ES2865482T3 - Moléculas de unión que inhiben el crecimiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un dominio variable que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT, en donde el anticuerpo biespecífico comprende dominios variables que se unen a EGFR y al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR5).

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión que inhiben el crecimiento del cáncer

La invención se refiere al campo de las moléculas de unión. En particular, se refiere al campo de las moléculas de unión terapéuticas para el tratamiento de enfermedades que involucran células aberrantes. Más en particular, se refiere a moléculas de unión que se unen a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT.

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de muerte en el mundo, a pesar de los muchos avances que se han realizado en el tratamiento de la enfermedad y el mayor conocimiento de los eventos moleculares que conducen al cáncer. El cáncer colorrectal (CCR), por ejemplo, es el tercer cáncer más común en todo el mundo. En 2008, 1.23 millones de personas fueron diagnosticadas con la enfermedad. Es el segundo cáncer más común en Europa, con alrededor de 447.000 nuevos casos diagnosticados en 2012 (13% del total). El cáncer colorrectal es la cuarta causa más común de muerte por cáncer, y se estima que es responsable de 608.000 (EU 148.000) muertes por año. Si bien se han avanzado algunos tratamientos nuevos en el CCR, muchos han fallado en las pruebas clínicas; el CCR metastásico sigue siendo en gran parte incurable.

Tradicionalmente, la mayoría de los descubrimientos de fármacos contra el cáncer se han centrado en agentes que bloquean las funciones celulares esenciales y destruyen las células en división. Sin embargo, en los casos de cáncer avanzado, no importa cuán agresivamente se aplique, incluso hasta el punto en que los pacientes sufren efectos secundarios potencialmente mortales del tratamiento, la quimioterapia rara vez resulta en una cura completa. En la mayoría de los casos, los tumores en los pacientes dejan de crecer o se encogen temporalmente (lo que se conoce como remisión) solo para comenzar a proliferar nuevamente, algunas veces más rápidamente (lo que se conoce como recaída) y se vuelven cada vez más difíciles de tratar. Más recientemente, el enfoque de desarrollo de fármacos contra el cáncer se ha alejado de la quimioterapia ampliamente citotóxica a las terapias citostáticas dirigidas con menos toxicidad. El tratamiento del cáncer avanzado con terapia dirigida que inhibe específicamente los componentes de la ruta de señalización se ha validado clínicamente en la leucemia. Sin embargo, en la mayoría de los carcinomas, las metodologías dirigidas siguen demostrando ser ineficaces. En el cáncer colorrectal, más del 80% de los pacientes sobreexpresan el receptor de tirosina quinasa EGFR, pero el tratamiento con terapias bloqueantes de EGFR da como resultado tasas de respuesta de ~10% y, al igual que con la quimioterapia, estas respuestas no son duraderas. Si bien en algunos pacientes la tasa de respuesta deficiente puede estar relacionada con la activación de mutaciones corriente abajo del agente bloqueante, existe evidencia científica acumulada de que un tipo especial de célula cancerosa autorrenovable puede explicar la actividad limitada de los medicamentos contra el cáncer en muchas situaciones.

Las células madre cancerosas son células tumorales que comparten características con las células madre normales, lo más importante es la capacidad de autorrenovarse durante largos períodos de tiempo y dar lugar a muchos de los tipos de células dentro de un cáncer dado. La evidencia reciente sugiere que mientras la quimioterapia convencional y las terapias dirigidas actuales matan las células diferenciadas y diferenciadoras que forman la mayor parte de los tumores, la célula madre cancerosa que se renueva a sí misma es menos sensible a estos enfoques terapéuticos. Por lo tanto, las células madre cancerosas, que típicamente forman una pequeña subpoblación de células dentro del tumor, pueden ser responsables de la regeneración de la enfermedad después de la terapia y la formación de metástasis. Se cree que las células madre cancerosas surgen de células madre adultas que han acumulado una o más mutaciones que inician el desarrollo del cáncer. En las células madre normales, la proliferación está estrictamente controlada tanto espacial como temporalmente a través de señales transmitidas en su entorno inmediato. Por el contrario, las células madre cancerosas proliferan y se diferencian de una manera menos controlada fuera del compartimento normal de células madre, en donde dependen de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores.

Sin limitación a ninguna teoría, se cree que se han desarrollado medios y métodos que se dirigen a las células madre cancerosas y cierran importantes rutas de crecimiento y diferenciación en estas células. La focalización se logra mediante el uso de proteínas que tienen un brazo de unión específico para un diana de células madre y otro brazo de unión que bloquea específicamente una ruta del receptor del factor de crecimiento.

Diversos estudios tuvieron como objetivo desarrollar métodos o anticuerpos para dirigirse a la ruta de señalización de Wnt. Por ejemplo, el documento de patente WO 2014/159580 describe un anticuerpo biespecífico dirigido a Met humano de un brazo y a FZD8 de la otra parte.

El documento WO 2013/149159 menciona anticuerpos e inmunoconjugados anti-LGR5 que, según se informa, se dirigen a LGR5 para diagnóstico y tratamiento.

Morita et al. informó en 2004 de la generación de anticuerpos monoclonales contra la secuencia 22-141 de LGR5 (la letalidad neonatal de ratones nulos LGR5 se asocia con anquiloglosia y distensión gastrointestinal. Mol Cell Biol. 2004 Nov; 24(22): 9736-43.) Además, Peng et al. informó en su disertación de 2014 que R-espondina 1-4 se une a la parte N-terminal de LGR5 (una tríada molecular que gobierna la activación de células madre adultas: Crystallographic studies of LGR5, R-spondin 1 and E3 ligase ZNRF3).

Sumario de la invención

La presente invención corresponde al objeto según se define en las reivindicaciones. En particular, la presente invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un dominio variable que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT, en la que el anticuerpo biespecífico comprende dominios variables que se unen a EGFR y LGR5.

En un aspecto, la divulgación proporciona una proteína que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT. La proteína es preferiblemente un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y o análogo del mismo.

La divulgación también proporciona un anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización WNT.

También se describe un método para el tratamiento de un individuo que tiene un cáncer, comprendiendo el método administrar una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención al individuo que lo necesita.

La invención proporciona además una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención, para su uso en el tratamiento de un individuo que tiene cáncer.

En una realización, el cáncer es un cáncer que responde al ligando del receptor de EGF que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

Se proporciona además un sistema celular que comprende una proteína de la divulgación o un anticuerpo biespecífico de la divulgación y una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta w Nt . La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor de EGF que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

Se proporciona además un sistema celular que comprende el anticuerpo biespecífico de la divulgación y una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT, en donde el miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es EGFR y en donde el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es LGR5.

También se describe un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT en un sistema que permite el crecimiento de la célula, el método que proporciona al sistema una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la divulgación. La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor de EGF que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

También se describe el uso del anticuerpo biespecífico de la divulgación para su uso en un método in vitro para inhibir la proliferación de una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT en un sistema permisivo para la proliferación de la célula, el método comprende proporcionar al sistema el anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo, en donde el miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es EGFR y en donde el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es LGR5.

La invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39, de los cuales residuos de aminoácidos D43; G44, M46, F67, G90 y F91 están implicados en la unión del anticuerpo al epítopo.

El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo en donde una o más de las sustituciones de residuos de aminoácidos de D43A; G44A, M46A, F67A, G90Ay F91A reducen la unión del anticuerpo de LGR5.

La invención proporciona además un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la figura 39, y en donde la unión del anticuerpo a LGR5 reducida por una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, f67A, G90Ay F91A.

El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo en donde la interacción del anticuerpo con LGR5 en una célula que expresa lGR5 no inhibe la unión de R-espondina 1 (RSPO 1) a LGR5 en más del 20%. La inhibición de la unión del anticuerpo a LGR5 se mide preferiblemente cuando el anticuerpo y la RSPO están presentes en una relación molar de 0.1 o menos; preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.001, (inclusive), preferiblemente de 0.1 a 0.01 (inclusive).

La invención proporciona además un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en LGR5 que se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de SEQ ID NO: 1 representado en la Figura 39, y en donde la interacción del anticuerpo con LGR5 en una célula que expresa LGR5 no inhibe la unión de una RSPO a LGR5 en más del 20% cuando el anticuerpo y la RSPO están presentes en una proporción molar de 0.1 o menos; preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.001, (inclusive), preferiblemente de 0.1 a 0.01 (inclusive).

El epítopo es preferiblemente un epítopo conformacional. El epítopo se localiza preferiblemente dentro de los residuos de aminoácidos 40-95 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39. La unión del anticuerpo a LGR5 se reduce preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, F67A, G90A y F91A. Preferiblemente, el anticuerpo comprende además un dominio variable adicional que puede unirse a otra proteína. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular. La proteína adicional es preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o cMET.

En la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

El anticuerpo biespecífico comprende preferiblemente un dominio variable que puede unirse a dicho epítopo en una parte extracelular de LGR5 y un dominio variable que puede unirse a otra proteína. Como se menciona en el presente documento, la proteína adicional es preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores EGFR o cMET. El dominio variable que se une a esta proteína adicional se une preferiblemente a una parte extracelular de dicha proteína adicional.

La invención proporciona además un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 y un dominio variable que puede unirse a otra proteína, en donde el epítopo LGR5 se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39 de la cual los residuos de aminoácidos D43; G44, M46, F67, G90 y F91 están implicados en la unión del anticuerpo. La unión del dominio variable a LGR5 se reduce preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, f67A, G90A y F91A. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular. La proteína adicional es preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores de EGF o cMET.

La unión del anticuerpo (bi)específico al miembro asociado a la membrana de la familia de receptores EGF o cMET reduce preferiblemente la señalización inducida por ligando en una célula que comprende dicho miembro asociado a la membrana de la familia del receptor EGF o cMET.

La invención proporciona además un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39 y en la que la unión de la proteína a LGR5 se reduce con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, F67A, G90Ay F91A.

Sin limitación a ninguna teoría, se cree que M46, F67, G90 y F91 de LGR5 como se muestra en la figura 39, son residuos de contacto para el dominio variable, es decir, el sitio de unión al antígeno del dominio variable que puede unirse al epítopo LGR. Que la sustitución de residuos de aminoácidos D43A y G44A reduzca la unión del anticuerpo puede deberse al hecho de que estos son residuos de contacto, sin embargo, también es posible que la sustitución de estos residuos de aminoácidos induzca una modificación (leve) de la conformación de la parte de LGR que tiene uno o más de los otros residuos de contacto (es decir, en las posiciones 46, 67, 90 o 91) y ese cambio de conformación es tal que se reduce la unión del anticuerpo. El epítopo se caracteriza por las sustituciones de aminoácidos mencionadas. Si un anticuerpo se une al mismo epítopo se puede determinar de diversas formas. En los ejemplos se describe un método preferido. El método utiliza células CHO. Las células CHO expresan LGR5 en la membrana celular, o en el mutante de sustitución de alanina, preferiblemente un mutante que comprende una o más de las sustituciones M46A, F67A, G90A o F91A. El anticuerpo de prueba se pone en contacto con las células CHO y se compara la unión del anticuerpo a las células. Un anticuerpo de prueba se une al epítopo si se une a LGR5 y, en menor grado, a LGR5 con una sustitución M46A, F67A, G90A o F91A. Se prefiere comparar la unión con un panel de mutantes que comprenden cada uno una sustitución de residuo de alanina. Dichos estudios de unión son bien conocidos en la técnica. A menudo, el panel comprende mutantes de sustitución de alanina individuales que cubren esencialmente todos los residuos de aminoácidos. Para LGR5, el panel solo necesita cubrir la parte extracelular de la proteína. La expresión de un mutante particular puede verse comprometida, pero esto se detecta fácilmente por uno o más anticuerpos LGR5 que se unen a diferentes regiones. Si la expresión también se reduce para estos anticuerpos de control, el nivel o plegamiento de la proteína en la membrana está comprometido para este mutante en particular. Las características de unión del anticuerpo de prueba al panel identifican fácilmente si los anticuerpos de prueba exhiben una unión reducida a mutantes con una sustitución M46A, F67A, G90Ao F91Ay, por tanto, si el anticuerpo de prueba es un anticuerpo de la invención. La unión reducida a mutantes con una sustitución M46A, F67A, G90A o F91Atambién identifica el epítopo que se ubicará dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39, lo mismo se aplica a la ubicación dentro de los residuos de aminoácidos. 40-95 de SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39. En una realización preferida, el panel incluye un mutante de sustitución D43A; un mutante de sustitución G44A de ambos. El anticuerpo con la secuencia VH del VH de MF5816 presenta una unión reducida a estos mutantes de sustitución.

En una realización preferida, la interacción de RSPO 1 con LGR5 en una célula que expresa LGR5 no inhibe la unión del anticuerpo a lGR5 en más del 20%. La inhibición de la unión del anticuerpo a LGR5 se mide preferiblemente en condiciones en las que el anticuerpo y la RSPO 1 están presentes en una relación molar de 0.1 o menos; preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.001, (inclusive), preferiblemente de 0.1 a 0.01 (inclusive).

La inhibición de la unión se mide preferiblemente cuando el anticuerpo y la RSPO 1 están presentes en una relación molar de 0.1 o menos, preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 y 0.01 (inclusive). Se encontró que las relaciones molares de anticuerpo a RSPO de menos de 0.001 pueden reducir a veces la unión del anticuerpo a LGR5.

Cuando en el presente documento se mencionan las relaciones molares de anticuerpo a RSPO, se prefiere que el anticuerpo esté presente en cantidades que den como resultado 40%-80% de la unión lograda cuando están presentes cantidades saturantes del anticuerpo.

La invención proporciona además un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular del EGFR humano del cual los residuos de aminoácidos 1462; G465; K489; 1491; N493; y C499 están implicados en la unión del anticuerpo al epítopo. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo caracterizado porque la unión del anticuerpo a EGFR se reduce con un EGFR en donde una o más de las sustituciones de residuos de aminoácidos seleccionadas de I462A; G465A; K489A; I491A; N493A; y C499A.

La invención proporciona además un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular del EGFR humano cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 420­ 480 de la SEQ ID NO: 2 representada en la figura 40, y en la que la unión del anticuerpo a EGFR se reduce mediante una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos I462A; G465A; K489A; I491A; N493A; y C499A. La unión del anticuerpo a EGFR humano interfiere con la unión del EGF al receptor. El epítopo del EGFR es un epítopo conformacional.

El epítopo está localizado dentro de los residuos de aminoácidos 420-480 de la SEQ ID NO: 2 representada en la Figura 40, preferiblemente dentro de 430-480 de la SEQ ID NO: 2 representada en la Figura 40; preferiblemente dentro de 438-469 de SEQ ID NO: 2 representada en la figura 40.

El anticuerpo comprende preferiblemente un dominio variable adicional, cuyo dominio variable adicional puede unirse a una proteína adicional. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular. La proteína adicional es preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

El dominio variable que se une a EGFR humano es preferiblemente un dominio variable con una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 del VH de MF3755 como se muestra en la Figura 1 o una secuencia CDR3 que difiere como máximo en tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 del VH de MF3755 como se muestra en la Figura 1.

El dominio variable que se une a EGFR humano es preferiblemente un dominio variable con una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 del VH de MF3755 como se muestra en la Figura 1; o las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 del VH de MF3755 como se representa en la Figura 1 con como máximo tres, preferiblemente como máximo dos, preferiblemente como máximo unas sustituciones de aminoácidos.

El dominio variable que se une a EGFR humano es preferiblemente un dominio variable con una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de la cadena VH de MF3755 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH de MF3755 representada en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a la cadena VH de MF3755.

La proteína adicional es preferiblemente LGR4; LGR5; LGR6; RNF43 o ZNRF3, preferiblemente LGR5.

La divulgación proporciona además un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de EGFR y un dominio variable que puede unirse a otra proteína, en donde el epítopo de EGFR se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 420-480 de SEQ ID NO: 2 representada en la Figura 40, cuyos residuos de aminoácidos 1462; G465; K489; 1491; N493; y C499 están implicados en la unión del anticuerpo al epítopo. La unión del dominio variable a EGFR se reduce preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos I462A; G465A; K489A; I491A; N493A; y C499A. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular, preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT, preferiblemente LGR5.

Sin limitación a ninguna teoría, se cree que los residuos de contacto del epítopo, es decir, en donde el dominio variable contacta con el EGFR humano, probablemente sean 1462; K489; 1491; y N493. Es probable que los residuos de aminoácidos G465 y C499 estén implicados indirectamente en la unión del anticuerpo a EGFR, probablemente porque la mutación por sustitución en una alanina induce una alteración conformacional (leve) del epítopo que da como resultado una unión reducida al epítopo.

Se ha demostrado que los anticuerpos que comprenden uno o más dominios variables que se unen a EGFR con el epítopo mencionado tienen una mejor eficacia cuando se usan para inhibir el crecimiento de una célula o cáncer que responde al ligando de EGFR. En el contexto de los anticuerpos biespecíficos, un brazo del anticuerpo que comprende un dominio variable de unión a EGFR con el epítopo mencionado se combina mejor con una variedad de otros brazos que comprenden dominios variables que se unen a partes extracelulares de otras proteínas de la superficie celular.

Descripción detallada de la invención

La invención describe una proteína que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT. Dicha proteína también se denomina además "una proteína de la invención".

En una realización preferida, la proteína de la invención es un anticuerpo (o parte de anticuerpo, derivado o análogo, como se describe en otra parte de la solicitud), un mimético de anticuerpo, un polipéptido, un aptámero o una combinación de los mismos. Estas proteínas o aptámeros se unen típicamente a una diana. La proteína de la invención se une a dos dianas. Debe entenderse que cualquier combinación de estos anticuerpos, miméticos de anticuerpos, polipéptidos y aptámeros puede unirse mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de la invención es un conjugado o una proteína de fusión. Para los anticuerpos, la tecnología de fabricación de anticuerpos multiespecíficos ha progresado para incluirtambién anticuerpos biespecíficos que tienen la misma estructura general que un anticuerpo monoespecífico normal, pero en los que los dos brazos del anticuerpo se unen cada uno a una diana diferente.

Un mimético de anticuerpo es un polipéptido que, como los anticuerpos, puede unirse específicamente a un antígeno, pero que no está relacionado estructuralmente con los anticuerpos. Los miméticos de anticuerpos suelen ser péptidos o proteínas artificiales con una masa molar de aproximadamente 3 a 20 kDa. Las ventajas comunes sobre los anticuerpos son una mejor solubilidad, penetración tisular, estabilidad frente al calor y las enzimas, y costos de producción comparativamente bajos. Los ejemplos no limitantes de miméticos de anticuerpos son moléculas aficuerpo (típicamente basadas en el dominio Z de la proteína A); afiliados (típicamente basados en Gamma-B cristalino o ubiquitina); afímeros (típicamente basados en Cystatin); afitinas (típicamente basadas en Sac7d de Sulfolobus acidocaldarius); cuerpos alfa (típicamente basados en una bobina en espiral de triple hélice); anticalinas (típicamente basadas en lipocalinas); avímeros (típicamente basados en dominios A de varios receptores de membrana); DARPins (típicamente basado en motivo de repetición de anquirina); finómeros (típicamente basados en el dominio SH3 de Fyn 7); péptidos de dominio de Kunitz (típicamente basados en dominios de Kunitz de varios inhibidores de proteasa); y monocuerpos (típicamente basados en el dominio de tipo III de fibronectina).

Los monocuerpos son proteínas de unión sintéticas que se construyen utilizando un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) como andamio molecular. Los monocuerpos son una alternativa simple y robusta a los anticuerpos para crear proteínas de unión a la diana. El término "monocuerpo" fue acuñado en 1998 por el grupo Koide que publicó el primer artículo que demuestra el concepto de monocuerpo utilizando el décimo dominio FN3 de la fibronectina humana.

Los monocuerpos y otros miméticos de anticuerpos se generan típicamente a partir de bibliotecas combinatorias en las que porciones del armazón se diversifican utilizando tecnologías de presentación molecular y evolución dirigida tales como presentación de fagos, presentación de ARNm y presentación de superficie de levadura. Un gran número de miméticos de anticuerpos tienen alta afinidad y alta especificidad para sus respectivas dianas.

Los aptámeros son moléculas de oligonucleótidos o péptidos que se unen a una molécula diana específica. Los aptámeros generalmente se crean seleccionándolos de un gran grupo de secuencia aleatoria, pero los aptámeros naturales también existen en los ribointercambiadores. Los aptámeros se pueden utilizar tanto para la investigación básica como para fines clínicos como macromoléculas.

Como se usa en este documento, el término "conjugado" se refiere a dos o más moléculas que se han unido covalentemente, opcionalmente mediante una región de enlace. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un conjugado es una primera porción proteica o no proteica unida a una segunda porción proteica o no proteica mediante una región de unión. Por ejemplo, en algunas realizaciones de una proteína de la invención, comprende o consta de dos o más anticuerpos que se han unido covalentemente. Un conjugado no se limita a un primera y segunda unidad estructural, pero en algunas realizaciones también puede tener una tercera, cuarta o más unidades estructurales unidos por regiones de enlace adicionales. Como se describe en otra parte de esta solicitud, ejemplos de unidades estructurales de proteína incluyen, pero no se limitan a: un polipéptido, un peptidomimético o un anticuerpo (o parte de anticuerpo, derivado o análogo, como se describe en otra parte de la solicitud). Ejemplos de unidades estructurales no proteicas incluyen, pero no se limitan a, aptámeros. Se pueden usar numerosos tipos de enlazador, y el enlazador se selecciona para que sea apropiado según los tipos de moléculas en el conjugado y las propiedades deseadas del enlazador (longitud, flexibilidad, resistencia a la actividad proteasa y otras características similares). Dichos enlazadores pueden comprender nucleótidos, polipéptidos o un material sintético adecuado. Por ejemplo, un enlazador puede ser un enlazador de péptido flexible. En determinadas realizaciones, el enlazador puede ser un enlazador escindible, permitiendo que las partes del conjugado se separen entre sí. En otras realizaciones, un enlazador peptídico podría ser un enlazador helicoidal. Se conocen bien en la técnica diversos ejemplos y kits para unir proteínas y otras moléculas. Como se usa en el presente documento, el término "proteína de fusión" se refiere a una proteína que comprende dos o más polipéptidos o proteínas que se han unido al nivel del ADN mediante recombinación y se expresan juntas como un único polipéptido. Una proteína de fusión también puede comprender una región de unión de péptidos también codificada por el ADN y expresada junto con la proteína de fusión. Un enlazador peptídico que forma parte de una proteína de fusión, puede diseñarse para tener características particulares tales como flexibilidad, hidrofilicidad, resistencia a proteasas, escisión, etc. Todas estas propiedades pueden diseñarse dentro de la secuencia de ADN y los métodos para diseñar enlazadores son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden unir mediante métodos bien conocidos en la técnica, y como se describe en el presente documento, para formar anticuerpos biespecíficos o multidireccionales. Además, los anticuerpos biespecíficos se pueden construir mediante diversos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando tecnología como BiClonics®. Un anticuerpo monoclonal biespecífico (BsMAb, BsAb) típicamente comprende dominios de unión de dos anticuerpos monoclonales diferentes y, en consecuencia, se une a dos epítopos diferentes. Las moléculas Biclonics®, pero también otros anticuerpos biespecíficos IgG de longitud completa, tienen dos especificidades de unión a antígenos diferentes codificadas por dos regiones variables diferentes de una molécula de IgG de longitud completa de un Fab de un scFv. Biclonics® se puede producir mediante cotransfección de células individuales con constructos genéticos que codifican dos anticuerpos de cadena liviana común (cLC) diferentes como se detalla en otra parte de este documento. La ingeniería genética de CH3 asegura una heterodimerización eficiente y la formación de anticuerpos biespecíficos esencialmente puros. En algunas realizaciones, una proteína de la invención suprime la señalización en una célula, grupo de células, tejido o tumor en una cantidad que es útil para el propósito pretendido de la proteína de la invención, por ejemplo, puede reducir la inducción de una o más de estas respuestas en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, preferiblemente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, más preferiblemente 70%, 80%, 85%, y más preferiblemente 90%, 95%, 99% o 100% en comparación con la señalización inducida por una sustancia neutra o control negativo según se mide en un ensayo conocido en la técnica.

Una proteína de la invención comprende preferiblemente un anticuerpo o una parte, derivado o análogo del mismo. Una proteína de la invención es preferiblemente un anticuerpo biespecífico.

Los anticuerpos se unen típicamente a su diana a través del llamado sitio de unión al antígeno. Un sitio de unión a antígeno no modificado está formado típicamente por el dominio variable del anticuerpo y está presente en él. El dominio variable contiene dicho sitio de unión al antígeno. Un dominio variable que se une a un antígeno es un dominio variable que comprende un sitio de unión al antígeno que se une al antígeno.

En una realización, un dominio variable de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena liviana (VL). El sitio de unión al antígeno puede estar presente en el dominio variable combinado VH/VL, o solo en la región VH o solo en la región VL. Cuando el sitio de unión al antígeno está presente en solo una de las dos regiones del dominio variable, la región variable contraparte puede contribuir al plegamiento y/o estabilidad de la región variable de unión, pero no contribuye significativamente a la unión del propio antígeno.

Como se usa en este documento, unión a antígeno se refiere a la capacidad de unión típica de un anticuerpo a su antígeno. La unión de un anticuerpo a un antígeno se puede evaluar de diversas formas. Una forma es incubar el anticuerpo con el antígeno (preferiblemente células que expresan el antígeno), eliminando el anticuerpo no unido (preferiblemente mediante un paso de lavado) y detectando el anticuerpo unido por medio de un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo unido.

La unión de antígeno por un anticuerpo típicamente está mediada a través de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo y la estructura tridimensional específica tanto del antígeno como del dominio variable que permite que estas dos estructuras se unan con precisión (una interacción similar a una cerradura y llave), en contraposición a la adhesión aleatoria e inespecífica de proteínas. Como un anticuerpo normalmente reconoce parte de un antígeno llamado epítopo de un antígeno, y como tal epítopo puede estar presente también en otros compuestos, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención también pueden reconocer otras proteínas, si dichos otros compuestos contienen el mismo epítopo. Por tanto, el término "unión" no excluye la unión de los anticuerpos a otra proteína o proteína(s) que contienen el mismo epítopo. Preferiblemente, dichas otras proteínas no son proteínas humanas.

Una proteína de la invención tal como un anticuerpo típicamente no se une a otras proteínas que la proteína diana especificada en la membrana de las células en un ser humano postnatal, preferiblemente adulto.

Un anticuerpo de la invención que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) se une al miembro especificado y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces más bajo a la parte extracelular de otro miembro de la familia de receptores EGF de la misma especie. Por ejemplo, un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-1, se une a ErbB-1 y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces menor a los receptores homólogos ErbB-2 (HER2), ErbB-3 (HER3) y ErbB-4 (HER4) de la misma especie.

Un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-2, se une a ErbB-2 y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces menor a los receptores homólogos ErbB-1, ErbB-3 y ErbB-4 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3, se une a ErbB-3 y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces menor a los receptores homólogos ErbB-1, ErbB-2 y ErbB-4 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-4, se une a ErbB-4 y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces más bajo a los receptores homólogos ErbB-1, ErbB-2 y ErbB-3 de la misma especie. Por supuesto, cuando se diseña un anticuerpo para unirse a dos o más miembros de la familia, la unión a los dos o más miembros puede ser esencialmente la misma. En la presente invención se prefiere que los respectivos anticuerpos se unan cada uno a un solo miembro de una familia. Teniendo en cuenta que la familia ErbB es una familia de receptores de superficie celular, la unión se evalúa típicamente en células que expresan el receptor o receptores en su superficie celular.

Un anticuerpo de la invención interfiere preferiblemente con la unión de un ligando para el miembro de la familia de receptores de EGF. El término "interfiere con la unión", como se usa en este documento, significa que la unión del anticuerpo al miembro de la familia de receptores de EGF compite con el ligando por la unión al miembro de la familia de receptores de EGF. El anticuerpo puede disminuir la unión del ligando, desplazar el ligando cuando este ya está unido al miembro de la familia de receptores de EGF o puede, por ejemplo, mediante un impedimento estérico, evitar al menos parcialmente que el ligando pueda unirse al miembro de la familia de receptores de EGF.

Una proteína de unión a EGFR (ErbB1) o HER3 (ErbB3) de la invención, preferiblemente un anticuerpo de la invención, inhibe de preferencia respectivamente la señalización inducida por ligando EGFR o ligando HER3, medida como crecimiento inducido por ligando de células BxPC3 (ATCC CRL-1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058) o muerte celular inducida por ligando de células A431 (ATCC CRL-1555). La proteína de unión EGFR o HER3 mencionada puede reducir la señalización inducida por ligando en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, preferiblemente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, más preferiblemente 70%, 80%, 85% y lo más preferiblemente 90%, 95%, 99% o 100% en comparación con el efecto inducido por ligando en presencia de una sustancia neutra o control negativo medido en un ensayo conocido en el arte. EGFR y ErbB-3 pueden unirse cada uno a varios ligandos y estimular el crecimiento de las células BxPC3 o células BxPC3-luc2 mencionadas. En presencia de un ligando para uno o ambos receptores, se estimula el crecimiento de células BxPC3 o BxPC3-luc2. El crecimiento de células BxPC3 inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 puede medirse comparando el crecimiento de las células en ausencia y presencia del ligando. El ligando de EGFR preferido para medir el crecimiento inducido por ligando de EGFR de células BxPC3 o BxPC3-luc2 es EGF. El ligando ErbB-3 preferido para medir el crecimiento inducido por ligando ErbB-3 de células BxPC3 o BxPC3-luc2 es NRG1. El crecimiento inducido por ligando se mide preferiblemente usando cantidades saturantes de ligando. En una realización preferida, el EGF se usa en una cantidad de 100 ng/ml de medio de cultivo. NRG1 se usa preferiblemente en 10 ng/ml de medio de cultivo. EGF y NRG1 son preferiblemente EGF y NRG1 de los sistemas de R&D, cat. nr. 396-HB y 236-EG como se describe en los ejemplos. Determinación de si una proteína o anticuerpo de la invención inhibe la señalización en formato bivalente, se prefiere que el método como se describe en el presente documento anteriormente se realice con una versión monovalente o bivalente monoespecífica de la proteína o anticuerpo. En otras palabras, una proteína o anticuerpo que solo tiene sitios de unión para el receptor cuya señalización se va a determinar. Para un anticuerpo, sería un anticuerpo monoespecífico bivalente en donde los dominios variables de unión al antígeno consisten en dominios variables que se unen al miembro de la familia del receptor de EGF.

Una proteína de unión a EGFR o HER3 de la invención, preferiblemente un anticuerpo de la invención preferiblemente inhibe respectivamente el ligando EGFR o el ligando HER3, el crecimiento inducido de células BxPC3 (ATCC CRL-1687) o células BxPC3-luc2 (Perkin Elmer 125058). La proteína de unión EGFR o HER3 mencionada puede reducir la señalización de crecimiento inducida por ligando en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, preferiblemente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, más preferiblemente 70%, 80%, 85% y lo más preferiblemente 90%, 95%, 99% o 100% en comparación con el crecimiento inducido por ligando inducido por una sustancia neutra o control negativo medido en un ensayo conocido en el arte. EGFR y ErbB-3 pueden unirse cada uno a varios ligandos y estimular el crecimiento de las células BxPC3 o células BxPC3-luc2 mencionadas. En presencia de un ligando para uno o ambos receptores, se estimula el crecimiento de células BxPC3 o BxPC3-luc2. El crecimiento de células BxPC3 inducido por ligando de EGFR y/o ErbB-3 puede medirse comparando el crecimiento de las células en ausencia y presencia del ligando. El ligando de EGFR preferido para medir el crecimiento inducido por ligando de EGFR de células BxPC3 o BxPC3-luc2 es EGF. El ligando ErbB-3 preferido para medir el crecimiento inducido por ligando ErbB-3 de células BxPC3 o BxPC3-luc2 es NRG1. El crecimiento inducido por ligando se mide preferiblemente usando cantidades saturantes de ligando. En una realización preferida, el EGF se usa en una cantidad de 100 ng/ml de medio de cultivo. NRG1 se usa preferiblemente en 10 ng/ml de medio de cultivo. EGF y NRG1 son preferiblemente EGF y NRG1 de los sistemas de R&D, cat. nr. 396-HB y 236-EG como se describe en los ejemplos.

Un ligando de la familia de receptores de EGF es preferiblemente un ligando de receptor de EGFR o HER3. "Ligando HER3 o ErbB-3", como se usa en el presente documento, se refiere a polipéptidos que se unen y activan ErbB-3. Ejemplos de ligandos ErbB-3 incluyen, pero no se limitan a, Neurregulina 1 (NRG1) y Neurregulina 2 (NRG2) (para revisión Olayioye MA et al.; EMBO J (2000) Vol 19: págs. 3159-3167). El término incluye preferiblemente fragmentos y/o variantes biológicamente activas de un polipéptido de origen natural. "Ligando EGFr o ErbB-1", como se usa en este documento, se refiere a polipéptidos que se unen y activan EGFR. Ejemplos de ligandos de EGFR incluyen, pero no se limitan a, EGF, TGF-a, HB-EGF, anfirregulina, betacelulina y epirregulina (para revisión Olayioye Ma et al.; EMBO J (2000) Vol 19: págs. 3159-3167). El término incluye preferiblemente fragmentos y/o variantes biológicamente activas de un polipéptido de origen natural.

Un anticuerpo de la invención que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a la parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT se une al miembro especificado y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces más bajo que la parte extracelular de otra proteína asociada a la membrana que no es miembro de una ruta de señalización de WNT de la misma especie, como el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1). Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a LGR5, se une a LGR5 y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces más bajo a una parte extracelular de un receptor de IGF-1 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a LGR4, se une a LGR4 y, en condiciones por lo demás idénticas, al menos 100 veces menor al receptor de IGF-1 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a RNF43, se une a RNF43 y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces menor al receptor de IGF-1, LGR4 o LGR5 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ZNRF3, se une a ZNRF3 y, en condiciones por lo demás idénticas, al menos 100 veces menor al receptor de IGF-1 o RNF43 de la misma especie. Por supuesto, cuando se diseña un anticuerpo para unirse a dos o más miembros de la familia, la unión a los dos o más miembros puede ser esencialmente la misma. Por ejemplo, algunos de los anticuerpos que se unen a LGR5 pueden unirse a LGR4 de la misma especie y viceversa. En una realización preferida, un anticuerpo de la invención que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a la parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT se une al miembro especificado y, en condiciones idénticas por lo demás, al menos 100 veces menor que la parte extracelular de otra membrana asociada de la familia de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a LGR5, se une a LGR5 y, en condiciones por lo demás idénticas, al menos 10 veces y preferiblemente al menos 100 veces más bajo que LGR4 de la misma especie. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a LGR4, se une a LGR4 y, en condiciones por lo demás idénticas, al menos 10 veces y preferiblemente al menos 100 veces más bajo que LGR5 de la misma especie En la presente invención se prefiere que los respectivos anticuerpos se unen cada uno a un solo miembro de una familia. Los miembros preferidos de la ruta de señalización WNT en el contexto de la presente invención son LRP5, LRP6, LGR4, LGR5, LGR6, FRZ1, FRZ2, FRZ3, FRZ4, FRZ5, FRZ6, FRZ7, FRZ8, FRZ9 FRZ10, ZNRF3, RNF43, N-Cadherin, Kremen1 y Kremen2, ROR2/RYK). Teniendo en cuenta que los miembros de esta lista son receptores de superficie celular, la unión se evalúa típicamente en células que expresan el receptor o receptores en su superficie celular.

El término "anticuerpo" como se usa en este documento significa una molécula proteinácea, preferiblemente perteneciente a la clase de proteínas de inmunoglobulina, que contiene uno o más dominios variables que se unen a un epítopo en un antígeno, en donde dichos dominios derivan de o comparten homología de secuencia con el dominio variable de un anticuerpo. Los anticuerpos para uso terapéutico son preferiblemente lo más cercanos posible a los anticuerpos naturales del sujeto por tratar (por ejemplo, anticuerpos humanos para sujetos humanos). La unión del anticuerpo se puede expresar en términos de especificidad y afinidad. La especificidad determina qué antígeno o epítopo del mismo se une específicamente al dominio de unión. La afinidad es una medida de la fuerza de unión a un antígeno o epítopo particular. La unión específica se define como la unión con afinidades (KD) de al menos 1x10e-6 M, más preferiblemente 1x10e-7 M, más preferiblemente con afinidades superiores a 1x10e-9 M. Normalmente, los anticuerpos para aplicaciones terapéuticas tienen afinidades de hasta 1x10e-10 M o más. Los anticuerpos tales como los anticuerpos biespecíficos de la presente invención típicamente comprenden los dominios constantes (parte Fc) de un anticuerpo natural. Un anticuerpo de la invención es típicamente un anticuerpo biespecífico de longitud completa, preferiblemente de la subclase IgG humana. Un anticuerpo de la presente invención es preferiblemente de la subclase IgG1 humana. Dichos anticuerpos de la invención tienen buenas propiedades ADCc que, si se desea, pueden mejorarse mediante técnicas conocidas en la técnica, tienen una vida media favorable tras la administración in vivo a seres humanos y existe tecnología de ingeniería genética de CH3 que puede proporcionar cadenas pesadas modificadas que se forman preferentemente heterodímeros sobre homodímeros tras la coexpresión en células clonales.

Un anticuerpo de la invención es preferiblemente un anticuerpo de "longitud completa". El término "longitud completa" de acuerdo con la invención se define como que comprende un anticuerpo esencialmente completo, que sin embargo no tiene necesariamente todas las funciones de un anticuerpo intacto. Para evitar dudas, un anticuerpo de longitud completa contiene dos cadenas pesadas y dos livianas. Cada cadena contiene regiones constantes (C) y variables (V), que se pueden dividir en dominios designados CH1, CH2, CH3, VH para la cadena pesada y CL, VL para la cadena liviana. Un anticuerpo se une al antígeno a través de los dominios variables contenidos en la porción del fragmento Fab. El anticuerpo puede interactuar con moléculas y células del sistema inmunológico a través de los dominios constantes, principalmente a través de la porción Fc.

Los términos "dominio variable", "par VH/VL", "VH/VL" se utilizan aquí indistintamente. Los anticuerpos de longitud completa de acuerdo con la invención abarcan anticuerpos en los que pueden estar presentes mutaciones que proporcionan las características deseadas o son simplemente alternativas a las de la cadena original. Tales mutaciones no deberían ser eliminaciones de porciones sustanciales de ninguna de las regiones. Sin embargo, los anticuerpos en los que se eliminan uno o varios residuos de aminoácidos, sin alterar esencialmente las características de unión del anticuerpo resultante, se incluyen dentro del término "anticuerpo de longitud completa". Por ejemplo, un anticuerpo IgG puede tener inserciones de residuos de aminoácidos de 1 a 20, eliminaciones o una combinación de los mismos en la región constante. Por ejemplo, la actividad ADCC de un anticuerpo se puede mejorar cuando el propio anticuerpo tiene una baja actividad ADCC, modificando livianamente la región constante del anticuerpo (Junttila, T.T., K. et al. (2010). Cancer Research 70: 4481- 4489). A veces también se realizan cambios para mejorar el almacenamiento o la producción o para eliminar lisinas C-terminales (anticuerpos terapéuticos diseñados con funciones efectoras mejoradas. Kubota T, Niwa R, Satoh M, Akinaga S, Shitara K, Hanai N). Otra forma de mejorar la actividad ADCC de un anticuerpo es interfiriendo enzimáticamente con la ruta de glicosilación que da como resultado una fucosa reducida (von Horsten et al. (2010); Glycobiology 20: 1607-1618). Existen varios métodos in vitro para determinar la eficacia de anticuerpos o células efectoras para provocar ADCC. Entre estos se encuentran los ensayos de liberación de cromo-51 [Cr51], los ensayos de liberación de europio [Eu] y los ensayos de liberación de azufre-35 [S35]. Por lo general, una línea de células diana marcada que expresa un cierto antígeno expuesto en la superficie se incuba con un anticuerpo específico para ese antígeno. Después del lavado, las células efectoras que expresan el receptor CD16 de Fc se incuban conjuntamente con las células diana marcadas con anticuerpo. La lisis de las células diana se mide posteriormente mediante la liberación de la marca intracelular mediante un contador de centelleo o espectrofotometría.

