RS61596B1 - Anti-cd71 aktivirani konjugati leka-antitela i metode njihovog korišćenja - Google Patents

Anti-cd71 aktivirani konjugati leka-antitela i metode njihovog korišćenja

Info

Publication number
RS61596B1
RS61596B1 RS20210341A RSP20210341A RS61596B1 RS 61596 B1 RS61596 B1 RS 61596B1 RS 20210341 A RS20210341 A RS 20210341A RS P20210341 A RSP20210341 A RS P20210341A RS 61596 B1 RS61596 B1 RS 61596B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
conjugated
seq
activated
sequence
Prior art date
Application number
RS20210341A
Other languages
English (en)
Inventor
Shweta Singh
Jennifer Hope Richardson
Laura Patterson Serwer
Jonathan Alexander Terrett
Susan E Morgan-Lappe
Tracy Henriques
Sherry L Ralston
Marvin Robert Leanna
Ilaria Badagnani
Sahana Bose
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of RS61596B1 publication Critical patent/RS61596B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Sadašnji pronalazak se generalno odnosi na aktivirane konjugate leka-antitela (AADC) koji vezuju CD71 u aktiviranom stanju i postupke za izradu i upotrebu ovih konjugovanih aktiviranih antitela protiv CD71 u različitim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama.
STANJE TEHNIKE
[0002] Terapije zasnovane na antitelima dokazale su se efikasnim u lečenju nekoliko bolesti, ali u nekim slučajevima, ispoljavanje toksičnosti usled široke ciljne ekspresije ograničava njihovu terapijsku efikasnost. Pored toga, terapijski agensi bazirani na antitelima pokazali su i druga ograničenja, kao što su brzo uklanjanje iz cirkulacije nakon primene.
[0003] U domenu terapije malim molekulima razvijene su strategije za obezbeđivanje prolekova aktivnog hemijskog entiteta. Takvi prolekovi se primenjuju u relativno neaktivnom (ili značajno manje aktivnom) obliku. Jednom primenjen, prolek je metabolisan in vivo u aktivno jedinjenje. Takve strategije za prolekove mogu obezbediti povećanu selektivnost leka za njegov predviđeni cilj i smanjenje neželjenih efekata.
[0004] Shodno tome, postoji kontinuirana potreba u oblasti terapeutskih sredstava zasnovanih na antitelima za antitelima koja oponašaju poželjne karakteristike proleka malog molekula.
[0005] WO 2016/179257 se generalno odnosi na antitela koja vezuju CD71, aktivirana antitela koja se specifično vezuju za CD71 i metode za njihovu izradu i korišćenje.
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Sadašnji pronalazak obezbeđuje konjugovana aktivirana antitela koja se specifično vezuju za CD71, takođe, poznat kao receptorni protein 1 za transferin (TfR1), konjugovana aktivirana antitela koja su u nastavku definisana.
[0007] Sadašnji pronalazak obezbeđuje konjugovano aktivirano antitelo koje obuhvata strukturu formule (I) ili njene soli:
Formula (I)
(a) pri čemu (i) AB je antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71 i sadrži varijabilni region
teškog lanca koji sadrži CDRH1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 9, CDRH2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 10 i CDRH3 sekvencu koji sadrži SEK ID BR: 11; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 12 ili SEK ID BR: 13, CDRL2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 14 i CDRL3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 15; (ii) MM je maskirajući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18, gde MM inhibira vezivanje antitela za humani CD71 kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju; (iii) LP1 je prvi vezivni koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 207; (iv) CM je cepljivi deo koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 156, gde je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu; i (v) LP2 je drugi vezivni ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38; i (b) pri čemu je "n" 2. U nekim realizacijama, AB sadrži izotip IgG1. U nekim realizacijama, AB je antitelo koje ima konstantan region teškog lanca, pri čemu C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. U nekim realizacijama, N-terminalni glutamat bilo na teškom lancu i/ili lakom lancu je opciono ili piroglutamat ili post-translaciono modifikovan u piroglutamat.
[0008] U srodnom aspektu pronalaska, ovde je obezbeđeno konjugovano aktivirano antitelo koje sadrži strukturu formule (I) ili njene soli, gde (i) AB je antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71 i sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 5 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 7; (ii) MM je maskirajući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18, gde MM inhibira vezivanje AB za humani CD71 kada je konjugovano aktivirano antitelo u intaktnom stanju; (iii) LP1 je prvi vezujući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 207; (iv) CM je cepljivi deo koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 156, gde je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu; i (v) LP2 je drugi vezujući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38; i (b) pri čemu je "n" 2.
U nekim realizacijama, AB sadrži izotip IgG1. U nekim realizacijama, AB je antitelo koje ima konstantan region teškog lanca i pri čemu C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. U nekim realizacijama, N-terminalni glutamat bilo na teškom lancu i/ili lakom lancu je opciono ili piroglutamat ili post-translaciono modifikovan u piroglutamat.
[0009] U srodnom aspektu pronalaska, ovde je obezbeđeno konjugovano aktivirano antitelo koje sadrži strukturu formule (I) ili njene soli, gde (i) AB je antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71 i sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 19; (ii) MM je maskirajući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18, gde MM inhibira vezivanje AB za humani CD71 kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju; (iii) LP1 je prvi vezujući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 207; (iv) CM je cepljivi deo koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 156, gde je CM jedan polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu; i (v) LP2 je drugi vezivni ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38; i (b) pri čemu je "n" 2. U nekim realizacijama, AB sadrži izotip IgG1. U nekim realizacijama, AB je antitelo koje ima konstantan region teškog lanca i pri čemu C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. U nekim realizacijama, N-terminalni glutamat bilo na teškom lancu i/ili lakom lancu je opciono ili piroglutamat ili post-translaciono modifikovan u piroglutamat.
[0010] U srodnom aspektu prema pronalasku, ovde je obezbeđeno konjugovano aktivirano antitelo koje sadrži strukturu formule (I) ili njene soli, gde je MM-LP1-CM-LP2-AB aktivirajuće antitelo, pri čemu je AB antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71, pri čemu aktivirano antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 169 i pri čemu je "n" 2. U nekim realizacijama, AB sadrži izotip IgG1. U nekim realizacijama, AB je antitelo koje ima konstantan region teškog lanca i pri čemu C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. U nekim realizacijama, N-terminalni glutamat bilo na teškom lancu i/ili lakom lancu je opciono ili piroglutamat ili post-translaciono modifikovan u piroglutamat.
[0011] U srodnom aspektu pronalaska, ovde je obezbeđeno konjugovano aktivirano antitelo koje sadrži strukturu formule (I) ili njene soli, gde je MM-LP1-CM-LP2-AB aktivirajuće antitelo, pri čemu je AB antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71, pri čemu aktivirano antitelo sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 170 gde je "n" 2. U nekim realizacijama, AB sadrži izotip IgG1. U nekim realizacijama, AB je antitelo koje ima konstantan region teškog lanca i pri čemu C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. U nekim realizacijama, N-terminalni glutamat bilo na teškom lancu i/ili lakom lancu je opciono ili piroglutamat ili posttranslaciono modifikovan u piroglutamat.
[0012] U drugom aspektu pronalaska koji nije deo zahtevanog pronalaska, ovde su obezbeđeni postupci za proizvodnju konjugovanog aktiviranog antitela kao što je zahtevano; postupak koji obuhvata (i) redukovanje aktivirajućeg antitela koje sadrži MM-LP1-CM-LP2-AB sa redukcionim agensom; (ii) spajanje dva vcMMAE sa redukovanim aktiviranim antitelom.
[0013] U srodnom aspektu pronalaska, ovde su obezbeđeni farmaceutski preparati koji sadrže konjugovano aktivirano antitelo prema zahtevima. U nekim realizacijama, farmaceutski preparati mogu da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0014] U drugom aspektu pronalaska koji nije deo zahtevanog pronalaska, ovde su obezbeđeni postupci za lečenje, ublažavanje simptoma, ili usporavanje progresije karcinoma kod subjekta, gde postupak obuhvata primenu terapijski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela prema zahtevima ili farmaceutski preparat koji sadrži konjugovano aktivirano antitelo prema zahtevima i opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač, kod subjekta kome je to potrebno za lečenje raka izabranog iz grupe koja se sastoji od: raka želuca, raka jajnika, raka jednjaka, raka pluća koji nije mikrocelularni, ER raka dojke, trostruko negativnog raka dojke, kolorektalnog karcinoma, melanoma, raka prostate, multiplog mijeloma, difuznog velikog B-ćelijskog limfoma, karcinoma sitnih ćelija glave i vrata, raka pankreasa, mezotelioma, ne-Hodžkinovog limfoma, hepatocelularnog karcinoma i glioblastoma.
[0015] U drugom aspektu pronalaska koji nije deo zahtevanog pronalaska, ovde je obezbeđeno konjugovano aktivirano antitelo prema zahtevima ili farmaceutski preparat koji sadrži isto, za upotrebu kao lek.
[0016] U drugom aspektu pronalaska koji nije deo zahtevanog pronalaska, ovde je obezbeđeno konjugovano aktivirano antitelo prema zahtevima ili farmaceutski preparat koji sadrži isto, za upotrebu u lečenju raka, opciono, gde je rak izabran iz grupe koja se sastoji od: raka želuca, raka jajnika, raka jednjaka, raka pluća koji nije sitnoćelijski, ER raka dojke, trostruko negativnog raka dojke, kolorektalnog karcinoma, melanoma, raka prostate, multiplog mijeloma, difuznog velikog B-ćelijskog limfoma, karcinoma sitnih ćelija glave i vrata, raka pankreasa, mezotelioma, ne-Hodgkinovog limfoma, hepatocelularnog karcinoma i glioblastoma.
[0017] U sledećem aspektu pronalaska, ovde je obezbeđen komplet koji sadrži najmanje jedno aktivirano antitelo kao što je zahtevano. Komplet može dalje sadržati jedan ili više vcMMAE i/ili redukciono sredstvo.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0018]
SL. 1, kao što je razmatrano u Primeru 5, prikazuje primerne imunohistohemijske (IHC) testove za određivanje nivoa ekspresije CD71 u različitim primarnim i metastatskim tipovima karcinoma tkiva. Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazali su da je CD71 eksprimiran pri visokim nivoima u primarnim tumorima različitih humanih karcinoma.
SL. 2, kao što je razmatrano u Primeru 5, prikazuje primerne studije nivoa ekspresije CD71 u višestrukim uzorcima metastatskog karcinoma izvedenih od pacijenta. Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazali su da se CD71 eksprimira pri visokim nivoima u metastatskim tumorima kod različitih humanih karcinoma.
SL. 3A i 3B, kao što je diskutovano u Primeru 4, predstavljaju primer in vitro ispitivanja sposobnosti nekonjugovanih i konjugovanih antitela koja se aktiviraju protiv CD71 prema pronalasku da vezuju humani ili cinomolgusni rekombinantni CD71 kada je aktivirajuće antitelo celo ili proteolitički aktivirano (označeno kao „AKT“). Primerni rezultati prikazani na ovim slikama i primeru pokazali su da je anti-CD71 konjugovano aktivirano antitelo vezano za CD71 pri nivoima uporedivim sa njegovom kopijom nekonjugovanim anti-CD71 aktiviranim antitelom, a takođe su oba vezana za CD71 sa ekvivalentnim povećanim afinitetom nakon aktivacije proteazom.
SL. 3C i 3D, kao što je razmatrano u Primeru 4, predstavljaju primer in vitro ispitivanja sposobnosti nekonjugovanih i konjugovanih antitela koja se aktiviraju protiv CD71 prema pronalasku da vezuju humani ili cinomolgusni CD71 na površini ćelije kada je aktivirano antitelo netaknuto ili proteolitički aktivirano (označeno kao „AKT“). Primerni rezultati prikazani na ovim slikama i primeru pokazali su da je anti-CD71 konjugovano aktivirano antitelo vezano za CD71 na ćelijskoj površini pri nivoima uporedivim sa njegovim nekonjugovanim anti-CD71 aktiviranim antitelom, kao i da su oba vezana za CD71 na površini ćelije sa ekvivalentnim povećanim afinitetom nakon aktivacije proteazom.
SL. 4A, 4B i 4C, kako je diskutovano u Primeru 6, prikazuju primerne studije efikasnosti anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (AADC) iz sadašnjeg pronalaska u modelu mišjeg ksenografta (anti-CD71 TF01-3011-MMAE vs. anti-CD71 TF02.13-2011-MMAE). Ovi primerni rezultati prikazani na ovim slikama i primer da je AADC sa maskirajućim ostatkom niskog afiniteta (TF02.13) pokazao veću efikasnost od AADC sa maskirajućim ostatkom višeg afiniteta (TF01).
SL. 5, kao što je razmatrano u Primeru 7, prikazuje primernu studiju efikasnosti anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (AADC) iz sadašnjeg pronalaska u modelu ksenografta na mišu. Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazuju da je efikasnost naznačenog AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE) sa manje cepljivom podlogom u suštini ista kao i efikasnost AADC (anti-CD71 TF02.13-3011-vcMMAE) sa podlogom koja se više razgrađuje prikazanom na SL.4B i 4C.
SL. 6A, 6B, 6C i 6D, kao što je razmatrano u Primeru 8, prikazuju primerne studije efikasnosti anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (AADC) sa različitim DAR-ovima (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE sa DAR~3 nasuprot anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2 sa DAR-om 2) iz sadašnjeg pronalaska u modelu ksenografta na mišu. Primerni rezultati prikazani na ovim slikama i primerima pokazuju da je efikasnost dozno usklađenih AADC-a (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE) koji imaju različite odnose DAR-a pokazala uporedivu efikasnost.
SL. 7A, 7B i 7C, kao što je diskutovano u Primeru 9, pokazuju primer šematskih radnih tokova za analizu metaboličkih proizvoda koji su rezultat primene anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (AADC) prema sadašnjem pronalasku.
SL. 8A, 8B, 9A, 9B, 10 i 11, kao što je razmatrano u Primerima 11-14, prikazuju primerne vremenske tokove sporednih proizvoda metabolizma nakon primene anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (AADC) iz sadašnjeg pronalaska na životinjskom modelu. Primerni rezultati prikazani na ovim slikama i primer pokazuju da se količina ukupnog i intaktnog AADC-a iz sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) održava kod životinja tokom doziranja u dozno proporcionalnoj količini i količina MMAE koja je konjugovana sa aktiviranim antitelom je suštinski veća nego količina nekonjugovanog MMAE tokom doziranja i pri svim nivoima doziranja.
SL. 12, kao što je diskutovano u Primeru 17, prikazuje primer titracije naznačenih ispitivanih proizvoda na fragment proteina iC3b, predstavljajući njihovu sposobnost da aktiviraju kaskadu komplementa. Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazuju da je AADC sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) pokazao nižu sposobnost aktivacije komplementa u poređenju sa njegovim nekonjugovanim aktiviranim antitelom.
SL. 13, kao što je diskutovano u Primeru 19, prikazuje primernu efikasnost AADC sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) u modelu ksenografta na mišu koristeći humane kolorektalne ćelijske linije. Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazuju da je AADC iz sadašnjeg pronalaska pokazao značajnu inhibiciju rasta tumora pri svim dozama, uz potpunu regresiju primećenu pri najvišim dozama. SL. 14, kao što je diskutovano u Primeru 20, prikazuje primernu efikasnost AADC sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) u modelu ksenografta na mišu koristeći tumore izvedene od humanog pacijenta (DLBCL). Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazuju da je AADC iz sadašnjeg pronalaska pokazao značajnu inhibiciju rasta tumora nakon jedne primene, sa kompletnim odgovorima primećenim u nekim slučajevima.
SL. 15A, 15B i 15C, kako je diskutovano u Primeru 21, predstavljaju primernu efikasnost AADC sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) u modelima ksenografta (PDX) koji potiču od miša. Primerni rezultati prikazani na ovim slikama i primerima pokazuju da je AADC sadašnjeg pronalaska pokazao efikasnost, uključujući kompletne odgovore u nekim slučajevima, u PDX modelima izvedenim iz različitih tipova humanih karcinoma.
SL. 16, kao što je diskutovano u Primeru 22, prikazuje primernu efikasnost AADC sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) u modelu ksenografta koji je izveden od miša. Primerni rezultati prikazani na ovoj slici i primeru pokazuju da je AADC sadašnjeg pronalaska pokazao efikasnost, uključujući kompletne odgovore u nekim slučajevima, na PDX modelu karcinoma pankreasa.
SL. 17, kao što je diskutovano u Primeru 10, sumira rezultate koji pokazuju da su antitela koja se aktiviraju protiv humanog CD71 sa konjugovanim toksinima (AADC) iz sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2) dobro tolerisana i stabilna kod cinomolgus majmuna, čak i pri većim relativnim dozama, u poređenju sa odgovarajućim roditeljskim konjugatom leka-antitela protiv CD71 (ADC), AADC koji imaju supstrat sa većom cepljivošću i AADC koji imaju veći DAR.
SL. 18A, 18B i 18C, kao što je razmatrano u Primeru 27, prikazuju HIC-odvojene profile vrsta prisutne u neprečišćenom anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE i prečišćenom antiCD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2, kao i njihovu brzina klirensa kod miševa. Ove slike i primeri pokazuju da anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 migrira kao pojedinačna vrsta konjugata i ima nižu stopu klirensa.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0019] Sadašnji pronalazak obezbeđuje anti-CD71 konjugovana aktivirana antitela koja se specifično vezuju za CD71 u aktiviranom stanju. CD71 je poznat i kao receptorski protein 1 transferina (TfR1). Generalno, sadašnji pronalazak je usmeren na anti-CD71 konjugovano aktivirano antitelo koje sadrži maskirajući deo, cepljivi deo, linker vc i toksin MMAE. Maskirajući deo (MM) smanjuje sposobnost mesta vezivanja antitela da se vezuje za svoj ciljni antigen CD71 kada je aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju; cepljivi deo (CM) je supstrat koji se može aktivirati proteazom i koji se razgrađuje u mikrookolini tumora, što rezultira uklanjanjem maskirajućeg dela i pratećom aktivacijom anti-CD71 ciljanih CDR-ova. Specifično, sadašnji pronalazak opisuje izbor anti-CD71 konjugovanog aktiviranog monoklonskog antitela koje ima superiornu efikasnost i podnošljivost u odnosu na druga anti-CD71 konjugovana aktivirana monoklonska antitela, inače poznata u struci, zbog toga što ima jedinstvenu kombinaciju maskirajućeg ostatka nižeg afiniteta, manje cepljiv ostatak supstrata i niže opterećenje lekom od 2, što zajedno rezultira značajno poboljšanom efikasnošću i podnošljivošću na modelima tumora miša. Pored toga, neočekivano, anti-CD71 konjugovanom aktiviranom monoklonskom antitelu takođe, nedostaje sposobnost da se vezuje za inhibitorni FcyRIIb receptor, za razliku od drugih antitela koja sadrže divlji tip IgG1 Fc, što je važno jer je poznato da vezivanje za takve receptore inhibira procese zavisne od kalcijuma poput degranulacije, fagocitoze, ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), oslobađanja citokina i proinflamatorne aktivacije, od kojih bi se očekivalo da svi rezultiraju smanjenom efikasnošću ako je aktiviran FcyRIIb receptor.
[0020] CD71 je receptor na ćelijskoj površini koji je izražen na ćelijama koje se dele, uključujući kancerogene ćelije. Eksprimiran je pri visokim nivoima kod velike raznolikosti kancerogenih tipova ćelija i CD71 je internalizovan, što ga čini privlačnim ciljem za ciljanu terapiju raka, korišćenjem konjugovanih toksina usmerenih pomoću antitela. Maskirajući delovi (MM) koji imaju veće i niže afinitete, kao i cepljivi delovi (CM) koji imaju manju ili veću cepljivost, identifikovani su i korišćeni za konstrukciju različitih aktiviranih antitela, a zatim antitela konjugovanih sa vcMMAE (tj. konjugati aktiviranih antitela-leka ili AADC). Primerne studije efikasnosti ovih konjugovanih aktiviranih antitela u modelu ksenografta na mišu pokazale su da AADC sa visoko afinitetnim maskirajućim delovima (npr. CD71-TF01-3011-vcMMAE) pokazuje manju efikasnost od onih sa maskirajućim delovima nižeg afiniteta (npr. CD71-TF02.13-3011-vcMMAE). Štaviše, druge studije efikasnosti koje koriste AADC koji imaju istu masku nižeg afiniteta, ali sa supstratima različite cepljivosti, pokazale su da dok je efikasnost bila ista, kod nehumanih primata AADC sa manje cepljivim supstratom (CD71-TF02.13-2011-vcMMAE) je bio bolje tolerisan i pri nižim nivoima cirkulišućeg AADC u aktiviranom obliku u poređenju sa AADC sa supstratom koji se više odvaja (CD71-TF02.13-3011-vcMMAE), obezbeđujući tako veći terapijski indeks. Dalje studije su pokazale da je AADC sa nižim odnosom leka prema aktiviranom antitelu (npr. CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2, gde je DAR 2) bolje tolerisan pri većim dozama u poređenju sa istim konjugovanim aktiviranim antitelom, sa višim DAR (tj DAR ~ 3). Štaviše, CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2 je pokazao ekvivalentnu efikasnost pri dozama koje se podudaraju sa dozama u odnosu na AADC sa višim DAR-om, na različitim CDX i PDX modelima miša humanih karcinoma. Konačno, CD71-TF02.13-3011-vcMMAE E2 je pokazao značajnu podnošljivost u odnosu na njegov nezaštićeni duplikat, koji se nije tolerisao ni pri niskim dozama.
[0021] U nekim realizacijama, konjugovana aktivirajuća monoklonska antitela su internalizovana od strane ćelija koje sadrže CD71. Upotreba izraza "CD71" je namenjena da obuhvati bilo koju njegovu varijaciju, kao što je, na primer, bez ograničenja, CD-71 i / ili CD 71, i sve varijacije su ovde naizmenično korišćene.
[0022] CD71 je transmembranski glikoprotein koji primarno vezuje transferin. CD71 je neophodan za ćelijsku homeostazu. CD71 se kontinuirano reciklira putem endocitoze posredovane ligandom, gde je glavni ligand transferin. Takođe je poznato da se CD71 svuda prisutno izražava na ćelijama koje se dele.
[0023] Abnormalna ekspresija i/ili aktivnost CD71 i signalizacija povezana sa CD71, uključene su u patogenezi mnogih bolesti i poremećaja, kao što je rak. CD71 je prekomerno izražen kod mnogih karcinoma, uključujući i solidne i hematološke karcinome. CD71 ima široku ekspresiju na površini ćelije. CD71 u malignim ćelijama posreduje većim unosom gvožđa potrebnog za ćelijsku deobu. Takođe, CD71 je povezan sa lošom prognozom kod leukemija. CD71 je poželjni cilj jer je dominantan kod više karcinomskih indikacija.
[0024] Pronalazak obezbeđuje konjugovana aktivirana antitela protiv CD71 koja su korisna u metodama lečenja, sprečavanja, odlaganja progresije, poboljšanja i/ili ublažavanja simptoma bolesti ili poremećaja povezanih sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. Na primer, aktivirana antitela protiv CD71 su korišćena u metodama lečenja, sprečavanja,
1
odlaganja napredovanja, poboljšanja i/ili ublažavanja simptoma karcinoma ili drugog neoplastičnog stanja.
[0025] Pronalazak obezbeđuje anti-konjugovana aktivirajuća anti-CD71 antitela koja su korisna u metodama lečenja, sprečavanja, odlaganja progresije, poboljšanja i/ili ublažavanja simptoma bolesti ili poremećaja povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CD71. U nekim realizacijama, ćelije su povezane sa abnormalnopm ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. U nekim realizacijama, ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. Na primer, aktivirajuća antitela protiv CD71 se koriste u metodama lečenja, sprečavanja, odlaganja progresije, poboljšanja i/ ili ublažavanja simptoma karcinoma ili drugog neoplastičnog stanja.
[0026] Pronalazak obezbeđuje konjugovana aktivirana antitela protiv CD71 koja su korisna u metodama lečenja, sprečavanja, odlaganja progresije, poboljšanja i/ili ublažavanja simptoma bolesti ili poremećaja u kome obolele ćelije eksprimiraju CD71. U nekim realizacijama, obolele ćelije su povezane sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. U nekim realizacijama, obolele ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. Na primer, aktivirana antitela protiv CD71 su korišćena u metodama lečenja, sprečavanja, odlaganja napredovanja, poboljšanja i/ili ublažavanja simptoma karcinoma ili drugog neoplastičnog stanja.
[0027] Konjugovana aktivirana anti-CD71 antitela, uključuju antitela koji se specifično vezuju za CD71 povezana sa maskirajućim ostatkom (MM), tako da kuplovanje MM-a smanjuje sposobnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta da veže CD71. MM je povezan putem sekvence koja uključuje supstrat za proteazu, na primer, proteazu koja je zajedno lokalizovana sa CD71 na mestu lečenja kod subjekta.
[0028] Primerna konjugovana aktivirana antitela protiv CD71 prema pronalasku uključuju, na primer, aktivirana antitela koja uključuju teški lanac i laki lanac koji su, ili su izvedeni od, varijabilnih sekvenci teškog lanca i varijabilnih sekvenci lakog lanca prikazanih u nastavku (CDR sekvence su prikazane u boldu i podvučene):
muM21 VH:
hu2vHa varijabilni teški lanac
hu2vHb varijabilni teški lanac
hu2vHc varijabilni teški lanac
hu21vKa varijabilni laki lanac
hu21vKb varijabilni laki lanac
hu21vKc varijabilni laki lanac
[0029] Primeri konjugovanih aktiviranih antitela protiv CD71 prema pronalasku uključuju, aktivirana antitela koja uključuju kombinaciju sekvence varijabilnog regiona 1 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH CDR1, ovde takođe označena kao CDRH1), sekvence varijabilnog regiona 2 koji određuje komplementarnost teškog lanca (VH CDR2, ovde se takođe naziva CDRH2), sekvence regiona 3 koji određuje komplementarnost varijabilnog teškog lanca (VH CDR3, ovde se takođe naziva i CDRH3), sekvence varijabilnog regiona 1 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL CDR1, takođe ovde navedena kao CDRL1), sekvence varijabilnog regiona 2 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL CDR2, ovde se takođe naziva CDRL2), i sekvence varijabilnog regiona 3 koji određuje komplementarnost lakog lanca (VL CDR3, ovde takođe nazvana CDRL3).
[0030] U sadašnjem pronalasku, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela sadrži kombinaciju
VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, VH CDR3 sekvence, VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu VH CDR1 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu GYTFTSYWMH (SEK ID BR: 9); VH CDR2 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu AIYPGNSETG (SEK ID BR: 10); VH CDR3 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu ENWDPGFAF (SEK ID BR: 11); VL CDR1 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu SASSSVYYMY (SEK ID BR: 12) ili CRASSSVYYMY (SEK ID BR: 13); VL CDR2 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu STSNLAS (SEK ID BR: 14); i VL CDR3 sekvenca sadrži aminokiselinsku sekvencu QQRRNYPYT (SEK ID BR: 15).
[0031] U sadašnjem pronalasku, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela specifično vezuje CD71. U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo, uključuje monoklonsko antitelo koje vezuje CD71. U nekim realizacijama, takvo monoklonsko antitelo koje vezuje CD71 je humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0032] U nekim realizacijama, antitelo od konjugovanog aktivirajućeg antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži SEK ID BR: 5. U nekim realizacijama, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži SEK ID BR: 7. U nekim realizacijama, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži SEK ID BR: 5 i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži SEK ID BR: 7.
[0033] U nekim realizacijama, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEK ID BR: 5. U nekim realizacijama, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži SEK ID BR: 7. U nekim
1
realizacijama, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja sadrži SEK ID BR: 1 i 3-5, i aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja sadrži SEK ID BR: 7.
[0034] U nekim realizacijama, antitelo od konjugovanog aktiviranog antitela prema sadašnjem pronalasku kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR : 5. U nekim realizacijama, antitelo konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR : 7. U nekim realizacijama, antitelo konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR : 5, i sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 7.
[0035] U nekim realizacijama, antitelo konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži jednu sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 5. U nekim realizacijama, antitelo konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 7. U nekim realizacijama, antitelo konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 5, i sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 7.
[0036] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode za proizvodnju aktiviranog antitela od konjugovanog aktiviranog antitela prema pronalasku, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije aktivirajućeg antitela, pri čemu ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ili vektor prema pronalasku.
[0037] Ovde obezbeđena konjugovana aktivirana antitela protiv CD71, koja se ovde zamenljivo takođe nazivaju anti-CD71 konjugovana aktivirana antitela ili CD71 konjugovana aktivirana antitela, stabilna su u cirkulaciji, aktiviraju se na predviđenim mestima terapije i/ili dijagnoze, ali ne u normalnom, npr. zdravom tkivu ili drugom tkivu koje nije ciljano za lečenje i/ ili dijagnozu, i kada je aktivirano, ispoljava vezivanje za CD71 koje je najmanje uporedivo sa odgovarajućim, nemodifikovanim antitelom, koje se ovde takođe naziva i roditeljskim antitelom.
[0038] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su metode lečenja, sprečavanja i/ ili odlaganja početka ili napredovanja ili ublažavanja simptoma povezanih sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71 kod subjekta, koristeći konjugovana aktivirana antitela prema patentnim zahtevima.
[0039] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su metode lečenja, sprečavanja i / ili odlaganja početka ili napredovanja, ili ublažavanja simptoma povezanih sa prisustvom, rastom, proliferacijom, metastazama i/ili aktivnostima ćelija koje eksprimiraju CD71 ili abnormalno eksprimiraju CD71 kod subjekta, korišćenjem konjugovanih aktiviranih antitela prema patentnim zahtevima.
[0040] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su metode lečenja, sprečavanja i / ili odlaganja početka ili napredovanja, ili ublažavanja simptoma povezanih sa prisustvom, rastom, proliferacijom, metastazama i/ili aktivnostima ćelija koje eksprimiraju CD71 kod subjekta, korišćenjem konjugovanih aktiviranih prema patentnim zahtevima.
[0041] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su metode lečenja, sprečavanja i / ili odlaganja početka ili napredovanja, ili ublažavanja simptoma povezanih sa prisustvom, rastom, proliferacijom, metastazama i/ili aktivnošću ćelija koje abnormalno eksprimiraju CD71 kod subjekata, korišćenjem konjugovanih aktiviranih antitela prema patentnim zahtevima.
[0042] Konjugovana aktivirana antitela u aktiviranom stanju vezuju CD71 i uključuju (i) antitelo (AB) koje se specifično vezuje za CD71; (ii) maskirajući ostatak (MM) koji, kada je aktivirano antitelo u intaktnom stanju, inhibira vezivanje AB za CD71; i (c) cepljivi ostatak
1
(CM) povezan sa AB, pri čemu je CM jedan polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu.
[0043] U sadašnjem pronalasku, konjugovano aktivirano antitelo sadrži jedan vezivni peptid između MM i CM i jedan vezivni peptid između CM i AB.
[0044] Stoga, u sadašnjem pronalasku, konjugovano aktivirano antitelo sadrži prvi vezivni peptid (LP1) i drugi vezivni peptid (LP2), pri čemu konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju ima strukturno uređenje od N-završetka do C-završetka kao što sledi: MM-LP1-CM-LP2-AB.
[0045] U sadašnjem pronalasku, LP1 sadrži aminokiselinsku sekvencu GGGSSGGS (SEK ID BR: 207).
[0046] U sadašnjem pronalasku, LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GGGS (SEK ID BR: 38).
[0047] U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od oko 100 nM ili manje za vezivanje za CD71 sisara. U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od oko 10 nM ili manje za vezivanje za CD71 sisara. U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od oko 5 nM ili manje za vezivanje za CD71. U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od oko 1 nM ili manje za vezivanje za CD71. U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od oko 0,5 nM ili manje za vezivanje za CD71. U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od oko 0,1 nM ili manje za vezivanje za CD71. U nekim realizacijama, AB ima konstantu disocijacije od 0,01 nM do 100 nM, 0,01 nM do 10 nM, 0,01 nM do 5 nM, 0,01 nM do 1 nM, 0,01 do 0,5 nM, 0,01 nm do 0,1 nM, 0,01 nm do 0,05 nM, 0,05 nM do 100 nM, 0,05 nM do 10 nM, 0,05 nM do 5 nM, 0,05 nM do 1 nM, 0,05 do 0,5 nM, 0,05 nm do 0,1 nM, 0,1 nM do 100 nM, 0,1 nM do 10 nM, 0,1 nM do 5 nM, 0,1 nM do 1 nM, 0,1 do 0,5 nM, 0,5 nM do 100 nM, 0,5 nM do 10 nM, 0,5 nM do 5 nM, 0,5 nM do 1 nM, 1 nM do 100 nM, 1 nM do 10 nM, 1 nM do 5 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 10 nM ili 10 nM do 100 nM za vezivanje za CD71 sisara.
