ES2870607T3 - Métodos y composiciones para tratar cáncer - Google Patents

Abstract

Una construcción de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; en donde el ligando comprende una hormona foliculoestimulante (FSH) o fragmento o modificación de la misma, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma se une al receptor de la hormona foliculoestimulante (FSHR) humana, y en donde la proteína quimérica es capaz de activar un linfocito T humano modificado que expresa la proteína quimérica.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para tratar cáncer

INCORPORACIÓN COMO REFERENCIA DE MATERIAL PRESENTADO EN FORMATO ELECTRÓNICO

El solicitante incorpora por este documento como referencia el material Listado de secuencias presentado en formato electrónico con la presente. Este archivo se llama "WST150PCT_ST25.txt", se creó el 28 de septiembre de 2015 y tiene 23 KB.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

A pesar de los avances en el abordaje quirúrgico y la quimioterapia, la supervivencia a los 5 años del cáncer de ovario apenas ha cambiado en los últimos 40 años. La presión inmunitaria contra la evolución del cáncer de ovario se provoca por linfocitos T infiltrantes de tumor. A pesar de la devastadora evolución del cáncer de ovario, los linfocitos T pueden ejercer espontáneamente una presión clínicamente relevante contra la progresión maligna, hasta tal punto que el patrón y la intensidad de la infiltración de linfocitos T pueda predecir el desenlace del paciente. Los cánceres de ovario son, por lo tanto, dianas inmunogénicas y óptimas para el diseño de novedosas inmunoterapias.

Durante los últimos años, la inmunoterapia ha surgido como una herramienta prometedora en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, la terapia con receptor quimérico para el antígeno (CAR) ha mostrado un resultado excelente como resultado del tratamiento de los tumores malignos hematológicos resistentes a la quimioterapia. Sin embargo, la escasez de antígenos específicos expresados en la superficie de células tumorales que no son compartidos con tejidos sanos ha evitado hasta la fecha el éxito de esta tecnología contra la mayoría de los tumores sólidos, que incluyen el cáncer de ovario. Hay una dificultad considerable en encontrar antígenos específicos en células tumorales que no están presentes en tejidos normales y provocan efectos secundarios intolerables. Además, el efecto inmunosupresor del microentorno tumoral de tumores sólidos altera en exceso las respuestas de linfocitos T antitumorales.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se describen en el presente documento composiciones y usos de las mismas que proporcionan herramientas eficaces y útiles para el tratamiento de cáncer, que incluyen tumores sólidos que se caracterizan por la expresión celular del receptor endocrino, la hormona foliculoestimulante (FSHR).

En un aspecto, una construcción de ácidos nucleicos comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de la hormona foliculoestimulante (FSH), cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a secuencias que proporcionan funciones activantes de linfocitos T. En un aspecto, las secuencias que proporcionan funciones activantes de linfocitos T son (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio de bisagra extracelular, un elemento espaciador, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; o (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un espaciador opcional y un ligando que se une a NKG2D. En una realización, el ligando es FSH que existe de forma natural, una subunidad individual de FSH, FSHp, un fragmento de FSH o de FSHp, o una versión modificada de cualquiera de las secuencias anteriores.

En otro aspecto, una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a (a) un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; o (b) un espaciador opcional, y un ligando que se une a NKG2D. En una realización, el ligando es FSH que existe de forma natural, una subunidad individual de FSH, FSHp, un fragmento de FSH o de FSHp, o una versión modificada de cualquiera de las secuencias anteriores.

En otro aspecto, un linfocito T humano modificado comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, unido a un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el linfocito T modificado es un linfocito T autólogo aislado del paciente al que se volverá a administrar el linfocito T una vez el linfocito T se modifica para contener una construcción de ácidos nucleicos como se describe en el presente documento. En otra realización, el linfocito T modificado es una plataforma alógena universal, es decir, un linfocito T heterólogo, para administración a cualquier número de pacientes una vez se modifica el linfocito T como se describe en el presente documento.

En una realización, el ligando es FSH que existe de forma natural, una subunidad individual de FSH, FSHp, un fragmento de FSH o de FSHp, o una versión modificada de cualquiera de las secuencias anteriores. Aún en otro aspecto, un uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto humano comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo, una composición como se describe en el presente documento, que incluye, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos, proteína quimérica o linfocito T modificado. En una realización, el uso comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un linfocito T humano modificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización.

Aún en otro aspecto, un uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto humano comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a cualquiera de (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio de bisagra extracelular, un elemento espaciador, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; o (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un espaciador opcional y un ligando que se une a NKG2D. En una realización, el ligando es FSH que existe de forma natural, una subunidad individual de FSH, FSHp, un fragmento de FSH o de FSHp, o una versión modificada de cualquiera de las secuencias anteriores.

Aún en otro aspecto, un método de tratamiento de un cáncer en un sujeto humano comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a cualquiera de (a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio de bisagra extracelular, un elemento espaciador, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; o (b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un espaciador opcional y un ligando que se une a un receptor de NKG2D asociado a tumor.

En otro aspecto, un método de tratamiento de cáncer de ovario comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un linfocito T humano modificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el ligando es FSH que existe de forma natural, una subunidad individual de FSH, FSHp, un fragmento de FSH o de FSHp, o una versión modificada de cualquiera de las secuencias anteriores. En otra realización, la paciente ha sido tratada quirúrgicamente para extraer los ovarios antes de la etapa de administración.

Otros aspectos y ventajas de estas composiciones y métodos se describen aún más en la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es un esquema de una construcción (es decir, una construcción de ácidos nucleicos o construcción de aminoácidos) que expresa el receptor endocrino quimérico (CER), proteína ligando de FSH, en linfocitos T.

La FIG. 2A es un gráfico de barras que muestra que los linfocitos T que contienen la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína quimérica que expresa el ligando para el receptor de FSH (FSHCER-CD8) responden en concreto a células tumorales B7F que expresan FSHR. Se incubaron conjuntamente linfocitos T positivamente transducidos (GFP+) que tienen el CER que se dirige a FSHR (FSHCER-CD8; patrón en damero pequeño) de la FIG.

1 o un CAR irrelevante que se dirige a mesotelina (K1) (patrón en damero grande) (1:20) durante 6 horas con células tumorales ID8-Defb29/Vegf-a (B7) transducidas con FSHCER-CD8 o un vector vacío (ID-8; CAR irrelevante). Se cuantificó IFN-y en sobrenadantes (pg/mL). Los linfocitos T modificados transfectados con la proteína quimérica FSH (o que se dirigen a FSHR) secretaron interferón-y, un marcador de activación, en respuesta a las células tumorales de ovario B7 de ratón que expresan en exceso FSHR. Los linfocitos T que se dirigen a mesotelina no secretan Interferóny frente a la estirpe de células tumorales B7F que expresa en exceso FSHR. Asimismo, el linfocito T que expresa la proteína quimérica FSH no se activa con una célula tumoral B7 que no expresa FSHR.

La FIG. 2B es un gráfico de barras que muestra el mismo análisis con una construcción FSHCER-CD4.

La FIG. 3 es un gráfico que muestra que los linfocitos T que contienen la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína quimérica que expresa el ligando para el receptor de FSH retrasa la progresión de células tumorales FSHR+ establecidas. Se administraron células de cáncer de mama singénicas A7C11 (B6) que expresan en exceso FSHR en el flanco de dos grupos de ratones (5 ratones/grupo). Cuatro días después de la administración de células tumorales, se transfirieron adoptivamente por vía intraperitoneal 106 linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR (■) o linfocitos T transducidos con vector vacío (CMSP) (▲). Se retrasa la evolución del crecimiento tumoral en los ratones tratados con los linfocitos T que tienen la proteína quimérica.