En una realización, un anticuerpo biespecífico de la invención puede estar afucosilado. Un anticuerpo biespecífico de la invención comprende preferiblemente una cantidad reducida de fucosilación de la estructura de carbohidrato unida a N en la región Fc, en comparación con el mismo anticuerpo producido en una célula CHO normal.

Se prefieren los anticuerpos IgG de longitud completa debido a su vida media favorable y la necesidad de permanecer tan cerca de las moléculas completamente autólogas (humanas) por razones de inmunogenicidad. Un anticuerpo de la invención es preferiblemente un anticuerpo IgG biespecífico, preferiblemente un anticuerpo IgG1 biespecífico de longitud completa. La IgG1 se ve favorecida por su larga vida media circulatoria en el hombre. Para prevenir cualquier inmunogenicidad en humanos, se prefiere que el anticuerpo IgG biespecífico de acuerdo con la invención sea una IgG1 humana.

El término "biespecífico" (bs) significa que una parte del anticuerpo (como se definió anteriormente) se une a un epítopo en un antígeno mientras que una segunda parte se une a un epítopo diferente en el mismo antígeno o en un antígeno diferente. Los diferentes epítopos están típicamente presentes en diferentes antígenos. Sin embargo, los diferentes epítopos también pueden estar presentes en el mismo antígeno. Según la presente invención, dichos primer y segundo antígenos son de hecho dos proteínas diferentes. Un anticuerpo biespecífico preferido es un anticuerpo que comprende partes de dos anticuerpos monoclonales diferentes y, en consecuencia, puede unirse a dos tipos diferentes de antígeno. Dependiendo del nivel de expresión, localización (sub)celular y estequiometría de los dos antígenos reconocidos por un anticuerpo biespecífico, ambos brazos Fab del anticuerpo pueden o no unirse simultáneamente a su epítopo. Un brazo del anticuerpo biespecífico normalmente contiene el dominio variable de un anticuerpo y el otro brazo contiene el dominio variable de otro anticuerpo (es decir, un brazo del anticuerpo biespecífico está formado por una cadena pesada emparejada con una cadena liviana mientras que el otro brazo está formado por una cadena pesada diferente emparejada con una cadena liviana). Las regiones variables de cadena pesada del anticuerpo biespecífico de la invención son típicamente diferentes entre sí, mientras que las regiones variables de cadena liviana son preferiblemente las mismas en los anticuerpos biespecíficos de la invención. Un anticuerpo biespecífico en donde las diferentes regiones variables de la cadena pesada están asociadas con la misma cadena liviana o común, también se denomina anticuerpo biespecífico con una cadena liviana común (cLC). Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en donde ambos brazos comprenden una cadena liviana común.

Los anticuerpos biespecíficos preferidos se pueden obtener mediante la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes y una cadena liviana común en una sola célula. Cuando se utilizan dominios CH3 de tipo salvaje, la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes (A y B) y una cadena liviana común dará como resultado tres especies de anticuerpos diferentes, AA, AB y BB. AA y b B son designaciones para los dos anticuerpos bivalentes monoespecíficos, y AB es una designación para el anticuerpo biespecífico. Para aumentar el porcentaje del producto biespecífico deseado (AB) se puede emplear ingeniería genética de CH3, o en otras palabras, se pueden usar cadenas pesadas con dominios de heterodimerización compatibles, como se define a continuación.

El término "dominios de heterodimerización compatibles", como se usa en el presente documento, se refiere a dominios de proteínas que se diseñan de tal manera que el dominio A de ingeniería genética formará preferentemente heterodímeros con el dominio de ingeniería genética B' y viceversa, mientras que la homodimerización entre A'-A' y B'-B' está disminuido.

Los anticuerpos biespecíficos como se describen en el presente documento preferiblemente comprenden una cadena liviana común. El término "cadena liviana común" de acuerdo con la invención se refiere a cadenas livianas que pueden ser idénticas o tener algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos, mientras que la especificidad de unión del anticuerpo de longitud completa no se ve afectada. Por ejemplo, es posible dentro del alcance de la definición de cadenas livianas comunes como se usa en este documento, preparar o encontrar cadenas livianas que no sean idénticas, pero aún funcionalmente equivalentes, por ejemplo, introduciendo y probando cambios conservadores de aminoácidos, cambios de aminoácidos en regiones que no contribuyen o contribuyen sólo parcialmente a la especificidad de unión cuando se emparejan con la cadena pesada, y similares. Los términos "cadena liviana común", "VL común", "cadena liviana simple", "VL simple", con o sin la adición del término "reordenada", se usan todos de manera intercambiable en este documento. Es un aspecto de la presente invención utilizar como cadena liviana común una cadena liviana humana que puede combinarse con diferentes cadenas pesadas para formar anticuerpos con dominios de unión a antígenos funcionales (WO2004/009618, WO2009/157771, Merchant et al.1998 y Nissim et al. al.1994). Preferiblemente, la cadena liviana común tiene una secuencia de línea germinal. Una secuencia de línea germinal preferida es una región variable de cadena liviana que se usa frecuentemente en el repertorio humano y tiene buena estabilidad termodinámica, rendimiento y solubilidad. Una cadena liviana de línea germinal preferida es 012, preferiblemente la cadena liviana kappa humana de línea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01 (Figura 3) o un fragmento o un equivalente funcional (es decir, el mismo segmento del gen IgVKl-39 pero diferente segmento del gen IGJk) del mismo (nomenclatura según la base de datos IMGT en la web mundial en imgt.org). Sin embargo, el mismo principio también funciona con una cadena liviana lambda y, por lo tanto, esto también se proporciona en el contexto de la invención. Por lo tanto, se proporciona además un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención, en donde dicha cadena liviana común es una cadena liviana de la línea germinal, preferiblemente una cadena liviana kappa humana de la línea germinal reordenada que comprende el segmento del gen IgVKl-39, más preferiblemente la cadena liviana kappa humana de la línea germinal reordenada IgVKl-39*01/IGJKl*01 (Figura 3). Los términos IgVKl-39*01/IGJk1*01 de cadena liviana kappa humana de línea germinal reordenada, IGKV1-39/IGkJ1, cadena liviana huVKl-39 o, en resumen, huVKl-39, o simplemente 1-39, se utilizan indistintamente en toda la solicitud. Obviamente, los expertos en la técnica reconocerán que "común" también se refiere a equivalentes funcionales de la cadena liviana cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica. Existen muchas variantes de dicha cadena liviana en las que están presentes mutaciones (eliminaciones, sustituciones, adiciones) que no influyen materialmente en la formación de regiones de unión funcionales. La cadena liviana de la presente invención también puede ser una cadena liviana como se especifica aquí anteriormente, que tiene 1-20, preferiblemente 1-5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos.

También se contemplan anticuerpos en los que un VH es capaz de reconocer específicamente un primer antígeno y el VL, emparejado con el VH en un dominio variable de inmunoglobulina, es capaz de reconocer específicamente un segundo antígeno. El par VH/VL resultante se unirá al antígeno 1 o al antígeno 2. Los denominados "anticuerpos dos en uno", descritos, por ejemplo, en los documentos WO2008/027236, WO2010/108127 y Schaefer et al (2011 Cancer Cell 20, 472-486), son diferentes de los anticuerpos biespecíficos de la invención y se denominan además anticuerpos "dos en uno".

Una parte de un anticuerpo es una parte que se une al antígeno y normalmente contiene los dominios variables del anticuerpo. Una parte también puede ser un denominado fragmento de anticuerpo de dominio único. Un fragmento de anticuerpo de dominio único (sdAb, llamado Nanobody por Ablynx, el desarrollador) es un fragmento de anticuerpo con un dominio de anticuerpo variable monomérico único. Como un anticuerpo completo, puede unirse selectivamente a un antígeno específico. Con un peso molecular de solo 12-15 kDa, los fragmentos de anticuerpos de dominio único son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa) que están compuestos por dos cadenas de proteínas pesadas y dos cadenas livianas, e incluso más pequeños que los fragmentos Fab (~50 kDa, una cadena liviana y media cadena pesada) y fragmentos variables de cadena sencilla (~25 kDa, dos dominios variables, uno de una cadena liviana y otro de una cadena pesada). Los anticuerpos de dominio único por sí mismos no son mucho más pequeños que los anticuerpos normales (siendo típicamente 90-100 kDa). Los fragmentos de anticuerpos de un solo dominio se diseñan principalmente a partir de anticuerpos de cadena pesada que se encuentran en los camélidos; estos se denominan fragmentos VHH (Nanobodies®). Algunos peces también tienen anticuerpos de cadena pesada (IgNAR, 'receptor de nuevo antígeno de inmunoglobulina'), a partir de los cuales se pueden obtener fragmentos de anticuerpos de dominio único llamados fragmentos VNAR. Un enfoque alternativo es dividir los dominios variables diméricos de la inmunoglobulina G común (IgG) de humanos o ratones en monómeros. Aunque la mayoría de las investigaciones sobre anticuerpos de dominio único se basan actualmente en dominios variables de cadena pesada, también se ha demostrado que los nanocuerpos derivados de cadenas livianas se unen específicamente a epítopos diana. Un ejemplo no limitante de una parte de anticuerpo contiene un dominio variable de una cadena pesada y/o una cadena liviana de un anticuerpo o un equivalente del mismo. Los ejemplos no limitantes de tales partes son VHH, Anticuerpos de dominio humano (dAbs) y Unicuerpos. Las partes o derivados de anticuerpos preferidos tienen al menos un dominio variable de una cadena pesada y una cadena liviana de un anticuerpo o equivalentes del mismo. Los ejemplos no limitantes de tales moléculas de unión son los fragmentos F(ab) y los fragmentos Fv de cadena sencilla. Una parte funcional de un anticuerpo biespecífico comprende las partes de unión al antígeno del anticuerpo biespecífico, o un derivado y/o análogo de las partes de unión. Como se mencionó anteriormente en el presente documento, la parte de unión de un anticuerpo está incluida en el dominio variable.

Un derivado de un anticuerpo es una proteína que, excepto para las regiones CDR, se desvía de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo natural en como máximo 20 aminoácidos. Un derivado de un anticuerpo como se describe en el presente documento es un anticuerpo que se desvía de dicha secuencia de aminoácidos en como máximo 20 aminoácidos.

El miembro preferido asociado a la membrana de la ruta WNT a la que se une una proteína de la invención es LRP5, LRP6, LGR4, LGR5, LGR6, FRZ1, FRZ2, FRZ3, FRZ4, FRZ5, FRZ6, FRZ7, FRZ8, FRZ9, FRZ10, ZNRF3, RNF43, N-Cadherin, Kremen1 y Kremen2, ROR2, RYK. De esta lista se prefieren los miembros asociados a la membrana de la familia LGR que están activos en la ruta WNT, en particular LGR4, LGR5 y LGR6. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la familia LGR es LGR4 o LGR 5, en particular LGR5. Otros miembros asociados a la membrana preferidos de la ruta canónica WNT son ZNRF3 y RNF43.

Se ha demostrado que Lgr4, Lgr5 y Lgr6 de ratón son receptores de alta afinidad para las R-espondinas (R-espondina 1-4) que conducen a un aumento de la fosforilación de los receptores Wnt Lrp5/6 y la estabilización de la b-catenina sin la participación de proteína G de señalización (Carmon, K.S., et al. (2011). Proc Natl Acad Sci USA 108, 11452­ 11457; de Lau, W., et al. (2011) Nature 476, 293-297). Las R-espondinas son miembros de una familia mucho mayor de proteínas caracterizadas por la presencia de repeticiones de tromboespondina (TSR). Las R-espondinas también contienen repeticiones de furina N-terminales ricas en cisteína que se requieren para ejercer la actividad potenciadora de Wnt medida por la estabilización de b-catenina y la fosforilación del correceptor Wnt/Frizzled Lrp6 (Kim et al. (2005)). Se han informado fusiones de genes que aumentan los niveles de expresión de R-espondinas funcionales en un subconjunto de cánceres de colon humanos (Seshagiri, S., et al. (2012). Nature 488, 660-664.). Si bien el papel percibido del complejo Lgr-R-espondina es modular la señalización a través del complejo receptor Lrp-Frizzed-wnt, los modelos actuales sugieren que el complejo Lgr-R-espondina está sujeto a modulación a través de las ligasas E3 altamente homólogas Rnf43 y Znrf3. Específicamente, los receptores Lgr4, Lgr5 y Lgr6 sirven para reclutar de manera eficiente ligandos R-espondina y colocarlos en posición para la interacción con Rnf43/Znrf3, que también contienen sitios de unión a R-espondina (de Lau, W., et al (2014). Genes Dev 28, 305-316). Esta interacción conduce a la eliminación de la membrana del Rnf43 o Znrf3, lo que da como resultado la persistencia de los receptores Frizzled de superficie y el aumento de la fuerza de la señalización wnt (de Lau, et al (2014). Genes Dev 28, 305-316) y enriquecido en cáncer de colon (Hao, H.-X., et al. (2012) Nature 485, 195-200).

Un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT que está activo en la ruta canónica, también puede estar activo, dependiendo del miembro particular, en la ruta no canónica y viceversa.

La familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) (HER) tiene cuatro miembros: ErbB (eritroblastoma)-1, ErbB-2, ErbB-3 y ErbB-4. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGFR, ErbB1 o HER1) es miembro de una familia de cuatro receptores detirosina quinasas (RTK), denominados Her- o cErbB-1, -2, -3 y -4. ErbB-1 también se conoce bajo varios sinónimos, el más común de los cuales es EGFR. El EGFR tiene un dominio extracelular (ECD) que se compone de cuatro subdominios, dos de los cuales están involucrados en la unión del ligando y dos de los cuales están involucrados en la homodimerización y heterodimerización. EGFR integra señales extracelulares de una variedad de ligandos para producir diversas respuestas intracelulares. La principal ruta de transducción de señales activada por EGFR está compuesta por la cascada de señalización mitogénica de la proteína quinasa activada por mitógeno Ras (MAPK). La activación de esta ruta se inicia mediante el reclutamiento de Grb2 en EGFR fosforilado en tirosina. Esto conduce a la activación de Ras a través del factor de intercambio de nucleótidos de guanina Ras unido a Son of Sevenless (SOS) Grb2. Además, la ruta de transducción de la señal PI3-quinasa-Akt también es activada por EGFR, aunque esta activación es mucho más fuerte en caso de que exista coexpresión de ErbB-3 (HER3). EGFR está implicado en varias neoplasias malignas epiteliales humanas, en particular cánceres de mama, vejiga, cáncer de pulmón de células no pequeñas, pulmón, colon, cabeza y cuello de ovario y cerebro. Se han encontrado mutaciones activadoras en el gen, así como sobreexpresión del receptor y de sus ligandos, dando lugar a bucles de activación autocrina. Por lo tanto, este RTK se ha utilizado ampliamente como diana para la terapia del cáncer. Se han desarrollado tanto inhibidores de molécula pequeña dirigidos a RTK como anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos a los dominios de unión de ligandos extracelulares y hasta ahora han mostrado varios éxitos clínicos, aunque principalmente para un grupo selecto de pacientes. El número de acceso a la base de datos para la proteína EGFR humana y el gen que la codifica es (GenBank NM_005228.3). Este número de acceso se proporciona principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de la proteína EGFR como diana, la secuencia real de la proteína EGFR unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. Las palabras cáncer y tumor se usan en este documento y típicamente ambas se refieren a cáncer, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Cuando en la presente se hace referencia a EGFR, la referencia se refiere a EGFR humano a menos que se indique lo contrario. El sitio de unión al antígeno que se une a EGFR, se une a EGFR y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas en algunos tumores positivos para EGFR.

El término 'ErbB-3' como se usa en este documento se refiere a la proteína que en humanos está codificada por el gen ERBB3. Los nombres alternativos para el gen o la proteína son HER3; LCCS2; MDA-BF-1; c-ErbB-3; c-ErbB3; ErbB3-S; p180-ErbB3; p45-sErbB3; y p85-sErbB3. Cuando se hace aquí referencia a ErbB-3, la referencia se refiere a ErbB-3 humano. Un anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a ErbB-3, se une a ErbB-3 humano. El sitio de unión al antígeno ErbB-3 puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína ErbB-3 humana y el gen que la codifica son (NP_001005915.1, NP_001973.2, NC_000012.11, NC_018923.2, NT_029419.12). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de ErbB-3 como diana, la secuencia real de la proteína ErbB-3 unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante como los que se produce en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno ErbB-3 se une a ErbB-3 y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para ErbB-3. El sitio de unión al antígeno que se une a ErbB-3 preferiblemente se une al dominio III de ErbB-3. El miembro de la familia del receptor de EGF como se menciona en el presente documento como diana para la proteína de la invención o el anticuerpo biespecífico de la invención es preferiblemente el receptor del factor de crecimiento epidérmico Erbb-1 (EGFR), ErbB-3 o ErbB-4. En una realización preferida, el miembro de la familia del receptor de EGF es ErbB-1 o ErbB-3.

El término "LGR" se refiere a la familia de proteínas conocidas como receptores acoplados a proteína G que contienen repeticiones ricas en leucina. Se sabe que varios miembros de la familia están implicados en la ruta de señalización WNT, cabe destacar LGR4; LGR5 y LGR6.

LGR4 es una repetición rica en leucina que contiene el receptor 4 acoplado a proteína G Los nombres alternativos para el gen o la proteína son; GPR48; Receptor 48 acoplado a proteínas G; BNMD17; Receptor 4 acoplado a proteína G rico en leucina que contiene repeticiones; Receptor 4 acoplado a proteína G rico en leucina que contiene repeticiones; Receptor 48 acoplado a proteína G;

Una proteína o anticuerpo de la invención que se une a LGR4, se une a LGR4 humano. La proteína de unión a LGR4 o el anticuerpo de la invención puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína LGR4 humana y el gen que la codifica son (NC_000011.10; NC_018922.2; NT_009237.19; NP_060960.2). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de LGR4 como diana, la secuencia real de la proteína LGR4 unida puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno LGR4 se une a LGR4 y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para LGR4.

LGR5 es Receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repetición rica en leucina. Nombres alternativos para el gen o proteína son Receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repetición rica en leucina; Receptor 5 acoplado a proteína G rico en leucina que contiene repeticiones; Receptor acoplado a proteína G HG38; Receptor 49 acoplado a proteína G; Receptor 67 acoplado a proteína G; GPR67; GPR49; Receptor acoplado a proteína G huérfano HG38; Receptor 49 acoplado a proteínas G; GPR49; HG38 y FEX.

Una proteína o anticuerpo de la invención que se une a LGR5, se une a LGR5 humano. La proteína de unión a LGR5 o el anticuerpo de la invención puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína LGR5 humana y el gen que la codifica son (NC_000012.12; NT_029419.13; NC_018923.2; NP_001264155.1; NP_001264156.1; n P_003658.1). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de LGR5 como diana, la secuencia real de la proteína LGR5 unida puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno LGR5 se une a LGR5 y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para LGR5.

ZNRF3 es dedo de zinc y anillo 3. Los nombres alternativos para el gen o proteína son dedo de zinc y anillo 3; Proteína de dedo de zinc/ANILLO 3; Proteína de dedo ANILLO 203; KIAA1133; RNF203; Nuevo dedo de zinc tipo C3HC4 (Dedo de Anillo); proteína ubiquitina E3 ligasa ZNRF3; CTA-292E10.6; EC 6.3.2.; y BK747E2.33.

Una proteína o anticuerpo de la invención que se une a ZNRF3, se une a ZNRF3 humano. La proteína de unión a ZNRF3 o el anticuerpo de la invención puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína ZNRF3 humana y el gen que la codifica son (NC_000022.11; NT_011520.13; NC_018933.2; NP_001193927.1; NP_115549.2). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de ZNRF3 como diana, la secuencia real de la proteína ZNRF3 unida puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno ZNRF3 se une a ZNRF3 y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para ZNRF3.

El RNF43 es la proteína 43 de dedo y anillo. Los nombres alternativos para el gen o la proteína son proteína 43 de dedo anillo; RNF124; proteína ubiquitina E3 ligasa RNF43; Proteína de dedo ANILLO 43; EC 6.3.2.; u Rc C.

Una proteína o anticuerpo de la invención que se une al RNF43, se une al RNF43 humano. La proteína de unión a RNF43 o el anticuerpo de la invención puede, debido a la similitud de secuencia y estructura terciaria entre ortólogos humanos y de otros mamíferos, también unirse a dicho ortólogo, pero no necesariamente. Los números de acceso a la base de datos para la proteína RNF43 humana y el gen que la codifica son (NC_000017.11; NT_010783.16; NC_018928.2; NP_001292473.1; NP_001292474.1; Np_060233.3). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de RNF43 como diana, la secuencia real de la proteína RNF43 unida puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno RNF43 se une al RNF43 y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para RNF43.

El receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) se une al factor de crecimiento similar a la insulina con una alta afinidad. El receptor tiene actividad tirosina quinasa. El receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I juega un papel crítico en los eventos de transformación. La escisión del precursor genera subunidades alfa y beta. Se sobreexpresa en la mayoría de los tejidos malignos en donde funciona como un agente antiapoptótico mejorando la supervivencia celular. La proteína se conoce con varios nombres diferentes, como Receptor de IGF-I; EC 2.7.10.1; Receptor del factor de crecimiento similar a la insulina I; IGF1R soluble; Variante 1; Variante 2 de IGF1R soluble; Antígeno CD221; EC 2.7.10; CD221; IGFIR; JTK13; e IGFR. Los identificadores externos para IGFIR son HGNC: 5465; Entrez Gene: 3480; Conjunto: ENSG00000140443; OMIM: 147370 y UniprotKB: P08069.

La invención proporciona además un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT en un sistema permisivo para el crecimiento de la célula, comprendiendo el método proporcionar al sistema una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención. La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor de EGF que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT. El sistema es preferiblemente un sistema de cultivo. El método comprende preferiblemente cultivar dicha célula en dicho sistema.

En el contexto de la presente invención, se dice que la célula expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT si la célula comprende ARN detectable que codifica el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT. La expresión a menudo también se puede detectar incubando la célula con un anticuerpo que se une al miembro asociado a la membrana de la ruta WNT. Sin embargo, algunos miembros no se expresan lo suficientemente alto para tal prueba de anticuerpos o para algunos miembros, no hay anticuerpos específicos disponibles. En tales casos, se prefiere la detección de ARNm.

Cuando en el presente documento se dan números de acceso o nombres alternativos de proteínas/genes, se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de la proteína mencionada como diana, la secuencia real de la proteína diana unida por un anticuerpo de la invención puede variar, por ejemplo, debido a una mutación y/o corte y empalme alternativo en el gen codificante, como los que ocurren en algunos cánceres o similares.

La invención también proporciona un método para el tratamiento de un individuo que tiene un cáncer, comprendiendo el método administrar una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención al individuo que lo necesita. El individuo es preferiblemente un individuo que tiene cáncer. El cáncer es preferiblemente un adenocarcinoma. Los cánceres preferidos son cáncer colorrectal; Cancer de páncreas; cáncer de pulmón; cáncer de mama; cáncer de hígado; cáncer de próstata; cáncer de ovarios; cáncer de cuello uterino; cáncer endometrial; cáncer de cabeza y cuello; melanoma; cáncer de testículo; cáncer de urotelio; cáncer de riñón; cáncer de estómago; o cáncer carcinoide. En una realización preferida, el cáncer es cáncer colorrectal; cáncer de páncreas; cáncer de pulmón; cáncer de mama; cáncer de hígado; cáncer de próstata; cáncer de ovarios; cáncer de cuello uterino; cáncer endometrial; cáncer de cabeza y cuello; o melanoma. En una realización particularmente preferida, el cáncer es cáncer colorrectal; Cancer de páncreas; cáncer de pulmón; cáncer de mama; o cáncer de hígado. En una realización particularmente preferida, el cáncer es un cáncer gastrointestinal. En una realización preferida, el cáncer es cáncer colorrectal.

El cáncer es preferiblemente, pero no se limita a, un cáncer que exhibe una respuesta de crecimiento cuando se le proporciona un ligando miembro de la familia del receptor de EGF. La proteína de la invención es preferiblemente una proteína que se une a un miembro de la familia del receptor de EGF para el que el cáncer exhibe una respuesta de crecimiento. En una realización preferida, el cáncer exhibe una respuesta de crecimiento in vitro en respuesta a los miembros de la familia EGF en el medio de cultivo. El in vitro es preferiblemente un cultivo como se detalla para organoides en la sección experimental. El cáncer es preferiblemente un cáncer que expresa el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT al que se une la proteína de la invención.

Se proporciona además un sistema celular que comprende una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención, y una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta w Nt . La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor de EGF que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

El sistema o sistema celular como se describe en este documento es preferiblemente un sistema de cultivo in vitro. El sistema puede usarse para detectar respuestas de crecimiento de la célula. En una realización preferida, el ligando del receptor de EGF es un ligando para un miembro preferido de la familia de receptores de EGF como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es un miembro asociado a la membrana preferido de la ruta WNT como se define en otra parte del presente documento.

Un cáncer o una célula que responde al ligando del receptor de EGF muestra una respuesta de crecimiento (proliferación) a un ligando del receptor de EGF. Un método preferido para determinar si una célula o un cáncer responde al ligando del receptor de EGF es determinar la capacidad de respuesta del factor de crecimiento de la célula en un ensayo de cultivo organoide como se describe en los ejemplos. Un método consiste en sembrar la célula o células del cáncer en el sistema celular organoide en presencia o ausencia de factores de crecimiento como (EGF (5 ng/ml) o NRG (5 ng/ml)) y luego cultivar durante 5 días. El número de células viables se puede determinar posteriormente usando el ensayo de viabilidad celular Cell Titer Glo (Promega, cat. Nr. G7571). La lectura de luminiscencia usando células estimuladas con factor de crecimiento puede compararse luego con la obtenida usando células no estimuladas (ausencia del factor o factores de crecimiento).

La invención proporciona además un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores EGF y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT en un sistema permisivo para el crecimiento de la célula, comprendiendo el método proporcionar al sistema una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención. La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor de EGF que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT. La inhibición es preferiblemente una disminución de al menos un 10% en el número de células o una medida derivada del número de células, como el tamaño del tumor, cuando se compara con el número de células que resultan en condiciones similares, pero para la presencia de la proteína o el anticuerpo biespecífico de la invención. La inhibición es preferiblemente una disminución de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en el número de células. La inhibición también puede ser una disminución de al menos un 10% en otros parámetros asociados con la malignidad del tumor o la displasia, como el número de lúmenes por organoide, en comparación con el número de lúmenes que resultan en condiciones similares, pero para la presencia de la proteína o el anticuerpo biespecífico de la invención. La inhibición es preferiblemente una disminución de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en el número de lúmenes por organoide.

Para evitar dudas, la referencia al crecimiento de una célula como se usa en este documento se refiere a un cambio en el número de células. La inhibición del crecimiento se refiere a una reducción en el número de células que de otro modo se habrían obtenido. El aumento del crecimiento se refiere a un aumento en el número de células que de otro modo se habrían obtenido. El crecimiento de una célula se refiere típicamente a la proliferación de la célula.

La unión de la proteína o anticuerpo biespecífico de la invención a una célula que comprende dicho miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o cMET; y/o dicho miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT en la membrana reduce el crecimiento/proliferación de dicha célula en presencia de un factor de crecimiento para dicha familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o cMET y/o R-espondina. La reducción se compara con el crecimiento/proliferación de la misma célula en condiciones por lo demás idénticas en ausencia de la proteína o el anticuerpo biespecífico de la invención.

La proteína o anticuerpo biespecífico de la invención, o parte funcional, derivado y/o análogo de la misma se selecciona preferiblemente de una proteína o anticuerpo biespecífico de la invención, o parte funcional, derivado y/o análogo del mismo que se une a ErbB-1 y LGR4; ErbB-1 y LGR5; ErbB-1 y LGR6; ErbB-1 y ZNRF3; ErbB-1 y RNF43; ErbB-2 y LGR4; ErbB-2 y LGR5; ErbB-2 y LGR6; ErbB-2 y ZNRF3; ErbB-2 y RNF43; ErbB-3 y LGR4; ErbB-3 y LGR5; ErbB-3 y LGR6; ErbB-3 y ZNRF3; ErbB-3 y RNF43; ErbB-4 y LGR4; ErbB-4 y LGR5; ErbB-4 y LGR6; ErbB-4 y ZNRF3; y ErbB-4 y RNF43.

En una realización preferida, se selecciona de ErbB-1 y LGR4; ErbB-1 y LGR5; ErbB-1 y ZNRF3; ErbB-1 y RNF43; ErbB-3 y LGR4; ErbB-3 y LGR5; ErbB-3 y ZNRF3; ErbB-3 y RNF43; ErbB-4 y LGR4; ErbB-4 y LGR5; ErbB-4 y ZNRF3; y ErbB-4 y RNF43. En una realización preferida, se selecciona entre ErbB-1 y LGR4; ErbB-1 y LGR5; ErbB-1 y ZNRF3; ErbB-1 y RNF43; ErbB-3 y LGR4; ErbB-3 y LGR5; ErbB-3 y ZNRF3; ErbB-3 y RNF43. Preferiblemente, se selecciona de ErbB-1 y LGR5; ErbB-1 y ZNRF3; ErbB-1 y RNF43; ErbB-3 y LGR5; ErbB-3 y ZNRF3; y ErbB-3 y RNF43. En una realización particularmente preferida, la proteína o anticuerpo biespecífico de la invención, o parte funcional, derivado y/o análogo de la misma, se selecciona de una proteína o anticuerpo biespecífico de la invención, o parte funcional, derivado y/o análogo de la misma que se une a ErbB-1 y LGR5; y ErbB-3 y LGR5.

El anticuerpo o anticuerpo biespecífico preferiblemente comprende dos dominios variables en los que un dominio variable se une a una parte extracelular de una proteína y el otro dominio variable se une a una parte extracelular de la otra proteína.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a ErbB-1, en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-1 seleccionada entre el grupo formado por MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se muestra en la Figura 1 o en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se muestra en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 de m F3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se muestra en la Figura 1.

Dicho dominio variable comprende preferiblemente una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-1 seleccionada del grupo que consiste en MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se muestra en la Figura 1, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en como máximo un aminoácido de las secuencias CDR1, c DR2 y CDR3 de ErbB-1 región variable de cadena pesada específica seleccionada del grupo que consiste en MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, Cd R2 y CDR3 de MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se muestra en la Figura 1. Una región variable de cadena pesada preferida es MF3755. Otra región variable de cadena pesada preferida es MF4280.

Se ha demostrado que los anticuerpos que comprenden uno o más dominios variables con una región variable de cadena pesada MF3755 tienen una mejor efectividad cuando se usan para inhibir el crecimiento de un cáncer o célula que responde al ligando de EGFR. En el contexto de los anticuerpos biespecíficos, un brazo del anticuerpo que comprende un dominio variable con una región variable de cadena pesada MF3755 se combina mejor con una variedad de otros brazos que comprenden dominios variables que se unen a partes extracelulares de otras proteínas de la superficie celular. Los anticuerpos que comprenden un dominio variable con la región variable de cadena pesada MF4280 también funcionan bien con un dominio variable que se une a LGR4, LGR5, LGR6, ZNRF3 o RNF43.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a ErbB-3, en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada entre el grupo que consiste en MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se muestra en la Figura 1 o en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 de MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se muestra en la Figura 1.

Dicho dominio variable comprende preferiblemente una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ErbB-3 seleccionada del grupo que consiste en MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se muestra en la Figura 1, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en como máximo un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de ErbB-3 específicas región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se representa en la Figura 1. El dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, c Dr 2 y CDR3 de MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se muestra en la Figura 1. Una región variable de cadena pesada preferida es MF3178.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a LGR4, en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de LGR4 seleccionada del grupo que consiste en MF5777; o MF5781 como se muestra en la Figura 1 o en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF5777; o MF5781 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 de MF5777; o MF5781 como se muestra en la Figura 1.

Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de LGR4 seleccionada del grupo que consiste en MF5777; o MF5781 como se muestra en la Figura 1, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en como máximo un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada específica LGR4 región variable seleccionada del grupo que consiste en MF5777; o MF5781 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF5777; o MF5781 como se muestra en la Figura 1. Una región variable de cadena pesada preferida es MF5781.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a LGR5, en donde una región variable de cadena pesada de dicho anticuerpo biespecífico comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de LGR5 seleccionada del grupo que consiste en MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se muestra en la Figura 1 o en donde una región variable de cadena pesada de dominio variable comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 de MF5790; MF5803; MF 5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se muestra en la Figura 1.

Dicho dominio variable comprende preferiblemente una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias de CDR1, c DR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de LGR5 seleccionada del grupo que consiste en MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se muestra en la Figura 1, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en como máximo un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada específica de LGR5 región variable seleccionada del grupo que consiste en MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se muestra en la Figura 1. Las regiones variables de cadena pesada preferidas son MF5790; MF5803; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818. Las regiones variables de cadena pesada particularmente preferidas son MF5790; MF5814; MF5816; y MF5818; preferiblemente MF5814, MF5818 y MF5816, se prefiere particularmente la región variable de cadena pesada MF5816. Otra región variable de cadena pesada preferida es MF5818.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a RNF43, en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de RNF43 seleccionada del grupo que consiste en MF5832; MF5836; o MF5839 como se muestra en la Figura 1 o en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un amino ácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF5832; MF5836; o MF5839 como se muestra en la Figura 1.

Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 de MF5832; MF5836; o MF5839 como se muestra en la Figura 1. Dicho dominio variable comprende preferiblemente una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de RNF43 seleccionada del grupo que consiste en MF5832; MF5836; o MF5839 como se muestra en la Figura 1, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDr 3 de cadena pesada que difieren en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en como máximo un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada específica de RNF43 región variable seleccionada del grupo que consiste en MF5832; MF5836; o MF5839 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, Cd R2 y CDR3 de MF5832; MF5836; o MF5839 como se muestra en la Figura 1. Las cadenas pesadas preferidas son MF5832; o MF5836. Una región variable de cadena pesada preferida es MF5836.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a ZNRF3, en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende al menos la secuencia CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ZNRF3 seleccionada del grupo que consiste en MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; Mf 5884; MF5887; o MF5888 como se muestra en la Figura 1 o en donde una región variable de cadena pesada de dicho dominio variable comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada que difiere en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en no más de un aminoácido de una secuencia CDR3 de un VH seleccionado del grupo que consiste en MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 como se muestra en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos la secuencia CDR3 de MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 como se muestra en la Figura 1.

Dicho dominio variable comprende preferiblemente una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada específica de ZNRF3 seleccionada del grupo que consiste en m F5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 como se muestra en la Figura 1, o secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que difieren en como máximo tres, preferiblemente en como máximo dos, preferiblemente en como máximo un aminoácido de las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada específica de ZNRF3 región variable seleccionada del grupo que consiste en MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 como se representa en la Figura 1. Dicho dominio variable preferiblemente comprende una región variable de cadena pesada que comprende al menos las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 como se muestra en la Figura 1. Las regiones variables de cadena pesada preferidas son MF5850; MF5853; MF5855; MF5884; o MF5888. Las regiones variables de cadena pesada preferidas son MF5888 y MF5850, preferiblemente MF5850.

Las secuencias de CDR se varían, por ejemplo, con fines de optimización, preferiblemente para mejorar la fuerza de unión o la estabilidad del anticuerpo. La optimización se realiza, por ejemplo, mediante procedimientos de mutagénesis en los que, después de la estabilidad y/o la afinidad de unión de los anticuerpos resultantes, se prueban preferiblemente y se selecciona preferiblemente una secuencia de CDR específica de ErbB3 o EGFR mejorada. Una persona experta es capaz de generar variantes de anticuerpos que comprenden al menos una secuencia de CDR alterada de acuerdo con la invención. Por ejemplo, se puede aplicar una sustitución conservadora de aminoácidos. Ejemplos de sustitución conservadora de aminoácidos incluyen la sustitución de un residuo hidrofóbico como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofóbico, y la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico. para ácido aspártico, o glutamina para asparagina.

El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a EGFR, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3370; MF3755; MF4280 o MF4289 representado en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 1. El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a EGFR, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable y preferiblemente comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755. En una realización preferida, este anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que se une a un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es LGR4, LGR5, RNF43 o ZNRF3.

El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a HER3, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3125; MF3176; MF3178; o MF4863 representado en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 1. Una cadena pesada preferida es MF3178. En una realización preferida, este anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que se une a un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es LGR4, LGR5, RNF43 o ZNRF3.

El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a LGR4, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777; o MF5781 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777; o MF5781 representado en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 1. En una realización preferida, este anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular del miembro asociado a la membrana de la familia EGFR como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la familia EGFR es EGFR o HER3, preferiblemente EGFR. Una cadena pesada preferida es MF3755.

El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a LGR5, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790; MF5803; MF5805; MF5808; MF5809; MF5814; MF5816; MF5817; o MF5818 representado en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 1. En una realización preferida, este anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular del miembro asociado a la membrana de la familia EGFR como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la familia EGFR es EGFR o HER3, preferiblemente EGFR. Una cadena pesada preferida es MF3755.

El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a RNF43, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5832; MF5836; o MF5839 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5832; MF5836; o MF5839 representado en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 1. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular del miembro asociado a la membrana de la familia EGFR como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la familia EGFR es EGFR o HER3, preferiblemente EGFR. Una cadena pesada preferida es MF3755.

El anticuerpo biespecífico de la invención que comprende un dominio variable que se une a ZNRF3, preferiblemente comprende la cadena VH de dicho dominio variable comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850; MF5853; MF5855; MF5862; MF5882; MF5884; MF5887; o MF5888 representado en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de los mismos con respecto a la secuencia de la cadena VH de la Figura 1. En una realización preferida, el anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular del miembro asociado a la membrana de la familia EGFR como se define en otra parte del presente documento. En una realización preferida, el miembro asociado a la membrana de la familia EGFR es EGFR o HER3, preferiblemente EGFR. Una cadena pesada preferida es MF3755.

Preferiblemente, las inserciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos mencionadas en un VH o VL como se especifica en el presente documento no están presentes en la región CDR3. Las inserciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos mencionadas también preferiblemente no están presentes en las regiones CDR1 y CDR2. Las inserciones, eliminaciones y sustituciones de aminoácidos mencionadas también preferiblemente no están presentes en la región FR4.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR4 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR4 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR4 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR4 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5781 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5781 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5803 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5803 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5814 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5814 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

-la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5817 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5817 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende - la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5818 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5818 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a RNF43 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a RNF43 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5832 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5832 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a RNF43 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a RNF43 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5836 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5836 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5853 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5853 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5855 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5855 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5884 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5884 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5888 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5888 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR4 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR4 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR4 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR4 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5781 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5781 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5803 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5803 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5814 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5814 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5817 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5817 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a LGR5 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5818 como se muestra en la Figura 1; o

-la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5818 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a RNF43 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a RNF43 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5836 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5836 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5853 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5853 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5855 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5855 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5884 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5884 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que se une a HER3 y un dominio variable que se une a ZNRF3 en donde la cadena VH del dominio variable que se une a HER3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3178 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

en donde la cadena VH del dominio variable que se une a ZNRF3 comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5888 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5888 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

Una proteína o un anticuerpo biespecífico de la presente invención se usa preferiblemente en seres humanos. Con este fin, un anticuerpo de la invención es preferiblemente un anticuerpo humano o humanizado. La tolerancia de un ser humano a un polipéptido se rige por muchos aspectos diferentes. La inmunidad, ya sea mediada por células T, mediada por células B u otra, es una de las variables que se engloban en la tolerancia del ser humano a un polipéptido. La región constante de un anticuerpo biespecífico de la presente invención es preferiblemente una región constante humana (Figura 4). La región constante puede contener una o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región constante de un anticuerpo humano de origen natural. Se prefiere que la parte constante se derive completamente de un anticuerpo humano de origen natural. Varios anticuerpos producidos en la presente se derivan de ratones de cadena liviana común inmunizados con la diana respectiva como se describe en el documento WO2009/157771. Diversos anticuerpos producidos en este documento se derivan de una biblioteca de dominios variables de anticuerpos humanos. Como tales, estos dominios variables son humanos. Las regiones CDR únicas pueden derivarse de seres humanos, ser sintéticas o derivadas de otro organismo. La región variable se considera una región variable humana cuando tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia de aminoácidos de la región variable de un anticuerpo humano de origen natural, pero para las regiones CDR. La región variable de un VH de anticuerpo que se une a un miembro de la familia EGFR o miembro asociado a la membrana de la ruta WNT, o una cadena liviana en un anticuerpo de la invención puede contener uno o más, preferiblemente no más de 10, preferiblemente no más de 5 diferencias de aminoácidos con la región variable de un anticuerpo humano natural, sin contar las posibles diferencias en la secuencia de aminoácidos de las regiones CDR. Tales mutaciones también ocurren en la naturaleza en el contexto de la hipermutación somática.

