ES2870533T3 - Métodos de determinación de la fracción de ácidos nucleicos fetales en muestras maternas - Google Patents

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Abstract

Un método de determinación de la fracción de ácidos nucleicos fetales en una muestra materna que comprende una mezcla de ADN genómico fetal y materno, en donde la muestra materna es una muestra de plasma y en donde dicho ADN genómico fetal y materno es ADN sin células (ADNsc), comprendiendo dicho método: (a) amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos diana en dicha mezcla, comprendiendo cada una de dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana polimórficos al menos un sitio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), de forma que se amplifiquen al menos 40 sitios de SNP diferentes de los ácidos nucleicos diana polimórficos, en donde al menos un sitio de SNP es informativo, y en donde dicha pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos diana se localiza en una pluralidad de cromosomas diferentes; (b) realizar secuenciación masiva en paralelo de al menos una porción del producto amplificado obtenida en (a), en donde dicha secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de marcas de secuencia; y (c) basándose en dicha secuenciación, determinar dicha fracción, en donde: (i) dicha fracción se determina basándose en el número total de marcas que cartografían un primer alelo y el número total de marcas que cartografían un segundo alelo en un sitio de SNP informativo contenido en un genoma de referencia; y (ii) el sitio de SNP informativo se identifica por la diferencia en las secuencias alélicas y la cantidad de cada uno de los posibles alelos.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de determinación de la fracción de ácidos nucleicos fetales en muestras maternas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos de determinación de la fracción de ácido nucleico fetal sin células que circula en una muestra materna.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las pruebas prenatales invasivas son potencialmente perjudiciales para la madre y para el feto. Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar pruebas prenatales no invasivas. La sangre materna puede contener células fetales (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 20080070792) y ADN fetal sin células (véase, por ejemplo, Huang et al. (2008), Methods in Molecular Biology, 444:203-208). Mientras que las células fetales circulantes presentan una diana atractiva para diagnósticos prenatales no invasivos, particularmente para el diagnóstico del sexo fetal y las anomalías cromosómicas por cariotipado simple, la escasez de células fetales intactas en la circulación materna (alrededor de una célula por mL de sangre materna), la baja eficiencia de enriquecimiento (Bianchi et al., Am J Hum Genet 61:822-829 [1997]) y las dificultades con los análisis cromosómicos asociados con núcleos anormalmente densos en algunas células (Babochkina et al., Haematologica 90:740-745 [2005]) han favorecido la investigación en ADN sin células.
El establecimiento de las concentraciones de ADN sin células (ADNsc) fetal en plasma materno en mujeres embarazadas sanas ha formado la plataforma en la que se pueden estudiar las anomalías del ADN fetal en trastornos asociados al embarazo. Se ha mostrado que el descubrimiento de un aumento gradual en la concentración de ADN fetal en suero materno a medida que avanza la gestación precede a complicaciones asociadas al parto prematuro. También se ha encontrado un aumento de cinco veces en la concentración de ADN fetal en el suero obtenido de mujeres afectadas por preeclampsia. Otros trastornos relacionados con el embarazo que se han asociado a una concentración elevada de ADNsc incluyen hiperemesis gravídica (intensas nauseas del embarazo), placentación invasiva (en la que la placenta se pone en contacto con la circulación sanguínea materna), restricción del crecimiento intrauterino, hemorragia feto-materna y polihidramnios (Wright C.F. y Burton H., Human Reproduction Update 15(1 ):139-151 [2009]).
El análisis cuantitativo de ADN sin células por estrategias de PCR en tiempo real también ha indicado que las concentraciones de ADN fetal circulatorio son elevadas en embarazos con aneuploidías fetales, sobre todo trisomía 21 (Lo et al., Clin Chem 45:1747-1751 [1999]). Sin embargo, la fracción de ADN fetal en ADN sin células de plasma materno se determina normalmente comparando la cantidad de locus específico del feto (tal como el locus SRY en el cromosoma Y en embarazo de niña) con el de un locus en cualquier autosoma que es común a tanto la madre como al feto usando PCR cuantitativa en tiempo real (Dahllan et al., Lancet 369:474-481 [2007]; Li et al., Clin Chem 1002­ 1011 [2004]; Fan et al., Proc Natl Acad Sci 105:16266-16271 [2008]).
El documento de patente WO 2011/057094 enseña el análisis genómico fetal de una muestra materna biológica. Chiu et al. (Trends in Genetics 2009, vol. 25, N° 7, páginas 324-331) enseña un diagnóstico prenatal no invasivo por tecnologías de recuento de una sola molécula.
Existe una necesidad de métodos adicionales que permitan la determinación de la fracción de ácido nucleico fetal en tanto embarazos de niño como de niña.
El método de la invención cumple la necesidad de proporcionar los medios para determinar la fracción fetal que es independiente del sexo del feto. El método se puede aplicar para determinar simultáneamente la presencia o ausencia de una aneuploidía cromosómica u otra variación del número de copias, y se puede usar junto con cualquier método conocido que se usa para determinar aneuploidías en una muestra materna.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un método de determinación de la fracción de ácidos nucleicos fetales en una muestra materna que comprende una mezcla de ADN genómico fetal y materno, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, el al menos un sitio de SNP es un sitio de SNP único seleccionado de rs560681, rs1109037, rs9866013, rs13182883, rs13218440, rs7041158, rs740598, rs10773760, rs4530059, rs7205345, rs8078417, rs576261, rs2567608, rs430046, rs9951171, rs338882, rs10776839, rs9905977, rs1277284, rs258684, rs1347696, rs508485, rs9788670, rs8137254, rs3143, rs2182957, rs3739005 y rs530022. En otras realizaciones, el al menos un sitio de SNP es un sitio de SNP en tándem seleccionado de los pares de SNP en tándem rs7277033-rs2110153; rs2822654-rs1882882; rs368657-rs376635; rs2822731-rs2822732; rs1475881-rs7275487; rs1735976-rs2827016; rs447340-rs2824097; rs418989- rs13047336; rs987980- rs987981; rs4143392- rs4143391; rs1691324- rs13050434; rs11909758-rs9980111; rs2826842-rs232414; rs1980969-rs1980970; rs9978999-rs9979175; rs1034346-rs12481852; rs7509629-rs2828358; rs4817013-rs7277036; rs9981121-rs2829696; rs455921-rs2898102; rs2898102- rs458848; rs961301 -rs2830208; rs2174536-rs458076; rs11088023-rs11088024; rs1011734-rs1011733; rs2831244-rs9789838; rs8132769-rs2831440; rs8134080-rs2831524; rs4817219-rs4817220; rs2250911-rs2250997; rs2831899-rs2831900; rs2831902-rs2831903; rs11088086-rs2251447; rs2832040-rs11088088; rs2832141-rs2246777; rs2832959 -rs9980934; rs2833734-rs2833735; rs933121-rs933122; rs2834140-rs12626953; rs2834485-rs3453; rs9974986-rs2834703; rs2776266-rs2835001; rs1984014-rs1984015; rs7281674-rs2835316; rs13047304-rs13047322; rs2835545-rs4816551; rs2835735-rs2835736; rs13047608-rs2835826; rs2836550-rs2212596; rs2836660-rs2836661; rs465612-rs8131220; rs9980072-rs8130031; rs418359-rs2836926; rs7278447-rs7278858; rs385787-rs367001; rs367001-rs386095; rs2837296-rs2837297; y rs2837381-rs4816672.
En el presente documento también se desvela una composición para determinar la fracción de ADNsc fetal en una muestra materna por secuenciación masiva en paralelo del ADNsc fetal y materno en la muestra materna, por ejemplo, una muestra de plasma, en donde la composición comprende al menos un conjunto de cebadores para amplificar al menos un ácido nucleico polimórfico en dicha mezcla.
En el presente documento también se desvela un kit que comprende la composición descrita anteriormente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un diagrama de flujo de un método 100 para determinar la fracción fetal en una muestra de prueba materna que comprende una mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos usando métodos de secuenciación masiva en paralelo o separación por tamaño de secuencias de ácidos nucleicos polimórficas.
La Figura 2 es un diagrama de barras que muestra la identificación de secuencias polimórficas fetales y maternas (SNP) usadas para determinar la fracción fetal en una muestra de prueba. Se muestran el número total de lecturas de secuencia (eje Y) cartografiadas con las secuencias de SNP identificadas por números rs (eje X), y el nivel relativo de ácidos nucleicos fetales (*).
La Figura 3 es un diagrama de flujo que resume realizaciones alternativas del método para determinar la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo mostrada en la Figura 1.
La Figura 4 ilustra marcadores de STR usados en el kit de amplificación por PCR AmpFISTR® Identifiler®. La Figura 5 ilustra marcadores de STR usados en el kit de amplificación por PCR AmpFISTR® Identifiler®. La Figura 6 ilustra la correlación de fracción fetal determinada por separación por tamaño por secuenciación masiva en paralelo de secuencias polimórficas que comprenden SNP y STR.
La Figura 7 ilustra una realización de uso de fracción fetal para determinar los umbrales de corte para la detección de aneuploidía.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona métodos de determinación de la fracción de ácidos nucleicos fetales en una muestra materna que comprende una mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos. Se puede usar la fracción de ácidos nucleicos fetales en la determinación de la presencia o ausencia de aneuploidía fetal.
La invención es como se explica en las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales comúnmente usadas en biología molecular, microbiología, purificación de proteínas, ingeniería de proteínas, secuenciación de proteínas y de ADN, y campos de ADN recombinante, que están dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas son conocidas por los expertos en la técnica y se describen en numerosos textos estándar y trabajos de referencia. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Se pretende que cada limitación numérica máxima dada en toda esta memoria descriptiva incluya cada limitación numérica más baja, como si dichas limitaciones numéricas más bajas se escribieran explícitamente en el presente documento. Cada limitación numérica mínima dada en toda esta memoria descriptiva incluirá cada limitación numérica más alta, como si dichas limitaciones numéricas más altas se escribieran explícitamente en el presente documento. Cada intervalo numérico dado en toda esta memoria descriptiva incluirá cada intervalo numérico más estrecho que entra dentro de dicho intervalo numérico más ancho, como si dichos intervalos numéricos más estrechos se escribieran todos explícitamente en el presente documento.
DEFINICIONES
Como se usa en el presente documento, los términos en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia en plural, a menos que el contexto indique claramente de otro modo. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' y las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, los términos en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen la referencia en plural, a menos que el contexto indique claramente de otro modo. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' y las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente.
El término "porción", cuando se usa en referencia a la cantidad de información de secuencias de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos en una muestra biológica, se refiere en el presente documento a la cantidad de información de secuencias de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos en una muestra biológica que en suma ascienden a menos que la información de secuencias de <1 genoma humano.
Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "moléculas de ácidos nucleicos" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de nucleótidos covalentemente unida (es decir, ribonucleótidos para ARN y desoxirribonucleótidos para ADN) en la que la posición 3' de la pentosa de un nucleótido se une por un grupo fosfodiéster a la posición 5' de la pentosa del siguiente, incluyen secuencias de cualquier forma de ácido nucleico, que incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ARN, ADN y ADNsc. El término "polinucleótido" incluye, sin limitación, polinucleótido mono- y bicatenario.
El término "variación del número de copias" en el presente documento se refiere a la variación en el número de copias de una secuencia de ácidos nucleicos que tiene 1 kb o más presente en una muestra de prueba en comparación con el número de copias de la secuencia de ácidos nucleicos presente en una muestra idónea. Una "variante del número de copias" se refiere a la secuencia de ácido nucleico de 1 kb o más en la que las diferencias en el número diferencias se encuentran por comparación de una secuencia de interés en la muestra de prueba con la presente en una muestra idónea. Las variantes/variaciones del número de copias incluyen deleciones, que incluyen microdeleciones, inserciones, que incluyen microinserciones, duplicaciones, multiplicaciones, inversiones, translocaciones y variantes multisitio complejas. Las CNV engloban aneuploidías cromosómicas y aneuploidías parciales.
Como se usa en el presente documento, el término "fracción fetal" se usa indistintamente con "fracción de ácido nucleico fetal", que se refiere a la fracción de ácido nucleico fetal en una muestra que comprende ácido nucleico fetal y materno. Similarmente, el término "fracción secundaria" o "componente secundario" en el presente documento se refiere a la menor fracción del material genético total que está presente en una muestra que contiene material genético derivado de fuentes separadas, por ejemplo, individuos.
Como se usa en el presente documento, el término "alelo" se refiere a una forma específica de una secuencia genética (tal como un gen) dentro de una célula, una muestra, un individuo o dentro de una población, diferenciándose la forma específica de otras formas del mismo gen en la secuencia de al menos un sitio de variante, y frecuentemente más de uno, dentro de la secuencia del gen. Las secuencias en estos sitios de variante que se diferencian entre alelos diferentes se llaman "variantes", "polimorfismos" o "mutaciones". En general, el polimorfismo se usa para referirse a variantes que tienen una frecuencia de al menos el 1 % en una población, mientras que el término mutación se usa, en general, para variantes que ocurren en una frecuencia de menos del 1 % en una población. En organismos diploides tales como los seres humanos, en cada localización cromosómica específica autosómica o "locus", un individuo posee dos alelos, uno primero heredado de un padre y uno segundo heredado del otro padre, por ejemplo, uno de la madre y uno del padre. Un individuo es "heterocigótico" en un locus si tiene dos alelos diferentes en el locus. Un individuo es "homocigótico" en un locus si tiene dos alelos idénticos en ese locus.
El término "enriquecer" en el presente documento se refiere al proceso de amplificación de ácidos nucleicos diana polimórficos contenidos en una porción de una muestra materna, y combinación del producto amplificado con el resto de la muestra materna de la que se retiró la porción.
Como se usa en el presente documento, el término "genotipado" se refiere a la determinación de la información genética que un individuo lleva en una o más posiciones en el genoma. Por ejemplo, el genotipado puede comprender la determinación de qué alelo o alelos tiene un individuo para un solo SNP o la determinación de qué alelo o alelos tiene un individuo para una pluralidad de SNP. Por ejemplo, un nucleótido particular en un genoma puede ser una T en algunos individuos y una C en otros individuos. Los individuos que tienen una T en la posición tienen el alelo T y los que tienen una C tienen el alelo C. En un organismo diploide, el individuo tendrá dos copias de la secuencia que contiene la posición polimórfica, por lo que el individuo puede tener un alelo T y un alelo C, o alternativamente dos copias del alelo T o dos copias del alelo C. Los individuos que tienen dos copias del alelo C son homocigóticos para el alelo C, los individuos que tienen dos copias del alelo T son homocigóticos para el alelo T, y los individuos que tienen una copia de cada alelo son heterocigóticos. Los alelos se denominan frecuentemente el alelo A, frecuentemente el alelo principal, y el alelo B, frecuentemente el alelo secundario. Los genotipos pueden ser AA (A homocigótico), BB (B homocigótico) o AB (heterocigótico). Los métodos de genotipado proporcionan, en general, la identificación de la muestra como AA, BB o AB.
Como se usa en el presente documento, el término "cromosoma" se refiere al portador del gen que lleva la herencia de una célula viva que deriva de cromatina y que comprende ADN y componentes de proteína (especialmente histonas). En el presente documento se emplea el sistema de numeración convencional internacionalmente reconocido de cromosomas del genoma humano individual. El tamaño de un cromosoma individual puede variar de un tipo a otro con un genoma multi-cromosómico dado y de un genoma a otro. En el caso del genoma humano, toda la masa de ADN de un cromosoma dado es normalmente superior a aproximadamente 100.000.000 pb. Por ejemplo, el tamaño de todo el genoma humano es aproximadamente 3 x 109 pb. El cromosoma más grande, el cromosoma N° 1, contiene aproximadamente 2,4 x 108 pb, mientras que el cromosoma más pequeño, el cromosoma N° 22, contiene aproximadamente 5,3 x 107 pb.
El término "aneuploidía" en el presente documento se refiere a la aparición de uno o más cromosomas adicionales o que faltan.
Como se usa en el presente documento, el término "región cromosómica" es una porción de un cromosoma. Puede variar enormemente el tamaño físico o grado actual de cualquier región cromosómica individual. El término "región" no es necesariamente definitivo de uno o más genes particulares debido a que una región no necesita tener en cuenta específicamente los segmentos codificantes particulares (exones) de un gen individual.
Como se usa en el presente documento, el término "marcador genético" se refiere a una secuencia de ADN que tiene una localización específica en un cromosoma que se puede medir en un laboratorio. El término "marcador genético" también se puede usar para referirse a, por ejemplo, un ADNc y/o un ARNm codificado por una secuencia genómica, así como a esa secuencia genómica. Para ser útil, un marcador necesita tener dos o más alelos o variantes. Los marcadores pueden ser o directos, es decir, situados dentro del gen o locus de interés (es decir, gen candidato), o indirectos, es decir, estrechamente asociados con el gen o locus de interés (supuestamente debido a una localización que está próxima, pero no dentro del gen o locus de interés). Además, los marcadores también pueden incluir secuencias que modifican o no modifican la secuencia de aminoácidos de un gen.
Como se usa en el presente documento, el término "muestra materna" se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto embarazado, y comprende una mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos. Un "sujeto embarazado" no se limita a un ser humano, pero también puede incluir otros organismos que incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, plantas, bacterias o células derivadas de cualquiera de los anteriores.
El término "amplificación de genoma completo" o "WGA", como se usa en el presente documento, se refiere, en general, a un método de amplificación de una muestra de ADN limitada en un modo no específico, para generar una nueva muestra que no es distinguible de la original, pero con una concentración de ADN más alta. La técnica ideal de amplificación de genoma completo amplificaría una muestra hasta un nivel de microgramo, mientras se mantiene la representación de secuencia original. El ADN de la muestra puede incluir un genoma completo o una porción del mismo. La PCR cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP), la técnica de PCR de extensión con cebadores (PEP) que incluye preamplificación por extensión con cebadores mejorados modificados (mIPEP) y la amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) son ejemplos de métodos de amplificación de genoma completo.
El término "repetición en tándem corta" o "STR", como se usa en el presente documento, se refiere a una clase de polimorfismos que ocurre cuando se repite un patrón de dos o más nucleótidos y las secuencias repetidas están directamente adyacentes entre sí. El patrón puede variar en longitud desde 2 hasta 10 pares de bases (pb) (por ejemplo, (CATG)n en una región genómica) y normalmente está en la región de intrón no codificante. Examinando varios loci de STR y contando cuántas repeticiones de una secuencia de STR específica existen en un locus dado, es posible crear un perfil genético único de un individuo.
El término "cebador", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido aislado que es capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis cuando se pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un primer producto de extensión de cebador que es complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor tal como ADN polimerasa y a una temperatura adecuada y pH). El cebador es preferentemente monocatenario para la máxima eficiencia en la amplificación, pero alternativamente puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se trata primero separando sus cadenas antes de ser usado para preparar los productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, que incluyen la temperatura, la fuente de cebador, el uso del método y los parámetros usados para el diseño del cebador, como se desvela en el presente documento.
El término "par de cebadores" o "conjunto de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluyen un cebador 5' "en la dirección 5'" o "cebador directo" que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ADN que se va a amplificar y un cebador 3' "en la dirección 3'" o "cebador inverso" que se hibrida con el extremo 3' de la secuencia que se va amplificar. Como se reconocerá por los expertos en la técnica, los términos "en la dirección 5'" y "en la dirección 3'" o "directo" e "inverso" no pretenden ser limitantes, sino que proporcionan orientación ilustrativa en realizaciones particulares. Se dice que un par de cebadores es "único" si se puede emplear para amplificar específicamente una secuencia de nucleótidos diana particular en una mezcla de amplificación dada.
