ES2865068T3

ES2865068T3 - Anticuerpos terapéuticos contra la proteína ROR-1 y métodos para usarlos

Info

Publication number: ES2865068T3
Application number: ES19192973T
Authority: ES
Inventors: Thomas Kipps; Ii George Widhopf; Bing Cui
Original assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2012-01-13
Publication date: 2021-10-14
Anticipated expiration: 2032-01-13
Also published as: WO2012097313A2; US20180348232A1; DK3604339T3; US9217040B2; EP2663579B1; DK3252076T3; EP2663579A2; CA2858350A1; EP3885366A3; HUE053720T2; ES2634098T3; PL2663579T3; PT2663579T; CA3027071A1; PT3604339T; EP2663579A4; EP3604339B1; CA2981662C; US9933434B2; WO2012097313A3

Abstract

Un anticuerpo o una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el anticuerpo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de un cáncer que expresa ROR-1, donde el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera codificadas por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:13 (cadena pesada) la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:15 (cadena ligera).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos terapéuticos contra la proteína ROR-1 y métodos para usarlos

Antecedentes

Las tirosina-quinasas son mediadores importantes de la cascada de señalización, determinando papeles clave en diversos procesos biológicos como crecimiento, diferenciación, metabolismo y apoptosis en respuesta a estímulos externos e internos. Diversos estudios han implicado el papel de las tirosina-quinasas en la fisiopatología del cáncer. Schlessinger J. (2000) Cell, 103:211-225; y Robinson et al. (2000) Oncogene,19: 5548-5557. MacKeigan y colaboradores usaron un enfoque de iARN a gran escala para identificar quinasas que podrían regular la supervivencia y apoptosis de una línea celular tumoral humana (HeLa), la iARN de ROR1 se encontró como una de las más potentes en la inducción de apoptosis entre el conjunto de iARN dirigidas a cada uno de 73 genes diferentes codificadores de quinasas. MacKeigan et al. (2005) Nat Cell Biol., 7: 591-600. Sin embargo, estos investigadores no examinaron la expresión ni la función de la proteína ROR1 en estas células.

La ROR1, un receptor huérfano similar al receptor de tirosina-quinasa, es una molécula expresada a altos niveles durante la embriogénesis que desempeña un papel principal en el desarrollo de esqueleto, pulmones y sistema nervioso. La expresión de ROR1 disminuye en gran medida en células de mamífero postparto hasta niveles que son apenas detectables. La ROR1 es un receptor de membrana con un dominio similar a quinasa intracelular y un dominio rico en cisteína similar a Frizzled extracelular que es común en receptores de miembros de la familia Wnt. La ROR1 es un miembro de la familia ROR que está evolutivamente conservado entre Caenorhavditis elegans, Drosophila, ratones y seres humanos. Wilson C, Goberdhan DC, Steller H. Dror, A potential neurotrophic receptor gene, encocles a Drosophila homolog of the vertebrate Ror family of Trk-related receptor tyrosine kinases. Proc Natl Acad Sci USA.1993;90:7109-7113; Oishi et al. (1997) J Biol Chem., 272:11916-11923; Masiakowski et al. (1992) J Biol Chem., 267:26181-26190; Forrester et al. (2002) Cell Mol Life Sci., 59:83-96; y Oishi et al. (1999) Genes Cells, 4:41-56. El papel funcional real de la proteína ROR1 durante la embriogénesis es desconocido, aunque se cree que es un receptor para proteínas Wnt que regulan la polaridad celular y las interacciones de célula con célula.

Aunque es principalmente una proteína embrionaria, la ROR1 se expresa excepcionalmente en ciertas células cancerosas, incluyendo LLC, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de linfocitos B de células marginales, linfoma de Burkett y otros cánceres (por ejemplo, cánceres de mama), pero no en tejidos y células de adultos normales. En un estudio reciente, se encontró que la ROR1, tanto a nivel de ARNm como de proteína, se expresaba en gran medida en linfocitos B de LLC, pero no en linfocitos B normales. Además, se encontró que la ROR1 es un receptor de Wnt5a, que podría inducir la activación de NF-^kB cuando se coexpresa con ROR1 en células HEK293 y mejora la supervivencia de células de LLC in vitro. Esto indica que la ROR1 es un receptor de señalización de la supervivencia a la LLC para Wnt5a. Otro estudio encontró que la ROR1 se expresaba también en leucemia linfocítica aguda (LLA). Shabani et al. (2007) Tumour Biol., 28:318-326; and Baskar et al. (2008) Clin Cancer Res., 14:396-404. La expresión de la proteína ROR1 se ha demostrado ahora en una variedad de cánceres hematológicos y de tumores sólidos. Fukida, T et al., PNAS (2008), 105(8):3047-3052 enseña el mAb 4A5 frente a ROR1 humano usado para detectar ROR1 en CLL.

El control terapéutico de la expresión de ROR1 es necesario. Sin embargo, aunque están comercialmente disponibles anticuerpos policlonales anti-ROR1 producidos contra el péptido ROR1. Los inventores desarrollaron un anticuerpo monoclonal anti-ROR1, denominado 4A5, que reacciona con la proteína ROR1 natural y es capaz de detectar la expresión en la superficie celular de ROR1 para análisis citométrico de flujo. Sin embargo, no han estado disponibles anticuerpos terapéuticos robustos con capacidad demostrable para inhibir la proliferación de células cancerosas mediada por ROR-1 en un grado que sea terapéuticamente significativo para retardar o prevenir el crecimiento y la metástasis.

Sumario de la invención:

Esta invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Además del uso médico definido por las reivindicaciones, la invención no se refiere a anticuerpos y combinación de anticuerpos para la inhibición in vivo e in vitro de la proliferación mediada por células ROR-1 de células de sujetos con cáncer, incluyendo linfomas, LLC, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de linfocitos B de células marginales, linfoma de Burkett, carcinoma de células renales, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de mama, carcinoma espinocelular epitelial, melanoma, mieloma, cáncer de estómago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de cabeza y cuello, pero no en linfocitos sanguíneos o esplénicos de pacientes no leucémicos o adultos normales.

