ES2865148T3 - Ligandos de carbohidratos que se unen a los anticuerpos IgM contra la glucoproteína asociada a mielina - Google Patents

Ligandos de carbohidratos que se unen a los anticuerpos IgM contra la glucoproteína asociada a mielina Download PDF

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Abstract

Un compuesto de la Fórmula (I) **(Ver fórmula)** o de la Fórmula (II) **(Ver fórmula)** en donde Z es fenilo sustituido o no sustituido.

Description

DESCRIPCIÓN
Ligandos de carbohidratos que se unen a los anticuerpos IgM contra la glucoproteína asociada a mielina
Campo de la invención
La invención se refiere a los ligandos de carbohidratos que se unen a anticuerpos IgM contra la glucoproteína asociada a mielina (MAG), los polímeros que los comprenden, y a su uso en el diagnóstico y la terapia de la neuropatía anti-MAG.
Antecedentes de la invención
La neuropatía anti-glucoproteína asociada a mielina es una neuropatía periférica desmielinizante, provocada por autoanticuerpos que reconocen el epítopo de carbohidrato HNK-1 antigénico, que se encuentra en la glucoproteína asociada a mielina (MAG) y otros glucoconjugados del sistema nervioso periférico (SNP). El cuadro clínico se caracteriza por una neuropatía desmielinizante predominantemente sensorial de progresión lenta. La correlación de altos niveles de anticuerpos y la desmielinización están bien establecidas. Así, los estudios patológicos sobre las biopsias nerviosas de pacientes muestran desmielinización y ensanchamiento de las laminillas de mielina, así como también depósitos de IgM anti-MAG en la mielina. Además, la reducción terapéutica de la concentración de anticuerpos IgM conduce a una mejora clínica de los síntomas neuropáticos. (A.J. Steck y otros, Current Opinion in Neurology 2006, 19:458-463; M.C. Dalakas, Current Treatment Options in Neurology 2010, 12:71-83).
Los glucoconjugados de mielina que contienen el epítopo HNK-1 incluyen las glucoproteínas MAG, la proteína cero (P0), la proteína de la mielina periférica 22 (PMP22), así como también los glucolípidos sulfoglucuronil paraglobósido (SGPG) y sulfoglucuronil lactosaminil paraglobósido (SGLPG). Varias observaciones sugieren que MAG es la principal diana de los anticuerpos IgM: (i) Los depósitos de anticuerpos de los pacientes contra los sitios del SNP se localizan conjuntamente con la MAG, (ii) la MAG se pierde selectivamente de la mielina y (iii) la patología nerviosa humana y los ratones inactivos a MAG muestran similitudes características (R.H. Quarles, Journal of Neurochemistry 2007, 100:1431-1448).
La MAG pertenece a la familia de lectinas de tipo inmunoglobulina que se unen al ácido siálico (Siglecs). Se localiza principalmente en las membranas periaxonales de las células oligodendrogliales en el SNC y las células de Schwann en el SNP y participa en los procesos de adhesión y señalización en la interfaz axón-glía (R.H. Quarles, 2007, loc. cit.). La MAG está fuertemente glucosilada, es decir, el 30 % de su peso molecular es aportado por oligosacáridos heterogéneos W-enlazados. Los ocho sitios potenciales de W-glucosilación de MAG pueden tener el epítopo HNK-1. Los dos glucolípidos (SGPG, SGLPG) que tienen el epítopo HNK-1 contienen ácido 3-O-sulfoglucurónico (SO3-3GlcA) como sello distintivo específico (T. Ariga y otros, J Biol Chem 1987, 262:848-853). Curiosamente, la estructura del epítopo HNK-1 de la glucoproteína bovina P0 también contiene este rasgo característico. La similitud entre las tres estructuras dilucidadas se limita al trisacárido terminal. En consecuencia, el epítopo HNK-1 se definió como SO3-3 -GlcA(P1-3)Gal(P1-4)GlcWAc-OH.
El epítopo de carbohidrato preciso reconocido por los anticuerpos IgM sigue sin estar claro. Un estudio con derivados de SGPG mostró que los anticuerpos IgM dan diferente importancia al grupo carboxilo y al grupo sulfato. Mientras que el SGPG "intacto", que contiene ambos grupos cargados negativamente, se informó como un epítopo óptimo para la unión de anticuerpos (A.A. Ilyas y otros., J Neurochemistry 1990, 55:594-601), otros estudios enfatizan la importancia de la longitud de la cadena de carbohidratos para el reconocimiento de los anticuerpos. Además, el epítopo de disacárido SO3-3-GlcA(P-3)Gal parece ser el requisito mínimo para la unión (A. Tokuda y otros, J. Carbohydrate Chemistry 1998, 17:535-546).
El documento núm. WO 97/07810 A1 describe las composiciones que comprenden los carbohidratos complejos que pueden estimular el crecimiento neuronal mediante la inhibición de la actividad inhibidora neuronal de la glucoproteína asociada a mielina (MAG), los métodos de uso de los compuestos para estimular el crecimiento neuronal.
Resumen de la invención
La invención se refiere a los ligandos de carbohidratos que se unen a los anticuerpos IgM anti-MAG y su uso en el diagnóstico así como también para el tratamiento de la neuropatía anti-MAG.
En particular, la invención se refiere a los disacáridos de la Fórmula (I)
Figure imgf000002_0001
y de la Fórmula (II)
Figure imgf000003_0001
en donde Z es fenilo sustituido o no sustituido.
Además, la invención se refiere a los polímeros terapéuticamente aceptables que comprenden una multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), en donde Z es un enlazador que conecta dicho sustituyente a la cadena principal del polímero.
La invención se refiere también a las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, los kits de diagnóstico que los contienen y al uso de estos compuestos para el diagnóstico y la terapia de la neuropatía anti-MAG. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática de un ensayo de unión competitiva
(a) Incubación de placas recubiertas con MAG con IgM anti-MAG (sueros de pacientes) y el polímero 25. (b) Etapa de lavado. (c) Incubación con anticuerpo anti-IgM humana acoplado a peroxidasa de rábano picante. (d) Etapa de lavado. (e) Adición de sustrato de tetrametilbencidina (TMB). (f) Adición de solución de parada ácida y medición de la densidad óptica.
Figura 2. Curvas de unión para los compuestos 1,2 y 25
2(a) Los pocillos recubiertos con MAG se incubaron conjuntamente con el compuesto 1 (concentración máxima 50 mM) y los sueros de cuatro pacientes MK, DP, KH y SJ (%ab = % de unión del anticuerpo IgM a MAG).
2(b) Incubación conjunta de pocillos recubiertos con MAG con el compuesto 2 (concentración máxima 50 mM) junto con sueros de pacientes MK y SJ.
2(c) Incubación conjunta con el compuesto 25 (concentración máxima 15 ^M) junto con los sueros de pacientes MK, KH y SJ. El compuesto 25 es un polímero de polilisina con un porcentaje definido de residuos de lisina acoplados al epítopo HNK-1 mínimo (1). La abreviatura general usada es la siguiente: PL(minHNK-1)x, donde x define el porcentaje de carga de epítopo en %. En este caso, el polímero es PL(minHNK-1)44.
2(d) Incubación conjunta con el suero de paciente KH junto con los polímeros PL(minHNK-1)x, donde x es 10, 25, 31 y 44 % (concentración máxima 0,5 mM).
2(e) Incubación conjunta con el anticuerpo monoclonal IgM anti-HNK-1 de ratón, un anticuerpo de control positivo, junto con los polímeros PL(minHNK-1)x, donde x es 10, 25, 31 y 44 % (concentración máxima 0,5 mM).
Descripción detallada de la invención
Se identificó un epítopo de carbohidrato HNK-1 mínimo reconocido de manera confiable por los anticuerpos IgM anti-MAG y se prepararon los disacáridos correspondientes tanto en una forma sulfatada (Fórmula I) como no sulfatada (Fórmula II).
La invención se refiere a estos disacáridos de la Fórmula (I)
Figure imgf000003_0002
y de la Fórmula (II)
Figure imgf000003_0003
en donde Z es fenilo sustituido o no sustituido. El resto de sulfato en la Fórmula (I) se encuentra en la posición 3 del ácido glucurónico.
Además, la invención se refiere a los polímeros que comprenden una multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), en donde Z es un enlazador que conecta dicho sustituyente a la cadena principal del polímero.
En particular, el enlazador Z es arilo (bifuncional), heteroarilo, arilalquilo inferior, arilcarbonilo o heteroarilmetilo, en donde el arilo o el heteroarilo está sustituido por alquileno con 3 a 25 átomos de carbono que se conectan al polímero en donde opcionalmente
(a) uno o más átomos de carbono de alquileno se reemplazan por nitrógeno que tiene un átomo de hidrógeno, y uno de los átomos de carbono adyacentes está sustituido por oxo, que representa una función amida -NH-CO-; y/o
(b) uno o más átomos de carbono de alquileno se reemplazan por oxígeno;
(c) uno o más átomos de carbono de alquileno se reemplazan por azufre; y/o
(d1) el átomo de carbono terminal que se conecta al polímero está sustituido por oxo; o
(d2) el átomo de carbono terminal que se conecta al polímero se reemplaza por -NH-.
El polímero que comprende la multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), en donde Z es un enlazador que conecta dicho sustituyente a la cadena principal del polímero, es preferentemente un polímero de a-aminoácido, un polímero o copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico, o un copolímero de N-vinil-2-pirrolidona-alcohol vinílico.
Los ejemplos particulares de los polímeros de la invención son
(A) un poli-a-aminoácido, en donde el aminoácido tiene una función aminoalquilo de la cadena lateral, tal como en la polilisina, en particular poli-L-lisina o poli-D-lisina, y el grupo amino está conectado a un grupo carbonilo terminal del enlazador bifuncional Z;
(B) un poli-a-aminoácido, en donde el aminoácido tiene una función carbonilalquilo de la cadena lateral, tal como en el ácido poliaspártico o poliglutámico, y el grupo carbonilo (que corresponde al grupo carboxi original en el ácido aspártico y el ácido glutámico, respectivamente) está conectado a un grupo terminal -CH2 del enlazador bifuncional Z;
(C) ácido poliacrílico, ácido polimetacrílico o un copolímero de ácido acrílico y metacrílico, en donde el grupo carboxi está amidado por un grupo amino terminal del enlazador bifuncional Z; y
(D) un copolímero de N-vinil-2-pirrolidona y alcohol vinílico, en donde el grupo hidroxi de la parte de alcohol vinílico del copolímero está conectado a un grupo carbonilo terminal del enlazador bifuncional Z.
En una modalidad particular, un polímero (A) comprende la Fórmula parcial (III)
Figure imgf000004_0001
en donde
R1 es un sustituyente aminoalquilo conectado al enlazador Z, en donde el grupo alquileno de Z tiene un grupo oxo en la posición terminal conectado al grupo amino de R1,
R2 es 2,3-dihidroxipropiltioacetil-aminoalquilo,
y la relación entre las dos entidades entre corchetes con R1 y R2, respectivamente, en el polímero indica la relación de la carga de disacárido con la función amino bloqueada.
Por ejemplo, R1 tiene la Fórmula (Illa)
Figure imgf000004_0002
y R2 tiene la Fórmula (IIIb)
Figure imgf000005_0001
en donde o está entre 1 y 6, preferentemente 3 o 4, p está entre 1 y 6, preferentemente entre 2 y 4, en particular 3, y q está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
Cuando o es 3, el sustituyente R1 representa una cadena lateral de poliornitina, y cuando o es 4, el sustituyente R1 representa una cadena lateral de polilisina, conectado a un enlazador Z que tiene un disacárido de la Fórmula (I) o (II) a la valencia libre, y R2 es 2,3-dihidroxipropiltioacetil-aminoalquilo, es decir, una función amino bloqueada que tiene un sustituyente solubilizante.
El poliaminoácido puede ser lineal, hiperramificado o dendrítico, como describen Z. Kadlecova y otros, Biomacromolecules 2012, 13:3127-3137, para la polilisina como sigue:
Figure imgf000005_0002
La polilisina usada para preparar el polímero (A) de la Fórmula (MI) tiene preferentemente un peso molecular entre 15 000 y 300000, en particular de 30000 a 70000, y dichos polímeros se conectan además mediante un enlazador Z a los compuestos de la Fórmula (I) y/o (II) y se prefieren con un residuo 2,3-dihidroxipropiltioacetilo de bloqueo.
En una modalidad particular, un polímero (B) comprende la Fórmula parcial (III)
Figure imgf000006_0001
en donde
R1 es un sustituyente carbonilalquilo conectado al enlazador Z, en donde el grupo alquileno de Z tiene un grupo -CH2 en la posición terminal conectado al grupo carbonilo de R1, R2 es 2,3-dihidroxipropiltioacetilcarbonilalquilo, y la relación entre las dos entidades entre corchetes con R1 y R2, respectivamente, en el polímero indica la relación de la carga de disacárido con la función carbonilo o carboxilo bloqueada.
Por ejemplo, R1 tiene la Fórmula (IIIc)
Figure imgf000006_0002
y R2 tiene la Fórmula (IIId)
Figure imgf000006_0003
en donde o está entre 1 y 6, preferentemente 1 o 2, p está entre 1 y 6, preferentemente entre 2 y 4, en particular 3, y q está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
Cuando o es 1, el sustituyente R1 representa una cadena lateral de poliácido glutámico, y cuando o es 2, el sustituyente R1 representa una cadena lateral de poliácido aspártico, conectado a un enlazador Z que tiene un disacárido de la Fórmula (I) o (II) en la valencia libre, y R2 es 2,3-dihidroxipropiltioacetil-carbonilalquilo, es decir, una función carboxi bloqueada que tiene un sustituyente solubilizante.
El poliácido aspártico usado para preparar el polímero (B) de la Fórmula (III) tiene preferentemente un peso molecular entre 15000 y 300000, en particular de 30000 a 70000, y tales polímeros reaccionan adicionalmente con el enlazador Z conectado a los compuestos de la Fórmula (I) y/o (II) y se prefieren con un residuo 2,3-dihidroxipropiltioalquilo de bloqueo.
En una modalidad particular, un polímero (C) comprende la Fórmula parcial (IV)
Figure imgf000006_0004
en donde
R1 es un enlazador Z, en donde el grupo alquileno de Z tiene un grupo -NH2- en la posición terminal conectado al grupo carbonilo en (IV),
R2 es 2,3-dihidroxipropiltioacetilaminoalquilamino o un sustituyente amino relacionado, y R3 es hidrógeno o metilo; y la relación entre las dos entidades entre corchetes con R1 y R2, respectivamente, en el polímero indica la relación de la carga de disacárido con la función carboxi bloqueada.
Por ejemplo, R1 tiene la Fórmula (IVa)
Figure imgf000007_0001
y R2 tiene la Fórmula (IVb)
Figure imgf000007_0002
en donde q está entre 1 y 6, preferentemente entre 4 y 6, y r está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
En otra modalidad, R1 tiene la Fórmula (IVd)
Figure imgf000007_0003
y R2 tiene la Fórmula (IVe)
Figure imgf000007_0004
en donde p está entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 4, q está entre 1 y 6, preferentemente entre 4 y 6, y r está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
En otra modalidad, R1 tiene la Fórmula (IVf)
Figure imgf000007_0005
en donde r está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2, y R2 tiene la Fórmula (IVc) (arriba).