[0048] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo u nerascepljenom stanju se specifično vezuje za CD71 sisara sa konstantom disocijacije manjom ili jednakom do 1 nM, manjom ili jednakom do 5 nM, manjom ili jednakom do 10 nM, manjom ili jednakom do 15 nM, manjom ili jednakom do 20 nM, manjom ili jednakom do 25 nM, manjom ili jednakom do 50 nM, manjom ili jednakom do 100 nM, manjom ili jednakom do 150 nM, manjom ili jednakom do 250 nM, manjom ili jednakom do 500 nM, manjom ili jednakom do 750 nM, manjom ili jednakom do 1000 nM i/ili manjom ili jednakom do 2000 nM.
1
[0049] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju se specifično vezuje za CD71 sisara sa konstantom disocijacije u opsegu od 1 nM do 2000 nM, 1 nM do 1000 nM, 1 nM do 750 nM, 1 nM do 500 nM, 1 nM do 250 nM, 1 nM do 150 nM, 1 nM do 100 nM, 1 nM do 50 nM, 1 nM do 25 nM, 1 nM do 15 nM, 1 nM do 10 nM, 1 nM do 5 nM, 5 nM do 2000 nM, 5 nM do 1000 nM, 5 nM do 750 nM, 5 nM do 500 nM, 5 nM do 250 nM, 5 nM do 150 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 50 nM, 5 nM do 25 nM, 5 nM do 15 nM, 5 nM do 10 nM, 10 nM do 2000 nM, 10 nM do 1000 nM, 10 nM do 750 nM, 10 nM do 500 nM, 10 nM do 250 nM, 10 nM do 150 nM, 10 nM do 100 nM, 10 nM do 50 nM, 10 nM do 25 nM, 10 nM do 15 nM, 15 nM do 2000 nM, 15 nM do 1000 nM, 15 nM do 750 nM, 15 nM do 500 nM, 15 nM do 250 nM, 15 nM do 150 nM, 15 nM do 100 nM, 15 nM do 50 nM, 15 nM do 25 nM, 25 nM do 2000 nM, 25 nM do 1000 nM, 25 nM do 750 nM, 25 nM do 500 nM, 25 nM do 250 nM, 25 nM do 150 nM, 25 nM do 100 nM, 25 nM do 50 nM, 50 nM do 2000 nM, 50 nM do 1000 nM, 50 nM do 750 nM, 50 nM do 500 nM, 50 nM do 250 nM, 50 nM do 150 nM, 50 nM do 100 nM, 100 nM do 2000 nM, 100 nM do 1000 nM, 100 nM do 750 nM, 100 nM do 500 nM, 100 nM do 250 nM, 100 nM do 150 nM, 150 nM do 2000 nM, 150 nM do 1000 nM, 150 nM do 750 nM, 150 nM do 500 nM, 150 nM do 250 nM, 250 nM do 2000 nM, 250 nM do 1000 nM, 250 nM do 750 nM, 250 nM do 500 nM, 500 nM do 2000 nM, 500 nM do 1000 nM, 500 nM do 750 nM, 500 nM do 500 nM, 500 nM do 250 nM, 500 nM do 150 nM, 500 nM do 100 nM, 500 nM do 50 nM, 750 nM do 2000 nM, 750 nM do 1000 nM ili 1000 nM do 2000 nM.
[0050] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo u aktiviranom stanju se specifično vezuje za CD71 sisara sa konstantom disocijacije manjom ili jednakom do 0,01 nM, 0,05 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 5 nM ili 10 nM.
[0051] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo u aktiviranom stanju se specifično vezuje za CD71 sisara sa konstantom disocijacije u opsegu od 0,01 nM do 100 nM, 0,01 nM do 10 nM, 0,01 nM do 5 nM, 0,01 nM do 1 nM, 0,01 do 0,5 nM, 0,01 nm do 0,1 nM, 0,01 nm do 0,05 nM, 0,05 nM do 100 nM, 0,05 nM do 10 nM, 0,05 nM do 5 nM, 0,05 nM do 1 nM, 0,05 do 0,5 nM, 0,05 nm do 0,1 nM, 0,1 nM do 100 nM, 0,1 nM do 10 nM, 0,1 nM do 5 nM, 0,1 nM do 1 nM, 0,1 do 0,5 nM, 0,5 nM do 100 nM, 0,5 nM do 10 nM, 0,5 nM do 5 nM, 0,5 nM do 1 nM, 1 nM do 100 nM, 1 nM do 10 nM, 1 nM do 5 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 10 nM ili 10 nM do 100 nM.
[0052] U sadašnjem pronalasku, CD71 sisara je humani CD71. U realizacijama, AB se specifično vezuje za humani CD71 sa konstantom disocijacije manjom od 1 nM.
1
[0053] U nekim realizacijama, AB blokira sposobnost prirodnog liganda da se veže za CD71 sisara sa EC50manjom od ili jednakom 5 nM, manjom ili jednakom 10 nM, manjom ili jednakom 50 nM, manjom ili jednakom do 100 nM, manjom ili jednakom 500 nM i/ili manjom ili jednakom 1000 nM. U nekim realizacijama, AB blokira sposobnost transferina da se veže za CD71 sisara sa EC50manjom ili jednakom 5 nM, manjom ili jednakom 10 nM, manjom ili jednakom 50 nM, manjom ili jednakom 100 nM, manjon ili jednakom 500 nM i/ili manjom ili jednakom 1000 nM. U nekim realizacijama, prirodni ligand CD71 je transferin.
[0054] U nekim realizacijama, AB blokira sposobnost prirodnog liganda da se veže za CD71 sisara sa EC50od 5 nM do 1000 nM, 5 nM do 500 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 50 nM, 5 nM do 10 nM, 10 nM do 1000 nM, 10 nM do 500 nM, 10 nM do 100 nM, 10 nM do 50 nM, 50 nM do 1000 nM, 50 nM do 500 nM, 50 nM do 100 nM, 100 nM do 1000 nM, 100 nM do 500 nM, 500 nM do 1000 nM. U nekim realizacijama, AB blokira sposobnost transferina da se veže za CD71 sisara sa EC50od 5 nM do 1000 nM, 5 nM do 500 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 50 nM, 5 nM do 10 nM, 10 nM do 1000 nM, 10 nM do 500 nM, 100 nM do 100 nΜ, 10 nM do 50 nM, 50 nM do 1000 nM, 50 nM do 500 nM, 50 nM do 100 nM, 100 nM do 1000 nM, 100 nM do 500 nM, 500 nM do 1000 nM. U nekim realizacijama, prirodni ligand za CD71 je transferin.
[0055] U nekim realizacijama, AB prema sadašnjem pronalasku inhibira ili smanjuje rast, proliferaciju i/ili metastaze ćelija koje eksprimiraju CD71 sisara. Bez namere da bude ograničeno bilo kojom teorijom, AB iz sadašnjeg pronalaska može inhibirati ili smanjiti rast, proliferaciju i/ ili metastaze ćelija koje eksprimiraju CD71 sisara specifičnim vezivanjem za CD71 i inhibiranjem, blokiranjem i/ili sprečavanjem vezivanja prirodnog liganda za CD71 sisara. U nekim realizacijama, prirodni ligand CD71 sisara je transferin.
[0056] U nekim realizacijama, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje za AB koja je veća od konstante disocijacije AB za CD71.
[0057] U nekim realizacijama, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje za AB koja nije veća od konstante disocijacije AB za CD71.
[0058] U nekim realizacijama, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje za AB koja je manja od konstante disocijacije AB za CD71.
[0059] U nekim realizacijama, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB nije veća od 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 puta ili više, ili između 1-5, 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000,
1
10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 , ili 100.000-10.000.000 puta ili veća od konstante disocijacije AB prema cilju.
[0060] U nekim realizacijama, MM ne ometa ili se takmiči sa AB za vezivanje za CD71 kada je aktivirano antitelo u rascepljenom stanju.
[0061] U nekim realizacijama, MM je polipeptid dužine oko 2 do 40 aminokiselina. U nekim realizacijama, MM je polipeptid dužine do oko 40 aminokiselina.
[0062] U nekim realizacijama, sekvenca MM polipeptida se razlikuje od one iz CD71. U nekim realizacijama, MM polipeptidna sekvenca nije više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim realizacijama, MM polipeptidna sekvenca se razlikuje od sekvence CD71 i nije više od 40%, 30%, 25%, 20%, 15% ili 10% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0063] U nekim realizacijama, kuplovanje MM sa AB smanjuje sposobnost AB da vezuje CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovan sa MM prema CD71 najmanje dva puta veća od KdAB kada nije kuplovan sa MM prema CD71.
[0064] U nekim realizacijama, kuplovanje MM sa AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovan sa MM prema CD71 najmanje pet puta veća od KdAB kada nije povezan sa MM prema CD71.
[0065] U nekim realizacijama, kuplovanje MM sa AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je povezan sa MM prema CD71 najmanje 10 puta veća od Kd AB kada nije povezan sa MM prema CD71.
[0066] U nekim realizacijama, kuplovanje MM za AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovan sa MM prema CD71 najmanje 20 puta veća od Kd AB kada nije povezan sa MM prema CD71.
[0067] U nekim realizacijama, spajanje MM za AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je povezan sa MM prema CD71 najmanje 40 puta veća od KdAB kada nije povezan sa MM prema CD71.
[0068] U nekim realizacijama, kuplovanje MM sa AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je povezan sa MM prema CD71 najmanje 100 puta veća od KdAB kada nije povezan sa MM prema CD71.
[0069] U nekim realizacijama, kuplovanje MM sa AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je povezan sa MM prema CD71 najmanje 1000 puta veća od KdAB kada nije povezan sa MM prema CD71.
1
[0070] U nekim realizacijama, kuplovanje MM sa AB smanjuje sposobnost AB da veže CD71 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je povezan sa MM prema CD71 najmanje 10.000 puta veća od KdAB kada nije povezan sa MM prema CD71.
[0071] U nekim realizacijama, u prisustvu CD71, MM smanjuje sposobnost AB da veže CD71 za najmanje 90% kada je CM nerazdvojen, u poređenju kada je CM razdvojen kada je analizirano in vitro pomoću testa ciljnog pomeranja kao, na primer, testa opisanog u PCT publikaciji br. WO 2010/081173.
[0072] U sadašnjem pronalasku, MM sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 18.
[0073] U nekim realizacijama, proteaza koja cepa CM je aktivna, na primer, ushodno regulisana ili neregulisana na drugi način, u bolesnom tkivu, a proteaza razdvaja CM u aktivirajućem antitelu kada je aktivirano antitelo izloženo proteazi.
[0074] U nekim realizacijama, proteaza je u tkivu zajedno lokalizovana sa CD71, a proteaza cepa CM u konjugovanom aktivirajućem antitelu kada je aktivirajuće antitelo izloženo proteazi.
[0075] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada se konjugovano aktivirano antitelo nalazi u nerazgrađenom stanju, smanjuje se vezivanje konjugovanog aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje dvostruko veća od konstante disocijacije nemodifikovanog AB vezivanja za CD71, dok u razdvojenom stanju (tj. kada je konjugovano aktivirano antitelo u rascepljenom stanju) AB vezuje CD71.
[0076] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktivirajućem antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerascepljenom stanju, smanjuje se vezivanje aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje pet puta veća od konstante disocijacije nemodifikovanog AB vezivanja za CD71, dok u rascepljenom stanju (tj. kada je konjugovano aktivirajuće antitelo u rascepljenom stanju) AB vezuje CD71.
[0077] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju, smanjuje se vezivanje aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje 10 puta veća od konstante disocijacije nemodifikovanog AB vezivanja za CD71, dok u rascepljenom stanju (tj. kada je konjugovano aktivirano antitelo u razdvojenom stanju) AB vezuje CD71.
[0078] U nekim realizacijama, CM je smešten u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerascepljenom stanju, smanjuje se vezivanje konjugovanog aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje 20 puta veća nego konstanta disocijacije nemodifikovanog AB vezivanja za CD71, dok u
2
rascepljenom stanju (tj. kada je konjugovano aktivirano antitelo u rascepljenom stanju) AB vezuje CD71.
[0079] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u neraskinutom stanju, smanjuje se vezivanje konjugovanog aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje 40 puta veća nego konstanta disocijacije nemodifikovanog AB vezivanja za CD71, dok u razdvojenom stanju AB vezuje CD71.
[0080] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerascepljenom stanju, smanjuje se vezivanje konjugovanog aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje 50 puta veća nego konstanta disocijacije nemodifikovanog AB vezanja za CD71, dok u razdvojenom stanju AB vezuje CD71.
[0081] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerascepljenom stanju, smanjuje se vezivanje konjugovanog aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje 100 puta veća nego konstanta disocijacije nemodifikovanog AB vezanja za CD71, dok u razdvojenom stanju AB vezuje CD71.
[0082] U nekim realizacijama, CM je pozicioniran u konjugovanom aktiviranom antitelu tako da kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju, smanjuje se vezivanje konjugovanog aktivirajućeg antitela za CD71 sa konstantom disocijacije koja je najmanje 200 puta veća nego konstanta disocijacije nemodifikovanog AB vezivanja za CD71, dok u razdvojenom stanju AB vezuje CD71.
[0083] U nekim realizacijama, CM je polipeptid dužine do 15 aminokiselina.
[0084] U nekim realizacijama, CM je polipeptid koji uključuje prvi cepljivi deo (CM1) koji je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i drugi cepljivi deo (CM2) koji je supstrat za najmanje jednu serinsku proteazu (SP). U nekim realizacijama, svaka od sekvence CM1 supstrata i sekvence CM2 supstrata iz CM1-CM2 supstrata je nezavisno jedan polipeptid dužine do 15 aminokiselina.
[0085] U nekim realizacijama, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu koja je ili za koju se smatra da je ushodno regulisana ili na drugi način neregulisana kod karcinoma.
[0086] U nekim realizacijama, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu odabranu iz grupe koja se sastoji od matriksne metaloproteaze (MMP), trombina, neutrofilne elastaze, cisteinske proteaze, legumaina i serinske proteaze, kao što su matriptaza (MT- SP1) i urokinaza (uPA).
Bez teorijskog ograničenja, smatra se da su ove proteaze regulisane naviše ili na drugi način neregulisane u najmanje jednom od karcinoma.
[0087] U nekim realizacijama, CM je odabran za upotrebu sa specifičnom proteazom, na primer sa proteazom za koju je poznato da je lokalizovana zajedno sa ciljem aktiviranog antitela.
[0088] U nekim realizacijama, CM je supstrat za najmanje jedan MMP. U nekim realizacijama, CM je supstrat za proteazu odabranu iz grupe koju čine MMP 9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11 i MMP19. U nekim realizacijama CM je supstrat za MMP9. U nekim realizacijama, CM je supstrat za MMP14.
[0089] U sadašnjem pronalasku, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSGRSDNP (SEK ID BR: 156) koja se ovde takođe naziva supstrat 2011.
[0090] U nekim realizacijama, CM je supstrat za najmanje dve proteaze. U nekim realizacijama, CM je supstrat za najmanje dve proteaze odabrane iz grupe koju čine MMP, trombin, neutrofilna elastaza, cisteinska proteaza, uPA, legumain i matriptaza.
[0091] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo uključuje najmanje prvi CM i drugi CM. U nekim realizacijama, svaki od prvog CM i drugog CM su polipeptidi dugi ne više od 15 aminokiselina. U nekim realizacijama, najmanje jedan od prvog CM i drugog CM je jedan polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu odabranu iz grupe koju čine MMP, trombin, neutrofilna elastaza, cisteinska proteaza, uPA, legumain i matriptaza. U nekim realizacijama, prvi CM je odvojen prvim sredstvom za razdvajanje odabranim iz grupe koju čine MMP, trombin, neutrofilna elastaza, cisteinska proteaza, uPA, legumain i matriptaza u ciljnom tkivu, a drugi CM je odvojen pomoću drugog sredstva za razdvajanje u ciljnom tkivu. U nekim realizacijama, druga proteaza je izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u Tabeli (I). U nekim realizacijama, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su ista proteaza izabrana iz grupe koju čine MMP, trombin, neutrofilna elastaza, cisteinska proteaza, uPA, legumain i matriptaza, i prvi CM i drugi CM su različiti supstrati za enzim. U nekim realizacijama, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su ista proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u Tabeli (I). U nekim realizacijama, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su različite proteaze. U nekim realizacijama, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su zajedno lokalizovani u ciljnom tkivu. U nekim realizacijama, prvi CM i drugi CM su odvojeni najmanje jednim agensom za cepanje u ciljnom tkivu.
[0092] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo je izloženo i odvojeno proteazom tako da, u aktiviranom ili rascepljenom stanju, konjugovano aktivirano antitelo uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja uključuje najmanje deo LP2 i/ili sekvencu CM nakon što je proteaza otcepila CM.
[0093] U sadašnjem pronalasku, aktivirano antitelo je konjugovano sa dva ekvivalenta agensa. U nekim realizacijama prema pronalasku, aktivirajuće antitelo je deo smeše aktiviranih antitela koja imaju homogeni broj ekvivalenata konjugovanih agenasa. U nekim realizacijama, aktivirano antitelo je deo smeše aktiviranih antitela koja imaju heterogeni broj ekvivalenata konjugovanih sredstava. U nekim realizacijama, smeša aktiviranih antitela je takva da je prosečan broj agenasa konjugovanih sa svakim aktiviranim antitelom između nula do jedan, između jedan do dva, između dva i tri ili između tri i četiri. U nekim realizacijama, smeša aktiviranih antitela je takva da je prosečan broj agenasa konjugovanih sa svakim aktiviranim antitelom jedan, dva, tri ili četiri.
[0094] U nekim realizacijama, aktivirano antitelo sadrži jednu ili više modifikacija aminokiselinskih sekvenci specifičnih za mesto tako da je broj lizinskih i/ili cisteinskih ostataka povećan ili smanjen u odnosu na originalnu aminokiselinsku sekvencu aktiviranog antitela, stoga, u nekim realizacijama odgovarajući rastući ili opadajući broj agenasa koji mogu biti konjugovani sa aktiviranim antitelom, ili u nekim realizacijama ograničavajući konjugaciju agenasa sa aktiviranim antitelom načinom specifičnim za mesto. U nekim realizacijama, modifikovano aktivirano antitelo je modifikovano sa jednom ili više neprirodnih aminokiselina na način specifičan za mesto, stoga, u nekim realizacijama ograničavajući konjugaciju agenasa samo na mesta neprirodnih aminokiselina.
[0095] Izraz "opterećenje lekom" ili "punjenje lekom" odnosi se na molarni odnos molekula leka po antitelu u pojedinačnom, konjugovanom aktiviranom antitelu. U sadašnjem pronalasku, opterećenje lekom je 2 molekula leka.
[0096] Za svrhe sadašnjeg pronalaska, stručnjak u tehnici bi razumeo da „punjenje leka“ i „odnos leka i antitela“ (takođe nazvan kao DAR) nisu isto. DAR se odnosi na prosečan molarni odnos molekula leka po antitelu u populaciji od najmanje dva konjugovana aktivirana molekula antitela, dok se opterećenje lekom odnosi na molarni odnos molekula leka po antitelu u pojedinačnom konjugovanom molekulu aktiviranog antitela. Punjenje lekom prvenstveno ima značaja za konstrukciju i dizajn konjugovanih aktiviranih antitela, dok je DAR prvenstveno relevantan za farmaceutski preparat od terapijski konjugovanih aktiviranih antitela koji će se primenjivati kod pacijenata.
[0097] U nekim realizacijama, aktivirana antitela prema sadašnjem pronalasku, mogu biti konjugovana da bi se generisali relativno homogeni preparati konjugovanih aktiviranih antitela koji imaju usku raspodelu DAR-a. U nekim realizacijama, preparat konjugovanog aktiviranog
2
antitela, može biti u osnovi homogen s obzirom na njegovu distribuciju DAR-a, što znači da je u preparatu pretežna vrsta ADC-a specifičnog za određeni lokalitet sa određenim DAR-om (npr. DAR od 2 i/ili 4). U nekim realizacijama, suštinski homogen preparat konjugovanog aktiviranog antitela, može takođe, biti uniforman u odnosu na mesto opterećenja (tj. na slobodnim cisteinima).
[0098] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće oko 2 i/ ili 4. U ovom kontekstu, izraz "oko" treba tumačiti da označava konjugovani aktivirani preparat antitela koji sadrži više od 80% dve primarne vrste u agregatu koje imaju DAR jednak 2 i 4 sa približno jednakom raspodelom (npr. veći od 40% svaki ), a ostatak se sastoji od drugih vrsta DAR.
[0099] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela iz pronalaska biće obogaćen da bude oko 2. U ovom kontekstu, izraz „oko“ treba tumačiti tako da označava konjugovani aktivirani preparat antitela koji sadrži više od oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0100] U nekim realizacijama, DAR od konjugovanih aktiviranih antitela iz pronalaska biće obogaćen da bude oko 2, s tim što će se izraz "oko" tumačiti da označava preparat konjugovanog aktiviranog antitela koji sadrži više od oko 94% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0101] U nekim realizacijama, DAR od konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće obogaćen da bude oko 2, s tim što će se pojam "oko" tumačiti kao konjugovani aktivirani preparat antitela koji sadrži više od oko 95% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0102] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće obogaćen na oko 2, s tim što će se izraz "oko" tumačiti kao konjugovani aktivni preparat antitela koji sadrži više od oko 96% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0103] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće obogaćen da bude oko 2, s tim što će se izraz "oko" tumačiti kao konjugovani aktivirani preparat antitela koji sadrži više od oko 97% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0104] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće obogaćen da bude oko 2, s tim što će se izraz "oko" tumačiti kao konjugovani aktivirani preparat antitela koji sadrži više od oko 98% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0105] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće obogaćen da bude oko 2, s tim što će se izraz "oko" tumačiti da označava konjugovani aktivirani preparat antitela koji sadrži više od oko 99% ± 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9%.
[0106] U nekim realizacijama, DAR konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku biće oko 2 i/ili 4. U ovom kontekstu, izraz "oko" treba tumačiti da označava preparat konjugovanog aktiviranog antitela koji sadrži više od 80% od dve primarne vrste u agregatu koje imaju DAR jednak 2 i 4 sa približno jednakom raspodelom (npr. više od 40% svaka), a ostatak se sastoji od drugih vrsta DAR-a.
[0107] U nekim realizacijama, moguće je postići željenu homogenost upotrebom aktiviranih antitela specifičnih za mesto i/ili selektivnom redukcijom i konjugacijom. U nekim realizacijama, željena homogenost se može postići upotrebom konstrukata specifičnih za mesto u kombinaciji sa selektivnom redukcijom. U nekim realizacijama, preparati mogu biti dalje prečišćeni, poput korišćenja analitičkih ili preparativnih hromatografskih tehnika. U ovim realizacijama, homogenost konjugovanog aktiviranog preparata antitela, može biti analizirana upotrebom različitih tehnika poznatih u tehnici, uključujući, ali ne ograničavajući se na masenu spektrometriju, HPLC (npr. HPLC za isključenje veličine, RP-HPLC, HIC-HPLC itd.) ili kapilarnu elektroforezu.
[0108] U pogledu prečišćavanja konjugovanih aktiviranih preparata antitela, biće razumljivo da se mogu angažovati standardni farmaceutski preparativni postupci za dobijanje željene čistoće. Kao što je ovde diskutovano, metode tečne hromatografije kao što su reverzno-fazna (RP) i hromatografija hidrofobnih interakcija (HIC), mogu razdvojiti jedinjenja u smeši pomoću vrednosti punjenja lekom. U nekim slučajevima, jono-izmenjivačka (IEC) ili hromatografija u mešovitom režimu (MMC) takođe, mogu biti korišćene za izolovanje vrsta sa specifičnim punjenjem leka.
[0109] U nekim realizacijama, konjugovani preparat aktiviranih antitela prema pronalasku koji ima dati DAR sa relativno visokim nivoom homogenosti opterećenja lekom, može zapravo sadržati mešavinu konjugata sa opsegom ili raspodelom opterećenja lekom, ali gde su raspodele opterećenja lekom u smeši centrirane oko (ili imaju težinski prosek) srednje vrednosti DAR-a. Stoga će u nekim realizacijama preparati konjugovanih aktiviranih antitela sadržati smešu konjugata u kojoj je prosečni DAR smeše oko 1, 2 ili 3, svaki /- 0,5. Podrazumeva se da opseg ili odstupanje može biti manje od 0,4 u određenim poželjnim realizacijama. Stoga, u drugim realizacijama preparati će sadržati prosečni DAR od 1, 2 ili 3, svaki /- 0,3.
[0110] U nekim realizacijama, raspodela lekova po antitelu u preparatima konjugovanih aktiviranih antitela iz reakcija konjugacije, može biti okarakterisana konvencionalnim
2
metodama kao što su UV-Vis spektrofotometrija, HPLC reverzne faze, HIC, masena spektroskopija, ELISA i elektroforeza.
[0111] U nekim realizacijama, smeša konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku koja uključuje smešu konjugata koji imaju različita punjenja lekom, može biti prečišćenja ili obogaćena za jednu ili više vrsta konjugata koji imaju specifično opterećenje lekom. Na primer, konjugovana smeša aktiviranog antitela koja uključuje smešu AADC-a sa punjenjem lekom od 0, 2, 4, 6 i 8, može biti obogaćena ili prečišćena za konjugovana aktivirana antitela koja imaju punjenje lekom od 2. Kako je ovde korišćeno, preparat ili prečišćavanje ili konjugovano aktivirano antitelo koje ima relativno homogen preparat vrsta od konjugovanih vrsta sa punjenjem lekom od 2 naziva se "Ε2", koje ima DAR od oko 2. Kako je ovde korišćeno, preparat ili prečišćavanje ili konjugovano aktivirano antitelo koje ima smešu konjugovanih vrsta sa punjenjem lekom od 2 ili 4, označeno kao "DE" (DAR obogaćeno), sa DAR-om od približno 3. U ovom kontekstu, izraz "oko" se tumači da znači /- 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ili 1,0 od propisane količine.
[0112] U nekim realizacijama, preparat konjugovanog aktivirajućeg antitela koji je prečišćen ili obogaćen za date vrste konjugata sa specifičnim punjenjem leka uključuje, najmanje određeni procenat datih vrsta punjenja lekom. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktiviranog antitela uključuje najmanje 50% preparata je konjugovano aktivirano antitelo koje ima punjenje lekom od 2. U nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktiviranog antitela uključuje najmanje 75% konjugovanog aktiviranog antitela sa opterećenjem lekom od 2. U nekim realizacijama, preparat E2 konjugovanog aktiviranog antitela uključuje najmanje 85% konjugovanog aktiviranog antitela sa opterećenjem lekom od 2. U nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktiviranog antitela uključuje najmanje 90% konjugovanog aktiviranog antitela koji ima punjenje lekom 2. U nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktivirajućeg antitela uključuje najmanje 95% konjugovanog aktivirajućeg antitela sa opterećenjem lekom od 2.
U nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktiviranog antitela uključuje najmanje 98% konjugovanog aktiviranog antitela koji ima punjenje lekom od 2.
[0113] U nekim realizacijama, preparat konjugovanog aktivirajućeg antitela koji je prečišćen ili obogaćen za date vrste punjenja lekom uključuje, više molarnih ekvivalenata datih vrsta lekova od ukupnih molarnih ekvivalenata svih ostalih vrsta punjenja lekovima zajedno. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktiviranog antitela je takav da su kombinovani ekvivalenti svake od vrste konjugovanih aktiviranih antitela iz preparata u
2
kome punjenje lekom nije 2 manje prisutni od ekvivalenata konjugovanog aktiviranog antitela sa punjenjem lekom od 2.
[0114] U nekim realizacijama, preparat konjugovanog aktivirajućeg antitela koji je prečišćen ili obogaćen za date vrste DAR (npr. E2, kako je ovde razmatrano) uključuje manje od određenog procenta konjugovanog aktiviranog antitela koji nije data vrsta punjenja lekom. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktivirajućeg antitela uključuje, manje od 50% konjugovanog aktivirajućeg antitela koje nije vrsta punjena lekom od 2. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktiviranog antitela, uključuje manje od 25% konjugovanog aktivirajućeg antitela koje nije vrsta sa opterećenjem lekom od 2. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktivirajućeg antitela uključuje, manje od 15% konjugovanog aktivirajućeg antitela koje nije vrsta opterećenja lekom od 2. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktivirajućeg antitela uključuje manje od 10% konjugovanog aktivirajućeg antitela koje nije vrsta opterećenja lekom od 2. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktivirajućeg antitela, uključuje manje od 5% konjugovanog aktivirajućeg antitela koje nije vrsta opterećenja lekom od 2. Na primer, u nekim realizacijama, preparat od E2 konjugovanog aktivirajućeg antitela uključuje, manje od 2% konjugovanog aktivirajućeg antitela koje nije vrsta opterećenja lekom od 2. U nekim drugim realizacijama, ili obogaćeni ili prečišćeni preparati (npr. E4 ili DE) mogu imati manje od 50%, manje od 25%, manje od 15%, manje od 10%, manje od 5% ili manje od 2% koji nije vrsta sa odgovarajućim punjenjem leka u obogaćenom ili prečišćenom preparatu konjugovanog aktivirajućeg antitela.
[0115] U nekim realizacijama, konjugovano antitelo koje se aktivira takođe, uključuje ostatak koji se može detektovati. U nekim realizacijama, detektovani ostatak je dijagnostički agens.
[0116] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo takođe, uključuje jedan signalni peptid. U nekim realizacijama, signalni peptid je konjugovan sa aktiviranim antitelom preko razdelnika. U nekim realizacijama, spejser je konjugovan sa antitelom koje se aktivira u odsustvu signalnog peptida. U nekim realizacijama, spejser je povezan direktno sa MM aktivirajućeg antitela. Primer razdelnika pridruženog direktno N-kraju MM aktivirajućeg antitela je QGQSGQ (SEK ID BR: 109). Ostali primeri razdelnika pridruženog direktno N-kraju MM aktiviranog antitela, uključuju QGQSGQG (SEK ID BR: 138), QGQSG (SEK ID BR: 139), QGQS (SEK ID BR: 140), QGQ, QG i Q. Ostali primeri razdelnika pridruženog direktno N-završetku MM aktivirajućeg antitela, uključuju GQSGQG (SEK ID BR: 143), QSGQG (SEK ID BR: 144), SGQG (SEK ID BR: 145), GQG i G. U nekim realizacijama, nijedan razdelnik nije povezan sa N-krajem MM. U nekim realizacijama, razdelnik uključuje
2
najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSGQ (SEK ID BR: 109). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSGQG (SEK ID BR: 138). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSG (SEK ID BR: 139). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQS (SEK ID BR: 140). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQ. U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QG. U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinski ostatak Q. U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu GQSGQG (SEK ID BR: 143). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QSGQG (SEK ID BR: 144). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SGQG (SEK ID BR: 145). U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu GQG. U nekim realizacijama, razdelnik uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu G. U nekim realizacijama razdelnik je odsutan.
[0117] U nekim realizacijama, AB konjugovanog aktiviranog antitela prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim realizacijama, AB može biti konstruisano tako da uključuje jednu ili više disulfidnih veza.
[0118] U nekim realizacijama, aktivirajuće antitelo od konjugovanog antitela koje se aktivira prema pronalasku, kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 5. U nekim realizacijama, aktivirajuće antitelo konjugovanog aktivirajućeg antitela prema pronalasku je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 7. U nekim realizacijama, antitelo koje se aktivira iz konjugovanog aktivirajućeg antitela prema pronalasku je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 5 i sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 7.
[0119] U nekim realizacijama, aktivirano antitelo od konjugovanog aktivirajućeg antitela prema pronalasku, kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 5. U nekim realizacijama,
2
antitelo koje se aktivira iz konjugovanog aktivirajućeg antitela prema pronalasku, kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 7. U nekim realizacijama, antitelo koje se aktivira od konjugovanog aktivirajućeg antitela prema pronalasku je kodirano sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 5 i sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sekvenci nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 7.
[0120] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode za proizvodnju aktiviranog antitela prema pronalasku, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije aktivirajućeg antitela, pri čemu ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline prema pronalasku ili vektor prema pronalasku.
[0121] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode za proizvodnju antitela sposobnog da se aktivira, koje u aktiviranom stanju vezuje CD71, a metoda uključuje: (a) kultivisanje ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji kodira aktivirano antitelo pod uslovima koji dovode do ekspresije aktivirajućeg antitela, pri čemu aktivirajuće antitelo sadrži aktivirajuće antitelo prema pronalasku; i (b) obnavljanje aktivirajućeg antitela.