Los anticuerpos pueden derivarse de diversas especies animales, al menos con respecto a la región variable de la cadena pesada. Es una práctica común humanizar por ejemplo tales regiones variables de cadena pesada murina. Hay varias formas de lograr esto, entre las que se encuentran el injerto de CDR en una región variable de la cadena pesada humana con una estructura 3D que coincide con la estructura 3-D de la región variable de la cadena pesada murina; desinmunizar la región variable de la cadena pesada murina, preferiblemente realizada eliminando los epítopos de células T o B conocidos o sospechosos de la región variable de la cadena pesada murina. La eliminación se realiza típicamente sustituyendo uno o más de los aminoácidos en el epítopo por otro aminoácido (típicamente conservador), de manera que la secuencia del epítopo se modifica de manera que ya no es un epítopo de células B Tor.

Las regiones variables de cadena pesada murina desinmunizadas son menos inmunogénicas en humanos que la región variable de cadena pesada murina original. Preferiblemente, una región o dominio variable de la invención se humaniza más, tal como, por ejemplo, enchapado. Mediante el uso de técnicas de recubrimiento, los residuos exteriores que el sistema inmunológico encuentra fácilmente se reemplazan selectivamente con residuos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende una superficie recubierta débilmente inmunogénica o sustancialmente no inmunogénica. Un animal como se usa en la invención es preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un primate, lo más preferiblemente un ser humano.

Una proteína o un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención comprende preferiblemente una región constante de un anticuerpo humano. Según las diferencias en sus dominios constantes de cadena pesada, los anticuerpos se agrupan en cinco clases o isotipos: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Estas clases o isotipos comprenden al menos una de dichas cadenas pesadas que se nombra con una letra griega correspondiente. En una realización preferida, la invención proporciona un anticuerpo de acuerdo con la invención en donde dicha región constante se selecciona del grupo de regiones constantes de IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, más preferiblemente dicha región constante comprende una región constante de IgG, más preferiblemente una región constante de IgG1 (Figura 4), preferiblemente una región constante de IgG1 mutada. Alguna variación en la región constante de IgG1 ocurre en la naturaleza y/o se permite sin cambiar las propiedades inmunológicas del anticuerpo resultante. Típicamente, se permiten en la región constante entre aproximadamente 1-10 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas.

Los métodos racionales han evolucionado hacia la minimización del contenido de residuos no humanos en el contexto humano. Hay varios métodos disponibles para injertar con éxito la propiedad de unión al antígeno de un anticuerpo en otro anticuerpo. Las propiedades de unión de los anticuerpos descansan predominantemente en la secuencia exacta de la región CDR3, a menudo respaldada por la secuencia de las regiones CDR1 y CDR2 en el dominio variable combinado con la estructura apropiada del dominio variable en su conjunto. Actualmente están disponibles varios métodos para injertar regiones CDR en un dominio variable adecuado de otro anticuerpo. Algunos de estos métodos se revisan en J.C. Almagro1 y J. Fransson (2008) Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633, que se incluye aquí como referencia.

Las 15 mencionadas como máximo, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones de aminoácidos son preferiblemente sustituciones, inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos conservadoras o una combinación de las mismas no están preferiblemente en la región CDR3 de la cadena VH, preferiblemente no en la región CDR1, CDR2 o CDR3 de la cadena VH y preferiblemente no en la región FR4.

La cadena liviana de un dominio variable que comprende una secuencia de cadena pesada variable como se muestra en la Figura 3, es preferiblemente una cadena liviana de la línea germinal de o basada en 012, preferiblemente la cadena liviana kappa humana de línea germinal reordenada IgVK1-39*01/IGJK1*01 o un fragmento o un derivado funcional del mismo (nomenclatura según la base de datos IMGT en la web mundial en imgt.org). Se utilizan los términos IgVK1-39*0/IGJK1*01 de cadena liviana kappa humana de línea germinal reordenada, IGKV1-39/IGKJ1, cadena liviana huVK1-39 o, en resumen, huVK1-39. La cadena liviana puede tener 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o combinaciones de las mismas de las mismas. Las sustituciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos mencionadas son preferiblemente sustituciones, inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos conservadoras o combinaciones de las mismas preferiblemente no están en la región CDR3 de la cadena VL, preferiblemente no en la CDR1, CDR2 o Región CDR3 o región FR4 de la cadena VL.

Están disponibles diversos métodos para producir anticuerpos biespecíficos. Un método implica la expresión de dos cadenas pesadas diferentes y dos cadenas livianas diferentes en una célula y la recolección de anticuerpos producidos por la célula. El anticuerpo producido de esta manera contendrá típicamente una colección de anticuerpos con diferentes combinaciones de cadenas pesadas y livianas, algunas de las cuales son el anticuerpo biespecífico deseado. El anticuerpo biespecífico se puede purificar posteriormente de la colección. La proporción de anticuerpos biespecíficos con respecto a otros que son producidos por la célula se puede incrementar de diversas formas. En una realización preferida de la invención, la proporción aumenta al expresar no dos cadenas livianas diferentes sino dos cadenas livianas esencialmente idénticas en la célula. Este concepto también se denomina en la técnica método de "cadena liviana común". Cuando las cadenas livianas esencialmente idénticas trabajan junto con las dos cadenas pesadas diferentes, lo que permite la formación de dominios variables con diferentes sitios de unión al antígeno y diferentes propiedades de unión concomitantes, la relación de anticuerpo biespecífico a otro anticuerpo producido por la célula mejora significativamente con respecto a la expresión de dos cadenas livianas diferentes. La proporción de anticuerpos biespecíficos que produce la célula puede mejorarse aún más estimulando el emparejamiento de dos cadenas pesadas diferentes entre sí sobre el emparejamiento de dos cadenas pesadas idénticas. La técnica describe varias formas en las que se puede lograr dicha heterodimerización de cadenas pesadas. Una forma es generar anticuerpos biespecíficos "de picaporte en orificio". Véase la Solicitud de Patente Estadounidense 20030078385 (Arathoon et al.-Genentech). Otro método consiste en utilizar la ingeniería genética de carga como se describe en Gunasekaran (JBC 2010, vol 285, págs. 19637-19646). Otro método preferido se describe en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos 61/635,935, que ha sido seguida por la solicitud regular de los Estados Unidos No. 13/866,747 y la Solicitud PCT No. PCT/NL2013/050294 (WO 2013/157954 A1). Se describen métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos (a partir de una sola célula), mediante los cuales se proporcionan medios que favorecen la formación de anticuerpos biespecíficos sobre la formación de anticuerpos monoespecíficos. Estos métodos también se pueden emplear favorablemente en la presente invención. Por tanto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención (a partir de una sola célula), en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, comprendiendo dicho método proporcionar en dicha célula a) un primer molécula de ácido que codifica un primer dominio CH3 que comprende una cadena pesada, b) una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo dominio CH3 que comprende una cadena pesada, en la que dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dicho primer y segundo dominio CH3 que comprende cadenas pesadas, comprendiendo además dicho método la etapa de cultivar dicha célula huésped y permitir la expresión de dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico pueden ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de administración de genes y pueden integrarse en el mismo sitio del genoma de la célula huésped. Alternativamente, dichas primera y segunda moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula.

Una realización preferida proporciona un método para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención a partir de una sola célula, en donde dicho anticuerpo biespecífico comprende dos dominios CH3 que son capaces de formar una interfaz, comprendiendo dicho método proporcionar:

- una célula que tiene a) una primera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia EGFR y que contiene un primer dominio CH3, y b) un segundo dominio nucleico molécula de ácido que codifica una cadena pesada que comprende un sitio de unión a antígeno que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT y que contiene un segundo dominio CH3, en donde dichas moléculas de ácido nucleico están provistas de medios para el emparejamiento preferencial de dichos dominios 1° y 2° CH3,

comprendiendo dicho método además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de las proteínas codificadas por dichas dos moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo IgG biespecífico del cultivo. En una realización particularmente preferida, dicha célula también tiene una tercera molécula de ácido nucleico que codifica una cadena liviana común. Dicha primera, segunda y tercera molécula de ácido nucleico puede ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, vector o vehículo de administración de genes y puede integrarse en el mismo sitio del genoma de la célula huésped. Alternativamente, dichas primera, segunda y tercera moléculas de ácido nucleico se proporcionan por separado a dicha célula. Una cadena liviana común preferida se basa en 012, preferiblemente es la cadena liviana kappa humana de línea germinal reordenada IgVKl 39*01/IGJk1*01, como se describió anteriormente. Los medios para el emparejamiento preferencial de dicho primer y segundo dominio CH3 son preferiblemente las mutaciones correspondientes en el dominio CH3 de las regiones codificantes de la cadena pesada. Las mutaciones preferidas para producir esencialmente sólo anticuerpos biespecíficos son las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración según la numeración EU) en el primer dominio CH3 y las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E en el segundo dominio CH3, o viceversa. Por lo tanto, se proporciona además un método de acuerdo con la invención para producir un anticuerpo biespecífico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K (numeración según la numeración EU) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E, comprendiendo además dicho método la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de proteínas codificadas por dichas moléculas de ácido nucleico y recolectar dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. También se proporciona un método de acuerdo con la invención para producir un anticuerpo biespecífico, en donde dicho primer dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351D y L368E (numeración según la numeración EU) y en donde dicho segundo dominio CH3 comprende las sustituciones de aminoácidos L351K y T366K, dicho método comprende además la etapa de cultivar dicha célula y permitir la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico y recoger dicho anticuerpo biespecífico del cultivo. Los anticuerpos que pueden producirse mediante estos métodos también forman parte de la presente invención. Los dominios de heterodimerización de CH3 son preferiblemente dominios de heterodimerización de IgG1. Las regiones constantes de cadena pesada que comprenden los dominios de heterodimerización de CH3 son preferiblemente regiones constantes de IgG1.

En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de anticuerpo de acuerdo con la invención. La molécula de ácido nucleico (típicamente una molécula de ácido nucleico recombinante o aislada in vitro) preferiblemente codifica una región variable de cadena pesada como se muestra en la Figura 1 o una región variable de cadena pesada como se muestra en la Figura 1 que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o combinaciones de las mismas de las mismas. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia como se muestra en la Figura 2. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico codifica la misma secuencia de aminoácidos que el ácido nucleico representado en la Figura 2 pero tiene una secuencia diferente porque codifica una o más diferentes codones. La invención proporciona además una secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de la Figura 1.

Una molécula de ácido nucleico como se usa en la invención es típicamente, pero no exclusivamente, un ácido ribonucleico (ARN) o un ácido desoxirribonucleico (ADN). Los ácidos nucleicos alternativos están disponibles para una persona experta en la técnica. Un ácido nucleico de acuerdo con la invención está, por ejemplo, contenido en una célula. Cuando dicho ácido nucleico se expresa en dicha célula, dicha célula puede producir un anticuerpo de acuerdo con la invención. Por tanto, la invención en una realización proporciona una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Dicha célula es preferiblemente una célula animal, más preferiblemente una célula de mamífero, más preferiblemente una célula de primate, lo más preferiblemente una célula humana. Para los propósitos de la invención, una célula adecuada es cualquier célula capaz de comprender y preferiblemente de producir un anticuerpo de acuerdo con la invención y/o un ácido nucleico de acuerdo con la invención.

La invención proporciona además una célula que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferiblemente, dicha célula (típicamente una célula in vitro, aislada o recombinante) produce dicho anticuerpo. En una realización preferida, dicha célula es una célula de hibridoma, una célula de ovario de hámster chino (CHO), una célula NS0 o una célula PER-C6TM. En una realización particularmente preferida, dicha célula es una célula CHO. Se proporciona además un cultivo celular que comprende una célula de acuerdo con la invención. Varias instituciones y empresas han desarrollado líneas celulares para la producción a gran escala de anticuerpos, por ejemplo, para uso clínico. Ejemplos no limitantes de tales líneas celulares son células CHO, células NS0 o células PER.C6. Estas células también se utilizan para otros fines, como la producción de proteínas. Las líneas celulares desarrolladas para la producción a escala industrial de proteínas y anticuerpos se denominan en el presente documento líneas celulares industriales. Por tanto, en una realización preferida, la invención proporciona el uso de una línea celular desarrollada para la producción a gran escala de anticuerpos para la producción de un anticuerpo de la invención. La invención proporciona además una célula para producir un anticuerpo que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un VH, un VL y/o una cadena pesada como se muestra en la Figura 1. Preferiblemente, dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia como se muestra en la Figura 2.

La invención proporciona además un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula de la invención y recolectar dicho anticuerpo de dicho cultivo. Preferiblemente, dicha célula se cultiva en un medio sin suero. Preferiblemente, dicha célula está adaptada para el crecimiento en suspensión. Se proporciona además un anticuerpo que se puede obtener mediante un método para producir un anticuerpo de acuerdo con la invención. Preferiblemente, el anticuerpo se purifica del medio del cultivo. Preferiblemente, dicho anticuerpo está purificado por afinidad.

Una célula de la invención es, por ejemplo, una línea celular de hibridoma, una célula CHO, una célula 293F, una célula NS0 u otro tipo de célula conocido por su idoneidad para la producción de anticuerpos con fines clínicos. En una realización particularmente preferida, dicha célula es una célula humana. Preferiblemente, una célula que se transforma mediante una región E1 de adenovirus o un equivalente funcional de la misma. Un ejemplo preferido de tal línea celular es la línea celular PER.C6 o equivalente de la misma. En una realización particularmente preferida, dicha célula es una célula CHO o una variante de la misma. Preferiblemente, una variante que utiliza un sistema de vector de glutamina sintetasa (GS) para la expresión de un anticuerpo.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica comprende preferiblemente un excipiente o vehículo preferiblemente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende histidina 5-50 mM, trehalosa 100-300 mM, polisorbato 20 0.1-03 g/l o una combinación de los mismos. El pH se ajusta preferiblemente a pH = 5.5-6.5. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende histidina 25 mM, trehalosa 220 mM, polisorbato 20 0.2 g/l o una combinación de los mismos. El pH se ajusta preferiblemente a pH = 5.5 - 6.5, lo más preferiblemente a pH = 6.

Un anticuerpo de la invención preferiblemente comprende además un marcador, preferiblemente un marcador para la generación de imágenes in vivo. Normalmente, dicha etiqueta no es necesaria para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en un entorno de diagnóstico, una etiqueta puede resultar útil. Por ejemplo, al visualizar células diana en el cuerpo. Son adecuadas diversas etiquetas y muchas son bien conocidas en la técnica. En una realización preferida, el marcador es un marcador radiactivo para la detección. En otra realización preferida, la etiqueta es una etiqueta de infrarrojos. Preferiblemente, la etiqueta de infrarrojos es adecuada para la generación de imágenes in vivo. El experto en la materia dispone de diversas etiquetas de infrarrojos. Las etiquetas de infrarrojos preferidas son, por ejemplo, IRDye 800; IRDye 680RD; IRDye 680LT; IRDye 750; IRDye 700DX; IRDye 800RS IRDye 650; fosforamidita IRDye 700; IRDye 800 fosforamidita (LI-COR USA; 4647 Superior Street; Lincoln, Nebraska).

Para establecer si un cáncer exhibe una respuesta de crecimiento cuando se le proporciona un ligando miembro de la familia del receptor de EGF, el experto puede, por ejemplo, determinar la amplificación de EGFR y/o la inmunohistoquímica de tinción (para una respuesta de EGF). Al menos el 10% de las células tumorales en una muestra de tumor deben ser positivas. La muestra de tumor también puede contener 20%, 30% 40% 50% 60% 70% o más células positivas. Para establecer si un cáncer muestra una respuesta de crecimiento a un ligando de HER3, el experto en la materia puede, por ejemplo, determinar la amplificación y/o tinción de HER3 en inmunohistoquímica. Al menos el 10% de las células tumorales en una muestra de tumor deben ser positivas. La muestra también puede contener 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o más células positivas. Para establecer si un cáncer será sensible al receptor Wnt (LGR5, LGR4, ZNRF3, RNF43) dirigido al receptor, el experto puede, por ejemplo, determinar la amplificación y/o tinción de la diana Wnt en inmunohistoquímica. Al menos el 1% de las células tumorales en una muestra de tumor deben ser positivas. La muestra también puede contener 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más células positivas.

La cantidad de anticuerpo de acuerdo con la invención que se administrará a un paciente está típicamente en la ventana terapéutica, lo que significa que se usa una cantidad suficiente para obtener un efecto terapéutico, mientras que la cantidad no excede un valor umbral que conduce a un inaceptable alcance de los efectos secundarios. Cuanto menor sea la cantidad de anticuerpo necesaria para obtener un efecto terapéutico deseado, mayor será la ventana terapéutica típicamente. Por tanto, se prefiere un anticuerpo de acuerdo con la invención que ejerza suficientes efectos terapéuticos a dosis bajas. La dosis puede estar dentro del rango del régimen de dosificación de cetuximab. La dosis también puede ser menor.

Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención induce preferiblemente menos toxicidad cutánea en comparación con cetuximab en condiciones por lo demás similares, por supuesto. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención produce preferiblemente menos quimioquinas proinflamatorias, preferiblemente CXCL14 en comparación con cetuximab en condiciones por lo demás similares, por supuesto. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención induce preferiblemente menos deterioro de las ARNas antimicrobianas, preferiblemente ARNasa 7, en comparación con cetuximab en condiciones por lo demás similares, por supuesto.

La presente invención describe, entre otros, anticuerpos que se dirigen a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores de EGF y una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la ruta de señalización WNT y dan como resultado una potente inhibición de la proliferación de líneas celulares cancerosas in vitro e inhibición del crecimiento tumoral in vivo. Los anticuerpos se produjeron como anticuerpos biespecíficos clonándolos en vectores de expresión complementarios que contienen mutaciones en la región CH3 que impulsa la heterodimerización de las cadenas pesadas. Se produjeron muchos anticuerpos biespecíficos a pequeña escala y se probaron en ensayos funcionales y de unión en líneas celulares cancerosas. Un anticuerpo de la invención, particularmente un anticuerpo biespecífico de la invención, puede combinar perfiles de baja toxicidad con alta eficacia. Un anticuerpo de la invención puede ser útil en varios tipos y líneas de terapias dirigidas a miembros de la familia EGFR. Un anticuerpo de la invención puede tener una ventana terapéutica aumentada cuando se compara con un anticuerpo que se une al mismo(s) antígeno(s) con ambos brazos. Un anticuerpo biespecífico de la invención puede exhibir mejores efectos inhibidores del crecimiento in vitro, in vivo o una combinación de los mismos en comparación con el anticuerpo MEHD7945A.

También se proporciona un método para contrarrestar la formación de una metástasis en un sujeto que tiene un cáncer que expresa un miembro de la familia de receptores EGF y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT. El cáncer es preferiblemente un cáncer que responde al ligando del receptor de EGF. Los niveles altos de ligando de Her (por ejemplo, EGF, Heregulina) están típicamente presentes durante la formación de metástasis (es decir, la migración, invasión, crecimiento y/o diferenciación de células tumorales o células iniciadoras de tumores). Normalmente, las células iniciadoras de tumores se identifican en función de marcadores de células madre como CD44. Por lo tanto, estos procesos apenas pueden contrarrestarse con terapias actualmente conocidas como trastuzumab y pertuzumab. Dado que un anticuerpo de acuerdo con la invención es capaz de contrarrestar el crecimiento y/o la diferenciación de células tumorales o células iniciadoras de tumores tales como células madre cancerosas, dicho anticuerpo de acuerdo con la invención también es particularmente adecuado para contrarrestar la formación de metástasis. Por lo tanto, se proporciona además un método para contrarrestar la formación de una metástasis en un sujeto que tiene un tumor positivo para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3, en donde dicha célula tumoral positiva para EGFR, ErbB-3 o EGFR/ErbB-3 y/o células de tejido estromal circundante (por ejemplo, fibroblastos, leucocitos como macrófagos y monocitos, endotelio, etc.) tiene un nivel de expresión del ligando Her que es al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% o el 95% del nivel de expresión de su ligando de células BXPC3 o MCF7, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo que se une a una parte extracelular de una célula de EGFR o HER3, una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la ruta de señalización WNT. También se proporciona un anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo que se une a una parte extracelular de EGFR o HER3, y una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la ruta de señalización WNT, para su uso en el tratamiento o prevención de la formación de metástasis. El tumor del que se originan dichas metástasis es preferiblemente un tumor positivo para ErbB-3 o EGFR/ErbB-3. El tumor y/o las células del tejido estromal circundante tienen preferiblemente un nivel de expresión de su ligando que es al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% o 95% del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7.

Se proporciona además un uso de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la invención o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la formación de metástasis. El tumor del que se originan dichas metástasis es preferiblemente un tumor positivo para ErbB-3 o EGFR/ErbB-3. El tumor y/o las células del tejido estromal circundante tienen preferiblemente un nivel de expresión de su ligando que es al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90% o 95% del nivel de expresión de herregulina de células BXPC3 o MCF7.

Los anticuerpos de la invención se pueden producir a niveles >50 mg/l después de la transfección transitoria en células 293F en suspensión. Los anticuerpos biespecíficos se pueden purificar hasta una pureza superior al 98% con rendimientos >70%. Los estudios de caracterización analítica muestran perfiles de anticuerpos lgG1 biespecíficos que son comparables a los de lgG1 monoespecífico bivalente.

Con el propósito de claridad y una descripción concisa, se describen características en este documento como parte de las mismas o de realizaciones separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir realizaciones que tengan combinaciones de todas o algunas de las características descritas.

En matemáticas, la distancia euclidiana o métrica euclidiana es la distancia "ordinaria" (es decir, en línea recta) entre dos puntos en el espacio euclidiano. Con esta distancia, el espacio euclidiano se convierte en un espacio métrico. La norma asociada se llama norma euclidiana.

Las tirosina quinasas receptoras (RTK) son los receptores de superficie celular de alta afinidad para muchos factores de crecimiento polipeptídicos, citoquinas y hormonas. De los 90 genes de tirosina quinasa únicos actualmente conocidos identificados en el genoma humano, 58 codifican proteínas receptoras de tirosina quinasa. Se ha demostrado que las tirosina quinasas receptoras son relevantes para los procesos celulares normales, pero también tienen un papel en el desarrollo y la progresión del cáncer. Las tirosina quinasas receptoras contienen al menos un dominio extracelular.

En un aspecto, la invención proporciona una proteína que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores RTK y una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT. La proteína es preferiblemente un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo.

La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico o una parte funcional, derivado y/o análogo del mismo que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores RTK y una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT.

También se proporciona un método para el tratamiento de un individuo que tiene un cáncer, comprendiendo el método administrar una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención al individuo que lo necesita.

La invención proporciona además una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención, para su uso en el tratamiento de un individuo que tiene cáncer.

En una realización, el cáncer es un cáncer que responde al ligando del miembro respectivo de la familia de receptores RTK y un cáncer que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

Se proporciona además un sistema celular que comprende una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención, y una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores RTK y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT. El sistema celular es preferiblemente un sistema celular que comprende una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención, y una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores RTK y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

También se proporciona un sistema permisivo para inhibir el crecimiento/proliferación de la célula, comprendiendo el método proporcionar al sistema una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención. La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor RTK que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT en un sistema permisivo para el crecimiento/proliferación de la célula, comprendiendo el método proporcionar al sistema una proteína de la invención o un anticuerpo biespecífico de la invención. La célula es preferiblemente una célula que responde al ligando del receptor RTK que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT.

Los miembros preferidos de la familia de receptores RTK son la familia de receptores EGF mencionada y c-MET; Axl y MST1R.

MET o C-MET es un receptor de tirosina quinasa de paso único relevante para el desarrollo embrionario, organogénesis y cicatrización de heridas. El factor de crecimiento de hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF) y su isoforma de corte y empalme (NK1, NK2) son los ligandos actualmente conocidos del receptor MET. MET se expresa normalmente por células de origen epitelial, mientras que la expresión de HGF/SF se observa en células de origen mesenquimatoso. Cuando HGF/SF se une a su receptor análogo MET, induce la activación. Met también se conoce como MET Protooncogén, Receptor tirosina quinasa; Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; proteína Tirosina quinasa Met; Receptor de factor de dispersión; Protooncogén C-Met; Receptor de HGF/SF; Receptor de HGF; Receptor SF; EC 2.7.10.1; Met protooncogén tirosina quinasa; Met Protooncogén; Ec 2.7.10; AUTS9; RCCP2; C-Met; y HGFR 3. Los números de acceso para el gen y la proteína son NC_000007.14; NT_007933.16; NC_018918.2; NP_000236.2; NP_001120972.1. Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de C-MET como diana, la secuencia real de la proteína C-MET unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante como los que se produce en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno C-MET se une a C-MET y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas a C-MET.

El receptor de tirosina quinasa de AXL o AXL codifica el receptor de proteína tirosina quinasa UFO, que es una enzima que en humanos está codificada por el gen AXL. Otros nombres para AXL son AXL Receptor Tirosina quinasa; Oncogén AXL; EC 2.7.10.1; UFO; receptor de proteína tirosina quinasa UFO; Secuencia de transformación/gen AXL; EC 2.7.10; JTK11; Tyro7; y ARK 3. Los números de acceso para el gen y la proteína son NC_000019.10; NC_018930.2; NT_011109.17; NP_001265528.1; NP_001690.2; NP_068713.2). Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de AXL como diana, la secuencia real de la proteína AXL unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres. o similar. El sitio de unión al antígeno AXL se une a AXL y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas a AXL.

MST1R o receptor 1 estimulante de macrófagos o RON. Otros nombres para MST1R son Receptor Estimulante de Macrófagos 1; RON; PTK8 Proteína Tirosina Quinasa 8; Tirosina quinasa relacionada con C-Met; Receptor MSP; EC 2.7.10.1; P185-Ron; CDw136; PTK8; 1 receptor estimulante de macrófagos (tirosina quinasa relacionada con C-Met) 3; Receptor de proteínas estimulantes de macrófagos; Proteína tirosina quinasa 8; Variante MST1R RON30; Variante MST1R RON62; Variante RON E2E3; Variante 21 RON; Antígeno CD136; EC 2.7.10; CD136, todos en forma de membrana. Los números de acceso para el gen y la proteína son NC_000003.12; NT_022517.19; NC_018914.2; NP_001231866.1; NP_002438.2. Los números de acceso se dan principalmente para proporcionar un método adicional de identificación de MST1R como diana, la secuencia real de la proteína MST1R unida por un anticuerpo puede variar, por ejemplo, debido a una mutación en el gen codificante, como las que ocurren en algunos cánceres o similares. El sitio de unión al antígeno MST1R se une a MST1R y una variedad de variantes del mismo, como las expresadas por algunas células tumorales positivas para MST1R.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a LGR4 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5777 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15,

preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR4 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5781 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5781 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15,

preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones

de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR5 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5790 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR5 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5803 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5803 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR5 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5814 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5814 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR5 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR5 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5817 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5817 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

LGR5 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5818 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5818 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente que tiene 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones,

sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a

RNF43 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5832 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5832 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a RNF43 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5836 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5836 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a ZNRF3 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5850 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a ZNRF3 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5853 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5853 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a ZNRF3 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5855 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5855 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a ZNRF3 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5884 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5884 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención también proporciona un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a ZNRF3 en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5888 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5888 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

En una realización de la invención, un anticuerpo monoespecífico que comprende dominios variables que se unen a EGFR en donde la cadena VH de los dominios variables comprende

• la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o

- la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 tiene como máximo 15, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 y preferiblemente tiene 1,2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

La invención se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39. Se mostró que los residuos de aminoácidos D43; G44, M46, F67, G90 y F91 están implicados en la unión del anticuerpo. Involucrado en no significa necesariamente que todos los residuos sean efectivamente contactados por el anticuerpo. Sin limitación a ninguna teoría, se cree que la sustitución D43A o G44A da como resultado un cambio conformacional (leve) en el epítopo y que el cambio de conformación da como resultado una unión reducida del anticuerpo al epítopo.

La interacción del anticuerpo con LGR5 no inhibe la unión de RSPO 1 a LGR5 expresada en la membrana de una célula que expresa LGR5. La interacción del anticuerpo con RSPO 1 no inhibe la unión del anticuerpo a LGR5 expresado en la membrana de una célula que expresa LGR5. Esto significa que el anticuerpo y RSPO1 no compiten entre sí por unirse a LGR5. Al menos no en el intervalo de relaciones molares indicado en este documento. La relación molar de anticuerpo a RSPO 1 es típicamente de 0.1 a 0.001 (inclusive) preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.01 (inclusive). En este rango, la unión del anticuerpo a LGR5 no inhibe (bloquea) la unión de RSPO 1 a LGR5.

Cuando en el presente documento se mencionan las relaciones molares de anticuerpo a RSPO, se prefiere que el anticuerpo esté presente en cantidades que den como resultado 40%-80% de la unión lograda cuando están presentes cantidades saturantes del anticuerpo.

Se han descrito diversos anticuerpos que se unen a LGR5. La unión de un anticuerpo a LGR5 puede bloquear la unión de una R-espondina a LGR5 o no. Se ha encontrado que los anticuerpos que bloquean la unión del ligando de R-espondina 1 a LGR5 se unen a una región que abarca la región N-terminal, la región 1 de repetición rica en leucina (LRR) y LRR2 de la proteína (Lau et al 2011; Nature vol 476; págs. 293-297 e información complementaria descrita en el mismo). Los elementos están contenidos en los aminoácidos 21-118 (inclusive) de una secuencia de proteína LGR5 como se muestra en la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39; en donde los aminoácidos 21-70 constituyen la región N-terminal, los aminoácidos 71-94 (inclusive) constituyen LRR1 y 95-118 constituyen LRR2. En la técnica sólo se han reportado unos pocos anticuerpos que no bloquean la interacción de LGR5 con R-espondina 1 y, según el conocimiento del inventor, ninguno de estos se une a la región N-terminal de LGR5.

La invención ahora proporciona una proteína que se une a un epítopo dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de una secuencia LGR5 de SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39 y cuya proteína no bloquea la unión de R-espondina 1 a LGR5.

La prueba para determinar si un anticuerpo bloquea o no la unión de una R-espondina a LGR5 preferiblemente incluye células CHO que expresan LGR5 en la membrana celular. El anticuerpo y la R-espondina a analizar se mezclan y se añaden a las células, después de lo cual se determina la unión del anticuerpo a las células. La cantidad de unión del anticuerpo a las células que expresan LGR5 en presencia de un exceso de R-espondina indica que el anticuerpo no bloquea la unión de R-espondina a LGR5. La prueba incluye además preferiblemente un anticuerpo de control que se une a LGR5 y que bloquea la unión de R-espondina a LGR5. El anticuerpo de control es preferiblemente el anticuerpo PB10261 u OMP88R20. Como se describe en los ejemplos la proteína A no bloquea la unión de R-espondina 1 a LGR5 si, en las mismas condiciones, más proteína en comparación con el anticuerpo de control puede unirse a células que expresan LGR5. Esto se evalúa preferiblemente en condiciones en las que la relación molar de proteína o anticuerpo de control a R-espondina es 1:10 o menos, es decir, 0.1 o menos; preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.001, (inclusive), preferiblemente de 0.1 a 0.01 (inclusive). La proteína preferiblemente también se une a una parte extracelular de otra proteína asociada a la membrana. En una realización preferida, la otra proteína asociada a la membrana es un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores de EGF o cMET.

La invención también proporciona una proteína que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39 y en la que la unión de la proteína a LGR5 se reduce con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, F67A, G90A y F91A. En una realización preferida, la interacción de R-Espondina (RSPO) 1 con LGR5 en una célula que expresa LGR5 no inhibe la unión de la proteína a LGR5 en más del 20%. La inhibición de la unión de la proteína a LGR5 se mide preferiblemente cuando la proteína y la RSPO 1, 2, 3 o 4 están presentes en una relación molar de 0.1 o menos; preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.001, (inclusive), preferiblemente de 0.1 a 0.01 (inclusive) (proteína: RSPO).

La invención proporciona además una proteína que puede unirse a un epítopo en LGR5 que se encuentra dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de SEQ ID NO: 1 representado en la Figura 39, y en donde la interacción de RSPO 1 con LGR5 en un LGR5 que expresa la célula no inhibe la unión de la proteína a LGR5 en más del 20% cuando la proteína y la RSPO 1 están presentes en una proporción molar de 0.1 o menos; preferiblemente en una relación molar de entre 0.1 a 0.001, (inclusive), preferiblemente de 0.1 a 0.01 (inclusive). El epítopo se localiza preferiblemente dentro de los residuos de aminoácidos 40-95 de la SEQ ID NO: 1 representada en la figura 39. La unión de la proteína a LGR5 se reduce preferiblemente con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, F67A, G90A y F91A. Esto normalmente indica que la proteína interactúa con estos aminoácidos mencionados. El cambio de estos aminoácidos altera la unión de la proteína a LGR5. Por lo tanto, es probable que estos aminoácidos sean los residuos de contacto en LGR5 para la proteína de unión. En el presente caso, los inventores consideran los residuos M46; F67, G90A y F91 como residuos de contacto. D43 y G44 también pueden ser residuos de contacto, pero también pueden ser residuos que alteran la conformación específica de otros residuos de modo que ya no puedan unirse a la proteína. Preferiblemente, la proteína puede unirse a otra proteína. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular. La proteína adicional es preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o cMET. La proteína de unión a LGR5 como se describe en el presente documento es preferiblemente un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo biespecífico.

La invención proporciona además un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21 ­ 118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la figura 39 y en la que la unión del dominio variable a LGR5 se reduce con una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, F67A, G90A y F91A; el anticuerpo biespecífico comprende además un dominio variable que puede unirse a otra proteína. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular. La proteína adicional es un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores EGF o cMET.

La unión de la proteína o anticuerpo biespecífico como se menciona aquí al miembro asociado a la membrana de la familia de receptores EGF o cMET preferiblemente reduce la señalización inducida por ligando en una célula que comprende dicho miembro asociado a la membrana de la familia del receptor EGF o cMET.

La invención proporciona un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está localizado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39.

La invención proporciona además un anticuerpo que se une a un epítopo en una parte extracelular de LGR5, en donde los residuos de aminoácidos D43; G44, M46, F67, G90 y F91 están implicados en la unión del anticuerpo al epítopo.

La invención proporciona además un anticuerpo que se une a un epítopo en una parte extracelular de LGR5, en donde una o más de las sustituciones de residuos de aminoácidos de D43A; G44A, M46A, F67A, G90A y F91A reducen la unión del anticuerpo al epítopo.

La invención proporciona además un anticuerpo que comprende un dominio variable que puede unirse a un epítopo en una parte extracelular de LGR5 cuyo epítopo está ubicado dentro de los residuos de aminoácidos 21-118 de la SEQ ID NO: 1 representada en la Figura 39, y en la que la unión del anticuerpo al epítopo se reduce mediante una o más de las siguientes sustituciones de residuos de aminoácidos D43A; G44A, M46A, F67A, G90Ay F91A.

Una proteína de membrana como se usa en este documento es una proteína de membrana celular, es decir, una proteína que se encuentra en la membrana externa de una célula, la membrana que separa la célula del mundo exterior. La proteína de membrana tiene una parte extracelular. Una proteína de membrana está al menos en una célula si contiene una región transmembrana que se encuentra en la membrana celular de la célula.

El anticuerpo preferiblemente comprende además un dominio variable adicional que puede unirse a otra proteína. La proteína adicional es preferiblemente una proteína de membrana que comprende una parte extracelular. La proteína adicional es preferiblemente un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) o cMET. El anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.

Para mayor claridad y una descripción concisa, en este documento se describen características como parte de la misma o de realizaciones separadas, sin embargo, se apreciará que el alcance de la invención puede incluir realizaciones que tengan combinaciones de todas o algunas de las características descritas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencias de aminoácidos de fragmentos VH descritos en la presente solicitud. Se indican las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, así como las regiones FR1, FR2, FR3 y FR4.

Figura 2: Secuencias de nucleótidos de ADNc que codifican VH seleccionados descritas en la presente solicitud.

Figura 3: Secuencia anotada de la cadena liviana común (cLC).

Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la región Fc (CH1-CH3) anotada de anticuerpos ensayados en la presente solicitud.

Figura 5: El efecto de los factores de crecimiento EGF y HRG sobre la morfología de los tumores en los tumores P14T y P18T. Ejemplo del efecto de los factores de crecimiento EGF y HRG sobre la morfología de los tumores en los tumores P14T y P18T. Los factores de crecimiento inducen un cambio simultáneo en el tamaño del tumor, el tamaño de la luz y la distribución de la luz. La combinación de estos tres parámetros morfológicos ubica a los organoides observados en un espacio de características únicas. La distancia euclidiana se puede calcular basándose en la combinación de estas tres características con el factor sin crecimiento (sin GF) como punto de referencia. La distancia euclidiana es entonces el cambio en la dirección X, Y y Z inducida por los tratamientos.

Figura 6: Análisis FACS de sueros de animales inmunizados con ZNRF3 que se unen a células Freestyle 293F que sobreexpresaron de manera estable el antígeno, tomado el día 35.

Los sueros se probaron en comparación con los sueros del día 0 (preinmunes) para la unión a la línea celular 293F Freestyle que expresa de manera estable el ECD de ZNRF3. Cada panel muestra una superposición de células de control (no teñidas) (rellenas de gris) y las células teñidas con los sueros respectivos (sin relleno). Los ratones están numerados L19-L24; Las tinciones de control se indican en el lado derecho de la figura n.c.: control negativo.

Figura 7: Ejemplo de tinción FACS de una mezcla de células que sobreexpresan ZNRF3 marcadas con DiD y células de estilo libre 293F no marcadas (parentales) usando preparaciones de clones de fagos monoclonales seleccionados.

Cada gráfico de puntos es una superposición de células no teñidas y células teñidas con un Fab seleccionado expresado en fagos. La mitad superior de cada panel muestra las células positivas al antígeno marcadas con DiD y la mitad inferior del panel las células de estilo libre 293F negativas al antígeno no marcadas. De los seis clones que se muestran en la Figura (marcados 1-6), cuatro son específicos de antígeno (1, 3, 4 y 6) y dos (2 y 5) no son reactivos. El control para la expresión de la proteína se tiñó con el anticuerpo dirigido a la etiqueta del epítopo derivado de cMyc y el control negativo se tiñó con los anticuerpos secundarios (anti-M13 y Strep-PE) solamente.

Figura 8: Clasificación de afinidad de IgG monovalente dirigida a hLGR5 (todo combinado con el Fragmento Fab de toxoide tetánico) en la superficie celular de células Freestyle 293F que sobreexpresan hLGR5.

Se muestra un ejemplo representativo de todo el panel. Se ensayó una serie de diluciones dobles de IgG (5 pg/ml -0.08 pg/ml) en un número fijo de células (5 x 105 células/pozo) que expresaban hLGR5 estable. Se midió la intensidad de fluorescencia media (MFI) para cada punto de datos y se representó gráficamente frente a la cantidad creciente de IgG utilizada para la tinción. A partir de cada IgG, se calculó el área bajo la curva (AUC) basándose en las curvas individuales y se utilizó para la clasificación. La tabla (panel derecho) muestra los valores de AUC de IgG biespecífica que se muestran en el gráfico (panel izquierdo). Basándose en los valores de AUC, las IgG se clasificaron por afinidad de unión a su diana respectiva.

