ES2903177T3

ES2903177T3 - Transaminasas

Info

Publication number: ES2903177T3
Application number: ES16732966T
Authority: ES
Inventors: Andreas Vogel; Daniel Schwarze; Rico Czaja; Sally Bayer; Sebastian Bartsch
Original assignee: C Lecta GmbH
Current assignee: C Lecta GmbH
Priority date: 2015-06-12
Filing date: 2016-06-10
Publication date: 2022-03-31
Anticipated expiration: 2036-06-10
Also published as: US10370693B2; EP4008777A1; EP3307881B1; ES2868191T3; US20180298354A1; EP3307881A1; WO2016198665A1; WO2016198660A1; EP3307880A1; US20190078130A1; US10774356B2; EP3307880B1

Abstract

Una transaminasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO:3, donde la transaminasa está sustituida en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una posición seleccionada de entre el grupo de sustituciones de aminoácidos N161A, N161M, N161Q y N161I, donde (A) la estereoselectividad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o (B) la termoestabilidad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3.

Description

DESCRIPCIÓN

Transaminasas

La solicitud reivindica la prioridad de EP15171924, depositada el 12 de junio de 2015.

La invención se refiere a transaminasas, también denominadas aminotransferasas, o más específicamente a amina transaminasas, también abreviadas en lo sucesivo y denominadas "ATA". Las ATA según la invención son particularmente útiles para catalizar la conversión de aminas en cetonas y/o viceversa.

Las transaminasas son enzimas ubicuas que se encuentran en todos los reinos de la vida. Las transaminasas catalizan la transferencia de un grupo amino de una molécula donadora de amina a una molécula cetona aceptora de amina y viceversa. Las transaminasas se dividen en seis clases basadas en características estructurales comunes y similitud de secuencia (Steffen-Munsberg y col. 2015). Las denominadas "omega transaminasas (w transaminasas) transfieren grupos amino que están más distantes de un grupo carboxílico (p. ej., en la posición p, y o 6) y, a menudo, forman parte de la familia de las aminotransferasas de clase III (principalmente (S)-transaminasas selectivas de amina) o clase IV (principalmente aminas transaminasas selectivas (R)). Para determinar la pertenencia a la familia de una proteína, se puede utilizar la herramienta web InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro; Hunter y col., 2012).

El término "Aminas transaminasas" (ATA) describe las transaminasas, incluidas las omega transaminasas, que permiten la conversión de aminas independientemente de la presencia o ausencia de grupos carboxílicos en el sustrato, y son predominantemente un subgrupo de transaminasas de clase III. En consecuencia, la terminología de las transaminasas omega es engañosa, pero se utiliza con frecuencia en las publicaciones. Las ATA son todas las enzimas que pertenecen a la subclase EC Interopero 2.6.1., según la definición de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular. A la fecha de esta invención, no se ha designado un número de serie de CE específico para las transaminasas que principalmente convierten sustratos no carboxílicos, y las ATA a menudo se denominan EC 2.6.1.X, mientras que X significa cualquier enzima clasificada en la subclase. EC 2.6.1., y a la fecha de esta invención para cualquier cifra de 1 a 107 (es decir, EC 2.6.1.1, EC 2.6.1.2, EC 2.6.1.3, ... hasta EC 2.6.1.107). Otros ejemplos de miembros de las transaminasas de clase III con diferentes funciones primarias son acetilornitina aminotransferasa (EC 2.6.1.11), ornitina aminotransferasa (EC 2.6.1.13), omega-aminoácido-piruvato aminotransferasa (EC 2.6.1.18), 4-aminobutirato aminotransferasa (EC 2.6.1.19), DAPA aminotransferasa (EC 2.6.1.62), 2, 2-dialquilglicina descarboxilasa (EC 4.1.1.64) o glutamato-1-semialdehído aminotransferasa (EC 5.4.3.8).

La reacción de las ATA convierte los sustratos de cetonas (A) en productos de amina (C) mientras que simultáneamente convierte los cosustratos de donantes de amino (B) en el coproducto de cetonas correspondiente (D):

Según su estereoselectividad, se han distinguido dos clases de ATA: (S)-ATA que catalizan preferentemente la formación de una (S)-amina a partir de un grupo ceto, y (R)-ATA que preferentemente catalizan la formación de una (R)-amina de un grupo ceto. Sin embargo, esta distinción en (S)-ATA y (R)-ATA puede ser engañosa, ya que depende de la naturaleza del sustrato, es decir, los sustituyentes del grupo ceto y su prioridad según las reglas de la nomenclatura CIP (Cahn -Ingold-Prelog). Por tanto, una ATA dada puede considerarse como una (S)-ATA con respecto a la conversión de un grupo ceto, mientras que la misma ATA puede considerarse como una (R)-ATA con respecto a la conversión de otro grupo ceto.

La síntesis estereoselectiva de compuestos de amina, en particular de compuestos de amina quirales, es de gran interés para la química sintética en particular en la industria farmacéutica (Shaheer Malik y col, 2012), pero también juega un papel importante en la química de polímeros (poliamidas). Además, se pueden aplicar ATA para la resolución cinética de aminas racémicas.

La reacción que es catalizada por las ATA es reversible (reacción de equilibrio) y puede sufrir inhibición del sustrato o del producto, dependiendo del equilibrio de reacción específico. Para obtener cantidades industrialmente relevantes de un producto deseado, se requieren ATA que catalicen la conversión de sustratos con alta actividad específica. Puede ser necesario desviar la reacción de equilibrio hacia la producción del compuesto de amina deseado eligiendo las condiciones óptimas de reacción, lo que da como resultado altos rendimientos de producto durante el tiempo del procedimiento. También pueden jugar un papel importante otros factores cinéticos, como la selectividad del sustrato, K^my la estereoselectividad. Otros aspectos relevantes pueden incluir, pero no se limitan a, diastereoselectividad, regioselectividad, inhibición por otros factores (por ejemplo, componentes de extracto crudo, contaminantes de sustrato o productos secundarios) y capacidad de expresión soluble recombinante en huéspedes adecuados.

Otro criterio importante en el uso industrial de ATA es una larga estabilidad del procedimiento, que a menudo se correlaciona con una alta estabilidad a temperaturas elevadas y una buena estabilidad en disolventes y/o a altas concentraciones de sustrato y producto, respectivamente. En aplicaciones industriales, la estabilidad del procedimiento también puede abarcar estabilidad química y física, actividad enzimática en diferentes disolventes (ambientes acuosos, no acuosos, sistemas bifásicos) y/o en un amplio intervalo de pH, por ejemplo, de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 11, y/o aplicabilidad con cualquier soporte sólido u otra técnica de procesamiento.

Para un uso eficiente y económico de las ATA en aplicaciones industriales, es deseable emplear ATA con una alta actividad específica, alta estereoselectividad y alta termoestabilidad y alta conversión.

Sin embargo, muchas de las ATA conocidas actualmente no poseen suficiente termoestabilidad, alta conversión o alta estereoselectividad, y no proporcionan la amina deseada (quiral) con un rendimiento suficiente.

La mejora de las enzimas se puede lograr mediante ingeniería enzimática. Esta técnica implica el desarrollo de variantes de una enzima de partida con propiedades mejoradas (para revisión: S. Lutz, U.T. Bornscheuer, Protein Engineering Handbook, Wiley VCH, Weinheim, 2009).

La ingeniería de ATA para mejorar la estereoselectividad, la termoestabilidad o la conversión se encuentra descrita en la bibliografía.

W Lima Afonso Neto y col., Technical University of Denmark, Phd Thesis, se refiere a consideraciones de procedimiento para la síntesis asimétrica de aminas quirales usando w transaminasa.

JP 2007 185133 (GSP:AGH64081) se refiere a una aminotransaminasa que mantiene su actividad enzimática en condiciones de alta temperatura. Esta aminotransaminasa está codificada por un polinucleótido derivado de Pseudomonas corrugata y que tiene una secuencia base específica. Es posible producir la aminotransaminasa preparando células transformadas usando un vector que contiene el polinucleótido. De ese modo, también es posible producir un compuesto amino ópticamente activo tal como una 1-bencil-3-aminopirrolidina ópticamente activa, etc.

EP 2022852 se refiere a un procedimiento para producir un compuesto de amina ópticamente activo. El procedimiento se caracteriza por usar una transaminasa (A), una alfa-cetoácido reductasa (B) y una enzima (C), cada una con propiedades específicas, en un sistema de reacción idéntico para convertir un compuesto cetónico en un compuesto de amina correspondiente ópticamente activo en el que un átomo de carbono con un grupo amino unido al mismo sirve como centro asimétrico.

WO 2004/085624 (GSP:ADS78319) se refiere a procedimientos de desintoxicación enzimática de toxinas aminadas, por ejemplo, micotoxinas, tales como fumonisina. La referencia proporciona procedimientos para desintoxicar enzimáticamente plantas, alimentos o piensos o cualquier producto o superficie contaminada, incluida la desintoxicación de micotoxinas, tales como fumonisina, por ejemplo, fumonisina B1 y fumonisina B2. La bibliografía proporciona procedimientos para impedir la contaminación de plantas, alimentos o piensos o cualquier producto o superficie contaminada por aplicación o un polipéptido que tenga actividad de desaminasa. En un aspecto, la referencia se refiere a polipéptidos que tienen una aminotransferasa, una aminomutasa y/o una actividad de desaminasa, polinucleótidos que codifican estas enzimas, procedimientos para fabricar y usar estos polinucleótidos y polipéptidos.

WO 2006/063336 describe omega-transaminasas termoestables, particularmente omega-transaminasas termoestables que se dice que tienen una alta velocidad de reacción y que se dice que son tolerantes a altas concentraciones de amina donante.

WO 2010/081053 proporciona enzimas transaminasas modificadas genéticamente que tienen propiedades mejoradas en comparación con una enzima transaminasa natural de tipo salvaje. También se proporcionan polinucleótidos que codifican las enzimas transaminasas modificadas genéticamente, células huésped capaces de expresar las enzimas transaminasas modificadas genéticamente y procedimientos para usar las enzimas transaminasas modificadas genéticamente para sintetizar una variedad de compuestos quirales.

WO 2011/159910 se refiere a polipéptidos de transaminasas modificadas genéticamente que se dice que tienen propiedades mejoradas en comparación con las transaminasas naturales, incluida la capacidad de convertir el sustrato, 3'-hidroxiacetofenona en (S)-3-(1-aminoetil)-fenol en exceso enantiomérico y conversión de alto porcentaje.

Sin embargo, las ATA de la técnica anterior no son satisfactorias en todos los aspectos y existe una demanda de ATA mejoradas que tengan ventajas en comparación con las ATA convencionales, en particular con respecto a la alta estabilidad del procedimiento a altas temperaturas para la producción industrial de productos de aminas quirales con buenos rendimientos en alto exceso enantiomérico.

Es un objetivo de la invención proporcionar ATA que tengan ventajas sobre las ATA de la técnica anterior. Este problema ha sido resuelto por el objeto de las reivindicaciones de patente.

La invención proporciona nuevas ATA, en particular ATA modificadas genéticamente que exhiben propiedades mejoradas en comparación con la enzima de tipo salvaje, preferiblemente la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3.

Un primer aspecto de la invención se refiere a una ATA que comprende una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos 80 %, más preferiblemente de al menos 85 %, aún más preferiblemente de al menos 90 %, a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3.

La transaminasa comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de homología con la SEQ ID NO:3, donde la transaminasa está sustituida en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una posición seleccionada de entre el grupo de sustituciones de aminoácidos N161A, N161M N161Q, N161I. y donde (A) la estereoselectividad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o (B) la termoestabilidad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3. Preferiblemente, la transaminasa se modifica adicionalmente en comparación con SEQ ID NO:3 en la posición Y164 y/o posición G51. En una realización particularmente preferida de la invención, la transaminasa comprende al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N161A, N161M, N161Q, N161I, Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, Y164I y G51S.

Preferiblemente, la ATA según la invención comprende una secuencia de aminoácidos con una homología con SEQ ID NO:3 de al menos al menos 80 %, más preferiblemente al menos 81 %, o al menos 82 %, o al menos 83 %, o al menos 84 %, o al menos 85 %, aún más preferiblemente al menos 86 %, o al menos 87 %, o al menos 88 %, o al menos 89 %, o al menos 90 %, aún más preferiblemente al menos 91 %, o al menos 92 %, o al menos 93 %, o al menos 94 %, o al menos 95 %, y lo más preferiblemente al menos 96 %, o al menos 97 %, o al menos 98 %, o al menos 99 %. Preferiblemente, la At a comprende una secuencia de aminoácidos con una homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 de al menos 98,6 o al menos 98,7 %, más preferiblemente al menos 98,8 o al menos 99,0 %, aún más preferiblemente al menos 99,1 % o al menos 99,2 %, aún más preferiblemente al menos 99,3 o al menos 99,4 %, incluso más preferiblemente al menos 99,5 % o al menos 99,6 %, lo más preferiblemente al menos 99.7 o al menos 99,8 % y en particular al menos 99,9 % o aproximadamente 100 %.

La ATA según la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos que se modifica por ingeniería comparada con la SEQ ID NO: 3 al menos en la posición N161, preferiblemente al menos en las posiciones N161 e Y164, o al menos en las posiciones N161 y G51, con una homología con la SEQ. ID NO: 3 de al menos 80 %, más preferiblemente al menos 81 %, o al menos 82 %, o al menos 83 %, o al menos 84 %, o al menos 85 %, aún más preferiblemente al menos 86 %, o al menos el 87 %, o al menos el 88 %, o al menos el 89 %, o al menos el 90 %, aún más preferiblemente al menos el 91 %, o al menos el 92 %, o al menos el 93 %, o al menos el 94 %, o al menos el 95 %, y lo más preferiblemente al menos el 96 %, o al menos el 97 %, o al menos el 98 %, o al menos el 99 %. Preferiblemente, la ATA comprende una secuencia de aminoácidos con una homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 de al menos 98,6 % o al menos 98,7 %, más preferiblemente al menos 98,8 o al menos 99,0 %, aún más preferiblemente al menos 99,1 % o al menos 99,2 %, aún más preferiblemente al menos 99,3 o al menos 99,4 %, incluso más preferiblemente al menos 99,5 % o al menos 99,6 %, lo más preferiblemente al menos 99,7 o al menos 99.8 % y en particular al menos 99,9 % o aproximadamente 100 %.

La ATA según la invención comprende tal secuencia de aminoácidos con una homología definida con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3. Esto significa que la ATA según la invención puede comprender dicha secuencia de aminoácidos como una subsecuencia de su secuencia global de aminoácidos, o que la ATA según la invención puede consistir esencialmente en dicha secuencia de aminoácidos. Cuando la ATA según la invención comprende dicha secuencia de aminoácidos como una subsecuencia de su secuencia de aminoácidos general, dicha secuencia de aminoácidos general puede extenderse, es decir, puede comprender residuos de aminoácidos adicionales, en el extremo N y/o en el extremo C de dicha subsecuencia. Tal extensión puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando la ATA debe inmovilizarse sobre un soporte sólido, por ejemplo, con fines de purificación.

En el sentido de esta invención, la homología se calcula preferiblemente como identidad usando BLASTP (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, y David J. Lipman (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.