Un "marcador polimórfico" o "sitio polimórfico" es un locus en el que ocurre la divergencia de la secuencia de nucleótidos. El locus puede ser tan pequeño como un par de bases. Los marcadores ilustrativos tienen al menos dos alelos, ocurriendo cada uno en una frecuencia superior al 1 %, y más normalmente superior al 10 % o 20 % de una población seleccionada. Un sitio polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), número variable de repeticiones en tándem (VNTR), regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos, repeticiones de tetranucleótidos, repeticiones de secuencias simples, deleciones y elementos de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada se designa arbitrariamente como la forma de referencia y otras formas alélicas se designan como alelos alternativos o de variante. La forma alélica que ocurre más frecuentemente en una población seleccionada se denomina algunas veces la forma natural. Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para las formas alélicas. Un polimorfismo dialélico tiene dos formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas. Un polimorfismo entre dos ácidos nucleicos puede ocurrir naturalmente, o se provoca por exposición a o contacto con sustancias químicas, enzimas, u otros agentes, o exposición a agentes que provocan un daño a los ácidos nucleicos, por ejemplo, radiación ultravioleta, mutágenos o carcinógenos. Los términos "locus polimórfico" y "sitio polimórfico" se usan indistintamente en el presente documento.
Los términos "ácido nucleico diana polimórfico", "secuencia polimórfica", "secuencia de ácidos nucleicos diana polimórficos" y "ácido nucleico polimórfico" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, una secuencia de ADN, que comprende uno o más sitios polimórficos, por ejemplo, un SNP o un SNP en tándem. Las secuencias polimórficas según la presente tecnología se pueden usar para diferenciar específicamente entre alelos maternos y no maternos en la muestra materna que comprende una mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos.
Un "polimorfismo de un solo nucleótido" (SNP) ocurre en un sitio polimórfico ocupado por un único nucleótido, que es el sitio de variación entre secuencias alélicas. El sitio va normalmente precedido y seguido por secuencias altamente conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que varían en menos de 1/100 o 1/1000 miembros de las poblaciones). Un SNP normalmente surge debido a la sustitución de un nucleótido por otro en el sitio polimórfico. Una transición es la sustitución de una purina por otra purina o una pirimidina por otra pirimidina. Una transición es la sustitución de una purina por una pirimidina o viceversa. Los SNP también pueden surgir de una deleción de un nucleótido o una inserción de un nucleótido con respecto a un alelo de referencia. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) son posiciones en las que dos bases alternativas ocurren a frecuencia apreciable (>1 %) en la población humana, y son el tipo más común de variación genética humana.
Como se usa en el presente documento, el término "repetición en tándem corta" o "STR" como se usa en el presente documento se refiere a una clase de polimorfismos que ocurre cuando se repite un patrón de dos o más nucleótidos y las secuencias repetidas están directamente adyacentes la una a la otra. El patrón puede variar en longitud desde 2 hasta 10 pares de bases (pb) (por ejemplo, (CATG)n en una región genómica) y normalmente está en la región de intrón no codificante. Examinando varios loci de STR y contando cuántas repeticiones de una secuencia de STR específica existen en un locus dado, es posible crear un perfil genético único de un individuo.
Como se usa en el presente documento, el término "miniSTR" en el presente documento se refiere a la repetición en tándem de cuatro o más pares de bases que engloba menos de aproximadamente 300 pares de bases, menos de aproximadamente 250 pares de bases, menos de aproximadamente 200 pares de bases, menos de aproximadamente 150 pares de bases, menos de aproximadamente 100 pares de bases, menos de aproximadamente 50 pares de bases, o menos de aproximadamente 25 pares de bases. "miniSTR" son STR que son amplificables de moldes de ADNsc.
El término "SNP en tándem" en el presente documento se refiere a dos o más SNP que están presentes dentro de una secuencia de ácidos nucleicos diana polimórficos.
Los términos "pluralidad de ácidos nucleicos diana polimórficos", "ácidos nucleicos polimórficos" y "secuencias polimórficas" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a varias secuencias de ácidos nucleicos que comprenden cada una al menos un sitio polimórfico, por ejemplo, un SNP, de forma que al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o 40 o más sitios polimórficos diferentes se amplifiquen de los ácidos nucleicos diana polimórficos para identificar y/o cuantificar alelos fetales presentes en muestras maternas que comprenden ácidos nucleicos fetales y maternos.
Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente sin células" engloba preparaciones de la muestra deseada de la que se retiran los componentes que están normalmente asociados con ella. Por ejemplo, una muestra de plasma se vuelve esencialmente sin células retirando los glóbulos sanguíneos, por ejemplo, glóbulos rojos, que normalmente están asociados con ella. En algunas realizaciones, las muestras sustancialmente libres se procesan para retirar células que contribuirían de otro modo al material genético deseado que se va a probar para una anomalía
Como se usa en el presente documento, el término "cromosoma" se refiere al portador del gen que lleva la herencia de una célula viva que deriva de cromatina y que comprende ADN y componentes de proteína (especialmente histonas). En el presente documento se emplea el sistema de numeración convencional internacionalmente reconocido de cromosomas del genoma humano individual. El tamaño de un cromosoma individual puede variar de un tipo a otro con un genoma multi-cromosómico dado y de un genoma a otro. En el caso del genoma humano, toda la masa de ADN de un cromosoma dado es normalmente superior a aproximadamente 100.000.000 pb. Por ejemplo, el tamaño de todo el genoma humano es aproximadamente 3 x 109 pb. El cromosoma más grande, el cromosoma N° 1, contiene aproximadamente 2,4 x 108 pb, mientras que el cromosoma más pequeño, el cromosoma N° 22, contiene aproximadamente 5,3 x 107 pb.
El término "oligonucleótido" se usa para referirse a un ácido nucleico que es relativamente corto, en general, más corto de 200 nucleótidos, más particularmente, más corto de 100 nucleótidos, lo más particularmente, más corto de 50 nucleótidos. Normalmente, los oligonucleótidos son moléculas de ADN monocatenario.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que es capaz de hibridarse (también llamado "apareamiento") con un ácido nucleico y servir de sitio de iniciación para la polimerización de nucleótidos (ARN o ADN) en condiciones apropiadas (es decir, en presencia de cuatro trifosfatos de nucleósido diferentes y un agente para la polimerización, tal como ADN o ARN polimerasa o transcriptasa inversa) en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada. La longitud apropiada de un cebador depende del uso previsto el cebador, pero los cebadores normalmente tienen al menos 7 nucleótidos de longitud y, más normalmente varían de 10 a 30 nucleótidos, o incluso más normalmente de 15 a 30 nucleótidos, de longitud. Otros cebadores pueden ser algo más largos, por ejemplo, 30 a 50 nucleótidos de longitud.
El término "identificación alélica", como se usa en el presente documento, se refiere a la caracterización satisfactoria de un alelo por un método de análisis dado. Si el análisis proporciona caracterización satisfactoria de ambos alelos de un locus de gen de una muestra de ADN, se dice que se hacen dos identificaciones alélicas. Si un alelo está caracterizado mientras que el otro alelo no está caracterizado, se dice que se hace una identificación alélica. Si ninguno de los dos alelos está caracterizado satisfactoriamente, no se hacen identificaciones alélicas.
El término "alelo", como se usa en el presente documento, es una cualquiera de varias codificaciones de ADN viable que ocupan un locus dado (posición) en un cromosoma. Normalmente, los alelos son secuencias de ADN (ácido desoxirribonucleico) que codifican un gen, pero algunas veces el término se usa para referirse a una secuencia no de génica. El genotipo de un individuo para ese gen es el conjunto de alelos que posee. En un organismo diploide, uno que tiene copias de cada cromosoma, dos alelos constituyen el genotipo del individuo.
El término "mezcla de reacción", como se usa en el presente documento, se refiere a una mezcla que contiene componentes suficientes para llevar a cabo una reacción de amplificación.
El término "densidad de marcas de secuencia" en el presente documento se refiere al número de lecturas de secuencias que se cartografían en una secuencia de genoma de referencia, por ejemplo, la densidad de marcas de secuencia para el cromosoma 21 es el número de lecturas de secuencias generadas por el método de secuenciación que se cartografían en el cromosoma 21 del genoma de referencia. El término "relación de densidad de marcas de secuencia" en el presente documento se refiere a la relación entre el número de marcas de secuencia que se cartografían en un cromosoma del genoma de referencia, por ejemplo, el cromosoma 21, y la longitud del genoma 21 del genoma de referencia.
Los términos "valor umbral" y "valor umbral idóneo" en el presente documento se refieren a cualquier número que se calcula usando un conjunto de datos idóneo y sirve de límite de diagnóstico de una variación del número de copias, por ejemplo, una aneuploidía, en un organismo. Si se supera un umbral, un sujeto se puede diagnosticar con una variación del número de copias, por ejemplo, trisomía 21.
El término "lectura" se refiere a una secuencia de ADN de longitud suficiente (por ejemplo, al menos aproximadamente 30 pb) que se puede usar para identificar una secuencia o región mayor, por ejemplo, que se puede alinear y asignar específicamente a un cromosoma o región genómica o gen.
El término "marca de secuencia" se usa en el presente documento indistintamente con el término "marca de secuencia cartografiada" para referirse a una lectura de secuencia que se ha asignado específicamente, es decir, cartografiado, en una secuencia mayor, por ejemplo, un genoma de referencia, por alineamiento. Las marcas de secuencia cartografiadas se cartografían de forma única en un genoma de referencia, es decir, se asignan a una localización única al genoma de referencia. Las marcas que se pueden cartografiar en más de una localización en un genoma de referencia, es decir, marcas que no se cartografían de forma única, no se incluyen en el análisis.
Los términos "alineado", "alineamiento" o "alinear" se refieren a una o más secuencias que se identifican como una correspondencia en términos del orden de sus moléculas de ácidos nucleicos con respecto a una secuencia conocida de un genoma de referencia. Dicho alineamiento se puede hacer manualmente o por un algoritmo informático, ejemplos de los cuales incluyen el programa informático Efficient Local Alignment of Nucleotide Data (ELAND) distribuido como parte de la canalización de Genomics Analysis de Illumina. El emparejamiento de una lectura de secuencia en el alineamiento puede ser un emparejamiento de secuencias del 100 % o inferior al 100 % (emparejamiento no perfecto).
El término "genoma de referencia" se refiere a cualquier secuencia de genoma conocida particular, tanto parcial como completa, de cualquier organismo o virus que se puede usar para referenciar secuencias identificadas de un sujeto. Por ejemplo, un genoma de referencia usado para sujetos humanos, así como muchos otros organismos, se encuentra en el Centro nacional para información biotecnológica en www.ncbi.nlm.nih.gov. Un "genoma" se refiere a la información genética completa de un organismo o virus, expresado en secuencias de ácidos nucleicos.
El término "genoma de secuencias diana artificial" en el presente documento se refiere a una agrupación de secuencias conocidas que engloban alelos de sitios polimórficos conocidos. Por ejemplo, un " genoma de referencia de SNP " es un genoma de secuencias diana artificial que comprende una agrupación de secuencias que engloba alelos de SNP conocidos.
El término "secuencia de relevancia clínica" en el presente documento se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se conoce o se sospecha que se asocia a o está implicada en una afección genética o patología. La determinación de la ausencia o presencia de una secuencia de relevancia clínica puede ser útil en la determinación de un diagnóstico o la confirmación de un diagnóstico de una afección médica, o que proporciona un pronóstico para el desarrollo de una enfermedad.
El término "muestra mixta" en el presente documento se refiere a una muestra que contiene una mezcla de ácidos nucleicos, que deriva de diferentes genomas.
El término "muestra materna original" en el presente documento se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto embarazado, por ejemplo, una mujer, que sirve de fuente de la que se retira una porción para amplificar los ácidos nucleicos diana polimórficos. La "muestra original" puede ser cualquier muestra obtenida de un sujeto embarazado, y las fracciones procesadas de la misma, por ejemplo, una muestra de ADNsc purificada extraída de una muestra materna de plasma. El término "muestra original materna" en el presente documento se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto embarazado, por ejemplo, una mujer, que sirve de fuente de la que se retira una porción para amplificar los ácidos nucleicos diana polimórficos. La "muestra original" puede ser cualquier muestra obtenida de un sujeto embarazado, y las fracciones procesadas de la misma, por ejemplo, una muestra de ADNsc purificada extraída de una muestra materna de plasma.
El término "líquido biológico" en el presente documento se refiere a un líquido tomado de una fuente biológica e incluye, por ejemplo, sangre, suero, plasma, esputo, líquido de lavado, líquido cefalorraquídeo, orina, semen, sudor, lágrimas, saliva y similares. Como se usa en el presente documento, los términos "sangre", "plasma" y "suero" engloban explícitamente fracciones o porciones procesadas de los mismos. Similarmente, donde una muestra se toma de una biopsia, hisopo, frotis, etc., la "muestra" engloba explícitamente una fracción o porción procesada derivada de la biopsia, hisopo, frotis, etc.
Los términos "ácidos nucleicos maternos" y "ácidos nucleicos fetales" en el presente documento se refieren a los ácidos nucleicos de un sujeto femenino embarazado y los ácidos nucleicos del feto que son portados por la hembra embarazada, respectivamente.
El término "correspondientes a" en el presente documento se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo un gen o un cromosoma, que está presente en el genoma de diferentes sujetos, y que no tiene necesariamente la misma secuencia en todos los genomas, pero sirve para proporcionar la identidad en vez de la información genética de una secuencia de interés, por ejemplo, un gen o cromosoma.
El término "grupo de cromosomas" en el presente documento se refiere a dos o más cromosomas.
El término "sujeto" en el presente documento se refiere a un sujeto humano, así como a sujeto no humano tal como un mamífero.
DESCRIPCIÓN
Los métodos descritos en el presente documento permiten la determinación de la fracción del componente secundario del ácido nucleico fetal en una muestra que comprende una mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos. En particular, el método permite la determinación de la fracción de ADNsc con la que contribuye un feto a la mezcla de ADNsc fetal y materno en una muestra materna, por ejemplo, una muestra de plasma. La diferencia entre la fracción materna y la fetal se determina por la contribución relativa de un alelo polimórfico derivado del genoma fetal a la contribución del alelo polimórfico correspondiente derivado del genoma materno. Se pueden usar secuencias polimórficas junto con pruebas de diagnóstico de relevancia clínica como control positivo para la presencia de ADNsc para poner de relieve resultados negativos falsos o positivos falsos que proceden de bajos niveles de ADNsc por debajo del límite de identificación. Los métodos descritos son independientes del sexo del feto, y son útiles en un intervalo de edades gestacionales.
La Figura 1 proporciona un diagrama de flujo de una realización 100 para determinar la fracción de ácidos nucleicos fetales en una muestra biológica materna por secuenciación masiva en paralelo de ácidos nucleicos diana polimórficos amplificados por PCR. En la etapa 110 se obtiene de un sujeto una muestra materna que comprende una mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos. La muestra es una muestra materna que se obtiene de una hembra embarazada, por ejemplo, una mujer embarazada. Otras muestras maternas pueden ser de mamíferos, por ejemplo, vaca, caballo, perro o gato. Si el sujeto es un humano, la muestra se puede tomar en el primer o segundo trimestre de embarazo. Se puede usar cualquier muestra biológica materna como fuente de ácidos nucleicos fetales y maternos que están contenidos en células o que están "sin células". En algunas realizaciones, es ventajoso obtener una muestra materna que comprende ácidos nucleicos sin células, por ejemplo, ADNsc. En la invención reivindicada, la muestra biológica materna es una muestra de plasma. Como se usa en el presente documento, los términos "sangre", "plasma" y "suero" engloban explícitamente fracciones o porciones procesadas de los mismos.
En la etapa 120, la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos se procesa aún más a partir de la fracción de muestra, por ejemplo, plasma, para obtener una muestra que comprende una mezcla purificada de ácidos nucleicos fetales y maternos, por ejemplo, ADNsc. Los ácidos nucleicos sin células, que incluyen ADN sin células, se pueden obtener por diversos métodos conocidos en la técnica a partir de muestras biológicas que incluyen, pero no se limitan a, plasma, suero y orina (Fan et al., Proc Natl Acad Sci 105:16266-16271 [2008]; Koide et al., Prenatal Diagnosis 25:604-607 [2005]; Chen et al., Nature Med. 2: 1033-1035 [1996]; Lo et al., Lancet 350: 485-487 [1997]. Para separar ADNsc de células, se puede usar fraccionamiento, centrifugación (por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad), precipitación específica de ADN o clasificación de células de alto rendimiento y/o métodos de separación. Los ejemplos de métodos para procesar las muestras líquidas se han desvelado previamente, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE. UU. N° 20050282293, 20050224351 y 20050065735. Están disponibles kits comercialmente disponibles para la separación manual y automática de ADNsc (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, Qiagen, Valencia, CA, Macherey-Nagel, Duren, DE). En algunos casos, puede ser ventajoso fragmentar las moléculas de ácidos nucleicos en la muestra de ácidos nucleicos. La fragmentación puede ser aleatoria, o puede ser específica, como se logra, por ejemplo, usando digestión por endonucleasa de restricción. Los métodos de fragmentación aleatoria se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, digestión con DNAsa limitada, tratamiento alcalino y cizallamiento físico. En la invención reivindicada, se obtienen ácidos nucleicos de muestra como ADNsc, que no se somete a fragmentación. En otros casos, los ácidos nucleicos de la muestra se pueden obtener como ADN genómico, que se somete a fragmentación en fragmentos de aproximadamente 500 o más pares de bases, y a los que se pueden aplicar fácilmente métodos de NGS.
En la etapa 130, se usa una porción de la mezcla purificada de ADNsc fetal y materno para amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos diana polimórficos cada uno de los cuales comprende un sitio polimórfico. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos diana comprenden cada uno un SNP. En otras realizaciones, cada uno de los ácidos nucleicos diana comprende un par de SNP en tándem. En aún otros casos, cada uno de los ácidos nucleicos diana comprende un STR. Los sitios polimórficos que están contenidos en los ácidos nucleicos diana incluyen, sin limitación, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), SNP en tándem, deleciones o inserciones de múltiples bases a pequeña escala, los denominados IN-DELS (también denominados polimorfismos de deleción-inserción o DIP), polimorfismos de nucleótidos múltiples (MNP), repeticiones en tándem cortas (STR), polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), o un polimorfismo que comprende cualquier otro cambio de secuencia en un cromosoma. En algunas realizaciones, los sitios polimórficos se localizan en cromosomas autosómicos, lo que permite así la determinación de la fracción fetal independientemente del sexo del feto. También se pueden usar los polimorfismos asociados a cromosomas distintos del cromosoma 13, 18, 21 e Y en los métodos descritos en el presente documento.
Los polimorfismos pueden ser indicativos, informativos, o ambos. Los polimorfismos indicativos indican la presencia de ADN sin células fetal en una muestra materna. Por ejemplo, cuanto más haya de una secuencia genética particular, por ejemplo, un SNP, más traducirá un método su presencia en una intensidad de color particular, densidad de color, o alguna otra propiedad que sea detectable y medible e indicativa de la presencia, ausencia y cantidad de un fragmento de ADN particular y/o polimorfismo particular, por ejemplo, SNP del embrión. Los polimorfismos indicativos dan información sobre el feto - por ejemplo, la presencia o ausencia de una enfermedad, anomalía genética o cualquier otra información biológica, tal como la etapa de gestación o sexo. Con respecto a la presente invención, los métodos no se realizan usando todos los posibles SNP en un genoma, sino que usan los que se dice que son "informativos". Los "SNP informativos" en este caso son los que identifican diferencias en la secuencia de la madre y del feto. Se puede usar cualquier sitio polimórfico que pueda estar englobado por las lecturas generadas por los métodos de secuenciación descritos en el presente documento para determinar la fracción fetal.