Figura 9: Se probó la capacidad de bloqueo de rhR-espondina3 de IgG de unión monovalente de hLGR5 (todo combinado con un fragmento TT Fab) en un ELISA de bloqueo de R-espondina.

Se muestra un ejemplo representativo del panel LGR5. La unión máxima (normalizada al 0%) se estableció mediante unión no inhibida a 2 pg/ml de rhR-espondina3 recubierta usando 0.031 pg/ml de rhLGR5-Fc y detección con un anticuerpo anti-Fc. El valor de DO450nm para la unión máxima se estableció en 100%. El exceso de R-espondina3 indica la adición de un exceso de R-espondina3 (15 pg/ml) para servir como control positivo para la competencia. La IgG biespecífica, probada a 15 pg/ml, los valores de DO450nm se normalizaron en base a la señal máxima y están indicados por las barras azules. Los clones se consideraron parcialmente bloqueantes cuando el porcentaje estaba por debajo del 80% y se consideraron bloqueantes cuando el porcentaje estaba por debajo del 50%. Este ejemplo muestra un panel representativo de LGR5 dirigido a fragmentos de IgG LGR5/TT.

Figura 10: Efectos inhibidores del crecimiento del anticuerpo de referencia PG3755 (EGFR bivalente, monoespecífico) y PB10651 (EGFR/LGR5 biespecífico) en la línea tumoral P18T en presencia de 5 ng/ml de EGF en el medio de cultivo. Los anticuerpos revierten el fenotipo tumoral inducido por EGF a un fenotipo sin factor de crecimiento estimulado (primera columna). PB10651 es activo como inhibidor del crecimiento a dosis más bajas que el anticuerpo de referencia biespecífico de EGFR PG3755.

Figura 11: Ejemplo de los resultados del cribado de validación para un tumor de colon expuesto a anticuerpos biespecíficos dirigidos a EGFR/WNT y tratamientos de control. Cuanto menor sea la distancia euclidiana, más potente será el efecto del tratamiento; 1 es igual al crecimiento normal. PB10651 (anticuerpo EGFR/LGR5 con MF3755xMF5816) muestra una inhibición completa del crecimiento a la dosis probada (2 pg/ml) y supera al Cetuximab.

Figura 12: PB10651 conserva la inmunorreactividad después del marcaje con 125I.

Inmunorreactividad de la proteína marcada radiactiva. A: Ensayo de Lindmo para el brazo Fab anti-EGFR en PB10651; B: Ensayo de Lindmo para el brazo Fab anti-LGR5 de PB10651. Hubo muy poca pérdida de inmunorreactividad después del marcaje de la proteína con 125I.

Figura 13: PB10651 se une con afinidad sub-nanomolar tanto a EGFR como a LGR5.

Análisis de afinidad de la unión de PB10651 a LGR5 y EGFR. A: análisis de la unión de PB10651 a células CHO-LGR5; B: análisis de la unión de PB10651 a células c Ho -EGFR y C: análisis de afinidad de la unión de PB10651 a células DLD-1.

Figura 14: El brazo Fab anti-EGFR en PB10651 se une a residuos en el dominio III de EGFR según se determina mediante análisis de mutagénesis de escopeta.

Se representa el epítopo en EGFR reconocido por el brazo Fab anti-EGFR presente en PB10651, modelado sobre la estructura de EGFR (Li et al., 2005; pdb referencia 1YY9). Los residuos que resultaron relevantes para la unión de PB10651 se destacan en la estructura.

Figura 15: El brazo Fab anti-LGR5 en PB10651 se une a los residuos presentes en el dominio N-CAP y la primera repetición rica en leucina de LGR5, según se determina mediante análisis de mutagénesis de escopeta.

La figura muestra el epítopo en LGR5 reconocido por PB10651, modelado sobre la estructura de LGR5 en complejo con RSPO1 (Peng et al., 2013: pdb referencia 4BSR). Los residuos que se reconocen se indican en negro en la molécula LGR5 izquierda (gris claro) del dímero. RSPO1 se indica en bola y barra.

Figura 16: La versión copiada del anticuerpo anti-LGR5 OMP88R20 se inhibe de forma dependiente de la dosis para unirse a LGR5 por el ligando R-espondina1.

La versión copiada de OMP88R20 (PG7711) se ensayó para determinar la unión a la EC50 (50 ng/ml) para la unión a células que sobreexpresan LGR5 en presencia de cantidades crecientes de R-espondina1. El valor de MFI obtenido se normalizó al valor de control (sin R-espondina1).

Figura 17: El Fab MF5816 anti-LGR5 presente en PB10651 no se inhibe para unirse a LGR5 en un gran exceso molar del ligando R-espondina1.

La versión copiada de OMP88R20 (PG7711) se probó para la unión a 50 ng/ml y los biespecíficos se probaron a 100 ng/ml para la unión a células que sobreexpresan LGR5 en presencia de concentraciones crecientes de R-espondina1, o del anticuerpo de rata 1D9. La unión de los anticuerpos indicados se detectó con un anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con PE. Para cada punto de la curva, el valor de MFI obtenido se normalizó a (dividido por) el valor encontrado en la situación de control (sin R-espondina1).

Figura 18: PG3755 bivalente monoespecífico inhibe de forma potente la señalización mediada por EGFR. La proliferación (medida como recuentos de fluorescencia después de la adición de azul alamar a las células: eje Y) de las células A431 se midió en presencia de 62.5 ng/ml de EGF humano y cantidades crecientes de los anticuerpos anti-EGFR indicados. PG1337 sirvió como control no vinculante (negativo). Un número creciente de recuentos es indicativo de un número aumentado de células y, por tanto, de bloqueo de la señalización mediada por EGFR.

Figura 19: El PB10651 afucosilado se une con afinidad comparable a los ortólogos de cynomolgus tanto de EGFR como de LGR5.

Los valores de MFI obtenidos después de la tinción con el anticuerpo indicado a la concentración indicada en FACS se representan en función de la concentración de anticuerpo utilizada. Para EGFR, se utilizó cetuximab como control positivo para la unión de EGFR de cynomolgus. Para LGR5, se usó la versión copiada de hu8E11v2 (PG7543) de Genentech como control positivo para la unión de cynomolgus LGR5.

Figura 20: La tinción de organoides derivados del paciente en FACS usando anticuerpos biespecíficos anti-LGR5/EGFR guía visualiza la expresión de LGR5.

Se tiñó una muestra de organoide derivada de un paciente con cáncer colorrectal (P18) utilizando dos anticuerpos anti-LGR5 diferentes (MF5816 y MF5814) y un control negativo que reconoce la toxina tetánica (TT). La tinción del anticuerpo TT se utilizó para establecer el umbral para la tinción de los dos anticuerpos anti-LGR5. Con la tinción TT establecida en 0.8%, los anticuerpos MF5816 y MF5814 mostraron niveles de tinción comparables con 53.6% y 52.7% de las células puntuadas positivas para la expresión de LGR5.

Figura 21: Tinción y clasificación de organoides derivados del paciente utilizando anticuerpos biespecíficos anti-LGR5/EGFR biespecíficos guía enriquecidos para células que expresan LGR5 (madre cancerosa). Se utilizó una línea de organoides de cáncer colorrectal (P18T) para la tinción FACS y la clasificación del 15% superior (positivo) y del inferior (negativo) de las células teñidas identificadas por los anticuerpos anti-LGR5 MF5814 y MF5816. Se clasificaron 2000 células individuales para cada población y se usaron para generar ADNc para PCR cuantitativa. La expresión de B2M se usó como control endógeno, y la expresión del ARNm de LGR5 en la fracción positiva se representó en relación con la fracción negativa usando el método 2-AACT y el software StepOne 2.2 plus. El experimento se realizó en dos ocasiones distintas (Exp.1 y Exp. 2), con cada anticuerpo y repeticiones experimentales, mostrando un aumento en el ARNm de LGR5 en la fracción positiva en relación con la negativa. Las barras de error representan el máximo de cuantificación relativo, que se produjo como parte del análisis utilizando el software StepOne 2.2 plus.

Figura 22: Clasificación de organoide derivado del paciente para células que expresan LGR5 utilizando anticuerpos biespecíficos anti-LGR5/EGFR guía enriquecidos para células iniciadoras de tumores.

Izquierda: las imágenes de los organoides representan una de las gotas de BME y fueron capturadas usando un microscopio Olympus MVX10 MacroView. El recuadro de la imagen MF5816 muestra una vista más cercana de uno de los organoides en la gota. Derecha: gráfico de barras que representa el número de organoides contados después de dos semanas de crecimiento encontrados en la población de células LGR5 positivas y negativas.

Figura 23: El tratamiento de organoides derivados del paciente con anticuerpo biespecífico anti-LGR5/EGFR guía inhibe de forma potente el crecimiento de organoides.

Izquierda: gráficos de barras que representan el número promedio de organoides (arriba) y el tamaño del organoide (abajo) encontrados después de los diferentes tratamientos con los anticuerpos indicados (indicados debajo de los gráficos). Derecha: ejemplos representativos de imágenes obtenidas de los organoides tras los diferentes tratamientos. Se sembraron células individuales y se dejaron establecer organoides durante tres días. El día tres se retiró el medio y se reemplazó con medio que contenía los anticuerpos a una concentración de 2 pg/ml. Los organoides se cultivaron adicionalmente durante otros 7 días. El día 7, los organoides se escanearon usando un Olympus ScanR usando el objetivo lumínico x4, y el número de organoides se cuantificó usando ImageJ ejecutando una macro diseñada internamente. Los datos se presentan en relación con el control TT, y se realizó una prueba T de muestras apareadas de dos colas para evaluar las diferencias significativas entre los tratamientos. Las barras de error representan la desviación estándar. *=p<0.05 relativo a TT, **=p<0.001 relativo a TT. #=p<0.05 en relación con EGFR-TT, ##=p<0.001 en relación con EGFR-TT.

Figura 24: Los biespecíficos LGR5xEGFR potencian la reducción de la población de células no diferenciadas Se sembraron y cultivaron células individuales durante tres días antes de ser tratadas con los anticuerpos. Después de siete días, se extrajo el ARN total y se usó para un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real para detectar los niveles de ARNm de LGR5 y CK20 (un marcador de diferenciación). Las diferencias en la expresión se detectaron utilizando el método 2-AACT. Los datos se presentan en relación con el control negativo (TT-TT). El experimento se llevó a cabo en dos ocasiones distintas y se muestra el promedio de los dos experimentos. Las barras de error representan la desviación estándar de los dos experimentos.

Figura 25: Ejemplos de superaglomeraciones que indican cambios de aminoácidos que se toleran en un VH y/o CDR de la presente invención sin perder la especificidad de unión.

Figura 26: Comparación de la potencia de PB10651 frente a Cetuximab para inhibir el crecimiento de tumores y organoides derivados del paciente derivados de tejido normal in vitro.

Ejemplos de los efectos de tratamientos con rangos de concentraciones de PB10651 y Cetuximab en cultivos de organoides de organoides derivados de tejido normal y de tejido canceroso (A y B). Figura 26C: Valores de IC50 para la inhibición del crecimiento obtenidos usando tumores y organoides derivados del paciente derivados de tejido normal. La relación en la tercera columna representa la relación IC50 (Cetuximab)/IC50 (PB10651).

Figura 27: PB10651 es significativamente más potente que los anticuerpos anti-EGFR y anti-LGR5 monoespecíficos en la inhibición del crecimiento de organoides in vitro.

Tratamiento in vitro de cultivos organoides p18T (A) y C1M (B) en 3D con los anticuerpos indicados. El tamaño de los organoides se representa en función de la concentración de anticuerpo utilizada. Los anticuerpos anti-LGR5 no muestran ningún efecto sobre el crecimiento organoide;

Figura 28: PB10651 es más potente para reducir el crecimiento organoide in vitro que una mezcla de anticuerpos monoespecíficos bivalentes parentales.

La figura muestra los efectos inhibidores del crecimiento de los anticuerpos de referencia PG3755 (EGFR bivalente, monoespecífico), PG5816 (LGR5 bivalente, monoespecífico) o una combinación equimolar de los mismos y PB10651 (EGFR/LGR5 biespecífico) en la línea tumoral P18T en presencia de EGF. A. El tamaño del organoide P18T se representa como una función de la concentración de anticuerpo usada para el tratamiento. Los organoides tratados con PG5816 no mostraron inhibición del crecimiento; PG3755 redujo significativamente el crecimiento, pero no en la misma medida que PB10651. La combinación de PG3755 y PG5816 también fue significativamente menos potente que PB10651 en la inhibición del crecimiento de tumores P18T. B. Una comparación de los valores de IC50 para la inhibición del crecimiento encontrados para el tratamiento de los organoides indicados (arriba) con los anticuerpos indicados (panel izquierdo). Los valores de IC50 encontrados para PB10651 son siempre más bajos que los encontrados para la mezcla de anticuerpos parentales.

Figura 29: El tratamiento con organoide in vitro con PB10651 provoca la localización intracelular del anticuerpo que no se observa con los anticuerpos bivalentes monoespecíficos dirigidos a LGR5 o EGFR.

Después de 24 horas de tratamiento con anticuerpos, los organoides se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para IgG humana para revelar la localización (sub)celular del anticuerpo. Solo en el caso de PB10651, se observó una tinción intracelular punteada que estaba ausente en los organoides tratados con anticuerpos monoespecíficos bivalentes. En el último caso, el anticuerpo se concentró y se localizó en la membrana celular.

Figura 30: Los organoides que responden al tratamiento con PB10651 muestran una localización intracelular del anticuerpo que no se observa después del tratamiento de los organoides que no responden al tratamiento.

Después de 24 horas de tratamiento con anticuerpos, los organoides se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para IgG humana para revelar la localización (sub)celular del anticuerpo. Los diferentes organoides que respondieron al tratamiento con PB10651 (C0M, C55T, P18T, C31M) mostraron tinción intracelular de anticuerpos, mientras que los organoides que no respondieron mostraron localización de PB10651 en la superficie celular (C28T, P19Tb, P8T, C51N).

Figura 31: Mapas de vectores de plásmidos MV1453 y MV1626.

Figura 32: Mapa de vectores de MV1622 (vector de expresión RMD).

Figura 33: Perfil CEX-HPLC de PB10651 afucosilado.

Figura 34: Resultados del ensayo reportador ADCC de PB10651 (mejorado con ADCC) en comparación con PB10651 (no mejorado) y PG1337 (control).

Figura 35: Expresión de EGFR y LGR5 en modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX).

La expresión de los genes EGFR y LGR5 en el estudio en vivo y los tumores de stock congelados se midió mediante PCR en tiempo real TaqMan. La expresión se representa como el valor de transformación logarítmica obtenido con el método 2-AACT, utilizando GAPDh como gen de mantenimiento. Los tumores extraídos de animales vivos presentaron valores de expresión génica similares a los tumores madre de referencia.

Figura 36: PB10651 inhibe el crecimiento in vivo de PDX.

Los modelos de PDX colorrectal se trataron semanalmente (flechas) con PB10651 o Cetuximab o PBS. Se siguió el crecimiento del tumor (indicado en mm3) durante y después del cese del tratamiento. Los modelos que responden a cetuximab (un mutante WT y un KRAS G13D) también respondieron a PB10651. Uno de cada tres modelos mutantes de KRAS G12V/D que no respondieron a Cetuximab mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral con PB10651.

Figura 37: El tratamiento con PB10651 provoca una reducción significativa en el número de células que proliferan en el tumor. Tinción inmunohistoquímica de tumores P18 después de 48 horas de tratamiento (2 |jg/ml). El panel superior muestra un marcador de proliferación (ki67) y el panel inferior un marcador de apoptosis (caspasa-3 escindida). Las imágenes se tomaron usando un objetivo x20, la tinción marrón indica expresión, con los núcleos teñidos con hematoxilina.

Figura 38: PB10651 es significativamente más potente que cetuximab para inhibir el crecimiento de organoides in vivo.

A El efecto de la dosificación semanal de anticuerpos sobre el crecimiento del xenoinjerto P18.

Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de 50 mm3, comenzaron los tratamientos con anticuerpos (día 0) y se representa gráficamente el cambio relativo de volumen. Los ratones se trataron una vez a la semana (indicado por flechas). Se promediaron y representaron todos los volúmenes tumorales dentro de un grupo de tratamiento; el número de xenoinjertos en cada momento se representa en la tabla. Las barras de error representan el error estándar de la media. *=P<0.01 en comparación con PBS, #=P<0.01 en comparación con cetuximab según lo determinado por análisis de prueba t pareada.

B. El efecto de la dosificación semanal de anticuerpos sobre el crecimiento del xenoinjerto C31M.

Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño medio de 30 mm3, comenzaron los tratamientos con anticuerpos (día 0) y se representa gráficamente el cambio relativo de volumen. Los ratones se trataron una vez a la semana (indicado por flechas). Se promediaron y representaron todos los volúmenes tumorales dentro de un grupo de tratamiento; el número de xenoinjertos en cada momento se representa en la tabla. Las barras de error representan el error estándar de la media. *=P<0.01 en comparación con PBS, #=P<0.05 en comparación con cetuximab según lo determinado por análisis de prueba t pareada.

Figura 39: Secuencia de aminoácidos anotada de LGR5 humano.

La guía indica la secuencia de aminoácidos que se corta de la proteína madura, la región N abarca los aminoácidos 21-70 inclusive; LRR significa región de repetición rica en leucina, LLR1 es la región 1 de repetición rica en leucina; LRR2 es la región de repetición 2 rica en leucina, etc. LLR1 comienza en el aminoácido 71 y termina en el aminoácido 94 (inclusive); LLR2 comienza en 95 y termina en 118 inclusive. CRL es la región enlazadora rica en cisteína. TM indica las diversas regiones transmembrana y C-TERM el extremo c-terminal de la proteína. Las partes anotadas juntas forman una secuencia consecutiva designada SEQ ID NO: 1. Esta secuencia completa es SEQ ID NO: 1 esta numeración prevalece incluso si por alguna razón otra secuencia también se enumera como SEQ ID NO: 1.

Figura 40: Secuencia de aminoácidos anotada de EGFR humano de tipo salvaje (GenBank NM_005228).

Se indican el péptido de señalización, la parte extracelular, la hélice transmembrana prevista y la tirosina quinasa intracelular, incluida la cola C-terminal. Las partes anotadas juntas forman una secuencia consecutiva designada SEQ ID NO: 2. Esta secuencia completa es SEQ ID NO: 2 esta numeración prevalece incluso si por alguna razón otra secuencia también se enumera como SEQ ID NO: 2.

Ejemplos

Como se usa en el presente documento, "MFXXXX" en donde X es independientemente un número 0-9, se refiere a un Fab que comprende un dominio variable en donde VH tiene la secuencia de aminoácidos identificada por los 4 dígitos. A menos que se indique lo contrario, la región variable de la cadena liviana del dominio variable normalmente tiene una secuencia de la Figura 3. La cadena liviana tiene una secuencia como se muestra en la Figura 3. "MFXXXX VH" se refiere a la secuencia de aminoácidos de la VH identificada por los 4 dígitos. MF comprende además una región constante de una cadena liviana y una región constante de una cadena pesada que normalmente interactúa con una región constante de una cadena liviana. PG se refiere a un anticuerpo monoespecífico que comprende cadenas livianas y pesadas idénticas. PB se refiere a un anticuerpo biespecífico con dos cadenas pesadas diferentes. La región VH/variable de las cadenas pesadas difiere y típicamente también la región CH3, en la que una de las cadenas pesadas tiene una mutación KK de su dominio CH3 y la otra tiene la mutación DE complementaria de su dominio Ch 3 (véase como referencia PCT/NL2013/050294 (publicado como WO2013/157954). En PB, PG y otros códigos, la indicación numérica a veces va seguida de una indicación del lote de producción. Por ejemplo, PB10651p06 se refiere al lote 6 de PB10651.

Ejemplo 1

Métodos, materiales y cribado de anticuerpos

Líneas celulares:

Se obtuvieron células Freestyle 293F (cat. Nr. P/n51-0029) de Invitrogen y se mantuvieron de forma rutinaria en medio 293 FreeStyle. Las líneas celulares HEK293T (ATCC-CRL-11268) y CHO-K1 (DSMZ ACC110) se adquirieron de ATCC y se mantuvieron de forma rutinaria en DMEM/F12 (Gibco) complementado con L-glutamina (Gibco) y FBS (Lonza).

Generación de vectores de expresión LGR4, LGR5, ZNRF3 y RNF43 recombinantes humanos y de ratón

LGR4 humano de longitud completa (h) estaba presente en el vector pEF1_Myc/His (Invitrogen), que contenía 2 etiquetas FLAG y 2 etiquetas Ha (pEF1_hLGR4-FLAG-HA), y se clonó en pVax1 (Invitrogen), lo que dio como resultado pVax1_hLGR4-FLAG-HA. La secuencia del inserto se verificó mediante comparación con la secuencia de referencia NCBI NM_018490. La secuencia contenía las siguientes desviaciones a nivel de aminoácidos: P2A en el péptido de señalización. El inserto del constructo pEF1_hLGR4-FLAG-HA se volvió a clonar en pVax1. Alternativamente, el hLGR4 de longitud completa en pVax1 fue reemplazado por una versión truncada de hLGR4; hLGR4 (ECD) -GPA33 (TM)-FLAG que da como resultado pVax1_hLGR4 (ECD)-GPA33 (TM)-FLAG.

Inserto de secuencia de aminoácidos de longitud completa hLGR4-FLAG-HA (tanto en pEF1_Myc/His como en pVax1) para expresión en la superficie celular

MAGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCnGDRRY^DCSGKGLTAYTEGLSAFTQALDTSM NNITQLPEDAFKNFPFLEELQLAGNDLSFIIIPKALSGLKELKVTTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQS LRLDANHTTSVPEDSFEGLVQLRFrLWLDDNSLTEYTYTrPLSNLPTLQALTLALNKTSSTPDFAFTNL SSL V VLHLHNNK1RSLSQH CFD GLDN LETLELN YN NLGEFPQ A1KALPSLKELGEHSNSIS'V1PDGA FDGNPLLRTIHLYDNPLSFVGNSAFHNLSDLHSLVIRGASMVQQFPNLTGTYYILESLTLTGTKISSI PNNLCQECjKMLRTLDLSYNNIRDLPSFNGCHALEEISLQRNQIYQIKEGTFQGLISLRILDLSRNLI HETHSR AF ATT .GPTTN1 F)VSF\'FT .TSFPTEG1 ,NGT ,NQT ,KT A'GNFKl K F AT. AAFT )FYAIT ,RST .SVPYA YQCCAFVVGCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQ11IHCTPSTGA1',KPCE YLLGSWMIRLTAYVFIFLVALFFNLLYlLTTFASCTSLPSSIvLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSW GKFAKFGIWWKTGSGCKVAGFI .AVFSSKSAIFl ,1.MI .ATVKRSI .SAKDIMKNGKSNH1.KQFRVAAI .1, AFT jG ATVAG CFPLFETRGE YS ASPT jCFPFPTGE TPSLGFTVTI AG J jNSI jAFT jLM AA7 YTKLY CNLEKE DLSENSQSSMllvHVAVVLlFTNClFFCPVAF’FSFAPUTAlSlSPElMKSV'rUFFPLPACLNPVLYVFF NPIvFKEDWIYLLKRRVTIÍKSGSVSVSISSQGGCLEQDFYYDCGMY'SHLQGNLTVCDCCESFLLTKP VSCKHL1KSHSCPALAVASCQRFEGYWSDGGTQSAHSDYADEEDSFVSDSSDQVQACGRACFYQS RGFPTAGÍYAYNLPRVKDSRDYKDDDDKAGADYKDDDDKLDGGYPYDYT'DYAAGAYPYDVPDYA De los cuales:

M A G P LG LLC FLA LG LLG S A G P S G A : péptido de señalización

AP P LC A A P C S C D G D R R V D C S G K G LTA V P E G LS A FTQ A LD IS M N N ITQ LP E D A FK N FP FLE E LQ LA G N D L S F IH P K A L S G LK E LK V LT LQ N N Q LK T V P S E A IR G LS ALQ SLR LD ANHT TSVP ED SFE G LV Q LR H L W L D D N S L T E V P Y H P L S N L P T L Q A L T L A L N K IS S IP D F A F T N L S S L W L H L H N N IG R S L S Q H C F D G L D N LE T L D LN Y N N LG E F P Q A IK A LP S L K E LG F H S N S IS V IP D G A F D G N P L L R T IH L Y D N P L S F V G N S A FPTNLSDLHSLVIRG A S M V Q QFPNLTGTVFTLE S L T LT G T K IS S IP N N L GQE Q K M LR T LD LS YNNT RD LP S F N G C H A L E E IS L Q R N Q IY Q IK E G T F Q G LIS L R ILD LS R N L IH E IH S R A F A T LG P IT N LD V S F N E L T SFPTEGLNGLNQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFWGCDSYANLNTEDNSLQD HSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSWMIRLTVWFIFLVALFFNLL VILTTFASCTSLPSSKLFIGLISVSNLFMGIYTGILTFLDAVSWGRFAEFGIWWETGSGCKVAGFLAV FSSESAIFLLMLATVERSLSAKDIMKNGKSNHLKQFRVAALLAFLGATVAGCFPLFHRGEYSASPL

CLPFPTGETPSLGFTVTLVLLNSLAFLLMAVIYTKLYCNLEKEDLSENSQSSMIKHVAWLIFTNGIF

FCPVAFFSFAPLITAISISPEIMKSVTLIFFPLPACLNPVLYVFFNPKFKEDWKLLKRRVTKKSGSVS VSISS QGGCLEQDF YYD G GM YSFTLQGNLTV CD CCESFLLTKP VS CKHLI KSHS CPALAVAS C QRPE GYWSI)<;GTQSAHSI)VAI)EEI)SFVSI)SSI)QVQA( GKAGFVQSHGFPIA’RYAYNEPKVKI): I lLGIM

SU: región enlazadora

DYKDDDDK: ítiqueta FLAG

AGA: región enlazadora

DYKDDDDK: etiqueta FLAG

^{l d g g} : región enlazadora

YPYDVPDYA: etiqueta HA

AGA: región enlazadora

YPYDVPDYA: etiqueta HA

Inserto de secuencia de aminoácidos hLGR4(ECD)-GPA33-FLAG en pVaxI para expresión en la superficie celular: MPGPLGLLCFLALGLLGSAGPSGAAPPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEG LSAFTQAEDISMNNITQLPEDAFKNPPPEEELQI ^jAGNDESPI 11PKALSGLKEEK VLTLQNNQLKTVPSEAIRGLSALQSLRLDANHITSVPEDSFEGLVQLRHLW LDD NSETEVPVIIPESNEPTLQAETEAENKISSIPDPAPTNESSEVVEIILIINNKIRSES QHCFDGLDNLETLDLNYNNLGEFPQAIKALPSLKELGFHSNSISVIPDGAFDGN P U JRTIHLYDNPTJSFVGNSAFHNTJSDLHSTJVTRGASMVQQFPNLTGTVHTJESTJT LTGTKISSIPNNLCQEQKM LRTLDLSYNNIRDLPSFN GGHALEE1SLQRNQ1YQI KEGTFQG LISLRILDLSRNLIHEIHSRAFATLG PITNLDVSFNELTSFPTEGLNCL NQLKLVGNFKLKEALAAKDFVNLRSLSVPYAYQCCAFW GCDSYANLNTEDNSL QDHSVAQEKGTADAANVTSTLENEEHSQIIIHCTPSTGAFKPCEYLLGSW MIR VAEYVGIAVGVVAAU IIGII lYCCCCRGKDDNTEDKEDARPNREAYEEPPEQLRE LSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQDYKDDDDK

De los cuales:

APPLCAAPCSCDGDRRVDCSGKGLTAVPEGLSAFTQALDISM NNITQLPEDAFK

N FPFLEELQ LAG N D LSFIH PKALSG LKELKVLTLQ N N Q LKTVPSE AIR G LSALQ

SLR LD AN H ITSVPED SFEG LVQ LR H LW LD D N SLTEVPVH PLSN LPTLQ ALTLAL

N K IS S IP D F A FTN LS S LW LH LH N N K IR S LS Q H C FD G LD N LE TLD LN Y N N LG E F

PQ A I KALPS LKELG FHSNSIS VIPD GAFD G N PLLR TIH LYD NPLSFVGN S A F H N L

SD LHSLVIR G ASM VQ Q FPNLTG TVH LESLTLTG TKISSIPN N LC Q EQ KM LRTLD

LSYN N IR D LPSFN G C H ALEEISLQ R N Q IYQ IKEG TFQ G LISLR ILD LSR N LIH E IH

SR AF AT LG PITN LD VS FNE LTS F PTE GLN G LN Q LK LV G N FK LK E A LA A K D FV N L

RSLSYPYAYQCCAFW GCDSYANLNTEDNSLQDHSVAQEKGTADAANVTSTLEN

EEIISQ IIIH C TPSTG AFKPC EYLLG SW M IR : hEGR/1(KCR)

V A LY V G IA V G W A A LIIIG IIIY C C C C R G K D D N TE D K E D A R P N R E A Y EEPPEQLRE

DYKDDDDK: F ^{l a g}

LGR5 humano

LGR5 humano de longitud completa (h) estaba presente en el vector pEF1_Myc/His (pEF1_hLGR5-FLAG-HA), que contenía 2 etiquetas FLAG y 2 etiquetas HA, y se clonó en pVax1 (Invitrogen), dando como resultado pVax1_hLGR5-FLAG-HA. La secuencia se verificó mediante comparación con la secuencia de referencia NCBI n M_003667.3. El inserto del constructo pEF1_hLGR5-FLAG-HA se reclonó en pVax1, dando como resultado pVax1_hLGR5-FLAG-HA. Alternativamente, el hLGR5 de longitud completa en pVax1 fue reemplazado por una versión truncada de hLGR5; hLGR5(ECD)-GPA33(TM)-FLAG que da como resultado pVax1_hLGR5 (ECD)-GPA33 (TM) -FLAG.

Inserto de secuencia de aminoácidos de longitud completa hLGR5-FLAG-HA (tanto en pEF1_Myc/His como en pVax1) para expresión en la superficie celular MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGOPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSV FTSYLDLSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTE AEQNERSEQSEREDANFrTSYVPPSCFSGRHSERHLWEDDNAETETPVQAFRSRSARQAMTEAENKT FLFLlPDYAFGNLSSLVVLHLFLNNEIFLSEGiíKCFDGLFLSLETLDLNYNNLDEFPTAlRTLSNLKELGF IISNNIRSIPEKAFVGNPSLITIIIFYDNPIQFVGRSAFQIILPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLES LTLTGAQlSSLPQ'rVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQlvLQKIDLKHNElYElKVDTFQQLLS ERSENEAWNKEAnFrPNAFSTEPSETKEDLSSNELSSFPTTGEFrGETFrLKETGNFrAEQSETSSENFPEE KViEMPYAYQOCAFGVOENAYlüSNQVVNKGDNSSMDDLHKKDAGMFQAQDERDLEDFLLDFEE DT.K \T JTSVQCSPSPGPFKPCETTT ,TT)GWT TRR AAYTT AVE AETCNATA’TSTYTRSPT AYSPTKT.T Ji'AlA AVNMLTGVSSAVLAGVDAFTFGSFARHGAWWENGVGCUV1GFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSA TCYSAKFETKAPFSSTjKVTTTJjCATJjATjTMAAVPLTjGGSKYGASPRCRPRPFGEPSTMGYTVrV'AETRRN SLCFLMMTIAYTIvLYCNLDKGDLENIWDCSMY^vHIALLLFTNCILNGPVAFLSFSSLINLTFISPEM KFTEEYAATEPAíG.NPERYU.FNPFrFKEDEVSERKQTYVWTRSKFrPSEMSTNSDDYTÍKQSCnSTQAE mTSSSITYDLFPSSVPSPAYPYTESCHLSSVAFVPCLAUDYKDDDDlíAGADYKDDDDKLDGGYP YnYHiYAAGAYPYUYPDYA

De los cuales:

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATG: péptido de señalización GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSMNNISQLLPNPLP SLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKYGAILQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYV PPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIPl )YAF(’3NLSSI A’VLHLHN NRIFtSLGKKCFDGLFtSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFFtSNNIRSIPEKAFVGNPSLITI HFYDNPTQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQWCNQLPN LQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSLNLAWNKIAIIHPNAFSTL PSLTKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENA YKISNQWNKGDNSSMDDLFnvKDAGMFQAQDERDLEDPLLDFEEDLIYALHSAQCSPSPGPFKPCE HLLDGWLIRIGVWTIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIGVTAAVNMLTGVSSAVLAGVDAFT FGSFARHGAWWENGVGCFTVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSAKYSAKFETKAPFSSLKVIILL CALLALTMAAVPLLGGSTYYGASPLCLPLPFGEPSTMGYMVALILLNSLCFLMMTIAYTKLYCNEDK GDLENIWDCSMVKHIALLLFTNCILNCPVAFLSFSSLINLTFISPEVIKFILLVVVPLPACLNPLLYIL FNPHFKEDLVSLRKQTYVWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSITYDLPPSSVPSPA YPYTESÍ'Í1L.SSYAFYPCL: hL( iR5

AR: Región enlazadora

DYKDDDDK: Etiqueta FLAG

A G A : Región enlazadora

D Y K D D D D K : Etiqueta FLAG

L D G G : Región enlazadora

Y P Y D V P D Y A : Etiqueta HA

A G A : Región enlazadora

Y P Y D V P D Y A : Etiqueta HA

Inserto de secuencia de aminoácidos hLGR5(ECD)-GPA33(TM)-FLAG en pVaxI para expresión en la superficie celular:

MDTSRLGVLLSLPVLLQLATGGSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCS DLGLSELPSNLSVFTSYLDLSM NNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKG AFTGLYSLKVLMLQNNQLRHVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLH SLR HLW LD D N ALTEIPVQ AFR SLSALQ AM TLALN KIH H IPD YAFG N LSSLW LH LHN N RiH SLG KKC FüG LH SLETLDEN YN NED EFPTAiR TESNLKELG FHSN N lR SIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPIQFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTG TANLESETETGAQTSSLPQTVCNQLPNEQVEDESYNEEEDEPSFSVCQKLQKTnE RHNEIYEIKVD TFQ Q LLSLR SLN LAW NKIAIIH PN AFSTLPSLIKLD LSSN LLSSF

P iTG LI IG LTIILKLTG NIIALQ SL1SS EN FPE LKV IEM P YAYQ GCAFGVGEN AYK1S NQWNKGDNSSMDDETTKKDAGMFQAQDERDLEDFLEDEEEDEKALTTSVQCSP SPG PFKPC EHLLD G W LIR VALYVG IAVG W AALIIIG IIIYCC C CR G KD D NTEDKE

l)ARPNREAYEEPPEQEREESREREEEI)l)YRQEEQRSTGRESPm iEl)Q I)YKI)l)n DK

De los cuales:

MDTSRLGVI A ,S I.PVLLQLATG: péptido de señalización GSSPRSGVLLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSM NNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGAFTGLYSLKVLMLQNNQLRHV PTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTEIPVQAFR SLSALQAMTLALNKTHHTPDYAFGNLSSLWLHLHNNRrHSLGKKCFDGLHSLE TLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELGFHSNNIRSIPEKAFVGNPSLITIHFYDNPI QFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPDLTGTANLESLTLTGAQISSLPQTVC NQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSL NLAWNKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPITGLHGLTHLKLTGNHALQSL ISSENFPELKVIEMPYAYQCCAFGVCENAYKISNQWNKGDNSSMDDLHKKDAG MFQAQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCEHLLDGWLIR:

hEGRS (ECD)

VALYVGIAVGWAALIIIGIIIYCCCCRG KDDNTEDKEDARPN REAYEEPPEQLRE LSREREEEDDYRQEEQRSTGRESPDHLDQ: Secuencia de GPA33 que contiene la

región TM

DYKDDDDK: F^l AG

Ratón LGR5

El ADNc que codifica LGR5 de ratón (m) de longitud completa (FL) estaba presente en pEF1_Myc/His (Invitrogen), que contenía una etiqueta cMyc y una HIS (pEF1_mLgr5-Myc-HIS). La secuencia de ADNc de mLgr5 se verificó mediante secuenciación y comparación con la secuencia de referencia NCBI NM_010195.2.

Secuencia de aminoácidos de ratón de longitud completa (m) Inserto Lgr5-Myc-HIS en pEF1_Myc/His para expresión en la superficie celular MDTSCYmiTYSTYATYQTAAAGSSPGPDATPRGCPSHCITCELDGRMELRYTiCSDLGESEEPSNESV FTSYLDLSMNN1SQLPASLLFIKLCFLEELRLAGNALTFÜPKGAETGLFISLKVLMLQNNQLEQVPEE AEQNERSRQSERLDANHTSYVPPSCFSGRHSERFÍTAVRDnNALTDVPVQAFRSESAEQAMTRAENKT HHIADYAFGNLSSLVVLHLHNNRIHSLGIAXCFDGLHSLETLDLNYNJSILDEFPTAIKTLSNLKELCtF HSNNTRSTPFRAFVGNPSUTTHFYTíNPTQFA'GVSAFQHT.PFT.RTT.TT.NGASHITEFPHTAGTATT.FS LTLTGjYKISSLPQAVCDQLI'NLQVLDLSYNLLEDLI'SLSGCQKLQKIDLRIINEIYEIKGSTFQQLFN ERSENTAWNKTATTHPNAFSTTIPSTJKEDLSSNT.ESSFPVTGEFrGETTTLTa/rGNRAEQSUPSANFPE LK11EMPSAYQCC:A1'’GGCENVYK1SNQWJMKDDGNSVDDLH1ÜÍDAGLFQVQDERDLEDFLLDFEE DLIGALIISVQCSPSPGPFIGXEIILFGSWLIRIGAYGTAYYALSCNALVALTVFRTPLYISSIKLLIGYl A\AT>ILMGVSSAYYAAYDAFTFGRFAQHGAWWEDGIGOQIYTGFLSIFASESSIFLLTLAALERGFSV TWSSKFEAlvAPIYSLRAFVRJYAGJATYTATTPTYGGSKYNASPT/YIPEPFGEPSTTGYMVATAYENS LCFLIMTIAYTKLYCSLEKGELENLWDCYSMAGvHIALLLFANGILYGPVAFLKFSSLLNLTFLSPDAlK FILLAlWLPSCLNPLLYIYTNPIIFKEDMGSLGiaiTRFWMRSKILYSLLSINSDriATÍKRSCESTQ.ALV SFTHASIAYDLPSTSGASPAYTMTESOHLSSVAFYTOLAAARGHPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHH I I

De los cuales:

GSSPGPDAIPRGCPSHCHCELDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVTTSYLDLSMNNISQLPASLLH

RLCFLEELRLAGNALTHIPKCtAFTGLHSLKVLMLQNNQLRQVPEEALQNLRSLQSLRLDANHISYV

PPSCFSGLHSLRHLWLDDNALTDVPVQAFRSLSALQAMTLALNKIHHIADYAFGNLSSLWLHLHN

NRIHSLGKKCFDGLHSLETLDLNYNNLDEFPTAIKTLSNLKELGFHSNNIRSIPERAFVGNPSLITI

HFYDNPIQFVGVSAFQHLPELRTLTLNGASHITEFPHLTGTATLESLTLTGAKISSLPQAVCDQLPN

LQVLDLSYNLLEDLPSLSGCQKLQKTDLRHNEIYEIKGSTFQQLFNLRSLNLAWNKIAIIHPNAFST

LPSLTKLDLSSNLLSSFPVTGLHGLTHLKLTGNRALQSLIPSANFPELKIIEMPSAYQCCAFGGCENV

YKISNQWNKDDGNSVDDLHKKDAGLFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPCE

HLFGSWURIGVWTTAVLALSCNALVALTVFKTPLYISSIKLLIGVIAWDILMGVSSAVLAAVDAFTF

GRFAQHGAWWEDGIGCQIVGFLSIFASESSIFLLTLAALERGFSVKCSSKFEVKAPLFSLRAIVLLCV

LLALTIATIPLLGGSKYNASPLCLPLPFGEPSTTGYMVALVLLNSLCFLIMTIAYTKLYCSLEKGELE

NLWDCSMVKHIALLLFANCILYCPVAFLSFSSLLNLTFISPDVTKFILLVTVPLPSCLNPLLYIWNPH

FTÍEDMGSLGKHTRFWMRSKHASLLSINSDDVEKRSCESTQALVSFTHASIAYDLPSTSGASPAYPM

TES(’HLSS V AFV'P(1L: niLC.Rf) (FL)

l l l l l l l l l l l l : etiqueta Hexa His

Clonación del ADNc que codifica el ZNRF3 humano

Se usó ADNc que codifica el (h)ZNRF3 humano (Genbank NM_001206998.1) como plantilla para amplificar partes específicas del ADNc (el dominio extracelular (ECD): aminoácidos 1-219, o la parte ECD-TM (mutante de truncamiento): aminoácidos 1-256). Para poder expresar la proteína diana en la superficie de las células negativas al antígeno y poder generar clones de células estables, el ADNc que codifica el ECD de hZNRF3 se clonó en pDisplay (pDisplay_hZNRF3(ECD)-cMyc-PDGFR (TM)) y se clonó un mutante de truncamiento (ECD con la región TM autóloga) en pADNc3.1 (pADNc3.1_hZNRF3 (ECD-TM)). El constructo pDisplay permite la confirmación de la expresión de la superficie de la proteína a través de una etiqueta de epítopo extracelular derivada de cMyc. Se diseñaron, sintetizaron y utilizaron cebadores específicos para amplificar las partes específicas de hZNRF3. Estos luego se clonaron en pDisplay (solo el ECD), lo que resultó en pDisplay_hZNRF3(ECD)-cMyc-PDGFR(TM) y en pADNc3.1 (ECD con región TM), dando como resultado pADNc3.1_hZNRF3(ECD-TM) para la expresión en células (antígeno-negativas).

