ES2870097T3 - Método de colocación molecular individual sobre un sustrato - Google Patents

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Abstract

Un método para colocar una molécula diana individual sobre una característica de un sustrato, comprendiendo dicho sustrato una pluralidad de características separadas por regiones intersticiales que carecen de un polinucleótido diana, comprendiendo el método: a. hibridar una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados a una característica sobre un sustrato con al menos un polinucleótido diana bicatenario, comprendiendo dicho polinucleótido diana bicatenario una región diana flanqueada por regiones de unión de primer y segundo cebadores de captura complementarias a dichos primer y segundo cebadores de captura, en los que la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario está unida a una molécula diana, y donde la región de unión del primer cebador de captura de la primera hebra del polinucleótido diana bicatenario es idéntica al primer cebador de captura, la región de unión del segundo cebador de captura de la primera hebra del polinucleótido diana bicatenario es 100% complementaria al segundo cebador de captura, y donde la región de unión del primer cebador de captura de la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario es 100% complementaria al primer cebador de captura, la región de unión del segundo cebador de captura de la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario contiene al menos una diferencia de nucleótidos del segundo cebador de captura de modo que la región de unión del segundo cebador en el polinucleótido diana bicatenario contiene un emparejamiento erróneo de pares de bases y b. amplificar dicho al menos un polinucleótido diana a una tasa de amplificación promedio que excede una tasa de transporte promedio de un polinucleótido diana hacia una característica para producir una pluralidad de amplicones clonales complementarios a dicho polinucleótido diana, donde dicha amplificación comprende una amplificación isotérmica y donde dicha molécula diana comprende un polipéptido, carbohidrato, aminoácido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de colocación molecular individual sobre un sustrato
Campo
La presente descripción se refiere al campo de la biología molecular y más específicamente a composiciones y métodos para colocar moléculas diana individuales sobre un sustrato con patrón.
Antecedentes
La colocación molecular individual tiene aplicaciones útiles en campos como el estudio cinético biomolecular, el descubrimiento de fármacos y la secuenciación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la secuenciación de ADN de una molécula individual se ha logrado colocando una única polimerasa en una guía de ondas que tiene dimensiones nanométricas. La secuenciación de ADN de una molécula individual también se ha logrado utilizando estructuras de nanoporos, que carga una proteína individual formadora de nanoporos en una bicapa lipídica.
Actualmente, la colocación de una molécula individual se logra principalmente mediante el efecto de exclusión por tamaño molecular al limitar el espacio de anclaje al nivel del tamaño de una molécula individual. Este enfoque requiere la utilización de litografía de alta resolución y da como resultado una eficiencia de carga relativamente baja debido a la pequeña área objetivo. La carga de un solo nanoporo en una bicapa lipídica se logra principalmente mediante el control del cambio de corriente iónica durante el proceso de carga, que carece de compatibilidad con la producción a gran escala.
Por tanto, existe la necesidad de un método eficaz para la colocación de una molécula individual en un área objetivo. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.
Jung Yongwon et al en Anal. Chem. Vol. 79, No 17, 1 de septiembre de 2007, páginas 6534-6541, XP009132784, describe un método para la inmovilización de anticuerpos sobre un sustrato. Los métodos para amplificar ácidos nucleicos se describen en los documentos US 2013/0338042 y US 2013/0210008.
Resumen
En la presente memoria se proporcionan, entre otros, sustratos y métodos útiles para colocar una molécula individual en un área objetivo. En un primer aspecto, hay un sustrato que incluye una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados en una característica del sustrato. Al menos un polinucleótido diana, un extremo unido a uno de los cebadores de captura y el otro extremo unido a una molécula diana, donde el polinucleótido diana incluye una región diana flanqueada por las regiones de unión del primer y segundo cebadores de captura complementarias al primer y segundo cebadores de captura, la región de unión del segundo cebador de captura incluye un desajuste de pares de bases con el segundo cebador de captura, y una pluralidad de amplicones clonales complementarios al polinucleótido diana inmovilizado en la característica. En algunas realizaciones, el desajuste de pares de bases es un desajuste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pares de bases. En algunas realizaciones, el desajuste de pares de bases es un desajuste de tres pares de bases.
En algunas realizaciones, el sustrato incluye además una pluralidad de características. En algunas realizaciones, la característica incluye una molécula diana individual. En algunas realizaciones, la característica se completa al máximo con la pluralidad de amplicones clonales. En algunas realizaciones, la pluralidad de características incluye una molécula diana individual. En algunas realizaciones, dos o más de las características incluyen diferentes moléculas diana individuales. En algunas realizaciones, las características se llenan al máximo con la pluralidad de amplicones clonales.
En algunas realizaciones, el polinucleótido diana incluye uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en ARN, ADN y PNA. En algunas realizaciones, el polinucleótido diana incluye ADN bicatenario (dsDNA). En algunas realizaciones, el polinucleótido diana incluye menos de 1000 nucleótidos. En algunas realizaciones, el polinucleótido diana incluye entre 10 a 25, 26 a 50, 51 a 100, 101 a 200, 201 a 300, 301 a 400, 401 a 500, 501 a 600, 601 a 700, 701 a 800, 801 a 900 o 901 a 1000 nucleótidos.
La molécula diana incluye un polipéptido, carbohidrato, aminoácido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico. En algunas realizaciones, la molécula diana incluye un polipéptido. En algunas realizaciones, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un nanoporo, polipéptido de unión y enzima. En algunas realizaciones, el poro del nanoporo se selecciona del grupo que consiste en MspA, OmpF, OmpG, NalP, WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina de ántrax, leucocidinas, canales iónicos, nanoporos de proteínas y nanoporos de origami de ADN.
En algunas realizaciones, el polipéptido de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, un minicuerpo y un anticuerpo de dominio único (sdAB), receptor de células T, microcinas, neuropéptidos, receptores acoplados a proteína G, anticuerpo, receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2. En algunas realizaciones, la enzima se selecciona del grupo que consiste en una recombinasa, polimerasa, helicasa, transposasa, ligasa, desaminasa, oxidasa y quinasa.
En algunas realizaciones, el sustrato incluye uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en vidrio, silicio, plástico y biopolímero. En algunas realizaciones, las características están separadas por regiones intersticiales que carecen de un polinucleótido diana. En algunas realizaciones, las características incluyen una moldura, pocillo, canal, arista, saliente o combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el pocillo es un micropocillo o nanopocillo. En algunas realizaciones, el sustrato incluye además un hidrogel o un gel unido covalentemente.
También se proporcionan en este documento métodos para colocar una molécula diana individual en una característica de un sustrato. El método es un método para colocar una molécula diana individual en una característica de un sustrato mediante la hibridación de una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados a una característica en un sustrato con al menos un polinucleótido diana bicatenario, donde el polinucleótido diana incluye una región diana flanqueada por las regiones de unión al primer y segundo cebadores de captura complementarias al primer y segundo cebadores de captura, donde la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario está unida a una molécula diana, y donde la región de unión del primer cebador de captura de la primera hebra del polinucleótido diana bicatenario es idéntica al primer cebador de captura, la región de unión del segundo cebador de captura de la primera hebra del polinucleótido diana bicatenario es 100% complementaria al segundo cebador de captura, y donde la región de unión del primer cebador de captura de la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario es 100% complementaria al primer cebador de captura, la región de unión del segundo cebador de captura de la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario contiene al menos una diferencia de un nucleótido respecto al segundo cebador de captura de modo que la región de unión del segundo cebador del polinucleótido diana bicatenario incluye un desajuste de pares de bases. El método incluye además amplificar el al menos un polinucleótido diana a una tasa de amplificación promedio que excede una tasa de transporte promedio de un polinucleótido diana a una característica para producir una pluralidad de amplicones clonales complementarios al polinucleótido diana.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el desajuste de pares de bases es un desajuste de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pares de bases. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el desajuste de pares de bases es un desajuste de tres pares de bases. En los métodos descritos en este documento, el sustrato comprende una pluralidad de características separadas por regiones intersticiales que carecen de un polinucleótido diana. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la característica incluye una molécula diana individual. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la característica se llena al máximo con la pluralidad de amplicones clonales. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la pluralidad de características incluye una molécula diana individual. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, dos o más de las características incluyen diferentes moléculas diana individuales. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, las características se llenan al máximo con la pluralidad de amplicones clonales.
En los métodos descritos en el presente documento, la amplificación comprende una amplificación isotérmica. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la amplificación isotérmica incluye además polipéptido de unión monocatenario. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la amplificación isotérmica incluye la amplificación por exclusión cinética. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la amplificación isotérmica incluye además amplificación por exclusión cinética.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la tasa de amplificación promedio de los amplicones posteriores producidos en la característica excede la tasa de amplificación promedio de un primer amplicón. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el polinucleótido diana incluye uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en ARN, ADN y PNA. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, los polinucleótidos diana incluyen ADN bicatenario (dsDNA). En algunas realizaciones, el polinucleótido diana comprende menos de 1000 nucleótidos. En algunas realizaciones de los métodos descritos en este documento, el polinucleótido diana comprende de 10 a 25, 26 a 50, 51 a 100, 101 a 200, 201 a 300, 301 a 400, 401 a 500, 501 a 600, 601 a 700, 701 a 800, 801 a 900 o 901 a 1000 pares de bases de longitud.
En los métodos descritos en el presente documento, la molécula diana incluye un polipéptido, carbohidrato, aminoácido monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la molécula diana incluye un polipéptido. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un nanoporo, un polipéptido de unión y una enzima. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el poro de nanoporos se selecciona del grupo que consiste en MspA, OmpF, OmpG, NalP, WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina de ántrax, leucocidinas y nanoporos de ADN origami. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el polipéptido de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un Fab, un Fab ', un F(ab')2 , un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, un minicuerpo y un anticuerpo de dominio único (sdAB), receptor de células T, microcinas, neuropéptidos, receptores acoplados a proteína G, anticuerpo, receptor de factor de crecimiento epidérmico y HER2.
En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, la enzima se selecciona del grupo que consiste en una recombinasa, polimerasa, helicasa, transposasa, ligasa, desaminasa, oxidasa y quinasa. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el sustrato incluye uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en vidrio, silicio, plástico y biopolímero. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, las características están separadas por regiones intersticiales que carecen de un polinucleótido diana. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, las características incluyen una moldura, pocilio, canal, arista, proyección o combinación de los mismos. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el pocillo es un micropocillo o nanopocillo. En algunas realizaciones de los métodos descritos en el presente documento, el sustrato incluye además un hidrogel o un gel unido covalentemente.
Breve descripción de las Figuras
La Figura 1 ilustra la colocación de una molécula diana individual en cada una de una pluralidad de características usando amplificación de exclusión cinética (KEA) del polinucleótido diana unido a la molécula diana.
La Figura 2 muestra un ejemplo de sustrato.
Las Figuras 3A-D muestran ejemplos de polinucleótidos diana.
La Figura 4 ilustra un diseño de una región de unión a un cebador de captura en un polinucleótido diana que puede emplearse para amplificar la hebra unida a una molécula diana desde una región de unión a un cebador de captura del extremo distal mientras se amplifican exponencialmente los amplicones producidos a partir de la misma.
La Figura 5 muestra un ejemplo de sustrato que comprende al menos dos características.
La Figura 6 ilustra la primera y segunda rondas de amplificación isotérmica usando regiones de cebador de captura no emparejadas en un polinucleótido diana bicatenario.
La Figura 7 muestra un ejemplo de flujo de trabajo para generar un sustrato.
La Figura 8 muestra ejemplos de kits.
La Figura 9 muestra el polinucleótido diana y diseños de región de unión de cebador de captura empleados en una reacción de amplificación por exclusión cinética (KEA) usando regiones de unión del cebador de captura / cebador de captura emparejados y no emparejados.
La Figura 10 muestra los productos de amplicón correspondientes a los polinucleótidos diana ilustrados en la Figura 9.
Descripción detallada
Esta descripción está dirigida a composiciones y métodos para colocar una molécula individual en un área de sustrato seleccionada. La colocación de una molécula individual puede ser útil en una variedad de aplicaciones en las que es deseable determinar una interacción molecular individual en contraposición con una medida promedio entre poblaciones. La colocación de una molécula individual también puede ser útil cuando es deseable usar una molécula individual para interrogar a otra entidad molecular a nivel de molécula individual.
En un ejemplo de realización ilustrada en la Figura 1, esta descripción está dirigida a la colocación de una molécula individual en un área diana de un sustrato usando un ensayo de exclusión cinética (KEA). En esta realización, el área diana de un sustrato se funcionaliza primero con un cebador KEA y la molécula diana se une a un ácido nucleico bicatenario que puede amplificarse rápidamente mediante KEA. Cuando la molécula diana aterriza en el sustrato, el ácido nucleico enlazado se amplifica rápidamente para llenar toda la almohadilla y evitar el aterrizaje de otra molécula diferente. Este método ejemplar está menos restringido de la dimensión crítica (CD) del área objetivo, y el rendimiento de carga será mayor que en los métodos basados en el efecto de exclusión de tamaño. Además, KEA es un proceso autolimitante y, por tanto, compatible con la producción a gran escala.
Tal como se usa en este documento, el término "sustrato" pretende significar un soporte sólido. El término incluye cualquier material que pueda servir como base sólida o semisólida para la creación de características tales como pocillos para la deposición de biopolímeros, incluidos ácidos nucleicos, polipéptidos y/u otros polímeros. Un sustrato de la descripción se modifica, por ejemplo, o se puede modificar para adaptarse a la unión de biopolímeros mediante una variedad de métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Los tipos ejemplares de materiales de sustrato incluyen vidrio, vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos, microesferas, incluidas partículas inertes y/o magnéticas, plásticos, polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice, materiales a base de sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibras ópticas, una variedad de polímeros distintos de los ejemplificados anteriormente y placas de micropocillos de múltiples pocillos. Los tipos específicos de plásticos ejemplares incluyen acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos y Teflon™ (p.ej., politetrafluoroetileno, perfluoroalcoxi, etileno propileno fluorado y derivados de los mismos). Los tipos específicos de materiales ejemplares basados en sílice incluyen silicio y diversas formas de silicio modificado.
En los métodos y composiciones presentados en el presente documento, los polinucleótidos pueden inmovilizarse en un sustrato descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, los polinucleótidos se inmovilizan covalentemente al sustrato. Cuando se hace referencia a la inmovilización de moléculas (p. ej., de ácidos nucleicos) a un sustrato, los términos "inmovilizado" y "unido" se usan indistintamente en el presente documento y ambos términos pretenden abarcar unión directa o indirecta, covalente o no covalente, a menos que se indique lo contrario, ya sea explícitamente o por contexto. En ciertas realizaciones, puede preferirse la unión covalente, pero generalmente todo lo que se requiere es que las moléculas (p.ej., ácidos nucleicos) permanezcan inmovilizadas o unidas al soporte en las condiciones en las que se pretende utilizar el sustrato.
Ciertas realizaciones pueden hacer uso de sustratos que incluyen un sustrato inerte o matriz (p.ej. portaobjetos de vidrio, perlas de polímero, etc.) que se ha funcionalizado, por ejemplo, mediante la aplicación de una capa o revestimiento de un material intermedio que comprende grupos reactivos que permiten la unión covalente a biomoléculas, tal como polinucleótidos. Los ejemplos de tales soportes incluyen, pero no se limitan a, hidrogeles de poliacrilamida soportados sobre un sustrato inerte tal como vidrio, particularmente hidrogeles de poliacrilamida como se describe en los documentos WO 2005/065814 y US 2008/0280773. En tales realizaciones, las biomoléculas (p.ej. polinucleótidos) se pueden unir covalentemente directamente al material intermedio (p.ej. el hidrogel) pero el material intermedio puede estar unido no covalentemente al sustrato o matriz (p.ej. el sustrato de vidrio). Los términos "unión covalente a un soporte sólido" y "unión covalente a un sustrato" se usan indistintamente y deben interpretarse en consecuencia como que abarcan este tipo de disposición.
Los enlaces covalentes ejemplares incluyen, por ejemplo, los que resultan del uso de técnicas de química clic. Los enlaces no covalentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, interacciones no específicas (p.ej. enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, interacciones de van der Waals, etc.) o interacciones específicas (p.ej. interacciones de afinidad, interacciones receptor-ligando, interacciones anticuerpo-epítopo, interacciones avidina-biotina, interacciones estreptavidina-biotina, interacciones lectina-carbohidrato, etc.). Los vínculos ejemplares se establecen en las Patentes de EE.UU. n2 6.737.236; 7.259.258; 7.375.234 y 7.427.678; y en la Publicación de Patente de EE.UU. n2 2011/0059865 A1. Los enlaces covalentes pueden incluir los formados usando química de conjugación, tal como se describe en el presente documento.
Los términos "superficie sólida", "soporte sólido" y otros equivalentes gramaticales en este documento se refieren a cualquier material que sea apropiado o pueda modificarse para que sea apropiado para la unión de los polinucleótidos. Como apreciarán los especialistas en la técnica, el número de posibles sustratos es muy grande. Los posibles sustratos incluyen, entre otros, vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, etc.), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice o materiales a base de sílice que incluyen silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos, plásticos, haces de fibras ópticas y una variedad de otros polímeros. Los soportes sólidos y las superficies sólidas particularmente útiles para algunas realizaciones se encuentran dentro de un aparato de celda de flujo. Las celdas de flujo ejemplares se exponen con más detalle a continuación.
Los especialistas en la técnica sabrán o entenderán que la composición y geometría de un sustrato de la descripción pueden variar dependiendo del uso previsto y de las preferencias del usuario. Por lo tanto, aunque los sustratos planos tales como portaobjetos, chips u obleas se ejemplifican en este documento con referencia a micromatrices a modo de ilustración, dadas las enseñanzas y la orientaciones proporcionadas en este documento, los especialistas en la técnica entenderán que en los métodos y/o composiciones descritos en este documento también se puede utilizar una amplia variedad de otros sustratos ejemplificados aquí o bien conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una o más superficies de una celda de flujo. El término "celda de flujo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una cámara que comprende una superficie sólida a través de la cual pueden fluir uno o más reactivos fluidos. Los ejemplos de células de flujo y sistemas fluídicos relacionados y plataformas de detección que pueden usarse fácilmente en los métodos de la presente descripción se describen, por ejemplo, en Bentley et al, Nature 456: 53-59 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082.
En algunas realizaciones, el soporte sólido o su superficie no es plana, como la superficie interior o exterior de un tubo o recipiente. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende microesferas o perlas. Por "microesferas" o "perlas" o "partículas" o equivalentes gramaticales en el presente documento se entiende pequeñas partículas discretas. Las composiciones de perlas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de óxido de torio, grafito de carbono, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como sefarosa, celulosa, nailon, micelas reticuladas y Teflón, así como cualquier otro material descrito en este documento para soportes sólidos. El documento "Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers Ind. es una guía útil. En determinadas realizaciones, las microesferas son microesferas o perlas magnéticas. Las perlas no necesitan ser esféricas; se pueden utilizar partículas irregulares. Alternativa o adicionalmente, las perlas pueden ser porosas. Los tamaños de las perlas van desde nanómetros, es decir 100 nm, a milímetros, es decir 1 mm, prefiriéndose perlas desde aproximadamente 0,2 micrómetros hasta aproximadamente 200 micrómetros, y siendo particularmente preferidas desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 micrómetros, aunque en algunas realizaciones se pueden usar perlas más pequeñas o más grandes.
En algunas realizaciones, el soporte sólido incluye una superficie estampada. Una "superficie estampada" se refiere a una disposición de diferentes regiones en o sobre una capa expuesta de un soporte sólido. Por ejemplo, una o más de las regiones pueden ser una característica en la que están presentes uno o más cebadores de amplificación. Las características pueden estar separadas por regiones intersticiales donde no están presentes cebadores de amplificación. En algunas realizaciones, el patrón puede tener un formato x-y de características que están en filas y columnas. En algunas realizaciones, el patrón puede ser una disposición repetida de características y/o regiones intersticiales. En algunas realizaciones, el patrón puede ser una disposición aleatoria de características y/o regiones intersticiales. Las superficies modeladas ejemplares que se pueden usar en los métodos y composiciones establecidos en este documento se describen en el documento US 2013/0116153 o en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n22012/0316086 A1.
En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una serie de pocillos o depresiones en una superficie. Esto se puede fabricar del modo conocido generalmente en la técnica usando una variedad de técnicas, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitografía, técnicas de estampación, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los especialistas en la técnica, la técnica utilizada dependerá de la composición y de la forma del sustrato de la matriz.
Las características en una superficie modelada pueden ser pocillos en una matriz de pocillos (p.ej., micropocillos o nanopocillos) sobre vidrio, silicio, plástico u otros soportes sólidos adecuados con un patrón de gel enlazado covalentemente, como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM, véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. n° 61/753.833). El proceso crea almohadillas de gel que se utilizan para la secuenciación que pueden ser estables en ciclos de secuenciación con una gran cantidad de ciclos. La unión covalente del polímero a los pocillos es útil para mantener el gel en las características estructuradas a lo largo de la vida útil del sustrato estructurado durante una variedad de usos. Sin embargo, en muchas realizaciones, no es necesario que el gel esté unido covalentemente a los pocillos. Por ejemplo, en algunas condiciones, se puede utilizar como material de gel acrilamida sin silano (SFA, ver, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2011/0059865 A1) que no está unido covalentemente a ninguna parte del sustrato estructurado.
En realizaciones particulares, se puede fabricar un sustrato estructurado modelando un material de soporte sólido con pocillos (p.ej. micropocillos o nanopocillos), recubriendo el soporte estampado con un material de gel (p.ej., PAZAM, SFA o variantes modificadas químicamente de los mismos, como la versión azidolizada de SFA (azido-SFA)) y puliendo el soporte recubierto de gel, por ejemplo mediante pulido químico o mecánico, reteniendo así el gel en los pocillos pero eliminando o inactivando sustancialmente todo el gel de las regiones intersticiales en la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. Los ácidos nucleicos cebadores se pueden unir al material de gel. A continuación, se puede poner en contacto una disolución de polinucleótidos diana (p.ej., un genoma humano fragmentado) con el sustrato pulido, de manera que los polinucleótidos diana individuales sembrarán pocillos individuales mediante interacciones con los cebadores unidos al material de gel; sin embargo, los polinucleótidos diana no ocuparán las regiones intersticiales debido a la ausencia o inactividad del material de gel. La amplificación de los polinucleótidos diana se limitará a los pocillos, ya que la ausencia o inactividad del gel en las regiones intersticiales evita la migración hacia el exterior de la colonia de ácidos nucleicos en crecimiento. El proceso se puede fabricar convenientemente, es escalable y utilizando métodos convencionales de micro o nanofabricación.
Un sustrato modelado puede incluir, por ejemplo, pocillos grabados en un portaobjetos o chip. El patrón de los grabados y la geometría de los pocillos puede adoptar una variedad de formas y tamaños diferentes siempre que dichas características sean física o funcionalmente separables entre sí. Los sustratos particularmente útiles que tienen tales características estructurales son sustratos modelados que pueden seleccionar el tamaño de las partículas de soporte sólido tales como microesferas. Un sustrato modelado ejemplar que tiene estas características es el sustrato grabado usado en relación con la tecnología BeadArray (Illumina, Inc., San Diego, CA). En la Patente de EE.UU. n° 6.770.441 se describen más ejemplos.
Una matriz se refiere a una población de sitios que se pueden diferenciar entre sí según la ubicación relativa. Las diferentes moléculas que se encuentran en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una molécula individual de polinucleótido diana que tiene una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia (y/o secuencia complementaria, de la misma). Los sitios de una matriz pueden ser características diferentes ubicadas en el mismo sustrato. Las características ejemplares incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, perlas (u otras partículas) en o sobre un sustrato, proyecciones de un sustrato, crestas en un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser sustratos separados, cada uno con una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a sustratos separados según las ubicaciones de los sustratos en una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Las matrices ejemplares en las que se ubican sustratos separados en una superficie incluyen, sin limitación, aquellas que tienen perlas en los pocillos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "microesferas" o "perlas" o "partículas" o equivalentes gramaticales en el presente documento se refiere a pequeñas partículas discretas. Las composiciones de perlas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de óxido de torio, grafito de carbono, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como sefarosa, celulosa, nailon, micelas reticuladas y teflón, así como cualquier otro material descrito en el presente documento para soportes sólidos. El documento "Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers Ind. es una guía útil. En determinadas realizaciones, las microesferas son microesferas o perlas magnéticas.
Tal como se usa en este documento, el término "pluralidad" pretende significar una población de dos o más miembros diferentes. Las pluralidades pueden variar en tamaño desde pequeñas, medianas, grandes o muy grandes. El tamaño de una pequeña pluralidad puede variar, por ejemplo, desde unos pocos miembros hasta decenas de miembros. Las pluralidades de tamaño medio pueden variar, por ejemplo, desde decenas de miembros hasta aproximadamente 100 miembros o cientos de miembros. Las grandes pluralidades pueden variar, por ejemplo, desde unos cientos de miembros hasta unos 1000 miembros, miles de miembros y hasta decenas de miles de miembros. Las pluralidades muy grandes pueden variar, por ejemplo, desde decenas de miles de miembros hasta alrededor de cientos de miles, un millón, millones, decenas de millones y hasta, o más, de cientos de millones de miembros. Por lo tanto, una pluralidad puede variar en tamaño de dos a más de cien millones de miembros, así como todos los tamaños, medidos por el número de miembros, en los rangos ejemplares anteriores, y mayores que ellos. Un número ejemplar de características dentro de una micromatriz incluye una pluralidad de aproximadamente 500.000 o más características discretas en 1,28 cm2. Los ejemplos de pluralidades de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, poblaciones de aproximadamente 1 x 105, 5 x 105 y 1 x 106 o más especies de ácido nucleico diferentes. Por consiguiente, se pretende que la definición del término incluya todos los valores enteros mayores de dos. Se puede establecer un límite superior de una pluralidad de la invención, por ejemplo, mediante la diversidad teórica de secuencias de nucleótidos en una muestra de ácido nucleico de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, el término "inmovilizado" cuando se usa en referencia a un polinucleótido pretende significar unión directa o indirecta a un soporte sólido mediante enlace(s) covalente(s) o no covalente(s). En ciertas realizaciones de la invención, se puede usar unión covalente, pero todo lo que se requiere es que los polinucleótidos permanezcan estacionarios o unidos a un soporte en las condiciones en las que se pretende usar el soporte, por ejemplo, en aplicaciones que requieren amplificación y/o secuenciación de ácidos nucleicos. Los oligonucleótidos que se utilizarán como cebadores de captura o cebadores de amplificación pueden inmovilizarse de manera que esté disponible un extremo 3' para la extensión enzimática y al menos una parte de la secuencia sea capaz de hibridarse con una secuencia complementaria. La inmovilización puede ocurrir mediante hibridación con un oligonucleótido unido a la superficie, en cuyo caso el oligonucleótido o polinucleótido inmovilizado puede estar en la orientación 3'-5'. Alternativamente, la inmovilización puede producirse por medios distintos de la hibridación por emparejamiento de bases, como la unión covalente expuesta anteriormente.