En una realización, se usa una porción de la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos en la muestra (es decir, el ADNsc) como molde para amplificar ácidos nucleicos diana que comprenden al menos un SNP. En algunas realizaciones, cada ácido nucleico diana comprende un único SNP, es decir, uno. Las secuencias de ácidos nucleicos diana que comprenden SNP están disponibles de bases de datos públicamente accesibles que incluyen, pero no se limitan a, Human SNP Database en la dirección de la malla multimedia mundial wi.mit.edu, NCBI dbSNP Home Page en la dirección de la malla multimedia mundial ncbi.nlm.nih.gov, la dirección de la malla multimedia mundial lifesciences.perkinelmer.com, Applied Biosystems de Life Technologies™ (Carlsbad, CA) en la dirección de la malla multimedia mundial appliedbiosystems.com, la base de datos Celera Human SNP en la dirección de la malla multimedia mundial celera.com, la base de datos de SNP del Genome Analysis Group (GAN) en la dirección de la malla multimedia mundial gan.iarc.fr. En una realización, los SNP elegidos para el enriquecimiento de los ADNsc fetales y maternos se seleccionan del grupo de 92 SNP de identificación individual (IISNP) descrito por Pakstis el al. (Pakstis et al., Hum Genet 127:315-324 [2010]), que se ha mostrado que tienen una variación muy pequeña en la frecuencia a través de las poblaciones (Fst <0,06), y que es altamente informativa en todo el mundo, teniendo una heterocigosidad promedio >0,4. Los SNP que están englobados por el método de la invención incluyen SNP unidos y no unidos. Otros SNP útiles aplicables o útiles para los métodos descritos en el presente documento se desvelan en las solicitudes de patente de EE. UU. N220080070792, 20090280492, 20080113358, 20080026390, 20080050739, 20080220422 y 20080138809. Cada ácido nucleico diana comprende al menos un sitio polimórfico, por ejemplo, un único SNP, que se diferencia del presente en otro ácido nucleico diana por generar un panel de sitios polimórficos, por ejemplo SNP, que contiene un número suficiente de sitios polimórficos de los que al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más son informativos. Por ejemplo, se puede configurar un panel de SNP para que comprenda al menos un SNP informativo. En una realización, los SNP que se dirigen para la amplificación se seleccionan de rs560681, rs1109037, rs9866013, rs13182883, rs13218440, rs7041158, rs740598, rs10773760, rs4530059, rs7205345, rs8078417, rs576261, rs2567608, rs430046, rs9951171, rs338882, rs10776839, rs9905977, rs1277284, rs258684, rs1347696, rs508485, rs9788670, rs8137254, rs3143, rs2182957, rs3739005 y rs530022. En una realización, el panel de SNP comprende al menos 3, al menos 5, al menos 10, al menos 13, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30 o más SNP. En una realización, el panel de SNP comprende rs560681, rs1109037, rs9866013, rs13182883, rs13218440, rs7041158, rs740598, rs10773760, rs4530059, rs7205345, rs8078417, rs576261 y rs2567608. Los ácidos nucleicos polimórficos que comprenden los SNP se pueden amplificar usando pares de cebadores a modo de ejemplo proporcionados en el Ejemplo 3, y desvelados como SEQ ID NO: 57-112.
En otras realizaciones, cada ácido nucleico diana comprende dos o más SNP, es decir, cada ácido nucleico diana comprende SNP en tándem. Preferentemente, cada ácido nucleico diana comprende dos SNP en tándem. Los SNP en tándem se analizan como una única unidad como haplotipos cortos, y se proporcionan en el presente documento como conjuntos de dos SNP. Para identificar secuencias de SNP en tándem adecuadas, se puede buscar en la base de datos International HapMap Consortium (The International HapMap Project, Nature 426:789-796 [2003]). La base de datos está disponible en la malla multimedia mundial en hapmap.org. En una realización, los SNP en tándem que se dirigen para amplificación se seleccionan de los siguientes conjuntos de pares de SNP en tándem rs7277033-rs2110153; rs2822654-rs1882882; rs368657-rs376635; rs2822731-rs2822732; rs1475881-rs7275487; rs1735976-rs2827016; rs447340-rs2824097; rs418989- rs13047336; rs987980- rs987981; rs4143392- rs4143391; rs1691324-rs13050434; rs11909758-rs9980111; rs2826842-rs232414; rs1980969-rs1980970; rs9978999-rs9979175; rs1034346-rs12481852; rs7509629-rs2828358; rs4817013-rs7277036; rs9981121-rs2829696; rs455921-rs2898102; rs2898102-rs458848; rs961301-rs2830208; rs2174536-rs458076; rs11088023-rs11088024; rs1011734-rs1011733; rs2831244-rs9789838; rs8132769-rs2831440; rs8134080-rs2831524; rs4817219-rs4817220; rs2250911-rs2250997; rs2831899-rs2831900; rs2831902-rs2831903; rs11088086-rs2251447; rs2832040-rs11088088; rs2832141-rs2246777; rs2832959 -rs9980934; rs2833734-rs2833735; rs933121-rs933122; rs2834140-rs12626953; rs2834485-rs3453; rs9974986-rs2834703; rs2776266-rs2835001; rs1984014-rs1984015; rs7281674-rs2835316; rs13047304-rs13047322; rs2835545-rs4816551; rs2835735-rs2835736; rs13047608-rs2835826; rs2836550-rs2212596; rs2836660-rs2836661; rs465612-rs8131220; rs9980072-rs8130031; rs418359-rs2836926; rs7278447-rs7278858; rs385787-rs367001; rs367001-rs386095; rs2837296-rs2837297; y rs2837381-rs4816672. Los ácidos nucleicos polimórficos que comprenden los SNP en tándem se pueden amplificar usando pares de cebadores que amplifican secuencias polimórficas que comprenden los SNP en tándem. Los ejemplos de pares de cebadores que se pueden usar para amplificar los SNP en tándem en el presente documento se desvelan en SEQ ID NO: 197-310 como se proporciona en el Ejemplo 8.
En un caso de la divulgación, una porción de la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos en la muestra, por ejemplo, ADNsc, se usa como molde para amplificar ácidos nucleicos diana que comprenden al menos un STR. En algunos casos de la divulgación, cada ácido nucleico diana comprende un único STR, es decir, uno. Los loci de STR se encuentran en casi cada cromosoma en el genoma y se pueden amplificar usando una variedad de cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se han preferido las repeticiones de tetranucleótidos entre los científicos forenses debido a su fidelidad en la amplificación por PCR, aunque también están en uso algunas repeticiones de tri- y pentanucleótidos. Un amplio listado de referencias, hechos e información de secuencias sobre STR, cebadores de PCR publicados, sistemas de múltiplex comunes y datos de poblaciones relacionados se compilan en STRBase, a la que se puede acceder por la malla multimedia mundial en ibm4.carb.nist.gov:8800/DNA/home.htm. La información de secuencias de GenBank® (http://www2.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/genbank) para loci de STR comúnmente usados también está accesible a través de STRBase. Los kits comerciales disponibles para el análisis de loci de STR proporcionan, en general, todos los componentes de reacción necesarios y controles requeridos para la amplificación. Los sistemas múltiplex de STR permiten la amplificación simultánea de múltiples loci que no se solapan en una única reacción, que aumentan sustancialmente el rendimiento. Con detección fluorescente multicolor, se pueden multiplexar loci que incluso se solapan. La naturaleza polimórfica de las secuencias de ADN repetidas en tándem que están extendidas en todo el genoma humano ha hecho que sean marcadores genéticos importantes para estudios de cartografía de genes, análisis de enlaces y pruebas de identidad humana. Debido al alto polimorfismo de STR, la mayoría de los individuos serán heterocigóticos, es decir, la mayoría de las personas poseerán dos alelos (versiones) de cada uno - uno heredado de cada padre - con un número de repeticiones diferente. Los productos de PCR que comprenden los STR se pueden separar y detectar usando métodos manuales, semiautomáticos o automáticos. Los sistemas semiautomáticos se basan en gel y combinan electroforesis, detección y análisis en una unidad. En un sistema semiautomático, el ensamblaje en gel y la carga de muestras son todavía procesos manuales; sin embargo, una vez se cargan las muestras en el gel, la electroforesis, la detección y el análisis se desarrollan automáticamente. La recogida de datos ocurre en "tiempo real" a medida que los fragmentos fluorescentemente marcados migran por delante del detector en un punto fijo y se pueden visualizar a medida que se recogen. Como el nombre implica, se lleva a cabo electroforesis capilar en un tubo microcapilar en vez de entre placas de vidrio. Una vez se cargan las muestras, el polímero de gel y el tampón en el instrumento, el capilar se llena con polímero de gel y la muestra se carga automáticamente. Por lo tanto, la secuencia de STR fetal no heredada de la madre se diferenciará en el número de repeticiones de la secuencia materna. La amplificación de estas secuencias de STR puede dar como resultado uno o dos productos de amplificación importantes correspondientes a los alelos maternos (y el alelo fetal heredado de la madre) y un producto secundario correspondiente al alelo fetal no heredado de la madre. Esta técnica fue informada por primera vez en 2000 (Pertl et al., Human Genetics 106:45-49) [2000] y se ha desarrollado posteriormente usando identificación simultánea de múltiples regiones de STR diferentes usando PCR en tiempo real (Liu et al., Acta Obset Gyn Scand 86:535-541 [2007]). Se han usado amplicones de PCR de diversos tamaños para diferenciar las respectivas distribuciones de tamaño de especies de ADN fetal y materno circulante, y han mostrado que las moléculas de ADN fetal en el plasma de mujeres embarazadas son, en general, más cortas que las moléculas de ADN materno (Chan et al., Clin Chem 50:8892 [2004]). El fraccionamiento por tamaño del ADN fetal circulante ha confirmado que la longitud promedio de los fragmentos de ADN fetal circulante es <300 pb, mientras que se ha estimado que el ADN materno está entre aproximadamente 0,5 y 1 Kb (Li et al., Clin Chem, 50: 1002-1011 [2004]). La divulgación proporciona un método de determinación de la fracción de ácido nucleico fetal en una muestra materna que comprende determinar la cantidad de copias de al menos un alelo fetal y uno materno en un sitio miniSTR polimórfico, que se puede amplificar para generar amplicones que son de longitudes de aproximadamente el tamaño de los fragmentos de ADN fetal circulante, por ejemplo, inferiores a aproximadamente 250 pares de bases. En un caso de la divulgación, la fracción fetal se puede determinar por un método que comprende la secuenciación de al menos una porción de ácidos nucleicos diana polimórficos amplificados cada uno de los cuales comprende una miniSTR. Los alelos fetales y maternos en un sitio de STR informativo se diferencian por sus diferentes longitudes, es decir, número de repeticiones, y la fracción fetal se puede calcular como una relación de porcentaje de la cantidad de alelos fetalesmaternos en ese sitio. El método puede usar uno o una combinación de cualquier número de miniSTR informativos para determinar la fracción de ácido nucleico fetal. Por ejemplo, se puede usar uno cualquiera o una combinación de cualquier número de miniSTR, por ejemplo las miniSTR desveladas en la Tabla 7 y las Figuras 4 y 5. En un caso de la divulgación, la fracción de ácido nucleico fetal en una muestra materna se realiza usando un método que incluye determinar el número de copias del ácido nucleico materno y fetal presente en la muestra materna amplificando al menos un miniSTR autosómico elegido de CSF1PO, FGA, TH01, TpOx , vWA, D3S1358,D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, D2S1338, D1S1677, D2S441, D4S2364, D10S1248, D14S1434, D22S1045, D22S1045, D20S1082, D20S482, D18S853, D17S1301, D17S974, D14S1434, D12ATA63, D11S4463, D10S1435, D10S1248, D9S2157, D9S1122, D8S1115, D6S1017, D6S474, D5S2500, D5S2500, D4S2408, D4S2364, D3S4529, D3S3053, D2S1776, D2S441, D1S1677, D1S1627 y D1GATA113. En otro caso de la divulgación, la al menos una miniSTR autosómica es el grupo de miniSTR CSF1PO, FGA, D13S317, D16S539, D18S51, D2S1338, D21S11, D2S1338 y D7S820. En un caso de la divulgación, el método comprende determinar el número de copias de al menos un alelo fetal y al menos uno materno al menos en una miniSTR polimórfica que se amplifica para generar amplicones que son inferiores a aproximadamente 300 pb, inferiores a aproximadamente 250 pb, inferiores a aproximadamente 200 pb, inferiores a aproximadamente 150 pb, inferiores a aproximadamente 100 pb o inferiores a aproximadamente 50 pb. En otro caso de la divulgación, los amplicones que se generan amplificando las miniSTRs son inferiores a aproximadamente 300 pb. En otro caso de la divulgación, los amplicones que se generan amplificando las miniSTR son inferiores a aproximadamente 250 pb. En otro caso de la divulgación, los amplicones que se generan amplificando las miniSTR son inferiores a aproximadamente 200 pb. La amplificación del alelo informativo incluye el uso de cebadores de miniSTR, que permite la amplificación de amplicones de tamaño reducido para detectar alelos de STR que son inferiores a aproximadamente 500 pb, inferiores a aproximadamente 450 pb, inferiores a aproximadamente 400 pb, inferiores a aproximadamente 350 pb, inferiores a aproximadamente 300 pares de bases (pb), inferiores a aproximadamente 250 pb, inferiores a aproximadamente 200 pb, inferiores a aproximadamente 150 pb, inferiores a aproximadamente 100 pb o inferiores a aproximadamente 50 pb. Los amplicones de tamaño reducido generados usando los cebadores de miniSTR se conocen como miniSTR, que se identifican según el nombre de marcador correspondiente en el locus con el que se han cartografiado. En un caso de la divulgación, los cebadores de miniSTR incluyen cebadores de miniSTR que han permitido la máxima reducción de tamaño en el tamaño del amplicón para los 13 loci de STR de CODIS, además de D2S1338, Penta D y pentaE encontrados en kits de STR comercialmente disponibles (Butler et al., J Forensic Sci 48:1054-1064 [2003]), loci de miniSTR que no están unidos a los marcadores CODIS como se describe por Coble y Butler (Coble y Butler, J Forensic Sci 50:43-53 [2005]) y otros miniSTR que se han caracterizado en NIST. La información referente a la miniSTR caracterizada en NIST está accesible por la malla multimedia mundial en cstl.nist.gov/biotech/strbase/newSTRs.htm. Se puede usar un par cualquiera o una combinación de dos o más pares de cebadores de miniSTR para amplificar al menos un miniSTR.
En un caso de la divulgación, los conjuntos de cebadores a modo de ejemplo que se pueden usar para amplificar STR en muestras de ADNsc materno incluyen los conjuntos de cebadores proporcionados en el Ejemplo 9 y desvelados como SEQ ID NO: 113-196.
La identificación del sexo (tipado del sexo) se realiza comúnmente junto con el tipado de STR usando productos de PCR generados a partir del gen amelogenina que se encuentra en tanto el cromosoma X como Y. La amelogenina no es un locus de STR, pero produce productos de PCR específicos del cromosoma X e Y. Un conjunto de cebadores de PCR comúnmente usado publicado por primera vez por Sullivan et al. (1993) (Sullivan et al., BioTechniques 15:637-641 [1993]) se dirige a una deleción de 6 pb que ocurre en el cromosoma X, que permite que amplicones generados a partir del cromosoma X e Y se distingan entre sí cuando se realiza la separación electroforética para separar alelos de STR. La mayoría de los kits comerciales de STR utilizan los cebadores de Sullivan et al. (1993) o modificaciones secundarias. Puesto que las hembras son X,X, solo se observa un único pico cuando se prueban muestras de ADN femenino, mientras que los varones, que poseen tanto cromosomas X como Y, presentan dos picos con una prueba de amelogenina habitual. En un caso de la divulgación, el método para determinar la fracción de ácido nucleico fetal en una muestra materna comprende coamplificar amelogenina con al menos una miniSTR. En otro caso de la divulgación, el método no comprende coamplificar amelogenina con loci de miniSTR.
La amplificación de los ácidos nucleicos diana en la mezcla de ácido nucleico fetal y materno, por ejemplo ADNsc, se lleva a cabo por cualquier método que use PCR o variaciones del método que incluyen, pero no se limitan a, PCR digital, PCR en tiempo real (RT-PCR), sistema de PCR TaqMan (Applied Biosystems), métodos SNPlex o GenPlex, PCR asimétrica, amplificación dependiente de helicasa, PCR de inicio en caliente, qPCR, PCR en fase sólida y PCR touchdown. Alternativamente, la replicación de secuencias de ácidos nucleicos diana se puede obtener por métodos independientes de enzima, por ejemplo, síntesis química en fase sólida usando los fosforamiditos. La amplificación de las secuencias diana se lleva a cabo usando pares de cebadores que son capaces de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos diana que comprende el sitio polimórfico, por ejemplo, SNP, en una reacción de PCR múltiplex. Las reacciones de PCR múltiplex incluyen combinar al menos 2, al menos tres, al menos 3, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más conjuntos de cebadores en la misma reacción para cuantificar los ácidos nucleicos diana amplificados que comprenden al menos dos, al menos tres, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más sitios polimórficos en la misma reacción de secuenciación. Se puede configurar cualquier panel de conjuntos de cebadores para amplificar al menos una secuencia polimórfica informativa.
En la etapa 140 del método 100 (Figura 1), se usa una porción o todas las secuencias polimórficas amplificadas para preparar una biblioteca de secuenciación para la secuenciación en un modo paralelo como se ha descrito. En una realización, la biblioteca se prepara para la secuenciación por síntesis usando química de secuenciación basada en terminador reversible de Illumina.
En la etapa 140, la información de secuencias que se necesita para determinar la fracción fetal se obtiene usando cualquiera de los métodos de secuenciación de ADN conocidos. En una realización, el método descrito en el presente documento emplea tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS) en la que moldes de ADN clonalmente amplificados o moléculas de ADN individuales se secuencian en un modo masivo en paralelo dentro de una celda de flujo (por ejemplo, como se describe en Volkerding et al. Clin Chem 55:641 -658 [2009]; Metzker M Nature Rev 11:31-46 [2010]). Además de la información de secuencias de alto rendimiento, la NGS proporciona información cuantitativa digital, en la que cada lectura de secuencia es una "marca de secuencia" contable que representa un molde de ADN clonal individual o una única molécula de ADN. Esta cuantificación permite que la NGS amplíe el concepto de PCR digital de contar moléculas de ADN sin células (Fan et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105:16266-16271 [2008]; Chiu et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2008;105:20458-20463 [2008]). Las tecnologías de secuenciación de NGS incluyen pirosecuenciación, secuenciación por síntesis con terminadores reversibles con colorante, secuenciación por ligación de sondas de oligonucleótidos y secuenciación en tiempo real.
Están disponibles comercialmente algunas de las tecnologías de secuenciación, tales como la plataforma de secuenciación por hibridación de Affymetrix Inc. (Sunnyvale, CA) y las plataformas de secuenciación por síntesis de 454 Life Sciences (Bradford, CT), Illumina/Solexa (Hayward, CA) y Helicos Biosciences (Cambridge, MA), y la plataforma de secuenciación por ligación de Applied Biosystems (Foster City, CA), como se describen a continuación. Además de la secuenciación de una sola molécula realizada usando secuenciación por síntesis de Helicos Biosciences, otras tecnologías de secuenciación de una sola molécula están englobadas por el método de la invención e incluyen la tecnología SMRT™ de Pacific Biosciences, la tecnología Ion Torrent™ y la secuenciación Nanopore que se desarrolla, por ejemplo, por Oxford Nanopore Technologies.