Clonación del ADNc que codifica ECD de ZNRF3 de ratón y ECD de RNF43 humano y producción de proteína recombinante

Los ADNc que codifican el ECD de ZNRF3 de ratón (m) (Genbank NM_001080924.2, aminoácido 53-205, el péptido de señalización utilizado se deriva de la cistatina) y el ECD del RNF43 humano (GenBank NM_017763, aminoácido 24-109, que contienen la secuencia líder de cistatina) se usaron para generar proteínas etiquetadas con his purificadas recombinantes que consisten en los ECD de las dianas, en el vector pUPE (U-Protein Express BV). En resumen: los constructos (Peng et al.2013 Plos ONE 8:2-10) se transfectaron en células Hek293E (293 c18 At Cc , CRL-10852) y después de una semana de producción, se recogió el sobrenadante que contenía proteínas. Las proteínas marcadas con hexa HIS se purificaron mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados) y filtración en gel. Otro ADNc que codifica el ECD (codón optimizado) de ZNRF3 de ratón se hizo sintéticamente y se clonó en marco con una etiqueta de epítopo derivado de cMyc y la región transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) en pDisplay para la expresión en la superficie celular (pDisplay_mZnrf3-cMyc-PDGFR (TM)).Clonación del a Dnc que codifica el RNF43 humano

El ADNc que codifica el (h)RNF43 humano (GenBank NM_017763) se usó como plantilla para amplificar partes específicas del ADNc (el dominio extracelular (ECD): aminoácido 1-199, o la parte e CD-TM (truncamiento mutante): aminoácido 1-222). Para poder expresar la proteína diana en la superficie de las células negativas al antígeno y poder generar clones de células estables, el ADNc que codifica el ECD de hRNF43 se clonó en pDisplay (pDisplay_hRNF43(ECD)-cMyc-PDGFR(TM)) y se clonó un mutante de truncamiento de hRNF43 (ECD con la región Tm autóloga) en pADNc3.1 (pADNc3.1_hRNF43(ECD-TM)). El constructo pDisplay permite la confirmación de la expresión de la superficie de la proteína a través de una etiqueta de epítopo extracelular derivada de cMyc. Se diseñaron, sintetizaron y utilizaron cebadores específicos para amplificar las partes específicas de hZNRF3. A continuación, estos se clonaron en pDisplay (solo el ECD, con el propósito de inmunización) y en pADNC3.1 (ECD con región TM) para la expresión en células (antígeno negativas) y la generación de clones celulares que expresan de manera estable la diana.

Clonación del ADNc que codifica RNF43 de ratón

El ADNc que codifica el ECD de ratón (m)RNF43 (Genbank NM_172448.3, aminoácido 1-199) se ordenó como un gen sintético y se clonó en marco con una etiqueta de epítopo derivada de cMyc y la región transmembrana del Receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) en pDisplay para la expresión en la superficie celular pDisplay_mRnf43-cMyc- PDGFR(TM).

ZNRF3 humano (ECD) en pDisplay secuencia de aminoácidos para la expresión en la superficie celular:

MRPRSGGRPGATGRRRRRLRRRPRGLRCSRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAAR AKETAFVEW LFESSPSGDYTTYTTGLTGRFSRAGATLSAEGEIVQMHPLGLCN NNDEEDLYEYGW VGW KLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSEN PEAIDQLNQGSEDPLKRPW YVKGADAIKLM NIVNKQKVARARIQHRPPRQ PTE

Y lG )M Vl)EQ KEISEEl)LN AVG Q l)TQ EVI VVP1ISEPPKVVVISAI EAEVVET[ ISE11E IMEWQKKPR

De los cuales:

KETAFVEW LFESSPSGDYTTYTTGLTGRFSRAGATLSAEGEIVQMHPLGLCNN NDEEDLYEYGW VGW KLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSENP EAIDQLNQG SEDPLKRPW YVKG ADAIKLM NIVNKQKVARARIQHRPPRQ PTEY FDM:

el ECD de ZNRF3 VD humano: aminoácidos que están codificados por sitios de clonación

EQKLISEEDL: etiqueta de epítopo derivada de cMyc NAVGQDTQEVIWPHSLPFKWVISAILALWLTNSUIUMLWQKKPR: secuencia PDGFR que contiene la región TM Secuencia de aminoácidos mutante de truncamiento de ZNRF3 humano para expresión en la superficie celular: MRPRSGGRPGATGRRRRRLRRRPRGLRCSRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAAR AKETAFVE W L F E S S PS GD YTTYTTGLTGRFSRAGATLS AE GE IVQM HPLGLCN NNDEEDLYEYGW VGW KLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSEN PEA1DQLNQGSEDPEKRPVVYVKGADA1KLMN1VNKQKVARAR1QHRPPRQPTE YFD M G IFLAFFVW SLVC LILLVKIKLKQ R R SQ N SM N R PAV

De los cuales:

KETAFVEW LFESSPSGDYTTYTTGLTG RFSRAG ATLSAEGEIVQM HPLGLCNN NDEEDLYEYG W VG W KLEQ PELDPKPCLTVLG KAKRAVQ RG ATAVIFDVSENP EAIDQ LN Q G SEDPLKR PW YVKG AD AIKLM NIVNKQ KVAR ARIQ H RPPRQ PTEY FD; ECD de ZNRF3 humano

MGIFLAFFVVVSLV: región TM prevista

CLILLVKIKLKQRRSQNSMNRPAV: Cola intracelular

ZNRF3 ECD-His de ratón en la secuencia de aminoácidos soluble pUPE para la expresión de proteína soluble: GSKETAFVEW LFESSPSGDYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLC NNNDEEDLYEYGW VGW KLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAV1FDVSE NPEATDQT.NQGSEDPT.KRPWYVKGADATKEMNTVNKQKVARARTQHLAAAHH H H H H

De los cuales:

GS: aminoácidos codificados por sitios de clonación.

K E T A F V E W LFE S S P S G D Y TTH TTG LT G R FS R A G A M LS A E G E IV Q M H P LG LC N N N D E E D LY E Y G W V G W K LE Q P E LD P K P C LT V LG K A K R A V Q R G A T A V IF D V S E N P E A ID Q LN Q G S E D P LK R P W Y V K G A D A IK LM N IV N K Q K V A R A R IQ H L : ECD de ZNRF3 de ratón

AAA: aminoácidos codificados por sitios de clonación

HHHHHH: etiqueta Hexa His

Secuencia de ZNRF3 de ratón (m) en pDisplay secuencia de aminoácidos expresada en la superficie celular: MRPRSGGRPGAPGRRRRRLRRGPRGRRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARAKE TAFVEW LFESSPSG DYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLCNNN UEEDLYEYGWVGVVKLEQPELDPKPCLTVEGKAKRAVQRGATAV1FUVSENPE AIDQLNQG SEDPLKRPW YVKG ADAIKLM NIVNKQ KVARARIQ HLPPRQ PTEYF D M V D E Q K LIS E E D LN A V G Q D T Q E V IW P H S LP F K V W IS A ILA LW LT IIS L IIL IM EWQKKPR

De los cuales:

MRPRSGGRPGAPGRRRRRLRRGPRGRRLPPPPPLPLLLGLLLAAAGPGAARA: péptido de señalización KETAFVEW LFESSPSGDYTTHTTGLTGRFSRAGAMLSAEGEIVQMHPLGLCN NNDEEDLYEYGW VGW KLEQPELDPKPCLTVLGKAKRAVQRGATAVIFDVSEN PEA1DQLNQGSEDPLKRPVVYVKGAUA1KLMN1VNKQKVARAR1QIILPPRQPTE YFDM: ECI) mZNRF3

VD: aminoácidos codificados por sitios de clonación.

EQKLISEEDL: etiqueta de epítopo derivada de cMyc NAVGQDTQEVIWPHSLPFKVWISAILALWLTIISUIUMLWQKKPR: secuencia PDGFR que contiene la región TM RNF43 humano en pDisplay secuencia de aminoácidos para expresión en la superficie celular:

MSGGHQLQLAALW PW LLMATLQAGFGRTGLVLAAAVESERSAEQKAIIRVIPL KM DPTGKLNLTLEGVFAGVAEITPAEGKLM QSHPLYLCNASDDDNLEPGFISIV KLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGASAVLFDITEDRAAAEQLQQPLGLTWPV VL1W CNDAEKLMEFVYKNQKAHVR1ELKEPPAW PDYDVVDEQKL1SEEDLNAV G Q D T Q E V IW P H S LP F K V W IS A ILA LW LT IIS L IIL IM LW Q K K P R

De los cuales

MSGGHQLQLAALWPWLLMATLQAGFGRTGLVLAAAVESERSA : péptido de señalización E GKAIIR.VIPLKMDPTG KLNLTLE G VFAG VAEITPAE G KLMQSIIPLYLCNAS D D DNLEPG FISIVKLESPRRAPRPCLSLASKARMAGERGASAVLFDITEDRAAAEQL QQPLGLTW PW LIW GNDAEREMEFVYKNQKAIIVRIELKEPPAW PDYDV: ECD de RNF43 humano

VD : Aminoácidos codificados por sitios de clonación

EQKLISEEDL : etiqueta de epítopo derivada de cVlyc

N A Y G Q D TQ EVIW P H SLPFKV W ISA ILALW LTIISLIIL IM LW Q KKPR : Secuencia de PDGFR que contiene la región TM

RNF43 de ratón en pDisplay secuencia de aminoácidos para expresión en la superficie celular:

M S G G IIQ LQ LA V LW P W LLM A T L IIA G F G IIT G R V LA A A V E S E R S A E Q K A V IR V IP L K M D P TG K LN LTLE G V FA G V A E V TP A E G K LM Q S H P LY LC N A S D D D N LE P G FIS I VKLESPR R A PR PC LSLASKAR M A G ER G AN AVLFD ITED R SAAEQ LQ Q PLG LTKP W L IW G S D A A K L M E F V Y K N R K A Y V W IE L K E P P A G A N Y D W D E Q K L IS E E D L N A VGQDTQ E V IW P H S I ,PFK V V V IS A IL A L W I IV I IS L I IL IM I ,WQ KKPR

De los cuales:

M SG G H Q LQ LA V LW PW LLM A TLH A G FG H TG R V LA A A V ESER SA : péptido de señalización

EQ K A V IR V IPLK M D PTG K LN LTLEG V FA G V A EV TPA EG K LM Q SH PLY L C N A SD

D D N L E PG FISIV K L E SPR R A PR PC L SL A SK A R M A G E R G A N A V L FD IT E D R SA A E Q

L Q Q PL G L T K PW L IW G SD A A K L M E FV Y K N R K A Y V W IE L K E PPA G A N Y D V : ECD de

de RNF43 de ratón

VI): Aminoácidos codificados por sitios de clonación

Clonación de cynomolgus y ortólogos de rata de LGR5 y EGFR

El ADNc que codifica cynomolgus LGR5 se amplificó a partir de ADNc de cynomolgus de colon y de hígado usando cebadores específicos para humanos (Cyno-LGR5-FOR: 5'-CCAGCAGGATCCGCCGCCACCATGGACACCTCCCGGCTCGGTG-3' y CynoAGGGTACGCTCGGTG-3' y CynoAGGGGC'5-CCACC'). Se añadió DMSO a la reacción para posiblemente mejorar el rendimiento y la especificidad de las reacciones de PCR. Tanto el ADNc de hígado como el de colon permitieron la amplificación de la banda esperada de 2.7 kb y el producto de PCR obtenido a partir del ADNc de colon se usó luego para la clonación. El ADNc obtenido se clonó en pADNc3.1 (BamH1-Not1) y se secuenció. La secuencia que codifica un receptor de EGF quimérico compuesto por el dominio extracelular de cynomolgus (también descrito en el documento WO2010/022736-A2) acoplado a la parte transmembrana e intracelular humana se obtuvo de la patente US2010/0183615-A1 (página 79) y el ADNc codificante fue codificado optimizado para la expresión en células humanas, ordenado y clonado por GeneArt. A continuación, este ADNc se volvió a clonar en pADNc3.1 utilizando Nhe1 y Not1. El ADNc que codifica el EGFR de rata y el LGR5 de rata están disponibles a través de Sino Biological (ADNc que codifica el EGFR de rata: No. de cat. RG80100-UT; referencia de GenBank HM801041.1) y Origene (ADNc que codifica LGR5 de rata: No. de cat. RN202738; referencia de GenBank NM_001106784). Ambos ADNc se volvieron a clonar en pADNc3.1 usando Kpn1 y Not1. Se secuenciaron todos los ADNc y se demostró que eran correctos.

Secuencia de aminoácidos LGR5 de wt cynomolgus de longitud completa

MDTSRLGVLLSLPVLLQLAAGSSSPRSGALLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSD LGLSELPSNLSVFTSYLULSMNNISQLLPNPLPSLRFLEELRLAGNALTY1PKGA FTGLYSLKVLMLQNNQLRQVPTEALQNLRSLQSLRLDANHISYVPPSCFSGLHS LR ÍILW LD D N A LTE lP V Q A FR S LS A LQ A M TLA LN K ÍIlIIIP D Y A FG N LS S LV V LilL HNNRIHSLG KKCFDG LHSLETLDLNYNNLDEFPTAIRTLSNLKELG FHSNNIRS TPEKAFVGNPSETTTTTFYDNPTQFVGRSAFQTTEPEERTLTENGASQTTEFPDLTGT ANLESLTLTGAQISSLPQTVCNQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQKIDLR U N ElYE lKVD TFQ Q LLS LR SLN LAW N KiA lílIPN AFSTLPSLlKLU LSSN LLS SFP VTGLHGLTHLKLTGNHALQSLISSENFPELKIIEM PYAYQ CCAFG VCENAYKIS NQW NKGDNSSMDDLHKKDAGMFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSP SPGPFKPCEHLLDGW LIRIG VW TIAVLALTCNALVTSTVFRSPLYISPIKLLIG VIA W N M L T G VSS AVLAG VD AFTF G S FARFIG AWWEN G VG CQ VIG FLSIF AS E S S VFL ETLAAFERGFSVKCSAKFETKAPFSSFKVIIEFCAFEALTMAAVPFFGGSFYGAS PLOLPLPFGEPSTTGYM VALILLNSLCFLM M TIAYTKLYONLDKGDLENIW DCS M VKH IALLLFTN C ILYC PVAFLSFSSLLN LTFISPEVIKFILLV IVPLPAC LN PLLYI LFNPHFKEDLVSLGKQTYFWTRSKHPSLMSINSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSS

lAYDFPPSSVPSPAYPVTESCHFSSVAFVPCF

De los cuales:

MDTSRLGVLLSLPVLLQLAAG Péptido de señalización

SSSPRSGALLRGCPTHCHCEPDGRMLLRVDCSDLGLSELPSNLSVFTSYLDLSM NNTSQELPNPLPSERFEEEERLAGNAETYTPKGAFTGLYSLKVEMLQNNQERQV PTEALQNLRSLQSLRLDANIIISYVPPSCFSGLIISLRIILW LDDNALTEIPVQAFR SLSALQ AM TLALN KIH H IPD YAFG N LSSLW LH LH N N R IH SLG KKC FD G LH SLE TLD LNYN NLDEFPTAIRTLSNLKELG FHSNNIRSIPEKAFVG NPSLITIHFYDNPI QFVGRSAFQHLPELRTLTLNGASQITEFPULTGTAIMLESLTLTGAQ1SSLPQTVC NQLPNLQVLDLSYNLLEDLPSFSVCQKLQ KIDLRHNEIYEIKVDTFQQLLSLRSL NLAW NKIAIIHPNAFSTLPSLIKLDLSSNLLSSFPVTG LHG LTHLKLTG NHALQ S LISSENFPELKI1EMPYAYQCCAFGVCENAYK1SNQW NKGDNSSMDDLIIKKDA GMFQVQDERDLEDFLLDFEEDLKALHSVQCSPSPGPFKPOEHLLDGW LIRIGV W TIAVLALTO NALVTSTVFRSPLYISPIKLLIG VIAW NM LTG VSSAVLAG VDAFT FGSFARHGAWWENGVGCQVIGFLSIFASESSVFLLTLAALERGFSVKCSAKFET KAPPSSEKVMEECAELAETMAAVPEEGGSEYGASPECEPEPKGEPSTTGYMVAEI LLNSLO FLM M TIAYTKLYCNLDKG DLENIW DO SM VKHIALLLFTNCILYO PVAF LSFSSLLNLTFISPEVIKFILLVIVPLPACLNPLLYILFNPHFKEDLVSLG KQ TYFW TRSKHPSEMSTNSDDVEKQSCDSTQALVTFTSSSTAYDEPPSSVPSPAYPVTESC HLSSVAFVPCL O y-n o m n íg u * I.GIÍ5

Generación de líneas celulares que sobreexpresan LGR4, LGR5, ZNRF3 y RNF43

Constructos que expresan hLGR4 (pEF1_hLGR4-FLAG-HA), hLGR5 (pEF1_hLGR5-FLAG-HA), hZRNF3(ECD) (pADNc3.1_hZNRF3(ECD) y pDisplay_hZNRF3(ECD)-Myc-PDGFR(TM)) y hRNF43(ECD) (pDisplay_hRNF43-(ECD)-Myc-PDGFR(TM) se utilizaron para generar clones de Freestyle 293F y CHO-K1 que expresan de forma estable las proteínas respectivas. Los constructos se transfectaron transitoriamente en células Freestyle 293F y CHO-K1 utilizando transfección con PEI (células Freestyle 293F) o lipofectamina (células CHO) y se cribaron mediante FACS utilizando anticuerpos que reaccionaban con las respectivas dianas. Después de una transfección exitosa, se sembraron células Freestyle 293F y CHO-K1 en dilución limitante y se cultivaron bajo una presión de selección de G418 de 0.5 mg/ml para obtener clones de células estables. Después de 2-3 semanas de selección, los clones se cribaron mediante FACS. Los clones seleccionados se expandieron mediante pases en serie, se volvieron a probar en FACS y se congelaron a -150°C.

Ratones utilizados para la inmunización

Para la generación de anticuerpos humanos que se unen a ratones LGR4, LGR5, ZNRF3 y RNF43 transgénicos para la cadena liviana VK1-39 humana (ratones de cadena liviana común, véase WO2009/157771) y para un minilocus de cadena pesada humana (HC) (que comprende una selección de segmentos del gen V humano, todos los D humanos y todos los J humanos) se inmunizaron con ADN que codifica las proteínas o ADN recombinante como se describe brevemente a continuación. Estos ratones se conocen como ratones 'MeMo®'. Inmunizaciones

Inmunizaciones de ADN hLGR4/hLGR5

Se inmunizaron 18 ratones con 20 |jg de ADN plasmídico (pVax1_hLGR4-FLAG-HA y pVax1_hLGR5-FLAG-HA) que expresaban hLGR4 y hLGR5 de longitud completa cada uno. Además, se inmunizaron 12 ratones con 20 jg de ADN plasmídico del dominio extracelular de hLGR4 y hLGR5 fusionado al dominio transmembrana de GPA33 y una etiqueta Flag (pVax1_hLGR4(ECD)-GPA33-FLAG y pVax1_hLGR5(ECD)-GPA33-FLAG). Los ratones se vacunaron los días 0, 3, 6, 14, 17, 28, 31, 49, 63, 70, 84 y 91.

Inmunizaciones con proteínas LGR4, LGR5, ZNRF3, RNF43

Se inmunizaron seis ratones con 40 jg de (rh) LGR4-Fc humana recombinante (RND systems Cat. Nr. 7750-GP), rhLGR5-Fc (RND systems Cat. Nr. 8078-GP), rhZNRF3-Fc (RND systems Cat. Nr. 7994-RF) o proteína rhRNF43-Fc (RND systems Cat. nr. 7964-RN) disuelta en PBS, y suplementada con 40 j l de adyuvante Gerbu MM (Gerbu Biotechnik). Posteriormente, los ratones se reforzaron con 20 jg de proteína recombinante (+ 20 j l de MM adyuvante Gerbu) el día 14 y el día 28, seguidos de más potencias de 20 jg de proteína recombinante hasta que se observó un título en suero o el período de inmunización fue superior a tres meses.

Determinación de títulos de anticuerpos.

Se determinaron los títulos de anti-hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43 en el suero de ratones inmunizados mediante FACS en células Freestyle 293F que sobreexpresaban la diana respectiva.

Recuperación de tejido linfoide

Se extrajeron el bazo y los ganglios linfáticos de drenaje de todos los ratones que se inmunizaron con éxito (véase tabla 1). Se generaron suspensiones de células individuales a partir de los ganglios linfáticos inguinales y del bazo y, posteriormente, estos tejidos se lisaron en reactivo Trizol y se almacenaron a -80°C hasta su uso.

Generación de repertorios de anticuerpos de fagos “ inmunes” mediante clonación por RT-PCR de genes VH

A partir de ratones inmunizados con éxito, se utilizaron los ganglios linfáticos inguinales para el constructo de repertorios de anticuerpos de fagos "inmunes". Se extrajo ARN del tejido linfoide usando Trizol y se usó 1 |jg de ARN total en una reacción de RT usando un cebador específico de IgG-CH1. El ADNc resultante se usó luego para amplificar el conjunto policlonal de ADNc que codifica VH usando cebadores específicos de VH desarrollados internamente esencialmente como se describe en Marks et al. (J Mol Biol. 5 de diciembre de 1991; 222(3): 581-97). El producto de PCR resultante se clonó luego en un vector fagémido para la presentación de fragmentos Fab en fagos, como se describe en de Haard et al. (J Biol Chem. 25 de junio de 1999; 274(26): 18218-30) con la excepción de que la cadena liviana era la misma para todos los anticuerpos y estaba codificada por el vector. Después de la ligación, los fagémidos se usaron para transformar bacterias E. coli TG1 y las bacterias transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían ampicilina y glucosa. Todas las bibliotecas de fagos contenían >106 transformantes y tenían una frecuencia de inserción de >80%. Las bacterias se recolectaron después del crecimiento durante la noche y se usaron para preparar fagos de acuerdo con protocolos establecidos (de Haard et al., J Biol Chem. 25 de junio de 1999; 274(26): 18218-30).

Selección de fagos que portan fragmentos Fab que se unen específicamente a LGR4, LGR5, ZNRF3 y RNF43 de repertorios de anticuerpos de fagos sintéticos o 'inmunes'

Se rescataron bibliotecas de fagos de acuerdo con procedimientos estandarizados (J Mol Biol. 5 de diciembre de 1991; 222(3): 581-97; J Biol Chem. 25 de junio de 1999; 274(26): 18218-30) y se seleccionaron los fagos. para dos rondas de selección en el caso de repertorios sintéticos generados internamente y una única ronda en el caso de los repertorios de anticuerpos de fagos inmunes. En la primera ronda, se recubrió proteína recombinante en los pozos de una placa ELISA MAXISORP™ o en un inmunotubo NUNC, mientras que en la segunda ronda, se usaron proteínas recombinantes o células que sobreexpresaban la diana. Las placas o inmunotubos de ELISA MAXISORP™ se bloquearon con ELK al 4%. Las bibliotecas de anticuerpos de fagos también se bloquearon con ELK al 4% y un exceso de IgG humana para reducir los aglutinantes de la región Fc antes de la adición de la biblioteca de fagos al antígeno revestido.

La incubación con la biblioteca de fagos con la proteína recubierta se realizó durante 2 horas a temperatura ambiente en condiciones de agitación. A continuación, las placas o tubos se lavaron de cinco a diez veces con Tween-20 al 0.05% en PBS seguido de un lavado de 5 a 10 veces con PBS. Los fagos unidos se eluyeron usando glicina 50 mM (pH 2.2) y se añadieron a E. coli TG-1 y se incubaron a 37°C para la infección por fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina y glucosa y se incubaron a 37°C durante la noche. Después de la primera ronda de selección, se rasparon las colonias de las placas y se combinaron y, posteriormente, se rescataron y amplificaron para preparar un grupo de fagos de primera ronda enriquecido para los repertorios sintéticos. Para los repertorios "inmunes", se cribaron clones individuales para la unión a la diana después de la primera ronda de selección de fagos.

Para los repertorios sintéticos, la biblioteca enriquecida se seleccionó en la proteína humana recombinante (rh) (rhLGR4-Fc, rmLgr4-Fc, rhLGR5-Fc, rhZNRF3-Fc o rhRNF43-Fc, RND systems, rhRNF-43-HIS soluble, rmZnrf3-HIS (producido internamente)) utilizando el protocolo descrito anteriormente o en células Freestyle 293F que sobreexpresan de manera estable hLGR4(FL), hLGR5(FL), hZNRF3(ECD) o hRNF43(ECD). Para las selecciones de células, los fagos y las células rescatados se bloquearon con ELK al 4%. Después de bloquear, los fagos rescatados se incubaron con 5A06 células parentales Freestyle 293F para sustracción durante 1 hora. Después de la sustracción, las células se centrifugaron y el sobrenadante del fago se transfirió a células Freestyle 293F que expresan hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43. Las células más fagos se incubaron durante 2 horas a 2-8°C. El lavado de las células (5­ 10 veces) se realizó usando 5 ml de BSA al 0.5% en PBS. Los fagos unidos se eluyeron usando TEA 200 mM, el eluato se neutralizó con Tris (pH 8) y se añadió a E. coli TG-1 y se incubó a 37°C para la infección por fagos. Posteriormente, las bacterias infectadas con fagos se sembraron en placas de agar que contenían ampicilina y glucosa y se incubaron a 30°C o 37°C durante la noche.

Después de la selección de la segunda ronda, los clones individuales se seleccionaron y se ensayaron para determinar la reactividad de la diana. Los clones de fagos positivos que se unen a hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43 se identificaron luego en FACS para unirse al Freestyle 293F estable que sobreexpresa la diana respectiva (véase más abajo).

Marcación DiD de células y tinción FACS de una mezcla de células DiD positivas y negativas

Se generaron internamente clones de células Freestyle 293F que sobreexpresaban de forma estable los dianas respectivas. Estas células se cultivaron y recolectaron usando procedimientos estandarizados. A continuación, se marcaron aproximadamente 20 millones de células que expresan antígenos con 1 ul de DiD (Invitrogen, No. de cat. V22889) en un volumen de 1 ml de medio de cultivo celular, durante 20 minutos a 37°C. Se comprobó el marcaje con DiD en una pequeña alícuota de células en FACS y se encontró sistemáticamente que era superior al 90%. A continuación, las células se lavaron dos veces con 20 ml de medio de cultivo celular y se utilizaron posteriormente para la tinción FACS. Para este objetivo, se preparó una mezcla 1:1 de células Freestyle 293F negativas al antígeno (parentales) y células positivas al antígeno marcadas con DiD y se dividieron en alícuotas de 200.000 células por pozo en placas de microtitulación FACS de 96 pozos de fondo redondo. La tinción usando fagos monoclonales se realizó como se describe a continuación.

Tinción FACS de una mezcla de células diana positivas y negativas utilizando fagos monoclonales

Se prepararon fagos monoclonales de clones individuales seleccionados para unirse a las respectivas dianas como se describe (J Mol Biol. 5 de diciembre de 1991; 222(3): 581-97; J Biol Chem. 25 de junio de 1999; 274(26): 18218 -30). Estos se analizaron para determinar su unión en FACS a una mezcla de líneas celulares positivas para antígeno (marcadas con DiD) y negativas (no marcadas) mediante incubación con fagos (30 j l ) en un total de 100 j l de regulador FACS (PBS, que contiene 0.5% de BSA y EDTA 0.5 mM) que contiene 4% de leche. Después de tres lavados, se detectaron los fagos unidos mediante tinción con un anticuerpo anti-M13 biotinilado (Fitzgerald, cat. No.

61R-M101ABTB62-FEZ, 1:125 en regulador FACS, 30 minutos en hielo) y estreptavidina marcada con PE (Invitrogen, cat. No. SA1004-4; 1:400 en regulador FACS durante 15 minutos en hielo). Las células teñidas se analizaron usando un FACS Canto (Becton and Dickinson).

Anticuerpos dirigidos a RTK

Se obtuvieron anticuerpos cLC dirigidos a EGFR y HER3 usando métodos descritos previamente (J Mol Biol. 5 de diciembre de 1991; 222(3): 581-97; J Biol Chem. 25 de junio de 1999; 274(26): 18218-30) a partir de grandes repertorios de anticuerpos de fagos sintéticos generados internamente (HER3), o de repertorios de anticuerpos de fagos generados a partir de ratones MeMo inmunizados con éxito (EGFR). En las solicitudes pendientes WO 2015/130173 A1 y WO 2015/130172 A1 se han descrito métodos para generar anticuerpos contra Eg FR y HER3 y cadenas VH de dominio variable de anticuerpos para los respectivos anticuerpos EGFR y HER3.

Reclonación de ADNc que codifican VH del vector fagémido a vectores de expresión de IgG

Se secuenciaron los ADNc que codifican VH de todos los clones específicos de la diana. A continuación, se volvió a clonar una selección de clones únicos basada en la identidad de secuencia y el análisis de agrupamiento (Figura 25) en diferentes vectores de expresión de IgG utilizando Sfi1-BstEII o una digestión y ligación de Sfil/Xhol del conjunto de ADNc digeridos en el plásmido de expresión de IgG de acuerdo con a técnicas biológicas moleculares estandarizadas.

Generación de anticuerpos biespecíficos

Se generaron anticuerpos biespecíficos mediante cotransfección transitoria de dos plásmidos que codifican IgG con diferentes dominios Vh , utilizando una tecnología de ingeniería genética CH3 patentada para asegurar la heterodimerización y la formación de anticuerpos biespecíficos eficientes. La cadena liviana común también se cotransfecta en la misma célula, ya sea en el mismo plásmido o en otro plásmido. En nuestras solicitudes copendientes (por ejemplo, WO2013/157954 y WO2013/157953;) hemos divulgado métodos y medios para producir anticuerpos biespecíficos a partir de una sola célula, mediante los cuales se proporcionan medios que favorecen la formación de anticuerpos biespecíficos sobre la formación de anticuerpos monoespecíficos. Estos métodos también se pueden emplear favorablemente en la presente invención. Específicamente, las mutaciones preferidas para producir esencialmente sólo moléculas de IgG de longitud completa biespecíficas son sustituciones de aminoácidos en las posiciones 351 y 366, por ejemplo, L351K y T366K (numeración según la numeración de la UE) en el primer dominio CH3 (la cadena pesada 'variante KK') y sustituciones de aminoácidos en las posiciones 351 y 368, por ejemplo, L351D y L368E en el segundo dominio CH3 (la cadena pesada 'variante DE'), o viceversa. Se demostró previamente en nuestras solicitudes copendientes que la cadena pesada de la variante DE cargada negativamente y la cadena pesada de la variante de KK cargada positivamente se emparejan preferentemente para formar heterodímeros (las llamadas moléculas biespecíficas 'DEKK'). La homodimerización de cadenas pesadas variantes DE (homodímeros DE-DE) o cadenas pesadas variantes KK (homodímeros KK-KK) apenas ocurre debido a una fuerte repulsión entre los residuos cargados en la interfaz CH3-CH3 entre cadenas pesadas idénticas.

Los genes VH que codifican los anticuerpos que se unen a LGR4, LGR5, ZNRF3 y RNF43 descritos anteriormente se clonaron en el vector que codifica el dominio CH3 cargado positivamente y los anticuerpos dirigidos a RTK (EGFR- o HER3-) como se obtuvo previamente y se describe en el documento WO 2015/130172 se clonaron en un vector que codifica el dominio CH3 cargado negativamente. Se cultivaron células 293F Freestyle adaptadas al crecimiento en suspensión en matraces T125 en una meseta agitadora hasta una densidad de 3.0 x 106 células/ml. Las células se sembraron a una densidad de 0.3-0.5 x 106 células viables/ml en cada pozo de una placa de 24 pozos de profundidad. Las células se transfectaron transitoriamente con una mezcla de dos plásmidos que codifican anticuerpos diferentes, clonados en el sistema de vector patentado. Siete días después de la transfección, se recogió el sobrenadante celular y se filtró a través de un filtro de 0.22 jM (Sartorius). El sobrenadante estéril se almacenó a 4°C hasta la purificación de los anticuerpos.

Generación de anticuerpos monoclonales

También se volvió a clonar una selección de secuencias de VH en un vector de expresión de IgG1 que codifica IgG bivalente monoespecífica. Se cultivaron células 293F Freestyle adaptadas a la suspensión en matraces T125 en una meseta de agitación hasta una densidad de 3.0 x 106 células/ml. Las células se sembraron a una densidad de 0.3-0.5 x 106 células viables/ml en cada pozo de una placa de 24 pozos de profundidad. Las células se transfectaron transitoriamente con mezclas individuales de ADN:PE1 estériles de acuerdo con procedimientos estandarizados y se cultivaron adicionalmente. Siete días después de la transfección, se recogió el sobrenadante y se filtró a través de un filtro de 0.22 pM (Sartorius). El sobrenadante estéril se almacenó a 4°C hasta que el anticuerpo se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A.

Clonación y expresión de anticuerpos comparadores dirigidos a LGR5, FZD7 y R-espondina3.

Se conocen en la técnica anticuerpos que reconocen específicamente EGFR, FZD, RSPO3 o LGR5. Los anticuerpos comparadores se construyeron de acuerdo con la información publicada: las secuencias de ADNc que codifican VH y VL se derivaron de patentes publicadas y se clonaron en un vector de expresión que codifica una molécula de IgG1 humana de longitud completa. Los anticuerpos se expresaron posteriormente en células 293F Freestyle mediante transfección transitoria y se purificaron del sobrenadante del cultivo usando cromatografía de afinidad de proteína A de acuerdo con procedimientos estándar. El anticuerpo hu8E11v2 (anti-LGR5) se copió de la patente US 2013/0336885 A1 (Genentech). La información de la secuencia para el anticuerpo BNC101 (anti-LGR5) se obtuvo de la patente US2016/0031984 A1 (Bionomics Inc.). La secuencia que codifica el anticuerpo OMP18R5 (anti-FZD) se copió de la patente AU2014/212081 A1 (Oncomed Pharmaceuticals Inc.). Las secuencias de anticuerpos OMP18R20 y OMP18R21 (anti-LGR5) se encontraron y se copiaron de la patente Us 8.628.774 B2 (Oncomed Pharmaceuticals Inc.). La secuencia que codifica OMP131R10 (anti-RSPO3) se copió de la patente WO 2016/090024 A2 (Oncomed Pharmaceuticals Inc.). Se utilizó un lote clínico de cetuximab (Erbitux®). En la Tabla 7 se proporciona una lista de los anticuerpos copiados y el número interno dado a estas versiones.

Purificación de IgG para cribado funcional

La purificación de IgG se realizó a pequeña escala (<500 pg), mediana (<10 mg) y gran escala (>10 mg) usando cromatografía de afinidad de proteína A. Se realizaron purificaciones a pequeña escala en condiciones estériles en placas de filtro de 24 pozos usando filtración. Primero, el pH del medio se ajustó a pH 8.0 y posteriormente, los sobrenadantes que contenían IgG se incubaron con perlas de proteína A Sepharose CL-4B (50% v/v) (Pierce) durante 2 horas a 25°C en una plataforma de agitación a 600 rpm. A continuación, las perlas se recogieron mediante filtración. Las perlas se lavaron dos veces con PBS pH 7.4. Después, la IgG unida se eluyó a pH 3.0 con regulador citrato 0,1 M y el eluido se neutralizó inmediatamente usando Tris pH 8.0. El intercambio de regulador se realizó mediante centrifugación utilizando multiplatos Ultracel 10 multicriba (Millipore). Las muestras se recolectaron finalmente en PBS pH 7.4. La concentración de IgG se midió usando Octet. Las muestras de proteína se almacenaron a 4°C.

Cuantificación de IgG usando Octet

Para determinar la cantidad de IgG purificada, se determinó la concentración de anticuerpo mediante análisis de Octeto utilizando biosensores de proteína A (Forte-Bio, según las recomendaciones del proveedor) utilizando IgG humana total (Sigma Aldrich, cat. No. 14506) de serie.

Caracterización de la unión de IgG específicas de LGR4/LGR5/ZNRF3/RNF43

Los anticuerpos dirigidos a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43 se expresaron en primer lugar como anticuerpos biespecíficos de cadena liviana común con un segundo brazo Fab que reconoce un antígeno no relevante (control): el toxoide tetánico. Se ensayó la unión de los anticuerpos en FACS a células 293F Freestyle que sobreexpresan hLGR4, hLGR5, hZNR3 o hRNF43. Por lo tanto, las células se recogieron y se diluyeron a 106 células/ml en regulador FACS (PBS/BSA al 0.5%/EDTA 0.5 mM). Se añadieron 1-2 x 105 células a cada pozo en una placa de 96 pozos con fondo en U. Las células se centrifugaron durante 2 minutos a 300 g a 4°C. El sobrenadante se descartó invirtiendo la(s) placa(s). Se añadieron 50 pl de cada muestra de IgG (para cribado diluido a una concentración de 5 pg/ml en regulador FACS) y se incubaron durante 1 hora en hielo. Las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con 150 pl de regulador FACS. Se añadieron 50 ul de PE de anti-IgG humana de cabra diluida 1:400 (Invitrogen) y se incubaron durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Después de añadir regulador FACS, las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con regulador FACS. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto (Becton and Dickinson) en un entorno HTS. La unión de los anticuerpos a las células se evaluó midiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la población de células teñidas. Se consideró que los anticuerpos se unían a su diana cuando el MFI era al menos cinco veces mayor que el de la misma población celular teñida con un anticuerpo sin unión (control negativo) (dirigido al toxoide tetánico).

Para probar la reactividad de unión, también se usaron ensayos ELISA. Se ensayó la reactividad de IgG biespecífica dirigida a LGR4 y LGR5 frente a los antígenos rhLGR4-Fc, rhLGR5-Fc y toxoide tetánico. Se ensayó la reactividad de los anticuerpos ZNRF3 y RNF43 frente a los antígenos rhZNRF3-Fc, rhRNF43-Fc y toxoide tetánico. Los antígenos se recubrieron durante la noche en placas de ELISA MAXISORP™. Los pozos de las placas de ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) que contenía BSA al 5% durante 1 hora. Los anticuerpos seleccionados se probaron a una concentración de 5 |jg/ml diluidos en PBS-BSA al 5% y se dejaron unirse durante 1 hora a 25°C. Alternativamente, cuando se tituló la IgG biespecífica, se preparó una serie de diluciones de dos veces en siete etapas comenzando con 5 jg/m l o 8 jg/ml. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente con un anticuerpo disponible comercialmente específico para los antígenos recubiertos y un anticuerpo de control antitoxoide tetánico. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05% v/v). La IgG unida se detectó con conjugado de HRP diluido 1:2000 (anti-IgG humana de cabra Becton Dickinson) y se dejó que se uniera durante 1 hora a 25°C. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05%) y la IgG unida se visualizó mediante tinción con TMB/H2O2 y la tinción se cuantificó mediante medición de OD450nm.