La FIG. 4A es un gráfico de barras que muestra la relación CD4/CD8 en las células esplénicas de ratones inyectados con la proteína quimérica o los linfocitos T de CMSP simulados en números iguales en el día 16 después de la administración de los linfocitos T que tienen la proteína quimérica o la proteína simulada.

La FIG. 4B es un gráfico de barras que muestra el número de células de linfocitos T adoptivamente transferidos de los ratones tratados como se describe en la FIG. 4A en el día 16.

La FIG. 4C es un gráfico de barras que muestra la cifra de CD4 individuales del bazo de las células esplénicas de los ratones de la FIG. 4A en el día 16.

La FIG. 4D es un gráfico que muestran las cifras de células CD8 de las células esplénicas de los ratones de la FIG. 4A en el día 16. Como se indica en los datos de citometría de flujo (datos gráficos no mostrados) de estas células del bazo dependientes de los marcadores de CD8 y CD4 (no mostrados), estas figuras también muestran que existe un aumento del número de células transfectadas, tanto CD4 como CD8, en el bazo de ratones administrados con los linfocitos T que tienen la proteína quimérica, en comparación con los linfocitos T que tienen la proteína simulada. Las FIG. 4A-4D muestran que existe un aumento del número de linfocitos T transferidos en el bazo de ratones inyectados con los linfocitos T que tienen la proteína quimérica de FSH en comparación con los de ratones inyectados con los linfocitos T que llevan la proteína simulada. También se detecta una mayor relación de CD4/CD8 en las células del bazo en las que se transfirieron los linfocitos T que llevan la proteína quimérica. Se encuentra que esta relación es un buen marcador de respuesta contra el cáncer en este modelo celular de cáncer de ovario.

La FIG. 5 es una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1 y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 para una construcción que comprende los siguientes componentes fusionados de la Tabla 1:

Tabla 1

La FIG. 6A es un esquema de una construcción quimérica de FSH-Letal, que muestra cómo se une a una célula tumoral y un linfocito Nk o un linfocito T (por ejemplo, un linfocito T CD8, un linfocito T gamma o un linfocito T NK).

La FIG. 6B es una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 3 y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 para una construcción que comprende los siguientes componentes fusionados de la Tabla 2:

Tabla 2

La FIG. 6C es una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 5 y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 para una construcción que comprende los siguientes componentes fusionados de la Tabla 3. La construcción tiene un MW de 45,87 kD, y emplea los sitios de enzima no de corte AscI, BamHI, BcgI, BclI, ClaI, HindIII, KpnI, MfeI, MluI, NcoI, NdeI, NotI, PacI, PmeI, PsiI, PvuI, SacII, SalI, SfiI, SgfI, SpeI, SphI, XbaI y XhoI.

Tabla 3

La FIG. 6D es una secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 7 y una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 para una construcción que comprende los siguientes componentes fusionados de la Tabla 4:

Tabla 4

La FIG. 7A es un gráfico de barras que muestra que células cancerosas adheridas ID8-Defb29/Vegf-a (B7F) transducidas con FSHR se incubaron durante 24 horas con linfocitos T que expresan CER de FSH o transducidos con vector vacío, CMSP (relación 1:40). Después de retirar las células no adheridas, se contaron las células negativas para azul de tripano en un hematocitómetro. Los linfocitos T-CER dirigidos a FSH eliminan eficazmente las células tumorales FSHR+.

La FIG. 7B es un gráfico de barras que muestra que A7C11F adheridas transducidas con FSHR transducidas con las construcciones dirigidas a FSH descritas en el presente documento eliminan eficazmente las células tumorales FSHR+. Se incubaron células cancerosas adheridas A7C11F transducidas con FSHR durante 24 horas con linfocitos T que expresan CER de FSH o transducidos con el vector vacío (relación 1:40). Después de eliminar las células no adheridas, se contaron las células negativas para azul de tripano en un hematocitómetro. Los linfocitos T de CER dirigidos a FSH eliminan eficazmente las células tumorales FSHR+.

La FIG. 8 es un esquema que muestra variantes de las construcciones de receptor endocrino quimérico (CER) de FSH-T descritas en el presente documento.

La FIG. 9 es un gráfico que muestra que los linfocitos T -CER FSH humana destruyen células tumorales de ovario de un modo dependiente de la dosis. Los linfocitos T humanos HLA-A2+ se expandieron con ConA, se infectaron por centrifugación con hFSHCER en CMSP con retronectina o se transdujeron con vector vacío a las 20 y 44 horas, y se mantuvieron a 0,5-1 millón de células/mL con 1 ug/mL de IL-7 y 20 U/mL de IL-2. En el día 7, se clasificaron los linfocitos T de CER y de control en función de la expresión de GFP y se dejaron reposar durante 18 horas, antes de sembrarse en placas con células de cáncer de ovario OVCAR-3 humanas HLA-A2+ (10000 por pocillo; espontáneamente FSHR+) en las relaciones indicadas entre efectoras (E) y diana (D). Seis horas después de establecer el cocultivo, las células se tiñeron con anexina V y 7AAD y se analizó la citotoxicidad por citometría de flujo. Se calculó el porcentaje de lisis específica como (muertas experimentales - muertas espontáneas)/(muertas máximo -muertas espontáneas) x 100 %.

La FIG. 10 es un gel de Western que muestra que los especímenes de carcinoma de ovario humano avanzado expresan niveles variables de FSHR. Se analizó la expresión de proteínas FSHR por transferencia Western (Santa Cruz N° H-190) en 6 especímenes de carcinoma de ovario avanzado humano no seleccionado y se comparó con la de células OVCAR3 sensibles a linfocitos T-CER dirigidos a FSH. Ab contra p-actina, Sigma#A5441

La FIG. 11 es un gráfico que muestra que los linfocitos T-FSHCER suprimen la evolución de los tumores de ovario ortotópico que expresan fshr. Los linfocitos T que tienen CAR que se dirigen a FSHR (FSH-CER) o linfocitos T transducidos con vector vacío (CMSP) idénticamente expandidas se administraron por vía intraperitoneal en los días 7 y 14 después de la exposición intraperitoneal a células tumorales ID8-defb29/vegf-a transducidas con FSHR (n=5 ratones/grupo). Se comparó la evolución maligna.

La FIG. 12 es un gráfico que muestra que un linfocito T-CER de FSH humana alógeno o heterólogo modificado generado usando células TALL-103/2 destruye células tumorales de ovario de un modo dependiente de la dosis. Las células TALL-103/2 se transdujeron con hFSHCER en CMSP y se mantuvieron en cultivo con 20 U/mL de IL-2. Células TALL-103/2 transducidas con CER de FSH (■) o transducidas con vector vacío (▲) se privaron de IL-224 h antes de ser incubadas con células de cáncer de ovario OVCAR-3 humanas FSHR+ transducidas con luciferasa (10000 por pocillo) en las relaciones indicadas entre efectoras (E) y diana (D). Cuatro horas después de establecer el cocultivo, las células se lisaron y se cuantificó la señal de luciferasa. Se calculó el porcentaje de lisis específica como (muertas experimental - muertas espontáneas)/(muertas máximo - muertas espontáneas) x 100 %.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se proporcionan en el presente documento composiciones y usos que provocan inmunidad antitumoral protectora contra, y previenen la reaparición de, por ejemplo, cáncer de ovario u otros cánceres caracterizados por células tumorales que tienen el receptor de FSH (FSHR), por ejemplo, células de cáncer de próstata52 y lesiones de tumor metastásico51. Eligiendo los receptores de hormona aprovechando los ligandos endógenos como motivos de elección, se vencen los retos que han evitado el éxito de ciertas tecnologías de inmunoterapia contra tumores epiteliales.

Los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención y por referencia a los textos publicados, que proveen a un experto en la técnica de una guía general a muchos de los términos usados en la presente solicitud. Las siguientes definiciones se proporcionan para claridad solo y no pretenden limitar la invención reivindicada.

