escindidas del AADC en el animal. En este ensayo ejemplar representado en la Figura 7C, la proteína total de la muestra se precipita, o que deja la toxina no conjugada libre (MMAE) en el sobrenadante. El sobrenadante puede analizarse mediante el uso de LC-MS/MS de fase inversa para identificar y cuantificar la toxina característica (por ejemplo, MMAE) que no se asoció con la proteína precipitada, por lo tanto, se mide así la cantidad de toxina no conjugada en la muestra. En estos ensayos, se incluyeron estándares internos (por ejemplo, SILu™ Mab, Sigma-Aldrich) para permitir la cuantificación.
Ejemplo 10: Tolerabilidad y estabilidad del anti-CD71-AADC y Anti-CD71 ADC en monos Cynomolgus
Este ejemplo muestra que los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación son bien tolerados en monos cynomolgus en comparación con el correspondiente conjugado de fármaco y anticuerpo (ADC) anti-CD71 parental basado en una o más lecturas hematológicas y clínicas. Los resultados se resumen más abajo en la Tabla 5 y se resumen en la Figura 17.
En este estudio, los monos cynomolgus se trataron por vía intravenosa con el AADC o ADC indicado, con la dosis indicada en los días 1 y 21. Solo se toleró una dosis para el anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE AADC y solo se administró una dosis para el anti-CD71-vc-MMAE E2 (es decir, que tiene un DAR de ~ 2) ADC. La estabilidad de los anticuerpos activables (es decir, anticuerpo activable total frente a anticuerpo activable intacto) en las muestras obtenidas de cada animal se realizó como se describe en el Ejemplo 9 mediante el uso de LC/MS/MS de fase inversa)
Tabla 5: Resumen de la tolerabilidad y estabilidad del anti-CD71 AADC y ADC en monos cynomolgus
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La pérdida de peso corporal se determinó con la medida de peso más baja después de la 1ra dosis administrada. El recuento basal de neutrófilos fue de al menos 1000 por pl.
Como se resume en la Tabla 5, el E2 no enmascarado (es decir, que tiene un DAR de ~ 2) ADC (Anti-CD71-vc-MMAE E2) demostró ser letal dentro de los 8 días de la primera dosis.
Los resultados ilustrativos resumidos en la Tabla 5 también muestran que los AADC con el sustrato menos escindible (es decir, anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE y anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2) se toleraron mejor y demostraron un nivel más alto de estabilidad circulatoria en un primate no humano que el AADC correspondiente con el sustrato más escindible (es decir, anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE). Por último, los resultados ilustrativos muestran que el AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (es decir, que tiene un DAR de ~ 2)) demostró una mejor tolerabilidad medible en un primate no humano que el correspondiente DAR AADC más alto (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE).
Ejemplo 11: Estabilidad y farmacocinética del anti-CD71-AADC en monos cynomolgus
Este ejemplo muestra la estabilidad y la farmacocinética de los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación en monos cynomolgus.
En este estudio, cuyos resultados se describen con más detalle en los ejemplos 12 a 14, cuatro grupos de monos cynomolgus se trataron por vía intravenosa con el anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2 (es decir, con un DAR de ~ 2) indicado o un vehículo de control con la dosis y el esquema indicados mostrados en la Tabla 6. Se obtuvieron muestras de cada animal en los días indicados en la Tabla 6, los cuales se analizaron para determinar el anticuerpo activable total e intacto y la toxina MMAE, conjugada y no conjugada, de la manera descrita en el ejemplo 9.
Tabla 6: Diseño del estudio de toxicidad del anti-CD71 AADC
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Como se resume en la Tabla 6, a los monos cynomolgus se les administró el vehículo o el anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC mediante bolo IV lento a los niveles de dosis y esquemas mostrados. Las muestras de sangre para el análisis toxicocinético se procesaron para obtener el plasma y se almacenaron a -80 °C antes del análisis. Se obtuvieron muestras de suero para análisis antifármacos antes de la primera dosis y 7 días después de la segunda dosis para los Grupos 1-3, y 22 días después de la primera dosis para el Grupo 4. Todos los grupos contenían tres animales (2 machos y 1 hembra).
Ejemplo 12: Estabilidad del anti-CD71-AADC en monos cynomolgus
Este ejemplo muestra la estabilidad de los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación en monos cynomolgus.
Como se muestra en los resultados ilustrativos de las Figuras 8A y 8B, las concentraciones plasmáticas del anticuerpo activable total e intacto (anti-CD71 TF02.13-2011) del AADC administrado se determinaron de la manera descrita en los ejemplos 9 y 11. Los límites inferiores de cuantificación (LLOQ) para el anticuerpo activable tanto intacto como total fueron 0,633 nM como se indica. Estos resultados ilustrativos demuestran que la concentración en plasma de anticuerpos activables intactos se mantuvo generalmente durante el intervalo de dosificación de 21 días, ya un nivel que era proporcional a la dosis administrada originalmente. Incluso 7 días después de la dosis, aproximadamente el 80 % del anticuerpo activable conjugado (anti-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2) en plasma estaba en forma de profármaco intacto.
Como se muestra en los resultados ilustrativos de las Figuras 9A y 9B, las concentraciones plasmáticas de toxina MMAE conjugada y no conjugada se determinaron de la manera descrita en los ejemplos 9 y 11. El límite inferior de cuantificación (LLOQ) fue 1,77 nM para MMAE conjugado y 0,31 nM para MMAE no conjugado como se indica. Estos resultados ilustrativos demuestran que menos del 1 % del MMAE total medido en la concentración plasmática estaba en forma no conjugada.
