ES2868191T3 - Transaminasas - Google Patents

Abstract

Una transaminasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones, de modo que comprende (i) la sustitución F255L; y (ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268L y N268V; y en la que la transaminasa se caracteriza por una estereoselectividad mejorada y/o una conversión aumentada de un sustrato de cetona en un producto de amina o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Transaminasas

La solicitud reivindica prioridad del documento EP15171924, presentando el 12 de junio de 2015.

La invención se refiere a transaminasas, también denominadas aminotransferasas, o más específicamente a amina transaminasas, en lo siguiente también abreviadas y denominadas "ATA". Las ATA de acuerdo con la invención son particularmente útiles para catalizar la conversión de aminas en cetonas y/o viceversa.

Las transaminasas son enzimas ubicuas encontradas en todos los reinos de vida. Las transaminasas catalizan la transferencia de un grupo amino desde una molécula donadora de amina a una molécula cetona aceptadora de amina y viceversa. Las transaminasas se dividen en seis clases basadas en los rasgos estructurales comunes y la similitud de secuencia (Steffen-Munsberg etal. 2015). Las denominadas "omega transaminasas" (w transaminasas) transfieren grupos amino que están más distantes de un grupo carboxílico (por ejemplo, en posición p, y o 5) y a menudo forman parte de la familia de aminotransferasa de clase III (principalmente amina transaminasas (S)-selectivas) o de clase IV (principalmente amina transaminasas (R)-selectivas). Para determinar la pertenencia de una proteína a una familia, puede usarse la herramienta internética InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro; Hunter et al., 2012).

La expresión "amina transaminasas" (ATA) describe transaminasas, incluyendo omega transminasas, que permiten la conversión de aminas independientemente de la presencia o ausencia de grupos carboxílicos en el sustrato, y predominantemente son un subgrupo de transaminasas de clase III. Por consiguiente, la terminología de omega transaminasa es engañosa, pero se usa a menudo en las publicaciones. Las ATA son todas enzimas que pertenecen a la EC de subsubclase EC 2.6.1., como se define por la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular. Hasta la fecha de esta invención, no se ha designado un número de serie de EC específico para transaminasas que convierten principalmente sustratos no carboxílicos, y las ATA a menudo se denominan EC 2.6.1.X mientras que X significa cualquier enzima clasificada en la subclase EC 2.6.1., y hasta la fecha de esta invención para cualquier cifra de 1 a 107 (es decir EC 2.6.1.1, EC 2.6.1.2, EC 2.6.1.3, ... hasta EC 2.6.1.107). Otros ejemplos de miembros de las transaminasas de clase III con diferentes funciones primarias son acetilornitina aminotransferasa (EC 2.6.1.11), ornitina aminotransferasa (EC 2.6.1.13), omega-aminoácido-piruvato aminotransferasa (EC 2.6.1.18), 4-aminobutirato aminotransferasa (EC 2.6.1.19), DAPA aminotransferasa (EC 2.6.1.62), 2,2-dialquilglicina descarboxilasa (EC 4.1.1.64) o glutamato-1 -semialdehído aminotransferasa (EC 5.4.3.8).

La reacción de las ATA convierte sustratos de cetona (A) en productos de amina (C) mientras convierten simultáneamente cosustratos donadores de amino (B) en el correspondiente coproducto de cetona (D):

A B C D

De acuerdo con su estereoselectividad, se han distinguido dos clases de ATA: (S)-ATA que catalizan preferentemente la formación de una (S)-amina a partir de un grupo ceto, y (R)-ATA que catalizan preferentemente la formación de una (R)-amina a partir de un grupo ceto. Sin embargo, esta distinción en (S)-ATA y (R)-ATA puede ser engañosa, ya que depende de la naturaleza del sustrato, concretamente los sustituyentes del grupo ceto y su prioridad de acuerdo con las normas de la nomenclatura de CIP (Cahn-Ingold-Prelog). Por tanto, una ATA dada puede considerarse una (S)-ATA con respecto a la conversión de un grupo ceto, mientras que la misma ATA puede considerarse una (R)-ATA con respecto a la conversión de otro grupo ceto.

La síntesis estereoselectiva de compuestos de amina, en particular de compuestos de amina quiral, es de interés destacado para química sintética, en particular en la industria farmacéutica (Shaheer Malik et al., 2012), pero también desempeña una función importante en química polimérica (poliamidas). Además, las ATA puede aplicarse para resolución cinética de aminas racémicas.

La reacción que se cataliza por las ATA es reversible (reacción en equilibrio) y puede experimentar inhibición de sustrato o producto, dependiendo del equilibrio de reacción específico. Para obtener cantidades industrialmente pertinentes de un producto deseado, se requiere que las ATA catalicen la conversión de sustratos con alta actividad específica. Puede requerirse desviar la reacción en equilibrio hacia la producción del compuesto de amina deseado eligiendo condiciones de reacción óptimas, provocando altos rendimientos de producto a lo largo del tiempo del proceso. También otros factores cinéticos, tales como la selectividad de sustrato, K^m y la estereoselectividad pueden desempeñar una función importante. Otros aspectos pertinentes pueden incluir, aunque sin limitación, la diastereoselectividad, regioselectividad, inhibición por otros factores (por ejemplo, componentes del extracto en bruto, contaminantes del sustrato o productos secundarios) y capacidad de expresión soluble recombinante en hospedadores adecuados.

Otro criterio importante en el uso industrial de las ATA es una larga estabilidad en el proceso, que a menudo se correlaciona con una alta estabilidad a temperaturas elevadas, y buena estabilidad en disolventes y/o a altas concentraciones de sustrato y producto, respectivamente. En aplicaciones industriales, la estabilidad en el proceso también puede englobar la estabilidad química y física, la actividad enzimática en diferentes disolventes (entornos acuosos, no acuosos, sistemas bifásicos) y/o en un amplio intervalo de pH, por ejemplo, de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 11, y/o la aplicabilidad con cualquier soporte sólido u otra técnica de procesamiento.

Para un uso eficaz y económico de las ATA en aplicaciones industriales, es deseable emplear ATA con una alta actividad específica, alta estereoselectividad y alta termoestabilidad y alta conversión.

Muchas de las ATA actualmente conocidas, sin embargo, no poseen suficiente termoestabilidad, alta conversión o alta estereoselectividad, y no proporcionan la amina deseada (quiral) en suficiente rendimiento.

Puede conseguirse mejora de las enzimas por ingeniería enzimática. Esta técnica implica el desarrollo de variantes de una enzima de partida con propiedades mejoradas (para una revisión: S. Lutz, U.T. Bornscheuer, Protein Engineering Handbook, Wiley VCH, Weinheim, 2009).

La ingeniería de las ATA para mejorar la estereoselectividad, la termoestabilidad o la conversión se ha descrito en la bibliografía.

W Lima Afonso Neto et al., "Process Considerations for the Asymmetric Synthesis of Chiral Amines using w-Transaminase", Universidad Técnica de Dinamarca, tesis doctoral de 2013, se refiere a consideraciones del proceso para la síntesis asimétrica de aminas quirales usando transaminasa.

Joo-Hyun Seo et al.: "Exploring sequence space: Profile analysis and protein-ligand docking to screen waminotransferases with expanded substrate specificity", Biotechnol. J. 2008, 3(5), páginas 676-686, se refiere a secuencias de aminotransferasa para la síntesis asimétrica de aminas quirales.

El documento JP 2007 185133 (GSP:AGH64081) se refiere a una aminotransaminasa que mantiene su actividad enzimática en condiciones de alta temperatura. Esta aminotransaminasa está codificada por un polinucleótido derivado de Pseudomonas corrugata y que tiene una secuencia de bases específica. Es posible producir la aminotransaminasa preparando células transformadas usando un vector que contenga el polinucleótido. De este modo, también es posible producir un aminocompuesto ópticamente activo tal como una 1-bencil-3-aminopirrolidina ópticamente activa, etc.

El documento EP 2 022 852 se refiere a un método para producir un compuesto de amina ópticamente activo. El método se caracteriza usando una transaminasa (A), una alfa-ceto ácido reductasa (B) y una enzima (C), que tienen, cada una, propiedades específicas, en un sistema de reacción idéntico para convertir un compuesto de cetona en un compuesto de amina ópticamente activo correspondiente en que un átomo de carbono con un grupo amino unido al mismo sirve como centro asimétrico.

El documento WO 2004/085624 (GSP:ADS78319) se refiere a métodos de destoxificación enzimática de toxinas aminadas, por ejemplo, micotoxinas, tales como fumonisina. La referencia proporciona métodos para destoxificar enzimáticamente plantas, alimentos o piensos o cualquier producto o superficie contaminada, incluyendo la destoxificación de micotoxinas, tales como fumonisina, por ejemplo, fumonisina B1 y fumonisina B2. La referencia proporciona métodos para evitar la contaminación de plantas, alimentos o piensos o cualquier producto o superficie contaminada mediante la aplicación de un polipéptido que tenga actividad desaminasa. En un aspecto, la referencia se refiere a polipéptidos que tienen una actividad aminotransferasa, aminomutasa y/o desaminasa, polinucleótidos que codifican estas enzimas, métodos de preparación y uso de estos polinucleótidos y polipéptidos.

El documento WO 2006/063336 divulga omega-transaminasas termoestables, particularmente omega-transaminasas termoestables que se dice que tienen una alta tasa de reacción y que se dice que son tolerantes a altas concentraciones de amina donadora. La secuencia de tipo silvestre de la ATA de Arthrobacter citreus se dice que tiene un residuo D268 (es decir, un residuo de aspartato en la posición 268), mientras que para los fines de la memoria descriptiva se hace referencia a una ATA de tipo silvestre de Arthrobacter citreus que tiene un residuo N268 (es decir, una asparagina en la posición 268).

El documento WO 2010/081053 proporciona enzimas transaminasa manipuladas que tienen propiedades mejoradas en comparación con una enzima transaminasa de tipo silvestre de origen natural. También se proporcionan polinucleótidos que codifican las enzimas transaminasa manipuladas, células hospedadoras que pueden expresar las enzimas transaminasa manipuladas, y métodos de uso de las enzimas transaminasa manipuladas para sintetizar una diversidad de compuestos quirales.