La hormona foliculoestimulante (FSH) es una hormona importante de la reproducción de los mamíferos producida principalmente en la glándula pituitaria anterior. Esta hormona ejerce su función biológica normal uniéndose al receptor de la hormona foliculoestimulante (FSHR) de la membrana plasmática y estimulando la maduración folicular y la producción de estrógeno en las mujeres. En los hombres, la interacción de FSH y FSHR estimula la proliferación de células de Sertoli y el mantenimiento de la espermatogénesis normal. La hormona FSH que existe de forma natural es un heterodímero formado por dos subunidades, una subunidad alfa y una beta. La subunidad alfa también se denomina CGa, y es común a la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante tiroidea (TSH). Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de las subunidades alfa y beta de FSH para los seres humanos y otras especies de mamífero son públicamente conocidas y accesibles.

El FSHR es un receptor de hormona que se expresa selectivamente en mujeres en las células de la granulosa del ovario y en bajos niveles en el endotelio del ovario. Y, lo que es más importante, este receptor de superficie se expresa en el 50-70 % de los carcinomas de ovario, pero no en el cerebro, ya que la retroalimentación negativa depende de la detección de estrógeno. Dado que la ooforectomía es un procedimiento convencional en el tratamiento de cáncer de ovario, la selección de FSHR no debe provocar daño a los tejidos sanos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "un ligando que comprende una secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR" incluye la secuencia de FSH de longitud completa que existe de forma natural de un mamífero adecuado. El ligando comprende una secuencia de FSH suficiente para permitir la unión entre el ligando y el FSHR por la afinidad natural entre la secuencia de la hormona y el receptor. El ligando no es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y no se une al receptor de ese modo. Si el ligando es una secuencia de FSHp-FSHa que existe de forma natural, por ejemplo, de longitud completa, o un fragmento que existe de forma natural de la misma, el ligando no induce una reacción inmunogénica en el sujeto al que se administra. Si el ligando comprende una secuencia de FSH de longitud completa modificada o fragmento de la secuencia de FSH que existe de forma natural, en ciertas realizaciones, las modificaciones no son suficientes para inducir una reacción inmunogénica fuerte en el sujeto al que se administra el ligando.

En una realización, un ligando que comprende una secuencia de FSH es una FSH humana de longitud completa que existe de forma natural, por ejemplo, la secuencia de FSHp unida a la secuencia de FSHa. En otra realización, un ligando que comprende una secuencia de FSH es una secuencia de FSHp modificada unida a una secuencia de FSHa que existe de forma natural. En otra realización, un ligando que comprende una secuencia de FSH es una secuencia de FSHp modificada unida a una secuencia de FSHa/CGa modificada. En otra realización, el ligando es una secuencia de FSHp que existe de forma natural unida a una secuencia de FSHa modificada. En otra realización, donde el sujeto mamífero es un humano y el tumor diana es un tumor humano, una secuencia de FSH adecuada es FSH humana o versiones modificadas de la secuencia humana. Alternativamente, el ligando es una FSH modificada, tal como una secuencia de FSHp que existe de forma natural o modificada unida por un espaciador opcional a una secuencia de FSHa que existe de forma natural o modificada. En otra realización, el ligando es una única subunidad FSHp que existe de forma natural o modificada sola. En otra realización, el ligando es una subunidad FSHp que existe de forma natural unida por una secuencia espaciadora opcional a una segunda secuencia de FSHp modificada. En otra realización, el ligando es una subunidad FSHp modificada unida por una secuencia espaciadora opcional a una segunda secuencia de FSHp que existe de forma natural.

En otra realización más, el ligando comprende un fragmento de una secuencia de FSH que existe de forma natural o modificada. En otra realización más, el ligando comprende un fragmento de una secuencia de FSHp que existe de forma natural o modificada. En otra realización, el ligando es una subunidad FSHp que existe de forma natural unida a una subunidad FSHa modificada o fragmento de la misma. En otra realización, el ligando es una subunidad FSHp modificada o fragmento de la misma unida a una subunidad FSHa que existe de forma natural. En otra realización, el ligando comprende un fragmento de una secuencia de FSHp que existe de forma natural o modificada unidos juntos.

Por "que existe de forma natural" se indica que la secuencia es una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos nativa que ocurre en el mamífero seleccionado, que incluye cualquier variante que existe de forma natural en diversas posiciones de ácidos nucleicos y/o de aminoácidos en las secuencias que ocurren entre diversos miembros de las especies de mamífero.

Por "modificada" se indica que la secuencia de referencia, por ejemplo, FSH o un fragmento de la misma o FSHp unida a la secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos de FSHa, o cualquier secuencia de subunidad individualmente se ha manipulado deliberadamente. Las modificaciones adecuadas incluyen el uso de fragmentos de las secuencias más cortos que la hormona de longitud completa que existe de forma natural. Dichas modificaciones incluyen cambios en las secuencias de ácidos nucleicos para incluir codones preferidos, que pueden codificar el mismo aminoácido o uno relacionado con el que ocurre en la secuencia de aminoácidos nativa. Las modificaciones también incluyen cambios en las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos para introducir cambios de aminoácidos conservativos, por ejemplo, un cambio de un aminoácido cargado o neutro por un aminoácido de carga diferente. Dichas modificaciones también pueden incluir el uso de FSHp con o sin secuencia de FSHa en una fusión deliberadamente creada con otras secuencias con las que FSHp o FSHa no ocurren naturalmente. Las modificaciones también incluyen la unión de las subunidades usando secuencias espaciadoras deliberadamente insertadas o fragmentos de unión de las subunidades juntas o uniendo fragmentos repetitivos o subunidades juntos en fusiones que no existen de forma natural.

Como un ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de FSHp humana que existe de forma natural que incluye la secuencia señal comprende o consiste en los ácidos nucleicos 1 -387 de SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos es aa 1-129 de SEQ ID NO: 2. La secuencia señal de FSHp comprende o consiste en sí misma en los ácidos nucleicos 1 -54 de SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos es aa 1-18 de SEQ ID NO: 2 La FSHp madura comprende o consiste en los ácidos nucleicos 55-387 de SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos es aa 19-129 de SEQ ID NO: 2.

Como otro ejemplo para su uso en los métodos y las composiciones en el presente documento, una secuencia de ácidos nucleicos de FSHp humana madura comprende o consiste en los ácidos nucleicos 4-336 de SEQ ID NO: 3 o 7, y la secuencia de aminoácidos es aa 2-112 de SEQ ID NO: 4 u 8. Como otro ejemplo para su uso en los métodos y las composiciones en el presente documento, un fragmento útil de una secuencia de ácidos nucleicos de FSHp humana comprende o consiste en los ácidos nucleicos 55-99 de FSHp SEQ ID NO: 1, los ácidos nucleicos 153-213 de FSHp SEQ ID NO: 1, los ácidos nucleicos 207-249 de FSHp SEQ ID NO: 1, o los ácidos nucleicos 295-339 de FSHp SEQ ID NO: 1. Como otro ejemplo para su uso en los métodos y las composiciones en el presente documento, un fragmento útil de una secuencia de aminoácidos de FSHp humana comprende o consiste en los aminoácidos 19­ 33 de FSHp SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 51-71 de FSHp SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 69-83 de FSHp SEQ ID NO: 2, o los aminoácidos 99-113 de FSHp SEQ ID NO: 2.