El poliácido acrílico usado para preparar el polímero (C) de la Fórmula (IV) tiene preferentemente un peso molecular entre 30000 y 400000, en particular 30000 a 160000, y dichos polímeros reaccionan adicionalmente con el enlazador Z conectado a los compuestos de la Fórmula (I) y/o (II) y se prefieren con un residuo 2,3-dihidroxipropiltioacetilo de bloqueo.
En una modalidad particular, un polímero (D) comprende la Fórmula parcial (V)
Figure imgf000007_0006
en donde
R1 es un enlazador Z, en donde el grupo alquileno de Z tiene un grupo aminocarbonilo en la posición terminal conectado al grupo hidroxilo en (V),
R2 es 2,3-dihidroxipropiltioacetilaminoalquilaminocarbonilo o un sustituyente aminocarbonilo relacionado, y la relación entre las dos entidades entre corchetes con R1 y R2, respectivamente, en el polímero indica la relación de la carga de disacárido con la función hidroxi bloqueada.
Por ejemplo, R1 tiene la Fórmula (Va)
Figure imgf000008_0001
y R2 tiene la Fórmula (Vb)
Figure imgf000008_0002
en donde q está entre 1 y 6, preferentemente entre 4 y 6, y r está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
En otra modalidad, R1 tiene la Fórmula (Vc)
Figure imgf000008_0003
y R2 tiene la Fórmula (Vd)
Figure imgf000008_0004
en donde p está entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 4, q está entre 1 y 6, preferentemente entre 4 y 6, y r está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
En otra modalidad R1 tiene la Fórmula (Ve)
Figure imgf000008_0005
y R2 tiene la Fórmula (Vf)
Figure imgf000008_0006
en donde r está entre 1 y 6, preferentemente entre 1 y 4, en particular 2.
El copolímero usado para preparar el polímero (D) de la Fórmula (V) tiene preferentemente un peso molecular entre 30 000 y 400 000, en particular 30 000 a 160 000, y tales polímeros reaccionan adicionalmente con el enlazador Z conectado a los compuestos de la Fórmula (I) y/o (ll) y se prefieren con un residuo 2,3-dihidroxipropiltioacetilo de bloqueo.
Los términos generales usados en la presente descripción anteriormente y en lo sucesivo preferentemente tienen dentro del contexto de esta descripción los siguientes significados, a menos que se indique de cualquier otra manera: El prefijo "inferior" indica un radical que tiene hasta, y que incluye, un máximo de 7, especialmente hasta, y que incluye, un máximo de 4 átomos de carbono, los radicales son en cuestión lineales o ramificados con ramificación simple o múltiple.
Cuando se usa la forma plural para compuestos, sales y similares, se entiende también un solo compuesto, sal o similar.
En principio, los dobles enlaces pueden tener configuración E- o Z-. Por tanto, los compuestos de esta invención pueden existir como mezclas isoméricas o isómeros individuales. Si no se especifica, se pretenden ambas formas isoméricas.
Cualquier átomo de carbono asimétrico puede estar presente en la configuración (R)-, (S)- o (R,S)-, preferentemente en la configuración (R)- o (S)-. Por tanto, los compuestos pueden estar presentes como mezclas de isómeros o como isómeros puros, preferentemente como enantiómeros-diastereómeros puros.
El alquilo (o alquileno bifuncional en un enlazador) tiene de 1 a 25, por ejemplo de 1 a 12, preferentemente de 1 a 7 átomos de carbono, y es lineal o ramificado. El alquilo es preferentemente un alquilo inferior. Preferentemente, el alquileno (bifuncional) tiene de 3 a 25, preferentemente de 4 a 12 átomos de carbono.
El alquilo inferior tiene de 1 a 7, preferentemente de 1 a 4 átomos de carbono y es butilo, tales como n-butilo, secbutilo, isobutilo, terbutilo, propilo, tales como n-propilo o isopropilo, etilo o metilo. Preferentemente, el alquilo inferior es metilo o etilo.
El cicloalquilo tiene preferentemente de 3 a 7 átomos de carbono en el anillo y puede estar sustituido o no sustituido, por ejemplo, con alquilo inferior o alcoxi inferior. El cicloalquilo es, por ejemplo, ciclohexilo, ciclopentilo, metilciclopentilo o ciclopropilo, en particular ciclopropilo.
El arilo representa un grupo aromático de anillo condensado mono o bicíclico con 5 a 10 átomos de carbono que opcionalmente tienen sustituyentes, tales como fenilo, 1-naftilo o 2-naftilo, o también un anillo condensado bicíclico parcialmente saturado que comprende un grupo fenilo, tal como indanilo, indolinilo, dihidro o tetrahidronaftilo, todos opcionalmente sustituidos. Preferentemente, el arilo es fenilo, indanilo, indolinilo o tetrahidronaftilo, en particular fenilo.
El término "sustituyentes que tienen arilo" significa arilo sustituido con hasta cuatro sustituyentes que se seleccionan independientemente de alquilo inferior, haloalquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, carboxialquilo inferior, alcoxicarbonil inferior-alquilo inferior; arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde el arilo o heteroarilo no están sustituidos o están sustituidos con hasta tres sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, ciclopropilo, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxisulfonilo, aminosulfonilo, tetrazolilo, carboxi, halógeno, amino, ciano y nitro; hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, ariloxialquilo inferior, heteroariloxialquilo inferior, arilalcoxi inferior-alquilo inferior, heteroarilalcoxi inferior-alquilo inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior-alquilo inferior; aminoalquilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxialquilo inferior y aminoalquilo inferior, o por un sustituyente alquilcarbonilo o mercaptoalquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminoalcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-aminocarbonilo y alcoxicarbonilo inferior, o en donde los dos sustituyentes del nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, cicloalquilalcoxi inferior, ariloxi, arilalcoxi inferior, ariloxi-alcoxi inferior, heteroariloxi, heteroarilalcoxi inferior, heteroariloxialcoxi inferior, alqueniloxi opcionalmente sustituido, alquiniloxi opcionalmente sustituido, cicloalquiloxi, heterocicliloxi, hidroxisulfoniloxi; alquilmercapto, hidroxisulfinilo, alquilsulfinilo, haloalquilsulfinilo inferior, hidroxisulfonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo; aminosulfonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; amino opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, dialquilamino inferior-alquilo inferior, cicloalquilo, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido y alquilo heteroalquilo inferior opcionalmente sustituido, o por un sustituyente fenilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alquilcarbonilo, fenilcarbonilo opcionalmente sustituido, piridilcarbonilo opcionalmente sustituido, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo, y en donde el alquilo o alquilo inferior en cada caso puede estar sustituido por halógeno, alcoxi inferior, arilo, heteroarilo o amino opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes del nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; carboximetilamino o alcoxicarbonilmetilamino inferior sustituido en el grupo metilo de manera que el sustituyente resultante corresponda a uno de los 20 aminoácidos estándar de origen natural, aminometilcarbonilamino sustituido en el grupo metilo de manera que el grupo acilo resultante corresponda a uno de los 20 aminoácidos estándar de origen natural; alquilcarbonilo inferior, haloalquilcarbonilo inferior, fenilcarbonilo opcionalmente sustituido, heteroarilcarbonilo opcionalmente sustituido, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-alcoxicarbonilo inferior; aminocarbonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con un grupo hidroxi o amino o uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferioralquilo inferior, cicloalquilo, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes del nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes en posición orto entre sí pueden formar un anillo carbocíclico o heterocíclico de 5, 6 o 7 miembros que contiene uno, dos o tres átomos de oxígeno, uno o dos átomos de nitrógeno y/o un átomo de azufre, en donde los átomos de nitrógeno están opcionalmente sustituidos con alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior o alquilcarbonilo inferior.
En particular, los sustituyentes pueden seleccionarse independientemente de alquilo inferior, haloalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, ciclohexilo, ciclopropilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, cicloalquiloxi, fenoxi, hidroxisulfoniloxi; alquilmercapto, hidroxisulfinilo, alquilsulfinilo, haloalquilsulfinilo inferior, hidroxisulfonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo; aminosulfonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con uno o dos sustituyentes que se selecciona de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior y fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; amino opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, dialquilamino inferior-alquilo inferior, cicloalquilo o por un sustituyente fenilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alquilcarbonilo, fenilcarbonilo opcionalmente sustituido, piridilcarbonilo, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; carboximetilamino o alcoxicarbonilmetilamino inferior sustituido en el grupo metilo de manera que el sustituyente resultante corresponda a uno de los 20 aminoácidos estándar de origen natural, aminometilcarbonilamino sustituido en el grupo metilo de manera que el grupo acilo resultante corresponda a uno de los 20 aminoácidos estándar de origen natural; alquilcarbonilo inferior, haloalquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-alcoxicarbonilo inferior; aminocarbonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con un grupo hidroxi o amino o uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos los sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes en posición orto entre sí pueden formar un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos átomos de oxígeno y/o uno o dos átomos de nitrógeno, en donde los átomos de nitrógeno están opcionalmente sustituidos con alquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior o alquilcarbonilo inferior.
En el fenilo opcionalmente sustituido, los sustituyentes son preferentemente alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aminoalquilo inferior, acilaminoalquilo inferior, ciclopropilo, hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, metilenodioxi, hidroxisulfoniloxi, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, aminocarbonilo, hidroxilaminocarbonilo, tetrazolilo, hidroxisulfonilo, aminosulfonilo, halo, ciano o nitro, en particular alcoxi inferior, aminoalquilo inferior, acilaminoalquilo inferior, carboxi, alkoxicarbonilo inferior, aminocarbonilo, hidroxilaminocarbonilo, tetrazolilo, o aminosulfonilo.
El heteroarilo representa un grupo aromático que contiene al menos un heteroátomo que se selecciona de nitrógeno, oxígeno y azufre, y es mono o bicíclico, que opcionalmente tiene sustituyentes. El heteroarilo monocíclico incluye grupos heteroarilo de 5 o 6 miembros que contienen 1,2, 3 o 4 heteroátomos que se seleccionan de nitrógeno, azufre y oxígeno. El heteroarilo bicíclico incluye grupos heteroarilo de anillo condensado de 9 o 10 miembros. Los ejemplos de heteroarilo incluyen pirrolilo, tienilo, furilo, pirazolilo, imidazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, oxadiazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, tiadiazolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, y derivados benzo o piridazo condensados de tales grupos heteroarilo monocíclicos, tales como indolilo, bencimidazolilo, benzofurilo, quinolinilo, isoquinolinilo, quinazolinilo, pirrolopiridina, imidazopiridina o purinilo, todos los opcionalmente sustituidos. Preferentemente, el heteroarilo es piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, indolilo, pirrolopiridina o imidazopiridina; en particular piridilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, indolilo, pirrolopiridina o imidazopiridina.
El término "sustituyentes que tienen heteroarilo" significa heteroarilo sustituido con hasta tres sustituyentes que se seleccionan independientemente de alquilo inferior, haloalquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, ariloxialquilo inferior, heteroariloxialquilo inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior-alquilo inferior; aminoalquilo, en donde el amino no está sustituido o está sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxialquilo inferior, aminoalquilo inferior, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminoalcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-alcoxicarbonilo inferior y aminocarbonilo; alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo; arilo, heteroarilo, arilalquilo o heteroarilalquilo, en donde arilo o heteroarilo no están sustituidos o están sustituidos con hasta tres sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, amino, ciano y nitro; hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, cicloalquiloxi, cicloalquilalcoxi inferior, ariloxi, arilalcoxi inferior, heteroariloxi, heteroarilalcoxi inferior, alqueniloxi, alquiniloxi, alquilmercapto, alquinilsulfinilo, haloalquilsulfonilo inferior, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, aminosulfonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferioralquilo inferior, cicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; amino opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, dialquilamino inferior-alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo, y en donde el alquilo o alquilo inferior en cada caso puede estar sustituido con halógeno, alcoxi inferior, arilo, heteroarilo o amino opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno formar junto con el heterociclilo nitrógeno; alquilcarbonilo inferior, haloalquilcarbonilo inferior, fenilcarbonilo opcionalmente sustituido, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-alcoxicarbonilo inferior; aminocarbonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con un grupo hidroxi o amino o uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; ciano, halógeno y nitro.
En particular, los sustituyentes en el heteroarilo pueden seleccionarse independientemente de alquilo inferior, haloalquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior-alquilo inferior, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo, arilo, heteroarilo, hidroxi, alcoxi inferior, cicloalquiloxi, alqueniloxi, alquiniloxi, alquilmercapto, alquilsulfinilo, haloalquilsulfinilo inferior, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, aminosulfonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido por uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, cicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; amino opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, dialquilamino inferior-alquilo inferior, cicloalquilo, alquilcarbonilo, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo, y en donde el alquilo o el alquilo inferior en cada caso puede estar sustituido con alcoxi inferior o amino opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; alquilcarbonilo inferior, haloalquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-alcoxicarbonilo inferior; aminocarbonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con un grupo hidroxi o amino o uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior o cicloalquilo, o en donde los dos sustituyentes del nitrógeno se forman juntos con el heterociclilo nitrógeno; ciano, halógeno y nitro.
En el heteroarilo opcionalmente sustituido, los sustituyentes son preferentemente alquilo inferior, haloalquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, metilendioxi, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, aminocarbonilo, hidroxilaminocarbonilo, tetrazolilo, aminosulfonilo, halo, ciano o nitro.
El alquenilo contiene uno o más, por ejemplo, dos o tres, dobles enlaces, y es preferentemente alquenilo inferior, tal como 1- o 2-butenilo, 1-propenilo, alilo o vinilo.
El alquinilo es preferentemente alquinilo inferior, tal como el propargilo o acetilenilo.
En el alquenilo o alquinilo opcionalmente sustituido, los sustituyentes son preferentemente alquilo inferior, alcoxi inferior, halo, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, y están conectados con un átomo de carbono saturado o insaturado de alquenilo o alquinilo.
El heterociclilo designa preferentemente un anillo mono o bicíclico saturado, parcialmente saturado o insaturado que contiene 4-10 átomos que comprenden uno, dos o tres heteroátomos que se seleccionan de nitrógeno, oxígeno y azufre, que pueden, a menos que se especifique de cualquier otra manera, estar unidos por carbono o nitrógeno, en donde un átomo de nitrógeno del anillo puede estar opcionalmente sustituido con un grupo que se selecciona de alquilo inferior, aminoalquilo inferior, arilo, arilalquilo inferior y acilo, y un átomo de carbono del anillo puede estar sustituido por alquilo inferior, aminoalquilo inferior, arilo, arilo-alquilo inferior, heteroarilo, alcoxi inferior, hidroxi u oxo, o que puede estar condensado con un anillo benzo opcionalmente sustituido. Los sustituyentes considerados para benzo sustituido son los mencionados anteriormente para arilo opcionalmente sustituido. Los ejemplos de heterociclilo son pirrolidinilo, oxazolidinilo, tiazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, dioxolanilo, tetrahidrofuranilo y tetrahidropiranilo y derivados benzocondensados opcionalmente sustituidos de dicho heterociclilo monocíclico, por ejemplo, indolinilo, benzoxazolidinilo, benzotiazolidinilo, tetrahidroquinolinilo, y benzodihidrofurilo.