Aunque el método automático de Sanger se considera una tecnología de 'primera generación', por el método de la invención también se puede emplear la secuenciación de Sanger que incluye la secuenciación automática de Sanger. Los métodos de secuenciación adicionales que comprenden el uso del desarrollo de tecnologías de obtención de imágenes de ácidos nucleicos, por ejemplo, microscopía de fuerza atómica (AFM) o microscopía de transmisión electrónica (TEM), también están englobados por el método de la invención. A continuación, se describen las tecnologías de secuenciación a modo de ejemplo.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN que se usa en el método de la invención es la T rue Single Molecule Sequencing (tSMS) de Helicos (por ejemplo, como se describe en Harris T.D. et al., Science 320:106-109 [2008]). En la técnica tSMS, una muestra de ADN se escinde en cadenas de aproximadamente 100 a 200 nucleótidos, y se añade una secuencia de poli A al extremo 3' de cada cadena de ADN. Cada cadena se marca mediante la adición de un nucleótido de adenosina fluorescentemente marcado. Entonces se hibridan las cadenas de ADN con una celda de flujo, que contiene millones de sitios de captura de oligo-T que se inmovilizan en la superficie de la celda de flujo. Los moldes pueden ser a una densidad de aproximadamente 100 millones de moldes/cm2. Entonces se carga la celda de flujo en un instrumento, por ejemplo, secuenciador HeliScope™, y un láser ilumina la superficie de la celda de flujo, revelando la posición de cada molde. Una cámara de CCD puede cartografiar la posición de los moldes en la superficie de la celda de flujo. Entonces se escinde la marca fluorescente del molde y se lava. La reacción de secuenciación empieza introduciendo una ADN polimerasa y un nucleótido fluorescentemente marcado. El ácido nucleico de oligo-T sirve de cebador. La polimerasa incorpora los nucleótidos marcados al cebador en un modo dirigido al molde. Se retiran la polimerasa y los nucleótidos no incorporados. Los moldes que tienen incorporación dirigida del nucleótido fluorescentemente marcado se diferencian por obtención de imágenes de la superficie de la celda de flujo. Después de la obtención de imágenes, una etapa de escisión retira la marca fluorescente, y el proceso se repite con otros nucleótidos fluorescentemente marcados hasta que se logra la longitud de lectura deseada. Se recoge la información de secuencia con cada etapa de adición de nucleótidos.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN que se usa en el método de la invención es la secuenciación 454 (Roche) (por ejemplo, como se describe en Margulies, M. et al., Nature 437:376-380 [2005]). La secuenciación 454 implica dos etapas. En la primera etapa, se corta el ADN en fragmentos de aproximadamente 300­ 800 pares de bases, y los fragmentos se hacen romos en los extremos. Entonces se ligan adaptadores de oligonucleótidos a los extremos de los fragmentos. Los adaptadores sirven de cebadores para la amplificación y la secuenciación de los fragmentos. Los fragmentos se pueden fijar a perlas de captura de ADN, por ejemplo, perlas recubiertas de estreptavidina, usando, por ejemplo, Adaptor B, que contiene una marca de 5'-biotina. Los fragmentos unidos a las perlas se amplifican por PCR dentro de gotitas de una emulsión de aceite-agua. El resultado es múltiples copias de fragmentos de ADN clonalmente amplificado en cada perla. En la segunda etapa, las perlas se capturan en pocillos (del tamaño de picolitros). La pirosecuenciación se realiza en cada fragmento de ADN en paralelo. La adición de uno o más nucleótidos genera una señal de luz que se registra por una cámara de CCD en un instrumento de secuenciación. La intensidad de la señal es proporcional al número de nucleótidos incorporados. La pirosecuenciación hace uso de pirofosfato (PPi) que se libera tras la adición de nucleótidos. La PPi se convierte en ATP por ATP sulfurilasa en presencia de adenosina 5'-fosfosulfato. La luciferasa usa ATP para convertir la luciferina en oxiluciferina, y esta reacción genera luz que se diferencia y se analiza.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN que se usa en el método de la invención es la tecnología SOLiD (Applied Biosystems). En la secuenciación por ligación SOLiD, se corta ADN genómico en fragmentos, y se fijan adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos para generar una biblioteca de fragmentos. Alternativamente, se pueden introducir adaptadores internos ligando adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos, circularizando los fragmentos, que digieren el fragmento circularizado para generar un adaptador interno, y uniendo los adaptadores a los extremos 5' y 3' de los fragmentos resultantes para generar una biblioteca de extremos emparejados. A continuación, se preparan poblaciones de perlas clonales en microrreactores que contienen perlas, cebadores, molde y componentes de PCR. Tras la PCR, los moldes se desnaturalizan y las perlas se enriquecen para separar las perlas con moldes ampliados. Los moldes en las perlas seleccionadas se someten a una modificación de 3' que permite la unión a un portaobjetos de vidrio. La secuencia se puede determinar por hibridación secuencial y ligación de oligonucleótidos parcialmente aleatorios con una base central determinada (o par de bases) que se identifica por un fluoróforo específico. Después de registrar un color, el oligonucleótido ligado se escinde y se retira y entonces se repite el proceso.
En una realización, la secuenciación de tecnología de ADN que se usa en el método de la invención es la tecnología de secuenciación en tiempo real de una molécula individual (SMRT™) de Pacific Biosciences. En la secuenciación SMRT, se obtienen imágenes de la incorporación continua de nucleótidos marcados con colorante durante la síntesis de ADN. Se fijan las moléculas individuales de ADN polimerasa a la superficie inferior de identificadores de longitud de onda de modo cero (identificadores ZMW) individuales que obtienen información de secuencia mientras que los nucleótidos unidos en fosfo se incorporan en la cadena de cebador que crece. Un ZMW es una estructura de confinamiento que permite la observación de la incorporación de un único nucleótido por ADN polimerasa contra el fondo de nucleótidos fluorescentes que difunden rápidamente dentro y fuera del ZMW (en microsegundos). Se necesitan varios milisegundos para incorporar un nucleótido en una cadena en crecimiento. Durante este tiempo, la marca fluorescente se excita y produce una señal fluorescente, y la marca fluorescente se escinde. La identificación de la fluorescencia correspondiente del colorante indica qué base se incorporó. Se repite el proceso.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN que se usa en el método de la invención es la secuenciación Nanopore (por ejemplo, como se describe en Soni GV y Meller A. Clin Chem 53: 1996-2001 [2007]). Varias empresas están desarrollando industrialmente técnicas de análisis de ADN de secuenciación Nanopore, que incluyen Nanopore Technologies de Oxford (Oxford, Reino Unido). La secuenciación Nanopore es una tecnología de secuenciación de moléculas individuales por la cual una única molécula de ADN se secuencia directamente a medida que pasa a través de un nanoporo. Un nanoporo es un orificio pequeño, del orden de 1 nanómetro de diámetro. La inmersión de un nanoporo en un líquido conductor y la aplicación de un potencial (tensión) a través de él da como resultado una ligera corriente eléctrica debido a la conducción de iones a través del nanoporo. La cantidad de corriente que circula es sensible al tamaño y la forma del nanoporo. A medida que una molécula de ADN pasa a través de un nanoporo, cada nucleótido en la molécula de ADN obstruye el nanoporo a un grado diferente, cambiando la magnitud de la corriente a través del nanoporo en diferentes grados. Así, este cambio en la corriente a medida que la molécula de ADN pasa a través del nanoporo representa una lectura de la secuencia de ADN.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN que se usa en el método de la invención es la matriz de transistores de efecto campo sensibles a agentes químicos (chemFET) (por ejemplo, como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 20090026082). En un ejemplo de la técnica, se pueden colocar moléculas de ADN en cámaras de reacción, y las moléculas de molde se pueden hibridar con un cebador de secuenciación unido a una polimerasa. La incorporación de uno o más trifosfatos en una nueva hebra de ácido nucleico en el extremo 3' del cebador de secuenciación se puede distinguir por un cambio en la corriente por un chemFET. Una matriz puede tener múltiples sensores de chemFET. En otro ejemplo, los ácidos nucleicos individuales se pueden fijar a perlas, y los ácidos nucleicos se pueden amplificar en la perla, y las perlas individuales se pueden transferir a cámaras de reacción individuales en una matriz de chemFET, teniendo cada cámara un sensor chemFET, y se pueden secuenciar los ácidos nucleicos.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN que se usa en el método de la invención es el método de Halcyon Molecular que usa microscopía electrónica de transmisión (TEM). El método, denominado Molecule Placement Rapid Nano Transfer (IMPRNT), comprende utilizar obtención de imágenes de microscopio electrónico de transmisión de resolución de átomos individuales de ADN de alto peso molecular (150 kb o superior) selectivamente marcado con marcadores de átomos pesados y disponer estas moléculas sobre películas ultrafinas en matrices paralelas ultradensas (3 nm de cadena a cadena) con separación constante entre bases. El microscopio electrónico se usa para obtener imágenes de las moléculas sobre las películas para determinar la posición de los marcadores de átomos pesados y para extraer información de secuencias de bases del ADN. El método se describe además en la publicación de patente PCT WO 2009/046445. El método permite la secuenciación de genomas humanos completos en menos de diez minutos.
En una realización, la tecnología de secuenciación de ADN es la secuenciación de moléculas individuales Ion Torrent, que junta la tecnología de semiconductores con una química de secuenciación simple para traducir directamente la información químicamente codificada (A, C, G, T) en información digital (0, 1) en un chip semiconductor. En la naturaleza, cuando un nucleótido se incorpora en una cadena de ADN por una polimerasa, se libera un ion hidrógeno como subproducto. Ion Torrent usa una matriz de alta densidad de pocillos micromecanizados para realizar este proceso bioquímico en un modo masivo en paralelo. Cada pocillo contiene una molécula de ADN diferente. Debajo de los pocillos está una capa sensible a los iones y debajo de ella un sensor de iones. Cuando un nucleótido, por ejemplo, una C, se añade a un molde de ADN y entonces se incorpora en una cadena de ADN, se liberará un ion hidrógeno. La carga de ese ion cambiará el pH de la disolución, que se puede identificar por el sensor iónico de Ion Torrent. El secuenciador - esencialmente el pH-metro en estado sólido más pequeño del mundo - identifica una base, que pasa directamente de información química a información digital. El secuenciador Ion personal Genome Machine (PGM™) inunda entonces secuencialmente el chip con un nucleótido después de otro. Si el siguiente nucleótido que inunda el chip no es un emparejamiento, no se registrará cambio de tensión y no se identificará la base. Si existen dos bases idénticas en la cadena de ADN, la tensión será el doble, y el chip registrará dos bases idénticas identificadas. La identificación directa permite el registro de la incorporación de nucleótidos en segundos.
Otros métodos de secuenciación incluyen PCR digital y secuenciación por hibridación. Se pueden usar la reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR digital o dPCR) para identificar y cuantificar directamente ácidos nucleicos en una muestra. La PCR digital se puede realizar en una emulsión. Los ácidos nucleicos individuales se separan, por ejemplo, en un dispositivo de cámara microfluídica, y cada ácido nucleico se puede amplificar individualmente por PCR. Los ácidos nucleicos se pueden separar tal que exista un promedio de aproximadamente 0,5 ácidos nucleicos/pocillo, o no más de un ácido nucleico/pocillo. Se pueden usar diferentes sondas para distinguir alelos fetales y alelos maternos. Se pueden enumerar los alelos para determinar el número de copias. En la secuenciación por hibridación, la hibridación comprende poner en contacto la pluralidad de secuencias de polinucleótidos con una pluralidad de sondas de polinucleótidos, en donde cada una de la pluralidad de sondas de polinucleótidos se puede unir opcionalmente a un sustrato. El sustrato podría ser la superficie plana que comprende una matriz de secuencias de nucleótidos conocidas. El patrón de hibridación con la matriz se puede usar para determinar las secuencias de polinucleótidos presentes en la muestra. En otras realizaciones, cada sonda se une a una perla, por ejemplo, una perla magnética o similares. Se puede identificar la hibridación con las perlas y usar para identificar la pluralidad de secuencias de polinucleótidos dentro de la muestra.
En una realización, el método emplea secuenciación masiva en paralelo de millones de fragmentos de ADN usando secuenciación por síntesis en Illumina y química de secuenciación reversible basada en terminadores (por ejemplo, como se describe en Bentley et al., Nature 6:53-59 [2009]). El molde de ADN puede ser ADN genómico, por ejemplo, ADNsc. En algunas realizaciones, el ADN genómico de las células aisladas se usa como molde, y se fragmenta en longitudes de varios cientos de pares de bases. En otras realizaciones, el ADNsc se usa como molde, y no se requiere la fragmentación ya que el ADNsc existe como fragmentos cortos. Por ejemplo, el ADNsc fetal circula en la circulación sanguínea como fragmentos de <300 pb, y se ha estimado que el ADNsc materno circula como fragmentos de entre aproximadamente 0,5 y 1 Kb (Li et al., Clin Chem, 50: 1002-1011 [2004]). La tecnología de secuenciación de Illumina se basa en la fijación de ADN genómico fragmentado a una superficie plana ópticamente transparente sobre la que están unidos anclajes de oligonucleótidos. El molde de ADN se repara en los extremos para generar extremos romos fosforilados en 5', y se usa la actividad de polimerasa del fragmento de Klenow para añadir una única base A al extremo 3' de los fragmentos de ADN fosforilados romos. Esta adición prepara los fragmentos de ADN para la ligación con adaptadores de oligonucleótidos, que tienen un nucleótido protuberante de una única base de T en su extremo 3' para aumentar la eficiencia de ligación. Los oligonucleótidos del adaptador son complementarios a los anclajes de la celda de flujo. En condiciones de dilución limitante, se añade molde de ADN monocatenario modificado por adaptador a la celda de flujo y se inmoviliza por hibridación a los anclajes. Se extienden los fragmentos de ADN unidos y se amplifican por puente para crear una celda de flujo de secuenciación de densidad ultra-alta con cientos de millones de clústeres, conteniendo cada uno ~ 1.000 copias del mismo molde. Las moléculas de ADN amplificado en clústeres se secuencian usando una robusta tecnología de secuenciación por síntesis de ADN de cuatro colores que emplea terminadores reversibles con colorantes fluorescentes extraíbles. La identificación de fluorescencia de alta sensibilidad se logra usando excitación láser y óptica de reflexión interna total. Las lecturas de secuencia corta de aproximadamente 2040 pb, por ejemplo 36 pb, se alinean contra un genoma de referencia de repeticiones enmascaradas y las diferencias genéticas se identifican usando un software de canalización de análisis de datos especialmente desarrollado. Después de finalizar la primera lectura, los moldes se pueden regenerar in situ para permitir una segunda lectura desde el extremo opuesto de los fragmentos. Así, según el método se usa o la secuenciación de extremo único o de extremos emparejados de los fragmentos de ADN. Se realiza la secuenciación parcial de fragmentos de ADN presentes en la muestra, y se cuentan marcas de secuencia que comprenden lecturas de longitud predeterminada, por ejemplo 36 pb, que se cartografían con un genoma de referencia conocido.
La longitud de la lectura de secuencia se asocia con la tecnología de secuenciación particular. Los métodos de NGS proporcionan lecturas de secuencia que varían en tamaño de decenas a cientos de pares de bases. En algunas realizaciones del método descrito en el presente documento, las lecturas de secuencia tienen aproximadamente 20 pb, aproximadamente 25 pb, aproximadamente 30 pb, aproximadamente 35 pb, aproximadamente 40 pb, aproximadamente 45 pb, aproximadamente 50 pb, aproximadamente 55 pb, aproximadamente 60 pb, aproximadamente 65 pb, aproximadamente 70 pb, aproximadamente 75 pb, aproximadamente 80 pb, aproximadamente 85 pb, aproximadamente 90 pb, aproximadamente 95 pb, aproximadamente 100 pb, aproximadamente 110 pb, aproximadamente 120 pb, aproximadamente 130, aproximadamente 140 pb, aproximadamente 150 pb, aproximadamente 200 pb, aproximadamente 250 pb, aproximadamente 300 pb, aproximadamente 350 pb, aproximadamente 400 pb, aproximadamente 450 pb, aproximadamente 500 pb, aproximadamente 550 pb o aproximadamente 600 pb. Se espera que los avances tecnológicos permitan las lecturas de un único extremo de más de 500 pb que permite lecturas superiores a aproximadamente 1000 pb cuando se generan lecturas de extremos emparejados. En una realización, las lecturas de secuencias tienen 36 pb. Otros métodos de secuenciación que se pueden emplear por el método de la invención incluyen los métodos de secuenciación de moléculas individuales que pueden secuenciar moléculas de ácidos nucleicos >5000 pb. La cantidad masiva de la salida de secuencia se transfiere por una canalización del análisis que transforma la salida de obtención de imágenes primaria del secuenciador en lazos de bases. Un paquete de algoritmos integrados realiza las etapas de transformación de datos principales centrales: análisis de imágenes, puntuación de intensidad, identificación de bases y alineamiento.
En una realización, se realiza la secuenciación de ácidos nucleicos polimórficos diana amplificados, y se cuentan marcas de secuencia que comprenden lecturas de longitud predeterminada, por ejemplo 36 pb, que se cartografían con un genoma de referencia conocido. Solo las lecturas de secuencia que se alinean de forma única con un genoma de referencia se cuentan como marcas de secuencia. En una realización, el genoma de referencia es un genoma de secuencias diana artificial que comprende las secuencias de los ácidos nucleicos diana polimórficos, por ejemplo, SNP. En una realización, el genoma de referencia es un genoma de referencia de SNP artificial. En otra realización, el genoma de referencia es un genoma de referencia de STR artificial. En otra realización más, el genoma de referencia es un genoma de referencia de STR en tándem artificial. Los genomas de referencia artificiales se pueden compilar usando las secuencias de los ácidos nucleicos polimórficos diana. Los genomas de referencia artificiales pueden comprender una secuencia diana polimórfica que comprende cada una uno o más tipos diferentes de secuencias polimórficas. Por ejemplo, un genoma de referencia artificial puede comprender secuencias polimórficas que comprenden alelos de SNP y/o STR. En una realización, el genoma de referencia es la secuencia NCBI36/hg18 del genoma de referencia humano, que está disponible en la malla multimedia mundial en genome.ucsc.edu/cgibin/hgGateway?org=Human&db=hg18&hgsid=166260105). Otras fuentes de información de secuencia pública incluyen GenBank, dbEST, dbSTS, EMBL (European Molecular Biology Laboratory) y DDBJ (DNA Databank of Japan). En otra realización, el genoma de referencia comprende la secuencia NCBI36/hg18 del genoma de referencia humano y un genoma de secuencias diana artificial, que incluye las secuencias polimórficas diana, por ejemplo, un genoma de SNP. La cartografía de las marcas de secuencia se logra comparando la secuencia de la marca cartografiada con la secuencia del genoma de referencia para determinar el origen cromosómico de la molécula de ácido nucleico secuenciada (por ejemplo, ADNsc), y no se necesita información de secuencia genética específica. Están disponibles varios algoritmos informáticos para alinear secuencias, que incluyen, sin limitación, BLAST (Altschul et al., 1990), BLITZ (MPsrch) (Sturrock & Collins, 1993), FASTA (Person & Lipman, 1988), BOWTIE (Langmead et al., Genome Biology 10:R25.1-R25.10 [2009]) o ELAND (Illumina, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). En una realización, se secuencia un extremo de las copias clonalmente expandidas de las moléculas de ADNsc plasmático y se procesa por análisis de alineamiento bioinformático para el Genome Analyzer de Illumina, que usa el software Efficient Large-Scale Alignment of Nucleotide Databases (ELAND). En realizaciones del método que comprenden determinar la presencia o ausencia de una aneuploidía y fracción fetal usando métodos de secuenciación de NGS, el análisis de la información de secuenciación para la determinación de aneuploidía puede permitir un pequeño grado de desapareamiento (0-2 desapareamientos por marca de secuencia) para explicar polimorfismos menores que pueden existir entre el genoma de referencia y los genomas en la muestra mixta. El análisis de información de secuenciación para la determinación de la fracción fetal puede permitir un grado pequeño de desapareamiento dependiendo de la secuencia polimórfica. Por ejemplo, se puede permitir un grado pequeño de desapareamiento si la secuencia polimórfica es STR. En casos cuando la secuencia polimórfica es un SNP, se cuenta primero toda la secuencia que se aparea exactamente con cualquiera de los dos alelos en el sitio de SNP y se filtra de las lecturas restantes, para lo que se puede permitir un pequeño grado de desapareamiento. La cuantificación del número de lecturas de secuencia que se alinean con cada cromosoma para determinar las aneuploidías cromosómicas se puede determinar como se describe en el presente documento, o usando análisis alternativos que emplean la normalización de la mediana del número de marcas de secuencia para un cromosoma de interés con la mediana del número de marcas para cada uno de los otros autosomas (Fan et al., Proc Natl Acad Sci 105:16266-16271 [2008]), o que comparan el número de lecturas únicas que se alinean con cada cromosoma con el número total de lecturas que se alinean con todos los cromosomas para obtener un porcentaje de representación genómica para cada cromosoma. Se genera una "puntuación z" para representar la diferencia entre la representación genómica del porcentaje del cromosoma de interés y la representación del porcentaje medio para el mismo cromosoma entre un grupo de control euploide, dividido entre la desviación estándar (Chiu et al., Clin Chem 56:459-463 [2010]). En otra realización, la información de secuenciación se puede determinar como se describe en la solicitud de patente provisional de EE. UU. titulada "Normalizing Biological Assays", expediente N° 32047-768,101, presentada el 19 de enero de 2010.