[0122] U nekim realizacijama, serumski poluživot konjugovanog aktiviranog antitela je duži od odgovarajućeg antitela; npr. pK konjugovanog aktiviranog antitela je duži od onog od odgovarajućeg antitela. U nekim realizacijama, serumski poluživot konjugovanog aktiviranog antitela sličan je onom od odgovarajućeg antitela. U nekim realizacijama, serumski poluživot konjugovanog aktiviranog antitela je najmanje 15 dana kada je primenjeno u organizmu. U nekim realizacijama, serumski poluživot konjugovanog aktiviranog antitela je najmanje 12 dana kada je primenjeno u organizmu. U nekim realizacijama, serumski poluživot konjugovanog aktiviranog antitela je najmanje 11 dana kada je primenjeno u organizmu. U nekim realizacijama, serumski poluživot konjugovanog aktiviranog antitela je najmanje 10 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot konjugovanog aktiviranog antitela u serumu je najmanje 9 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot konjugovanog aktiviranog antitela u serumu je najmanje 8 dana kada
2
je primenjeno u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot konjugovanog aktiviranog antitela u serumu je najmanje 7 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, serumski poluživot aktiviranog antitela je najmanje 6 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 5 dana kada je primenjeno u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 4 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 3 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 2 dana kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 24 sata kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 20 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, serumski poluživot aktiviranog antitela je najmanje 18 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 16 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 14 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 12 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 10 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 8 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 6 sati kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 4 sata kada se primeni u organizmu. U nekim realizacijama, poluživot aktiviranog antitela u serumu je najmanje 3 sata kada se primeni u organizmu.
[0123] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode za proizvodnju anti-CD71 antitela i/ili polipeptida aktivirajućeg anti-CD71 antitela, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije polipeptida, pri čemu ćelija sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo i/ili ovde opisano aktivirano antitelo i/ili vektore koji uključuju ove izolovane sekvence nukleinske kiseline. Pronalazak obezbeđuje metode za proizvodnju antitela i/ili aktiviranog antitela kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela i / ili aktiviranog antitela, pri čemu ćelija sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo i/ili ovde opisano aktivirajuće antitelo, i/ili vektore koji uključuju ove izolovane sekvence nukleinske kiseline.
[0124] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode za sprečavanje, odlaganje progresije, lečenje, ublažavanje simptoma ili na drugi način poboljšanje bolesti posredovane CD71 kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 prema patentnim zahtevima.
[0125] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode sprečavanja, odlaganja progresije, lečenja, olakšanja simptoma ili na drugi način poboljšanja karcinoma kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 prema patentnim zahtevima kod subjekta kome je to potrebno. Poznato je da je CD71 izražen u različitim karcinomima, kao što su, putem neograničavajućeg primera, adenokarcinom, rak žučnih puteva (bilijarni), rak bešike, rak dojke, npr. trostruko negativni rak dojke i Her2 negativni rak dojke; karcinoidni rak; rak grlića materice; holangiokarcinom; kolorektalni; endometrijalni; gliom; rak glave i vrata, npr. rak skvamoznih ćelija glave i vrata; leukemija; rak jetre; rak pluća, npr. NSCLC, SCLC; limfom; melanom; rak jednjaka; rak jajnika; rak pankreasa; rak prostate, npr. metastatski karcinom prostate rezistentan na kastraciju; rak bubrega; rak kože; rak skvamoznih ćelija, rak želuca; rak testisa; rak štitne žlezde; i urotelijalni rak.
[0126] U nekim realizacijama, rak je povezan sa tumorom koji izražava CD71. U nekim realizacijama, rak je posledica tumora koji eksprimira CD71.
[0127] Konjugovano aktivirano antitelo protiv CD71 koje se koristi u bilo kojoj realizaciji ovih metoda i upotreba, može biti primenjeno u bilo kojoj fazi bolesti. Na primer, takvo konjugovano aktivirano antitelo protiv CD71, može biti primenjeno kod pacijenta koji pati od karcinoma bilo kojeg stadijuma, od ranog do metastatskog. Izrazi subjekt i pacijent su ovde korišćeni naizmenično.
[0128] U nekim realizacijama, subjekt je sisar, kao što je čovek ili nehumani primat.
[0129] Konjugovano aktivirano anti-CD71 antitelo prema patentnim zahtevima i njegove terapijske formulacije primenjivane su kod subjekta koji pati ili je podložan bolesti ili poremećaju povezanom sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. Subjekt koji pati ili je podložan bolesti ili poremećaju povezanom sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71 identifikuje se korišćenjem bilo koje od različitih metoda poznatih u tehnici. Na primer, subjekti koji pate od raka ili drugog neoplastičnog stanja identifikovani su korišćenjem bilo kojih od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova, kao što su fizički pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji pate od inflamacije i/ili inflamatornog poremećaja identifikovani su korišćenjem bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova, kao što su fizički pregled i/ili analiza telesnih tečnosti, npr. analiza krvi, urina i/ili stolice, za procenu zdravstvenog stanja.
1
[0130] Primena konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 prema patentnim zahtevima kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja povezanog sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71 smatra se uspešnom ako se postigne bilo koji od različitih laboratorijskih ili kliničkih ciljeva. Na primer, primena konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja povezanog sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71 smatra se uspešnom ako je jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem ublaženo, smanjeno, inhibirano ili ne napreduje dalje, tj. u još gore stanje. Primena konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja povezanog sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71 smatra se uspešnom ako bolest ili poremećaj uđe u remisiju ili ne napreduje dalje, tj. u pogoršano stanje.
[0131] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo protiv CD71 i njegove terapeutske formulacije primenjuju se kod subjekta koji boluje od ili je podložan bolesti ili poremećaju, kao što su subjekti koji boluju od karcinoma ili drugog neoplastičnog stanja, pri čemu obolele ćelije subjekta izražavaju CD71. U nekim realizacijama, bolesne ćelije su povezane sa poremećenom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. U nekim realizacijama, bolesne ćelije su povezane sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. Subjekt koji boluje od ili je podložan bolesti ili poremećaju, gde bolesne ćelije subjekta izražavaju CD71, identifikovan je korišćenjem bilo koje od različitih metoda poznatih u struci. Na primer, subjekti koji boluju od raka ili drugog neoplastičnog stanja, identifikovani su pomoću bilo kojih različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova, kao što su fizički pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji boluju od upale i/ili upalnog poremećaja identifikovani su pomoću bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova, kao što su fizički pregled i/ili analiza telesnih tečnosti, npr. analiza krvi, urina i/ili stolice, za procenu zdravstvenog stanja.
[0132] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo protiv CD71 i njegove terapeutske formulacije su primenjene kod subjekta koji boluje od ili je sklon bolesti ili poremećaju povezanom sa ćelijama koje eksprimiraju CD71 ili prisustvom, rastom, proliferacijom, metastazama i/ili aktivnošću takvih ćelija, kao što su osobe koje boluju od raka ili drugih neoplastičnih stanja. U nekim realizacijama, ćelije su povezane sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. U nekim realizacijama, ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD71. Subjekt koji pati od ili je podložan bolesti ili poremećaju povezanom sa ćelijama koje eksprimiraju CD71, identifikovan je korišćenjem bilo koje od različitih metoda poznatih u struci. Na primer, subjekti koji boluju od raka ili drugog neoplastičnog stanja, identifikovani su pomoću bilo kog niza kliničkih i/ili laboratorijskih
2
testova, kao što su fizički pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji pate od upale i/ili upalnog poremećaja identifikovani su pomoću bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova, kao što su fizički pregled i/ili analiza telesnih tečnosti, npr. analiza krvi, urina i/ili stolice, za procenu zdravstvenog stanja.
[0133] Primena konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja povezanog sa ćelijama koje eksprimiraju CD71 smatra se uspešnom ako se postigne bilo koji od različitih laboratorijskih ili kliničkih ciljeva. Na primer, primena konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja povezanog sa ćelijama koje eksprimiraju CD71 smatra se uspešnom ako je jedan ili više simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem ublaženo, smanjeno, inhibirano ili ne napreduje u dalje, tj. još gore stanje. Primena konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 kod pacijenta koji boluje od bolesti ili poremećaja povezanog sa ćelijama koje eksprimiraju CD71 smatra se uspešnom ako bolest ili poremećaj uđe u remisiju ili ne napreduje u dalje, tj. gore stanje.
[0134] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode lečenja, ublažavanja simptoma ili odlaganja progresije poremećaja ili bolesti u kojima bolesne ćelije izražavaju CD71, uključujući primenu terapijski efikasne količine konjugovanog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano antitelo prema patentnim zahtevima, kod subjekta kome je to potrebno.
[0135] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode lečenja, ublažavanja simptoma ili odlaganja progresije poremećaja ili bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CD71, a koje obuhvataju primenu terapijski efikasne količine konjugovanog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano antitelo prema patentnim zahtevima, subjektu kome je to potrebno. U nekim realizacijama, poremećaj ili bolest povezana sa ćelijama koje izražavaju CD71 je rak. U nekim realizacijama, rak je adenokarcinom, rak žučnog kanala (bilijarnog), rak bešike, rak kostiju, rak dojke, trostruko negativni rak dojke, Her2-negativni rak dojke, karcinoidni rak, rak grlića materice, holangiokarcinom, kolorektalni karcinom, rak debelog creva, rak endometrijuma, gliom, rak glave i vrata, rak skvamoznih ćelija glave i vrata, leukemija, rak jetre, rak pluća, rak plućnih ćelija koje nisu sitnoćelijske, mikrocelularni rak pluća, limfom, melanom, orofaringealni karcinom, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, metastatski karcinom prostate otporan na kastraciju, rak bubrega, sarkom, rak kože, rak skvamoznih ćelija, rak želuca, rak testisa, rak štitaste žlezde, urogenitalni rak ili urotelijalni rak. U nekim realizacijama, prirodni ligand je transferin. U nekim realizacijama, ekspresija i/ili aktivnost CD71 kod sisara je poremećena. U nekim realizacijama, postupak uključuje primenu dodatnog agensa. U nekim realizacijama, dodatni agens je terapijski agens.
[0136] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode inhibicije ili smanjenja rasta, proliferacije ili metastaza ćelija koje eksprimiraju CD71 sisara, koje uključuju primenu terapijski efikasne količine konjugovanog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano antitelo prema patentnim zahtevima, subjektu kome je to potrebno. U nekim realizacijama, prirodni ligand je transferin. U nekim realizacijama, ekspresija i/ili aktivnost CD71 sisara je poremećena. U nekim realizacijama, postupak uključuje primenu dodatnog agensa. U nekim realizacijama, dodatni agens je terapijski agens.
[0137] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode inhibicije, blokiranja ili sprečavanja vezivanja prirodnog liganda za CD71 kod sisara, koje uključuju primenu terapijski efikasne količine antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano antitelo prema patentnim zahtevima, kod subjekta kome je to potrebno. U nekim realizacijama, prirodni ligand je transferin. U nekim realizacijama, ekspresija i/ili aktivnost CD71 kod sisara je poremećena. U nekim realizacijama, postupak uključuje primenu dodatnog agensa. U nekim realizacijama, dodatni agens je terapeutski agens.
[0138] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode lečenja, ublažavanja simptoma ili odlaganja napredovanja poremećaja ili bolesti u kojima bolesne ćelije eksprimiraju CD71, a koje uključuju primenu terapijski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano aktivirano antitelo prema patentnim zahtevima, kod subjekta kome je to potrebno. U nekim realizacijama, poremećaj ili bolest je rak.
[0139] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode lečenja, ublažavanja simptoma ili odlaganja progresije poremećaja ili bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CD71, a koje obuhvataju primenu terapeutski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano aktivirano antitelo prema patentnim zahtevima, kod subjekta kome je to potrebno. U nekim realizacijama, poremećaj ili bolest povezana sa ćelijama koje eksprimiraju CD71 je rak. U nekim realizacijama, rak je adenokarcinom, rak žučnog kanala (bilijarnog), rak bešike, rak kostiju, rak dojke, trostruko negativni rak dojke, Her2 negativni rak dojke, karcinoidni rak, rak grlića materice, holangiokarcinom, kolorektalni rak, rak debelog creva, rak endometrijuma, gliom, rak glave i vrata, rak skvamoznih ćelija glave i vrata, leukemija, rak jetre, rak pluća, rak pluća koji nije sitnoćelijski, mikrocelularni rak pluća, limfom, melanom,
4
orofaringealni rak, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, metastatski karcinom prostate rezistentan na kastraciju, rak bubrega, sarkom, rak kože, rak skvamoznih ćelija, rak želuca, rak testisa, rak štitaste žlezde, urogenitalni rak ili urotelijalni rak. U nekim realizacijama, prirodni ligand je transferin. U nekim realizacijama, ekspresija i/ili aktivnost CD71 sisara je poremećena. U nekim realizacijama, postupak uključuje primenu dodatnog agensa. U nekim realizacijama, dodatni agens je terapijski agens.
[0140] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode inhibiranja ili smanjenja rasta, proliferacije ili metastaza ćelija koje eksprimiraju CD71 sisara, koje uključuju primenu terapeutski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano aktivirano antitelo prema patentnim zahtevima, kod subjekta kome je to potrebno. U nekim realizacijama, prirodni ligand je transferin. U nekim realizacijama, ekspresija i/ili aktivnost CD71 kod sisara je abnormalna. U nekim realizacijama, postupak uključuje primenu dodatnog agensa. U nekim realizacijama, dodatni agens je terapeutski agens.
[0141] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, metode inhibiranja, blokiranja ili sprečavanja vezivanja prirodnog liganda za CD71 sisara, koje uključuju primenu terapeutski efikasne količine konjugovanog aktiviranog antitela prema patentnim zahtevima ili farmaceutskog preparata koji sadrži konjugovano aktivirano antitelo prema patentnim zahtevima, kod subjekta kome je to potrebno. U nekim realizacijama, prirodni ligand je transferin. U nekim realizacijama, ekspresija i/ili aktivnost CD71 sisara je abnormalna. U nekim realizacijama, postupak uključuje primenu dodatnog agensa. U nekim realizacijama, dodatni agens je terapeutski agens.
[0142] U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, anti-CD71 konjugovano aktivirano antitelo uključuje detektabilnu oznaku. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, oznaka koja se može detektovati uključuje sredstvo za slikanje, kontrastno sredstvo, enzim, fluorescentnu oznaku, hromofor, boju, jedan ili više metalnih jona ili oznaku na bazi liganda. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, sredstvo za obradu slike sadrži radioizotop. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, radioizotop je indijum ili tehnecijum. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, kontrastno sredstvo sadrži jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, enzim sadrži peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu ili β-galaktozidazu. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, fluorescentna oznaka sadrži žuti fluorescentni protein (YFP), cijano fluorescentni protein (CFP), zeleni fluorescentni protein (GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (mRFP), crveni fluorescentni protein tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED ili derivat europijuma. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, luminiscentna oznaka sadrži derivat N-metilakridijuma. U nekim realizacijama ovih metoda, oznaka sadrži Alexa Fluor® oznaku, kao što su Alexa Fluor®680 ili Alexa Fluor®750. U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, oznaka bazirana na ligandu sadrži biotin, avidin, streptavidin ili jedan ili više haptena.
[0143] U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, subjekt je sisar. U nekim realizacijama ovih metoda, subjekt je humani. U nekim realizacijama, subjekat je nehumani sisar, kao što je nehumani primat, životinja pratilac (npr. mačka, pas, konj), domaća životinja, životinja za rad ili životinja u zoološkom vrtu. U nekim realizacijama, subjekt je glodar.
[0144] U nekim realizacijama ovih metoda i kompleta, metoda je in vivo metoda. U nekim realizacijama ovih metoda, metoda je in situ metoda. U nekim realizacijama ovih metoda, metoda je ex vivo metoda. U nekim realizacijama ovih metoda, metoda je in vitro metoda.
[0145] U nekim realizacijama metoda i kompleta, metoda se koristi za identifikovanje ili na drugi način izdvaja populacije pacijenata pogodne za lečenje sa anti-CD71 konjugovanim aktiviranim antitelom iz patentnih zahteva, praćene lečenjem primenom tog konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 kod subjekta kome je to potrebno. Na primer, pacijenti kod kojih je test pozitivan i na cilj (npr. CD71) i na proteazu koja odvaja supstrat u cepljivom delu (CM) antitela aktiviranog protiv CD71 koje se ispituje ovim metodama, identifikovani su kao pogodni kandidati za lečenje sa takvim anti-CD71 aktiviranim antitelom koje sadrži takav CM, a pacijentu se zatim primenjuje terapeutski efikasna količina konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 koje je testirano. Slično tome, pacijenti kod kojih je test negativan na jedan ili oba cilja (npr. CD71) i proteazu koja cepa supstrat u CM u aktiviranom antitelu koje je testirano pomoću ovih metoda, mogu se identifikovati kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije. U nekim realizacijama, takvi pacijenti mogu da se testiraju sa drugim antitelima koja se aktiviraju protiv CD71 sve dok se ne identifikuje odgovarajuće antitelo aktivirano protiv CD71 za lečenje (npr. antitelo aktivirano protiv CD71 koje sadrži CM koji pacijent odvaja na mestu bolesti). U nekim realizacijama, pacijentu se zatim primenjuje terapijski efikasna količina aktiviranog antitela protiv CD71 i/ili konjugovanog na koju je pacijent bio pozitivan.
[0146] Farmaceutski preparati prema pronalasku, mogu da sadrže antitelo iz patentnih zahteva i opciono, farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovi farmaceutski preparati mogu biti uključeni u komplete, kao što su, na primer, dijagnostički kompleti.
[0147] U nekim realizacijama, farmaceutski preparat sadrži konjugovano aktivirano antitelo iz patentnih zahteva i opciono farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim realizacijama, farmaceutski preparat sadrži dodatno sredstvo. U nekim realizacijama, dodatno sredstvo je terapijsko sredstvo.
[0148] AB u aktiviranim antitelima iz pronalaska specifično vezuje humani CD71.
[0149] Konjugovana aktivirana antitela protiv CD71, prema sadašnjem pronalasku uključuju maskirajući deo. U sadašnjem pronalasku, maskirajući deo je aminokiselinska sekvenca koja je povezana ili je na neki drugi način vezana za antitelo protiv CD71 i smeštena je unutar konstrukta aktiviranog anti-CD71 antitela tako da maskirajući deo smanjuje sposobnost antitela protiv CD71 da specifično vezuje CD71. Pogodni maskirajući delovi su identifikovani korišćenjem bilo koje od različitih poznatih tehnika. Na primer, delovi koji maskiraju peptide su identifikovani korišćenjem metoda opisanih u PCT publikaciji br. WO 2009/025846 od strane Daugherty i sar. Maskirajući ostatak konjugovanih aktiviranih anti-CD71 antitela prema sadašnjem pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 18.
[0150] Konjugovana aktivirana antitela protiv CD71, prema sadašnjem pronalasku uključuju cepljivi deo. Prema sadašnjem pronalasku, cepljivi deo uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je supstrat za proteazu, obično ekstracelularnu proteazu. Pogodni supstrati su identifikovani korišćenjem bilo koje od različitih poznatih tehnika. Na primer, peptidni supstrati su identifikovani korišćenjem metoda opisanih u američkom patentu br.7,666,817 od strane Daugherti i sar.; u američkom patentu br.8,563,269 od strane Stagliano i sar; i u PCT publikaciji br. WO 2014/026136 od La Porte i sar. (Videti takođe Boulware i sar. " Evoluciona optimizacija peptidnih supstrata za proteaze koje ispoljavaju rapidnu kinetiku hidrolize. „Biotechnol. Bioeng. 106.3 (2010): 339-46). Prema pronalasku, cepljivi deo sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 156
[0151] Primeri supstrata uključuju, ali nisu ograničeni na supstrate, koji se mogu otcepiti jednim ili više od sledećih enzima ili proteaza navedenih u Tabeli (I).
Tabela (I): Primerne proteaze i/ili enzimi
[0152] Ovde opisana, aktivirana antitela protiv CD71 prevazilaze ograničenja terapijskih antitela, naročito terapijskih antitela za koje je poznato da su toksična do najmanje određenog stepena in vivo. Ciljno-posredovana toksičnost predstavlja glavno ograničenje za razvoj terapijskih antitela. Ovde obezbeđena, aktivirana antitela protiv CD71 su dizajnirana da upućuju na toksičnost povezanu sa ciljnom inhibicijom u normalnim tkivima pomoću tradicionalnih terapijskih antitela.
Ova aktivirajuća antitela protiv CD71 ostaju maskirana sve do proteolitičke aktivacije na mestu bolesti. Polazeći od antitela protiv CD71 kao roditeljskog terapijskog antitela, aktivirana antitela protiv CD71 prema pronalasku, konstruisana su spajanjem antitela sa inhibitornom maskom preko veznika koji inkorporira proteazni supstrat.
[0153] Kada je AB modifikovan sa MM i nalazi se u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za njegov cilj je smanjeno ili inhibirano u poređenju sa specifičnim vezivanjem nemodifikovanog AB sa MM ili specifičnim vezivanjem roditeljskog AB za cilj.
[0154] Kdmodifikovanog AB sa MM prema cilju je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ili veći, ili između 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 ili 100.000-10.000.000 puta veći od KdAB koji nije modifikovan sa MM ili roditeljskog AB prema cilju. Suprotno tome, afinitet vezivanja AB modifikovanog sa MM prema cilju je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50,000,000 ili veći, ili između 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.0001.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 ili 100.000-10.000.000 puta niži od afiniteta vezivanja nemodifikovanog AB sa MM ili roditeljskog AB prema cilju.
[0155] Konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je uglavnom veća od KdAB prema cilju. KdMM prema AB može biti najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 ili čak 10.000.000 puta veći od KdAB prema cilju. Suprotno, afinitet vezivanja MM prema AB je generalno niži od afiniteta vezivanja AB prema cilju. Afinitet vezivanja MM prema AB može biti najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 100.000, 1.000.000 ili čak 10.000.000 puta niži od afiniteta vezivanja AB prema cilju.
[0156] U nekim realizacijama, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB približno je jednaka KdAB prema cilju. U nekim realizacijama, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB nije veća od konstante disocijacije AB prema cilju.
[0157] U nekim realizacijama, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je manja od konstante disocijacije AB prema cilju.
[0158] U nekim realizacijama, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je veća od konstante disocijacije AB prema cilju.
[0159] U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji nije veći od Kdza vezivanje AB za cilj.
[0160] U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji nije manji od Kdza vezivanje AB za cilj.
[0161] U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji je približno jednak Kdza vezivanje AB za cilj.
[0162] U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji je manji od Kdza vezivanje AB za cilj.
[0163] U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji je veći od Kdza vezivanje AB za cilj.
[0164] U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji nije više od 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ili 1.000 puta veći od Kdza vezivanje AB za cilj. U nekim realizacijama, MM ima Kdza vezivanje za AB koji je između 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1.000, 20-100, 20-1000 ili 100-1.000 puta veći od Kdza vezivanje AB za cilj.
[0165] U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji je manji od afiniteta vezivanja AB za cilj.
[0166] U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji nije veći od afiniteta vezivanja AB za cilj.
4
[0167] U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji je približno jednak afinitetu vezivanja AB za cilj.
[0168] U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji nije manji od afiniteta vezivanja AB za cilj.
[0169] U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji je veći od afiniteta vezivanja AB za cilj.
[0170] U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji je 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 ili 1.000 puta manji od afiniteta vezivanja AB za cilj. U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji je između 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1.000, 20-100, 20-1000 ili 100-1.000 puta manji od afiniteta vezivanja AB za cilj. U nekim realizacijama, MM ima afinitet za vezivanje za AB koji je 2 do 20 puta niži od afiniteta za vezivanje AB za cilj. U nekim realizacijama, MM koji nije kovalentno povezan sa AB i pri ekvimolarnoj koncentraciji sa AB ne inhibira vezivanje AB za cilj.
[0171] Kada je AB modifikovan sa MM i u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za njegov cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem nemodifikovanog AB sa MM ili specifičnim vezivanjem roditeljskog AB za cilj. U poređenju sa vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM ili vezivanjem roditeljskog AB za cilj, sposobnost AB da veže cilj kada je modifikovan sa MM može biti redukovana za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% za najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 ili 96 sati, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci ili više kada je merena in vivo ili u in vitro testu.
[0172] MM inhibira vezivanje AB za cilj. MM vezuje domen za vezivanje antigena od AB i inhibira vezivanje AB za cilj. MM može prostorno inhibirati vezivanje AB za cilj. MM može alosterično inhibirati vezivanje AB za njegov cilj. U ovim realizacijama kada je AB modifikovan ili kuplovan sa MM i u prisustvu cilja nema vezivanja ili suštinski nema vezivanja AB za cilj, ili ne više od 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ili 50% vezivanja AB za cilj, u poređenju sa vezivanjem nemodifikovanog AB sa MM, roditeljskog AB ili AB koji nije spojen sa MM za cilj, za najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 ili 96 sati, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci ili duže kada je mereno in vivo ili u in vitro testu.
[0173] Kada je AB kuplovan sa ili modifikovan pomoću MM, MM „maskira“ ili smanjuje ili na drugi način inhibira specifično vezivanje AB za cilj. Kada je AB povezan sa MM ili je modifikovan pomoću MM, takvo kuplovanje ili modifikacija može postići strukturnu promenu koja smanjuje ili inhibira sposobnost AB da specifično veže svoj cilj.
[0174] U određenim realizacijama, MM nije prirodni vezujući partner AB. U nekim realizacijama, MM ne poseduje nikakvu ili suštinski nikakvu homologiju sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim realizacijama MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili 80% sličan bilo kojem prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim realizacijama MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili 80% identičan bilo kojem prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 25% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 50% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 20% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 10% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB.
[0175] U sadašnjem pronalasku, aktivirana antitela uključuju AB koji je modifikovan pomoću MM i takođe, uključuje jedan ili više cepljivih ostataka (CM). Takva aktivirana antitela pokazuju aktivirajuće/preklopno vezivanje za cilj AB. Antitela koja se aktiviraju obično uključuju, antitelo ili fragment antitela (AB), modifikovan od strane ili povezan sa maskirajućim ostatkom (MM) i modifikovanim ili cepljivim ostatkom (CM). U sadašnjem pronalasku, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu koja služi kao supstrat za najmanje jednu proteazu.
[0176] Elementi aktivirajućih antitela su raspoređeni tako da su MM i CM pozicionirani tako da u rascepljenom (ili relativno aktivnom) stanju i u prisustvu cilja, AB vezuje cilj, dok kada je aktivirajuće antitelo u nerazgrađenom (ili relativno neaktivnom) stanju u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za njegov cilj je smanjeno ili inhibirano. Specifično vezivanje AB za njegov cilj može biti smanjeno usled inhibicije ili maskiranja sposobnosti AB da specifično vezuje svoj cilj od strane ММ.
[0177] Kdmodifikovanog AB sa MM i CM prema cilju je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000, 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ili veći, ili između 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1, 000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 ili 100.000-10.000.000 puta veći od Kdnemodifikovanog AB sa MM i CM ili roditeljskog AB prema cilju. Suprotno, afinitet vezivanja AB modifikovanog sa MM i CM prema cilju je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1.000, 2.500, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, 500.000 , 1.000.000, 5.000.000, 10.000.000, 50.000.000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1.000, 10-10.000, 10-100.000, 10-1.000.000, 10-10.000.000, 100-1.000, 100-10.000, 100-100.000, 100-1.000.000, 100-10.000.000, 1.000-10.000, 1.000-100.000, 1.000-1.000.000, 1000-10.000.000, 10.000-100.000, 10.000-1.000.000, 10.000-10.000.000, 100.000-1.000.000 ili 100.000-10.000.000 puta niži od afiniteta vezivanja AB koji nije modifikovan sa MM i CM ili roditeljskog AB prema cilju.
[0178] Kada je AB modifikovan sa MM i CM i nalazi se u prisustvu cilja, ali ne i u prisustvu modifikujućeg agensa (na primer, najmanje jedne proteaze), specifično vezivanje AB za njegov cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem nemodifikovanog AB sa MM i CM ili roditeljskog AB za cilj. U poređenju sa vezivanjem roditeljskog AB ili vezivanjem nemodifikovanog antitela sa MM i CM za njegov cilj, sposobnost modifikovanog AB-a sa MM i CM da vezuje cilj, može biti smanjena za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% za najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 ili 96 sati ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 meseci ili duže kada je izmerena in vivo ili u in vitro testu.
[0179] Kako se ovde koristi, izraz rascepljeno stanje se odnosi na stanje aktiviranih antitela nakon modifikacije CM-a pomoću najmanje jedne proteaze. Izraz nerazdvojeno stanje, kako se ovde koristi, odnosi se na stanje aktivirajućih antitela u odsustvu odvajanja CM-a od strane proteaze. Kao što je gore diskutovano, izraz "aktivirajuća antitela" je ovde korišćen da se odnosi na aktivirajuće antitelo kako u njegovom nerazgrađenom (nativnom) stanju, tako i u njegovom rascepljenom stanju. Prosečnom stručnjaku će biti očigledno da u nekim realizacijama razdvojenom aktiviranom antitelu može nedostajati MM usled odvajanja CM-a proteazom, što rezultira oslobađanjem najmanje MM-a (npr., kada MM nije povezan sa aktiviranim antitelima kovalentnom vezom (npr. disulfidna veza između ostataka cisteina).
[0180] Pod aktivirajućim ili promenljivim, označava se da aktivirajuće antitelo ispoljava prvi nivo vezivanja za cilj kada je aktivirajuće antitelo u inhibiranom, maskiranom ili nerazgrađenom stanju (tj. prva konformacija), a drugi nivo vezivanja za cilj u neinhibiranom, demaskiranom i/ili rascepljenom stanju (tj. druga konformacija), gde je drugi nivo ciljnog vezivanja veći od prvog nivoa vezivanja. Generalno, pristup cilja prema AB aktivirajućeg antitela je veći u prisustvu agensa za cepanje sposobnog za odvajanje CM-a, tj. proteaze, nego u otsustvu takvog agensa za cepanje.
Stoga, kada se aktivirijaće antitelo nalazi u nerazgrađenom stanju, AB je inhibirano za vezivanje za cilj i može biti maskirano od vezivanja cilja (tj. prva konformacija je takva da AB
4
ne može vezati cilj), a u rascepljenom stanju AB nije inhibiran ili je demaskiran za ciljno vezivanje.
[0181] CM i AB aktiviranih antitela su odabrani tako da AB predstavlja vezujući ostatak za dati cilj, a CM predstavlja supstrat za proteazu. U nekim realizacijama, proteaza je lokalizovana zajedno sa ciljem na mestu lečenja ili dijagnostičkom mestu kod subjekta. Kako se ovde koristi, lokalizovano zajedno odnosi se da se nalazi na istom mestu ili je relativno u neposrednoj blizini. U nekim realizacijama, proteaza cepa CM dajući aktivirano antitelo koje se vezuje za cilj koji se nalazi u blizini mesta odvajanja. Ovde otkrivena, aktivirajuća antitela nalaze posebnu upotrebu tamo gde je, na primer, proteaza sposobna da otcepi mesto u CM-u, tj. proteaza je prisutna pri relativno višim nivoima u ciljnom tkivu mesta za lečenje ili dijagnostičkom mestu nego u tkivu nelečenih mesta (na primer u zdravom tkivu). U nekim realizacijama, CM prema pronalasku je takođe, otcepljen pomoću jedne ili više drugih proteaza. U nekim realizacijama, to je jedna ili više drugih proteaza koje su zajedno lokalizovane sa ciljem i koje su odgovorne za cepanje CM-a in vivo.
[0182] U nekim realizacijama, antitela koja se aktiviraju obezbeđuju smanjenu toksičnost i/ili neželjene sporedne efekte koji bi inače mogli nastati vezivanjem AB na mestima koja nisu tretirana ako AB nije maskiran ili na drugi način inhibiran da se vezuje za cilj.
[0183] Generalno, aktivirajuće antitelo može biti dizajnirano izborom AB od interesa i konstruisanjem ostatka aktivirajućeg antitela tako da, kada je konformacijski ograničeno, MM obezbeđuje maskiranje AB ili smanjenje vezivanja AB za njegov cilj. Kriterijumi strukturnog dizajna mogu se uzeti u obzir da bi se obezbedila ova funkcionalna karakteristika.