Tal como se usa en este documento, el término "polinucleótido" pretende significar un ácido ribonucleico o desoxirribonucleico o análogo del mismo, incluyendo un analito polinucleótido presentado en cualquier contexto; por ejemplo, una sonda, diana o cebador. Las formas particulares de polinucleótidos de la invención incluyen todos los tipos de ácidos nucleicos que se encuentran en un organismo, así como ácidos nucleicos sintéticos tales como polinucleótidos producidos por síntesis química. Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos que son aplicables para el análisis mediante la incorporación en micromatrices producidos por los métodos de la invención incluyen ADN genómico (ADNg), ARN mensajero copiado de ADN (ADNc), ARN mensajero copiado de ARN (ARNc), ADN o genoma mitocondrial, ARN, ARN mensajero (ARNm) y/u otras poblaciones de ARN. Ejemplos adicionales de polinucleótidos incluyen ADN bicatenario (dsDNA), ADN monocatenario (ssDNA), un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, etiqueta de secuencia expresada (EST) o etiqueta de análisis en serie de la expresión de genes (SAGE)), ADN genómico, exón, intrón, ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ribozima, polinucleótido recombinante, polinucleótido sintético, polinucleótido ramificado, plásmido, vector, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia o copia amplificada de cualquiera de los anteriores. Los fragmentos y/o porciones de los ácidos nucleicos ejemplares anteriores también se incluyen dentro del significado del término como se usa en este documento.
Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente en el presente documento. Los diferentes términos no pretenden indicar ninguna diferencia particular de tamaño, secuencia u otra propiedad a menos que se indique específicamente lo contrario. Para mayor claridad en la descripción, los términos se pueden usar para distinguir una especie de ácido nucleico de otra cuando se describe un método o composición particular que incluye varias especies de ácido nucleico.
Tal como se usa en este documento, el término "bicatenario", cuando se usa en referencia a un polinucleótido, significa que algunos o todos los nucleótidos entre las cadenas complementarias de un polinucleótido están unidos por enlaces de hidrógeno para formar una doble hélice parcial o completa. Un polinucleótido parcialmente bicatenario puede tener al menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de sus nucleótidos unidos con enlaces de hidrógeno a un nucleótido complementario.
Un polinucleótido monocatenario se refiere a un polinucleótido que tiene pocos o ninguno enlaces de hidrógeno con otro polinucleótido, de modo que no se forma una doble hélice o es inestable en un conjunto dado de condiciones de hibridación.
Tal como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido diana" pretende significar un polinucleótido que es objeto de un análisis, acción, interrogación o uso. El análisis, la acción o la interrogación incluyen someter el polinucleótido diana a, por ejemplo, copia, amplificación, secuenciación y/u otro procedimiento para la interrogación de ácidos nucleicos. El análisis o uso también puede incluir emplear el polinucleótido diana como un componente en un sistema para analizar, realizar una acción o interrogar a otras entidades moleculares. El componente puede ser estructural o funcional. Un polinucleótido diana puede incluir secuencias de nucleótidos adicionales a la secuencia diana que se va a analizar o usar. Por ejemplo, un polinucleótido diana puede incluir uno o más adaptadores, incluido un adaptador que funciona como un sitio de unión del cebador, que flanquea una secuencia de polinucleótido diana que se va a analizar o usar en un sistema. Un polinucleótido diana hibridado con un oligonucleótido de captura o cebador de captura puede contener nucleótidos que se extienden más allá del extremo 5 'o 3' del oligonucleótido de captura, de tal manera que no todo el polinucleótido diana es susceptible de extensión. En realizaciones particulares, como se expone con más detalle a continuación, una pluralidad de polinucleótidos diana incluye diferentes especies que difieren en sus secuencias de polinucleótidos diana, pero tienen adaptadores que son los mismos para dos o más de las diferentes especies. Los dos adaptadores que pueden flanquear una secuencia de polinucleótidos diana particular pueden tener la misma secuencia o los dos adaptadores pueden tener secuencias diferentes. Por consiguiente, una pluralidad de polinucleótidos diana diferentes pueden tener la misma secuencia adaptadora o dos secuencias adaptadoras diferentes en cada extremo de la secuencia de polinucleótido diana. Por tanto, las especies en una pluralidad de polinucleótidos diana pueden incluir regiones de secuencia conocida que flanquean regiones de secuencia desconocida que deben evaluarse, por ejemplo, mediante secuenciación. Además, una pluralidad de polinucleótidos diana puede ser de la misma especie o especies diferentes y pueden incluir regiones de secuencia conocida que flanquean regiones de secuencia conocida que se van a emplear como componente en un sistema. En los casos en los que los polinucleótidos diana llevan un adaptador en un solo extremo, el adaptador puede ubicarse en el extremo 3' o en el extremo 5' del polinucleótido diana. Los polinucleótidos diana se pueden usar sin ningún adaptador, en cuyo caso una secuencia de unión del cebador puede provenir directamente de una secuencia que se encuentra en el polinucleótido diana.
Tal como se usa en este documento, el término "molécula diana" pretende significar cualquier molécula que sea objeto de un análisis, acción, interrogación o uso. El análisis, acción o interrogación incluye someter la molécula a, por ejemplo, secuenciación, determinaciones de unión, medidas de afinidad, medidas catalíticas, especificidad de sustrato o producto y otras determinaciones moleculares. El análisis o uso también puede incluir el empleo de la molécula diana como un componente en un sistema para analizar, realizar una acción o interrogar a otras entidades moleculares. El componente puede ser estructural o funcional. Por ejemplo, una molécula diana puede ser un nanoporo utilizado en la secuenciación de nanoporos de ácidos nucleicos. Otras moléculas diana aplicables en la secuenciación de nanoporos incluyen, por ejemplo, helicasas y polimerasas. Otros análisis o usos ejemplares de una molécula diana incluyen, por ejemplo, cribado por afinidad de unión molecular, cribado de enzimas, cribado de compuestos y todos los demás ensayos en los que es deseable determinar o medir una interacción molecular. Por tanto, una molécula diana puede ser objeto de un análisis, acción o interrogación o puede utilizarse para analizar, realizar una acción o interrogar a otras moléculas. Las moléculas diana ejemplares incluyen, por ejemplo, un biopolímero que incluye un polipéptido, polinucleótido o polisacárido, aminoácido, nucleótido, monosacárido, disacárido, otro carbohidrato, receptor, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico, vitamina, metabolito, antioxidante, inmunosupresor, fármaco contra el cáncer o cualquier combinación de los mismos.
Adicionalmente, debe apreciarse que una molécula diana se puede unir a un polipéptido (polipéptido diana) de varias formas. Por ejemplo, la molécula diana se puede unir usando técnicas de química de conjugación conocidas en la técnica y descritas en el presente documento. Las clases favorables de química de conjugación incluyen reacciones químicas que se desarrollan en condiciones relativamente suaves. Éstas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones nucleofílicas (p.ej., reacciones de aminas y alcoholes con haluros de acilo, ésteres activos), sustituciones electrofílicas (p.ej., reacciones de enamina) y adiciones a enlaces múltiples carbono-carbono y carbono-heteroátomo (p.ej., reacción de Michael, adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se analizan, por ejemplo, en March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3ra Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney et al., MODiFiCATION OF PRo T e INS; Advances in Chemistry Series, vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.
Los ejemplos de grupos funcionales reactivos útiles en técnicas de química de conjugación incluyen grupos carboxilo (p.ej., ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenztriazol, haluros de ácido, acil imidazoles, tioésteres, ésteres de p-nitrofenilo, ésteres de alquilo, alquenilo, alquinilo y aromáticos); grupos hidroxilo (es decir, convertidos en, por ejemplo, ésteres, éteres o aldehídos); haloalquilos; los dienófilos (p.ej., reacciones de Diels-Alder); grupos aldehído; grupos cetona; grupos sulfonilo; grupos amina; alquenos (es decir, cicloadiciones y adiciones de Michael); epóxidos; grupos fosforamidita; grupos fosfina; grupos azida (es decir, para química clic); y grupos tiol. Dichos grupos reactivos se pueden funcionalizar en una molécula diana o un polipéptido.
En una realización ilustrativa, el grupo tiol reducido (-SH) (es decir, un grupo sulfhidrilo) de un residuo de cisteína se puede hacer reaccionar con una ligando que tiene un grupo reactivo con tiol. Los ejemplos de tales grupos incluyen maleimida y yodoacetamida. Los reactivos primarios que reaccionan con tiol, que incluyen yodoacetamidas, maleimidas, haluros bencílicos y bromometilcetonas, pueden reaccionar mediante S-alquilación de tioles para generar productos de tioéter estables; los reactivos de arilación como los haluros de 7-nitrobenz-2,1,3-oxadiazol (NBD) pueden reaccionar con tioles o aminas mediante una sustitución similar del haluro aromático por el nucleófilo; y debido a que el anión tiolato es un mejor nucleófilo que el tiol neutro, la cisteína es más reactiva por encima de su pKa. Los grupos químicos reactivos con sulfhidrilo adicionales incluyen haloacetilo, maleimidas, aziridinas, acriloilo, agentes arilantes, vinilsulfonas, disulfuros de piridilo, tioles TNB (ácido 2-nitro-5-tiobenzoico) y agentes reductores de disulfuro. Dichos grupos pueden conjugarse con sulfhidrilos mediante alquilación (p.ej., a través de la formación de un enlace tioéter) o intercambio de disulfuro (p.ej., formación de un enlace disulfuro). También pueden usarse adecuadamente reacciones de intercambio de sulfhidrilo.
Alternativamente, las aminas (-NH2) pueden usarse como dianas. Por ejemplo, la amina primaria del residuo de lisina y el extremo N del polipéptido son relativamente reactivos. Los residuos de amina se pueden atacar con ésteres de N-hidroxisuccinimida (ésteres de NHS), que pueden formar un enlace amida estable, o con reticuladores de imidoéster, que pueden reaccionar con aminas primarias para formar enlaces amidina. Hay muchos otros compuestos reactivos con amina. Por ejemplo, los grupos químicos sintéticos que pueden formar enlaces químicos con aminas primarias incluyen isotiocianatos, isocianatos, acilazidas, ésteres NHS, cloruros de sulfonilo, aldehídos, glioxales, epóxidos, oxiranos, carbonatos, haluros de arilo, imidoésteres, carbodiimidas, anhídridos y ésteres de fluorofenilo; dichos grupos pueden conjugarse con aminas, por ejemplo, mediante acilación o alquilación.
En otras realizaciones adicional, se puede usar una molécula diana modificada para introducir una nueva funcionalidad como una azida o un alquino para uso con química clic. Por ejemplo, reactividades de tiol o amina como las descritas anteriormente se pueden usar con ligandos que permiten la adición de funcionalidades azida o alquino para usarse adicionalmente en una reacción de química clic.
La capacidad de crear una matriz de moléculas individuales espaciadas en una superficie con patrón incluye una serie de características y aplicaciones para productos químicos y biosensores. Una característica de las matrices de molécula individual incluye la optimización de la densidad de empaquetamiento, sujeto a la restricción de detección. La detección se puede realizar mediante detección óptica estándar. Para la detección óptica estándar, el espaciado intermolecular puede ser de aproximadamente de 500 nm (p.ej., el orden de la longitud de onda de la luz de detección). La detección se puede realizar utilizando una lectura electrónica como, por ejemplo, una lectura electrónica en un chip CMOS.
El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 9 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 7 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 6 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 1 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 2 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 3 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 4 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 5 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 6 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 7 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 8 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 9 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 10 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 11 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 12 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 13 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 14 pm de tamaño. El espaciado de las moléculas individuales para la lectura electrónica (p.ej., en un chip CMOS) puede ser tal que una molécula individual ocupe aproximadamente 15 pm de tamaño. En las realizaciones, una molécula individual ocupa aproximadamente un solo píxel (p.ej., 1-10 pm de tamaño).
Los sensores de molécula individual se pueden usar en una amplia variedad de aplicaciones que incluyen, pero no se limitan a, secuenciación de ADN, detección química y ensayos de proteína/antígeno usando anticuerpos, etc. En realizaciones, una molécula individual de polimerasa puede usarse en secuencias de ADN para secuenciar ADN en tiempo real. En otras realizaciones, se puede usar la secuenciación de ADN basada en nanoporos cuando la colocación de un solo nanoporo en la bicapa es útil para generar datos interpretables.
Tal como se usa en este documento, el término "amplicón", cuando se usa en referencia a un ácido nucleico, pretende significar el producto de copiar el ácido nucleico, en el que el producto tiene una secuencia de nucleótidos que es igual o complementaria a al menos una porción de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico copiado. Un amplicón se puede producir mediante cualquiera de una variedad de métodos de amplificación que usan el ácido nucleico, o un amplicón del mismo, como plantilla, que incluyen, por ejemplo, amplificación de polimerasa de recombinasa, amplificación de exclusión cinética, extensión de polimerasa, reacción en cadena de polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), extensión de ligadura o reacción en cadena de ligadura. Un amplicón puede ser una molécula de ácido nucleico que tiene una sola copia de una secuencia de nucleótidos particular (p.ej. un producto de PCR) o múltiples copias de la secuencia de nucleótidos (p.ej. un producto concatamérico de RCA). Un primer amplicón de un ácido nucleico diana puede ser una copia complementaria. Los amplicones posteriores son copias que se crean, después de la generación del primer amplicón, a partir del polinucleótido diana o del primer amplicón. Un amplicón posterior puede tener una secuencia que sea sustancialmente complementaria al polinucleótido diana o sustancialmente idéntica al polinucleótido diana.
El número de copias de plantilla o amplicones que se pueden producir puede modularse mediante la modificación apropiada de la reacción de amplificación, que incluye, por ejemplo, variar el número de ciclos de amplificación ejecutados, usar polimerasas de capacidad de procesado variable en la reacción de amplificación y/o variar la duración de tiempo en el que se realiza la reacción de amplificación, así como modificando otras condiciones conocidas en la técnica que influyen en el rendimiento de la amplificación. El número de copias de una plantilla de ácido nucleico puede ser de al menos 1, 10, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 y 10.000 copias, y se puede variar en función de la aplicación particular.
El término "clonal" cuando se usa en referencia a amplicones o una pluralidad de amplicones pretende significar una población de ácidos nucleicos que es homogénea con respecto a una secuencia de nucleótidos particular. La secuencia homogénea puede tener al menos 10 nucleótidos de longitud, o más, por ejemplo, al menos 50, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos de longitud. Una población clonal puede derivarse de un único polinucleótido diana o ácido nucleico plantilla. Esencialmente, todos los ácidos nucleicos de una población clonal tienen la misma secuencia de nucleótidos. Se entenderá que puede ocurrir un pequeño número de mutaciones (p.ej. debido a artefactos de amplificación) en una población clonal sin apartarse de la clonalidad.
Tal como se usa en este documento, el término "cebador de captura" pretende significar un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse específicamente a una secuencia de polinucleótidos monocatenaria para ser analizada o sometida a una interrogación de ácido nucleico en las condiciones encontradas en una etapa de hibridación del cebador, por ejemplo, de una reacción de secuenciación o amplificación. El término también pretende significar un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridarse específicamente con una secuencia de polinucleótidos monocatenaria que se usa para analizar, interrogar o realizar una acción sobre otra entidad molecular.
Tal como se usa en este documento, el término "específico de diana" cuando se usa en referencia a un cebador de captura u otro oligonucleótido pretende significar un cebador de captura u otro oligonucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos específica para una secuencia de polinucleótidos diana, es decir, una secuencia de nucleótidos capaz de hibridación selectiva con una región de identificación de un polinucleótido diana. Los cebadores de captura específicos de diana pueden tener una especie individual de oligonucleótido o pueden incluir dos o más especies con diferentes secuencias. Por tanto, los cebadores de captura específicos de diana pueden ser dos o más secuencias, que incluyen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más secuencias diferentes. Los oligonucleótidos de captura específicos de diana pueden incluir una secuencia de cebador de captura específica de diana y una secuencia de cebador de captura universal. Otras secuencias tales como secuencias de cebadores de secuenciación y similares también pueden incluirse en un cebador de captura específico de diana.
En comparación, el término "universal" cuando se usa en referencia a un cebador de captura u otra secuencia de oligonucleótidos pretende significar un cebador de captura u otro oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos común entre una pluralidad de cebadores de captura. Una secuencia común puede ser, por ejemplo, una secuencia complementaria a la misma secuencia adaptadora. Los cebadores de captura universales son aplicables para interrogar una pluralidad de polinucleótidos diferentes sin distinguir necesariamente las diferentes especies, mientras que los cebadores de captura específicos de diana son aplicables para distinguir las diferentes especies.
La descripción proporciona un sustrato que incluye: (a) una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados en una característica de un sustrato; (b) al menos un polinucleótido diana, un extremo unido a uno de los cebadores de captura y el otro extremo unido a una molécula diana, en el que el polinucleótido diana comprende una región diana flanqueada por regiones de unión del primer y segundo cebadores de captura complementarias al primer y segundo cebadores de captura, incluyendo la región de unión del segundo cebador de captura un desajuste de pares de bases con el segundo cebador de captura, y (c) una pluralidad de amplicones clonales complementarios al polinucleótido diana inmovilizado en la característica.
En una realización, un sustrato de la descripción puede contener al menos una molécula diana individual localizada en un sitio sobre un sustrato. En realizaciones para su uso en análisis y/o interrogaciones moleculares individuales, un sustrato de la descripción tendrá una molécula diana individual localizada en un sitio sobre un sustrato. Las moléculas diana individuales pueden localizarse en uno o más sitios en un sustrato usando, por ejemplo, los métodos y componentes moleculares descritos en este documento.
Los sustratos para localizar una molécula diana individual pueden incluir aquellos materiales y formatos descritos anteriormente, así como otros materiales y formatos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un sustrato puede ser cualquier soporte sólido insoluble, soporte semisólido o matriz a la que se pueda unir una biomolécula, incluyendo, por ejemplo, un polinucleótido. Los soportes sólidos ejemplares incluyen placas de vidrio, vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos, microesferas (p.ej. partículas inertes y/o magnéticas), plásticos, polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice, materiales a base de sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibra óptica, polímeros y de multipocillo (p.ej. placas de microtitulación). Los plásticos ejemplares incluyen acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos y Teflon™. Los materiales a base de sílice ejemplares incluyen silicio, incluidas las obleas de silicio, y diversas formas de silicio modificado. Otros soportes sólidos aplicables para su uso como sustrato incluyen, por ejemplo, perlas de látex, perlas de dextrano, gel de poliacrilamida, superficies de oro, superficies de nitruro de silicio o superficies de óxido metálico.
En algunas realizaciones, la superficie puede tener cualquier forma deseable, incluyendo, por ejemplo, material plano, esférico o poroso adecuado para una colocación molecular individual como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser una superficie de vidrio plana.
En realizaciones particulares, un sustrato puede estar dentro o formar parte de un recipiente tal como un pocillo, tubo, canal, cubeta, placa de Petri, botella o similar para permitir la interacción con disoluciones de varios reactivos. Un recipiente particularmente útil es una celda de flujo, por ejemplo, como se describe en el documento US 2010/01 11768 A1 o en Bentley et al, Nature 456: 53-59 (2008). Las celdas de flujo ejemplares incluyen aquellas que están disponibles comercialmente en Illumina, Inc. (San Diego, CA). Otro recipiente particularmente útil es un pocillo en una placa de micropocillos o placa de microtitulación.
En algunas realizaciones, el sitio sobre un sustrato para la localización de al menos una molécula diana puede ser una característica. Como se ha descrito anteriormente y como se describirá más adelante, las características pueden estar presentes en cualquiera de una variedad de formatos deseados. Por ejemplo, una característica puede ser un pocillo, foso, canal, cresta, región elevada, clavija, poste o similar. Como se ejemplificó anteriormente, la característica puede ser una perla o puede contener una perla.
En realizaciones particulares, una característica no necesita contener una perla o partícula. Las características ejemplares incluyen pocillos que están presentes en sustratos utilizados, por ejemplo, en plataformas de secuenciación comerciales vendidas por 454 LifeSciences (una subsidiaria de Roche, Basilea, Suiza) o Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad, California). Otros sustratos que tienen pocillos incluyen, por ejemplo, fibras ópticas grabadas y otros sustratos descritos en las Patentes de EE.UU. n° 6.266.459; 6.355.431; 6.770.441; 6.859.570; 6.210.891; 6.258.568; 6.274.320; los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; US 2010/0282617 A1 o la Publicación de Patente Internacional PCT n2 WO 00/63437. En varios casos, los sustratos se ejemplifican en estas referencias para aplicaciones que utilizan una perla en el pocillo. Los sustratos que contienen pocillos se pueden usar con o sin perlas en las composiciones de la presente descripción.
En algunas realizaciones, los pocillos de un sustrato pueden incluir material de gel como se establece en la Solicitud Provisional de EE.UU. n° 61/769.289.
En una realización, una característica puede ser una característica metálica sobre una superficie no metálica, como vidrio, plástico u otros materiales ejemplificados anteriormente. Se puede depositar una capa de metal sobre una superficie usando métodos conocidos en la técnica tales como grabado con plasma húmedo, grabado con plasma seco, deposición de capa atómica, grabado con haz de iones, deposición de vapor químico, pulverización catódica al vacío o similares. Se puede usar cualquiera de una variedad de instrumentos comerciales según sea apropiado, incluidos, por ejemplo, los sistemas FlexAL®, OpAL®, Ionfab 300plus® u Optofab 3000® (Oxford Instruments, Reino Unido). Una capa de metal también se puede depositar por evaporación o pulverización catódica con haz de electrones como se establece en Thornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7: 239-60 (1977). Las técnicas de deposición de capas metálicas, como las ejemplificadas anteriormente, se pueden combinar, por ejemplo, con técnicas de fotolitografía para crear regiones o parches metálicos en una superficie. Los métodos ejemplares para combinar técnicas de deposición de capas metálicas y técnicas de fotolitografía se describen en el documento US 2012/0316086.
Un sustrato de la descripción puede tener un primer y un segundo cebadores de captura inmovilizados en una característica del sustrato. El primer y segundo cebadores de captura pueden ser una pluralidad de primeros cebadores de captura y una pluralidad de segundos cebadores de captura. En algunas realizaciones, el primer y segundo cebadores de captura se pueden dirigir a diferentes secuencias de un polinucleótido diana y, por lo tanto, exhiben especificidad para diferentes regiones del polinucleótido diana. En otras realizaciones, el primer y segundo cebadores de captura pueden dirigirse a diferentes polinucleótidos diana.
En la Figura 2 se muestra un ejemplo de sustrato. Tal como se muestra en la Figura 2, un sustrato (201) puede contener una pluralidad de primeros cebadores de captura (202, 203, 204) y una pluralidad de segundos cebadores de captura (205, 206, 207). El sustrato (201) puede comprender además un polinucleótido diana (208) que se adjunta en un extremo a un cebador de captura (202). El sustrato (201) puede comprender además amplicones (210, 211, 212, 213, y 214) del polinucleótido diana (208). Además, el sustrato (201) puede comprender una molécula diana (209) que está unido al polinucleótido diana (208).
En una realización, la descripción proporciona un sustrato que comprende una primera característica, en la que la primera característica comprende (a) una pluralidad de primeros cebadores de captura; (b) una pluralidad de segundos cebadores de captura; y (c) un polinucleótido diana, en el que: (i) el polinucleótido diana es bicatenario; (ii) el polinucleótido diana comprende una región de unión del segundo cebador de captura; (iii) la región de unión del segundo cebador de captura comprende al menos un emparejamiento incorrecto de nucleótidos; y (iv) una hebra de la región de unión del segundo cebador de captura es un complemento inverso del segundo cebador de captura y la otra hebra de la región de unión del segundo cebador de captura es menos idéntica en menos del 100% al segundo cebador de captura. La región de unión del segundo cebador de captura puede contener dos o más emparejamientos erróneos de nucleótidos. La región de unión del segundo cebador de captura puede contener tres o más emparejamientos erróneos de nucleótidos. La región de unión del segundo cebador de captura puede contener cuatro o más desajustes de nucleótidos. El polinucleótido diana puede comprender además una o más regiones de unión a cebadores de captura adicionales. El polinucleótido diana puede comprender además una región de unión del primer cebador de captura que puede hibridarse con el primer cebador de captura. La región de unión del primer cebador de captura puede hibridarse con el primer cebador de captura con un 100% de complementariedad. Por ejemplo, la región de unión del primer cebador de captura puede contener una coincidencia de nucleótidos del 100% con el primer cebador de captura. La primera característica puede comprender además una pluralidad de amplicones. La pluralidad de amplicones puede comprender amplicones del polinucleótido diana. La primera característica puede comprender además una molécula diana. La molécula diana se puede unir al polinucleótido diana. La primera característica puede comprender además una o más moléculas diana adicionales. La una o más moléculas diana adicionales se pueden suspender en un cebador de captura, polinucleótido diana o amplicón dentro de la característica. Alternativamente, o adicionalmente, la una o más moléculas diana adicionales no están unidas o fijadas a la característica. Las una o más moléculas diana adicionales pueden estar en disolución dentro de la característica. El sustrato puede comprender además una o más características adicionales. La una o más características adicionales pueden comprender una pluralidad de primeros cebadores de captura, una pluralidad de segundos cebadores de captura, polinucleótido diana, molécula diana, pluralidad de amplicones o una combinación de los mismos.
Pueden estar presentes dos o más cebadores de captura en una característica en cualquier proporción. Por ejemplo, una pluralidad de primeros cebadores de captura y una pluralidad de segundos cebadores de captura pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales o en cualquier otra proporción, por ejemplo, en proporción molar. Una característica puede tener un valor mayor que 1,1x, mayor que 1,2x, mayor que 1,3x, mayor que 1,4x, mayor que 1,5x, mayor que 2,0x, mayor que 2,5x, mayor que 3,0x, mayor que 5,0x, mayor que 10x, mayor que 15x, mayor que 20x, mayor que 20x, mayor que 25x, mayor que 30x, mayor que 50x, mayor que 100x, mayor que 300x, mayor que 500x o mayor que 1.000x en exceso de un primer cebador de captura sobre un segundo cebador de captura. En realizaciones que usan una pluralidad de características tales como, por ejemplo, en una micromatriz, las diferentes características pueden tener la misma proporción de los dos o más cebadores de captura o una proporción diferente.