El análisis de la información de secuenciación para la determinación de la fracción fetal puede permitir un pequeño grado de desapareamiento dependiendo de la secuencia polimórfica. Por ejemplo, se puede permitir un pequeño grado de desapareamiento si la secuencia polimórfica es una STR. En casos cuando la secuencia polimórfica sea un SNP, se cuentan primero todas las secuencias que se aparean exactamente con cualquiera de los dos alelos en el sitio de SNP y se filtran de las lecturas restantes, para las que se puede permitir un pequeño grado de desapareamiento. Se puede usar el método presente para determinar la fracción fetal por secuenciación de ácidos nucleicos en combinación con otros métodos.
En la etapa 160, se determina la fracción fetal basándose en el número total de marcas que se cartografían con el primer alelo y el número total de marcas que se cartografían con el segundo alelo en un sitio polimórfico informativo, por ejemplo, un SNP, contenido en un genoma de referencia. Por ejemplo, el genoma de referencia es un genoma de secuencia diana artificial que engloba las secuencias polimórficas que comprenden los SNP rs560681, rs1109037, rs9866013, rs13182883, rs13218440, rs7041158, rs740598, rs10773760, rs4530059, rs7205345, rs8078417, rs576261, rs2567608, rs430046, rs9951171, rs338882, rs10776839, rs9905977, rs1277284, rs258684, rs1347696, rs508485, rs9788670, rs8137254, rs3143, rs2182957, rs3739005 y rs530022. En una realización, el genoma de referencia artificial incluye las secuencias polimórficas diana de SEQ ID NO: 1 -56 (véase el Ejemplo 3).
En otra realización, el genoma artificial es un genoma de secuencia diana artificial que engloba secuencias polimórficas que comprenden los SNP en tándem rs7277033-rs2110153; rs2822654-rs1882882; rs368657-rs376635; rs2822731-rs2822732; rs1475881-rs7275487; rs1735976-rs2827016; rs447340-rs2824097; rs418989-rs13047336; rs987980-rs987981; rs4143392- rs4143391; rs1691324- rs13050434; rs11909758-rs9980111; rs2826842-rs232414; rs1980969-rs1980970; rs9978999-rs9979175; rs1034346-rs12481852; rs7509629-rs2828358; rs4817013-rs7277036; rs9981121 -rs2829696; rs455921-rs2898102; rs2898102- rs458848; rs961301-rs2830208; rs2174536-rs458076; rs11088023-rs11088024; rs1011734-rs1011733; rs2831244-rs9789838; rs8132769-rs2831440; rs8134080-rs2831524; rs4817219-rs4817220; rs2250911-rs2250997; rs2831899-rs2831900; rs2831902-rs2831903; rs11088086-rs2251447; rs2832040-rs11088088; rs2832141-rs2246777; rs2832959 -rs9980934; rs2833734-rs2833735; rs933121-rs933122; rs2834140-rs12626953; rs2834485-rs3453; rs9974986-rs2834703; rs2776266-rs2835001; rs1984014-rs1984015; rs7281674-rs2835316; rs13047304-rs13047322; rs2835545-rs4816551; rs2835735-rs2835736; rs13047608-rs2835826; rs2836550-rs2212596; rs2836660-rs2836661; rs465612-rs8131220; rs9980072-rs8130031; rs418359-rs2836926; rs7278447-rs7278858; rs385787-rs367001; rs367001-rs386095; rs2837296-rs2837297; y rs2837381-rs4816672.
En otro caso de la divulgación, el genoma diana artificial engloba secuencias polimórficas que comprenden STR seleccionadas de CSF1PO, FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358,D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, PentaD, PentaE, D2S1338, D1S1677, D2S441, D4S2364, D10S1248, D14S1434, D22S1045, D22S1045, D20S1082, D20S482, D18S853, D17S1301, D17S974, D14S1434, D12ATA63, D11S4463, D10S1435, D10S1248, D9S2157, D9S1122, D8S1115, D6S1017, D6S474, D5S2500, D5S2500, D4S2408, D4S2364, D3S4529, D3S3053, D2S1776, D2S441, D1S1677, D1S1627 y DIGATA113. La composición del genoma de secuencias diana artificiales variará dependiendo de las secuencias polimórficas que se usen para determinar la fracción fetal. Por consiguiente, un genoma de secuencias diana artificiales no se limita al SNP, SNP en tándem o secuencias de STR ejemplificadas en el presente documento.
El sitio polimórfico informativo, por ejemplo, SNP, se identifica por la diferencia en las secuencias alélicas y la cantidad de cada uno de los posibles alelos. El ADNsc fetal está presente a una concentración que es <10 % del ADNsc materno. Así, la presencia de una contribución secundaria de un alelo a la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos con respecto a la principal contribución del alelo materno se puede asignar al feto. Los alelos que derivan del genoma materno se denominan en el presente documento alelos principales, y los alelos que derivan del genoma fetal se denominan en el presente documento alelos secundarios. Los alelos que se representan por niveles similares de marcas de secuencia cartografiadas representan alelos maternos. Los resultados de una amplificación múltiplex a modo de ejemplo de ácidos nucleicos diana que comprenden SNP y derivados de una muestra de plasma materno se muestran en la Figura 2. Los SNP informativos se diferencian del cambio de un solo nucleótido en un sitio polimórfico, y los alelos fetales se diferencian por su contribución secundaria relativa a la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos en la muestra cuando se comparan con la contribución principal a la mezcla por los ácidos nucleicos maternos. Por consiguiente, la abundancia relativa de ADNsc fetal en la muestra materna se determina como un parámetro del número total de marcas de secuencia únicas cartografiadas con la secuencia de ácidos nucleicos diana en un genoma de referencia para cada uno de los dos alelos del sitio polimórfico predeterminado. En una realización, la fracción de ácidos nucleicos fetales en la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos se calcula para cada uno del alelo informativo (alelox) del siguiente modo:
% de alelox de la fracción fetal = ((SMarcas de secuencia fetal para el alelox) / (SMarcas de secuencia materna para el alelox)) x 100
y la fracción fetal para la muestra se calcula como el promedio de la fracción fetal de todos los alelos informativos. Opcionalmente, la fracción de ácidos nucleicos fetales en la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos se calcula para cada uno del alelo informativo (alelox) del siguiente modo:
% de alelox de la fracción fetal = ((2 X SMarcas de secuencia fetal para el alelox) / (SMarcas de secuencia materna para el alelox)) x 100,
para compensar la presencia de 2 alelos fetales, estando uno enmascarado por el fondo materno.
El porcentaje de fracción fetal se calcula para al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más alelos informativos. En una realización, la fracción fetal es la fracción fetal promedio determinada para al menos 3 alelos informativos.
La Figura 3 muestra un diagrama de flujo de métodos alternativos por los que se puede determinar la fracción fetal a partir de ácidos nucleicos diana amplificados que se han combinado con muestra de ADNsc fetal y materno sin amplificar para permitir la determinación simultánea de fracción fetal y la presencia o ausencia de aneuploidía fetal enriqueciendo la muestra materna que comprende ácidos nucleicos fetales y maternos para ácidos nucleicos diana polimórficos. En una realización, la muestra que se enriquece es la fracción de plasma de una muestra de sangre (a). Por ejemplo, se usa una porción de una muestra de plasma materna original para amplificar secuencias de ácidos nucleicos diana. Posteriormente, algo del producto amplificado o todo se combina con la muestra de plasma original sin amplificar restante, enriqueciéndose así (véase el Ejemplo 7). En otra realización, la muestra que se enriquece es la muestra de ADNsc purificado que se extrae de plasma (b). Por ejemplo, el enriquecimiento comprende amplificar los ácidos nucleicos diana que están contenidos en una porción de una muestra original de mezcla purificada de ácidos nucleicos fetales y maternos, por ejemplo, ADNsc que se ha purificado de una muestra materna de plasma, y posteriormente combinar algo del producto amplificado o todo con la muestra purificada original sin amplificar restante (véase el Ejemplo 6). En otra realización más, la muestra que se enriquece es una muestra de bibliotecas de secuenciación preparada a partir de una mezcla purificada de ácidos nucleicos fetales y maternos (c). Por ejemplo, el enriquecimiento comprende amplificar los ácidos nucleicos diana que están contenidos en una porción de una muestra original de mezcla purificada de ácidos nucleicos fetales y maternos, por ejemplo ADNsc que se ha purificado de una muestra materna de plasma, preparar una primera biblioteca de secuenciación de secuencias de ácidos nucleicos sin amplificar, preparar una segunda biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos diana polimórficos amplificados y posteriormente combinar algo de la segunda biblioteca de secuenciación o toda con algo de la primera biblioteca de secuenciación o toda (véase el Ejemplo 5). La cantidad de producto amplificado que se usa para enriquecer la muestra original se selecciona para obtener información de secuenciación suficiente para determinar tanto la presencia como la ausencia de aneuploidía y la fracción fetal de la misma serie de secuenciación. Se cartografían al menos aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 7 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 % o más del número total de marcas de secuencia obtenidas de la secuenciación para determinar la fracción fetal. La secuenciación de la biblioteca generada siguiendo uno cualquiera de los métodos representados en la Figura 3 proporciona marcas de secuencia derivadas de los ácidos nucleicos diana amplificados y marcas derivadas de la muestra materna sin amplificar original. La fracción fetal se calcula a partir del número de marcas cartografiadas con un genoma de referencia artificial, y la presencia o ausencia de aneuploidía se determina a partir del número de marcas que se cartografían con el genoma del sujeto, por ejemplo, el genoma humano.
Un método alternativo de determinación de la fracción fetal de ácidos nucleicos diana polimórficos amplificados en la etapa 130 de la Figura 1 usa separación por tamaño de ácidos nucleicos diana polimórficos amplificados que comprenden STR (etapa 150 de la Figura 1). Como se ha descrito anteriormente, el carácter polimórfico de un locus de STR se debe a la variación en el número de unidades repetidas en tándem entre alelos. Debido al alto polimorfismo de STR, la mayoría de los individuos serán heterocigóticos para STR. La amplificación de una STR dará como resultado uno o dos productos de PCR en la mayoría de las muestras. En muestras obtenidas de mujeres embarazadas, por ejemplo, muestras de plasma, la amplificación de una STR dará como resultado uno o dos productos de PCR principales, que corresponden a uno o dos alelos maternos que incluyen un alelo fetal heredado de la madre y un tercer alelo fetal heredado del padre que se detecta en una STR informativa.
La amplificación se dirige a STR que son miniSTR como se describe en el presente documento que tienen menos de aproximadamente 300 pares de bases y que se amplifican en una reacción de PCR múltiplex, que permite la amplificación simultánea de múltiples loci en una única reacción. Los cebadores se marcan con diferentes colorantes fluorescentes que emiten cada uno fluorescencia a una longitud de onda diferente, por ejemplo, 6FAM™, VIC™, NED™ y PET™, y el número de unidades repetidas para cada STR marcada fluorescentemente en los productos de PCR resultantes se detecta tras su separación y tamaño preciso que se logra por electroforesis en bloque o capilar. En un caso, se usa electroforesis capilar, y se puede realizar en canales microfabricados o matrices capilares.
Alternativamente, se usan métodos que utilizan espectrometría de masas y tecnología de micromatrices. Se puede realizar análisis de STR múltiplex para determinar la fracción fetal usando kits comercialmente disponibles, por ejemplo, el kit de amplificación por PCR AmpFISTR® Identifiler® (Figura 4) y el kit de amplificación por PCR AmpFISTR® MiniFiler® (Figura 5) (Applied Biosystems, Foster City, Calif.). El kit de amplificación por PCR AmpFISTR® MiniFiler® se diseñó para amplificar como miniSTR ocho de los mayores loci dimensionados en el kit de amplificación por PCR AmpFISTR® Identifiler®. Junto con el locus de identificación de sexo amelogenina, el múltiplex de nueve locus permite la amplificación simultánea de loci de muestras de ADNsc (véase el Ejemplo 10).
En un caso de la divulgación, el análisis de STR múltiplex para determinar la fracción fetal se realiza amplificando ácidos nucleicos diana polimórficos presentes en una muestra materna de plasma que comprende cada una una miniSTR seleccionada de CSF1PO, FGA, TH01, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D2S1338, Penta D, Penta E, D22S1045, D20S1082, D20S482, D18S853, D17S1301, D17S974, D14S1434, D12ATA63, D11S4463, D10S1435, D10S1248, D9S2157, D9S1122, D8S1115, D6S1017, D6S474, D5S2500, D4S2408, D4S2364, D3S4529, D3S3053, D2S1776, D2S441, D1S1677, D1S1627 y D1GATA113. En otro caso de la divulgación, el análisis de STR múltiplex para determinar la fracción fetal se realiza amplificando ácidos nucleicos diana polimórficos presentes en una muestra materna de plasma para el panel de miniSTR: CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D7S820 y FGA. Las miniSTR se pueden localizar en el mismo cromosoma o en diferentes. El método es un método independiente del sexo fetal. Por lo tanto, en algunos casos de la divulgación, las miniSTR se localizan en cromosomas distintos del cromosoma Y. En otros casos de la divulgación, las miniSTR se localizan en cromosomas distintos de los cromosomas 13, 18, 21 o X, es decir, cromosomas que podrían causar una aneuploidía.
Las muestras de plasma materno contienen frecuentemente menos de 100 pg de ADNsc. Las muestras de ADN de bajo número de copias pueden caer por debajo de las limitaciones de sensibilidad de los métodos de análisis de STR. Las muestras no tratables se pueden hacer susceptibles aumentando el número de ADNsc de partida disponible para el posterior análisis de STR por una estrategia de amplificación del genoma completo. En una realización, la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos se puede preamplificar antes de que se detecten o cuantifiquen los alelos. Por ejemplo, el ADN sin células de molde se puede amplificar por PCR. El ácido nucleico se puede amplificar durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 ciclos. El ácido nucleico se puede amplificar durante aproximadamente 1­ 10 ciclos, aproximadamente 1-20 ciclos, aproximadamente 1-30 ciclos, aproximadamente 1-40 ciclos, aproximadamente 5-15 ciclos, aproximadamente 5-20 ciclos, aproximadamente 5-30 ciclos, aproximadamente 5-40 ciclos, aproximadamente 10-15 ciclos, aproximadamente 10-20 ciclos, aproximadamente 10-30 ciclos, aproximadamente 10-40 ciclos, aproximadamente 20-30 ciclos, aproximadamente 20-40 ciclos o aproximadamente 30-40 ciclos. La cantidad de ácido nucleico de molde que se puede amplificar puede ser aproximadamente 10-1000 pg, 25-1000 pg, 50-1000 pg, 100-1000, pg, 200-1000 pg, 300-1000 pg, 400-1000 pg, 500-1000 pg, 600-1000 pg, 700­ 1000 pg o 800-1000 pg. Después de la preamplificación, los ácidos nucleicos se pueden diluir antes de detectar o cuantificar los alelos. Se puede usar preamplificación para aumentar la sensibilidad de detección de los alelos en una muestra, por ejemplo, una muestra materna (Ejemplo 11). En otra realización, el genotipado de un polimorfismo no necesita requerir una etapa de pre-amplificación. Se puede usar cualquier método de amplificación basado en PCR para preamplificar el ADNsc. Los métodos de amplificación incluyen, pero no se limitan a, estrategias de amplificación de genoma completo que incluyen métodos tales como preamplificación por extensión de cebadores, PCR cebada con oligonucleótidos degenerados (DOP-PCR), bajos fragmentos de bajas cantidades de DOP-PCR, PCR de preamplificación por extensión con cebadores mejorados (IPEP PCR) y preamplificación por extensión con cebadores mejorados modificados (mlPEP). Así, en una realización, el método que se usa para determinar la fracción fetal en una muestra materna, por ejemplo una muestra de plasma, comprende preamplificar la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos presentes en la muestra de ADNsc plasmática usando un método de amplificación de genoma completo, amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos en dicha mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos, en donde cada uno de dicho al menos un ácido nucleico polimórfico comprende una STR; determinar la cantidad de alelos de STR fetales y maternos de al menos un ácido nucleico polimórfico; y calcular la fracción fetal de la cantidad de alelos de STR fetales y maternos. Tras la preamplificación, se realiza análisis de STR múltiple para determinar la fracción fetal amplificando los ácidos nucleicos diana polimórficos presentes en una muestra materna de plasma que comprende cada una una miniSTR seleccionada de CSF1PO, FGA, TH01, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D2S1338, Penta D, Penta E, D22S1045, D20S1082, D20S482, D18S853, D17S1301, D17S974, D14S1434, D12ATA63, D11S4463, D10S1435, D10S1248, D9S2157, D9S1122, D8S1115, D6S1017, D6S474, D5S2500, D4S2408, D4S2364, D3S4529, D3S3053, D2S1776, D2S441, D1S1677, D1S1627 y D1GATA113. Alternativamente, el análisis de STR múltiplex para determinar la fracción fetal se realiza amplificando ácidos nucleicos diana polimórficos para el panel de miniSTR: CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D7S820 y FGA.
Aplicaciones
Los métodos descritos en el presente documento son aplicables al diagnóstico o pronóstico de diversas patologías que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, trastornos genéticos e infección. Se puede usar la fracción fetal de ácido nucleico en una muestra materna para determinar una anomalía cromosómica. Los ejemplos de anomalías cromosómicas incluyen, por ejemplo, aneuploidía, monosomía, trisomía, duplicación, inversión, deleción, poliploidía, deleción de una parte de un cromosoma, adición, adición de una parte de cromosoma, inserción, un fragmento de un cromosoma, una región de un cromosoma, transposición cromosómica y translocación. Por ejemplo, aneuploidía puede referirse a la aparición de uno o más cromosomas adicionales o ausentes en una muestra.
Los ejemplos de afecciones fetales que se pueden determinar usando los métodos de la invención proporcionada incluyen, por ejemplo, síndrome de Angleman (15q11.2-q13), síndrome del maullido (5p-), síndrome de DiGeorge y síndrome velocardiofacial (22q11.2), síndrome de Miller-Dieker (17 p13.3), síndrome de Prader-Willi (15q11.2-q13), retinoblastoma (13q14), síndrome de Smith-Magenis (17 p11,2), trisomía 13, trisomía 16, trisomía 18, trisomía 21 (síndrome de Down), triploidía, síndrome de Williams (7q 11.23) y síndrome de Wolf-Hirschhom (4p-). Los ejemplos de anomalías de cromosomas sexuales que se pueden detectar por los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, síndrome de Kallman (Xp22.3), deficiencia de sulfato esteroide (STS) (Xp22.3), ictiosis ligada al X (Xp22.3), síndrome de Klinefelter (XXY), síndrome X frágil, síndrome de Turner, metahembras o trisomía X, y monosomía X.
En una realización, la información de la fracción fetal se puede usar para establecer umbrales y estimar el tamaño de muestra mínimo en la detección de aneuploidía. Dicho uso se describe en el Ejemplo 7 más adelante. La información de la fracción fetal se puede usar junto con la información de secuenciación. Por ejemplo, se pueden usar ácidos nucleicos de una muestra sin células, por ejemplo, una muestra de plasma o suero materno, para enumerar las secuencias en una muestra. Las secuencias se pueden enumerar usando cualquiera de las técnicas de secuenciación descritas anteriormente. El conocimiento de la fracción fetal se puede usar para establecer umbrales de "corte" para identificar estados de "aneuploidía", "normales" o "marginales/no identificados" (inciertos). Entonces, se pueden realizar cálculos para estimar el número mínimo de secuencias requeridas para lograr una sensibilidad adecuada (es decir, probabilidad de identificar correctamente un estado de aneuploidía).