25:3389-3402; Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksandr Morgulis, Alejandro A. Schaffer, y Yi-Kuo Yu (2005) "Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices." FEBS J. 272:5101-5109), preferiblemente usando la versión BLASTP 2.2.29+ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), preferiblemente usando la siguiente configuración:

- Campo "Ingresar secuencia de consulta": Subintervalo de consulta: ninguno

- Campo "Seleccionar conjunto de búsqueda": Base de datos: secuencias de proteínas no redundantes (nr); parámetros opcionales: ninguno

- Campo "Selección de programa": Algoritmo: blastp (proteína-proteína BLAST)

- Parámetros del algoritmo: Campo "Parámetros generales": Secuencias diana máx.: 100; Consultas breves: ajustar automáticamente los parámetros para secuencias de entrada breves; Esperar umbral: 10; Tamaño de palabra: 3; Coincidencias máximas en un intervalo de consulta: 0

- Parámetros de algoritmo: Campo "Parámetros de puntuación": Matriz: BLOSUM62; Costos de brecha: Existencia: 11 Extensión: 1; Ajustes de composición: ajuste de matriz de puntuación de composición condicional

- Parámetros del algoritmo: Campo "Filtros y enmascaramiento": Filtro: ninguno; Máscara: ninguna.

Preferiblemente, la ATA según la divulgación es capaz de catalizar la conversión de un sustrato de cetona (A) en una amina (C). Al mismo tiempo, la ATA según la invención es capaz de catalizar la conversión de una molécula donadora de amina (B) en un producto cetónico (D). También preferiblemente, la ATA según la invención es capaz de catalizar la conversión de una amina (C) en un producto cetónico (A), catalizando concomitantemente la conversión de un aceptor de amina (D) en una molécula de amina (B):

En una realización preferida de la invención, la ATA según la invención es capaz de catalizar la conversión estereoselectiva de un sustrato de cetona (A) en una (S)-amina (C) quiral, y/o viceversa de una (S)-amina (C) quiral a un producto cetónico (A).

En otra realización preferida de la invención, la ATA según la invención es capaz de catalizar la conversión estereoselectiva de un sustrato de cetona (A) en una (R)-amina (C) quiral, y/o viceversa de una (R)-amina (C) quiral a un producto cetónico (A).

La ATA según la invención es preferiblemente capaz de catalizar la conversión de

(i) un sustrato de cetona según la fórmula general (I)

a un producto de amina según la fórmula general (II)

(II);

y/o la conversión preferiblemente concomitante de

(ii) un cosustrato de amina según la fórmula general (III)

a un coproducto de cetona según la fórmula general (IV)

(IV);

o viceversa;

donde el producto de amina según la fórmula general (II) tiene preferiblemente configuración (S) o configuración (R) en el átomo de carbono central como se muestra en la fórmula general (II); y

donde X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente uno de otro, se seleccionan de entre residuos de hidrocarburos alifáticos o alicíclicos C^1-12, saturados o insaturados, no sustituidos o mono o polisustituidos; residuos de hidrocarburos aromáticos C^6-10, no sustituidos o mono o polisustituidos, opcionalmente puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; residuos de hidrocarburos heteroaromáticos no sustituidos o mono o polisustituidos, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático C^1-12, saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido;y residuos de azúcar o residuos de desoxiazúcar que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos;

donde uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno;

donde mono o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de entre -halo, -OH, =O, -OC^1-12-alquilo, -OC^6-10-arilo, -O-heteroarilo, -OCOC^1-12-alquilo, -OCOC^6-10-arilo, -OCO-heteroarilo, -SH, -SC^1-12-alquilo, -SC^6-10-arilo, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³, -NH², -NH(C^1-12-alquilo), -N(C^1-12-alquilo)², -NH(C^6-10-arilo), -N(C^6-10-arilo)², -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)², -CN, -CHO, -CO²H, CO-C^1-2-alquilo, -CO-C^6-10-arilo y -CO-heteroarilo.

Un experto reconocerá que cuando X t Y t hidrógeno, el átomo de carbono central como se muestra en la fórmula general (II) es quiral y puede tener una configuración (S) o una configuración (R). Lo mismo se aplica a A, B y a la fórmula general (IV).

Preferiblemente, la ATA según la invención es preferiblemente capaz de catalizar la conversión estereoselectiva de (i) un sustrato de cetona según la fórmula general (I)

a un producto de amina quiral según la fórmula general (II)

(II):

y/o la conversión preferiblemente concomitante de

(ii) un cosustrato de amina quiral o no quiral según la fórmula general (III)

a un coproducto de cetona según la fórmula general (IV)

o viceversa;

donde el producto de amina quiral según la fórmula general (II) tiene preferiblemente configuración (S) o configuración (R); y

donde X e Y, así como A y B, en cualquier caso, independientemente uno de otro, se seleccionan de entre residuos de hidrocarburos alifáticos o alicíclicos C^1-12, saturados o insaturados, no sustituidos o mono o polisustituidos;

residuos de hidrocarburos aromáticos C^6-10, no sustituidos o mono o polisustituidos, opcionalmente puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; residuos de hidrocarburos heteroaromáticos no sustituidos o mono o polisustituidos, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático C^1-12, saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido;y residuos de azúcar o residuos de desoxiazúcar que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos;

X e Y así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, pueden ser alquilo, cicloalquilo, alquilcicloalquilo, arilo, alquilarilo, heteroarilo o alquilheteroarilo, que en cada caso pueden estar insustituidos o sustituidos con uno o más grupos químicos que no interfieren con la catálisis enzimática y donde X o Y así como A y B pueden ser hidrógeno. Además, X e Y pueden no ser idénticos en estructura y quiralidad, y pueden contener ya un centro de quiralidad. X e Y también pueden formar un anillo, que puede estar sustituido o no sustituido o fusionado con otros anillos. A y B del cosustrato pueden ser idénticos o no idénticos en estructura o quiralidad, y como X e Y, pueden formar un anillo, que puede estar sustituido o no sustituido o fusionado con otros anillos.

Preferiblemente, X e Y así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan cada uno independientemente de entre alquilo C^1-12; arilo no sustituido o mono o polisustituido C^6-10, que opcionalmente está puenteado a través de un residuo de alquileno no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; heteroarilo no sustituido o mono o polisustituido, que opcionalmente está puenteado a través de un residuo de alquileno alifático no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; y residuos de azúcar o residuos de desoxiazúcar que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos;

Para el propósito de la descripción, residuos de hidrocarburos alifáticos saturados o insaturados C^1-12, incluyen, pero no se limitan a, residuos de alquilo, alquenilo y alquinilo, tales como -CH³, -CH²CH³, -CH²CH²CH³, -CH(CH³)², -CH²CH²CH²CH³, -CH(CH³)CH²CH³, -CH²CH(CH³)², -C(CH³)³, -CH=CH², -CH=CHCH=CH², -C=CH y -CH=CHC=CH.

Para el propósito de la descripción, los residuos de hidrocarburo alicíclicos saturados o insaturados C^1-12, incluyen, entre otros C^3-12-cicloalquilo, donde 1 o 2 átomos de carbono en el anillo pueden ser opcionalmente reemplazados por heteroátomos seleccionados de entre N, O y S(C^1-12-heterocicloalquilo).

Para el propósito de la descripción, residuos de hidrocarburos aromáticos C^6-10, (=C^a-10-arilo) incluyen, pero no se limitan a, fenilo y naftilo.

Para el propósito de la descripción, residuos de hidrocarburos heteroaromáticos (= heteroarilo) incluyen, pero no se limitan a, sistemas de anillos monocíclicos, sistemas de anillos bicíclicos y sistemas de anillos tricíclicos. Ejemplos de heteroarilos monocíclicos incluyen, entre otros, azetidinilo, azepanilo, aziridinilo, diazepinilo, 1 ,3-dioxolanilo, dioxanilo, ditianilo, furilo, imidazolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolinilo, isotiazolidinilo, isoxazolilo, isoxazolinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, oxadiazolilo, oxadiazolinilo, oxadiazolidinilo, oxazolilo, oxazolinilo, oxazolidinilo, piperazinilo, piperidinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirrolilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrazinilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, tiadiazolinilo, tiadiazolidinilo, tiazolilo, tiazolinilo, tiazolidinilo, tienilo, tiomorfolinilo, 1, 1 -dioxidotiomorfolinilo (tiomorfolina sulfona), tiopiranilo, triazinilo, triazolilo y tritianilo. Ejemplos de heteroarilos bicíclicos incluyen, entre otros, benzimidazolilo, benzodioxinilo, benzotiazolilo, benzotienilo, benzotriazolilo, benzoxazolilo, benzofuranilo, benzopiranilo, benzotiopiranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolilo, 2, 3-dihidroindolilo, indolizinilo, naftiridinilo, isobenzofuranilo, isobenzotienilo, isoindolilo, isoquinolinilo, ftalazinilo, 4H-pirido(1,2-a)pirimidin-4-ona, piranopiridinilo, quinolinilo, quinolizinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, y tiopiranopiridinilo. Ejemplos de heteroarilos tricíclicos incluyen, entre otros, acridinilo, carbazolilo, carbolinilo, dibenzo(b, d)furanilo, dibenzo(b, d)tienilo, nafto(2,3-b)furano, nafto(2, 3-b)tienilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, tiantrenilo, tioxantenilo y xantenilo.

Para el propósito de la descripción, mono- o polisustituido con respecto a alquilo (por ejemplo, -C^1-12-alquilo), cicloalquilo (por ejemplo, -C^3-8-clonalidad), arilo (por ejemplo, -C^6-10-arilo) y heteroarilo, respectivamente, preferiblemente independientemente significa el reemplazo de un hidrógeno del núcleo por uno o más grupos funcionales seleccionados de entre -halo (preferiblemente -F, -Cl, -Br, -I), -OH, =O, -OC^1-12-alquilo, -OC^6-10-arilo, -O-heteroarilo, -OCOC^1-12-alquilo, -OCOC^6-10-arilo, -OCO-heteroarilo, -SH, -SC^1-12-alquilo, -SC^6-10-arilo, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³, -NH², -NH(C^1-12-alquilo), -N(C^1-12-alquilo)², -NH(C^6-10-arilo), -N(C^6-10-arilo)², -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)², -CN, -CHO, -CO²H,CO-C^1-2-alquilo, -CO-C^6-10-arilo y -CO-heteroarilo.

Para el propósito de la descripción, los residuos de azúcar o desoxisazúcar que comprenden en cada caso mono-, diu oligosacáridos significa que el sustrato de cetona de fórmula general (I) o el cosustrato de amina de fórmula general (III) puede ser un compuesto de polihidroxicarbonilo, opcionalmente unido a otros compuestos polihidroxicarbonílicos mediante acetal y/o enlaces cetales. Por ejemplo, cuando X es C¹alquilo monosustituido con -OH e Y es C²alquilo polisustituido con -OH, donde cada átomo de carbono tiene un sustituyente -OH único, el sustrato de cetona de fórmula general (I) es una cetona que abarca ambos enantiómeros, D-eritrulosa y L-eritrolosa. De manera análoga, el sustrato de cetona de fórmula general (I) puede ser una cetopentosa o una cetohexosa que, a su vez, puede unirse a otros residuos de azúcar formando de esta manera disacáridos u oligosacáridos.

Preferiblemente, la ATA según la invención es capaz de convertir un sustrato de cetona en una amina con una amplia actividad específica para los sustratos donadores de amina seleccionados. Donantes de amina adecuados pueden seleccionarse según su actividad específica en una ración dada. Ejemplos de donantes de amina que se pueden usar con la invención incluyen, sin limitación, isopropilamina (en lo sucesivo también denominada "IPA", también conocida como 2-aminopropano o propan-2-amina), feniletilamina (también conocida como 1 -feniletilamina, y a menudo también incorrectamente referida como metil-bencilamina, en adelante también referida como "MBA"), 1-metil-3-fenilpropilamina (también conocida como 2-amino-4-fenilbutano), glicina, ácido glutámico, glutamato, glutamato de monosodio, D-alanina, L-alanina, ácido aspártico, lisina, ornitina, p-alanina, taurina, n-octilamina, ciclohexilamina, 1,4-butanodiamina, 1,6-hexanodiamina, ácido 6-aminohexanoico, ácido 4-ammobutírico, tiramina y bencil amina, 2-aminobutano, 2-amino-1-butanol, 1-amino-1-feniletano, 1-amino-1-(2-metoxi-5-fluorofenil)etano, 1-amino-1-fenilpropano, 1-amino-1-(4-hidroxifenil)propano, 1-amino-1-(4-bromofenil)propano, 1-amino-1-(4-nitrofenil)propano, 1-fenil-2-aminopropano, 1-(3-trifluorometilfenil)-2-aminopropano (también conocida como norfenfluramina), 2-aminopropanol, 1-amino-1-fenilbutano, 1-fenil-2-aminobutano, 1-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)-2-aminobutano, 1 -fenil-3-aminobutano, 1-(4-hidroxifenil)-3-aminobutano, 1-amino-2-metilciclopentano, 1-amino-3-metilciclopentano, 1-amino-2-metilciclohexano, 1-amino-l-(2-naftil)etano, 3-metilciclopentilamina, 2-metilciclopentilamina, 2-etilciclopentilamina, 2-metilciclohexilamina, 3-metilciclohexilamina, 1-aminotetralina, 2-aminotetralina, 2-amino-5-metoxitetralina y 1-aminoindano, cada ejemplo también incluye su estructura de enantiónmeros e isómeros , según sea el caso y cuando sea posible, e incluyendo todas las posibles sales de los mismos.

Preferiblemente, la ATA según la invención es capaz de convertir una amina en un sustrato de cetona con una amplia actividad específica para los sustratos aceptores de amina seleccionados. Aceptores de amina adecuados pueden seleccionarse según su actividad específica en una ración dada. Ejemplos de aceptores de amina que se pueden usar con la invención incluyen, sin limitación, 1-feniletanona (también conocida como acetofenona, en lo sucesivo denominada "AP"), 4-fenil-2-butanona (también conocida como bencilacetona, denominada en lo sucesivo como "BA"), ácido 2-oxo-acético, ácido 2-oxo-pentanodioico (también conocido como ácido alfa-cetoglutárico), ácido 5-amino-2-oxo-pentanoico, piruvato, ácido 2-cetosuccínico, ácido 6-amino-2-oxo-hexanoico, 6-oxo-norleucina, ácido 5-amino-2-oxopentanoico, 5-oxo-norvalina, ácido 3-oxo-propanoico, ácido 2-oxoetanosulfónico, octanal, ciclohexanona, 4 -aminobutanal, butanodial, 6-amino-hexanal, hexanodial, ácido 6-oxo-hexanoico, ácido 4-oxo-butírico, 4-hidroxibencenoacetaldehído, benzaldehído, 2-butanona, 1-hidroxi-2-butanona, 1-feniletanona, 1-(5-fluoro-2-metoxifenil)-etanona, 1-fenil-1-propanona, 1-(4-hidroxifenil)-1-propanona, 1-fenil-1-propanona, 1-(4-bromofenil)-1-propanona, 1-fenil-1-propanona, 1-(4-Nitrofenil)-1-propanona, 1-fenil-2-propanona, 1-(3-trifluorometilfenil)-2-propanona, 1-hidroxi-2-propanona, 1-fenil-1-butanona, 1-fenil-2-butanona, 1-(2,5-dimetoxi-4-metilfenil)-2-butanona, 1-fenil-3-butanona, 1-(4-hidroxifenil)-3-butanona, 2-metil-ciclopentanona, 3-metilciclopentanona, 2-metilciclohexanona, 1-(2-naftalenil)etanona, 1-metil-3-ciclopentanona, 2-metilciclopentanona, 2-etilciclopentanona, 2-metilciclohexanona, 3-metilciclohexanona, 1,2,3,4-tetra-hidro-1-oxonaftaleno, 1,2,3,4-tetrahidro-2-naftalenona, 2-oxo-5-metoxi-1,2,3,4-tetrahidronaftaleno y 1-indona, incluyendo cada ejemplo su estructura de enantiómeros e isómeros, según sea el caso y cuando sea posible, e incluyendo todas las posibles sales de los mismos.