Ejemplo 13: Cambio de las proporciones de fármaco a anticuerpo activable después de la dosificación de anti-CD71-AADC en monos cynomolgus
Este ejemplo muestra la relación observada de fármaco (MMAE) a anticuerpo activable (anti-CD71 TF02.13-2011) en plasma después de la dosificación de monos cynomolgus con los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación.
Las concentraciones plasmáticas del anticuerpo activable total e intacto (anti-CD71 TF02.13-2011) se determinaron de la manera descrita en los ejemplos 9 y 11. Como se muestra en la Figura 10, la proporción de fármaco respecto al anticuerpo activable se calculó al dividir la concentración de MMAE conjugado (ver ejemplo 12 y Figura 9A) por la concentración del anticuerpo activable total (ver ejemplo 11 y Figura 8A) en cada punto de tiempo indicado. Las proporciones promedio y las desviaciones estándar para puntos de tiempo específicos se muestran en la Tabla 7. Estos resultados ilustrativos demuestran que la proporción observada del fármaco MMAE al anticuerpo activable cambió con el tiempo de una manera que fue consistente entre cada una de las tres (3) dosis. En cada dosificación, el DAR calculado del AADC intacto comenzó en ~ 2 inmediatamente después y dentro de las 4 horas de la administración, y esta proporción descendió a aproximadamente 1 en aproximadamente 96 horas (es decir, aproximadamente 4 días) después de la dosis.
Tabla 7: Proporción de fármaco respecto al anticuerpo activable
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Ejemplo 14: Parámetros farmacocinéticos del anti-CD71-AADC en monos cynomolgus
Este ejemplo muestra los parámetros farmacocinéticos de los anticuerpos anti-CD71 humano activables con toxinas conjugadas (AADC) de la presente divulgación en monos cynomolgus.
Las concentraciones plasmáticas del anticuerpo activable total e intacto (anti-CD71 TF02.13-2011) se determinaron de la manera descrita en los ejemplos 9 y 11. Como se muestra en la Tabla 8, la Cmáx media para un analito dado se basó en la concentración plasmática máxima observada. El AUC0-7 medio se basó en el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo de los días 0 a 7. Las estimaciones de la vida media para el anticuerpo activable conjugado total, el anticuerpo activable conjugado intacto y el MMAE conjugado oscilaron entre 2,5 y 6,3 días. No se generaron estimaciones de vida media para MMAE no conjugado.
Tabla 8: Proporción de fármaco respecto al anticuerpo activable
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Ejemplo 15: Ensayo de anticuerpos antifármacos
Este ejemplo describe el uso de un ensayo puente para controlar la formación de anticuerpos anti-fármaco (ADA) en los animales probados.
Se recolectaron muestras de plasma para el análisis de ADA antes del estudio y 7 días después de la segunda dosis. Se detectaron anticuerpos antifármaco en 3 de los 9 animales dosificados en el estudio.
Ejemplo 16: Citotoxicidad in vitro del anticuerpo activable conjugado anti-CD71
Este ejemplo describe ensayos de citotoxicidad in vitro en líneas celulares derivadas de tumores humanos de anticuerpos activables conjugados anti-CD71 intactos y activados de la presente divulgación en comparación con un ADC control de isotipo.
Una actividad citotóxica in vitro ilustrativa del anticuerpo activable conjugado anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (HC de SEQ ID NO: 167 y LC de SEQ ID NO: 169) de la presente invención es, con o sin pretratamiento con matriptasa, se evaluó y se comparó con un anticuerpo control de isotipo del conjugado que no se une al CD71 (AB095-vcMMAE con DAR de 2, donde AB095 es específico para la toxina tetánica). La citotoxicidad de los artículos de prueba se probó en HT29 (línea celular de cáncer colorrectal humano), H292 (línea celular de cáncer de pulmón humano), H520 (línea celular de cáncer de pulmón humano) y HCC1806 (línea celular de cáncer de mama humano) al incubar cada artículo de prueba con cada línea celular durante 5 días, y luego medir la viabilidad celular en un intervalo de concentraciones de cada artículo de prueba para determinar la CE50 para cada artículo de prueba. Los resultados se resumen más abajo en la Tabla 9.
T a b la 9: V a lo re s d e C E 50 para e n s a y o s d e c ito to x ic id a d in vitro en c é lu la s tu m o ra le s h u m an as
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Estos resultados ilustrativos muestran que la citotoxicidad in vitro del anticuerpo activable conjugado anti-CD71 intacto fue similar a la del control de isotipo, pero aumentó sustancialmente por la activación con matriptasa.
Ejemplo 17: Unión al Fc y activación del complemento por el anticuerpo activable conjugado anti-CD71
Este ejemplo demostró la capacidad de los anticuerpos activables conjugados anti-CD71 de la presente divulgación para mediar en los mecanismos basados en la función efectora tales como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
La porción de fragmento cristalizable (Fc) de un anticuerpo IgG puede mediar en una variedad de funciones, algunas de las cuales ocurren mediante la unión a receptores Fc y a C1q. Estas funciones incluyen la inducción de citocinas, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) mediante la activación de la vía clásica del sistema del complemento, la fagocitosis y la homeostasis de los anticuerpos mediante el reciclaje de IgG. (Ravetch y otros, Annu Rev Immunol., 2001;19:275-290; Roopenian y otros, Nat Rev Immunol. 2007;7:715-725).
