ES2864712T3

ES2864712T3 - Compuesto inhibidor de FGFR4 cristalino y usos del mismo

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Publication number: ES2864712T3
Application number: ES16718153T
Authority: ES
Inventors: George Moniz; Kristen Sanders; Arani Chanda; Kenshi Yoshida
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2036-04-13
Also published as: WO2016168331A1; SG10201810057UA; US20180093972A1; RU2017139246A; CA2982562C; AU2020257131A1; RU2763328C2; IL254974A0; AU2016248056B2; CN107660200A; AU2016248056A1; JP6431622B2; US11498916B2; IL254974B; JP2018188465A; SG11201708472WA; EP3283465A1; CN107660200B; RU2017139246A3; JP2021050231A

Abstract

Una forma de base libre cristalina del compuesto: **(Ver fórmula)** N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)- 1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4- etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Description

DESCRIPCIÓN

Compuesto inhibidor de FGFR4 cristalino y usos del mismo

Antecedentes

Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) son una familia de más de 20 proteínas relacionadas estructuralmente con una diversidad de actividades biológicas. Sus principales receptores, los receptores de factores de crecimiento de fibroblastos (FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4), son una familia de receptores tirosina quinasas que se unen al FGF y están involucrados en procesos de proliferación y diferenciación celular. La desregulación de las redes de señalización de FGFR está implicada en una serie de condiciones fisiopatológicas, incluidos muchos cánceres humanos.

Se sabe que el "receptor 4 del factor de crecimiento de fibroblastos" o "FGFR4" regula la proliferación y la antiapoptosis y se expresa o se expresa de forma elevada en muchos cánceres. Véase, por ejemplo, Dieci et al. 2013, Cancer Discovery, 0F1-0F16. Se ha demostrado en estudios que la expresión de FGFR4 es un factor predictivo de un fenotipo más agresivo del cáncer, y la desactivación o la reducción de la expresión de FGFR4 sirve para reducir la proliferación y promover la apoptosis. Véase, por ejemplo, Wesche et al. 2011, Biochem J 437: 199-213.

Por ejemplo, la expresión o la sobreexpresión de FGFR4 se asocia con la agresividad del cáncer en cáncer gástrico (Ye et al. 2011, Cancer, 5304-5313), cáncer de prostata (Xu et al. 2011, BMC Cancer, 11 ;84), un sarcoma tal como un rabdomiosarcoma (Taylor VI et al. 2009, J Clin Invest, 119 (11): 3395-3407), cáncer de piel tal como un melanoma (Streit et al. 2006, British J Cancer, 94: 1879-1886), cáncer de hígado tal como un colangiocarcinoma (Sia et al. 2013, Gastroenterology 144: 829-840) y un carcinoma hepatocelular (French et al. 2012, PLoS ONE 7 (5): e367313; Miura et al. 2012, BMC Cancer 12:56; Chiang et al. 2008, Cancer Res 68 (16): 6779-6788; Sawey et al. 2011, Cancer Cell 19: 347-358), cáncer de páncreas tal como una neoplasia intraepitelial pancreática y un adenocarcinoma ductal pancreático (Motoda et al. 2011, Int'l J Oncol 38: 133-143), cáncer de pulmón tal como el cáncer de pulmón de células no pequeñas (Fawdar et al. 2013, PNAS 110 (30): 12426-12431), cáncer colorrectal (Pelaez-Garcia et al. 2013, PLoS ONE 8 (5): e63695; Barderas et al.2012, Proteomics J 75: 4647-4655) y cáncer de ovario (Zaid et al.2013, Clin Cancer Res 19: 809-820).

El desarrollo clínico de varios inhibidores de FGFR ha confirmado su utilidad como agentes antitumorales. Dieci et al.

2013, Cancer Discovery, 0F1-0F16. No obstante, son necesarios nuevos agentes que sean útiles para dirigirse a FGFR, y a FGFR4 en particular.

El documento WO2006/000420 se refiere a compuestos descritos como heteroarilarilureas que son útiles para el tratamiento de enfermedades dependientes de proteína quinasa. El documento WO2015/957938 describe determinados compuestos útiles como inhibidores de FGFR4.

Además, en la fabricación de productos farmacéuticos, el compuesto debe encontrarse en una forma que pueda manipularse y procesarse convenientemente. A este respecto, la estabilidad química y la estabilidad física del compuesto activo son consideraciones importantes. Preferentemente, el compuesto y las composiciones farmacéuticas que lo contienen pueden almacenarse eficazmente durante largos periodos de tiempo sin mostrar un cambio significativo en sus características físico-químicas.

Sumario

La presente divulgación comprende una forma cristalina del compuesto:

1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida

Una forma cristalina puede ser una forma de base libre, una forma de sal clorhidrato, una forma de sal monoclorhidrato, una forma de sal de diclorhidrato o una forma de sal etanosulfonato.

La presente invención proporciona una forma de base libre cristalina de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (compuesto 108):

-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida

(compuesto 108)

En algunas formas de realización, el compuesto de forma de base libre cristalina proporciona picos en un espectro de difracción de rayos X en polvo (PXRD) al menos en uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de los siguientes intervalos de valores de 20Q: 7,8-8,2, 10,1-10,5, 14,6-15,0, 16,3-16,7, 16,9-17,3 y 21,6-22,0. Por ejemplo, el compuesto puede mostrar al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis valores de 20° (± 0,2°) seleccionados del grupo que consiste en: 8,0, 10,3, 14,8, 16,517,1 y 21,8. En algunas formas de realización, el compuesto de base libre cristalina se caracteriza por un patrón PXRD sustancialmente tal como se indica en la figura 5 (FIG. 5). En algunas formas de realización, la forma de base libre cristalina del compuesto proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 10,3, 8,0 y 9,5; al menos 10,3, 8,0, 9,5, 14,8, 16,5 y 17,1; o al menos 10,3, 8,0, 9,5, 14,8, 16,5, 17,1, 19,3, 21,8, 23,7 y 24,5.

En algunas formas de realización, la forma de base libre cristalina se caracteriza por una curva de calorimetría diferencial de barrido (DSC) sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 7 (FIG. 7).

En algunas formas de realización, el compuesto en forma de base libre cristalina se caracteriza sustancialmente por una RMN de 13C sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 10 (FIG. 10).

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, una sal monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina. En algunas formas de realización, la sal monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 26,6, 19,9 y 11,3; al menos 26,6, 19,9, 11,3, 9,0, 23,5 y 25,4; o al menos 26,6, 19,9, 11,3, 9,0, 23,5, 25,4, 27,6, 23,0, 18,1 y 29,0. En algunas formas de realización, la sal monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina se caracteriza por un espectro PXRD sustancialmente similar al que se muestra en la figura 13 (FIG. 13).

En algunas formas de realización, la sal monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina se caracteriza por una RMN de 13C sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 11 (FIG. 11).

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, una forma cristalina de sal diclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida. En algunas formas de realización, la sal diclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 26,6, 22,8 y 21,3; al menos 26,6, 22,8, 21,3, 8,0, 26,2 y 13,5; o al menos 26,6, 22,8, 21,3, 8,0, 26,2, 13,5, 12,4, 16,1, 28,0 y 18,7. En algunas formas de realización, la sal diclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina se caracteriza por un espectro PXRD sustancialmente similar al que se muestra en la figura 16 (FIG. 16).

En algunas formas de realización, la sal diclorhidrato de /V-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina se caracteriza por una RMN de 13C sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 14 (FIG. 14).

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, una forma cristalina de sal etanosulfonato de A/-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida. En algunas formas de realización, la sal etanosulfonato de A/-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 19,2, 15,1 y 23,3; al menos 19,2, 15,1, 23,3, 20,3, 11,2 y 21,8; o al menos 19,2, 15,1, 23,3, 20,3, 11,2, 21,8, 9,4, 22,4, 23,6 y 24,0. En algunas formas de realización, la sal etanosulfonato de /V-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida cristalina se caracteriza por un espectro PXRD sustancialmente similar al que se muestra en la figura 19 (FlG. 19).

En algunas formas de realización, la sal etanosulfonato de /V-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina se caracteriza por una RMN de 13C sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 17 (FIG. 17).

Un propósito adicional es una composición farmacéutica que comprende un compuesto en forma cristalina tal como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas formas de realización, la composición se formula para administración oral o parenteral.

Otro propósito es un procedimiento para producir una forma de base libre cristalina del compuesto:

A/-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida

Dichos procedimientos pueden incluir una o más de las etapas siguientes:

b) añadir un ácido a dicha composición a una velocidad tal que se mantenga la temperatura de la composición a < 50 °C (por ejemplo, < 30, 20 o 15 °C);

c) dejar que la composición formada en la etapa b) se caliente (por ejemplo, a temperatura ambiente); y a continuación

d) añadir la composición a una solución saturada de hidróxido de amonio (por ejemplo, fría, tal como a 0-5 °C) a una velocidad tal que se mantenga la temperatura de la composición a < 25 °C; y a continuación

e) extraer la composición con una mezcla de disolventes inmiscibles (por ejemplo, diclorometano/metanol) para formar una fase orgánica; y

f) añadir un disolvente adecuado a la fase orgánica,

para formar de este modo dicha forma de base libre cristalina del compuesto.

Un propósito adicional es un procedimiento de tratamiento de un carcinoma hepatocelular en un sujeto con necesidad de ello, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz para el tratamiento de un compuesto en forma cristalina tal como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, el carcinoma hepatocelular ha alterado el estado de FGFR4 y/o FGF19 (por ejemplo, ha aumentado la expresión de FGFR4 y/o FGF19).