Preferiblemente, la ATA según la divulgación que convierte un sustrato de cetona en una amina, o viceversa, una amina en un producto de cetona tiene una

- alta termoestabilidad,

- tiene una alta actividad específica

- permite una alta actividad de conversión en diferentes condiciones de reacción que implican altas concentraciones de amina.

Sorprendentemente se encontró que la ATA de SEQ ID NO:3 según la invención muestra una termoestabilidad, actividad específica y conversión superiores bajo ciertas concentraciones de amina en comparación con otras ATA actualmente descritas.

En particular, se ha encontrado sorprendentemente que la ATA según la invención que convierte un sustrato de cetona en una amina, o viceversa, una amina en un producto de cetona ya tiene una alta estabilidad a temperaturas mesófilas o altas, medida como un valor alto de Tm(80 %) como se describe en el Ejemplo 5 a continuación. Preferiblemente, la ATA según la invención tiene un valor de T^m(80 %) de al menos 55 °C, preferiblemente de al menos 56 °C, preferiblemente de al menos 57 °C, preferiblemente de al menos 58 °C, preferiblemente de al menos 59 °C, y lo más preferiblemente de al menos 60 °C.

En particular, además, se ha descubierto sorprendentemente que la ATA según la invención, que convierte un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, ya tiene una alta actividad específica en las Condiciones Estándar de Transaminasa como se describe en el Ejemplo. 2 a continuación. En particular, la ATA según la invención tiene una alta actividad específica para la conversión de 1-feniletan-1-amina (MBA) racémica y piruvato en 1-feniletanona (acetofenona) y L-alanina como se describe a continuación. Preferiblemente, la actividad específica de la ATA según la invención para convertir un sustrato de cetona en una amina, o viceversa, una amina en un producto de cetona en condiciones estándar de transaminasa es de al menos 0,5 U/mg, preferiblemente al menos 0,6 U/mg, preferiblemente al menos 0,7 U/mg, preferiblemente al menos 0,8 U/mg, preferiblemente al menos 0,9 U/mg, preferiblemente al menos 1 U/mg, lo más preferiblemente al menos 1,1 U/mg.

En particular, además, se ha descubierto sorprendentemente que la ATA según la invención que convierte un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona, muestra una alta conversión de un sustrato a ciertas concentraciones de diferentes co-sustratos de donantes de amina de relevancia industrial. En particular, la ATA según la invención muestra altas propiedades de conversión en condiciones de reacción relevantes para aplicaciones de síntesis preparativa con los diferentes donantes de amina, isopropilamina (IPA), 1-feniletan-1-amina racémica (MBA) o alanina racémica, respectivamente con el sustrato 4-fenil-2-butanona (BA) como se describe en el Ejemplo 3. En particular, la ATA según la invención es muy eficiente en la conversión en la Condición A (50 mM BA, 100 mM IPA), la Condición B ( 50 mM BA, 200 mM rac. MbA), la Condición C (50 mM BA, 500 mM IPA), la Condición D (50 mM BA, 1000 mM rac. m Ba ), o la Condición E (50 mM bA, 200 mM alanina racémica).

Preferiblemente, la ATA según la invención al convertir un sustrato de cetona en un producto de amina, o viceversa, un sustrato de amina en un producto de cetona en condiciones de ensayo de conversión de transaminasas muestra una conversión de

- en la Condición A una conversión de al menos 5 %, preferiblemente de al menos 6 %, preferiblemente de al menos 7 %, preferiblemente de al menos 8 %, preferiblemente de al menos 9 %, preferiblemente de al menos 10 %, preferiblemente de al menos 11 %, y lo más preferiblemente de al menos 11,9 %; y/o

- en la Condición B una conversión de al menos 10 %, preferiblemente de al menos 20 %, preferiblemente de al menos 30 %, preferiblemente de al menos 40 %, preferiblemente de al menos 50 %, preferiblemente de al menos 60 %, preferiblemente de al menos 70 %, y lo más preferiblemente de al menos 71 %; y/o

- en la Condición C una conversión de al menos 10 %, preferiblemente de al menos 20 %, preferiblemente de al menos 25 %, y lo más preferiblemente de al menos 25,8 %; y/o

- en la Condición D una conversión de al menos 1 %, preferiblemente de al menos 2 %, preferiblemente de al menos 3 %, preferiblemente de al menos 3,5 %, y lo más preferiblemente de al menos 3,7 %; y/o

- en la Condición E una conversión de al menos 2 %, preferiblemente de al menos 2,5 %, preferiblemente de al menos 3 %, y lo más preferiblemente de al menos 3,2 %.

La ATA según la invención es un derivado de SEQ ID NO:3 obtenible mediante ingeniería de proteínas, es decir, la ATA según la invención se puede considerar preferiblemente como una ATA modificada con respecto al tipo salvaje de SEQ ID NO:3.

Sorprendentemente, se ha descubierto que tras la ingeniería selectiva, las características de una variante de ATA con respecto al uso industrial se pueden mejorar aún más, y que se pueden obtener variantes de ATA que exhiben en comparación con la secuencia de tipo salvaje de SEQ ID NO:3

- una estereoselectividad mejorada, y/o

- una mayor termoestabilidad, y/o

- una mayor conversión.

Por tanto, la ATA según la invención presenta propiedades mejoradas, por ejemplo, termoestabilidad, y/o estereoselectividad tras la ingeniería de SEQ ID NO:3 tal que (A) la estereoselectividad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o (B) la termoestabilidad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3.

Con respecto a SEQ ID NO:3 la ATA según la invención está diseñada en al menos una o más posiciones de modo que

(A) la estereoselectividad de la ATA diseñada es mayor que la de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3, en particular de modo que la estereoselectividad medida como un exceso enantionmérico ( %ee) es al menos 50 %ee, preferiblemente al menos 60 %ee, más preferiblemente al menos 65 %ee, más preferiblemente al menos 70 %ee, aún más preferiblemente al menos 75 %ee, aún más preferiblemente al menos 80 %ee, aún más preferiblemente al menos 85 %ee, aún más preferiblemente al menos 90 %ee, aún más preferiblemente al menos 91 %ee, aún más preferiblemente al menos 92 %ee, aún más preferiblemente al menos 93 %ee, aún más preferiblemente al menos 94 %ee, aún más preferiblemente al menos 95 %ee, aún más preferiblemente al menos 96 %ee, incluso más preferiblemente al menos 97 %ee, lo más preferiblemente al menos 98 %ee, y en particular al menos 99 %ee, y en particular al menos 99.9 %ee; y/o

(B) la termoestabilidad de la ATA diseñada es mayor que la de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3, en particular de modo que la ATA sea estable al menos a 65 °C, más preferiblemente al menos a 70 °C, aún más preferiblemente al menos a 75 °C, aún más preferiblemente al menos a 76 °C, aún más preferiblemente al menos a 77 °C, aún más preferiblemente al menos a 78 °C, aún más preferiblemente al menos a 79 °C, aún más preferiblemente al menos a 80 °C, aún más preferiblemente al menos a 81 °C, aún más preferiblemente al menos a 82 °C, aún más preferiblemente al menos a 83 °C, aún más preferiblemente al menos a 84 °C y lo más preferiblemente al menos a 85 °C.

Con respecto a SEQ ID NO:3 la ATA según la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones de modo que

(C) la conversión de la ATA diseñada es mayor que la de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3., en particular, de modo que la tasa de conversión

en la Condición G es al menos 5,0 %, preferiblemente al menos 5,1 %, por lo menos 5,2 %, por lo menos 5,3 %, por lo menos 5,4 %, por lo menos 5,5 %, por lo menos 5,6 %, por lo menos 5,7 %, por lo menos 5,8 %, por lo menos 5,9 %, por lo menos 6 %, por lo menos 7 %, por lo menos 8 %, por lo menos 9 %, por lo menos 10 %, por lo menos 11 %, por lo menos 12 %, o por lo menos 13 %, más preferiblemente por lo menos 14 %, y lo más preferiblemente por lo menos 15 %; y/o

en la condición H es al menos 34 %, preferiblemente al menos 35 %, preferiblemente al menos 36 %, preferiblemente al menos 37 %, preferiblemente al menos 38 %, preferiblemente al menos 39 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 41 %, preferiblemente al menos 42 %, preferiblemente al menos 43 %, preferiblemente al menos 44 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 46 %, preferiblemente al menos 47 %, preferiblemente al menos 48 %, preferiblemente al menos 49 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 51 %, preferiblemente al menos 52 %, preferiblemente al menos 53 %, preferiblemente al menos 54 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 66 %, preferiblemente al menos 67 %, preferiblemente al menos 58 %, preferiblemente al menos 59 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 61 %, preferiblemente al menos 62 %, preferiblemente al menos 63 %, preferiblemente al menos 64 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 66 %, preferiblemente al menos 67 %, preferiblemente al menos 68 %, preferiblemente al menos 69 %, más preferiblemente al menos 70 %, más preferiblemente al menos 80 %, más preferiblemente al menos 90 %, más preferiblemente al menos 95 %, más preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 %; y lo más preferiblemente al menos 99,9 %; y/o.

en la condición I es al menos 30 %, preferiblemente al menos 35 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 46 %, preferiblemente al menos 47 %, preferiblemente al menos 48 %, preferiblemente al menos 49 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 51 %, preferiblemente al menos 52 %, preferiblemente al menos 53 %, preferiblemente al menos 54 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 56 %, preferiblemente al menos 57 %, preferiblemente al menos 58 %, preferiblemente al menos 59 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 61 %, preferiblemente al menos 62 %, preferiblemente al menos 63 %, preferiblemente al menos 64 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 66 %, preferiblemente al menos 67 %, preferiblemente al menos 68 %, preferiblemente al menos 69 %, preferiblemente al menos 70 %, preferiblemente al menos 71 %, preferiblemente al menos 72 %, preferiblemente al menos 73 %, preferiblemente al menos 74 %, preferiblemente al menos 75 %, preferiblemente al menos 76 %, preferiblemente al menos 77 %, preferiblemente al menos 78 %, preferiblemente al menos 79 %, preferiblemente al menos 80 % preferiblemente al menos 81 %, preferiblemente al menos 82 %, preferiblemente al menos 83 %, preferiblemente al menos 84 %, preferiblemente al menos 85 %, preferiblemente al menos 86 %, preferiblemente al menos 87 %, preferiblemente al menos 88 %, preferiblemente al menos 89 %, preferiblemente al menos 90 % preferiblemente al menos 91 %, preferiblemente al menos 92 %, preferiblemente al menos 93 %, preferiblemente al menos 94 %, preferiblemente al menos 95 %, preferiblemente al menos 96 %, preferiblemente al menos 97 %, preferiblemente al menos 98 %, preferiblemente al menos 99 %, y lo más preferiblemente al menos 99,9 %; y/o en la condición J es al menos 30 %, preferiblemente al menos 35 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, preferiblemente al menos 76 %, preferiblemente al menos 77 %, preferiblemente al menos 78 %, preferiblemente al menos 79 %, preferiblemente al menos 80 % preferiblemente al menos 81 %, preferiblemente al menos 82 %, preferiblemente al menos 83 %, preferiblemente al menos 84 %, preferiblemente al menos 85 %, preferiblemente al menos 86 %, preferiblemente al menos 87 %, preferiblemente al menos 88 %, preferiblemente al menos 89 %, preferiblemente al menos 90 % preferiblemente al menos 91 %, preferiblemente al menos 92 %, preferiblemente al menos 93 %, preferiblemente al menos 94 %, preferiblemente al menos 95 %, preferiblemente al menos 96 %, preferiblemente al menos 97 %, preferiblemente al menos 98 %, preferiblemente al menos 99 %, y lo más preferiblemente al menos 99,9 %.

Para el propósito de la memoria descriptiva, la estereoselectividad es la propiedad de una reacción química en la que un solo reactivo forma una mezcla desigual de estereoisómeros durante la creación no estereoespecífica de un nuevo estereocentro o durante la transformación no estereoespecífica de uno preexistente. La selectividad surge típicamente de diferencias en los efectos estéricos y electrónicos en las vías mecánicas que conducen a los diferentes productos. El exceso enantiomérico (ee) de un producto quiral sobre el otro producto obtenido de una reacción enzimática es una medida de la estereoselectividad de la enzima, en particular de la ATA según la invención:

[producto(qulralldad 1)] -[producto(qulralidad2)]

%ee --------------------------------------------------------- .

[producto(quiralldad 1)] [producto(quiralidad2)]

El exceso enantiomérico (expresado en porcentaje) se calcula como la diferencia entre la cantidad de dos productos con diferente quiralidad (producto(quiralidad 1), producto(quiralidad2)) expresada como valor absoluto dividida por la suma de la concentración de ambos productos, multiplicado por 100. Preferiblemente, la conversión de un sustrato en un producto quiral bajo catálisis de la ATA según la invención proporciona el producto quiral deseado con un exceso enantiomérico de al menos 50 %ee, más preferiblemente al menos 60 %ee, más preferiblemente al menos 65 %ee, más preferiblemente al menos 70 %ee, más preferiblemente al menos 75 %ee, aún más preferiblemente al menos 80 %ee, aún más preferiblemente al menos 85 %ee, aún más preferiblemente al menos 90 %ee, aún más preferiblemente al menos 91 %ee, aún más preferiblemente al menos 92 %ee, aún más preferiblemente al menos 93 %ee, aún más preferiblemente al menos 94 %ee, aún más preferiblemente al menos 95 %ee, aún más preferiblemente al menos 96 %ee, incluso más preferiblemente al menos 97 %ee, lo más preferiblemente al menos 98 %ee, y en particular al menos 99 %ee, y en particular al menos 99,9 %ee.