La homeostasis de los anticuerpos está regulada en parte por el receptor neonatal relacionado con Fc, FcRn, el cual está presente en las células epiteliales intestinales, las células endoteliales vasculares y las células presentadoras de antígenos profesionales. Intracelularmente, el FcRn está presente en vesículas; en endosomas ácidos a pH bajo, puede unirse a la porción Fc de una IgG que ha sido absorbida por pinocitosis. Luego, la IgG se libera cuando los endosomas se reciclan a la superficie celular como resultado de la exposición a un pH neutro extracelular. Este proceso permite el control del tráfico de IgG a través de las barreras epiteliales de una sola capa y protege las moléculas de IgG del catabolismo, lo que prolonga la vida media sérica de IgG. (Roopenian). De hecho, se ha demostrado que las mutaciones que potencian la unión del FcRn a pH bajo pero mantienen una unión baja a pH fisiológico tienen una vida media en suero más prolongada. (Hinton y otros, J Biol Chem. 2004;279:6213-6216; Hinton y otros, J Immunol. 2006;176:346-356)
El sistema FcyR humano está compuesto por receptores tanto activadores (FcyRI, FcYRIIa y FcYRIIIa) como inhibidores (FcYRIIb). FcyRI, un receptor de IgG1 de alta afinidad, es expresado por células de linaje monocítico. (Li y otros, J Immunol. 2008;181:1012-1018) FcYRIIa es un receptor de IgG de baja afinidad más ampliamente expresado que se une preferentemente a inmunocomplejos. (Littaua y otros, J Immunol., 1990;144:3183-3186) FcyRIIb se expresa principalmente en el linaje monocítico y en las células B y es un receptor de IgG inhibidor de baja afinidad. Tras la unión del FcYRIIb a los complejos de IgG, se bloquean todos los procesos dependientes del calcio como la desgranulación, la fagocitosis, la ADCC, la liberación de citocinas y la activación proinflamatoria. (Clynes y otros, Nat. Med., 6:446-446 (2000); Minard-Colin y otros, Blood, 112:1205-1213 (2008); y Hamaguchi y otros, J. Exp. Med. 203:743-753 (2006)). El FcYRIIIa es un receptor de baja afinidad responsable de la actividad ADCC de las células NK. (Ravetch) Para aumentar la diversidad de los receptores Fcy, existen variantes polimórficas del FcYRIIa (H131 frente a R131) y del FcYRIIIa (V158 frente a F158) que tienen diferencias en las afinidades por las moléculas de IgG. (Bruhns y otros, Blood, 2008;113:3716-3725).
La capacidad de los anticuerpos para mediar una variedad de funciones a través del FcYR o de los sistemas efectores del complemento permite la posibilidad de un efecto farmacológico exagerado no intencional en productos biológicos modificados basados en IgG. La reactividad cruzada desconocida en los linfocitos de sangre periférica es capaz de desencadenar la reticulación de los receptores Fcy. Debido a que las interacciones entre los receptores Fcy reticulados pueden mediar una variedad de funciones que incluyen la inducción de citocinas, ADCC y fagocitosis (Ravetch), es importante determinar la capacidad de los anticuerpos terapéuticos para unirse a dianas no deseadas en sangre o en tejidos.
Métodos - ensayo de unión de FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa y FcRn por resonancia de plasmón superficial
Se capturaron los FcyRII y FcyRIII humanos recombinantes a través de la etiqueta 6xHis para evaluar su unión al anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE, anti-CD71 Ab21.12 (IgG1/K), AB095-MMAE-E2 y AB095 (IgG1/K) por resonancia de plasmón superficial (Biacore). Los anticuerpos anti-6xHis de ratón se inmovilizaron directamente en un chip CM5 mediante el acoplamiento de amina de acuerdo con el protocolo del fabricante a la densidad de 10 000 RU. A continuación, se capturaron los FcyR humanos en las celdas de flujo 2, 3 y 4 para lograr un nivel de captura de los FcyR de 250-500 RU. Se usó la celda de flujo 1 como superficie de referencia. Se usó tampón HBS-EP (GE, Healthcare) como tampón de ejecución. Se inyectaron anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2, anti-CD71 Ab21.12 (IgG1/K), AB095-MMAE-E2, Ab095 (IgG1/K) y trastuzumab (IgG1/K) en todos las celdas de flujo a una tasa de flujo de 50 pL/minuto durante uno o dos minutos (un minuto para FcYRIIb y FcYRIIa H131, y dos minutos para FcYRIIIa F158 y FcYRIIIa V158) en concentraciones que varían de 46,9 a 12000 nM para FcyRII y 7,8 a 4000 nM para FcyRIII (dilución en serie de 2 veces para ambos), seguido de un tiempo de disociación de uno a cinco minutos (un minuto para FcYRIIb, FcYRIIa H131 y cinco minutos para FcYRIIIa F158 y FcYRIIIa V158). Las superficies de los chips se regeneraron con una inyección de HCl 100 mM a una tasa de flujo de 100 pl/minuto durante dos segundos en las cuatro celdas de flujo. Se realizaron tres experimentos con el uso de tres chips CM5 diferentes para cada muestra (cada uno por duplicado) para adaptarse a todos los tipos de errores experimentales (instrumento, superficie y operador). Se promediaron los resultados de estos tres experimentos.