El documento WO 2011/159910 se refiere a polipéptidos de transaminasa manipulados que se dice que tienen propiedades mejoradas en comparación con transaminasas de origen natural, incluyendo la capacidad de convertir el sustrato, 3'-hidroxiacetofenona en (S)-3-(1-aminoetil)-fenol en exceso enantiomérico y alto porcentaje de conversión.

Las ATA de la técnica anterior, sin embargo, no son satisfactorias en todos los aspectos y hay demanda de ATA mejoradas que tengan ventajas en comparación con las ATA convencionales, en particular con respecto a altas estabilidades del proceso a altas temperaturas para la producción industrial de productos de amina quiral con buenos rendimientos en alto exceso enantiomérico.

Un objeto de la invención es proporcionar ATA que tengan ventajas sobre las ATA de la técnica anterior.

Este problema se ha conseguido por la materia en cuestión de las reivindicaciones de la patente.

Un primer aspecto de la invención se refiere a ATA que se obtienen de la ATA de SEQ ID NO: 1, por manipulación, pero que no son idénticas a SEQ ID NO: 1. La transaminasa de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones, de modo que comprende

(i) la sustitución F255L; y

(ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268L y N268V; y en la que la transaminasa se caracteriza por una estereoselectividad mejorada y/o una conversión aumentada de un sustrato de cetona en un producto de amina o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

Para el propósito de la memoria descriptiva, "ATA manipulada" se refiere a una ATA que difiere de la secuencia de tipo silvestre especificada, por ejemplo, la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1. La manipulación puede significar sustitución de un residuo aminoacídico de la secuencia de tipo silvestre especificada por otro residuo aminoacídico. Además, la manipulación también puede significar eliminación de un residuo aminoacídico de la secuencia de tipo silvestre especificada, o inserción de un residuo aminoacídico en la secuencia de tipo silvestre especificada, o sustitución de un residuo aminoacídico de la secuencia de tipo silvestre especificada por más de un solo residuo aminoacídico distinto.

A este respecto, manipulación significa que uno o más aminoácidos en una posición dada se sustituyen con cualquier otro aminoácido proteinogénico seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Tyr y Val. En una realización preferida, la sustitución no altera la longitud de la secuencia, es decir, un solo residuo aminoacídico se remplaza por otro solo residuo aminoacídico. Sin embargo, también es posible eliminar uno o más residuos aminoacídicos sin remplazo y/o insertar uno o más residuos aminoacídicos.

En una realización específica, la ATA manipulada de acuerdo con la invención es un fragmento de al menos 380 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 400 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 420 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 425 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 430 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 435 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 440 residuos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 445 residuos aminoacídicos y mucho más preferiblemente al menos 446 residuos aminoacídicos del polipéptido de SEQ ID NO: 1. A este respecto, "fragmento" se refiere a una subsecuencia consecutiva de la SEQ ID NO: 1 respectiva, pero que está acortada en el extremo N y/o el extremo C.

En principio, una sustitución en cualquier posición de una enzima puede ser una sustitución conservativa donde dicho aminoácido se sustituye con un aminoácido de características comparables (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo con otro aminoácido hidrófobo). Además, una sustitución en cualquier posición de una enzima puede ser una sustitución no conservativa donde dicho aminoácido se sustituye con un aminoácido de otras características (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo con un aminoácido hidrófilo).

Una ATA manipulada preferida de acuerdo con la invención comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. También se divulgan ATA correspondientes a SEQ ID NO: 3, 4 y 5 que, sin embargo, no pertenecen a la invención. La relación de SEQ ID NO: 2, 3 y 4, así como de SEQ ID NO: 5, que se ensayó en los ejemplos, con respecto a SEQ ID NO: 1 se recoge en la tabla a continuación:

Por tanto, en comparación con SEQ ID NO: 1, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 tiene 10 mutaciones, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 tiene 2 mutaciones, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 tiene 3 mutaciones y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 tiene 1 mutación.

Preferiblemente, las ATA manipuladas obtenidas de la ATA de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con la invención pueden catalizar la conversión de un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) como se define a continuación en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) como se define a continuación; y/o preferiblemente la conversión concomitante de (ii) un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III) como se define a continuación en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) como se define a continuación, o viceversa.

Se ha descubierto sorprendentemente que tras la manipulación selectiva de SEQ ID NO: 1, las características de la ATA respectiva pueden potenciarse más, y que pueden obtenerse variantes de ATA que muestran, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1

- una estereoselectividad más mejorada, y/o

- una termoestabilidad más aumentada, y/o

- una conversión más aumentada; y/o

- un desplazamiento en la actividad y/o conversión de la especificidad de sustrato.

Se ha descubierto sorprendentemente que la ATA de acuerdo con la invención muestra termoestabilidad, actividad específica y conversión superiores en determinadas concentraciones de amina en comparación con otras ATA actualmente descritas.

En particular, se ha descubierto sorprendentemente que la ATA de acuerdo con la invención que convierte un sustrato de cetona en una amina, o viceversa, una amina en un producto de cetona, tiene una alta estabilidad a temperaturas mesófilas o altas, medidas como un valor de Tm(80 %) alto como se describe en el ejemplo 1 a continuación. Preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención tiene un valor de Tm(80 %) de al menos 55 °C, preferiblemente de al menos 56 °C, preferiblemente de al menos 57 °C, preferiblemente de al menos 58 °C, preferiblemente de al menos 59 °C y mucho más preferiblemente de al menos 60 °C.

En particular, se ha descubierto además que la ATA de acuerdo con la invención que convierte un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, tiene una alta actividad específica en condiciones del ensayo convencional de transaminasa como se describe en el ejemplo 1 a continuación. En particular, la ATA de acuerdo con la invención tiene una alta actividad específica para la conversión de 1-feniletan-1- amina racémica (MBA) y piruvato en 1-feniletanona (acetofenona) y L-alanina como se describe a continuación. Preferiblemente, la actividad específica de la ATA de acuerdo con la invención en la conversión de un sustrato de cetona en una amina, o viceversa, una amina en un producto de cetona, en condiciones del ensayo convencional de transaminasa es de al menos 0,05 U/mg, 0,06 U/mg, 0,07 U/mg, 0,08 U/mg, 0,09 U/mg, 0,1 U/mg, 0,15 U/mg, 0,2 U/mg, 0,25 U/mg, 0,3 U/mg, 0,35 U/mg, 0,4 U/mg, 0,45 U/mg, 0,5 U/mg, preferiblemente de al menos 0,6 U/mg, preferiblemente de al menos 0,7 U/mg, preferiblemente de al menos 0,8 U/mg, preferiblemente de al menos 0,9 U/mg, preferiblemente de al menos 1 U/mg, mucho más preferiblemente de al menos 1,1 U/mg.

En particular, se ha descubierto sorprendentemente además que la ATA de acuerdo con la invención que convierte un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, muestra alta conversión de un sustrato en determinadas concentraciones de cosustratos donadores de amina diferentes de interés industrial. En particular, la ATA de acuerdo con la invención muestra propiedades de alta conversión en condiciones de reacción pertinentes para aplicaciones de síntesis preparativa con los diferentes donadores de amina, isopropilamina (IPA), 1-feniletan-1-amina racémica (MBA) o alanina racémica, respectivamente con el sustrato 4-fenil-2- butanona (BA) como se describe en el ejemplo 1. En particular, la ATA de acuerdo con la invención es muy eficaz en la conversión en la condición A (BA 50 mM, IPA 100 mM), la condición B (BA 50 mM, MBA rac. 200 mM), la condición C (BA 50 mM, IPA 500 mM), la condición D (BA 50 mM, MBA rac. 1000 mM), la condición E (BA 50 mM, alanina racémica 200 mM), la condición K (BA 100 mM, MBA rac. 500 mM), la condición L (BA 200 mM, MBA rac. 500 mM) o la condición M (10 g/l de BA, IPA 900 mM).

Preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención en la conversión de un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, en condiciones del ensayo convencional de transaminasa (para los detalles véase la sección experimental) muestra una conversión de

- en la condición A una conversión de al menos un 5 %, preferiblemente de al menos un 6 %, preferiblemente de al menos un 7 %, preferiblemente de al menos un 8 %, preferiblemente de al menos un 9 %, preferiblemente de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 12,5 %, preferiblemente de al menos un 15 %, preferiblemente de al menos un 17,5 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 22,5 %, preferiblemente de al menos un 25 %, preferiblemente de al menos un 27,5 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 32,5 % y mucho más preferiblemente de al menos un 33,7 %; y/o

- en la condición B una conversión de al menos un 5 %, preferiblemente de al menos un 6 %, preferiblemente de al menos un 7 %, preferiblemente de al menos un 8 %, preferiblemente de al menos un 9 %, preferiblemente de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 40 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 60 %, preferiblemente de al menos un 70 %, preferiblemente de al menos un 71 %, preferiblemente de al menos un 72 %, preferiblemente de al menos un 73 %, preferiblemente de al menos un 74 %, preferiblemente de al menos un 75 %, preferiblemente de al menos un 76 %, preferiblemente de al menos un 77 %, preferiblemente de al menos un 78 %, preferiblemente de al menos un 79 %, preferiblemente de al menos un 80 % preferiblemente de al menos un 81 %, preferiblemente de al menos un 82 %, preferiblemente de al menos un 83 %, preferiblemente de al menos un 84 %, preferiblemente de al menos un 85 %, preferiblemente de al menos un 86 %, preferiblemente de al menos un 87 %, preferiblemente de al menos un 88 % y mucho más preferiblemente de al menos un 88,8; y/o

- en la condición C una conversión de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 25 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 40 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 60 %, preferiblemente de al menos un 61 %, preferiblemente de al menos un 62 %, preferiblemente de al menos un 63 %, preferiblemente de al menos un 64 %, preferiblemente de al menos un 65 %, preferiblemente de al menos un 66 %, preferiblemente de al menos un 67 %, preferiblemente de al menos un 68 %, preferiblemente de al menos un 69 %, preferiblemente de al menos un 70 % y mucho más preferiblemente de al menos un 70,7; y/o