El acilo designa, por ejemplo, alquilcarbonilo, cicloalquilcarbonilo, arilcarbonilo, arilalquilcarbonilo inferior o heteroarilcarbonilo. El acilo inferior es preferentemente alquilcarbonilo inferior, en particular propionilo o acetilo.
El hidroxialquilo es especialmente hidroxialquilo inferior, preferentemente hidroximetilo, 2-hidroxietilo o 2-hidroxi-2-propilo.
El cianoalquilo designa preferentemente cianometilo y cianoetilo.
El haloalquilo es preferentemente fluoroalquilo, especialmente trifluorometilo, 3,3,3-trifluoroetilo o pentafluoroetilo.
El halógeno es flúor, cloro, bromo o yodo.
El alcoxi inferior es especialmente metoxi, etoxi, isopropiloxi o terc-butiloxi.
El arilalquilo incluye arilo y alquilo como se definieron anteriormente, y es, por ejemplo, bencilo, 1 -fenetilo o 2-fenetilo.
El heteroarilalquilo incluye heteroarilo y alquilo como se definen anteriormente, y es, por ejemplo, 2-, 3- o 4-piridilmetilo, 1- o 2-pirrolilmetilo, 1-pirazolilmetilo, 1-imidazolilmetilo, 2-(1-imidazolil)etilo o 3-(1-imidazolil)propilo.
En el amino sustituido, los sustituyentes son preferentemente los mencionados anteriormente como sustituyentes. En particular, el amino sustituido es alquilamino, dialquilamino, arilamino opcionalmente sustituido, arilalquilamino opcionalmente sustituido, alquilcarbonilamino inferior, benzoilamino, piridilcarbonilamino, alcoxicarbonilamino inferior o aminocarbonilamino opcionalmente sustituido.
Las sales particulares consideradas son aquellas que reemplazan los átomos de hidrógeno del grupo sulfato y la función ácido carboxílico. Los cationes adecuados son, por ejemplo, cationes de sodio, potasio, calcio, magnesio o amonio, o también cationes derivados por protonación de aminas primarias, secundarias o terciarias que contienen, por ejemplo, grupos alquilo inferior, hidroxialquilo inferior o hidroxi-alcoxi inferior-alquilo inferior, por ejemplo, 2-hidroxietilamonio, 2-(2-hidroxi-etoxi)etildimetilamonio, dietilamonio, di(2-hidroxietil)amonio, trimetilamonio, trietilamonio, 2-hidroxietildimetilamonio o di(2-hidroxietil)metilamonio también de aminas cíclicas secundarias y terciarias correspondientemente sustituidas, por ejemplo, N-metilpirrolidinio, N-metilpiperidinio, N-metil-morfolinio, N-2- hidroxietilpirrolidinio, N-2-hidroxietilpiperidinio o N-2-hidroxietilmorfolinio, y similares.
En vista de la estrecha relación entre los nuevos compuestos en forma libre y los que se encuentran en forma de sus sales, que incluyen aquellas sales que pueden usarse como productos intermedios, por ejemplo, en la purificación o la identificación de los nuevos compuestos, cualquier referencia a los compuestos libres en lo que antecede y en lo sucesivo debe entenderse que se hace referencia también a las sales correspondientes, y viceversa, según sea apropiado y conveniente.
Preferentemente, Z es fenilo sustituido o no sustituido.
En particular, la invención se refiere a los compuestos de la Fórmula (I) o (II), en donde Z es fenilo opcionalmente sustituido.
Los sustituyentes preferidos considerados para Z con el significado de los grupos arilo mencionados, por ejemplo, el fenilo, son alquilo inferior, haloalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, aminoalquilo inferior, alcanocarbonilamino inferior-alquilo inferior, mercapto- alcanocarbonilamino inferior-alquilo inferior, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, ciclohexilo, ciclopropilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, hidroxi, alcoxi inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior-alcoxi inferior, cicloalquiloxi, hidroxisulfoniloxi; mercapto, alquilmercapto, hidroxisulfinilo, alquilsulfinilo, haloalquilsulfinilo inferior, hidroxisulfonilo, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, aminosulfonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido por uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; amino opcionalmente sustituido con uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, cicloalquilalquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferioralquilo inferior y dialquilamino inferior-alquilo inferior, o por un sustituyente cicloalquilo, fenilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, alquilcarbonilo, fenilcarbonilo opcionalmente sustituido, piridilcarbonilo, alcoxicarbonilo o aminocarbonilo opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes del nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; carboximetilamino o alcoxicarbonilmetilamino inferior sustituido en el grupo metilo de manera que el sustituyente resultante corresponda a uno de los 20 aminoácidos estándar de origen natural, aminometilcarbonilamino sustituido en el grupo metilo de manera que el grupo acilo resultante corresponda a uno de los 20 aminoácidos estándar de origen natural; alquilcarbonilo inferior, haloalquilcarbonilo inferior, carboxi, alcoxicarbonilo inferior, alcoxi inferior-alcoxicarbonilo inferior; aminocarbonilo en donde el amino no está sustituido o está sustituido con un grupo hidroxi o amino o uno o dos sustituyentes que se seleccionan de alquilo inferior, hidroxialquilo inferior, alcoxi inferior-alquilo inferior, fenilalquilo inferior opcionalmente sustituido y heteroarilalquilo inferior opcionalmente sustituido, o en donde los dos sustituyentes en el nitrógeno se forman junto con el heterociclilo nitrógeno; ciano, halógeno y nitro; y en donde dos sustituyentes en posición orto entre sí pueden formar un anillo heterocíclico de 5 o 6 miembros que contiene uno o dos átomos de oxígeno y/o uno o dos átomos de nitrógeno, en donde los átomos de nitrógeno están opcionalmente sustituidos con alquilo inferior, alcoxi inferior -alquilo inferior o alquilcarbonilo inferior.
Z particularmente preferido es p-metoxifenilo, 4-(2-aminoetil)fenilo o 4-(2-(4-mercapto-butanoilamino)etil)fenilo.
En los polímeros que comprenden una multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), un enlazador Z particular es arilo (bifuncional), heteroarilo, arilalquilo inferior, arilcarbonilo o heteroarilmetilo, en donde el arilo o heteroarilo está sustituido por -(CH2)2NH(C=O)(CH2)3S-CH2-(C=O)- que conecta al polímero con las cadenas laterales de aminoalquilo en la función C=O.
Más particularmente, el enlazador Z es fenilo sustituido por -(CH2)2NH(C=O)(CH2)3S-CH2-(C=O)- que conecta al polímero con las cadenas laterales de aminoalquilo en la función C=O.
Un polímero preferido en los polímeros que comprenden una multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II) es la polilisina, en particular la poli-L-lisina.
Preferentemente, el peso molecular de la polilisina es de 1000 a 300000 kDa, preferentemente de 10000 a 100000 kDa. Un peso molecular de aproximadamente 50000 kDa, 125000 kDa o 200 000 kDa es particularmente preferido. El peso molecular de máxima preferencia es de aproximadamente 50000 kDa.
En particular, la invención se refiere a los polímeros en donde la carga relativa de la cadena principal del polímero con el disacárido de la Fórmula (I) y/o (II) es de 10 - 80 %, lo que significa que de 10 - 80 % de todas las cadenas laterales de lisina en el polímero se acoplan/reaccionan con un enlazador que tiene un disacárido, las funciones amino restantes están bloqueadas. Preferentemente, la carga del polímero es de 30 - 60 %, con mayor preferencia de 40 - 50 %.
En una modalidad particular, el epítopo de HNK-1 mínimo sulfatado 22 que tiene un enlazador con una función sulfhidrilo terminal se sintetizó y reaccionó en una cantidad subestequiométrica con el polímero de lisina activado 24 (cloroacetilado). La carga de carbohidratos (40 %) se determinó mediante 1H RMN. El polímero de partida 23 tenía un peso molecular promedio (MW) de 50 kDa, mientras que el polímero final (25) con un 40 % de carga de epítopo de HNK-1 mínimo tenía un MW promedio calculado de 123 kDa.
Los monómeros de carbohidratos sintetizados (1 y 2) y el polímero 25 se probaron en un ensayo ELISA establecido (Bühlmann Laboratories, Schonenbuch, Suiza) aplicado para el diagnóstico de la neuropatía anti-MAG y para el control de la terapia en la clínica. El ensayo se usa para determinar la concentración sérica de autoanticuerpos IgM anti-MAG. El ensayo se modificó a un ensayo de unión competitiva. Los compuestos sintetizados y las muestras de suero que contienen los anticuerpos IgM anti-MAG se administran en placas de 96 pocillos, recubiertas con MAG purificada de cerebro humano. La MAG inmovilizada y los compuestos sintetizados compiten por unirse a los anticuerpos IgM anti-MAG. Después de una etapa de lavado, los anticuerpos IgM unidos a la m Ag se detectan con un anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante, seguido de una reacción colorimétrica. La competencia exitosa de los compuestos con la MAG conduce a una disminución en la DO450nm medida (densidad óptica), porque bloquean los sitios de unión de los anticuerpos IgM, lo que evita que se unan a la MAG. El principio del ensayo se describe en la Figura 1. Para la evaluación de los compuestos, se eligieron cuatro sueros de diferentes pacientes (MK, DP, KH, SJ) con altos títulos de anticuerpos IgM anti-MAG informados. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos IgM para cada suero en experimentos preliminares. Las diluciones de suero con valores de DO450 nm medidos alrededor de 1,0 se eligieron para el ensayo, para ser capaces de comparar los valores de IC50 medidos (concentración media máxima inhibidora) que son dependientes de la concentración de anticuerpos. Diluciones de suero: DP 1:2500, KH 1:3000, SJ 1:7500, MK 1:23000. Los dos sueros que sirvieron como controles negativos (dilución 1:1000) no mostraron unión a la MAG.
Los valores de IC50 del compuesto 1 se determinaron para todos los sueros. Los del compuesto 2 se determinaron para el suero MK con la mayor afinidad de anticuerpos por 1 y para el suero SJ con la menor afinidad de anticuerpos por 1. Los resultados se muestran en la tabla de abajo. El ensayo se repitió cuatro veces. A partir de las curvas de unión recibidas para cada suero, se eligieron los tres mejores ajustes y se normalizaron para el cálculo de IC50. Las curvas de unión se muestran en la Figura 2. Para la generación de la curva del compuesto 2, se añadió un punto de concentración artificialmente alto a 500 mM con 0 % de unión del anticuerpo porque incluso a la concentración más alta de 2 (50 mM) la inhibición de la unión del anticuerpo no fue del 100 %. Los valores de IC50 para el compuesto 2 deben considerarse como valores aproximados, aunque cambiaron sólo marginalmente tras la adición del punto de concentración alta. En las mismas condiciones de ensayo, el polímero de carbohidratos se probó con los sueros KH, MK y SJ. Las mediciones se repitieron al menos tres veces. Se eligieron las tres mejores curvas ajustadas para cada suero para el cálculo de IC50. Las curvas de unión no normalizadas se muestran en la Figura 2.
Tabla: Valores de IC^ n de los compuestos 1, 2 y el polímero de HNK-1 mínimo (25) para los sueros de cuatro
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Los datos de la evaluación biológica de 1 y 2 muestran claramente diferentes afinidades de los anticuerpos IgM de cada suero por los disacáridos sintetizados. El disacárido 1 muestra una afinidad de unión superior hacia los anticuerpos IgM en comparación con el disacárido 2, que carece del resto sulfato. El grupo sulfato parece ser esencial para el epítopo HNK-1 mínimo sintetizado para la unión del anticuerpo. Sin embargo, no es igualmente importante para todos los sueros. El suero MK mostró un alto requerimiento de sulfato con una unión aproximadamente 230 veces más débil al disacárido no sulfatado. El suero SJ, por otro lado, mostró solo una afinidad de unión 12,6 veces menor al disacárido no sulfatado. El grupo carboxilo de GlcA parece ser más importante para este suero.
Para todos los anticuerpos IgM, el resto de sulfato se requiere para unirse en el intervalo de pM. Es sorprendente que el epítopo HNK-1 mínimo sulfatado sea capaz de inhibir la unión del anticuerpo a la MAG en el intervalo de concentración de pM. Esto sugiere la posibilidad de que el resto aromático terminal del disacárido esté implicado en la unión, como si imitara el tercer azúcar (GlcMAc) del epítopo HNK-1. El anillo aromático podría sufrir interacción catión-n o apilamiento n-n.
La relación causal entre los autoanticuerpos anti-MAG y el desarrollo de la neuropatía en pacientes con neuropatía anti-MAG está ampliamente aceptada en la actualidad (M.C. Dalakas, Current Treatment Options in Neurology 2010, 12:71-83). El determinante antigénico de estos anticuerpos es el epítopo de carbohidrato h NK-1, el trisacárido SO4-3-GlcA(p1-3)Gal(p1-4)GlcWAc-OH que también se reconoce por el anticuerpo HNK-1.
De acuerdo con la presente invención, se muestra que los ligandos de carbohidratos que bloquean los sitios de unión del anticuerpo IgM evitan la unión del anticuerpo a la MAG y otras dianas de mielina.
Se muestra que los ligandos de disacáridos de la Fórmula (I) y (II), epítopos de carbohidrato HNK-1 mínimo, que son mucho más fáciles de preparar que los carbohidratos más grandes, retienen la afinidad por los anticuerpos IgM y son útiles para fines diagnósticos y terapéuticos.
Los compuestos relacionados con las sustancias 1 y 2 son conocidos en la técnica, pero no los compuestos que contienen agliconas arílicas. Los residuos aromáticos de Z participan en el proceso de unión a los anticuerpos IgM anti-MAG y, por lo tanto, confieren un beneficio sustancial a los compuestos tales como (I) y/o (II) con las agliconas arílicas.
En el caso de la estructura sulfatada (I), se publica un derivado sustituido con etilamina de un pentasacárido (A.V. Kornilov, Carbohydrate Research 2000, 329:717-730). En el caso de la estructura (II), se publican el derivado no sustituido (R=H) y los derivados con restos alquilo comunes. Además de la sustitución de arilo actualmente reivindicada, tal como para-metoxifenilo, el enfoque para presentar este epítopo en múltiples copias en un polímero adecuado es novedoso.
Los carbohidratos naturales generalmente muestran una baja afinidad de unión por sus compañeros de unión. En los sistemas biológicos, a menudo se logra suficiente afinidad mediante la presentación multivalente de carbohidratos, así como también la presentación oligovalente de dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD) de proteínas de unión a carbohidratos (B. Ernst y J.L. Magnani, Nature Reviews Drug Discovery 2009, 8:661-677). Este también es el caso para la unión de anticuerpos IgM a la MAG: la MAG presenta hasta ocho epítopos de HNK-1 en sus dominios extracelulares.
En una modalidad particularmente preferida, la invención se refiere a los polímeros que comprenden una multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II), en donde el polímero es poli-L-lisina y Z es un enlazador bifuncional que conecta dicho sustituyente a la cadena principal del polímero.