Para el análisis de la unión del FcRn, anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2, Anti-CD71 TF02.13-2011 (IgG1/K sin vc-MMAE), AB095-vcMMAE-E2 (un anticuerpo no específico, monoclonal humano IgG1/K contra el toxoide tetánico que contiene MMAE con DAR enriquecido = 2), AB095 (un anticuerpo IgG1/K antitetánico humano monoclonal no específico) y trastuzumab (IgG1/K) se inmovilizaron directamente en un chip CM5 mediante el acoplamiento de amina de acuerdo con el protocolo del fabricante a la densidad de 500 RU. Se inyectó e1Hu FcRn sobre todas las celdas de flujo a una tasa de flujo de 50 pL/minuto durante un minuto a concentraciones que variaban de 5,5 a 12 000 nM (dilución en serie de 3 veces), seguido de un tiempo de disociación de dos minutos. Las superficies se regeneraron con una inyección de HCl 100 mM durante dos segundos seguido de HBS-EP , pH 7,4. Las muestras se prepararon y se procesaron en dos sistemas de tampón en funcionamiento, MES-EP pH 6,0 y HBS-EP pH 7,4. Se realizaron tres experimentos con el uso de tres chips CM5 diferentes para cada muestra (cada uno por duplicado) para tener en cuenta el error del instrumento, la superficie y el operador. Se promediaron los resultados de estos tres experimentos.
Todos los datos del FcYRIIIa V158 humano recombinante y los datos del FcYRIIIa F158 se ajustaron al modelo de ajuste de unión 1:1 con Rmáx fijo local para tener en cuenta la variabilidad en los niveles de captura. Los datos de unión de los FcYRIIb, FcYRIIa H131 y FcRn humanos recombinantes se ajustaron a un modelo de afinidad de estado estacionario. Se usó la versión 2.0 del software de evaluación Biacore T200 para ajustar todos los datos.
Resultados
El anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 contiene un isotipo Fc humano IgG1/K. Se esperaba que se uniera a FcyRI, FcYIIa, FcYIIb, FcyIII, de acuerdo con otros anticuerpos IgG1/K de tipo salvaje. La unión del anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 a FcyR se analizó mediante resonancia de plasmón superficial, un ELISA de unión competitiva con el FcyRI (resultados no mostrados) y un ELISA de unión competitiva con el FcyRIII (resultados no mostrados) y unión del anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 al complemento se analizó mediante ensayos funcionales de activación del complemento humano y de cynomolgus (resultados no mostrados). Estos ensayos se compararon con anticuerpos humanos comerciales y generados internamente. Se usó como material el trastuzumab humano, anti-HER2, IgG1/K, de grado clínico como control positivo para los ensayos de unión al FcyR. Se sabe que los receptores Fc y el complemento se unen a anticuerpos IgG1 de tipo salvaje. (Ravetch; Roopenian; Burton y otros, Nature. 1980; 288:338-344; Hughes-Jones y otros, Mol Immunol., 1979;16:697-701; y Hezareh y otros, J Virol.
2001;75:12161-12168). El examen del anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE reveló que se unía FcyRI, FcYIIa H131, FcyRIII y FcRn, aunque se observó una unión modestamente reducida al FcyRIII (por SPR) en comparación con el control positivo, trastuzumab. La unión del anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE e2 al FcYRIIb fue demasiado débil para determinarla porque cayó más abajo del límite de detección del instrumento Biacore a 1,0 e-05 KD. (ver Tablas 10A y 10B).
Tabla 10A: Unión del anticuerpo activable conjugado anti-CD71 al FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa por resonancia de plasmón superficial
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Tabla 10B: Resonancia de plasmón superficial de FcRn humano
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La citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) se evaluó al determinar la capacidad del anticuerpo activable conjugado anti-CD71 para activar el complemento de suero humano y cynomolgus mediante la captura del iC3b (humano) o el C3 (cino) por ELISA, para CDC.
Como se muestra en los resultados ilustrativos en la Figura 12, la unión de los artículos de prueba indicados a las concentraciones indicadas al iC3b se muestra como un ensayo para la activación del complemento humano. El anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 se unió al iC3b en un ensayo de activación del complemento tanto en el suero humano como en el suero de cynomolgus, pero en menor grado que el control positivo, el anticuerpo 7C6, que se usó en el ensayo de CDC. El anticuerpo 7C6.7 con las mutaciones indicadas se usó como control negativo. La unión al iC3b del anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 también fue menor que su contraparte de anticuerpo activable no conjugado (anti-CD71-TF02.13-2011).
Ejemplo 18: Liberación de citocinas por PBMC humanas
Este ejemplo mostró que aunque el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 no se une a células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas o de cynomolgus, los anticuerpos IgG1 son capaces de reticular a los receptores Fcy en los linfocitos de sangre periférica, lo que media una variedad de funciones, incluida la inducción de citocinas.