Un cebador de captura puede incluir una o más regiones de captura. Una región de cebador de captura puede incluir, por ejemplo, una región de captura universal, un sitio de unión del cebador de secuenciación (SBS), una región de captura específica de la diana, un sitio de escisión predeterminado, tal como un sitio de restricción, y una región enlazadora, por ejemplo, una región enlazadora que separa dos o más regiones del cebador de captura. Algunos cebadores de captura pueden incluir, por ejemplo, una región de captura universal y un SBS. Otros cebadores de captura pueden incluir una región de captura universal y una región de captura específica de diana. Otros cebadores de captura más pueden incluir, por ejemplo, una región de captura universal, un SBS y una región específica de diana. Un cebador de captura se puede bloquear en el extremo 3' (bloqueado en 3') o desbloquear en el extremo 3' (desbloqueado en 3'). Un cebador con un extremo 3' bloqueado puede, por ejemplo, desbloquearse en una reacción enzimática o química. Un cebador de captura también puede incluir un sitio de escisión predeterminado (no aleatorio). Se describen ejemplos de sitios de escisión predeterminados, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. n° 8.715.966 B2. La escisión en sitios predeterminados puede ocurrir, por ejemplo, como escisión enzimática o como escisión no enzimática, tal como escisión química usando métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Dadas las enseñanzas y las orientaciones proporcionadas en este documento, los especialistas en la técnica comprenderán que un cebador de captura puede contener cualquier número de regiones diferentes que son útiles en una o más aplicaciones.
Una región de captura universal puede ser cualquier secuencia de nucleótidos conocida o predeterminada que se incluya como una secuencia común entre una pluralidad de cebadores de captura. Generalmente, una región de captura universal será suficientemente larga para tener una secuencia de nucleótidos individual entre una población de secuencias diversas, como el número de secuencias de nucleótidos diferentes contenidas en un genoma. Los especialistas en la técnica comprenderán qué longitud de una región de captura universal es suficiente para ser individual dada la diversidad de secuencias de una población objetivo.
Una región de captura universal puede diseñarse desde cero o puede obtenerse de fuentes bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los cebadores de captura universales o regiones que se hibridan específicamente con tales cebadores de captura universales están disponibles en fuentes comerciales. Dos cebadores de captura universales ejemplares incluyen, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3' y 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' (P5 y P7, respectivamente; Illumina, San Diego, CA). Una región que se hibrida específicamente con los cebadores de captura anteriores puede incluir, por ejemplo, la secuencia del complemento inverso correspondiente a 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3' o 5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3' (P5' y P7', respectivamente, Illumina, San Diego, CA).
Al igual que con una región de captura universal, un SBS puede ser cualquier secuencia conocida o diseñada de longitud suficiente para emparejarse específicamente con un cebador de secuenciación complementario. Los ejemplos de SBS incluyen, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3' y 5'-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3' (SBS3 y SBS8, respectivamente; Illumina, San Diego, CA). Una región que se hibrida específicamente con las SBS anteriores puede incluir, por ejemplo, la secuencia del complemento inverso correspondiente a 5'-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3' y 5'-AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCG-3' ("SBS3' y SBS8", respectivamente; Illumina, Diego, CA).
Tal como se describió anteriormente, un cebador de captura puede tener cualquier combinación de regiones, por ejemplo, cualquier combinación de las regiones del cebador P5, P7, SBS3 o SBS8 ejemplificadas anteriormente o secuencias complementarias a las mismas (p.ej., P5', P7' SBS3' o SBS8'). Las combinaciones ejemplares de las secuencias específicas anteriores incluyen, por ejemplo, combinaciones tales como P5-SBS3, P5-SBS8, P7-SBS8 y P7-SBS3, secuencias complementarias a las mismas o combinaciones de las mismas.
El primer y segundo cebadores de captura inmovilizados en una característica pueden incluir cualquier región de captura o cualquier combinación de regiones de captura. Por ejemplo, el primer cebador de captura puede incluir una primera región de captura universal y el segundo cebador de captura puede incluir la misma región de captura universal o una segunda región de captura universal. El primer y segundo cebadores de captura pueden incluir además el mismo o diferentes SBS. Por ejemplo, el primer cebador de captura puede incluir una primera región de cebador de captura universal y un primer SBS y el segundo cebador de captura puede incluir una segunda región de captura universal y un segundo SBS.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, el primer cebador de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 y el segundo cebador de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7.
En otras realizaciones, el primer cebador de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3, y el segundo cebador de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8. En otras realizaciones adicionales, el primer cebador de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 y un nucleótido del cebador SBS8, y el segundo cebador de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3.
Un cebador de captura inmovilizado en una característica de un sustrato puede ser una pluralidad de cebadores de captura. En algunas realizaciones, una característica puede tener una sola pluralidad de cebadores de captura, como cuando se desea una reacción de extensión del cebador o cuando la amplificación de un polinucleótido diana usa la misma región de unión del cebador de captura en ambos extremos. En otras realizaciones, una característica puede tener una pluralidad de primeros cebadores de captura y una pluralidad de segundos cebadores de captura. Además, una característica de un sustrato también puede tener una pluralidad de cebadores de captura además de una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una característica de un sustrato puede incluir una pluralidad de un tercer, cuarto, quinto y/o sexto o más cebadores de captura. El número de pluralidades de cebadores de captura a incluir dependerá de la aplicación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones puede ser deseable realizar una primera amplificación de puente usando una pluralidad de primer y segundo cebadores de captura y luego realizar una segunda amplificación de puente usando una pluralidad de tercer y cuarto cebadores de captura. En tales realizaciones, el polinucleótido diana tendrá regiones de unión al cebador de captura para cada uno de los cebadores de captura primero, segundo, tercero y cuarto. Dadas las enseñanzas y las orientaciones proporcionadas en el presente documento, los especialistas en la técnica entenderán el número de pluralidades de cebadores de captura y de las correspondientes regiones de unión del cebador de captura a usar dada una aplicación particular o una configuración deseada.
Una pluralidad puede ser una población de dos o más miembros. En algunas realizaciones, la pluralidad es una población de dos o más polinucleótidos diferentes u otras moléculas referenciadas tales como cebadores de captura o moléculas diana. En otras realizaciones, una pluralidad es una población de dos o más miembros idénticos (p.ej., polinucleótidos u otras moléculas de referencia tales como cebadores de captura, polinucleótidos diana o moléculas diana). Alternativamente, o adicionalmente, una pluralidad puede ser una población de dos o más miembros similares (p.ej., polinucleótidos u otras moléculas de referencia tales como cebadores de captura, polinucleótidos diana o moléculas diana). En consecuencia, a menos que se indique expresamente lo contrario, el término "pluralidad" se usa como sinónimo de población.
En algunas realizaciones, una pluralidad son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más miembros diferentes de la población. En otras realizaciones, una pluralidad son 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 1 x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1 x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106 o 1x107, o más miembros diferentes.
En algunas realizaciones, una pluralidad son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más miembros similares de la población. En otras realizaciones, una pluralidad son 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8 x 105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x10 7x106, 8x106, 9x106 o 1x107, o más miembros similares.
En algunas realizaciones, una pluralidad son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más miembros idénticos de la población. En otras realizaciones, una pluralidad son 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8 x 105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x10 7x106, 8x106, 9x106 o 1x107, o más miembros idénticos.
En algunas realizaciones, una pluralidad es una mezcla de miembros diferentes y similares de la población. En otras realizaciones, una pluralidad es una mezcla de miembros diferentes e idénticos de la población. En algunas realizaciones, al menos el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de los miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos el 10% de los miembros de la población en una pluralidad son idénticos.
En algunas realizaciones, al menos el 20% de los miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos el 30% de los miembros de la población en una pluralidad son idénticos.
En algunas realizaciones, al menos el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%,
45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más de los miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos el 10% de los miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos el 20% de los miembros de la población en una pluralidad son diferentes.
En algunas realizaciones, al menos el 30% de los miembros de la población en una pluralidad son diferentes.
En algunas realizaciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,
75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más miembros de la población en una pluralidad son homólogos en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más. En algunas realizaciones, al menos dos o más miembros de la población en una pluralidad son homólogos en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%,
25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más. En algunas realizaciones, al menos tres o más miembros de la población en una pluralidad son homólogos en al menos aproximadamente el 1%,
2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90% o 95% o más. En algunas realizaciones, al menos cuatro o más miembros de la población en una pluralidad son homólogos en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%,
25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más. En algunas realizaciones, al menos cinco o más miembros de la población en una pluralidad son homólogos en al menos aproximadamente el 1%,
2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,
80%, 85%, 90% o 95% o más. En algunas realizaciones, al menos diez o más miembros de la población en una pluralidad son homólogos en al menos aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%,
35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% o más.
En algunas realizaciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos 2 miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos 3 miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos 5 miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos 10 miembros de la población en una pluralidad son idénticos. En algunas realizaciones, al menos 20 miembros de la población en una pluralidad son idénticos.
En algunas realizaciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más miembros de la población en una pluralidad son similares. En algunas realizaciones, al menos 2 miembros de la población en una pluralidad son similares. En algunas realizaciones, al menos 3 miembros de la población en una pluralidad son similares. En algunas realizaciones, al menos 5 miembros de la población en una pluralidad son similares. En algunas realizaciones, al menos 10 miembros de la población en una pluralidad son similares. En algunas realizaciones, al menos 20 miembros de la población en una pluralidad son similares.
En algunas realizaciones, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,
70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos 2 miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos 3 miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos 5 miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos 10 miembros de la población en una pluralidad son diferentes. En algunas realizaciones, al menos 20 miembros de la población en una pluralidad son diferentes.
Un sustrato de la descripción puede contener al menos un polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura inmovilizado en una característica. En algunas realizaciones, un sustrato de la descripción contendrá un polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura inmovilizado en una característica. Aunque se describe en el presente documento en referencia a la unión de al menos un polinucleótido diana o en referencia a un polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura inmovilizado en una característica, se entiende que en otras realizaciones un sustrato puede contener dos o más polinucleótidos diana unidos a un extremo para capturar cebadores inmovilizados a una característica. En estas otras realizaciones, el número de polinucleótidos diana puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más polinucleótidos diana diferentes. Alternativamente, el número de polinucleótidos diana puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más polinucleótidos diana idénticos. En otras realizaciones, el número de polinucleótidos diana es, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más polinucleótidos diana similares.
Con referencia a al menos un polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura inmovilizado en una característica, el polinucleótido diana puede ser cualquier polinucleótido capaz de amplificarse en número de copias incluyendo, por ejemplo, ADN, ARN o proteína-ácido nucleico (PNA). Un polinucleótido diana puede comprender dos o más nucleótidos. Los dos o más nucleótidos pueden comprender ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o cualquier combinación de los mismos. Un polinucleótido diana puede comprender una base de purina, una base de pirimidina o ambas. Un polinucleótido diana puede comprender bases de nucleótidos naturales, modificadas químicamente, modificadas bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. Un polinucleótido diana puede comprender una o más bases de nucleótidos emparejadas. Un polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico bicatenario. En algunas realizaciones, el polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico bicatenario tal como ADN bicatenario (dsDNA). Un polinucleótido diana puede ser un ARN bicatenario (dsRNA). Un polinucleótido diana puede ser un híbrido de ADN/ARN bicatenario. Un polinucleótido diana puede comprender una o más bases de nucleótidos no emparejadas. Un polinucleótido diana puede ser monocatenario. En otras realizaciones, el polinucleótido diana puede ser un ácido nucleico monocatenario tal como ADN monocatenario (ssDNA). Un polinucleótido diana puede ser un ARN monocatenario. Un polinucleótido diana puede comprender una mezcla de bases de nucleótidos emparejadas y no emparejadas.
Para la colocación de una molécula individual en una característica, un polinucleótido diana actúa como enlace o ancla de la molécula diana a la característica. Por consiguiente, el polinucleótido diana puede ser cualquier secuencia de una longitud deseada. En algunas realizaciones en las que una pluralidad de moléculas diana están ancladas cada una a una pluralidad de características diferentes, la pluralidad de polinucleótidos diana puede tener la misma secuencia o secuencias diferentes. En otras realizaciones, algunos o todos de la pluralidad de polinucleótidos diana, cada uno de los cuales ancla una pluralidad de moléculas diana a diferentes características, puede tener diferentes secuencias. Por tanto, un polinucleótido diana puede ser cualquier secuencia o mezcla de secuencias deseada. Dadas las enseñanzas y las orientaciones proporcionadas en el presente documento, los especialistas en la técnica discernirán si utilizar la misma secuencia de polinucleótidos diana o diferentes secuencias de polinucleótidos diana inmovilizando una pluralidad de moléculas diana en una pluralidad de características diferentes.
Un polinucleótido diana puede comprender una o más regiones de polinucleótidos diana. Una región de polinucleótido diana puede comprender una región de unión de cebador de captura, región diana, región de unión de cebador, región de código de barras, región de ligando o región adaptadora. Por ejemplo, un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una región de unión al cebador de captura. Un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una primera región de unión al cebador de captura. Un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una segunda región de unión al cebador de captura. Alternativa o adicionalmente, un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una región diana. Un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una región de unión a cebador. Un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una región de código de barras. Un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una región de ligando. Alternativa o adicionalmente, un polinucleótido diana puede comprender una región de polinucleótido diana que comprende una región adaptadora.
Un polinucleótido diana puede comprender una pluralidad de regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender dos o más regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender tres o más regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender cuatro o más regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender cinco o más regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender seis o más regiones de polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender una pluralidad de regiones de polinucleótido diana que comprenden una o más regiones de unión del primer cebador de captura, regiones de unión del segundo cebador de captura, regiones diana, regiones de unión de cebador, regiones de código de barras, regiones de ligando, regiones adaptadoras o cualquier combinación de las mismas. Un polinucleótido diana puede comprender una pluralidad de regiones de polinucleótido diana que comprenden dos o más regiones de unión del primer cebador de captura, regiones de unión del segundo cebador de captura, regiones diana, regiones de unión del cebador, regiones de código de barras, regiones de ligando, regiones adaptadoras o cualquier combinación de las mismas. Un polinucleótido diana puede comprender una pluralidad de regiones de polinucleótido diana que comprenden tres o más regiones de unión de primer cebador de captura, regiones de unión de segundo cebador de captura, regiones diana, regiones de unión de cebador, regiones de código de barras, regiones de ligando, regiones adaptadoras o cualquier combinación de las mismas.
Los polinucleótidos diana ejemplares que comprenden dos o más regiones de polinucleótido diana se representan en la Figura 3A-D. Tal como se muestra en la Figura 3A, un polinucleótido diana puede comprender dos o más regiones de polinucleótido diana (301, 302). Una primera región de polinucleótido diana (301) puede ser una región de unión del primer cebador de captura. Una segunda región de polinucleótido diana (302) puede ser una región de unión del segundo cebador de captura. Tal como se muestra en la Figura 3B, un polinucleótido diana puede comprender tres o más regiones de polinucleótido diana (301,302, 303). Una primera región de polinucleótido diana (301) puede ser una región de unión del primer cebador de captura. Una segunda región de polinucleótido diana (302) puede ser una región de unión del segundo cebador de captura. Una tercera región de polinucleótido diana (303) puede ser una región objetivo. Tal como se muestra en la Figura 3C, un polinucleótido diana puede comprender cuatro o más regiones de polinucleótido diana (301, 302, 303, 304). Una primera región de polinucleótido diana (301) puede ser una región de unión del primer cebador de captura. Una segunda región de polinucleótido diana (302) puede ser una región de unión del segundo cebador de captura. Una tercera región de polinucleótido diana (303) puede ser una región objetivo. Una cuarta región de polinucleótido diana (304) puede ser una región de unión de cebadores. Tal como se muestra en la Figura 3D, un polinucleótido diana puede comprender cinco o más regiones de polinucleótido diana (301, 302, 303, 304, 305). Una primera región de polinucleótido diana (301) puede ser una región de unión del primer cebador de captura. Una segunda región de polinucleótido diana (302) puede ser una región de unión del segundo cebador de captura. Una tercera región de polinucleótido diana (303) puede ser una región objetivo. Una cuarta región de polinucleótido diana (304) puede ser una región de unión de cebadores. Una quinta región de polinucleótido diana (305) puede ser una región de código de barras. Alternativa o adicionalmente, una región de polinucleótido diana puede ser una región de ligando. Alternativa o adicionalmente, una región de polinucleótido diana puede ser una región adaptadora.
Un polinucleótido diana o una región de polinucleótido diana (polinucleótido diana o región del mismo) que incluye, por ejemplo, una región diana, una región de unión a un cebador de captura y/u otra región descrita en el presente documento o bien conocida por los especialistas en la técnica puede comprender dos o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana puede comprender 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 70, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 700, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 7000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 100 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 300 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 400 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 500 o más nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 600 o más nucleótidos.
Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de 10 a 25, 26 a 50, 51 a 100, 101 a 200, 201 a 300, 301 a 400, 401 a 500, 501 a 600, 601 a 700, 701 a 800, 801 a 900, o de 901 a 1000 nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de aproximadamente 5 a 2000, 5 a 1500, 5 a 1000, 5 a 800, 5 a 600, 5 a 400, 5 a 200, 5 a 100 o 5 a 50 nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de aproximadamente 10 a 2000, 10 a 1500, 10 a 1000, 10 a 800, 10 a 600, 10 a 400, 10 a 200, 10 a 100 o 10 a 50 nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de aproximadamente 20 a 2000, 20 a 1500, 20 a 1000, 20 a 800, 20 a 600, 20 a 400, 20 a 200, 20 a 100 o 20 a 50 nucleótidos.
Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender menos de aproximadamente 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500 o 1000 o menos nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender menos de aproximadamente 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 o menos nucleótidos. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender menos de aproximadamente 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 o menos nucleótidos. .
Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender un polinucleótido bicatenario. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender uno o más pares de bases. Un polinucleótido diana puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 70, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 700, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 7000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 100 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 300 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 400 o más pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender 500 o más pares de bases. Un polinucleótido diana puede comprender 600 o más pares de bases.
Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de 10 a 25, 26 a 50, 51 a 100, 101 a 200, 201 a 300, 301 a 400, 401 a 500, 501 a 600, 601 a 700, 701 a 800, 801 a 900, o de 901 a 1000 pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de aproximadamente 5 a 2000, 5 a 1500, 5 a 1000, 5 a 800, 5 a 600, 5 a 400, 5 a 200, 5 a 100 o 5 a 50 pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de aproximadamente 10 a 2000, 10 a 1500, 10 a 1000, 10 a 800, 10 a 600, 10 a 400, 10 a 200, 10 a 100 o 10 a 50 pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender de aproximadamente 20 a 2000, 20 a 1500, 20 a 1000, 20 a 800, 20 a 600, 20 a 400, 20 a 200, 20 a 100 o 20 a 50 pares de bases.
Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender menos de aproximadamente 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500 o 1000 o menos pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender menos de aproximadamente 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150 o 100 o menos pares de bases. Un polinucleótido diana o una región del mismo puede comprender menos de aproximadamente 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 o menos pares de bases.
Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana o una región del mismo que es bicatenario puede comprender uno o más emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender dos o más emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender tres o más emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender cuatro o más emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender cinco o más emparejamientos erróneos.
Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender cinco o menos emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender cuatro o menos emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender tres o menos emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender dos o menos emparejamientos erróneos. Un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo puede comprender uno o menos emparejamientos erróneos.
Tal como se ejemplificó previamente, un polinucleótido diana puede comprender una o más regiones que comprenden una o más regiones de unión a cebadores de captura. Generalmente, una región de unión a un cebador de captura es complementaria a un cebador de captura. Una región de polinucleótido diana puede comprender una región de unión a un cebador de captura en un extremo 5'. Una región de polinucleótido diana puede comprender una región de unión a un cebador de captura en un extremo 3'. Una región de polinucleótido diana puede comprender una primera región de unión a cebador de captura en un extremo 5' de la región diana y una segunda región de unión a cebador de captura en un extremo 3' de la región diana. Alternativamente, o adicionalmente, una región de polinucleótido diana que comprende una región de unión a cebador de captura se puede ubicar en una región interna del polinucleótido diana.
Un polinucleótido diana puede comprender dos o más regiones de unión a cebadores de captura. Un polinucleótido diana puede comprender tres o más regiones de unión a cebadores de captura. Un polinucleótido diana puede comprender cuatro o más regiones de unión a cebadores de captura. Las dos o más regiones de unión del cebador de captura pueden ser iguales. Alternativa o adicionalmente, las dos o más regiones de unión del cebador de captura pueden ser diferentes. Las dos o más regiones de unión del cebador de captura pueden estar adyacentes entre sí en el polinucleótido diana. Alternativamente, o adicionalmente, las dos o más regiones de unión del cebador de captura pueden no estar adyacentes entre sí en el polinucleótido.
Al igual que con los cebadores de captura correspondientes, una región de unión del cebador de captura puede incluir una o más regiones de unión del cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura puede incluir, por ejemplo, una región de unión del cebador de captura universal, un sitio de unión del cebador de secuenciación (SBS), una región de unión del cebador de captura específica de diana, un sitio de escisión predeterminado, como un sitio de restricción y una región de enlace, por ejemplo, una región de enlace que separa dos o más regiones de la región de unión del cebador de captura. Algunas regiones de unión del cebador de captura pueden incluir, por ejemplo, una región de unión del cebador de captura universal y un SBS. Otras regiones de unión del cebador de captura pueden incluir una región de unión del cebador de captura universal y una región de unión del cebador de captura específica de diana. Aún otras regiones de unión del cebador de captura pueden incluir, por ejemplo, una región de unión del cebador de captura universal, un SBS y una región de unión del cebador de captura específica de diana. Una región de unión del cebador de captura se puede bloquear o desbloquear en el extremo 3' o 5'. Dadas las enseñanzas y las orientaciones proporcionadas en el presente documento, los especialistas en la técnica comprenderán que una región de unión a un cebador de captura puede contener cualquier número de regiones diferentes que son útiles en una o más aplicaciones.
Por ejemplo, los cebadores de captura universales ejemplificados previamente también pueden usarse como regiones de unión de cebadores de captura universales al igual que otras regiones de cebadores de captura ejemplificadas aquí o bien conocidas en la técnica. En referencia a los cebadores de captura universales descritos anteriormente, las secuencias P5, P7 P5' y/o P7' ejemplificadas se pueden usar como regiones de unión del cebador de captura universal para emparejar con cebadores de captura complementarios (p.ej., P5', P7', P5 y/o P7, respectivamente). De manera similar, las secuencias de SBS ejemplificadas previamente u otras secuencias diseñadas o conocidas en la técnica pueden incluirse como una región en una región de cebador de captura. En una realización, las secuencias de SBS ejemplares SBS3, SBS8, SBS3' y/o SBS8' pueden incluirse, por ejemplo.
Por ejemplo, una pluralidad de regiones de unión de polinucleótidos diana puede tener cualquier combinación de regiones de unión de cebadores de captura, por ejemplo, cualquier combinación de las regiones de cebadores P5, P7, SBS3 o SBS8 ejemplificadas anteriormente o secuencias complementarias a las mismas (p.ej., P5', P7' SBS3' o SBS8'). Las combinaciones ejemplares de las secuencias específicas anteriores incluyen, por ejemplo, combinaciones tales como P5-SBS3, P5-SBS8, P7-SBS8 y P7-SBS3, secuencias complementarias a las mismas o combinaciones de las mismas.
Tal como se muestra en la Figura 4, una combinación ejemplar para una región diana flanqueada por regiones de unión a cebadores de captura es una región de unión a cebadores de captura P5-SBS3 en un primer extremo del polinucleótido diana y una región de unión a cebadores de captura P7'-SBS8' en un segundo extremo. La hebra complementaria correspondiente incluye una región de unión del cebador de captura P5'-SBS3' en el primer extremo y una región de unión del cebador de captura P7-SBS8 en el segundo extremo.
Una región de unión del cebador de captura puede comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos. Una región de unión del cebador de captura puede comprender 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 5 o más nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 10 o más nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 15 o más nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 20 o más nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 25 o más nucleótidos.
Una región de unión del cebador de captura puede comprender 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100 o pocos nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 300 nucleótidos o menos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 200 nucleótidos o menos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 100 o menos nucleótidos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 50 nucleótidos o menos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 40 nucleótidos o menos. Una región de unión a un cebador de captura puede comprender 30 nucleótidos o menos.
Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser 100% complementaria a un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser complementaria en al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 97% o más a un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser complementaria en un 80% a un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser complementaria en un 85% a un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser complementaria al menos en un 90% a un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser complementaria en al menos un 95% a un cebador de captura.
Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede comprender uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede comprender dos o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede comprender tres o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede comprender cuatro o más emparejamientos erróneos de nucleótidos con un cebador de captura.
Un polinucleótido diana puede comprender una o más regiones diana. Un polinucleótido diana puede tener una región diana ubicada en una región interna del polinucleótido diana. Por ejemplo, la región objetivo puede estar flanqueada en sus extremos 5' y 3' por una región de unión al cebador de captura u otra región. Alternativamente, o adicionalmente, una región diana se puede ubicar, por ejemplo, en un extremo 5' del polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede incluir una región de unión del cebador de captura en un extremo 3', un extremo 5' o ambos, como se ejemplificó anteriormente, del polinucleótido diana. Un polinucleótido diana puede comprender una primera región diana en un extremo 5' del polinucleótido diana y una segunda región diana en un extremo 3' del polinucleótido diana. Una región diana puede estar flanqueada por una o más regiones de unión del cebador de captura en uno o ambos extremos.
Un polinucleótido diana puede comprender dos o más regiones diana. Un polinucleótido diana puede comprender tres o más regiones diana. Un polinucleótido diana puede comprender cuatro o más regiones diana. Las dos o más regiones diana pueden ser iguales. Alternativa o adicionalmente, las dos o más regiones diana pueden ser diferentes. Las dos o más regiones diana pueden ser adyacentes entre sí en el polinucleótido diana. Alternativamente, o adicionalmente, las dos o más regiones diana pueden ser no adyacentes entre sí en el polinucleótido diana.