Los anticuerpos son también útiles para la diferenciación entre células cancerosas que expresan ROR1 ("cáncer de ROR1") y células normales. Por ejemplo, se proporciona un inmunoensayo que detecta ROR1 en una muestra de un sujeto mediante la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo específico de ROR1 de la invención y la detección de la inmunorreactividad entre el anticuerpo y ROR1 en la muestra.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una serie de gráficos que ilustran los resultados del análisis citométrico de flujo de la expansión de linfocitos B de leucemia CD5+B220low en ratones ROR1 Tg después de la transferencia adoptiva de 1x107 esplenocitos de un ratón ROR1 x TCL1 Tg. El panel superior representa la expansión de 2 a 4 semanas después de la transferencia adoptiva. Se indica el porcentaje de células leucémicas en el gráfico de contornos de mCD5 (eje x) frente a mB220 (eje y) por encima de la ventana en linfocitos CD5+B220low. El panel inferior representa la expresión relativa de ROR1 (eje x) usando el mAb anti-ROR1 4A5 de ratón.

La Figura 2 es un diagrama que resume el análisis del mAb anti-ROR1 en la transferencia adoptiva y el injerto de esplenocitos leucémicos ROR1 XTCL1. Se administraron a ratones ROR1 Tg (4 ratones/grupo) 250 gg de 4A5, D10 o mIgG de control por vía i.v. el día 0. Al día siguiente, se transfirieron adoptivamente por vía i.v. 1x107 esplenocitos de un ratón ROR1 x TCL1 Tg. En todos los ratones se monitorizó posteriormente cada semana la expansión de linfocitos B leucémicos CD5+B220low por citometría de flujo empezando 2 semanas después de la transferencia. La Figura 3 es una serie de gráficos que ilustran los resultados de un análisis citométrico de flujo que demuestra que los anticuerpos anti-ROR1 inhibían el desarrollo de leucemia similar a la LLC en ratones ROR1 Tg. 2 semanas después de la transferencia adoptiva, se efectuaron los análisis FACS de PBMC. Los datos mostraron que el anticuerpo D10 anti-ROR1, pero no el anticuerpo 4A5 anti-ROR1, podían inhibir notablemente la expansión de linfocitos B leucémicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.

La Figura 4A es una serie de gráficos que ilustran los resultados de ensayos in vivo en un modelo de múrido de cáncer de mama humano. Los anticuerpos anti-ROR1 inhibían la metástasis de cáncer de mama en ratones con deficiencia de rag-/- g-/-. Se transfirieron células de cáncer de mama 5E5 MDA-MB-231 por inyección i.v. a ratones rag-/- g-/- el día 1. Se inyectaron también en ratones con deficiencia de rag-/- g-/- por vía i.v. control isotípico o anticuerpo anti-ROR1 (4A5, D10 y 4A5 más D10) los días 1, 3, 7 y 14 a 100 mg por ratón. La Figura 4A (centro) proporciona también imágenes de procedimientos de obtención de imágenes por IVIS in vivo de los ratones anteriores, que se efectuaron cada semana. 5 semanas después, se sacrificaron los ratones y se efectuaron análisis de histología (Figura 4B). El anticuerpo D10 anti-ROR1 y la combinación de anticuerpos (4A5 más D10) inhibían ambos significativamente la metástasis de cáncer de mama, siendo la inhibición por D10 solo mayor que la inhibición por 4a5 solo.

La Figura 5 proporciona una comparación de secuencias codificadoras de nucleótidos de la cadena pesada de Ig 4A5 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de ratón y humana de línea germinal más cercana.

La Figura 6 proporciona una comparación de secuencias codificadoras de nucleótidos de la cadena pesada de Ig G6 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de ratón y humana de línea germinal más cercana.

La Figura 7 proporciona una comparación de secuencias codificadoras de nucleótidos de la cadena pesada de Ig G3 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de ratón y humana de línea germinal más cercana.

La Figura 8 proporciona una comparación de secuencias codificadoras de nucleótidos de la cadena pesada de Ig H10 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de ratón y humana de línea germinal más cercana.

La Figura 9 proporciona una comparación de secuencias codificadoras de nucleótidos de la cadena pesada de Ig D10 (VH) con la VH de inmunoglobulina (Ig) de ratón y humana de línea germinal más cercana.

La Figura 10 es un diagrama y esquema que representa la naturaleza altamente conservada de ROR1 humana y de múrido.

La Figura 11 es una comparación de nucleótidos que representa la estructura de dominio y la homología de secuencias de la proteína extracelular ROR1 humana y de múrido.

La Figura 12 es una tabla que indica el dominio extracelular con que los mAb anti-ROR1 se unen a la proteína ROR1.

La Figura 13 es un diagrama que representa las proteínas ROR1 quiméricas generadas para determinar el dominio de unión de cada uno de los mAb anti-ROR1.

La Figura 14 es un diagrama que representa las proteínas ROR1 truncadas generadas para determinar las subregiones con que se une cada uno de los mAb anti-ROR1.

La Figura 15 es un diagrama que representa los aminoácidos que se muridizaron para determinar los residuos críticos para la unión del mAb a ROR1 humana y una transferencia de Western que muestra que el residuo de ácido glutámico 138 es crítico para la unión del anticuerpo D10 a ROR1 humana.

La Figura 16 es una gráfica que indica los valores de K^dpara el anticuerpo D10 (Figura 16a) y 4A5 (Figura 16b).

La Figura 17 es una serie de gráficas que ilustran que el anticuerpo D10 anti-ROR1 es altamente activo en ensayos in vivo.

La Figura 18 es un diagrama que resume el análisis del mAb anti-ROR1 en la transferencia adoptiva y el injerto de esplenocitos leucémicos ROR1 X TCL1. Se administraron a ratones ROR1 Tg (5 ratones/grupo) 250 gg de 4A5, D10 o mIgG de control por vía i.v. el día 0. Al día siguiente, se transfirieron adoptivamente por vía i.v. 5x105 esplenocitos de un ratón ROR1 x TCL1 Tg. En todos los ratones se monitorizó posteriormente cada semana la expansión de linfocitos B leucémicos CD5dullB220+ por citometría de flujo empezando 2 semanas después de la transferencia. La Figura 19 es una serie de gráficos que ilustran los resultados de un análisis citométrico de flujo de los anticuerpos anti-ROR1 que inhiben el desarrollo de leucemia similar a la LLC en ratones ROR1 Tg. 2 semanas después de la transferencia adoptiva, se efectuaron los análisis FACS de PBMC. Los datos mostraban que el anticuerpo D10 anti-ROR1, pero no el anticuerpo 4A5 anti-ROR1, podía inhibir notablemente la expansión de linfocitos B leucémicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.