[0184] Obezbeđena su aktivirajuća antitela koja pokazuju promenljivi fenotip željenog dinamičkog opsega za ciljno vezivanje u inhibiranim naspram neinhibiranih konformacija. Dinamički opseg se generalno odnosi na odnos (a) maksimalno detektovanog nivoa parametra pod prvim skupom uslova i (b) minimalno detektovane vrednosti tog parametra pod drugim skupom uslova. Na primer, u kontekstu aktiviranog antitela, dinamički opseg se odnosi na odnos (a) maksimalno otkrivenog nivoa vezivanja ciljnog proteina za aktivirano antitelo u prisustvu najmanje jedne proteaze koja je sposobna da razdvaja CM od aktivirajućih antitela do (b) minimalno otkrivenog nivoa vezivanja ciljnog proteina za aktivirano antitelo u otsustvu proteaze. Dinamički opseg aktiviranog antitela može se izračunati kao odnos konstante disocijacije tretmana agensom za cepanje aktivirajućeg antitela (npr. enzima) prema konstanti disocijacije tretmana agensom za cepanje aktiviranih antitela. Što je veći dinamički opseg aktiviranog antitela, to je bolji promenljivi fenotip aktiviranog antitela. Antitela koja se aktiviraju koja imaju relativno veće vrednosti dinamičkog opsega (npr. veće od 1) pokazuju poželjnije, promenljive fenotipe, tako da se vezivanje ciljnog proteina od strane aktiviranih antitela dešava u većoj meri (npr. pretežno se dešava) u prisustvu agensa za cepanje (npr. enzima) sposobnog za razdvajanje CM-a od aktivnih antitela nego u otsustvu agensa za cepanje.
[0185] U određenim realizacijama, MM nije prirodni vezujući partner AB-a. U nekim realizacijama, MM ne sadrži ili suštinski nema homologiju sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB-a. U nekim realizacijama MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ili 80% sličan bilo kojem prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim realizacijama MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75% ili 80% identičan bilo kojem prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 50% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 25% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 20% identičan bilo kojem prirodnom vezujućem partneru AB. U nekim realizacijama, MM nije više od 10% identičan bilo kom prirodnom vezujućem partneru AB.
[0186] U mnogim realizacijama, može biti poželjno umetanje jednog ili više linkera, na primer, fleksibilnih linkera, u konstrukt antitela koje se može aktivirati, tako da se obezbedi fleksibilnost na jednom ili više od MM-CM spoja, CM-AB spoja ili oba. Na primer, AB, MM i/ili CM mogu da ne sadrže dovoljan broj ostataka (npr. Gli, Ser, Asp, Asn, posebno Gli i Ser, posebno Gli) da bi se obezbedila željena fleksibilnost. Kao takav, promenljivi fenotip takvih aktiviranih konstrukata antitela može imati koristi od uvođenja jedne ili više aminokiselina kako bi se obezbedio fleksibilni linker. Pored toga, kao što je opisano u nastavku, gde je aktivirajuće antitelo obezbeđeno kao konformaciono ograničeni konstrukt, fleksibilni linker može biti operativno ubačen da olakša formiranje i održavanje ciklične strukture u nerascepljenom antitelu koje se aktivira.
[0187] U sadašnjem pronalasku, aktivirajuće antitelo sadrži sledeću formulu (gde formula niže predstavlja aminokiselinsku sekvencu u smeru od N- do C-kraja ili od C- do N-kraja):
(MM)-LP1-(CM)-LP2-(AB)
Pored toga, gornje formule obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu biti pozicionirane N-terminalno ili C-terminalno prema elementima aktivirajućih antitela. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, ciljajuće ostatke (npr. ligand za receptor ćelije prisutan u ciljnom tkivu) i ostatke za produženje serumskog poluživota (npr. polipeptidi koji vezuju
4
serumske proteine, kao što su imunoglobulin (npr. IgG) ili serumski albumin (npr. humani serumski albumin (HAS)).
[0188] CM se specifično raskida najmanje jednom proteazom pri brzini od oko 0,001-1500 x 10<4>M<-1>S<-1>ili najmanje 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250 ili 1500 x 10<4>M<-1>S<-1>. U nekim realizacijama, CM se specifično raskida pri brzini od oko 100,000 M<-1>S<-1>. U nekim realizacijama, CM se specifično raskida brzinom od oko 1x10E2 do oko 1x10E6 M<-1>S<-1>(tj. od oko 1x10<2>do oko 1x10<6>M<-1>S<-1>).
[0189] Za specifično raskidanje enzimom, ostvaruje se kontakt između enzima i CM. Kada je aktivirano antitelo koje sadrži AB povezano sa MM i CM u prisustvu cilja i dovoljne enzimske aktivnosti, CM se može raskinuti. Dovoljna aktivnost enzima može se odnositi na sposobnost enzima da stupi u kontakt sa CM i daje cepanje. Može se lako pretpostaviti da enzim može biti u blizini CM-a, ali je nesposoban za cepanje zbog drugih ćelijskih faktora ili proteinske modifikacije enzima.
[0190] Veznici pogodni za upotrebu u sadašnjem pronalasku su generalno, oni koji obezbeđuju fleksibilnost modifikovanog AB ili aktivirajućih antitela da olakšaju inhibiciju vezivanja AB za cilj. Takvi linkeri se obično nazivaju fleksibilnim linkerima. Pogodni linkeri se mogu lako odabrati i mogu biti bilo koje od pogodnih različitih dužina. U sadašnjem pronalasku LP1 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 207 i LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEK ID BR: 38
[0191] Prosečan stručnjak će prepoznati da dizajn aktivirajućih antitela može uključivati veznike koji su svi ili delimično fleksibilni, tako da veznik može uključiti fleksibilni linker, kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu da bi se obezbedila željena struktura aktivirajućih antitela.
[0192] Pronalazak takođe, obezbeđuje preparate i metode koje uključuju konjugovano aktivirano antitelo iz patentnih zahteva. Ovde obezbeđeni preparati i metode omogućavaju vezivanje dva agensa za dva cisteinska ostatka u AB bez ugrožavanja aktivnosti (npr. aktivnosti maskiranja, aktiviranja ili vezivanja) aktiviranog antitela protiv CD71. U nekim realizacijama, ovde obezbeđeni preparati i postupci omogućavaju vezivanje dva agensa za dva cisteinska ostatka u AB bez smanjenja ili drugog narušavanja jedne ili više disulfidnih veza unutar MM. Ovde obezbeđeni preparati i postupci proizvode aktivirajuće anti-CD71 antitelo koje je konjugovano sa dva agensa, kao što je definisano u patentnim zahtevima. Ovde obezbeđeni preparati i postupci proizvode konjugovana aktivirajuća antitela protiv CD71, u kojima MM zadržava sposobnost da uspešno i efikasno maskira AB aktivirajućeg antitela u nerazgrađenom
4
stanju. Ovde obezbeđeni preparati i postupci proizvode konjugovana aktivirajuća antitela protiv CD71, u kojima se aktivirajuće antitelo još uvek aktivira, tj. cepa, u prisustvu proteaze koja može da otcepi CM.
[0193] Aktivirajuća antitela protiv CD71 imaju dve tačke konjugacije za agens. U nekim realizacijama, tačke konjugacije su atomi sumpora uključeni u disulfidnim vezama. U nekim realizacijama, tačke konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančanim disulfidnim vezama. U nekim realizacijama, tačke konjugacije su atomi sumpora koji su uključeni u međulančanim sulfidnim vezama, ali ne i atomi sumpora uključeni u intralančanim disulfidnim vezama. U nekim realizacijama, tačke konjugacije su atomi sumpora cisteina ili drugih aminokiselinskih ostataka koji sadrže atom sumpora. Takvi ostaci se mogu prirodno javiti u strukturi antitela ili se mogu ugraditi u antitelo pomoću mutageneze usmerene na mesto, hemijskom konverzijom ili pogrešnom ugradnjom ne-prirodnih aminokiselina.
[0194] Deo sadašnjeg pronalaska, ali ne zahtevanog pronalaska su takođe, postupci za pripremu konjugata aktivirajućeg anti-CD71 antitela koji ima jednu ili više međulančanih disulfidnih veza u AB i jednu ili više intralančanih disulfidnih veza u MM, a obezbeđen je lek reaktivan sa slobodnim tiolima. Postupak generalno uključuje, delimično redukovanje međulančanih disulfidnih veza u aktivirajućem antitelu sa redukcionim agensom, kao što je, na primer, TCEP; i konjugovanje leka reaktivnog sa slobodnim tiolima sa delimično redukovanim aktiviranim antitelom. Kako se ovde koristi, izraz delimična redukcija odnosi se na situacije kada je aktivirajuće anti-CD71 antitelo u kontaktu sa redukcionim sredstvom i manje od svih disulfidnih veza, npr. manje od svih mogućih mesta konjugacije je redukovano. U nekim realizacijama, manje od 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45% , 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ili manje od 5% svih mogućih mesta konjugacije je redukovano.
[0195] U još drugim aspektima sadašnjeg pronalaska koje nisu deo zahtevanog pronalaska, obezbeđen je postupak za redukovanje i konjugaciju agensa, npr. leka, u aktivirajuće anti-CD71 antitelo, što dovodi do selektivnosti u postavljanju agensa. Postupak generalno uključuje, delimično redukovanje aktivirajućeg anti-CD71 antitela sa redukcionim agensom tako da bilo koja mesta konjugacije u maskirajućem delu ili drugom ne-AB delu aktivirajućeg antitela nisu redukovana, i konjugaciju agensa sa međulančanim tiolima u AB. Mesta (a) konjugacije su odabrana tako da omogućavaju željeno postavljanje agensa da omogući konjugaciju na željenom mestu. Redukcioni agens je, na primer, TCEP. Uslovi redukcione reakcije kao što su, na primer, odnos redukcionog agensa prema aktiviranom antitelu, dužina inkubacije, temperatura tokom inkubacije, pH redukciono reakcionog rastvora itd., određuju se
4
identifikovanjem uslova koji stvaraju konjugovano aktivirano antitelo u kojem MM zadržava sposobnost da uspešno i efikasno maskira AB aktivirajućeg antitela u nerazgrađenom stanju. Odnos redukcionog agensa prema aktivirajućem antitelu protiv CD71 variraće u zavisnosti od aktivirajućeg antitela. U nekim realizacijama, odnos redukcionog agensa prema aktivirajućem antitelu protiv CD71 biće u rasponu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1 od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1,5, od oko 10:1 do 1:1,5, od oko 9:1 do 1:1,5, od oko 8:1 do 1:1,5, od oko 7:1 do 1:1,5, od oko 6:1 do 1:1,5, od oko 5:1 do 1:1,5, od oko 4:1 do 1:1,5, od oko 3:1 do 1:1,5, od oko 2:1 do 1:1,5, od oko 1,5:1 do 1:1,5 ili od oko 1:1 do 1:1,5. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1,5:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1,5:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 2,5:1 do 1:1.
[0196] U nekim aspektima koji nisu deo zahtevanog pronalaska, obezbeđen je postupak redukovanja međulančanih disulfidnih veza u AB aktiviranog anti-CD71 antitela i konjugacije agensa, npr. agensa koji sadrži tiol, poput leka, sa nastalim međulančanim tiolima za selektivno lociranje agensa (-asa) na AB. Postupak generalno uključuje, delimično redukovanje AB sa redukcionim sredstvom da bi se formirala najmanje dva međulančana tiola bez formiranja svih mogućih međulančanih tiola u aktivirajućem antitelu; i konjugovanje agensa sa međulančanim tiolima delimično redukovanog AB. Na primer, AB iz aktivirajućeg antitela je delimično redukovan tokom oko 1 sata na oko 37 ° C, pri željenom odnosu redukcionog agensa: aktivirajuće antitelo. U nekim realizacijama, odnos redukcionog agensa prema aktiviranom antitelu biće u opsegu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1,5, od oko 10:1 do 1:1,5, od oko 9:1 do 1:1,5, od oko 8:1 do 1:1,5, od oko 7:1 do 1:1,5, od oko 6:1 do 1:1,5, od oko 5:1 do 1:1,5, od oko 4:1 do 1:1,5, od oko 3:1 do 1:1,5, od oko 2:1 do 1: 1,5, od oko 1,5:1 do 1:1,5 ili od oko 1:1 do 1:1,5. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1,5:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1,5:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim realizacijama, odnos je u opsegu od oko 2,5: 1 do 1:1.
4
[0197] Reagens koji sadrži tiol može biti, na primer, cistein ili N-acetil cistein. Redukcioni agens može biti, na primer, TCEP. U nekim realizacijama, redukovano aktivirano antitelo može biti prečišćeno pre konjugacije, korišćenjem na primer hromatografije na koloni, dijalize ili dijafiltracije. Alternativno, redukovano antitelo nije prečišćeno nakon delimične redukcije i pre konjugacije.
[0198] U drugim aspektima koji nisu deo zahtevanog pronalaska, metoda redukovanja i konjugovanja agensa, npr. leka, sa aktivirajućim anti-CD71 antitelom rezultira selektivnošću u postavljanju agensa, obezbeđivanjem aktivirajućeg antitela protiv CD71 sa definisanim brojem i položajima lizinskih i/ili cisteinskih ostataka. U nekim realizacijama, definisani broj ostataka lizina i/ili cisteina je veći ili manji od broja odgovarajućih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci roditeljskog antitela ili aktiviranog antitela. U nekim realizacijama, definisani broj ostataka lizina i/ili cisteina može rezultirati definisanim brojem ekvivalenata agensa koji mogu biti konjugovani sa antitelom protiv CD71 ili aktivirajućim antitelom protiv CD71. U nekim realizacijama, definisani broj ostataka lizina i/ili cisteina može rezultirati definisanim brojem ekvivalenata agensa koji mogu biti konjugovani sa antitelom protiv CD71 ili aktivirajućim antitelom protiv CD71 na način specifičan za mesto, stoga, u nekim realizacijama, ograničavajući konjugaciju agenasa samo na mestima neprirodnih aminokiselina. U nekim realizacijama, antitelo protiv CD71 ili aktivirano antitela protiv CD71 sa definisanim brojem i položajima lizinskih i/ili cisteinskih ostataka mogu biti delimično redukovana sa redukcionim agensom, kao što je ovde diskutovano, tako da bilo koja mesta konjugacije u maskirajućem delu ili drugom ne-AB delu aktiviranog antitela nisu redukovana i konjugacijom agensa sa međulančanim tiolima u AB.
[0199] Sadašnji pronalazak se odnosi na konjugovano antitelo sposobno da se aktivira koje uključuje sledeću strukturu, ili njenu so:
Formula (I)
4
(a) gde
(i) AB je antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71 i sadrži
i. varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu CDRH1 koja sadrži SEK ID BR: 9, sekvencu CDRH2 koja sadrži SEK ID BR: 10 i sekvencu CDRH3 koja sadrži SEK ID BR: 11; i
ii. varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu CDRL1 koja sadrži SEK ID BR: 12 ili SEK ID BR: 13, sekvencu CDRL2 koja sadrži SEK ID BR: 14 i sekvencu CDRL3 koja sadrži SEK ID BR: 15;
(ii) MM je maskirajući ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18, pri čemu MM inhibira vezivanje AB za humani CD71 kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju;
(iii) LP1 je prvi vezujući ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 207; (iv) CM je cepljivi ostatak koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 156, gde je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu; i
(v) LP2 je drugi vezujući ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38; i
(b) pri čemu je "n" 2.
[0200] U sadašnjem pronalasku, agens monometil auristatin E (MMAE) je povezan sa AB korišćenjem maleimidnog kaproil-valin-citrulinskog linkera, a ovaj vezivni korisni teret konstrukta se ovde naziva "vc-MMAE". Struktura vc-MMAE je prikazana u nastavku:
[0201] U nekim realizacijama, AB sadrži izotip IgG1. U nekim realizacijama, AB je antitelo koje ima konstantan region teškog lanca, pri čemu C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. U nekim realizacijama, N-terminalni glutamat na teškom i/ili lakom lancu je opciono ili piroglutamat ili post-translaciono modifikovan u piroglutamat.
[0202] U nekim realizacijama konjugovanih aktivirajućih antitela prema sadašnjem pronalasku, AB uključuje varijabilni region teškog lanca koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 5 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje sekvencu SEK ID BR : 7.
[0203] U nekim realizacijama prema sadašnjem pronalasku, AB uključuje teški lanac koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 19.
[0204] U nekim realizacijama prema sadašnjem pronalasku, AB uključuje teški lanac koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 169. U nekim realizacijama prema sadašnjem pronalasku, AB uključuje teški lanac koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji uključuje sekvencu SEK ID BR: 201.
[0205] Spajanje se može postići bilo kojom hemijskom reakcijom koja će vezati dva molekula sve dok antitelo i drugi ostatak zadrže svoje odgovarajuće aktivnosti. Ova veza može da uključuje mnoge hemijske mehanizme, na primer kovalentno vezivanje, afinitetno vezivanje, interkalaciju, koordinatno vezivanje i kompleksiranje. U nekim realizacijama, vezivanje je, međutim, kovalentno vezivanje. Kovalentno vezivanje se može postići ili direktnom kondenzacijom postojećih bočnih lanaca ili ugradnjom spoljnih premošćujućih molekula. Mnogi dvovalentni ili polivalentni agensi za vezivanje su korisni za spajanje proteinskih molekula, kao što su antitela iz sadašnjeg pronalaska, za druge molekule. Na primer, reprezentativni agensi za kuplovanje, mogu da uključuju organska jedinjenja poput tioestara, karbodiimida, sukcinimidnih estara, diizocijanata, glutaraldehida, diazobenzena i heksametilen diamina. Ovaj spisak nije namenjen izostavljanju različitih klasa kuplujućih agenasa poznatih u tehnici, već je primer uobičajenih kuplujućih agenasa. (Videti Killen i Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen i sar., Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); i Vitetta i sar., Science 238: 1098 (1987).
[0206] U nekim realizacijama, pored ovde obezbeđenih preparata i postupaka, konjugovano aktivirano antitelo takođe, može biti modifikovano za konjugaciju specifičnu za mesto putem modifikovanih aminokiselinskih sekvenci ubačenih ili uključenih na neki drugi način u sekvencu aktivirajućeg antitela. Ove modifikovane sekvence aminokiselina su dizajnirane da omoguće kontrolisano postavljanje i/ili doziranje konjugovanog agensa u konjugovano aktivirano antitelo. Na primer, aktivirajuće antitelo može biti konstruisano tako da uključuje cisteinske supstitucije na položajima na lakim i teškim lancima koji obezbeđuje reaktivne
1
tiolske grupe i ne utiču negativno na uvijanje i sklapanje proteina, niti menjaju vezivanje antigena. U nekim realizacijama, aktivirajuće antitelo može biti konstruisano tako da uključuje ili na drugi način uvodi jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji nisu prirodni unutar aktiviranog antitela kako bi se obezbedila pogodna mesta za konjugaciju. U nekim realizacijama, antitelo koje se aktivira može biti konstruisano tako da uključuje ili na drugi način uvodi enzimski aktivirajuće peptidne sekvence unutar sekvence aktivirajućeg antitela.
[0207] Pogodni linkeri su opisani u literaturi. (Videti, na primer, Ramakrishnan, S. i sar., Cancer Res.44: 201-208 (1984) koji opisuje upotrebu MBS (M-maleimidobenzoil-N-hidroksi sukcinimidnog estra). Videti takođe, američki patent br. 5,030,719, koji opisuje upotrebu halogenovanog derivata acetil hidrazida, povezanog sa antitelom pomoću oligopeptidnog linkera. U nekim realizacijama, pogodni veznici uključuju: (i) EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid; (ii) SMPT (4-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridil-ditio)-toluen (Pierce Chem. Co., Kat. (21558G); (iii) SPDP (sukcinimidil-6[3-(2-piridilditio) propionamido] heksanoat (Pierce Chem. Co., Kat # 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosukcinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamid] heksanoat (Pierce Chem. Co. Kat. # 2165-G); i (v) sulfo-NHS (N-hidroksisulfo-sukcinimid: Pierce Chem. Co., Kat. # 24510) konjugovan sa EDC. Dodatni linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, SMCC ((sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat), sulfo-SMCC (sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat), SPDB (N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio) butanoate), ili sulfo-SPDB (N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoat).
[0208] Gore opisani linkeri sadrže komponente koje imaju različite osobine, što dovodi do konjugata sa različitim fizičko-hemijskim svojstvima. Na primer, sulfo-NHS estri alkil karboksilata su stabilniji od sulfo-NHS estara aromatičnih karboksilata. Linkeri koji sadrže NHS-estar su manje rastvorljivi od sulfo-NHS estara. Dalje, linker SMPT sadrži sterno ometenu disulfidnu vezu i može da obrazuje konjugate sa povećanom stabilnošću. Disulfidne veze su generalno manje stabilne od ostalih veza jer se disulfidna veza cepa in vitro, rezultirajući sa manje konjugata na raspolaganju. Sulfo-NHS, posebno, može da poboljša stabilnost karbodimidnog kuplovanja. Karbodimidna kuplovanja (kao što je EDC) kada se koriste zajedno sa sulfo-NHS, obrazuju estre koji su otporniji na hidrolizu od same reakcije spajanja karbodimida.
[0209] U nekim realizacijama, veznici se mogu cepati. U nekim realizacijama, veznici se ne mogu cepati. U nekim realizacijama prisutna su dva ili više veznika. Dva ili više veznika su svi isti, tj. razdvojivi ili nerazdvojivi, ili su dva ili više veznika različiti, tj. najmanje jedan cepljivi i najmanje jedan necepivi.
2
[0210] Sadašnji pronalazak koristi nekoliko metoda za vezivanje agenasa sa AB: (a) vezivanje za ugljovodonične delove AB, ili (b) vezivanje za sulfhidrilne grupe od AB, ili (c) vezivanje za amino grupe AB-a, ili (g) vezivanje za karboksilatne grupe AB-a. Prema pronalasku, AB mogu biti kovalentno vezani za agensa preko intermedijernog veznika koji ima najmanje dve reaktivne grupe, jednu za reagovanje sa AB i drugu za reagovanje sa agensom. Veznik, koji može uključivati bilo koje kompatibilno organsko jedinjenje, može biti odabran tako da reakcija sa AB (ili agensom) ne utiče negativno na reaktivnost i selektivnost AB. Štaviše, vezivanje linkera za agens možda neće uništiti aktivnost agensa. Pogodni linkeri za reakciju sa oksidovanim antitelima ili oksidovanim fragmentima antitela uključuju, one koji sadrže amin izabran iz grupe koju čine grupe primarnog amina, sekundarnog amina, hidrazina, hidrazida, hidroksilamina, fenilhidrazina, semikarbazida i tiosemikarbazida. Takve reaktivne funkcionalne grupe mogu postojati kao deo strukture linkera ili se mogu uvesti odgovarajućom hemijskom modifikacijom veznika koji ne sadrže takve grupe.
[0211] Prema sadašnjem pronalasku, pogodni linkeri za vezivanje za redukovana AB uključuju, one koji imaju određene reaktivne grupe sposobne za reakciju sa sulfhidrilnom grupom redukovanog antitela ili fragmenta. Takve reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na: reaktivne haloalkilne grupe (uključujući, na primer, haloacetilne grupe), pmerkuribenzoatne grupe i grupe sposobne za reakcije dodavanja po Michael-ovom tipu (uključujući, na primer, maleimide i grupe tipa opisanog od strane Mitra i Lawtona, 1979, J. Amer. Chem. Soc.101 : 3097-3110).
[0212] Prema sadašnjem pronalasku, pogodni linkeri za vezivanje za antitela koja nisu ni oksidovana ni redukovana uključuju, one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa primarnim amino grupama prisutnim u nemodifikovanim lizinskim ostacima u antitelu. Takve reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, NHS karboksilne ili karbonske estre, sulfo-NHS-karboksilne ili karbonske estre, 4-nitrofenil-karboksilne ili karbonske estre, pentafluorofenil-karboksilne ili karbonske estre, acil-imidazole, izocijanate i izotiocijanate.
[0213] Prema sadašnjem pronalasku, pogodni linkeri za vezivanje za antitela koja nisu ni oksidovana ni redukovana uključuju, one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa karboksilnim kiselinskim grupama prisutnim u aspartatnim ili glutamatnim ostacima u antitelu, koje su aktivirane sa pogodnim reagensima. Pogodni reagensi za aktiviranje uključuju EDC, sa ili bez dodatog NHS ili sulfo-NHS, i druga sredstva za dehidrataciju koja se koriste za stvaranje karboksamida. U ovim slučajevima, funkcionalne grupe prisutne u pogodnim linkerima bi uključivale primarne i sekundarne amine, hidrazine, hidroksilamile i hidrazide.
[0214] Agens može biti vezan za linker pre ili nakon što je linker vezan za AB. U određenim primenama može biti poželjno da se prvo proizvede intermedijerni AB-linker u kome je linker oslobođen od pridruženog agensa. U zavisnosti od konkretne primene, specifični agens tada može biti kovalentno vezan za linker. U nekim realizacijama, AB je prvo vezan sa MM, CM i povezane veznike, a zatim pripojen za veznik u svrhe konjugacije.
[0215] Razgranati linkeri: U specifičnim realizacijama, korišćeni su razgranati linkeri koji imaju više mesta za vezivanje agenasa. Za višestruke povezivače lokacija, jedno kovalentno vezivanje za AB rezultiralo bi međuproduktom AB-linkera sposobnim da veže agens na većem broju položaja. Položaji mogu biti aldehidne ili sulfhidrilne grupe ili bilo koje hemijsko mesto na koje agensi mogu biti vezani.
[0216] U nekim realizacijama, veća specifična aktivnost (ili veći odnos agenasa prema AB) može se postići pripajanjem veznika jednog mesta na više položaja na AB. Ovo mnoštvo lokacija može se uvesti u AB bilo kojim od dva načina. Prvo, može se generisati više aldehidnih grupa i/ ili sulfhidrilnih grupa u istom AB. Drugo, na aldehid ili sulfhidril AB može se vezati „račvasti linker“ koji ima više funkcionalnih mesta za naknadno vezivanje za linkere. Funkcionalna mesta račvastog linkera ili veznika više mesta, mogu biti aldehidne ili sulfhidrilne grupe, ili mogu biti bilo koja hemijska mesta na koja mogu biti vezani linkeri. Čak veće specifične aktivnosti mogu biti dobijene kombinovanjem ova dva pristupa, odnosno pričvršćivanjem višestrukih povezivača lokacija na nekoliko lokacija na AB.
[0217] Veznici koji se mogu ukloniti: Peptidni linkeri koji su podložni cepanju pomoću enzima sistema komplementa, kao što su, ali nisu ograničeni na u-plazminogenski aktivator, tkivni aktivator plazminogena, tripsin, plazmin ili drugi enzim koji ima proteolitičku aktivnost, mogu biti korišćeni u jednoj realizaciji sadašnjeg pronalaska. Prema jednom postupku iz sadašnjeg pronalaska, agens je vezan preko veznika podložnog cepanju od strane komplementa. Antitelo je odabrano iz klase koja može aktivirati komplement. Konjugat antitelo-agens, prema tome, aktivira kaskadu komplementa i oslobađa agens na ciljnom mestu. Prema drugoj metodi sadašnjeg pronalaska, agens je vezan preko veznika osetljivog na cepanje enzimima koji imaju proteolitičku aktivnost kao što je aktivator u-plazminogena, tkivni aktivator plazminogena, plazmin ili tripsin.
[0218] Neograničavajući primeri cepljivih sekvenci linkera su date u Tabeli (II).
4
________________________________________________________________________
[0219] Dodatno, agensi mogu biti vezani putem disulfidnih veza (na primer, disulfidnih veza na molekulu cisteina) za AB. Pošto mnogi tumori prirodno oslobađaju visoke nivoe glutationa (redukcionog agensa), to može redukovati disulfidne veze sa naknadnim oslobađanjem agensa na mestu isporuke. U nekim realizacijama, redukciono sredstvo koje bi modifikovalo CM takođe bi modifikovalo veznika iz konjugovanog aktiviranog antitela.
[0220] Spejseri i elementi koji se mogu ukloniti: U nekim realizacijama, može biti potrebno da se konstruiše linker na takav način da se optimizuje razdvajanje između agensa i AB aktiviranog antitela. Ovo se može postići upotrebom veznika opšte strukture:
W - (CH2)n - Q
pri čemu
W je ili --NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je aminokiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0221] U nekim realizacijama, linker može sadržati element razdelnika i element koji se može otcepiti. Spejser element služi da pozicionira cepljivi element daleko od jezgra AB tako da je odvojivi element pristupačniji enzimu koji je odgovoran za cepanje. Neki od gore opisanih razgrananih veznika mogu služiti kao spejser elementi.
[0222] Tokom ovog razmatranja, trebalo bi shvatiti da vezivanje linkera za agens (ili spejser elementa za cepljivi element, ili cepljivog elementa za agens) ne mora biti poseban način vezivanja ili reakcije. Svaka reakcija koja daje proizvod odgovarajuće stabilnosti i biološke kompatibilnosti je prihvatljiva.
[0223] Komplement seruma i odabir veznika: Prema jednoj metodi sadašnjeg pronalaska, kada se želi oslobađanje agensa, korišćeno je AB koji je antitelo klase koja može da aktivira komplement. Dobijeni konjugat zadržava i sposobnost da vezuje antigen i aktivira kaskadu komplementa. Stoga, prema ovoj realizaciji sadašnjeg pronalaska, agens je pridružen na jednom kraju cepljivog veznika ili otcepljivog elementa, a drugi kraj grupe veznika je pričvršćen na specifično mesto na AB. Na primer, ako agens ima hidroksi grupu ili amino grupu, može biti vezan za karboksi završetak peptida, aminokiseline ili drugog pogodno izabranog veznika putem estra ili amidne veze, respektivno. Na primer, takvi agensi mogu biti vezani za vezivni peptid putem reakcije karbodimida. Ako agens sadrži funkcionalne grupe koje bi ometale vezivanje za linker, ove interferirajuće funkcionalne grupe mogu biti blokirane pre vezivanja i deblokirane kada je napravljen proizvod konjugata ili intermedijera. Suprotan ili amino završetak linkera se tada koristi ili direktno ili posle dalje modifikacije za vezivanje za AB koji je sposoban da aktivira komplement.
[0224] Veznici (ili razdelni elementi veznika) mogu biti bilo koje željene dužine, čiji jedan kraj može biti kovalentno vezan za određena mesta na AB aktiviranog antitela. Drugi kraj veznika ili razdelnog elementa može biti vezan za aminokiselinski ili peptidni linker.
[0225] Stoga, kada se ovi konjugati vežu za antigen u prisustvu komplementa, amidna ili estarska veza koja veže agens za linker biće rascepljena, što će rezultirati oslobađanjem agensa u njegovom aktivnom obliku. Ovi konjugati, kada se primene subjektu, postići će isporuku i oslobađanje agensa na ciljnom mestu.
[0226] Veznici za oslobađanje bez aktivacije komplementa: U još jednoj primeni ciljne isporuke, poželjno je oslobađanje agensa bez aktivacije komplementa pošto će aktivacija kaskade komplementa na kraju lizirati ciljnu ćeliju. Stoga je ovaj pristup koristan kada se isporuka i oslobađanje agensa treba postići bez ubijanja ciljne ćelije. Ovi konjugati mogu biti pripremljeni vezivanjem agensa na AB koji nije sposoban da aktivira komplement putem veznika koji je blago podložan cepanju serumskim proteazama. Kada je ovaj konjugat primenjen kod pojedinca, obrazovaće se brzo kompleksi antigen-antitelo, dok će cepanje agensa nastupiti polako, što će rezultirati oslobađanjem jedinjenja na ciljnom mestu.
[0227] Biohemijski veznici umrežavanja: U nekim realizacijama, aktivirajuće antitelo može biti konjugovano sa terapijskim agensima korišćenjem određenih biohemijskih veznika umrežavanja. Reagensi za umrežavanje formiraju molekularne mostove koji povezuju funkcionalne grupe dva različita molekula. Da bi se postepeno povezala dva različita proteina, mogu se koristiti hetero-bifunkcionalni unakrsni linkeri koji eliminišu neželjeno stvaranje homopolimera.
[0228] Korisni su i peptidilni linkeri koji se mogu cepati lizozomskim proteazama, na primer, Val-Cit, Val-Ala ili drugi dipeptidi. Pored toga, mogu se koristiti kiselo-labilni veznici koji se mogu cepati u okruženju sa niskim lizozomskim pH, na primer: bis-sialil etar. Ostali pogodni linkeri uključuju katepsin-labilne supstrate, posebno one koji pokazuju optimalnu funkciju pri kiselom pH.
[0229] Primeri hetero-bifunkcionalnih unakrsnih veznika su navedeni u Tabeli (III).