- en la condición D una conversión de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 40 %, preferiblemente de al menos un 41 %, preferiblemente de al menos un 42 %, preferiblemente de al menos un 43 %, preferiblemente de al menos un 44 %, preferiblemente de al menos un 45 %, preferiblemente de al menos un 46 %, preferiblemente de al menos un 47 %, preferiblemente de al menos un 48 %, preferiblemente de al menos un 49 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 51 %, preferiblemente de al menos un 52 %, preferiblemente de al menos un 53 %, preferiblemente de al menos un 54 % y mucho más preferiblemente de al menos un 54,8; y/o

- en la condición E una conversión de al menos un 0,5 %, preferiblemente de al menos un 1 %, preferiblemente de al menos un 1,5 % y mucho más preferiblemente de al menos un 1,6 %; y/o

- en la condición K una conversión de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 40 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 60 %, preferiblemente de al menos un 61 %, preferiblemente de al menos un 62 %, preferiblemente de al menos un 63 %, preferiblemente de al menos un 64 %, preferiblemente de al menos un 65 %, preferiblemente de al menos un 66 %, preferiblemente de al menos un 67 %, preferiblemente de al menos un 68 %, preferiblemente de al menos un 69 %, preferiblemente de al menos un 70 %, preferiblemente de al menos un 71 %, preferiblemente de al menos un 72 %, preferiblemente de al menos un 73 % y mucho más preferiblemente de al menos un 74 %; y/o

- en la condición L una conversión de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 40 %, preferiblemente de al menos un 41 %, preferiblemente de al menos un 42 %, preferiblemente de al menos un 43 %, preferiblemente de al menos un 44 %, preferiblemente de al menos un 45 %, preferiblemente de al menos un 46 %, preferiblemente de al menos un 47 %, preferiblemente de al menos un 48 %, preferiblemente de al menos un 49 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 51 %, preferiblemente de al menos un 52 % y mucho más preferiblemente de al menos un 53 % y/o

- en la condición M una conversión de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 40 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 60 %, preferiblemente de al menos un 70 %, preferiblemente de al menos un 71 %, preferiblemente de al menos un 72 %, preferiblemente de al menos un 73 %, preferiblemente de al menos un 74 %, preferiblemente de al menos un 75 %, preferiblemente de al menos un 76 %, preferiblemente de al menos un 77 %, preferiblemente de al menos un 78 %, preferiblemente de al menos un 79 % y mucho más preferiblemente de al menos un 80 %.

Para el propósito de la memoria descriptiva, la estereoselectividad es la propiedad de una reacción química en que un solo reactante forma una mezcla desigual de estereoisómeros durante la creación no estereoespecífica de un nuevo estereocentro o durante la transformación no estereoespecífica de uno preexistente. La selectividad típicamente surge de diferentes en los efectos estéricos y efectos electrónicos en las rutas mecanísticas que dan lugar a los diferentes productos. El exceso enantiomérico (ee) de un producto quiral sobre el otro producto obtenido de una reacción enzimática es una medida para la estereoselectividad de la enzima, en particular de la ATA de acuerdo con la invención:

[prajucfr^quiralidadl ¡1 -[productiojqu iralkjad2¡i}

[pmduDtn(qu¡naJ¡dajcl1)] ■ liroductotauiralidad^

El exceso enantiomérico (expresado en porcentaje) se calcula como la diferencia entre la cantidad de dos productos con quiralidad diferente (producto(quiralidad1), producto(quiralidad2)) expresada como valor absoluto dividido por la suma de la concentración de ambos productos, multiplicado por 100. Preferiblemente, la conversión de un sustrato en un producto quiral en catálisis de la ATA de acuerdo con la invención proporciona el producto quiral deseado con un exceso enantiomérico de al menos un 50 % ee, más preferiblemente al menos un 60 % ee, más preferiblemente al menos un 65 % ee, más preferiblemente al menos un 70 % ee, más preferiblemente al menos un 75 % ee, aún más preferiblemente al menos un 80 % ee, aún más preferiblemente al menos un 85 % ee, aún más preferiblemente al menos un 90 % ee, todavía más preferiblemente al menos un 91 % ee, todavía más preferiblemente al menos un 92 % ee, todavía más preferiblemente al menos un 93 % ee, todavía más preferiblemente al menos un 94 % ee, todavía más preferiblemente al menos un 95 % ee, todavía más preferiblemente al menos un 96 % ee, incluso más preferiblemente al menos un 97 % ee, mucho más preferiblemente al menos un 98 % ee y en particular al menos un 99 % ee y en particular al menos un 99,9 % ee.

Una estereoselectividad mejorada de acuerdo con la invención se refiere a un exceso enantiomérico del producto proporcionado por medio de una ATA manipulada que es mayor que el exceso enantiomérico del producto proporcionado por medio de la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, el exceso enantiomérico proporcionado por una ATA manipulada de acuerdo con la invención se aumenta en al menos un 0,1 % ee, al menos un 0,5 % ee, al menos un 1 % ee, al menos un 3 % ee, al menos un 5 % ee, al menos un 7 % ee, al menos un 9 % ee, al menos un 11 % ee, al menos un 13 % ee, al menos un 15 % ee, al menos un 17 % ee, al menos un 19 % ee, al menos un 21 % ee, al menos un 23 % ee, al menos un 25 % ee, al menos un 27 % ee, al menos un 29 % ee, al menos un 31 % ee, al menos un 32 % ee, al menos un 33 % ee, al menos un 34 % ee, al menos un 35 % ee, al menos un 36 % ee, al menos un 37 % ee, al menos un 38 % ee, al menos un 39 % ee, al menos un 40 % ee, al menos un 41 % ee, al menos un 42 % ee, al menos un 43 % ee, al menos un 44 % ee, al menos un 45 % ee, al menos un 46 % ee, al menos un 47 % ee, al menos un 48 % ee, al menos un 49 % ee, al menos un 50 % ee, al menos un 55 % ee o al menos un 60 % ee, al menos un 65 % ee, al menos un 70 % ee, al menos un 75 % ee, al menos un 80 % ee, al menos un 85 % ee, al menos un 90 % ee, al menos un 95 % ee, al menos un 97 % ee, al menos un 98 % ee, al menos un 99 % ee o al menos un 99,5 % ee y en particular al menos un 99,9 % ee en comparación con la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1 para un sustrato dado. La estereoselectividad mejorada también puede significar que la ATA manipulada tiene una determinada estereoselectividad hacia el producto quiral deseado, mientras que la ATA no manipulada no tiene estereoselectividad significativa hacia dicho producto quiral. La estereoselectividad mejorada también puede significar que la ATA manipulada tiene una determinada estereoselectividad hacia un producto quiral deseado, mientras que la ATA no manipulada tiene una estereoselectividad hacia el producto quiral inverso, por ejemplo, la ATA manipulada tiene una estereoselectividad para construir una (R)-amina mientras que la ATA no manipulada tiene una estereoselectividad para la (S)-amina y viceversa.

Para el propósito de la memoria descriptiva, la termoestabilidad es la propiedad de una enzima de retener la actividad enzimática tras incubación a altas temperaturas durante un tiempo dado. La actividad enzimática de este modo puede determinarse en cualquier condición de ensayo. Para el propósito de esta invención, la termoestabilidad se expresa como un valor de Tm(80 %), que indica la temperatura a la que una enzima conserva un 80 % de su actividad enzimática inicial tras incubación en un sistema tamponante dado durante 15 minutos a dicha temperatura.

La termoestabilidad de una ATA de acuerdo con la invención, preferiblemente la termoestabilidad de la ATA de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1 o una ATA manipulada de acuerdo con esta invención, se determina preferiblemente por incubación de la ATA que contiene extracto en bruto durante 15 minutos a varias temperaturas dadas en un ciclador de PCR. Una muestra de cada extracto en bruto de ATA se incuba durante 15 minutos en hielo como referencia. Después de ello, todos los extractos en bruto se incuban en hielo durante 30 minutos. Las proteínas insolubles se separan por centrifugación y el sobrenadante se analiza con respecto a su actividad ATA restante en el ensayo convencional de transaminasa como se describe en el ejemplo 1 controlando la conversión de 1-feniletan-1-amina (MBA) y piruvato en 1-feniletanona (acetofenona) y L-alanina.

Una termoestabilidad mejorada de acuerdo con la invención se refiere a un valor de Tm(80 %) mayor de una ATA manipulada en comparación con la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, el valor de Tm(80 %) se aumenta en al menos 1 °C, al menos 2 °C, al menos 3 °C, al menos 4 °C, al menos 5 °C, al menos 6 °C, al menos 7 °C, al menos 8 °C, al menos 9 °C, al menos 10 °C, al menos 11 °C, al menos 12 °C, al menos 13 °C, al menos 14 °C, al menos 15 °C, al menos 16 °C, al menos 17 °C, al menos 18 °C, al menos 19 °C, al menos 20 °C, al menos 21 °C, al menos 22 °C, al menos 23 °C, al menos 24 °C, al menos 25 °C y mucho más preferiblemente al menos 30 °C en comparación con la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1.

Para el propósito de la memoria descriptiva, la conversión de una enzima de acuerdo con esta invención es el rendimiento de un producto dado después de un tiempo dado en una reacción que implica la enzima. Para el propósito de esta invención, la tasa de conversión se expresa como X % de conversión después de un tiempo dado usando 4-fenil-2-butanona como sustrato junto con isopropilamina (IPA) o (S)-1-feniletan-1-amina (S-MBA) como donador de amina en el producto correspondiente 1-metil-3-fenilpropilamina y acetona o 1-feniletanona (acetofenona) en una condición respectiva. Aunque la conversión de una ATA dada de acuerdo con esta invención puede desviarse dependiendo de diferentes sustratos usados, la conversión mejorada de una ATA manipulada de acuerdo con esta invención puede determinarse en cualquiera de las condiciones del ensayo de conversión de transaminasa condición A, condición B, condición C, condición D, condición E, condición K, condición L y/o condición M como se describe anteriormente y en el ejemplo 1.