Un propósito adicional es un procedimiento de tratamiento de un carcinoma hepatocelular en un sujeto con necesidad de ello, que comprende: detectar un estado alterado de FGFR4 y/o FGF19 (por ejemplo, un aumento en la expresión de FGFR4 y/o FGF19) en una muestra biológica que contiene células de dicho carcinoma hepatocelular, y si dicho carcinoma hepatocelular presenta dicho estado alterado de FGFR4 y/o FGF19, administrar un compuesto en forma cristalina tal como se describe en el presente documento a dicho sujeto en una cantidad de tratamiento eficaz. Un propósito adicional es el uso de un compuesto en forma cristalina tal como se describe en el presente documento en un procedimiento de tratamiento de un carcinoma hepatocelular.

Un propósito adicional es el uso de un compuesto en forma cristalina tal como se describe en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un carcinoma hepatocelular.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta los resultados de análisis de eficacia in vivo en un modelo de carcinoma hepatocelular utilizando células HUH7. Se administró el compuesto 108 (25 mg/kg o 37,5 mg/kg) o el vehículo de control mediante inyección intraperitoneal y se midió el volumen tumoral dos veces por semana a lo largo del transcurso de 15 días.

La figura 2 presenta los resultados de análisis de eficacia in vivo en un modelo de carcinoma hepatocelular utilizando células HEP3B. Se administró el compuesto 108 (12,5 mg/kg, 25 mg/kg o 37,5 mg/kg) o vehículo de control mediante inyección intraperitoneal y se midió el volumen tumoral dos veces por semana a lo largo del transcurso de 15 días. La figura 3 presenta los resultados de análisis de eficacia in vivo en un modelo de carcinoma hepatocelular utilizando células JHH7. Se administró el compuesto 108 (12,5 mg/kg, 25 mg/kg o 37,5 mg/kg) o vehículo de control mediante inyección intraperitoneal y se midió el volumen tumoral dos veces por semana a lo largo del transcurso de 15 días. La figura 4 presenta los resultados de análisis de eficacia in vivo comparativos en un modelo de carcinoma hepatocelular utilizando células HEP3B. Se administró el compuesto 108 (25 mg/kg, 37,5 mg/kg o 50 mg/kg) dos veces al día mediante inyección intraperitoneal, o BGJ398 (30 mg/kg o 60 mg/kg) por vía oral dos veces al día. La figura 5 presenta un espectro PXRD obtenido a partir de la forma de base libre cristalina del compuesto 108. La figura 6 presenta una superposición de los espectros PXRD de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 de tres lotes.

La figura 7 presenta una curva DSC de la forma de base libre cristalina del compuesto 108.

La figura 8 presenta una superposición de curvas DSC para tres lotes de la forma de base libre cristalina del compuesto 108.

Las figuras 9A-9D presentan el espectro de RMN de 1H consistente con la estructura del compuesto 108.

La figura 10 presenta un espectro de RMN de C13 de la forma de base libre cristalina del compuesto 108.

La figura 11 presenta un espectro de RMN de C13 de monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (es decir, la forma de sal monoclorhidrato cristalina del compuesto 108) obtenido en el ejemplo 10 del presente documento.

La figura 12 presenta un espectro de RMN de H1 de monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida obtenido en el ejemplo 10 del presente documento.

La figura 13 presenta un espectro PXRD de monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida obtenido en el ejemplo 10 del presente documento.

La figura 14 presenta un espectro de RMN de C13 de diclorhidrato de /V-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida (es decir, la forma de sal diclorhidrato cristalina del compuesto 108) obtenido en el ejemplo 13 del presente documento.

La figura 15 presenta un espectro de RMN de H1 de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida obtenido en el ejemplo 13 del presente documento.

La figura 16 presenta un espectro PXRD de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida obtenido en el ejemplo 13 del presente documento.

La figura 17 presenta un espectro de RMN de C13 de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (es decir, la forma de sal etanosulfonato cristalina del compuesto 108) obtenido en el ejemplo 16 del presente documento.

La figura 18 presenta un espectro de RMN de H1 de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida obtenido en el ejemplo 16 del presente documento.

La figura 19 presenta un espectro PXRD de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida obtenido en el ejemplo 16 del presente documento.

Descripción detallada de formas de realización

En el presente documento se proporcionan formas cristalinas del compuesto:

1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida,

que es útil como inhibidor selectivo de FGFR4.

En algunas formas de realización, el compuesto cristalino es la forma de base libre de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida. Una forma de realización de la forma de base libre cristalina proporciona picos en un espectro de difracción de rayos X en polvo (PXRD) en uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de los siguientes intervalos de valores de 20°: 7,8-8,2; 10,1-10,5; 14,6-15,0; 16,3-16,7; 16,9-17,3; y 21,6-22,0. Por ejemplo, el compuesto cristalino en forma de base libre puede mostrar al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis valores seleccionados del grupo que consiste en 20° (± 0,2°): 8,0, 10,3, 14,8, 16,5 17,1 y 21.8, En algunas formas de realización, el compuesto de base libre cristalina se caracteriza por un patrón PXRD sustancialmente similar al que se muestra en la figura 5. En algunas formas de realización, la forma de base libre cristalina del compuesto proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20Q (± 0,2): al menos 10,3, 8,0 y 9,5; al menos 10,3, 8,0, 9,5, 14,8, 16,5 y 17,1; o al menos 10,3, 8,0, 9,5, 14.8, 16,5, 17,1, 19,3, 21,8, 23,7 y 24,5.

En algunas formas de realización, la forma de base libre cristalina se caracteriza por una curva de calorimetría diferencial de barrido (DSC) sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 7.

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, una sal monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina. En algunas formas de realización, la sal monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 26,6, 19,9 y 11,3; al menos 26,6, 19.9, 11,3, 9,0, 23,5 y 25,4; o al menos 26,6, 19,9, 11,3, 9,0, 23,5, 25,4, 27,6, 23,0, 18,1 y 29,0. Dicha forma de realización puede tener un espectro PXRD tal como se muestra en la figura 13.

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, una forma cristalina de sal diclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida. En algunas formas de realización, la sal diclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 26,6, 22,8 y 21,3; al menos 26,6, 22,8, 21,3, 8,0, 26,2 y 13,5; o al menos 26,6, 22,8, 21,3, 8,0, 26,2, 13,5, 12,4, 16,1,28,0 y 18,7. Dicha forma de realización puede tener un espectro PXRD tal como se muestra en la figura 16.

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la presente invención, una forma cristalina de sal etanosulfonato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida. En algunas formas de realización, la sal etanosulfonato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalina proporciona picos en los espectros de difracción de rayos X en polvo en los siguientes intervalos de 20° (± 0,2): al menos 19,2, 15,1 y 23,3; al menos 19,2, 15,1,23,3, 20,3, 11,2 y 21,8; o al menos 19,2, 15,1,23,3, 20,3, 11,2, 21,8, 9,4, 22,4, 23,6 y 24,0. Dicha forma de realización puede tener un espectro PXRD tal como se muestra en la figura 19.

Tal como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente tal como se muestra". "sustancialmente similar" o "sustancialmente tal como se indica" con referencia a datos tales como un espectro significan que el experto, al comparar dichos espectros obtenidos utilizando los mismos procedimientos de recopilación de datos, por ejemplo, tal como se muestra en la figura 6, concluiría que los espectros son lo suficientemente similares como para ser indicativos de la misma forma de base libre cristalina del compuesto tal como se enseña en el presente documento.

También se proporcionan procedimientos para sintetizar y cristalizar compuestos tal como se enseñan en el presente documento. Para una forma de base libre cristalina, los procedimientos pueden incluir una o más de las etapas siguientes:

f) añadir un disolvente adecuado a la fase orgánica, para formar de este modo dicha forma de base libre cristalina del compuesto.

Un compuesto cristalino tal como se presenta en el presente documento se puede combinar con un vehículo farmacéuticamente aceptable para proporcionar formulaciones farmacéuticas del mismo. La elección particular del vehículo y la formulación dependerá de la vía de administración particular a la que está destinada la composición. En algunas formas de realización, el vehículo se selecciona a fin de mantener la forma cristalina del compuesto antes de la administración.

"Vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un vehículo, coadyuvante o excipiente no tóxico que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el que se formula. En algunas formas de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable se selecciona a fin de mantener la forma de base libre cristalina del compuesto. Los vehículos, coadyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir, entre otros, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polietilenglicol y grasa de lana.

Las composiciones de la presente invención pueden ser adecuadas para administración por vía parenteral, oral, inhalatoria, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante depósito implantado, etc. En algunas formas de realización, la formulación comprende ingredientes procedentes de fuentes naturales o no naturales. En algunas formas de realización, la formulación o el vehículo se pueden proporcionar en forma estéril. Los ejemplos no limitantes de un vehículo estéril incluyen agua exenta de endotoxinas o agua exenta de pirógenos.

El término "parenteral", tal como se utiliza en el presente documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. En formas de realización particulares, los compuestos se administran por vía intravenosa, oral, subcutánea o intramuscular. Las formas inyectables estériles de las composiciones de la presente invención pueden ser una suspensión acuosa u oleosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica utilizando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión.

Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite fijo suave, incluidos monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, al igual que aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se utilizan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, incluidas emulsiones y suspensiones. También pueden utilizarse para fines de formulación otros tensioactivos utilizados comúnmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes que se usan comúnmente en la fabricación de formas farmacéuticas sólidas, líquidas u otras formas farmacéuticas aceptables.