En realizaciones en las que el ligando también comprende una secuencia de FSHa, la secuencia de ácidos nucleicos de FSHa humana que existe de forma natural comprende o consiste en los ácidos nucleicos 433-801 de SEQ ID NO: 1, y la secuencia de aminoácidos es aa 145-267 de SEQ ID NO: 2. En otra realización para su uso en los métodos y las composiciones en el presente documento, una secuencia de ácidos nucleicos de FSHa humana comprende o consiste en los ácidos nucleicos 382-750 de SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoácidos es aa 128-250 de SEQ ID NO: 4. En otra realización para su uso en los métodos y las composiciones en el presente documento, un fragmento de una secuencia de ácidos nucleicos de FSHa humana comprende o consiste en los ácidos nucleicos 382-657 de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos es aa 128-219 de SEQ ID NO: 8.

Se debe entender que las modificaciones de aminoácidos o las modificaciones de ácidos nucleicos como se ha descrito anteriormente aplicadas a estos fragmentos también son ligandos útiles en este método. El ligando no se une a FSHR en un anticuerpo o fragmento de complejo anticuerpo-antígeno. Como se ha descrito anteriormente, los ligandos descritos en el presente documento se unen usando la afinidad natural entre la hormona natural (o una versión modificada de una hormona natural) y su receptor. Debido a que el ligando es una hormona natural o una versión modificada de la misma, se diseña para evitar la inducción de una respuesta antigénica en el sujeto.

Los términos "conector" y "espaciador" se usan indistintamente y se refieren a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de longitud suficiente para separar dos componentes y/o se refiere al péptido en sí. La composición y la longitud de un conector se pueden seleccionar dependiendo del uso que se le dé al conector. En una realización, un conector de aminoácidos usado para separar FSHa y FSHp (ya sea secuencias que existen de forma natural o secuencias modificadas o fragmentos) tiene entre 2 y 70 aminoácidos de longitud, que incluye cualquier número dentro de ese intervalo. Por ejemplo, en una realización, el conector tiene 10 aminoácidos de longitud. En otra realización, el conector tiene 15 aminoácidos de longitud. En otra realización más, el conector tiene 25, 35, 50 o 60 aminoácidos de longitud. Véanse, por ejemplo, los espaciadores/conectores identificados en las secuencias descritas en las Tablas 1­ 4 anteriores.

Correspondientemente, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el conector o espaciador comprenden de desde 6 hasta 210 nucleótidos de longitud, que incluyen todos los valores en ese intervalo. En ciertas realizaciones, el conector comprende múltiples restos de glicina o ácidos nucleicos que los codifican. En ciertas realizaciones, el conector de aminoácido comprende múltiples restos de serina o ácidos nucleicos que los codifican. En otras realizaciones, el conector comprende múltiples restos de timina o ácidos nucleicos que los codifican. En otra realización más, los conectores y los espaciadores comprenden cualquier combinación de los restos serina, timina y glicina. También se pueden diseñar fácilmente otros conectores para su uso.

Como se usa en el presente documento, un "vector" comprende cualquier elemento genético que incluye, sin limitación, ADN desnudo, un fago, transposón, cósmido, episoma, plásmido, bacteria, o un virus, que expresa, o hace que se exprese, una construcción deseada de ácidos nucleicos.

Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a un mamífero masculino o femenino, preferentemente un ser humano. Sin embargo, el sujeto mamífero también puede ser un animal veterinario o de granja, un animal doméstico o mascota, y animales usados normalmente para investigación clínica. En una realización, el sujeto de estos métodos y las composiciones es un ser humano.

El término "cáncer", como se usa en el presente documento, significa cualquier enfermedad, afección, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por replicación o crecimiento celular no regulado como se conoce en la técnica. Una "célula cancerosa" es una célula que se divide y reproduce anormalmente con crecimiento incontrolado. Esta célula se puede separar del sitio de su origen (por ejemplo, un tumor) y viajar a otras partes del cuerpo y establecerse en otro lugar (por ejemplo, otro tumor), en un proceso denominado metástasis. Un "tumor" es una masa de tejido anormal que resulta de la excesiva división celular que es incontrolada y progresiva, y también se denomina una neoplasia. Los tumores pueden ser o benignos (no cancerosos) o malignos. Las composiciones y los métodos descritos en el presente documento son útiles para el tratamiento de células cancerosas y tumorales, es decir, tanto tumores malignos como benignos, mientras que las células que se van a tratar expresan FSHR. Así, en diversas realizaciones de los métodos y las composiciones descritas en el presente documento, el cáncer puede incluir, sin limitación, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, cáncer pancreático, cáncer de riñón, cáncer de cuello uterino, cáncer de hígado, cáncer de ovario y cáncer testicular.

Como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "diluyente" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, adyuvantes y similares compatibles con la administración a los seres humanos. En una realización, el diluyente es solución salina o solución salina tamponada. El término "un" o "una" se refiere a uno o más, por ejemplo, se entiende que "un linfocito T antitumoral" representa uno o más linfocitos T antitumorales. Por lo tanto, los términos "un" (o "una"), "uno o más," y "al menos uno" se usan indistintamente en el presente documento. El término "aproximadamente" se usa en el presente documento para modificar un valor de referencia y para incluir todos los valores ± 0,01 % de ese valor hasta valores de ± 10 % del valor de referencia, y todos los números dentro de y que incluyen estos puntos extremos, por ejemplo, ± 0,5 %, ± 1 %, ± 5 %, etc. Las diversas realizaciones en la memoria descriptiva se presentan usando el lenguaje "que comprende", que incluye otros componentes o etapas del método. Cuando se usa "que comprende", se debe entender que las realizaciones relacionadas incluyen descripciones que usan la terminología "que consiste en", que excluye otros componentes o etapas de método, y la terminología "que consiste esencialmente en", que excluye cualquier componente o etapa de método que cambia sustancialmente la naturaleza de la realización o invención.

En una realización, la presente invención proporciona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH que se une a FSHR humano, unido a secuencias de ácidos nucleicos que codifican funciones activantes de linfocitos T. Como se ha descrito anteriormente con más detalle, en ciertas realizaciones, el ligando es una FSH que existe de forma natural con ambas subunidades, una subunidad individual de FSH, una subunidad FSHp solo, un FSHa/CGa o fragmento de FSHp, o una versión modificada de las secuencias anteriores.

En una realización, las funciones activantes de linfocitos T se pueden proporcionar uniendo el ligando anteriormente indicado con secuencias de ácidos nucleicos que codifican componentes útiles en el diseño de receptores quiméricos para el antígeno (CAR) conocidos. Véase, por ejemplo, Sadelain, M et al., "The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design", abril de 2013, Cancer Discov. 3(4):388-398; publicación de solicitud de patente internacional WO2013/044255, publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° US 2013/0287748, y otras publicaciones que se refieren al uso de dichas proteínas quiméricas. Estas publicaciones se incorporan como referencia para proporcionar información referente a diversos componentes útiles en el diseño de algunas de las construcciones descritas en el presente documento. Dichos linfocitos T-CAR son linfocitos genéticamente modificados que expresan un ligando que les permite reconocer un antígeno de elección. Después del reconocimiento del antígeno, estos linfocitos T modificados se activan por dominios de señalización que convierten estos linfocitos T en potentes destructores celulares. Una ventaja con respecto a los linfocitos T endógenos es que no están restringidos por el MHC, que permite que estos linfocitos T venzan una táctica de inmunovigilancia usada en muchas células tumorales que reducen la expresión de MHC19.

Por ejemplo, dichas funciones activantes de linfocitos T se pueden proporcionar uniendo el ligando por espaciadores opcionales a dominios transmembranarios, regiones de señalización coestimulante y/o endodominios de señalización.