Una estereoselectividad mejorada según la invención se refiere a un exceso enantiomérico del producto proporcionado por medio de una ATA modificada que es mayor que el exceso enantiomérico del producto proporcionado por medio de la ATA no modificada de SEQ ID NO:3. El exceso enantiomérico proporcionado por una ATA modificada en comparación con la ATA no modificada de SEQ ID NO:3 para un sustrato dado y en realizaciones preferidas se incrementa en por lo menos 0,1 %ee, por lo menos 0,5 %ee, por lo menos 1 %ee, por lo menos 3 %ee, por lo menos 5 %ee, por lo menos 7 %ee, por lo menos 9 %ee, por lo menos 11 %ee, por lo menos 13 %ee, por lo menos 15 %ee, por lo menos 17 %ee, por lo menos 19 %ee, por lo menos 21 %ee, por lo menos 23 %ee, por lo menos 25 %ee, por lo menos 27 %ee, por lo menos 29 %ee, por lo menos 31 %ee, por lo menos 32 %ee, por lo menos 33 %ee, por lo menos 34 %ee, por lo menos 35 %ee, por lo menos 36 %ee, al menos al menos 37 %ee, por lo menos 38 %ee, por lo menos 39 %ee, por lo menos 40 %ee, por lo menos 41 %ee, por lo menos 42 %ee, por lo menos 43 %ee, por lo menos 44 %ee, por lo menos 45 %ee, por lo menos 46 %ee, por lo menos 47 %ee, por lo menos 48 %ee, por lo menos 49 %ee, por lo menos 50 %ee, por lo menos 55 %ee, o al menos 60 %ee, por lo menos 65 %ee, por lo menos 70 %ee, por lo menos 75 %ee, por lo menos 80 %ee, por lo menos 85 %ee, por lo menos 90 %ee, por lo menos 95 %ee, por lo menos 97 %ee, por lo menos 98 %ee, por lo menos 99 %ee, o al menos 99,5 %ee y en particular al menos 99,9 %ee en comparación con la ATA no diseñada de SEQ ID NO:3 para un sustrato dado. La estereoselectividad mejorada también puede significar que la ATA diseñada tiene una cierta estereoselectividad hacia el producto quiral deseado, mientras que la ATA no modificada no tiene estereoselectividad significativa hacia dicho producto quiral. La estereoselectividad mejorada también puede significar que la ATA diseñada tiene una cierta estereoselectividad hacia un producto quiral deseado, mientras que la ATA no diseñada tiene una estereoselectividad hacia el producto quiral inverso, por ejemplo, la ATA diseñada tiene una estereoselectividad para construir una (R)-amina. mientras que la ATA sin ingeniería tiene una estereoselectividad para la (S)-amina y viceversa.

A los efectos de la memoria descriptiva, la termoestabilidad es la propiedad de una enzima de retener la actividad enzimática tras la incubación a altas temperaturas durante un tiempo determinado. Por tanto, la actividad enzimática se puede determinar en cualquier condición de ensayo. Para el propósito de esta invención, la termoestabilidad se expresa como Tm(80 %) valor, que indica la temperatura a la que una enzima retiene el 80 % de su actividad enzimática inicial tras la incubación en un sistema tampón dado durante 15 minutos a dicha temperatura.

La termoestabilidad de una ATA según la invención, preferiblemente la termoestabilidad de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 o una ATA modificada según esta invención, se determina preferiblemente mediante la incubación del extracto crudo que contiene ATA durante 15 minutos a varias temperaturas dadas en un ciclador de PCR. Una muestra de cada extracto crudo de ATA se incuba durante 15 minutos en hielo como referencia. Posteriormente, todos los extractos crudos se incuban en hielo durante 30 minutos. Las proteínas insolubles se separan por centrifugación y el sobrenadante se analiza con respecto a su actividad ATA restante en el Ensayo estándar de transaminasas como se describe en el Ejemplo 2, monitoreando la conversión de 1-feniletan-1-amina (MBA) y piruvato en 1-feniletanona (acetofenona) y L-alanina.

Una termoestabilidad mejorada según la invención se refiere a una mayor Tm(80 %) valor de una ATA diseñada en comparación con la ATA no diseñada de SEQ ID NO:3. Preferiblemente, el valor de Tm(80 %) aumenta en al menos 1 °C, al menos 2 °C, al menos 3 °C, al menos 4 °C, al menos 5 °C, al menos 6 °C, al menos 7 °C, al menos 8 °C, al menos 9 °C, al menos 10 °C, al menos 11 °C, al menos 12 °C, al menos 13 °C, al menos 14 °C, al menos 15 °C, al menos 16 °C, al menos 17 °C, al menos 18 °C, al menos 19 °C, al menos 20 °C, al menos 21 °C, al menos 22 °C, al menos 23 °C, al menos 24 °C, al menos 25 °C, y más preferiblemente al menos 30 °C en comparación con la ATA no diseñada de SEQ ID NO:3.

Para el propósito de la memoria descriptiva, la conversión de una enzima según esta invención es el rendimiento de un producto dado después de un tiempo dado en una reacción que involucra la enzima. Para el propósito de esta invención, la tasa de conversión se expresa como X % de conversión después de un tiempo dado usando 4-fenil-2-butanona como sustrato junto con isopropilamina (IPA) o (S)-1-feniletan-1-amina (S-MBA) como donante de amina para el producto correspondiente 1-metil-3 -fenilpropilamina y acetona o 1-feniletanona (acetofenona) en una condición respectiva. Si bien la conversión de una ATA dada según esta invención puede desviarse dependiendo de los diferentes sustratos utilizados, la conversión mejorada de una ATA diseñada según esta invención se puede determinar en cualquiera de las condiciones del ensayo de conversión de transaminasas Condición G (150 mM BA, 300 mM IPA ), Condición H (150 mM BA, 300 mM (S)-MBA), Condición I (150 mM BA, 1000 mM IPA) y/o Condición J (50 mM BA, 1000 mM IPA) como se describe en el Ejemplo 6 a continuación.

Una conversión mejorada según la divulgación se relaciona con una conversión de una ATA diseñada que es mayor que la conversión de la ATA no diseñada de SEQ ID NO:3 bajo una Condición respectiva. Preferiblemente, la conversión es

bajo la Condición G: por lo menos 0,1 %, preferiblemente al menos 0,2 %, a 0,3 %, por lo menos 0,4 %, por lo menos 0,5 %, por lo menos 1 %, por lo menos 1,5 %, por lo menos 2 %, por lo menos 2,5 %, por lo menos 3 %, más preferiblemente al menos 3,5 %, más preferiblemente al menos 4 %, más preferiblemente al menos 4,5 %, más preferiblemente al menos 5 %, más preferiblemente al menos 6 %, más preferiblemente al menos 7 %, más preferiblemente al menos 8 %, más preferiblemente al menos 9 %, más preferiblemente al menos 10 %, y lo más preferiblemente al menos un 20 % más alto que la conversión de la ATA no modificada de SEQ ID NO:3, y/o

bajo la Condición H: al menos 0,1 %, preferiblemente al menos 0,2 %, al menos 0,3 %, al menos 0,4 %, al menos 0,5 %, al menos 1 %, al menos 1,5 %, al menos 2,5 %, al menos 5 %, al menos 7,5 %, más preferiblemente al menos 10 %, más preferiblemente al menos 12,5 %, más preferiblemente al menos 15 %, más preferiblemente al menos 17,5 %, más preferiblemente al menos 20 %, más preferiblemente al menos 22,5 %, más preferiblemente al menos 25 %, más preferiblemente al menos 27,5 %, más preferiblemente al menos 30 %, y más preferiblemente al menos 40 % más alto que la conversión de la ATA no modificada de SEQ ID NO:3; y/o

bajo la Condición I: es al menos 30 %, preferiblemente al menos 35 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 46 %, preferiblemente al menos 47 %, preferiblemente al menos 48 %, preferiblemente al menos 49 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 51 %, preferiblemente al menos 52 %, preferiblemente al menos 53 %, preferiblemente al menos 54 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 56 %, preferiblemente al menos 57 %, preferiblemente al menos 58 %, preferiblemente al menos 59 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 61 %, preferiblemente al menos 62 %, preferiblemente al menos 63 %, preferiblemente al menos 64 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 66 %, preferiblemente al menos 67 %, preferiblemente al menos 68 %, preferiblemente al menos 69 %, preferiblemente al menos 70 %, preferiblemente al menos 71 %, preferiblemente al menos 72 %, preferiblemente al menos 73 %, preferiblemente al menos 74 %, preferiblemente al menos 75 %, preferiblemente al menos 76 %, preferiblemente al menos 77 %, preferiblemente al menos 78 %, preferiblemente al menos 79 %, preferiblemente al menos 80 % preferiblemente al menos 81 %, preferiblemente al menos 82 %, preferiblemente al menos 83 %, preferiblemente al menos 84 %, preferiblemente al menos 85 %, preferiblemente al menos 86 %, preferiblemente al menos 87 %, preferiblemente al menos 88 %, preferiblemente al menos 89 %, preferiblemente al menos 90 % preferiblemente al menos 91 %, preferiblemente al menos 92 %, preferiblemente al menos 93 %, preferiblemente al menos 94 %, preferiblemente al menos 95 %, preferiblemente al menos 96 %, preferiblemente al menos 97 %, preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 %, más alto que la conversión de la ATA no modificada de SEQ ID NO:3; y/o

bajo la Condición J: es al menos 30 %, preferiblemente al menos 35 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, preferiblemente al menos 76 %, preferiblemente al menos 77 %, preferiblemente al menos 78 %, preferiblemente al menos 79 %, preferiblemente al menos 80 % preferiblemente al menos 81 %, preferiblemente al menos 82 %, preferiblemente al menos 83 %, preferiblemente al menos 84 %, preferiblemente al menos 85 %, preferiblemente al menos 86 %, preferiblemente al menos 87 %, preferiblemente al menos 88 %, preferiblemente al menos 89 %, preferiblemente al menos 90 % preferiblemente al menos 91 %, preferiblemente al menos 92 %, preferiblemente al menos 93 %, preferiblemente al menos 94 %, preferiblemente al menos 95 %, preferiblemente al menos 96 %, preferiblemente al menos 97 %, preferiblemente al menos 98 %, más preferiblemente al menos 99 % más alto que la conversión de la ATA no modificada de SEQ ID NO:3.

A los efectos de la memoria descriptiva, "ATA diseñada" se refiere a una ATA que difiere de la secuencia de tipo salvaje especificada, por ejemplo, la ATA no diseñada de SEQ ID NO:3. La ingeniería puede significar la sustitución de un residuo de aminoácido de la secuencia de tipo salvaje especificada por otro residuo de aminoácido. Además, la ingeniería también puede significar la eliminación de un residuo de aminoácido de la secuencia de tipo salvaje especificada, o la inserción de un residuo de aminoácido en la secuencia de tipo salvaje especificada, o la sustitución de un residuo de aminoácido de la secuencia de tipo salvaje especificada por más de otro simple residuo de aminoácidos.

La ATA diseñada según la divulgación difiere de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 por 1 a 70 aminoácidos, típicamente por 1 a 50 aminoácidos, más típicamente por 1 a 30 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 25 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 20 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 15 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 10 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 5 aminoácidos y más típicamente de 1 a 4 aminoácidos.

En este sentido, ingeniería significa que uno o más aminoácidos en una posición dada se sustituyen por cualquier otro aminoácido proteinogénico seleccionado de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Tyr y Val. En una realización preferida de la invención, la sustitución no altera la longitud de la secuencia, es decir, un único residuo de aminoácido se reemplaza por otro único residuo de aminoácido. Sin embargo, también es posible eliminar uno o más residuos de aminoácidos sin reemplazo y/o para insertar uno o más residuos de aminoácidos.

En una realización específica, la ATA diseñada según la invención es un fragmento de al menos 380 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 400 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 420 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 425 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 430 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 435 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 440 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 445 residuos de aminoácidos y lo más preferentemente al menos 446 residuos de aminoácidos del polipéptido de la SEQ. ID NO:3. En este sentido, "fragmento" se refiere a una subsecuencia consecutiva de la respectiva SEQ ID NO:3, pero eso se abrevia en el extremo N y/o el extremo C.

En principio, una sustitución en cualquier posición de una enzima puede ser una sustitución conservadora en la que dicho aminoácido se sustituye por un aminoácido de características comparables (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo por otro aminoácido hidrófobo). Además, una sustitución en cualquier posición de una enzima puede ser una sustitución no conservadora en la que dicho aminoácido se sustituye por un aminoácido de otras características (por ejemplo, sustitución de un aminoácido hidrófobo por un aminoácido hidrófilo).

La técnica de la ingeniería enzimática es revisada en: S. Lutz, U. T. Bornscheuer, Protein Engineering Handbook, Wiley VCH, Weinheim, 2009.

Cualquier sustitución según esta invención excluye las sustituciones de aminoácidos en las posiciones de la ATA según la invención, que son indispensables para la actividad catalítica de la ATA, preferiblemente la posición K284 de SEQ ID NO:3. Además, es conocido en el estado de la técnica, que las posiciones de secuencia que participan en elementos de estructura de proteínas predecibles, por ejemplo, hélices alfa o láminas beta, o interacciones iónicas, son sensibles a la mutagénesis y pueden no requerir ninguna sustitución o solo una sustitución concomitante con una contra-posición.

La ATA diseñada según la divulgación difiere de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 por 1 a 70 aminoácidos, típicamente por 1 a 50 aminoácidos, más típicamente por 1 a 30 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 25 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 20 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 15 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 10 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 5 aminoácidos, y más típicamente de 1 a 4 aminoácidos y además es una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos con cualquier otro aminoácido, oligo- o polipéptido, que se fusiona con el extremo N y/o el extremo C.

En una realización preferida de la invención, la ATA diseñada según la divulgación es una proteína de fusión que comprende la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 que difiere de 1 a 70 aminoácidos, típicamente de 1 a 50 aminoácidos, más típicamente de 1 a 30 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 25 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 20 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 15 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 10 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 5 aminoácidos, y más típicamente de 1 a 4 aminoácidos, y además, al menos 1 residuo de aminoácido, al menos 2 aminoácidos residuos de ácido, al menos 4 residuos de aminoácidos, al menos 6 residuos de aminoácidos, al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 20 residuos de aminoácidos, incluso más preferentemente al menos 30 residuos de aminoácidos y lo más preferentemente al menos 40 residuos de aminoácidos residuos ácidos, seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Tyr y Val.

La transaminasa según la invención comprende al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N161A, N161M,, N161Q, N161I, Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, Y164I y G51S

La transaminasa según la invención comprende una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N161A, N161M, N161Q y N1611 y se caracteriza porque (A) la estereoselectividad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o (B) la termoestabilidad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3

Se describen las transaminasas que comprenden una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en Y164A, Y164C, Y164D, Y164E, Y164F, Y164G, Y164H, Y164I, Y164K, Y164L, Y164M, Y164N, Y164P, Y164Q, Y164R, Y164S, Y164T, Y164V Y164W; más preferiblemente seleccionada de entre el grupo que consiste en Y164L, Y164M, Y164A, Y164F e Y164I.

Preferiblemente, la transaminasa según la invención comprende una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en G51A, G51C, G51D, G51E, G51F, G51H, G51I, G51K, G51L, G51M, G51N, G51P, G51Q, G51R, G51S, 5 IT, G51V, G51W y G51Y; más preferiblemente G51S.

La divulgación también se refiere a ATA modificadas genéticamente que difieren de la secuencia de aminoácidos de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 de 1 a 70 cambios de residuo, preferiblemente de 1 a 50 cambios de residuo, más preferiblemente de 1 a 30 cambios de residuo, incluso más preferiblemente de 1 a 25 cambios de residuo, incluso más preferiblemente de 1 a 20 cambios de residuo, incluso más preferiblemente de 1 a 15 cambios de residuo, incluso más preferiblemente de 1 a 10 cambios de residuo, incluso más preferiblemente de 1 a 5 cambios de residuo y más preferiblemente de 1 a 4 cambios de residuo, preferiblemente incluyendo cambios en una o más de las siguientes posiciones de SEQ ID NO:3: N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433.