La capacidad del anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 o el anti-CD71-TF02.13-2011 para inducir la liberación de citocinas in vitro en PBMC humanas se evaluó en un formato soluble o en fase sólida (unida a placa) para las siguientes citocinas: interleucina (IL)-1p, IL6, IL2, interferón (IFN)y, y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). Para el experimento en fase sólida, se añadieron PBMC de 8 donantes humanos sanos a placas de polipropileno previamente recubiertas con 0,96 pg de artículo de prueba y se lavaron después de 1,5 horas. El sobrenadante se recogió después de 48 horas para su análisis. Como controles negativos se usaron trastuzumab y un ADC de control de isotipo no vinculante, AB095-vcMMAE E2. Se usaron tres controles positivos: anticuerpos estimulantes de células T, TGN1412 o visilizumab y células B, y lipopolisacárido estimulante de células mieloides (LPS). En 1 de los 8 donantes analizados, se observó una liberación sustancial de 3 de las 5 citocinas medidas, IL-1p, IL-6 y TNFa, en respuesta tanto al anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 como al AB095-vcMMAE-E2. Se observó liberación de IL-6 y TNFa en 2 de 8 donantes adicionales en respuesta tanto al anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 como al AB095-vcMMAE E2. Se analizaron tres donantes en el ensayo de presentación soluble, que fue un ensayo de presentación de alta densidad celular de 24 horas.
En este estudio, se midió la liberación de citocinas de PBMC de donantes humanos después de la estimulación con una capa previa de 0,96 pg/pocillo con el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 y el anti-CD71-TF02.13-2011 (IgGlK). Se usó trastuzumab como un anticuerpo IgGlK de control negativo. Se usaron AB095-vcMMAE-E2 y AB095 (IgGlK) como anticuerpos de control de isotipo. Se agregaron TGN1412, visilizumab y lipopolisacárido (LPS) como controles positivos para la liberación de citocinas. Los valores en negrita y recuadro resaltan el artículo de la prueba que provocó la liberación de citocinas > 2 veces que la liberada por el trastuzumab.
Como se muestra en los resultados ilustrativos de la Tabla 11, el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 no provocó liberación de citocinas por encima del nivel inducido por el trastuzumab de control negativo. También se evaluó la liberación de citocinas en 3 donantes de monos cynomolgus en el formato de fase sólida para las siguientes citocinas: IL-ip, IL-6, IL-2, IFNy, IL-8 e IL 10. El anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 provocó la producción de IL-8 ligeramente por encima del nivel de fondo, según lo definido por el trastuzumab, en 1 de los 3 donantes analizados. En los estudios de toxicología no GLP y GLP en monos cynomolgus para el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2, no se observaron síntomas clínicos agudos representativos de la liberación de citocinas a ningún nivel de dosis.
Tabla 11: Liberación de citocinas por PBMC humanas en respuesta al anticuerpo activable conjugado anti-CD71 en fase sólida y otros artículos de prueba
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continuación
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Ejemplo 19: Eficacia antitumoral del anti-CD71 AADC en el modelo en ratón de xenoinjerto con SW-48
Este ejemplo muestra la eficacia del anticuerpo activado conjugado anti-CD71 de la presente invención en un modelo de xenoinjerto de tumor en ratón, mediante el uso de las células SW-48 (cáncer colorrectal humano).
En este estudio ilustrativo, se administraron inyecciones intraperitoneales únicas del anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) en las dosis indicadas a grupos de 8 ratones, y se observó el volumen tumoral medio a lo largo del tiempo. Como se muestra en la Figura 13 y la Tabla 12, se observó un intervalo de inhibición total del crecimiento (TGI) a los 23 días en comparación con el control del vehículo en todas las dosis, observándose una regresión tumoral completa a las dosis de 6 y 12 mg/kg.
Tabla 12: Inhibición del crecimiento tumoral del xenoinjerto después del tratamiento con el anti-CD71 AADC
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Ejemplo 20: Eficacia antitumoral del anti-CD71 AADC en un modelo en ratón PDX con DLBCL
Este ejemplo muestra la eficacia del anticuerpo activado conjugado anti-CD71 de la presente invención en cinco (5) modelos de xenoinjerto en ratón de tumor derivado de paciente (PDX), mediante el uso de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) HuPrime derivado de paciente en ratones SCID o NOG hembras.
En este estudio ejemplar, se establecieron grupos de 3 ratones con tumores subcutáneos (100-200 mm3) y se les administró 6 mg/kg del anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) o un vehículo control en los días 0 y 7. Como se muestra en los resultados ilustrativos de la Figura 14, el artículo de prueba AADC logró > 100 % de t Gi en 4 de los 5 modelos y 72 % de TFI en 1 modelo en comparación con el grupo control del vehículo. Se observaron respuestas completas (es decir, ausencia del tumor medible al finalizar el estudio) en los modelos administrados con el AADC en 2 de 3 ratones para LY2345, 3 de 3 ratones para el modelo LY6933, 2 de 3 ratones para el modelo LY6934 y 2 o 3 ratones para el modelo LY2318. No se observaron respuestas completas para el modelo LY3604. Estos resultados ilustrativos demuestran que el AADC de la presente divulgación demostró eficacia, hasta respuesta completa en algunos modelos.
Ejemplo 21: Eficacia antitumoral del anti-CD71 AADC en modelos en ratón PDX de trasplante tumoral
Este ejemplo muestra la eficacia del anticuerpo activado conjugado anti-CD71 de la presente invención en nueve (9) modelos de xenoinjerto en ratón de tumor derivado de paciente (PDX), mediante el uso del injerto de tumor de cáncer de mama humano derivado de paciente (CTG-0437, CTG-0869, CTG -1059), cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (CTG-1082, CTG-0860, CTG-0160, CTG-1012) y carcinoma de células pequeñas de cabeza y cuello (HNSCC) (CTG-1140, CTG-1082) en ratones desnudos.