La Figura 20 es un gráfico que ilustra que el anticuerpo D10 anti-ROR1 inhibe el desarrollo y expansión de linfocitos B leucémicos ROR1 x TCL1 en la sangre de animales receptores hasta 2 semanas después de recibir la última infusión del mAb.

La Figura 21 es una representación de la rápida internalización del anticuerpo D10 anti-ROR1 en células de LLC. La Figura 22 es una serie de gráficos que ilustran los resultados del análisis citométrico de flujo que muestran que los anticuerpos D10 y 4A5 anti-ROR1 están internalizados ambos en células de LLC. Se incubaron células de LLC con Ab-Alex647 anti-hROR1 durante 30 minutos a 4°C. Posteriormente, se lavaron las células y se dejaron a 4°C o se incubaron durante 4 horas a 37°C, seguido de citometría de flujo. Se muestra también la señal de fondo sin tinción.

La Figura 23 es un gráfico que ilustra la cinética de la internalización de los anticuerpos D10 y 4A5 anti-ROR1. La Figura 24 es un diagrama que representa los aminoácidos que se muridizaron para determinar los residuos críticos para la unión del mAb a la ROR1 humana y una transferencia de Western que muestra que el residuo de isoleucina 111 es crítico para la unión del anticuerpo 4A5 a ROR1 humana.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Los anticuerpos de la invención se produjeron monoclonalmente usando técnicas como se describen anteriormente. Brevemente, los anticuerpos de origen natural son generalmente tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Experimentalmente, los anticuerpos pueden escindirse con la enzima proteolítica papaína, que causa la rotura de cada una de las cadenas pesadas, produciendo tres subunidades separadas. Las dos unidades que consisten en una cadena ligera y un fragmento de la cadena pesada aproximadamente igual a la masa de la cadena ligera se denominan fragmentos Fab (es decir, los fragmentos de unión al antígeno). La tercera unidad, consistente en dos segmentos iguales de la cadena pesada, se denomina el fragmento Fc. El fragmento Fc típicamente no está implicado en la unión antígeno-anticuerpo, pero es importante en procesos posteriores implicados en retirar el cuerpo del antígeno.

Debido a que los fragmentos Fab y F(ab')2 son menores que las moléculas de anticuerpo intactas, están disponibles más dominios de unión al antígeno que cuando se usan moléculas de anticuerpo enteras. Se sabe que la escisión proteolítica de una molécula de IgG típica con papaína produce dos fragmentos separados de unión a antígeno denominados fragmentos Fab que contienen una cadena ligera intacta unida a una porción aminoterminal de la cadena pesada contigua a por medio de un enlace disulfuro. La porción restante de la molécula de inmunoglobulina digerida con papaína es conocida como el fragmento Fc, y consiste en las porciones carboxiterminales del anticuerpo dejadas intactas y unidas conjuntamente a través de enlaces disulfuro. Si se digiere un anticuerpo con pepsina, se produce un fragmento conocido como F(ab')2, que carece de la región Fc, pero contiene ambos dominios de unión al antígeno mantenidos juntos por enlaces disulfuro entre las cadenas ligera y pesada contiguas (como los fragmentos Fab) y también enlaces disulfuro entre las porciones restantes de las cadenas pesadas contiguas (Handbook of Experimental Immunology. Vol 1: Immunochemistry, Weir, D. M., Editor, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986)).

Como se reconoce fácilmente por los especialistas en la técnica, pueden producirse también mediante métodos bien conocidos en la técnica anticuerpos alterados (por ejemplo, quiméricos, humanizados, injertados con CDR, bifuncionales), dímeros polipeptídicos de anticuerpos (es decir, una asociación de dos componentes de cadena polipeptídica de un anticuerpo, por ejemplo, un brazo de un anticuerpo que incluye una cadena pesada y una cadena ligera, o un fragmento Fab que incluye los dominios de anticuerpo VL, VH, CL y CH, o un fragmento Fv que comprende un dominio VL y un dominio VH), anticuerpos monocatenarios (por ejemplo., un fragmento scFv (es decir, Fv monocatenario) que incluye un dominio VL unido a un dominio VH por un enlazador, y similares).

La tecnología de anticuerpos monoclonales (mAb) puede usarse para obtener mAb para ROR1. Brevemente, se producen hibridomas usando células de bazo de ratones inmunizados con antígenos de ROR1. Se fusionan las células de bazo de cada ratón inmunizado con células Sp 2/0 de mieloma de ratón, por ejemplo, usando el método de fusión con polietilenglicol de Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981). Se llevan a cabo el crecimiento de los hibridomas, la selección en medio HAT, la clonación y el cribado de clones contra antígenos usando metodología estándar (Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981)).

Se inyectan clones seleccionados por HAT en ratones para producir grandes cantidades de mAb en ascitis como se describe por Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol., 73:3-46 (1981), que pueden purificarse usando cromatografía en columna de proteína A (BioRad, Hercules, Calif.). Los mAb se seleccionan basándose en (a) su especificidad para ROR1, (b) una alta afinidad de unión, (c) el isotipo y (d) la estabilidad.

Los mAb pueden cribarse o ensayarse para determinar la especificidad para ROR1 usando cualquiera de una variedad de técnicas estándares, incluyendo transferencia de Western (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)) y ensayo de inmunosorción ligado a enzima (ELISA) (Koren, E. et al., Biochim. Biophys. Acta 876:91-100 (1986)).

Pueden generarse formas humanizadas de anticuerpos de ratón uniendo las regiones CDR de anticuerpos no humanos con regiones constantes humanas mediante técnicas de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989 y WO 90/07861, incorporadas cada una como referencia). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse usando métodos de presentación en fago (véanse, por ejemplo, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al., WO 92/01047). En estos métodos, se producen colecciones de fagos en las que los miembros presentan diferentes anticuerpos sobre sus superficies externas. Los anticuerpos se presentan habitualmente como fragmentos Fv o Fab. Puede seleccionarse el fago que presenta anticuerpos con una especificidad deseada mediante enriquecimiento por afinidad.