Así, una realización de una secuencia de ácidos nucleicos útil en los métodos descritos en el presente documento se ejemplifica en la FIG. 5 SEQ ID NO: 1 y la Tabla 1 en el presente documento. La secuencia de ácidos nucleicos o construcción de CER comprende un ligando formado de una secuencia de FSHp humana que existe de forma natural formada de la secuencia señal de FSHp humana de 18 aminoácidos y la FSHp madura de 120 aminoácidos, unida a un espaciador de 15 aminoácidos, y a la secuencia de FSHa de 123 aminoácidos que existe de forma natural. La construcción de CER también incluye otros componentes, es decir, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región intracelular humana y un endodominio de señalización. En el caso de la construcción de la FIG. 5, por ejemplo la región de bisagra y los dominios transmembranarios son de CD8a humano, la región intracelular humana es de 4-1BB y el dominio de señalización es el dominio CD3 Z humano.

Otras realizaciones útiles como dicha construcción de ácidos nucleicos pueden incluir esa construcción con un ligando diferente, tal como uno de los ligandos descritos anteriormente. En una realización, la secuencia de FSHa en la misma construcción descrita en la FIG. 5 puede ser una secuencia acortada que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de los nts 382-657 de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de aa 128-219 de SEQ ID NO: 8. Aún otra realización del ligando usado en la construcción de FIG. 5 puede comprender la secuencia de FSHp sin los aminoácidos 2-18 de la secuencia señal de SEQ ID NO: 2. Las realizaciones similares a las de la construcción de ácidos nucleicos de FIG.

5 se pueden diseñar fácilmente sustituyendo las porciones de ligando de la Tabla 1 con cualquiera de los ligandos, modificados, que existen de forma natural o fragmentos tratados anteriormente.

Otras realizaciones de una construcción de ácidos nucleicos similar a la de la FIG. 5 pueden emplear diferentes componentes, tales como los detallados en Sadelain et al., citado anteriormente, o las publicaciones de patente, incorporadas como referencia en el presente documento. Por ejemplo, donde se emplea un dominio de bisagra, otros dominios de bisagra que existen de forma natural o sintéticos, que incluyen una región de bisagra de inmunoglobulina, tal como la de la IgG 1, la región CH²CH³ de inmunoglobulina, fragmentos de CD3, etc. Otras realizaciones de una construcción de ácidos nucleicos similar a las de la FIG. 5 pueden emplear un dominio transmembranario diferente que existen de forma natural o sintético obtenido de un receptor de linfocitos T. Diversas proteínas transmembranarias contienen dominios útiles en las construcciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, se ha indicado que son útiles los dominios transmembranarios obtenidos de los receptores de linfocitos T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 o CD154.

Otras realizaciones de una construcción de ácidos nucleicos similar a la de la FIG. 5 pueden emplear una región intracelular diferente que existe de forma natural o sintética, que incluyen, entre otras conocidas en la técnica, una región de señalización coestimulante. La región de señalización coestimulante puede ser el dominio intracelular de una molécula de la superficie celular (por ejemplo, una molécula coestimulante), tal como CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, Ic Os , antígeno-1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3. Véanse, por ejemplo, otras enumeradas en las publicaciones citadas anteriormente.

Otras realizaciones de una construcción de ácidos nucleicos similar a la de la FIG. 5 puede emplear un dominio de señalización citoplásmico diferente que existe de forma natural o sintético que incluye, entre otros conocidos en la técnica, los derivados de CD3 Z, TCR Z, FcR y, FcR p, CD3y, CD35, CD3 £, CD5, Cd 22, 25 CD79a, CD79b y CD66d, entre otros.

Dadas las enseñanzas proporcionadas en el presente documento y usando la información conocida en la técnica, se puede diseñar cualquier número de variaciones de las construcciones de ácidos nucleicos, tales como la FIG. 5, para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

Así, otro componente descrito en el presente documento es una proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSHp, o una modificación o fragmento de dicha secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a péptidos o proteínas que tienen funciones de activación de linfocitos T. Dicha proteína quimérica comprende un ligando como se ha descrito anteriormente que se une a FSHR humano unido a un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización. Las proteínas quiméricas a modo de ejemplo están codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente. Una realización de dicha proteína quimérica es la de la FIG. 5 SEQ ID NO: 2. Otras se diseñan fácilmente empleando los diversos ligandos identificados en el presente documento, por ejemplo, uno o más de los fragmentos de FSHp identificados con detalle anteriormente, o los otros ligandos de unión a FSHR identificados en el presente documento en lugar del ligando específico ejemplificado en SEQ ID NO: 2.

En otra realización, una construcción de CER útil es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el ligando que comprende una secuencia de FSHp, o una modificación o fragmento de dicha secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR humano, como se ha descrito anteriormente, unida a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un ligando que se une a un receptor de NKG2D asociado a tumor. Véase, por ejemplo, la FIG. 6A. Dicho ligando NKG2D se llama Letal o ULBP4. Letal está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos nts 796-1365 de SEQ ID NO: 3 y tiene la secuencia de aminoácidos de aa 266-454 de SEQ ID NO: 4. Véase, por ejemplo, Conejo-Garcia, J et al., "Letal, A Tumor-Associated NKG2D Immunoreceptor Ligand, Induces Activation and Expansion of Effector Immune Cells" julio de 2003, Canc. Biol. & Ther., 2(4): 446-451; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 20060247420, incorporada como referencia en el presente documento. Otros ligandos de NKG2D o modificaciones de aminoácidos, modificaciones al nivel de ácidos nucleicos o fragmentos funcionales de la secuencia Letal se pueden sustituir en esta descripción por las secuencias Letal ejemplificadas.

Además, estos ligandos de unión a FSHR y ligando NKG2D se unen opcionalmente por un espaciador o conector adecuado como se ha descrito anteriormente.

Los ejemplos específicos de dicha construcción quimérica se proporcionan en la FIG. 6A, FIG. 6B, Tabla 2, SEQ ID NO: 3, FIG. 6D, Tabla 4, SEQ ID NO: 7 y FiG. 8. En la realización de la Fig. 7B, el ligando de unión a FSHR está formado por una secuencia de FSHp humana que existe de forma natural formada por un único aminoácido de metionina de la secuencia señal, seguido por la FSHp madura de 120 aminoácidos, unida a un espaciador de 15 aminoácidos, a su vez unida a la secuencia de FSHa de 123 aminoácidos que existe de forma natural. Este ligando se une a su vez a Letal por otro espaciador de 15 aminoácidos. En la realización de la FIG. 6D, el ligando de unión a FSHR está formado por una secuencia de FSHp humana que existe de forma natural formada por un único aminoácido de metionina de la secuencia señal, seguida por la FSHp madura de 120 aminoácidos, unida a un espaciador de 15 aminoácidos, a su vez se une a la secuencia de FSHa modificada, es decir, un fragmento de aminoácidos 128-219 de SEQ ID NO: 8, codificado por los nucleótidos 382-657 de SEQ ID NO: 7. Este ligando se une a su vez a Letal por otro espaciador de 15 aminoácidos.

Otras realizaciones útiles como dicha construcción de ácidos nucleicos pueden incluir las construcciones de las FIG. 6B y 6D con una secuencia codificante de ligando diferente, tal como una secuencia que codifica uno de los ligandos descritos anteriormente. En una realización, la secuencia de FSHa en la misma construcción descrita en la FIG. 6B puede ser una copia individual o múltiple de FSHp de longitud completa con o sin una secuencia señal. Como otro ejemplo, la construcción de la FIG. 6B o 6D puede contener un ligando formado por un fragmento de una FSHp humana codificada por la secuencia de ácidos nucleicos que comprende o que consiste en los ácidos nucleicos 55-99 de FSHp SEQ ID NO: 1, los ácidos nucleicos 153-213 de FSHp SEQ ID NO: 1, los ácidos nucleicos 207-249 de FSHp SEQ ID NO: 1, o los ácidos nucleicos 295-339 de FSHp SEQ ID NO: 1. El ligando puede estar formado por estos fragmentos solo, en combinación o sustituido por la FSHp de longitud completa y así se fusiona por un conector con la secuencia de FSHa de FIG. 6B o 6D. Las realizaciones similares a las de la construcción de ácidos nucleicos de la FIG. 6B o 6D pueden ser fácilmente diseñadas sustituyendo las porciones de ligando de la Tabla 2 o 4 con cualquiera de los ligandos, modificados, que existen de forma natural o fragmentos tratados anteriormente.