El tamaño o la longitud de la región diana puede ser cualquiera de las longitudes ejemplificadas anteriormente con respecto a un polinucleótido diana o una región de polinucleótido diana. Las longitudes ejemplares incluyen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o más nucleótidos. Una región diana puede comprender 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más nucleótidos. Una región diana puede comprender 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 100 o más nucleótidos. Una región diana puede comprender 5 o más nucleótidos. Una región diana puede comprender 10 o más, 20 o más, 50 o más, 100 o más, 200 o más o 400 o más nucleótidos. Otras longitudes ejemplares incluyen, por ejemplo, 1000, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 450, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100 o pocos nucleótidos. Aún otras longitudes ejemplares incluyen, por ejemplo, 700 o menos, 500 o menos, 300 o menos, 200 o menos, 100 o menos o 50 o menos nucleótidos.
Un sustrato de la descripción puede contener al menos una molécula diana. La al menos una molécula diana se puede unir a un polinucleótido diana. La al menos una molécula diana se puede unir a un polinucleótido diana que se une a un cebador de captura. La al menos una molécula diana se puede unir a un polinucleótido diana que se une a un cebador de captura inmovilizado en una característica. Aunque se describe en el presente documento en referencia a al menos una molécula diana, en referencia a al menos una molécula diana unida a un polinucleótido diana, en referencia a al menos una molécula diana unida a un polinucleótido diana unido a un cebador de captura, o en referencia a al menos una molécula diana unida a un polinucleótido diana unido a un cebador de captura inmovilizado a una característica, se entiende que en otras realizaciones un sustrato puede contener una pluralidad de dos o más moléculas diana en cada una de las situaciones referidas. Como se ejemplifica más adelante, la pluralidad de moléculas diana se puede inmovilizar individualmente en diferentes características sobre un sustrato. Alternativamente, se puede inmovilizar una pluralidad de moléculas diana con la misma característica en un sustrato. En las realizaciones en las que una pluralidad de moléculas diana se inmovilizan individualmente en diferentes características, la pluralidad de moléculas diana puede ser la misma molécula diana o diferentes tipos o especies de moléculas diana como se ha ejemplificado anteriormente y como se ejemplifica más adelante. En estas realizaciones, el número de moléculas diana dentro de una pluralidad puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 250, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más moléculas diana diferentes, idénticas y/o similares.
Por ejemplo, una pluralidad de moléculas diana puede comprender dos o más moléculas diana idénticas. En esta realización, tanto la primera como la segunda o más moléculas diana pueden ser, por ejemplo, un polipéptido específico tal como un nanoporo MspA. Alternativamente, o adicionalmente, una pluralidad de moléculas diana puede comprender dos o más moléculas diana diferentes. Por ejemplo, una primera molécula diana de la pluralidad de moléculas diana puede ser una enzima y una segunda molécula diana de la pluralidad de moléculas diana puede ser un polinucleótido. La pluralidad de moléculas diana puede comprender tres o más moléculas diana diferentes. Por ejemplo, una primera molécula diana de la pluralidad de moléculas diana puede ser una enzima, una segunda molécula diana de la pluralidad de moléculas diana puede ser un polinucleótido y una tercera molécula diana de la pluralidad de moléculas diana puede ser un compuesto orgánico pequeño. Alternativa o adicionalmente, la pluralidad de moléculas diana puede comprender dos o más moléculas diana similares. Las dos o más moléculas diana similares pueden ser del mismo tipo de molécula. Por ejemplo, una primera molécula diana puede ser un nanoporo MspA y una segunda molécula diana puede ser un nanoporo NaIP. En este caso, la primera y la segunda moléculas diana son del mismo tipo de moléculas (p.ej., nanoporos). Las dos o más moléculas diana similares pueden ser homólogas o variantes. Por ejemplo, una primera molécula diana puede ser una versión humana de un polipéptido y una segunda molécula diana puede ser una versión de ratón de un polipéptido. Las variantes pueden incluir polipéptidos codificados por diferentes alelos u obtenidos por mutagénesis específica de sitio, evolución dirigida o similares. Las dos o más moléculas diana similares pueden ser variantes de división alternativas de la misma proteína. Por ejemplo, una primera molécula diana puede ser una versión completa de un polipéptido y una segunda molécula diana puede ser una versión truncada del polipéptido. Las dos o más moléculas diana similares pueden ser análogos o derivados químicos. Por ejemplo, una primera molécula diana puede ser un compuesto X y la segunda molécula diana puede ser un derivado del compuesto X. En una realización ejemplar, la pluralidad de moléculas diana similares puede ser una biblioteca de variantes enzimáticas. Las moléculas diana ejemplares se describen más adelante.
En algunas realizaciones, al menos una molécula diana o una pluralidad de moléculas diana pueden unirse al sustrato y/o unirse a una característica del sustrato. Al menos una molécula diana o una pluralidad de moléculas diana pueden unirse a un cebador de captura o una pluralidad de cebadores de captura, respectivamente, inmovilizados a una característica del sustrato. Se puede unir al menos una molécula diana o una pluralidad de moléculas diana a un polinucleótido diana que se une a un cebador de captura o una pluralidad del mismo, respectivamente, inmovilizado a una característica del sustrato. La unión puede ser una unión covalente o no covalente de la molécula diana a cualquiera de las regiones o componentes descritos anteriormente. Con referencia a al menos una molécula diana, por ejemplo, al menos una molécula diana se puede unir covalentemente al sustrato y/o una característica del sustrato. Al menos una molécula diana se puede unir covalentemente a un cebador de captura inmovilizado en una característica del sustrato. Al menos una molécula diana se puede unir covalentemente a un polinucleótido diana que se une covalentemente a un cebador de captura inmovilizado en una característica del sustrato. Una realización ejemplar para la unión covalente de un polinucleótido diana a un cebador de captura a través de un enlace fosfodiéster covalente se describe más adelante en referencia a métodos para colocar al menos una molécula diana en una característica de un sustrato. Además, por ejemplo, al menos una molécula diana puede unirse de forma no covalente al sustrato y/o a una característica del sustrato. Al menos una molécula diana puede unirse de forma no covalente a un cebador de captura inmovilizado en una característica del sustrato. Al menos una molécula diana se puede unir de forma no covalente a un polinucleótido diana que está unido de forma no covalente a un cebador de captura inmovilizado en una característica del sustrato. Los métodos para la unión covalente y no covalente de los polinucleótidos y moléculas diana a sustratos y entre sí son bien conocidos en la técnica.
Además de al menos una molécula diana inmovilizada a través de una configuración descrita anteriormente, una característica o una pluralidad de características en un sustrato también puede incluir una pluralidad de amplicones del polinucleótido diana. Los amplicones pueden ser complementarios al polinucleótido diana. En realizaciones en las que un polinucleótido diana o una región de polinucleótido diana contiene uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos, los amplicones pueden ser complementarios al polinucleótido diana excepto por uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos. De manera similar, en esta realización, un amplicón bicatenario del polinucleótido diana puede tener una hebra complementaria al polinucleótido diana excepto por uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos y la otra cadena idéntica en secuencia al polinucleótido diana excepto por uno o más emparejamientos erróneos de nucleótidos. En otras realizaciones, los amplicones pueden ser una pluralidad de las diferentes especies de amplicones ejemplificadas anteriormente. La pluralidad de amplicones puede llenar mínimamente una característica, llenar parcialmente una característica o llenar hasta la capacidad de una característica sobre un sustrato. Por consiguiente, la densidad del amplicón puede ser baja, media o alta. El diseño de polinucleótidos diana, los métodos para generar tales amplicones y los métodos para controlar la densidad se describen más adelante en referencia a métodos para colocar al menos una molécula diana en una característica de un sustrato. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 100 en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm, o de aproximadamente 100 a 10000 en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm.
La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 100, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 95, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 90, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 85, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 80, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 75, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 70, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 65, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 60, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 55, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 50, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 45, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 40, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 35, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 30, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 25, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 20 en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 10 a 15, en una característica con un tamaño inferior a aproximadamente 100 nm.
La densidad de amplicones puede ser mayor de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 en una característica con un tamaño menor de aproximadamente 100 nm.
La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 10000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 9000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 8000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 7000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 6000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 5000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 4000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 3000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 2000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 1000, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 900, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 800, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 700, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 600, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 500, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de los amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 400, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 300, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm. La densidad de amplicones puede ser de aproximadamente 100 a 200, en una característica con un tamaño de aproximadamente 100 nm a 1 pm.
Una molécula diana aplicable para la colocación molecular individual sobre un sustrato de la descripción y para su uso en un método de la descripción puede ser cualquier molécula deseada. Las categorías ejemplares de moléculas diana incluyen, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato, aminoácido, nucleótido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, canal iónico, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico. Las especies ejemplares para cada una de las categorías anteriores se describen más adelante.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un polipéptido. Un polipéptido puede comprender uno o más aminoácidos. Un polipéptido puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más aminoácidos. Un polipéptido puede comprender 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 o más aminoácidos. Un polipéptido puede comprender 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 o más aminoácidos. El aminoácido puede ser un aminoácido natural. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural. El aminoácido puede ser un D-aminoácido. El aminoácido puede ser un L-aminoácido. El uno o más aminoácidos puede comprender uno o más aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, D-aminoácidos, L-aminoácidos o una combinación de los mismos. Los ejemplos de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, p-acetilfenalalanina, m-acetilfenalalanina, alanina, p-alanina, ácido yaminobórico (GABA), ácido aminoisobutírico, ácido 5-aminolevulínico, ácido 4-aminobenzoico (PABA), arginina, asparagina, ácido aspártico, p-benxoil-1-fenilalanina, citrulina, cistationina, cisteína, cistina, ácido diaminopimélico, ácido Djenkólico, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, lantionina, leucina, lisina, meitina fenilalanina, fenilselenidilalanina, prolina, selenocisteína, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. Los ejemplos de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, péptido ribosómico, péptido no ribosómico, peptona, fragmento de péptido o cualquier combinación de los mismos. Los polipéptidos de la descripción pueden ser recombinantes, sintéticos o de origen natural.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un polipéptido ribosómico. Generalmente, un péptido ribosómico puede ser un péptido que se sintetiza por traducción de ARNm. La proteína ribosómica puede sufrir una o más modificaciones post-traduccionales. Los ejemplos de modificaciones post-traduccionales incluyen, pero sin limitación, fosforilación, hidroxilación, sulfonación, palmitoilación, glicosilación, ubiquitinación, sumoilación y formación de disulfuro. Los ejemplos de péptidos ribosomales incluyen, pero no se limitan a, enzimas, receptores, anticuerpos, factores de transcripción, hormonas, ligandos, antígenos y haptenos.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un péptido no ribosómico. Generalmente, un péptido no ribosómico puede ser un péptido ensamblado por enzimas que son específicas para cada péptido en lugar de para el ribosoma. El péptido no ribosómico puede tener una estructura cíclica y/o ramificada. El péptido no ribosómico puede contener uno o más aminoácidos no proteinogénicos tales como D-aminoácidos. El polipéptido no ribosómico puede comprender modificaciones tales como grupos N-metilo y N-formilo. El polipéptido no ribosómico puede estar glicosilado, acilado, halogenado o hidroxilado. El polipéptido no ribosómico puede sufrir la deshidratación de una o más serinas, dando como resultado deshidroalanina. El péptido no ribosómico puede ser un multímero. El péptido no ribosómico puede ser un dímero o un trímero. Los ejemplos de péptidos no ribosómicos incluyen, pero no se limitan a, toxinas, sideróforos, pigmentos, antibióticos, precursores de antibióticos, citostáticos e inmunosupresores.
Una molécula diana de la descripción puede comprender uno o más polipéptidos que se ensamblan en un nanoporo. Se puede seleccionar un nanoporo del grupo que consta de Mycobacterium smegmatis porina A (MspA), fosfolipasa A de membrana externa (OmpA), OmpC, OmpF, OmpG, Neisseria lipoproteína autotransportadora (NaIP), WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina de ántrax, gramicidina A, maltoporina, PhoE, Tsx, F-pilus, SP1, porina mitocondrial (VDAC), Tom40, leucocidinas y nanoporos de origami de ADN.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un antibiótico. Un antibiótico puede ser penicilina, cefalosporina, polimixina, rifamicina, lipiarmicina, quinolona, sulfonamida, macrólido, aminoglucósido, lipopéptido cíclico, glicilciclina, oxazolidinona o una microcina. Los ejemplos de antibióticos incluyen, pero no se limitan a, actinomicina, bacitracina, antibiótico dependiente de calcio, daptomicina, gramicidina, tirocidina, vancomicina, zwittermicina A, plazomicina, eravaciclina, brilacidina, avibactam, azitromicina, claritromicina, eritromicina, kitasamicina, midecamicina, oleandomicina, solitromicina, espiramicina, troleandomicina, tilosina, roxitromicina, cetromicina, ansamicina, carbomicina, tilosina y telitromicina.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una toxina. Una toxina puede ser una hemotoxina. Una hemotoxina puede causar la destrucción de los glóbulos rojos. La toxina puede ser una fototoxina. Una fototoxina puede causar fotosensibilidad. La toxina puede ser una exotoxina. Una exotoxina puede ser excretada por un organismo o una célula. La toxina puede ser una endotoxina. Una endotoxina puede ser una toxina que se libera cuando se lisa una célula u organismo. La toxina puede ser una biotoxina. Una biotoxina puede ser una toxina de origen biológico. Por ejemplo, una toxina que se produce a partir de un hongo puede denominarse biotoxina. La toxina puede ser una necrotoxina. Una necrotoxina puede causar necrosis. La toxina puede ser una neurotoxina. Una neurotoxina puede afectar el sistema nervioso de los animales. La toxina puede ser una citotoxina. Una citotoxina puede ser tóxica a nivel de células individuales. La toxina puede ser una micotoxina. Los ejemplos de micotoxinas incluyen aflatoxinas, ocratoxinas, citrinina, alcaloides del cornezuelo de centeno, patulina y fusarium. Los ejemplos de toxinas incluyen, pero no se limitan a, microcistinas, nodularinas, anatoxina-a, anatoxina-a (S), cilindrospermopsinas, lyngbyatoxina-a, saxitoxina, aplisiatoxina, cianotoxinas, toxina HC, toxina AM, victorina, ricina, apitoxina, fumonisinas, tricotecenos, zearalenona, beauvercina, enniatinas, butenolida, equisetina, toxina tetánica, toxina botulínica, tetrodotoxina y fusarinas.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una hormona. Una hormona puede ser una aminohormona, una hormona peptídica, una hormona proteica, una hormona esteroidea o una combinación de las mismas. Una aminohormona puede comprender uno o más aminoácidos con uno o más grupos modificados. Por ejemplo, un carboxilo de un aminoácido se puede reemplazar con un grupo químico como un anillo de benceno. Una hormona peptídica puede comprender una cadena corta de aminoácidos enlazados. Una hormona proteica puede comprender una cadena larga de aminoácidos enlazados. Una hormona esteroidea se puede derivar de un colesterol lipídico. Los ejemplos de hormonas incluyen, pero no se limitan a, melatonina, triyodotironina, tiroxina, prostaglandina, leucotrienos, prostaciclina, trombaxano, amilina, hormona anti-Mulleriana, adinopectina, hormona adrenocorticotrópica, corticotropina, angiotensinógeno, angiotensinógeno, angipresinurensina, hormona péptido natriurético, atriopeptina, péptido natriurético cerebral, calcitonina, colecistoquinina, hormona liberadora de corticotropina, cortistatina, encefalina, endotelina, eritropoyetina, hormona estimulante del folículo, galanina, polipéptido inhibidor gástrico, gastrina, péptido similar a la grelina, glucagón-1, glucagón hormona liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona del crecimiento, hepcidina, gonadotropina coriónica humana, lactógeno placentario humano, hormona del crecimiento, inhibina, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina, somatomedina, leptina, lipotropina, hormona luteinizante, hormona estimulante de melanocitos, motilina, orexina , oxitocina, polipéptido pancreático, hormona paratiroidea, adenilato ciclasa-activatina hipofisaria g péptido, prolactina, hormona liberadora de prolactina, relaxina, renina, secretina, somatostatina, trombopoyetina, hormona estimulante del tiroides, tirotropina, péptido intestinal vasoactivo, andrógeno, mineralocorticoide, estrógeno, glucocorticoide, progestágeno y secosteroide.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un hapteno. Generalmente, un hapteno puede ser una molécula pequeña que puede provocar una respuesta inmune cuando se une a un portador grande, como una proteína. Los ejemplos de haptenos incluyen, pero no se limitan a, anilina, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminoabenzoico, ácido paminobenzoico, uroshiol, quinina, hidralazina, fluoresceína, biotina, digoxigenina y dinitrofenol.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un canal iónico (es decir, porina) o un receptor. Un receptor puede provenir de una célula inmunitaria. La célula inmunitaria puede ser una célula T, una célula B, una célula NK o un fagocito. El fagocito puede ser un monocito, eosinófilo, macrófago, neutrófilo, mastocito o basófilo. El receptor puede provenir de una célula no inmunitaria. Por ejemplo, la célula no inmunitaria puede ser un órgano o tejido. La célula no inmunitaria puede ser una célula de la piel, una célula pulmonar, una célula cardíaca, una célula mamaria, una célula muscular, una célula renal, un glioma y una célula ovárica. El receptor puede ser un receptor de superficie celular. El receptor puede ser un receptor interno. El receptor puede ser un receptor de canal iónico, un receptor de proteína G o un receptor de proteína unida a enzima. El receptor puede ser un receptor transmembrana. El receptor puede comprender un dominio de unión a ligando externo (p.ej., dominio extracelular), dominio hidrófobo que atraviesa la membrana, dominio intracelular o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de receptores incluyen, entre otros, receptor nicotínico de acetilcolina, receptor de glicina, receptor GABA, receptor de glutamato, receptor 5-HT3, receptor P2X, canal iónico controlado por nucleótidos cíclicos, receptor IP3, receptor ATP intracelular, receptor de rianodina, receptor de células T (TCR), receptor de células B (BCR), receptor de reconocimiento de patrones (PRR), receptor tipo peaje (TLR), receptor activado por asesino (KAR), receptor inhibidor asesino (KIR), receptor del complemento, receptor Fc, receptor de quimiocinas, receptor de interferón, receptor de factor de crecimiento, que incluye, por ejemplo, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). El receptor puede ser un receptor de citocina, un receptor de serina/treonina quinasa, un receptor de tirosina quinasa, un receptor de IFN-a/p (IFNAR), IFNGR, IL10R2, IFNLR1 o un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF-R).
Una molécula diana de la descripción puede comprender una citocina. Las citocinas incluyen, pero no se limitan a, quimiocinas, interferones, interleucinas, linfocinas y factor de necrosis tumoral (TNF). La quimiocina puede ser de la subfamilia CXC, CC, CX3C o XC. Las quimiocinas pueden ser CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17 y CCL22. La quimiocina puede ser CCR1, CCR2, c Cr 3, CCR4, CCR5, CXCR2 y CXCR4. La quimiocina puede ser CCL11, CCL24, CCL26, CCL5, CCL7, CCL13 y CCL3. La quimiocina puede ser CCL2, CCL1, CCL22 y CCL17. La quimiocina puede ser quimiocina CXC. La quimiocina puede ser CXC8. El interferón puede ser un interferón de tipo I, un interferón de tipo II o un interferón de tipo III. El interferón puede ser IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-k, IFN-w , IFN-y. La interleucina (IL) puede ser IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15 o IL-17. La linfocina puede ser factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos o interferón-gamma. El factor de necrosis tumoral puede ser TNF, linfotixina alfa, CD40L, CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L y ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Una molécula diana de la descripción también puede ser un neuropéptido.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una enzima. Las enzimas se pueden clasificar en oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Una oxidorreductasa puede catalizar reacciones de oxidación/reducción. Una transferasa puede transferir un grupo funcional (p.ej. un grupo metilo o fosfato). Una hidrolasa puede catalizar la hidrólisis de varios enlaces. Las liasas pueden escindir varios enlaces por medios distintos de la hidrólisis y la oxidación. Una isomerasa puede catalizar cambios de isomerización dentro de una molécula individual. Una ligasa puede unir dos moléculas con enlaces covalentes. La enzima puede ser lactasa, reductasa, deshidrogenasa y polimerasa. La enzima puede ser una alcohol deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, homoserina deshidrogenasa, aminopropanol oxidorreductasa, diacetil reductasa, glicerol deshidrogenasa, propanodiol-fosfato deshidrogenasa, glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, D-xilulosa reductasa, L-xilulosa reductasa, lactato deshidrogenasa, malato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa, HMG-CoA reductasa, descarboxilasa, deshidratasa, aldehído liasas, oxoácido liasa, carbono-carbono liasa, carbono-nitrógeno liasa, carbono-azufre liasa, carbono-haluro liasa, fósforo-oxígeno liasa, ferroquelatasa, adenilato ciclasa, desaminasa, oxidasa, quinasa o una enzima para autoinductores bacterianos.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una polimerasa. La polimerasa puede ser una ADN polimerasa, ARN polimerasa o ADN/ARN polimerasa. La polimerasa puede ser una polimerasa eucariótica. La polimerasa puede ser una polimerasa procariótica. La ADN polimerasa puede ser Pol I, Pol II, Pol III, Pol IV o Pol V. La ADN polimerasa puede ser polimerasa beta, polimerasa lambda, polimerasa sigma, polimerasa mu, polimerasa alfa, polimerasa delta, polimerasa épsilon, polimerasa eta, polimerasa iota, polimerasa kappa, polimerasa Rev1, polimerasa zeta, telomerasa, polimerasa gamma y polimerasa theta. La ARN polimerasa puede ser ARN polimerasa I, ARN polimerasa II, ARN polimerasa III, ARN polimerasa IV o ARN polimerasa V. La ARN polimerasa puede ser RNAP. La ARN polimerasa puede comprender una subunidad de RNAP. La subunidad de RNAP puede ser p', p, a', a" y w. La polimerasa puede ser una ADN polimerasa dependiente de ARN (RdDp). La RdDp puede ser una transcriptasa inversa. La polimerasa puede ser VentR® ADN polimerasa, ADN polimerasa VentR™ (exo-), ADN polimerasa OneTaq®, ADN polimerasa LongAmp® Taq, ADN polimerasa T4, ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion®, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa OneTaq® Hot Start, ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow), ADN polimerasa de alta fidelidad Q5®, ARN polimerasa SP6, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa de E. coli, holoenzima, ARN polimerasa de E. coli, enzima de núcleo, poli(U) polimerasa y poli(A) polimerasa de E. coli.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una ligasa. Una ligasa puede ser una ligasa eucariótica. La ligasa puede ser una ligasa procariótica. La ligasa puede ser una ligasa monocatenaria. La ligasa puede ser una ligasa bicatenaria. La ligasa puede ser una ADN ligasa. La ADN ligasa puede ser ADN ligasa T4, ADN ligasa Taq, ADN ligasa T7, ADN ligasa T3, ADN ligasa 9°N™ y ADN ligasa de E. coli. La ligasa puede ser una ARN ligasa. La RNA ligasa puede ser T4 ARN ligasa 1, T4 ARN ligasa 2, T4 ARN ligasa truncada, T4 ARN ligasa 2 truncada K227Q, T4 ARN ligasa 2 truncada KQ y 5' AppAD/ARN ligasa termoestable. La ligasa puede ser una ligasa termoestable. La ligasa puede ser una ADN/ARN ligasa. La ligasa puede ser una ligasa SplintR®, roma/TA ligasa y ligasa de extremo pegajoso. La ligasa puede ser CircLigaseTM, CircLigaseTM II.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una transcriptasa inversa. Una transcriptasa inversa puede ser una transcripasa inversa vírica. La transcriptasa inversa vírica puede ser una transcriptasa inversa retrovírica. La transcriptasa inversa puede ser una transcriptasa inversa eucariótica. La transcriptasa inversa puede ser transcriptasa inversa AMV, transcriptasa inversa ProtoScript® II, transcriptasa inversa M-MuLV, transcriptasa inversa SuperScript®, transcriptasa inversa Superscript® II, transcriptasa inversa Superscript® III, transcriptasa inversa VIH-1 o transcriptasa inversa telomerasa.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una nucleasa. Una nucleasa puede ser una ADNasa. La nucleasa puede ser una ARNasa. La nucleasa puede ser una exonucleasa. La exonucleasa puede ser Exonucleasa Lambda, Exonucleasa VII, Exonucleasa T5, Exonucleasa T7, Exonucleasa T, Exonucleasa I (E. coli), Exonucleasa V (RecBCD) o Exonucleasa III (E. coli). La nucleasa puede ser una endonucleasa. La endonucleasa puede ser Endonucleasa IV, T7 Endonucleasa I, Endonucleasa V, Endonucleasa VIII, Tma Endonucleasa III, Endonucleasa III (Nth), T4 PDG (T4 Endonucleasa V) o Tth Endonucleasa IV. La ARNasa puede ser ARNasa H, ARNasa HII, ARNasa If, ARNasa ShortCut® III, XRN-1. Los ejemplos de nucleasas incluyen, pero no se limitan a, Afu Uracil-ADN glicosilasa (UDG), Tma Endonucleasa III, Tth Endonucleasa IV, UDG antártica termolábil, APE 1, Cas9 nucleasa, S. pyogenes, ADNasa I, Endonucleasa III (Nth) , Endonucleasa IV, Endonucleasa V, Endonucleasa VIII, Exonucleasa I (E. coli), Exonucleasa III (E. coli), Exonucleasa T, Exonucleasa V (RecBCD), Exonucleasa VII, Fpg, hAAG, hOGG1, hSMUG1, Exonucleasa Lambda, tampón de reacción de Exonucleasa Lambda, nucleasa microcócica, nucleasa de frijol mungo, nucleasa BAL-31, RecAf, RecJf, T4 PDG (endonucleasa V T4), exonucleasa T5, endonucleasa I T7, exonucleasa T7, Inhibidor de Uracilo Glicosilasa (UGI), y Uracilo-ADN Glicosilasa (UDG).