La poli-L-lisina es biodegradable y, por tanto, adecuada para aplicaciones terapéuticas. El polímero de HNK-1 mínimo ejemplificado muestra un aumento masivo en la afinidad de unión hacia los anticuerpos IgM patógenos. La actividad inhibidora, que ahora se encuentra en el intervalo bajo de nM, se incrementa en un factor de al menos 34 000 en comparación con el monómero (suero KH). El aumento de la afinidad obtenido por el suero MK y SJ fue de aproximadamente 50 000 (véase la tabla anterior). Estos hallazgos indican claramente la naturaleza multivalente de la interacción antígeno-anticuerpo.
El polímero de HNK-1 mínimo ejemplificado sirve como antígeno sustituto para la MAG del cerebro humano purificada que se usa actualmente en un ensayo ELISA de diagnóstico para la detección de anticuerpos IgM anti-MAG.
Los compuestos de la invención tienen valiosas propiedades farmacológicas. La invención también se refiere a los compuestos como se definieron anteriormente para su uso como medicamentos. Un compuesto de acuerdo con la invención muestra eficacia profiláctica y terapéutica especialmente contra la neuropatía anti-MAG.
Un compuesto de la Fórmula (I) o (II), o los polímeros que los comprenden, pueden administrarse solo o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos, una posible terapia de combinación en forma de combinaciones fijas o la administración de un compuesto de la invención y uno o más de otros agentes terapéuticos escalonados o administrados independientemente entre sí, o la administración combinada de combinaciones fijas y uno o más de otros agentes terapéuticos.
Los agentes terapéuticos para una posible combinación son especialmente agentes inmunosupresores. Son ejemplos los análogos de purina tales como fludarabina y/o cladribina, además del anticuerpo monoclonal quimérico rituximab (A.J. Steck y otros, Current Opinion in Neurology 2006, 19:458-463).
En otra modalidad particular, la invención se refiere al uso de los compuestos de la invención en un ensayo de diagnóstico de neuropatía anti-MAG. En particular, la invención se refiere a los kits que comprenden los compuestos de la Fórmula (I) o (II) como se definieron anteriormente, y también a los polímeros de la invención que comprenden tales compuestos como sustituyentes.
La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de neuropatía anti-MAG, en donde el nivel de IgM contra la MAG se determina en una muestra de líquido corporal, por ejemplo, suero, y un nivel alto es indicativo del desarrollo y la gravedad de la neuropatía anti-MAG.
Otros fluidos corporales distintos del suero útiles para la determinación de IgM contra la MAG son, por ejemplo, sangre completa, líquido cefalorraquídeo o extractos de tejido sólido.
Puede usarse cualquier método conocido para la determinación del nivel de IgM contra la MAG en los fluidos corporales. Los métodos considerados son, por ejemplo, ELISA, RIA, EIA o análisis de micromatrices.
Un método preferido para la determinación de IgM contra la MAG en fluidos corporales humanos, por ejemplo, en suero, es un ELISA. En tal modalidad, las placas de microtitulación se recubren con compuestos de la Fórmula (I) o (II), o preferentemente los polímeros de la invención que comprenden tales compuestos como sustituyentes. A continuación, se bloquean las placas y se carga la muestra o una solución estándar. Después de la incubación, se aplica un anticuerpo anti-IgM, por ejemplo, un anticuerpo anti-IgM conjugado directamente con un marcador adecuado, por ejemplo, con una enzima para la detección cromogénica. Alternativamente, se añade un anticuerpo anti-IgM policlonal de conejo (o ratón). A continuación, se añade un segundo anticuerpo que detecta el tipo particular de anticuerpo anti-IgM, por ejemplo, un anticuerpo anti-conejo (o anti-ratón), conjugado con un marcador adecuado, por ejemplo, la enzima para la detección cromogénica como anteriormente. Finalmente la placa se desarrolla con un sustrato para el marcador para detectar y cuantificar el marcador, y es una medida de la presencia y la cantidad de IgM frente a la MAG. Si el marcador es una enzima para la detección cromogénica, el sustrato es un sustrato generador de color de la enzima conjugada. Luego, la reacción de color se detecta en un lector de microplacas y se compara con los estándares.
También es posible usar los fragmentos de anticuerpos. Los marcadores adecuados son marcadores cromogénicos, es decir, enzimas que pueden usarse para convertir un sustrato en un compuesto coloreado o fluorescente detectable, marcadores espectroscópicos, por ejemplo marcadores fluorescentes o marcadores que presentan un color visible, marcadores de afinidad que pueden desarrollarse por un compuesto adicional específico para el marcador y que permite una fácil detección y cuantificación, o cualquier otro marcador usado en ELISA estándar.
Otros métodos preferidos de detección de IgM contra la MAG son el radioinmunoensayo o el inmunoensayo competitivo y la detección por quimioluminiscencia en robots analíticos comerciales automatizados. También pueden usarse la fluorescencia mejorada con micropartículas, las metodologías de polarización de fluorescencia o la espectrometría de masas. Los dispositivos de detección, por ejemplo, las micromatrices, son componentes útiles como sistemas de lectura de IgM contra la MAG.
En una modalidad adicional, la invención se refiere a un kit adecuado para un ensayo como se describe anteriormente, en particular un ELISA, que comprende los compuestos de la Fórmula (I) o (II), o los polímeros que comprenden tales compuestos como sustituyentes. Los kits contienen además los anticuerpos anti-IgM (o los fragmentos de anticuerpos anti-IgM) que tienen un marcador adecuado, o los anticuerpos anti-IgM y los segundos anticuerpos que tienen dicho marcador adecuado, y los reactivos o los equipos para detectar el marcador, por ejemplo, los reactivos que reaccionan con las enzimas usadas como marcadores y que indican la presencia de dicho marcador mediante una formación de color o fluorescencia, los equipos estándar, tales como las placas de microtitulación, las pipetas y similares, las soluciones estándar y las soluciones de lavado.
El ELISA también puede diseñarse de manera que se usen muestras de sangre o suero del paciente para el recubrimiento de placas de microtitulación con la posterior detección de los anticuerpos anti-MAG con los compuestos marcados de la Fórmula (I) o (II), o los polímeros marcados que comprenden tales compuestos como sustituyentes. El marcador puede detectarse directamente o detectarse indirectamente mediante un anticuerpo.
El polímero que tiene los compuestos de la Fórmula (I) o (II) de la invención se une a los anticuerpos IgM anti-MAG patógenos y potencialmente regula negativamente la producción de anticuerpos IgM anti-MAG. Esto permite un tratamiento específico de antígeno para pacientes con neuropatía anti-MAG.
Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula (I) o (II), o un polímero que tiene los compuestos de la Fórmula (I) o (II) de la invención.
Se consideran las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral, tales como la administración subcutánea, intravenosa, intrahepática o intramuscular, a animales de sangre caliente, especialmente seres humanos. Las composiciones comprenden el ingrediente o los ingredientes activos solos o, preferentemente, juntos con un portador farmacéuticamente aceptable. La dosificación del ingrediente o los ingredientes activos depende de la edad, el peso y la condición individual del paciente, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración.
Para la administración parenteral se da preferencia al uso de las suspensiones o las dispersiones del polímero de carbohidrato de la invención, especialmente las dispersiones o las suspensiones acuosas isotónicas que, por ejemplo, pueden prepararse poco antes de su uso. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservantes, estabilizantes, humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, agentes que aumentan la viscosidad, sales para regular la presión osmótica y/o amortiguadores y se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, mediante procesos convencionales de disolución y liofilización.
Los portadores adecuados para la administración enteral, tal como la administración nasal, bucal, rectal u oral, son especialmente agentes de rellenos, tales como azúcares, por ejemplo, lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo, fosfato tricálcico o hidrógeno fosfato de calcio, y también aglutinantes, tales como almidones, por ejemplo almidón de maíz, trigo, arroz o patata, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona, y/o, si se desea, desintegradores, tales como los almidones mencionados anteriormente, también carboximetil almidón, polivinilpirrolidona reticulada, ácido algínico o una sal de este, tal como el alginato de sodio. Los excipientes adicionales son especialmente acondicionadores de flujo y lubricantes, por ejemplo el ácido silícico, el talco, el ácido esteárico o las sales de estos, tales como el estearato de magnesio o calcio, y/o polietilenglicol, o los derivados de estos.
Los núcleos de los comprimidos pueden proporcionarse con revestimientos adecuados, opcionalmente entéricos, mediante el uso de, entre otros, soluciones de azúcar concentradas que pueden comprender goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, o soluciones de revestimiento en disolventes orgánicos adecuados o mezclas de revestimiento, o, para la preparación de revestimientos entéricos, soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas, tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse tintes o pigmentos a los comprimidos o los revestimientos de los comprimidos, por ejemplo, con fines de identificación o para indicar diferentes dosis del ingrediente o los ingredientes activos.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral también incluyen cápsulas duras que consisten en gelatina, y también cápsulas blandas selladas que consisten en gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener el ingrediente activo en forma de gránulos, por ejemplo mezclado con cargas, tales como almidón de maíz, aglutinantes y/o deslizantes, tales como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente estabilizantes. En las cápsulas blandas, el ingrediente activo se disuelve o suspende preferentemente en excipientes líquidos adecuados, tales como aceites grasos, aceite de parafina o polietilenglicoles líquidos o ésteres de ácidos grasos de etileno o propilenglicol, a los que también pueden añadirse estabilizantes y detergentes, por ejemplo, del tipo de éster de ácido graso de polioxietilensorbitano.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal son, por ejemplo, los supositorios que consisten en una combinación del ingrediente activo y una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos, hidrocarburos de parafina, polietilenglicoles o alcanoles superiores.
Las composiciones farmacéuticas mencionadas de acuerdo con la invención pueden contener comprimidos, gránulos u otras formas de formulación oral aceptable de los ingredientes activos por separado, o pueden contener una mezcla de ingredientes activos en una forma de dosificación farmacéutica adecuada, como se describe anteriormente. En particular, las formulaciones orales separadas aceptables o la mezcla en una forma de dosificación farmacéutica adecuada pueden ser composiciones farmacéuticas de liberación lenta y liberación controlada.
Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 1 % a aproximadamente 95 % del ingrediente activo o la mezcla de ingredientes activos, las formas de administración de dosis única que comprenden en la modalidad preferida de aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 % del ingrediente o los ingredientes activos y las formas que no son de tipo dosis única que comprende en la modalidad preferida de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 % del ingrediente o los ingredientes activos.
La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas mencionadas como medicamentos en el tratamiento de la neuropatía anti-MAG.
Se describe además un método de tratamiento de la neuropatía anti-MAG, que comprende administrar una composición de acuerdo con la invención en una cantidad eficaz contra dicha enfermedad, a un animal de sangre caliente que requiera dicho tratamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse profilácticamente o terapéuticamente, preferentemente en una cantidad eficaz contra dichas enfermedades, a un animal de sangre caliente, por ejemplo un ser humano, que requiera dicho tratamiento. En el caso de un individuo que tiene un peso corporal de aproximadamente 70 kg, la dosis diaria administrada es de aproximadamente 0,01 g a aproximadamente 5 g, preferentemente de aproximadamente 0,25 g a aproximadamente 1,5 g, de los ingredientes activos en una composición de la presente invención.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención sin limitar la invención en su alcance.
Ejemplos
Métodos generales
Los espectros de RMN se obtuvieron en un espectrómetro Bruker Avance DMX-500 (500 MHz). La asignación de espectros de RMN de 1H y 13C se logró mediante el uso de métodos 2D (COSY y HSQC). Los desplazamientos químicos se expresan en ppm mediante el uso de CHCh residual, CHD2OD o HDO como referencias. Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro Perkin-Elmer 341. Los espectros IR se registraron mediante el uso de un espectrómetro Perkin-Elmer Spectrum One FT-IR. Los espectros de masas de ionización por pulverización de electrones (ESI-MS) se obtuvieron en un Waters Micromass ZQ. El análisis HRMS se llevó a cabo mediante el uso de un Agilent 1100 LC equipado con un detector de matriz de fotodiodos y un Micromass QTOF I equipado con un convertidor de tiempo digital de 4 GHz. Las reacciones se controlaron por TLC mediante el uso de placas de vidrio recubiertas con gel de sílice 60 F254 (Merck) y se visualizaron mediante el uso de luz UV y/o carbonizando con Mostain (una solución 0,02 M de sulfato de amonio y cerio dihidrato y molibdato de amonio tetrahidratado en solución acuosa de H2SO4 al 10 %). La cromatografía en columna se realizó sobre gel de sílice (Fluka C60 40/60) o RP-18 (Merck LiChroprep® RP-18 40/60). El metanol (MeOH) se secó mediante reflujo con metóxido de sodio y destilación. La piridina se secó sobre tamices moleculares activados (4 A). La dimetilformamida (DMF) se adquirió de Acros (99,8 %, extra seca, sobre tamices moleculares). El diclorometano (DCM), el tolueno y el hexano se secaron mediante filtración sobre AhO3 (Fluka, tipo 5016A básico). Los tamices moleculares (4 A) se activaron al vacío a 500 °C durante 1 h inmediatamente antes de su uso. Las centrifugaciones se llevaron a cabo con una centrífuga Eppendorf 5804 R. ta = temperatura ambiente.
Los tres compuestos para la evaluación biológica (1, 2 y 25) se sintetizaron de acuerdo con el Esquema 1 y 2. Todos los reactivos se compraron a Sigma Aldrich o Acros. Los disacáridos GlcA-Gal 5 se obtuvieron al hacer reaccionar el donante de GlcA 3 activado (C. Coutant y J.-C. Jacquinet, J. Chem Soc Perkin Trans I, 1995, 1573-1581) y el aceptor de Gal 4 protegido selectivamente (F. Belot y otros, Synlett 2003, 1315-1318) con trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf) como promotor. La desprotección de los grupos éster eon LiOH en tetrahidrofurano (THF)/agua (H2O) proporcionó 6. Los disacáridos 2 se obtuvieron mediante hidrogenación catalítica. Los disacáridos sin protección en 3' 7 se sintetizaron mediante un procedimiento de lactonización/metanólisis publicado por A.V. Kornilov (Carbohydrate Research 2000, 329:717-730). La sulfatación subsiguiente con el complejo sulfato-piridina (SOaPy) en N,N-dimetilformamida (DMF) dio el disacárido 3-O-sulfato 8 (65 %). La desprotección final por la hidrogenación catalítica seguida de la hidrólisis y el tratamiento con resina de intercambio catiónico Na+ proporcionó los disacáridos sulfatados 1 deseados.
Para la síntesis del polímero de carbohidrato 25, se preparó el monómero sulfatado 21 (Esquema 1). Este contiene 4-(2-aminoetil)fenil aglicona en lugar del para-metoxifenilo presente en 1. El grupo amino primario adicional se adquirió para el acoplamiento al polímero de polilisina. Para su síntesis, el 4-(2-azidoetil)fenol (9) se galactosiló con el donante de tricloroacetimidato 10 (R. Burkowski y otros, Eur J Org Chem 2001, 2697-2705). El aceptor 9 se obtuvo mediante la interconversión amina-azida (A. Titz y otros, Tet. Letters 2006, 47:2383-2385) a partir de la tirosina. La desacetilación en condiciones Zempen (proporciona 12), seguida de la formación del derivado 13 de 3,4-isopropilideno, la dibencilación (da como resultado 14), la escisión catalizada por ácido del acetónido (proporciona 15) y la monobenzoilación produjo el galactósido 16. Para las etapas restantes hasta el disacárido monosulfatado 21 se aplicó una secuencia de reacción similar a la ya aplicada para la síntesis del disacárido 1, excepto para la bencilación que se llevó a cabo bajo catálisis de transferencia de fase mediante el uso de NaOH/DCM acuoso al 50 % y éter 18-corona-6. Después, el grupo amino libre en 21 se hizo reaccionar con tiobutirolactona y trietilamina (TEA) en DMF para dar el compuesto 22 con un rendimiento del 59 %, listo para acoplarse al polímero de polilisina.