Para la administración oral, se puede proporcionar un compuesto o una sal en una forma de dosificación oral aceptable, incluidas, pero sin limitación, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos utilizados habitualmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se pueden añadir agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo puede combinarse con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir determinados agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes. Además, también se pueden añadir conservantes. Los ejemplos adecuados de conservantes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, diversos agentes antibacterianos y antifúngicos tales como disolventes, por ejemplo, etanol, propilenglicol, alcohol bencílico, clorobutanol, sales de amonio cuaternario y parabenos (tales como metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, etc.).

Sujetos y procedimientos de uso

La forma cristalina del compuesto tal como se enseña en el presente documento puede utilizarse para tratar un carcinoma hepatocelular.

"Tratamiento", "tratar" y "tratando" se refieren a revertir, aliviar, retrasar el inicio, inhibir el progreso o mejorar de otra forma una enfermedad o trastorno tal como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, el tratamiento puede administrarse después de que se hayan desarrollado uno o más síntomas. En otras formas de realización, el tratamiento puede administrarse en ausencia de síntomas. Por ejemplo, el tratamiento puede administrarse a un individuo susceptible antes de la aparición de los síntomas (por ejemplo, a la luz de un historial de síntomas y/o a la luz de factores genéticos u otros factores de susceptibilidad).

El tratamiento también puede continuarse después de que los síntomas hayan desaparecido, por ejemplo, para prevenir o retrasar su recurrencia.

"Paciente" o "sujeto", tal como se utiliza en el presente documento, significa un sujeto animal, preferentemente un sujeto mamífero, y particularmente sujetos humanos (incluidos sujetos masculinos y femeninos, e incluidos sujetos neonatales, lactantes, juveniles, adolescentes, adultos y geriátricos). Los sujetos también pueden incluir otros sujetos mamíferos (por ejemplo, perro, gato, caballo, vaca, oveja, cabra, mono, ave, etc.), con fines de laboratorio o veterinarios.

En algunas formas de realización, se proporciona tratamiento a un sujeto que tiene un carcinoma hepatocelular con estado alterado de FGFR4 y/o FGF19 (factor de crecimiento de fibroblastos 19).

En algunas formas de realización, el tratamiento puede incluir, o puede realizarse junto con, el análisis (por ejemplo, la medición o la evaluación) del estado de FGFR4 y/o FGF19 en una muestra biológica que contiene células de dicho carcinoma hepatocelular, y si dicho carcinoma hepatocelular presenta una alteración de FGFR4 y/o FGF19, tratar a un sujeto con una cantidad de tratamiento eficaz de un agente activo tal como se describe en el presente documento.

"Estado alterado" tal como se utiliza en el presente documento con referencia a FGFR4 y/o FGF19 incluye un aumento de la expresión del mismo (por ejemplo, niveles aumentados del ARNm o niveles aumentados de la proteína), mayor número de copias en el genoma y/o mayor actividad de la proteína codificada como resultado de una mutación, etc., en comparación con un tejido no canceroso correspondiente. En algunas formas de realización, el estado alterado de FGFR4 y/o FGF19 incluye mutaciones de genes y/o proteínas codificadas que dan como resultado un aumento de la actividad o están asociadas de otro modo con una forma más agresiva de carcinoma hepatocelular.

"Expresión" de FGFR4 y/o FGF19 significa que un gen que codifica el mismo se transcribe y, preferentemente, se traduce. Normalmente, la expresión de una región codificante dará como resultado la producción del polipéptido codificado.

Se conocen las proteínas FGFR4 y FGF19, y su estado alterado y/o expresión alterada se pueden medir utilizando técnicas estándar en la técnica, por ejemplo análisis genómico de mutaciones o aberraciones en el número de copias tal como por amplificación de ácido nucleico, análisis de secuenciación y/o técnicas basadas en hibridación, análisis de expresión de ARN tal como inmunotransferencia Northern o qRT-PCR, inmunotransferencia Western u otra inmunotransferencia o inmunoensayo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), etc.

Para que la invención descrita en el presente documento se entienda más completamente, se exponen los ejemplos siguientes. Debe entenderse que estos ejemplos se presentan solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Procedimientos para la síntesis de:

-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida

(compuesto 108)

General:

El calentamiento por microondas se realizó utilizando un microondas Biotage Emrys Liberator o Initiator. La cromatografía en columna se llevó a cabo utilizando un Isco Rf200d. La eliminación del disolvente se llevó a cabo utilizando un evaporador rotatorio Büchi o un evaporador centrífugo Genevac. La CL/EM preparativa se llevó a cabo utilizando un autopurificador Waters y una columna XTerra de 5 micrómetros MS C18 de 19 x 100 mm en condiciones de fase móvil ácida. Los espectros de RMN se registraron utilizando un espectrómetro Varian de 400 MHz. Los resultados de los espectros de masas (EM) analíticos se obtuvieron utilizando un UPLC Waters Acquity equipado con un único detector EM cuadripolar (Waters SQD).

Condiciones de HPLC preparativa para purificación

Condiciones de cromatografía:

Instrumento: Waters 2767-SQD Mass trigger Prep System

Columna: Waters Xbridge C18150 mm * 19 mm * 5 pm

Detector: VWD SQD

Caudal: 15 ml/min

Tiempo de gradiente:

Tiempo (min) % de B

0 5

7,5 70

8 95

11 95

Fase móvil representativa:

1)

Fase móvil: A: TFA al 0,1% en agua

Fase móvil: B: ACN

2)

Fase móvil: A: NH⁴HCO³al 0,1% en agua

Fase móvil: B: ACN

3)

Fase móvil: A: NH4OAc al 0,1% en agua

Fase móvil: B: ACN

4)

Fase móvil: A: NH⁴OH al 0,1% en agua

Fase móvil: B: ACN

Definiciones: Las abreviaturas siguientes tienen los significados indicados:

ACN: Acetonitrilo

Boc²O: Dicarbonato de di-terc-butilo

Brettphos: 2-(Diciclohexilfosfino)-3,6-dimetoxi-2',4',6'-triisopropil-1, 1 '-bifenilo

tBuONa: Terc-butóxido de sodio

CH³I: Yodometano

Cs²CO³: Carbonato de cesio

DCC: N,N'-diciclohexilcarbodiimida

DCM: Diclorometano

DIEA: N,N-diisopropiletilamina

DIPEA: N,N-diisopropiletilamina

DMAP: 4-(Dimetilamino)piridina

DME: Dimetil éter

DMF: Dimetilformamida

DMSO: Dimetilsulfóxido

EGTA: Ácido etilenglicoltetraacético

ESI-EM: Espectrometría de masas con ionización por electropulverización

EtOH: Etanol

HATU: 3-oxido Hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-trizolo [4,5-b]piridinio

H²SO⁴: Ácido sulfúrico

iPrOH: Isopropanol

K²CO³: Carbonato de potasio

KHMDS: Bis(trimetilsilil)amida de potasio

KOH: Hidróxido de potasio

CL-EM: Cromatografía líquida - espectrometría de masas

MeOH: Metanol

MsCl: Cloruro de metanosulfonilo

NaBH3CN: Cianoborohidruro de sodio

NaBH(OAc)3: Triacetoxiborohidruro de sodio

NH4Cl: Cloruro de amonio

NH⁴HCO³: Bicarbonato de amonio

NaI: Yoduro de sodio

NaNO3 : Nitrato de sodio

NaOAc: Acetato de sodio

MTBE: Metil terc-butil éter

nBuOH: n-Butanol

prep-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución preparativa

prep-TLC: Cromatografía en capa fina preparativa

TBAF: Fluoruro de tetrabutilamonio

TBDMS-Cl: Cloruro de terc-butildimetilsililo

TBSCl: Cloruro de terc-butildimetilsililo

TBSOTf: Trifluorometanosulfonato de terc-butildimetilsililo

TEA: tTrietilamina

TESCl: Clorotrietilsilano

TFA: Ácido trifluoroacético

THF: Tetrahidrofurano

Ti(OIPr)4 : Isopropóxido de titanio

TLC: Cromatografía de capa fina

PPTS: p-Toluenosulfonato de piridinio

PE: Éter de petróleo

PEG: Poli(etilenglicol)

PtO²: Dióxido de platino

EtOAc: Acetato de etilo

Pd/C: Paladio (0) sobre carbono

Pd2(dba)3: Tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0)

Pd (dppf)²Cl²: [1,1'-Bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II)

Ruphos: 2-Diciclohexilfosfino-2',6'-diisopropoxibifenilo

Xantphos: 4,5-Bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno

Tal como se utilizan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido indique lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una sal de HCl" hace referencia a sales monoclorhidrato, sales diclorhidrato, sales 1,5-clorhidrato y otras sales clorhidrato estequiométricas y no estequiométricas.