Como otro aspecto, por lo tanto, es una proteína quimérica o biespecífica codificada por las secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente y que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSHp, o una modificación o fragmento de dicha secuencia de FSH como se describe en el presente documento que se une a FSHR humano, unida a un ligando que se une a NKG2D. Estas proteínas son principalmente útiles en forma de una proteína, y funcionan in vivo para juntar linfocitos endógenos y células tumorales FSHR+.

En aún otros aspectos, se proporcionan vectores recombinantes que tienen las construcciones de ácidos nucleicos anteriormente descritas. Las construcciones de ácidos nucleicos pueden ser llevadas en, y se pueden expresar proteínas quiméricas en, sistemas basados en plásmidos, de los que muchos están comercialmente disponibles, o en vectores virales recombinantes replicantes o no replicantes. Las secuencias de ácidos nucleicos tratadas en el presente documento se pueden expresar y producir usando dichos vectores in vitro en células hospedadoras deseadas o in vivo. Así, en una realización, el vector es un virus no patógeno. En otra realización, el vector es un virus no replicante. En una realización, un vector viral deseable puede ser un vector retroviral, tal como un vector lentiviral. En otra realización, un vector deseable es un vector adenoviral. En otra realización adicional, un vector adecuado es un vector viral adeno-asociado. Se prefieren, en general, adenovirus, virus adenoasociados y lentivirus debido a que infectan células que se dividen activamente, así como en reposo y diferenciadas, tales como las células madre, macrófagos y neuronas. Están disponibles una variedad de cepas de adenovirus, lentivirus y de AAV de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia, o disponibles a petición de una variedad de fuentes comerciales e institucionales. Además, están disponibles secuencias de muchas de dichas cepas de una variedad de bases de datos que incluyen, por ejemplo, PubMed y GenBank.

En una realización, se usa un vector lentiviral. Entre los vectores útiles están los virus de la anemia infecciona equina y el virus de la inmunodeficiencia felina, así como bovina, y los vectores basados en el VIH. Una variedad de vectores de lentivirus útiles, así como los métodos y manipulaciones para generar dichos vectores para su uso en la transducción de células y la expresión de genes heterólogos, por ejemplo, N Manjunath et al, 2009 Adv Drug Deliv Rev., 61(9): 732-745; Porter et al., N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):725-33), entre otros.

En otra realización, el vector usado en el presente documento es un vector de adenovirus. Dichos vectores se pueden construir usando ADN de adenovirus de uno o más de cualquiera de los serotipos de adenovirus conocidos. Véase, por ejemplo, T. Shenk et al., Adenoviridae: The Viruses and their Replication", Cap. 67, en FIELD’S VIROLOGY, 6a ed., editado por B.N Fields et al., (Lippincott Raven Publishers, Philadelphia, 1996), pág. 111-2112; documento de patente 6.083.716, que describe el genoma de dos adenovirus de chimpancé; patente de EE. UU. N° 7.247.472; documento de patente WO 2005/1071093, etc. Un experto en la técnica puede construir fácilmente un vector de adenovirus adecuado para llevar y expresan una construcción de nucleótidos como se describe en el presente documento. En otra realización, el vector usado en el presente documento es un vector de virus adenoasociado (AAV). Dichos vectores se pueden construir usando ADN de AAV de uno o más de los serotipos de AAV conocidos. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 7.803.611; patente de EE. UU. N° 7.696.179, entre otras.

En otra realización más, el vector usado en el presente documento es un vector bacteriano. En una realización, el vector bacteriano es Listeria monocytogenes. Véase, por ejemplo, Lauer et al., Infect. Immunity, 76(8):3742-53 (agosto de 2008). Así, en una realización, el vector bacteriano es vivo atenuado o fotoquímicamente inactivado. La proteína quimérica se puede expresar recombinantemente por las bacterias, por ejemplo, por un plásmido introducido en las bacterias, o integrado en el genoma bacteriano, es decir, por recombinación homóloga.

Estos vectores también incluyen elementos de control convencionales que permiten la transcripción, la traducción y/o la expresión de las construcciones de ácidos nucleicos en una célula transfectada con el vector plasmídico o infectada con el vector viral. Se conocen en la técnica un gran número de secuencias de control de la expresión, que incluyen promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido, y se pueden utilizar. En una realización, el promotor se selecciona basándose en el vector elegido. En otra realización, cuando el vector es un lentivirus, el promotor es U6, H1, el gen IE del CMV, EF-1a, ubiquitina C o el promotor de fosfoglicero-cinasa (PGK). En otra realización, cuando el vector es un AAV, el promotor es un RSV, U6 o promotor del CMV. En otra realización, cuando el vector es un adenovirus, el promotor es RSV, U6, CMV, o promotores de HI. En otra realización, cuando el vector es Listeria monocytogenes, el promotor es un promotor de hly o actA. Aún otras secuencias de control de la expresión convencionales incluyen marcadores de selección o genes indicadores, que pueden incluir secuencias que codifican resistencia a geneticina, higromicina, ampicilina o purimicina, entre otros. Otros componentes del vector pueden incluir un origen de replicación. La selección de estos y otros promotores y elementos de vector son convencionales y están disponibles muchas de dichas secuencias (véanse, por ejemplo, las referencias citadas en el presente documento).

Estos vectores se generan usando las técnicas y secuencias proporcionadas en el presente documento, junto con técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Dichas técnicas incluyen técnicas de clonación convencional de ADNc, tales como las descritas en los textos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY), el uso de secuencias de oligonucleótidos de solapamiento, la reacción en cadena de la polimerasa y cualquier método adecuado que proporcione la secuencia de nucleótidos deseada.

Así, en una realización, usando la información enseñada en el presente documento y públicamente disponible y componentes y técnicas de construcción de vectores conocidos, un experto en la técnica puede construir un vector viral (o plásmido) que expresa la construcción de ácidos nucleicos deseada. Las proteínas quiméricas codificadas por estas construcciones de ácidos nucleicos se pueden expresar in vitro, o ex vivo, en células hospedadoras o expresar in vivo por administración a un sujeto mamífero. Alternativamente, las proteínas quiméricas se pueden generar sintéticamente por metodologías de síntesis química conocidas. Un experto en la técnica puede seleccionar el método apropiado para producir estas proteínas quiméricas dependiendo de los componentes, la eficiencia de las metodologías y el uso previsto, por ejemplo, tanto para la administración como proteínas, ácidos nucleicos o en linfocitos T adoptivos, como de otro modo para realizar el resultado terapéutico deseado.

En otro aspecto más, se proporciona un linfocito T humano modificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando que se une a FSHR humano, unido a secuencias de ácidos nucleicos que codifican funciones activantes de linfocitos T. En una realización, estas últimas secuencias de ácidos nucleicos codifican un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un linfocito T modificado es un linfocito T que se ha transducido o transfectado con uno de los vectores anteriormente descritos que llevan las construcciones de ácidos nucleicos que codifican las proteínas quiméricas. Deseablemente, el linfocito T es un linfocito T primario, un linfocito T CD8 (citotóxico), o un linfocito T NK u otro linfocito T obtenido del mismo sujeto mamífero en el que se administra el linfocito T modificado o de otro miembro de la especie de mamífero. En una realización, el linfocito T es un linfocito T humano autólogo o linfocito T citolítico natural (NK) obtenido del sujeto o de un donante compatible para trasplante de médula ósea para el sujeto. Otros linfocitos T adecuados incluyen linfocitos T obtenidos de tumores extirpados, un linfocito T policlonal o monoclonal reactivo con tumor. El linfocito T se obtiene, en general, por aféresis, y se transfecta o transduce con la construcción de ácidos nucleicos seleccionada para expresar la proteína quimérica in vivo.