La determinación de la fracción fetal según el método de la invención se puede poner en práctica en combinación con cualquier método usado para determinar la presencia o ausencia de aneuploidía fetal en una muestra materna de plasma. Además del método descrito en el presente documento para la determinación de aneuploidía, se puede usar la determinación de la fracción fetal en la secuenciación masiva en paralelo junto con otros métodos de determinación de la aneuploidía fetal, por ejemplo, según los métodos descritos en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N2 US 2007/0202525A1; US2010/0112575A1, US 2009/0087847A1; US2009/0029377A1; US 2008/0220422A1; US2008/0138809A1, US2008/0153090A1 y la patente de EE. UU. 7.645.576. Los métodos también se pueden combinar con ensayos para determinar otras afecciones prenatales asociadas a la madre y/o al feto. Por ejemplo, el método se puede usar junto con análisis prenatales, por ejemplo, como se describen en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N2 US2010/0112590A1, US2009/0162842A1, US2007/0207466A1 y US2001/0051341A1.
Los métodos descritos se pueden aplicar a determinar la fracción de una población cualquiera de ácidos nucleicos en una mezcla de ácidos nucleicos contribuida por diferentes genomas. Además de determinar la fracción contribuida a una muestra por dos individuos, por ejemplo, los diferentes genomas son contribuidos por el feto y la madre que lleva el feto, los métodos se pueden usar para determinar la fracción de un genoma en una mezcla derivada de dos células diferentes de un individuo, por ejemplo, los genomas son contribuidos a la muestra por células cancerosas aneuploides y células euploides normales del mismo sujeto.
Composiciones y kits
La presente divulgación también se refiere a composiciones y kits o sistemas de reactivo útiles para poner en práctica los métodos descritos en el presente documento.
Las composiciones desveladas en el presente documento se pueden incluir en kits para mezclas de secuenciación masiva en paralelo de moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternos, por ejemplo, ADNsc, presentes en una muestra materna, por ejemplo, una muestra de plasma. Los kits comprenden una composición que comprende al menos un conjunto de cebadores para amplificar al menos un ácido nucleico diana polimórfico en dichas moléculas de ácidos nucleicos fetales y maternas. Los ácidos nucleicos diana polimórficos pueden comprender sin limitación polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), SNP en tándem, deleciones o inserciones de múltiples bases a pequeña escala, denominadas IN-DELS (también denominados polimorfismos de deleción-inserción o DIP), polimorfismos de múltiples nucleótidos (MNP), repeticiones en tándem cortas (STR), polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), o un polimorfismo que comprende cualquier otro cambio de secuencia en un cromosoma. Los métodos de secuenciación que utilizan las composiciones son métodos de NGS de moléculas de ácidos nucleicos individuales o moléculas de ácidos nucleicos clonalmente amplificadas como se describe en el presente documento. Los métodos de secuenciación masiva en paralelo de NGS incluyen pirosecuenciación, secuenciación por síntesis con terminadores reversibles con colorante, secuenciación en tiempo real, o secuenciación por ligación de sondas de oligonucleótidos.
En un caso, las composiciones incluyen cebadores para amplificar los ácidos nucleicos diana polimórficos que comprenden cada uno al menos un SNP. En un caso, el al menos un SNP se selecciona de los SNP rs560681, rs1109037, rs9866013, rs13182883, rs13218440, rs7041158, rs740598, rs10773760, rs4530059, rs7205345, rs8078417, rs576261, rs2567608, rs430046, rs9951171, rs338882, rs10776839, rs9905977, rs1277284, rs258684, rs1347696, rs508485, rs9788670, rs8137254, rs3143, rs2182957, rs3739005, y rs530022. Los conjuntos de cebadores a modo de ejemplo correspondientes para amplificar los SNP se proporcionan como SEQ ID NO: 57-112.
En otro caso, la composición incluye cebadores para amplificar ácidos nucleicos diana polimórficos que comprenden cada uno al menos un SNP en tándem. En un caso, la composición incluye cebadores para amplificar SNP en tándem. En un caso, la composición incluye cebadores para amplificar los SNP en tándem desvelados en el presente documento, y la composición comprende los cebadores a modo de ejemplo correspondientes de SEQ ID NO: 197­ 310.
Los kits pueden contener una combinación de reactivo que incluye los elementos requeridos para realizar un ensayo según los métodos desvelados en el presente documento. El sistema de reactivos se presenta en una forma comercialmente envasada, como una composición o mezcla donde la compatibilidad de los reactivos permitirá, en una configuración de dispositivo de prueba, o más normalmente como un kit de prueba, es decir, una combinación envasada de uno o más recipientes, dispositivos o similares que contienen los reactivos necesarios, y que incluyen preferentemente instrucciones por escrito para la realización de los ensayos. El kit desvelado en el presente documento se puede adaptar para cualquier configuración de ensayo y puede incluir composiciones para realizar cualquiera de los diversos formatos de ensayo descritos en el presente documento. Los kits para determinar la fracción fetal comprenden composiciones que incluyen conjuntos de cebadores para amplificar ácidos nucleicos polimórficos presentes en una muestra materna como se describe y, si procede, se desvelan reactivos para purificar ADNsc en el presente documento. En un caso, un kit diseñado para permitir la cuantificación de secuencias polimórficas fetales y maternas, por ejemplo, STR y/o SNP y/o SNP en tándem, en una muestra de ADNsc plasmática, incluye al menos un conjunto de oligonucleótidos específicos de alelo específicos para un SNP seleccionado y/o región de repeticiones en tándem. Preferentemente, el kit incluye una pluralidad de conjuntos de cebadores para amplificar un panel de secuencias polimórficas. Un kit puede comprender otros reactivos y/o información para el genotipado o la cuantificación de alelos en una muestra (por ejemplo, tampones, nucleótidos, instrucciones). Los kits también incluyen una pluralidad de recipientes de tampones y reactivos apropiados.
Ejemplo 1
Determinación de la fracción fetal usando secuenciación masiva en paralelo: procesamiento de muestras y extracción de ADNsc
Se recogieron muestras de sangre periférica de mujeres embarazadas en su primer o segundo trimestre de embarazo y que se consideró que estaban en riesgo de aneuploidía fetal. Se obtuvo el consentimiento informado de cada participante antes de extraer la sangre. Se recogió la sangre antes del muestreo de amniocentesis o de vellosidades coriónicas. Se realizó el análisis de cariotipo usando las muestras de vellosidades coriónicas o amniocentesis para confirmar el cariotipo fetal.
Se recogió en tubos ACD la sangre periférica extraída de cada sujeto. Se transfirió un tubo de muestra de sangre (aproximadamente 6-9 mL/tubo) a un tubo de 15 mL de centrifugadora de baja velocidad. La sangre se centrifugó a 2640 rpm, 4 °C, durante 10 min usando la centrifugadora Beckman Allegra 6 R y modelo de rotor GA 3.8.
Para la extracción de plasma sin células, se transfirió la capa de plasma superior a un tubo de 15 mL de centrifugadora de alta velocidad y se centrifugó a 16000 x g, 4 °C, durante 10 min usando la centrifugadora Beckman Coulter Avanti J-E y el rotor JA-14. Las dos etapas de centrifugación se realizaron en 72 h después de la extracción de la sangre. Se guardó a -80 °C el plasma sin células que comprendía el ADNsc y se descongeló solo una vez antes de la amplificación del ADNsc de plasma o para la purificación de ADNsc.
Se extrajo ADN sin células (ADNsc) purificado de plasma sin células usando el minikit de ADN de sangre QlAamp (Qiagen) esencialmente según las instrucciones del fabricante. Se añadieron un mililitro de tampón AL y 100 pL de disolución de proteasa a 1 mL de plasma. La mezcla se incubó durante 15 minutos a 56 °C. Se añadió un mililitro de etanol al 100 % al digesto de plasma. La mezcla resultante se transfirió a minicolumnas QlAamp que se ensamblaron con VacValves y VacConnectors provistas en el ensamblaje de columna QIAvac 24 Plus (Qiagen). Se aplicó vacío a las muestras, y el ADNsc retenido en los filtros de columna se lavó a vacío con 750 pL de tampón AW1, seguido por un segundo lavado con 750 pL de tampón AW24. La columna se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos para retirar el tampón residual del filtro. Se eluyó el ADNsc con tampón AE por centrifugación a 14.000 rpm y se determinó la concentración usando la plataforma de cuantificación Qubit™ (Invitrogen).
Ejemplo 2
Determinación de la fracción fetal usando secuenciación masiva en paralelo: preparación de bibliotecas de secuenciación, secuenciación y análisis de los datos de secuenciación
a. Preparación de bibliotecas de secuenciación
Todas las bibliotecas de secuenciación, es decir, bibliotecas diana, primaria y enriquecidas, se prepararon a partir de aproximadamente 2 ng de ADNsc purificado que se extrajo de plasma materno. La preparación de bibliotecas se realizó usando reactivos del conjunto 1 de reactivos de ADN NEBNext™ DNA Sample Prep (pieza N° E6000L; New England Biolabs, Ipswich, MA) para Illumina® del siguiente modo. Debido a que el ADN plasmático sin células está fragmentado en la naturaleza, no se hizo fragmentación por nebulización o sonicación adicional en las muestras de ADN de plasma. Los nucleótidos protuberantes de aproximadamente 2 ng de fragmentos de ADNsc purificado contenidos en 40 pL se convirtieron en extremos romos fosforilados según el módulo de reparación de extremos NEBNext® incubando en un tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL el ADNsc con 5 pL 10X tampón de fosforilación, 2 pL de mezcla de disolución de desoxinucleótidos (10 mM cada dNTP), 1 pL de una dilución 1:5 de ADN polimerasa I, 1 pL de ADN polimerasa T4 y 1 pL de polinucleótido cinasa T4 proporcionado en el conjunto 1 de reactivos de ADN NEBNext™ DNA Sample Prep durante 15 minutos a 20 °C. Entonces se inactivaron térmicamente las enzimas incubando la mezcla de reacción a 75 °C durante 5 minutos. La mezcla se enfrió hasta 4 °C, y se llevó a cabo la prolongación con dA del ADN de extremos romo usando 10 pL de la mezcla maestra de prolongación con dA que contenía el fragmento de Klenow (3' a 5' exo menos) (conjunto 1 de reactivos de ADN NEBNext™ DNA Sample), e incubando durante 15 minutos a 37 °C. Posteriormente, el fragmento de Klenow se inactivo térmicamente incubando la mezcla de reacción a 75 °C durante 5 minutos. Después de la inactivación del fragmento de Klenow, se usó 1 pL de una dilución 1:5 de Genomic Adaptor Oligo Mix de Illumina (pieza N° 1000521; Illumina Inc., Hayward, CA) para ligar los adaptadores de Illumina (adaptadores Y sin índice) al a Dn prolongado con dA usando 4 pL de la ADN ligasa T4 proporcionada en el conjunto 1 de reactivos de ADN NEBNext™ DNA Sample Prep, incubando la mezcla de reacción durante 15 minutos a 25 °C. La mezcla se enfrió hasta 4 °C, y los ADNsc ligados por adaptador se purificaron de adaptadores no ligados, dímeros de adaptador y otros reactivos usando perlas magnéticas proporcionadas en el sistema de purificación por PCR Agencourt AMPure XP (pieza N° A63881; Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA). Se realizaron dieciocho ciclos de PCR para enriquecer selectivamente ADNsc ligado por adaptador usando la mezcla maestra Phusion® de alta fidelidad (Finnzymes, Woburn, MA) y cebadores de PCR de Illumina complementarios a los adaptadores (pieza N° 1000537 y 1000537). El ADN ligado por adaptador se sometió a PCR (98 °C durante 30 segundos; 18 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 65 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos; extensión final a 72 °C durante 5 minutos y mantenimiento a 4 °C) usando cebadores de PCR genómicos de Illumina (piezas N° 100537 y 1000538) y la mezcla maestra de fusión de alta fidelidad Phusion proporcionada en el conjunto 1 de reactivos de ADN NEBNext™ DNA Sample Prep, según las instrucciones del fabricante. El producto amplificado se purificó usando el sistema de amplificación por PCR Agencourt AMPure XP (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA) según las instrucciones del fabricante disponible en www.beckmangenomics.com/products/AMPureXPProtocol_000387v001.pdf. El producto amplificado purificado se eluyó en 40 pL de tampón Qiagen EB, y la concentración y la distribución de tamaño de las bibliotecas amplificadas se analizó usando el kit DNA 1000 de Agilent para el bioanalizador 2100 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA).
b. Secuenciación
Se realizó la secuenciación del ADN de biblioteca usando el analizador II del genoma (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) según protocolos habituales del fabricante. Las copias del protocolo para la secuenciación de genoma completo usando la tecnología Illumina/Solexa se pueden encontrar en BioTechniques.RTM. Protocol Guide 2007 publicada en diciembre de 2006: p 29, y en la malla multimedia mundial en biotechniques.com/default.asp?page=protocol&subsection=article display&id=112378. La biblioteca de ADN se diluyó hasta 1 nM y se desnaturalizó. Se sometió el ADN de la biblioteca (5 pM) a amplificación en clústeres según el procedimiento descrito en Cluster Station User Guide y Cluster Station Operations Guide de Illumina, disponible en la malla multimedia mundial en illumina.com/systems/genome analyzer/cluster_station.ilmn. Se secuenció el ADN amplificado usando el analizador II del genoma de Illumina para obtener lecturas de extremo único de 36 pb. Solo se necesitan aproximadamente 30 pb de información de secuencia aleatoria para identificar que una secuencia pertenece a un cromosoma humano específico. Secuencias más largas pueden identificar de forma única dianas más particulares. En el presente caso, se obtuvo un gran número de lecturas de 36 pb, que cubren aproximadamente el 10 % del genoma.
c. Datos del análisis de secuenciación para la determinación de la fracción fetal
Tras completarse la secuenciación de la muestra, "Sequencer Control Software" de Illumina transfirió los archivos de imágenes y de identificación de bases a un servidor Unix que ejecuta la versión 1.51 del software "Genome Analyzer Pipeline" de Illumina. Se alinearon las lecturas de 36 pb con un genoma de referencia artificial, por ejemplo, un genoma de SNP, usando el programa BOWTIE. El genoma de referencia artificial se identificó como la agrupación de las secuencias polimórficas de ADN que engloban los alelos comprendidos en las secuencias polimórficas diana. Por ejemplo, el genoma de referencia artificial es un genoma de SNP que comprende SEQ ID NO: 1-56. Solo se usaron las lecturas que se cartografían de forma única con el genoma artificial para el análisis de la fracción fetal. Las lecturas que coincidieron perfectamente con el genoma de SNP se contaron como marcas y se filtraron. De las lecturas restantes, solo las lecturas que tenían uno o dos desapareamientos se contaron como marcas y se incluyeron en el análisis. Se contaron las marcas cartografiadas con cada uno de los alelos polimórficos, y se determinó la fracción fetal como un porcentaje de la relación del número de marcas cartografiadas con el alelo principal, es decir, el alelo materno, y el número de marcas cartografiadas con el alelo secundario, es decir, el alelo fetal.
Selección de SNP autosómicos para la determinación de la fracción fetal
Se seleccionó un conjunto de 28 SNP autosómicos de una lista de 92 SNP (Pakstis et al., Hum Genet 127:315-324 [2010]) y de Applied Biosystems de Life Technologies™ (Carlsbad, CA) en la dirección de la malla multimedia mundial appliedbiosystems.com, y se validó para su uso en amplificación por PCR multiplexada. Los cebadores se diseñaron para hibridarse con una secuencia próxima al sitio de SNP en el ADNsc para garantizar que se incluía en la lectura de 36 pb generada a partir de la secuenciación masiva en paralelo en el analizador GII de Illumina, y para generar amplicones de longitud suficiente para someterse a amplificación por puentes durante la formación de clústeres. Así, se diseñaron cebadores para generar amplicones que tuvieron al menos 110 pb, que cuando se combinaron con los adaptadores universales (Illumina Inc., San Diego, CA) usados para la amplificación de clústeres, produjeron moléculas de ADN de al menos 200 pb. Se identificaron las secuencias de cebadores, y se sintetizaron conjuntos de cebadores, es decir, cebadores directos e inversos, por Integrated DNA Technologies (San Diego, CA), y se conservaron como una disolución 1 pM que se iba a usar para amplificar secuencias polimórficas diana como se describe en los Ejemplos 4-7. La Tabla 1 proporciona los números ID de acceso de RefSNP (rs), los cebadores usados para amplificar la secuencia de ADNsc diana y las secuencias de los amplicones que comprenden los posibles alelos de SNP que se generarían usando los cebadores. Se usaron los SNP dados en la Tabla 1 para la amplificación simultánea de 13 secuencias diana en un ensayo multiplexado. El panel proporcionado en la Tabla 1 es un panel de SNP a modo de ejemplo. Se pueden emplear más o menos SNP para enriquecer el ADN fetal y materno para ácidos nucleicos diana polimórficos. Los SNP adicionales que se pueden usar incluyen los SNP dados en la Tabla 2. Los alelos de SNP se muestran en negrita y están subrayados. Otros SNP adicionales que se pueden usar para determinar la fracción fetal según el presente método incluyen rs315791, rs3780962, rs1410059, rs279844, rs38882, rs9951171, rs214955, rs6444724, rs2503107, rs1019029, rs1413212, rs1031825, rs891700, rs1005533, rs2831700, rs354439, rs1979255, rs1454361, rs8037429 y rs1490413, que se han analizado para determinar la fracción fetal por PCR TaqMan, y se desvelan en las solicitudes provisionales de EE. UU. 61/296.358 y 61/360.837.
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Ejemplo 4
Determinación de la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo de una biblioteca diana
Para determinar la fracción de ADNsc fetal en una muestra materna, se amplificaron secuencias de ácidos nucleicos polimórficos diana que comprendían cada una un SNP y se usaron para preparar una biblioteca diana para secuenciación en un modo masivo en paralelo.
Se extrajo ADNsc como se describe en el Ejemplo 1. Se preparó una biblioteca de secuenciación diana del siguiente modo. Se amplificó ADNsc contenido en 5 pL de ADNsc purificado en un volumen de reacción de 50 pL que contenía 7,5 pL de una mezcla 1 pM de cebadores (Tabla 1), 10 pL de mezcla maestra NEB 5X y 27 pL de agua. Se realizó ciclado térmico con el gen Amp9700 (Applied Biosystems) usando las siguientes condiciones de ciclado: incubación a 95 °C durante 1 minuto, seguido por 20-30 ciclos a 95 °C durante 20 segundos, 68 °C durante 1 minuto, y 68 °C durante 30s, que fue seguido por una incubación final a 68 °C durante 5 minutos. Se añadió un mantenimiento final a 4 °C hasta que las muestras se retiraron para su combinación con la porción no amplificada de la muestra de ADNsc purificado. El producto amplificado se purificó usando el sistema de purificación por PCR Agencourt AMPure XP (pieza N° A63881; Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA). Se añadió un mantenimiento final a 4 °C hasta que las muestras se retiraron para preparar la biblioteca diana. El producto amplificado se analizó con un bioanalizador 2100 (Agilent Technologies, Sunnyvale, CA), y se determinó la concentración de producto amplificado. Se preparó una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos diana amplificados como se describe en el Ejemplo 2, y se secuenció en un modo masivo en paralelo usando secuenciación por síntesis con terminadores reversibles con colorante y según el protocolo de Illumina (BioTechniques.RTM. Protocolo Guide 2007 publicado en diciembre de 2006: p 29, y en la malla multimedia mundial en biotechniques.com/default.asp?page=protocol&subsection=article_display&id=112378). Se realizó como se describe el análisis y el recuento de marcas cartografiadas con un genoma de referencia que consiste en 26 secuencias (13 pares que representan cada uno dos alelos) que comprende un SNP, es decir, SEQ ID NO: 1-26.
La Tabla 3 proporciona los recuentos de marcas obtenidos de la secuenciación de la biblioteca diana, y la fracción fetal calculada derivada de datos de secuenciación.
TABLA 3 Determinación de la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo de una biblioteca de ácidos nucleicos polimórficos
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Los resultados muestran que las secuencias polimórficas de ácidos nucleicos que comprenden cada una al menos un SNP se pueden amplificar a partir de ADNsc derivados de una muestra materna de plasma para construir una biblioteca que se puede secuenciar en un modo masivo en paralelo para determinar la fracción de ácidos nucleicos fetales en la muestra materna.