Clasificación de afinidad de IgG específicas de LGR4/LGR5/ZNRF3/RNF43 en FACS

Se recogieron las células y se diluyeron a 106 células/ml en regulador FACS (PBS/BSA al 0.5%/EDTA 0.5 mM). Se añadieron 1-2 x 105 células a cada pozo en una placa FACS de 96 pozos con fondo en U. Las células se centrifugaron durante 2 minutos a 300 g a 4°C. El sobrenadante se descartó invirtiendo la(s) placa(s). Se añadieron 50 j l de cada muestra de IgG en una dilución en serie de dos veces en siete etapas comenzando a 5 jg/m l y se incubó durante 1 hora en hielo. Las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con 150 j l de regulador FACS. Se añadieron 50 ul de PE de IgG antihumano de ratón diluido 1:400 (Invitrogen) y se incubó durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Después de añadir regulador FACS, las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con regulador FACS. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto en un entorno HTS. La unión de los anticuerpos a las células se cuantificó midiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI) y calculando el área bajo la curva (AUC) resultante de los gráficos resultantes de la MFI en función de la concentración de anticuerpo utilizada para la tinción.

Purificación de IgG para estudios funcionales

Se realizaron purificaciones a mediana escala en un sistema ÁKTAexplorer 100 usando columnas HiTrap MabSelect Sure y columnas de desalinización HiTrap. Las muestras se cargaron a 5 ml/min. La columna se lavó con 2 volúmenes de columna de PBS. La IgG se eluyó a pH 3.0 con regulador citrato 0.1 M. A continuación, la muestra se desaló y terminó en un regulador final de PBS pH 7.4. Las IgG se filtraron a través de un filtro de 0.45 jM (Sartorius). La concentración de IgG se midió usando DO280. Las muestras de proteínas se almacenaron a -80°C.

Prueba de anticuerpos para determinar su reactividad con el ortólogo de ratón de la diana

Para probar la reactividad de unión de mLgr4, se usó un ensayo ELISA. Se ensayó la reactividad de los anticuerpos dirigidos a LGR4 y LGR5 frente a la proteína mLgr4-Fc recombinante (RND systems, Cat. No. 8077-GP). Se revistió mLgr4-Fc durante la noche a placas de ELISA MAXISORP™. Los pozos de las placas de ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) que contenía BSA al 5% durante 1 hora. Los anticuerpos seleccionados se probaron a una concentración única de 5 jg/m l diluidos en PBS-BSA al 5% y se dejaron unirse durante 1 hora a 25°C. Como control, el procedimiento se realizó simultáneamente con un anticuerpo disponible comercialmente específico para los antígenos recubiertos y un anticuerpo de control (anti-TT cLC). Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05% v/v). La IgG unida se detectó con conjugado de HRP diluido 1:2000 (IgG antihumana de cabra; Becton Dickinson) y se dejó que se uniera durante 1 hora a 25°C. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05%) y la IgG unida se visualizó mediante tinción con TMB/H2O2; la tinción se cuantificó mediante la medición de DO450nm.

También se ensayó la unión de IgG biespecífica en FACS a células Freestyle 293F que expresan transitoriamente mLgr5, mZnr3 o mRnf43. Por lo tanto, las células se transfectaron transitoriamente con constructos que codifican mLgr5, mZnrf3 o mRnf43 (pEF1_mLgr5-Myc-HIS, pDisplay_mZnrf3-Myc-PDGFR(TM), pDisplay_mRnf43-Myc-PDGFR(TM)) usando lipofectamina y se recolectaron 106 en regulador FACS (PBS/0.5% BSA/0.5 mM EDTA). Se añadieron 1-2 x 105 células a cada pozo en una placa de 96 pozos con fondo en U. Las células se centrifugaron durante 2 minutos a 300 g a 4°C. El sobrenadante se descartó invirtiendo la(s) placa(s). Se añadieron 50 j l de cada muestra de IgG a una concentración de 5 jg/m l y se incubaron durante 1 hora en hielo. Las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con regulador FACS. Se añadieron 50 ul de PE de IgG antihumano de ratón diluido 1:400 (Invitrogen) y se incubó durante 30-60 minutos en hielo en la oscuridad. Después de añadir regulador FACS, las células se centrifugaron una vez, se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron dos veces con regulador FACS. Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto en un entorno HTS. La unión de los anticuerpos a las células se cuantificó midiendo la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la población de células transfectadas.

Ensayo ELISA de bloqueo de R-espondina3

Las cuatro dianas WNT tienen R-espondina como su ligando (Prog Biophys Mol Biol. 2015 Sep; 118(3): 112-8; J Struct Biol. 2015 Aug; 191(2): 149-55). Para cada diana, se desarrolló un ensayo de bloqueo de ligando para probar la capacidad de los anticuerpos específicos de la diana (LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43) para interferir con la unión de R-espondina3 a la diana. Se ensayó la unión de las proteínas de fusión Fc del ECD de la diana respectiva a R-espondina3 revestida en presencia de un exceso de cLC IgG dirigida a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43. En caso de que la cLC IgG se una al sitio de unión de R-espondina3, la proteína de fusión Fc ya no podrá unirse al recubrimiento y se perderá la señal de ELISA. Se recubrió con R-espondina3 recombinante (RND systems) los pozos de una placa ELISA MAXISORP™. Los pozos de las placas de ELISA se bloquearon con PBS (pH 7.2) que contenía BSA al 5% durante 1 hora. Se ensayó el bloqueo de anticuerpos seleccionados a una concentración de 15) pg/ml diluidos en PBS-BSA al 5% en presencia de proteína diana humana recombinante (rhLGR4-Fc, rhLGR5-Fc, rhZNRF3-Fc o rhRNF43-Fc). El complejo IgG/proteína diana humana recombinante se preincubó durante 10 minutos antes de la adición a la placa recubierta con R-espondina3 durante 10 minutos-2 horas. Como control para el bloqueo, el procedimiento se realizó simultáneamente mediante la adición de un excedente (15) pg/ml) de rhR-espondina3 en lugar de IgG. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05% v/v). La proteína Fc unida se detectó con conjugado de HRP anti-IgG humana diluido 1:2000 (anti-IgG humana de cabra Bethyl labs) y se dejó que se uniera durante 1 hora a 25°C. Las placas de ELISA se lavaron 3 veces con PBS-T (PBS-Tween 20 al 0.05%) y se detectó el complejo unido mediante tinción con TMB/H2O2; la tinción se cuantificó mediante la medición de DO450nm.

Medición de la afinidad de la unión del anticuerpo biespecífico al antígeno expresado en la superficie celular.

Se radiomarcó PB10651 afucosilado con 125I usando IODO-GEN de acuerdo con el protocolo descrito por van Uhm et al. La inmunorreactividad del anticuerpo después de la radiomarcación se investigó con el método descrito por Lindmo et al. Se realizaron mediciones de afinidad celular en estado estacionario de 125I-PB10651 con células CHO que expresaban EGFR o LRG5 para investigar la afinidad hacia EGFR y LGR5 respectivamente. Además, también se determinó la afinidad hacia la línea celular DLD-1 que expresa endógenamente EGFR pero no LGR5 detectable. El ensayo utilizó una concentración constante de diana (células) y la cantidad de radio ligando se tituló sin violar las suposiciones detrás de las mediciones de afinidad en condiciones de estado estacionario. La unión no específica (NSB) se evaluó mediante la presencia de PB10651 no marcado en exceso molar de 100 veces en una serie paralela. El ensayo se repitió dos veces y el valor estimado de Kd se indica como la media de tres experimentos independientes. La estimación de los valores de Kd se realizó utilizando GraphPad Prism v. Regresión no lineal de 6.0 h, enlace de un sitio: total y no específico con la restricción de que los valores de K^d deben ser mayores que 0.

Referencias:

Lindmo T, Boven E, Cuttitta F, Fedorko J, Bunn PA. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. J Immunol Methods. 1984; 72: 77­ 89.

van Uhm JI, Visser GW, van der Schans MJ, Geldof AA, Meuleman EJ, Nieuwenhuijzen JA. The ultimate radiochemical nightmare: upon radio-iodination of Botulinum neurotoxin A, the introduced iodine atom itself seems to be fatal forthe bioactivity of this macromolecule. EJNMMI Res. 2015; 5: 5.

Mapeo de epítopos a través del análisis de mutagénesis de escopeta

Los epítopos en EGFR y LGR5 reconocidos por PB10651 se determinaron mediante análisis de mutagénesis de escopeta de acuerdo con el método descrito por Davidson et al., (2014). Se hicieron dos bibliotecas de mutaciones a partir de los dos antígenos: una biblioteca comprendía 300-520 a.a. (dominio de unión a ligando L2 o dominio III) de EGFR humano (secuencia de referencia de GenBank NP_005219.2) y el otro 22-560 a.a. (siendo el dominio N-terminal hasta la primera hélice transmembrana) de LGR5 humano (secuencia de referencia de GenBank AAH96324.1). El constructo de expresión de LGR5 se truncó en a.a. 834 para aumentar la expresión del receptor en la superficie celular. Los anticuerpos desarrollados internamente que se dirigen a un epítopo diferente se utilizaron como anticuerpos de control para la expresión de los mutantes.

Referencia

Davidson, E. and Doranz, B.J. (2014) A high-throughput shotgun mutagenesis approach to mapping B-cell antibody epitope. Immunology 143, 13-20.

Competencia por la unión de LGR5 entre el brazo Fab de LGR5 en PB10651 y el ligando R-espondina1 usando un ensayo basado en células.

La versión copiada de la literatura del anticuerpo OMP88R20 (llamado PG7711 descrita en la patente de los Estados Unidos No. 8.628.774B2) se usó como control de bloqueo de ligando para establecer un ensayo para demostrar la capacidad de bloqueo de ligando de los brazos Fab anti-LGR5. Se generó un clon celular derivado de CHO-K1 que sobreexpresó LGR5 humano mediante transfección transitoria de células CHO-K1 con el constructo de expresión que codifica LGR5, seguida de selección de clones resistentes a antibióticos (G418) mediante dilución limitante. A continuación, se ensayó la unión de la versión copiada de OMP88R20 a esta línea celular en una serie de diluciones de anticuerpo y se determinó la EC50 para la unión. A continuación, se midió la unión del anticuerpo al clon de células CHO que expresa LGR5 a la concentración de EC50 en FACS en presencia de cantidades crecientes del ligando R-espondina1 (r &D Systems, cat. No. 4645-RF/CF). Para probar si la unión del Fab anti-LGR5 (MF5816) de PB10651 a LGR5 podría inhibirse mediante la unión del ligando, se analizó el anticuerpo para determinar la unión de LGR5 a 100 ng/ml en presencia de cantidades crecientes del ligando R-espondina1. Se realizó un ensayo similar usando el anticuerpo anti-LGR5 de rata 1D9 que se ha informado que se une a la región yuxtamembrana de LGR5 (de Lau et al., 2011) para mostrar la especificidad de la interacción.

Capacidad de bloqueo de ligandos del brazo Fab anti-EGFR en PB10651.

Para probar IgG anti-EGFR por sus efectos sobre la señalización inducida por EGF, se probó su capacidad para prevenir la muerte celular apoptótica inducida por EGF de las células A431. En resumen, concentraciones elevadas (10 nM) de EGF inducen la muerte celular (apoptótica) en las células A431 (Gulli et al., 1996). Este efecto puede revertirse de forma dependiente de la dosis mediante la adición de anticuerpos anti-EGFR que bloquean el ligando, como cetuximab (el anticuerpo 225 murino es el equivalente de cetuximab en ratón). Las células a 431 se cultivaron en placas a 1500 células/pozo en placas de cultivo de tejidos de 96 pozos y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, se añadió anticuerpo a las concentraciones indicadas junto con 62.5 ng/ml (10 nM) de EGF humano recombinante (R&D Systems, No. de cat. 236-EG) y las células se cultivaron durante tres días. Después de tres días, se determinó el número de células metabólicamente activas mediante la adición de azul alamar (Invitrogen, No. de cat. DAL1100) y la medición de la fluorescencia a una emisión de 590 nm con una excitación de 560 nm. Todas las IgG anti-EGFR se analizaron para determinar sus efectos de bloqueo de EGF en este ensayo en comparación con cetuximab.

Referencia:

Gulli, L.F., et al., Epidermal growth factor-induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tyrosine kinase activity. Cell Growth Differ, 1996. 7(2): p. 173-178.

Ensayo de estabilidad térmica

Para obtener una indicación sobre la estabilidad de la IgG biespecífica, todas las IgG se incubaron a 40°C durante una semana en medio que contenía suero (DMEM, alto contenido de glucosa (Gibco, cat. No. 41966-029), suplementado con suero bovino fetal al 9% (Thermo Scientific Cat. nr. SV30180)) y luego se ensayaron para determinar la unión en un ELISA de unión (esencialmente como se describió anteriormente). Este ELISA consistió en recubrir 2 pg/ml de antígeno (rhLGR4-Fc, rhLGR5-Fc, rhZNRF3-Fc o rhRNF43-Fc), usando 100 pl a 5 pg/ml de IgG y bloqueo en 5% BSA en PBS. En este ensayo, la unión de la misma IgG (en medio que contiene suero) mantenida a 2-8°C (refrigerador) al antígeno se comparó con la de IgG mantenida a 40°C. Se calculó el porcentaje de pérdida de unión después de 1 semana de incubación a 40°C.

Cultivos de organoides de cáncer colorrectal (CCR)

Los organoides de CRC se produjeron como se describe (Van de Wetering et al.2015 Cell 161: 933-45) como bancos de células de trabajo y se enviaron para ensayos de detección en hielo seco como viales congelados a una densidad de 1.500.000 células por 1 ml de medio de congelación (Suero fetal bovino que contiene DMSO al 10% como crioprotector). Los criotubos se almacenan a -80°C para su uso dentro de 3 meses o a -150°C para almacenamiento a largo plazo.

Medios de cultivo

El medio de expansión tumoral se produjo enriqueciendo 500 ml de DMEM avanzado (Thermo Fisher 12491-023) con 5 ml de penicilina-estreptomicina 100x (Thermo Fisher 15140-122), 5 ml de glutamax 100x (Thermo Fisher 35050-038) y 5 ml de Hepes 1M (Thermo Fisher 15630-056). A 70 ml de DMEM avanzado enriquecido, se agregaron 20 ml de medio acondicionado R-espondina 1 y 10 ml de medio acondicionado con Noggin (Van de Wetering et al.2015 Cell 161: 933-45) para preparar 100 ml de medio de expansión de tumor que se complementó adicionalmente con 2 ml de suplemento 50x b27 (Thermo Fisher 17504-044), 1 ml de nicotinamida 1 M (Sigma-Aldrich N0636), 250 pl 500 mM de N-acetilcisteína (Sigma-Aldrich A9165), 10 pl 5 mM A83-01 (inhibidor de TGFp, Tocris 2939) y 33 pl 30 mM SB202190 (inhibidor de p38, Sigma Aldrich S7067). El medio de expansión tumoral se complementó adicionalmente con 100 pl de Y27632 10 mM (inhibidor de la quinasa Rho, diclorhidrato de Abmole Y-27632) tras la siembra fresca de tumores de colon en presencia de EGF humano (Peprotech AF-100-15) o NRG-1/HRG humano (ImmunoTools 11343047). EGF y HRG son factores de crecimiento que estimulan la expansión organoide y su dosis determina la sensibilidad del ensayo de cribado. Se añadió EGF a dosis de 2.5 ng/ml, 5 ng/ml o 10 ng/ml durante la selección o 10 ng/ml o 50 ng/ml durante la expansión. La HRG se utilizó únicamente a 5 ng/ml.

El medio de expansión organoide de tipo salvaje es igual al medio de expansión de tumor, con un reemplazo: el DMEM avanzado enriquecido con 70 ml se reemplazó por una combinación de DMEM avanzado enriquecido con 20 ml y medio acondicionado con WNT3A de 50 ml (Van de Wetering et al. 2015 Cell 161: 933-45). Los organoides de colon normales derivados de tejido y los tumores de colon con APC de tipo salvaje son dependientes de WNT y, por lo tanto, requieren la presencia de WNT para su expansión.

Composición del gel

Los tumores de colon congelados se descongelaron rápidamente en un baño de agua a 37°C y se recogieron en 5 ml de DMEM avanzado enriquecido. Los organoides se sedimentaron mediante centrifugación de 5 minutos a 1000 rpm a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y se recogieron los organoides en medio de expansión tumoral sin factores de crecimiento. Esta suspensión de organoide se mezcló con extracto de membrana basal de factor de crecimiento reducido Cultrex, tipo 2, PathClear (Amsbio 3533-010-02). El porcentaje de gel de Cultrex final fue del 60% y el número de células por ml fue de 100.000.

Determinación de la capacidad de respuesta del factor de crecimiento de los organoides derivados del paciente

Para determinar si los organoides derivados del paciente respondían al tratamiento con factor de crecimiento, se sembraron como se describió anteriormente en presencia o ausencia de factores de crecimiento (EGF (5 ng/ml) o NRG (5 ng/ml)) y luego se cultivó durante 5 días. A continuación, se determinó el número de células viables usando el ensayo de viabilidad celular Cell Titer Glo (Promega, cat. No. G7571). La lectura de luminiscencia usando células estimuladas con factor de crecimiento se comparó luego con la obtenida usando células no estimuladas.

Preparación de placas de cultivo

La gelificación fue más rápida en placas de cultivo precalentadas. Por lo tanto, todas las placas de cultivo se colocaron a 37°C en una incubadora de CO2 humidificada (Eppendorf) el día antes de la siembra celular.

Para expandir los tumores de colon, se utilizaron placas de 24 o 6 pozos (Greiner Bio-One) y por pozo, se colocaron 3 o 10 gotas de 15 pl de suspensión de gel/organoide a distancias regulares. Se añadió medio de expansión tumoral (0.5 ml o 2 ml) que contenía entre 10 ng/ml y 50 ng/ml de EGF después de un período de gelificación de 30 minutos a 37°C. El día 1 de la siembra, el medio de expansión tumoral contenía 10juM de Y27632. Los reemplazos de medio durante la expansión fueron con medio de expansión de tumor que contiene EGF desprovisto de Y27632.

Para realizar un cribado, se utilizaron placas pclear de 384 pozos (Greiner Bio-One 781091). Por pozo, se dispensaron 15 pl de la mezcla de gel/organoide usando manipulación automática de líquidos. Tras 30 minutos de gelificación a 37°C, se añadieron 45 ul de medio de expansión de tumoride (o medio de expansión de organoide cuando fuera aplicable) en la parte superior del gel en cada pozo. Los medios se suplementaron con o sin factores de crecimiento y los anticuerpos y compuestos (de referencia) se mezclaron con el medio en placas de 96 pozos con fondo en V antes de aplicarlos a las placas de 384 pozos con gel solidificado.

Preparación de placas maestras de anticuerpos

Los anticuerpos de referencia (Cetuximab (4°C), anticuerpos de control negativo, anticuerpos dirigidos a HER3 o EGFR de un solo brazo y anticuerpos HER3/EGFR (en hielo seco)) se enviaron y almacenaron a 4°C para el cribado. Los anticuerpos biespecíficos y monoespecíficos se administraron en placas de 96 pozos de pozos profundos que se sellaron y enviaron a 4°C. En general, la notación para anticuerpos cLC monoespecíficos en todos los ejemplos se reconoce por el prefijo 'PG' mientras que la notación para anticuerpos cLC biespecíficos se reconoce por el prefijo 'PB'. Para evitar dudas, la notación de fragmentos Fab de anticuerpos cLC se reconoce por el prefijo 'MF'. Los anticuerpos se transfirieron manualmente a cuatro placas de 96 pozos con fondo en V (Greiner Bio-One 736-0118) en ubicaciones aleatorias que iban desde el pozo B02 al pozo G11 (60 pozos internos). También se añadieron anticuerpos de referencia a las placas en ubicaciones aleatorias, a igual concentración. Estas placas maestras de anticuerpos se utilizaron para preparar placas de dilución 1:10 en PBS. Las placas maestras y las placas de dilución se almacenaron selladas a 4°C. Para la validación de los resultados del cribado, se envió un panel guía de IgG biespecífica (46 anticuerpos a una concentración de 0.5 mg/ml) en microviales con tapón de rosca, para permitir una fácil aleatorización de los anticuerpos en las placas de cribado y evitar la contaminación cruzada y la evaporación. Antes de cada ejecución experimental, las IgG biespecíficas se colocaron en una placa de 96 pozos con fondo en V (60 pozos internos) junto con anticuerpos de referencia a 0.1 mg/ml diluyéndolos en PBS. Esta placa se diluyó una vez más 1:5 en PBS para lograr una segunda placa maestra que contenía anticuerpos a 20 pg/ml. Las diluciones y exposiciones en placa se realizaron utilizando el manipulador de líquidos Felix.

Regímenes de exposición

Las placas maestras de anticuerpos de 96 pozos con fondo en V de dosis alta y dosis baja se diluyeron 1:10 en medio de cultivo antes de la exposición. Las concentraciones de anticuerpos aplicadas en el cribado primario fueron 10 pg/ml y 1 pg/ml o 40 pg/ml y 4 pg/ml; y en el cribado de validación, las dosis de anticuerpos fueron 10 pg/ml y 2 pg/ml. Los anticuerpos se agregaron a los organoides 30 minutos después de la siembra. La exposición al anticuerpo antes de la fijación de la placa fue mínimamente de 7 días y máxima de 9 días.

Fijación y generación de imágenes

Para preparar las placas de tumor expuestas para la generación de imágenes, los organoides se fijaron y se tiñeron para visualizar los núcleos y el citoesqueleto de actina, respectivamente, como se describió anteriormente (Di et al PlosOne 2014, PMID 25289886). La generación de imágenes de las placas se realizó utilizando un dispositivo Molecular ImageXpress Micro XLS conectado a un brazo robótico Twister II como se describió anteriormente (Sandercock et al, Molecular Cancer 2015, PMID 26227951). En resumen, se capturaron apilamientos en z de cada pozo en una placa de 384 pozos usando una lente 4x, con un tamaño de paso z de 50 pm. El número de secciones por pozo varió de 20 a 24 secciones, para cubrir todo el rango de profundidad del gel en cada pozo.

Análisis de imágenes

Las imágenes capturadas se almacenaron en un servidor de datos central, accesible por la plataforma de análisis de imágenes 3D OcellO Ominer™ que permite el análisis paralelo directo de los apilamientos de imágenes 3D mediante su diseño computacional distribuido. El software analiza la estructura de los objetos (núcleos y citoesqueleto) detectados en cada pozo y sus posiciones relativas. Tras el análisis, se verificó la salida para detectar la calidad de las imágenes sin procesar y el método de análisis. Las mediciones por objeto que produjo el software (para los núcleos, los organoides, los núcleos dentro de los organoides, los lúmenes, la posición relativa de los lúmenes dentro de los organoides y la estructura completa (organoides, núcleos y lúmenes)) se agregaron posteriormente por pozo y se acoplaron los datos a la información de disposición de la placa (línea celular, condición del factor de crecimiento, tratamiento, etc.). Tras la agregación de datos, se verificó la coherencia de los datos dentro de los tratamientos de control, la ausencia de efectos de borde, la coherencia entre las repeticiones y el factor z' entre los controles positivos y negativos. A continuación, los datos se normalizaron con puntuación z y se inspeccionaron mediante la carga de los datos en TIBCO Spotfire® para eliminar valores atípicos adicionales. Se recolectaron 500 características morfológicas diferentes; luego, los datos se procesaron a través de una serie de estadísticas que hicieron una subselección de 3 a 20 de las ~500 características recopiladas de las imágenes del apilamiento en z, según la capacidad de este conjunto de características para distinguir el efecto del tratamiento de referencia del control negativo. morfología. La distancia entre la referencia y los controles negativos se calculó como una medida de distancia euclidiana (Figura 5) y se escaló entre cero y uno. Esta puntuación unificada de cambio de morfología se utilizó para discriminar aciertos en las cribas de compuestos. Las medidas de las características individuales seleccionadas, junto con la corroboración con las imágenes, se utilizaron para corroborar y verificar los efectos de los tratamientos del compuesto de impacto en los organoides.

Factor Z': el factor Z' es una medida estadística de la calidad de un ensayo de cribado de alto rendimiento e indica la ventana de separación entre los controles positivos y negativos. El factor Z' se define como 1 menos 3 veces la suma de las desviaciones estándar de los controles positivos y negativos dividida por la diferencia absoluta entre las medias de los controles positivos y negativos. Los valores Z' menores que 0 indican que hay demasiada superposición entre los controles negativos y positivos, los valores entre 0 y 0.5 indican una ventana de selección útil pero marginal y los valores entre 0.5 y 1.0 indican un ensayo excelente con una fuerte separación entre los controles positivos y negativos.

Tinción FACS de células obtenidas del organoide P18T utilizando anticuerpos cLC anti-LGR5 seleccionados

Se cultivaron organoides derivados de una muestra de cáncer colorrectal en extractos de membrana basal al 100% (BME, Amsbio), a 37°C y CO2 al 5%, con medio compuesto de DMEM avanzado/F12 (Invitrogen) complementado con: GlutaMax 2 mM (Invitrogen), HEPES 10 mM (Invitrogen), 1x B27 sin ácido retinoico (Invitrogen), e Gf 50 ng/ml (Peprotech), Noggin 0.1 pg/ml (Peprotech), inhibidor de rocas Y-27632 (Sigma-Aldrich), PGE2 10 nM (Sigma-Aldrich), SB202190 de 3 pm (Sigma-Aldrich), Gastrina 10 nM (Tocris), R-SPO1 1 pg/ml (hecho en casa), Nicotinomida 10 mM (Sigma-Aldrich), N-Acetil-cisteína 1.25 mM (Sigma-Aldrich ), 0.5 uM de A83-01 (Tocris). El día anterior al análisis, los organoides se desagregaron en células individuales. Para ello, los organoides se liberaron primero del BME retirando el medio de cultivo y resuspendiendo el BME en solución de recuperación celular (BD Biosciences) e incubando durante 1 hora en hielo. Posteriormente, los organoides se centrifugaron (todos los pasos de centrifugación fueron durante 5 minutos, 200 g a 4°C). El sedimento se resuspendió en 1 ml de solución de tripsina/EDTA al 50% (TE); PBS al 50%, pipeteado hacia arriba y hacia abajo, y evaluado visualmente con regularidad hasta que se logró una suspensión de una sola célula. El TE se diluyó en 10 ml de PBS y se centrifugó. Las células se lavaron dos veces en 10 ml de PBS antes de volver a suspenderlas en BME y se dividieron en alícuotas en gotas de 50 pl sobre placas precalentadas (37°C). Las gotas de BME se dejaron reposar durante 15 minutos antes de que se añadieran 500 pl de medio por gota. Después de 12 horas, las células se aislaron del BME usando una solución de recuperación celular. Después de 1 hora en hielo, las células se centrifugaron y se lavaron una vez en 10 ml de PBS que contenía BSA al 0.5% y EDTA 0.5 mM (regulador de tinción). A continuación, el sedimento se resuspendió en regulador de tinción y se contó. Se utilizó un máximo de 100.000 células/100 pl de anticuerpo. Después de contar el número apropiado de células, se centrifugaron y se resuspendieron en 100 pl del regulador de tinción que contenía el anticuerpo primario (IgG monoclonal y biespecífica) diluido a 10 pg/ml. Las células se incubaron en hielo durante 45 minutos, con inversión regular de los tubos para asegurar una tinción homogénea. Después de la incubación, las células se lavaron en 1 ml de regulador de tinción y se centrifugaron. Las células se lavaron de nuevo en 1 ml de regulador de tinción antes de incubar con 100 pl de regulador de tinción que contenía un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con R-PE (Invitrogen, H10104) diluido 1:400. Las células se incubaron durante 20 minutos en hielo, protegidas de la luz. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces en 1 ml de regulador de tinción antes de volver a suspenderlas en regulador de tinción que contenía DAPI 0.1 pM (Sigma-Aldrich). Las células se mantuvieron en hielo, se protegieron de la luz y se analizaron inmediatamente. Se excluyeron los dobletes usando SSC-W frente a SSC-A, y se usó DAPI para excluir las células muertas. La activación de los anticuerpos LGR5 se estableció basándose en la tinción del anticuerpo de control negativo que se generó contra la toxina tetánica (MF1337). La fluorescencia se detectó usando un BD FACS Aria Fusion usando el láser UV y el conjunto de filtros 450/50 para DAPI, y el láser verde con el filtro 582/15 para detectar la fluorescencia R-PE.

Enriquecimiento de ARNm de LGR5 después de la clasificación

Para evaluar si la tinción de LGR5 FACS enriquecida para las células que expresan LGR5, las células se clasificaron con la puerta de clasificación establecida de modo que se aisló el 15% más alto y el más bajo de células teñidas. Se clasificó un total de 2000 células en regulador de picroperfilado (proporcionado por la instalación de genómica del IRB), y las células clasificadas fueron luego procesadas por la instalación de genómica del IRB para la extracción de ARN y la síntesis de ADNc. La expresión de LGR5 se evaluó mediante PCR cuantitativa utilizando sondas TaqMan y TaqMan Universal PCR Master Mix (ambos de Applied Biosystems). Se utilizó la máquina de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) para ejecutar las reacciones en placas de reacción ópticas transparentes de 96 pozos con cubiertas ópticas, siguiendo las instrucciones del fabricante. La expresión entre las fracciones LGR5 negativa y positiva se evaluó usando una sonda LGR5 (Hs00173664_m1) y se normalizó usando la expresión del gen de control endógeno B2M (Hs99999907_m1). Las diferencias en la expresión del gen diana se determinaron utilizando el software StepOne 2.2 plus.

Tinción P18 para LGR5 y clasificación de la población positiva y negativa de LGR5 y las diferencias en el crecimiento entre esos dos

Las células se tiñeron como se describió previamente y las puertas de clasificación se establecieron de modo que el 15% más alto y el más bajo de células teñidas se clasificaron en 200 pl de medio de cultivo que contenía Primocin (Invitrogen). El número de celdas clasificadas se determinó basándose en el número de eventos clasificados por FACS. Después de la clasificación, las células se centrifugaron y se colocaron en placas a una densidad de 2000 células/25 pl de BME. El número de organoides formados después de dos semanas se contó manualmente usando un microscopio óptico invertido.

Tratamiento del organoide P18T con biespecíficos EGFRxLGR5

Para los experimentos de tratamiento con anticuerpos, el medio de cultivo se modificó y no contenía gastrina ni PGE2, y tenía una concentración reducida de EGF (2.5 ng/ml). Después de la desagregación de los organoides, se utilizó tinción con azul trifano (Sigma-Aldrich) para determinar el número de células vivas y se sembraron 5000 células/25 pl de BME en una placa de cultivo de tejido de 48 pozos. Cada tratamiento tenía 8 réplicas técnicas y se cultivó en 250 pl de medio/pozo. Tres días después de sembrar células individuales, el medio se retiró y se reemplazó con medio que contenía los tratamientos con anticuerpos (2 pg/ml). Después de 7 días desde la adición de los anticuerpos, la placa se escaneó usando un Olympus ScanR usando el objetivo lumínico x4, y el número de organoides se cuantificó usando ImageJ ejecutando una macro diseñada por la instalación de microscopía IRB.

El experimento se repitió en tres ocasiones distintas y se realizó una prueba T de muestras apareadas de dos colas para evaluar las diferencias significativas entre los tratamientos.

Aislamiento de ARN y análisis Q-PCR de los niveles de ARNm de LGR5 y CK20

Después de que se escanearon las placas de cultivo de tejidos de los tumoroides tratados para la enumeración, se aislaron los tumoroides usando una solución de recuperación celular y se incubaron en hielo durante 1 hora. A continuación, los tumores se centrifugaron y resuspendieron en 1 ml de TRIzol® Plus RNA Purification Kit (Life Technologies) y se extrajo el ARN total. Después de la separación de fases con cloroformo, la fase acuosa superior se mezcló con etanol al 70% y se lavó a través de columnas de ARN (kit PureLink™ RNA Mini, Life Technologies) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. El ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop. A continuación, el ARN se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). Se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real con sondas TaqMan y TaqMan Universal PCR Master Mix (ambas de Applied Biosystems) para cuantificar los niveles de ARNm de LGR5 (Hs00173664_m1) y CK20 (Hs00300643_m1). Las diferencias en la expresión se detectaron utilizando el método 2-AACT y el software StepOne 2.2 plus.

Medición ex vivo de niveles de ARNm y proteínas de LGR5 y EGFR en modelos PDX de diferentes indicaciones

Se usó ARNm extraído de tumores PDX cultivados in vivo para analizar los niveles de expresión de los genes LGR5 y EGFR mediante secuenciación de ARN (RNAseq). Los datos de la base de datos Crown Bioscience (http://hubase2.crownbio.com) se expresan como conversión log 2 de fragmentos por millón de kilobase (FKPM): Tabla 9. Además, las células tumorales extraídas de diferentes tumores PDX cultivados in vivo se tiñeron con 15 pg/ml de PG5816 (anti-LGR5), PG3755 (anti-EGFR) y (control) PG1337 y posteriormente se detecto el anticuerpo unido con antimarcación con PEy posteriormente se detectó el anticuerpo unido con anti-IgG humana marcada con PE. La Tabla 10 muestra las intensidades medias de fluorescencia para todas las tinciones de anticuerpos en varias indicaciones de cáncer.

Ejemplo 2: Generación de paneles de anticuerpos dirigidos a dianas de la ruta WNT utilizando selecciones de anticuerpos de fagos

Inmunización de ratones MeMo® con las cuatro dianas diferentes de WNT.

Se inmunizaron ratones MeMo® con constructos de expresión que codifican LGR4 y LGR5 humanos de longitud completa (pVax1_hLGR4-FLAG-HA y pVax1_hLGR5-FLAG-HA), con el dominio extracelular de LGR4 o LGR5 (pVax1_hLGR4(ECD)-GPA33-FLAG y pVax1_hLGR5(ECD)-GPA33-FLAG) o con proteínas recombinantes rhLGR4Fc, rhLGR5-Fc, rhZNRF3-Fc o rhRNF43-Fc (RND systems). Se cribaron sueros de ratón para detectar la evidencia de una respuesta inmune humoral dirigida hacia la diana en un ensayo basado en FACS usando líneas celulares Freestyle 293F generadas internamente que sobreexpresaban de manera estable el antígeno respectivo. La Figura 6 muestra un ejemplo de los datos. Los títulos de IgG en suero (definidos como la dilución de suero más alta que da una tinción de la línea celular Freestyle 293F que expresa de manera estable la diana de al menos tres veces el MFI del suero recolectado antes de la inmunización) de ratones inmunizados con éxito con las cuatro dianas de WNT se muestran en la Tabla 1. Los ratones que demostraron haber montado una respuesta inmune significativa y específica hacia el antígeno respectivo se retiraron del estudio y se recolectaron los tejidos linfoides de estos ratones (ganglios linfáticos inguinales y bazos). A partir de los ganglios linfáticos obtenidos, se generaron repertorios de anticuerpos de fagos 'inmunes' mediante RT-PCR utilizando pares de cebadores específicos de IgG y VH y clonación del conjunto policlonal de ADNc que codifican VH en un fagémido para la expresión de fragmentos Fab en la superficie de no fagolítico. Todas las bibliotecas generadas tenían un tamaño de más de 10A6 clones (transformantes individuales) y una frecuencia de inserción de más del 80%.

Selecciones de fagos para generar anticuerpos cLC específicos de la diana

Para generar paneles de anticuerpos cLC dirigidos a las dianas hLGR4, hLGR5, hZNRF3 y hRNF43, el rhLGR4-Fc, rhLGR5-Fc, rhZNRF3-Fc, rhRNF43-Fc (RND systems) o el ECD soluble de hRNF43 o mZNR (preparados internamente) se recubrieron con un soporte sólido y se seleccionaron repertorios de anticuerpos de fagos cLC sintéticos generados internamente para la unión a los antígenos recubiertos en presencia de un exceso de IgG humana (para evitar la selección del fago de unión a Fc) esencialmente como describen Marks et al. (J. Mol. Biol. 5 de diciembre de 1991; 222(3): 581-97). Paralelamente, también se utilizaron para las selecciones repertorios de anticuerpos de fagos "inmunes" elaborados a partir de animales inmunizados con la diana con éxito. Las selecciones de la proteína recubierta se realizaron en placas de microvaloración (NUNC, maxisorp) y las selecciones de las células Freestyle 293F que sobreexpresaron la diana respectiva se realizaron en solución; La elución del fago unido se realizó mediante un choque de pH usando glicina 100 mM (pH 2) o TEA 100 mM (pH 12). Después de una primera ronda de selección usando bibliotecas de anticuerpos de fagos sintéticos, el grupo policlonal de clones seleccionados se usó para preparar el fago nuevamente y los fagos se seleccionaron para unirse al mismo antígeno o se seleccionaron en células Freestyle 293F generadas internamente de manera estable sobre expresando el antígeno respectivo. Después de una sola ronda (bibliotecas inmunes), o dos rondas (bibliotecas sintéticas) de selección, se seleccionaron clones individuales y se usaron para preparar fagos monoclonales que se probaron para unirse a sus respectivas dianas en FACS usando una mezcla de dos líneas celulares: la parental (antígeno negativo) línea celular Freestyle 293F y células 293F Freestyle marcadas con DiD que sobreexpresaron de manera estable la diana WNT. Los clones de fagos que reconocían la población de células positivas al antígeno (marcadas con DiD) y no las células negativas al antígeno se consideraron específicos de antígeno y, por lo tanto, se caracterizaron más. La Figura 7 muestra un experimento para probar clones seleccionados para la unión específica de antígeno a células que expresan la diana mediante FACS.

Los clones que demostraron ser específicos de la diana se secuenciaron y agruparon sobre la base de su identidad de secuencia: un "grupo" de clones de anticuerpos se definió como un grupo de anticuerpos que comparten el mismo uso del gen VH V y que tienen una secuencia HCDR3 idéntica y longitud HCDR3 (Figura 17). Todos estos clones se derivan de un solo clon ancestral que se diversificó durante la respuesta inmune in vivo en los ratones MeMo. Un "superaglomeración" se definió como un grupo de clones que comparten el mismo uso del gen VH V y que tienen al menos un 70% de identidad de secuencia en HCDR3 y la misma longitud de HCDR3. Aunque esta definición es arbitraria, es probable (pero no probado) que estos clones también surgieran de un único precursor de células B que fue seleccionado, activado y diversificado durante la respuesta inmune humoral in vivo. Prácticamente, se espera que los clones en un superaglomeración se unan al mismo epítopo aunque con diferentes afinidades y/o diferentes ubicaciones en el epítopo. Por superaglomeración (definida como se describió anteriormente), luego se seleccionaron al menos dos clones para ingresar en el proceso de validación de clones, durante el cual se confirmó la unión específica a la diana y se verificó la secuencia del clon. Estos números se basan en clones Fab de los cuales el VH tiene un uso de gen de línea germinal y/o secuencia HCDR3 diferente. Los clones que pasaron el proceso de validación de clones (es decir, de los cuales se confirmó la unión a y la especificidad para la diana y para los cuales se validó la secuencia) se usaron luego para volver a clonar el gen VH en un vector de expresión para producir y caracterizar el correspondiente IgG. En total, se identificaron 667 anticuerpos diferentes que reconocieron específicamente uno de las cuatro dianas LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43, de los cuales 288 se caracterizaron más (Tabla 2). Posteriormente, todos estos clones se volvieron a clonar en formato biespecífico cLC IgG con un brazo Fab 'ficticio' (es decir, anti-TT no relevante) para poder caracterizar la interacción monovalente del brazo Fab dirigido a la diana WNT con su diana.

Ejemplo 3: Caracterización del panel de anticuerpos.