Pueden seleccionarse anticuerpos humanos por experimentos de unión competitiva, o de otro modo, para tener la misma especificidad de epítopo que un anticuerpo de ratón particular. Usando estas técnicas, un anticuerpo para ROR1 humanizado que tiene el dominio de región constante de IgG1 humana y el dominio de región constante de cadena ligera kappa humana con las regiones variables de cadena pesada y ligera de ratón. El anticuerpo humanizado tiene la especificidad de unión de un mAb para ROR1 de ratón, específicamente el mAb 4A5 descrito en los Ejemplos 4 y 5.

Puede ser deseable producir y usar fragmentos funcionales de un mAb para una aplicación particular. La estructura básica bien conocida de una molécula de IgG típica es una molécula en forma de Y tetramérica simétrica de aproximadamente 150.000 a 200.000 dáltones consistente en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas (que contienen aproximadamente 220 aminoácidos) y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas (que contienen aproximadamente 440 aminoácidos). Las cadenas pesadas están unidas entre sí a través de al menos un enlace disulfuro. Cada cadena ligera está unida con una cadena pesada contigua por un enlace disulfuro. Está localizado un sitio o dominio de unión al antígeno en cada brazo de la molécula de anticuerpo en forma de Y, y está formado entre las regiones aminoterminales de cada par de cadenas ligera y pesada unidas por disulfuro. Estas regiones aminoterminales de las cadenas ligera y pesada consisten en aproximadamente sus primeros 110 aminoácidos aminoterminales y son conocidas como las regiones variables de las cadenas ligera y pesada. Además, dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, hay regiones hipervariables que contienen tramos de secuencias de aminoácidos conocidas como regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las CDR son responsables de la especificidad del anticuerpo para un sitio particular en una molécula de antígeno denominada epítopo. Por tanto, la molécula de IgG típica es divalente al poder unirse a dos moléculas de antígeno, debido a que cada sitio de unión al antígeno es capaz de unirse al epítopo específico de cada molécula de antígeno. Las regiones carboxiterminales de las cadenas ligera y pesada son similares o idénticas a las de otras moléculas de anticuerpo y se denominan regiones constantes. La secuencia de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas de un anticuerpo particular define que clase de anticuerpo es, por ejemplo IgG, IgD, IgE, IgA o IgM. Algunas clases de anticuerpos contienen dos o más anticuerpos idénticos asociados entre sí en disposiciones de unión a antígeno multivalentes.

Pueden usarse fragmentos Fab y F(ab')2 de mAb que se unen a ROR1 en lugar de mAb enteros. Debido a que los fragmentos Fab y F(ab')2 son menores que las moléculas de anticuerpo intactas, están disponibles más dominios de unión a antígeno que cuando se usan moléculas de anticuerpo enteras. Se sabe que la escisión proteolítica de una molécula de IgG típica con papaína produce dos fragmentos separados de unión a antígeno denominados fragmentos Fab que contienen una cadena ligera intacta unida a una porción aminoterminal de la cadena pesada contigua a través de un enlace disulfuro. La porción restante de la molécula de inmunoglobulina digerida con papaína es conocida como el fragmento Fc, y consiste en las porciones carboxiterminales del anticuerpo dejadas intactas y unidas conjuntamente a través de enlaces disulfuro. Si se digiere un anticuerpo con pepsina, se produce un fragmento conocido como F(ab')2, que carece de la región Fc, pero contiene ambos dominios de unión a antígeno mantenidos juntos por enlaces disulfuro entre las cadenas ligera y pesada contiguas (como los fragmentos Fab) y también enlaces disulfuro entre las porciones restantes de las cadenas pesadas contiguas (Handbook of Experimental Immunology). Vol 1: Immunochemistry, Weir, D. M., Editor, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1986)).

Con respecto a anticuerpos particulares, "unión específica" hace referencia a la unión de un anticuerpo a un antígeno predeterminado. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad correspondiente a una K^dde aproximadamente 10-8 M o menor, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad (expresada por KD) que es al menos 10 veces menor, y preferiblemente al menos 100 veces menor, que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o de un antígeno estrechamente relacionado. Como alternativa, el anticuerpo puede unirse con una afinidad correspondiente a una KA de aproximadamente 106 M-1 o de aproximadamente 107 M-1, o de aproximadamente 108 M-1, o de 109 M-1 o mayor, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad (expresada por KA) que es al menos 10 veces mayor, y preferiblemente al menos 100 veces mayor, que su afinidad de unión a un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) distinto del antígeno predeterminado o de un antígeno estrechamente relacionado.

También, la referencia a "un anticuerpo que tiene especificidad de unión para la proteína ROR-1" incluye fragmentos de anticuerpo que tienen una identidad de secuencia al menos 90 o 95% con cualquiera de las secuencias polipeptídicas descritas en las SEQ ID NO: 2, 4 6, 8, 12, 14, 16, 18 y 20 incluyendo variantes modificadas por mutación para mejorar la su utilidad (por ejemplo, capacidad mejorada para dirigirse a tipos de células específicas y similares). Tales variantes incluyen aquellas en donde están introducidas una o más sustituciones conservadoras en la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo.

Los anticuerpos F2, F12, G6 y 4A5 así como los anticuerpos definidos por sus secuencias de aminoácidos o polinucleótidos que los codifican, concretamente por referencia a SEQ ID Nos. 1-12 y 17-20 no son parte de la invención.

Tales variantes incluyen aquellas donde están introducidas una o más sustituciones en la secuencia nucleotídica de la cadena pesada y/o la secuencia nucleotídica de la cadena ligera del anticuerpo. En algunas realizaciones, la variante tiene una cadena ligera y/o una cadena pesada que tiene una secuencia nucleotídica al menos 80% o al menos 90% o al menos un 95% idéntica a cualquier de las secuencias nucleotídicas expuestas en las SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 y 19.