Una molécula diana de la descripción puede comprender una helicasa. Una helicasa puede ser una helicasa eucariótica. La helicasa puede ser una helicasa procariótica. La helicasa puede ser una helicasa de ADN. La helicasa puede ser una ARN helicasa. La helicasa puede ser una ADN/ARN helicasa. La helicasa puede ser una helicasa dependiente de ATP. La helicasa puede ser una helicasa monocatenaria. La helicasa puede ser una helicasa bicatenaria. La helicasa puede ser una proteína de unión a cromodominio de ADN helicasa. La helicasa puede ser una caja DEAD/DEAD/caja DEAH helicasa. Los ejemplos de helicasas incluyen, entre otros, ATXR, XPD, RecQ, ASCC3, Bl M, BRIP1, DNA2, FBXO18, FBXO30, HELB, HELLS, HELQ, HELZ, HFM1, HLTF, IFIH1, NAV2, PIF1, RECQL, RTEL1, SHPRH, SMARCA4, SMARCAL1, WRN, WRNIP1, DDX3X, DDX5, DDX6, DDX10, DDX11, DDX12, DDX58, DHX8, DHX9, DHX37, DHX40, DHX58, CHD1, CHD1L, CHD2, CHD3, CHD4, CHD5, CHD6, CHD7, CHD8 y CHD9.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una transposasa. Una transposasa puede ser una transposasa de ADN. La transposasa puede ser una Tn5 transposasa o una ADN Mos1 transposasa. La transposasa puede ser una integrasa. La integrasa puede ser una integrasa vírica. La transposasa puede ser HIV-1 IN, ASV IN y MuA transposasa.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Un anticuerpo puede comprender una inmunoglobulina (Ig). La inmunoglobulina puede ser IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. El anticuerpo puede comprender una cadena ligera de anticuerpo. La cadena ligera del anticuerpo puede ser una cadena ligera kappa o lambda. El anticuerpo puede comprender una cadena pesada de anticuerpo. La cadena pesada del anticuerpo puede comprender una cadena pesada alfa, gamma, delta, épsilon o mu. El anticuerpo puede comprender un fragmento de anticuerpo. El anticuerpo puede comprender un fragmento de unión a antígeno (Fab), Fab2, fragmento cristalizable (Fc), fragmento variable (Fv), fragmento de cadena simple variable (scFv), fragmento variable dimérico de cadena simple (di-scFv), anticuerpo de dominio único ( sdAb), scFv-Fc, minicuerpo, diacuerpo, dominio variable de una cadena pesada (dominio VH), dominio variable de una cadena ligera (dominio VL), dominio constante de una cadena pesada (dominio CH), dominio constante de una cadena ligera (dominio CL), región determinante de complementariedad (CDR). El anticuerpo puede ser un monómero. El anticuerpo puede ser un dímero. El dímero puede ser un homodímero. El dímero puede ser un heterodímero. El anticuerpo puede ser un multímero. El anticuerpo puede ser un pentámero. El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo puede ser un camélido. El anticuerpo puede ser un anticuerpo trifuncional. El anticuerpo puede ser un activador de células T biespecífico (BiTE). El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico. Un anticuerpo quimérico puede referirse a un anticuerpo que comprende regiones derivadas de dos o más fuentes. Las dos o más fuentes pueden ser de diferentes especies. Alternativamente, las dos o más fuentes pueden ser de diferentes células. Las células pueden ser del mismo tipo de célula. Alternativamente, las células pueden ser de diferentes tipos de células. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado. El anticuerpo puede ser de un mamífero, reptil, pájaro y pez. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un perro, un gato, una vaca, una oveja, un conejo, una cabra, una rata, un ratón, un oso, un caballo, un camello y un cerdo. Los ejemplos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, aducanumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ald518, alemtuzumab, alirocumab, altumomab pentekinábato, anifrumab arcitumomab, aselizumab, atinumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab, bavituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab, bertilimumab, besilesomab, bevacizumab, bezlotoxumab, biciromab, bimagrumab, mertansine bivatuzumab, blinatumomabblosozumab, brentuximab, briakinumab, brodalumab, canakinumab, cantuzumab mertansine, cantuzumab ravtansine, caplacizumab, capromab pendetida, carlumab, catumaxomab, cc49, cbr96-doxorrubicina inmunoconjugado, cedelizumab, certolizumab pegol, cetuximab, citatuzumab bogatox, cixutumumab, clazakizumab, clenoliximab, tetraxetan clivatuzumab, conatumumab, concizumab, Crenezumab, cr6261, dacetuzumab, daclizumab, dalotuzumab , daratumumab, demcizumab, denosumab, detumomab, dorlimomab aritox, drozitumab, duligotumab, dupilumab, dusigitumab, ecromeximab, eculizumab, edobacomab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, eldelumab, elotuzumab, elsilimomab, peajeatabumabumab, enitutabumabumab , etaracizumab, etrolizumab, evolocumab, exbivirumab, fanolesomab, faralimomab, farletuzumab, fasinumab, fbta05, felvizumab, fezakinumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, fontolizumab, fomavirbumab, gamatuzumab, gemtuzumab, gevokizumab, girentuximab, glembatumumab brentuximab, golimumab, gomiliximab, guselkumab, ibalizumab, ibritumomab tiuxetan, icrucumab, igovomab, imab362, imciromab, imgatuzumab, inclacumab, ravtansine indatuximab, infliximab, intetumumab, inolimomab, gemtuzumab inotuzumab, ipilimumab, iratumumab, itolizumab, ixekizumab, keliximab, labetuzumab, lambrolizumab, lámpara alizumab, lebrikizumab, lemalesomab, lerdelimumab, lexatumumab, libivirumab, ligelizumab, lintuzumab, lirilumab, lodelcizumab, mertansine lorvotuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab, margetuximab, maslimomab, mavrilimumab, matuzumab, mepolizumab, metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, mogamulizumab, morolimumab , motavizumab, pasudotox moxetumomab, muromonab-cd3, nacolomab tafenatox, namilumab, naptumomab estafenatox, narnatumab, natalizumab, nebacumab, necitumumab, nerelimomab, nesvacumab, nimotuzumab, nivolumab, nofetumomab merpentan, ocaratuzumab, ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, olaratumab, olokizumab, omalizumab , onartuzumab, ontuxizumab, oportuzumab monatox, oregovomab, orticumab, otelixizumab, otlertuzumab, oxelumab, ozanezumab, ozoralizumab, pagibaximab, palivizumab, panitumumab, pankomab, panorsmabumab, petitumpertuzumabpexelizumab, pidilizumab, pinatuzumab vedotin, pintumomab, placulumab, polatuzumab vedotin, ponezumab, priliximab, pritoxaximab, pritumumab, pro 140, quilizumab, racotumomab, radretumab, rafumabumab, racotumomab, radretumab, rafumabumabuma, rumibumabumab, rafibumabumab, rafitubumab , romosozumab, rontalizumab, rovelizumabruplizumab, samalizumab, sarilumab, satumomab pendetide, secukinumab, seribantumab, setoxaximab, sevirumab, sibrotuzumab, sgn-cd19a, sgn-cd33a, simumabimabimumab, sumabumab estamulumab, sulesomab, suvizumab, tabalumab, tacatuzumab tetraxetan, tadocizumab, talizumab, tanezumab, taplitumomab paptox, tefibazumab, telimomab aritox, tenatumomab, teneliximab, teplizumab, teprotumumab, tgn1412, ticilimumab, tremelimumab, tildrakizumab, trigatuzumab, tnx-650, tocilizumab, atlizumab, toralizumab, tositumomab, tovetumab, tralokinumab, trastuzumab, trbs07, tregalizu mab, tremelimumab, tucotuzumab celmoleukin, tuvirumab, ublituximab, urelumab, urtoxazumab, ustekinumab, vantictumab, vapaliximab, vatelizumab, Vedolizumab, veltuzumab, vepalimomab, vesencumab, visilizumab, volociximab, vorsetuzumab mafodotin, votumumab, zalutumumab, zanolimumab, zatuximab, ziralimumab, y zolimomab aritox.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un polinucleótido. El polinucleótido puede comprender uno o más nucleótidos. Un polinucleótido puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más ácidos nucleicos. Un polinucleótido puede comprender 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 o más ácidos nucleicos. Un polinucleótido puede comprender 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 o más ácidos nucleicos. El uno o más nucleótidos puede comprender ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o cualquier combinación de los mismos. El polinucleótido puede comprender una base de purina, una base de pirimidina o ambas. El polinucleótido puede comprender bases de nucleótidos naturales, modificadas químicamente, modificadas bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. El polinucleótido puede comprender una o más bases de nucleótidos no emparejados. El polinucleótido puede ser monocatenario. El polinucleótido puede comprender una o más bases de nucleótidos emparejadas. El polinucleótido puede ser bicatenario. El polinucleótido puede comprender un ADN bicatenario, ARN bicatenario o un híbrido ADN/ARN bicatenario. El polinucleótido puede ser un polinucleótido sintético. En algunos casos, se conoce la secuencia del polinucleótido. Por ejemplo, el polinucleótido puede comprender una secuencia poliadenilada. En algunos casos, se desconoce la secuencia del polinucleótido. Por ejemplo, el polinucleótido de la secuencia aleatoria puede comprender una secuencia degenerada. En algunos casos, solo se conoce una parte de la secuencia del polinucleótido. Por ejemplo, el polinucleótido puede comprender una secuencia poliadenilada, pero se desconoce el resto de la secuencia.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un cebador de oligonucleótido. Un cebador de oligonucleótido puede ser un cebador de amplificación o secuenciación. Puede usarse un cebador de amplificación o secuenciación en la amplificación o secuenciación de otro polinucleótido. Por ejemplo, un cebador de secuenciación o amplificación puede comprender una secuencia que es parcialmente complementaria a un gen. El cebador de amplificación o secuenciación puede hibridarse con el gen y permitir la amplificación o secuenciación del gen. Un cebador de amplificación o secuenciación puede ser un cebador específico. Generalmente, un cebador específico es complementario a una secuencia de un polinucleótido (p.ej., un gen, región de exón, etc.). La secuencia del polinucleótido puede ser única para el polinucleótido. Por ejemplo, un cebador específico puede hibridarse con al menos una porción de un gen de anticuerpo. Un cebador de amplificación o secuenciación puede ser un cebador universal. Generalmente, un cebador universal es complementario a una secuencia que es común a dos o más tipos de polinucleótidos. Por ejemplo, un cebador universal puede comprender una secuencia oligodT que se puede hibridar con una secuencia poliadenilada de dos o más polinucleótidos (p.ej., ARNm). El cebador de amplificación o secuenciación puede hibridarse con una secuencia que es natural para el polinucleótido (p.ej., una secuencia poliA de ARNm, un sitio de restricción, una región de exón). El cebador de amplificación o secuenciación puede hibridarse con una secuencia que no es natural para el polinucleótido (p.ej., una secuencia de adaptador o una secuencia de código de barras). El cebador de amplificación o secuenciación puede comprender una secuencia aleatoria o degenerada. Por ejemplo, el cebador de amplificación o secuenciación puede comprender una secuencia hexámera aleatoria. Los ejemplos de cebadores de secuenciación o amplificación incluyen, pero no se limitan a, oligodT, cebador aleatorio, cebador específico de gen y cebadores promotores. El cebador oligodT puede ser un cebador oligo (dT)20, oligo (dT)18 u oligo (dT)12-18. El cebador aleatorio puede ser un cebador de 9 meros o un cebador de 6 meros al azar. El cebador aleatorio puede comprender oligodesoxirribonucleótidos. Alternativamente, el cebador aleatorio incluye oligodesoxinucleótidos. Los ejemplos de cebadores específicos de genes incluyen, pero no se limitan a, cebadores de genes de citocinas y cebadores de genes de mantenimiento. Un cebador promotor puede ser, por ejemplo, un cebador SP6, un cebador promotor T7, un cebador promotor Runx2, un cebador promotor GAPDH, un cebador promotor U6, un cebador promotor T3 y un cebador promotor CaMV 35S. Una molécula diana puede comprender un cebador de oligonucleótido seleccionado del grupo que consiste en 3' AOX1 (para secuencias con terminador AOX1, cebador inverso), 5' AOX1 (para secuencias con promotor AOX1, cebador directo), promotor 35S (promotor CaMV 35S, cebador directo), AC5 (promotor de actina 5C de Drosophila, cebador directo), factor alfa (secuencia señal del factor alfa, cebador directo), Amp-R (extremo 5' del gen de resistencia a ampicilina, cebador inverso), AUG1 directo (para secuencias con AUG1 promotor, cebador directo), AUG1 inverso (para secuencias con promotor AUG1, cebador inverso), BGH inverso (terminador de hormona de crecimiento bovino, cebador inverso), Bglob-intrón-F (intrón de betaglobina de conejo, cebador directo), Bglob-intrón-R (intrón de beta-globina de conejo, cebador inverso), Bglob-pA-R (región poliA de beta-globina de conejo, cebador inverso), CAT-R (extremo 5' del gen de resistencia al cloranfenicol, cebador inverso), CMV directo (promotor humano temprano inmediato CMV, cebador directo), CRE-R (extremo 5' de Cre recombinasa, cebador inverso), CYC1 (señal de terminación de la transcripción CYC1, cebador inverso), DsRed1-C (extremo 3' de DsRed1, cebador directo), DsRed1-N (extremo 5' de DsRed1, cebador inverso), EBV inverso (terminador poliA SV40, cebador inverso), Ecdisona directa (promotor de choque térmico de Drosophila, cebador directo), EF-1a directo (promotor del factor de elongación humano 1a, cebador directo), EGFP-C (extremo 3' de EGFP, cebador directo), EGFP-N (extremo 5' de EGFP, cebador inverso), EXFP-R (para distinguir EGFP de ECFP de EYFP, cebador inverso), F1 ori-F (origen F1, cebador directo), GAL1 (promotor GAL1 de S. cerevisiae, cebador directo), Gal10pro-F (promotor GAL10 de S. cerevisiae, cebador directo), término N de Gal4 (extremo 3' del dominio de unión al ADN de Gal4, cebador directo), Gal4-AD (extremo 3' del dominio de activación de Gal4, cebador directo), GFP-F (extremo 3' de GFP, cebador directo), GFP-R (extremo 5' de GFP, cebador inverso), GPDpro-F (promotor GPD de S. cerevisiae, cebador directo), GW- 3' (extremo 3' del casete Gateway, cebador directo), GW-5' (extremo 5' del casete Gateway, cebador inverso), H1 (promotor H1 humano, cebador directo), HA-F (etiqueta HA, cebador directo) , HA-R (etiqueta HA, cebador inverso), HAT (etiqueta de afinidad de histidina, cebador directo), hGH-PA-R (terminador de la hormona de crecimiento humana, cebador inverso), hrGFP-R (hrGFP (GFP Renilla humanizada), cebador directo), hUBCpro-F (promotor de ubiquitina C (UbC) humana, cebador directo), IRES-F (extremo 3' de IRES, cebador directo), IRES-R (extremo 5' de IRES, cebador inverso), L4440 (5' de MCS en el vector L4440, cebador directo), LacI-R (extremo 5' de LacI, cebador inverso), LacZ-R (extremo 5' de LacZ, cebador inverso), LexA (extremo 3' del dominio de unión al ADN de LexA, cebador directo), LKO.1 5' (promotor U6 humano, cebador directo), LNCX (promotor CMV humano, cebador directo), Luc-F (extremo 3' de luciferasa, cebador directo), LucNrev (extremo 5' de luciferasa, cebador inverso), M13 (-21) directo (en el gen lacZ), M13 (-40) (en el gen lacZ), M13 inverso (en el gen lacZ), M13/pUC directo (en el gen lacZ), M13/pUC inverso (en el gen lacZ), MBP-F (extremo 3' de la proteína de unión a maltosa, cebador directo), mCherry-F (extremo 3' de mCherry, cebador directo), mCherry-R (extremo 5' de mCherry, cebador inverso), MT directo (promotor de metalotioneína de Drosophila, cebador directo), MMLV-F (LTR del virus de la leucemia de Moloney de ratón (MoMuLV), cebador directo), mPGK-F (promotor de PGK de ratón, cebador directo), MSCV (virus de células madre de ratón, cebador directo), MSCV-rev (virus de células madre de ratón, cebador inverso), MT1-F (promotor de metalotioneína 1 de ratón, cebador directo), mU6-F (promotor U6 de ratón, cebador directo ), Myc (etiqueta Myc, cebador directo), Neo-F (extremo 3' de gen de resistencia a neomicina, cebador directo), Neo-R (extremo 5' de gen de resistencia a neomicina, cebador inverso), NOS-F (promotor de nopalina sintasa, cebador directo), Nmt1-F (promotor nmt1 de S. pombe, cebador directo), OpIE2 directo (promotor OpIE2, cebador directo), pACYC-F (origen p15A, cebador directo), pAd-CMV (para sitios de clonación después de SalI en el vector pAd-CMV), pBABE 3' (potenciador SV40, 3' de MCS en vectores pBABE, cebador inverso), pBABE 5' (señal de empaquetamiento Psi, 5' de MCS en vectores pBABE, cebador directo), pBAD directo (para secuencias con el promotor araBAD de E. coli, cebador directo), pBAD inverso (para secuencias con el promotor araBAD de E. coli, cebador inverso), pBluescriptKS (para secuencias del vector pBluescript), pBluescriptSK (para la secuencia del vector pBluescript), pBMN 5' (secuencia MMLV, para inserciones en el vector retroviral pBMN), pBR322ori-F (origen pBRS322, cebador directo), pBRforBam (en la región pBR322 tet, por encima de BamHI, cebador directo), pBRforEco (en pBR322, por encima del sitio EcoRI, cebador directo), pBRrevBam (en la región pBR322 tet, por debajo de BamHI, cebador inverso), pCAG-F (intrón de beta-globina de conejo, para plásmidos pCAG, cebador directo), pCasper-F (extremo 5' del gen miniblanco de Drosophila, cebador inverso), pCasper-hs (promotor Hsp70 de Drosophila, cebador directo), pcDL-F (5' del sitio EcoRI en el vector pcDL, cebador directo), pENTR-F (5' de attL1 en el vector pENTR, cebador directo), pENTR-R (3' de attL2 en el vector pENTR, cebador inverso), pGEX 3' (3' de MCS en vectores pGEX, cebador inverso), pGEX 5' (extremo 3' de glutatión-S-transferasa, cebador directo), pGP704-R (origen gamma R6K, 3' de MCS en el vector pGP704, cebador inverso), pHybLex inverso (terminador ADH, cebador inverso), pLTet-F (promotor de la izquierda temprana (pL) del fago lambda, cebador), pLXSN 5' (virus de células madre de ratón, igual que MSCV, cebador directo), pMRB101-F (proteína temprana inmediata principal (IE) del HCMV, cebador directo), pMT2-F (extremo 3' del intrón sintético, cebador directo), pMX-S1811 (secuencia MMLV, 5' de MCS en el vector pMXs, cebador directo), polihedrina directa (promotor de polihedrina, cebador directo), polihedrina inversa (para vector de baculovirus con promotor de polihedrina, cebador inverso), promotor pQE (5' de MCS en vectores pQE, cebador directo), pREP directo (promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), cebador directo), marcador pRS (para secuenciar el marcador seleccionable de levadura en vectores pRS), Pry1 (elemento P de PZ, cebador inverso) , pTrcHis directo (5' de MCS en el vector pTrcHis, cebador directo), pTrcHis inverso (3' de MCS en el vector pTrcHis, igual que pBAD-R, cebador inverso), Puro-F (extremo 3' de gen de resistencia a la puromicina, cebador directo), pZIP (virus de la leucemia de ratón (MuLV), cebador inverso), RCAS-F (gen env 3' del virus del sarcoma de Rous (RSV), cebador directo), Rluc-F (extremo 3' de Renilla luciferasa, cebador directo), RVprimer3 (5' de MCS en el vector pGL3, cebador directo), SFFV-F (virus formador de foco del bazo 5' LTR, cebador directo), SP6 (promotor SP6, cebador directo), SV40pA-R (SV40 poliA, cebador inverso), SV40pro-F (promotor/origen de SV40, cebador directo), SV40-spliceR (secuencia de división de SV40, cebador inverso), T3 (promotor T3, cebador directo), T7 (promotor T7, cebador directo), T7 terminal (terminador T7, cebador inverso), promotor Tac (promotor Tac, cebador directo), tdTomato-Fwd (extremo 3' de tdTomato, cebador directo), tdTomato-Rev (extremo 5' de tdTomato, cebador inverso), Tet-R (extremo 5' del gen de resistencia a la tetraciclina, cebador inverso), TK-pA-R (timidina quinasa poliA, cebador inverso), extremo Tn7 (transposón bacteriano Tn7), TRC-F (promotor U6 humano, cebador directo), Ubx- F (gen de Drosophila Ultrabithorax, cebador directo), V5 inverso (epítopo V5, cebador inverso), WPRE-R (extremo 5' de WPRE, cebador inverso), XBG-R (3'UTR de beta-globina de Xenopus, cebador inverso), XEF1 a (potenciador/promotor alfa EF1 de Xenopus, cebador directo) y Xpress directo (epítopo Xpress, cebador directo).
Una molécula diana de la descripción puede comprender una molécula de ARN. El ARN puede ser un ARN que codifica una proteína. El ARN que codifica la proteína puede ser un ARNm. El ARN puede ser un ARN no codificante (ARNnc). El ARNnc puede ser un ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), ARN interferente pequeño (ARNsi), microARN (miARN), ARN nuclear pequeño (ARNsn), ARN nucleolar pequeño (ARNsno), ARN largo no codificante (ARNInc), y ARN de interacción Piwi (ARNpi). El a Rn puede ser un ARN sintético. Los ejemplos de ARN sintético incluyen, pero no se limitan a, un ARN antisentido, ARN en horquilla corta (ARNhc), ARN complementario (ARNc). El ARn puede derivarse de un exón. El ARN puede derivarse de un intrón. El ARN puede derivarse de una región no traducida (UTR). El ARN se puede poliadenilar. En algunos casos, el ARN no está poliladenilado.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una molécula de ADN. El ADN puede ser ADN genómico (ADNg) o ADN complementario (ADNc). El ADN puede ser B-ADN. El ADN puede ser A-ADN. El ADN puede ser Z-ADN. El ADN puede comprender al menos una parte de una región codificante de proteínas. El ADN puede comprender al menos una parte de un gen. El ADN puede comprender un exón. El ADN puede comprender un intrón. El ADN puede comprender una región no traducida (UTR). El ADN puede comprender al menos una parte de un ADN no codificante. El ADN no codificante puede comprender una secuencia que se transcribe en un ARN no codificante. El ADN no codificante puede comprender un elemento regulador. El elemento regulador puede ser un elemento regulador cis. El elemento regulador puede ser un elemento transregulador. El elemento regulador puede ser un promotor. El promotor puede facilitar la transcripción de un gen. El promotor puede ubicarse cadena arriba de una región codificante. El elemento regulador puede ser un potenciador. El potenciador puede ejercer efectos distantes sobre el nivel de transcripción de genes. El ADN no codificante puede comprender un pseudogén. El ADN no codificante puede comprender transposones o retrotransposones. El ADN no codificante puede comprender secuencias repetidas tales como elementos nucleares intercalados largos (LINES) y elementos nucleares intercalados cortos (SINES). El SINE puede comprender una secuencia Alu. El ADN no codificante puede comprender elementos víricos. El ADN no codificante puede comprender telómeros.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un carbohidrato. Un carbohidrato puede ser un monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacárido. Los ejemplos de monosacáridos incluyen, pero no se limitan a, gliceraldehídos, galactosamina, glucosamina, ácido siálico, N-acetilglucosamina, sulfoquinovosa, piranosa, glucopiranosa, furanosa, glucosa, fructosa y galactosa. El disacárido puede ser sacarosa, lactosa, trehalosa, celobiosa o maltosa. El oligosacárido puede ser fructooligosacáridos, galactooligosacáridos y mananooligosacáridos. El polisacárido puede ser un polisacárido de almacenamiento. El polisacárido puede ser un polisacárido estructural. Los ejemplos de polisacáridos incluyen, pero no se limitan a, almidón, glucógeno, quitina, amilasa, amilopectina ramificada, callosa o laminarina, crisolaminarina, xilano, arabinoxilano, manano, fucoidano, galactomanano y celulosa.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un compuesto orgánico. Generalmente, un compuesto orgánico es un compuesto cuyas moléculas contienen carbono. El compuesto orgánico puede ser un compuesto natural. Generalmente, los compuestos orgánicos naturales se refieren a aquellos que son producidos por plantas o animales. Los ejemplos de compuestos orgánicos naturales incluyen la mayoría de los azúcares, algunos alcaloides y terpenoides, ciertos nutrientes como la vitamina B12. El compuesto orgánico puede ser un compuesto sintético. Generalmente, un compuesto orgánico sintético se puede preparar mediante la reacción de otros compuestos que se denominan "sintéticos". Los polímeros, incluidos plásticos y cauchos, pueden ser compuestos orgánicos sintéticos o semisintéticos. Algunos compuestos orgánicos se pueden fabricar utilizando la bioquímica de organismos como bacterias y levaduras. El compuesto orgánico puede ser una molécula pequeña, alcohol, ácido graso, policétido, hormona o carbohidrato.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un compuesto inorgánico. Generalmente, un compuesto que no se denomina compuesto orgánico es un compuesto inorgánico. Los ejemplos de compuestos inorgánicos que contienen carbono incluyen, pero no se limitan a, carburos, carbonatos, óxidos simples de carbono (tales como CO y CO2) y cianuros. Los compuestos inorgánicos pueden incluir puntos cuánticos, nanopartículas metálicas, nanopartículas de óxidos metálicos y similares. Los compuestos inorgánicos también pueden incluir minerales, sulfuros, compuestos organometálicos y compuestos bioinorgánicos. El mineral puede ser talco, yeso, calcita, fluorita, apatita, ortoclasa, cuarzo, topacio, corindón o diamante.
Una molécula diana de la descripción puede comprender una molécula pequeña. Una molécula pequeña puede comprender un péptido. El péptido comprende uno o más aminoácidos. El aminoácido puede ser un aminoácido natural. El aminoácido puede ser un aminoácido no natural. El aminoácido puede ser un D-aminoácido. El aminoácido puede ser un L-aminoácido. Los ejemplos de aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, p-acetilfenalalanina, macetilfenalalanina, alanina, p-alanina, ácido Y-aminobórico (GABA), ácido aminoisobutírico, ácido 5-aminolevulínico, ácido 4-aminobenzoico (PABA), arginina, asparagina, ácido aspártico, p-benxoil-1-fenilalanina, citrulina, cistationina, cisteína, cistina, ácido diaminopimélico, ácido Djenkólico, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, lantionina, leucina, lisina, meitina fenilalanina, fenilselenidilalanina, prolina, selenocisteína, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina. La molécula pequeña puede comprender un agente terapéutico.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un metabolito. Los ejemplos de metabolitos incluyen, pero no se limitan a, alcaloides, glucósidos, lípidos, péptidos no ribosómicos, tales como actinomicina-d, fenazinas, fenoles naturales (incluidos flavonoides), policétidos, terpenos, incluidos esteroides y tetrapirroles.