Aún otros linfocitos T adecuados incluyen linfocitos T alógenos o heterólogos útiles como plataforma universal de linfocitos T que lleva las construcciones de ácidos nucleicos descritas en el presente documento. En una realización, se puede emplear un linfocito T citotóxico humano. Las células TALL-104 y TALL-103/2 son linfocitos sensibles a CD3, CD3+TCRap+ y CD3+TCRyó+, respectivamente, derivadas de leucemia infantil de linfocitos T que muestra actividad tumoricida mediada por receptores de linfocitos NK no restringidos por el complejo mayor de histocompatibilidad, principalmente dependiente de NKG2D. 596061 Las células TALL muestran un amplio intervalo de reactividad con la diana tumoral que es dependiente de NKG2D. Se han usado células TALL-104 irradiadas para el tratamiento de cáncer de mama y de ovario metastásico debido a su actividad citolítica espontánea (de tipo NK) y seguridad.

Estos linfocitos T modificados, tanto autólogos como endógenos, se activan por dominios de señalización que convierten estos linfocitos T en potentes destructores celulares. Las células autólogas tienen una ventaja con respecto a los linfocitos T endógenos en que no están restringidos por el MHC, que permite que estos linfocitos T venzan una táctica de evasión de la inmunovigilancia usada en muchas células tumorales que reducen la expresión de MHC. Las células endógenas, tales como las células TALL, tienen la ventaja de ser universales, aceptadas para la producción a gran escala, normalización y manipulación celular adicional, para dirigirse a cánceres de ovario FSHR+.

En otra realización más, el linfocito T modificado también se manipula ex vivo para inhibir, suprimir o disminuir la expresión de la proteína Forkhead Box (Foxp1). En una realización, los linfocitos T se modifican o manipulan para disminuir Foxp1 antes de que el linfocito T se transfecte con una secuencia de ácidos nucleicos como se ha descrito anteriormente que codifica la proteína quimérica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSH que existe de forma natural o modificada o fragmento de la misma, cuyo ligando se une a FSHR humano, unida a otras secuencias estimulantes o que se dirigen a linfocitos T. En otra realización, la manipulación para reducir o suprimir Foxp1 ocurre después de que el linfocito T se transfecte con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica o proteína biespecífica como se describe en el presente documento. En una realización, el linfocito T se ha pretratado de manera que no exprese Foxp1 una vez los linfocitos T se administran al sujeto. Lo más deseablemente, se suprime Foxp1 en el linfocito T modificado. Los linfocitos T se pueden tratar con nucleasas de dedo de cinc, nucleasas efectoras de tipo activadores de la transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas, o endonucleasas de recirculación que se han vuelto a manipular con meganucleasa manipulada junto con secuencias que se optimizan y diseñan para dirigirse a la secuencia única de Foxp1 para introducir defectos en o delecionar la secuencia genómica de Fox-P1. Aprovechando la maquinaria de reparación de ADN endógeno, estos reactivos eliminan Foxp1 de los linfocitos T modificados antes de la transferencia adoptiva. Alternativamente, los linfocitos T pueden ser cotransfectados con otra secuencia de ácidos nucleicos diseñada para inhibir, disminuir, regular por disminución o suprimir la expresión de Foxp1. Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente internacional WO2013/063019, incorporada como referencia en el presente documento. También se pueden emplear diversas combinaciones de estas técnicas antes o después de que los linfocitos T se hayan modificado por introducción de la construcción de ácidos nucleicos.

En general, cuando se administra el vector por transfección a los linfocitos T, el vector se administra en una cantidad desde aproximadamente 5 gg hasta aproximadamente 100 gg de ADN a aproximadamente 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células. En otra realización, el vector se administra en una cantidad desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 gg de ADN a 1 x 104 células a aproximadamente 1 x 1013 células. En otra realización, el vector se administra en una cantidad desde aproximadamente 5 gg hasta aproximadamente 100 gg de ADN a aproximadamente 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN de vector con respecto a los linfocitos T se pueden ajustar teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de administración y las células hospedadoras seleccionadas. El vector se puede introducir en los linfocitos T mediante cualquier medio conocido en la técnica o como se desvela anteriormente, que incluye transfección, transformación, infección, extrapolación o inyección de ADN directa. La construcción de ácidos nucleicos puede ser establemente integrada en el genoma de la célula hospedadora, establemente expresada como episomas, o expresada transitoriamente.

Los linfocitos T modificados resultantes se preparan para expresar las construcciones de ácidos nucleicos para la terapia adoptiva en un vehículo farmacéutico adecuado. Sin embargo, las proteínas biespecíficas quiméricas se pueden administrar como proteínas en un vehículo farmacéutico adecuado, como se ha mencionado anteriormente.

Todas las composiciones y los componentes descritos anteriormente se pueden usar en los métodos descritos en el presente documento para tratar los cánceres descritos en el presente documento y estimular la actividad inmunitaria antitumoral. Así, se proporcionan métodos de tratamiento de un cáncer en un sujeto humano que comprenden administrar a un sujeto cualquiera de las composiciones que se ha descrito anteriormente, en una formulación o vehículo farmacéuticamente aceptable.

El sujeto que está tratándose por el método es en una realización un sujeto que tiene un cáncer que expresa FSHR, que incluye los cánceres enumerados anteriormente. En otra realización, el sujeto con cáncer que expresa FSHR o células tumorales se ha tratado quirúrgicamente para extirpar el tumor en cuestión antes de la administración de la composición descrita en el presente documento. En una realización, el sujeto es una mujer con cáncer de ovario. En otra realización, la paciente con cáncer de ovario ha sido tratada quirúrgicamente para extirpar los ovarios, las trompas de Falopio y/o el útero. Los sujetos que tienen cualquiera de los otros cánceres enumerados anteriormente se pueden tratar por cirugía apropiada antes o después de la aplicación de estos métodos.

En una realización, el sujeto se administra con una composición que comprende una construcción de ácidos nucleicos como se ha descrito anteriormente. En otra realización, el sujeto se administra con una composición que comprende una proteína quimérica como se ha descrito anteriormente. En una realización específica, el método de tratamiento del cáncer en un sujeto humano comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo la proteína biespecífica que comprende un ligando que comprende una secuencia de FSHp, ligando que se une a FSHR humano, unida a un ligando que se une a NKG2D. En otra realización, la composición es un vector viral que lleva la construcción de ácidos nucleicos para permitir la infección in vivo.

En otra realización, el método de tratamiento del cáncer en un sujeto humano comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un linfocito T humano modificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende una secuencia de FSH, una modificación o fragmento de dicha secuencia de FSH, cuyo ligando se une a FSHR, unida a secuencias de ácidos nucleicos que codifican funciones activantes de linfocitos T. En una realización, las funciones activantes de linfocitos T se proporcionan por una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización. En una realización, el linfocito T modificado expresa cualquiera de las construcciones de ácidos nucleicos descritas en el presente documento. En una realización a modo de ejemplo, el linfocito T modificado expresa la construcción de ácidos nucleicos de la FIG. 5 o construcciones similares descritas en el presente documento. En otra realización, tras la administración, el linfocito T modificado no expresa la proteína Forkhead Box (Foxp1). En otra realización, el linfocito T modificado lleva una construcción de ácidos nucleicos que expresa o expresa conjuntamente secuencias que suprimen o disminuyen la expresión de Foxp1.