Las secuencias polinucleotídicas que codifican rasgos estructurales de los anticuerpos anti-ROR-1 incluyen aquellas cuyas secuencias se exponen a continuación. Cada secuencia polinucleotídica va seguida por la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Las secuencias de la cadena ligera que se considera que son "correspondientes" a secuencias de la cadena pesada son las enumeradas por ser del mismo anticuerpo; es decir, las secuencias de la cadena pesada de F2 corresponden a las secuencias de la cadena ligera de F2, las secuencias de la cadena pesada de D10 corresponden a las secuencias de la cadena ligera de D10 y así sucesivamente.

SEQ ID NO: 1: Secuencia codificadora de la región variable de la cadena pesada del mAb 4A5 anti-ROR1 de ratón

GAAGTGAAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATT

CACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGATTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGG

TCGCATCCATTAGTCGTG

GTGGTACCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTC

AGGAACATCCTGTACCTG

CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGGAAGATATGATTACGA

CGGGTACTATGCAATGGA

CTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 2: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada del mAb 4A5 anti-ROR1 de ratón:

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQIPEKRLEWVASISRGGTTYYPDS

VKGRFTISRDNVRNILYL

QMSSLRSEDTAMYYCGRYDYDGYYAMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO: 3: Secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera del mAb 4A5 anti-ROR1 de ratón: GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTAT CACTTGCAAGGCGAGTCC

GGACATTAATAGCTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGA TCTATCGTGCAAACAGAT

TGGTTGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCGGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACC ATCAACAGCCTGGAGTAT

GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAATTTCCGTACACGTTCGGAGGGGG GACCAAGCTGGAAATGAA

AC SEQ ID NO: 4: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera del mAb 4A5 anti-ROR1 de ratón: DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASPDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF SGGGSGQDYSLTINSLEY

EDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEMK SEQ ID NO: 5: Secuencia codificadora de la región variable de la cadena pesada de los mAb F2, F12 y G6 anti-ROR1 de ratón:

CGCATTCACTGGCTACAACATGAACTGGGTGAAACAGACCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGA TTGGAAGTATTGATCCTT

ACTATGGTGGTTCTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAA TCCTCCAGCACAGCCTAC

ATGCAACTCAAGAGCCTCACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCCCCGGG GGGGGACTATGCTATGGA

CTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 6: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada de los mAb F2, F12 y G6 anti-ROR1 de ratón:

EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGFAFTGYNMNWVKQTNGKSLEWIGSIDPYYGGSTYNQ KFKDKATLTVDKSS STAY

MQLKSLTSDDSAVYYCARSPGGDYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 7: Secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera de los mAb F2, F12 y G6 anti-ROR1 de ratón:

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTGTAGGAGAGAGAGTCACTAT CACTTGTAAGGCGAGTCA

GGGCATTAATAGCTATTCAGGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGA TTTATCGTGGAAATAGAT

TGGTGGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACC ATCAGCAGCCTGGAGTAT

GAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGAGTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGG GACCAAGCTGGAAATAAA

AC SEQ ID NO: 8: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera de los mAb F2, F12 y G6 anti-ROR1 de ratón:

DIKMTQSPSSMYASVGERVTITCKASQGINSYSGWFQQKPGKSPKTLIYRGNRLVDGVPSRF SGSGSGQDYSLTISSLEY

EDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 9 Secuencia codificadora de la región variable de cadenas pesadas del mAb G3 anti-ROR1 de ratón: CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGACTTCAGTGAAGCTGTC CTGCAAGGCTTCTGGCTA

CAACTTCACCAACTACTGGATAAACTGGGTGAAGCTGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGA TTGGAGAAATTTATCCTG

GTAGTGGTAGTACTAATTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGCAGACACA TCCTCCAGCACAGCCTAC

ATGCAACTCAGCAGCCTGGCATCTGAAGACTCTGCTCTCTATTACTGTGCAAGAGATGGTAA CTACTATGCTATGGACTA

CTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 10 Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada del mAb G3 anti-ROR1 de ratón:

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYNFTNYWINWVKLRPGQGLEWIGEIYPGSGSTNYNE KFKSKATLTADTSSSTAY

MQLSSLASEDSALYYCARDGNYYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 11 Secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera del mAb G3 anti-ROR1 de ratón: GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCAT CACTTGCAGGGCAAGTCA

GGACATTAACAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGA TCTACTACACATCAGCAT TACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACC ATTAGCAACCTGGAACAA

GAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCTCCGTACACGTTCGGAGG GGGGACCAAGCTGGAAAT

AAAAC SEQ ID NO: 12 Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera del mAb G3 anti-ROR1 de ratón: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSALHSGVPSRF SGSGSGTDYSLTISNLEQ

EDIATYFCQQGNTLPPYTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 13 Secuencia codificadora de la región variable de la cadena pesada del mAb D10 anti-ROR1 de ratón: CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGACTCTGTCCATCAC TTGCACTGTCTCTGGGTT

TTCATTAACCAGTTATGGTGTACACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGC TGGGAGTAATATGGGCTG

GTGGATTCACAAATTATAATTCGGCTCTCAAGTCCAGACTGAGCATCAGCAAAGACAACTCC AAGAGCCAAGTTCTCTTA

AAAATGACCAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAGGAGAGGTAGTTC CTATTCTATGGACTATTG

GGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 14: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada del mAb D10 anti-ROR1 de ratón:

QVQLKESGPGLVAPSQTLSITCTVSGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGFTNYNSA LKSRLSISKDNSKSQVLL

KMTSLQTDDTAMYYCARRGS SYSMDYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO: 15 Secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera del mAb D10 anti-ROR1 de ratón: GAAATTGTGCTCTCTCAGTCTCCAGCCATCACAGCTGCATCTCTGGGCCAAAAGGTCACCAT CACCTGCAGTGCCAGTTC

AAATGTAAGTTACATCCACTGGTACCAGCAGAGGTCAGGCACCTCCCCCAGACCATGGATTT ATGAAATATCCAAACTGG

CTTCTGGAGTCCCAGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATC AGCAGCATGGAGGCTGAA

GATGCTGCCATTTATTATTGTCAGCAGTGGAATTATCCTCTTATCACGTTCGGCTCGGGGAC AAAGTTGGAAATACAA SEQ ID NO: 16 Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera del mAb D10 anti-ROR1 de ratón: EIVLSQSPAITAASLGQKVTITCSASSNVSYIHWYQQRSGTSPRPWIYEISKLASGVPVRFS GSGSGTSYSLTISSMEAE