Para este propósito, el polímero comercial de polilisina 23 se aciló, que proporciona 24 con un rendimiento del 96 % (G. Thoma y otros, J Am Chem Soc 1999, 121:5919-5929) antes de que se acoplara a una cantidad subestequiométrica del epítopo HNK-1 mínimo 22 (0,4 eq). Para mejorar la solubilidad en agua del polímero de polilisina glucosilado, los grupos de cloroacetamida restantes se bloquearon con un exceso de tioglicerol. La purificación por ultrafiltración (Sartorius Stedim Vivaspin 6, nivel de corte de peso molecular, 5000) produjo el glucopolímero 25 con un rendimiento del 70 %.
Esquema 1: Síntesis del epítopo HNK-1 mínimo en forma sulfatada (1) y no sulfatada (2)
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Reactivos y condiciones: a) TMSOTf, tamices moleculares de 4 A, DCM, 0 °C hasta ta, (81 %) b) LiOH, THF/H2O (97 %); c) Pd(OH)2/C, H2 , MeOH/H2O (96 %); d) Ac2O, 80 °C, pir, DMAP; MeOH, AcONa anhidro (57 %); e) SOs-Py, DMF (65 %); f) Pd(OH)2/C, H2, MeOH/H2O, LiOH, MeOH/H2O (88 %).
4-metoxifenil_______ (metil_______2,3,4-tri-0-benzoil-B-D-glucopiranuronato)-(1^3)-4-Q-benzoil-2,6-di-0-bencil-B-D-galactopiranósido (5).
En atmósfera de argón 3 (1,12 g, 1,68 mmol), se suspendieron 4a (800 mg, 1,40 mmol) y tamices moleculares de 4 A activados (1,2 g) en DCM (30 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a ta y luego se enfrió hasta 0 °C. Se añadió gota a gota TMSOTf (38,1 ^l, 0,21 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta ta durante la noche y luego se neutralizó con TEA (100 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía (éter de petróleo/EtOAc, de 9:1 a 7:3) para producir 5 (1,21 g, 1,13 mmol, 81 %) como un sólido blanco.
[a]D20 28,4 (c 1,01, CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 53,59 (dd, J = 7,2, 10,1 Hz, 1H, H-6a), 3,65 (s, 3H, OMe), 3,69 (dd, J = 4,8, 10,1 Hz, 1H, H-6b), 3,74 (s, 3H, OMe), 3,93 (dd, J = 7,8, 9,5 Hz, 1H, H-2), 3,96 (dd, J = 5,1,6,9 Hz, 1H, H-5), 4,12 (d, J = 9,8 Hz, 1H, H-5'), 4,20 (dd, J = 3,5, 9,6 Hz, 1H, H-3), 4,46 (A, B de AB, J = 11,5 Hz, 2H, C W h ), 4,51,4,90 (A, B de AB, J = 10,5 Hz, 2H, CH2Ph), 4,94 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H-1), 5,36 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-1'), 5,44 (dd, J = 7,5, 9,2 Hz, 1H, H-2'), 5,66 (t, J = 9,6 Hz, 1H, H-4), 5,72-5,79 (m, 2H, H-3', H-4'), 6,76, 7,00 (AA', BB' de AA'BB', J = 9,1 Hz, 4H, C6H4), 7,19-7,44, 7,47-7,51,7,54-7,61,7,75-7,78, 7,87-7,91,8,03-8,08 (m, 30H, 6 CeHs); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 552,88, 55,64 (2 OMe), 69,07 (C-6), 70,01 (C-4), 70,05 (C-4’), 71,76 (C-2’), 72,17 (C-3’), 72,90 (C-5'), 73,54 (C-5), 73,72, 75,23 (2 CH2Ph), 76,16 (C-3), 79,86 (C-2), 100,29 (C-1'), 102,73 (C-1), 114,57, 118,19 (4C, C6H4), 127,69, 127,78, 128,00, 128,09, 128,30, 128,37, 128,43, 128,59, 128,71, 128,89, 129,05, 129,58, 129,77, 129,82, 129,92, 130,11, 132,91, 133,08, 133,27, 133,39, 137,88, 137,90 (36C, 6 CeHs), 151,33, 155,33 (2C, C6H4), 164,45, 165,00, 165,52, 165,63, 167,15 (5 CO); ESI-MS: m/z: calculada para C62H56NaO-i7 [M+Na]+: 1095,35, encontrada: 1095,48.
4-metoxifenil (B-D-glucopiranuronato)-(1^3)-2,6-di-Q-bencil-B-D-galactopiranósido (6)
El compuesto 5 (810 mg, 0,76 mmol) se suspendió en THF (7 ml) y la suspensión se enfrió hasta -10 °C. Luego se añadió gota a gota LiOH acuoso 2 M (5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se dejó calentar hasta ta. Los disolventes se evaporaron, el residuo se recogió en THF/H2O (2:3, 8 ml) y se trató con TFA (4 ml) durante 30 min. La mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (RP-18, MeOH/agua, de 0:1 a 2:1) para proporcionar 6 (0,47 g, 0,73 mmol, 97 %) como un sólido blanco.
[a]D20 -43,2 (c 1,00, MeOH); 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 83,30-3,41 (m, 2H, H-2', H-3'), 3,49 (t, J = 8,9 Hz, 1H, H-4'), 3,66 (s, 3H, OMe), 3,68 (d, J = 5,9 Hz, 2H, H-6a, H-6b), 3,72 (d, J = 9,7 Hz, 1H, H-5'), 3,76 (d, J = 5,9 Hz, 1H, H-5), 3,79 (dd, J = 3,3, 9,9 Hz, 1H, H-3), 3,87 (m, 1H, H-2), 4,00 (d, J = 2,7 Hz, 1H, H-4), 4,48 (s, 2H, C ^P h), 4,70 (d, J= 7,4 Hz, 1H, H-1'), 4,84 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-1), 4,87 (s, 2H, C ^P h), 6,73, 6,97 (AA', BB' de AA'BB', J = 9,0 Hz, 4H, C6H4), 7,17-7,28 (m, 8H, 2 C6H5), 7,38 (d, J = 7,1 Hz, 2H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CD3OD): 856,10 (OMe), 70,37 (C-4), 70,72 (C-6), 73,35 (C-4'), 74,37 (CH2Ph), 74,85 (C-2'), 75,00 (C-5), 76,22 (C-5'), 76,46 (CH2Ph), 77,35 (C-3'), 80,11 (C-2), 82,20 (C-3), 103,87 (C-1), 105,59 (C-1'), 115,58, 119,23 (4C, C6H4), 128,66, 128,76, 128,79, 129,31, 129,41, 129,77, 139,76, 139,96 (12C, 2 C6H5), 153,05, 156,67 (2C, C6H4), 173,01 (CO); ESI-MS: m/z: calculada para C33H3sNaO13 [M+Na]+: 665,23, encontrada: 665,23.
4-metoxifenil (B-D-glucopiranuronato de sodio)-(1^3)-B-D-galactopiranósido (2)
El compuesto 6 (205 mg, 0,31 mmol) y Pd(OH)2/C (42 mg, 20 %) se suspendieron en MeOH/H2O (10:1,5 ml) en atmósfera de argón. La mezcla se agitó durante la noche bajo una atmósfera de hidrógeno (1 atm), luego el catalizador se separó por filtración a través de una almohadilla de Celite. El Celite se lavó con un gradiente de MeOH/H2O (6 x 10 ml, 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 0:10). El filtrado se concentró y se pasó por una columna de intercambio iónico Dowex® 50X8 (Na+). Después de la concentración, el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (RP-18, agua) seguida de una cromatografía de exclusión por tamaño P2 para proporcionar 2 (148 mg, 0,31 mmol, 96 %) como un sólido blanco.
[a]D20 -40,7 (c 1,00, H2O); 1H RMN (500 MHz, D2O): 83,43 (t, J = 8,3 Hz, 1H, H-2'), 3,48-3,56 (m, 2H, H-3', H-5'), 3,67­ 3,81 (m, 7H, H-5, H-6, H-4', OMe), 3,83 (dd, J = 2,9, 9,8 Hz, 1H, H-3), 3,90 (dd, J = 8,0 Hz, 1H, H-2), 4,22 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H-4), 4,68 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-1'), 4,95 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-1), 6,94, 7,09 (AA', BB' de AA'BB', J = 9,0 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, D2O): 855,71 (OMe), 60,70 (C-6), 67,94 (C-4), 69,63 (C-2), 71,73 (C-3'), 73,09 (C-2'), 75,05 (C-5'), 75,25 (C-5), 76,18 (C-4'), 82,37 (C-3), 101,29 (C-1), 103,61 (C-1'), 114,96, 118,10, 150,84, 154,61 (6C, C6H4), 175,92 (CO); HRMS: m/z: calculada para C -is^N aO -^M H]+: 485,1271, encontrada: 485,1276.
4-metoxifenil (metil 2,4-di-O-acetil-B-D-glucopiranuronato)-(1^3)-4-O-acetil-2,6-di-O-bencil-B-D-galactopiranósido (7)
Se agitó una solución de 6 (470 mg, 0,73 mmol) en Ac2O (10 ml) a 80 °C durante 90 min y luego se enfrió hasta ta. Se añadieron piridina (6 ml) y DMAP (15 mg) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 días. Los disolventes se evaporaron conjuntamente con tolueno (5 x 5 ml). El residuo se disolvió en DCM (50 ml) y se extrajo con salmuera (50 ml) y agua (50 m). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se filtró a través de algodón. Después de la evaporación del disolvente, el residuo se disolvió en MeOH seco (14 ml) y se añadió NaOAc anhidro (90 mg). La mezcla se agitó durante la noche, se neutralizó con resina de intercambio iónico Amberlyste® 15 (H+) y se filtró. El filtrado se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc, de 2:1 a 1:1) para producir 7 (334 mg, 0,43 mmol, 57 %) en forma de un sólido amarillento.
[a]D20 34,3 (c 1,00, CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 81,92, 2,01, 2,04 (3s, 9H, 3 OAc), 3,48 (dd, J = 7,1, 10,1 Hz, 1H, H-6a), 3,55 (dd, J = 4,8, 10,1 Hz, 1H, H-6b), 3,60 (m, 1H, H-3'), 3,66, 3,69 (2s, 6H, 2 OMe), 3,77 (dd, J = 5,4, 7,0 Hz, 1H, H-5), 3,80 (d, J = 9,8 Hz, 1H, H-5'), 3,83 (dd, J = 7,6, 9,7 Hz, 1H, H-2), 3,89 (dd, J = 3,5, 9,7 Hz, 1H, H-3), 4,43 (A, B de AB, J = 11,6 Hz, 2H, C ^P h), 4,64 (A de AB, J = 11,5 Hz, 1H, C ^P h), 4,81 (d, J= 7,6 Hz, 1H, H-1), 4,83-4,87 (m, H-1', H-2'), 4,97 (B de AB, J = 11,5 Hz, 1H, C ^P h), 5,06 (t, J = 9,5 Hz, 1H, H-4'), 5,36 (d, J = 3,2 Hz, 1H, H-4), 6.72, 6,96 (AA', BB' de AA'BB', J = 9,1 Hz, 4H, C6H4), 7,18-7,31 (m, 10H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 5 20.72, 20,76, 20,80 (3 COCH3), 52,81, 55,63 (2 OMe), 68,95 (C-6), 69,33 (C-4), 71,87 (C-4'), 72,54 (C-5), 73,04 (C-5'), 73,26 (C-3'), 73,70 (O-^Ph), 73,79 (C-2'), 75,31 (O-^Ph), 77,24 (C-3), 79,26 (C-2), 100,15 (C-1'), 102,65 (C-1), 114,56, 118,24 (4C, C6H4), 127,76, 127,83, 127,98, 128,04, 128,41, 128,53, 137,87, 138,00 (12C, 2 C6H5), 151,35, 155,35 (2C, C6H4), 167,46, 170,15, 170,36, 170,38 (4 CO); ESI-MS: m/z: calculada para C40H46NaO-i6 [M+Na]+: 805,28, encontrada: 805,34.
4-metoxifenil (metil 2,4-di-O-acetil-3-O-sulfo-B-D-glucopiranuronato)-(1^3)-4-O acetil-2,6-di-O-bencil-B-D-galactopiranósido, sal sódica (8)
El compuesto 7 (334 mg, 0,43 mmol) se disolvió en DMF (5 ml) y se añadió SO3-Py (370 mg, 2,34 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h a ta, luego la reacción se inactivó por agitación con NaHCO3 (320 mg, 3,77 mmol) durante 2 h. El sólido se separó por filtración y el filtro se lavó con MeOH. El filtrado se pasó por una columna de intercambio iónico Dowex® 50X8 (Na+), se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH, de 1:0 a 9:1) para proporcionar 8 (237 mg, 0,28 mmol, 65 %) como un sólido amarillento. Durante la concentración después de la cromatografía ultrarrápida se añadieron unas gotas de NaOH acuoso 0,1 M.
[a]D20 -10,4 (c 1,01, MeOH); 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 8 1,89, 2,03, 2,06 (3s, 9H, 3 OAc), 3,48 (dd, J = 7,4, 10,4 Hz, 1H, H-6a), 3,59 (dd, J = 4,4, 10,5 Hz, 1H, H-6b), 3,69, 3,72 (2s, 6H, 2 OMe), 3,77 (dd, J = 7,8, 9,6 Hz, 1H, H-2), 3,98 (dd, J = 4,5, 7,4 Hz, 1H, H-5), 4,03 (m, 1H, H-3), 4,05 (d, J = 10,2 Hz, 1H, H-5'), 4,46, 4,49 (A, B de AB, J= 11,6 Hz, 2H, CH2PIU 4,60 (t, J = 9,3 Hz, 1H, H-3'), 4,73, 4,92 (A, B de AB, J = 11,8 Hz, 2H, CH2Ph), 4,94 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-2'), 4,96 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-1'), 4,99 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-1), 5,06 (m, 1H, H-4'), 5,40 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-4), 6,77, 7,00 (AA', BB' de AA'BB', J = 9,1 Hz, 4H, C6H4), 7,23-7,35 (m, 8H, 2 C6H5), 7,39 (d, J = 7,2 Hz, 2H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CD3OD): 819,32, 19,23, 19,64 (3 COCH3), 51,68, 54,52 (2 OMe), 68,73 (C-6), 69,50 (C-4), 69,80 (C-4'), 71,36 (C-2'), 71,91 (C-5'), 72,52 (C-5), 72,83, 74,69 (2 CH2PIU 77,50 (C-3'), 78,57 (C-3), 78,59 (C-2), 100,04 (C-1), 102,01 (C-1'), 114,03, 117,64 (4C, C6H4), 127,14, 127,23, 127,36, 127,57, 127,81, 127,89, 138,02, 138,23 (12C, 2 C6H5), 151,29, 155,26 (2C, C6H4), 167,77, 170,07, 170,17, 170,64 (4 CO); ESI-MS: m/z: calculada para C40H46O19S [M]+: 862,24, encontrada: 862,42.