W-[2-{6-[3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-metil-ureido]-pirimidin-4-ilamino}-5-(4-etil-piperazin-1 -il)-fenil]-acrilamidametano

a. 4-Bromo-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo

Se calentó una mezcla de 4-bromo-2-nitroanilina (4 g, 18,4 mmol), (Boc)2O (4,4 g, 20,24 mmol) a reflujo durante la noche en THF (50 ml). La mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice eluyendo con PE:EtOAc = 20:1 para obtener el compuesto del título (5,4 g, rendimiento: 93%). MS (ESI): 317, 319 [M+H]+.

b. 4-(4-Etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo

Una mezcla desgasificada de 4-bromo-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo (5,4 g, 17 mmol), 1 -etilpiperazina (2,91 g, 25,5 mmol), Pd2(dba)3 (2,1 g, 3,4 mmol), xantphos (3,92 g, 6,8 mmol) y Cs2CO3 (11,1 g, 34 mmol) en tolueno (85 ml) se calentó a 100 °C durante 4 horas. La reacción se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice eluyendo con MeOH:DCM = 1:50~1:20 para obtener el compuesto del título (3,3 g, rendimiento: 55%). MS (ESI): 351 [M+H]+.

c. 4-(4-Etilpiperazin-1 -il)-2-nitroanilina

A una solución de 4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo (3,3 g, 9,43 mmol) en DCM (50 ml) se añadió TFA (20 ml) a 0 °C, la mezcla resultante se agitó durante 3 horas a ta. Después de eliminar todos los compuestos volátiles al vacío, el residuo se volvió a disolver en DCM, se neutralizó con K²CO³acuoso saturado y se extrae con DCM. Los extractos combinados se concentraron para obtener el compuesto del título (2,1 g, rendimiento: 90%), que se utilizó directamente en la etapa siguiente. 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 5 1,02 (t, 3H), 2,36 (c, 2H),

d. N4-(4-(4-Etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenil)-N6-metilpirímidina-4,6-diamina

Una mezcla desgasificada de 4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitroanilina (2,1 g, 8,4 mmol), 6-cloro-N-metilpirimidin-4-amina (procedimiento 2A, etapa e; 1,2 g, 8,4 mmol), Pd2(dba)3 (1,54 g, 1,68 mmol), xantphos (1,94 g, 3,36 mmol) y Cs2CO3 (5,48 g, 16,8 mmol) en tolueno (45 ml) se calentó a 100 °C durante 1 hora. La reacción se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice eluyendo con MeOH:DCM = 1:40~1:20 para obtener el compuesto del título (870 mg, rendimiento: 29%). MS (ESI): 358 [M+H]+.

A una solución de N4-(4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenil)-N6-metilpirimidina-4,6-diamina (870 mg, 2,44 mmol) en THF (15 ml), se añadió NaH (60%, 200 mg, 5 mmol) a 0 °C y la mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió gota a gota una solución de 2,4-dicloro-3-isocianato-1,5-dimetoxibenceno (procedimiento 2A, etapas a-d; 908 mg, 3,66 mmol) en THF a 0 °C. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió una solución acuosa saturada de NH4Cl (2 ml) para inactivar la reacción. La mezcla se concentró y se extrajo con DCM. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SÜ4 anhidro y se concentraron para dar el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice para obtener el compuesto del título (330 mg, rendimiento: 21%) como un aceite rojo. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 51,44 (t, 3H), 3,01 (t, 2H), 3,21 (c, 2H), 3,41-3,49 (m, 5H), 3,73-3,80 (m, 4H), 3,92 (s, 6H), 6,27 (s, 1H), 6,55 (s, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,69 (s, 1H), 8,32 (d, 1H), 8,52 (s, 1H), 10,28 (s a, 1H), 12,05 (s a, 1H);MS (ESI): 605 [M+H]+.

f. 1-(6-(2-Amino-4-(4-etilpiperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilurea

A una solución de 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-(6-(4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenilamino)pirimidin-4-il)-1-metilurea (330 mg, 0,546 mmol) en THF (20 ml) y MeOH (20 ml) se añadió Ni Raney (suspensión en agua) a temperatura ambiente, la mezcla resultante se agitó durante 3 horas en atmósfera de hidrógeno (1 atm). La reacción se filtró y se concentró. El residuo se lavó dos veces con MeOH para obtener el compuesto del título (280 mg, pureza: 90%), que se utilizó directamente en la etapa siguiente. MS (ESI): 575 [M+H]+.

g. N-(2-(6-(3-(2,6-Dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-ilamino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se añadió una solución de 1-(6-(2-amino-4-(4-etilpiperazin-1-il)fenilamino)pirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilurea (280 mg, pureza: 90%, 0,44 mmol) en THF (30 ml) a una solución de cloruro de acriloílo en THF (20 mg/ml, 2 ml, 0,44 mmol) a -10 °C, y la la mezcla resultante se agitó durante 1 hora a esta temperatura. Se añadió MeOH (1 ml) para inactivar la reacción. La mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante prep-HPLC y prep-TLC para obtener el compuesto del título 108 (20 mg, rendimiento: 7%). 1H RMN (400 MHz, CDCh) 5 1,31 (t, 3H), 2,65 (c, 2H), 2,62-2,68 (m, 4H), 3,27 (s, 3H), 3,36-3,38 (m, 4H), 3,91 (s, 6H), 5,76 (d, 1H), 5,90 (s, 1H), 6,24 (dd, 1H), 6,41 (d, 1H), 6,52 (s, 1H), 6,74 (dd, 1H), 7,07 (s a, 1H), 7,23 (d, 1H), 7,72 (s a, 1H), 7,98 (s a, 1H), 8,37 (s, 1H), 12,52 (s, 1H); MS (ESI): 629 [M+H]+.

Ejemplo 2: Ensayos de actividad biológica

Ensayo de unión a FGFR4. Se preincubó FGFR4 recombinante purificado con compuesto 10 pM durante la noche a 4 °C o durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la preincubación, el FGFR4 se concentró y se intercambió el tampón en una columna C4 de concentración y desalado de proteínas OPTI-TRAP (Optimize Technologies). La proteína se eluyó en acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 0,1% y se procesó mediante inyección directa en un CL-EM Thermo Scientific Q Exactive™ para identificar el FGFR4 intacto modificado.

Los resultados proporcionados a continuación en la tabla 1 confirman la formación de aductos covalentes del compuesto de ensayo con los péptidos por correspondencia de la masa esperada del aducto péptido-ligando con la masa observada.

Tabla 1

Caracterización de CI⁵⁰de la inhibición de la actividad de quinasa. Los compuestos se caracterizaron por su actividad de inhibición de FGFR en Reaction Biology Corporation (Malvern, Pensilvania) con su ensayo Kinase HotSpotSM. Véase, Anastassiadis et al., 2011, Comprehensive assay of kinase catalytic activity reveals features of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol 29, 1039-1045.

Se prepararon FGFR1 (2,5 nM), FGFR2 (1 nM), FGFR3 (5 nM) o FGFR4 (12 nM) recombinantes (Invitrogen™) como una mezcla con sustrato KKKSPGEYVNIEFG (SEQ ID NO: 1) (20 pM, sustrato de FGFR1); y poli[E,Y] 4:1 (0,2 mg/ml, sustrato de FGFR2,3,4)] en tampón de reacción de quinasa (HEPES-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl²10 mM, MnCl²2 mM, EGTA 1 mM, Brij35 al 0,02%, Na3VO4 0,1 mM, 0,02 mg/ml de BSA, DTT 2 mM y Dm So al 1%). El compuesto se añadió a la mezcla de enzima/sustrato utilizando tecnología acústica (Labcyte® Echo 550, Sunnyvale, California) (véase Olechno et al., 2006, Improving IC50 results with acoustic droplet ejection. JALA 11,240-246) y se preincubó durante 0, 15 o 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la preincubación del compuesto, se añadió una mezcla de ATP (Sigma-Aldrich®) y 33P-y -ATP (PerkinElmer) hasta una concentración final de 10 pM para iniciar reacciones de quinasa. Las reacciones se incubaron durante 120 minutos a temperatura ambiente y después se vertieron sobre papel de filtro de intercambio iónico Whatman™ P81. El fosfato no unido se eliminó lavando exhaustivamente los filtros en ácido fosfórico al 0,75%. Veáse Anastassiadis et al., 2011, Comprehensive assay of kinase catalytic activity reveals features of kinase inhibitor selectivity. Nat Biotechnol 29, 1039-1045.

Los resultados para FGFR4 y FGFR1 se muestran en la tabla 2. El compuesto 108 mostró inhibición selectiva de FGFR4, con una CI⁵⁰más alta para FGFR1.

Tabla 2

Sin desear vincularse a ninguna teoría, la actividad de CI⁵⁰con respecto a FGFR1 es generalmente representativa de la actividad con respecto a FGFR1, FGFR2 y FGFR3. Véase también, Dieci et al., 2013, Fibroblast Growth Factor Receptor Inhibitors as a Cancer Treatment: From a Biologic Rationale to Medical Perspectives. Cancer Discovery, F1-F16.

Para realizar una confirmación, el compuesto también se analizó para determinar su inhibición de FGFR2 y FGFR3. Estos resultados que se muestran a continuación en la tabla 3 son consistentes con la actividad de CI⁵⁰de FGFR1, que es generalmente representativa de la actividad de FGFR1, FGFR2 y FGFR3, y demuestra además la selectividad de este inhibidor de FGFR4.

Tabla 3

Eficacia in vivo en modelos tumorales. Se evaluó la capacidad del compuesto 108 para inhibir el crecimiento tumoral en ratones desnudos portadores de xenoinjertos tumorales de tres líneas celulares tumorales de carcinoma hepatocelular (HCC) humano diferentes. Estas líneas celulares son representativas de cánceres que tienen un estado alterado de FGFR4 y/o FGF19. Véase Sawey et al., Cancer Cell 19 (3): 347-358 (2011).

Animales: Se adquirieron de Taconic (Taconic, Hudson, Nueva York) ratones desnudos, de 6 a 8 semanas de edad y con un peso aproximado de 19 a 25 g. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales.