DAAIYYCQQWNYPLITFGSGTKLEIQ SEQ ID NO: 17: Secuencia codificadora de la región variable de la cadena pesada de los mAb H10 y G11 anti-ROR1 de ratón:

GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTC CTGTGCAGCCTCTGGATT

CACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGG TCGCTTCCATTAGTACTG

GTGCTAGCGCCTACTTTCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC AGGAACATCCTGTACCTG CAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTATTGTGCAAGGATTACTACGTC TACCTGGTACTTCGATGT

CTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA SEQ ID NO: 18: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena pesada de los mAb H10 y G11 anti-ROR1 de ratón:

EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISTGASAYFPDS VKGRFTISRDNARNILYL

QMSSLRSEDTAMYYCARITTSTWYFDVWGAGTTVTVSS

SEQ ID NO: 19: Secuencia codificadora de la región variable de la cadena ligera de los mAb H10 y G11 anti-ROR1 de ratón:

GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTAT CACTTGCAAGGCGAGTCA

GGACATTAATAGTTATTTAAGCTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGACCCTGA TCTATCGTGCAAACAGAT

TGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACC ATCAGCAGCCTGGAGTAT

AC SEQ ID NO: 20: Secuencia polipeptídica de la región variable de la cadena ligera de los mAb H10 y G11 anti-ROR1 de ratón:

DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRF SGSGSGQDYSLTISSLEY

EDMGIYYCLQYDEFPYTFGGGTKLEIK

En un aspecto, se proporcionan anticuerpos en los que una cadena pesada está codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 13 y una cadena ligera está codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto un anticuerpo contiene una cadena pesada codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 3.

En aspectos adicionales se proporcionan anticuerpos que tienen una cadena pesada codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 5 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 7 o por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 11; o por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera codificada por la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID NO: 17.

En otro aspecto se proporcionan anticuerpos que contienen una cadena pesada con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 14 y una cadena ligera con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 16.

En otro aspecto se proporcionan anticuerpos que contienen una cadena pesada con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 2 y una cadena ligera con la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO: 4.

En una realización se proporcionan polinucleótidos aislados que codifican un anticuerpo que se une específicamente a la proteína ROR1 que (a) comprenden una región de cadena pesada codificada por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 90% con cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo consistente en las SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13 o 17, (b) comprenden una región de cadena ligera correspondiente codificada por polinucleótidos que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos 90% con cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo consistente en las SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15 o 19 y (c) se unen específicamente a cualquiera del extremo 3' o la porción central de la región similar a Ig del dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana o de múrido.

También se proporcionan anticuerpos que se unen a residuos en el centro de la región similar a Ig del dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana o de múrido (aminoácidos 1-147 en la molécula humana). Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen 4A5, G11, H10 y G3.

Se proporcionan adicionalmente anticuerpos que se unen a residuos en la región 3' similar a Ig y la región enlazadora entre el dominio similar a Ig y el dominio CRD de la proteína ROR-1 humana o de múrido (aminoácidos 1-165 en la molécula humana). En un aspecto, los anticuerpos de la presente invención se unen a los aminoácidos 130-165 de la ROR1 humana. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen D10, F2, F12 y G6.

Como alternativa o adicionalmente, los anticuerpos se unen a un residuo de ácido glutámico correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana en la posición 138.

Como alternativa o adicionalmente, un residuo correspondiente al encontrado en el dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana en la posición 138 es crítico para la actividad de unión de los anticuerpos.

Como alternativa o adicionalmente, el anticuerpo codificado tiene actividad in vivo en la reducción de la carga de células leucémicas o linfómicas en un modelo animal aceptado en la técnica a una tasa de 2-8 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 veces la del anticuerpo anti-ROR1 humano de tipo natural o anticuerpo monoclonal 4A5 (descrito en la presente memoria).

Como alternativa, o adicionalmente, el anticuerpo codificado tiene actividad in vivo en la inhibición de la expansión de linfocitos B leucémicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.

Como alternativa o adicionalmente, el anticuerpo codificado se internaliza en células leucémicas o linfómicas a una tasa de al menos 2 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces la del anticuerpo monoclonal 4A5. Tales anticuerpos son particularmente útiles como vehículos para el suministro de fármaco a una célula diana.

Un ejemplo de un anticuerpo que posee todas las características funcionales anteriormente mencionadas es D10, que tiene una región de cadena pesada codificada por la SEQ ID NO: 13 y una región de cadena ligera codificada por la SEQ ID NO: 15.

En otro aspecto, se proporcionan polipéptidos que consisten o comprenden anticuerpos que se unen específicamente a la proteína ROR1 y (a) comprenden una región de cadena pesada que tiene al menos una identidad de secuencia de al menos 90% con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14 o 18, (b) comprenden una región de cadena ligera correspondiente que tiene una identidad de secuencia de al menos 90% con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16 o 20 y (c) se unen específicamente a cualquiera del extremo 3’ o la porción central de la región similar a Ig del dominio extracelular de la proteína ROR-1 humana o de múrido. En un aspecto, el polipéptido aislado es un anticuerpo. En un aspecto adicional, el polipéptido es un Fab o F(ab)’2.

Se describe, pero no es parte de la invención, el anticuerpo puede contener adicionalmente un marcador detectable. Tales marcadores son conocidos en la técnica e incluyen radioisótopos y marcadores fluorescentes. Como tal, la internalización de un compuesto que evidencie el paso mediante transportadores puede ser detectado detectando una señal desde dentro de una célula de cualquiera de una variedad de indicadores. El indicador puede ser un marcador, tal como un fluoróforo, un cromóforo o un radioisótopo. Puede usarse también la formación de imágenes confocales para detectar la internalización de un marcado, ya que proporciona suficiente resolución espacial para distinguir entre fluorescencia sobre una superficie celular y fluorescencia dentro de una célula; como alternativa, se puede usar la formación de imágenes confocales para rastrear el movimiento de los compuestos con el tiempo. En otro enfoque, se detecta la internalización de un compuesto usando un indicador que es un sustrato de una enzima expresada dentro de una célula. Una vez se internaliza el complejo, el sustrato es metabolizado por la enzima y genera una señal óptica o descomposición radiactiva que es indicativa de la captación. La emisión de luz puede monitorizarse por instrumentos comerciales basados en PMT o por sistemas de formación de imágenes basados en CCD. Además, se emplean también procedimientos de ensayo que utilizan detección por LCMS de los compuestos transportados o de señales electrofisiológicas indicativas de la actividad de transporte.