4-metoxifenil (disodio-3-O-sulfo- B-D-qlucop¡ranuronato)-(1^3)-B-D-aalactop¡ranósido (1)
El compuesto 8 (237 mg, 0,28 mmol) y Pd(OH)2/C (48 mg, 20 %) se suspendieron en MeOH/H2O (10:1, 5 ml) en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó durante 9 h en una atmósfera de hidrógeno (1 atm). El catalizador se separó por filtración a través de una almohadilla de Celite y la almohadilla se lavó con un gradiente de MeOH/H2O (6 x 10 ml, 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 0:10). El filtrado se concentró y el residuo se disolvió en MeOH/H2O (1:1, 8 ml). Luego se añadió LiOH acuoso 1 M (6,5 ml) a -10 °C y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta ta durante 3 h, se neutralizó con resina de intercambio iónico Amberlyste® 15 (H+), se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (RP-18, agua) y se pasó por una columna de intercambio iónico Dowex® 50X8 (Na+). La purificación final por cromatografía de exclusión por tamaño P2 produjo 1 (142 mg, 0,24 mmol, 88 %) como un sólido.
[a]D20 -19,2 (c 1,00, H2O); 1H RMN (500 MHz, D2O): 83,63 (dd, J = 8,0, 9,2 Hz, 1H, H-2'), 3,73 (m, 1H, H-4'), 3,75-3,81 (m, 6H, H-5, H-6, OMe), 3,85 (d, J = 10,0 Hz, 1H, H-5'), 3,89 (dd, J = 3,2, 9,9 Hz, 1H, H-3), 3,94 (dd, J = 7,7, 9,8 Hz, 1H, H-2), 4,24 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-4), 4,40 (t, J = 9,2 Hz, 1H, H-3'), 4,81 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-1'), 4,97 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-1), 6,96, 7,11 (AA', BB' de AA'BB', J = 9,2 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, D2O): 855,82 (OMe), 60,62 (C-6), 67,95 (C-4), 69,55 (C-2), 70,42 (C-4'), 71,86 (C-2'), 74,92 (C-5), 75,82 (C-5'), 82,49 (C-3), 83,30 (C-3'), 101,43 (C-1), 103,17 (C-1'), 115,02, 118,14, 150,89, 154,59 (6C, C6H4), 175,48 (CO); HRMS: m/z: calculada para C19H25Na2O-,6S [M H]+: 587,0659, encontrada: 587,0665.
Esquema 2: Síntesis del polímero de HNK-1 mínimo 25
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Reactivos y condiciones: a) TMSOTf, tamices moleculares de 4 A, DCM, 0 °C hasta ta (53 %); b) MeOH, NaOMe, ta, durante la noche (proporciona 12, 95 %); c) 2,2-dimetoxipropano, p-TsOH (Ts: toluilsulfonilo), DMF, ta, durante la noche (75 %); d) Eter corona 15-corona-5, BnBr, NaOH acuoso al 50 %, d Cm , durante la noche, 60 °C (83 %); e) AcOH, H2O, 60 °C, durante la noche (cuant.); f) ortobenzoato de trimetilo, p-TsOH, tolueno, 45 °C, durante la noche; AcOH, H2O, 60 °C, 2 h (93 %); g) TMSOTf, tamices moleculares de 4 A, DCM, 0 °C hasta ta, 86 %; h) LiOH en THF/H2O (89 %); i) Ac2O, DMAP, pir; MeOH, NaOAc MeOH (proporciona 18, 73 %); j) SOsPyDMF (91 %); k) LiOH, THF/H2O; Pd(OH)2/C, H2 , MeOH/H2O (78 %); I) ditiotreitol, tiobutirolactona, TEA, DMF, 85 °C (59 %); m) anhídrido cloroacético, 2,6-lutidina, DMF (96 %); n) DMF, H2O, DBU; tioglicerol, TEA; ultracentrifugación (70 %).
4-(2-azidoetil)fenol (9)
Se disolvieron tiramina (3,43 g, 25,0 mmol), NaHCO3 (7,80 g, 92,8 mmol) y CUSO4 5 H2O (0,22 g, 0,9 mmol) en agua (30 ml). Se añadieron una solución concentrada de azida tríflica (40 ml), que se preparó de acuerdo con Titz A. y otros, Tetrahedron Letters 47:2383-2385 (2006), y MeOH (190 ml) para proporcionar una mezcla homogénea. La mezcla se agitó a ta durante la noche, luego se diluyó con agua (150 ml) y se extrajo con EtOAc (3 x 150 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y los disolventes se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc, de 1:0 a 4:1) para producir 9 (cuant.) como un aceite incoloro.
1H RMN (500 MHz, CDCh): 82,81 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,44 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2N3), 6,77, 7,07 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, CDCla): 834,50 (CH2CH2N3), 52,72 (CH2CH2N3), 115,53, 129,96, 130,22, 154,39 (6C, C6H4); IR (película): 2105 cm-1 (N3).
4-(2-azidoetil)fen¡l 2,3,4,6-tetra-O-acetil-B-D-galactopiranósido (11)
A una suspensión enfriada con hielo de 10 (8,30 g, 17,5 mmol) (Bukowski R y otros, European Journal of Organic Chemistry 2001:2697-2705) y tamices moleculares de 4 A (3 g) en DCM (40 ml) se añadió 9 (4,00 g, 24,5 mmol) en DCM (40 ml) en atmósfera de argón. Se añadió gota a gota TfOH (0,45 ml, 2,5 mmol) y la mezcla de reacción se dejó calentar hasta ta durante la noche. Después de inactivar con TEA (0,8 ml), la suspensión se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc, de 9:1 a 3:2) para producir 11 (4,58 g, 9,28 mmol, 53 %) en forma de aceite.
[a]D20 6,1 (c 1,10, CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 81,98, 2,02, 2,06, 2,15 (4s, 12H, 4 OAc), 2,82 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,45 (t, J = 7,1 Hz, 2H, CH2CH2N3), 4,02 (t, J = 6,6 Hz, 1H, H-5), 4,13 (dd, J = 6,3, 11,3 Hz, 1H, H-6a), 4,20 (dd, J = 6,9, 11,2 Hz, 1H, H-6b), 4,99 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-1), 5,08 (dd, J = 3,4, 10,5 Hz, 1H, H-3), 5,40-5,48 (m, 2H, H-2, H-4), 6,93, 7,12 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,6 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 820,58, 20,65, 20,65, 20,73 (4 COCH3), 34,52 (CH2CH2N3), 52,51 (CH2CH2N3), 61,36 (C-6), 66,89 (C-4), 68,67 (C-2), 70,85 (C-3), 71.01 (C-5), 99,78 (C-1), 117,19, 129,87, 133,01, 155,85 (6C, C6H4), 169,40, 170,13, 170,26, 170,36 (4 CO); ESI-MS: m/z: calculda para C22H27N3NaO-i0 [M+Na]+: 516,17, encontrada: 516,19; IR (película): 2101 cirr1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l B-D-qalactopiranósido (12)
Una solución de 11 (4,58 g, 9,28 mmol) en MeOH (45 ml) se trató con NaOMe/MeOH 1 M (4,5 ml) en atmósfera de argón durante la noche. Después de la neutralización con resina de intercambio iónico Amberlite® IR-120 (H+), el disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH, de 1:0 a 4:1) para proporcionar 12 (2,86 g, 8,79 mmol, 95 %) como un aceite. [a]D20-38,1 (c 1,00, MeOH); 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 8 2,85 (t, J = 7,1 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,49 (t, J = 7,1 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,60 (dd, J = 3,4, 9,7 Hz, 1H, H-3), 3,70 (m, 1H, H-5), 3,75-3,85 (m, 3H, H-2, H-6), 3,93 (d, J = 3,2 Hz, 1H, H-4), 4,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H-1), 7,09, 7,20 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,6 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, CD3OD): 835,49 (CH2CH2N3), 53,75 (CH2CH2N3), 62,44 (C-6), 70,25 (C-4), 72,34 (C-2), 74,89 (C-3), 76,96 (C-5), 103,11 (C-1), 118,00, 130,82, 133,65, 158,08 (6C, C6H4); ESI-MS: m/z: calculada para C14H-igN3NaO6 [M+Na]+: 348,13, encontrada: 348,04; IR (película): 2112 cirr1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l 3,4-isopropiliden-B-D-galactopiranósido (13)
A una solución de 12 (2,86 g, 8,79 mmol) en DMF (30 ml) se le añadieron 2,2-dimetoxipropano (2,50 ml, 19,3 mmol) y p-TsOH (37 mg) en atmósfera de argón. Después de agitar durante la noche a 80 °C, la mezcla de reacción se neutralizó con TEA (0,5 ml) y los disolventes se evaporaron. El residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo TEA/EtOAc al 0,5 %, de 1:2 a 0:1) para producir 13 (2,39 g, 6,55 mmol, 75 %) como un aceite. [a]D20 -22,4 (c 1,10, CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 8 1,34, 1,53 (2s, 6H, Me2C), 2,42 (s, 2H, 2 OH), 2,81 (t, J = 7.1 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,44 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,78-3,85 (m, 2H, H-2, H-6a), 3,93-4,00 (m, 2H, H-6b, H-5 ), 4,14-4,21 (m, 2H, H-3, H-4), 4,78 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H-1), 6,95, 7,12 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 826,33, 28,10 (C(CH3)2), 34,54 (CH2CH2N3), 52,53 (CH2CH2N3), 62,29 (C-6), 73,31 (C-2), 73,69 (C-5), 73,87 (C-4), 78,89 (C-3), 100,33 (C-1), 110,69 (C(CH3)2), 116,89, 129,95, 132,63, 155,78 (6C, C6H4); ESI-MS: m/z: calculada para C-i7H23N3NaO6 [M+Na]: 388,16, encontrada: 388,06; IR (película): 2099 cirr1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l 2,6-di-O-bencil-3,4-isopropiliden-B-D-galactopiranósido (14)
El compuesto 13 (1,02 g, 2,78 mmol) se disolvió en DCM (15 ml). Se añadieron 15-corona-5 (55 pl, 0,28 mmol), NaOH acuoso al 50 % (37,5 ml) y bromuro de bencilo (3,30 ml, 27,8 mmol) y la mezcla bifásica se agitó durante la noche a reflujo a 60 °C. La mezcla de reacción se neutralizó con HCl acuoso 4 M. La capa orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con DCM (2 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se concentraron y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo TEA/EtOAc al 0,5 %, de 1:0 a 3:1) para proporcionar 14 (1,26 g, 2,31 mmol, 83 %) como un sólido blanco.
[a]D20 8,4 (c 1,00, CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 81,28, 1,34 (2s, 6H, Me2C), 2,76 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,37 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,60 (dd, J = 6,8, 7,9 Hz, 1H, H-2), 3,69-3,80 (m, 2H, H-6), 3,97 (ddd, J = 1,8, 4,7, 6,8 Hz, 1H, H-5), 4,13 (dd, J = 2,0, 5,7 Hz, 1H, H-4), 4,18 (m, 1H, H-3), 4,46, 4,54 (A, B de AB, J = 11,8 Hz, 2H, CH2Ph), 4,78-4,85 (m, 3H, CH2Ph, H-1), 6,69, 7,03 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,6 Hz, 4H, C6H4), 7,15-7,28 (m, 8H, 2 C6H5), 7,34 (d, J = 7,4 Hz, 2H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 8 26,41, 27,81 (C(CH3)2), 34,62 (CH2CH2N3), 52,62 (CH2CH2N3), 69,60 (C-6), 72,72 (C-5), 73,67 (C-4), 73,69 (2C, 2 CH2Ph), 79,08 (C-3), 79,26 (C-2), 101,09 (C-1), 110,27 (C(CHa)2), 117,23 (2C, C6H4), 127,63, 127,69, 127,72, 128,26, 128,32, 128,40 (8 C, 2 C6H5), 129,80 (2C, C6H4), 132,19, 138,14 (2 CaHa), 138,29, 156,26 (CaH4); ESI-MS: m/z: calculada para Ca-iHaaNaNaOa [M+Na]+: 568,25, encontrada: 568,21; IR (KBr): 2096 cm-1 (N3).8
4-(2-azidoetil)fen¡l 2,6-di-O-bencil-B-D-galactopiranósido (15)
Se agitó una solución de 14 (1,26 g, 2,31 mmol) en AcOH acuoso al 90 % (50 ml) a 60 °C y se agitó durante la noche. Los disolventes se evaporaron y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH, de 1:0 a 9:1) para proporcionar 15 (1,17 g, 2,31 mmol, cuant) como un aceite.
[a]D20 -9,9 (c 1,10, CHCl3); 1H RMN (500 MHz, CDCl3): 8 2,76 (t, J = 7,3 Hz, 2H, C ^ C ^ N a ), 3,38 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,59 (dd, J = 3,3, 9,5 Hz, 1H, H-3), 3,62-3,76 (m, 4H, H-2, H-5, H6 ), 3,92 (d, J = 3,2 Hz, 1H, H-4), 4,48 (s, 2H, CH2Ph), 4,69 (A de AB, J = 11,5 Hz, 1H, CH2Ph), 4,87 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-1), 4,96 (B de AB, J = 11,5 Hz, 1H, CH2Ph), 6,97, 7,05 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4), 7,15-7,31 (m, 10H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 834,58 (CH2CH2N3), 52,59 (CH2CH2N3), 68,92 (C-4), 69,41 (C-6), 73,20 (C-3), 73,74 (C-5), 73,81, 74,91 (2 CH2Ph), 78,87 (C-2), 101,86 (C-1), 117,19 (2C, C6H4), 127,75, 127,83, 128,03, 128,27, 128,47, 128,60 (8C, 2 C6H5), 129,83 (2C, C6H4), 132,33, 137,87 (2 C6H5), 138,14, 156,13 (C6H4); ESI-MS: m/z: calculada para C28H3-iN3NaO6 [M+Na]: 528,22, encontrada: 528,22; IR (película): 2098 cm-1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l 4-O-benzo¡l-2,6-d¡-O-benc¡l-B-D-galactop¡ranós¡do (16)
A una solución de 15 (1,17 g, 2,31 mmol) en tolueno (15 ml) se le añadieron trimetilortobenzoato (0,64 ml, 3,72 mmol) y p-TsOH (118 mg, 0,62 mmol). La mezcla se agitó a 45 °C durante la noche, luego se concentró y el residuo se disolvió en AcOH acuoso al 90 % (15 ml). La solución se agitó durante 2 h a 60 °C, se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc, de 9:1 a 7:3) para producir 16 (1,30 g, 2,14 mmol, 93 %) como un aceite incoloro.