Los fragmentos Fab seleccionados (designados con el código MFnnnn) aislados de la presentación de fagos se volvieron a clonar en un vector de expresión de IgG1 que contenía mutaciones DEKK. Con este fin, el ADNc que codifica VH se escindió del vector fagémido que se usó para seleccionar el fragmento de anticuerpo y se volvió a clonar en el vector de expresión de IgG que contenía mutaciones DEKK (KK). Mediante cotransfección con un constructo de expresión que contiene las mutaciones complementarias (DE) DEKK y que codifica un fragmento Fab dirigido al antígeno de control no vinculante Toxoide tetánico (TT: MF1337), se obtuvieron IgG anti-WNTxTT biespecífico (WNT se refiere a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43). El panel de IgG1 biespecífico con actividad de unión monovalente a las dianas de WNT se produjo, purificó y caracterizó a continuación con respecto a su productividad y especificidad.

Se produjeron IgG biespecíficas a pequeña escala mediante cotransfección transitoria de los plásmidos que codifican ambos fragmentos Fab en células Freestyle 293F mediante la combinación de diferentes fragmentos Fab que se unen al brazo de dirección WNT (hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43) en el vector KK cargado positivamente con el fragmento de control Fab dirigido al toxoide tetánico en el vector biespecífico DE cargado negativamente. Después de la producción, las IgG biespecíficas se purificaron mediante cromatografía de afinidad de proteína A y el regulador se cambió por PBS. Las producciones exitosas dieron como resultado un anticuerpo IgG1 de longitud completa, con una concentración mínima de 0.1 mg/ml, a los que se les asignó un código único (PBnnnnn; en donde nnnnn representa un número generado aleatoriamente) para identificar la combinación específica de 2 fragmentos Fab de unión a diana diferentes.

Se ensayó la unión de las IgG biespecíficas producidas con éxito a sus dianas respectivas tanto en ELISA como en FACS. El ELISA se realizó usando rhLGR4-Fc, rhLGR5-Fc, rhZNRF3-Fc o rhRNF43-Fc a 2 pg/ml o Toxoide Tetánico a 25 pg/ml como recubrimiento. Las IgG se probaron a una concentración única de 5 pg/ml. Se consideró que las IgG se unían a rhLGR4-Fc, rhLGFR5-Fc, rhZNRF3-Fc o rhRNF43-Fc cuando la señal de OD450nm observada es cinco veces superior al fondo (señal de OD450nm del anticuerpo de control negativo). Además, se realizó un análisis FACS de la IgG biespecífica dirigida a TT y una de las cuatro dianas WNT (hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43) para determinar la unión específica a su respectiva diana WNT. El análisis FACS se realizó usando una tinción DiD, mezclando células Freestyle 239F (DiD-) sin marcar con antígeno marcado positivo (hLGR4, hLGR5, hZRNF3 o hRNF43 que expresan) células Freestyle 293F (DiD+). Las IgG biespecíficas siempre se probaron en paralelo en dos mezclas de células para determinar su especificidad. La IgG biespecífica que contiene un fragmento Fab dirigido a LGR4 o LGR5 se probó en células Freestyle 293F que sobreexpresan tanto hLGR4 como hLGR5 (mezcladas con células Freestyle 293F negativas al antígeno), y los anticuerpos de unión a ZNRF3 y RNF43 se probaron tanto en hZNRF3 como en hRNF43 que sobreexpresan células Freestyle 293F (mezcladas con células 293F Freestyle negativas al antígeno). Se consideró que las IgG biespecíficas se unían específicamente a hLGR4, hLGFR5, hZNRF3 o hRNF43 cuando la MFI de la población positiva al antígeno (células Freestyle 293F estables que expresan hLGR4, hLGR5, hZRNF3 o hRNF43) es cinco veces mayor que la MFI de la población antígeno negativa (células Freestyle 293F).

Se encontró que 41 de 66 fragmentos Fab LGR4, 69 de 84 fragmentos Fab LGR5, 92 de 105 fragmentos Fab ZNRF3 y 29 de 33 fragmentos Fab RNF43 se unían específicamente a sus respectivas dianas (hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43) en formato biespecífico (Biclonics®) tanto en FACS como en ELISA, o en algunos casos FACS solamente (fragmentos Fab de unión a hLGR4).

Caracterización del panel de anticuerpos biespecíficos

Las IgG monovalentes biespecíficas de las que se confirmó que se unían específicamente a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43 humanos se caracterizaron adicionalmente por su afinidad, estabilidad, capacidad de bloqueo de R-espondina3 y reactividad cruzada de ortólogos de ratón, después de lo cual se realizó una subselección adicional.

Análisis FACS de titulación por afinidad

Los anticuerpos de unión se valoraron en un anticuerpo limitado FACS, para clasificarlos con respecto a su afinidad. La IgG monovalente se dirigió a hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43 (todos combinados con el fragmento Fab del toxoide tetánico) en la superficie celular de las células Freestyle 293F que sobreexpresan hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43. Cada IgG se probó en su correspondiente línea celular que sobreexpresa Freestyle 293F. Se ensayó una serie de dilución doble de IgG (5 pg/ml-0.08 ug/ml) en un número fijo de células (5 x 105 células/pozo) estable que expresaban las dianas de WNT. La intensidad de fluorescencia media (MFI) de cada medición individual se determinó mediante FlowJo (software de análisis FACS BD). Para cada IgG, los valores de MFI se representaron frente a la concentración de anticuerpo y, a partir de estas curvas, se calculó el área bajo las curvas (AUC). En base a los valores de AUC, se realizó una clasificación de la IgG biespecífica por diana. En la Figura 8 se ofrece un ejemplo de los datos utilizados para la clasificación de afinidad.

Reactividad cruzada de ortólogos de ratón de anticuerpos seleccionados

Para definir más las características de unión de la IgG biespecífica, se determinó la reactividad cruzada del ortólogo de ratón. Los constructos que expresan los ortólogos de ratón de mLgr5, mZNRF3 y mRNF43 (pEF1_mLgr5-Myc-HIS, pDisplay_mZnrf3-Myc-PDGFR(TM), pDisplay_mRnf43-Myc-PDGFR(TM)) se transfectaron transitoriamente en células HEK293T. Se utilizó IgG monovalente a una concentración de 5 pg/ml para la tinción y se analizó la unión de IgG mediante FACS. Las IgG biespecíficas se consideraron de reacción cruzada a ratón si la intensidad fluorescente media (MFI) aumentaba dos veces en comparación con las células Freestyle 293F no transfectadas. 92 de 92 IgG anti-ZNRF3 presentaron reactividad cruzada con mZnrf3; 9 de las 29 IgG anti-RNF43 tuvieron reactividad cruzada con mRnf43 y 18 de las 69 IgG anti-LGR5 tuvieron reactividad cruzada con el ortólogo Lgr5 de ratón. La reactividad cruzada de mLgr4 se probó en un ELISA sobre la proteína rmLgr4-Fc (RND systems). Las IgG biespecíficas se consideraron con reactividad cruzada de mLgr4 en caso de que la DO450nm fuera 5 veces superior al fondo (señal de DO450nm del anticuerpo de control negativo). Se ensayó la unión de IgG a una concentración única de 5 pg/ml a rmLgr4-Fc y se comprobó la reactividad cruzada. 36 de 41 IgG anti-LGR4 dieron positivo para reactividad cruzada mLgr4.

Bloqueo de R-espondina

Se probaron todas las IgG biespecíficas en un ELISA de bloqueo de ligando para poder probar si los anticuerpos dirigidos a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43 pueden interferir con la unión de R-espondina3. Se ensayó la unión de las proteínas de fusión Fc del dominio extracelular de las cuatro dianas WNT a R-espondina3 recubierto en presencia de un exceso de IgG biespecífica dirigida a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43. Para probar la IgG biespecífica dirigida a las diferentes dianas por su capacidad para bloquear la interacción de la proteína de fusión Fc respectiva con rhR-espondina3, se probaron en un ELISA de bloqueo. Las IgG se probaron usando una concentración única de IgG de 15 |jg/ml.

Los clones se consideraron bloqueantes cuando en dos ensayos independientes se redujo al menos el 50% de la señal de OD450nm. Cuando sólo se redujo el 20-50% de la señal de OD450nm, estos clones se consideraron parcialmente bloqueantes. Un subconjunto de IgG dirigido a ZNRF3 (48) y RNF43 (10) y el panel completo LGR4 (4 l) y Lgr5 (69), se probaron para determinar la capacidad de bloqueo de R-espondina. Para LGR4, 3 estaban bloqueando y 5 estaban bloqueando parcialmente. Para ZNRF3, se identificó 1 bloqueador y 1 bloqueador parcial. Para RNF43 se identificaron 3 bloqueadores y 2 bloqueadores parciales, todos pertenecientes a 2 superaglomeraciones diferentes. Para el panel LGR5, se identificaron 10 IgG que bloquearon parcialmente la unión de R-espondina3. En la Figura 9 se ofrece un ejemplo de los datos generados en el ensayo de bloqueo de R-espondina3.

Medición de la estabilidad de anticuerpos a 40°C

Para obtener una indicación de la estabilidad de la IgG biespecífica, todas las IgG se incubaron en medio que contenía suero a 40°C durante 1 semana y luego se comparó su unión en ELISA con la de los biespecíficos incubados en el mismo medio a 4°C. Después de 1 semana, las IgG se utilizaron en un examen ELISA para determinar si conservaban la unión a su diana. La unión se determinó por el porcentaje de señal de DO450nm que quedaba después de una semana de incubación a 40°C en comparación con una semana de incubación a 4°C. La mayoría de las IgG se analizaron dos veces; cuando una IgG retuvo al menos el 50% de su unión en dos ensayos independientes, se consideró estable. Cuando en los dos experimentos la estabilidad varió, estas IgG se consideraron parcialmente estables, y cuando la IgG retuvo dos veces menos del 50% de unión, se consideraron inestables. Para LGR4, 12 de 41 IgG retuvieron unión (7 parcialmente estables, 2 indeterminadas; no se unieron en ELISA), para LGR5 38 de 69 IgG retuvieron unión (7 parcialmente estables), para ZNRF328 de 92 IgG retuvieron unión (10 parcialmente estables) y para RNF43 10 de 29 IgG retuvieron la unión (9 parcialmente estables).

Clasificación y selección de IgG biespecíficas

Una vez finalizada la caracterización, se recopilaron los datos y se realizó una clasificación basada en todos los datos obtenidos. La selección de fragmentos Fab dirigidos a Wnt para el cribado funcional de seguimiento se realizó de la siguiente manera:

Se seleccionaron IgG biespecíficas que retuvieron la unión de al menos 50% a 40°C. A continuación, se seleccionaron los aglutinantes de mayor afinidad. Esta selección contenía ligantes con diferentes características, por ejemplo, reactividad cruzada de ortólogo de ratón o capacidad de bloqueo de R-espondina. En total, se seleccionaron 54 fragmentos Fab biespecíficos dirigidos a las cuatro dianas de WNT diferentes para el cribado funcional; para LGR4 se seleccionaron 10 de 41 fragmentos Fab, para LGR5 17 de 69 fragmentos Fab, para ZNRF3 18 de 92 fragmentos Fab y para RNF439 de 29 fragmentos Fab (Tabla 3).Generación de paneles para cribado funcional

Los fragmentos Fab de direccionamiento de WNT seleccionados contra hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43 se usaron para la generación de un gran panel de anticuerpos biespecíficos (>500 biespecíficos). Los fragmentos Fab seleccionados que se dirigen a WNT se combinaron con fragmentos Fab de unión a tirosina quinasa del receptor (RTK) en un panel de IgG biespecífica y se produjeron y purificaron. Los fragmentos Fab específicos para EGFR y HER3 que se seleccionaron bloquean la activación del receptor en ensayos basados en células no interfieren con la funcionalidad de otro fragmento Fab cuando se combinan en formato biespecífico. Se utilizaron cuatro fragmentos EGFR Fab MF3755, MF4280, MF3370 y MF4289, así como cuatro fragmentos HER3 Fab MF3178, MF3176, MF3125 y MF4863 en combinación con los fragmentos Fab seleccionados dirigidos a WNT (véase Tabla 5 para una subselección del panel producido).

Los biespecíficos se produjeron por coexpresión de vectores IgG en los que el brazo WNT se expresó en la cadena pesada que contenía la mutación KK cargada positivamente y el brazo RTK se expresó en la cadena pesada que contenía la mutación DE cargada negativamente, purificado y validado por su unión, especificidad y estabilidad de la diana. Los paneles de biespecíficos que pasaron el control de calidad (QC) de unión y estabilidad se utilizaron para el cribado funcional (53 de 54 fragmentos Fab dirigidos a WNT pasaron el QC). El panel de >500 anticuerpos biespecíficos purificados y validados que se dirigen a una de las cuatro dianas de WNT (hLGR4, hLGR5, hZNRF3 o hRNF43) y un fragmento Fab EGFR o HER3 o toxoide tetánico como control negativo simulado del fragmento Fab se cribaron para determinar su actividad frente a organoides derivados del paciente en los ensayos de selección funcional que se describen a continuación.

Ejemplo 4: Cribado funcional de anticuerpos biespecíficos en organoides de colon

Los organoides de colon se derivan de células madre (cancerosas) positivas para LGR5 cultivadas en medio de expansión que contiene factor de crecimiento que permite la formación de estructuras de colon epitelial que forman un lumen funcional (Sato et al. 2011 Gastroenterology 141: 1762-1772). El crecimiento, el desarrollo y la formación de lumen de los organoides dependen de los antecedentes genéticos de las células de cáncer colorrectal y de la respuesta a los factores de crecimiento estimulantes del crecimiento, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o la Neurregulina-1 (NRG)/Heregulina (HRG). Aunque la morfología de los tumores de CCR de diferentes pacientes difiere ampliamente, el perfil morfológico es consistente entre los tumoroides del mismo origen y son genéticamente casi idénticos al tumor original del que se derivaron. Por lo tanto, el análisis cuantitativo de alto contenido de imágenes de organoides de CCR cultivados puede discriminar los organoides de CCR de diferentes pacientes y también se puede utilizar para medir los cambios morfológicos asociados con la activación de rutas de señalización, por ejemplo, impulsado por los ligandos para los receptores HER, por ejemplo, EGF y HRG. De manera similar, se puede medir la inhibición de estas respuestas mediante anticuerpos bloqueadores de la función u otras moléculas terapéuticas. El análisis basado en imágenes permite medir cambios en la morfología que pueden ser independientes de la proliferación celular, proporcionando información adicional sobre la actividad del compuesto a la que se obtiene de los ensayos de proliferación convencionales.

Los cambios fenotípicos inducidos por compuestos, por lo tanto, forman la base para el cribado funcional de anticuerpos en organoides de CRC.

Los anticuerpos biespecíficos que se han desarrollado se dirigen a EGFR o HER3 en combinación con las proteínas LGR4, LGR5, RNF43 o ZNRF3 expresadas en la superficie celular relacionadas con la señalización de WNT. El sistema de detección está diseñado para monitorizar la inhibición del crecimiento tumoral debido a la actividad de los anticuerpos biespecíficos. Esto se puede usar tanto para la selección de organoides (y el perfil molecular asociado) que son sensibles a la inhibición dirigida de rutas específicas como para la selección de moléculas nuevas que son activas en los organoides.

Selección de modelos de tumor de colon

Los modelos de tumor de colon usados para las cribas se seleccionaron basándose en la demostración de cambios morfológicos en respuesta a EGF, HRG o WNT3A. Las respuestas morfológicas a estos factores se investigaron en un panel de 20 tumores de origen diferente del paciente (Van de Wetering et al. 2015 Cell 161: 933-45). Primero, los tumoroides se expandieron, dividieron y volvieron a sembrar en placas de 384 pozos para analizar y documentar la morfología básica después de 1 semana de crecimiento. A continuación, se analizaron los mismos 20 tumores para determinar su capacidad de respuesta a los factores de crecimiento, siendo EGF o HRG, o sin factor de crecimiento presente en el medio de expansión. Para ello, se analizaron las 500 características morfológicas y se midieron los cambios inducidos por los factores solubles. Se seleccionó un conjunto de características robustas para cada organoide que permitió la medición de la respuesta del factor de crecimiento y la discriminación entre cultivos de tumores dependientes del factor de crecimiento y cultivos de tumores independientes del factor de crecimiento (véase Tabla 4). Esto demostró que ninguna característica única era suficiente para cuantificar de manera óptima las respuestas en diferentes organoides de CRC. Basándose en estos datos, se seleccionaron las siguientes líneas de tumores: P18T (APCmut) que depende en gran medida de la señalización de EGFR para el crecimiento y la formación de estructuras de lumen ramificadas dentro de los tumores; P14T (APCmut, SMAD4mut) que muestra claros efectos de alteración de la morfología sobre la señalización e inhibición de EGFR y HER3; P19Tb (APC*1, pero PIK3CA, TP53, BRAF, ARID1A, ARID2, ERBB3, POLE y mutante RNF43) como un modelo de tumor que carece de mutaciones APC y, por tanto, depende de WNT3A para su expansión; finalmente, P26T (APCmut, KRASmut, TP53muty CTNNB1mut) como modelo que no depende de la presencia de factores de crecimiento para su expansión. En la selección inicial de anticuerpos biespecíficos, P26T no mostró ninguna dependencia del factor de crecimiento ni sensibilidad hacia los anticuerpos dirigidos al receptor del factor de crecimiento, y se eliminó de la selección adicional de anticuerpos.

Identificación de fragmentos Fab funcionales en anticuerpos biespecíficos

Para identificar anticuerpos biespecíficos funcionales capaces de alterar las características morfológicas de los tumores de colon, se compararon con condiciones de crecimiento sin estimulación de EGF y con el efecto de compuestos inhibidores de la señalización de EGFR/MAPK (por ejemplo, Cetuximab y Trametinib) en condiciones de crecimiento de EGF. Los anticuerpos biespecíficos funcionales se definieron por su capacidad para limitar la expansión tumoral en condiciones de EGF en la dirección del perfil morfológico obtenido por los inhibidores de señalización de EGFR/MAPK y/o omitiendo EGF del medio de cultivo. Los fragmentos Fab dirigidos a WNT que potenciaron el efecto del brazo dirigido a EGFR son aquellos que mostraron una capacidad inhibidora del crecimiento significativamente mejorada en comparación con el fragmento Fab dirigido monovalente equivalente (EGFRxTT biespecífico).

Se compararon anticuerpos biespecíficos que solo se dirigieron a LGR4, LGR5, ZNRF3 o RNF43 (en combinación con el fragmento de toxoide tetánico no dirigido (TT)-Fab) con la morfología del control negativo en un medio que no contiene factor de crecimiento (P19Tb) o medio que contiene EGF o HRG (P18T y P14T) para buscar los efectos potenciales de dirigirse a los receptores de señalización de WNT solos.

Los anticuerpos biespecíficos que llevan fragmentos Fab dirigidos a HER3 se compararon funcionalmente con las condiciones de crecimiento sin estimulación de HRG o el efecto de los anticuerpos dirigidos a HER3 y el inhibidor de PI3K en condiciones de HRG; los anticuerpos biespecíficos inhibidores de HER3 funcionales se definieron como aquellos que inhibían la respuesta de crecimiento estimulada por HRG en la misma dirección en el espacio euclidiano que el inhibidor de la quinasa MEK, Trametinib, sin condiciones de cultivo de HRG y/o anticuerpos de referencia dirigidos a HER3. Los fragmentos Fab dirigidos a WNT que potenciaron el efecto del brazo dirigido a HER3 en términos de efecto inhibidor del crecimiento en comparación con el HER3 biespecífico monovalente equivalente se consideraron como fragmentos Fab candidatos dirigidos a diana.

Selección de candidatos a anticuerpos biespecíficos en el cribado primario

Anticuerpos biespecíficos que, en presencia de EGF, indujeron un cambio en la morfología de los tumores de colon P14T y P18T acercándose, igualando o superando el fenotipo en ausencia de factores de crecimiento o presencia de inhibidores de EGFR/MAPK de referencia, estos anticuerpos fueron identificados como candidatos potenciales. De manera similar a las condiciones de EGF, los anticuerpos probados en condiciones de cultivo de HRG se marcaron para seguimiento si el efecto se acercaba, igualaba o excedía la distancia de control negativo de las condiciones sin factor de crecimiento y/o inhibidores de referencia HER3/PI3K. Para P19Tb, que era relativamente insensible al tratamiento con factor de crecimiento, la selección de anticuerpos funcionales se basó en el cálculo de la distancia de los controles negativos marcada por el perfil morfológico inducido por Trametinib y el inhibidor de PI3K CH5132799.

Los paneles biespecíficos se seleccionaron en 3 tumores de colon diferentes (P18T, P14T y P19Tb). El panel de anticuerpos examinados probó las combinaciones de cuatro fragmentos Fab dirigidos a EGFR diferentes, cuatro fragmentos Fab dirigidos a HER3 diferentes y un fragmento Fab antitetánico (control negativo) con 53 fragmentos Fab dirigidos a WNT diferentes y un fragmento Fab dirigido a TT. Cada anticuerpo biespecífico se puntuó por su capacidad para inhibir el crecimiento tumoral. Ninguna de las combinaciones de fragmentos TT/WNT inhibió el crecimiento tumoral (0/53). Dentro del grupo de fragmentos Fab dirigidos a EGFR, el fragmento Fab MF3755 fue más potente: 22/53 combinaciones de fragmentos Fab MF3755/WNT biespecíficos inhibieron el desarrollo de tumores. El segundo fragmento dirigido a EGFR fue MF4280 con 4/53 combinaciones de fragmentos Fab de EGFR/WNT inhibidores activos. Una combinación (1/53) de fragmentos biespecíficos MF3370/WNT Fab dirigidos a EGFR mostró actividad inhibidora y ninguna (0/53) de las combinaciones biespecíficas de fragmentos MF4289/WNT Fab dirigidos a EGFR limitó significativamente el crecimiento tumoral. Dentro del fragmento Fab dirigido a HER3 que contiene un grupo de anticuerpo biespecífico, el fragmento Fab MF3178 en combinación con los fragmentos Fab dirigidos a WNT fue más potente: 19/52 combinaciones de MF3178/WNT inhibieron el crecimiento tumoral. El segundo fragmento Fab dirigido a HER3 fue MF4863 con 6/53 anticuerpos biespecíficos activos MF4863/WNT. Los anticuerpos biespecíficos que contienen los fragmentos Fab dirigidos a HER3 MF3125 (0/53) y MF3176 (0/52) no mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral.

En la clasificación, los fragmentos Fab dirigidos a RTK que se combinaron más potentemente en el formato de IgG biespecífico con los fragmentos Fab dirigidos a WNT fueron MF3755 como el fragmento Fab dirigido a EGFR y MF3178 como el fragmento Fab dirigido a HER3. Los fragmentos Fab dirigidos a LGR4 MF5777 y MF5781, los fragmentos Fab dirigidos a LGR5 MF5790, MF5803, MF5814, MF5816, MF5817 y MF5818, los fragmentos Fab dirigidos a RNF43 MF5832 y MF5836 y los fragmentos Fab dirigidos a ZNRF3 MF58588 y MF5850, M888 fueron identificados como candidatos potenciales para hacer avanzar a la criba de validación en función de su efecto funcional sobre la morfología de los tumores de P18T, P14T y P19Tb cuando se combinan con fragmentos Fab dirigidos a RTK en el formato de IgG biespecífico. Los fragmentos Fab dirigidos a LGR4, LGR5, RNF43 y ZNRF3 se combinaron con los fragmentos Fab dirigidos a EGFR MF3755, los fragmentos Fab dirigidos a HER3 MF3178 o los fragmentos Fab TT no dirigidos MFa 1337 y se produjeron en nuevos lotes para confirmar su actividad en la criba de validación de seguimiento.

Criba de validación de anticuerpos biespecíficos RTK/WNT

Debido a que los candidatos de anticuerpos biespecíficos RTK/WNT habían mostrado actividad potencialmente relevante tanto en EGF como en condiciones de cultivo de HRG, el cribado de validación de los anticuerpos candidatos biespecíficos también se realizó en dos condiciones de factor de crecimiento: 5 ng/ml EGF o 5 ng/m1 HRG. Los controles incluyeron pozos que recibieron medio de cultivo sin EGF ni HRG. Otros controles usados en condiciones de factor de crecimiento: Cetuximab (EGFR), PG3755 (EGFR/EGFR), Trametinib (MEK), CH5132799 (PI3K), PG3178 (HER3/HER3), PG2863 (HER3/HER3), PG3794 (HER3/EGFR) y PB4522 (HER3/EGFR). PG1337 (TT/TT) sirvió como un anticuerpo de control negativo, y se denominó control negativo, junto con los pozos que recibieron volúmenes iguales de DMSO o PBS como los pozos tratados con compuesto o anticuerpo, respectivamente. El cribado de validación de anticuerpos de 46 biespecíficos se realizó en 24 tumores de colon de diferente origen de pacientes, por duplicado o por cuadruplicado. El conjunto de líneas de tumor de colon ensayadas consistió en 3 muestras de pacientes dependientes del factor de crecimiento descritas en Van de Wetering et al. (2015 Cell 161: 933-45): P18T, P14T y P8T y 2 muestras de pacientes independientes del factor de crecimiento, P19Tb y P28N. Se examinó un nuevo conjunto de 19 tumores de colon: 10 líneas de tumor de colon primarias dependientes del factor de crecimiento, 5 líneas de tumor de colon primarias independientes del factor de crecimiento y 4 líneas de tumor de colon metastásico (dependientes del factor de crecimiento). El cribado de los candidatos a anticuerpos biespecíficos en el panel de 24 diferentes líneas de tumor de colon derivadas de pacientes reveló que la dependencia del factor de crecimiento para la excrecencia del tumor es capaz de identificar la inhibición tumoral mediada por el fragmento Fab que se dirige a RTK.

El punto de corte para identificar anticuerpos inhibidores de tumores de colon funcionales en el cribado de validación de anticuerpos biespecíficos se calculó normalizando el perfil morfológico en una escala de 0 (fenotipo igual a un perfil inhibido por completo del crecimiento) y 1 (fenotipo similar a los controles negativos). Cada vez que un solo anticuerpo, a una determinada dosis, en una determinada línea tumoral puntuó menos de 0.5, este tratamiento con anticuerpos se marcó mostrando inhibición del desarrollo tumoral. Se puntuó el número de veces que un anticuerpo, a una determinada dosis en condiciones de cultivo de EGF o HRG, mostró inhibición y se expresó como un porcentaje del número de pozos tratados para esa condición. Este porcentaje se calculó en las 24 líneas de tumor de colon examinadas.

El cribado de validación en 24 tumores de colon identificó cuatro fragmentos Fab dirigidos a LGR5 y 2 fragmentos Fab dirigidos a RNF43 que potenciaron la inhibición del desarrollo tumoral mediada por fragmentos RTK-Fab: MF5816, MF5814, MF5818 y MF5790 como fragmentos Fab de anticuerpos dirigidos a LGr 5 y MF5832 y MF5836 como RNF43 dirigido a fragmentos Fab. El anticuerpo de clasificación superior fue el anticuerpo biespecífico EGFR/LGR5 PB10651 compuesto por los fragmentos Fab dirigidos MF3755 y MF5816: Figura 10. En condiciones de HRG, el anticuerpo de clasificación superior fue el anticuerpo biespecífico HER3/LGR5 PB10748 compuesto por los fragmentos Fab dirigidos MF3178 y MF5816. Esto mostró, en dos condiciones de factor de crecimiento independientes y en combinación con dos fragmentos Fab dirigidos a RTK diferentes, que los fragmentos Fab dirigidos a LGR5 MF5816 son los fragmentos Fab dirigidos a WNT más potentes que mejoran el direccionamiento RTK. MF5816 combinado con MF3755 en PB10651 agrega otro nivel de inhibición tumoral al reducir de manera potente el crecimiento y desarrollo de los tumores, observable por una mayor pérdida de formación de lumen, encogimiento celular y redondeo de los núcleos. Estos hallazgos morfológicos indican que el anticuerpo EGFR/LGR5 PB10651 bloquea activamente la señalización del factor de crecimiento epidérmico e induce una respuesta de muerte celular en las células tumorales de crecimiento deteriorado: Figura 11. Este fenotipo morfológico no se observó con el anticuerpo dirigido a EGFR Cetuximab ni cuando se formateó MF3755 como una IgG convencional.

Selección del anticuerpo candidato principal

Se seleccionó PB10651 (anticuerpo biespecífico EGFR/LGR5 (compuesto por los fragmentos Fab MF3755 y MF5816)) como el anticuerpo candidato principal en condiciones de EGF de 5 ng/ml para las siguientes características: PB10651 mostró efectos inhibidores potentes a una prueba de 10 pg/ml dosis en el 75% de los 24 modelos diferentes de tumor de colon; 2) El 67% de los pozos tratados con PB10651 a 10 pg/ml (40/60) mostraron una reducción del crecimiento de más del 50%; 3) el 52% (31 de 59 pozos) mostró una reducción del crecimiento de más del 50% tras el tratamiento con PB10651 a 2 pg/ml; 4) PB10651 superó a Cetuximab (47% (56/119) a 10 pg/ml y 29% (35/119) a 2 pg/ml) y al anticuerpo de referencia e Gf R/TT PB9919 (27% (16/60) a 10 pg/ml y 5% (3/60) a 2 pg/ml).

El PB10647 (EGFR/LGR5 MF3755xMF5814) es el segundo anticuerpo candidato que inhibió el 54% de los 24 modelos diferentes de tumor (13/24) a 10 pg/ml, y se encontró una reducción del crecimiento de más del 50% en el 52% de los pozos expuestos (31/60) a 10 pg/ml y al 37% (22/60) a 2 pg/ml.

Otros anticuerpos EGFR/LGR5 son PB10659 (MF3755xMF5818), eficaces en el 50% de los 24 modelos de tumor (12/24), el 50% de los pozos expuestos con PB10659 a 10 pg/ml mostraron inhibición (30/60) y 32 % (19/60) a 2 pg/ml. PB10627 (MF3755xMF5790) fue activo en el 42% de los tumores (10/24) y mostró una reducción a 10 pg/ml en el 39% de los pozos (23/59) y a 2 pg/ml en el 33% de los pozos (20/60). PB10631 (MF3755xMF5803) fue activo en 33% de los tumoroides (8/24) e inhibitorio a 10 pg/ml en 34% de los pozos (20/59) y en 12% (7/59) a 2 pg/ml. PB10655 (MF3755xMF5817) fue activo en el 20% (5) de los 24 modelos de tumor y mostró inhibición en el 25% de los pozos (15/60) a 10 pg/ml y 6/60 (10%) a 2 pg/ml.

El anticuerpo EGFR/LGR4 PB10619 (MF3755xMF5777) fue activo en modelos de tumor al 29% (7/24) y condujo a la inhibición del tumor en el 28% (17/60) de los pozos a 10 pg/ml y al 15% (9/60) a 2 pg/ml. El anticuerpo EGFR/LGR4 PB10623 (MF3755xMF5781) fue activo en 8 de los 24 modelos de tumor (33%) e inhibió a 10 pg/ml en el 30% de los pozos (18/60) y el 10% de los pozos a 2 pg/ml (6 / 60).

El anticuerpo EGFR/RNF43 PB10661 (MF3755xMF5832) fue activo en 13 de los 24 modelos de tumor (54%) y mostró inhibición en 42% de los pozos (25/60) a 10 pg/ml y 22% (13/60) a una dosis de prueba de 2 pg/ml. El anticuerpo EGFR/RNF43 PB10667 (Mf 3755xMF5836) fue activo en 13/24 modelos de tumores (54%) y mostró inhibición a 10 pg/ml en el 35% de los pozos (21/60) y a 2 pg/ml en el 20% de los pozos (12/60).

Los anticuerpos EGFR/ZNRF3 son: PB10675 (MF3755xMF5850), activos en 8/24 modelos de tumor (33%) con 35% de los pozos probados (21/60) que muestran más del 50% de inhibición a 10 pg/ml y 15% (9/60) a 2 pg/ml; PB10695 (MF3755xMF5884) fue activo en el 37% de los modelos de tumor (9/24) y mostró inhibición en el 34% (20/59) a 10 pg/ml y 12% (7/59) a 2 pg/ml; PB10679 (MF3755xMF5853) inhibió el desarrollo de tumores en el 21% de los modelos de tumores (5/24), el 20% de los pozos a 10 pg/ml (12/60); PB10703 (MF3755xMF5888) fue activo en 5 de los 24 modelos de tumor (21%) y se inhibió a 10 pg/ml en el 22% de los pozos (13/60) y a 2 pg/ml en el 12% de los pozos (7/59).

El PB10748, el anticuerpo HER3/LGR5 compuesto por los fragmentos Fab MF3178 y MF5816, es activo como un anticuerpo inhibidor de tumores estimulados por HRG en el 62% de los modelos de tumores de colon probados (15/24), mostrando inhibición en el 56% de los pozos expuestos (67/120). PB10748 superó al anticuerpo de referencia HER3/TT PB9215 (MF3178xMF1337) que inhibió más del 50% del desarrollo de tumores estimulados por HRG en el 34% (41/120) de los pozos expuestos.

Otros anticuerpos HER3/LGR5 son: PB10735 (MF3178xMF5814), activo en 11/24 modelos de tumor (46%) e inhibidor en el 43% de los pozos expuestos (51/118); PB10756 (MF3178xMF5818) fue activo en 8/24 (33%) de los modelos de tumor e inhibidor en el 37% de los pozos expuestos (44/119); PB10715 (MF3178xMF5790) fue activo en 12/24 (50%) de los modelos de tumor e inhibidor en 42% de los pozos (49/117); PB10719 (MF3178xMf 5803) fue activo en 7/24 (29%) de los modelos de tumor e inhibidor en el 34% de los pozos expuestos (40/119); PB10752 (MF3178xMF5817) fue activo en 12/24 (50%) de los modelos de tumor e inhibitorio en el 28% de los pozos (33/120).

Dos anticuerpos HER3/RNF43 son: PB10764 (MF3178xMF5836), activo en 17/24 modelos de tumor (71%) e inhibidor en el 38% de los pozos expuestos (46/120) y PB12336 (MF3178xMF5832), activo en 11/24 modelos de tumor (46%) e inhibitorio en 41% de los pozos expuestos (49/120).

Dos anticuerpos HER3/LGR4 son: PB10711 (MF3178xMF5781, activo en el 62% de los modelos de tumor (15/24) e inhibidor en el 50% de los pozos expuestos (59/119) y PB10707 (MF3178xMF5777), activo en 13 de los 24 modelos de tumores probados (54%) e inhibitorios en 41 de los 120 pozos expuestos (34%).

Los anticuerpos biespecíficos que se dirigen tanto a HER3 como a ZNRF3 son: PB10776 (MF3178xMF5853), activo en 11/24 (46%) de los modelos de tumores expuestos a HRG e inhibidor en el 40% de los pozos expuestos (48/120); PB10772 (MF3178xMF5850), activo en modelos 12/24 (50%) e inhibitorio en 39% de los pozos expuestos (46/119); PB10780 (MF3178xMF5855), activo en 8/24 (33%) modelos de tumor de colon y 31% de los pozos expuestos (37/119); PB10800 (MF3178xMF5888) fue activo en 12/24 modelos de tumores (50%) e inhibitorio en el 29% (34/119) de los pozos expuestos.

Ejemplo 5: Caracterización del anticuerpo candidato principal

Medición de la afinidad de la unión de anticuerpos biespecíficos utilizando un ensayo basado en células.

Después de la optimización del protocolo de yodación, se obtuvo una proteína PB10651 marcada con una radiactividad específica de 40 GBq/pmol. La pureza radioquímica fue >99% según se analizó mediante precipitación de proteínas. En el ensayo de Lindmo, solo se observó una pequeña reducción de la inmunorreactividad. Se estimó que la inmunorreactividad de 125I-PB10651 hacia EGFR y lGR5 era >89% usando células CHO que expresaban e Gf R o LRG5. Los resultados del ensayo de Lindmo se muestran en la Figura 12. Utilizando mediciones de afinidad en estado estacionario, se midió que la Kd de 125I-PB10651 hacia las células CHO-LGR5 era de 0.86 ± 0.13 nM, y la Kd de 125I-PB10651 hacia las células CHO-EGFR se encontró que era 0.22 ± 0.086 nM, la Kd de 125I-PB10651 hacia células DLD-1 se estimó en 0.18 ± 0.024 nM. En la Figura 13 se muestra un ejemplo de los datos.

Mapeo de epítopos de PB10651 mediante análisis de mutagénesis de escopeta

Para mapear los epítopos en EGFR y LGR5 reconocidos respectivamente por ambos brazos Fab presentes en PB10651, se usó el enfoque de mutagénesis de escopeta. Los residuos que eran relevantes para la unión de ambos brazos de Fab a sus respectivos antígenos podían determinarse de forma inequívoca. Las mutaciones que anularon la unión de PB10651 a EGFR o LGR5 y que no inhibieron la unión de los anticuerpos de control (identificando residuos relevantes) se muestran en la Tabla 8. Estos datos muestran que el brazo Fab anti-EGFR reconoce el dominio III en una región que se superpone parcialmente con el sitio que normalmente contacta con el ligando EGF (Ogiso et al., 2002). Esto indica que PB10651 puede bloquear directamente la interacción ligando-EGFR. El epítopo está indicado en la estructura de EGFR (referencia de pdb 1YY9) en la Figura 14. Se demostró que el brazo Fab que reconoce LGR5 reconoce residuos que están ubicados en el dominio N-CAP y la primera repetición rica en leucina (LRR). Los residuos se indican en la Figura 15 en la estructura de LGR5 en complejo con RSPO1 (pdb referencia 4BSR, Peng et al., 2013).

Referencias:

Li S, Schmitz KR, et al., (2005) Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor by cetuximab. CancerCell. Apr;7(4): 301-11.

Ogiso, H. Ishitani, R. et al., (2002) Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains. Cell, Vol. 110, 775-787.

Peng, W.C. de Lau W. et al., (2013) Structure of Stem Cell Growth Factor R-espondina 1 in Complex with the Ectodomain of Its Receptor LGR5. Cell Rep 27; 3(6): 1885-1892.

Competencia por la unión del brazo Fab anti-LGR en PB10651 por el ligando R-espondina1 usando un ensayo basado en células

Para poder determinar la capacidad del brazo Fab anti-LGR5 presente en PB10651 para unirse a LGR5 en presencia del ligando R-espondinal, se estableció un ensayo basado en células. Se determinó que la EC50 para la unión del anticuerpo anti-LGR5 de bloqueo de ligando OMP88R20 (PG7711) al clon de células que expresan lGR5 era 50 ng/ml (333 pM) y esta concentración se usó luego para determinar la competencia con el ligando R-espondina1 para vincular a LGR5. La Figura 16 muestra la señal de MFI (normalizada a la señal de MFI obtenida en ausencia de R-espondina1) de la unión de OMP88R20 a células CHO-K1 que expresan LGR5 medida en FACS como una función de la concentración de R-espondina1 añadida. A continuación, se ensayaron los anticuerpos biespecíficos anti (TTxLGR5) para determinar su capacidad para unirse al clon de células CHO que expresaban LGR5 en presencia de concentraciones crecientes de R-espondina1. Se incluyó PG7711 como control positivo a 50 ng/ml. Los biespecíficos se probaron en primer lugar para determinar la unión al clon de células CHO que expresa LGR5 en un rango de concentración para determinar la EC50 para la unión en FACS. Se encontró que la EC50 era de 156 ng/ml para PB10286 que contenía el Fab MF5816 guía y 200 ng/ml para PB10261 que contenía MF5790. Sin embargo, los biespecíficos se probaron a 100 ng/ml para comparar las mismas concentraciones de Fab específicos de antígeno en el ensayo que se usaron o PG7711 y posiblemente incluso aumentar la sensibilidad del ensayo. La Figura 17 muestra que el Fab MF5816 anti-LGR5 principal no inhibió la unión de LGR5, incluso en presencia de un exceso molar grande (120 veces) del ligando, mientras que, en el mismo ensayo, la unión de la versión copiada de OMP88R20 fue totalmente inhibida. Además, se observó una unión reducida de PB10261 (que contiene el brazo de direccionamiento LGR5 MF5790), lo que demuestra que el ensayo es capaz de discriminar entre el bloqueo del ligando y los Fabs anti-LGR5 que no bloquean el ligando. No se observaron diferencias ni competencia cuando se utilizó el anticuerpo anti-LGR5 de rata 1D9 en el ensayo de bloqueo (Figura 17), lo que demuestra la especificidad de la interacción.