La ATA diseñada según la divulgación difiere de la secuencia de aminoácidos de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 de 1 a 70, más preferiblemente de 1 a 50, aún más preferiblemente de 1 a 30, incluso más preferiblemente de 1 a 25, incluso más preferiblemente de 1 a 20, incluso más preferiblemente de 1 a 15, incluso más preferiblemente de 1 a 10 cambios de residuo, incluso más preferiblemente de 1 a 5 cambios de residuo y más preferiblemente de 1 a 4 cambios de residuo, preferiblemente incluyendo uno o más de los siguientes cambios de residuo: N7L, E9R, M16F, M16C, M16V, M16L, M16A, M16W, V29L, V29I, G33Y, Q44R, Q44N, Q44H, R45K, G51S, L53F, L53W, L53V, L53A, L53S, L53G, W54A, W54I, W54L, W54Y, W54S, W54C, W54F, W54V, A67N, A68P, A71G, L73M, F82V, F82A, F82G, F82L, F82Y, H87T H87N, V109I, G114S, R140K, N146Y, N146D, N146S, G147S, Y148F, Y148S, Y148G, V151A, V151W, V151I, V151F, V151Y, V151S, N161A, N161F, N161M, N161Y, N161Q, N161I, Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, Y164I, H165R, E222S, E222A, E222D, A227Y, A227V, A227I, A227G, A227F, A227M, G228A, G228I, V230A, V230G, V230I, V230L, V257A, V258I, V258A, A288G, Q300E, A349G, A353R, Q354F, Y366H, Y366F, M378L, M378V, M378I, M378F, M378Y, M378T, M378A, M378C, Q391K, Q391E, R415A, R415V, R415L, R415G, R415Y, R415T, R415C, I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y, I417A, K420H, K420S, K420N, I422V, I422S, I422A, I422L, T430N, y E433D.

La ATA según la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433.

La ATA según la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO: 3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, G33, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433.

La ATA según la invención podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO: 3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, G33, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, T430, y E433.

La ATA según la divulgación está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones de modo que comprenda al menos una o más sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en

- en la posición N7 sustitución por N7L; y/o

- en la posición E9 sustitución por E9R; y/o

- en la posición M16, sustitución por M16F, M16C, M16V, M16L, M16A o M16W; preferiblemente M16C, M16W o M16F; y/o

- en la posición V29 sustitución por V29L o V29I; preferiblemente V29L; y/o

- en la posición G33 sustitución por G33Y; y/o

- en la posición Q44, sustitución de Q44R, Q44N o Q44H; preferiblemente Q44R o Q44N; y/o

- en la posición R45 sustitución por R45K; y/o

- en la posición G51 sustitución por G51S; y/o

- en la posición L53 sustitución por L53F, L53W, L53V, L53A, L53S o L53G; y/o

- en la posición W54 sustitución por W54A, W54I, W54L, W54Y, W54S, W54C, W54F o W54V; preferiblemente W54I, W54L, W54Y o W54A; y/o

- en la posición A67 sustitución por A67N; y/o

- en la posición A68 sustitución por A68P; y/o

- en la posición A71 sustitución por A71G; y/o

- en la posición L73 sustitución por L73M; y/o

- en la posición F82, sustitución por F82V, F82A, F82G, F82L o F82Y; y/o

- en la posición H87 sustitución por H87T o H87N; y/o

- en la posición V109 sustitución por V109I; y/o

- en la posición G114 sustitución por G114S; y/o

- en la posición R140 sustitución por R140K; y/o

- en la posición N146 sustitución por N146Y, N146D o N146S; preferiblemente, N146Y y/o

- en la posición G147 sustitución por G147S; y/o

- en la posición Y148 sustitución por Y148F, Y148S o Y148G; y/o

- en la posición V151 sustitución por V151A, V151W, V151I, V151F, V151Y o V151S; y/o

- en la posición N161 sustitución por N161A, N161F, N161M, N161Y, N161Q o N161I; preferiblemente N161M, N161Q, N161I, N161A o N161F; y/o

- en la posición Y164, sustitución por Y164L, Y164M, Y164A, Y164F o Y164I; preferiblemente Y164L, Y164F, Y164M o Y164I; y/o

- en la posición H165 sustitución por H165R; y/o

- en la posición E222 sustitución por E222S, E222A o E222D; y/o

- en la posición A227 sustitución por A227Y, A227V, A227I, A227G, A227F o A227M; preferiblemente A227Y; y/o - en la posición G228 sustitución por G228A o G228I; preferiblemente G228A; y/o

- en la posición V230, sustitución de V230A, V230G, V230I o V230L; preferiblemente V230A; y/o

- en la posición V257 sustitución por V257A; y/o

- en la posición V258 sustitución por V258A o V258I; preferiblemente V258I; y/o

- en la posición A288 sustitución por A288G; y/o

- en la posición Q300 sustitución por Q300E; y/o

- en la posición A349 sustitución por A349G; y/o

- en la posición A353 sustitución por A353R; y/o

- en la posición Q354 sustitución por Q354F; y/o

- en la posición Y366 sustitución por Y366H o Y366F; y/o

- en la posición M378 sustitución por M378L, M378V, M378I, M378F, M378Y, M378T, M378A o M378C; y/o - en la posición Q391 sustitución por Q391K o Q391E; y/o

- en la posición R415 sustitución por R415A, R415V, R415L, R415G, R415Y, R415T o R415C; preferiblemente R415A, R415V o R415L; y/o

- en la posición I417, sustitución por I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y o I417A; preferiblemente I417V, I417T, I417C, I417A o I417F; y/o

- en la posición K420 sustitución por K420H, K420S o K420N; y/o

- en la posición 1422 sustitución por I422V, I422S, I422A, I422L o I422C; preferiblemente I422S, I422C, o I422V; más preferiblemente I422S o I422C;

- en la posición T430 sustitución por T430N; y/o

- en la posición E433 sustitución por E433D.

La ATA según la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO:3 en

(I) al menos una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140 , N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422 , T430 y E433; y

(II) además en al menos otra posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433.

La ATA según la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO: 3 en

(I) al menos una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en M16, L53, W54, F82, N146, Y148, Y151, N161, Y164, E222, A227, G228, V230, V257, V258, M378, R415, 1417 y 1422; y

(I) al menos una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en M16, W54, N146, N161, Y164, A227, G228, V230, V258, R415, 1417, y 1422; y

(II) al menos una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, G33, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433.

(I) al menos una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en M16, W54, N146, N161, Y164, A227, G228, V230, V258, R415, y 1417; y

(II) además en al menos otra posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, G33, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, T430, y E433.

La ATA según la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones seleccionadas de entre el grupo formado por

- N161 así como Y164;

- 1417 así como 1422; y

- N146 así como N161.

Preferiblemente, la ATA según la invención está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda

(i) en la posición N161 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N161A, N161M, N161Q o N1611; así como

en la posición Y164 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en Y164L, Y164M, Y164A, Y164F o Y164I; preferiblemente Y164L, Y164M, Y164F o Y164I.

y se caracterizan porque (A) la estereoselectividad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o

(B) la termoestabilidad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3.

Además, la ATA según la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda

(ii) en la posición 1417 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y o I417A; preferiblemente I417T, I417C, I417F, I417V o I417A; más preferiblemente I417V, I417F o I417A; así como en la posición 1422 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en I422V, I422S, I422A, I422L o I422C; preferiblemente I422S, I422C o I422V; más preferiblemente I422S o I422C; y/o

(iii) en la posición N146 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N146Y, N146D o N146S; preferiblemente N146Y; así como

en la posición N161 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N161A, N161F, N161M, N161Y, N161I o N161Q; preferiblemente N161A, N161F, N161M, N161Q o N161I; más preferiblemente N161M, N161Q o N1611; y lo más preferiblemente N161Q.

Preferiblemente, la ATA según la invención está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las sustituciones N161M así como Y164L; N161I así como Y164L; N161Q y Y164L; N161I así como Y164M; N161M y Y164M; N161Q y Y164M; N161I así como Y164F; N161M así como Y164I; y N146Y así como N161Q.

Además, la ATA según la invención podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en 1417V así como I422S; 1417V así como I422C; I417A así como I422S; I417F y 1422V; I417A y I422C.

Más preferiblemente, la ATA según la invención está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las sustituciones N161I así como Y164L; N161M así como Y164I; N161Q y Y164L.

Además, la ATA según la invención podría diseñarse comparado con la SEQ ID NO: 3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en I417V así como I422S; I417V así como I422C; I417A así como I422S; e I417A así como I422C.

Aún más preferiblemente, la ATA según la invención está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda al menos las dos sustituciones N1611 así como Y164L.

(i) al menos dos posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N161 así como Y164; o I417 así como 1422; o N146 así como N161; y

(ii) además en al menos otra posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, G33, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433.

(i) al menos dos posiciones de manera que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N146Y así como N161Q; N161M y Y164L; N161I así como Y164L; N161Q y Y164L; N161I así como Y164M; N161M y Y164M; N161Q y Y164M; N161I así como Y164F; N161M así como Y164I; I417V así como I422S; I417V así como I422C; I417A así como I422S; I417F así como I422V; e I417A así como I422C; preferiblemente N146Y así como N161Q; N161I así como Y164L; N161M así como Y164I; y N161Q así como Y164L; I417V así como I422S; I417V así como I422C; I417A así como I422S; I417A así como I422C; y

(ii) además en al menos otra posición tal que comprenda al menos otra sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en

-N7L;

- E9R;

- M16F, M16C, M16V, M16L, M16A, o M16W; preferiblemente M16C, M16W, o M16F

- V29L o V29I; preferiblemente V29L;

- G33Y;

- Q44R, Q44N o Q44H; preferiblemente Q44R o Q44N;

- R45K;

- G51S;

- L53F, L53W, L53V, L53A, L53S, o L53G;

- W54A, W54I, W54L, W54Y, W54S, W54C, W54F, o W54V; preferiblemente W54I, W54L, W54Y, o W54A;

- A67N;

- A68P;

- A71G;

- L73M;

- F82V, F82A, F82G, F82L, o F82Y;

- H87T o H87N;

- V109I;

- G114S;

- R140K;

- N146Y, N146D o N146S;

- G147S;

- Y148F, Y148S oY148G;

- V151A, V151W, V151I, V151F, V151Y, o V151S;

- N161A, N161F, N161M, N161Y, N161Q o N161I; preferiblemente N161M, N161Q, N161I, N161A o N161F, más preferiblemente N161I, N161M o N161Q;

- Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, o Y164I; preferiblemente Y164L, Y164F, Y164M o Y164I;

- H165R;

- E222S, E222A o E222D;

- A227V, A227I, A227G, A227F, A227Y, o A227M; preferiblemente A227Y

- G228A o G228I; preferiblemente G228A;

- V230G, V230A, V230I, o V230L; preferiblemente V230A;

- V257A;

- V258A o V258I; preferiblemente V258I;

- A288G;

- Q300E;

- A349G;

-A353R;

- Q354F;

- Y366H o Y366F;

- M378L, M378V, M378I, M378F, M378Y, M378T, M378A, o M378C;

- Q391K o Q391E;

- R415A, R415V, R415L, R415G, R415Y, R415T, o R415C; preferiblemente R415A, R415V, o R415L;

- I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y, o I417A; preferiblemente I417V, I417T, I417C, I417A, o I417F;

- K420H, K420S o K420N;

- I422V, I422S, I422A, I422L o I422C; preferiblemente I422S, I422C, o I422V; más preferiblemente I422S o I422C; - T430N; y/o

- E433D.

Preferiblemente, la ATA según la invención está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos en tres posiciones de modo que comprenda al menos tres sustituciones, donde

(i) la primera sustitución de dichas al menos tres sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en N161I, N161M y N161Q; preferiblemente N161I; y

(ii) la segunda sustitución de dichas al menos tres sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en Y164L e Y164I; y

(iii) la tercera sustitución de dichas al menos tres sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en N7L, E9R, M16F, M16W, V29L, V29I, G33Y, Q44R, Q44N, Q44H, R45K, G51S, W54A, A67N, A68P, A71G, L73M, H87T, H87N, V109I, G114S, R140K, G147S, H165R, V230A, A288G, Q300E, A349G, A353R, Q354F, Y366H, Y366F, Q391K, Q391E, K420H, K420S, K420N, T430N, yE433D.

Preferiblemente, la ATA según la invención se diseña comparada con SEQ ID NO: 3 en al menos cuatro posiciones de manera que comprenda al menos cuatro sustituciones, donde

(i) la primera sustitución de dichas al menos cuatro sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en N161I, N161M y N161Q; y

(ii) la segunda sustitución de dichas al menos cuatro sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en Y164L e Y164I; y

(iii) la tercera sustitución de dichas al menos cuatro sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en M16F, M16C, M16V, M16L, M16A o M16W; preferiblemente M16W o M16F; y

(iv) la cuarta sustitución de dichas al menos cuatro sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en V230G, V230A, V230I o V230L; preferiblemente V230A.

Se divulgan por ingeniería ATA en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una, dos, tres o cuatro posiciones y se selecciona de entre el grupo de las siguientes secuencias diseñadas:

16, 17, 18, , 47, 48, 49, 78, 79, 80,

, 107, 108

La ATA según la divulgación podría ser una variante del polipéptido de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,

46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76,

77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,

106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,

129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 que

comprenden una sustitución, deleción y/o inserción de 3 por 1 a 70 aminoácidos, típicamente por 1 a 50 aminoácidos,

más típicamente por 1 a 30 aminoácidos, incluso más típicamente por 1 a 25 aminoácidos, incluso más típicamente

por 1 a 20 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 15 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 10 aminoácidos, incluso más típicamente de 1 a 5 aminoácidos y más típicamente de 1 a 4 aminoácidos.

La ATA diseñada según la divulgación podría ser un fragmento de al menos 380 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 400 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 420 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 425 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 430 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 435 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 440 residuos de aminoácidos, más preferentemente al menos 445 residuos de aminoácidos y lo más preferentemente al menos 446 residuos de aminoácidos del polipéptido de SEQ ID NO : 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,

19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,

50, 51, 52, 53 , 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 , 80,

81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104 , 105, 106, 107, 108,

109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,

132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150. En este sentido, "fragmento" se refiere a una subsecuencia consecutiva de la SEQ ID NO respectiva, pero que se abrevia en el extremo

N y/o el extremo C.

La ATA según la divulgación podría ser una proteína de fusión de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,

146, 147, 148, 149 o 150 con cualquier otro aminoácido, oligo- o polipéptido, que se fusiona con el extremo N y/o el extremo C.

La ATA según la divulgación podría ser una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ

ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,

34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57.58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119,

120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142,

143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150 y adicionalmente al menos 1 residuo de aminoácido, al menos 2 residuos de aminoácido, al menos 4 residuos de aminoácido, al menos 6 residuos de aminoácido, al menos 10 aminoácidos residuos de ácido, más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos

30 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 40 residuos de aminoácidos, seleccionados independientemente de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met,

Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Tyr y Val.

La ATA de la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO: 3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54,

A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228,

V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433, y exhibe una estereoselectividad que es mayor que la de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO: 3 como se describió anteriormente.