En este estudio ilustrativo, se establecieron grupos de 3 ratones para cada modelo PDX con tumores subcutáneos (150 - 300 mm3) y se administraron con 6 mg/kg del anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) o un control de vehículo los días 0 y 7. Como se muestra en los resultados ilustrativos de las Figuras 15A, 15B y 15C, el artículo de prueba del AADC logró > 100 % de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) en 6 de 9 modelos en las tres indicaciones de cáncer. En estos 6 modelos en los que se observó > 100 % de TGI, 6 de 18 ratones que recibieron el AADC lograron una respuesta completa (es decir, ausencia de tumor medible al final del estudio). En 2 modelos adicionales, se observó 92 % y 78 % de TGI para HNSCC y NSCLC, respectivamente. Un modelo de NSCLC no respondió a la AADC. Como se muestra en estos resultados ilustrativos, el AADC de la presente divulgación demostró eficacia, incluidas respuestas completas en algunos casos, en el modelo PDX derivado de una variedad de tipos de cáncer humano.
Ejemplo 22: Eficacia antitumoral del anti-CD71 AADC en el modelo en ratón PDX HuPrime pancreático
Este ejemplo muestra la eficacia del anticuerpo activado conjugado anti-CD71 de la presente invención en un modelo en ratón de xenoinjerto derivado de paciente (PDX), mediante el uso del cáncer pancreático humano derivado de paciente HuPrime (PA6237) en ratones SCID.
En este estudio ilustrativo, se estableció un grupo de 3 ratones con tumores subcutáneos (100-200 mm3) y se les administró 3 o 6 mg/kg del anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) o un vehículo control en los días 0 y 7. Como se muestra en los resultados ilustrativos de la Figura 16, el artículo de prueba AADC logró > 100 % de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) a 3 y 6 mg/kg. En este grupo de 6 mg/kg, se observaron 3 de 3 respuestas completas hasta el día 59, mientras que el grupo de 3 mg/kg mantuvo la respuesta completa hasta el día 31, seguido por el recrecimiento del tumor.
Ejemplo 23: Estudios piloto de toxicidad no GLP del anticuerpo activable conjugado anti-CD71
Este ejemplo muestra las toxicidades relativas del anticuerpo activable conjugado anti-CD71 (AADC) anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 de la presente invención a niveles de dosis que varían de 6 a 18 mg/kg para anticuerpos conjugados anti-CD71 (ADC) Ab21.12-vcMMAE E2 a niveles de dosis con intervalo desde 0,6 a 6 mg/kg en monos cynomolgus (1-2 monos por sexo por grupo) después de la inyección intravenosa en bolo una vez cada 3 semanas (Q3W) o una vez cada 2 semanas (Q2W). Se realizaron necropsias terminales en los animales de ensayo el día 29 (7 días después de la última dosis). Las evaluaciones durante el estudio incluyeron signos clínicos, peso corporal, consumo de alimentos, patología clínica, patología anatómica, TK e inmunogenicidad. En la Tabla 13 se muestra un resumen del estudio piloto de toxicidad.
Tabla 13: Estudio piloto de toxicidad sin GLP en monos cynomolgus
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Se observó toxicidad grave manifestada por postura encorvada, disminución de la actividad y elevación de la temperatura corporal en los grupos que recibieron una dosis alta del CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (18 mg/kg), dosis frecuentes de CD71-TF02.13 -2011-vcMMAE E2 (dosificación en los días 1 y 15), o el conjugado de fármaco y anticuerpo (ADC) anti-CD71 parental desenmascarado (Ab21.12-vcMMAE E2) a 6 y 2 mg/kg. Cuando se pudo establecer una causa de muerte, se determinó que era una infección secundaria a la inmunosupresión relacionada con el fármaco.
Los hallazgos relacionados con el artículo de prueba fueron similares para el CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 y el Ab21.12-vcMMAE E2 y consistieron principalmente en toxicidad hematológica. Los hallazgos clave incluyeron (1) se observó mortalidad atribuida a infección secundaria en los grupos que recibieron una dosis única del CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 a 18 mg/kg, el CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 en el día 1 y 15 a 8 mg/kg, o una dosis única del ADC (Ab21.12-vcMMAE E2) a > 2 mg/kg, (2) disminución del peso corporal 2 semanas después de la dosis, con recuperación a las 3 semanas después de la dosis a > 12 mg/kg del CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2, (3) disminuciones dependientes de la dosis en la masa de glóbulos rojos y todas las poblaciones de leucocitos con recuperación parcial a completa observada 3 semanas después de la dosis, (4) aumento transitorio del nivel de plaquetas 2 semanas después de la dosis, (5) aumentos leves a moderados del fibrinógeno, disminución de la albúmina y aumento de la globulina, (6) disminución leve a moderada de la celularidad de la médula ósea, el bazo y el timo, con las correspondientes reducciones de peso en el timo y el bazo. También se observó una disminución de la celularidad en varios tejidos linfoides.
En este estudio ilustrativo, las dosis más altas toleradas del CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 y el Ab21.12-vcMMAE E2 (el ADC correspondiente) en estos estudios fueron 12 mg/kg y 0,6 mg/kg, respectivamente, administrados una vez cada 3 semanas por 2 dosis.