___
[0230] Veznici koje se ne mogu ukloniti ili direktno povezivanje: U nekim realizacijama iz pronalaska, konjugat može biti dizajniran tako da je agens isporučen do cilja, ali ne i oslobođen. To se može postići vezivanjem agensa na AB bilo direktno ili preko necepivog veznika.
[0231] Ovi necepljivi linkeri mogu da uključuju aminokiseline, peptide, D-aminokiseline ili druga organska jedinjenja koja mogu biti modifikovana tako da uključuju funkcionalne grupe koje se kasnije mogu koristiti u vezivanju sa AB pomoću ovde opisanih postupaka. Opšta formula za takav organski veznik može biti
W - (CH2)n - Q
pri čemu
W je ili --NH-CH2-- ili --CH2--;
Q je aminokiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0232] Konjugati koji se ne mogu ukloniti: U nekim realizacijama, jedinjenje može biti vezano za AB-a koja ne aktiviraju komplement. Kada se koriste AB koji nisu sposobni za aktivaciju komplementa, ovo vezivanje se može postići upotrebom veznika koji su podložni cepanju od strane aktiviranog komplementa ili upotrebom veznika koji nisu podložni cepanju od strane aktiviranog komplementa.
Definicije:
[0233] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi korišćeni u vezi sa sadašnjim pronalaskom imaće značenja koja su opšte razumljiva prosečnim stručnjacima u tehnici. Izraz jedan "entitet" ili izvesni "entitet" se odnosi na jedan ili više od tog entiteta. Na primer, jedinjenje se odnosi na jedno ili više jedinjenja. Kao takvi, izrazi „jedan“, „izvestan“, „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ mogu se koristiti naizmenično. Dalje, osim ako kontekstom nije drugačije određeno, pojmovi u jednini uključuju množinu, a pojmovi u množini uključuju jedninu. Generalno, nomenklature korišćene u vezi sa, i tehnikama kulture ćelija i tkiva, molekularnom biologijom i proteinskom i oligo- ili polinukleotidnom hemijom i hibridizacijom, ovde opisanim, su one koje su dobro poznate i opšte korišćene u struci. Standardne tehnike su korišćene za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvedene prema specifikacijama proizvođača ili onako kako se to uobičajeno postiže u tehnici ili kako je ovde opisano. Prethodne tehnike i postupci su generalno izvedeni prema konvencionalnim metodama dobro poznatim u struci i kao što je opisano u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u celoj sadašnjoj specifikaciji. Videti, na primer, Sambrook i sar. Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik (drugo izdanje, Laboratorija za štampu Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
Nomenklature korišćene u vezi sa i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i ovde opisane medicinske i farmaceutske hemije su one koje su dobro poznate i često korišćene u struci. Standardne tehnike su korišćene za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju i isporuku i lečenje pacijenata.
[0234] Kao što su korišćeni u skladu sa sadašnjim pronalaskom, sledeći izrazi, ukoliko nije drugačije naznačeno, biće razumljivi da imaju sledeća značenja:
[0235] Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" se odnosi na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove imunoglobulinskih (Ig ) molekula, tj. molekuli koji sadrže mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje (imunoreaguje) sa antigenom. Pod "specifičnim vezivanjem" ili "imunoreaguje sa" ili "imunospecifično vezuje" označava se da antitelo reaguje sa jednom ili više antigenskih determinanti željenog antigena i da ne reaguje sa drugim polipeptidima ili se vezuje sa mnogo nižim afinitetom (Kd> 10<-6>).
[0236] Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan „laki“ (oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje, varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Generalno, molekuli antitela dobijeni od čoveka se odnose na bilo koju klasu IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, koje se međusobno razlikuju po prirodi teškog lanca prisutnog u molekulu. Određene klase takođe imaju potklase, kao što su IgGi, IgG2i druge. Dalje, kod ljudi laki lanac može biti kapa lanac ili lambda lanac.
[0237] Izraz "monoklonsko antitelo" (mAt) ili "sastav monoklonskih antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju molekula antitela koji sadrže samo jednu molekularnu vrstu molekula antitela koja se sastoji od jedinstvenog genskog proizvoda lakog lanca i jedinstvenog genskog proizvoda teškog lanca. Konkretno, regioni koji određuju komplementarnost (CDR regioni) monoklonskih antitela identični su u svim molekulima populacije. Monoklonska antitela sadrže mesto vezivanja antigena sposobno da imunoreaguje sa određenim epitopom antigena koji se karakteriše jedinstvenim afinitetom vezivanja za njega.
[0238] Izraz "mesto za vezivanje antigena" ili "deo za vezivanje" odnosi se na deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju antigena. Mesto vezivanja antigena čine aminokiselinski ostaci N-terminalnih promenljivih („V“) regiona teških („H“) i lakih („L“) lanaca.
Tri veoma različita prostiranja unutar V regiona teškog i lakog lanca, koja se nazivaju „hipervarijabilnim regionima“, ubačena su između očuvanijih bočnih protezanja poznatih kao
1
„okvirni regioni“ ili „FR“. Stoga, izraz "FR" se odnosi na aminokiselinske sekvence koje se prirodno nalaze između i susedno sa, hipervarijabilnim regiona u imunoglobulinima. U molekulu antitela, tri hipervarijabilna regiona lakog lanca i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca su raspoređena međusobno povezana u trodimenzionalnom prostoru da bi formirala površinu koja veže antigen. Površina za vezivanje antigena je komplementarna trodimenzionalnoj površini vezanog antigena, a tri hipervarijabilna regiona svakog od teških i lakih lanaca nazivaju se „regionima koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabatovih proteinskih sekvenci od imunološkog interesa (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)) ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), Chothia i sar. Nature 342: 878-883 (1989).
[0239] Kako se ovde koristi, izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično vezuje za imunoglobulin, scFv ili T-ćelijski receptor. Izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopske determinante se obično sastoje od površinskog grupisanja hemijski aktivnih molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične karakteristike trodimenzionalne strukture, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Na primer, antitela se mogu potstaknuti protiv N-terminalnih ili C-terminalnih peptida iz polipeptida. Kaže se da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disocijacije ≦ 1μΜ; u nekim realizacijama, ≦ 100 nM i u nekim realizacijama, ≦10 nM.
[0240] Kako se ovde koriste, izrazi "specifično vezivanje", "imunološko vezivanje" i "svojstva imunološkog vezivanja" odnose se na nekovalentne interakcije od tipa koji se javlja između imunoglobulinskog molekula i antigena za koji je imunoglobulin specifičan. Snaga ili afinitet interakcije imunološkog vezivanja, može biti izražen preko konstante disocijacije (Kd) interakcije, pri čemu manji Kdpredstavlja veći afinitet. Imunološka svojstva vezivanja odabranih polipeptida mogu biti kvantifikovana korišćenjem metoda dobro poznatih u struci. Jedna takva metoda povlači merenje brzina obrazovanja i disocijacije kompleksa antigenvezujućeg mesta sa antigenom, pri čemu ove brzine zavise od koncentracije kompleksnih partnera, afiniteta interakcije i geometrijskih parametara koji podjednako utiču na brzinu u oba smera. Stoga, i „ konstanta brzine on“ (Kon) i „konstanta brzine off“ (Koff), mogu biti određene izračunavanjem koncentracija i stvarnih stopa asocijacije i disocijacije. (Videti Nature 361: 186-87 (1993)). Odnos Koff/Konomogućava poništavanje svih parametara koji nisu povezani sa afinitetom, a jednak je konstanti disocijacije Kd. (Videti, generalno, Davies i sar. (1990) Annual Rev Biochem 59: 439-473). Rečeno je da se antitelo iz sadašnjeg pronalaska specifično vezuje za cilj, kada je konstanta vezivanja (Kd) ≦ 1 μΜ, u nekim realizacijama ≦100 nM, u
2
nekim realizacijama ≦10 nM i u nekim realizacijama ≦ 100 pM do oko 1 pM, kao što je mereno testovima, kao što su testovi vezivanja radioliganda ili slični testovi poznati stručnjacima.
[0241] Izraz "izolovani polinukleotid" kako se ovde koristi označava polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju, koji na osnovu njegovog porekla "izolovani polinukleotid" (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kome je „izolovani polinukleotid“ nađen prirodno, (2) operativno je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (3) u prirodi se ne javlja kao deo veće sekvence. Polinukleotidi u skladu sa pronalaskom uključuju, molekule nukleinske kiseline koji kodiraju ovde prikazane molekule imunoglobulina teškog lanca i molekule nukleinske kiseline koji kodiraju ovde prikazane imunoglobulinske molekule lakog lanca.
[0242] Izraz "izolovani protein" na koji se ovde odnosi označava protein cDNK, rekombinantne RNK ili sintetičkog porekla ili neke njihove kombinacije, koji na osnovu svog porekla ili izvora dobijanja, "izolovani protein" (1) nije povezan sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) oslobođen je od drugih proteina iz istog izvora, npr. bez mišjih proteina, (3) izražen je od strane ćelija različitih vrsta, ili (4) se ne javlja u prirodi.
[0243] Izraz "polipeptid" se ovde koristi kao generički termin koji se odnosi na nativni protein, fragmente ili analoge polipeptidne sekvence. Otuda su nativni proteinski fragmenti i analozi vrste roda polipeptida. Polipeptidi u skladu sa pronalaskom sadrže ovde prikazane molekule imunoglobulina teškog lanca i ovde prikazane molekule imunoglobulina lakog lanca, kao i molekule antitela obrazovane kombinacijama koje sadrže molekule imunoglobulina teškog lanca sa molekulama imunoglobulina lakog lanca, kao što su molekule imunoglobuliskog lakog lanca kapa i obrnuto, kao i njihovi fragmenti i analozi.
[0244] Izraz „koji se javlja u prirodi“, kako se ovde koristi u odnosu na objekat, odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može biti izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji ili se na neki drugi način javlja u prirodi.
[0245] Izraz "operativno povezan", kako se ovde koristi, odnosi se na položaje komponenata koje su tako opisane u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom je spojena na takav način da se postiže ekspresija kodirajuće sekvence pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama.
[0246] Izraz "kontrolna sekvenca", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da izvrše ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina u prokariotima, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotera, mesto za vezivanje ribozoma i sekvencu završetka transkripcije u eukariotima, generalno, takve kontrolne sekvence uključuju promotere i sekvencu završetka transkripcije. Izraz "kontrolne sekvence" podrazumeva da uključuje, pri minimumu, sve komponente čije je prisustvo od suštinskog značaja za ekspresiju i obradu, a takođe može da uključuje dodatne komponente čije je prisustvo prednost, na primer, vodeće sekvence i sekvence fuzionih partnera. Izraz "polinukleotid" kako se ovde odnosi označava nukleotide dužine najmanje 10 baza, bilo ribonukleotide ili deoksinukleotide, ili modifikovani oblik bilo koje vrste nukleotida. Izraz uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0247] Izraz oligonukleotid na koji se ovde odnosi, uključuje prirodno nastale i modifikovane nukleotide povezane zajedno prirodno nastalim i ne-prirodnim oligonukleotidnim vezama. Oligonukleotidi su polinukleotidni podskup koji se obično sastoji od dužine od 200 baza ili manje.
U nekim realizacijama, oligonukleotidi su dužine 10 do 60 baza, a u nekim realizacijama, dužine od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 do 40 baza. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr. za probe, mada oligonukleotidi mogu biti dvolančani, npr. za upotrebu u konstrukciji genskog mutanta. Oligonukleotidi iz ovog pronalaska su ili smisaoni ili antismisaoni oligonukleotidi.
[0248] Izraz "nukleotidi koji se javljaju u prirodi" ovde naveden uključuje, deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Izraz "modifikovani nukleotidi" na koji se ovde odnosi uključuje, nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i slično. Izraz "oligonukleotidne veze" na koje se ovde odnosi uključuju, oligonukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselerloat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforonmidat i slično. Videti, na primer, LaPlanche i sar. Nucl. Acids Res.
14:9081 (1986); Stec i sar. J. Am. Chem. Soc.
106:6077 (1984), Stein i sar. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon i sar. Dizajn lekova protiv raka 6: 539 (1991); Zon i sar. Oligonukleotidi i analozi: praktični pristup, str. 87-108 (F. Eckstein, izd., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec i sar. Američki patent br. 5,151,510; Uhlmann i Peiman Chemical Reviews 90: 543 (1990). Ako je poželjno, oligonukleotid može da uključuje oznaku za detekciju.
[0249] Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Videti Imunologija - sinteza (2. izdanje, E.S. Golub i D.R. Green, ur., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr. D-
4
aminokiseline) od dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su α-,α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe, mogu biti pogodne komponente za polipeptide iz sadašnjeg pronalaska. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4 hidroksiprolin, γkarboksiglutamat, ε-Ν,Ν,Ν-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksi lizin, σ-Ν-metilarginin i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr. 4-hidroksiprolin). U polipeptidnom obeležavanju koje se ovde koristi, smer leve strane je amino terminalni smer, a smer desne strane je karboksi-terminalni smer, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0250] Slično, ukoliko nije drugačije naznačeno, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj, levi smer dvolančanih polinukleotidnih sekvenci se naziva 5' smerom. Smer dodavanja 5' do 3' transkripata nastale RNK naziva se sekventnim regionima transkripcionog smera na lancu DNK koji ima istu sekvencu kao RNK i koji su od 5' do 5' kraja RNK transkripta nazvani "ushodnim sekvencama", regionima sekvence na lancu DNK koji imaju istu sekvencu kao i RNK i koji su od 3' do 3' kraja RNK transkripta nazvani "nishodnim sekvencama".
[0251] Primenjen na polipeptide, izraz „suštinska identičnost“ označava da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnane, kao što su pomoću programa GAP ili BESTFIT koristeći zadate težine razmaka, dele najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, u nekim realizacijama, najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, u nekim realizacijama, najmanje 95 procenata identičnosti sekvence i u nekim realizacijama, najmanje 99 procenata identičnosti sekvence.
[0252] U nekim realizacijama, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
[0253] Izraz "polipeptidni fragment" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji ima amino terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju i/ili jednu ili više unutrašnjih delecija, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim položajima u prirodnoj sekvenci izvedenoj, na primer, iz sekvence cDNK pune dužine. Fragmenti su obično dugi najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina, u nekim realizacijama najmanje 14 aminokiselina, u nekim realizacijama najmanje 20 aminokiselina, obično dugi najmanje 50 aminokiselina, a u nekim realizacijama, dugi najmanje 70 aminokiselina. Izraz "analog", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji se sastoje od segmenta od najmanje 25 aminokiselina koji ima suštinsku identičnost sa delom izvedene aminokiselinske sekvence i koji se specifično vezuje za cilj, pod pogodnim uslovima vezivanja. Tipično, polipeptidni analozi sadrže konzervativnu supstituciju aminokiselina (ili dodavanje ili deleciju) u odnosu na sekvencu koja se prirodno javlja. Analozi su obično dugi najmanje 20 aminokiselina, u nekim realizacijama najmanje 50 aminokiselina ili duži, a često mogu biti dugi kao prirodni polipeptid pune dužine.
[0254] Izraz "agens" se ovde koristi da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.
[0255] Kako se ovde koriste, izrazi „oznaka“ ili „obeleženi“ odnose se na ugradnju markera koji se može detektovati, na primer, ugradnjom radio-obeležene aminokiseline ili vezivanjem za polipeptid biotinilnih ostataka koji se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr. streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimska aktivnost koja se može otkriti optičkim ili kalorimetrijskim metodama). U određenim situacijama, oznaka ili marker takođe, mogu biti terapeutski. Razni postupci obeležavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u struci i mogu se koristiti. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>J,<131>J), fluorescentne oznake (npr. FITC, rodamin, lantanidni fosfori), enzimske oznake (npr. peroksidaza rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne, biotinilne grupe, prethodno definisane polipeptidne epitope prepoznate od strane sekundarnog reportera (npr. sekvence parova leucinskih zatvarača, mesta vezivanja sekundarnih antitela, domeni za vezivanje metala, oznake epitopa). U nekim realizacijama, oznake su pričvršćene krajevima razdelnika različitih dužina kako bi se smanjila potencijalna prostorna barijera. Izraz "farmaceutski agens ili lek", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili preparat sposoban da indukuje željeni terapijski efekat kada se pravilno primenjuje kod pacijenta.
[0256] Ostali hemijski izrazi se ovde koriste prema uobičajenoj upotrebi u tehnici, kao što je prikazano u Rečniku hemijskih izraza od McGraw-Hill (Parker, S., ur., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
[0257] Kako se ovde koristi, „suštinski čista“ označava da je predmetna vrsta pretežno prisutna vrsta (tj. na molarnoj osnovi je obilnija od bilo koje druge pojedinačne vrste u sastavu), a u nekim realizacijama, suštinski prečišćena frakcija je sastav gde predmetna vrsta sadrži najmanje oko 50 procenata (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekularnih vrsta.
[0258] Generalno, suštinski čist preparat će sadržati više od oko 80 procenata svih makromolekularnih vrsta prisutnih u preparatu, u nekim realizacijama, više od oko 85%, 90%, 95% i 99%. U nekim realizacijama, predmetne vrste se prečišćavaju do suštinske homogenosti (vrste zagađivača se ne mogu otkriti u preparatu konvencionalnim metodama detekcije) pri čemu se preparat u osnovi sastoji od jedne makromolekularne vrste.
[0259] Izraz pacijent uključuje humane i veterinarske subjekte.
Upotreba konjugovanih aktiviranih antitela
[0260] Podrazumevaće se da će primena terapijskih entiteta u skladu sa pronalaskom biti primenjivana sa odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima i drugim agensima koji su ugrađeni u formulacije da bi se obezbedio poboljšani prenos, isporuka, tolerancija i slično.
[0261] Terapeutske formulacije prema pronalasku, koje uključuju konjugovano aktivirano antitelo, koriste se za sprečavanje, lečenje ili na drugi način poboljšanje bolesti ili poremećaja povezanih sa abnormalnom ciljnom ekspresijom i/ili aktivnošću. Na primer, terapeutske formulacije iz pronalaska, koje uključuju konjugovano aktivirano antitelo, koriste se za lečenje ili na drugi način poboljšanje karcinoma ili drugog neoplastičnog stanja, inflamacije, inflamatornog poremećaja i/ili autoimune bolesti. U nekim realizacijama, rak je čvrst tumor ili hematološki malignitet sa izraženim ciljem. U nekim realizacijama, rak je solidan tumor u kome je cilj izražen. U nekim realizacijama, rak je hematološki malignitet gde je cilj izražen. U nekim realizacijama, cilj je izražen na parenhimu (npr. kod karcinoma, deo organa ili tkiva koji često vrši funkciju (e) organa ili tkiva). U nekim realizacijama, cilj je izražen na ćeliji, tkivu ili organu. U nekim realizacijama, cilj je izražen na stromi (tj. na vezivnom potpornom okviru ćelije, tkiva ili organa). U nekim realizacijama, cilj je izražen na osteoblastu. U nekim realizacijama, cilj je izražen na endotelu (vaskulatura). U nekim realizacijama, cilj je izražen na matičnoj ćeliji karcinoma. U nekim realizacijama, agens sa kojim je antitelo i/ili aktivirano antitelo konjugovano je mikrotubularni inhibitor. U nekim realizacijama, agens sa kojim je konjugovano antitelo i/ili aktivirajuće antitelo je agens koje oštećuje nukleinsku kiselinu.
[0262] Efikasnost prevencije, poboljšanja ili lečenja određuje se u vezi sa bilo kojim poznatim postupkom za dijagnostikovanje ili lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa ciljnom ekspresijom i/ili aktivnošću, kao što su, na primer, abnormalna ciljna ekspresija i/ili aktivnost. Produžavanje preživljavanja subjekta ili na drugi način odlaganje progresije bolesti ili poremećaja povezanog sa ciljnom ekspresijom i/ili aktivnošću, npr. abnormalna ciljna ekspresija i/ ili aktivnost kod subjekta ukazuje da antitelo, konjugovano antitelo, aktivirano antitelo i/ili konjugovano aktivirano antitelo daje kliničku korist.
[0263] Konjugovano aktivirano antitelo, može biti primenjivano u obliku farmaceutskih preparata.
[0264] Formulacije koje će biti korišćene za in vivo primenu moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0265] U nekim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo sadrži detektujuću oznaku. Koristi se intaktno antitelo ili njegov fragment (npr. Fab, scFv ili F(ab)2). Izraz „obeležen“, u odnosu na probu ili antitelo, namerava da obuhvati direktno obeležavanje probe ili antitela spajanjem (tj. fizičkim povezivanjem) detektabilne supstance sa probom ili antitelom, kao i indirektno obeležavanje probe ili antitela reaktivnošću sa drugim reagensom koji je direktno obeležen. Primeri indirektnog obeležavanja uključuju, detekciju primarnog antitela pomoću fluorescentno obeleženih sekundarnih antitela i krajnje obeležavanje DNK probe sa biotinom tako da se može detektovati sa fluorescentno obeleženim streptavidinom. Izraz "biološki uzorak" podrazumeva da uključuje tkiva, ćelije i biološke tečnosti izolovane od subjekta, kao i tkiva, ćelije i tečnosti prisutne u subjektu. Prema tome, upotreba izraza „biološki uzorak“ uključuje krv i frakciju ili komponentu krvi, uključujući krvni serum, krvnu plazmu ili limfu. Odnosno, metoda otkrivanja prema pronalasku može se koristiti za otkrivanje analita mRNK, proteina ili genomske DNK u biološkom uzorku in vitro, kao i in vivo. Na primer, in vitro tehnike za otkrivanje mRNK analita uključuju Northern hibridizacije i hibridizacije in situ. In vitro tehnike za detekciju proteinskog analita uključuju, enzimski povezane imunosorbentne testove (ELISA), Western blot-ove, imunoprecipitacije, imunohemijsko bojenje i imunofluorescenciju. In vitro tehnike za otkrivanje analita genomske DNK uključuju Southern hibridizacije. Postupci za sprovođenje imunoanaliza su opisani, na primer u „ELISA: Teorija i praksa: Metode u Molekularnoj Biologiji“, vol.42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; „Imunoanaliza“, E. Diamandis i T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; i „Praksa i teorija enzimskih imunotestova “, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Dalje, tehnike in vivo za detekciju proteinskih analita uključuju uvođenje u subjekt obeleženih antitela protiv analiziranog proteina. Na primer, antitelo može biti obeleženo sa radioaktivnim markerom čije se prisustvo i lokacija kod subjekta mogu otkriti standardnim tehnikama snimanja.
[0266] Konjugovana aktivirana antitela iz pronalaska su takođe, korisna u različitim dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednoj realizaciji, konjugovano aktivirano antitelo je primenjeno kod pacijenata koji su pod rizikom od nastanka jednog ili više gore pomenutih poremećaja. Predispozicija pacijenta ili organa jednom ili više gore pomenutih poremećaja može se utvrditi korišćenjem genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0267] U nekim realizacijama iz pronalaska, konjugovano aktivirajuće antitelo je primenjeno kod humanih pojedinaca dijagnostikovanih sa kliničkom indikacijom povezanom sa jednim ili više od gore pomenutih poremećaja. Nakon dijagnoze, primenjuje se konjugovano aktivirano antitelo da bi umanjilo ili preokrenulo efekte kliničke indikacije.
[0268] Konjugovano aktivirano antitelo iz pronalaska je takođe, korisno u otkrivanju cilja u pacijentovim uzorcima i shodno tome korisno je kao dijagnostičko sredstvo. Na primer, konjugovana aktivirana antitela iz pronalaska se koriste u in vitro testovima, na primer ELISA, za otkrivanje ciljnih nivoa u uzorku pacijenta.
[0269] U jednoj realizaciji, konjugovano aktivirano antitelo prema pronalasku je imobilisano na čvrstom nosaču (npr. bazenčiću (ima) mikrotitarske ploče). Imobilisano, konjugovano aktivirano antitelo služi kao antitelo za hvatanje bilo kojeg cilja koji može biti prisutan u ispitivanom uzorku. Pre stupanja u kontakt imobilisanog, konjugovanog aktiviranog antitela sa uzorkom pacijenta, čvrst nosač je ispran i tretiran sa blokirajućim agensom, kao što su mlečni protein ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0270] Nakon toga, bazenčići su tretirani sa ispitivanim uzorkom za koji se sumnja da sadrži antigen ili sa rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, na primer, uzorak seruma od subjekta za koga se sumnja da poseduje nivoe cirkulišućeg antigena koji se smatra dijagnostikom patologije. Nakon ispiranja test uzorka ili standarda, čvrsti nosač je tretiran sa drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao antitelo za detektovanje. Izmeren je nivo otkrivene oznake, a koncentracija ciljnog antigena u test uzorku je određena upoređivanjem sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.
[0271] Ceniće se da je na osnovu rezultata dobijenih korišćenjem konjugovanih aktiviranih antitela prema pronalasku u in vitro dijagnostičkom testu, moguće prikazati stadijum bolesti kod subjekta na osnovu nivoa ekspresije ciljnog antigena. Za datu bolest, uzimaju se uzorci krvi od subjekata kojima je dijagnostikovano da su u različitim fazama progresije bolesti i/ili u različitim tačkama terapijskog lečenja bolesti. Korišćenjem populacije uzoraka koji obezbeđuju statistički značajne rezultate za svaku fazu progresije ili terapije, označen je opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaku fazu.
[0272] Konjugovano aktivirano antitelo takođe, može biti korišćeno u dijagnostičkim i/ili metodama snimanja. U nekim realizacijama, takve metode su in vitro metode. U nekim realizacijama, takve metode su metode in vivo. U nekim realizacijama, takve metode su in situ metode. U nekim realizacijama, takve metode su ex vivo metode. Na primer, aktivirajuća antitela koja imaju enzimski cepljivi CM, mogu se koristiti za otkrivanje prisustva ili odsustva enzima koji je sposoban za cepanje CM. Takva aktivirajuća antitela mogu se koristiti u dijagnostici, koja mogu uključivati in vivo detekciju (npr. kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim realizacijama, okruženje povećanog potencijala smanjenja, kao što je ono koje može obezbediti redukciju disulfidne veze) putem izmerene akumulacije aktiviranih antitela (tj. antitela koja nastaju cepanjem aktivirajućeg antitela) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma domaćina. Takva akumulacija aktiviranih antitela ukazuje ne samo da tkivo izražava enzimsku aktivnost (ili povećani redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM), već i da tkivo izražava cilj za koji se vezuje aktivirano antitelo.
[0273] Na primer, CM može biti odabrano da bude supstrat za najmanje jednu proteazu koja se nalazi na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr. kao što je apsces, u organu, i slično), i slično. AB može biti onaj koji veže ciljni antigen. Korišćenjem ovde opisanih metoda ili, kada je to prikladno, metoda koje su poznate stručnjaku u ovoj oblasti, detektabilna oznaka (npr. fluorescentna oznaka ili radioaktivna oznaka ili radioobeleživač) može biti konjugovana sa AB ili drugim regionom antitela i/ili aktiviranog antitela. Pogodne detektabilne oznake su razmatrane u kontekstu gore navedenih metoda skrininga, a niže su obezbeđeni dodatni specifični primeri. Korišćenjem AB specifičnog za protein ili peptid bolesnog stanja, zajedno sa najmanje jednom proteazom čija je aktivnost povišena u bolesnom tkivu bolesti od interesa, aktivirajuća antitela će pokazati povećanu stopu vezivanja za bolesno tkivo u odnosu na tkiva u kojima nije prisutan enzim specifičan za CM enzim na detektabilnom nivou ili je prisutan pri nižem nivou nego u bolesnom tkivu ili je neaktivan (npr. u obliku zimogena ili u kompleksu sa inhibitorom). S obzirom da se mali proteini i peptidi sistemom bubrežne filtracije brzo uklanjaju iz krvi i zato što enzim specifičan za CM nije prisutan pri detektabilnom nivou (ili je prisutan pri nižim nivoima u tkivima koja nisu bolesna ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji ), akumulacija aktiviranih antitela u bolesnom tkivu je pojačana u odnosu na tkiva koja nisu bolesna.
[0274] N- i C-krajevi polipeptidnih lanaca antitela iz sadašnjeg pronalaska mogu se razlikovati od ovde opisanih sekvenci usled opšte primećenih post-translacionih modifikacija. Na primer, C-terminalni ostaci lizina često nedostaju u teškim lancima antitela. Dick i sar. (2008) Biotechnol. Bioeng. 100: 1132. N-terminalni ostaci glutamina, i u manjoj meri ostaci glutamata, često se pretvaraju u ostatke piroglutamata i na lakim i na teškim lancima terapijskih antitela. Dick i sar. (2007) Biotechnol. Bioeng.97:544; Liu i sar. (2011) JBC 28611211; Liu i sar. (2011) J. Biol. Chem.286: 11211. Shodno tome, konjugovano aktivirano antitelo Formule (I) može imati antitelo (AB) gde C-terminalnom ostatku konstantnog regiona teškog lanca nedostaje jedna ili više aminokiselina na završetku, nedostaje C-terminalni lizin, ima uklonjen C-terminalni lizin zbog post-translacione obrade ili je C-terminalni lizin aminokiselina koja nije lizin. Ako je C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca aminokiselina koja nije lizin, u jednoj realizaciji, to je aminokiselina koja generalno nije podložna stvaranju disulfidne veze ili na drugi način nije podložna konjugaciji sa citotoksičnim agensom.
[0275] U određenim realizacijama, konjugovano aktivirano antitelo Formule (I) može imati antitelo (AB) u kome je N-terminalni glutamat bilo na teškom i/ili lakom lancu opciono ili piroglutamat ili post-translaciono modifikovan u piroglutamat.
[0276] U određenim realizacijama, konstantni region teškog lanca konjugovanog aktiviranog antitela Formule (I) sadrži lizin ili drugu aminokiselinu na C-kraju, npr. sadrži sledeće poslednje aminokiseline: PGK za teški lanac. U određenim realizacijama, konstantnom regionu teškog lanca nedostaje jedna ili više aminokiselina na C-kraju i ima, na primer, C-terminalnu sekvencu PG ili P.
[0277] U određenim realizacijama, varijabilni regioni teškog lanca i/ili lakog lanca konjugovanih aktiviranih antitela Formule (I) sadrže aminokiselinu glutamat ili piroglutamat na N-kraju, npr., sadrži sledeće poslednje aminokiseline: pQGQ za laki lanac i/ili pQVQ za teški lanac, gde "pQ" predstavlja piroglutamat.
[0278] Konjugovana aktivirana antitela iz pronalaska su korišćena u dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednoj realizaciji, aktivirajuće antitelo se primenjuje kod pacijenata koji su pod rizikom od razvoja jedne ili više od gore pomenutih inflamacija, zapaljenskih poremećaja, karcinoma ili drugih poremećaja.
[0279] Predispozicija pacijenta ili organa ka jednom ili više gore pomenutih poremećaja, može biti utvrđena korišćenjem genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0280] U nekim realizacijama prema pronalasku, konjugovano aktivirano antitelo je primenjeno kod humanih pojedinaca dijagnostikovanih sa kliničkom indikacijom povezanom sa jednim ili više od gore pomenutih poremećaja. Nakon dijagnoze, primenjeno je konjugovano aktivirano antitelo da bi se ublažili ili preokrenuli efekti kliničke indikacije.
[0281] Konjugovana aktivirana antitela iz pronalaska su takođe, korisna u otkrivanju cilja u uzorcima pacijenta i shodno tome su korisna kao dijagnostici. Na primer, konjugovana aktivirana antitela iz pronalaska su korišćena u in vitro testovima, npr. ELISA, za otkrivanje ciljnih nivoa u uzorku pacijenta.
[0282] U jednoj realizaciji, aktivirano antitelo iz pronalaska je imobilisano na čvrstom nosaču (npr. udubljenju (otvorima) mikrotitarske ploče). Imobilisano antitelo i / ili aktivirano antitelo služi kao antitelo za hvatanje bilo koje mete koja može biti prisutna u ispitivanom uzorku. Pre stupanja u kontakt imobilisanog, aktiviranog antitela sa uzorkom pacijenta, čvrsti nosač se ispere i tretira blokirajućim sredstvom, kao što je mlečni protein ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0283] Nakon toga se bazenčići tretiraju test uzorkom za koji se sumnja da sadrži antigen ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, na primer, uzorak seruma
1
subjekta za koga se sumnja da ima nivo cirkulišućeg antigena koji se smatra dijagnostikom patologije. Nakon ispiranja test uzorka ili standarda, čvrsti nosač se tretira sa drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Označeno drugo antitelo služi kao antitelo za otkrivanje. Meri se nivo detektabilne oznake, a koncentracija ciljnog antigena u test uzorku se određuje upoređivanjem sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.