En ciertas realizaciones terapéuticas, el anticuerpo seleccionado se puede administrar solo, en combinación con otro anticuerpo de la invención o con uno o más agentes terapéuticos combinatorios para tratar un cáncer de ROR-1. Cuando se administran uno o más de los anticuerpos descritos en la presente memoria como agentes terapéuticos, pueden ejercer un efecto beneficioso en el sujeto mediante una variedad de mecanismos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se purifican anticuerpos que se unen específicamente a ROR1 y se administran a un paciente para neutralizar una o más formas de ROR1, para bloquear una o más actividades de ROR1 o para bloquear o inhibir una interacción de una o más formas de ROR1 con otra biomolécula; por ejemplo, para tratar LLC u otros cánceres de ROR1. Todos los procedimientos terapéuticos mencionados se practican por suministro de una dosificación terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que contiene los anticuerpos y agentes terapéuticos, que puede ser determinados por un farmacólogo o facultativo especialista en inmunoterapia de cáncer humano.

La invención se refiere a un uso de un anticuerpo como se define en las reivindicaciones en un método para el tratamiento de cáncer mediante la administración, a un sujeto humano que lo necesita, de una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Dicho método para el tratamiento de cáncer comprende la administración, a un sujeto humano que necesita, de una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de acuerdo con la invención.

Ventajosamente, dichos métodos proporcionan una reducción de la carga de células leucémicas o linfómicas (como se demuestra en y equivalente a un modelo animal aceptado en la técnica) de 2-8 veces, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 veces la del anticuerpo anti-ROR1 humano de tipo natural o anticuerpo monoclonal 4A5 (descrito en la presente memoria).

Dichos métodos proporcionan adicionalmente un enfoque terapéutico para inhibir la expansión de linfocitos B leucémicos CD5^dullB220⁺y ROR1^brightB220⁺.

Como se estudia en la presente memoria, los anticuerpos de la invención pueden incluir anticuerpos humanizados y se pueden combinar para uso terapéutico con ingredientes activos o inertes adicionales, por ejemplo, en vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, por ejemplo, adyuvantes inmunogénicos, y opcionalmente con moléculas complementarias o combinatoriamente activas, tales como fármacos antiinflamatorios y antifibrinolíticos. Los anticuerpos que se internalizan fácilmente en células, como se demuestra en la presente memoria con respecto al anticuerpo D10, son también de uso particular como vehículos para el suministro de fármacos a células diana (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 21-23). Los especialistas en la técnica estarán familiarizados con métodos para la producción de conjugados de anticuerpo-fármaco útiles en tales protocolos de suministro de fármaco.

Al llevar a cabo diversos métodos de ensayo, de diagnóstico y terapéuticos que no son parte de la invención, es deseable preparar por adelantado kits que comprenden una combinación de anticuerpos como se describen en la presente memoria con otros materiales. Por ejemplo, en el caso de inmunoensayos enzimáticos de tipo sándwich, los kits de la invención pueden contener un anticuerpo que se une específicamente a ROR1 unido opcionalmente a un vehículo apropiado, una preparación liofilizada o una solución de un anticuerpo monoclonal marcado con enzima que se puede unir al mismo antígeno junto con el anticuerpo monoclonal o de un anticuerpo policlonal marcado con la enzima de la misma manera, una solución patrón de ROR1 purificada, una solución tampón, una solución de lavado, pipetas, un recipiente de reacción y similares. Además, los kits incluyen opcionalmente materiales de etiquetado y/o explicativos que proporcionan instrucciones (es decir, protocolos) para la práctica de los métodos descritos en la presente memoria en un entorno de ensayo. Aunque los materiales explicativos comprenden típicamente materiales escritos o impresos, no están limitados a ellos. Se contempla cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Tales medios incluyen, pero no se limitan a medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM) y similares. Tales medios pueden incluir direcciones de sitios de internet que proporcionan tales materiales explicativos.

En general, un método in vitro de diagnóstico de un cáncer de ROR-1 comprenderá poner en contacto las presuntas células cancerosas de un sujeto humano con un anticuerpo de acuerdo con la invención, y detectar la unión con ROR-1 expresada en dichas células en comparación con la expresión en células no cancerosas humanas post embrionarias. Todos los dichos métodos de diagnóstico se practican mediante el suministro de una cantidad con efecto de diagnóstico de anticuerpos de acuerdo con la invención, que puede ser determinada por un especialista en diagnóstico o ingeniero de diagnóstico in vivo especializado en el diagnóstico de cáncer humano.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar la invención.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales anti-ROR1

Para la producción de mAb generados por hibridoma, se inocularon ratones con ADN, proteína y construcciones adenovirales que expresan la porción extracelular (AA 1-406) de la proteína ROR1 que incluye los dominios similares a Ig, CRD y Kringle y regiones enlazadoras adyacentes (Figuras 10-11). Debido al alto grado de homología entre las moléculas de múrido y humanas, se coinyectaron una variedad de citoquinas y agentes inmunoestimulantes, tales como adyuvante completo de Freund, para maximizar la generación de anticuerpos anti-ROR1 humana. Se generaron mAb generados por hibridoma y se seleccionó la unión a ROR1 humana y de múrido. Un ejemplo de mAb derivados de hibridoma es D10.

Ejemplo 2: Generación de anticuerpos anti-ROR1 usando presentación de fagos

Se generó un segundo conjunto de anticuerpos mediante el uso de una colección de fago mejorada patentada (Alere, Inc. San Diego). Estos anticuerpos anti-ROR1 humana se unen a epítopos que cubren toda la longitud del dominio extracelular de la proteína ROR1 (Figura 12). Un ejemplo de un anticuerpo anti-ROR1 derivado de presentación de fago es 4A5.