Una molécula diana de la descripción puede comprender un agente terapéutico. Un agente terapéutico puede comprender un compuesto orgánico, compuesto inorgánico, péptido, hormona, molécula pequeña, anticuerpo, antígeno, hapteno o cualquier combinación de los mismos. El agente terapéutico puede ser un antipirético, analgésico, fármaco antipalúdico, antibiótico, antiséptico, estabilizador del estado de ánimo, reemplazo hormonal, anticonceptivo oral, estimulante, tranquilizante, fármaco antivírico, fármaco contra el cáncer, inmunosupresor y estatina. El tranquilizante puede ser meprobamato, clorpromazina, reserpina, clordiazepóxido, diazepam y alprazolam. La estatina puede ser lovastatina, pravastatina o simvastatina.
En algunas realizaciones, un sustrato proporcionado aquí contiene una pluralidad de características. Una pluralidad de características en un sustrato también se denomina en el presente documento una matriz o una matriz de características.
En la Figura 5 se representa un sustrato ejemplar que comprende dos o más características. Como se muestra en la Figura 5, un sustrato (501) puede comprender dos o más características (502, 503). Una primera característica (502) puede comprender una pluralidad de primeros cebadores de captura (504, 505, 506) y una pluralidad de segundos cebadores de captura (507, 508, 509). La primera característica (502) puede comprender además un primer polinucleótido diana (510). El primer polinucleótido diana (510) se puede colocar en la primera característica (502) por unión del primer polinucleótido diana (510) a un primer cebador de captura (504). La primera característica (502) puede comprender además una pluralidad de amplicones (512, 513, 514, 515, 516). La pluralidad de amplicones (512, 513, 514, 515, 516) puede comprender amplicones del primer polinucleótido diana (510). La primera característica (502) puede comprender además una primera molécula diana (511). La primera molécula diana (511) se puede unir al primer polinucleótido diana (510). Una segunda característica (503) puede comprender una pluralidad de primeros cebadores de captura (520, 521, 522) y una pluralidad de segundos cebadores de captura (523, 524, 525). La segunda característica (503) puede comprender además un segundo polinucleótido diana (526). El segundo polinucleótido diana (526) se puede colocar en la segunda característica (503) por unión del segundo polinucleótido diana (526) a un segundo cebador de captura (520). La segunda característica (503) puede comprender además una pluralidad de amplicones (528, 529, 530, 531, 532). La pluralidad de amplicones (528, 529, 530, 531, 532) puede comprender amplicones del segundo polinucleótido diana (526). La segunda característica (503) puede comprender además una segunda molécula diana (527). La segunda molécula diana (527) se puede unir al segundo polinucleótido diana
(526). El sustrato puede comprender dos o más características idénticas. Por ejemplo, la primera característica (502) y la segunda característica (503) pueden ser idénticas. El sustrato puede comprender dos o más características diferentes. Por ejemplo, la primera característica (502) y la segunda característica (503) pueden ser diferentes. La primera característica (502) y la segunda característica (503) pueden diferir en los primeros cebadores de captura asociados con cada característica. Por ejemplo, la pluralidad de primeros cebadores de captura (504, 505, 506) de la primera característica (502) puede ser diferente de la pluralidad de primeros cebadores de captura (520, 521,522) de la segunda característica (503). La primera característica (502) y la segunda característica (503) pueden diferir en los segundos cebadores de captura asociados con cada característica. Por ejemplo, la pluralidad de segundos cebadores de captura (507, 508, 509) de la primera característica (502) puede ser diferente de la pluralidad de segundos cebadores de captura (523, 524, 525) de la segunda característica (503). La primera característica (502) y la segunda característica (503) pueden diferir en el polinucleótido diana asociado con cada característica. Por ejemplo, el primer polinucleótido diana (510) de la primera característica (502) puede ser diferente del segundo polinucleótido diana (526) de la segunda característica (503). Posteriormente, la pluralidad de amplicones (512, 513, 514, 515, 516) de la primera característica (502) puede ser diferente de la pluralidad de amplicones (528, 529, 530, 531, 532) de la segunda característica (503). La primera característica (502) y la segunda característica (503) pueden diferir en la molécula diana asociada con cada característica. Por ejemplo, la primera molécula diana (511) de la primera característica (502) puede ser diferente de la segunda molécula diana (527) de la segunda característica (503). La primera característica puede comprender además una o más moléculas diana adicionales. La segunda característica puede comprender además una o más moléculas diana adicionales. La una o más moléculas diana adicionales de la primera característica pueden ser las mismas que las una o más moléculas diana adicionales de la segunda característica. Alternativamente, o adicionalmente, la una o más moléculas diana adicionales de la primera característica pueden ser diferentes de la una o más moléculas diana adicionales de la segunda característica.
Un sustrato que tiene una pluralidad de características puede aparecer como una cuadrícula de puntos o parches. Las características se pueden ubicar en un patrón repetido. Alternativamente, o adicionalmente, las características pueden ubicarse en un patrón irregular no repetitivo. En algunas realizaciones, los patrones son patrones hexagonales, patrones rectilíneos, patrones de rejilla, patrones que tienen simetría de reflexión, patrones que tienen simetría rotacional o similares. También pueden ser útiles los patrones asimétricos. La inclinación puede ser la misma entre los diferentes pares de características vecinas más cercanas, o la inclinación puede variar entre los diferentes pares de características vecinas más cercanas.
Un sustrato que tiene una pluralidad de características y los métodos establecidos en este documento que usan tales matrices pueden tener características en cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 características/cm2, 100 características/cm2, 500 características/cm2, 1.000 características/cm2, 5.000 características/cm2, 10.000 características/cm2, 50.000 características/cm2, 100.000 características/cm2, 1.000.000 características/cm2, 5.000.000 características/cm2, o más.
En realizaciones particulares, las características de una matriz pueden tener cada una un área mayor de aproximadamente 100 nm2, 250 nm2, 500 nm2, 1 gm2, 2,5 gm2, 5 gm2, 10 gm2, 100 gm2 o 500 gm2. Alter adicionalmente, las características de una matriz pueden tener cada una un área menor de aproximadamente 1 mm2,
500 gm2, 100 gm2, 25 gm2, 10 gm2, 5 gm2, 1 gm2, 500 nm2 o 100 nm2. De hecho, una región puede tener un tamaño que esté en un rango entre un límite superior y uno inferior seleccionados, por ejemplo, entre los ejemplificados anteriormente.
En algunas realizaciones, las características de la superficie de un sustrato de matriz no son contiguas y están separadas por regiones intersticiales de la superficie. Las regiones intersticiales que tienen una cantidad o concentración sustancialmente menor de cebadores de captura u otros agentes de captura, en comparación con las características de la matriz, pueden ser útiles. Las regiones intersticiales que carecen de cebadores de captura u otros agentes de captura son particularmente útiles. Por ejemplo, una cantidad relativamente pequeña o la ausencia de agentes de captura en las regiones intersticiales favorece la localización de al menos un polinucleótido diana, y de los grupos de amplicones generados posteriormente, en las características deseadas.
En realizaciones particulares, las características son características cóncavas en una superficie (p.ej., pocillos) y las características pueden contener un material de gel. Las características que contienen gel están separadas entre sí por regiones intersticiales en la superficie donde el gel está sustancialmente ausente o, si está presente, el gel es sustancialmente incapaz de soportar la localización de polinucleótidos incluyendo, por ejemplo, cebadores de captura.
En algunas realizaciones, los pocillos son micropocillos o nanopocillos. Los métodos y composiciones para fabricar y usar sustratos que tienen características que contienen gel, tales como pocillos, se establecen, por ejemplo, en el documento US 2014/0243224.
En algunas realizaciones, el tamaño de la característica (p.ej., área, diámetro y similares) en una matriz se selecciona en un rango que favorece la amplificación por exclusión cinética (KEA) y la formación de una ubicación molecular individual en la característica. A modo de ejemplo, en referencia a realizaciones que emplean pocillos como características, el
tamaño del pocilio (p.ej., el diámetro) puede variar entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 1 pm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 800 nm, entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 600 nm, o entre 100 nm y aproximadamente 400 nm. En algunas realizaciones, el pocilio tiene un diámetro de aproximadamente 400 nm. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de menos de aproximadamente 1 pm. Las micromatrices ejemplares incluyen micromatrices en celdas de flujo con patrón Illumina® HiSeq-X10.
En algunas realizaciones que incluyen una serie de características en una superficie, las características pueden ser discretas, separadas por regiones intersticiales. El tamaño de las características y/o el espaciado entre las regiones puede variar de manera que las matrices pueden ser de alta densidad, densidad media o densidad más baja.
En algunas realizaciones, las matrices son matrices de alta densidad, densidad media o baja densidad. Las matrices de alta densidad se caracterizan por tener regiones separadas por menos de aproximadamente 15 pm. Las matrices de densidad media tienen regiones separadas por aproximadamente de 15 a 30 pm, mientras que las matrices de baja densidad tienen regiones separadas por más de 30 pm. Una matriz útil en la invención puede tener regiones que están separadas por menos de 100 pm, 50 pm, 10 pm, 5 pm, 1 pm o 0,5 pm.
En algunas realizaciones, las matrices contienen perlas. En algunas realizaciones, las perlas están ubicadas en una superficie que incluye aquellas en las que las perlas están ubicadas en pocillos, tal como una matriz BeadChip (Illumina Inc., San Diego, CA) o sustratos utilizados en plataformas de secuenciación de 454 LifeSciences (una subsidiaria de Roche, Basilea, Suiza) o Ion Torrent (una subsidiaria de Life Technologies, Carlsbad, California). Otras matrices que tienen perlas ubicadas en una superficie se describen en las Patentes de EE.UU. n° 6.266.459; 6.355.431; 6.770.441 ; 6.859.570; 6.210.891; 6.258.568; 6.274.320; en los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; US 2010/0282617 A1 o en la Publicación de Patente Internacional n° No. WO 00/63437. Varias de las referencias anteriores describen métodos para unir polinucleótidos diana (o cebadores de captura) a perlas antes de cargar las perlas en o sobre un sustrato de matriz. Sin embargo, se entenderá que las perlas se pueden preparar de tal modo que incluyan cebadores de captura y las perlas se pueden usar luego para cargar una matriz, formando así sitios de amplificación para usar en un método establecido en este documento. Como se ha indicado anteriormente en el presente documento, los sustratos se pueden usar sin perlas.
En algunas realizaciones, las composiciones de perlas ejemplares incluyen, pero no se limitan a, plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de óxido de torio, grafito de carbono, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como Sepharosa, celulosa, nailon, micelas reticuladas y teflón, así como cualquier otro material descrito en este documento para soportes sólidos. El documento "Microsphere Detection Guide" de Bangs Laboratories, Fishers Ind. es una guía útil. En determinadas realizaciones, las microesferas son microesferas o perlas magnéticas.
Por consiguiente, la descripción proporciona un sustrato que tiene (a) una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados en una característica; (b) al menos un polinucleótido diana, un extremo unido a uno de dichos cebadores de captura y el otro extremo unido a una molécula diana, en el que dicho polinucleótido diana comprende una región diana flanqueada por regiones de unión al primer y segundo cebador de captura, complementarias a dichos primer y segundo cebadores de captura, comprendiendo dicha región de unión del segundo cebador de captura un emparejamiento erróneo de pares de bases con dicho segundo cebador de captura, y (c) una pluralidad de amplicones clonales complementarios a dicho polinucleótido diana inmovilizado a dicha característica. El sustrato puede tener una característica o una pluralidad de características. La característica o características pueden ser una perla, un pocillo, que incluye un micropocillo o nanopocillo, canal, reborde, proyección o combinación de los mismos. La característica o características incluyen una molécula diana individual. La característica o características pueden llenarse al máximo con una pluralidad de amplicones clonales de un polinucleótido diana. Las regiones intersticiales entre una pluralidad de características pueden carecer de un polinucleótido diana. El sustrato que tiene una pluralidad de características, incluidas dos o más características, puede tener diferentes moléculas diana individuales en cada una de las diferentes características dentro de la pluralidad. El polinucleótido diana en una característica incluye uno o más polinucleótidos seleccionados entre ARN, ADN, PNA o ADN bicatenario (dsDNA). La longitud del polinucleótido diana en una característica puede ser inferior a 1000 nucleótidos. La longitud del polinucleótido diana en una característica puede estar entre 10 y 25, 26 y 50, 51 y 100, 101 y 200, 201 y 300, 301 y 400, 401 y 500, 501 y 600, 601 y 700, 701 y 800, 801 y 900 o 901 y 1000 nucleótidos. La molécula diana puede ser un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato, aminoácido, nucleótido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico. Las moléculas de polipéptido diana pueden ser un nanoporo, un polipéptido de unión o una enzima. Un nanoporo puede ser MspA, OmpF, OmpG, NalP, WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina del ántrax, leucocidinas o un nanoporo de origami de ADN. Un polipéptido de unión puede ser un anticuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, un minicuerpo y un anticuerpo de dominio único (sdAB) o un receptor de células T. Una enzima puede ser una polimerasa, helicasa, recombinasa, transposasa o ligasa. El sustrato puede ser uno o más materiales seleccionados entre vidrio, silicio, plástico o biopolímero. El sustrato puede incluir además un hidrogel o un gel unido covalentemente.
La descripción proporciona además un método para colocar una molécula diana individual en una característica de un sustrato. El método incluye (a) hibridar una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados a una característica en un sustrato con (b) al menos un polinucleótido diana, comprendiendo dicho polinucleótido diana una región diana flanqueada por regiones de unión de primer y segundo cebador de captura complementarias a dicho primer y segundo cebadores de captura, en el que dicha región de unión del segundo cebador de captura comprende un emparejamiento erróneo de pares de bases con dicho segundo cebador de captura y está unido a una molécula diana, y (c) amplificar dicho al menos un polinucleótido diana a una tasa de amplificación promedio que excede una tasa de transporte promedio de un polinucleótido diana a una característica para producir una pluralidad de amplicones clonales complementarios a dicho polinucleótido diana.
Una amplificación de exclusión cinética (KEA) permite la amplificación de un único polinucleótido diana por característica en un sustrato que incluye, por ejemplo, una celda de flujo con patrón que tiene pocillos, y la producción de una población de polinucleótidos diana monoclonales en uno o más de los pocillos. Los métodos para realizar KEA son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento US 2013/0338042 A1. En una KEA, la velocidad de amplificación del primer polinucleótido diana capturado dentro de una característica es mucho más rápida en relación con las velocidades mucho más lentas de transporte y captura de los polinucleótidos diana. El primer polinucleótido diana capturado en una característica se puede amplificar rápidamente y llenar toda la característica, evitando la captura de polinucleótidos diana adicionales en la misma característica.
La presente descripción se basa, en parte, en la constatación de que la eficacia de una KEA con respecto a la producción de poblaciones de polinucleótidos diana monoclonales en características tales como nanopocillos de células de flujo estructuradas disminuye a medida que aumenta el tamaño de las características o nanopocillos. La amplificación de un primer polinucleótido diana capturado y el llenado de una característica con una población monoclonal de polinucleótidos diana es más lenta en las características más grandes que en las más pequeñas, mientras que la captura de un segundo polinucleótido diana es más rápida en las características más grandes que en las más pequeñas. Por tanto, la probabilidad de que se capture y amplifique más de un polinucleótido diana dentro de una característica aumenta con el tamaño de la característica. La calidad de los datos de un interrogatorio molecular de una característica es óptima para poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana. La calidad de los datos de la característica disminuye a medida que aumenta la proporción de polinucleótidos diana distintos del primer polinucleótido diana inmovilizado.
En la Figura 1 se ilustra un ejemplo específico del uso de KEA para la colocación de una molécula diana individual en cada una de una pluralidad de características. Brevemente, las características de un sustrato se modelan con cebadores de captura inmovilizados, por ejemplo PAZAM dentro de nanopocillos injertados con un par de cebadores de captura P5 y P7. La molécula diana, tal como la polimerasa o un polipéptido nanoporoso (que se muestra como una estrella en la Figura 1) se une al extremo de un polinucleótido diana bicatenario mediante conjugación química. El polinucleótido diana se puede amplificar usando KEA (también conocido como amplificaciones de polimerasa recombinasa (RPA)) con, por ejemplo, un kit TwistDX disponible comercialmente. RPA es un tipo de método de amplificación que se utiliza principalmente en disolución libre. Pero KEA es un tipo de reacción de RPA localizada en la que la amplificación se puede llevar a cabo en un espacio semicerrado, como un sustrato sólido o una superficie de perlas, para generar grupos monoclonales de nucleótidos dirigidos. La amplificación consume rápidamente los cebadores en la característica, evitando y/o reduciendo significativamente la siembra y amplificación de un polinucleótido diana diferente y, por lo tanto, eliminando o reduciendo la probabilidad de cargar las otras moléculas diana.
En algunas realizaciones, la amplificación isotérmica se puede realizar usando amplificación de exclusión cinética (KEA), también denominada amplificación de exclusión (ExAmp). Se puede preparar una biblioteca de ácidos nucleicos de la presente descripción usando un método que incluye un paso de hacer reaccionar un reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación, incluyendo cada uno una población sustancialmente clonal de amplicones de un ácido nucleico diana individual que ha sembrado el sitio. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación prosigue hasta que se genera un número suficiente de amplicones para llenar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. Llenar un sitio ya sembrado hasta su capacidad de esta manera inhibe que los ácidos nucleicos diana se posen y se amplifiquen en el sitio, produciendo así una población clonal de amplicones en el sitio. En algunas realizaciones, se puede lograr una clonalidad aparente incluso si un sitio de amplificación no está lleno hasta su capacidad antes de que llegue un segundo ácido nucleico diana al sitio. En algunas condiciones, la amplificación de un primer ácido nucleico diana puede llevarse a cabo hasta un punto en el que se haga un número suficiente de copias para competir eficazmente o abrumar la producción de copias de un segundo ácido nucleico diana que se transporta al sitio. Por ejemplo, en una realización que usa un proceso de amplificación puente en una característica circular que es menor de 500 nm en diámetro, se ha determinado que después de 14 ciclos de amplificación exponencial para un primer ácido nucleico diana, la contaminación de un segundo ácido nucleico diana en el mismo sitio producirá un número de amplicones contaminantes insuficiente como para afectar negativamente al análisis de secuenciación por síntesis en una plataforma de secuenciación de Illumina.
Tal como se demuestra con el ejemplo anterior, los sitios de amplificación en una matriz pueden ser, aunque no necesariamente, completamente clonales en realizaciones particulares. Más bien, para algunas aplicaciones, un sitio de amplificación individual puede estar poblado predominantemente con amplicones de un primer ácido nucleico diana y también puede tener un nivel bajo de amplicones contaminantes de un segundo ácido nucleico diana. Una matriz puede tener uno o más sitios de amplificación que tengan un nivel bajo de amplicones contaminantes siempre que el nivel de contaminación no tenga un impacto inaceptable en un uso posterior de la matriz. Por ejemplo, cuando la matriz se va a utilizar en una aplicación de detección, un nivel aceptable de contaminación sería un nivel que no afecta la relación señal-ruido o a la resolución de la técnica de detección de una manera inaceptable. Por consiguiente, la clonalidad aparente será generalmente relevante para un uso o aplicación particular de una matriz fabricada mediante los métodos aquí expuestos. Los niveles de contaminación ejemplares que pueden ser aceptables en un sitio de amplificación individual para aplicaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, como máximo un 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10% o 25% de amplicones contaminantes. Una matriz puede incluir uno o más sitios de amplificación que tengan estos niveles ejemplares de amplicones contaminantes. Por ejemplo, hasta el 5%, 10%, 25%, 50%, 75% o incluso 100% de los sitios de amplificación en una matriz pueden tener algunos amplicones contaminantes. Se entenderá que, en una matriz u otra colección de sitios, al menos el 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% o más de los sitios pueden ser clonales o aparentemente clonales.
En algunas realizaciones, la exclusión cinética puede ocurrir cuando un proceso ocurre a una velocidad suficientemente rápida para excluir de manera efectiva que ocurra otro evento o proceso. Tomemos, por ejemplo, la fabricación de una matriz de ácido nucleico donde los sitios de la matriz se siembran aleatoriamente con ácidos nucleicos diana de una disolución y se generan copias del ácido nucleico diana en un proceso de amplificación para llenar cada uno de los sitios sembrados hasta su capacidad. De acuerdo con los métodos de exclusión cinética de la presente descripción, los procesos de siembra y amplificación pueden proceder simultáneamente en condiciones en las que la tasa de amplificación excede la tasa de siembra. Como tal, la velocidad relativamente rápida a la que se hacen las copias en un sitio que ha sido sembrado por un primer ácido nucleico diana excluirá eficazmente la siembra de un segundo ácido nucleico en el sitio para la amplificación. Los métodos de amplificación por exclusión cinética se pueden realizar como se describe en detalle en la descripción de la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2013/0338042.
La exclusión cinética puede aprovechar una velocidad relativamente lenta para iniciar la amplificación (p.ej., una velocidad lenta para hacer una primera copia de un ácido nucleico diana) frente a una velocidad relativamente rápida para hacer copias posteriores del ácido nucleico diana (o de la primera copia del ácido nucleico diana). En el ejemplo del párrafo anterior, la exclusión cinética se produce debido a la tasa relativamente lenta de siembra de ácido nucleico diana (p.ej., difusión o transporte relativamente lento) frente a la velocidad relativamente rápida a la que se produce la amplificación para llenar el sitio con copias de la semilla de ácido nucleico. En otra realización ejemplar, la exclusión cinética puede ocurrir debido a un retraso en la formación de una primera copia de un ácido nucleico diana que ha sembrado un sitio (p.ej., activación retardada o lenta) frente a la velocidad relativamente rápida a la que se realizan copias posteriores para llenar el sitio. En este ejemplo, un sitio individual puede haber sido sembrado con varios ácidos nucleicos diana diferentes (p.ej., varios ácidos nucleicos diana pueden estar presentes en cada sitio antes de la amplificación). Sin embargo, la formación de la primera copia para cualquier ácido nucleico diana dado se puede activar aleatoriamente de modo que la velocidad media de formación de la primera copia sea relativamente lenta en comparación con la velocidad a la que se generan las copias posteriores. En este caso, aunque un sitio individual puede haber sido sembrado con varios ácidos nucleicos diana diferentes, la exclusión cinética permitirá que solo uno de esos ácidos nucleicos diana sea amplificado. Más específicamente, una vez que se ha activado un primer ácido nucleico diana para la amplificación, el sitio se llenará rápidamente hasta su capacidad con sus copias, evitando así que se produzcan copias de un segundo ácido nucleico diana en el sitio.
Un reactivo de amplificación puede incluir componentes adicionales que faciliten la formación de amplicones y, en algunos casos, aumenten la velocidad de formación de amplicones. Un ejemplo es una recombinasa. La recombinasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir la invasión/extensión repetidas. Más específicamente, la recombinasa puede facilitar la invasión de un ácido nucleico diana por la polimerasa y la extensión de un cebador por la polimerasa usando el ácido nucleico diana como plantilla para la formación de amplicones. Este proceso se puede repetir como una reacción en cadena en la que los amplicones producidos en cada ronda de invasión/extensión sirven como plantillas en una ronda posterior. El proceso puede ocurrir más rápidamente que la PCR estándar ya que no es necesario un ciclo de desnaturalización (p.ej. mediante calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por recombinasa se puede llevar a cabo de forma isotérmica. Generalmente es deseable incluir ATP u otros nucleótidos (o en algunos casos análogos no hidrolizables del mismo) en un reactivo de amplificación facilitado por recombinasa para facilitar la amplificación. Una mezcla de recombinasa y proteína de unión monocatenaria (SSB) es particularmente útil, ya que la SSB puede facilitar aún más la amplificación. Las formulaciones ejemplares para la amplificación facilitada por recombinasa incluyen las vendidas comercialmente como kits TwistAmp por TwistDx (Cambridge, Reino Unido). Los componentes útiles del reactivo de amplificación facilitado por recombinasa y las condiciones de reacción se establecen en las Patentes de EE.UU. n° 5.223.414 y 7.399.590.
Otro ejemplo de un componente que puede incluirse en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicones y en algunos casos para aumentar la velocidad de formación de amplicones es una helicasa. La helicasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir una reacción en cadena de formación de amplicones. El proceso puede ocurrir más rápidamente que la PCR estándar, ya que no es necesario un ciclo de desnaturalización (p.ej. mediante calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por helicasa se puede llevar a cabo de forma isotérmica. Una mezcla de helicasa y proteína de unión monocatenaria (SSB) es particularmente útil ya que la SSB puede facilitar aún más la amplificación. Las formulaciones ejemplares para la amplificación facilitada por helicasa incluyen las que se venden comercialmente como kits IsoAmp de Biohelix (Beverly, MA). Además, se describen ejemplos de formulaciones útiles que incluyen una proteína helicasa en las Patentes de EE.UU. n° 7.399.590 y 7.829.284.
Otro ejemplo adicional de un componente que puede incluirse en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicones y, en algunos casos, aumentar la velocidad de formación de amplicones es una proteína de unión al origen.
Se pueden utilizar KEA u otros métodos de amplificación isotérmica en un esquema de amplificación en puente para anclar a una característica un único polinucleótido diana que tiene una molécula diana individual. Aunque la amplificación del polinucleótido diana se puede realizar desde ambos extremos, es útil amplificar linealmente desde el extremo distal a la molécula diana unida para evitar o reducir la pérdida de polinucleótidos diana (y de molécula diana unida) de algunas características. La amplificación lineal del polinucleótido diana se puede lograr incorporando uno o más emparejamientos erróneos de pares de bases en la región de unión del cebador de captura de un polinucleótido diana que está próximo a la molécula diana unida. La región de unión del cebador de captura de la hebra complementaria que no está unida a la molécula diana puede ser complementaria a su cebador de captura correspondiente en el sustrato. Siguiendo esta configuración ejemplar, la primera ronda de KEA amplificará linealmente ambas cadenas del polinucleótido diana. Sin embargo, las rondas posteriores de amplificación amplificarán linealmente la hebra de polinucleótido diana unida a la molécula diana y amplificarán exponencialmente el amplicón producido a partir de la hebra complementaria.
El emparejamiento erróneo dentro de la región de unión del cebador de captura se puede colocar en cualquier ubicación siempre que inhiba o retarde la invasión del cebador de captura afín y/o la extensión del cebador con una polimerasa. Colocar el emparejamiento erróneo al final de la región de unión complementaria a un cebador de captura afín como se ejemplifica en las Figuras 4 y 6 es particularmente útil porque crea una baja probabilidad de invasión de la hebra usando una recombinasa e inhibe y/o reduce la extensión por una polimerasa porque el cebador de captura no se hibrida en el extremo 3' con el polinucleótido diana.