Una conversión mejorada de acuerdo con la invención se refiere a una conversión de una ATA manipulada que es mayor que la conversión de la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1 en una condición respectiva. Preferiblemente, la conversión en cualquier condición es al menos un 0,1 %, preferiblemente al menos un 0,2 %, al menos un 0,3 %, al menos un 0,4 %, al menos un 0,5 %, al menos un 1 %, al menos un 1,5 %, al menos un 2,5 %, al menos un 5 %, al menos un 7,5 %, más preferiblemente al menos un 10 %, más preferiblemente al menos un 12,5 %, más preferiblemente al menos un 15 %, más preferiblemente al menos un 17,5 %, más preferiblemente al menos un 20 %, más preferiblemente al menos un 22,5 %, más preferiblemente al menos un 25 %, más preferiblemente al menos un 27,5 %, más preferiblemente al menos un 30 %, 35 %, preferiblemente al menos un 40 %, preferiblemente al menos un 45 %, preferiblemente al menos un 46 %, preferiblemente al menos un 47 %, preferiblemente al menos un 48 %, preferiblemente al menos un 49 %, preferiblemente al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 51 %, preferiblemente al menos un 52 %, preferiblemente al menos un 53 %, preferiblemente al menos un 54 %, preferiblemente al menos un 55 %, preferiblemente al menos un 56 %, preferiblemente al menos un 57 %, preferiblemente al menos un 58 %, preferiblemente al menos un 59 %, preferiblemente al menos un 60 %, preferiblemente al menos un 61 %, preferiblemente al menos un 62 %, preferiblemente al menos un 63 %, preferiblemente al menos un 64 %, preferiblemente al menos un 65 %, preferiblemente al menos un 66 %, preferiblemente al menos un 67 %, preferiblemente al menos un 68 %, preferiblemente al menos un 69 %, preferiblemente al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 71 %, preferiblemente al menos un 72 %, preferiblemente al menos un 73 %, preferiblemente al menos un 74 %, preferiblemente al menos un 75 %, preferiblemente al menos un 76 %, preferiblemente al menos un 77 %, preferiblemente al menos un 78 %, preferiblemente al menos un 79 %, preferiblemente al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 81 %, preferiblemente al menos un 82 %, preferiblemente al menos un 83 %, preferiblemente al menos un 84 %, preferiblemente al menos un 85 %, preferiblemente al menos un 86 %, preferiblemente al menos un 87 %, preferiblemente al menos un 88 %, preferiblemente al menos un 89 %, preferiblemente al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 91 %, preferiblemente al menos un 92 %, preferiblemente al menos un 93 %, preferiblemente al menos un 94 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 96 %, preferiblemente al menos un 97 %, preferiblemente al menos un 98 %, mucho más preferiblemente al menos un 99 % mayor que la conversión de la ATA no manipulada de SEQ ID NO: 1.

La secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones, en realizaciones preferidas en al menos tres posiciones, o en al menos cuatro posiciones, o en al menos cinco posiciones, o en al menos seis posiciones, o en al menos siete posiciones, o en al menos ocho posiciones, o en al menos nueve posiciones, o en al menos diez posiciones.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con esta divulgación puede manipularse en al menos una o más posiciones preferiblemente por 1 a 20 cambios de residuo, incluso más preferiblemente por 1 a 15 cambios de residuo, incluso más preferiblemente por 1 a 11 cambios de residuo, preferiblemente incluyendo cambios en una o más de las siguientes posiciones de SEQ ID NO: 1: V13, E15, M22, F25, P35, T39, D48, T50, R51, N57, L59, Y60, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, Y164, P195, E237, A242, G243, S244, A245, F255, N268, V271, L272, S302, K314, V328, K358, E362, Y363, H375, L387, T409, H410, K424, G434, V436, M437, T440, R442 y S450.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con esta divulgación puede manipularse en al menos una o más posiciones preferiblemente por 1 a 20 cambios de residuo, incluso más preferiblemente por 1 a 15 cambios de residuo, incluso más preferiblemente por 1 a 11 cambios de residuo, preferiblemente incluyendo cambios en una o más de las siguientes posiciones de SEQ ID NO: 1: V13, E15, M22, F25, P35, T39, D48, T50, R51, N57, L59, Y60, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, Y164, P195, E237, A242, G243, S244, A245, F255, N268, V271, L272, S302, K314, V328, K358, E362, Y363, H375, L387, T409, H410, K424, G434, V436, M437, T440, R442 y S450 con sustitución de cualquiera de los aminoácidos de estas posiciones con cualquier otro aminoácido proteinogénico seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Tyr y Val.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con esta divulgación puede manipularse de modo que comprenda al menos una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en

- en la posición V13 sustitución a V13L;

- en la posición E15 sustitución a E15R

- en la posición M22 sustitución a M22F, M22C, M22V, M22L, M22A o M22W;

- en la posición F25 sustitución a F25L;

- en la posición P35 sustitución a P35L o P35I;

- en la posición T39 sustitución a T39Y;

- en la posición D48 sustitución a D48G;

- en la posición T50 sustitución a T50R, T50N o T50H;

- en la posición R51 sustitución a R51K;

- en la posición N57 sustitución a N57S;

- en la posición L59 sustitución a L59F, L59W, L59V, L59A, L59S o L59G;

- en la posición Y60 sustitución a Y60A, Y60I, Y60L, Y60F o Y60V;

- en la posición A73 sustitución a A73N;

- en la posición A74 sustitución a A74P;

- en la posición E77 sustitución a E77G;

- en la posición L79 sustitución a L79M;

- en la posición T88 sustitución a T88V, T88A, T88G, T88L o T88Y;

- en la posición Y93 sustitución a Y93T o Y93N;

- en la posición V115 sustitución a V115I;

- en la posición T120 sustitución a T120S;

- en la posición L140 sustitución a L140K;

- en la posición H146 sustitución a H146Y, H146D o H146S;

- en la posición D147 sustitución a D147S;

- en la posición Y148 sustitución a Y148F, Y148S o Y148G;

- en la posición W151 sustitución a W151A, W151I, W151F, W151Y o W151S;

- en la posición L161 sustitución a L161A, L161F, L161M, L161Y, L161I o L161Q;

- en la posición Y164 sustitución a Y164F o Y164M;

- en la posición P195 sustitución a P195S;

- en la posición E237 sustitución a E237S, E237A o E237D;

- en la posición A242 sustitución a A242V, A242Y o A242G;

- en la posición G243 sustitución a G243A o G243I;

- en la posición S244 sustitución a S244A, S244G, S244I o S244L;

- en la posición A245 sustitución a A245T;

- en la posición F255 sustitución a F255L;

- en la posición N268 sustitución a N268A;

- en la posición V271 sustitución a V271A;

- en la posición L272 sustitución a L272I o L272A;

- en la posición S302 sustitución a S302G;

- en la posición K314 sustitución a K314E;

- en la posición V328 sustitución a V328G;

- en la posición K358 sustitución a K358E;

- en la posición E362 sustitución a E362R;

- en la posición Y363 sustitución a Y363F;

- en la posición H375 sustitución a H375F;

- en la posición L387 sustitución a L387V, L387I, L387F, L387Y, L387T, L387A o L387C;

- en la posición T409 sustitución a T409R;

- en la posición H410 sustitución a H410K o H410E;

- en la posición K424 sustitución a K424E;

- en la posición G434 sustitución a G434A, G434V, G434L, G434Y, G434T o G434C;

- en la posición V436 sustitución a V436A;

- en la posición M437 sustitución a M437T, M437C, M437F, M437V, M437Y o M437A;

- en la posición T440 sustitución a T440H, T440S o T440N;

- en la posición R442 sustitución a R442V, R442S, R442A, R442L o R442C;

- en la posición S450 sustitución a S450N.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con esta divulgación puede manipularse en al menos una o más posiciones de SEQ ID NO: 1 seleccionadas del grupo que comprende las posiciones M22, F25, T39, D48, T50, Y60, A73, V93, H146, L161, Y164, P195, A242, G243, S244, A245, F255, N268, V328, T409, K424, G434, V436, M437, T440, y R442.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con esta divulgación puede manipularse en al menos una o más posiciones de SEQ ID NO: 1 seleccionadas del grupo que comprende las posiciones F25, D48, Y164, P195, A242, A245, F255, N268, V328, T409, K424, y V436.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con esta divulgación puede manipularse en las posiciones

- D48, Y164, P195, A242, A245, F255, N268, T409, K424, y V436, preferiblemente D48G, Y164F, P195S, A242V, A245T, F255L, N268A, T409R, K424E, y V436A; y/o

- F255 y V328, preferiblemente F255L y V328G; y/o

- F25, Y164 y F255, y preferiblemente F25L, Y164M y F255L.

La transaminasa (ATA) de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 de modo que comprende (i) la sustitución F255L; (ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268L y N268V; y en la que la transaminasa se caracteriza por una estereoselectividad mejorada y/o una conversión aumentada de un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

En el sentido de esta invención, la homología se calcula preferiblemente como identidad usando BLASTP (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller y David J. Lipman (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.

25:3389-3402; Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksandr Morgulis, Alejandro A. Schaffer y Yi-Kuo Yu (2005) "Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices." FEBS J. 272:5101-5109), preferiblemente usando la versión de BLASTP 2.2.29+ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), preferiblemente usando los siguientes ajustes:

• Campo "introducir secuencia de consulta": subintervalo de consulta: ninguno

• Campo "elegir conjunto de búsqueda": base de datos: secuencias proteínicas no redundantes (nr); parámetros opcionales: ninguno

• Campo "selección de programa": algoritmo: blastp (BLAST de proteína-proteína)

• Parámetros del algoritmo: Campo "parámetros generales": secuencias diana máx.: 100; consultas cortas: ajustar automáticamente los parámetros para secuencias introducidas cortas; umbral de expectativa: 10; tamaño de palabra: 3; coincidencias máx. en un intervalo de consulta: 0

• Parámetros del algoritmo: Campo "parámetros de puntuación": matriz: BLOSUM62; costes de hueco: existencia: 11 prolongación: 1; ajustes compositivos: ajuste de matriz de puntuación compositiva condicionada

• Parámetros del algoritmo: Campo "filtros y enmascarado": filtro: ninguno; máscara: ninguna.