Referencia:

de Lau W, Barker N, et al., Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-espondina signalling. Nature.

2011 Jul 4; 476 (7360): 293-7.

Capacidad de bloqueo de ligandos del brazo Fab anti-EGFR de PB10651 usando un ensayo basado en células.

Para probar la capacidad del Fab anti-EGFR de PB10651 para bloquear la señalización mediada por EGF, se usó un ensayo basado en células. La Figura 18 muestra la potencia de PG3755 para bloquear la muerte celular mediada por EGF en células A431 (probadas según el método descrito por Gulli et al.) en comparación con la de cetuximab. El anticuerpo bloquea la señalización mediada por EGF con una potencia que es al menos igual a la del cetuximab.

Referencia:

Gulli, L.F., et al., Epidermal growth factor-induced apoptosis in A431 cells can be reversed by reducing the tirosina quinasa activity. Cell Growth Differ, 1996. 7(2): p. 173-178.

Reactividad cruzada de especies de PB10651.

Se ensayó PB10651 para determinar su reactividad cruzada con los ortólogos de rata y cynomolgus de ambas dianas: EGFR y LGR5. La secuencia de ADNc de cynomolgus LGR5 que se obtuvo mediante RT-PCR a partir de ADNc de cynomolgus coincidió con la secuencia predicha de GenBank (referencia XM_005571542). Se utilizaron constructos que codifican tanto el ser humano como el de rata y cynomolgus para una transfección transitoria de células CHO-K1. La unión del anticuerpo a las células que expresan transitoriamente el ortólogo de rata humana o de cynomolgus se ensayó luego en FACS. La Figura 19 muestra los gráficos de la intensidad de fluorescencia media (MFI) obtenida en FACS después de la tinción en función de la concentración de anticuerpo utilizada para la tinción. Se descubrió que tanto el brazo de Fab que reconoce EGFR como el brazo de Fab que reconoce lGR5 tienen una reacción cruzada completa con el ortólogo de cinomolgus de la diana: los valores de EC50 para la unión no fueron significativamente diferentes para la unión al ortólogo humano o de cynomolgus. En un experimento similar, se evaluó la reactividad cruzada de ambos brazos con el ortólogo de rata. Se encontró que PB10651 se unía bien al ortólogo de rata de LGR5, aunque la EC50 se desplazó con aproximadamente un logaritmo en comparación con el valor encontrado para la unión de LGR5 humano. Sin embargo, el brazo de Fab anti-EGFR apenas tuvo reactividad cruzada (diferencia de dos logaritmos en EC50) con el ortólogo de rata de EGFR, lo que hace que el anticuerpo no sea adecuado para modelos in vivo de rata o estudios de toxicidad en ratas. Como control positivo para la reactividad cruzada de cynomolgus LGR5, se utilizó la versión copiada de hu8E11v2 (PG7543). Se utilizó cetuximab como control de la reactividad cruzada de EGFR de cynomolgus.

Orientación específica de LGR5 en un organoide derivado del paciente

Para demostrar que los fragmentos Fab MF5816 y MF5814 se unen a LGR5 expresado en la superficie de organoides derivados del paciente, se usaron PG5816 y PG5814 (IgG bivalente, monoclonal) que contenían fragmentos Fab MF5816 o MF5814 para teñir las células individuales derivadas de el organoide P18T. El uso de PG5816 dio como resultado la tinción del 53.6% de las células derivadas del tumor P18T y el PG5814 dio como resultado la tinción del 52.5% de las células derivadas del tumor P18T, en comparación con la tinción utilizando el anticuerpo de control negativo dirigido a TT (Figura 20).

La clasificación de LGR5 enriquece las células que expresan LGR5 y las células iniciadoras de tumores.

Además, para mostrar que los fragmentos Fab dirigidos a LGR5 en un formato biespecífico se unen realmente a LGR5 en las células tumorales P18T, las células se tiñeron con anticuerpos biespecíficos PB10284 y PB10286 que contenían los fragmentos Fab MF5814 o MF5816 combinados con el fragmento Fab anti-TT. Después de la tinción, las células se clasificaron usando FACS, y las poblaciones de células teñidas y no teñidas se analizaron mediante Q-PCR para determinar los niveles de ARNm de LGR5. La tinción de células tumorales derivadas de P18T utilizando los biespecíficos que contienen el brazo Fab LGR5 MF5816 o MF5814 dio como resultado un enriquecimiento de 6-14 veces de los niveles de expresión de ARNm de LGR5 en la fracción de células positivas para LGR5 clasificadas en comparación con la fracción de células negativas para LGR5: Figura 21.

Además, estas poblaciones de células tumorales P18T que expresan LGR5 enriquecidas permitieron un aumento de 4 veces en las capacidades de formación de colonias: se usó P18T para la tinción FACS y la clasificación del 15% superior (positivo) e inferior (negativo) de las células teñidas identificadas por los anticuerpos anti-LGR5: MF5814-TT, m F5816-Tt y MF5790-TT. Se sembraron 2000 células en 25 pl de BME por duplicado (réplicas técnicas). Después de dos semanas de crecimiento, los organoides se contaron manualmente usando un microscopio óptico invertido. Los resultados demuestran que, en promedio, los anticuerpos MF5814-TT, MF5790-TT y MF5816-TT se enriquecen para el crecimiento organoide, con las fracciones positivas formando 4.5, 3.7 y 7.1 veces más organoides que las fracciones negativas, respectivamente: Figura 22. Estos datos demuestran un claro enriquecimiento para las células iniciadoras de tumores después de clasificar las células positivas para LGR5 de un organoide derivado del paciente.

Los biespecíficos LGR5xEGFR inhiben el crecimiento de organoides derivados del paciente

Como una forma independiente de medir la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-LGR5xEGFR biespecíficos guía, identificados en el cribado 3-D, los organoides se trataron con los diferentes biespecíficos y se evaluó el crecimiento organoide en un ensayo de formación de colonias estándar después de 7 días.: Figura 23. Las imágenes que se muestran a la derecha de la figura son un ejemplo de las imágenes producidas por el análisis de la macro y muestran una gota que contiene organoides (círculos negros). El experimento se repitió en tres ocasiones distintas y se promedió el número y el tamaño de los organoides entre los experimentos. Estos datos corroboran los datos obtenidos utilizando la criba de validación de anticuerpos y muestran que los anticuerpos LGR5xEGFR biespecíficos guía son potentes inhibidores del crecimiento organoide derivado del paciente.

El tratamiento de organoides derivados de pacientes con anticuerpos biespecíficos LGR5xEGFR reduce fuertemente la población de células no diferenciadas.

Después de que los tumores se trataron durante siete días con el biespecífico LGR5/EGFR biespecífico guía, se utilizó un análisis de PCR cuantitativo en tiempo real para evaluar los efectos de los anticuerpos sobre la expresión de LGR5 y CK20 (un marcador de diferenciación) (Figura 24). Los resultados demuestran que el tratamiento con el anticuerpo EGFRxTT (MF3755xMF1337; PB9919) provoca un aumento de 0.5 veces en los niveles de ARNm de LGR5 al tiempo que reduce los niveles de CK204 veces en relación con TTxTT. Los anticuerpos LGR5 MF5814xTT (MF5814xMF1337; PB10284) y MF5816-TT (MF5816xMF1337; PB10286) muestran pocos efectos. Sin embargo, cuando el brazo de EGFR se sustituye por el brazo de TT, los niveles de LGR5 se reducen en 5.9 y 7.2 veces después del tratamiento con los anticuerpos MF5814xEGFR (MF5814xMF3755; LGR5xEGFR; PB10647) y MF5816-EGFR (MF5816xMF3755; LGR5xEGFR; PB10651) respectivamente. La expresión de CK20 también se reduce por los anticuerpos PB10647 (EGFR/LGR5, MF5814xMF3755) y PB10651 (EGFR/LGR5, MF5816xMF3755) en 10.4 y 13.7 veces. Estos datos sugieren que, en esta línea de tumores, mediante la adición de un brazo de direccionamiento LGR5, el aumento relativo en los niveles de ARNm de LGR5 causados por la inhibición de EGFR puede anularse, al tiempo que se mejoran los efectos originales de la inhibición de EGFR (disminución en el ARNm de CK20).

Tratamiento de organoides de tumores (tumoroides) y organoides de tejido normal con PB10651.

Para demostrar que PB10651 se dirige selectivamente a tumores derivados del cáncer de colon y no a organoides derivados de tejido de colon normal, se incubaron cultivos de organoides con PB10651 afucosilado o Cetuximab. La Figura 26 muestra el tamaño del organoide (tumoroide) a la dosis respectiva del anticuerpo indicado. C51N es un organoide de tejido normal del colon. C1M es un organoide (tumoroide) de tejido canceroso (Figura 26B). La Figura 26A representa los resultados en un organoide de tejido normal (C55N) y tejido canceroso (C55T) del mismo paciente. La Figura 26C muestra la tabla IC50 para Cetuximab y PB10651 en 5 organoides de tejido normal, 3 tumores de cáncer de colon primario y 3 tumores de cáncer de colon metastásico. La relación Cetuximab IC50: PB10651 IC50 se proporciona en la última columna de la Figura 26C. Esto muestra que PB10651 es 20-200 veces más potente que Cetuximab en tumores, mientras que el efecto de PB10651 en organoides normales es más débil que Cetuximab. Pruebas adicionales demostraron que la presencia de WNT o R-espondina en el medio de cultivo no influyó en la eficacia de Cetuximab o PB10651 para inhibir el crecimiento de los tumores (no se muestra).

Los anticuerpos dirigidos contra LGR5 no inhiben el crecimiento de los tumores de colon

Para verificar que se requiere el aspecto biespecífico de PB10651 para lograr la capacidad inhibidora de tumores, se comparó PB10651 con otros anticuerpos dirigidos a WNT en producción porGenentech, Bionomics u OncoMed (Tabla 7). En la Figura 27, los efectos de los anticuerpos dirigidos a LGR5 (PG7709, PG7711, PG7712 y PG7543) sobre el crecimiento organoide se comparan con los mediados por PB10651 y Cetuximab en los modelos de tumor P18T y C1M. Los resultados muestran que ninguno de los anticuerpos comparadores inhibe el crecimiento de los tumores de colon.

El biespecífico PB10651 es más potente que la mezcla de anticuerpos monoespecíficos bivalentes para inhibir el crecimiento tumoral.

El anticuerpo biespecífico PB10651 está compuesto por un brazo de dirección de EGFR (MF3755) y un brazo de dirección de LGR5 (MF5816). Para demostrar que se requiere la interacción física real entre ambos brazos de Fab para lograr el potente efecto de inhibición sobre los tumores de colon, estos se incubaron con dosis crecientes de PB10651 (MF3755xMF5816; EGFRxLGR5), Cetuximab, PG3755 (MF3755xMF3755; EGFRxEGFR), PG5816 (MF5816xMF5816; LGR5xLGR5), PG1337 (MF1337xMF1337; TTxTT) y una mezcla 1:1 de PG3755 con PG5816. La Figura 28A muestra que el tratamiento con una mezcla de anticuerpos anti-LGR5 y anti-EGFR da como resultado una inhibición del crecimiento de tumores menos potente en comparación con el tratamiento con el anticuerpo biespecífico PB10651. Curiosamente, el crecimiento de los organoides normales fue inhibido de manera más potente por la mezcla de anticuerpos anti-EGFR y anti-LGR5 que por el anticuerpo biespecífico. Estos efectos se resumen en la tabla IC50 para otros modelos de organoides normales y tumorales en la Figura 28B.

Los estudios de localización de PB10651 en tumores de colon revelan un patrón de tinción intracelular específico

Para mostrar que los anticuerpos alcanzan los tumores mientras se siembran en el hidrogel BME2 RGF, se trataron tumores P18T de 7 días durante 24 horas con los anticuerpos indicados (2 pg/ml) y luego se fijaron (15 minutos, 4% paraformaldehído) y permeabilizaron (Triton-X100 al 0.1% y BSA al 0.5% en PBS). Los organoides se tiñeron posteriormente con anti-FITC humano de cabra (Thermo Scientific, 1:3000). Los núcleos y la actina se tiñeron como se describe en (Di et al PlosOne 2014, PMID 25289886). La Figura 29 muestra que todos los anticuerpos pueden penetrar el gel y unirse a todas las células de un tumor. Los anticuerpos dirigidos a EGFR Cetuximab y PG3755 se localizan en la membrana plasmática, mientras que PB10651 muestra un patrón de tinción moteado intracelular, que no se observa para ninguno de los anticuerpos LGR5 comparadores (PG7709, PG7711 o PG7712).

Los estudios de localización de PB10651 en tumores de colon revelan un patrón de tinción punteada intracelular yuxtanuclear que se correlaciona con la sensibilidad de los tumores

Se incluyeron más modelos de organoides y tumores de colon en el ensayo de contratinción y generación de imágenes de PB10651 (véase más arriba). La Figura 30 muestra que el patrón de tinción intracelular de PB10651 se observa en P18T, C0M, C55T (altamente sensible a PB10651, IC50 <1 ug/ml), en algunos tumores de C31M (moderadamente sensibles a PB10651), pero no en los insensibles a PB10651 (1C50 >10 pg/ml) tumoroides C28T, P8T o P19Tb u organoides de colon normal C51N. La aparición de motas intracelulares yuxtanucleares con PB10651 se encuentra consistentemente, independientemente del tiempo de incubación del anticuerpo (24 horas o 7 días), a bajas concentraciones de anticuerpo (50 ng/ml de PB10651) y en forma conjugada con Alexa-488.

Ejemplo 6: Producción y caracterización bioquímica de PB10651

Generación de plásmidos

Los plásmidos para la transfección se generaron a partir de los plásmidos MV1453 y MV1626, véase Figura 31. Estos plásmidos se digirieron con las enzimas de restricción Sfil y BstEII (MV1453) y las enzimas de restricción Sfil y Xhol (MV1626), después de lo cual los VHs MF3755 (digeridos Sfil y BstEII) y MF5816 (Sfil y Xhol digeridos), se ligaron para formar los constructos MG3755C453 y MG5816C626. MV1622 codifica la enzima RMD etiquetada con Flag (Figura 32).

Producción de anticuerpos

La producción de proteínas se realizó mediante transfección transitoria de células en suspensión Freestyle 293-F (Invitrogen No. de cat. R79007) cultivadas en FreeStyle 293 Expression Medium (Gibco, No. de cat. 12338-018) suplementado con L-glutamina 2 mM (Gibco, No. de catálogo 25030-024) que fueron inhibidos en la unión de residuos de fucosa a la cola de los anticuerpos [Henning von Horsten et. al., Glycobiology, vol. 20, No. 12, págs. 1607-1618, 2010]. Un día antes de la transfección, las células se sembraron a una densidad de 5.0 x 105 células/ml y se incubaron durante la noche a 37°C, CO2 al 8% a una velocidad de agitación orbital de 155 rpm. Para la transfección, se preparó una mezcla de ADN plasmídico y polietilenimina (PEI, PM 25.000 Da, Polysciences Inc., No. de cat. 23966) en medio de cultivo. Para un volumen de transfección de 25 ml, se mezclaron 25 pg de ADN plasmídico sin endotoxina con 62.5 pg de PEI y 2.5 ml de medio de cultivo. Después, la mezcla se agitó con vórtex, se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y se añadió a las células. Las células se incubaron a 37°C, CO2 al 8% a una velocidad de agitación orbital de 155 rpm durante 6 días. La suspensión celular se recogió, se centrifugó a 1000 g durante 10 min y el sobrenadante se recogió y se centrifugó a 4000 g durante 10 min.

Purificación de anticuerpos

La purificación de anticuerpos se realiza uniendo los anticuerpos por lotes a MabSelectSure LX (GE Healthcare) durante varias horas a temperatura ambiente. El anticuerpo unido que contenía sefarosa MabSelectSure LX se transfirió luego a una columna de flujo por gravedad. La columna se lavó con PBS, los anticuerpos se eluyeron usando regulador citrato 100 mM pH 3.0 y el pH se neutralizó a 7.0 utilizando Tris 1 M pH 8.0. Las muestras se concentraron usando filtros giratorios Vivaspin20 (Sartorius) de 10 kDa y se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel usando una columna Superdex20026/600 (GE Healthcare) preequilibrada con regulador PBS.

HPLC de intercambio catiónico

Se usó cromatografía de intercambio catiónico (CEX-HPLC) para abordar la heterogeneidad de carga de las muestras de anticuerpos, así como para determinar la presencia y la cantidad de impurezas relacionadas con el producto (homodímeros y semicuerpos). Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente en un sistema de HPLC Dionex equipado con una columna SP STAT de 7 jm (Tosoh Biosciences) y un detector de UV-vis. Se inyectaron 10 |jg de muestra en cada ejecución. Se aplicó un gradiente de regulador fosfato 25 mM pH 6.0 con concentraciones de NaCl aumentando de 0 a 1 M para separar los anticuerpos. Los datos se analizaron utilizando el software Chromeleon.

Ensayo reportador ADCC

Se ensayó la actividad del anticuerpo afucosilado PB10651 (MV1622) en células indicadoras de ADCC que contenían la variante del receptor FcYRIIIa V158 (alta afinidad) o la variante del receptor FcYRIIIa F158 (baja afinidad) (Promega). Se añadió una titulación en serie de anticuerpo, es decir, PB10651 afucosilado (PB10651-MV1622), PB10651 no afucosilado y una IgG1 no dirigida (PG1337) en combinación con células indicadoras de ADCC que albergan variantes de FcYRIIIa de alta y baja afinidad [Cartron et. al., Blood, vol. 99, no. 3, págs. 754 -758, 2002;] Musolino et. al., Journal of Clinical Oncology, vol. 26, no. 11, págs. 1789-1796] a células A431, células A549 y células BxPC3. La actividad de ADCC se detectó midiendo la actividad de luciferasa.

Parte experimental

Se transfectaron células Freestyle 293-F con MG3755C453, MG5816C626 y MV1622, dando como resultado IgG PB10651p10. Después de la purificación, se determinó que el rendimiento de PB10651 (MV1622) era de 29 mg por litro de volumen de producción mediante medición de DO280. El análisis CEX-HPLC se realizó en la proteína purificada (Figura 33), mostrando un pico principal con algunas variantes de carga ácida en un tiempo de retención de 15 minutos que representa la molécula biespecífica PB10651 (MV1622). Un pequeño pico (<5%) que representa los homodímeros de MF3755xMF3755 DEDE es visible a aproximadamente 11 minutos.

Además, se realizó un ensayo indicador de ADCC. Los datos muestran que el PB10651 afucosilado (MV1622) muestra una actividad ADCC significativamente aumentada para todas las líneas celulares en combinación con la variante del receptor FcyRIIIa alto (V158) y bajo (F158). El control, PB10651 no afucosilado mostró alguna actividad ADCC en células A431 combinadas con células efectoras variantes del receptor FcyRIIIa de alta afinidad, pero la señal fue significativamente más baja que la señal de PB10651 (MV1622). Para las otras combinaciones de línea celular/célula efectora, el PB10651 fue negativo mientras que el PB10651 (MV1622) mostró una fuerte actividad ADCC. PG1337 (toxoide antitetánico) es una IgG de control sin unión que fue negativa en todos los experimentos (Figura 34).

Ejemplo 7 Efectividad in vivo del anticuerpo principal

Selección de modelo animal

Se evaluó la eficacia terapéutica de PB10651 afucosilado (MV1622) en ratones inmunodeprimidos que portaban tumores de pacientes colorrectales, conocidos como modelos de xenoinjerto derivado del paciente (PDX). Los modelos PDX CR2519, CR2161, CR2501, CR0150 y CR0193 (base de datos Crown Bioscience, (http://hubase2.crownbio.com) se seleccionaron en función de la expresión de genes LGR5 y EGFR analizados mediante secuenciación de ARN (RNAseq). Los modelos presentaron un estado diferente del gen KRAS. A saber, CR2519 y CR2161 eran de tipo salvaje para KRAS, mientras que CR2501, CR0150 eran KRAS G12V y CR0193 eran KRa S eran mutantes G13D. CR0231 y CR2501 eran sensibles a Cetuximab, mientras que CR0150 respondía poco a Cetuximab.

Análisis de expresión genética

Para verificar que los modelos PDX habían retenido los niveles de expresión de ARNm de LGR5 y EGFR indicados en los animales usados en el estudio de eficacia, se comparó la expresión en tumores vivos con la de los tumores madre de PDX. Se extrajo ARN de los tumores madre (material congelado) y tumores vivos (animales de estudio), se homogeneizó con TRIzol (Ambiom 15596-018) y Tissue Lyser II (Qiagen 85300). A continuación, se purificó el ARN con RNeasy Mini Kit (Qiagen 74106) y RNase-Free DNase Set (Qiagen 76254). La calidad del ARN fue confirmada por el espectrofotómetro NanoDropTM. El ADNc se preparó mediante transcripción inversa (ABI 4374966). La expresión de LGR5 y EGFR se midió mediante reacción de RT-PCR en tiempo real usando las sondas TaqMan Hs00969422_m1 y Hs01076090_m1, respectivamente, y se normalizó frente a la expresión de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) usando la sonda TaqMan Hs02758991_g1. Los datos se analizaron calculando la diferencia en el valor de Ct entre el gen de interés y GAPDH, y convirtiéndolo a la potencia de 2. La Figura 35 muestra que los seis modelos PDX utilizados en el estudio de eficacia presentaron una expresión de EGFR y LGR5 comparable a las reservas tumorales PDX congeladas originales. La expresión de LGR5 en estos seis modelos fue mil veces mayor que en el modelo PDX que presenta la expresión LGR5 más baja (CR01560) de la colección disponible de 137 modelos PDX de cáncer colorrectal. La expresión de ARNm de EGFR en los seis modelos seleccionados fue menor que CR1197, que presentó la expresión de EGFR más alta en toda la colección CRC PDX.

Estudio de eficacia en PDX

Se inocularon ratones desnudos BALB/c por ruta subcutánea en el flanco derecho con un fragmento de tumor PDX (2-3 mm de diámetro) que se originó a partir de uno de los cinco modelos de tumor PDX de cáncer colorrectal (CR2519, CR2161, CR2501, CR0150 y CR0193).

Se dejó que los tumores crecieran hasta un volumen de 100-200 mm3. Después, los ratones se trataron con cuatro dosis intraperitoneales (i.p.) semanales de PBS (200 j l ) o PB10651 afucosilado (0.5 mg por animal en PBS). Los tumores se midieron cada dos semanas por calibre y el volumen del tumor (TV) se calculó usando la fórmula TV = 0.5 x a x b 2en donde a y b eran los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. El PB10651 afucosilado presentó una fuerte actividad tumoristática en los modelos PDX CR2519 y CR0193, y esta actividad fue similar a la del Cetuximab (Figura 36). El PB10651 afucosilado presentó una actividad antitumoral limitada pero significativa en el modelo CR2501 PDX, mientras que Cetuximab no logró reducir significativamente el crecimiento tumoral. Los modelos de PDX CR2161 y CR0150 no respondieron fuertemente a Cetuximab o PB10651 afucosilado y solo mostraron una tendencia en la actividad antitumoral para el PB10651 afucosilado (Figura 36).

Ejemplo 8 Estudios de xenoinjerto P18T y C31M

Materiales y métodos

Inmunohistoquímica de los tumores P18

Después de 48 horas a partir de la adición de los anticuerpos, se retiró el medio de cultivo y el BME se depositó en una placa de 48 pozos fijada en 300 j l de formalina durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación, las gotas de BME se rompieron manualmente con una pipeta, se sedimentaron y se colocaron en formalina fresca sin romper el sedimento. Los sedimentos se dejaron a temperatura ambiente durante la noche antes de lavarlos en PBS tres veces. A continuación, el sedimento se volvió a suspender suavemente en PBS y se colocó en un microcasete para su procesamiento en la instalación de histología del IRB (Institute for Research in Biomedicine) para la generación de secciones incluidas en parafina.

La tinción con Ki67 y caspasa-3 escindida se realizó en la instalación de histología del IRB utilizando un Autostainer Plus (Dako-Agilent). Antes de la tinción, las secciones se desparafinaron como parte del proceso de recuperación de antígeno utilizando las soluciones de recuperación de dianas EnVision™ FLEX de bajo pH (Dako, Burlington) durante 20 minutos a 97°C utilizando un PT Link (Dako-Agilent). La peroxidasa endógena se inactivó durante 10 minutos usando una solución de bloqueo de peroxidasa (Dako REAL S2023). Se diluyeron anti-Ki67 policlonal de conejo (ab15580, Abcam) y anti-caspasa 3 policlonal de conejo (señalización celular, 9661S) 1:1000 y 1:500 y se incubaron durante 60 y 120 min a temperatura ambiente respectivamente. Se utilizó BrightVision Poly-HRP-Anti Rabbit IgG sin biotina para el anticuerpo secundario (inmunológico, DPVR-110HRP) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La tinción se reveló usando 3-3'-diaminobencidina (K3468, Dako), durante 5 minutos. Las secciones se tiñeron por contraste con hematoxilina (Dako, S202084) y se montaron con medio de montaje sin tolueno (CS705, Dako) usando un Dako CoverStainer. La especificidad de la tinción se confirmó mediante la omisión del anticuerpo primario. Las imágenes se capturaron con un Nikon Eclipse E600 acoplado a una cámara Nikon DS-Ri1.

Tratamiento de xenoinjertos de organoides P18T y C31M

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado Animal del Parque Científico de Barcelona (CEEA-PCB) y la Generalidad de Cataluña con el número de protocolo DAAM7329. Los tumores se cultivaron durante siete días antes de disgregarse en una suspensión de células individuales para inyección. Las condiciones de cultivo y el método de creación de células individuales se describen en la sección "Tinción FACS de células obtenidas del organoide P18T usando 5 anticuerpos anti-LGR5 cLC seleccionados". Para todos los estudios con ratones, se utilizaron ratones hembra NOD.CB17/AlhnRj-Prkdcscid/Rj (Janvier Labs) de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas. Los xenoinjertos se iniciaron inyectando subcutáneamente 100 j l de solución de BME: PBS (50:50) que contenía 200.000 células P18T o 1.000.000 de células C31M. Una vez que el volumen del tumor alcanzó los 300 mm3, se sacrificaron los ratones y se recogieron los tumores. Un tumor se cortó manualmente en trozos pequeños de aproximadamente 0.5 mm x 0.5 mm x 0.5 mm (ancho x largo x alto). A continuación, las piezas se colocaron en cuatro flancos de ratones receptores NOD-SCID, utilizando una pieza/flanco. Se utilizó un trócar para implantar las piezas en los ratones, un dispositivo que empuja una pieza de tumor debajo de la piel. Se utilizó un total de 30 ratones para el injerto. Una vez que el volumen del tumor en un ratón alcanzó un promedio de 50 mm3, los ratones se asignaron al azar a un grupo de tratamiento. Los ratones se inyectaron una vez a la semana durante cuatro semanas con 200 jL de PBS (pH 7.4 Gibco Ref 10010-015), Cetuximab (lote clínico, 5 mg/ml) o PB10651 afucosilado (2.5 mg/ml). Se inyectaron cetuximab y PB10651 afucosilado a una dosis de 0.5 mg/ratón, independientemente del peso del ratón. El volumen tumoral se calculó usando calibradores manuales con mediciones tomadas tres veces por semana y usando la fórmula: (largo x ancho x alto)/2. Los ratones se sacrificaron cuando el volumen del tumor excedía los 300 mm3, el tumor estaba ulcerado o se había alcanzado el punto final del estudio, 28 días desde la primera inyección de anticuerpos. Si solo era necesario extraer un solo tumor en un ratón debido a limitaciones de tamaño/ulceración, se resecaba dejando el resto en su lugar para un estudio adicional. Si era necesario recolectar resecciones adicionales o múltiples tumores, se sacrificaba el ratón y se tomaban todas las muestras simultáneamente. Los datos se expresan en relación con el día 0 (el primer día de tratamiento) y se realizó un análisis de pruebas t de muestras pareadas entre cada grupo de tratamiento utilizando GraphPad Prism.

Resultados

La tinción con Ki67 es un indicador de la proliferación celular y se utilizó para determinar si los efectos sobre el crecimiento provocados por los tratamientos con anticuerpos se debían a una reducción de la proliferación. Los tumores se trataron in vitro durante 48 horas (2 |jg/ml) antes de la fijación. El tratamiento de los tumores con PB10651 afucosilado provocó una reducción en el número de células positivas y en la intensidad de la tinción, en comparación con los otros grupos de tratamiento (Figura 37). El cetuximab y los anticuerpos EGFR-TT causaron una pequeña y modesta reducción en el número de células positivas en relación con el tratamiento de control TT-TT. También se realizó la tinción con caspasa-3 escindida para evaluar si los anticuerpos promovían la apoptosis. Se observaron niveles bajos de apoptosis en los grupos de tratamiento de control TT, EGFR-TT y cetuximab, con tinciones comparables observadas entre los tres grupos. El número de células positivas aumentó en el grupo tratado con PB10651 afucosilado. Estos resultados sugieren que el anticuerpo biespecífico PB10651 afucosilado es superior para reducir la proliferación e inducir la apoptosis que cetuximab y el único brazo anti-EGFR.

Se establecieron xenoinjertos en ratones NOD-SICD y se trataron una vez a la semana durante cuatro semanas con PB10651 afucosilado (0.5 mg/ratón/semana), Cetuximab (0.5 mg/ratón/semana) o PBS. Para evaluar las respuestas de anticuerpos, los volúmenes de los tumores se rastrearon y se compararon entre los grupos. El tratamiento con PB10651 afucosilado provocó una reducción significativa en el aumento medio del volumen tumoral en comparación con PBS y cetuximab para los modelos de xenoinjerto P18T y C31M desde el día 2 en adelante (P=<0.01 para todos los puntos de tiempo, Figura 38). En el modelo de xenoinjerto P18T, los ratones tratados con Cetuximab mostraron una cinética de crecimiento similar a la de los ratones tratados con PBS y debido a los grandes volúmenes tumorales, la mayoría de los ratones del grupo de PBS y cetuximab debían retirarse del estudio el día 16. Para el día 20, el cambio de veces promedio en el volumen tumoral fue 15.2 (±5.3) y 14.2 (±9.9) para PBS y cetuximab respectivamente, mientras que para el grupo de PB10651 afucosilado el valor fue 4.5 (±0.59). Los tiempos de duplicación del tumor, determinados por el ajuste de la curva no lineal de una ecuación de crecimiento exponencial, se calcularon como 9 días para los grupos de PBS y cetuximab, y 6 días para el grupo de tratamiento con PB10651 afucosilado, una reducción del 30% en el tiempo de duplicación del tumor. De manera similar, en el modelo de xenoinjerto C31M, PB1065 redujo significativamente el crecimiento tumoral en comparación con los brazos de tratamiento con PBS y cetuximab (Figura 38).

Ejemplo 8: Estudio de toxicidad por cynomolgus sin GLP usando dosis repetidas de PB10651.

Para medir la posible toxicidad de PB10651, se realizó un estudio de toxicidad por dosis repetidas sin GLP en monos cynomolgus. En vista del brazo EGFR Fab presente en PB10651, se puede esperar toxicidad cutánea y del tracto gastrointestinal (GI). En el caso del anticuerpo anti-EGFR Cetuximab (Erbitux), se observaron muertes en monos a una dosis semanal de 75 mg/kg debido a una toxicidad cutánea grave, siendo una dosis de 24 mg/kg/semana la dosis más alta tolerada en estudios de toxicidad crónica en monos. En el caso de Panitumumab (Vectibix), se observó mortalidad en monos a una dosis de 30 mg/kg/semana después de solo tres semanas de tratamiento en un estudio de 4 semanas, con muertes ocasionales a dosis más bajas (7.5 y 15 mg/kg/semana) en un estudio de toxicidad IV de 13 semanas. Con base en esta información, se seleccionó un nivel de dosis de 25 mg/kg para PB10651 como la dosis más alta en el presente estudio. Se utilizaron un animal macho y una hembra por grupo y se designaron cuatro grupos: control (solo vehículo), 2.5 mg/kg/semana, 7.5 mg/kg/semana y 25 mg/kg/semana y se administraron cuatro dosis semanales a cada grupo. El anticuerpo se administró mediante infusión intravenosa durante una hora a los animales.

Resultados

Los estudios de toxicidad en monos cynomolgus con Cetuximab y Panitumumab revelaron toxicidad dérmica (eritema, piel seca/descamada/caída del cabello) y efectos en el tracto gastrointestinal (GI) (heces blandas/diarrea, deshidratación) como las toxicidades limitantes de la dosis (EMA-EPAR 2004 cetuximab, EMA-EPAR 2007 panitumumab), consistente con la actividad anti-EGFR de los elementos de prueba. Sin embargo, para PB10651, incluso con la dosis más alta administrada en este estudio, no se observó toxicidad cutánea ni toxicidad del tracto gastrointestinal después de la administración repetida. Los signos clínicos, como adelgazamiento del pelaje, hematomas e incidencia de heces sueltas, se observaron por igual en los grupos activo y de control y, por lo tanto, estos signos clínicos no se consideraron relacionados con el fármaco. No hubo cambios en el peso de los órganos y/o en la relación de peso de los órganos que se consideren relacionados con la administración de PB10651. Además, no hubo hallazgos macroscópicos o microscópicos que se consideren relacionados con la administración de PB10651. En conclusión, la administración intravenosa (infusión) una vez a la semana de PB10651 al mono cynomolgus durante 4 semanas no produjo cambios en el peso de los órganos o en la proporción de pesos de los órganos, hallazgos macroscópicos o microscópicos considerados relacionados con la administración de PB10651.

El trabajo que dio lugar a esta invención ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la [Unión Europea] [Comunidad Europea de la Energía Atómica] ([FP7/2007-2013] [FP7/2007-2011]) en virtud del acuerdo de subvención No. [601876].14

Tabla 1: Títulos de ratones MeMo® inmunizados con éxito.

Tabla 2: Resumen de los paneles de anticuerpos generados a partir de los repertorios de anticuerpos de fagos contra las diferentes dianas de WNT.

Diana Tamaño final del anticuerpo

(número de clones

diferentes caracterizados)

Tabla 3: Características de la IgG biespecífica que contiene un panel seleccionado de fragmentos Fab dirigidos a Wnt contra LGR4, LGR5, ZNRF3 y RNF43 combinados con el fragmento Fab del toxoide tetánico.

Se muestran la titulación de afinidad FACS, el ELISA de bloqueo de R-espondina3 y el ELISA de estabilidad a 40°C. Para la titulación de afinidad FACS, se indican los valores del área bajo la curva (AUC). Para el ELISA de bloqueo de R-espondina, se indicó el porcentaje de unión restante por IgG en comparación con el valor de unión máximo (establecido en 100% de unión), así como la conclusión final de 2 experimentos independientes. Se muestra el ELISA de estabilidad a 40°C. Los valores de DO450nm después de una semana a 4°C y a 40°C se indican en la tabla. Las relaciones (en porcentaje) de la DO450nm de 4°C frente a 40°C se indican en la tabla. La conclusión final se inserta en la columna de la derecha, si una IgG se considera estable, parcialmente estable o NA cuando las señales de DO estaban por debajo de 0.1.

Tabla 4: Puntuaciones del factor Z ' para diferentes características y una puntuación multiparamétrica en diferentes organoides, comparando el crecimiento con y sin EGF en tumores dependientes de EGF.

La puntuación del factor Z ' multiparamétrico fue similar o superior a las puntuaciones de características individuales, lo que demuestra que el uso de dicha puntuación es sensible y se puede aplicar en múltiples organoides diferentes que experimentan diferentes respuestas fenotípicas después del tratamiento con factor de crecimiento.

Tabla 5: Combinaciones de cadena pesada preferidas para anticuerpos biespecíficos que se unen a LGR4/EGFR; LGR4/HER3; LGR5/EGFR; LGR5/HER3; RNF43/EGFR; RNF43/HER3; y ZNRF3/FGFR; ZNRF3/HER3. TT es una cadena pesada para el toxoide tetánico y solo como referencia.

Tabla 5 continuación

Tabla 6: Combinaciones de cadena pesada preferidas para anticuerpos biespecíficos que se unen a LGR4/EGFR; LGR4/HER3; LGR5/EGFR; LGR5/HER3; RNF43/EGFR; RNF43/HER3; y ZNRF3/EGFR; ZNRF3/HER3. TT es una cadena pesada para el toxoide tetánico y solo como referencia.

Tabla 7 | Lista de anticuerpos comparadores copiada de la literatura con su número interno.

Las secuencias de anticuerpos VH y VL se copiaron de patentes, se hicieron como ADNc sintéticos y luego se clonaron en un vector de expresión para la expresión de IgG 1 humana. Los anticuerpos se expresaron y purificaron usando procedimientos estandarizados.

A nticuerpo Diana Firm a Especies Núm ero

interno

h u s n iv Genentech Humanizada PG7543

B N C 101 B io n o m ic s Humanizada P G 7709

OMP1P.R O n c o M e d Humana

i i l i

O M P 88 R O n c o M e d Humana P G 7711

ÜMP8SR OncoMed T f i e i i á j ®

O M P 131

O n c o M e d Humanizada P G 7713

Tabla 81 Residuos en EGFR y LGR5 encontrados por ser relevantes para la unión de PB10651 a la respectiva diana en análisis de mutagénesis de escopeta.

Residuos relevantes Residuos relevantes

de LGR5 de EGFR

G44A G465A

F67A I491A

F91A C499A

Tabla 9 | Niveles de expresión de ARNm de EGFR y LGR5 en tumores PDX utilizados para la tinción FACS ex vivo.

Tabla 10: Valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) obtenidos después de la tinción ex vivo de xenoinjertos derivados de pacientes de diferentes indicaciones.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio variable que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un dominio variable que se une a una parte extracelular de un miembro asociado a la membrana de una ruta de señalización de WNT, en donde

el anticuerpo biespecífico comprende dominios variables que se unen a EGFR y al receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina (LGR5).

2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, que comprende un dominio variable que se une a EGFR y un dominio variable que se une a LGR5

- en donde la cadena VH del dominio variable que se une a EGFR comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF3755 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 y preferiblemente no más de 5, 4, 3, 2 o 1 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH; y

- en donde la cadena VH del dominio variable que se une a LGR5 comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1; o la secuencia de aminoácidos de la cadena VH MF5816 como se muestra en la Figura 1 que tiene como máximo 15, preferiblemente no más de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 y preferiblemente no más de 5, 4, 3, 2 o 1 inserciones, eliminaciones, sustituciones de aminoácidos o una combinación de las mismas con respecto a dicho VH.

3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 o 2, para uso en el tratamiento de un individuo que tiene cáncer.

4. El anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso según la reivindicación 3, en donde el cáncer es un adenocarcinoma.

5. El anticuerpo biespecífico de las reivindicaciones 1 o 2, para su uso de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en donde el cáncer es cáncer colorrectal; cáncer de páncreas; cáncer de pulmón; cáncer de mama; cáncer de hígado; cáncer de próstata; cáncer de ovarios; cáncer de cuello uterino; cáncer de endometrio; cáncer de cabeza y cuello; melanoma; cáncer de testículo; cáncer de urotelio; cáncer de riñón; cáncer de estómago; o cáncer carcinoide.

6. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 o 2, para uso según de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el cáncer es cáncer colorrectal.

7. Un sistema celular que comprende el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, y una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT,

en donde el miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es EGFR y en donde el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es LGR5.

8. Uso del anticuerpo biespecífico según la reivindicación 1 o 2 en un método in vitro para inhibir la proliferación de una célula que expresa un miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y que expresa un miembro asociado a la membrana de la ruta WNT en un sistema permisivo para la proliferación de la célula, comprendiendo el método proporcionar al sistema el anticuerpo biespecífico,

en donde el miembro asociado a la membrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF) es EGFR y en donde el miembro asociado a la membrana de la ruta WNT es LGR5.