Ejemplo 24: Estudios de toxicidad GLP del anticuerpo activable conjugado anti-CD71
Este ejemplo muestra un estudio de toxicidad por dosis repetidas de GLP en monos cynomolgus del anticuerpo activable conjugado anti-CD71 (AADC) anti-CD71 -TF02.13-2011-vcMMAE E2 de la presente invención a niveles de dosis de 0, 2, 6 o 12 mg/kg, los días 1 y 22 mediante inyección intravenosa en bolo. Los grupos de dosis se muestran en la Tabla 14.
Tabla 14: Estudio de toxicidad de GLP en monos cynomolgus
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En este estudio ilustrativo, a cada grupo de 6 monos machos y 6 hembras se les administró el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 o el vehículo (bolo IV de la dosis indicada los días 1 y 22) como se muestra en la Tabla 14. Las necropsias terminales se realizaron el día 29 y las necropsias de recuperación se realizaron el día 64. Las evaluaciones de toxicidad incluyeron mortalidad, signos clínicos, cambios de peso corporal, consumo de alimentos, patología clínica, patología anatómica, exámenes oftalmológicos y evaluaciones de la función cardiovascular, respiratoria y del sistema nervioso central. El estudio incluyó un análisis TK y una evaluación de la formación de ADA. Se hicieron las siguientes observaciones ilustrativas. En la Tabla 15 se resumen resultados seleccionados del estudio de toxicidad GLP del anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2, que tiene un DAR de ~ 2, en comparación con los estudios correspondientes sin GLP de un conjugado de fármaco y anticuerpo anti-CD71 (ADC) no enmascarado Ab21.12-vcMMAE E2 (que también tiene un DAR de ~ 2).
Tabla 15: Resultados del estudio de toxicidad de GLP en monos cynomolgus
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No hubo efectos relacionados con el AADC sobre el peso corporal, el consumo de alimentos, la frecuencia respiratoria, la electrocardiografía, la coagulación y los parámetros del análisis de orina, ni hubo efectos neurológicos, efectos oculares o hallazgos patológicos graves.
Se observó mortalidad relacionada con el AADC a dosis de 12 mg/kg; 1 hembra fue encontrada muerta el día 10 y 2 hembras se sacrificaron el día 11 en estado clínico en declive. La patología clínica relacionada con la AADC y los hallazgos microscópicos en estos animales fueron similares a los presentes en los animales que sobrevivieron a la necropsia programada (día 29), con la excepción de la evidencia microscópica de infección bacteriana, que se consideró una consecuencia de la inmunosupresión relacionada con el AADC.
Como se muestra en la Tabla 15, el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 demostró una tolerabilidad superior en relación con el Ab21.12-vcMMAE E2 sin pérdida detectable de peso corporal. Como se muestra, el Ab21.12-vcMMAE E2 carecía de tolerabilidad dentro de los 8 días de una dosis única a 2 mpk, mientras que el anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 proporcionó una protección > 10 veces mayor que el Ab21.12-vcMMAE E2 no enmascarado.
Los signos clínicos relacionados con el AADC en animales tratados con 12 mg/kg que sobrevivieron hasta la necropsia programada fueron lesiones/heridas cutáneas compatibles con la infección que se correlacionaron con una disminución de las poblaciones de leucocitos y signos de respuesta de fase aguda (disminución de albúmina y colesterol y aumento de globulinas, bilirrubina total y triglicéridos).
Los cambios en los parámetros hematológicos a > 6 mg/kg después de la primera dosis consistieron en disminuciones en la masa de glóbulos rojos, los reticulocitos y todos los subconjuntos de leucocitos, junto con aumentos en las plaquetas. Los cambios hematológicos a 2 mg/kg se limitaron a un leve aumento de las plaquetas después de la primera y segunda dosis.
Los cambios relacionados con el AADC en los parámetros de la química clínica después de la primera dosis fueron más notables a 12 mg/kg y consistieron en una respuesta de fase aguda (disminuciones de albúmina y colesterol, y aumentos de globulinas, triglicéridos [solo hembras], bilirrubina total) y aumenta el nitrógeno ureico (solo individual) y la creatinina, y disminuye el fósforo. Los cambios en la química clínica a 6 mg/kg solo se observaron después de la primera dosis y se limitaron a un aumento mínimo de la bilirrubina y al aumento de globulinas en hembras individuales.
Los hallazgos de la química clínica y hematológica relacionados con el AADC se recuperaron al final de la fase de recuperación.
Los hallazgos microscópicos relacionados con el AADC en la eutanasia terminal estaban presentes en el timo, la glándula suprarrenal y la médula ósea a > 6 mg/kg/dosis. Se observaron hallazgos en el lugar de la inyección en todos los grupos y se interpreta que están relacionados con el procedimiento de administración y no específicamente con el AADC. Los pesos tímicos disminuyeron en monos machos a los que se les administró una dosis de 12 mg/kg y en monos hembras a los que se les administró una dosis de 6 mg/kg, lo cual se correlacionó histológicamente con la celularidad disminuida, particularmente de la corteza tímica. Los pesos de las glándulas suprarrenales aumentaron en monos machos que recibieron dosis de 12 mg/kg y en monos hembras que recibieron dosis de 6 mg/ g y el correlato histológico fue la hipertrofia adrenocortical. Hubo disminución de la celularidad en la médula ósea, específicamente en el fémur, en monos machos a los que se les administró una dosis de > 6 mg/kg. Después de un intervalo sin dosis de 6 semanas, la celularidad disminuida del timo y la hipertrofia adrenocortical no estaban presentes, lo que es consistente con la recuperación completa de estos cambios. El aumento de la celularidad de la médula ósea persistió pero con una severidad disminuida, consistente con una recuperación parcial.