La ATA de acuerdo con la invención comprende dicha secuencia de aminoácidos con una homología definida con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Definiciones adicionales de acuerdo con la divulgación se refieren a una homología con respecto a SEQ ID NO: 2, 3 y 4, respectivamente. Esto significa que la ATA de acuerdo con la invención puede comprender dicha secuencia de aminoácidos como subsecuencia de su secuencia de aminoácidos global, o que la ATA de acuerdo con la invención puede consistir esencialmente en dicha secuencia de aminoácidos. Cuando la ATA de acuerdo con la invención comprende dicha secuencia de aminoácidos como subsecuencia de su secuencia de aminoácidos global, dicha secuencia de aminoácidos global puede prolongarse, es decir, puede comprender residuos aminoacídicos adicionales, en el extremo N y/o en el extremo C de dicha subsecuencia. Dicha prolongación puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando la ATA tiene que inmovilizarse en un soporte sólido, por ejemplo, con fines de purificación.

En una realización particularmente preferida, la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones de modo que comprende las sustituciones F255L y N268A.

De acuerdo con la invención, la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones, de modo que comprende

(i) la sustitución F255L; y

(ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268L y N268V.

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones de modo que comprende

(i) la sustitución F255L; y

(ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268V.

En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos está manipulada adicionalmente en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una posición más seleccionada del grupo que consiste en D48, Y60, Y164, P195, A242, A245, T409, K424, y V436.

En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos está manipulada adicionalmente en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una posición más por un residuo aminoacídico seleccionado del grupo que consiste en V13, E15, M22, P35, T39, T50, R51, N57, L59, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, E237, G243, S244, V271, L272, S302, K314, K358, E362, Y363, H375, L387, H410, G434, M437, T440, R442, y S450.

En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos está manipulada adicionalmente en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una posición más de modo que comprende una sustitución seleccionada del grupo que consiste en V13L, E15R, M22F, M22C, M22V, M22L, M22A, M22W, P35L, P35I, T39Y, D48G, T50R, T50N, T50H, R51K, N57S, L59F, L59W, L59V, L59A, L59S, L59G, Y60A, Y60I, Y60L, Y60F, Y60V, A73N, A74P, E77G, L79M, T88V, T88A, T88G, T88L, T88Y, V93T, V93N, V1151, T120S, L140K, H146Y, H146D, H146S, D147S, Y148F, Y148S, Y148G, W151A, W151I, W151F, W151Y, W151S, L161A, L161F, L161M, L161Y, L161I, L161Q, Y164F, Y164M, P195S, E237S, E237A, E237D, A242V, A242Y, A242G, G243A, G243I, S244A, S244G, S244I, S244L, A245T, V271A, L272I, L272A, S302G, K314E, K358E, E362R, Y363F, H375F, L387V, L387I, L387F, L387Y, L387T, L387A, L387C, T409R, H410K, H410E, K424E, G434A, G434V, G434L, G434Y, G434T, G434C, V436A, M437T, M437C, M437F, M437V, M437Y, M437A, T440H, T440S, T440N, R442V, R442S, R442A, R442L, R442C, y S450N.

La secuencia de aminoácidos de acuerdo con esta divulgación puede estar manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en

(i) al menos dos posiciones de modo que comprende las sustituciones F255L y también N268A; y

(ii) al menos una posición más seleccionada del grupo que consiste en V13, E15, M22, P35, T39, D48, T50, R51, N57, L59, Y60, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, Y164, P195, E237, A242, G243, S244, A245, V271, L272, S302, K314, K358, E362, Y363, H375, L387, T409, H410, K424, G434, V436, M437, T440, R442, y S450.

La secuencia de aminoácidos de acuerdo con esta divulgación puede estar manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en

(i) al menos dos posiciones de modo que comprende las sustituciones F255L y también N268A; y

(ii) al menos una posición más de modo que comprende una sustitución más seleccionada del grupo que consiste en V13L, E15R, M22F, M22C, M22V, M22L, M22A, M22W, P35L, P35I, T39Y, D48G, T50R, T50N, T50H, R51K, N57S, L59F, L59W, L59V, L59A, L59S, L59G, Y60A, Y60I, Y60L, Y60F, Y60V, A73N, A74P, E77G, L79M, T88V, T88A, T88G, T88L, T88Y, V93T, V93N, V1151, T120S, L140K, H146Y, H146D, H146S, D147S, Y148F, Y148S, Y148G, W151A, W151I, W151F, W151Y, W151S, L161A, L161F, L161M, L161Y, L161I, L161Q, Y164F, Y164M, P195S, E237S, E237A, E237D, A242V, A242Y, A242G, G243A, G243I, S244A, S244G, S244I, S244L, A245T, V271A, L272I, L272A, S302G, K314E, K358E, E362R, Y363F, H375F, L387V, L387I, L387F, L387Y, L387T, L387A, L387C, T409R, H410K, H410E, K424E, G434A, G434V, G434L, G434Y, G434T, G434C, V436A, M437T, M437C, M437F, M437V, M437Y, M437A, T440H, T440S, T440N, R442V, R442S, R442A, R442L, R442C, y S450N.

Preferiblemente, la transaminasa comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención puede catalizar la conversión de un sustrato de cetona (A) en una amina (C). Simultáneamente, la ATA de acuerdo con la invención puede catalizar la conversión de una molécula donadora de amina (B) en un producto de cetona (D). También preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención puede catalizar la conversión de una amina (C) en un producto de cetona (A), catalizando simultáneamente de ese modo la conversión de un aceptador de amina (D) en una molécula de amina (B):

En una realización preferida, la ATA de acuerdo con la invención puede catalizar la conversión estereoselectiva de un sustrato de cetona (A) en una (S)-amina quiral (C), y/o viceversa, una (S)-amina quiral (C) en un producto de cetona (A).

En otra realización preferida, la ATA de acuerdo con la invención puede catalizar la conversión estereoselectiva de un sustrato de cetona (A) en una (R)-amina quiral (C), y/o viceversa, una (R)-amina quiral (C) en un producto de cetona (A).

Preferiblemente, la transaminasa de acuerdo con la invención puede catalizar la conversión de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I)

en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II)

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III)

en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV)

(IV);

o viceversa;

en la que el producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) preferiblemente tiene configuración (S) o configuración (R) en el átomo de carbono central como se muestra en la fórmula general (II); y

en la que X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de residuos hidrocarbonados C^1-12 alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, sin sustituir o mono- o polisustituidos; residuos hidrocarbonados C^6-10 aromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; residuos hidrocarbonados heteroaromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; y residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden, en cada caso, mono-, di- u oligosacáridos;

en la que uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno;

en la que mono- o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12K -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10)² , -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo.

Un experto en la materia reconoce que, cuando X t Y t hidrógeno, el átomo de carbono central como se muestra en la fórmula general (II) es quiral y puede tener configuración (S) o configuración (R). Lo mismo se aplica a A, B y la fórmula general (IV).

Preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención preferiblemente puede catalizar la conversión estereoselectiva de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I)

en un producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II)

(II);

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina quiral o aquiral de acuerdo con la fórmula general (III)

en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV)

(IV);

o viceversa;

en la que el producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II) preferiblemente tiene configuración (S) o configuración (R); y

en la que X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de residuos hidrocarbonados C^1-12 alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, sin sustituir o mono- o polisustituidos; residuos hidrocarbonados C^6-10 aromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; residuos hidrocarbonados heteroaromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; y residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden, en cada caso, mono-, di- u oligosacáridos;

en la que uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno;

en la que mono- o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12K -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10K -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo.

X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, pueden ser alquilo, cicloalquilo, alquilcicloalquilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo o alquilheteroarilo, que en cada caso puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más grupos químicos que no interfieren con la catálisis enzimática, y donde X o Y, así como A y B pueden ser hidrógeno. Además, X e Y pueden no ser idénticos en estructura y quiralidad, y ya pueden contener un centro de quiralidad. X e Y también pueden formar un anillo, que puede estar sustituido o sin sustituir o condensado con otros anillos. A y B del cosustrato pueden ser idénticos o no idénticos en estructura o quiralidad, y como X e Y, pueden formar un anillo, que puede estar sustituido o sin sustituir o condensado con otros anillos.

Preferiblemente, X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, cada uno se selecciona independientemente de alquilo C^1-12 sin sustituir o mono- o polisustituido; arilo C^6-10 sin sustituir o mono- o polisustituido, que opcionalmente está unido a través de un residuo de alquileno C^1-12 sin sustituir o mono- o polisustituido; heteroarilo sin sustituir o mono- o polisustituido, que opcionalmente está unido a través de un residuo de alquileno C^1-12 alifático sin sustituir o mono- o polisustituido; y residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden, en cada caso, mono-, di- u oligosacáridos;

en la que mono- o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12)² , -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10)² , -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo.

Para el propósito de la descripción, los residuos hidrocarbonados C^1-12 alifáticos saturados o insaturados incluyen, aunque sin limitación, residuos de alquilo, alquenilo y alquinilo, tales como -CH³ , -CH²CH³ , -CH²CH²CH³ , -CH(CH³)² , - CH²CH²CH²CH³ , -CH(CH³)CH²CH³ , -CH²CH(CH³)² , -C(CH³)³ , -CH=CH² , -CH=CHCH=CH² , -C=CH y -CH=CHC=CH.

Para el propósito de la descripción, los residuos hidrocarbonados C^1-12 alicíclicos saturados o insaturados incluyen, aunque sin limitación, cicloalquilo C^3-12, en el que 1 o 2 átomos de carbono en el anillo pueden remplazarse opcionalmente con heteroátomos seleccionados de N, O y S (heterocicloalquilo C^1-12).

Para el propósito de la descripción, los residuos hidrocarbonados C^6-10 aromáticos (= arilo C^6-10) incluyen, aunque sin limitación, fenilo y naftilo.