[0284] Podrazumevaće se da je na osnovu rezultata dobijenih upotrebom aktiviranih antitela iz otkrića u in vitro dijagnostičkom testu, moguće prikazati stadijum bolesti kod subjekta na osnovu nivoa ekspresije ciljnog antigena. Za datu bolest uzimaju se uzorci krvi kod subjekata kojima je dijagnostikovano da su u različitim fazama progresije bolesti i/ili u raznim tačkama terapijskog lečenja bolesti. Koristeći populaciju uzoraka koja pruža statistički značajne rezultate za svaku fazu napredovanja ili terapije, određuje se opseg koncentracija antigena koji se mogu smatrati karakterističnim za svaku fazu.
[0285] Konjugovana aktivirana antitela se takođe, mogu koristiti u dijagnostičkim i/ili metodama snimanja. U nekim realizacijama, takve metode su in vitro metode. U nekim realizacijama, takve metode su in vivo metode. U nekim realizacijama, takve metode su in situ metode. U nekim realizacijama, takve metode su ex vivo metode. Na primer, aktivirajuća antitela koja imaju enzimski cepljivi CM, mogu se koristiti za otkrivanje prisustva ili odsustva enzima koji je sposoban za cepanje CM. Takva aktivirajuća antitela mogu se koristiti u dijagnostici, koja mogu uključivati in vivo detekciju (npr. kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim realizacijama, okruženje povećanog potencijala smanjenja, kao što je ono koje može obezbediti redukciju disulfidne veze) putem izmerene akumulacije aktiviranih antitela (tj. antitela koja nastaju cepanjem aktivirajućeg antitela) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma domaćina. Takva akumulacija aktiviranih antitela ukazuje ne samo da tkivo izražava enzimatsku aktivnost (ili povećani redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM), već i da tkivo izražava cilj za koji se vezuje aktivirano antitelo.
[0286] Na primer, CM se može odabrati da bude proteazni supstrat za proteazu koja se nalazi na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr. kao što je apsces, u organu, i slično), i slično. Korišćenjem postupaka poznatih stručnjaku u ovoj oblasti, detektabilna oznaka (na primer, fluorescentna oznaka ili radioaktivna oznaka ili radioobeleživač), može biti konjugovana sa AB ili drugim regionom aktiviranog antitela. Specifični primeri su niže obezbeđeni. Korišćenjem AB specifičnog za protein ili peptid bolesnog stanja, zajedno sa proteazom čija je aktivnost povišena u obolelom tkivu od značaja, aktivirajuća antitela će ispoljiti povećanu stopu vezivanja za obolelo tkivo u odnosu na tkiva u kojima CM specifični enzim nije prisutan pri nivou koji se može detektovati ili je prisutan pri
2
nižem nivou nego u bolesnom tkivu ili je neaktivan (npr. u obliku zimogena ili u kompleksu sa inhibitorom). S obzirom da se mali proteini i peptidi brzo uklanjaju iz krvi sistemom bubrežne filtracije i zato što enzim specifičan za CM nije prisutan pri detektabilnom nivou (ili je prisutan pri nižim nivoima u tkivima koja nisu bolesna ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji), akumulacija aktiviranih antitela u bolesnom tkivu je pojačana u odnosu na tkiva koja nisu bolesna.
[0287] Oznaka koja se može detektovati može biti fluorescentna boja, (npr. Fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin izotiocijanat (TRITC), skoro infracrvena (NIR) boja (npr. Qdot® nanokristali), koloidni metal, hapten, radioaktivni marker, biotin i amplifikacioni reagens poput streptavidina ili enzima (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
[0288] Otkrivanje oznake u uzorku koji je inkubiran sa obeleženim, aktiviranim antitelom ukazuje da uzorak sadrži cilj i sadrži proteazu koja je specifična za CM aktivirajućeg antitela.
[0289] U nekim realizacijama in situ snimanje se koristi za identifikovanje ili na drugi način rafiniranje populacije pacijenata pogodnih za lečenje aktiviranim antitelom iz pronalaska. Na primer, pacijenti kod kojih je test pozitivan i na cilj i na proteazu koja odvaja supstrat u cepljivom delu (CM) aktivnog antitela koje se ispituje (npr. akumuliraju aktivirana antitela na mestu bolesti) identifikovani su kao pogodni kandidati za lečenje sa takvim aktiviranim antitelom koje sadrži takav CM. Slično tome, pacijenti kod kojih je test negativan na bilo koji ili i cilj i proteazu koja cepa supstrat u CM u aktiviranom antitelu koje se testira ovim metodama, identifikovani su kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije (tj. nisu pogodni za lečenje sa aktivirajući antitelom koje se testira).
[0290] U nekim realizacijama, snimanje in vivo se koristi za identifikaciju ili na drugi način pročišćavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje aktiviranim antitelom iz pronalaska. Na primer, pacijenti kod kojih je test pozitivan i na cilj i na proteazu koja cepa supstrat u cepljivom delu (CM) aktivnog antitela koje se testira (npr. akumuliraju aktivirana antitela na mestu bolesti), identifikovani su kao pogodni kandidati za lečenje sa takvim aktiviranim antitelom koje sadrži takav CM. Slično tome, pacijenti sa negativnim testom su identifikovani kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije (tj. nisu pogodni za lečenje sa aktiviranim antitelom koje se testira).
Farmaceutski preparati
[0291] Konjugovana aktivirana antitela prema pronalasku (koja se ovde takođe nazivaju "aktivnim jedinjenjima"), mogu biti inkorporirana u farmaceutske preparate pogodne za primenu.
[0292] Naročito je korisno formulisati oralne ili parenteralne preparate u doznom jediničnom obliku radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Oblik jedinične doze, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice koje odgovaraju jedinstvenim dozama za lečenog subjekta; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Specifikacije za dozne jedinične oblike pronalaska su diktirane i direktno zavise od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji se želi postići, i ograničenja svojstvenih veštini formulisanja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje pojedinaca.
[0293] Farmaceutski preparati mogu biti sadržani u kontejneru, pakovanju ili dozatoru zajedno sa uputstvima za primenu.
[0294] Pronalazak će biti dalje opisan u sledećim nabrojanim realizacijama i primerima, koji ne ograničavaju obim pronalaska opisan u patentnim zahtevima.
PRIMERI
PRIMER 1. Konjugovana aktivirana antitela protiv CD71 (AADC)
[0295] Ovde obezbeđene studije su dizajnirane da izrade neka od anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela iz pronalaska.
[0296] Kao što je opisano u američkoj patentnoj prijavi br. US 2016/0355599 A1, M21 monoklonsko antitelo protiv CD71 je dobijeno korišćenjem tehnologije hibridoma miša u skladu sa tehnikama poznatim u tehnici. Miševi su imunizovani sa humanim CD71 ekstraćelijskim domenom (ECD) i naknadni hibridomi su pregledani korišćenjem lančanog testa citotoksičnosti, i citotoksični pozitivni klonovi iz ovog testa su potvrđeni ELISA tehnikom da vezuju humani CD71 ECD polipeptid i potvrđeni da vezuju ćelijske površine pomoću FACS-a. M21 monoklonsko antitelo protiv CD71 uključuje, varijabilni region teškog lanca (VH) od SEK ID BR: 1 i varijabilni region lakog lanca (VL) od SEK ID BR: 2.
[0297] Takođe su ispitana sledeća humanizovana antitela protiv CD71, koja su bazirana na mišjem monoklonskom antitelu M21 protiv CD71: Ab21.10 LcB: HcA (VH od SEK ID BR: 3 i VL od SEK ID BR: 7), Ab21.11 LcB: HcB (VH od SEK ID BR: 4 i VL od SEK ID BR: 7),
4
Ab21.12 LcB: HcC (VH od SEK ID BR: 5 i VL od SEK ID BR: 7) i M21 (VH od SEK ID BR: 1 i VL od SEK ID BR: 2). Sposobnost različitih antitela protiv CD71 iz ovog pronalaska da vežu CD71 na ćelijskoj površini potvrđena je FACS-om.
[0298] Sva humanizovana antitela protiv CD71 su pokazala vezivanje za humani i cinomolgusni CD71, koje je bilo uporedivo sa vezivanjem koje je demonstrirano mišjim antitelom CD71 M21.
Vezivanje humanizovanih antitela protiv CD71 je potvrđeno na ćelijskoj liniji BxPC3 pomoću FACS-a. Ukratko, BxPC3 ćelije su obeležene sa mišjim monoklonskim Mab21 ili huCD71 (Ab21.10, Ab21.11 i Ab21.12) antitelom u naznačenim koncentracijama i naknadno detektovane sa Alexa Fluor 647 obeleženim kozjim anti-mišjim ili anti-humanim IgG Alexa Fluor 647, respektivno.
[0299] U primernoj studiji, izmerena je aktivnost vezivanja anti-CD71 Ab21.12 LcB: HcC (VH od SEK ID BR: 5 i VL od SEK ID BR: 7) za rekombinantne CD71 (korišćenjem ELISA) i ćelije koje izražavaju CD71 (korišćenjem protočne citometrije) iz humanih, cinomolgus majmuna, mišjih i pacovskih izvora. Kao što je prikazano u primerima rezultata u Tabeli 1, antitela protiv CD71 vezuju humani i majmunski rekombinantni CD71 sa ekvivalentnim afinitetom mereno ELISA tehnikom i koji su bili ekvivalentni afinitetu humanog holotransferina za humani CD71. Antitela su vezala ćelijske linije koje izražavaju humani i majmunski CD71 (humane BxPC3 ćelije karcinoma pankreasa i primarne bubrežne epitelne ćelije cinomolgus majmuna, respektivno) sa ekvivalentnim afinitetom izmerenim protočnom citometrijom. Nije izmereno značajno vezivanje antitela protiv CD71 za rekombinantni CD71 miša ili ćelijsku liniju koja izražava CD71 pacova (odnos H-4-11-E ćelija hepatoma).
Tabela 1: Vezivanje anti-CD71 za CD71 čoveka, majmuna, pacova i miša pomoću ELISA i protočne citometrije, i vezivanje holo-transferina za humani CD71 pomoću
ELISA
PRIMER 2. Otkriće maske
[0300] Ovde obezbeđene studije su dizajnirane da identifikuju i karakterišu maskirajuće ostatke za upotrebu u aktiviranim antitelima protiv CD71 iz pronalaska.
[0301] Kao što je opisano u američkoj patentnoj prijavi br. US 2016/0355599 A1, antitelo 21.12 protiv CD71, koje sadrži VH iz SEK ID BR: 5 i VL iz SEK ID BR: 7, korišćeno je za skrining proizvoljne biblioteke peptida X15sa ukupnom raznolikošću od 6x10<10>, gde je X bilo koja aminokiselina, primenom metode slične onoj opisanoj u PCT Međunarodnoj publikaciji br. WO2010/081173, objavljenoj 15. jula 2010. Skrining se sastojao od jedne runde MACS i pet rundi FACS sortiranja. Inicijalno MACS sortiranje je izvršeno sa protein-A Dyna zrncima (Invitrogen) i anti-CD71 21.12 antitelom u koncentraciji od 200 nM. Za MACS, približno 1x10<12>ćelija je pregledano na vezivanje i sakupljeno je 1x10<7>ćelija. Anti-CD71 21.12 je konjugovan sa DyLight-488 (ThermoFisher), potvrđena je aktivnost vezivanja CD71 i anti-CD71 21.12-488 je korišćen kao fluorescentna proba za sve FACS runde. Bakterijske ćelije su obojene, a pozitivni klonovi sakupljeni na sledeći način: 20 nM anti-CD7121.12-488 sa 1x10<6>ćelija sakupljenih u FACS krugu 1, 5nM anti-CD7121.12-488 sa 6,2x10<4>ćelija sakupljenih u FACS krugu 2 i 5 nM anti-CD71 21.12-488 sa 5x10<3>ćelija i 1 nM anti-CD7121.12-488 sa 5x10<2>ćelija sakupljenih u FACS krugu 3, 1 nM anti-CD71 21.12-488 sa > 2x10<2>ćelija prikupljenih u FACS krugovima 4 i 5. Verifikovano je da pozitivna populacija iz drugog kruga FACS inhibira vezivanje anti-CD71 21.12-488 antitela za rekombinantni CD71 protein. Pojedinačni peptidni klonovi su identifikovani analizom sekvence iz 5 nM veziva iz FACS runde 3 i 1 nM veziva iz FACS rundi 3, 4 i 5.
[0302] Identifikovani ostaci za maskiranje uključuju TF01 (QFCPWSYYLIGDCDI; SEK ID BR: 16) i TF02 (NLCTEHSFALDCRSY; SEK ID BR: 17). Maske TF01 i TF02 su skraćene i skenirane sa alaninom da generišu familije aktiviranih antitela sa različitim efikasnostima maskiranja, uključujući maskirajući deo TF02.13 (NLCTEHSAALDCRSY; SEK ID BR: 18).
[0303] Ovi maskirajući peptidi su korišćeni za stvaranje antitela iz pronalaska koja se mogu aktivirati protiv CD71. Sekvence za neka od ovih antitela koja se aktiviraju protiv CD71 su niže prikazane u tabeli A. U nekim realizacijama, ova antitela koja se aktiviraju protiv CD71 uključuju cepljivi deo 2001 (ISSGLLSGRSDNH; SEK ID BR: 91), cepljivi deo 3001 (AVGLLAPPGGLSGRSDNH; SEK ID BR: 97), cepljivi deo 2011 (ISSGLLSGRSDNP; SEK ID BR: 156) ili cepljivi deo 3011 (AVGLLAPPGGLSGRSDNP; SEK ID BR: 164) kako je naznačeno.
[0304] Iako određene sekvence prikazane u nastavku uključuju razdelnu sekvencu SEK ID BR: 138, stručnjaci u ovoj oblasti cene da aktivirajuća antitela protiv CD71 iz pronalaska mogu da uključuju bilo koju pogodnu razdvojnu sekvencu, kao što je, na primer, sekvenca za razdvajanje izabrana iz grupe koju čine QGQSGQG (SEK ID BR: 138), QGQSGQ (SEK ID BR: 109), QGQSG (SEK ID BR: 139), QGQS (SEK ID BR: 140), QGQ, QG, GQSGQG (SEK ID BR: 143), QSGQG (SEK ID BR: 144), SGQG (SEK ID BR: 145), GQG, G ili Q. U nekim realizacijama, aktivirana antitela protiv CD71 iz pronalaska mogu da nemaju sekvencu za razdvajanje pridruženu njihovom N-kraju.
Tabela A. Sekvence Anti-CD71 aktiviranih antitela
HuCD71_HcC varijabilni region teškog lanca
Aminokiselinska sekvenca
(SEK ID BR: 206)
HuCD71_HcC-des teški lanac
Aminokiselinska sekvenca
Nukleotidna sekvenca
(nastavak)
HuCD71_HcC teški lanac
Aminokiselinska sekvenca
Nukleotidna sekvenca
(nastavak)
HuCD71_LcB
Aminokiselinska sekvenca
HuCD71_LcB
Nukleotidna sekvenca
(nastavak)
Laki lanac aktivirajućeg antitela protiv CD71-TF02.13-2001 [razdvojnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_2001 (SEK ID BR: 142)]
Aminokiselinska sekvenca
Laki lanac aktivirajućeg antitela protiv CD71-TF02.13-3011
[razdelnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_3011 (SEK ID BR: 146)] Aminokiselinska sekvenca
Laki lanac aktivirajućeg antitela protiv CD71-TF02.13-2011
[razdelnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_2011 (SEK ID BR: 169)] Aminokiselinska sekvenca
Laki lanac aktivirajućeg antitela protiv CD71-TF01-3011
[razdvojnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF01_3011 (SEK ID BR: 173)] Aminokiselinska sekvenca
Varijabilni region lakog lanca aktivirajućeg antitela protiv-CD71-TF02.13-2001 [razdelnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_2001 VL domen (SEK ID Br: 197)] Aminokiselinska sekvenca
1
Varijabilni region lakog lanca aktivirajućeg antitela protiv-CD71-TF02.13-3011
[razdelnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_3011 VL domen (SEK ID BR: 199)] Aminokiselinska sekvenca
Varijabilni region lakog lanca aktivirajućeg antitela protiv-CD71-TF02.13-2011
[razdelnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF02.13_2011 VL domen (SEK ID BR: 201)] Aminokiselinska sekvenca
Varijabilni region lakog lanca aktivirajućeg antitela protiv-CD71-TF01-2001
[razdelnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF01_2001 VL domen (SEK ID BR: 195)] Aminokiselinska sekvenca
Varijabilni region lakog lanca aktivirajućeg antitela protiv-CD71-TF01-3011
[razdvojnik (SEK ID BR: 138)] [huCD71Lc_TF01_3011 VL domen (SEK ID BR: 203)] Aminokiselinska sekvenca
PRIMER 3. Stvaranje i karakterizacija aktiviranih antitela protiv CD71 i konjugovanih aktiviranih antitela protiv CD71
[0305] Ovde obezbeđene studije su dizajnirane da generišu neka antitela prema pronalasku koja se mogu aktivirati protiv CD71.
2
[0306] Generisana su anti-CD71 aktivirana antitela sa različitim maskirnim efikasnostima (tj. merenje sposobnosti MM aktiviranog antitela da blokira vezivanje AB aktivirajućeg antitela za njegov cilj). Peptidi TF01 i TF02 su mutirani odsecanjem i skeniranjem alanina, kao što je opisano u Primeru 2, a ove maskirne varijante peptida su korišćene za generisanje familija antitela koja se aktiviraju protiv CD71 iz sadašnjeg pronalaska sa nizom maskirajućih efikasnosti.
[0307] Vezivanje antitela koja se mogu aktivirati protiv CD71 iz sadašnjeg pronalaska za ćelijsku liniju NCI H292 (koja se ovde takođe naziva H292) je ocenjeno korišćenjem FACS-a. Ukratko, ćelije su obeležene sa huCD71 antitelom ili aktiviranim antitelom u opsegu koncentracija i naknadno detektovane sa kozjim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom obeleženim Alexa Fluor 647 za određivanje krive vezivanja. Kao što je sumirano u primerima podataka o vezivanju niže u Tabeli 2, antitela koja se aktiviraju protiv CD71 prema sadašnjem pronalasku pokazuju niz efikasnosti maskiranja u poređenju sa roditeljskim antitelom protiv CD71 (huCD7121.12 Ab).
Tabela 2: Maskirajuće efikasnosti maskirnih ostataka
[0308] Ovi primerni podaci u tabeli 2 pokazuju da obe maske (TF01 i TF02.13) inhibiraju vezivanje anti-CD71 antitela za CD71 kada je aktivirano antitelo u intaktnom ili neodvojenom stanju. Ovi primerni podaci takođe pokazuju da maskirajući deo TF01 pokazuje veću efikasnost maskiranja od maskirnog dela TF02.13.
PRIMER 4: Karakterizacija aktivnosti vezivanja CD71 aktiviranog antitela i CD71 konjugovanog aktivirajućeg antitela
[0309] Ovaj primer pokazuje da antitela koja se aktiviraju protiv CD71 i konjugovana antitela koja se aktiviraju protiv CD71 iz sadašnjeg pronalaska pokazuju niži afinitet vezivanja za rekombinantni i površinski ćelijski humani i cinomolgusni CD71 protein u njihovom intaktnom, nerazgrađenom obliku u poređenju sa njihovim odgovarajućim oblicima otcepljenim pomoću proteaza.
[0310] Kao što je prikazano na SL. 3A i 3B, test vezivanja na čvrstoj fazi (ELISA) korišćen je da se prikaže afinitet vezivanja anti-CD71 aktiviranih antitela i anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela iz sadašnjeg pronalaska za rekombinantni CD71, kako u njihovim celim, nerazgrađenim oblicima i njihovim rascepljenim oblicima aktiviranim proteazom. U ovim primerima, rekombinantni cinomolgusni (slika 3B) ili humani CD71 (slika 3A) protein (R&D sistemi) je obložen na ELISA pločama u koncentraciji od 1 μg/mL, a zatim inkubiran sa naznačenom koncentracijom intaktnog, neraspadnutog anti-CD71 aktiviranog antitela ("anti-CD71-TF02.13-2011") iz sadašnjeg pronalaska ili intaktnog, nerazdvojenog E2 (tj. koje ima DAR od ~ 2) anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela ("anti-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2") iz sadašnjeg pronalaska. Takođe su analizirana antitela koja se aktiviraju protiv CD71 („anti-CD71-TF02.13-2011 (Act)“) ili E2 (tj. koja imaju DAR od ~ 2) anti-CD71 konjugovana aktivirana antitela („anti-CD71-TF02. 13-2011 (Act)") iz sadašnjeg pronalaska, nakon tretmana sa proteazom koja odvaja cepljivi deo komponente aktivirajućeg antitela.
[0311] Kao što je ovde razmatrano, "E2" se odnosi na preparat datog anti-CD71 konjugovanog aktivirajućeg antitela iz sadašnjeg pronalaska koji uključuje suštinski samo vrste konjugovanih aktiviranih antitela gde je punjenje lekom od 2 molekula leka za svaki molekul aktivirajućeg antitela i suštinski ne uključuje nikakve ili minimalne količine drugih mogućih vrsta (tj. gde je punjenje lekom 0, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 itd.). Kao što je ovde diskutovano, "DAR" se odnosi na prosečan odnos između leka (u ovom slučaju, MMAE) prema aktiviranom antitelu (tj. CD71-TF02.13-2011) u populaciji takvih konjugovanih aktiviranih antitela. Stoga, u ovom primeru, anti-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2 se odnosi na sastav koji uključuje samo anti-CD71-TF02.13-2011 aktivirana antitela u kojem je svako aktivirano antitelo imalo punjenje lekom od 2 ekvivalenata vc-MMAE i DAR od oko 2, kao što je opisano u primeru 26.
[0312] Količina vezanog antitela u svakom uzorku je detektovana inkubacijom i detekcijom kozjim anti-humanim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena i Ultra TMB (Thermo Fisher Scientific) detekcijom. Sažetak afiniteta vezivanja je prikazan u nastavku:
Tabela 3A: Primerno uočena aktivnost vezivanja CD71 od nerazgrađenih i razgrađenih antitela koja se aktiviraju protiv CD71 i konjugovanih antitela koja se aktiviraju protiv
CD71
4
[0313] SL.3C i 3D pokazuju u FACS analizi primerne rezultate da antitela koja se aktiviraju protiv CD71 iz sadašnjeg pronalaska i konjugovana antitela koja se aktiviraju protiv CD71 prema sadašnjem pronalasku vezuju ćelije koje izražavaju humani CD71 (SL. 3C) i cinomolgusni CD71 (SL. 3D) sa većom konstantom disocijacije i nižim afinitetom od odgovarajućeg antitela aktiviranog protiv CD71 proteazom ili konjugovanog aktivirajućeg antitela protiv CD71 aktiviranog proteazom iz sadašnjeg pronalaska. Ovi primerni rezultati pokazuju da je afinitet vezivanja rascepljenih, proteazom aktiviranih antitela koja se aktiviraju protiv CD71 iz sadašnjeg pronalaska i rascepljenih, aktiviranih proteazom anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela iz sadašnjeg pronalaska vezana za ćelije afinitetom sličnom onom od roditeljskog anti-CD71 antitela, demonstrirajući na taj način efekat maskirajućeg ostatka u inhibiranju vezivanja anti-CD71 za njegov cilj u intaktnom aktiviranom antitelu ili intaktnom konjugovanom aktiviranom antitelu.
[0314] U primernoj studiji prikazanoj na SL. 3C i 3D, vezivanje antitela iz sadašnjeg pronalaska za naznačene ćelijske linije je izvedeno korišćenjem standardne FACS metode obeležavanja. Ukratko, ćelije su obeležene sa naznačenim antitelima ili aktiviranim antitelima iz sadašnjeg pronalaska: kontrolno antitelo (AB095), humano antitelo protiv CD71 (Ab 21.12, koje ima VH od SEK ID BR: 5 i VL od SEK ID BR : 7), antitelo koje se aktivira protiv CD71 (anti-CD71 TF02.13-2011) ili E2 (tj. koje ima DAR od ~ 2) anti-CD71 konjugovano aktivirano antitelo (anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2). Dodatno, afinitet vezivanja anti-CD71 aktiviranog antitela (anti-CD71 TF02.13-2011 (Akt)) i E2 (tj. koje ima DAR od ~ 2) anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela (anti-CD71 TF02. 13-2011-vcMMAE E2 (Akt)) je takođe analiziran nakon aktivacije proteazom koja je odvajala cepljivi deo u njima. Svaki ispitivani proizvod je primenjen pri naznačenim koncentracijama i naknadno detektovan sa kozijim antihumanim IgG sekundarnim antitelom obeleženim Alexa Fluor 647.
[0315] Tabela 3B niže prikazuje vrednosti EC50na osnovu vezivnih kriva prikazanih na SL.
3C do 3D. Ovi rezultati pokazuju da su intaktna aktivirana antitela i intaktna konjugovana aktivirana antitela vezana za svoj cilj sa nižim afinitetom od njihovih duplikata aktiviranih proteazom i da su aktivirana antitela aktivirana proteazom vezana afinitetom koji je sličan onom od roditeljskih antitela protiv CD71.
Tabela 3B: Primerno uočena aktivnost vezivanja CD71 od anti-CD71 vezujućih agenasa
[0316] U sličnoj primernoj studiji, ELISA i testovi protočne citometrije su korišćeni za prikazivanje afiniteta vezivanja anti-CD71 antitela, antitela konjugovanih protiv CD71, antitela koja se aktiviraju protiv CD71 (intaktni, nerazgrađeni oblik i proteazno-aktiviran, rascepljeni oblik) i anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (intaktni, nerazgrađeni oblik i proteaznoaktiviran, rascepljeni oblik) iz sadašnjeg pronalaska za rekombinantni CD71, za rekombinantni humani i cinomolgusni CD71 i humane i cinomolgusne ćelijske linije koje izražavaju CD71. Ispitivani proizvodi su bili antitelo protiv CD71 Ab21.12 (VH od SEK ID BR: 5 i VL od SEK ID BR: 7), konjugovano antitelo anti-CD71 Ab21.12-vcMMAE E2 (tj. koje ima DAR od ~ 2), aktivirajuće antitelo anti-CD71-TF02.13-2011 i DAR2 konjugovano aktivirano antitelo anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (tj. koje ima DAR od ~ 2).
[0317] U primerima ELISA, rekombinantni cinomolgusni ili humani CD71 ECD proteini su obloženi na ELISA ploče, a zatim inkubirani sa jednim od koncentracijskih raspona ispitivanih proizvoda iz sadašnjeg pronalaska, praćeno merenjem količine vezanog ispitivnog proizvoda sa sekundarnim antitelom. Ispitivani proizvodi koji su aktivirani, inkubirani su sa enzimom proteaze matriptazom. Primerne prividne vrednosti Kd za svaki ispitivani proizvod su prikazane su u tabeli 3C.
[0318] U primernoj studiji takođe, prikazanoj u Tabeli 3C, vezivanje antitela iz ovog pronalaska za naznačene ćelijske linije izvedeno je korišćenjem standardne FACS metode obeležavanja. Rezultati protočne citometrije odražavaju prosečno izmereni Kapp iz četiri humane ćelijske linije (HCC1806 humanog raka dojke, HT-29 humanog raka debelog creva, NCI-H292 humanog raka pluća i NCI-H520 humanog raka pluća) i jedne CHO-K1 ćelijske linije koja izražava CD71 cinomolgus majmuna. Primerne prividne vrednosti Kd za svaki ispitivani proizvod prikazane su u tabeli 3C.
Tabela 3C: Primerno uočena aktivnost vezivanja CD71 od anti-CD71 antitela, anti-CD71 konjugovanih antitela, nerazgrađenih i razgrađenih antitela koja se aktiviraju protiv CD71 i konjugovanih antitela koja se aktiviraju protiv CD71
[0319] Ovi primerni rezultati pokazuju da su intaktna aktivirajuća antitela i intaktna konjugovana aktivirajuća antitela pokazala niži prividni afinitet prema CD71, u poređenju sa njihovim aktiviranim duplikatima ili njihovim roditeljskim antitelima.
PRIMER 5: Ekspresija CD71 u višestrukim primarnim i metastatskim tumorima izvedenim od pacijenta
[0320] Ovaj primer pokazuje da je CD71 izražen u velikom broju različitih primarnih i metastatskih tipova tumora pomoću imunohistohemijskog (IHC) bojenja, korišćenjem anti-CD71 antitela.
[0321] SL. 1 i 2 pokazuju da je CD71 visoko eksprimiran u velikom broju primarnih i metastatskih uzoraka tumora, korišćenjem IHC bojenja sa komercijalno nabavljenim antitelom protiv CD71 na više primarnih tumora izvedenih od pacijenta i metastatskih tkivnih mikronizova izvedenih od pacijenta (TMA). SL.1 prikazuje IHC bojenje CD71 kod raka glave i vrata (1), raka grlića materice (2), raka dojke (3), ne-Hodgkinovog limfoma (NHL) u limfnim čvorovima (4), karcinoma pluća (5), raka bešike (6), raka jajnika (7) i raka jednjaka (8). SL.2 prikazuje IHC bojenje CD71 u mikromreži tkiva (TMA) koja se sastoji od jezgara iz metastatskih tumora, pokazalo je umeren do visoki nivo ekspresije CD71 u većini jezgara. Rezime ekspresije CD71 u uzorcima humanog tumora pomoću imunohistohemije (IHC) prikazan je u tabeli 4A.
Tabela 4A: Rezime ekspresije CD71 u uzorcima humanog tumora pomoću IHC
PRIMER 6: Efikasnost maskiranja i aktiviranje Anti-CD71-AADC in vivo efikasnost u CRC modelu ksenografta
[0322] Ovaj primer pokazuje da je efikasnost maskiranja anti-humanih CD71 aktivirajućih antitela sa konjugovanim toksinima (AADC) iz sadašnjeg pronalaska faktor njihove efikasnosti u modelu ksenografta miša HT29 kolorektalnog karcinoma (CRC).
[0323] U ovim studijama, tumori ksenografta HT29 kod miševa rasli su do prosečne zapremine od 150 mm<3>. Miševi su zatim randomizovani u grupe i dozirani 1. dana sa 3 mg/kg (ili je drugačije naznačeno) od svakog naznačenog, ispitivanog proizvoda. Za svaku vremensku tačku je ucrtana srednja zapremina tumora ± SD.
[0324] SL. 4A pokazuje da primerni anti-CD71 AADC prema sadašnjem pronalasku (anti-CD71 TF01-3011-vc-MMAE) sa maskom većeg afiniteta pokazuje određenu inhibiciju rasta tumora u odnosu na kontrolni nosač nakon pojedinačne doze od 3 mg/kg. U poređenju, SL.4B pokazuje primer anti-CD71 AADC-a iz sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) sa maskom nižeg afiniteta, ali sa istim cepljivim supstratom pokazuje suštinski potpunu regresiju ksenografta nakon pojedinačne doze od 3 mg/kg. SL. 4C prikazuje primer anti-CD71 AADC-a iz sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) sa maskom nižeg afiniteta, ali sa istim cepljivim supstratom takođe, pokazuje suštinski potpunu regresiju HT29 ksenografta pri oba pojedinačna doziranje od 2 mg/kg ili 3 mg/kg. Ovi primerni rezultati pokazuju da je AADC sa maskirnim ostatkom nižeg afiniteta pokazao veću efikasnost od AADC sa maskirnim ostatkom višeg afiniteta.
PRIMER 7: Supstrati koje se mogu odvojiti i in vivo efikasnost aktivirajućih Anti-CD71-AADC-a u CRC modelima ksenografta
[0325] Ovaj primer pokazuje efekat razgradivog supstrata na efikasnost primernih antihumanih CD71 konjugovanih aktiviranih antitela (AADC) iz sadašnjeg pronalaska u modelu ksenografta na mišu.
[0326] U ovim studijama, tumori ksenografta HT29 (izvedeni iz kolorektalnog karcinoma) kod miševa rasli su do prosečne zapremine od 150 mm<3>. Miševi su zatim randomizovani u grupe i dozirani su 1. dana sa naznačenom količinom naznačenog ispitivnog proizvoda. Za svaku vremensku tačku ucrtana je srednja zapremina tumora ± SD.
[0327] SL.5 pokazuje da primerni anti-CD71 AADC konjugati iz sadašnjeg pronalaska (CD71 TF02.13-2011- vc-MMAE) pokazuju potpunu ili skoro potpunu regresiju u modelu ksenografta kod miša pri dve različite doze. Ovi primerni podaci pokazuju da je efikasnost naznačenog AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) sa supstratom koji je manje otcepljiv suštinski ista kao i efikasnost AADC (anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE) sa cepljivijim supstratom prikazanom na SL.4B i 4C.