[a]D20 -8,4 (c 1,00, CHCh); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 82,83 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,44 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3) 3,60-3,66 (m, 2H, H-6), 3,87 (dd, J = 7,4, 9,6 Hz, 1H, H-2), 3,92 (dd, J = 3,5, 9,6 Hz, 1H, H-3), 3,96 (t, J = 6,2 Hz, 1H, H-5), 4,41,4,48 (A, B de AB, J = 11,7 Hz, 2H, CH2Ph), 4,78 (A de AB, J = 11,2 Hz, 1H, CH2Ph), 4,99-5,07 (m, 2H, H-1, CH2Ph), 5,63 (d, J = 2,8 Hz, 1H, H-4), 7,06, 7,12 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4), 7,18-7,35 (m, 10H, 2 C6H5), 7,43 (t, J = 7,8 Hz, 2H, C6H5), 7,56 (t, J = 7,4 Hz, 1H, C6H5), 8,04-8,09 (m, 2H, C6H5); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 834,62 (CH2CH2N3), 52,63 (CH2CH2N3), 68,61 (C-6), 70,25 (C-4), 72,21 (C-3), 73,28 (C-5), 73,71, 75,13 (2 CH2Ph), 79,15 (C-2), 101,89 (C-1), 117,07 (2C, C6H4), 127,76, 127,78, 128,04, 128,29, 128,39, 128,49, 128,58, 129,57 (12C, 3 C6H5), 129,93 (2C, C6H4), 130,10, 132,46, 133,38, 137,79 (6C, 3 C6H5), 138,06, 156,17 (C6H4), 166,38 (CO); ESI-MS: m/z: calculada para C35H35N3NaOy [M+Na]+: 532,24, encontrada: 532,28; IR (película): 2102 cm ' 1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l_____(metil 2,3,4-tr¡-O-benzo¡l-B-D-glucop¡ranuronato)-(1^3)-4-O-benzo¡l-2,6-d¡-O-benc¡l-B-D-galactopiranósido (17)
En atmósfera de argón se suspendieron tricloroacetimidato 3 (1,75 g, 2,63 mmol), 16 (1,30 g, 2,14 mmol) y tamices moleculares de 4 A activados (2 g) en DCM (25 ml). La mezcla se agitó durante 1 h a ta y luego se enfrió hasta 0 °C. Se añadió gota a gota TMSOTf (58,4 pl, 0,32 mmol). La mezcla de reacción se dejó calentar hasta ta durante la noche y luego se neutralizó con TEA (150 pl) y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía (éter de petróleo/EtOAc, de 9:1 a 7:3) para producir 17 (2,04 g, 1,84 mmol, 86 %) en forma de un sólido blanco.
[a]D20 25,2 (c 1,10, CHCl3); 1H RMN (500 MHz, CDCh): 82,84 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,46 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,61 (dd, J = 7,3, 10,1 Hz, 1H, H-6a), 3,67 (s, 3H, OMe), 3,72 (dd, J = 4,7, 10,2 Hz, 1H, H-6b), 3,98 (dd, J= 7,9, 9,5 Hz, 1H, H-2), 4,02 (dd, J = 5,3, 6,5 Hz, 1H, H-5), 4,15 (d, J = 9,8 Hz, 1H, H-5'), 4,24 (dd, J = 3,4, 9,5 Hz, 1H, H-3), 4,48 (A, B de AB, J = 11,5 Hz, 2H, CH2Ph), 4,55, 4,91 (A, B de AB, J = 10,7 Hz, 2H, CH2Ph), 5,02 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-1), 5,39 (d, J = 7,4 Hz, 1H, H-1'), 5,47 (dd, J= 7,4, 9,1 Hz, 1H, H-2'), 5,69 (t, J = 9,5 Hz, 1H, H-4'), 5,77 (t, J = 9,3 Hz, 1H, H-3'), 5,81 (d, J = 3,3 Hz, 1H, H-4), 7,02, 7,10 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,7 Hz, 4H, C6H4), 7,22-7,46, 7,48-7,53, 7,56-7,66, 7,76-7,81, 7,88-7,93, 8,05-8,10 (m, 30H, 6 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CDCh): 834,60 (CH2CH2N3), 52,59 (CH2CH2N3), 52,86 (OMe), 69,06 (C-6), 70,01 (C-4), 70,06 (C-4'), 71,83 (C-2'), 72,24 (C-3'), 72,94 (C-5'), 73,67 (C-5), 73,73, 75,25 (2 CH2Ph), 76,26 (C-3), 79,77 (C-2), 100,3 (C-1'), 101,81 (C-1), 117,02 (2C, C6H4), 127,69, 127,76, 127,98, 128,10, 128,30, 128,37, 128,43, 128,56, 128,75, 128,94, 129,09, 129,60, 129,77, 129,82, 129,87, 129,94, 130,10, 132,39, 132,92, 133,08, 133,26, 133,38, 137,85, 137,92, 156,09 (40C, 6 C6H5, C6H4), 164,47, 165,00, 165,51, 165,64, 167,16 (5 CO); ESI-MS: m/z: calculada para Cg3H57N3NaO-i6 [M+Na]+: 1134,36, encontrada: 1134,47; IR (KBr): 2099 cm ‘ 1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l (B-D-glucop¡ranuronato)-(1^3)-2,6-d¡-O-benc¡l-B-D-galactop¡ranós¡do (18)
El compuesto 17 (2,04 g, 1,84 mmol) se suspendió en THF (14 ml) y la suspensión se enfrió hasta -10 °C. Luego se añadió gota a gota LiOH acuoso 2 M (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante la noche y se dejó calentar hasta ta. Después de la neutralización con resina de intercambio iónico Amberlite® IR-120 (H+) y la filtración, los disolventes se evaporaron, el residuo se disolvió en THF/H2O (2:3, 16 ml) y se trató con TFA (8 ml) durante 30 min. La mezcla se evaporó hasta sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía de fase inversa (RP-18, MeOH/agua, de 0:1 a 3:1) para proporcionar 18 (1,12 g, 1,64 mmol, 89 %) como un sólido.
[a]D20 -48,1 (c 1,00, MeOH); 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 52,79 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,35-3,47 (m, 4H, H-2', H-3', CH2CH2N3), 3,53 (t, J = 9,1 Hz, 1H, H-4'), 3,73 (m, 2H, H-6), 3,77 (d, J = 9,8 Hz, 1H, H-5'), 3,81-3,89 (m, 2H, H-3, H-5), 3,94 (m, 1H, H-2), 4,06 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H-4), 4,53 (s, 2H, CH2PIU 4,74 (d, J = 7,3 Hz, 1H, H-1'), 4,88­ 4,95 (m, 2H, CH2Ph), 4,99 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H-1), 7,02, 7,12 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4), 7,20-7,34 (m, 8H, 2 C6H5), 7,41 (d, J = 7,1 Hz, 2H, 2 CaHs); 13C RMN (126 MHz, CD3OD): 533,97 (CH2CH2N3), 52,19 (CH2CH2N3), 68,85 (C-4), 69,18 (C-6), 71,78 (C-4'), 72,86 (O-hPh), 73,32 (C-2'), 73,58 (C-5), 74,69 (CH2Ph), 74,93 (C-5'), 75,83 (C-3'), 78,50 (C-2), 80,64 (C-3), 101,39 (C-1), 104,07 (C-1'), 116,43 (2C, C6H4), 127,12, 127,21, 127,25, 127,75, 127,87, 128,23 (10C, 2 C6H5), 129,44, 132,31 (3C, C6H4), 138,22, 138,38 (2 C6H5), 156,25 (C6H4), 171,27 (CO); ESI-MS: m/z: calculada para C34H3gN3NaO-i2 [M+Na]+: 704,24, encontrada: 704,30; IR (KBr): 2099 cm'1 (N3).
4-(2-azidoetil)fen¡l_____ (metil____ 2.4-d¡-0-acetil-B-D-alucop¡ranuronato)-(1^3)-4-0-acet¡l_____2,6-di-O-bencil-B-D-galactopiranósido (19)
Se agitó una solución de 18 (900 mg, 1,32 mmol) en Ac2O (15 ml) a 80 °C durante 1 h y luego se enfrió hasta ta. Se añadieron piridina (9 ml) y DMAP (25 mg) y la mezcla de reacción se agitó durante 3 días. Los disolventes se evaporaron conjuntamente con tolueno (5 x 5 ml). El residuo se disolvió en DCM (50 ml) y se extrajo con salmuera (50 ml) y agua (50 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se filtró a través de algodón. Después de la evaporación del disolvente, el residuo se disolvió en MeOH seco (20 ml) y se añadió NaOAc anhidro (100 mg). La mezcla se agitó durante la noche, se neutralizó con resina de intercambio iónico Amberlyste® 15 (H+) y se filtró. El filtrado se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (éter de petróleo/EtOAc, de 2:1 a 2:3) para producir 19 (794 mg, 0,97 mmol, 73 %) en forma de un sólido amarillento.
[a]D20 -32,6 (c 1,00, CHClg); 1H RMN (500 MHz, CDClg): 5 1,92, 2,01, 2,04 (3s, 9H, 3 OAc), 2,77 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,40 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,48 (dd, J = 7,1, 10,1 Hz, 1H, H-6a), 3,55 (dd, J = 4,8, 10,2 Hz, 1H, H-6b), 3,61 (m, 1H, H-3'), 3,67 (s, 3H, OMe), 3,78-3,83 (m, 2H, H-5, H-5'), 3,86 (dd, J = 7,6, 9,7 Hz, 1H, H-2), 3,91 (dd, J = 3,3, 9,6 Hz, 1H, H-3), 4,43 (A, B de AB, J = 11,7 Hz, 2H, CH2Ph), 4,64 (A de AB, J= 11,6 Hz, 1H, CH2Ph), 4,81­ 4,88 (m, 2H, H-1, H-2), 4,91 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H-1'), 4,95 (B de AB, J = 10,6 Hz, 1H, CH2Ph), 5,07 (t, J = 9,5 Hz, 1H, H-4'), 5,38 (d, J = 3,0 Hz, 1H, H-4), 6,96, 7,04 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4), 7,18-7,31 (m, 10H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CDClg): 520,69, 20,72, 20,76 (3 COCH3), 34,59 (CH2CH2N3), 52,58 (CH2CH2N3), 52,79 (OCH3), 68,93 (C-6), 69,30 (C-4), 71,91 (C-4'), 72,53 (C-5), 73,10 (C-5'), 73,38 (C-3'), 73,70 (CH2Ph), 73,87 (C-2'), 75,31 (CH2Ph), 77,24 (C-3), 79,19 (C-2), 100,10 (C-1'), 101,71 (C-1), 117,04 (2C, C6H4), 127,76, 127,80, 127,96, 128,01, 128,40, 128,49 (10C, 2 C6H5), 129,85, 132,41 (3C, C6H4), 137,87, 137,96 (2 C6H5), 156,08 (C6H4), 167,42, 170,11, 170,29, 170,32 (4 CO); ESI-MS: m/z: calculada para C41H47N3NaO-,5 [M+Na]+: 844,29, encontrada: 844,39; IR (KBr): 2101 cm-1 (N3).
4-(2-az¡doet¡l)fen¡l (metil 2,4-d¡-0-acet¡l-3-0-sulfo-B-D-alucop¡ranuronato)-(1^3)-4-0-acet¡l-2,6-d¡-0-benc¡l-B-D-galactopiranósido, sal sódica (20)
El compuesto 19 (794 mg, 0,97 mmol) se disolvió en DMF seca (10 ml) y se añadió SO3-Py (846 mg, 5,31 mmol). La mezcla se agitó durante 2 h a ta y se inactivó mediante agitación con NaHCO3 (719 mg, 8,56 mmol) durante 2 h. El sólido se separó por filtración y el filtro se lavó con MeOH. El filtrado se pasó por una columna de intercambio iónico Dowex 50X8 (Na+). El filtrado se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH, de 1:0 a 9:1) para proporcionar 20 (808 mg, 0,88 mmol, 91 %) como un sólido amarillento. Durante la concentración después de la cromatografía ultrarrápida se añadieron unas gotas de NaOH acuoso 0,1 M.
[a]D20 -18,3 (c 1,00, MeOH); 1H RMN (500 MHz, CD3OD): 5 1,97, 2,09, 2,11 (3s, 9H, 3 OAc), 2,86 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,50 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2CH2N3), 3,54 (dd, J = 7,4, 10,4 Hz, 1H, H-6a), 3,65 (dd, J = 4,4, 10,4 Hz, 1H, H-6b), 3,75 (s, 3H, OMe), 3,86 (dd, J = 7,9, 9,5 Hz, 1H, H-2), 4,07 (dd, J = 4,6, 7,1 Hz, 1H, H-5), 4,09-4,14 (m, 2H, H-3, H-5'), 4,49-4,57 (m, 2H, CH2Ph), 4,66 (t, J = 9,2 Hz, 1H, H-3'), 4,80 (A de AB, J = 10,7 Hz, 1H, CH2Ph), 4,96-5,03 (m, 2H, CH2Ph, H-2'), 5,06 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-1'), 5,11-5,17 (m, 2H, J = 8,2 Hz, H-1, H-4') 5,48 (d, J = 3,6 Hz, 1H, H-4), 7,07, 7,18 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4), 7,29-7,44 (m, 10H, 2 C6H5); 13C RMN (126 MHz, CD3OD): 5 20,87, 21,20 (3C, 3 COCH3), 35,50 (CH2CH2N3), 53,24 (CH2CH2N3), 53,71 (OMe), 70,27 (C-6), 71,08 (C-4), 71,37 (C-4'), 72,95 (C-2'), 73,50 (C-5'), 74,14 (C-5), 74,41, 76,26 (2 CH2Ph), 78,98 (C-3'), 80,02 (C-3), 80,11 (C-2), 101,62 (C-1'), 102,61 (C-1), 117,93 (2C, C6H4), 128,69, 128,79, 128,90, 129,17, 129,37, 129,43 (10C, 2 C6H5), 131,02, 134,06 (3C, C6H4), 139,56, 139,72 (2 C6H5), 157,58 (C6H4), 164,89, 169,39, 171,64, 171,75 (4 CO); ESI-MS: m/z: calculada para C41H46N3O18S [M-H]v 900,25, encontrada: 900,42; IR (KBr): 2101 cm-1 (N3).
4-(2-am¡noet¡l)fen¡l (3-O-sulfo-B-D-glucopiranuronato d¡sód¡co)-(1^3)-B-D-aalactop¡ranós¡do (21)
A una solución de 20 (470 mg, 0,51 mmol) en THF/H2O (10:1, 10 ml) se añadió LiOH aq 2 M (2 ml) a -10 °C. La mezcla de reacción se dejó calentar hasta ta y se agitó durante la noche. La mezcla se neutralizó con resina de intercambio iónico Amberlyste 15 (H+) y se filtró. El filtrado se pasó por una columna de intercambio iónico Dowex® 50X8 (Na+) con MeOH y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía flash (DCM/MeOH/H2O, 10:3:0,3). Se añadieron unas pocas gotas de NaOH acuoso 0,1 M durante la concentración del producto, que después se disolvió en MeOH (4,5 ml) y H2O (3,75 ml). Se añadieron AcOH (0,2 ml) y Pd(OH)2/C (94 mg, 20 %) en atmósfera de argón y la mezcla de reacción se agitó durante la noche en una atmósfera de hidrógeno (1 atm). El catalizador se separó por filtración a través de una almohadilla de Celite y la almohadilla se lavó con MeOH y unas pocas gotas de H2O. El filtrado se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño P2 para producir 21 (238 mg, 0,40 mmol, 78 %) como un sólido incoloro después de la liofilización.