Ejemplo 5
Determinación de la fracción fetal tras el enriquecimiento de ácidos nucleicos fetales y maternos en una muestra de bibliotecas de secuenciación de ADNsc
Para enriquecer el ADNsc fetal y materno contenido en una biblioteca de secuenciación primaria construida usando ADNsc fetal y materno purificado, se usó una porción de una muestra de ADNsc purificado para amplificar secuencias polimórficas de ácidos nucleicos diana, y para preparar una biblioteca de secuenciación de ácidos nucleicos diana polimórficos amplificados, que se usó para enriquecer las secuencias de ácidos nucleicos fetales y maternas comprendidas en la biblioteca primaria.
El método corresponde al flujo de trabajo 3 representado en la Figura 3. Se preparó una biblioteca de secuenciación diana a partir de una porción de los ADNsc purificados como se describe en el Ejemplo 2. Se preparó una biblioteca de secuenciación primaria usando la porción restante del ADNsc purificado como se describe en el Ejemplo 2. El enriquecimiento de la biblioteca primaria para los ácidos nucleicos polimórficos amplificados comprendidos en la biblioteca diana se obtuvo diluyendo las bibliotecas de secuenciación primaria y diana con 10 nM, y combinando la biblioteca diana con la biblioteca primaria a una relación de 1:9 para proporcionar una biblioteca de secuenciación enriquecida. La secuenciación de la biblioteca enriquecida y el análisis de los datos de secuenciación se realizaron como se describe en el Ejemplo 2.
La Tabla 4 proporciona el número de marcas de secuencia que se calcografiaron con el genoma de SNP para los SNP informativos identificados a partir de la secuenciación de una biblioteca enriquecida derivada de muestras de plasma de mujeres embarazadas que llevaban cada una un feto con T21, T13, T18 y monosomía X, respectivamente. La fracción fetal se calculó del siguiente modo:
% de alelox de la fracción fetal = ((SMarcas de secuencia fetal para el alelox) / (SMarcas de secuencia materna para el alelox)) x 100
La Tabla 4 también proporciona el número de las marcas de secuencia cartografiadas con el genoma de referencia humano. Las marcas cartografiadas con el genoma de referencia humano se usaron para determinar la presencia o ausencia de aneuploidía usando la misma muestra de plasma que se utilizó para determinar la fracción fetal correspondiente. El método de uso de recuentos de marcas de secuencia para determinar la aneuploidía se describe en las solicitudes provisionales de EE. UU. 61/407.017 y 61/455.849778.
TABLA 4 Determinación de la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo de una biblioteca enriquecida de ácidos nucleicos polimórficos
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Ejemplo 6
Determinación de la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo: Enriquecimiento de ácidos nucleicos fetales y maternos en ácidos nucleicos polim órficos en una muestra de ADNsc purificado.
Para enriquecer el ADNsc fetal y materno contenido en una muestra de ADNsc extraída de una muestra materna de plasma, se usó una porción del ADNsc purificado para amplificar secuencias de ácidos nucleicos polimórficos diana que comprendían cada una un SNP elegido del panel de SNP dado en la Tabla 5.
El método corresponde al flujo de trabajo 2 representado en la Figura 3. Se obtuvo plasma sin células de una muestra de sangre materna, y se purificó el ADNsc de la muestra de plasma como se describe en el Ejemplo 1. Se determinó que la concentración final era 92,8 pg/pL. Se amplificó el ADNsc contenido en 5 pL de ADNsc purificado en un volumen de reacción de 50 pL que contenía 7,5 pL de una mezcla de cebadores 1 uM (Tabla 1), 10 pL de mezcla maestra NEB 5X y 27 pL de agua. Se realizó el ciclado térmico con el gen Amp9700 (Applied Biosystems). Usando las siguientes condiciones de ciclado: incubación a 95 °C durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos a 95 °C durante 20 segundos, 68 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 30s, que fue seguido por una incubación final a 68 °C durante 5 minutos. Se añadió un mantenimiento final a 4 °C hasta que las muestras se retiraron para su combinación con la porción sin amplificar de la muestra de ADNsc purificado. El producto amplificado se purificó usando el sistema de purificación por PCR Agencourt AMPure XP (pieza N° A63881; Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), y se cuantificó la concentración usando Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). El producto de amplificación purificado se diluyó 1:10 en agua y se añadieron 0,9 pL (371 pg) a 40 pL de muestra purificada de ADNsc para obtener un enriquecimiento del 10 %. Se usó el ADNsc fetal y materno enriquecido presente en la muestra de ADNsc purificado para preparar una biblioteca de secuenciación, y se secuenció como se describe en el Ejemplo 2.
La Tabla 5 proporciona los recuentos de marcas obtenidos para cada uno de los cromosomas 21, 18, 13, X e Y, es decir, la densidad de marcas de secuencia, y los recuentos de marcas obtenidos para las secuencias polimórficas informativas contenidas en el genoma de referencia de SNP, es decir, la densidad de marcas de SNP. Los datos muestran que la información de secuenciación se puede obtener de la secuenciación de una única biblioteca construida a partir de una muestra de ADNsc materno purificado que se ha enriquecido para secuencias que comprenden SNP para determinar simultáneamente la presencia o ausencia de aneuploidía y la fracción fetal. La presencia o ausencia de aneuploidía se determinó usando el número de marcas calcografiadas en cromosomas como se describe en las solicitudes provisionales de EE. UU. 61/407.017 y 61/455.849. En el ejemplo dado, los datos muestran que la fracción de ADN fetal en la muestra de plasma AFR105 fue cuantificable a partir de los resultados de secuenciación de cinco SNP informativos y se determinó que era del 3,84 %. Se proporcionan densidades de marcas de secuencia para los cromosomas 21, 13, 18, X e Y.
El ejemplo muestra que el protocolo de enriquecimiento proporciona los recuentos de marcas requeridos para determinar la aneuploidía y la fracción fetal de un único proceso de secuenciación.
TABLA 5
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Ejemplo 7
Determinación de la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo: Enriquecimiento de ácidos nucleicos fetales y maternos en ácidos nucleicos polim órficos en una muestra de plasma.
Para enriquecer el ADNsc fetal y materno contenido en una muestra original de plasma derivada de una mujer embarazada, se usó una porción de la muestra original de plasma para amplificar secuencias polimórficas de ácidos nucleicos diana comprendían cada una un SNP elegido del panel de SNP dado en la Tabla 1, y se combinó una porción del producto amplificado con la muestra original de plasma restante.
El método corresponde al flujo de trabajo 2 representado en la Figura 3. Se amplificó el ADNsc contenido en 15 gL de plasma sin células en un volumen de reacción de 50 gL que contenía 9 uL de una mezcla de cebadores 1 gM (15 plex, Tabla 1), 1 gL de ADN polimerasa de sangre Phusion, 25 gL de 2X tampón de PCR de sangre Phusion que contenía trifosfatos de desoxinucleótido (dNTP: dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Se realizó el ciclado térmico con el gen Amp9700 (Applied Biosystems) usando las siguientes condiciones de ciclado: incubación a 95 °C durante 3 minutos, seguido por 35 ciclos a 95 °C durante 20 segundos, 55 °C durante 30 s y 70 °C durante 1 minuto, que fue seguido por una incubación final a 68 °C durante 5 minutos. Se añadió un mantenimiento final a 4 °C hasta que las muestras se retiraron para su combinación con la porción sin amplificar de plasma sin células. El producto amplificado se diluyó 1:2 con agua y se analizó usando el bionalizador. Se diluyeron 3 pL adicionales de producto amplificado con 11,85 pL de agua para obtener una concentración final de 2 ng/ pL. se combinaron 2,2 pL del producto amplificado diluido con la muestra de plasma restante. El ADNsc fetal y materno enriquecido presente en la muestra de plasma se purificó como se describe en el Ejemplo 1, y se usó para la preparación de una biblioteca de secuenciación. Se realizó la secuenciación y el análisis de los datos de secuenciación como se describe en el Ejemplo 2.
Los resultados se dan en la Tabla 6. En el ejemplo dado, los datos muestran que la fracción de ADN fetal en la muestra de plasma SAC2517 fue cuantificable a partir de los resultados de secuenciación de un SNP informativo y se determinó que era del 9,5%. En el ejemplo dado, se mostró por cariotipado que la muestra SAC2517 no estaba afectada por aneuploidías de los cromosomas 21, 13, 18, X e Y. Se proporcionan las densidades de marcas de secuencia para los cromosomas 21, 13, 18, X e Y. Se determinó la presencia o ausencia de aneuploidía usando recuentos de marcas como se describe en las solicitudes provisionales de EE. UU. 61/407.017 y 61/455.849.
El ejemplo demuestra que se puede usar el enriquecimiento de la mezcla de ADNsc fetal y materno presente en una muestra de plasma para las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden al menos un SNP informativo para proporcionar la secuencia requerida y recuentos de marcas de SNP para determinar la aneuploidía y fracción fetal de un único proceso de secuenciación en la secuenciación masiva en paralelo de una biblioteca preparada a partir del ADNsc contenido en una muestra de plasma que está enriquecida en ácidos nucleicos polimórficos.
TABLA 6
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Ejemplo 8
Determinación de la fracción fetal en la secuenciación masiva en paralelo de muestras que comprenden secuencias polimórficas amplificadas: SNP en tándem
Para determinar la fracción de ADNsc fetal en una muestra materna, se amplifican secuencias polimórficas de ácidos nucleicos diana que comprenden cada una un par de SNP en tándem y se usan para preparar una biblioteca diana para la secuenciación en un modo masivo en paralelo. Se pueden seleccionar pares de SNP en tándem de rs7277033-rs2110153; rs2822654-rs1882882; rs368657-rs376635; rs2822731-rs2822732; rs1475881-rs7275487; rs1735976-rs2827016; rs447340-rs2824097; rs418989- rs13047336; rs987980- rs987981; rs4143392- rs4143391; rs1691324-rs13050434; rs11909758-rs9980111; rs2826842-rs232414; rs1980969-rs1980970; rs9978999-rs9979175; rs1034346-rs12481852; rs7509629-rs2828358; rs4817013-rs7277036; rs9981121-rs2829696; rs455921-rs2898102; rs2898102-rs458848; rs961301-rs2830208; rs2174536-rs458076; rs11088023-rs11088024; rs1011734-rs1011733; rs2831244-rs9789838; rs8132769-rs2831440; rs8134080-rs2831524; rs4817219-rs4817220; rs2250911-rs2250997; rs2831899-rs2831900; rs2831902-rs2831903; rs11088086-rs2251447; rs2832040-rs11088088; rs2832141-rs2246777; rs2832959 -rs9980934; rs2833734-rs2833735; rs933121-rs933122; rs2834140-rs12626953; rs2834485-rs3453; rs9974986-rs2834703; rs2776266-rs2835001; rs1984014-rs1984015; rs7281674-rs2835316; rs13047304rs13047322; rs2835545-rs4816551; rs2835735-rs2835736; rs13047608-rs2835826; rs2836550-rs2212596; rs2836660-rs2836661; rs465612-rs8131220; rs9980072-rs8130031; rs418359-rs2836926; rs7278447-rs7278858; rs385787-rs367001; rs367001-rs386095; rs2837296-rs2837297; y rs2837381-rs4816672. Los cebadores usados para amplificar las secuencias diana que comprenden los SNP en tándem se diseñan para englobar ambos sitios de SNP. Por ejemplo, el cebador directo se diseña para englobar el primer SNP y el cebador inverso se diseña para englobar el segundo del par de SNP en tándem, es decir, cada uno de los sitios de SNP en el par del tándem está englobado dentro de los 36 pb generados por el método de secuenciación. Se puede usar secuenciación de extremos emparejados para identificar todas las secuencias que engloban los sitios de SNP en tándem. Los conjuntos de cebadores a modo de ejemplo que se usan para amplificar los SNP en tándem desvelados en el presente documento son rs7277033-rs2110153_F: TCCTGGAAACAAAAGTATT (SEQ ID NO:197) y rs7277033-rs2110153_R: AACCTTACAACAAAGCTAGAA (SEQ ID NO:198), set rs2822654-rs1882882_F: ACTAAGCCTTGGGGATCCAG (SEQ ID NO:199) y rs2822654-rs1882882_R: TGCTGTGGAAATACTAAAAGG (SEQ ID NO:200), set rs368657-rs376635 F:CTCCAGAGGTAATCCTGTGA (SEQ ID NO:201) y rs368657-rs376635 R:TGGTGTGAGATGGTATCTAGG (SEQ ID NO:202), rs2822731-rs2822732 F:GTATAATCCATGAATCTTGTTT (SEQ ID NO:203) y rs2822731-rs2822732 _R:TTCAAATTGTATATAAGAGAGT (SEQ ID NO:204), rs1475881-rs7275487 F: G CAGGAAAGTT ATTTTT AAT (SEQ ID NO:205) y rs1475881-rs7275487 R :TGCTT GAGAAAGCT AACACTT (SEQ ID NO:206), rs1735976-rs2827016 F:CAGT GTTTGGAAATT GTCTG (SEQ ID NO:207) y rs1735976-rs2827016 _R:GGCACTGGGAGATTATTGTA (SEQ ID NO:208), rs447349-rs2824097_F:TCCTGTTGTTAAGTACACAT (SEQ ID NO:209) y rs447349-rs2824097_R:GGGCCGTAATTACTTTTG (SEQ ID NO:210), 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Se pueden incluir secuencias de polinucleótidos, por ejemplo las secuencias de abrazadera de GC, para garantizar la hibridación específica de cebadores ricos en AT (Ghanta et al., PLOS ONE 5(10): doi10.1371/joumal.pone.0013184 [2010], disponibles en la malla multimedia mundial en plosone.org). Un ejemplo de una secuencia de abrazadera de GC que puede incluir 5' del cebador directo o 3' del cebador inverso es GCCGCCTGCAGCCCGCGCCCCCCGTGCCCCCGCCCCGCCGCCGGCCCGGGCGCC (SEQ ID NO:311). Las secuencias polimórficas se pueden usar solas o en combinación con ADNsc sin amplificar para determinar o la fracción fetal o la presencia o ausencia de aneuploidía y la fracción fetal en una muestra materna como se describe para las secuencias polimórficas de SNP. La preparación de muestras y el enriquecimiento de la biblioteca de secuenciación de ADNsc, una muestra de ADNsc purificado y una muestra de plasma se realizan según el método descrito en los Ejemplos 5, 6 y 7, respectivamente. Todas las bibliotecas de secuenciación se preparan como se describe en el Ejemplo 2a, y la secuenciación se realiza como se describe en el Ejemplo 2b. El análisis de los datos de secuenciación para la determinación de aneuploidía fetal se realiza como se describe en el Ejemplo 5. Concomitante al análisis para determinar la aneuploidía, se analizan los datos de secuenciación para determinar la fracción fetal del siguiente modo. Después de la transferencia de los archivos de imágenes y de identificación de bases al servidor Unix que ejecuta la versión 1.51 del software "Genoma Analyser Pipeline" de Illumina como se describe en el Ejemplo 3a, las lecturas de 36 pb se alinean con un 'genoma de SNP en tándem' usando el programa BOWTIE. El genoma de SNP en tándem se identifica como la agrupación de las secuencias de ADN que engloban los alelos de los 58 pares de SNP en tándem desvelados anteriormente. Solo las lecturas que se cartografían de forma única con el genoma de SNP en tándem se usan para el análisis de la fracción fetal. Las lecturas que se emparejan perfectamente con el genoma de SNP en tándem se cuentan como marcas y se filtran. De las lecturas restantes, solo las lecturas que tienen uno o dos desapareamientos se cuentan como marcas y se incluyen en el análisis. Se cuentan las marcas cartografiadas con cada uno de los alelos de SNP en tándem y se determina la fracción fetal esencialmente como se describe en el Ejemplo 6 anterior, pero teniendo en cuenta las marcas cartografiadas con los dos alelos de SNP en tándem x e y presentes en cada una de las secuencias polimórficas de ácidos nucleicos diana amplificadas que se amplifican para enriquecer las muestras, es decir,
% de alelox+y de la fracción fetal = ((SMarcas de secuencia fetal para el alelox+y) / (SMarcas de secuencia materna para el alelox+y)) x 100
Solo se usan SNP en tándem informativos para determinar la fracción fetal.
Opcionalmente, se calcula la fracción de ácidos nucleicos fetales en la mezcla de ácidos nucleicos fetales y maternos para cada uno del alelo informativo (alelox+y) del siguiente modo:
% de alelox+y de la fracción fetal = ((2 x SMarcas de secuencia fetal para el alelox+y) / (SMarcas de secuencia materna para el alelox+y)) x 100,
para compensar la presencia de 2 conjuntos de alelos fetales en tándem, estando uno enmascarado por el fondo materno.
El porcentaje de fracción fetal se calcula para al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20 o más conjuntos informativos de alelos en tándem. En una realización, la fracción fetal es la fracción fetal promedio determinada para al menos 3 conjuntos informativos de alelos en tándem.
Ejemplo 9
Determinación de la fracción fetal en secuenciación masiva en paralelo de muestras que comprenden secuencias polimórficas amplificadas: STR
Para determinar la fracción de ADNsc fetal en una muestra materna, se amplifican secuencias de ácidos nucleicos polimórficos diana que comprenden cada una una STR y se usan para preparar una biblioteca diana para la secuenciación en un modo masivamente paralelo.
Se obtienen muestras de sangre periférica de sujetos embarazos, y se purifica el ADNsc de la fracción de plasma como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Las STR que se amplifican se eligen de las STR codis y no codis desveladas en la Tabla 7, y la amplificación de las secuencias de STR polimórficas se obtiene usando los conjuntos correspondientes de cebadores proporcionados. Por ejemplo, las STR enumeradas en la Tabla 7 se amplifican usando los cebadores correspondientes (SEQ ID NO: 113-197), y el producto amplificado se usa para generar una biblioteca de secuenciación diana. La biblioteca de secuenciación diana de STR se prepara como se describe para la preparación de la biblioteca diana de SNP como se describe en el Ejemplo 8. Las St R CSF1PO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338D7S820 y FGA se han analizado previamente para determinar la fracción fetal, y se desvelan en las solicitudes provisionales de EE. UU. 61/296.358 y 61/360.837.
TABLA 7 MiniSTRs CODIS y no CODIS
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Se realiza la secuenciación de la biblioteca enriquecida en secuencias de STR polimórficas usando una tecnología de NGS, por ejemplo, secuenciación por síntesis. Las lecturas de secuencias de longitudes que engloban las STR, por ejemplo, miniSTRs de al menos 100 pb, para un genoma de STR de referencia que consiste en las secuencias polimórficas que se amplificaron en la muestra. Se identifican alelos de STR de informativos por diferencias en la longitud de las repeticiones, y se cuentan el número de marcas de secuencia de STR, y se usan para determinar la fracción fetal. Opcionalmente, se realiza la amplificación de las secuencias de STR polimórficas para enriquecer una muestra de plasma, una muestra de ADNsc purificado o una muestra de biblioteca de secuenciación de ADNsc, como se describe en los Ejemplos 5, 6 y 7, respectivamente.