Ejemplo 25: Conjugación del MMAE con el anticuerpo activable CD71 y métodos para reducir el DAR del anticuerpo activable conjugado CD71 resultante a aproximadamente DAR 3
Este ejemplo describe los métodos que se usaron para conjugar vc-MMAE con el anticuerpo activable anti-CD71, anti-CD71 TF02.13-2011, para crear el anti-CD71 t F02.13-2011-vc-MMAE que contiene una carga de fármaco de 2 moléculas de MMAE por cada molécula del anti-CD71 TF02.13-2011, además de los métodos usados para enriquecer el DAR a aproximadamente 3.
Método de conjugación
El anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE enriquecido en E2 - A una solución del anti-CD71 TF02.13-2011 (13,95 mg/ml), 39 g de solución, 544 mg, 3,5 nmol) se añadió a 0,5 MEDTA (0,39 ml) y TCEP (0,77 ml, 10 mM en w Fi, 7,7 nmol, 2,2 equivalentes) a 2-8 °C durante la noche. El anticuerpo reducido se diluyó luego con DMSO (2,29 ml) tratado con vcMMAE en DMSO (1,89 ml de vcMMAE 9,49 mM en DMSO, 17,9 nmol, 5,1 equivalentes) a temperatura ambiente durante 1 h. El anticuerpo conjugado se trató con N-acetilcisteína (0,29 ml de 100 mM en WFI, 29 nmol, 8,2 equivalentes) para apagar el exceso de vcMMAE. La solución inactivada se analizó mediante HIC (cromatografía de interacción hidrófoba) para especies de DAR > E4 (especies de DAR superiores, 20,9 % en la preparación más arriba).
Método de enriquecimiento para reducir el DAR
La reacción de conjugación se resuspendió con resina HIC, como aquellas disponibles comercialmente de Tosoh Biosciences (Toyopearl alquilo como un ejemplo) en porciones, a temperatura ambiente, durante 2 h, para reducir las especies de DAR superiores a nivel de la diana (generalmente < 2 %). La solución tratada se filtró y la resina se lavó sucesivamente con PBSE (fosfato de potasio 125 mM, NaCl 150 mM, EDTA 6,3 mM, pH 7,2, 22 g) seguido de PBS (fosfato de potasio 5 mM, NaCl 200 mM, pH 7, 35 g). El filtrado y los enjuagues combinados se concentraron y se intercambió el tampón mediante el uso de un filtro de centrífuga de corte de peso molecular de 30 kD y después se diluyó con los componentes de la formulación para su almacenamiento.
El producto resultante contenía 228 mg (A2806,5 mg/ml) y se demostró que tenía un DAR de aproximadamente 2,9 medido a partir de una columna HIC disponible comercialmente y que constituía las siguientes características y especies de DAR: SEC 98,7 % de monómero, 0,2 % de peso molecular superior, 1,1 % de peso molecular inferior, endotoxina <0,06 UE/mg, las especies de DAR superiores a E4 eran inferiores a 2 % del área; DAR E0 fue

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo activable conjugado que comprende la estructura de la Fórmula (I) o una sal del mismo:
Figure imgf000140_0001
(a) en donde
(i) AB es un anticuerpo que se une específicamente a CD71 humano y comprende
i. una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de CDRH1 que comprende la SEQ ID NO: 9, una secuencia de CDRH2 que comprende la SEQ ID NO: 10 y una secuencia de c Dr H3 que comprende la SEQ ID NO: 11; y
ii. una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de CDRL1 que comprende la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13, una secuencia de CDRL2 que comprende la SEQ ID NO: 14 y una secuencia de CDRL3 que comprende la SEQ ID NO: 15;
(ii) MM es un resto de enmascaramiento que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde MM inhibe la unión del AB al CD71 humano cuando el anticuerpo activable conjugado está en un estado no escindido;
(iii) LP1 es un primer resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 207; (iv) CM es un resto escindible que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 156, en donde el CM es un polipéptido que funciona como sustrato para una proteasa; y
(v) LP2 es un segundo resto de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; y (b) en donde "n" es 2.
2. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 1, en donde el AB comprende un isotipo IgG1.
3. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 1 o 2, en donde el AB es un anticuerpo que tiene una región constante de la cadena pesada y en donde el residuo C-terminal de la región constante de la cadena pesada no es una lisina.
4. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de SEQ ID NO: 5 y la región variable de la cadena ligera comprende una secuencia de SEQ ID NO: 7.
5. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SeQ ID NO: 19.
6. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 201.
7. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 6, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 202.
8. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 6, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 5 y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 202, en donde el aminoácido N-terminal de SEQ ID NO: 202 está modificado a piroglutamato.
9. El anticuerpo activable conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SeQ ID NO: 169.
10. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 9, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 170.
11. El anticuerpo activable conjugado de la reivindicación 9, que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 167 y una cadena ligera que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 170, en donde el aminoácido N-terminal de SEQ ID NO: 170 está modificado a piroglutamato.
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