Para el propósito de la descripción, los residuos hidrocarbonados heteroaromáticos (= heteroarilo) incluyen, aunque sin limitación, sistemas de anillo monocíclicos, sistemas de anillo bicíclicos y sistemas de anillo tricíclicos. Ejemplos de heteroarilos monocíclicos incluyen, aunque sin limitación, azetidinilo, azepanilo, aziridinilo, diazepinilo, 1,3-dioxolanilo, dioxanilo, ditianilo, furilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolinilo, isotiazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, oxadiazolilo, oxadiazolinilo, oxadiazolidinilo, oxazolilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, piperidinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranoílo, tetrahidrotienilo, tetrazinilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolinilo, tiadiazolidinilo, tiazolilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, tienilo, tiomorfolinilo, 1,1-dioxidotiomorfolinilo (tiomorfolina sulfona), tiopiranilo, triazinilo, triazolilo y tritianilo. Ejemplos de heteroarilos bicíclicos incluyen, aunque sin limitación, bencimidazolilo, benzodioxinilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzofuranilo, benzopiranilo, benzotiopiranilo, cinolinilo, indazolilo, indolilo, 2,3-dihidroindolilo, indolizinilo, naftiridinilo, isobenzofuranilo, isobenzotienilo, isoindolilo, isoquinolinilo, ftalazinilo, 4H-pirido(1,2-a)pirimidin-4-ona, piranopiridinilo, quinolinilo, quinolizinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo y tiopiranopiridinilo. Ejemplos de heteroarilos tricíclicos incluyen, aunque sin limitación, acridinilo, carbazolilo, carbolinilo, dibenzo(b,d)furanilo, dibenzo(b,d)tienilo, nafto(2,3-b)furano, nafto(2,3-b)tienilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tiantrenilo, tioxantenilo y xantenilo.

Para el propósito de la descripción, mono- o polisustituido con respecto a alquilo (por ejemplo, -alquilo C^1-12), cicloalquilo (por ejemplo, -cicloalquilo C^3-8), arilo (por ejemplo, -arilo C^6-10) y heteroarilo, respectivamente, preferiblemente significa independientemente remplazo de un hidrógeno del núcleo con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo (preferiblemente -F, -Cl, -Br, -I), -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO² , -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12K -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10K -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo.

Para el propósito de la descripción, residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos significa que el sustrato de cetona de fórmula general (I) o el cosustrato de amina de fórmula general (III) puede ser un compuesto de polihidroxicarbonilo, opcionalmente ligado a otros compuestos de polihidroxicarbonilo a través de enlaces acetal y/o cetal. Por ejemplo, cuando X es alquilo C¹ monosustituido con -OH e Y es alquilo C² polisustituido con -OH, en el que cada átomo de carbono porta un solo sustituyente -OH, el sustrato de cetona de fórmula general (I) es una cetotetrosa que engloba ambos enantiómeros, D-eritrulosa, así como L-eritrulosa. De forma análoga, el sustrato de cetona de fórmula general (I) puede ser una cetopentosa o una cetohexosa que puede estar ligada, a su vez, a otros residuos glucídicos formando, por tanto, disacáridos u oligosacáridos.

Preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención puede convertir un sustrato de cetona en una amina con una amplia actividad específica por sustratos donadores de amina elegidos. Los donadores de amina adecuados pueden seleccionarse de acuerdo con su actividad específica en una reacción dada. Ejemplos de donadores de amina que pueden usarse con la invención incluyen, sin limitación, isopropilamina (a partir de ahora en este documento también denominada "IPA", también conocida como 2-aminopropano o propan-2-amina), feniletilamina (también conocida como 1-feniletilamina, y también denominada a menudo incorrectamente metil-bencilamina, a partir de ahora en este documento denominada "MBA"), 1-metil-3-fenilpropilamina (también conocida como 2-amino-4-fenilbutano), glicina, ácido glutámico, glutamato, glutamato de monosodio, D-alanina, L-alanina, ácido aspártico, lisina, ornitina, p-alanina, taurina, n-octilamina, ciclohexilamina, 1,4-butanodiamina, 1,6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-aminobutírico, tiramina, y bencilamina, 2-aminobutano, 2-amino-1 -butanol, 1 -amino-1 -feniletano, 1 -amino-1 -(2-metoxi-5-fluorofenil)etano, 1-amino-1-fenilpropano, 1-amino-1-(4-hidroxifenil)propano, 1-amino-1-(4-bromofenil)propano, 1-amino-1-(4-nitrofenil)propano, 1-fenil-2-aminopropano, 1-(3-trifluorometilfenil)-2-aminopropano (también conocido como norfenfluramina), 2-aminopropanol, 1-amino-1-fenilbutano, 1-fenil-2-aminobutano, 1-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)-2-aminobutano, 1-fenil-3-aminobutano, 1-(4-hidroxifenil)-3-aminobutano, 1-amino-2-metilciclopentano, 1-amino-3-metilciclopentano, 1-amino-2-metilciclohexano, 1-amino-1-(2-naftil)etano, 3-metilciclopentilamina, 2-metilciclopentilamina, 2-etilciclopentilamina, 2-metilciclohexilamina, 3-metilciclohexilamina, 1-aminotetralina, 2-aminotetralina, 2-amino-5-metoxitetralina, y 1-aminoindano, incluyendo también cada ejemplo sus enantiómeros e isómeros estructurales, según pueda ser el caso y cuando sea posible, e incluyendo todas las posibles sales de los mismos.

Preferiblemente, la ATA de acuerdo con la invención puede convertir una amina en un sustrato de cetona con una amplia actividad específica por sustratos aceptadores de amina elegidos. Los aceptadores de amina adecuados pueden seleccionarse de acuerdo con su actividad específica en una reacción dada. Ejemplos de aceptadores de amina que pueden usarse con la invención incluyen, sin limitación, 1-feniletanona (también conocida como acetofenona, a partir de ahora en este documento denominada "AP"), 4-fenil-2-butanona (también conocida como bencilacetona, a partir de ahora en este documento denominada "BA"), ácido 2-oxo-acético, ácido 2-oxo-pentanodioico (también conocido como ácido alfa-cetoglutárico), ácido 5-amino-2-oxo-pentanoico, piruvato, ácido 2-cetosuccínico, ácido 6-amino-2-oxo-hexanoico, 6-oxo-norleucina, ácido 5-amino-2-oxo-pentanoico, 5-oxo-norvalina, ácido 3-oxopropanoico, ácido 2-oxo-etanosulfónico, octanal, ciclohexanona, 4-aminobutanal, butanodial, 6-amino-hexanal, hexanodial, ácido 6-oxo-hexanoico, ácido 4-oxo-butírico, 4-hidroxi-bencenoacetaldehído, benzaldehído, 2-butanona, 1-hidroxi-2-butanona, 1-feniletanona, 1-(5-fluoro-2-metoxifenil)-etanona, 1-fenil-1-propanona, 1-(4-hidroxifenil)-1-propanona, 1-fenil-1-propanona, 1-(4-bromofenil)-1-propanona, 1-fenil-1-propanona, 1-(4-nitrofenil)-1-propanona, 1-fenil-2-propanona, 1-(3-trifluorometilfenil)-2-propanona, 1-hidroxi-2-propanona, 1-fenil-1-butanona, 1-fenil-2-butanona, 1- (2,5-dimetoxi-4-metilfenil)-2-butanona, 1-fenil-3-butanona, 1-(4-hidroxifenil)-3-butanona, 2-metil-ciclopentanona, 3-metilciclopentanona, 2-metilciclohexanona, 1-(2-naftalenil)etanona, 1-metil-3-ciclopentanona, 2-metilciclopentanona, 2- etilciclopentanona, 2-metilciclohexanona, 3-metilciclohexanona, 1,2,3,4-tetra-hidro-1-oxonaftaleno, 1,2,3,4-tetrahidro-2-naftalenona, 2-oxo-5-metoxi-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno y 1-indona, incluyendo cada ejemplo sus enantiómeros e isómeros estructurales, según pueda ser el caso y cuando sea posible, e incluyendo todas las posibles sales de los mismos.

Preferiblemente, la transaminasa de acuerdo con la invención se caracteriza por

(A) una temoestabilidad de al menos 50 °C, preferiblemente 55 °C y mucho más preferiblemente de 60 °C, y/o (b ) una actividad específica de al menos 0,05 U/mg, 0,06 U/mg, 0,07 U/mg, 0,08 U/mg, 0,09 U/mg, 0,1 U/mg, 0,15 U/mg, 0,2 U/mg, 0,25 U/mg, 0,3 U/mg, 0,35 U/mg, 0,4 U/mg, 0,45 U/mg, 0,5 U/mg, preferiblemente 0,75 U/mg, más preferiblemente de 1 U/mg y mucho más preferiblemente de 1,1 U/mg en el ensayo convencional de transaminasas; y/o

(C) una alta actividad de conversión en diferentes condiciones de reacción que implican altas concentraciones de amina.

Preferiblemente, la transaminasa de acuerdo con la invención está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una o más posiciones de modo que

(A) la estereoselectividad de la transaminasa manipulada es mayor que la de la transaminasa de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1; y/o

(B) la termoestabilidad de la transaminasa manipulada es mayor que la de la transaminasa de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1; y/o

(C) la conversión de la transaminasa manipulada es mayor que la de la transaminasa de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, la ATA manipulada de SEQ ID NO: 1 de acuerdo con la invención comprende una secuencia de aminoácidos de al menos un 90 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 91 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 92 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 93 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 94 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 95 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 96 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 97 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 98 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,1 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,2 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,3 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,4 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,5 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,6 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,7 % de homología, todavía más preferiblemente al menos un 99,8 % de homología, o al menos un 99,9 % de homología con SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO 2.