En la Figura 4 se ilustra el diseño ejemplar anterior para colocar al menos una molécula diana en una característica o al menos una molécula diana en cada una de una pluralidad de características a través de KEA. Brevemente, debido a que la molécula diana puede difundirse si la KEA desplaza la hebra de polinucleótido conjugada con la molécula diana, el polinucleótido diana se puede construir con uno o más pares de bases no emparejados en las regiones del cebador de captura. La Figura 4 ilustra un polinucleótido diana que consiste en una región diana PhiX flanqueada por regiones de cebadores de captura. El extremo 3' (cadena inferior) del polinucleótido diana ds ilustra una región de unión del cebador de captura (P5') que incluye una región de unión del cebador de secuenciación (SBS3'). El extremo 5' (cadena inferior) ilustra una región de unión del cebador de captura (P7) que incluye una región de unión del cebador de secuenciación (SBS8). La configuración de la hebra complementaria se ilustra en la hebra superior del polinucleótido diana. Aunque se puede utilizar cualquier desajuste de pares de bases, en esta realización ilustrativa la región de unión del cebador de captura P7/P7' contiene un emparejamiento erróneo de tres pares de bases correspondiente a la secuencia de desajuste CCC/CTA que se introduce en el extremo 3' de la secuencia P7. En el extremo 5' de la hebra P7 mutada o no coincidente, se puede utilizar la conjugación química para unir el polinucleótido diana a la molécula diana, que se ilustra con una estrella en la Figura 4. Alternativamente, se puede utilizar un sitio abásico o poli-8oxo-G (7,8-dihidro-8-oxo-guanina) para conservar la molécula de plantilla primaria (secuencia P7).
La Figura 6 representa la primera y la segunda rondas de KEA usando el diseño de polinucleótidos diana ejemplificado anteriormente. La característica se ilustra mediante las marcas de cepillado sombreadas en los extremos derecho e izquierdo del polinucleótido objetivo. Unidos a la característica hay cebadores de captura denominados P5 y P7. Los óvalos que decoran el cebador de captura ilustran la inclusión de la proteína SSB. Estos cebadores de captura son complementarios a las regiones de unión del cebador de captura P5' y P7' que flanquean la región diana del polinucleótido diana. La región de unión del cebador de captura de P7 adyacente o próxima a la molécula diana unida no es idéntica ni complementaria a la P7, por lo que previene o reduce la invasión de la hebra durante la KEA. Tal como se muestra en la Figura 6, la hebra regular o estándar de P5-SBS3-phiX-SBS8'-P7' que es complementaria a un cebador de captura P7 sufrirá una amplificación exponencial durante la KEA para consumir el cebador P5/P7 en una característica tal como un nanopocillo. Por el contrario, la invasión de la hebra se inhibirá a partir del extremo P7 de la hebra mutada o no emparejada. Como resultado, la molécula diana unida al polinucleótido diana permanecerá hibridada con el amplicón unido al sustrato.
Por consiguiente, los métodos proporcionados en este documento pueden emplear una captura e inmovilización inicial de un único polinucleótido diana por característica o pocillo de, por ejemplo, un sustrato con patrón tal como una celda de flujo usando un primer par de cebadores de captura como se ejemplificó anteriormente. La captura inicial del polinucleótido diana puede ir seguida de una amplificación inicial del polinucleótido diana único para producir una población monoclonal de amplicones de polinucleótido diana dentro de la característica por medio de, por ejemplo, KEA. El polinucleótido diana inicial que tiene una molécula diana unida permanecerá inmovilizado en la característica mediante, por ejemplo, hibridación con un cebador de captura inmovilizado en el extremo distal a la molécula diana.
Además, los métodos proporcionados en el presente documento pueden emplear cualquiera de los componentes descritos anteriormente, tales como cebadores de captura, regiones de unión del cebador de captura, polinucleótidos diana, moléculas diana y similares, en referencia a un sustrato proporcionado en este documento, o cualquier combinación de los mismos. Estos componentes pueden emplearse, por ejemplo, con el diseño de la región de unión del cebador de captura de desajustes ejemplificado y un procedimiento de amplificación isotérmica que amplifica al menos un polinucleótido diana a una tasa de amplificación promedio que excede la tasa de transporte promedio de un polinucleótido diana a una característica para generar cualquier configuración de los sustratos descritos en el presente documento que tenga al menos un polinucleótido diana unido a una molécula diana inmovilizada en una característica.
En consecuencia, los métodos proporcionados en el presente documento se pueden realizar usando cualquiera de los sustratos ejemplares descritos anteriormente, incluyendo, por ejemplo, cualquier forma de cualquier soporte sólido insoluble, soporte semisólido o matriz a la que se pueda unir una biomolécula, incluyendo, por ejemplo, un polinucleótido. Los soportes sólidos ejemplares incluyen vidrio, vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos, microesferas (p.ej., partículas inertes y/o magnéticas), plásticos, nailon, materiales a base de sílice y similares, como se ha descrito anteriormente.
Además, por ejemplo, los métodos proporcionados en este documento se pueden realizar utilizando un sustrato que incluye una celda de flujo, por ejemplo, como se describe en los documentos US 2010/01 11768 A1 o Bentley et al, Nature 456: 53-59 (2008), y ejemplificado anteriormente.
Los métodos proporcionados aquí se pueden realizar en una o más características de un sustrato que incluye, por ejemplo, un pocillo, pocillo, canal, cresta, región elevada, clavija, poste, perla, metal o similar como se describió anteriormente en referencia a un sustrato proporcionado en este documento. En algunas realizaciones, un método para colocar al menos una molécula diana en una característica puede utilizar pocillos como característica y puede incluir material de gel como se establece en el documento US 2014-0243224 y como se ha descrito anteriormente.
Un método proporcionado en el presente documento puede utilizar un sustrato que tiene un primer y un segundo cebadores de captura inmovilizados en una característica del sustrato. El primer y segundo cebadores de captura pueden ser una pluralidad de primeros cebadores de captura y una pluralidad de segundos cebadores de captura. En algunas realizaciones, el primer y segundo cebadores de captura se pueden dirigir a diferentes secuencias de un polinucleótido diana y, por lo tanto, exhiben especificidad para diferentes regiones del polinucleótido diana. En otras realizaciones, el primer y segundo cebadores de captura pueden dirigirse a diferentes polinucleótidos diana. En la
Figura 2 se representa un sustrato ejemplar que puede emplearse en un método para colocar al menos una molécula diana en una característica, tal como se ha descrito anteriormente.
Dos o más cebadores de captura utilizados en el método proporcionado en este documento pueden estar presentes en una característica en cualquier proporción. Por ejemplo, una pluralidad de primeros cebadores de captura y una pluralidad de segundos cebadores de captura pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales o en cualquier otra proporción, p.ej., relación molar que incluye, por ejemplo, un exceso de más de 1,1x hasta más de 1.000x de un primer cebador de captura respecto a un segundo cebador de captura, como se ejemplificó anteriormente. De manera similar, en un método proporcionado en el presente documento que emplea una pluralidad de características, las diferentes características pueden tener la misma proporción de los dos o más cebadores de captura o una proporción diferente.
Brevemente, por ejemplo, un cebador de captura utilizado en un método para colocar al menos una molécula objetivo en una característica puede incluir una o más regiones de captura que incluyen, por ejemplo, una región de captura universal, un sitio de unión del cebador de secuenciación (SBS), una región de captura específica de diana, un sitio de escisión predeterminado, tal como un sitio de restricción, y una región enlazadora, por ejemplo, una región enlazadora que separa dos o más regiones del cebador de captura. Los cebadores de captura pueden emplear cualquiera de los diseños ejemplificados anteriormente, tal como una región de captura universal y un SBS que incluya cualquier combinación de P5, P5', P7, P7', SBS3, SBS3', SBS8 y SBS8' y/o cualquier otra secuencia. que sea suficientemente exclusivo para funcionar como cebador universal, cebador de secuenciación o cualquier otra secuencia, como un adaptador.
Por tanto, los métodos proporcionados en el presente documento pueden emplear primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados en una característica que puede incluir cualquier región de captura o cualquier combinación de regiones de captura. Por ejemplo, el primer cebador de captura puede incluir una primera región de captura universal y el segundo cebador de captura puede incluir la misma región de captura universal o una segunda región de captura universal. El primer y segundo cebadores de captura pueden incluir además el mismo o diferentes SBS. Por ejemplo, el primer cebador de captura puede incluir una primera región de cebador de captura universal y un primer SBS y el segundo cebador de captura puede incluir una segunda región de captura universal y un segundo SBS.
Un método proporcionado en este documento puede utilizar una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados en una característica, tal como se ha descrito anteriormente en referencia a un sustrato elaborado mediante los métodos proporcionados en este documento. La pluralidad puede ser una sola pluralidad, una pluralidad de primeros cebadores de captura y una pluralidad de segundos cebadores de captura. Alternativamente, o adicionalmente, un método proporcionado en este documento puede usar una pluralidad de un tercero, cuarto, quinto y/o sexto o más cebadores de captura. El número de pluralidades de cebadores de captura a incluir dependerá de la aplicación, como se ejemplificó anteriormente. La pluralidad puede ser una población de dos o más miembros que incluyen, por ejemplo, una pluralidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más miembros diferentes de la población. En otras realizaciones, una pluralidad es 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x10 o más miembros diferentes, así como cualquiera de los otros miembros de las pluralidades ejemplificadas anteriormente. La pluralidad puede contener diferentes miembros, miembros similares y/o miembros idénticos que incluyen, por ejemplo, una mezcla de cualquier combinación de miembros diferentes, similares y/o idénticos desde al menos un 1% hasta, e incluyendo, un 99% o más de los miembros.
Se puede usar un método proporcionado en el presente documento para inmovilizar en una característica al menos un polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura. También se puede usar un método proporcionado en el presente documento para inmovilizar en una característica un único polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura. Aunque se describe en el presente documento en referencia a la unión de al menos un polinucleótido diana o en referencia a un único polinucleótido diana unido en un extremo a un cebador de captura inmovilizado a una característica, se entiende que en otras realizaciones, el método proporcionado en este documento puede usarse para inmovilizar dos o más polinucleótidos diana unidos en un extremo para capturar cebadores inmovilizados en una característica. En estas otras realizaciones, el número de polinucleótidos diana puede ser, por ejemplo, de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más polinucleótidos diana diferentes. Alternativamente, o adicionalmente, los métodos proporcionados en este documento se pueden usar para inmovilizar, por ejemplo, de 2 a 100 o más polinucleótidos diana idénticos, similares o diferentes, incluidas mezclas de los mismos, como se ejemplificó anteriormente.
Cualquiera de los polinucleótidos diana ejemplificados previamente se puede emplear en un método para colocar al menos una molécula diana en una característica o en cada una de una pluralidad de características proporcionadas en el presente documento. Por consiguiente, un polinucleótido diana empleado en un método proporcionado en este documento puede comprender dos o más nucleótidos que incluyen, por ejemplo, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o cualquier combinación de los mismos. Un polinucleótido diana puede comprender una base de purina, una base de pirimidina, una base de purina y una base de pirimidina, bases de nucleótidos naturales, modificadas químicamente, modificadas bioquímicamente, no naturales o derivatizadas, una o más bases de nucleótidos emparejadas. Un polinucleótido diana empleado en un método proporcionado en el presente documento puede ser un ácido nucleico bicatenario tal como dsDNA, dsRNA, un híbrido de ADN/ARN bicatenario y también puede incluir o más bases de nucleótidos no emparejados. Los polinucleótidos diana monocatenarios también se pueden emplear en un método proporcionado en el presente documento como se ejemplificó anteriormente. Por tanto, un polinucleótido diana puede ser cualquier tipo deseado de polinucleótido, secuencia o mezcla de tipos de polinucleótidos y/o secuencias.
De manera similar, un polinucleótido diana empleado en un método proporcionado en el presente documento puede comprender una o más regiones de polinucleótido diana como se estableció previamente, incluyendo, por ejemplo, una región de unión a cebador de captura, región diana, región de unión a cebador, región de código de barras, región de ligando y/o región del adaptador. La una o más regiones de polinucleótido diana pueden ser una pluralidad de regiones de polinucleótido diana que incluyen, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más regiones de polinucleótido diana. Los polinucleótidos diana ejemplares que comprenden dos o más regiones de polinucleótido diana se representan en la Figura 3A-D como se describió previamente.
Un método proporcionado en el presente documento puede emplear un polinucleótido diana o una región de polinucleótido diana (polinucleótido diana o región del mismo) que incluye, por ejemplo, una región diana, una región de unión a cebador de captura y/u otra región descrita en este documento o bien conocida por los especialistas en la técnica que tiene dos o más nucleótidos. Otras longitudes incluyen de 2 a 100 o más nucleótidos y hasta 10000 o más nucleótidos, así como cualquiera de los diversos tamaños ejemplificados anteriormente.
Un método para colocar al menos un polinucleótido diana en una característica puede emplear un polinucleótido diana o una región del mismo que comprenda un polinucleótido bicatenario de cualquiera de las diversas longitudes expuestas y/o ejemplificadas previamente que incluyen, por ejemplo, 2, 25, 150, 1100, 10000 o más pares de bases y todos los números enteros intermedios.
Un método proporcionado en el presente documento puede emplear un polinucleótido diana bicatenario o una región del mismo, incluida una región de cebador de captura del mismo, que puede comprender cualquier número de emparejamientos erróneos. Un número particularmente útil de emparejamientos erróneos incluye, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más emparejamientos erróneos con su secuencia complementaria o, por ejemplo, un cebador de captura u otro agente de captura. Dichos emparejamientos erróneos se ejemplifican en las Figuras 4 y 6 y se describen con respecto a un sustrato producido mediante un método proporcionado en este documento.
Tal como se ejemplificó previamente con respecto a un sustrato proporcionado en el presente documento, un método de esta descripción puede emplear un polinucleótido diana que comprende una o más regiones que tienen una o más regiones de unión a cebadores de captura. La región de unión del cebador de captura se puede ubicar en el extremo 5', en el extremo 3' o en ambos extremos 5' y 3' de una región de polinucleótido diana, o de forma alternativa o adicional puede ubicarse en una región interna del polinucleótido diana. El polinucleótido diana puede comprender dos o más regiones de unión a cebadores de captura hasta cualquier número de regiones de cebadores de captura aplicables a cualquier propósito deseado. De manera similar, al igual que con los cebadores de captura correspondientes, una región de unión del cebador de captura puede incluir una o más regiones de unión del cebador de captura que incluyen, por ejemplo, una región de unión del cebador de captura universal, un sitio de unión del cebador de secuenciación (SBS), una región de unión de cebador de captura específica de la diana, un sitio de escisión predeterminado, tal como un sitio de restricción, y una región de ligando, por ejemplo, una región de ligando que separa dos o más regiones de la región de unión del cebador de captura. Se pueden emplear todas y cada una de las combinaciones y permutaciones posibles en un método proporcionado en este documento, tal como se ejemplificó anteriormente. Por ejemplo, un método proporcionado en el presente documento puede emplear cualquiera de los diseños de la región de unión del cebador de captura ejemplificados anteriormente, tal como una región de captura universal y un SBS que incluye cualquier combinación de P5, P5', P7, P7', SBS3, SBS3', SBS8 y SBS8' y/o cualquier otra secuencia que sea suficientemente individual para funcionar como cebador universal, cebador de secuenciación o cualquier otra secuencia tal como un adaptador. La longitud de una región de unión del cebador de captura puede comprender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3035, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más nucleótidos, así como 400 hasta 100 o menos nucleótidos, tal como se ejemplifica con respecto a un sustrato producido por un método proporcionado en este documento.
Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana puede ser 100% complementaria a un cebador de captura. Una región de unión del cebador de captura del polinucleótido diana empleado en un método proporcionado en este documento puede ser, por ejemplo, al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95% o 97% o más complementario a un cebador de captura que incluye, por ejemplo, que comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más emparejamientos erróneos de nucleótidos a un cebador de captura. Además de una o más regiones de unión a cebadores de captura, un polinucleótido diana puede comprender una o más regiones diana que incluyen dos o más regiones diana como se ejemplificó previamente. El tamaño o la longitud de la región diana puede ser cualquiera de las longitudes ejemplificadas anteriormente con respecto a un polinucleótido diana o una región de polinucleótido diana.
Un método proporcionado en el presente documento puede colocar al menos una molécula diana en una característica de un sustrato mediante, por ejemplo, la unión a un polinucleótido diana que se puede unir, por ejemplo, a un cebador de captura. Un método proporcionado en este documento también puede colocar una pluralidad de dos o más moléculas diana en cada una de las situaciones referenciadas como se ejemplificó anteriormente, incluyendo, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 250, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más moléculas diana diferentes, idénticas y/o similares a las ejemplificadas anteriormente. La unión de la molécula diana a un polinucleótido diana, cebador de captura, característica y/o sustrato puede ser covalente o no covalente.
Además de al menos una molécula diana inmovilizada a través de una configuración descrita anteriormente, un método proporcionado en este documento también puede generar una pluralidad de amplicones del polinucleótido diana en una característica o en una pluralidad de características sobre un sustrato, tal como se ejemplifica en las Figuras 4 y 6. La pluralidad de amplicones puede llenar mínimamente una característica, llenar parcialmente una característica o llenar hasta la capacidad una característica en un sustrato. Por consiguiente, la densidad del amplicón puede ser baja, media o alta. El diseño de polinucleótidos diana, los métodos para generar tales amplicones y los métodos para controlar la densidad se describen más adelante en referencia a métodos para colocar al menos una molécula diana en una característica de un sustrato. La densidad de los amplicones es tal como se describe en este documento.
Un método proporcionado en el presente documento para la colocación molecular individual de una molécula diana sobre un sustrato o característica puede utilizar cualquier molécula deseada. Categorías ejemplares de moléculas diana incluyen, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato, aminoácido, nucleótido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico. Las especies ejemplares para cada una de las categorías anteriores se describen más adelante. Se han descrito previamente especies ejemplares para cada una de estas categorías, cada una de las cuales puede emplearse igualmente en un método proporcionado en este documento para generar un sustrato proporcionado aquí como se ejemplificó previamente.
A modo de ejemplo, las moléculas diana empleadas en un método proporcionado en este documento pueden incluir, por ejemplo, un polipéptido de cualquier tamaño o actividad y que contenga cualquier aminoácido natural o no natural; un polipéptido ribosómico, que incluye, pero no se limita a, enzimas, receptores, anticuerpos, factores de transcripción, hormonas, ligandos, antígenos y haptenos; un péptido no ribosómico, que incluye, pero no se limita a, toxinas, sideróforos, pigmentos, antibióticos, precursores de antibióticos, citostáticos e inmunosupresores; un nanoporo, que incluye MspA, fosfolipasa A de membrana externa (OmpA), OmpC, OmpF, OmpG, lipoproteína autotransportadora de Neisseria (NalP), WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina del ántrax, gramicidina A, maltoporina, PhoE, Tsx, F-pilus, SP1, porina mitocondrial (VDAC), Tom40, leucocidinas y nanoporos de origami de ADN; un antibiótico como se ejemplificó anteriormente; una toxina como se ejemplificó previamente; una hormona como las ejemplificadas anteriormente; un hapteno que incluye, pero no se limita a, anilina, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminoabenzoico, ácido p-aminobenzoico, uroshiol, quinina, hidralazina, fluoresceína, biotina, digoxigenina y dinitrofenol; un receptor que incluye, por ejemplo, un receptor que puede ser de una célula inmune o de una célula no inmune como se ejemplificó previamente; una citocina como las quimiocinas, interferones, interleucinas, linfocinas, factor de necrosis tumoral (TNF) y neuropéptidos ejemplificados previamente; una enzima de cualquier tipo que incluye, por ejemplo, las enzimas metabólicas, polimerasas, ligasas, transcriptasas inversas, nucleasas, helicasas y transposasas ejemplificadas previamente; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se ejemplificó previamente; un polinucleótido u oligonucleótido que incluye, por ejemplo, ADN o ARN de cualquier longitud o secuencia como se ejemplificó previamente; un compuesto inorgánico que incluye, entre otros, carburos, carbonatos, óxidos simples de carbono (como CO y CO2), puntos cuánticos de cianuros, nanopartículas metálicas, nanopartículas de óxidos metálicos y similares, minerales, sulfuros, compuestos organometálicos y bioinorgánicos compuestos y minerales como se ejemplificó previamente; una pequeña molécula como se ejemplificó anteriormente; un metabolito que incluye, pero no se limita a, alcaloides, glucósidos, lípidos, péptidos no ribosómicos, tales como actinomicina-d, fenazinas, fenoles naturales (incluidos flavonoides), policétidos, terpenos, incluidos esteroides y tetrapirroles; un agente terapéutico que incluye, por ejemplo, un compuesto orgánico, compuesto inorgánico, péptido, hormona, molécula pequeña, anticuerpo, antígeno, hapteno o cualquier combinación de los mismos. El agente terapéutico puede ser un fármaco antipirético, analgésico, antipalúdico, antibiótico, antiséptico, estabilizador del estado de ánimo, reemplazo hormonal, anticonceptivo oral, estimulante, tranquilizante, fármaco antivírico, fármaco contra el cáncer, inmunosupresor y estatina, tal como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones, un método proporcionado en el presente documento se puede usar para colocar al menos una molécula diana en cada una de una pluralidad de características en un sustrato o una (también denominada en este documento una matriz o una matriz de características), como la pluralidad de características ilustradas en la Figura 5. Por ejemplo, los métodos proporcionados en este documento se pueden utilizar con un sustrato que tiene una pluralidad de características dispuestas en cualquier patrón especial como se ejemplificó anteriormente, incluyendo, por ejemplo, una cuadrícula de puntos o parches, un patrón repetido, una patrón repetitivo irregular, patrones hexagonales, patrones rectilíneos, patrones de rejilla, patrones que tienen simetría de reflexión, patrones que tienen simetría rotacional, o similares. Las características pueden tener cualquiera de una variedad de densidades como se ejemplificó anteriormente, incluyendo, por ejemplo, de al menos aproximadamente 10 características/cm2 a aproximadamente 5.000.000 características/cm2, o más. El área de las características de una matriz empleada en un método proporcionado en este documento puede tener cada una un área que sea mayor de aproximadamente 100 nm2 hasta aproximadamente 500 pm2 así como cualquier área intermedia. Las características de la superficie de un sustrato de matriz pueden ser no contiguas, estando separadas por regiones intersticiales de la superficie. En realizaciones particulares, los métodos se utilizan con características que son características cóncavas en una superficie (p.ej., pocillos) que incluyen, por ejemplo, micropocillos o nanopocillos, y las características pueden contener un material de gel como se ejemplificó anteriormente. Los métodos y composiciones para fabricar y usar sustratos que tienen características que contienen gel, tales como pocillos, se establecen, por ejemplo, en el documento US 2014/0243224. Los métodos se pueden realizar con matrices que tienen una densidad alta, media o baja de características, tal como se ejemplificó anteriormente. Los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar con características que son perlas o perlas en pocillos. Las perlas pueden estar compuestas por cualquier material que permita la inmovilización de polinucleótidos en la superficie, incluidos, entre otros, plásticos, cerámica, vidrio, poliestireno, grafito de carbono y similares, así como cualquier otro material descrito en este documento para soportes sólidos.
En algunas realizaciones, se usa un método proporcionado para colocar al menos una molécula diana en una característica o en cada una de una pluralidad de características en donde el tamaño de la característica se selecciona de un rango que favorece la amplificación de exclusión cinética (KEA) y la formación de una ubicación molecular individual en la característica. Tal como se ejemplificó previamente en referencia a un nanopocillo, el diámetro del pocillo puede variar entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 1 pm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 800 nm, entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 600 nm, o entre 100 nm y aproximadamente 400 nm. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 400 nm. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de menos de aproximadamente 1 pm.
A modo de ejemplo, en una realización específica, los métodos descritos en este documento pueden comprender (a) unir una pluralidad de primeros cebadores de captura a una superficie; (b) unir una pluralidad de segundos cebadores de captura a una superficie; y (c) unir un polinucleótido diana bicatenario a un segundo cebador de captura de los segundos cebadores de captura, en el que (i) el polinucleótido diana bicatenario comprende una primera hebra parental y una segunda hebra parental; (ii) el polinucleótido diana bicatenario comprende una región de unión del segundo cebador de captura en la primera y segunda hebras parentales; (iii) la región de unión del segundo cebador de captura de la primera hebra parental es 100% complementaria a un segundo cebador de captura de la pluralidad de segundos cebadores de captura; y (iv) la región de unión del segundo cebador de captura de la segunda hebra parental es menos del 100% idéntica al segundo cebador de captura de la pluralidad de segundos cebadores de captura. El método puede comprender además unir una molécula diana al polinucleótido diana. La molécula diana puede unirse al polinucleótido diana antes de la unión del polinucleótido diana al segundo cebador de captura. La unión de la pluralidad de primeros cebadores de captura a la superficie puede ocurrir antes de la unión de la pluralidad de segundos cebadores de captura a la superficie. Alternativamente, la unión de la pluralidad de primeros cebadores de captura a la superficie puede ocurrir simultáneamente a la unión de la pluralidad de segundos cebadores de captura a la superficie. El polinucleótido diana puede comprender además una primera región de unión de captura. Al menos una hebra de la primera región de unión de captura puede hibridarse con un primer cebador de captura de la pluralidad de primeros cebadores de captura. El método puede comprender además producir una pluralidad de amplicones. La pluralidad de amplicones puede comprender copias del polinucleótido diana. La pluralidad de amplicones se puede producir llevando a cabo una reacción de amplificación. La reacción de amplificación puede incluir una primera amplificación de polimerasa recombinasa (RPA). La primera RPA puede comprender extender el primer cebador de captura y el segundo cebador de captura que se hibridan con el polinucleótido diana para producir una pluralidad de primeros amplicones del polinucleótido diana. La pluralidad de amplicones se puede producir llevando a cabo una o más reacciones de amplificación adicionales. La una o más reacciones de amplificación adicionales pueden comprender una o más amplificaciones de polimerasa recombinasa (RPA) adicionales. La una o más RPA adicionales pueden comprender (a) unir uno o más primeros cebadores de captura de la pluralidad de cebadores de captura a uno o más amplicones de la pluralidad de primeros amplicones; y (b) extender uno o más primeros cebadores de captura para producir una pluralidad de amplicones adicionales. La una o más RPA adicionales pueden comprender (a) unir uno o más segundos cebadores de captura de la pluralidad de segundos cebadores de captura; y (b) extender uno o más segundos cebadores de captura para producir una pluralidad de amplicones adicionales. En algunos casos, un segundo cebador de captura no se hibrida con un amplicón que contiene un complemento de la segunda hebra parental. En algunos casos, un segundo cebador de captura no se hibrida con una segunda región de unión del cebador de captura de un amplicón que es un complemento de la segunda región de unión del cebador de captura de la segunda hebra parental.