Xenoinjertos de tumores y tratamiento: Se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) 7,5 x 106 células HUH7 (N° de catálogo HSRRB: JCRB0403), 5 x 106 Hep3B (N° de catálogo ATCC: HB8064) o 2,5 x 106 células JHH7 (N° de catálogo HSRRB: JCRB 1031), en cada caso en un volumen total de 100 gl, Matrigel 1:1 (Coming Inc, Corning, NY) en el flanco lateral derecho. Cuando los tumores alcanzaron 150-200 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento de 5-10 animales. La dosificación se realizó dos veces al día mediante inyección intraperitoneal a las dosis indicadas durante 15 días utilizando el compuesto 108, formulado en un vehículo de DMSO al 5% (Alfa Aesar, Ward Hill, MA), PEG300 al 10% (Sigma, St. Louis, MO), TWEEN® 80 al 8% (Sigma, St. Louis, MO), solución salina USP al 77% a la concentración deseada. Los volúmenes tumorales se registraron dos veces por semana utilizando la fórmula volumen = (longitud*anchura2)/2. También se recogieron los pesos corporales dos veces por semana. Todos los animales se observaron y se cuidaron de acuerdo con The Guide for Care and Use of Laboratory Animals, octava edición (National Academies Press, Washington D.C.).

Procedimientos de estadística: Se realizaron comparaciones estadísticas al final del experimento utilizando mediciones repetidas Anova con post-ensayo de Bonferroni para comparaciones de grupos de tratamiento, utilizando GraphPad Prism 5. Se utilizaron los criterios siguientes para determinar enfermedad progresiva, enfermedad estable, regresión parcial y regresión completa. La enfermedad progresiva se define como tres mediciones consecutivas que aumentan desde la mejor respuesta o > 120% del volumen tumoral inicial. Enfermedad estable son tres mediciones consecutivas < 120% y > 50% del volumen tumoral inicial, mientras que tres mediciones consecutivas < 50% del volumen tumoral inicial se califican como regresión parcial. Una regresión completa son tres mediciones consecutivas < 30 mm3. Se utilizó la prueba de Chi cuadrado para comparar las respuestas entre los grupos de tratamiento (Microsoft Excel).

Los resultados de animales que portan tumores de células cancerosas HUH7, HEP3B y JHH7 se muestran en las figuras 1-3, respectivamente, y también se reflejan en la tabla 4.

Tabla 4 - Inhibición del crecimiento tumoral en xenoinjertos de HCC amplificados con FGF19

Estos datos demuestran que el compuesto 108 es eficaz en todos los modelos. Entre los tres modelos, HEP3B es el más sensible, JHH7 el menos sensible y HUH7 muestra una sensibilidad intermedia al compuesto 108. Aunque puede observarse una respuesta a la dosis en la figura 3 para JHH7, hubo enfermedad progresiva en todos los niveles de dosis analizados.

Estudios comparativos del compuesto 108 con BGJ398. Se realizaron estudios comparativos con el compuesto 108 y el inhibidor de FGFR conocido BJG398.

Protocolo de ensayo de quinasa bioquímica para obtener CI⁵⁰: Se preparó FGFR1 recombinante (2,5 nM) o FGFR4 (12 nM) como una mezcla con el sustrato KKKSPGEYVNIEFG (SEQ iD NO: 1)(20 gM, sustrato de FGFR1); poli[E,Y] 4:1 (0,2 mg/ml, sustrato FGFR2,3,4)] en tampón de reacción de quinasa (HEPES-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl²10 mM, MnCl²2 mM, EGTA 1 mM, Brij35 al 0,02%, Na3VO40,1 mM, BSA 0,02 mg/ml, DTT 2 mM y DMs O al 1%). El compuesto se añadió a la mezcla de enzima/sustrato utilizando tecnología acústica y se preincubó durante 0, 15 o 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la preincubación del compuesto, se añadió 33P-y -ATP a una concentración final de 10 gM para iniciar reacciones de quinasa. Las reacciones se incubaron durante 120 minutos a temperatura ambiente. La fosforilación del sustrato se controló mediante un ensayo de filtro, como anteriormente. Los resultados se muestran en la tabla 5. Los resultados presentados muestran que el compuesto 108 es un inhibidor de FGFR4 más potente, mientras que BGJ398 es un inhibidor de FGFR1 más potente.

Tabla 5 - Análisis comparativo del compuesto 108 y BGJ398 con ensayo de quinasa bioquímico

Protocolo de ensayo de viabilidad celular para obtener GI⁵⁰: Se cultivaron líneas celulares a 37 °C, el 5% de CO²y el 95% de humedad. Los medios de cultivo se adquirieron de GIBCO®, Estados Unidos. Para el ensayo de viabilidad, se sembraron 2000 células/pocillo en placas de 96 pocillos, se incubaron durante 24 h antes del tratamiento con el compuesto. Después de la adición del compuesto, las placas se incubaron durante 72 h a 37 °C con el 5% de CO², y después se midieron mediante el ensayo CTG (ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo®, N° de catálogo: G7572, Promega). Los resultados se muestran en la tabla 6. La tabla muestra que el compuesto 108 es más potente que BGJ398 en células Hep3B, una línea amplificada de FGF19. La potencia en HUH7 y JHH7, las otras dos líneas amplificadas de FGF19, es comparable entre el compuesto 108 y BGJ398. HepG2 (N° de catálogo ATCC: HB-8065), SNU398 (N° de catálogo ATCC: CRL-2233) y SNU449 (N° de catálogo ATCC: CRL-2234) son líneas celulares no amplificadas FGF19 que se utilizaron como controles.

GI⁵⁰es la concentración del fármaco de ensayo en la que 100 x (T - T0)/(C - T0) = 50. Véase, por ejemplo, Monks et al., Feasibility of a High-Flux Anticancer Drug Screen Using a Diverse Panel of Cultured Human Tumor Cell Lines, J Natl Cancer Inst (1991) 83(11):757-766; Boyd et al., Data Display and Analysis Strategies for the NCI Disease-oriented In Vitro Antitumor Drug Screen, en CYTOTOXIC ANTICANCER DRUGS: MODELS AND CONCEPTS FOR DRUG DISCOVERY AND DEVELOp Me NT, Valeriote et al., Eds. (1990), páginas 11-34. La luminiscencia del pocillo de ensayo después de un periodo de 72 horas de exposición al fármaco de ensayo es T, la luminiscencia en el tiempo cero es T0 y la luminiscencia de control es C. El GI⁵⁰mide el poder inhibidor del crecimiento del agente de ensayo.

Tabla 6 - Análisis comparativo del compuesto 108 y BGJ398 en ensayos de viabilidad celular

Comparación de eficacia in vivo: Se utilizaron ratones desnudos para estos experimentos como anteriormente. Se inyectaron 5,0 x 106 células Hep3B en un volumen total de 100 pl, 1:1 en Matrigel (Corning Inc, Coming, Nueva York), por vía s.c. en el flanco lateral derecho. Cuando los tumores alcanzaron 150-200 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento de 5-10 animales. Después se inició el tratamiento con el compuesto 108, formulado en un vehículo de DMSO al 5% (Alfa Aesar, Ward Hill, MA), PEG300 al 10% (Sigma, St. Louis, MO), TWEEN® 80 al 8% (Sigma, St. Louis, MO), solución salina USP al 77% a la concentración deseada. Se suspendió BGJ398, formulado como una suspensión en metilcelulosa (Sigma) al 0,5%/TWEEN® 80 al 0,2%, a la concentración deseada. Ambos fármacos se dosificaron durante 18 días, excepto para un grupo de tratamiento (véase más adelante). Los volúmenes tumorales se registraron dos veces por semana utilizando la fórmula volumen = (longitud*anchura2)/2. También se registraron los pesos corporales dos veces por semana. Todos los animales se observaron y se cuidaron de acuerdo con The Guide for Care and Use of Laboratory Animals, octava edición (National Academies Press, Washington D.C.). Los resultados de este estudio comparativo in vivo se muestran en la figura 4.

Los datos muestran que el compuesto 108 es más eficaz que BGJ398 a niveles de dosificación tolerables. Aunque BGJ398 a 60 mg/kg mostró una eficacia comparable al compuesto 108, la dosificación de este grupo de 60 mg/kg de BGJ398 tuvo que interrumpirse el día 11 debido a la mala salud de los animales. Esta diferencia en la toxicidad no se debe a las vías de administración porque el grupo de animales a los que se administró BGJ398 por vía oral a 30 mg/kg no mostró mala salud.

Ejemplo 3: Procedimientos alternativos de síntesis y cristalización del compuesto 108. Síntesis de bis(Boc)-4-bromo-2-nitroanilina

Se cargó un matraz de fondo redondo de 5 l de 3 bocas con 4-bromo-3-nitroanilina (200 g, 922 mmol), anhídrido de Boc (412 g, 1889 mmol, 2,05 equiv) y THF (3 l). En la mezcla agitada se cargó DMAP (11,26 g, 92,2 mmol, 0,10 equiv.). La mezcla se calentó a 65 °C y se agitó a esta temperatura hasta que la reacción se consideró completa por HPLC (< 2% de 4-bromo-3-nitroanilina remanente, aproximadamente 3,5 horas) y después se enfrió a temperatura ambiente. La mezcla se transfirió a un recipiente de tratamiento de 12 l, se añadió acetato de etilo (3 l) y la mezcla se lavó secuencialmente con HCl 1 N (1 l), solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (1 l) y solución acuosa de NaCl al 10% (1 l). La capa orgánica se concentró hasta un volumen mínimo de agitación y se añadió acetato de etilo (1 l). La solución se capturó dos veces con heptano (1,5 l), se concentró la mezcla hasta un volumen total de 1,5 l después de la segunda captura. La suspensión resultante se filtró, se lavó con heptano (3 x 200 ml) y se secó al vacío para proporcionar el compuesto del título (345,5 g, rendimiento del 90%) como un sólido blancuzco.