PRIMER 8: In vivo efikasnost aktiviranog anti-CD71-AADC u višestrukim modelima ksenografta
[0328] Ovaj primer pokazuje efikasnost anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE AADC iz sadašnjeg pronalaska pri dva različita odnosa leka i antitela (DAR) na različitim modelima ksenografta miša.
[0329] U ovim studijama tumori ksenografta raka jajnika (OV-90; SL.6B), raka želuca (NCI-N87; SL.6 A), ER+ raka dojke (BT474; SL.6C) ili trostruko negativnog raka dojke (HCC-70; SL. 6D) kod miševa su rasli do prosečne zapremine od 150 mm<3>. Miševi su zatim randomizovani u grupe i dozirani prvog dana sa navedenim ispitivanim proizvodom. Količina svakog primenjenog AADC-a prilagođena je dozi na osnovu količine MMAE toksina, tako da je anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE (koji ima prosečni DAR od ~ 3) primenjen pri 3 mg/kg i anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (sa prosečnim DAR-om od ~ 2) primenjen pri 4,3 mg/kg. Za svaku vremensku tačku prikazana je na dijagramu srednja zapremina tumora ± SD.
[0330] SL. 6A-6B pokazuju da primeri anti-CD71 AADC-a iz sadašnjeg pronalaska (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) pokazuju potpunu ili skoro potpunu regresiju u modelu ksenografta raka jajnika i želuca kod miša. Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (tj. koji ima DAR od ~ 2), koji je uključio prečišćene AADC konjugate, svaki sa dva ekvivalenta MMAE toksina, takođe je pokazao potpune regresije u istim modelima. U svim slučajevima, kao što je prikazano na SL. 6C i 6D, čak i kada nije primećena potpuna ili gotovo potpuna regresija, aktivnosti E2 (tj. koji imaju DAR od ~ 2) i viši DAR AADC-a su ekvivalentne ili gotovo ekvivalentne. Ovi primerni podaci pokazuju da je dozno usklađena efikasnost E2 (tj. koji ima DAR od ~ 2) AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2) uporediva sa odgovarajućim višim DAR-om AADC-a.
[0331] Kao što je prikazano u Tabeli 4B, efikasnost anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC konjugata koji ima DAR od ~ 2, ispitivana je protiv različitih ćelijskih linija izvedenih od pacijenta (PDX) ili karcinoma (CDX) u modelu ksenografta kod miša, a dozirano je sa manje od ili 6 mg/kg jednom ili dva puta. Rezultati, koji su sumirani u nastavku, pokazuju da je AADC pokazao najmanje izvesnu efikasnost, u rasponu od regresije do zaustavljanja do inhibicije rasta tumora u skoro svim ispitivanim modelima.
Tabela 4B: Efikasnost Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 u ksenograftima izvedene ćelijske linije
1
PRIMER 9: Bioanalitički testovi za određivanje nivoa konjugovanog i slobodnog toksina i intaktnog i ukupnog AADC u uzorcima od tretiranih životinja
[0332] Ovaj primer prikazuje primerne radne tokove analiza za merenje nivoa metabolita u ispitivanim uzorcima, uključujući nivoe konjugovanog i slobodnog toksina, i nivoe intaktnih i ukupnih konjugovanih aktiviranih antitela.
[0333] SL.7A, 7B i 7C prikazuju šematske radne tokove primernih bioanalitičkih testova za određivanje količine intaktnog i ukupnog (tj. kombinovanog celog i rascepljenog) aktiviranog antitela kod lečenih majmuna, kao i količine intaktnog AADC (sa nerazdvojenim toksinom) i
2
otcepljenim toksinom kod lečenih majmuna. Korišćenjem primera protokola ispitivanja prikazanog na SL. 7A, ukupna količina netaknutog i rascepljenog aktiviranog antitela (npr. anti-CD71 TF02.13-3001) u uzorku, može biti uhvaćena magnetnim zrncima proteina A, a zatim naknadno denaturisana (RapiGest ™), redukovana sa ditiotreitolom, alkilovana i digestovana tripsinom. Dobijeni peptidni fragmenti mogu biti analizirani korišćenjem LC-MS/MS reverzne faze za identifikovanje i kvantifikovanje karakterističnih fragmenata peptida iz teških i lakih lanaca antitela. U ovom određenom testu, jedan ili više peptida koji su karakteristični za deo antitela od aktiviranog antitela ili konjugovanog aktiviranog antitela, mogu biti identifikovani i kvantifikovani korišćenjem LC-MS/MS reverzne faze da bi se utvrdila ukupna količina netaknutog i rascepljenog aktivirajućeg antitela, stoga merenjem količine ukupnog netaknutog i rascepljenog aktiviranog antitela u uzorku.
[0334] U istom testu, jedan ili više peptida koji su karakteristični za nerascepljeni deo koji se može odvojiti (CM) i maskirajući deo (MM) aktiviranog antitela (npr. sa N-kraja lakog lanca anti-CD71 -TF02.13-2011), mogu se identifikovati i kvantifikovati pomoću LC-MS/MS reverzne faze da bi se utvrdila ukupna količina intaktnog aktiviranog antitela, mereći na taj način količinu intaktnog aktivirajućeg antitela u uzorku.
[0335] Upotrebom primernog protokola ispitivanja prikazanog na SL. 7B, može se odrediti ukupna količina AADC-a (npr. anti-CD71 TF02.13-3001-vc-MMAE) koja ostaje konjugovana sa svojim toksinom (MMAE) u uzorku. U ovoj analizi, ukupna količinu aktiviranog antitela, i konjugovanog i nekonjugovanog, uhvaćena je pomoću MabSelect® Proteina A. Ova frakcija je tretirana cisteinskom proteazom da odvoji linker-toksin, oslobađajući tako sve toksine koji su ostali konjugovani sa svojim aktiviranim antitelom. Korišćenje LC-MS/MS reverzne faze za analizu frakcije otcepljene pomoću cisteinske proteaze, može biti identifikovan i kvantifikovan karakteristični toksin (npr. MMAE) koji je ostao konjugovan sa uhvaćenim aktiviranim antitelom, mereći na taj način količinu konjugovanog toksina u uzorku.
[0336] Korišćenjem primernog protokola ispitivanja prikazanog na SL. 7C, može se odrediti ukupna količina toksina u uzorku, koja uključuje toksine odvojene iz AADC kod životinje. U ovoj primernoj analizi prikazanoj na SL. 7C, ukupni protein iz uzorka se taloži, ostavljajući slobodni, nekonjugovani toksin (MMAE) u supernatantu. Supernatant se može analizirati korišćenjem LC-MS/ MS reverzne faze da bi se identifikovao i kvantifikovao karakteristični toksin (npr. MMAE) koji se nije vezao sa istaloženim proteinom, mereći na taj način količinu nekonjugovanog toksina u uzorku. U ovim testovima interni standardi (npr. SILu ™ Mab, Sigma-Aldrich) bili su uključeni da omoguće kvantifikaciju.
PRIMER 10: Podnošljivost i stabilnost anti-CD71-AADC i Anti-CD71 ADC-a kod Cinomolgus majmuna
[0337] Ovaj primer pokazuje da su antitela koja se aktiviraju protiv humanog CD71 sa konjugovanim toksinima (AADC) iz sadašnjeg pronalaska dobro tolerisana kod cinomolgus majmuna u poređenju sa odgovarajućim roditeljskim konjugatima antitela i leka (ADC) protiv CD71 na osnovu jednog ili više hematoloških očitavanja i kliničkih simptoma. Rezultati su sumirani u nastavku u Tabeli 5 i sumirani na slici 17.
[0338] U ovoj studiji, cinomolgus majmuni su tretirani intravenski sa naznačenim AADC ili ADC sa naznačenom dozom u danima 1 i 21. Samo jedna doza je tolerisana za anti-CD71 TF02.13-3011-VC-MMAE AADC i samo jedna doza je primenjena za anti-CD71-vc-MMAE E2 (tj. koji ima DAR od ~ 2) ADC. Stabilnost aktiviranih antitela (tj. ukupno aktiviranih antitela nasuprot intaktnih antitela koja se mogu aktivirati) u uzorcima dobijenim od svake životinje izvedena je kako je opisano u primeru 9, korišćenjem LC/MS/MS reverzne faze)
Tabela 5: Pregled podnošljivosti i stabilnosti anti-CD71 AADC i ADC kod Cinomolgus majmuna
4
[0339] Gubitak telesne mase je određen pri najnižoj izmerenoj masi nakon prve primenjene doze. Početni broj neutrofila bio je najmanje 1000 po μL.
[0340] Kao što je sumirano u Tabeli 5, nemaskirani E2 (tj. koji ima DAR od ~ 2) ADC (Anti-CD71-vc-MMAE E2) je pokazao smrtnost u roku od 8 dana od prve doze.
[0341] Primerni rezultati sumirani u tabeli 5 takođe, pokazuju da su AADC sa manje cepljivim supstratom (tj. anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE i anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2) bolje tolerisani i pokazali su viši nivo stabilnosti u cirkulaciji kod primata koji nisu humani od odgovarajućeg AADC sa supstratom koji se više razgrađuje (tj anti-CD71 TF02.13-3011-vc-MMAE). Konačno, primerni rezultati pokazuju da je AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 (tj. koji ima DAR od ~ 2)) pokazao merljivo poboljšanu podnošljivost kod nehumanih primata u odnosu na odgovarajući AADC (anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE) sa višim DAR-om.
PRIMER 11: Stabilnost i farmakokinetika anti-CD71-AADC kod Cinomolgus
majmuna
[0342] Ovaj primer pokazuje stabilnost i farmakokinetiku anti-humanih CD71 aktiviranih antitela sa konjugovanim toksinima (AADC) prema sadašnjem pronalasku kod Cinomolgus majmuna.
[0343] U ovoj studiji, čiji su rezultati detaljnije opisani u Primerima 12 do 14, četiri grupe Cinomolgus majmuna tretirane su intravenski sa naznačenim E2 (tj. koji ima DAR od ~ 2) anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE ili kontrolnim nosačem, pri naznačenim dozama i rasporedom prikazanim u Tabeli 6. U danima naznačenim u Tabeli 6 dobijeni su uzorci od svake životinje, koji su ispitivani na ukupna i intaktna aktivirana antitela i konjugovani i nekonjugovani MMAE toksin na način opisan u Primeru 9.
Tabela 6: Dizajn studije toksičnosti Anti-CD71 AADC
[0344] Kao što je sumirano u Tabeli 6, cinomolgus majmuni su dozirani ili sa nosačem ili anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 AADC laganim IV bolusom pri prikazanim nivoima doza i rasporedu. Uzorci krvi za toksikokinetičku analizu obrađeni su u plazmu i čuvani na -80 ° C pre analize. Uzorci seruma su dobijeni za anti-lek analizu prethodne doze i 7 dana nakon druge doze za grupe 1-3 i 22 dana nakon prve doze za grupu 4. Sve grupe su sadržale tri životinje (2 mužjaka i 1 ženku).
PRIMER 12: Stabilnost Anti-CD71-AADC kod Cinomolgus majmuna
[0345] Ovaj primer pokazuje stabilnost antitela koja se mogu aktivirati protiv humanog CD71 sa konjugovanim toksinima (AADC) iz sadašnjeg pronalaska kod majmuna cinomolgus.
[0346] Kao što je prikazano u primerima rezultata sa SL.8A i 8B, koncentracije ukupnih i celih aktiviranih antitela u plazmi (anti-CD71 TF02.13-2011) primenjenog AADC utvrđene su na način opisan u Primerima 9 i 11. Donje granice kvantifikacije (LLOQ) i za intaktno i za ukupno aktivirano antitelo su bile 0,633 nM, kako je naznačeno. Ovi primerni rezultati pokazuju da je koncentracija intaktnih aktiviranih antitela u plazmi generalno održana tokom 21-dnevnog intervala doziranja i na nivou proporcionalnom prvobitno primenjenoj dozi. Čak i 7 dana nakon doze, približno 80% konjugovanih aktiviranih antitela (anti-CD71-TF02.13-2011-vc-MMAE E2) u plazmi bilo je u intaktnom obliku, proleku.
[0347] Kao što je prikazano u primerima rezultata sa SL.9A i 9B, koncentracije konjugovanog i nekonjugovanog MMAE toksina u plazmi su određene na način opisan u primerima 9 i 11. Donja granica kvantifikacije (LLOQ) bila je 1,77 nM za konjugovani MMAE i 0,31 nM za nekonjugovani MMAE, kako je naznačeno. Ovi primerni rezultati pokazuju da je manje od 1% ukupnog MMAE izmerenog u koncentraciji u plazmi bilo u nekonjugovanom obliku.
PRIMER 13: Promena odnosa leka prema aktiviranom antitelu nakon doziranja Anti-CD71-AADC kod Cinomolgus majmuna
[0348] Ovaj primer pokazuje uočeni odnos leka (MMAE) prema aktiviranom antitelu (anti-CD71 TF02.13-2011) u plazmi, nakon doziranja prema sadašnjem pronalasku anti-humanih CD71 aktiviranih antitela sa konjugovanim toksinima (AADC) kod cinomolgus majmuna.
[0349] Koncentracije ukupnih i intaktnih aktiviranih antitela u plazmi (anti-CD71 TF02.13-2011) su utvrđene na način opisan u Primerima 9 i 11. Kao što je prikazano na SL.10, odnos leka i aktiviranog antitela izračunat je deljenjem koncentracije konjugovanog MMAE (videti Primer 12 i SL.9A) sa koncentracijom ukupno aktiviranog antitela (videti Primer 11 i SL.8A) u svakoj naznačenoj vremenskoj tački. Prosečni odnosi i standardna odstupanja za specifične vremenske tačke prikazana su u Tabeli 7. Ovi primerni rezultati pokazuju da se uočeni odnos leka MMAE prema aktiviranom antitelu promenio tokom vremena na način koji je bio konzistentan između svake od tri (3) doze. U svakoj dozi, izračunati DAR netaknutog AADC-a započeo je sa ~ 2 odmah nakon i u roku od 4 sati od primene, i ovaj odnos je pao na oko 1 približno 96 sati (tj. oko 4 dana) nakon doze.
Tabela 7: Odnos leka i aktiviranog antitela
PRIMER 14: Farmakokinetički parametri anti-CD71-AADC kod Cinomolgus majmuna
[0350] Ovaj primer prikazuje farmakokinetičke parametre anti-humanih CD71 aktiviranih antitela sa konjugovanim toksinima (AADC) iz sadašnjeg pronalaska kod Cinomolgus majmuna.
[0351] Koncentracije ukupnih i intaktnih aktiviranih antitela u plazmi (anti-CD71 TF02.13-2011) određene su na način opisan u Primerima 9 i 11. Kao što je prikazano u Tabeli 8, srednja Cmaxza dati analit je bazirana na maksimalno uočenoj koncentraciji u plazmi. Srednja vrednost AUC0-7je bazirana na površini ispod krive koncentracije u plazmi u vremenskom perodu od 0 do 7 dana. Procene poluvremena života za ukupno konjugovano aktivirano antitelo, intaktno konjugovano aktivirano antitelo i konjugovani MMAE su bile u rasponu od 2,5 do 6,3 dana. Procene poluvremena života nisu generisane za nekonjugovani MMAE.
Tabela 8: Odnos leka i aktiviranog antitela
PRIMER 15: Analiza antitela na lekove
[0352] Ovaj primer opisuje upotrebu premošćujućeg testa za praćenje stvaranja antitela na lekove (ADA) kod testiranih životinja.
[0353] Uzorci plazme za ADA analizu su sakupljeni pre studije i 7 dana nakon druge doze. Antitela protiv leka su otkrivena kod 3 od 9 životinja doziranih u studiji.
[0989]
PRIMER 16: In vitro citotoksičnost konjugovanih aktiviranih antitela protiv CD71
[0354] Ovaj primer opisuje in vitro analize citotoksičnosti na humanim ćelijskim linijama dobijenim od tumora od intaktnih i aktiviranih anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela iz sadašnjeg pronalaska u poređenju sa izotipskim kontrolnim ADC.
[0355] Primer in vitro citotoksične aktivnosti konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (HC od SEK ID BR: 167 i LC od SEK ID BR: 169), sa ili bez prethodne obrade sa matriptazom, procenjena je i upoređena sa izotipskom kontrolom konjugovanih antitela koja se ne vezuju za CD71 (AB095-vcMMAE sa DAR odnosom od 2, gde je AB095 specifičan za tetanusni toksin). Citotoksičnost ispitivanih proizvoda je testirana na HT29 (humana ćelijska linija kolorektalnog karcinoma), H292 (humana ćelijska linija karcinoma pluća), H520 (humana ćelijska linija karcinoma pluća) i HCC1806 (humana ćelijska linija karcinoma dojke) inkubacijom svakog ispitivanog proizvoda sa svakom ćelijskom linijom tokom 5 dana, a zatim merenjem održivosti ćelija u opsegu koncentracija svakog ispitivanog proizvoda da bi se odredila vrednost EC50za svaki ispitivani proizvod. Rezultati su sumirani u nastavku u Tabeli 9.
Tabela 9: Vrednosti EC50 analize citotoksičnosti in vitro u humanim tumorskim ćelijama
[0356] Ovi primerni rezultati pokazuju da je citotoksičnost in vitro intaktnog anti-CD71 konjugovanog antitela sposobnog da se aktivira bila slična onoj od kontrolnog izotipa, ali je značajno povećana nakon aktivacije matriptazom.
PRIMER 17: Fc vezivanje i aktivacija komplementa od strane konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71
[0357] Ovaj primer pokazuje sposobnost anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela iz sadašnjeg pronalaska da posreduju u mehanizmima zasnovanim na efektorskoj funkciji, kao što je ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).
[0358] Deo fragmenta IgG antitela koji se može kristalizovati (Fc), može da posreduje u raznim funkcijama, od kojih se neke dešavaju vezivanjem za Fc receptore i C1q. Ove funkcije uključuju indukciju citokina, ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) preko aktivacije klasičnog mehanizma sistema komplementa, fagocitozu i homeostazu antitela kroz reciklažu IgG-a. (Ravetch i sar., Annu Rev Immunol., 2001; 19: 275-290; Roopenian i sar., Nat Rev Immunol.2007;7:715-725).
[0359] Homeostaza antitela je regulisana delimično od strane neonatalnog receptora u vezi sa Fc, FcRn, koji je prisutan na intestinalnim epitelnim ćelijama, vaskularnim endotelnim ćelijama i profesionalnim ćelijama koje predstavljaju antigen. Unutar ćelije, FcRn je prisutan
1
u vezikulama; u kiselim endozomima pri niskom pH može vezati Fc deo IgG-a koji je preuzet pinocitozom. IgG se zatim oslobađa kada se endozomi recikliraju na površinu ćelije kao rezultat izlaganja vanćelijskom neutralnom pH. Ovaj postupak omogućava kontrolu prometa IgG-a preko jednoslojnih epitelnih barijera i štiti molekule IgG-a od katabolizma, produžavajući poluživot IgG u serumu. (Roopenian). Zaista se pokazalo da mutacije koje pojačavaju vezivanje FcRn pri niskom pH, ali održavaju nisko vezivanje pri fiziološkom pH, imaju duži poluživot u serumu. (Hinton i sar., J Biol Chem.2004;279:6213-6216; Hinton i sar., J Immunol. 2006; 176:346-356)
[0360] Humani sistem FcγR je sastavljen od oba aktivirajućih (FcγRI, FcγRIIa i FcγRIIIa) i inhibitornih (FcγRIIb) receptora. FcγRI, receptor za IgG1 sa visokim afinitetom, izražen je pomoću ćelija monocitne loze. (Li i sar, J Immunol. 2008;181 : 1012-1018) FcγRIIa je više izraženi IgG receptor sa malim afinitetom koji poželjno vezuje imuno komplekse. (Littaua i sar., J Immunol., 1990; 144: 3183-3186) FcγRIIb je uglavnom eksprimiran na monocitnoj liniji i B ćelijama i inhibitor je IgG receptora sa niskim afinitetom. Nakon vezivanja FcγRIIb za IgG komplekse, blokirani su svi procesi zavisni od kalcijuma kao što su degranulacija, fagocitoza, ADCC, oslobađanje citokina i proinflamatorna aktivacija. (Clynes i sar., Nat. Med., 6: 446-446 (2000); Minard-Colin i sar., Blood, 112: 1205-1213 (2008); i Hamaguchi i sar., J. Exp. Med., 203: 743-753 (2006). FcγRIIIa je receptor sa niskim afinitetom odgovoran za ADCC aktivnost NK ćelija. (Ravetch) Da bi se povećala raznolikost Fcγ receptora, postoje polimorfne varijante FcγRIIa (H131 vs. R131) i FcγRIIIa (V158 vs. F158) koje imaju razlike u afinitetima za molekule IgG-a. (Bruhns i sar., Blood, 2008; 113: 3716-3725).
[0361] Sposobnost antitela da posreduju u različitim funkcijama preko FcγR ili efektorskih sistema komplementa dozvoljava mogućnost nenamenjene, preterane farmakološke aktivnosti u konstruisanim biološkim agensima na bazi IgG-a. Nepoznata unakrsna reaktivnost na limfocitima periferne krvi sposobna je da pokrene umrežavanje Fcγ receptora. Budući da interakcije unakrsnog vezivanja Fcγ receptora mogu da posreduju u različitim funkcijama, uključujući indukciju citokina, ADCC i fagocitozu (Ravetch), važno je odrediti kapacitet terapijskih antitela da vežu neželjene ciljeve u krvi ili tkivima.
Analize vezivanja FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa i FcRn metodama površinske plazmonske rezonance
[0362] Rekombinantni humani FcγRII & FcγRIII uhvaćeni su putem 6xHis-oznake da bi se procenilo njihovo vezivanje za Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE, anti-CD71 Ab21.12
1 1
(IgG1/ κ), AB095-MMAE-E2 i AB095 (IgG1/κ) površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore).
Mišja antitela protiv 6xHis su direktno imobilisana na CM5 čipu spajanjem amina prema protokolu proizvođača do gustine od 10000 RU. Humani FcγR-ovi su zatim uhvaćeni na protočnim ćelijama 2, 3 i 4 da bi se postigao nivo hvatanja FcγR receptora od 250-500 RU. Protočna ćelija 1 je korišćena kao referentna površina. Kao propuštajući pufer korišćen je HBS-EP pufer (GE, Healthcare). Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2, anti-CD71 Ab21.12 (IgG1/κ), AB095-MMAE-E2, AB095 (IgG1/κ) i trastuzumab (IgG1/κ) injektovani su preko svih protočnih ćelija pri brzini protoka od 50 μL/minuti tokom jednog do dva minuta (jedan minut za FcγRIIb i FcγRIIa H131, i dva minuta za FcγRIIIa F158 i FcγRIIIa V158) pri koncentracijama u opsegu od 46,9 do 12000 nM za FcγRII i 7,8 do 4000 nM za FcγRIII (dvostruko serijsko razblaživanje za oba), praćeno vremenom disocijacije od jednog do pet minuta (jedan minut za FcγRIIb, FcγRIIa H131 i pet minuta za FcγRIIIa F158 i FcγRIIIa V158). Površine čipa su obnovljene injektovanjem 100 mM HCl pri brzini protoka od 100 μL/minuti u toku dve sekunde preko sve četiri protočne ćelije. Tri eksperimenta sa upotrebom tri različita CM5 čipa su izvedena za svaki uzorak (svaki u duplikatu) kako bi se prilagodile sve vrste eksperimentalnih grešaka (instrumenta, površine i operatera). Rezultati ova tri eksperimenta su bili prosečni.
[0363] Za analizu vezivanja FcRn, Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2, Anti-CD71 TF02.13-2011 (IgG1/κ bez vc-MMAE), AB095-vcMMAE-E2 (nespecifično, monoklonsko humano antitetanusno toksoidno IgG1/κ antitelo koje sadrži MMAE sa obogaćenim DAR = 2), AB095 (nespecifično, monoklonsko humano antitetanusno toksoidno IgG1/κ antitelo) i trastuzumab (IgG1/κ) su direktno imobilisani na CM5 čipu aminskim kuplovanjem prema protokolu proizvođača do gustine od 500 RU. Hu FcRn je injektovan preko svih protočnih ćelija pri brzini protoka od 50 μL/minuti tokom jednog minuta, pri koncentracijama u rasponu od 5,5 do 12000 nM (trostruko serijsko razblaženje), praćeno vremenom disocijacije od dva minuta. Površine su regenerisane sa injekcijom od 100 mM HCl tokom dve sekunde, a zatim HBS-EP , pH 7,4. Uzorci su pripremljeni i propušteni u dva protičuća puferska sistema, MES-EP pH 6,0 i HBS-EP pH 7,4. Tri eksperimenta sa upotrebom tri različita CM5 čipa su izvedena za svaki uzorak (svaki u duplikatu) kako bi se uzele u obzir greške instrumenta, površine i operatera. Rezultati ova tri eksperimenta su bili prosečni.
[0364] Svi podaci o rekombinantnim humanim FcγRIIIa V158 i FcγRIIIa F158 su podešeni prema modelu podešavanja vezivanja 1: 1 sa Rmax fiksiranim lokalno kako bi se objasnila varijabilnost nivoa zadržavanja. Podaci o vezivanju za rekombinantni humani FcγRIIb,
1 2
FcγRIIa H131 i FcRn prilagođeni su modelu afiniteta u stanju dinamičke ravnoteže. Za uklapanje svih podataka korišćen je softver za procenu Biacore T200, verzija 2.0.
Rezultati
[0365] Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 sadrži humani Fc IgG1/κ izotipa. Očekivano je da se vezuje za FcγRI, FcγIIa, FcγIIb, FcγIII, u skladu sa drugim antitelima divljeg tipa IgG1/κ. Vezivanje Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 za FcγR je analizirano površinskom plazmonskom rezonancom, ELISA kompeticionim vezivanjem FcγRI ELISA (rezultati nisu prikazani) i ELISA kompeticionim vezivanjem FcγRIII (rezultati nisu prikazani) i vezivanje Anti -CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 sa komplementom je analizirano funkcionalnim testovima aktivacije komplementa kod čoveka i cinomolgusa (rezultati nisu prikazani). Ovi testovi su poređeni sa komercijalnim i sopstveno generisanim humanim antitelima. Klinički kvalitet humanog anti-HER2, IgG1/κ, trastuzumab materijala korišćen je kao pozitivna kontrola za testove vezivanja FcγR. Poznato je da Fc receptori i komplement vezuju IgG1 antitela divljeg tipa. (Ravetch; Roopenian; Burton i sar., Nature.1980; 288:338-344; Hughes-Jones i sar., Mol Immunol., 1979; 16: 697-701; i Hezareh i sar., J Virol.2001;75: 12161-12168). Ispitivanjem Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE otkriveno je da ono vezuje FcγRI, FcγIIa H131, FcγRIII i FcRn, mada je primećeno umereno smanjeno vezivanje za FcγRIII (pomoću SPR) u poređenju sa pozitivnom kontrolom, trastuzumabom. Vezivanje Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 za FcγRIIb bilo je isuviše slabo za određivanje, jer je palo ispod granice detekcije Biacore instrumenta na 1,0 e-05 KD. (videti Tabele 10A i 10B).
Tabela 10A: Vezivanje anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela za FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa pomoću površinske plazmonske rezonance
1
Tabela 10B: Površinska plazmonska rezonanca vezivanje humanog FcRn
[0366] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) ocenjena je procenom sposobnosti anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela da aktivira humani i cinomolgusni serumski komplement hvatanjem iC3b (humani) ili C3 (cino) pomoću ELISA, za CDC.
[0367] Kao što je prikazano u primerima rezultata na slici 12, vezivanja naznačenih ispitivanih proizvoda u naznačenim koncentracijama za iC3b su prikazana kao test za aktivaciju humanog komplementa. Anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 vezuje iC3b u testu aktivacije komplementa i u humanom i u serumu cinomolgusa, ali u manjem stepenu od pozitivne kontrole, 7C6 antitela, koje je korišćeno u CDC testu. Kao negativna kontrola korišćeno je antitelo 7C6.7 sa naznačenim mutacijama. Vezivanje iC3b od anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 takođe je bilo niže od njegovog duplikata nekonjugovanog aktiviranog antitela (anti-CD71-TF02.13-2011).
PRIMER 18: Oslobađanje citokina u humanim PBMC
1 4
[0368] Ovaj primer je pokazao da, iako anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 ne vezuje mononuklearne ćelije periferne krvi kod čoveka ili cinomolgusa (PBMC), IgG1 antitela su sposobna da unakrsno vezuju Fcγ receptore na limfocitima periferne krvi, čime posreduju u različitim funkcijama, uključujući indukciju citokina.
[0369] Sposobnost anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 ili anti-CD71-TF02.13-2011 da indukuju oslobađanje citokina in vitro u humanim PBMC ćelijama, procenjena je u rastvorljivom ili obliku čvrste faze (vezanom za ploče) za sledeće citokine: interleukin (IL)-1β, IL 6, IL 2, interferon (IFN)γ i i faktor alfa nekroze tumora (TNFα). Za eksperiment u čvrstoj fazi, mononuklearne ćelije periferne krvi od 8 zdravih humanih donora dodate su na polipropilenske ploče prethodno obložene sa 0,96 μg ispitivanog proizvoda i isprane nakon 1,5 sata. Supernatant je sakupljen za analizu nakon 48 sati. Trastuzumab i nevezujuća izotipska kontrola ADC, AB095-vcMMAE E2, korišćeni su kao negativne kontrole. Korišćene su tri pozitivne kontrole: antitela koja stimulišu T ćelije, TGN1412 ili visilizumab i B ćelije i lipopolisaharid koji stimuliše mijeloidne ćelije (LPS). Kod 1 od 8 testiranih davaoca primećeno je značajno oslobađanje 3 od 5 izmerenih citokina, IL-1β, IL-6 i TNFα, kao odgovor na oba anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 i AB095-vcMMAE-E2. Oslobađanje IL-6 i TNFα je primećeno kod 2 dodatna davaoca od 8 kao odgovor na oba anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 i AB095-vcMMAE E2. Tri davaoca su testirana u ispitivanju solubilnog prikaza koji je bio 24-časovni test prezentacije ćelija visoke gustine.
[0370] U ovoj studiji, izmereno je oslobađanje citokina iz PBMC-a humanog donora nakon stimulacije sa pred-oblaganjem 0,96 μg/bazenčiću sa anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 i anti-CD71-TF02.13-2011 (IgG1 κ). Trastuzumab je korišćen kao negativna kontrola antitela IgG1 κ. AB095-vcMMAE-E2 i AB095 (IgG1 κ) su korišćeni kao izotipska kontrolna antitela. TGN1412, visilizumab i lipopolisaharid (LPS) su dodati kao pozitivne kontrole za oslobađanje citokina. Vrednosti ispitivanih proizvoda prikazane zadebljano i u okvirenim svetlim površinama koji izazivaju oslobađanje citokina veće od 2 puta nego oslobađanje od strane trastuzumaba.
[0371] Kao što je prikazano u primerima rezultata u Tabeli 11, anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 ne izaziva oslobađanje citokina iznad nivoa indukovanog od strane negativne kontrole trastuzumaba. Oslobađanje citokina je takođe procenjeno kod 3 donora cinomolgus majmuna, u obliku čvrste faze za sledeće citokine: IL-1β, IL-6, IL-2, IFNγ, IL-8 i IL 10. Anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 izaziva proizvodnju IL-8 malo iznad nivoa podloge, kao što je definisano pomoću trastuzumaba, kod 1 od 3 ispitivana donora. U toksikološkim
1
studijama ne-GLP i GLP kod cinomolgus majmuna za anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2, akutni klinički simptomi reprezentativni za oslobađanje citokina nisu primećeni pri nijednom nivou doze.
Tabela 11: Oslobađanje citokina humanih PBMC-a kao odgovor na konjugovano aktivirano antitelo protiv CD71 na čvrstoj fazi i drugih ispitivanih proizvoda.
1
(nastavak)
1
(nastavak)
PRIMER 19: Antitumorska efikasnost Anti-CD71 AADC u modelu mišjeg ksenografta SW-48
[0372] Ovaj primer pokazuje efikasnost anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska u modelu ksenografta tumora kod miša, koristeći SW-48 ćeliju (humani kolorektalni rak).
[0373] U ovoj primernoj studiji, pojedinačne intraperitonealne injekcije anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) u naznačenim dozama primenjivane su grupama od 8 miševa, a srednja zapremina tumora je primećena tokom vremena. Kao što je prikazano na slici 13 i tabeli 12, opseg inhibicije ukupnog rasta (TGI) za 23 dana u poređenju sa kontrolnim nosačem je primećen pri svim dozama, sa potpunom regresijom tumora primećenom pri dozama od 6 i 12 mg/ kg.