En la Figura 7 se muestra un método ejemplar para producir un sustrato. Como se muestra en el paso 1 de la Figura 7, una superficie (706) que comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura (707, 711, 714) y una pluralidad de segundos cebadores de captura (708, 713, 715) se pone en contacto con un polinucleótido diana (701). El polinucleótido diana (701) comprende una primera hebra parental (703) y una segunda hebra parental (702). La primera hebra parental (703) y la segunda hebra parental (702) contienen una región de unión del primer cebador de captura (717) y una región de unión del segundo cebador de captura (718). Dentro de la región de unión del segundo cebador de captura (718) hay una región de emparejamiento erróneo entre la primera hebra parental (703) y la segunda hebra parental (702). La región de unión del segundo cebador de captura (718) de la segunda hebra parental (702) contiene al menos una diferencia de nucleótidos (704) respecto a un segundo cebador de captura de la pluralidad de segundos cebadores de captura (708, 713, 715). La región de unión del segundo cebador de captura (718) de la primera hebra parental (703) es 100% complementaria al segundo cebador de captura de la pluralidad de segundos cebadores de captura (708, 713, 715). Tal como se muestra en el paso 2, un primer cebador de captura (707) de la pluralidad de cebadores de primera captura (707, 711, 714) se hibrida con la región de unión del primer cebador de captura (717) de la segunda hebra parental (702). Un segundo cebador de captura (708) de la pluralidad de segundos cebadores de captura (708, 713, 715) se hibrida con la segunda región de unión de captura (718) de la primera hebra parental (703). Tal como se muestra en el paso 3, la primera y segunda hebras parentales se amplifican para producir una primera pluralidad de amplicones. El primer cebador de captura (707) desplaza la primera hebra padre (703) y se extiende para producir un amplicón de la segunda hebra parental (709). El amplicón de la segunda hebra parental (709) contiene un complemento de la segunda hebra parental. Como tal, el amplicón de los cebadores no coincidentes (709) contiene un complemento de la región de unión del segundo cebador de captura (718b) de la segunda hebra parental (702). Como también se muestra en el paso 3, el segundo cebador de captura (708) desplaza la segunda hebra parental (702b) y se extiende para producir un amplicón de la primera hebra parental (710). Tal como se muestra en el paso 4, se llevan a cabo una o más reacciones de amplificación adicionales para producir una segunda pluralidad de amplicones. En el paso 4a, un primer cebador de captura (711) se hibrida con la región de unión del primer cebador de captura de la segunda hebra parental y desplaza al primer cebador de captura (707). En el paso 4b, un segundo cebador de captura (713) intenta hibridarse con la región de unión del segundo cebador de captura del amplicón de la segunda hebra parental (709). Sin embargo, debido a que la región de unión del segundo cebador de captura del amplicón de la segunda hebra parental (709) es un complemento de la región de unión del segundo cebador de captura de la segunda hebra parental, la región de unión del segundo cebador de captura del amplicón de la segunda hebra parental (709) no es 100% complementaria al segundo cebador de captura (711). El segundo cebador de captura (711) es incapaz de desplazar el amplicón de la segunda hebra parental (709) de la segunda hebra parental. Como tal, el amplicón de la segunda hebra parental que contiene una región de unión del segundo cebador de captura que es complementaria a la segunda región de enlace de captura de la segunda hebra parental no puede actuar como plantilla para la extensión de un segundo cebador de captura. Tal como se muestra en el paso 4c, debido a que la región de unión del primer cebador de captura del amplicón de la primera hebra parental (710) es 100% complementaria a un primer cebador de captura (714), el primer cebador de captura (714) puede desplazar la primera hebra parental (703) y se hibridan con la región de unión del primer cebador de captura del amplicón de la primera hebra parental (710). El amplicón de la primera hebra parental (710) puede servir como plantilla para la extensión del primer cebador de captura (714). Tal como se muestra en el paso 4d, un segundo cebador de captura (715) puede hibridarse con la segunda región de unión del cebador de captura de la primera hebra parental (703), desplazando así el segundo cebador de captura (708). Tal como se muestra en el paso 5, el primer cebador de captura (711) se puede extender para producir un amplicón de la primera hebra parental (716). También se muestra en el paso 5 que el primer cebador de captura (714) se puede extender para producir un amplicón del amplicón de la primera hebra parental (717). También se muestra en el paso 5 que el segundo cebador de captura (715) se puede extender para producir un amplicón de la primera hebra parental (718).
Por consiguiente, la descripción proporciona un método para colocar una molécula diana individual en una característica de un sustrato. El método incluye: (a) hibridar una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados a una característica sobre un sustrato con al menos un polinucleótido diana, comprendiendo dicho polinucleótido diana una región diana flanqueada por regiones de unión de primer y segundo cebador de captura complementarias a dicho primer y segundo cebadores de captura, en el que dicha región de unión del segundo cebador de captura comprende un emparejamiento erróneo de pares de bases con dicho segundo cebador de captura y está unido a una molécula diana, y (c) amplificar dicho al menos un polinucleótido diana a una tasa de amplificación promedio que excede una velocidad de transporte media de un polinucleótido diana a una característica para producir una pluralidad de amplicones clonales complementarios a dicho polinucleótido diana. El método puede utilizar un sustrato que tiene una característica o una pluralidad de características. La característica o características pueden ser una perla, un pocillo, que incluye un micropocillo o nanopocillo, canal, reborde, proyección o combinación de los mismos. El método puede colocar al menos una molécula diana, incluida una molécula diana individual, en una característica o en cada una de una pluralidad de características. El método puede llenar una característica o características al máximo con una pluralidad de amplicones clonales de un polinucleótido diana. Las regiones intersticiales entre una pluralidad de características pueden carecer de un polinucleótido diana. El método puede usarse con un sustrato que tiene una pluralidad de características, incluidas dos o más características, y puede colocar diferentes moléculas diana individuales en cada una de las diferentes características dentro de la pluralidad. El método puede usarse con un polinucleótido diana seleccionado entre ARN, ADN, PNA o ADN bicatenario (dsDNA). La longitud del polinucleótido diana usado mediante un método proporcionado en este documento puede ser inferior a 1000 nucleótidos y/o puede estar entre 10 y 25, 26 y 50, 51 y 100, 101 y 200, 201 y 300, 301 y 400, 401 y 500, 501 y 600, 601 y 700, 701 y 800, 801 y 900 o 901 y 1000 nucleótidos. La molécula diana colocada en una o más características con el método puede ser un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato, aminoácido, nucleótido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico. Las moléculas polipeptídicas diana pueden ser un nanoporo, un polipéptido de unión o una enzima. Un nanoporo puede ser MspA, OmpF, OmpG, NalP, WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina del ántrax, leucocidinas o un nanoporo de origami de ADN. Un polipéptido de unión puede ser un anticuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un scFV, un diacuerpo, un triacuerpo, un minicuerpo y un anticuerpo de dominio único (sdAB) o receptor de células T. Una enzima puede ser una polimerasa, helicasa, recombinasa, transposasa o ligasa. El método se puede utilizar con un sustrato seleccionado entre uno o más materiales tales como vidrio, silicio, plástico o biopolímero. El sustrato puede incluir además un hidrogel o un gel unido covalentemente.
Los sustratos de la descripción que tienen una molécula diana individual en una característica o que tienen una molécula diana individual en cada una de una pluralidad de características pueden utilizarse para interrogar entidades moleculares individuales. Una o más moléculas a interrogar pueden estar en disolución y la molécula diana inmovilizada puede usarse para determinar una característica de la o las moléculas a interrogar. Por ejemplo, la secuencia de un único polinucleótido o una pluralidad de polinucleótidos individuales se puede determinar mediante secuenciación de nanoporos donde el nanoporo corresponde a la molécula diana inmovilizada. Alternativamente, una o más moléculas a interrogar pueden ser las moléculas diana inmovilizadas y se pueden usar una o más moléculas en disolución para sondear o determinar una característica de cada una de las moléculas diana inmovilizadas. Por ejemplo, la molécula diana inmovilizada puede ser una biblioteca de diferentes variantes enzimáticas y las sondas en disolución pueden ser un sustrato o una pluralidad de sustratos diferentes para determinar una característica catalítica de cada una de las diferentes variantes enzimáticas. La orientación opuesta también se puede utilizar cuando el sustrato, por ejemplo, corresponde a la molécula diana inmovilizada en una característica y se pone en contacto con las diferentes variantes de enzima para medir una característica catalítica. Dadas las enseñanzas y orientaciones proporcionadas en el presente documento, los especialistas en la técnica comprenderán que se puede utilizar un gran número de moléculas diana diferentes en un sustrato proporcionado en el presente documento para interrogar o para ser interrogadas para la determinación de una o más características moleculares. Las características ejemplares incluyen, por ejemplo, determinar una secuencia de polinucleótidos, una secuencia de polipéptidos, una actividad de unión, una actividad catalítica y similares.
A modo de ejemplificación adicional con respecto a la secuenciación, algunas realizaciones pueden utilizar la secuenciación de nanoporos (Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing" Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer, D. y D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis" Acc. Chem. Res. 35: 817-825 (2002)); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin y J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2: 611-615 (2003)). En tales realizaciones, el polinucleótido a secuenciar pasa a través de un nanoporo. El nanoporo puede ser un poro sintético o una proteína de membrana biológica, como la a-hemolisina. A medida que el ácido nucleico diana pasa a través del nanoporo, se puede identificar cada par de bases midiendo las fluctuaciones en la conductancia eléctrica del poro. (Patente de e E.UU. n° 7.001.792; Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores" Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis" Nanomed.
2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. y Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution" J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)). Los datos obtenidos de la secuenciación de nanoporos se pueden almacenar, procesar y analizar tal como se establece en este documento. En particular, los datos se pueden tratar como una imagen de acuerdo con el tratamiento ejemplar de imágenes ópticas y otras imágenes que se expone en este documento.
Los métodos del presente documento también pueden ser útiles en el cribado de afinidad de unión molecular. En las realizaciones, se puede anclar un único anticuerpo molecular sobre el sustrato descrito en el presente documento. El evento de unión al antígeno único se puede detectar mediante tinción con fluorescencia. La técnica de tinción por fluorescencia incluye aquellas bien conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, técnicas de ensayo Illumina Infinium o ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). En determinadas formas de realización, la concentración del antígeno en la disolución puede analizarse cuantitativamente contando los puntos de fluorescencia de moléculas individuales, tales técnicas conocidas en la técnica (T. Blicharz, et al. "Fiber-Optic Microsphere bead antibody array for the analysis of inflammatory cytokines in saliva" Anal. Chem. 2009, 81,2106). En las realizaciones, los métodos descritos en este documento son aplicables para el diagnóstico in vitro.
Una ventaja de los métodos expuestos en este documento es que proporcionan una detección rápida y eficaz de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en paralelo. Por consiguiente, la presente descripción proporciona sistemas integrados capaces de preparar y detectar ácidos nucleicos usando técnicas conocidas en la técnica tales como las ejemplificadas anteriormente. Por tanto, un sistema integrado de la presente descripción puede incluir componentes fluidos capaces de suministrar reactivos de amplificación y/o reactivos de secuenciación a una o más moléculas diana inmovilizadas, incluyendo el sistema componentes tales como bombas, válvulas, depósitos, líneas de flujo y similares. Una celda de flujo se puede configurar y/o utilizar en un sistema integrado para interrogación. Las celdas de flujo ejemplares se describen, por ejemplo, en los documentos US 2010/0111768 A1 y US 2012/0270305. Como se ejemplifica para las celdas de flujo, uno o más de los componentes fluidos de un sistema integrado pueden usarse para diferentes pasos en una interrogación. Tomando una realización de reacción de unión como ejemplo, se pueden usar uno o más de los componentes fluidos de un sistema integrado para una etapa de unión y para el suministro de reactivos para detección. Alternativamente, un sistema integrado puede incluir sistemas fluidos separados para realizar una etapa de unión y para llevar a cabo métodos de detección. Los ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear ácidos nucleicos amplificados y también de determinar la secuencia de los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, la plataforma MiSeqTM (Illumina, Inc., San Diego, CA) y los dispositivos descritos en el documento US 2012/0270305.
También se describen en este documento kits que comprenden cualquiera de los sustratos descritos en este documento. Un kit puede comprender (a) un sustrato que comprende una característica, en la que la característica comprende (i) una pluralidad de primeros cebadores de captura; y (ii) una pluralidad de segundos cebadores de captura; y (b) un polinucleótido diana que comprende una primera región de polinucleótido diana bicatenario, en el que (i) la primera región de polinucleótido diana bicatenario comprende una región de unión al segundo cebador de captura; (ii) una primera hebra de la región de unión del segundo cebador de captura es 100% complementaria a un segundo cebador de captura de los segundos cebadores de captura; y (iii) la región de unión del segundo cebador de captura comprende al menos un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre la primera hebra y una segunda hebra.
Un kit puede comprender un sustrato que comprende una característica, donde la característica comprende (a) una pluralidad de primeros cebadores de captura; (b) una pluralidad de segundos cebadores de captura; y (c) un polinucleótido diana que comprende una primera región de polinucleótido diana bicatenario, en el que (i) la primera región de polinucleótido diana bicatenario comprende una región de unión al segundo cebador de captura; (ii) una primera hebra de la región de unión del segundo cebador de captura es 100% complementaria a un segundo cebador de captura de los segundos cebadores de captura; y (iii) la región de unión del segundo cebador de captura comprende al menos un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre la primera hebra y una segunda hebra.
Un kit puede comprender (a) un sustrato que comprende una característica, en la que la característica comprende (i) una pluralidad de primeros cebadores de captura; y (ii) una pluralidad de segundos cebadores de captura; y (b) un polinucleótido diana que comprende una primera región de polinucleótido diana bicatenario y una segunda región de polinucleótido diana bicatenario, donde (i) la primera región de polinucleótido diana bicatenario comprende una región de unión al segundo cebador de captura; (ii) una primera hebra de la región de unión del segundo cebador de captura es 100% complementaria a un segundo cebador de captura de los segundos cebadores de captura; y (iii) la región de unión del segundo cebador de captura comprende al menos un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre la primera hebra y una segunda hebra. La segunda región de polinucleótido diana bicatenario puede comprender una primera región de unión al cebador de captura.
Un kit puede comprender (a) un sustrato que comprende una característica, donde la característica comprende (i) una pluralidad de primeros cebadores de captura; y (ii) una pluralidad de segundos cebadores de captura; (b) un primer polinucleótido diana que comprende una primera región de polinucleótido diana bicatenario, en el que (i) la primera región de polinucleótido diana bicatenario comprende una región de unión al segundo cebador de captura; (ii) una primera hebra de la región de unión del segundo cebador de captura es 100% complementaria a un segundo cebador de captura de los segundos cebadores de captura; y (iii) la región de unión del segundo cebador de captura comprende al menos un emparejamiento erróneo de nucleótidos entre la primera hebra y una segunda hebra; y (c) una segunda región de polinucleótido diana que comprende una segunda región de polinucleótido diana bicatenario. La segunda región de polinucleótido diana bicatenario puede comprender una primera región de unión al cebador de captura.
Un kit descrito en este documento puede comprender un sustrato como se muestra en la Figura 2. Tal como se muestra en la Figura 2, un kit puede comprender un sustrato (201) que comprende (a) una pluralidad de primeros cebadores de captura (202, 203, 204); (b) una pluralidad de segundos cebadores de captura (205, 206, 207); (c) un polinucleótido diana (208); (d) una molécula diana (209); y (e) una pluralidad de amplicones (210, 211,212, 2 I 3 , 2 l4).
Un kit descrito en este documento puede comprender un sustrato como se muestra en la Figura 5. Tal como se muestra en la Figura 5, un kit puede comprender un sustrato (501) que comprende (a) una primera característica (502) que comprende (i) una primera pluralidad de primeros cebadores de captura (504, 505, 506); (ii) una primera pluralidad de segundos cebadores de captura (507, 508, 509); (iii) un primer polinucleótido diana (510); (iv) una primera molécula diana (511); y (v) una primera pluralidad de amplicones (512, 513, 514, 515, 516); y (b) una segunda característica (503) que comprende (i) una segunda pluralidad de primeros cebadores de captura (520, 521,522); (ii) una segunda pluralidad de segundos cebadores de captura (523, 524, 525); (iii) un segundo polinucleótido diana (526); (iv) una segunda molécula diana (527); y (v) una segunda pluralidad de amplicones (528, 529, 530, 531,532).
Los componentes ejemplares de los kits descritos en este documento se ejemplifican en la Figura 8A-B. Tal como se muestra en la Figura 8A, un kit puede comprender (a) un sustrato (801) que comprende (i) una pluralidad de primeros cebadores de captura (802, 803, 804); y (ii) una pluralidad de segundos cebadores de captura (805, 806, 807); y (b) un polinucleótido diana (808). Tal como se muestra en la Figura 8B, el kit puede comprender además uno o más polinucleótidos diana adicionales (809), amplicones (810), moléculas diana (811), o una combinación de los mismos.
El polinucleótido diana de cualquiera de los kits descritos en este documento puede comprender además una o más de las regiones de polinucleótido diana descritas en este documento. Por ejemplo, el polinucleótido diana puede comprender además una segunda región de polinucleótido diana que comprende un primer dominio de unión al cebador de captura. La región de unión del primer cebador de captura puede hibridarse con un primer cebador de captura de la pluralidad de primeros cebadores de captura. En otro ejemplo, el polinucleótido diana puede comprender además una región de polinucleótido diana adicional que comprende una región diana. El polinucleótido diana puede comprender una o más regiones de polinucleótido diana adicionales que comprenden un código de barras, una región de unión al cebador, una región enlazadora, una región adaptadora o una combinación de los mismos.
El polinucleótido diana de cualquiera de los kits descritos en este documento puede ser parte del sustrato. Por ejemplo, el polinucleótido diana se puede unir a un segundo cebador de captura del sustrato. Alternativamente, el polinucleótido diana de cualquiera de los kits descritos en este documento puede separarse del sustrato. Por ejemplo, el kit puede comprender un primer recipiente que comprende el sustrato y un segundo recipiente que comprende el polinucleótido diana.
Los kits descritos en el presente documento pueden comprender además una molécula diana. La molécula diana puede ser cualquiera de las moléculas diana descritas en el presente documento. Por ejemplo, la molécula diana puede ser un nanoporo. La molécula diana se puede unir al polinucleótido diana. La molécula diana puede ser parte del sustrato. Por ejemplo, la molécula diana puede unirse al polinucleótido diana que está unido a un primer cebador de captura o un segundo cebador de captura del sustrato. Alternativa o adicionalmente, la molécula diana no está unida al polinucleótido diana. Por ejemplo, el kit puede comprender un primer recipiente que comprende el polinucleótido diana y un segundo recipiente que comprende la molécula diana. La molécula diana se puede proporcionar con el sustrato. Por ejemplo, el kit puede comprender un primer recipiente que comprende el sustrato y la molécula diana y un segundo recipiente que comprende el polinucleótido diana. Alternativamente, el kit puede comprender un primer recipiente que comprende el sustrato, el polinucleótido diana y la molécula diana.
El kit puede comprender además una pluralidad de amplicones. La pluralidad de amplicones puede formar parte del sustrato. Por ejemplo, la pluralidad de amplicones se puede unir a la pluralidad de primeros cebadores, la pluralidad de segundos cebadores o una combinación de los mismos. Los amplicones pueden ser copias de los polinucleótidos diana.
Los sustratos de cualquiera de los kits descritos en este documento pueden comprender dos o más características.
La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por consiguiente, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la presente invención.
Ejemplo I
Am plificación de exclusión cinética mediante una región de unión del cebador de captura de emparejamiento erróneo
Este ejemplo muestra que una región de unión del cebador de captura no emparejada evita la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) en el extremo del polinucleótido diana emparejado incorrectamente.
Para confirmar que los pares de bases de emparejamiento erróneo entre una región de unión del cebador de captura y un cebador de captura pueden evitar una reacción de RPA, se emplearon los polinucleótidos diana y los cebadores de captura que se muestran en la Figura 9 en la reacción de RPA usando un kit comercial TwistDX según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los polinucleótidos diana emplearon una región diana phiX de ~500 pb flanqueada por regiones de cebadores de captura denominadas estándar (std) o no emparejadas (msm). Por diseño, el conjunto de cebadores P5-std/P7-std es complementario a las regiones de unión del cebador de captura del polinucleótido diana phiX-std y P5-msm/P7-msm es complementario a las regiones de unión del cebador de captura en el polinucleótido objetivo phiX-msm. P5-std/P7-std tiene 3 pb no coincidentes con la plantilla phiX-msm, mientras que P5-msm/P7-msm tiene 3 pb no coincidentes con la plantilla phiX-std.
La diana phiX (13,2 pL) que contenía la molécula diana phix 5E-16 mol se mezcló con 2,4 pL 10 pM de cebadores emparejados o mal emparejados, luego se añadió con tampón de rehidratación TwistDx 29,5 pL. La disolución anterior se transfirió a un sedimento de reacción TwistDx y se mezcló con una pipeta. La reacción se inició añadiendo 2,5 pL de acetato de magnesio 280 mM y se dejó reaccionar durante 8 a 10 minutos. La reacción se detuvo para el análisis en gel mediante el proceso de purificación del producto de PCR.
Después de una reacción KEA, los amplicones se separaron mediante electroforesis en gel (electroforesis en gel E al 2%, Life Technologies) y los resultados se muestran en la Figura 10. Brevemente, la reacción de RPA con combinaciones complementarias de la región de unión del cebador de captura-cebador de captura, por ejemplo, P5-msm/P7-msm más phiX-msm, dieron como resultado un buen rendimiento de formación de amplicones. Sin embargo, las combinaciones de regiones de unión de cebador de captura y cebador de captura no emparejadas en la reacción de RPA no generaron o dieron como resultado un bajo rendimiento del producto amplicón de 500 pb.
Estos resultados confirman que el diseño de emparejamientos erróneos puede detener eficazmente una reacción de RPA en el extremo del emparejamiento erróneo de un polinucleótido diana.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para colocar una molécula diana individual sobre una característica de un sustrato, comprendiendo dicho sustrato una pluralidad de características separadas por regiones intersticiales que carecen de un polinucleótido diana, comprendiendo el método:
a. hibridar una pluralidad de primeros y segundos cebadores de captura inmovilizados a una característica sobre un sustrato con al menos un polinucleótido diana bicatenario, comprendiendo dicho polinucleótido diana bicatenario una región diana flanqueada por regiones de unión de primer y segundo cebadores de captura complementarias a dichos primer y segundo cebadores de captura, en los que la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario está unida a una molécula diana, y donde la región de unión del primer cebador de captura de la primera hebra del polinucleótido diana bicatenario es idéntica al primer cebador de captura, la región de unión del segundo cebador de captura de la primera hebra del polinucleótido diana bicatenario es 100% complementaria al segundo cebador de captura, y donde la región de unión del primer cebador de captura de la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario es 100% complementaria al primer cebador de captura, la región de unión del segundo cebador de captura de la segunda hebra del polinucleótido diana bicatenario contiene al menos una diferencia de nucleótidos del segundo cebador de captura de modo que la región de unión del segundo cebador en el polinucleótido diana bicatenario contiene un emparejamiento erróneo de pares de bases y
b. amplificar dicho al menos un polinucleótido diana a una tasa de amplificación promedio que excede una tasa de transporte promedio de un polinucleótido diana hacia una característica para producir una pluralidad de amplicones clonales complementarios a dicho polinucleótido diana, donde dicha amplificación comprende una amplificación isotérmica y donde dicha molécula diana comprende un polipéptido, carbohidrato, aminoácido, monosacárido, hapteno, ligando, antígeno, analito, compuesto orgánico de molécula pequeña o compuesto inorgánico.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicho emparejamiento erróneo de pares de bases es un emparejamiento erróneo de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pares de bases, opcionalmente en el que dicho emparejamiento erróneo de pares de bases es un emparejamiento erróneo de tres pares de bases.
3. El método de la reivindicación 1, donde cada una de dicha pluralidad de características comprende una molécula diana individual, opcionalmente donde dos o más de dichas características comprenden diferentes moléculas diana individuales y opcionalmente donde dichas características se llenan al máximo con dicha pluralidad de amplicones clonales.
4. El método de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido diana comprende uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en ARN, ADN y PNA, donde opcionalmente dicho polinucleótido diana comprende ADN bicatenario (dsDNA).
5. El método de la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido diana comprende menos de 1000 nucleótidos, opcionalmente donde dicho polinucleótido diana comprende entre 10 y 25, 26 y 50, 51 y 100, 101 y 200, 201 y 300, 301 y 400, 401 y 500 , 501 y 600, 601 y 700, 701 y 800, 801 y 900 o 901 y 1000 pares de bases de longitud.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicha molécula diana comprende un polipéptido.
7. El método de la reivindicación 6, donde dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un nanoporo, un polipéptido de unión y una enzima.
8. El método de la reivindicación 7, donde dicho poro de nanoporo se selecciona del grupo que consiste en MspA, OmpF, OmpG, NalP, WZA, toxina ClyA, a-hemolisina, toxina de ántrax, leucocidinas, canal iónico, nanoporo de proteína y nanoporo de origami de ADN, o dicho polipéptido de unión se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un Fab, un Fab', un F(ab')2 , un scFv, un diacuerpo, un triacuerpo, un minicuerpo y un anticuerpo de dominio único (sdAB), un receptor de células T, microcinas, neuropéptidos, receptores acoplados a proteína G, anticuerpo, receptor del factor de crecimiento epidérmico y HER2, o dicha enzima se selecciona del grupo que consiste en una recombinasa, polimerasa, helicasa, transposasa, ligasa, desaminasa, oxidasa y quinasa.
9. El método de la reivindicación 1, donde el sustrato comprende uno o más materiales seleccionados del grupo que consiste en vidrio, silicio, plástico y biopolímero.
10. El método de la reivindicación 1, donde las características comprenden una perla, pocillo, canal, cresta, proyección o combinación de los mismos, opcionalmente donde dicho pocillo es un micropocillo o nanopocillo, y opcionalmente donde el sustrato comprende además un hidrogel o gel unido covalentemente.
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