La ATA de la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo formado por las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67,

A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230,

V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433, y exhibe una estereoselectividad superior a la de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO:3 como se describe anteriormente, y se selecciona de entre el grupo de ATA modificadas genéticamente que comprende la SEQ ID NO: 4, 5, 17, 18, 19, 47,

48, 55, 61, 68, 78, 79, 80, 85, 86, 87, 88, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,

112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 144, 145 o 146.

V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433, y exhibe una termoestabilidad superior a la de la ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO: 3 como se describió anteriormente.

V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433, y exhibe una termoestabilidad superior a la de la ATA del tipo salvaje de SEQ ID NO: 3 como se describe anteriormente, y se selecciona de entre el grupo de ATA diseñadas que comprende la SEQ ID NO: 4, 16, 47, 48, 87, 101, 102, 103,

104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 123, 124, 125, 126, 127, o 146.

La ATA de la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO: 3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433, y exhibe una conversión que es mayor que la del ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO: 3. como se describió anteriormente.

La ATA de la divulgación podría diseñarse en comparación con SEQ ID NO: 3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433, y exhibe una conversión que es mayor que la del ATA de tipo salvaje de SEQ ID NO: 3. como se describió anteriormente, y se selecciona de entre el grupo de At a diseñadas que comprenden la SEQ ID NO: 47, 48, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, o 146.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a las ATA que se obtienen de la ATA de SEQ ID NO:148, por ingeniería, pero que no son idénticas a SEQ ID NO:148

Las ATA diseñadas obtenidas de ATA de SEQ ID NO:148 según la divulgación son capaces de catalizar la conversión de un sustrato de cetona según la fórmula general (I) como se definió anteriormente en un producto de amina según la fórmula general (II) como se definió anteriormente; y/o la conversión preferiblemente concomitante de (ii) un cosustrato de amina según la fórmula general (III) como se define anteriormente en un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) como se define anteriormente, o viceversa.

Sorprendentemente, se ha descubierto que tras la ingeniería selectiva de SEQ ID NO:148, las características de la ATA respectiva pueden mejorarse aún más, y pueden obtenerse variantes de ATA que exhiben en comparación con la secuencia de tipo salvaje de SEQ ID NO:148

- una estereoselectividad mejorada aún más, y/o

- una termoestabilidad aún mayor, y/o

- una conversión aún mayor; y/o

- un cambio en la actividad y/o conversión de la especificidad del sustrato.

La ATA de SEQ ID NO:148 de esta realización de la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones, preferiblemente por 1 a 20 cambios de residuos, incluso más preferiblemente por 1 a 15 cambios de residuos, incluso más preferiblemente por 1 a 11 cambios de residuos, incluso más preferiblemente por 1 a 7 cambios de residuos y más preferiblemente de 1 a 4 cambios de residuos, preferiblemente incluyendo cambios en una o más de las siguientes posiciones de SEQ ID NO:148: V13, E15, M22, F25, P35, T39, D48, T50, R51, N57, L59, Y60, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, Y164, P195, E237, A242, G243, S244, A245, N268, V271, L272, S302, K314, V328, K358, E362, Y363, H375, L387, T409, H410, K424, G434, V436, M437, T440, R442, y S450.

La ATA de SEQ ID NO: 148 de esta realización de la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones, preferiblemente por 1 a 20 cambios de residuos, incluso más preferiblemente por 1 a 15 cambios de residuos, incluso más preferiblemente por 1 a 11 cambios de residuos, incluso más preferiblemente por 1 a 7 cambios de residuos y más preferiblemente por 1 a 4 cambios de residuos, preferiblemente incluyendo cambios en una o más de las siguientes posiciones de SEQ ID NO: 148: V13, E15, M22, F25, P35, T39, D48, T50, R51, N57, L59, Y60, A73, A74, E77, L79, T88, V93, V115, T120, L140, H146, D147, Y148, W151, L161, Y164, P195, E237, A242, G243, S244, A245, N268, V271, L272, S302, K314, V328, K358, E362, Y363, H375, L387, T409, H410, K424, G434, V436, M437, T440, R442, y S450 con sustitución de cualquiera de los aminoácidos de estas posiciones por cualquier otro aminoácido proteinogénico seleccionado de entre el grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp Tyr, y Val.

La ATA de SEQ ID NO:148 de esta realización de la divulgación está diseñada de tal manera que comprende al menos una o más sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en

- en la posición V13 sustitución por V13L; y/o

- en la posición E15 sustitución por E15R; y/o

- en la posición M22, sustitución de M22F, M22C, M22V, M22L, M22A o M22W; y/o

- en la posición F25 sustitución por F25L; y/o

- en la posición P35 sustitución por P35L o P35I; y/o

- en la posición T39 sustitución por T39Y; y/o

- en la posición D48 sustitución por D48G; y/o

- en la posición T50 sustitución por T50R, T50N o T50H; y/o

- en la posición R51 sustitución por R51K; y/o

- en la posición N57 sustitución por N57S; y/o

- en la posición L59, sustitución de L59F, L59W, L59V, L59A, L59S o L59G; y/o

- en la posición Y60, sustitución de Y60A, Y60I, Y60L, Y60F o Y60V; y/o

- en la posición A73 sustitución por A73N; y/o

- en la posición A74 sustitución por A74P; y/o

- en la posición E77 sustitución por E77G; y/o

- en la posición L79 sustitución por L79M; y/o

- en la posición T88, sustitución de T88V, T88A, T88G, T88L o T88Y; y/o

- en la posición Y93 sustitución por Y93T o Y93N; y/o

- en la posición V115 sustitución por V115I; y/o

- en la posición T120 sustitución por T120S; y/o

- en la posición L140 sustitución por L140K; y/o

- en la posición H146 sustitución por H146Y, H146D o H146S; y/o

- en la posición D147 sustitución por D147S; y/o

- en la posición Y148 sustitución por Y148F, Y148S o Y148G; y/o

- en la posición W151, sustitución de W151A, W151I, W151F, W151Y o W151S; y/o

- en la posición L161, sustitución de L161A, L161F, L161M, L161Y, L161I o L161Q; y/o

- en la posición Y164 sustitución por Y164F o Y164M; y/o

- en la posición P195 sustitución por P195S; y/o

- en la posición E237 sustitución por E237S, E237A o E237D; y/o

- en la posición A242 sustitución por A242V, A242Y o A242G; y/o

- en la posición G243 sustitución por G243A o G243; y/o

- en la posición S244 sustitución por S244A, S244G, S244I o S244L; y/o

- en la posición A245 sustitución por S245T; y/o

- en la posición F255 sustitución por F255L; y/o

- en la posición N268 sustitución por N268A; y/o

- en la posición V271 sustitución por V271A; y/o

- en la posición L272 sustitución por L272I o L272A; y/o

- en la posición S302 sustitución por S302G; y/o

- en la posición K314 sustitución por K314E; y/o

- en la posición V328 sustitución por V328G; y/o

- en la posición K358 sustitución por K358E; y/o

- en la posición E362 sustitución por E362R; y/o

- en la posición Y363 sustitución por Y363F; y/o

- en la posición H375 sustitución por H375F; y/o

- en la posición L387, sustitución de L387V, L387I, L387F, L387Y, L387T, L387A o L387C; y/o

- en la posición T409 sustitución por T409R; y/o

- en la posición H410 sustitución por H410K o H410E; y/o

- en la posición K424 sustitución por K424E; y/o

- en la posición G434, sustitución de G434A, G434V, G434L, G434Y, G434T o G434C; y/o

- en la posición V436 sustitución por V436A; y/o

- en la posición M437, sustitución de M437T, M437C, M437F, M437V, M437Y o M437A; y/o

- en la posición T440 sustitución por T440H, T440S o T440N; y/o

- en la posición R442, sustitución de R442V, R442S, R442A, R442L o R442C; y/o

- en la posición S450 sustitución por S450N.

La ATA de SEQ ID NO: 148 de esta realización de la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones de SEQ ID NO:148 seleccionadas de entre el grupo que comprende las posiciones M22, F25, T39, D48, T50, Y60, A73, V93, H146, L161, Y164, P195, A242, G243, S244, A245, F255, N268, V328, T409, K424, G434, V436 , M437, T440 y R442.

La ATA de SEQ ID NO:148 de esta realización de la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones de SEQ ID NO:148 seleccionadas de entre el grupo que comprende las posiciones F25, D48, Y164, P195, A242, A245, F255, N268, V328, T409, K424 y V436.

La ATA de SEQ ID NO: 148 de esta realización de la divulgación está diseñada en las posiciones

- D48, Y164, P195, A242, A245, F255, N268, T409, K424, y/o V436; preferiblemente D48G, Y164F, P195S, A242V, A245T, F255L, N268A, T409R, K424E, y/o V436A; y/o

- F255 y V328, preferiblemente F255L y/o V328G; y/o

- F25, Y164, y/o F255; preferiblemente F25L, Y164M, y/o F255L.

La ATA diseñada de SEQ ID NO:148 según la divulgación comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de homología, preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, incluso más preferiblemente al menos 70 %, aún más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 % de homología, aún más preferiblemente al menos 91 % de homología, aún más preferiblemente al menos 92 % de homología, aún más preferiblemente al menos 93 % de homología, aún más preferiblemente al menos 94 % de homología, aún más preferiblemente al menos 95 % de homología, aún más preferiblemente al menos 96 % de homología, aún más preferiblemente al menos 97 % de homología, aún más preferiblemente al menos 98 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,1 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,2 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,3 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,4 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,5 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,6 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,7 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,8 % de homología, o al menos 99,9 %, homología con SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:149, y/o SEQ ID NO:150. En cuanto a SEQ ID NO:148 se refiere, sin embargo, la homología no debe ser 100 %.

La ATA de SEQ ID NO:148 de esta realización de la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones de SEQ ID NO: 148 seleccionadas de entre el grupo que comprende posiciones M22, F25, T39, D48, t 50, Y60, A73, V93, H146, L161, Y164, P195, A242, G243, S244, A245, F255, N268, V328, T409, K424, G434, V436, M437, T440, y R442; y comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de homología , preferiblemente al menos 55 %, más preferiblemente al menos 60 %, todavía más preferiblemente al menos 70 %, aún más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 % de homología, aún más preferiblemente al menos 91 % de homología, aún más preferiblemente al menos 92 % de homología, aún más preferiblemente al menos 93 % de homología, aún más preferiblemente al menos 94 % de homología, aún más preferiblemente al menos 95 % de homología, aún más preferiblemente al menos 96 % de homología, aún más preferiblemente al menos 97 % de homología, aún más preferiblemente al menos 98 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,1 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,2 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,3 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,4 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,5 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,6 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,7 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,8 % de homología, o al menos 99,9 %, de homología a SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:149, y/o SEQ ID NO: 150. En cuanto se refiere a SEQ ID NO: 148, sin embargo, la homología no debe ser 100 %.

La ATA de SEQ ID NO: 148 de esta realización de la divulgación está diseñada en al menos una o más posiciones de SEQ ID NO: 148 seleccionadas de entre el grupo que comprende las posiciones F25, D48, Y164, P195, A242, A245, F255, N268 , V328, T409, K424 y V436; y comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 50 % de homología, preferiblemente al menos 55 %. más preferiblemente al menos 60 %, aún más preferiblemente al menos 70 %, todavía más preferiblemente al menos 80 %, aún más preferiblemente al menos 90 % de homología, aún más preferiblemente al menos 91 % de homología, aún más preferiblemente al menos 92 % de homología, aún más preferiblemente al menos 93 % de homología, aún más preferiblemente al menos 94 % de homología, aún más preferiblemente al menos 95 % de homología, aún más preferiblemente al menos 96 % de homología, aún más preferiblemente al menos 97 % de homología, aún más preferiblemente al menos 98 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,1 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,2 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,3 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,4 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,5 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,6 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,7 % de homología, aún más preferiblemente al menos 99,8 % de homología, o al menos 99,9 %, de homología to SEQ ID NO:147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, y/o SEQ ID NO: 150. En cuanto se refiere a SEQ ID NO: 148, sin embargo, la homología no debe ser 100 %.

En una realización específica de esta divulgación, cualquier ATA diseñada de SEQ ID NO:148 de esta realización en comparación con la ATA no diseñada de SEQ ID NO:148

- proporciona una estereoselectividad mejorada de al menos 35 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, preferiblemente al menos 80 %, preferiblemente al menos 85 %, preferiblemente al menos 90 %, preferiblemente al menos 95 %, preferiblemente al menos 98 %, preferiblemente al menos 99 %, preferiblemente al menos 99,5 %, y lo más preferiblemente al menos 99,9 %; y/o

- proporciona una termoestabilidad de al menos 65 °C, más preferiblemente al menos 70 °C, aún más preferiblemente al menos 75 °C, aún más preferiblemente al menos 80 °C, y lo más preferiblemente al menos 85 °C; y/o

- proporciona una conversión aún mayor de preferiblemente al menos 35 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 45 %, preferiblemente al menos 50 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 60 %, preferiblemente al menos 65 %, preferiblemente al menos 70 %, preferiblemente al menos 75 %, preferiblemente al menos 802 %, preferiblemente al menos 85 %, preferiblemente al menos 90 %, preferiblemente al menos 55 %, preferiblemente al menos 95 %, y más preferiblemente de al menos 99 %; y/o

- proporciona una conversión mejorada y una mayor especificidad del sustrato para la especificidad del sustrato y/o actividad para (R)-fenilacetilcarbinol, 1-fenil-1-butanona, 2-metil-1-fenil-1-propanona, 1-fenil-1-pentanona, metil-3-oxo3-fenilpropanoato, y/o 3-oxo-3-fenil-butirato de metilo.

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la conversión de

(i) un sustrato de cetona según la fórmula general (I) como se describió anteriormente a un producto de amina según la fórmula general (II) como se describió anteriormente;

y/o la conversión preferiblemente concomitante de

(ii) un cosustrato de amina según la fórmula general (III) como se describió anteriormente a un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) como se describió anteriormente,

o viceversa;

donde el producto de amina según la fórmula general (II) tiene preferiblemente configuración (S) o configuración (R); y

donde el procedimiento comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona según la fórmula general (I) y/o un producto amínico según la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina según la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) en presencia de una ATA según la invención.

Preferiblemente, la invención se refiere a un procedimiento para la conversión estereoselectiva de

(i) un sustrato de cetona según la fórmula general (I) como se describe anteriormente a un producto de amina quiral según la fórmula general (II) como se describe anteriormente;

y/o la conversión preferiblemente concomitante de

(ii) un cosustrato de amina quiral o no quiral según la fórmula general (III) como se describió anteriormente a un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) como se describió anteriormente,

o viceversa;

donde el procedimiento comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona según la fórmula general (I) y/o un producto de amina quiral según la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina quiral o no quiral según la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) en la presencia de una ATA según la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una ATA según la invención como se describió anteriormente para la amidación de un grupo ceto en cualquier dirección posible, preferiblemente en el procedimiento según la invención como se describió anteriormente.

Preferiblemente, la invención se refiere al uso de una ATA según la invención como se describe anteriormente para la conversión de

y/o la conversión preferiblemente concomitante de

o viceversa;

donde el producto de amina según la fórmula general (II) tiene preferiblemente configuración (S) o configuración (R).