Ejemplo 10
Determinación de la fracción fetal por electroforesis capilar de secuencias polimórficas que comprenden STR
Para determinar la fracción fetal en muestras maternas que comprenden ADNsc fetal y materno, se recogieron muestras de sangre periférica de mujeres embarazadas voluntarias que portaban o fetos varones o hembra. Se obtuvieron muestras de sangre periférica y se procesaron para proporcionar ADNsc purificado como se describe en el Ejemplo 1
Se analizaron diez microlitros de muestras de ADNsc usando el kit de amplificación por PCR AmpF1 STR® MiniFiler™ (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se amplificó el ADNsc contenido en 1o pL en un volumen de reacción de 25 pL que contenía 5 pL de cebadores fluorescentemente marcados (conjunto de cebadores AmpF/STR® MiniFiler™), y la mezcla maestra AmFíSTR® MiniFiler™, que incluye ADN polimerasa AmpliTaq Gold® y tampón asociado, sal (MgC12 1,5 mM) y trifosfatos de desoxinucleótido 200 pM (dNTP: dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Los cebadores fluorescentemente marcados son cebadores directos que se marcan con colorantes 6FAM™, VIC™, NED™ y PET™. Se realizó ciclado térmico con el gen Amp9700 (Applied Biosystems) usando las siguientes condiciones de ciclado: incubación a 95 °C durante 10 minutos, seguido por 30 ciclos a 94 °C durante 20 segundos, 59 °C durante 2 minutos y 72 °C durante 1 minuto, que fue seguido por una incubación final a 60 °C durante 45 minutos. Se añadió un mantenimiento final a 4 °C hasta que las muestras se retiraron para el análisis. El producto amplificado se preparó diluyendo 1 uL de producto amplificado en 8,7 uL de formamida Hi-DiTM (Applied Biosystems) y 0,3 pL de patrón de tamaño interno GeneScanTM-500 LIZ (Applied Biosystems), y se analizó con un analizador genético ABI PRISM3130xl (Applied Biosystems) usando el analizador genético HID G5 POP4 (Applied Biosystems) y una matriz capilar de 36 cm. Todo el genotipado se realizó con el software GeneMapper_ID v3.2 (Applied Biosystems) usando escaleras alélicas y cajas y paneles proporcionados por el fabricante.
Toda la medición del genotipado se realizó en el analizador genético 3130xl de Applied Biosystems usando una "ventana" de ± 0,5 nt alrededor del tamaño obtenido para cada alelo para permitir la detección y la correcta asignación de alelos. Se determinó que cualquier alelo de muestra cuyo tamaño estaba fuera de la ventana de ± 0,5 nt era OL, es decir, "fuera de la escalera". Los alelos OL son alelos de un tamaño que no está representado en la escalera alélica AnmFíSTR® MiniFiler™ o un alelo que no se corresponde con una escalera alélica, pero cuyo tamaño está justamente fuera de una ventana debido al error de medición. Se estableció el umbral mínimo de la altura de pico de >50 URF basándose en los experimentos de validación realizados para evitar el tipado cuando es probable que los efectos estocásticos interfieran con la interpretación precisa de las mezclas. El cálculo de fracción fetal se basa en promediar todos los marcadores informativos. Los marcadores informativos se identifican por la presencia de picos en el electroferograma que entran dentro de los parámetros de las cajas prefijadas para las STR que se analizan.
Se realizaron los cálculos de fracción fetal usando la altura de pico promedio para los alelos principal y secundario en cada locus de STR determinado a partir de inyecciones por triplicado. Las reglas aplicadas al cálculo son:
1. Datos de alelos fuera de la escalera (OL) para alelos que no están incluidos en el cálculo; y
2. Solo se incluyen en el cálculo alturas de pico derivadas de >50 URF (unidades relativas de fluorescencia)
3. Si solo está presente una caja, el marcador se considera no informativo; y
4. Si se identifica una segunda caja, pero los picos de la primera y segunda cajas están dentro del 50-70 % de sus unidades relativas de fluorescencia (URF) en altura de pico, la fracción secundaria no se mide y se considera que el marcador no es informativo.
La fracción del alelo secundario para cualquier marcador informativo dado se calcula dividiendo la altura del pico del componente secundario entre la suma de la altura del pico para el componente principal, y se expresa como un porcentaje que se calculó primero para cada locus informativo como
fracción fetal = (Zaltura de picos de alelo secundario / Z altura de picos de alelo(s) principal(es)) x 100
La fracción fetal para una muestra que comprende dos o más STR informativas se calcularía como el promedio de las fracciones fetales calculadas para los dos o más marcadores informativos.
La Tabla 8 proporciona los datos obtenidos de analizar ADNsc de un sujeto embarazado con un feto varón.
TABLA 8 Fracción fetal determinada en ADNsc de un sujeto embarazado por análisis de STR
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Los resultados muestran que el ADNsc se puede usar para determinar la presencia o ausencia de ADN fetal como se indica por la detección de un componente secundario en uno o más alelos de STR, para determinar el porcentaje de fracción fetal, y para determinar el sexo del feto como se indica por la presencia o ausencia del alelo de amelogenina.
Preamplificación de ADNsc para determinar la fracción fetal por electroforesis capilar de secuencias polimórficas que comprenden STR
Para mejorar la sensibilidad del ensayo de STR en la detección y la cuantificación de los alelos de STR en el contribuyente secundario de la muestra de ADNsc, el número de genomas iniciales en las muestras artificiales aumentó por una estrategia modificada de amplificación de genoma completo.
Se recogieron muestras de sangre periférica y se procesaron como se describe en el Ejemplo 2. Se extrajo ADN sin células de 1 mL de plasma sin células usando MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I - Large Volume de Roche (Roche Applied Science, IN) usando el instrumento MagNA Pure Compact, y se eluyó en 50 pL de tampón de elución. Se usaron diez microlitros del ADNsc extraído para cuantificar el ADNsc, y el resto se almacenó (véanse las instrucciones de almacenamiento WI0035 Almacenamiento de muestras clínicas). La concentración del ARNsc extraído del plasma se determinó por cuantificación basada en fluorescencia con mediciones de absorbancia de UV usando la plataforma de cuantificación Qubit™ (Invitrogen).
Se determinó que la concentración de ADNsc cuantificado en muestras de plasma preparadas usando el MagnaPure Nucleic Acid Isolation Kit I de 16 sujetos embarazados variaba entre 20 y 100 pg/pL. Como se conoce que el componente fetal del ADNsc de plasma contribuye al 3-10 % del ADNsc de plasma total, se crearon muestras de plasma artificiales enriqueciendo alícuotas de ADNsc derivadas de plasma de sujetos femeninos voluntarios con ADNsc extraído de plasma de sujetos masculinos voluntarios para imitar las relaciones entre ADNsc fetal y materno encontradas en los sujetos embarazados. Se crearon muestras artificiales para contener 200-1000 pg de ADNsc femenino extraído que se enriqueció con 45-150 pg de ADNsc masculino extraído en un volumen total de 10 pL. Cada muestra artificial se enriqueció para contener 3 %, 5 % y 10 % de ADNsc masculino.
Se preamplificaron muestras artificiales que tienen concentraciones de ADNsc total inferiores a aproximadamente 50 pg/pL usando la amplificación por PCR de amplificación por extensión de cebadores mejorados modificados (mIPEP) según el método de Hanson y Ballantyne (Hanson y Ballantyne, Analytical Biochem 346:246-257 [2005]) del siguiente modo. Se amplificaron diez microlitros de ADNsc de plasma enriquecido en un volumen de reacción de 25 pL que contenía dNTP 1 mM, MgCl2 2,5mM (Applied Biosystems), tampón IX Expand High Fidelity (N° 3), 10,5 U de mezcla de enzimas Expand High Fidelity (Roche Diagnostics) y cebador PEP 40 pM (5'-NNNNNNNNNNNNNNN-3', Qiagen). La amplificación se realizó en un ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 en las siguientes condiciones: (1) 20 y 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 37 °C durante 2 minutos, y rampa de 0,1 °C/s hasta 55 °C durante 4 minutos. El producto de amplificación se purificó usando una columna Qiagen. La concentración del producto de amplificación se determinó usando la plataforma de cuantificación Qubit™ como se ha descrito anteriormente. Se realizó el análisis de STR como se describe en el Ejemplo 9 anterior, excepto que solo se incluyeron alturas de pico >100 URF en los cálculos.
Los resultados se muestran en las Tablas 9, 10 y 11. Los resultados proporcionados en la Tabla 9 muestran que el ADNsc contenido en 10 pL de ADNsc de muestras artificiales ART23 y ART24 que tienen una concentración inicial de ADNsc de 46,2 y 50,2 pg/ pL, respectivamente, se amplificó en aproximadamente 5 y 10 veces tras 20 y 30 ciclos de amplificación por PCR, respectivamente.
Estos datos indican que una preamplificación de ADNsc usando el método mIPEP proporcionó niveles potenciados de ADNsc total que hacen que el nivel del componente secundario sea más susceptible al análisis de STR.
TABLA 9 Preamplificación con mIPEP
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La Tabla 10 muestra mediciones por triplicado que perfilan 9 loci del ADNsc de muestras enriquecidas ART23 y ART24 siguiendo el procedimiento de mIPEP con 20 y 30 ciclos de amplificación, como se ha descrito anteriormente.
Los datos en la Tabla 11 indican que la preamplificación de ADNsc permite la detección y la cuantificación del componente secundario en la mayoría de los loci probados en muestras artificialmente mezcladas que tienen una
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TABLA 11 Fracción fetal determinada en una muestra después de la preamplificación usando mlPEP
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Ejemplo 12
Correlación de fracción fetal determinada por análisis de SNP y STR fetales y maternas
Para verificar que la fracción fetal calculada, es decir, la fracción de componente de ácido nucleico secundario, determinada usando el ensayo de SNP y STR como se describe en los ejemplos precedentes proporcionó una medición precisa de la fracción fetal, se comparó el porcentaje de la fracción fetal de ADNsc en el plasma de los mismos sujetos embarazados.
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de 48 sujetos voluntarios, 24 de los sujetos estuvieron embarazados con fetos varones y 24 estuvieron embarazados con fetos hembra. Se preparó ADNsc como se describe en el Ejemplo 1, se determinó la fracción fetal usando SNP en secuenciación masiva en paralelo por síntesis como se describe en el Ejemplo 5 y se determinó la fracción fetal usando STR usando electroforesis capilar como se describe en el Ejemplo 10
Los resultados mostrados en la Figura 6 indican que existe una correlación positiva entre la fracción determinada usando el ensayo de STR y la fracción determinada usando la fracción determinada. Estos datos validan además el uso de secuencias polimórficas que comprenden STR o SNP para determinar la fracción de ADNsc fetal en una muestra de plasma.
Ejemplo 13
Uso de fracción fetal para establecer umbrales y estimar el tamaño de muestra mínimo en la detección de aneuploidía
Se manipulan los recuentos de coincidencias de secuencias con cromosomas diferentes para generar una puntuación que variará con el número de copias cromosómicas que se pueden interpretar para identificar amplificación o deleción cromosómica. Por ejemplo, dicha puntuación se podría generar comparando la cantidad relativa de una marca de secuencia en un cromosoma que experimenta cambios del número de copias con un cromosoma que se sabe que es euploide. Los ejemplos de puntuaciones que se pueden usar para identificar amplificación o deleción incluyen, pero no se limitan a: recuentos para el cromosoma de interés dividido entre recuentos de otro cromosoma de la misma serie experimental, recuentos para el cromosoma de interés dividido entre el número total de recuentos de la serie experimental, comparación de recuentos de la muestra de interés frente a una muestra separada de control. Sin pérdida de generalidad, se puede asumir que las puntuaciones aumentarán a medida que aumente el número de copias. Se puede usar el conocimiento de fracción fetal para establecer los umbrales de corte para identificar estados de "aneuploidía", "normales" o "marginales" (inciertos). Entonces, se realizan cálculos para estimar el número mínimo de secuencias requerido para lograr sensibilidad adecuada (es decir, probabilidad de identificar correctamente un estado de aneuploidía).
La Figura 7 es un gráfico de dos poblaciones de puntuaciones diferentes. El eje x es la puntuación y el eje y es la frecuencia. Las puntuaciones en muestras de cromosomas sin aneuploidía pueden tener una distribución que se muestra en la Figura 7A. La Figura 7B ilustra una distribución hipotética de una población de puntuaciones en muestras con un cromosoma amplificado. Sin pérdida de generalidad, los gráficos y las ecuaciones muestran el caso de una puntuación univariante donde la condición de aneuploidía representa una amplificación del número de copias. Los casos multivariantes y/o las anomalías de reducción/deleción son simples extensiones o transposiciones de las descripciones dadas y se entiende que entran dentro del alcance de esta técnica.
La cantidad de "solapamiento” entre las poblaciones puede determinar cómo de bien se pueden discriminar casos normales y de aneuploidía. En general, al aumentar la fracción fetal, ff, aumenta la potencia de discriminación separando los dos centros de poblaciones (moviendo "C2," el "Centro de puntuaciones de aneuploidía", y aumentando "d", que hace que las poblaciones se solapen menos. Además, un aumento en el valor absoluto de la magnitud, m, (por ejemplo, que tiene cuatro copias del cromosoma en lugar de una trisomía) de la amplificación también aumentará la separación de centros de población que conducen a mayor potencia (es decir, mayor probabilidad de identificar correctamente los estados de aneuploidía).
El aumento en el número de secuencias generadas, N, reduce las desviaciones estándar "sdevA" y/o "sdevB", la diseminación de las dos poblaciones de puntuaciones, que también hace que las poblaciones se solapen menos.
Establecimiento de umbrales y estimación del tamaño de muestra
Se puede usar el siguiente procedimiento para establecer "c", el valor crítico para identificar estados de "aneuploidía", "normales" o "marginales" (inciertos). Sin pérdida de generalidad, a continuación, se usan pruebas estadísticas unilaterales.
Primero, se decide una tasa de positivos falsos aceptable, FP (algunas veces también llamado "error de tipo I" o "especificidad"), que es la probabilidad de un positivo falso o que se llama de forma falsa aneuploidía. Por ejemplo, FP puede ser al menos, o aproximadamente 0,001,0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,01,0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 o 0,1.
Segundo, el valor de "c" se puede determinar resolviendo la ecuación: FP = integral desde c hasta el infinito de (f1(x)dx).
Figure imgf000055_0001
Una vez se ha determinado un valor crítico, c, se puede estimar el número mínimo de secuencias requeridas para lograr una cierta TP = Tasa de positivos verdaderos. La tasa de positivos verdaderos puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9. En una realización, la tasa de positivos verdaderos puede ser 0,8. En otras palabras, N es el número mínimo de secuencias requerido para identificar aneuploidía el 100*TP por ciento del tiempo. N = número mínimo de forma que TP = integral desde c hasta el infinito de f2(x,ff)dx > 0,8. N se determina resolviendo 00
mín N s.t. {TB > J /2 (x , N)dx} (Ecuación 2)
En las pruebas estadísticas clásicas f1 y f2 son frecuentemente F, distribuciones F no centradas (un caso especial de distribuciones t y t no centradas), aunque esto no es una condición necesaria para la presente solicitud.
Establecimiento de "niveles" de umbrales para dar más control de errores
Los umbrales también se pueden establecer en etapas usando los métodos anteriores. Por ejemplo, se puede establecer un umbral para alta confianza que se llama "aneuploidía", llamémosla ca, usando FP 0,001 y un umbral "marginal", llamémoslo cb, usando FP 0,05. En este caso, si la puntuación, S:
(S > ca) entonces se llama "Trisomía"
(cb > S <= ca) entonces se llama "Marginal"
(S < cb) entonces se llama "Normal"
Algunas generalizaciones triviales que se encuentran dentro del alcance de esta técnica
Se pueden usar diferentes valores para los umbrales, tales como TP, FP, etc. Los procedimientos se pueden realizar en cualquier orden. Por ejemplo, se puede empezar con N y resolver para c, etc. Las distribuciones pueden depender de ff de manera que f1(x,N,ff), f2(x,N,ff), y/u otras variables. Las ecuaciones integrales anteriores se pueden resolver por referencia a tablas o por métodos informáticos iterativos. Puede estimarse un parámetro no de centralidad y la potencia se pueden leer de tablas estadísticas estándar. La potencia estadística y los tamaños de muestras pueden derivar del cálculo o la estimación de medias cuadradas estimadas. Se pueden usar distribuciones teóricas de forma cerrada, tales como f, t, t no centrada, normal, etc. o estimaciones (kernel u otras) para modelar las distribuciones f1, f2. Se puede usar el establecimiento de umbrales empíricos y la selección de parámetros usando curvas de eficacia diagnóstica (ROC) y cotejarse con la fracción fetal. Se pueden usar diversas estimaciones de la dispersión de la distribución (varianza, desviación absoluta media, intervalo intercuartílico, etc.). Se pueden usar diversas estimaciones del centro de distribución (media, mediana de, etc.). Se pueden usar pruebas estadísticas bilaterales a diferencia de unilaterales. La prueba de hipótesis simple puede reformularse como regresión lineal o no lineal. Se pueden usar métodos combinatorios, simulación (por ejemplo, monte carlo), maximización (por ejemplo, maximización de la esperanza), métodos iterativos u otros métodos independientemente o junto con los anteriores para establecer la potencia estadística o los umbrales.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método de determinación de la fracción de ácidos nucleicos fetales en una muestra materna que comprende una mezcla de ADN genómico fetal y materno, en donde la muestra materna es una muestra de plasma y en donde dicho ADN genómico fetal y materno es ADN sin células (ADNsc), comprendiendo dicho método:
(a) amplificar una pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos diana en dicha mezcla, comprendiendo cada una de dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana polimórficos al menos un sitio de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), de forma que se amplifiquen al menos 40 sitios de SNP diferentes de los ácidos nucleicos diana polimórficos, en donde al menos un sitio de SNP es informativo, y en donde dicha pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos diana se localiza en una pluralidad de cromosomas diferentes;
(b) realizar secuenciación masiva en paralelo de al menos una porción del producto amplificado obtenida en (a), en donde dicha secuenciación comprende proporcionar una pluralidad de marcas de secuencia; y
(c) basándose en dicha secuenciación, determinar dicha fracción, en donde:
(i) dicha fracción se determina basándose en el número total de marcas que cartografían un primer alelo y el número total de marcas que cartografían un segundo alelo en un sitio de SNP informativo contenido en un genoma de referencia; y
(ii) el sitio de SNP informativo se identifica por la diferencia en las secuencias alélicas y la cantidad de cada uno de los posibles alelos.
2. El método de la reivindicación 1, en donde cada una de dicha pluralidad de ácidos nucleicos diana polimórficos comprende un único sitio de SNP.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el genoma de referencia es un genoma de secuencias diana artificial que comprende las secuencias de los ácidos nucleicos diana polimórficos.
4. El método de la reivindicación 3, en donde el genoma de referencia es un genoma de referencia de SNP artificial.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la amplificación de la pluralidad de ácidos nucleicos diana polimórficos se lleva a cabo usando pares de cebadores cada uno de los cuales es capaz de amplificar una secuencia de ácidos nucleicos diana que comprende un sitio de SNP en una reacción de PCR múltiplex.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el método comprende combinar al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más conjuntos de cebadores en la misma reacción para cuantificar los ácidos nucleicos diana amplificados que comprenden al menos dos, al menos tres, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más sitios de SNP en la misma reacción de secuenciación.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el porcentaje de fracción fetal se calcula para al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más alelos informativos.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la fracción fetal es la fracción fetal promedio determinada para al menos 3 alelos informativos.
9. El método de la reivindicación 1, en donde dicha secuenciación es: (i) secuenciación por síntesis con terminadores reversible con colorante; (ii) secuenciación por ligación; o (iii) secuenciación de molécula única.
10. El método de la reivindicación 1, en donde dicha secuenciación comprende una amplificación.
11. El método de la reivindicación 1, en donde dicha secuenciación es secuenciación por hibridación, en donde la hibridación comprende poner en contacto la pluralidad de secuencias de polinucleótidos con una pluralidad de sondas de polinucleótidos, en donde cada una de la pluralidad de sondas de polinucleótidos se puede unir opcionalmente a un sustrato, y en donde el patrón de hibridación con las sondas de polinucleótidos se puede usar para determinar las secuencias de polinucleótidos presentes en la muestra.
12. El método de la reivindicación 11, en donde el sustrato es una superficie plana que comprende una matriz de secuencias de nucleótidos conocidas.
13. El método de la reivindicación 1, en donde dicho método es un método independiente del sexo del feto.
14. El método de la reivindicación 1, en donde dicha pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos diana contiene un número suficiente de sitios de SNP de forma que al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40 o más sean informativos.
15. El método de la reivindicación 1, en donde:
(i) la pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos se localiza en los cromosomas 1-22; o
(ii) la pluralidad de ácidos nucleicos polimórficos se localiza en una pluralidad de cromosomas diferentes distintos de los cromosomas 13, 18, 21, X o Y.
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