En una realización específica de esta divulgación, cualquier secuencia de aminoácidos manipulada de SEQ ID NO: 1 en comparación con la secuencia de aminoácidos no manipulada de SEQ ID NO: 1

- proporciona una estereoselectividad mejorada de al menos un 35%, preferiblemente al menos un 40 %, preferiblemente al menos un 45 %, preferiblemente al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 55 %, preferiblemente al menos un 60 %, preferiblemente al menos un 65 %, preferiblemente al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, preferiblemente al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 85 %, preferiblemente al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 95 %, preferiblemente al menos un 98 %, preferiblemente al menos un 99 %, preferiblemente al menos un 99,5 % y mucho más preferiblemente al menos un 99,9 % y/o

- proporciona una termoestabilidad de al menos 65 °C, más preferiblemente al menos 70 °C, aún más preferiblemente al menos 75 °C, aún más preferiblemente al menos 80 °C y mucho más preferiblemente al menos 85 °C; y/o - proporciona una conversión más aumentada de preferiblemente al menos un 35 %, preferiblemente al menos un 40 %, preferiblemente al menos un 45 %, preferiblemente al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 55 %, preferiblemente al menos un 60 %, preferiblemente al menos un 65 %, preferiblemente al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 75 %, preferiblemente al menos un 802 %, preferiblemente al menos un 85 %, preferiblemente al menos un 90 %, preferiblemente al menos un 55 %, preferiblemente al menos un 95 % y mucho más preferiblemente al menos un 99 % y/o

- proporciona una conversión mejorada y una especificidad de sustrato aumentada para la especificidad de sustrato y/o actividad para (R)-fenilacetilcarbinol, 1-fenil-1-butanona, 2-metil-1-fenil-1-propanona, 1-fenil-1-pentanona, metil-3-oxo-3-fenilpropanoato y/o metil-3-oxo-3-fenilbutirato.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la conversión de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) como se describe anteriormente en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) como se describe anteriormente;

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III) como se describe anteriormente en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) como se describe anteriormente,

o viceversa;

en el que el producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) preferiblemente tiene configuración (S) o configuración (R); y

en el que el método comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) y/o un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) en presencia de una ATA de acuerdo con la invención.

Preferiblemente, la invención se refiere a un método para la conversión estereoselectiva de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) como se describe anteriormente en un producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II) como se describe anteriormente;

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina quiral o aquiral de acuerdo con la fórmula general (III) como se describe anteriormente en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) como se describe anteriormente,

o viceversa;

en la que el producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II) preferiblemente tiene configuración (S) o configuración (R); y

en el que el método comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) y/o un producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina quiral o aquiral de acuerdo con la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) en presencia de una ATA de acuerdo con la invención.

Preferiblemente, el método de acuerdo con la invención es para la conversión de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I)

en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II)

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de acuerdo con la fórmula general (III)

en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV)

(IV);

o viceversa;

en la que X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de residuos hidrocarbonados C^1-12 alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, sin sustituir o mono- o polisustituidos; residuos hidrocarbonados C^6-10 aromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; residuos hidrocarbonados heteroaromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; y residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden, en cada caso, mono-, di- u oligosacáridos;

en la que uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno;

en la que mono- o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12K -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10K -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo;

en el que el método comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) y/o un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) en presencia de una transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una ATA de acuerdo con la invención como se describe anteriormente, para la amidación de un grupo ceto en cualquier dirección posible, preferiblemente en el método de acuerdo con la invención como se describe anteriormente.

Preferiblemente, la invención se refiere al uso de una ATA de acuerdo con la invención como se describe anteriormente para la conversión de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) como se describe anteriormente en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) como se describe anteriormente;

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III) como se describe anteriormente en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) como se describe anteriormente,

o viceversa;

en el que el producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) preferiblemente tiene configuración (S) o configuración (R).

Preferiblemente, la invención se refiere al uso de una ATA de acuerdo con la invención como se describe anteriormente para la conversión estereoselectiva de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) como se describe anteriormente en un producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II) como se describe anteriormente;

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina quiral o aquiral de acuerdo con la fórmula general (III) como se describe anteriormente en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) como se describe anteriormente,

o viceversa;

en el que el producto de amina quiral de acuerdo con la fórmula general (II) tiene configuración (S) o configuración (R).

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero no se deben interpretar como limitantes de su alcance.

La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 se sustituyó sistemáticamente en las posiciones F25, A268, V328 y L255. En cada caso, se sustituyó únicamente una sola posición en comparación con SEQ ID NO: 2. Los siguientes mutantes de SEQ ID NO: 2 obtenidos de este modo tienen las siguientes SEQ ID NO en la lista de secuencias:

Ejemplo 1: Caracterización de propiedades enzimáticas de ATA manipulada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5

Las secuencias génicas que codifican la ATA correspondiente a SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 se clonaron en el vector de expresión pLE1A17 (derivado de pRSF-1b, Novagen). Los plásmidos resultantes se usaron para la transformación de células de E. coli BL21(DE3).

Para la expresión de la ATA correspondiente a SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 las células se cultivaron en medio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) complementado con kanamicina (50 mg/l) a 37 °C. La expresión de los genes se indujo en fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) y se realizó a 30 °C durante 16-18 horas.

Las células se recogieron por centrifugación (3220 x g, 20 min, 4 °C) y se alteraron por resuspensión correspondiente a una densidad óptica, medida a 600 nm (DO600) de 100 con tampón de lisis celular (Tris-HCl 50 mM pH 7,0; MgCl2 2 mM, CelLytic B 1x (Sigma); 0,02 U de nucleasa de ADN, 0,5 mg/ml de lisozima). Los extractos en bruto se separaron de los desechos celulares por centrifugación (3220 x g 30 min, 4 °C), dando como resultado preparaciones activas enzimáticas de la ATA de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. Para la detección de la actividad enzimática de una ATA de la invención, puede obtenerse un liofilizado de la preparación activa de la ATA. El extracto en bruto o liofilizado se investigó con respecto a la actividad ATA usando el ensayo convencional de transaminasa.

El ensayo convencional de transaminasa controla la conversión de 1-feniletan-1-amina racémica (MBA) y piruvato en 1-feniletanona (acetofenona) y L-alanina. La reacción se realiza a 30 °C en tampón fosfato 50 mM (pH 7,4) y piridoxalfosfato 0,1 mM (PLP) usando 1 -feniletan-1 -amina racémica 10 mM y piruvato de sodio 10 mM como sustratos. Se hizo seguimiento de la producción de 1 -feniletanona fotométricamente a 300 nm. Una unidad (U) libera 1 pmol de 1-feniletanona (acetofenona) por minuto. La actividad específica se refiere a unidades por miligramo de liofilizado de extracto en bruto (U/mg)

Además, se analizó la termoestabilidad de cada enzima. Para este fin, se registraron los perfiles de fusión de estas preparaciones activas enzimáticas de una ATA respectiva por incubación del extracto en bruto durante 15 minutos a diferentes temperaturas en un ciclador de PCR. Después de ello, los extractos en bruto se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las proteínas insolubles se separaron por centrifugación y los sobrenadantes se analizaron con respecto a su actividad ATA restante en un ensayo convencional de transaminasa como se describe anteriormente.

La termoestabilidad se expresó como la temperatura a la que un 80 % de la actividad inicial de la variante de ATA permanece después de 15 min de incubación [Tm(80 %)]. La actividad inicial es la actividad de la variante de ATA respectiva sin ningún tratamiento a alta temperatura, es decir, con 15 min de incubación en hielo en lugar de incubación a diferentes temperaturas en un ciclador de PCR.

Adicionalmente, se investigaron las propiedades de conversión de estas enzimas en el ensayo de conversión de transaminasas.

El ensayo de conversión de transaminasas controla las propiedades enzimáticas en diferentes condiciones de reacción que son pertinente para una aplicación de síntesis preparativa a alta concentración de diferentes donadores de amina, isopropilamina (IPA), 1-feniletan-1-amina racémica (MBA) o (S)-1-feniletan-1-amina (S-MBA) o alanina racémica, respectivamente. El aceptador de cetona fue 4-fenil-2-butanona (BA). La reacción se realizó a 30 °C en tampón fosfato 50 mM (pH 7,4) y piridoxalfosfato 0,1 mM (PLP).

La conversión de BA en 1-metil-3-fenilpropilamina se analizó por HPLC después de un tiempo de acción dado, típicamente 6 h o 20 h. Las condiciones analíticas son:

- Columna: Gemini 5p C18, 150 x 4,6 mm (Phenomenex);

- Eluyentes: A) dH2O, ácido trifluoroacético al 0,1 % (TfA); B) Acetonitrilo, TFA al 0,1 %;

- Flujo: 1 ml/min; gradiente: 20 % de B a 80 % de B en 6 min, mantenimiento durante 1 min, hasta 20 % de B en 1 min, mantenimiento durante 3 min;

- Temperatura del horno: 35 °C;

- Detección: 210 nm.

Los tiempos de retención de los analitos son 6,52 min para BA y 3,65 min para 1 -metil-3-fenilpropilamina.

En general, el ensayo de conversión de transaminasas puede hacerse en condiciones que difieren en el tipo de donador de amina (IPA, MBA y alanina) y la concentración respectiva de los reactantes.

- Condición A: BA 50 mM, IPA 100 mM; después de 6 h

- Condición B: BA 50 mM, MBA rac. 200 mM; después de 6 h

- Condición C: BA 50 mM, IPA 500 mM; después de 6 h

- Condición D: BA 50 mM, MBA rac. 1000 mM; después de 6 h

- Condición E: BA 50 mM, alanina rac. 200 mM; después de 6 h

- Condición K: BA 100 mM, MBA rac. 500 mM,

- Condición L: BA 200 mM, MBA rac. 500 mM,

- Condición M: 10 g/l de bA, IPA 900 mM.

Las preparaciones de enzima activa de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 en este ejemplo se analizaron en las condiciones A, B, C, D, E, K, L y M.

Las características de las preparaciones de enzima activan de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 se resumen en las tablas a continuación.

Ejemplo 2: Generación y expresión de colecciones de ATA mutantes de SEQ ID NO: 2

Se generaron colecciones de mutantes de SEQ ID NO: 2 para las posiciones 25, 255, 268 y 328, usando protocolos convencionales para mutagénesis de saturación del sitio, generando el conjunto completo de variantes que presentaban cada uno de los 20 aminoácidos canónicos para una posición dada. Los genes se clonaron en el vector de expresión pLE1A17 (derivado de pRSF-1b, Novagen). Los plásmidos resultantes se usaron para la transformación de células de E. coli BL21 (DE3).

Para la expresión de las nuevas variantes de ATA correspondientes a SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 81 las células se cultivaron en medio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) complementado con kanamicina (50 mg/l) a 37 °C. La expresión de los genes se indujo en fase logarítmica por IPTG (0,1 mM) y se realizó a 30 °C durante 16-18 horas.