Ejemplo 3: Análisis in vitro de anticuerpos anti-ROR1

Se seleccionaron los anticuerpos generados por hibridomas o presentación de fagos para la unión a ROR1 humana y de múrido. Se determinó que los anticuerpos D10 y 4A5 anti-ROR1 se unían solo a ROR1 humana y no reaccionaban de forma cruzada con ROR1 de múrido.

Ejemplo 4: Determinación de los sitios de unión para anticuerpos anti-ROR1

Debido a que los mAb anti-ROR1 son específicos de especie, se generaron una serie de proteínas quiméricas que se usaron para determinar el sitio de unión de cada uno de los mAb anti-ROR1 (Figura 13). Como selección de segundo nivel, se generó una serie de construcciones por deleción para determinar el dominio extracelular de ROR1 real al que se unen los mAb. Una vez se identificó el dominio de unión, se generaron moléculas de ROR1 quiméricas truncadas para identificar subregiones específicas que son reconocidas por los mAb anti-ROR1 humana (Figura 14). Como etapa final, se determinaron los aminoácidos reales diana de estos anticuerpos. Para esta selección final, se generaron aminoácidos humanos muridizados en los fragmentos de subdominio para determinar los residuos críticos requeridos para la unión de mAb (Figura 15). A partir de este paradigma de selección, se determinaron los subdominios de unión para los mAb (Figura 15). Se determinó que el mAb D10 anti-ROR1 humana requería el residuo de ácido glutámico en la posición 138 para unirse al dominio similar a Ig de la molécula de ROR1 humana. Cuando se reemplaza este aminoácido por el residuo de lisina de la molécula de múrido, la molécula D10 ya no se une a la proteína ROR1.

De manera similar, se determinó que el mAb 4A5 anti-ROR1 humana requería el residuo de isoleucina en la posición 111 se uniera a la molécula de ROR1 humana (Figura 24). Cuando se reemplaza este aminoácido por el residuo de asparagina de la molécula de múrido, la molécula 4A5 ya no se une a la proteína ROR1. Se determinó también que los anticuerpos G11, H10 y G3 anti-ROR1 se unen a la misma región que 4A5.

Usando técnicas estándares de bloqueo cruzado, se determinaron los sitios de unión para los anticuerpos F2, F12 y G6 anti- ROR1. Estos experimentos determinaron que los anticuerpos F2, F12 y G6 bloquean de forma cruzada el anticuerpo D10 anti-ROR1, indicando que comparten un sitio de unión.

Ejemplo 5: Determinación de los valores de K^dpara los anticuerpos D10 y 4A5 anti-ROR1

Se determinaron los valores de K^dpara los anticuerpos anti-ROR1 usando técnicas estándares. Se determinó que la K^dpara el anticuerpo D10 era 40 nM y para el anticuerpo 4A5 era 4 nM (Figuras 16A y B).

Ejemplo 6: Análisis in vivo de anticuerpos anti-ROR1

Se valoró el mAb D10 en varios modelos in vivo. En un modelo de actividad dependiente del nicho xenográfico in vivo de múrido, se administraron dos dosis de mAb a 10 mg/kg contra 4 células de LLC de paciente primario en 76 ratones. Como se muestra en la Figura 17, el mAb D10 eliminaba sustancialmente las células de LLC del paciente de manera dependiente de la dosis. En contraposición, el mAb 4A5 tuvo una actividad mínima en estos estudios, aunque el kDa de este mAb sea 10 veces mayor (4 frente a 40) que para el mAb D10.

Además de este modelo de actividad, se ensayó también el mAb D10 en un modelo de ratón transgénico inmunocompetente que genera espontáneamente células leucémicas que expresan la proteína ROR1 humana (Figuras 18-20). Se administraron los mAb D10 y 4A5 específicos de ROR1 o anticuerpos IgG de control (10 mg/kg) antes y después de la transferencia adoptiva de linfocitos B ROR1xTCL1 LLC en ratones Balb C. El mAb D10, pero no el IgG de control ni 4A5, era capaz de inhibir el desarrollo y expansión de linfocitos B leucémicos ROR1xTCL en la sangre de animales receptores hasta dos semanas después de recibir la última infusión de mAb.

Junto con la actividad antileucémica de este mAb, se ha demostrado también que el anticuerpo D10 anti-ROR1 se internaliza en células de LLC de paciente y líneas celulares de leucemia y linfoma de linfocitos B a una mayor tasa y grado que otros mAb anti-ROR1 que se unen a otros sitios antigénicos en la porción extracelular de la proteína ROR1 (Figuras 21-23). Debido a la ausencia de la proteína ROR1 en tejidos postparto y a su rápida tasa de internalización, el mAb D10 puede servir como una excelente proteína portadora para fármacos; por ejemplo, para uso en citotoxicidad dirigida mediada por el conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Basándose en estos hallazgos preclínicos, el mAb D10 tiene potencial para tener actividad terapéutica contra leucemias, linfomas y cánceres tumorales sólidos que expresan ROR1 como terapia dirigida y/o vehículo de fármaco conjugado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o una composición farmacéuticamente aceptable que comprende el anticuerpo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de un cáncer que expresa ROR-1, donde el anticuerpo se une al mismo epítopo como un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera codificadas por la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:13 (cadena pesada) la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:15 (cadena ligera).

2. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1, donde el cáncer que expresa ROR-1 es leucemia, linfoma, LLC, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de linfocitos B de células marginales, leucemia de linfocitos B, linfoma de Burkett, carcinoma de células renales, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de mama, carcinoma espinocelular epitelial, melanoma, mieloma, cáncer de estómago, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de tiroides o cáncer de cabeza y cuello.

3. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde el uso comprende reducir la carga de células linfómicas o leucémicas.

4. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el uso comprende inhibir la expansión de linfocitos B leucémicos CD5dullB220+ y ROR1brightB220+.

5. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el uso comprende administrar el anticuerpo con otro agente terapéutico.

6. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el anticuerpo es humano, quimérico o humanizado.

7. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el anticuerpo sirve como proteína vehículo para un fármaco.

8. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con la reivindicación 7, donde el fármaco se conjuga al anticuerpo, proporcionando así un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC).

9. El anticuerpo o composición para usar de acuerdo con la reivindicación 8, donde el conjugado anticuerpo-fármaco media en la citotoxicidad.

10. La composición para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable comprende un adyuvante inmunogénico.