Preferiblemente, la invención se refiere al uso de un ATA según la invención como se describe anteriormente para la conversión estereoselectiva de

y/o la conversión preferiblemente concomitante de

o viceversa;

donde el producto de amina quiral según la fórmula general (II) tiene configuración (S) o configuración (R).

Las siguientes realizaciones sirven para fines informativos:

Las realizaciones particularmente preferidas de la invención Emb-1 a 15 de la divulgación se resumen a continuación: Emb-1: Una transaminasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 75 % de homología con la SEQ ID NO:3. Emb-2: la transaminasa según Emb-1, que es capaz de catalizar la conversión de (i) un sustrato cetónico según la fórmula general (I)

en un producto amínico según la fórmula general (II)

y/o la conversión preferiblemente concomitante de (ii) un cosustrato de amina según la fórmula general (III)

en un coproducto de cetona según la fórmula general (IV)

o viceversa; donde X e Y, asi como A y B, en cualquier caso, independientemente uno de otro, se seleccionan de entre residuos de hidrocarburos alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, no sustituidos o mono o polisustituidos C^1-12; residuos de hidrocarburos aromáticos no sustituidos o mono o polisustituidos C^6-10, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; residuos de hidrocarburos heteroaromáticos no sustituidos o mono o polisustituidos, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; y residuos de azúcar o residuos de desoxiazúcar que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos; donde uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno; donde mono o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de entre -halo, -OH, =O, -OC^1-12-alquilo, -OC^6-10-arilo, -O-heteroarilo, -OCOC^1-12-alquilo, -OCOC^6-10-arilo, -OCO-heteroarilo, -SH, -SC^1-12-alquilo, -SC^6-10-arilo, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³, -NH², -NH(C^1-12-alquilo), -N(C^1-12-alquilo)², -NH(C^6-10-arilo), -N(C^6-10-arilo)², -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)², -CN, -CHO, -CO²H,CO-C^1-2-alquilo, -CO-C^6-10-arilo y -CO-heteroarilo. Emb-3: La transaminasa según Emb-1 o 2, que se caracteriza por (A) una estabilidad a la temperatura de al menos 50 °C, preferiblemente 55 °C, y lo más preferiblemente de 60 °C, y/o (B) una actividad específica de al menos 0,5 U/mg, preferiblemente, 0,75 U/mg, más preferiblemente de 1 U/mg, y más preferiblemente a 1,1 U/mg en ensayos estándar de transaminasas; y/o (C) una alta actividad de conversión en diferentes condiciones de reacción que implican altas concentraciones de amina. Emb-4: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones de modo que (A) la estereoselectividad de la transaminasa modificada es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de s Eq ID NO:3; y/o (B) la termoestabilidad de la transaminasa diseñada es más alta que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o (C) la conversión de la transaminasa modificada es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3. Emb-5: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo formado por las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433. Emb-6: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones de modo que comprenda al menos una o más sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N7L, E9R, M16F, M16C, M16V, M16L, M16A, M16W, V29L, V29I, G33Y, Q44R, Q44N, Q44H, R45K, G51S, L53F, L53W, L53V, L53A, L53S, L53G, W54A, W54I, W54L, W54Y, W54S, W54C, W54F, W54V, A67N, A68P, A71G, L73M, F82V, F82A, F82G, F82L, F82Y, H87T, H87N, V109I, G114S, R140K, N146Y, N146D, N146S, G147S, Y148F, Y148S, Y148G, V151A, V151W, V151I, V151F, V151Y, V151S, N161A, N161F, N161M, N161Y, N161Q, N161I, Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, Y164I, H165R, E222S, E222A, E222D, A227Y, A227V, A227I, A227G, A227F, A227M, G228A, G228I, V230A, V230G, V230I, V230L, V257A, V258A, V258I, A288G, Q300E, A349G, A353R, Q354F, Y366H, Y366F, M378L, M378V, M378I, M378F, M378Y, M378T, M378A, M378C, Q391K, Q391E, R415A, R415V, R415L, R415G, R415Y, R415T, I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y, I417A, K420H, K420S, K420N, I422V, I422S, I422A, I422L, I422C, T430N, y E433D. Emb-7: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en (I) al menos una posición seleccionada de entre el grupo que consiste en M16, W54, N146, N161, Y164, A227, G228, V230, V258, R415, 1417 y 1422; y (II) además en al menos otra posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, V29, G33, q 44, R45, G51, L53, W54, A67, a 68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433. Emb-8: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N161 así como Y164; 1417 y 1422; y N146 así como N161. Emb-9: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de manera que comprenda (i) en la posición N161 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N161A, N161F, N161M, N161Y, N161I o N161Q; así como en la posición Y164 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en Y164L, Y164M, Y164A, Y164F o Y164I; y/o (ii) en la posición 1417 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y o I417A; así como en la posición 1422 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en I422V, I422S, I422A, I422L o I422C; y/o (iii) en la posición N146 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N146Y, N146D o N146S; así como en la posición N161 una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N161A, N161F, N161M, N161Y, N161I o N161Q. Emb-10: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos dos posiciones de modo que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las sustituciones N161M así como Y164L; N161I así como Y164L; N161Q y Y164L; N161I así como Y164M; N161M y Y164M; N161Q y Y164M; N161I así como Y164F; N161M así como Y164I; I417V así como I422S; 1417V así como I422C; I417A así como I422S; I417F y 1422V; I417A así como I422C; y N146Y así como N161Q. Emb-11: La transaminasa según cualquiera de las Embs precedentes, que se modifica por ingeniería en comparación con la SEQ ID NO:3 en (i) al menos dos posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N161 así como Y164; o 1417 así como 1422; o N146 así como N161; y (ii) además, al menos, otra posición seleccionada de entre el grupo que consiste en N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, G51, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140, N146, G147, Y148, Y151, N161, Y164, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430, y E433. Emb-12: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con s Eq ID NO:3 en (i) al menos dos posiciones de manera que comprenda al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N146Y así como N161Q; N161M y Y164L; N161I así como Y164L; N161Q y Y164L; N161I así como Y164M; N161M y Y164M; N161Q y Y164M; N161I así como Y164F; N161M así como Y164I; I417V así como I422S; 1417V así como I422C; I417A así como I422S; I417F así como I422V; e I417A así como I422C; y (ii) además en al menos otra posición que comprende al menos otra sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en N7L, E9R, M16F, M16C, M16V, M16L, M16A, M16W, V29L, V29I, G33Y, Q44R, Q44N, Q44H, R45K, G51S, L53F, L53W, L53V, L53A, L53S, L53G, W54A, W54I, W54L, W54Y, W54S, W54C, W54F, W54V, A67N, A68P, A71G, L73M, F82V, F82A, F82G, F82L, F82Y, H87T, H87N, V109I, G114S, R140K, N146Y, N146D, N146S, G147S, Y148F, Y148S, Y148G, V151A, V151W, V151I, V151F, V151Y, V151S, N161A, N161F, N161M, N161Y, N161Q, N161I, Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, Y164I, H165R, E222S, E222A, E222D, A227V, A227I, A227G, A227F, A227Y, A227M, G228A, G228I, V230G, V230A, V230I, V230L, V257A, V258A, V258I, A288G, Q300E, A349G, A353R, Q354F, Y366H, Y366F, M378L, M378V, M378I, M378F, M378Y, M378T, M378A, M378C, Q391K, Q391E, R415A, R415V, R415L, R415G, R415Y, R415T, R415C, I417T, I417C, I417F, I417V, I417Y, I417A, K420H, K420S, K420N, I422V, I422S, I422A, I422L, I422C, T430N, y E433D. Emb-13: La transaminasa según cualquiera de las Embs anteriores, que está diseñada en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos en tres posiciones de modo que comprenda al menos tres sustituciones, donde (i) la primera sustitución de dichas al menos tres sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en N1611, N161M y N161Q; y (ii) la segunda sustitución de dichas al menos tres sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en Y164L e Y164I; y (iii) la tercera sustitución de dichas al menos tres sustituciones se selecciona de entre el grupo que consiste en n 7l , E9R, M16F, M16W, V29L, V29I, G33Y, Q44R, Q44N, Q44H, R45K, G51S, W54A, A67N, A68P, A71G, L73M, H87T, H87N, V109I, G114S, R140K, G147S, H165R, V230A, A288G, Q300E, A349G, A353R, Q354F, Y366H, Y366F, Q391K, Q391E, K420H, K420S, K420N, T430N, y E433D. Emb-14: La transaminasa según cualquiera de las Embs precedentes, que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos un 85% de homología con la SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57.58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139,140, 141, 142, 143, 144,145, 146, 147, 148, 149, o 150. Emb-15: Un procedimiento para la conversión de (i) un sustrato de cetona según la fórmula general (I)

(i)

en un producto de amina según la fórmula general (II)

y/o la conversión preferiblemente concomitante de (ii) un cosustrato según la fórmula general (III)

a un coproducto de cetona según la fórmula general (IV)

(IV);

o viceversa; donde X e Y así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de entre residuos de hidrocarburos alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, no sustituidos o mono o polisustituidos C^1-12; residuos de hidrocarburos aromáticos no sustituidos o mono o polisustituidos C^6-10, opcionalmente puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; residuos de hidrocarburos heteroaromáticos no sustituidos o mono o polisustituidos, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido C^1-12; y residuos de azúcar o residuos de desoxiazúcar que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos; donde uno de los residuos X o Y, así como uno de los residuos A o B, en cualquier caso, independientemente entre sí, puede ser hidrógeno; donde mono o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de entre -halo, -OH, =O, -OC^1-12-alquilo, -OC^6-10-arilo, -O-heteroarilo, -OCOC^1-12-alquilo, -OCOC^6-10-arilo, -OCO-heteroarilo, -SH, -SC^1-12-alquilo, -SC^6-10-arilo, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³, -NH², -NH(C^1-12-alquilo), -N(C^1-12-alquilo)², -NH(C^6-10-arilo), -N(C^6-10-arilo)², -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)², -CN, -CHO, -CO²H, CO-C^1-2-alquilo, -CO-C^6-10-arilo y -CO-heteroarilo; donde el procedimiento comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona según la fórmula general (I) y/o un producto de amina según la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina según la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) en presencia de una transaminasa según cualquiera de las Embs-1 a 14.

Los siguientes ejemplos ilustran aún más la invención, pero no deben interpretarse como una limitación de su alcance.

Ejemplo 1: identificación de un nuevo gen ATA correspondiente a SEQ ID NO:1

El gen de la nueva aminotransferasa se detectó durante un cribado de nuevas aminotransferasas mediante el enriquecimiento selectivo de cepas de tipo salvaje que expresan aminotransferasas. Se recolectaron aleatoriamente muestras de suelo de diferentes hábitats y se suspendieron cinco gramos de cada muestra en 20 ml de NaCl al 0,9 %. Un medio rico no selectivo TSB (15 g/L peptona de caseína, 5 g/L peptona de harina de soja, 5 g/L NaCl) se inoculó mediante estas suspensiones y se incubó a 30 °C durante varias horas para obtener un primer precultivo. Este primer precultivo se ha utilizado para inocular un segundo precultivo en medio mínimo definido Ma (fosfato de potasio 50 mM pH 7, glicerol 100 mM, CaC^b0,2 mM, MgSO⁴4 mM, 1 g/L NH⁴Cl, 10 ml/L 100 * solución madre de oligoelementos [10 mg/L ZnCl², 10 mg/ml MnSO⁴* 4 H²O, 2 mg/L H³BO³, 10 mg/L CuSO⁴* 5 H²O, 5 mg/L CoC^b, 10 mg/L NiSO⁴* 6 H²O, 200 mg/L Na²MoO⁴, 400 mg/L FeSO⁴* 7 H²O]). Después de cultivar durante la noche, este segundo precultivo se lavó con NaCI al 0,9 % para eliminar las fuentes residuales de nitrógeno. Las células lavadas se usaron para inocular un medio de enriquecimiento selectivo que consiste en el medio mínimo definido MA donde la fuente de nitrógeno original ha sido reemplazada por una colección de diferentes aminas (p. ej., R/S-a-Metilbenzilamina o R/S-1-Metil-3-fenilpropilamina). Las aminas se han añadido a concentraciones de 50 mM. El enriquecimiento se ha asegurado mediante la dilución repetitiva del cultivo desarrollado en un nuevo medio de enriquecimiento. Después de la tercera dilución de cultivos enriquecidos, las células enriquecidas se sembraron en placas de agar que contenían medio de enriquecimiento MA con la fuente de nitrógeno respectiva para seleccionar clones individuales. Los clones individuales se han verificado adicionalmente mediante cultivo líquido en medio de enriquecimiento, así como mediante detección directa de la actividad de transaminasa.

La actividad de transaminasa se detectó cultivando cepas seleccionadas en 400 pl de medio LB medio concentrado durante dos días a 30 °C. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 200 pl de solución de sustrato que consiste en 4-fenil-2-butanona 5 mM, 1-feniletan-1-amina (MBA) 100 mM, fosfato potásico 50 mM pH 7,4 y piridoxalfosfato 1 mM. La reacción transcurrió durante la noche a 30°C, se detuvo añadiendo 200 pl de metanol y se analizó mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 3.

Identificación de los genes de transaminasas correspondientes, se han construido bibliotecas genómicas a partir de cepas activas. El ADN de microorganismos seleccionados cultivados en un formato de 96 pocillos se aisló, se fragmentó mecánicamente al intervalo de tamaño deseado y se clonó en pF2F4 (WO2010/075956 A1). Los plásmidos resultantes se transformaron en E. coli BL21(DE3)placI(+) células. El cribado de la biblioteca se realizó con cribado de grupos (WO2005/040376 A2) con tamaños de grupos de aproximadamente 300, 000 a 350, 000 clones por placa también por enriquecimiento selectivo.

Para la expresión de la biblioteca genómica, las células se cultivaron en un medio mínimo definido suplementado con kanamicina (50 mg/l) y cloranfenicol (34 mg/l)). La expresión de los genes de la biblioteca genómica se indujo en la fase logarítmica mediante IPTG (0,5 mM) o arabinosa (0,1 (v/v)). Los cultivos se llevaron a cabo a 30 °C durante 16 horas, después de lo cual las células se lavaron con NaCl al 0,9 % para eliminar las fuentes residuales de nitrógeno. Las células lavadas se cultivaron en un medio mínimo definido, reemplazando la fuente de nitrógeno original por la amina respectiva para el enriquecimiento. El enriquecimiento se logró en tres diluciones repetidas. Después de la tercera dilución, los plásmidos se han purificado a partir de cultivos enriquecidos y se han determinado las secuencias del gen de las transaminasas.

Ejemplo 2: Expresión de un nuevo gen ATA correspondiente a SEQ ID NO:1 y 2

Las secuencias del gen ATA recién encontradas correspondientes a SEQ ID NO:1 se optimizaron por codón para la expresión de E. coli mientras que simultáneamente disminuyó el contenido de GC, correspondiente a SEQ ID NO:2. Ambos genes según SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 se clonaron en el vector de expresión pLE1A17 (derivado de pRSF-1b, Novagen). Los plásmidos resultantes se utilizaron para la transformación de células E. coli BL21 (DE3).