Tabela 12: Inhibicija rasta tumora ksenografta nakon lečenja Anti-CD71 AADC
PRIMER 20: Antitumorska efikasnost Anti-CD71 AADC u DLBCL PDX modelu miša
[0374] Ovaj primer pokazuje efikasnost anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska u pet (5) modela ksenografta (PDX) koji potiču od tumora miša, koristeći
1
HuPrime difuzni veliki B-ćelijski limfom (DLBCL) izveden od pacijenta kod ženki SCID-a ili NOG miševa.
[0375] U ovoj primernoj studiji, grupe od 3 miša su ustanovljene sa potkožnim tumorima (100 - 200 mm<3>) i primenjeno im je 6 mg/kg anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) ili kontrolni nosač 0 dana i 7. dana. Kao što je prikazano u primerima rezultata na slici 14, ispitivani proizvod AADC je postigao > 100% TGI u 4 od 5 modela i 72% TFI u 1 modelu u poređenju sa kontrolnom grupom nosača. Kompletni odgovori (tj. odsustvo merljivog tumora na završetku studije) u modelima kojima je primenjen AADC primećeni su kod 2 od 3 miša za LY2345, 3 od 3 miša za model LY6933, 2 od 3 miša za model LY6934 i 2 ili 3 miša za model LY2318. Nisu primećeni potpuni odgovori za model LY3604. Ovi primerni rezultati pokazuju da je AADC iz sadašnjeg pronalaska ispoljio efikasnost, sve do potpunog odgovora u nekim modelima.
PRIMER 21: Antitumorska efikasnost Anti-CD71 AADC u modelima miša TumorGraft PDX
[0376] Ovaj primer pokazuje efikasnost konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71 iz sadašnjeg pronalaska u devet (9) modela ksenografta kod miša dobijenih od tumora pacijenta (PDX), koristeći TumorGraft humani karcinom dojke dobijen od pacijenta (CTG-0437, CTG-0869, CTG -1059), nesitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC) (CTG-1082, CTG-0860, CTG-0160, CTG-1012) i karcinom malih ćelija glave i vrata (HNSCC) (CTG-1140, CTG-1082) u golim miševima.
[0377] U ovoj primernoj studiji, uspostavljene su grupe od 3 miša za svaki PDX model sa potkožnim tumorima (150-300 mm<3>) i primenjeno im je 6 mg/kg anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) ili kontrolni nosač 0 i 7 dana. Kao što je prikazano u primerima rezultata na slikama 15A, 15B i 15C, ispitivani proizvod AADC postigao je > 100% inhibicije rasta tumora (TGI) u 6 od 9 modela u tri indikacije karcinoma. Kod ovih 6 modela u kojima je primećeno > 100% TGI, 6 od 18 miševa koji su primili AADC postigli su potpuni odgovor (tj. odsustvo merljivog tumora na kraju studije). Kod 2 dodatna modela, uočeno je 92% i 78% TGI za HNSCC i NSCLC, respektivno. Jedan NSCLC model nije odgovorio na AADC. Kao što je prikazano u ovim primernim rezultatima, AADC iz sadašnjeg pronalaska je pokazao efikasnost, uključujući kompletne odgovore u nekim slučajevima, na PDX modelu izvedenom iz različitih tipova humanih karcinoma.
1
PRIMER 22: Antitumorska efikasnost Anti-CD71 AADC u HuPrime pankreasnom modelu PDX-a kod miša
[0378] Ovaj primer pokazuje efikasnost anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela iz sadašnjeg pronalaska u modelu mišjeg ksenografta (PDX) koji je izveden od pacijenta, koristeći HuPrime humani karcinom pankreasa koji potiče od pacijenta (PA6237) u SCID miševima.
[0379] U ovoj primernoj studiji, ustanovljena je grupa od 3 miša sa potkožnim tumorima (100 - 200 mm<3>) i kojima je primenjeno 3 ili 6 mg/kg anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (AADC) ili kontrolni nosač 0. i 7. dana. Kao što je prikazano u primerima rezultata na slici 16, ispitivani proizvod AADC je postigao > 100% inhibicije tumorskog rasta (TGI) pri 3 i 6 mg/kg. U ovoj grupi sa 6 mg/kg, primećeno je 3 od 3 potpuna odgovora do 59. dana, dok je grupa sa 3 mg/kg održavala potpun odgovor do 31. dana, praćen ponovnim rastom tumora.
PRIMER 23: Pilot studije toksičnosti koje nisu GLP konjugovanog aktiviranog antitela protiv CD71
[0380] Ovaj primer pokazuje relativne toksičnosti anti-CD71 konjugovanog aktivirajućeg antitela (AADC) anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 prema sadašnjem pronalasku, pri doznim nivoima u rasponu od 6 do 18 mg/kg do anti-CD71 konjugovanih antitela (ADC) Ab21.12-vcMMAE E2 pri doznim nivoima u rasponu od 0,6 do 6 mg/kg kod majmuna cinomolgus (1-2 majmuna po polu u grupi) nakon IV bolus injekcije ili jednom na svake 3 nedelje (Q3W) ili jednom svake 2 nedelje (Q2W). Terminalne autopsije su rađene na ispitivanim životinjama 29. dana (7 dana nakon poslednje doze). Procene tokom studije uključivale su kliničke simptome, telesnu težinu, unos hrane, kliničku patologiju, anatomsku patologiju, TK i imunogenost. Rezime pilot studije toksičnosti prikazan je u tabeli 13.
Tabela 13: Pilot studija toksičnosti koja nije GLP kod Cinomolgus majmuna
11
[0381] Primećena je ozbiljna toksičnost koja se manifestovala pogrbljenim držanjem tela, smanjenom aktivnošću i povišenjem telesne temperature u grupama koje su primile visoku dozu CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (18 mg/kg), učestale doze CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 (doziranje 1. i 15. dana), ili nemaskirani konjugat leka i roditeljskog antitela protiv CD71 (ADC) (Ab21.12-vcMMAE E2) pri 6 i 2 mg/kg. Kada se mogao utvrditi uzrok smrti, određeno je da je ona bila sekundarna infekcija u odnosu na supresiju imunskog sistema povezanu sa lekom.
[0382] Nalazi u vezi sa ispitivanim proizvod bili su slični za CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 i Ab21.12-vcMMAE E2 i sastojali su se prvenstveno od hematološke toksičnosti. Ključni nalazi uključuju (1) mortalitet pripisan sekundarnoj infekciji primećen u grupama koje su primile pojedinačnu dozu CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 pri 18 mg/kg, CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 prvog dana i petnaestog dana pri 8 mg/kg, ili pojedinačnu dozu ADC-a (Ab21.12-vcMMAE E2) pri ≧ 2 mg/ kg, (2) smanjenje telesne težine 2 nedelje nakon doze, sa oporavkom za 3 nedelje nakon doze pri ≧ 12 mg/kg CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2, (3) smanjenje mase crvenih krvnih zrnaca u zavisnosti od doze i svih populacija leukocita sa delimičnim do potpunim oporavkom primećenim 3 nedelje nakon doze, (4) privremeno povećanje nivoa trombocita 2 nedelje nakon doze, (5) blago do umereno povećanje fibrinogena, smanjenje albumina i povećanje globulina, (6) blago do umereno smanjenje celularnosti koštane srži, slezine i timusa, sa odgovarajućim težinskim smanjenjem u timusu i slezini. Smanjena celularnost je takođe primećena u nekoliko limfoidnih tkiva.
[0383] U ovoj primernoj studiji, najviše tolerisane doze CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 i Ab21.12-vcMMAE E2 (odgovarajući ADC) u ovim studijama su bile 12 mg/kg i 0,6 mg/kg, respektivno, primenjene jednom svake 3 nedelje po 2 doze.
PRIMER 24: GLP studije toksičnosti anti-CD71 konjugovanih aktiviranih antitela
[0384] Ovaj primer pokazuje GLP studiju toksičnosti ponovljenog doziranja kod cinomolgus majmuna, anti-CD71 konjugovanog aktiviranog antitela (AADC) anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 iz sadašnjeg pronalaska, pri doznim nivoima od 0, 2, 6 ili 12 mg/kg 1. i 22. dana putem intravenske bolus injekcije. Dozne grupe su prikazane u Tabeli 14.
Tabela 14: GLP studija toksičnosti kod Cinomolgus majmuna
[0385] U ovoj primernoj studiji, svakoj grupi od 6 mužjaka i 6 ženki majmuna doziran je anti-CD71-TF02.13-2011-VCMMAE E2 ili nosač (IV bolus naznačene doze 1. i 22. dana) kako je prikazano u Tabeli 14. Terminalne autopsije su izvršene 29. dana, a autopsije obnavljanja su izvršene 64. dana. Procene toksičnosti su uključivale smrtnost, kliničke znake, promene telesne težine, konzumiranje hrane, kliničku patologiju, anatomsku patologiju, oftalmološke preglede i procene funkcije kardiovaskularnog, respiratornog i centralnog nervnog sistema. Studija je uključivala TK analizu i procenu stvaranja ADA. Izneta su sledeća primerna zapažanja. Rezime izabranih rezultata studije GLP toksičnosti anti-CD71 TF02.13- 2011-vcMMAE E2, sa DAR od ~ 2, u poređenju sa odgovarajućim studijama koje nisu GLP nemaskiranog konjugata leka i antitela protiv CD71 (ADC) Ab21.12-vcMMAE E2 (koji takođe ima DAR od ~ 2), rezimiran je u Tabeli 15.
Tabela 15: Rezultati GLP studije toksičnosti kod Cinomolgus majmuna
[0386] Nije bilo efekata povezanih sa AADC-om na telesne mase, potrošnju hrane, brzinu disanja, elektrokardiografiju, koagulaciju i parametre analize urina, niti bilo kakvih neuroloških efekata, očnih efekata ili grubih patoloških nalaza.
[0387] Smrtnost povezana sa AADC-om primećena je pri dozama od 12 mg/kg; 1 ženka je uginula 10. dana, a 2 ženke su eutanazirane 11. dana u opadajućem kliničkom stanju. Klinička patologija i mikroskopski nalazi povezani sa AADC kod ovih životinja bili su slični onima prisutnim kod životinja koje su preživele zakazanu autosiju (29. dan), sa izuzetkom mikroskopskih dokaza o bakterijskoj infekciji, za koju se smatralo da je posledica imunosupresije povezane sa AADC-om.
[0388] Kao što je prikazano u tabeli 15, anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 je pokazao višu podnošljivost u odnosu na Ab21.12-vcMMAE E2, bez uočljivog gubitka telesne težine. Kao što je prikazano, Ab21.12-vcMMAE E2 nije imao podnošljivost u roku od 8 dana od jedne
11
doze pri 2 mpk, dok je anti-CD71-TF02.13-2011-vcMMAE E2 obezbedio ≧ 10 puta veću zaštitu od nemaskiranih, Ab21.12- vcMMAE E2.
[0389] Klinički znaci povezani sa AADC-om kod životinja doziranih sa 12 mg/kg sa preživljavanjem do predviđene autopsije su bile lezije kože/rane u skladu sa infekcijom koje su korelirale sa smanjenjem populacije leukocita i znacima odgovora u akutnoj fazi (smanjenje albumina i holesterola i povećanje globulina, ukupnog bilirubina i triglicerida).
[0390] Promene hematoloških parametara pri dozi ≧ 6 mg/kg nakon prve doze sastojale su se od smanjenja mase crvenih krvnih zrnaca, retikulocita i svih podskupova leukocita, zajedno sa povećanjem trombocita. Hematološke promene pri 2 mg/kg bile su ograničene na blago povećane trombocite nakon prve i druge doze.
[0391] Promena kliničko-hemijskih parametara u vezi sa AADC-om nakon prve doze je najuočljivija pri 12 mg/kg i sastojala se od odgovora akutne faze (smanjenja albumina i holesterola i povećanja globulina, triglicerida [samo ženke], ukupnog bilirubina) i povećanja azota uree (samo jedinke) i kreatinina, a smanjenja fosfora. Kliničko-hemijske promene pri 6 mg/kg uočene su tek nakon prve doze i bile su ograničene na minimalno povišeni bilirubin i povećane globuline kod pojedinih ženki.
[0392] Hematološki i klinički hemijski nalazi povezani sa AADC-om oporavljeni su do kraja faze oporavka.
[0393] Mikroskopski nalazi povezani sa AADC-om u terminalnoj eutanaziji bili su prisutni u timusu, nadbubrežnoj žlezdi i koštanoj srži pri 6 mg/kg/dozi. Nalazi na mestu injektovanja primećeni su u svim grupama i tumačeni su da su povezani sa postupkom primene, a ne specifično sa AADC-om. Težina timusa je smanjena kod mužjaka majmuna doziranih sa 12 mg/kg i ženki majmuna doziranih sa 6 mg/kg, što je histološki bilo u korelaciji sa smanjenom celularnošću, posebno kore timusa. Težina nadbubrežne žlezde je bila povećana kod mužjaka majmuna doziranih sa 12 mg/kg, a kod ženki majmuna doziranih sa 6 mg/kg, a histološki korelat je bila adrenokortikalna hipertrofija. Smanjena celularnost je bila prisutna u koštanoj srži, posebno u butnoj kosti, kod mužjaka majmuna doziranih sa 6 mg/kg. Posle 6-nedeljnog intervala bez doze smanjena celularnost timusa i adrenokortikalna hipertrofija nisu bili prisutni, u skladu sa potpunim oporavkom od ovih promena. Povećana celularnost koštane srži je postojala, ali sa smanjenom težinom, u skladu sa delimičnim oporavkom.
PRIMER 25: Konjugacija MMAE sa CD71 aktiviranim antitelom i metode snižavanja DAR-a rezultujućeg CD71 konjugovanog aktiviranog antitela na približno DAR 3
[0394] Ovaj primer opisuje metode koje su korišćene za konjugaciju vc-MMAE sa antitelom aktiviranim protiv CD71, anti-CD71 TF02.13-2011, da bi se kreiralo anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE sa sadržajem leka od 2 MMAE molekula za svaki molekul anti-CD71 TF02.13-2011, pored metoda korišćenih za obogaćivanje DAR-a na oko 3.
Metoda konjugacije
[0395] Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE obogaćen E2 - U rastvor anti-CD71 TF02.13-2011 (13,95 mg/mL) 39 g rastvora, 544 mg, 3,5 nmol) dodato je 0,5 M EDTA (0,39 mL) i TCEP (0,77 mL, 10 mM u WFI, 7,7 nmol, 2,2 ekvivalenta) na 2-8 ° C preko noći. Redukovano antitelo je zatim razblaženo sa DMSO (2,29 mL), tretirano sa vcMMAE u DMSO (1,89 mL 9,49 mM vcMMAE u DMSO, 17,9 nmol, 5,1 ekvivalenata) na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Konjugovano antitelo je tretirano sa N-acetil cisteinom (0,29 mL 100 mM u WFI, 29 nmol, 8,2 ekvivalenta) da bi se ugasio višak vcMMAE. Ugašeni rastvor je analiziran pomoću HIC (hromatografije hidrofobnih interakcija) za DAR vrste > E4 (vrste višeg DAR, 20,9% u gornjem preparatu).
Metoda obogaćivanja do nižeg DAR-a
[0396] Reakcija konjugacije je suspendovana sa HIC smolom, poput onih komercijalno dostupnih od Tosoh Biosciences (Toyopearl alkil kao primer), u delovima na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi se smanjo visoki DAR vrsta na ciljni nivo (obično < 2%). Tretirani rastvor je filtriran i smola je isprana uzastopno sa PBSE (125 mM kalijum fosfat, 150 mM NaCl, 6,3 mM EDTA, pH 7,2, 22 g), praćeno PBS-om (5 mM kalijum fosfat, 200 mM NaCl, pH 7, 35 g). Kombinovani filtrat i ispiranja su koncentrovana i razmenjena puferom upotrebom isečenog centrifugnog filtera od 30 kD molekularne težine, a zatim razblažena komponentama formulacije za skladištenje.
[0397] Dobijeni proizvod je sadržao 228 mg (A2806,5 mg/mL) i pokazalo se da ima DAR od oko 2,9 mereno iz komercijalno dostupne HIC kolone i da predstavlja sledeće karakteristike i DAR vrste: SEC 98,7% monomer, 0,2% viša molekulska težina, 1,1% niža molekulska težina, endotoksin < 0,06 EU/mg, vrste DAR-a veće od E4 bile su manje od 2% površine; DAR E0 je bio oko 6,2% površine, DAR E2 je bio oko 40,7% površine, a DAR E4 je bio oko 46,8% površine).
11
[0398] U ovde opisanim primerima, ovaj obogaćeni DAR proizvod se naziva „anti-CD71 TF02.13 -2011-vc-MMAE (sa prosečnim DAR od ~ 3)“
PRIMER 26: Konjugacija MMAE sa CD71 aktiviranim antitelom i metode obogaćivanja DAR-a rezultujućeg CD71 konjugovanog aktiviranog antitela do oko DAR 2 ("E2")
[0399] Ovaj primer opisuje metode koje su korišćene za spajanje vc-MMAE sa antitelom aktiviranim protiv CD71, anti-CD71 TF02.13-2011, da bi se kreiralo anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE sa sadržajem leka od 2 MMAE molekula za svaki molekul anti-CD71 TF02.13-2011, pored metoda korišćenih za obogaćivanje DAR-a na oko 2.
Metoda konjugacije
[0400] Anti-CD71 TF02.13-2011-vc-MMAE E2 - Rastvor anti-CD71 TF02.13-2011 (20,3 mg/ mL) razblažen je sa 1457 g PBSE (125 mM kalijum fosfata, 150 mM NaCl, 6,3 mM EDTA, pH 7,7) i ohlađen na 4 ° C. Ohlađenom rastvoru dodat je TCEP (10 mM u WFI, 30,2 mL, 0,30 mmol, 1,5 ekvivalenta) i održavan na 4 ° C tokom 15 sati. Redukovanom antitelu, dodat je rastvor vc-MMAE (1,056 g, 0,80 mmol, 4 ekvivalenata) u DMSO (300 g) dodat je uz hlađenje, a zatim je isprano DMSO (65 g), nakon čega je rastvor ostavljen da se zagreje do sobne temperature. Nakon 3,5 h, dodat je N-acetil cistein (0,262 g, 1,60 mmol, 8 ekvivalenata) da bi se ugasio višak vc-MMAE i reakciona smeša je čuvana na 2-8 ° C do prečišćavanja.
Metoda obogaćivanja do nižeg DAR-a
[0401] Proizvod je prečišćen u delovima na komercijalno dostupnim kolonama za prečišćavanje HIC poput onih koje su komercijalno dostupne od GE Life Sciences (alkil sefaroza), koristeći gradijent amonijum sulfata/fosfatnih pufera pri pH 7,1 sa kontrolom na 280 nm pomoću UV. Sakupljeni bazen proizvoda DAR 2 (približno 9,5 g, prinos 30%) puferski je izmenjen sa puferom na pH 6,0 pomoću TFF koristeći membrane Pellicon 3 Ultracel 30 kD, a zatim razblažen komponentama formulacije za skladištenje.
[0402] Pokazano je da nastali proizvod (A280 6,4 mg/mL) ima DAR od oko 2 meren komercijalno dostupnom HIC kolonom i da čini sledeće karakteristike i vrste DAR-a: SEC 99,6% monomer, 0,2% HMW, 0,2% LMW, Endotoksin < 0,06 EU/mg i DAR E2 iznosio je oko 99,0% površine, sa varijabilnošću između 94 i 99% DAR E2.
11
[0403] U ovde opisanim primerima, ovaj obogaćeni DAR 2 („E2“) proizvod se naziva „anti-CD71 TF02.13-2011-vcMMAE E2“.
PRIMER 27: Procena biofizičkih karakteristika E2 naspram vrsta viših DAR-ova u pretkliničkim modelima miša
[0404] Prečišćen ali ne-HIC-om, konjugovani proizvod dobijen postupkom opisanim u Primeru 25 propušten je preko HIC kolone koristeći standardne pufere i postupke kako je ovde opisano. Kao što je prikazano na slici 18 A, identifikovan je niz vrsta sa punjenjem lekom između 0 i 8.
[0405] Prečišćeni E2 proizvod dobijen iz Primera 26 podvrgnut je istoj HIC hromatografiji. Kao što je prikazano na Slici 18B, primećena je samo jedna vrsta koja sadrži punjenje lekom od 2.
[0406] Neprečišćeni i E2 proizvodi su radio-obeleženi i injektovani miševima da bi se procenio ukupan klirens i toksičnost svakog proizvoda. Kao što je prikazano na slici 18C, prikazano je da prečišćeni E2 proizvod ima značajno niži klirens u odnosu na neprečišćeni proizvod sa visokim sadržajem leka.
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
�
11
12
1
��
1
�
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
�
11
12
�
14
�
1
1
�
1
�
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
�

Claims (1)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Konjugovano aktivirano antitelo koje sadrži strukturu Formule (I) ili njene soli:
    Formula (I) (a) gde (i) AB je antitelo koje se specifično vezuje za humani CD71 i sadrži i. varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu CDRH1 koja sadrži SEK ID BR: 9, sekvencu CDRH2 koja sadrži SEK ID BR: 10 i sekvencu CDRH3 koja sadrži SEK ID BR: 11; i ii. varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu CDRL1 koja sadrži SEK ID BR: 12 ili SEK ID BR: 13, sekvencu CDRL2 koja sadrži SEK ID BR: 14 i sekvencu CDRL3 koja sadrži SEK ID BR: 15; (ii) MM je maskirajući deo koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 18, pri čemu MM inhibira vezivanje AB za humani CD71 kada je konjugovano aktivirano antitelo u nerazgrađenom stanju; (iii) LP1 je prvi vezujući ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 207; (iv) CM je cepljivi ostatak koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 156, gde je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu; i (v) LP2 je drugi vezujući ostatak koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 38; i (b) gde je "n" 2. 2 2. Konjugovano aktivirano antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da AB sadrži izotip IgG1. 3. Konjugovano aktivirano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time, da je AB antitelo koje ima konstantan region teškog lanca i gde C-terminalni ostatak konstantnog regiona teškog lanca nije lizin. 4. Konjugovano aktivirano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time, da varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 5 i varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR : 7. 5. Konjugovano aktivirano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koje sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 19. 6. Konjugovano aktivirano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 5 i varijabilni region lakog lanca sadrži koji sekvencu SEK ID BR : 201. 7. Konjugovano aktivirano antitelo prema patentnom zahtevu 6, koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 5 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR : 202. 8. Konjugovano aktivirano antitelo prema patentnom zahtevu 6, koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 5 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 202, gde je N-terminalna aminokiselina od SEK ID BR: 202 modifikovana u piroglutamat. 9. Konjugovano aktivirano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, koje sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 169. 10. Konjugovano aktivirano antitelo prema patentnom zahtevu 9, koje sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 170. 11. Konjugovano aktivirano antitelo prema patentnom zahtevu 9, koje sadrži teški lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 167 i laki lanac koji sadrži sekvencu SEK ID BR: 170, gde je N-terminalna aminokiselina od SEK ID BR : 170 modifikovana u piroglutamat.
RS20210341A 2017-10-14 2018-10-12 Anti-cd71 aktivirani konjugati leka-antitela i metode njihovog korišćenja RS61596B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762572467P 2017-10-14 2017-10-14
EP18797311.0A EP3691692B8 (en) 2017-10-14 2018-10-12 Anti-cd71 activatable antibody drug conjugates and methods of use thereof
PCT/US2018/055733 WO2019075417A1 (en) 2017-10-14 2018-10-12 CONJUGATES OF MEDICAMENT ANTI-CD71 ACTIVATED ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61596B1 true RS61596B1 (sr) 2021-04-29

Family

ID=64110112

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210341A RS61596B1 (sr) 2017-10-14 2018-10-12 Anti-cd71 aktivirani konjugati leka-antitela i metode njihovog korišćenja

Country Status (36)

Country Link
US (3) US20190111150A1 (sr)
EP (2) EP3834846A1 (sr)
JP (2) JP7374891B2 (sr)
KR (4) KR102529359B1 (sr)
CN (1) CN111278467B (sr)
AR (1) AR115178A1 (sr)
AU (1) AU2018346969A1 (sr)
BR (1) BR112020007302B1 (sr)
CA (1) CA3077730A1 (sr)
CL (1) CL2020000977A1 (sr)
CO (1) CO2020005685A2 (sr)
CR (1) CR20200206A (sr)
CY (1) CY1123968T1 (sr)
DK (1) DK3691692T3 (sr)
DO (1) DOP2023000150A (sr)
EC (1) ECSP20025198A (sr)
ES (1) ES2864013T3 (sr)
HR (1) HRP20210436T8 (sr)
HU (1) HUE054037T2 (sr)
IL (1) IL273586A (sr)
LT (1) LT3691692T (sr)
MA (1) MA50752B1 (sr)
MD (1) MD3691692T2 (sr)
MX (1) MX2020003723A (sr)
PE (1) PE20210125A1 (sr)
PH (1) PH12020550417A1 (sr)
PL (1) PL3691692T3 (sr)
PT (1) PT3691692T (sr)
RS (1) RS61596B1 (sr)
RU (2) RU2022111211A (sr)
SG (1) SG11202003378WA (sr)
SI (1) SI3691692T1 (sr)
SM (1) SMT202100184T1 (sr)
TW (2) TW202330039A (sr)
UY (1) UY37931A (sr)
WO (1) WO2019075417A1 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130116404A1 (en) 2011-11-08 2013-05-09 Case Western Reserve University Targeted non-invasive imaging probes of egfr expressing cells
BR112017023862A2 (pt) 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
DK3635009T3 (da) 2017-06-07 2026-03-30 Regeneron Pharma Sammensætninger og fremgangsmåder til internalisering af enzymer
PL3691692T3 (pl) * 2017-10-14 2021-07-19 Abbvie Inc. Koniugaty lek-aktywowalne przeciwciało anty-cd71 i sposoby ich wykorzystania
US12258597B2 (en) 2018-02-07 2025-03-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for therapeutic protein delivery
WO2019183633A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Case Western Reserve Univeristy Psma targeted conjugate compounds and uses thereof
BR112020023145A2 (pt) 2018-05-17 2021-02-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. anticorpo anti-cd63 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, molécula de ligação ao antígeno biespecífica, proteína terapêutica de múltiplos domínios, polinucleotídeo composição farmacêutica, e, composto
CN121754667A (zh) * 2020-04-08 2026-03-31 阿里亚达治疗公司 用于血脑屏障递送的组合物和方法
JP2023521384A (ja) * 2020-04-09 2023-05-24 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能抗体を含む組成物
CN116194470B (zh) * 2020-07-23 2025-10-03 达因疗法公司 肌肉靶向复合物及其用途
US20250332265A1 (en) 2021-11-09 2025-10-30 Case Western Reserve University Psma targeted conjugate compounds and uses thereof
CN120659627A (zh) * 2022-07-29 2025-09-16 瑞泽恩制药公司 用于转铁蛋白受体（tfr）介导的脑和肌肉递送的组合物和方法
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
WO2025133132A1 (en) * 2023-12-20 2025-06-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Novel anti-tfr1 (cd71) antibodies for cancer treatment

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0279862B1 (en) 1986-08-28 1993-11-03 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
AU2006284651C1 (en) 2005-08-31 2013-09-12 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CN101888856B (zh) * 2007-11-07 2014-08-27 塞尔德克斯医疗公司 结合人树突和上皮细胞205(dec-205)的抗体
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
AU2010241706B2 (en) * 2009-04-29 2015-07-09 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. ERG monoclonal antibodies
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
WO2012104344A1 (en) * 2011-02-01 2012-08-09 Genmab A/S Human antibodies and antibody-drug conjugates against cd74
PL2809683T3 (pl) * 2012-01-31 2019-03-29 Sbi Biotech Co., Ltd. Przeciwciało przeciwko fosfolipazie D4
EP2882844B1 (en) 2012-08-10 2018-10-03 Cytomx Therapeutics Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
CN103145847B (zh) * 2013-02-05 2014-05-21 浙江大学 一种抗cd20抗体-海兔毒素偶联物及其制备方法和应用
BR112017023862A2 (pt) * 2015-05-04 2018-07-17 Cytomx Therapeutics Inc anticorpos anti-cd71, anticorpos anti-cd71 ativáveis, e métodos de uso destes
CN106237341B (zh) * 2016-07-12 2019-07-30 浙江大学 一种抗体偶联药物及其制备方法和应用
PL3691692T3 (pl) * 2017-10-14 2021-07-19 Abbvie Inc. Koniugaty lek-aktywowalne przeciwciało anty-cd71 i sposoby ich wykorzystania

Also Published As

Publication number Publication date
RU2771292C2 (ru) 2022-04-29
RU2020115713A (ru) 2021-11-16
CR20200206A (es) 2021-02-18
RU2022111211A (ru) 2022-05-05
PH12020550417A1 (en) 2021-04-12
MA50752B1 (fr) 2021-03-31
DOP2023000150A (es) 2023-08-31
HRP20210436T8 (hr) 2022-01-07
SMT202100184T1 (it) 2021-05-07
HUE054037T2 (hu) 2021-08-30
RU2020115713A3 (sr) 2022-02-25
PL3691692T3 (pl) 2021-07-19
AR115178A1 (es) 2020-12-09
MX2020003723A (es) 2020-07-22
US20190111150A1 (en) 2019-04-18
KR20230004932A (ko) 2023-01-06
EP3691692B1 (en) 2020-12-30
WO2019075417A1 (en) 2019-04-18
AU2018346969A1 (en) 2020-04-23
CN111278467B (zh) 2024-07-30
SI3691692T1 (sl) 2021-04-30
KR20220045088A (ko) 2022-04-12
JP2020537649A (ja) 2020-12-24
CY1123968T1 (el) 2022-05-27
JP2024012366A (ja) 2024-01-30
TWI780237B (zh) 2022-10-11
CA3077730A1 (en) 2019-04-18
PT3691692T (pt) 2021-03-29
CN111278467A (zh) 2020-06-12
KR102529359B1 (ko) 2023-05-09
BR112020007302B1 (pt) 2023-01-31
SG11202003378WA (en) 2020-05-28
LT3691692T (lt) 2021-05-10
PE20210125A1 (es) 2021-01-19
MD3691692T2 (ro) 2021-05-31
HRP20210436T1 (hr) 2021-04-30
DK3691692T3 (da) 2021-03-22
TW202330039A (zh) 2023-08-01
JP7374891B2 (ja) 2023-11-07
IL273586A (en) 2020-05-31
BR112020007302A2 (pt) 2020-09-29
KR102385495B1 (ko) 2022-04-15
CO2020005685A2 (es) 2020-05-15
TW201927815A (zh) 2019-07-16
KR20230070046A (ko) 2023-05-19
EP3691692B8 (en) 2021-05-26
EP3691692A1 (en) 2020-08-12
US20240115724A1 (en) 2024-04-11
US20210145978A1 (en) 2021-05-20
KR20200070324A (ko) 2020-06-17
ES2864013T3 (es) 2021-10-13
ECSP20025198A (es) 2020-06-30
CL2020000977A1 (es) 2020-09-11
UY37931A (es) 2019-04-30
EP3834846A1 (en) 2021-06-16
MA50752A (fr) 2020-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7781254B2 (ja) マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能なおよびセリンまたはシステインプロテアーゼ切断可能な基質ならびにそれらの使用方法
RS61596B1 (sr) Anti-cd71 aktivirani konjugati leka-antitela i metode njihovog korišćenja
TWI787796B (zh) 抗ｃｄ７１抗體類、可活化之抗ｃｄ７１抗體類及使用彼等之方法
CN107849133B (zh) 抗cd166抗体、可活化抗cd166抗体及其使用方法
JP6826055B2 (ja) 抗ｐｄｌ１抗体、活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
KR20190134654A (ko) Cd147 항체, 활성화가능한 cd147 항체, 그리고 이를 만들고, 이용하는 방법
RS63276B1 (sr) Supstrati koji mogu da se seku matriksnom metaloproteazom i serin proteazom i postupci njihove upotrebe
CN107922490A (zh) 抗ITGa3抗体、可活化抗ITGa3抗体及其使用方法
HK40025681A (en) Anti-cd71 activatable antibody drug conjugates and methods of use thereof
HK40025681B (en) Anti-cd71 activatable antibody drug conjugates and methods of use thereof
BR112017015468B1 (pt) Polipeptídeos isolados, composição farmacêutica compreendendo-os, uso terapêutico destes, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, método para produzir um polipeptídeo isolado e método para fabricar um anticorpo ativável que, em um estado ativado, se liga a um alvo
BR122022003994B1 (pt) Polipeptídeos isolados, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, uso terapêutico dos mesmos, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, bem como métodos de produzir um polipeptídeo isolado e de fabricar um anticorpo ativável que, em um estado ativado, se liga a um alvo