(4-(4-Etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenil)carbamato de terc-butilo

equiv)

3) Concentrar

Se cargó un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 5 l con Bis(Boc)-4-bromo-2-nitroanilina (250 g, 599 mmol), carbonato de cesio (234 g, 719 mmol, 1,2 equiv.) y pre-catalizador Buchwald Ru-Phos (N° CAS 1375325-68-00, 20 g, 27,4 mmol, 0,046 equiv.). En los sólidos se cargó tolueno previamente desgasificado (1 l) y W-etilpiperazina (156 ml, 1228 mmol, 2,05 equiv.). La mezcla resultante se purgó con gas nitrógeno durante 30 minutos, después se calentó la mezcla a 95-105 °C y se agitó a esta temperatura hasta que el análisis de HPLC mostró una reacción completa (aproximadamente 6 horas). La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se filtró sobre Celite® 545 (125 g), lavando la torta con tolueno (3 x 60 ml). La solución resultante se concentró para producir el compuesto del título (210 g, rendimiento del 100%) que se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.

4-(4-Etilpiperazin-1-il)-2-nitroanilina

En una suspensión de 4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo (210 g, 599 mmol) en una cantidad mínima de tolueno se cargó HCl acuoso 4 N (2,1 l, 14 equiv.) con agitación mecánica, manteniendo la temperatura interna a < 40 °C. La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente con un barrido de nitrógeno para eliminar el disolvente orgánico remanente hasta que el análisis de HPLC indicó que la reacción se había completado. A la suspensión se añadió MTBE (1 l). La mezcla se agitó durante 30 minutos y las capas se separaron. La capa acuosa inferior se enfrió a 0-5 °C y se añadió una solución acuosa de NaOH 12 N a pH 9-10 (se requirieron aproximadamente 480 ml). El sólido resultante se filtró y se lavó con agua fría (0-5 °C) (3 x 400 ml). La torta húmeda se filtró al vacío y/o con barrido con nitrógeno a 30 °C para proporcionar el compuesto del título (136,3 g, rendimiento del 91%) como un sólido rojo.

4-Bromo-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo - procedimiento alternativo

Se calentó una mezcla de 4-bromo-2-nitroanilina (4 g, 18,4 mmol) y (Boc)2O a reflujo durante la noche (4,4 g, 20,24 mmol) en THF (50 ml). La mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice eluyendo con PE:EtOAc = 20:1 para obtener el compuesto del título (5,4 g, rendimiento: 93%). MS (ESI): 317, 319 [M+H]+.

4-(4-Etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo - procedimiento alternativo

Una mezcla desgasificada de 4-bromo-2-nitrofenilcarbamato de terc-butilo (5,4 g, 17 mmol), 1-etilpiperazina (2,91 g, 25,5 mmol), Pd2(dba)3 (2,1 g, 3,4 mmol), xantphos (3,92 g, 6,8 mmol) y Cs2CO3 (11,1 g, 34 mmol) en tolueno (85 ml) se calentó a 100 °C durante 4 horas. La reacción se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida sobre sílice eluyendo con MeOH:DCM = 1:50~1:20 para obtener el compuesto del título (3,3 g, rendimiento: 55%). MS (ESI): 351 [M+H]+.

a. 1 -(6-Cloropirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilurea

Se cargó un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 3 l con 2,6-dicloro-3,5-dimetoxianilina (199,65 g, 899 mmol), trifosgeno (93 g, 315 mmol, 0,35 equiv.) y 1,4-dioxano (1,9 l). La mezcla se calentó a 100 °C y se agitó a esta temperatura durante 3,5 h. Después, la mezcla se enfrió a 20-25 °C y se filtró. El residuo sólido se lavó con 1,4-dioxano (200 ml). El filtrado se concentró hasta un volumen mínimo de agitación y se capturó 3x con dioxano (700 ml cada captura). La solución se concentró hasta un volumen mínimo de agitación después de la última captura y a continuación se redisolvió en 1,4-dioxano (730 ml). En esta suspensión se cargó 6-cloro-A/-metilpirimidin-4-amina (129 g, 899 mmol, 1 equiv.). La mezcla resultante se calentó a 80 °C y se agitó a esta temperatura durante 60 h, periodo durante el cual se formó una cantidad sustancial de precipitado. La mezcla se enfrió a 20-22 °C y se filtró. La torta sólida se lavó con dioxano (2 x 90 ml) y se secó al vacío a temperatura ambiente con un barrido de nitrógeno para producir el compuesto del título (191 g, 54% de rendimiento) como un sólido.

b. 1 -(6-Cloropirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)urea

Se cargó un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 5 l con 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -(6-(4-(4-etilpiperazin-1 -il)-2-nitrofenilamino)pirimidin-4-il)-1-metilurea (135 g, 345 mmol), yoduro de potasio (6,87 g, 41,4 mmol, 0,12 equiv.) y DMF (400 ml). La mezcla se enfrió hasta 0-5 °C y se cargó NaH (dispersión al 60% en aceite mineral, 17,9 g, 448 mmol, 1,3 equiv.) en porciones a fin de mantener la temperatura interna a < 5 °C. La mezcla se dejó en agitación durante 1 hora a 0-5 °C, después de lo cual se añadió gota a gota SEM-Cl (73,2 ml, 414 mmol, 1,2 equiv.) a fin de mantener la temperatura interna a < 5 °C. La mezcla de reacción se agitó a 0-5 °C hasta que el análisis de HPLC indicó que la reacción se había completado (aproximadamente 1 h). El lote se transfirió a un segundo matraz de fondo redondo de 3 bocas de 5 l que contenía agua fría (0-5 °C) (4 l). La suspensión resultante se agitó durante 15 minutos y después se filtró. La torta se lavó con agua (3 x 300 ml) y se secó al vacío para producir el compuesto del título (184 g, 102%) como un sólido.

c. 1 -(2,6-Dicloro-3,5-dimetoxifenil)-3-(6-((4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenil)amino)pirimidin-4-il)-3-metil-1-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)urea

Se cargó un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 3 l con 1-(6-cloropirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)urea (182 g, 349 mmol), 4-(4-etilpiperazin-1-il) -2-nitroanilina (87 g, 349 mmol, 1 equiv.), precatalizador BrettPhos (N° CAS 1470372-59 -8, 15,6 g, 17,2 mmol, 0,05 equiv) y carbonato de cesio (136 g, 418 mmol, 1,2 equiv). El sistema se purgó con nitrógeno y se añadió DMF previamente desgasificada (910 ml). La solución se purgó con gas nitrógeno durante 30 minutos, después se dejó en agitación a 22-25 °C hasta que el análisis de HPLC indicó que la reacción se había completado (3-4 horas). La mezcla se cargó en un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 5 l que contenía agua (2,7 l) a una velocidad tal que se mantuviera la temperatura interna a < 35 °C. La suspensión resultante se enfrió a 22-25 °C y después se filtró. La torta se lavó con agua (4 x 150 ml) y se secó al vacío para producir el compuesto del título (257 g, rendimiento del 100%) como un sólido.

d. Síntesis de 1 -(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-3-(6-((4-(4-etilpiperazin-1 -il)-2-nitrofenil)amino)pirimidin-4-il)-3-metil-1 -((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)urea - procedimiento alternativo

A un matraz de fondo redondo de cuatro bocas de 3 l equipado con condensador de reflujo, agitador magnético y sistema de purga de nitrógeno se añadió 4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitroanilina (50 g, 0,199 mol), 1-(6-cloropirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)urea (125,1 g, 0,239 mol, 1,2 equiv.), DMF (500 ml) y carbonato de cesio (130,17 g, 0,399 mol, 2,0 equiv.). La mezcla resultante se purgó borboteando nitrógeno a través de la mezcla durante 5-10 min a temperatura ambiente. A la mezcla se añadió Pd2(dba)3 (18,29g, 0,0199 mol, 0,10 equiv.), Xantphos (11,55 g, 0,0199 mol, 0,10 equiv.) y se continuó purgando con nitrógeno durante otros 10 min. Después, la mezcla de reacción se calentó a 100 °C hasta que el análisis por TLC indicó que la reacción se había completado (aproximadamente 2 h). La mezcla se filtró a través de un lecho de celite y se realizó un tratamiento acuoso, extrayéndose el producto deseado con EtOAc (3 x 500 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución de salmuera (2 x 500 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido rojizo (142 g) que se llevó a la siguiente etapa sin tratamiento adicional.

e. 1 -(6-(2-Amino-4-(4-etilpiperazin-1 -il)fenilamino)pirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilurea

A una solución de 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-(6-(4-(4-etilpiperazin-1-il)-2-nitrofenilamino)pirimidin-4-il)-1-metilurea (330 mg, 0,546 mmol) en THF (20 ml) y MeOH (20 ml) se añadió Ni Raney (suspensión en agua) a temperatura ambiente, la mezcla resultante se agitó durante 3 horas en atmósfera de hidrógeno (1 atm) . La reacción se filtró y se concentró. El residuo se lavó dos veces con MeOH para obtener el compuesto del título (280 mg, pureza: 90%), que se utilizó directamente en la etapa siguiente. MS (ESI): 575 [M+H]+.