Para la expresión de la nueva ATA correspondiente a SEQ ID NO:1 y SEQ.ID NO:2 las células se cultivaron en medio ZYM505 (F. William Studier, Protein Expression and Purification 41 (2005) 207-234) suplementado con kanamicina (50 mg/l) a 37 °C. La expresión del gen se indujo en fase logarítmica mediante IPTG (0,1 mM) y se llevó a cabo a 30 °C durante 16-18 horas.

Las células se recogieron por centrifugación (3220 xg, 20 min, 4 °C) y se rompieron por resuspensión correspondiente a una densidad óptica, medida a 600 nm (OD⁶⁰⁰) de 100 con tampón de lisis celular (Tris-HCl 50 mM pH 7,0; MgCl22 mM, 1 x CelLytic B (Sigma); ADN nucleasa 0,02 U, lisozima 0,5 mg/ml). Los extractos brutos se separaron de los restos celulares mediante centrifugación (3220 x g 30 min, 4 °C), lo que dio como resultado preparaciones enzimáticas activas de ATA de SEQ ID NO:3. Para la detección de la actividad enzimática de una ATA de la invención, se puede obtener un liofilizado de la preparación activa de la ATA. El extracto crudo liofilizado se investigó con respecto a la actividad de ATA usando el Ensayo Estándar de Transaminasas.

El ensayo estándar de transaminasas controla la conversión de 1-feniletan-1-amina (MBA) racémica y piruvato en 1-feniletanona (acetofenona) y L-alanina. La reacción se realiza a 30 °C en tampón fosfato 50 mM (pH 7, 4) y piridoxalfosfato (PLP) 0,1 mM usando 1-feniletan-1-amina racémica 10 mM y piruvato sódico 10 mM como sustratos. La producción de 1-fenilehanona se sigue fotométricamente a 300 nm. Una unidad (U) libera 1 pmol de 1-feniletanona (acetofenona) por minuto. La actividad específica se refiere a unidades por miligramo de extracto crudo liofilizado (U/mg)

Ejemplo 3: Caracterización de las propiedades enzimáticas de la nueva ATA de SEQ ID NO:3

Una preparación enzimática activa de ATA de SEQ ID NO:3 se preparó como se describe en el Ejemplo 2. Para comparar sus propiedades enzimáticas, se prepararon preparaciones enzimáticas activas de varias otras omegatransaminasas de una manera similar. Estas incluyen omega-transaminasas bien conocidas en la bibliografía (J.S. Shin y col., Appl.Microbiol.Biotechnol. 2003, 61463-471. WO 2010/081053.J.H. Seo y col. Biotechnol. J 3 (5):676-686, 2008.S. Schatzle y col. Anal.Chem. 81 (19):8244-8248, 2009.).

La actividad enzimática de estas enzimas se analizó con el Ensayo estándar de transaminasas como se describe en el Ejemplo 2. Además, la termoestabilidad de cada enzima se analizó como se describe en el Ejemplo 5.

Además, se investigaron las propiedades de conversión de estas enzimas en ensayos de conversión de transaminasas.

Los ensayos de conversión de transaminasas monitorean las propiedades enzimáticas en diferentes condiciones de reacción que son relevantes para una aplicación de síntesis preparativa a alta concentración de diferentes donantes de amina, isopropilamina (IPA), 1-feniletan-1-amina (MBA) racémica o (S)-1-feniletan-1-amina (S-MBA) o alanina racémica, respectivamente. El aceptor de cetonas fue 4-fenil-2-butanona (BA). La reacción se realizó a 30 °C en tampón fosfato 50 mM (pH 7,4) y piridoxalfosfato (PLP) 0,1 mM.

La conversión de BA a 1-metil-3-fenilpropilamina se analizó mediante HPLC después de un tiempo de reacción determinado, típicamente 6 horas o 20 horas. Las condiciones analíticas son:

Columna: Gemini 5|j C18, 150x4,6 mm (Phenomenex);

Eluyentes: A) dH2O, ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1 %; B) acetonitrilo, TFA al 0,1 %;

Flujo: 1 ml/min; gradiente: 20 % B a 80 % B en 6 min, mantener durante 1 min, a 20 % B en 1 min, mantener durante 3 min;

Temperatura del horno: 35 °C;

Detección: 210 nm.

Los tiempos de retención de los analitos son 6,52 min para BA y 3,65 min para 1-metil-3-fenilpropilamina.

En general, los ensayos de conversión de transaminasas se pueden realizar en condiciones que difieren en el tipo de donante de amina (|Pa , MBA y alanina) y la concentración respectiva de los reactivos.

Condición A: 50 mM BA, IPA 100 mM; después de 6h

Condición B: 50 mM BA, 200 mM rac. MbA; después de 6h

Condición C: 50 mM BA, 500 mM IPA; después de 6h

Condición D: 50 mM BA, rac. 1000 mM MBA; después de 6h

Condición E: 50 mM BA, rac 200 mM, alanina; después de 6h

Condición F: 10 mM BA, 50 mM IPA; después de 6h

Condición G: 50 mM BA, IPA 300 mM; después de 20h

Condición H: 150 mM BA, (S)-MBA 300 mM; después de 20h

Condición I: 150 BA, 1000 mM IPA; después de 2üh

Condición J: 50 mM BA, 1000 mM IPA; después de 20h

Las transaminasas de este ejemplo se analizaron en las Condiciones A, B, C, D y E.

Entre las enzimas de tipo salvaje analizadas, la nueva enzima transaminasa SEQ ID NO:3 muestra la actividad estándar de transaminasa más alta y las mejores propiedades con respecto a la conversión del sustrato en las diferentes condiciones relevantes del procedimiento.

Ejemplo 4: Análisis de la estereoselectividad de las ATA diseñadas

Varias variantes de ATA que se han diseñado en comparación con SEQ ID NO:3 se analizaron con respecto a su estereoselectividad en la formación de (S)-1-metil-3-fenilpropilamina. Para el análisis de la estereoselectividad, se realizaron ensayos de conversión de transaminasas con cada ATA como se describe en el Ejemplo 3 en la Condición F.

Los productos se analizaron mediante análisis HPLC quiral. Las condiciones analíticas son:

Columna: chiralpak IB (Daicel);

Eluyente: n-hexano al 98 %, isopropanol al 2 %, etilendiamina al 0,1 %;

Flujo 1 ml/min;

Temperatura del horno: 35 °C;

Detección: 267 nm.

Los tiempos de retención de los analitos son 5,6 min para (R)-1-metil-3-fenilpropilamina y 5,9 min para (S)-1-metil-3-fenilpropilamina.

Cálculo del exceso enantiomérico (%ee) del enantiómero (S) se realiza integrando las áreas de los picos de los enantiómeros usando la fórmula:

%ee = [enantiómero (S) - enantiómero(R)] / [(enantiómero (S) enantiómero(R)]

Se encontró que las ATA modificadas genéticamente mostraban una estereoselectividad mejorada en comparación con la ATA de tipo salvaje SEQ ID No:3: Las estereoselectividades de mutantes se enumeran en la tabla siguiente.

Ejemplo 5: Detección de termoestabilidad de ATA diseñadas

Varias variantes de ATA que se han diseñado en comparación con SEQ ID NO:3 fueron analizadas en cuanto a su termoestabilidad. Se obtuvieron extractos brutos de una ATA respectiva como se describe en el Ejemplo 2. Se registraron los perfiles de fusión de estas preparaciones activas enzimáticas activas de una ATA respectiva incubando el extracto bruto durante 15 minutos a diferentes temperaturas en un ciclador de PCR. Posteriormente, los extractos brutos se incubaron en hielo durante 30 minutos. Las proteínas insolubles se separaron por centrifugación y los sobrenadantes se analizaron con respecto a su actividad de ATA restante en un ensayo estándar de transaminasas como se describe en el Ejemplo 2.

La termoestabilidad se expresó como la temperatura a la que 80 % de la actividad inicial de la variante ATA permanece después de 15 min de incubación [Tm(80 %)]. La actividad inicial es la actividad de la variante de ATA respectiva sin ningún tratamiento a alta temperatura, es decir, con 15 min de incubación en hielo en lugar de incubación a diferentes temperaturas en un ciclador de PCR.

Se encontró que las ATA modificadas genéticamente mostraron una termoestabilidad mejorada en comparación con la ATA de tipo salvaje SEQ ID No:3: Las temperaturas de fusión de los mutantes se enumeran en la siguiente tabla.

Ejemplo 6: Evaluación para una conversión mejorada en las condiciones de procedimiento relevantes

Varias variantes de ATA que se han diseñado en comparación con SEQ ID NO:3 se analizaron en ensayos de conversión de transaminasas en busca de propiedades relevantes para una aplicación de síntesis preparativa a alta concentración de donantes de amina, isopropilamina (IPA) y 1-feniletan-1-amina racémica (MBA), respectivamente. Las reacciones se realizaron y analizaron para la conversión como se describe en el Ejemplo 3, con análisis de conversión después de un tiempo de reacción de 20 h. Para la reacción, el 20 % del volumen total de reacción fue extracto crudo de la ATA respectiva, obtenido como se describe en el Ejemplo 2. Se utilizaron diferentes condiciones variando las concentraciones de reactivos y el tipo de donante de amino como se indica para cada tabla.

Ejemplo 7 Caracterización de propiedades enzimáticas de la ATA diseñada de SEQ ID NO:148

Una preparación enzimática activa de ATA de SEQ ID NO:148 y SEQ ID NO147 se prepararon como se describe en el Ejemplo 2. El análisis de sus propiedades en el Ensayo estándar de transaminasas se ha mostrado en el Ejemplo 3

Preparaciones de enzimas activas de SEQ ID NO:147 y SEQ ID NO:148 se han sometido además a Ensayos de conversión de transaminasas como se describe en el Ejemplo 3, pero en las condiciones:

Condición K (BA 100 mM; rac 500 mM. MBA), o

Condición L (BA 200 mM; rac. 500 mM MBA) o Condición M (BA 10g/L, IPA 900 mM)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una transaminasa que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO:3, donde la transaminasa está sustituida en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una posición seleccionada de entre el grupo de sustituciones de aminoácidos N161A, N161M, N161Q y N1611,

donde

(A) la estereoselectividad de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3; y/o

2. La transaminasa según la reivindicación 1, que está sustituida con respecto a SEQ ID NO:3 en la posición N161 e Y164.

3. La transaminasa según la reivindicación 1 o 2, donde

(C) la conversión de la transaminasa es mayor que la de la transaminasa de tipo salvaje de SEQ ID NO:3.

4. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se sustituye adicionalmente en comparación con SEQ ID NO:3 en la posición G51.

5. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos dos sustituciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en N161A, N161M, N161Q, N161I, Y164L, Y164M, Y164A, Y164F, Y164I y G51S.

6. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en Y164A, Y164C, Y164D, Y164E, Y164F, Y164G, Y164H, Y164I, Y164K, Y164L, Y164M, Y164N, Y164P, Y164Q, Y164R, Y164S, Y164T, Y164V e Y164W.

7. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una sustitución seleccionada de entre el grupo que consiste en G51A, G51C, G51D, G51E, G51F, G51H, G51I, G51K, G51L, G51M, G51N, G51P, G51Q, G51R, G51S , G51T, G51V, G51W y G51Y.

8. La transaminasa según la reivindicación 7, que comprende la sustitución G51S.

9. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la identidad con SEQ ID NO:3 es por lo menos 90 %.

10. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se sustituye adicionalmente en comparación con SEQ ID NO:3 en al menos una o más posiciones seleccionadas de entre el grupo que consiste en las posiciones N7, E9, M16, V29, G33, Q44, R45, L53, W54, A67, A68, A71, L73, F82, H87, V109, G114, R140 , N146, G147, Y148, Y151, H165, E222, A227, G228, V230, V257, V258, A288, Q300, A349, A353, Q354, Y366, M378, Q391, R415, 1417, K420, 1422, T430 y E433.

11. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está sustituida en comparación con SEQ ID NO: 3 en al menos una o más posiciones de manera que comprende al menos una o más sustituciones adicionales seleccionadas de entre el grupo que consiste en N7L, E9R, M16F, M16C, M16V, M16L, M16A, M16W, V29L, V29I, G33Y, Q44R, Q44N, Q44H, R45K, L53F, L53W, L53V, L53A, L53S, L53G, W54A, W54I, W54L, W54Y, W54S, W54C, W54F, W54V, A67N, A68P, A71G, L73M, F82V, F82A, F82G, F82L, F82Y, H87T, H87N, V109I, G114S, R140K, N146Y, N146D, N146S, G147S, Y148F, Y148S, Y148G, V151A, V151W, V151I, V151F, V151Y, V151S, H165R, E222S, E222A, E222D, A227Y, A227V, A227I, A227G, A227F, A227M, G228A, G228I, V230A, V230G, V230I, V230L, V257A, V258A, V258I, A288G, Q300E, A349G, A353R, Q354F, Y366H, Y366F, M378L, M378V, M378I, M378F, M378Y, M378T, M378A, M378C, Q391K, Q391E, R415A, R415V, R415L, R415G, R415Y, R415T, R415C I417T, I417C, I417F, 1417V, I417Y, I417A, K420H, K420S, K420N, I422V, I422S, I422A, I422L, I422C, T430N, y E433D.

12. La transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57.58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, o 150.

13. Un procedimiento para la conversión de

(i) un sustrato de cetona según la fórmula general (I)

( i )

para un producto de amina según la fórmula general (II)

(ii) un cosustrato según la fórmula general (III)

(IV):

o viceversa;

donde X e Y así como A y B, en cualquier caso, independientemente entre sí, se seleccionan de entre residuos de hidrocarburos C^1-12, alifáticos o alicíclicos alifáticos o alicíclicos saturados o insaturados, no sustituidos o mono o polisustituidos; residuos de hidrocarburo aromático C^6-10, no sustituidos o mono o polisustituidos, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo C^1-12, alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido; residuos de hidrocarburos heteroaromáticos mono o polisustituidos o no sustituidos, que opcionalmente están puenteados a través de un residuo de hidrocarburo C^1-12, alifático saturado o insaturado, no sustituido o mono o polisustituido; y residuos de azúcar o residuos de desoxiazúcar que comprenden en cada caso mono-, di- u oligosacáridos;

donde mono o polisustituido significa independientemente sustituido con uno o más grupos funcionales seleccionados de entre -halo, -OH, =O, -OC^1-12-alquilo, -OC^6-10-arilo, -O-heteroarilo, -OCOC^1-12-alquilo, -OCOC^6-10-arilo, -OCO-heteroarilo, -SH, -SC^1-12-alquilo, -SC^6-10-arilo, -S-heteroarilo, -S(=O)^1-2OH, -NO, -NO², -N³, -NH², -NH(C^1-12-alquilo), -N(C^1-12-alquilo)², -NH(C⁶-¹⁰-arilo), -N(C^6-10-arilo)², -NH(heteroarilo), -N(heteroarilo)², -CN, -Ch O, -CO²H, CO-C^1-2-alquilo, -CO-C^6-10-arilo y -CO-heteroarilo;

donde el procedimiento comprende la etapa de hacer reaccionar un sustrato de cetona según la fórmula general (I) y/o un producto de amina según la fórmula general (II) y/o un cosustrato de amina según la fórmula general (III) y/o un coproducto de cetona según la fórmula general (IV) en presencia de una transaminasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.