[a]D20 -25,6 (c 1,00, H2O); 1H RMN (500 MHz, D2O): 82,99 (t, J = 7,0 Hz, 2H, CH2CH2NH2), 3,28 (t, J = 7,1 Hz, 2H, CH2CH2NH2), 3,66 (t, J = 8,4 Hz, 1H, H-2'), 3,71-3,88 (m, 5H, H5, H-6, H-4', H-5'), 3,92 (dd, J = 3,2, 9,9 Hz, 1H, H-3), 3,99 (t, J = 8,6 Hz, 1H, H-2), 4,26 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-4), 4,39 (t, J = 9,0 Hz, 1H, H-3'), 4,82 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-1'), 5,12 (d, J = 7.,7 Hz, 1H, H-1), 7,17, 7,32 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,0 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, D2O): 831,97 (CH2CH2NH2), 40,65 (CH2CH2NH2), 60,78 (C-6), 68,05 (C-4), 69,02 (C-2), 70,50 (C-4'), 72,03 (C-2'), 75,10 (2C, C-5, C-5'), 82,43 (C-3), 83,60 (C-3'), 100,46 (C-1), 103,24 (C-1'), 117,01, 130,30, 131,29, 155,75 (6C, C6H4), 175,45 (CO); ESI-MS: m/z: calculada para C20H27NNa2O15S [M-2Na+H]v 554,12, encontrada: 554,07.
4-(2-(4-mercaptobutanamido)et¡l)fen¡l (disodio-3-0-sulfo-B-D-glucopiranuronato)-(1^3)-B-D-galactopiranósido (22)
A una suspensión de 21 (238 mg, 0,40 mmol) en DMF (8 ml) se le añadieron ditiotreitol (112 mg, 0,72 mmol), tiobutirolactona (343 pl, 4 mmol) y TEA (552 pl, 4 mmol). La mezcla se agitó durante 18 ha 85 °C. El disolvente se evaporó conjuntamente con el tolueno ( 3 x 5 ml) y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (DCM/MeOH/H2O, 10:5:1). Se añadieron unas gotas de NaOH acuoso 0,1 M durante la concentración del producto. La liofilización proporcionó 22 (164 mg, 0,234 mmol, 59 %) como un sólido incoloro.
[a]D20 -20,2 (c 1,00, H2O); 1H RMN (500 MHz, D2O): 8 1,72-1,85 (m, 2H, CH2CH2CH2SH), 2,28 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2CH2SH), 2,37 (t, J = 7,2 Hz, 2H, CH2CH2CH2SH), 2,83 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2CH2NH), 3,49 (t, J = 6,5 Hz, 2H, CH2CH2NH), 3,67 (dd, J = 8,1, 9,1 Hz, 1H, H-2'), 3,73-3,91 (m, 5H, H-5, H6, H-4', H-5'), 3,94-4,02 (m, 2H, H-2, H-3), 4,29 (d, J = 2,7 Hz, 1H, H-4), 4,39 (t, J = 9,1 Hz, 1H, H-3'), 4,84 (d, J = 7,9 Hz, 1H, H-1'), 5,13 (d, J = 7,4 Hz, 1H, H-1), 7,14, 7,27 (AA', BB' de AA'BB', J = 8,5 Hz, 4H, C6H4); 13C RMN (126 MHz, D2O): 8 22,87 (CH2CH2CH2SH), 29,44 (CH2CH2CH2SH), 33,63 (CH2CH2NH), 34,34 (CH2CH2CH2SH), 40,25 (CH2CH2NH), 60,77 (C-6), 68,04 (C-4), 69,03 (C-2), 70,47 (C-4'), 72,02 (C-2'), 75,10 (C-5), 76,10 (C-5'), 82,48 (C-3), 83,62 (C-3'), 100,67 (C-1), 103,26 (C-1'), 116,72, 130,19, 133,93, 155,24 (6C, C6H4), 175,43, 175,79 (2 CO); HRMS: m/z: calculada para C24HaaNNa2O16S2 [M+H]+: 702,1109, encontrada: 702,1104.
Polilisina cloroacetilada (24)
Se suspendió bromhidrato de polilisina (23) (Sigma P2636, PM 30-70 kDa, 0,50 g, 2,4 mmol) en una mezcla de DMF (5 ml) y 2,6-lutidina (1,25 ml) en atmósfera de argón. La suspensión se enfrió hasta 0 °C y se añadió lentamente una solución de anhídrido cloroacético (513 mg, 3,00 mmol) en DMF (1 ml). La solución transparente resultante se agitó durante 16 h a 0 °C. El producto se precipitó mediante la adición gota a gota de la mezcla de reacción a una solución agitada de etanol/éter (1:1, 40 ml). El precipitado se separó por filtración, se lavó con etanol/éter (1:1, 20 ml) y se concentró para proporcionar 24 (449 mg, 96 %). Los datos de 1H RMN estaban de acuerdo con los valores de la bibliografía (G. Thoma y otros, J Am Chem Soc 1999, 121:5919-5929).
Polímero de HNK-1 mínimo (25)
A una solución de 24 (80,2 mg, 0,39 mmol) en DMF (4 ml) se añadieron posteriormente 22 (110 mg, 0,16 mmol), agua (200 pl) y DBU (88 pl, 0,59 mmol) en DMF (0,8 ml). Después de agitar durante 1 h, se añadieron tioglicerol (102 pl, 1,18 mmol) y TEA (164 pl, 1,18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 18 h. El producto se precipitó mediante la adición gota a gota de la mezcla de reacción a una solución agitada de etanol/éter (1:1, 30 ml). El precipitado se separó por filtración, se lavó con etanol/éter (1:1, 15 ml) y se secó. Se consiguió una purificación adicional mediante ultrafiltración. El producto seco se disolvió en agua (10 ml) y la ultracentrifugación se realizó mediante el uso de dos tubos Sartorius Stedim Vivaspin 6 (volumen, 6 ml, diámetro, 17 mm, nivel de corte de peso molecular 5000). La ultrafiltración se repitió cuatro veces desde 10 ml hasta 3 ml, en cada ocasión el volumen se llenó con agua. La liofilización proporcionó el polímero de HNK-1 25 (139 mg, 70 %). De acuerdo con 1H RMN, el producto contenía aproximadamente 44 % de unidades de carbohidrato de monómero unidas al polímero.
Esquema 3: Síntesis del polímero de HNK-1 mínimo 30
Figure imgf000026_0001
Reactivos y condiciones: a) TEA, CHCI3 , 46 %; b) AlBN, benceno, 84 %; c) i. DMF, DMSO, DBU, TEA; ii. MeNH2/MeOH, 39 %.
Acrilato de 2.5-d¡oxop¡rroI¡din-1-¡Io (28)
A una solución enfriada (baño de hielo) de A/-hidroxisuccinimida (27) (6.41 g. 55.8 mmol) y NEt3 (8.5 ml. 61.0 mmol) en CHCl3 (100 ml) se añadió cloruro de acriloilo (26) gota a gota en atmósfera de argón. La temperatura de la mezcla se mantuvo por debajo de 12 °C durante la adición. Después de agitar durante 2.5 h. la mezcla de reacción se lavó posteriormente con agua helada (100 ml). agua (100 ml) y salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4. se filtró. se concentró al vacío hasta 15 ml y se filtró a través de una almohadilla de Celite. El Celite se lavó con CHCh (15 ml). el filtrado se diluyó con EtOAc (2 ml) y éter de petróleo (11 ml). y se almacenó a -20 °C durante la noche. El precipitado formado se separó por filtración y se secó al vacío para producir 28 (4.30 g. 25.4 mmol. 46 %) en forma de agujas blancas.
Poliacrilato activado (29)
Se calentó una solución de 28 (2.10 g. 12.4 mmol) y AIBN (133 mg. 0.81 mmol) en benceno seco (100 ml) a 60 °C durante 1 d. El precipitado formado se separó por filtración. se lavó con THF seco y se secó al vacío para proporcionar 29 (1.70 g. 81 %) como un sólido blanco. El peso molecular de 29 se determinó mediante cromatografía de filtración en gel (GPC). con el uso del kit de calibración de poliestireno Varian S-M2-10 como estándar. Mn = 13.9 kDa. Mw = 55.3 kDa. Mz = 127.4 kDa. Mp = 39.0 kDa. Mw/Mn = 3.99.
Polímero de HNK-1 mínimo (30)
El compuesto 22 (51 mg, 0,085 mmol), DBU (10,5 mg, 0,183 mmol) y el polímero 29 (29 mg) se disolvieron en DMF (0,5 ml) y DMSO (1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 18 h. Luego, se añadió MeNH2 (0,5 ml, solución al 33 % en MeOH) y se continuó la agitación durante 19 h. La mezcla se dializó posteriormente con una membrana de nivel de corte de 10 kDa en agua (1 l), formiato de amonio ac. (40 mM, 1 l), formiato de amonio ac. (60 mM, 2 x 1 l) y agua (2 x 1 l). La liofilización final proporcionó un polímero de HNK-1 mínimo 30 (27 mg, 39 %) como sal de amonio. De acuerdo con 1H RMN, el producto contenía aproximadamente el 50 % de unidades de monómeros de carbohidrato unidas al polímero.
Suero del paciente
Se investigaron los sueros de cuatro pacientes (tres hombres y una mujer). Todos resultaron positivos para una gammapatía monoclonal IgM y se diagnosticaron con neuropatía anti-MAG en el University Hospital of Basel (Basilea, Suiza). Los títulos de anticuerpos anti-MAG en suero se determinaron mediante un ensayo ELISA (Bühlmann Laboratories, Schonenbuch, Suiza). Los sueros de dos pacientes con gammapatía monoclonal IgM y actividad anti-MAG negativa sirvieron como control. El uso de sueros fue aprobado por el comité de ética de1Hospital Universitario de Basilea.
Ensayo de unión competitivo
Se utilizó un kit ELISA anti-MAG (Bühlmann Laboratories, Schonenbuch, Suiza) para la evaluación biológica de los compuestos 1, 2 y 25. Las placas de 96 pocillos recubiertas con MAG purificada de cerebro humano se lavaron cuatro veces con amortiguador de lavado (300 pl/pocillo) antes de añadir los ligandos de carbohidratos en siete concentraciones diferentes (0,05 - 50 mM para los monómeros 1 y 2 y 0,05 - 5000 nM para el polímero 25), 25 pl/pocillo. Los sueros de los pacientes que contenían los anticuerpos IgM anti-MAG se añadieron en las diluciones apropiadas, 25 pl/pocillo. Las medidas se realizaron por duplicado. La placa se cubrió con un sellador de placas y se incubó durante 2 h a 5 °C. Los pocillos se lavaron cuatro veces con amortiguador de lavado (300 pl/pocillo) antes de añadir (100 pl/pocillo) la IgM marcada con enzima (anticuerpo anti-IgM humana conjugado con peroxidasa de rábano picante en un amortiguador a base de proteínas con conservantes). La placa se incubó durante 2 ha 5 °C. Después de lavar los pocillos (4 x 300 pl/pocillo), se añadió una solución de sustrato de tetrametilbencidina (TMB en amortiguador de citrato con peróxido de hidrógeno) (100 pl/pocillo) y la placa se incubó durante 30 minutos más a 800 rpm y temperatura ambiente (ta), protegido de la luz del día. Finalmente, se añadió una solución de parada (ácido sulfúrico 0,25 M) (100 pl/pocillo) y se determinó el grado de reacción colorimétrica mediante la medición de absorción a 450 nm con un lector de microplacas (Spectramax 190, Molecular Devices, California, Estados Unidos).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la Fórmula (I)
Figure imgf000028_0001
o de la Fórmula (II)
Figure imgf000028_0002
en donde Z es fenilo sustituido o no sustituido.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de la Fórmula (I) o (II) en donde Z es p-metoxifenilo.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de la Fórmula (I) en donde Z es p-metoxifenilo.
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de la Fórmula (II) en donde Z es p-metoxifenilo.
5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 de la Fórmula (I) o (II) en donde Z es p-metoxifenilo, 4-(2-aminoetil)fenilo o 4-(2-(4-mercaptobutanoilamino)etil)fenilo.
6. Un polímero que comprende una multitud de sustituyentes de la Fórmula (I) y/o la Fórmula (II),
Figure imgf000028_0003
en donde Z es un enlazador que conecta dicho sustituyente a la cadena principal del polímero, en donde el enlazador Z es arilo, heteroarilo, arilalquilo C1-7, arilcarbonilo o heteroarilmetilo, en donde arilo o heteroarilo está sustituido por alquileno con 3 a 25 átomos de carbono que conectan al polímero en donde opcionalmente (a) uno o más átomos de carbono de alquileno se reemplazan por nitrógeno que tiene un átomo de hidrógeno, y uno de los átomos de carbono adyacentes está sustituido por oxo, que representa una función amida -NH-CO-; y/o
(b) uno o más átomos de carbono de alquileno se reemplazan por oxígeno;
(c) uno o más átomos de carbono de alquileno se reemplazan por azufre; y/o
(d1) el átomo de carbono terminal que se conecta al polímero está sustituido por oxo; o
(d2) el átomo de carbono terminal que se conecta al polímero se reemplaza por -NH-.
7. El polímero de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la cadena principal del polímero es un polímero de aaminoácido, un polímero o copolímero de ácido acrílico o ácido metacrílico o un copolímero de N-vinil-2-pirrolidona-alcohol vinílico.
8. El polímero de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la cadena principal del polímero es un polímero de aaminoácido, en donde el a-aminoácido es lisina, ácido glutámico o ácido aspártico.
9. El polímero de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la cadena principal del polímero es polilisina.
10. El polímero de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el peso molecular de la cadena principal del polímero es de 1000 D a 300000 D.
11. El polímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde el peso molecular relativo de la cadena principal del polímero al disacárido de la Fórmula (I) y/o (II) está entre 10:1 y 1:1,5.
12. El polímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde Z es arilo, heteroarilo, arilalquilo C1-7, arilcarbonilo o heteroarilmetilo, en donde el arilo o heteroarilo está sustituido por -(C H 2)2NH(C=O)(CH2)3S CH2-(C=O)- que conecta al polímero con cadenas laterales de aminoalquilo en la función C=O, y en donde preferentemente dicho enlazador Z es fenilo sustituido con -(CH2)2NH(C=O)(CH2)3S-CH2-(C=O)- que conecta al polímero con las cadenas laterales de aminoalquilo en la función C=O.
13. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula (I) o (II) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un polímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.
14. Un kit de diagnóstico que comprende un compuesto de la Fórmula (I) o (II) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5 o un polímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12.
15. Un compuesto de la Fórmula (I) o (II) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o un polímero de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 2 , para su uso en un método de diagnóstico o de tratamiento de la neuropatía anti-MAG.
ES15709483T 2014-03-13 2015-03-12 Ligandos de carbohidratos que se unen a los anticuerpos IgM contra la glucoproteína asociada a mielina Active ES2865148T3 (es)

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PCT/EP2015/055140 WO2015136027A1 (en) 2014-03-13 2015-03-12 Carbohydrate ligands that bind to igm antibodies against myelin-associated glycoprotein

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