f. Preparación de W-(2-(6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-ilamino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se cargó un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 5 l con diclorometano (1 l), ácido acrílico (14,6 ml, 213 mmol, 1,5 equiv.) y base de Hunig (39,5 ml, 227 mmol, 1,6 equiv.). La solución se enfrió a 0-5 °C y se trató con cloroformiato de metilo (15,4 ml, 198 mmol, 1,4 equiv.) a una velocidad tal que se mantuviera la temperatura interna a < 7 °C. La mezcla se calentó a 20-25 °C y se agitó a esta temperatura durante 1 h, después se enfrió a 0-5 °C. En un matraz de fondo redondo de 500 ml aparte se disolvió 1-(6-((2-amino-4-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)urea (100 g, 142 mmol, 1 equiv.) en diclorometano (150 ml). La solución de sustrato se transfirió a la solución de anhídrido mixta, enjuagando con diclorometano (200 ml) y transfiriendo este enjuague a la solución de anhídrido también. A la mezcla resultante se añadió piridina (27,5 ml, 340 mmol, 2,4 equiv.) y la mezcla resultante se calentó a 20-25 °C. La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura hasta que el análisis por HPLC indicó que la reacción se había completado (aproximadamente 1 h). A continuación, la mezcla se enfrió a 0-5 °C y se añadió una solución acuosa saturada de NaHCÜ3 (1 l). El lote se agitó durante 20 minutos, después se sedimentaron y se dividieron las fases. La fase orgánica inferior se lavó una segunda vez con solución de NaHCÜ3 (600 ml). Después, la fase orgánica inferior se lavó con una solución acuosa de NaCl al 10% (600 ml). La fase orgánica inferior se secó sobre Na2SÜ4 sólido (250g), se filtró y se concentró para producir el compuesto del título (108 g, 100%) que se utilizó en la etapa siguiente sin purificación.

g. Síntesis y cristalización de la forma de base libre del compuesto 108

Una solución agitada de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metil-3-((2-(trimetilsilil)etoxi)metil)ureido)-pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (1, 51 g, 67,12 mol) en diclorometano (102 ml) se enfrió a 0-5 2C. A esta solución se añadió ácido trifluoroacético (102 ml, 1585 mol, 23,6 equiv.) a una velocidad tal que se mantuviera la temperatura interna < 15 °C. Una vez que se completó la adición, la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 3 h, momento en el que el análisis por HPLC indicó que la reacción se había completado. La mezcla se transfirió a un segundo matraz que contenía una solución de hidróxido de amonio saturada fría (0-5 °C) (550 ml), a una velocidad tal que se mantuviera la temperatura interna < 25 °C. La mezcla se dejó en agitación durante 5-10 minutos, en los que el análisis por HPLC indicó que la reacción se había completado. La mezcla se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo dos veces con diclorometano/metanol (5:1, 600 ml) y una vez con diclorometano/metanol (5: 1,300 ml). Las fases orgánicas combinadas se concentraron hasta un volumen mínimo de agitación y se añadió acetonitrilo (150 ml). El sólido resultante se suspendió durante 15 minutos y después se filtró. La torta sólida se lavó con acetonitrilo (4 x 30 ml) y se secó sobre el filtro al vacío con un barrido de nitrógeno para proporcionar W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (108, 29,56g, rendimiento del 70%) como un sólido. 1H-RMN (d6-DMSO): 5 1,04 (t, J=7,15 Hz, 3H); 2,37 (m, 2H); 3:13 (m, 4H); 3,22 (m, 4H); 3,31 (s, 3H); 3,93 (s, 6H); 5,72 (dd, 1H, J=10,27, 1,83 Hz); 6,23 (dd, 1H, J=17,06, 1,83 Hz; s a, 1H); 6,48 (dd, 1H, J=16,87, 10,27 Hz); 6,81 (dd, 1H, J=8,99, 2,75 Hz); 6,89 (s, 1H); 7,29 (d a, J=9,17 Hz, 2H); 8,32 (s, 1H); 8,71 (s, 1H); 9,58 (s, 1H) (figuras 9A-9C). Espectroscopía de masas: [M+H]+ = 629,2. Esta se determinó en un Varian Inova a 500 MHz.

Recristalización de la forma de base libre del compuesto 108:

Se disolvió A/-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)-acrilamida (108, 42 g) en diclorometano/metanol (4:1, 500 ml). A esta solución se le añadió acetonitrilo (150 ml). La mezcla se concentró a presión reducida hasta un volumen total de 150 ml. A la mezcla resultante se añadió acetonitrilo adicional (150 ml) y la mezcla se concentró de nuevo a presión reducida hasta un volumen total de 150 ml. Se filtró la suspensión resultante. La torta sólida se lavó con acetonitrilo (4 x 30 ml) y se secó sobre el filtro al vacío con un barrido de nitrógeno para producir una forma de base libre recristalizada de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida (108, 36 g, 86% de recuperación a partir de la recristalización) como un sólido.

Ejemplo 4: Caracterización de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 por difracción de rayos X en polvo (PXRD)

Los datos de PXRD para las muestras de este ejemplo se tomaron en un instrumento Rigaku MultiFlex (anticátodo: Cu; voltaje del tubo: 40 kV; corriente del tubo: 30 mA, intervalo 3,0-45,0 = 42,0°). Las muestras se prepararon añadiendo polvos en portamuestras de aluminio redondos estándar y se nivelaron con un portaobjetos de vidrio.

Una forma de base libre cristalina del compuesto 108 se caracteriza por el patrón PXRD mostrado en la figura 5, truncado para mostrar un intervalo de 3,0-35,0 = 32,0°. Una superposición de los espectros PXRD de tres lotes de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 (figura 6) demuestra la reproducibilidad.

Tal como se resume en la tabla 7, la forma de base libre cristalina del compuesto 108 muestra un patrón PXRD con seis picos característicos.

Tabla 7: Picos PXRD característicos del compuesto 108 en forma de base libre cristalina

Ejemplo 5: Caracterización del compuesto 108 en forma de base libre cristalina mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC)

La DSC para las muestras de este ejemplo se tomó en un Mettler-Toledo DSC 1/700 (condiciones de ejecución: temperatura inicial 35 °C, temperatura final 325 °C, velocidad de calentamiento 10 °C/min).

Se añadieron de aproximadamente 4 a 8 mg de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 a una bandeja de aluminio de 70 gl, se cubrieron, se comprimieron y se perforaron con un solo orificio. La muestra y un recipiente en blanco preparado de la misma forma se añadieron a la superficie del termopar y el instrumento se equilibró a la temperatura inicial. La cámara se calentó a 325 °C a 10 °C/min y se recogió el termograma diferencial.

Se obtuvo un termograma diferencial de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 utilizando un instrumento de calorimetría de barrido diferencial (DSC) (véase la figura 7, truncada después de aproximadamente 254 °C). La forma de base libre cristalina del compuesto 108 se caracteriza por tener un único pico endotérmico a una temperatura de inicio de 213,6 °C (±1 °C). Una comparación de las temperaturas de inicio de tres lotes diferentes de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 se muestra en la tabla 8 y la figura 8 (truncada después de aproximadamente 246 °C).

Tabla 8 Comparación de temperaturas de inicio de tres lotes

Ejemplo 6: Solubilidad del compuesto 108 en forma de base libre cristalina

La solubilidad del compuesto 108 en forma de base libre cristalina en HCl 0,1 N fue de 5,2 mg/ml.

Ejemplo 7:

Este ejemplo notifica datos adicionales preparados a partir de un lote de la forma de base libre cristalina del compuesto 108 separado del material que proporciona los datos indicados anteriormente.

13C-RMN (100 MHz, estado sólido) 5(ppm): 11,9, 31,1,52,2, 54,8, 56,5, 88,6, 95,7, 106,2, 110,8, 112,3, 114,5, 123,0, 129,0, 130,3, 132,3, 132,9, 133,8, 149,9, 153,2, 154,8, 155,4, 160,0, 162,1, 164,4. Se muestra en la figura 10.

Espectro de RMN de 1H (DMSO-afe) 5(ppm): 1,03 (3H, t, J=7,2 Hz), 2,37 (2H, c, J=7,2 Hz), 2,46-2,51 (4H, m), 3,12 (4H, t, J= 5,0 Hz), 3,21 (3H, s), 3,92 (6H, s), 5,71 (1H, dd, J= 10,3, 1,7 Hz), 6,13-6,26 (1H, m), 6,22 (1H, dd, J=17,1, 1,8 Hz), 6,48 (1H, dd, J=17,0, 10,3 Hz), 6,80 (1H, dd, J= 8,9, 2,6 Hz), 6,88 (1H, s), 7,23-7,33 (1H, m), 7,28 (1H, d, J=8,9 Hz), 8,30 (1H, s), 8,69 (1H, s a), 9,57 (1H, s a), 12,05 (1H, s). Se midió utilizando un Avance 600 MHz (Bruker). Se muestra en la figura 9D.

Los ejemplos 8-17 son solo con fines de referencia. Ejemplo 8: Preparación de cristales de monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se roció una solución (4 ml) de acetona que contenía DMSO al 10% (v/v) con una solución de ácido clorhídrico (2,76 gl, 1 eq), se añadió a N-(2((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (20,25 mg), se irradió con ultrasonidos y se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración y se lavaron con acetona para dar cristales de monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida.

Ejemplo 9: Preparación de cristales de monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilam ida

Se roció una solución (2,5 ml) de acetona que contenía DMSO al 10% (v/v) con una solución de ácido clorhídrico (7,25 gl, 1 eq), se añadió a N-(2((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido) pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (53,12 mg), se irradió con ultrasonidos y se agitó a temperatura ambiente durante un día. Se añadió a la mezcla de reacción la forma cristalina obtenida en el ejemplo 8 y se agitó adicionalmente durante 5 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración y se lavaron con etanol (1 ml) para dar cristales de monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (50,60 mg).

Ejemplo 10: Preparación de cristales de monoclorhidrato de N-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se roció una solución (25 ml) de acetona que contenía DMSO al 10% (v/v) con una solución de ácido clorhídrico (68,51 gl, 1 eq), se añadió a W-(2((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (502,1 mg) y se irradió con ultrasonidos. Se añadió a la mezcla de reacción la forma cristalina obtenida en el ejemplo 9 y se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración, se lavaron con acetato de etilo (1,5 ml) y se secaron a presión reducida durante 3 días para dar cristales de monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida (543,0 mg).