Las células se recogieron por centrifugación (3220 x g, 20 min, 4 °C) y se alteraron por resuspensión correspondiente a una densidad óptica, medida a 600 nm (DO600) de 100 con tampón de lisis celular (Tris-HCl 50 mM pH 7,0; MgCl2 2 mM, piridoxalfosfato 0,1 mM (PLP), CelLytic B 1x (Sigma); 0,02 U de nucleasa de a Dn , 0,5 mg/ml de lisozima). Los extractos en bruto se separaron de los desechos celulares por centrifugación (3220 x g 30 min, 4 °C), dando como resultado preparaciones activas enzimáticas de las variantes de ATA de SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 81.

El extracto en bruto o el extracto en bruto con tratamiento por calor adicional se investigó con respecto a la actividad ATA usando el ensayo convencional de transaminasa como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3: Caracterización de actividad transaminasa relativa de variantes de saturación del sitio derivadas de SEQ ID NO: 2

Las preparaciones de enzima activa (extractos en bruto) de variantes de ATA manipuladas de SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 81 de colecciones de saturación del sitio, obtenidas como se describe en el ejemplo 2, se caracterizaron usando el ensayo convencional de transaminasa como se describe anteriormente, a una dilución final adecuada para la detección de pendientes lineales. Los datos de actividad se indican como actividad relativa, que describe la actividad (pendiente ajustada como tasas iniciales a partes lineales de los ciclos temporales) de una variante mutante dada en relación con la actividad de SEQ ID NO: 2, que se determinó en paralelo durante el mismo experimento.

Los resultados experimentales se resumen en la tabla a continuación.

Ejemplo 4: Estudio comparativo del efecto de incubación térmica sobre lisados en bruto de variantes de saturación del sitio de SEQ ID NO: 2

La preparación de enzima activa (extractos en bruto) de variantes de ATA manipuladas de SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 81 de colecciones de saturación del sitio, obtenida como se describe en el ejemplo 2, se caracterizó para sus actividades relativas después de tratamiento por calor a 66 °C. Los extractos en bruto se incubaron a 66 °C durante 15 min, posteriormente se incubaron en hielo durante 30 min. Las proteínas agregadas se sedimentaron por centrifugación (3220 x g, 20 min, 4 °C).

Las actividades relativas de los extractos en bruto después de este tratamiento se determinaron usando el ensayo convencional de transaminasa como se describe en el ejemplo 1, a una dilución final adecuada para la detección de pendientes lineales. Los datos de actividad se indican como actividad relativa después de incubación por calor, que describe la actividad después de incubación por calor (pendiente ajustada como tasas iniciales a partes lineales de los ciclos temporales) de un mutante dado en relación con la actividad después de incubación por calor de SEQ ID NO: 2, que se determinó en paralelo durante el mismo experimento.

Los resultados experimentales se resumen en la tabla a continuación.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una transaminasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de homología con SEQ ID NO: 1, en la que la secuencia de aminoácidos está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones, de modo que comprende

(i) la sustitución F255L; y

(ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268L y N268V;

y en la que la transaminasa se caracteriza por una estereoselectividad mejorada y/o una conversión aumentada de un sustrato de cetona en un producto de amina o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, en comparación con la secuencia de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

2. La transaminasa de acuerdo con la reivindicación 1, que está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones de modo que comprende

(i) la sustitución F255L; y

(ii) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en N268A, N268I, N268V, preferiblemente N268A.

3. La transaminasa de acuerdo con la reivindicación 1, que está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos dos posiciones de modo que comprende las sustituciones F255L y N268A.

4. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está manipulada adicionalmente en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una posición más seleccionada del grupo que consiste en D48, Y60, Y164, P195, A242, A245, T409, K424, y V436.

5. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está manipulada adicionalmente en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una posición más por un residuo aminoacídico seleccionado del grupo que consiste en V13, E15, M22, F25, P35, T39, T50, R51, N57, L59, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, E237, G243, S244, V271, L272, S302, K314, V328, K358, E362, Y363, H375, L387, H410, G434, M437, T440, R442, y S450.

6. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está manipulada adicionalmente en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una posición más de modo que comprende una sustitución seleccionada del grupo que consiste en V13L, E15R, M22F, M22C, M22V, M22L, M22A, m 22W, F25L, P35L, P35I, T39Y, D48G, T50R, T50N, T50H, R51K, N57S, L59F, L59W, L59V, L59A, L59S, L59G, Y60A, Y60I, Y60L, Y60F, Y60V, A73N, A74P, E77G, L79M, T88V, T88A, T88G, T88L, T88Y, V93T, V93N, V115I, T120S, L140K, H146Y, H146D, H146S, D147S, Y148F, Y148S, Y148G, W151A, W151I, W151F, W151Y, W151S, L161A, L161F, L161M, L161Y, L161I, L161Q, Y164F, Y164M, P195S, E237S, E237A, E237D, A242V, A242Y, A242G, G243A, G243I, S244A, S244G, S244I, S244L, A245T, V271A, L272I, L272A, S302G, K314E, V328G, K358E, E362R, Y363F, H375F, L387V, L387I, L387F, L387Y, L387T, L387A, L387C, T409R, H410K, H410E, K424E, G434A, G434V, G434L, G434Y, G434T, G434C, V436A, M437T, M437C, M437F, M437V, M437Y, M437A, T440H, T440S, T440N, R442V, R442S, R442A, R442L, R442C, y S450N.

7. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en

(i) al menos dos posiciones de modo que comprende las sustituciones F255L y también N268A; y

(ii) al menos una posición más seleccionada del grupo que consiste en V13, E15, M22, F25, P35, T39, D48, T50, R51, N57, L59, Y60, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, Y164, P195, E237, A242, G243, S244, A245, V271, L272, S302, K314, V328, K358, E362, Y363, H375, L387, T409, H410, K424, G434, V436, M437, T440, R442, y S450.

8. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en

(i) al menos dos posiciones de modo que comprende las sustituciones F255L y también N268A; y

(ii) al menos una posición más de modo que comprende una sustitución más seleccionada del grupo que consiste en V13L, E15R, M22F, M22C, M22V, M22L, M22A, M22W, F25L, P35L, P35I, T39Y, D48G, T50R, T50N, T50H, R51K, N57S, L59F, L59W, L59V, L59A, L59S, L59G, Y60A, Y60I, Y60L, Y60F, Y60V, A73N, A74P, E77G, L79M, T88V, T88A, T88G, T88L, T88Y, V93T, V93N, V115I, T120S, L140K, H146Y, H146D, H146S, D147S, Y148F, Y148S, Y148G, W151A, W151I, W151F, W151Y, W151S, L161A, L161F, L161M, L161Y, L161I, L161Q, Y164F, Y164M, P195S, E237S, E237A, E237D, A242V, A242Y, A242G, G243A, G243I, S244A, S244G, S244I, S244L, A245T, V271A, L272I, L272A, S302G, K314E, V328G, K358E, E362R, Y363F, H375F, L387V, L387I, L387F, L387Y, L387T, L387A, L387C, T409R, H410K, H410E, K424E, G434A, G434V, G434L, G434Y, G434T, G434C, V436A, M437T, M437C, M437F, M437V, M437Y, M437A, T440H, T440S, T440N, R442V, R442S, R442A, R442L, R442C, y S450N.

9. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la homología de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 es de al menos un 85 %.

10. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la homología de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 es de al menos un 90 %.

11. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la homología de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 1 es de al menos un 95 %; o en la que la homología de la secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO: 2 es de al menos un 95 %.

12. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la transaminasa comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

13. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que puede catalizar la conversión de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I)

en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II)

( I I ) ;

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III)

en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV)

(IV);

o viceversa;

en la que X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de residuos hidrocarbonados C^{1 -12} alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, sin sustituir o mono- o polisustituidos; residuos hidrocarbonados C6 aromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^{1 - 12} alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; residuos hidrocarbonados heteroaromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^{1 - 12} alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; y residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden, en cada caso, mono-, di- u oligosacáridos;

en la que uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno;

en la que mono- o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12)² , -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10)² , -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo.

14. La transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está manipulada en comparación con SEQ ID NO: 1 en al menos una o más posiciones de modo que

(A) la estereoselectividad de la transaminasa manipulada es mayor que la de la transaminasa de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1; y/o

(B) la termoestabilidad de la transaminasa manipulada es mayor que la de la transaminasa de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1; y/o

(C) la conversión de la transaminasa manipulada es mayor que la de la transaminasa de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1.

15. Un método para la conversión de

(i) un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I)

en un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II)

(IT);

y/o la conversión preferiblemente simultánea de

(ii) un cosustrato de acuerdo con la fórmula general (III)

en un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV)

(IV),

o viceversa;

en la que X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de residuos hidrocarbonados C^1-12 alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, sin sustituir o mono- o polisustituidos; residuos hidrocarbonados C⁶ aromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; residuos hidrocarbonados heteroaromáticos sin sustituir o mono- o polisustituidos, que opcionalmente están unidos a través de un residuo hidrocarbonado C^1-12 alifático saturado o insaturado, sin sustituir o mono- o polisustituido; y residuos glucídicos o residuos desoxiglucídicos que comprenden, en cada caso, mono-, di- u oligosacáridos;

en la que uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno;

en la que mono- o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de -halo, -OH, =O, -O-alquilo C^1-12, -O-arilo C^6-10, -O-heteroarilo, -OCO-alquilo C^1-12, -OCO-arilo C^6-10, -OCO-heteroarilo, -SH, -S-alquilo C^1-12, -S-arilo C^6-10, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³ , -NH² , -NH(alquilo C^1-12), -N(alquilo C^1-12K -NH(arilo C^6-10), -N(arilo C^6-10)² , -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)² , -CN, -CHO, -CO²H, CO-alquilo C^1-2, -CO-arilo C^6-10 y -CO-heteroarilo;

en el que el método comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona de acuerdo con la fórmula general (I) y/o un producto de amina de acuerdo con la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina de acuerdo con la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona de acuerdo con la fórmula general (IV) en presencia de una transaminasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.