RMN de 13C (100 MHz, estado sólido) 5 (ppm): 10,9, 32,1,34,1,45,4, 49,2, 51,9, 53,7, 56,0, 91,3, 95,7, 112,5, 121,2, 124,1, 128,2, 130,7, 134,3, 144,7, 153,6, 154,8, 160,3, 166,9. Se muestra en la figura 11.

Espectro de RMN de 1H (DMSO-dfe) 5(ppm): 1,26 (3H, m), 2,98-3,21 (6H, m), 3,23 (3H, s), 3,55 (2H, s a), 3,77 (2H, s a), 3,92 (6H, s), 5,72 (1H, dd, J= 10,3, 1,3 Hz), 6,23 (1H, dd, J=17,0, 1,6 Hz), 6,26 (1H, s a), 6,52 (1H, dd, J=17,0, 10,2), 6,87 (1H, dd, J= 9,0, 2,0 Hz), 6,89 (1H, s), 7,37 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,41 (1H, s a), 8,32 (1H, s), 8,88 (1H, s), 9,67 (1H, s), 10,17 (1H, s a), 12,02 (1H, s). Se muestra en la figura 12.

Ejemplo 11:

Los datos de PXRD para las muestras de este ejemplo se tomaron en un instrumento Rigaku RINT TTR-III (anticátodo: Cu; voltaje del tubo: 50 kV; corriente del tubo: 300 mA, intervalo 5,0-35,0 = 30°).

Un monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalino preparado en el ejemplo 10 se caracteriza por el patrón PXRD mostrado en la figura 13.

Tal como se resume en la tabla 8, la forma cristalina de monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida presenta un patrón PXRD con al menos diez picos característicos.

Tabla 8: Picos PXRD característicos de monoclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilam ida.

Ejemplo 12: Preparación de cristales de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se roció acetona (3 ml) con solución de ácido clorhídrico (12,36 gl, 3 eq), se añadió a W-(2((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (30,19 mg), se irradió con ultrasonidos y se agitó a temperatura ambiente durante 4 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración para dar cristales de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida.

Ejemplo 13: Preparación de cristales de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se roció una solución (10 ml) de acetona que contenía DMSO al 10% (v/v) con una solución de ácido clorhídrico (137,7 gl, 2 eq), se añadió a W-(2((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (504,4 mg) y se irradió con ultrasonidos. Se añadió a la mezcla de reacción la forma cristalina obtenida en el ejemplo 12 y se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración, se lavaron con acetato de etilo (1,5 ml) y se secaron a presión reducida durante 3 días para dar cristales de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida (565,4 mg).

13C-RMN (100 MHz, estado sólido) 5(ppm): 9,9, 30,4, 35,0, 39,8, 41,5, 45,5, 46,7, 51,3, 53,8, 56,1, 57,6, 93,2, 96,1, 109,9, 111,5, 112,5, 115,6, 119,0, 128,2, 130,0, 131,6, 134,0, 148,6, 154,6, 161,4, 163,7. Se muestra en la figura 14. Espectro de RMN de 1H (DMSO-d6) 5(ppm): 1,27 (3H, t, J=7,3 Hz), 3,03-3,21 (6H, m), 3,25 (3H, s), 3,52-3,59 (2H, m), 3,72-3,83 (2H, m), 3,92 (6H, s), 5,72 (1H, dd, J= 10,3, 1,5 Hz), 6,23 (1H, dd, J=17,1, 1,6 Hz), 6,32 (1H, s a), 6,53 (1H, dd, J=17,0, 10,4), 6,88 (1H, dd, J= 8,9, 2,5 Hz), 6,89 (1H, s), 7,37 (1H, d, J=8,8 Hz), 7,42 (1H, s a), 8,34 (1H, s), 9,03 (1H, s a), 9,73 (1H, s), 10,43 (1H, s a), 11,88 (1H, s a). Se muestra en la figura 15.

Ejemplo 14:

Un diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida cristalino preparado en el ejemplo 13 se caracteriza por el patrón PXRD mostrado en la figura 16. Tal como se resume en la tabla 9, la forma cristalina de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida muestra un patrón PXRD con al menos diez picos característicos.

Tabla 9: Picos PXRD característicos de diclorhidrato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida cristalino.

Ejemplo 15: Preparación de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se roció acetona (5 ml) con una solución de ácido etanosulfónico (13,51 pl, 1 eq), se añadió a W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (100,6 mg), se irradió con ultrasonidos y se agitó a temperatura ambiente durante 7 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración para dar cristales de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (103,7 mg).

Ejemplo 16: Preparación de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida

Se roció acetona (20 ml) con solución de ácido etanosulfónico (67,22 pl, leq), se añadió a W-(2((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida (500,6 mg) y se irradió con ultrasonidos. Se añadió a la mezcla de reacción la forma cristalina obtenida en el ejemplo 15 y se agitó a temperatura ambiente durante 3 días. Los cristales resultantes se separaron por filtración, se lavaron con acetato de etilo (1,5 ml) y se secaron a presión reducida durante 3 días para dar cristales de etanosulfonato de A/-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida (562,0 mg).

13C-RMN (100 MHz, estado sólido) 5(ppm): 10,3, 33,4, 44,0, 44,3, 45,0, 45,9, 47,0, 50,0, 53,0, 55,9, 87,6, 95,5, 107,4, 111,0, 124,8, 129,5, 131,5, 134,5, 144,2, 154,6, 159,2, 159,9, 164,1. Se muestra en la figura 17.

Espectro de RMN de 1H (DMSO-afe) 5(ppm): 1,05 (3H, t, J=7,5 Hz), 1,25 (3H, t, J=7,3 Hz), 2,37 (2H, c, J=7,4 Hz), 2,98 (2H, t, J=11,7 Hz), 3,13 (2H, m), 3,21 (2H, m), 3,24 (3H, s), 3,58 (2H, brd, J=11,6 Hz), 3,80 (2H, brd, J=12,9 Hz), 3,92 (6H, s), 5,72 (1H, dd, J= 10,3, 1,5 Hz), 6,22 (1H, dd, J=17,0, 1,7 Hz), 6,25 (1H, s a), 6,50 (1H, dd, J=17,0, 10,3), 6,84-6,92 (2H, m), 7,36 (1H, d, J=8,9 Hz), 7,41 (1H, s a), 8,32 (1H, s), 8,81 (1H, s), 9,34 (1H, s a), 9,58 (1H, s a), 11,99 (1H, s). Se muestra en la figura 18.

Ejemplo 17:

Un etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1 -metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida cristalino preparado en el ejemplo 16 se caracteriza por el patrón PXRD mostrado en la figura 19. Tal como se resume en la tabla 10, la forma cristalina de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)acrilamida presenta un patrón PXRD con al menos diez picos característicos.

Tabla 10: Picos PXRD característicos de etanosulfonato de W-(2-((6-(3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxifenil)-1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1-il)fenilo)acrilamida cristalino.

Lo anterior es ilustrativo de la presente invención y no debe interpretarse como una limitación de la misma. La invención está definida por las reivindicaciones siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una forma de base libre cristalina del compuesto:

1-metilureido)pirimidin-4-il)amino)-5-(4-etilpiperazin-1 -il)fenil)acrilamida

2. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 1, en el que el compuesto en la forma de base libre cristalina muestra al menos los siguientes picos de difracción de rayos X en polvo, 29a (± 0,2): 10,3 y 8,0.

3. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 2, en el que el compuesto en la forma de base libre cristalina muestra al menos los siguientes picos de difracción de rayos X en polvo, 29° (± 0,2°): 10,3, 8,0, 14,8, 16,5 y 17,1.

4. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 3, en el que el compuesto en la forma de base libre cristalina muestra al menos los siguientes picos de difracción de rayos X en polvo, 29° (± 0,2°): 10,3, 8,0, 14,8, 16,5, 17,1 y 21,8.

5. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 4, en el que el compuesto en la forma de base libre cristalina muestra al menos los siguientes picos de difracción de rayos X en polvo, 29° (± 0,2°): 10,3, 8,0, 9,5, 14,8, 16,5, 17,1, 19,3, 21,8, 23,7 y 24,5.

6. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 1, en el que la forma de base libre cristalina se caracteriza por un patrón de difracción de rayos X en polvo (PXRD) sustancialmente similar al que se muestra en la figura 5.

7. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 1, en el que la forma de base libre cristalina se caracteriza por una curva de calorimetría diferencial de barrido (DSC) sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 7.

8. El compuesto de base libre cristalina de la reivindicación 1, en el que la forma de base libre cristalina se caracteriza por una RMN de 13C sustancialmente similar a la que se muestra en la figura 10.

9. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto cristalino en la forma de base libre de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que dicha composición está formulada para administración oral, intravenosa o subcutánea.

11. Una forma de base libre cristalina del compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9 o la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento de un carcinoma hepatocelular.

12. Una forma de base libre cristalina o una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, en la que dicho carcinoma hepatocelular tiene un estado de FGFR4 alterado.

13. Una forma de base libre cristalina o una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, en la que dicho estado de FGFR4 alterado comprende una expresión aumentada de FGFR4.

14. Una forma de base libre cristalina o una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 11, en la que dicho carcinoma hepatocelular tiene un estado de FGF19 alterado.

15. Una forma de base libre cristalina o una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 14, en la que dicho estado de FGF19 alterado comprende una expresión aumentada de FGF19.