En otra realización adicional, el linfocito T humano modificado se administra con inhibidores de PD-1 clínicamente disponibles. En otra realización adicional, el linfocito T humano modificado se administra con inhibidores clínicamente disponibles que incluyen TGF-p (incluyendo anticuerpos bloqueantes). En otra realización adicional, el linfocito T humano modificado se administra con inhibidores de IL-10 clínicamente disponibles.

Estos métodos de tratamiento se diseñan para potenciar la actividad terapéutica de los linfocitos T y prolongar la supervivencia de pacientes con cáncer. Las composiciones terapéuticas administradas por estos métodos, por ejemplo, ya sea la construcción de ácidos nucleicos sola, en un vector de virus o nanopartícula, como proteína quimérica o biespecífica, o como linfocito T antitumoral modificado para terapia adoptiva, se administran por vía sistémica o directamente en el entorno de la célula cancerosa o microentorno tumoral del sujeto. Vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, vías sistémicas, tales como intraperitoneal, intravenosa, intranasal, intravenosa, intramuscular, intratraqueal, subcutánea y otras vías de administración parenteral o administración intratumoral o intranodal. Las vías de administración se pueden combinar, si se desea. En algunas realizaciones, la administración se repite periódicamente. En una realización, la composición se administra por vía intraperitoneal. En una realización, la composición se administra por vía intravenosa. En otra realización, la composición se administra por vía intratumoral.

Estas composiciones terapéuticas se pueden administrar a un paciente, preferentemente suspensas en una disolución biológicamente compatible o vehículo de administración farmacéuticamente aceptable. Los diversos componentes de las composiciones se preparan para su administración siendo suspensos o disueltos en un vehículo farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, tal como solución salina isotónica; disolución de sales isotónicas u otras formulaciones que serán evidentes para los expertos en dicha administración. El vehículo apropiado será evidente para los expertos en la técnica y dependerá en gran parte de la vía de administración. Se pueden emplear para este fin otras disoluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas y suspensiones estériles acuosas y no acuosas conocidas por ser vehículos farmacéuticamente aceptables y bien conocidas por los expertos en la técnica.

La administración de estas composiciones terapéuticas dependerá principalmente de factores tales como el tipo de composición (es decir, linfocitos T, vectores, construcciones de ácidos nucleicos o proteínas), la afección que está tratándose, la edad, el peso y la salud del paciente, y así puede variar entre pacientes. En una realización, la composición que contiene linfocitos T modificados se administra en múltiples administraciones de entre 2 millones y 200 millones de linfocitos T modificados. Se puede seleccionar cualquier valor intermedio dependiendo de la afección y la respuesta del paciente individual. Como otro ejemplo, un experto en la técnica puede optimizar el número de linfocitos T antitumorales adoptivamente transferidos. En una realización, dicha administración puede variar desde aproximadamente 105 hasta aproximadamente 1011 células por kilogramo de peso corporal del sujeto. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x105 células por kilogramo de peso corporal. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x106 células por kilogramo de peso corporal. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x107 células por kilogramo de peso corporal. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x108 células por kilogramo de peso corporal. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x109 células por kilogramo de peso corporal. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x1010 células por kilogramo de peso corporal. En otra realización, la administración de linfocitos T antitumorales es aproximadamente 1,5x1011 células por kilogramo de peso corporal. Otras administraciones dentro de estas cantidades especificadas también están englobadas por estos métodos.

En otra realización, una administración humana o veterinaria en adultos terapéuticamente eficaz de un vector viral está, en general, en el intervalo de desde aproximadamente 100 pL hasta aproximadamente 100 mL de un vehículo que contiene concentraciones de desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 1 x 1015 partículas, aproximadamente 1 x 1011 a 1 x 1013 partículas, o aproximadamente 1 x 109 a 1 x 1012 partículas virus.

La administración de las composiciones que contienen proteína puede variar entre una dosis unitaria de entre 0,01 mg y 100 mg de proteína (que es equivalente a aproximadamente 12,5 pg/kg de peso corporal).

Los métodos de determinación de la programación de frecuencia (reforzadores) de la administración incluirán una evaluación de la respuesta tumoral a la administración.

En otras realizaciones más, estos usos en el tratamiento de cáncer administrando una composición descrita en el presente documento son parte de una terapia de combinación con diversos otros tratamientos o terapias para el cáncer.

En una realización, los usos incluyen la administración de una citocina, tal como tratamiento con IL-7 como estrategias de acondicionamiento del hospedador específicas de tumor. La administración exógena de IL-7 promueve además la actividad in vivo, en concreto de linfocitos T deficientes en Foxp1. En otra realización, el uso comprende además administrar al sujeto, junto con las composiciones descritas en el presente documento, una terapia contra el cáncer complementaria que puede incluir un anticuerpo monoclonal, quimioterapia, radioterapia, una citocina, o una combinación de las mismas. En otra realización adicional, los usos en el presente documento pueden incluir la coadministración o un ciclo de terapia también usando otras moléculas pequeñas de ácidos nucleicos o moléculas químicas pequeñas o con tratamientos o agentes terapéuticos para el abordaje y el tratamiento el cáncer. En una realización, un uso para el tratamiento de la invención comprende el uso de una o más farmacoterapias en condiciones adecuadas para el tratamiento del cáncer.

Como se menciona previamente, la citorreducción quirúrgica en ciertas realizaciones es un procedimiento necesario para la retirada de grandes masas tumorales, y se puede emplear antes, durante o después de la aplicación de los usos y las composiciones que se describen en el presente documento. La quimioterapia y la radioterapia, en otras realizaciones, reafirman los efectos de los usos descritos en el presente documento. Se espera que dichos enfoques de combinación (cirugía más quimioterapia/ radiación más inmunoterapia) sean satisfactorios en el tratamiento de muchos cánceres junto con los usos descritos en el presente documento.

En realizaciones aún adicionales, los usos en el tratamiento de un sujeto con un cáncer o tumor que expresa FSHR incluyen las siguientes etapas antes de la administración de las composiciones descritas en el presente documento. En una realización, los usos incluyen retirar los linfocitos T del sujeto y transducir los linfocitos T ex vivo con un vector que expresa la proteína quimérica. En otra realización, los linfocitos T retirados se tratan para suprimir o reducir la expresión de Fox-P1 en los linfocitos T antes o después de la transducción de los linfocitos T retirados con la construcción de ácidos nucleicos descrita en el presente documento. En otro uso, los linfocitos T retirados y tratados se cultivan antes de la administración para retirar Foxp1 de las células ex vivo. Otra etapa del uso implica la formulación de los linfocitos T en un vehículo farmacéutico adecuado antes de la administración. También es posible congelar los linfocitos T retirados y tratados para la posterior descongelación y administración.

Los usos en tratamiento también pueden incluir extraer linfocitos T del sujeto para la modificación y expansión de células ex vivo, seguido por el tratamiento del sujeto con quimioterapia y la reducción de linfocitos del sujeto y opcionalmente extirpación quirúrgica del tumor. Estas etapas pueden tener lugar antes de administrar los linfocitos T modificados u otras composiciones al sujeto.

La invención se describe ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan con el fin de ilustración solo. Las composiciones, los protocolos experimentales y los usos desvelados y/o reivindicados en el presente documento se pueden preparar y ejecutar sin excesiva experimentación en vista de la presente divulgación. No se considera que los protocolos y los usos descritos en los ejemplos sean limitaciones del alcance de la invención reivindicada. Más bien, se debe interpretar que esta memoria descriptiva engloba todas y cada una de las variaciones que son evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento. Un experto en la técnica entenderá que se pueden hacer cambios o variaciones en las realizaciones desveladas de los ejemplos, y se espera que se obtengan resultados similares. Por ejemplo, se espera que las sustituciones de reactivos que están químicamente o fisiológicamente relacionadas con los reactivos descritos en el presente documento produzcan los mismos resultados o similares. Todos aquellos sustitutos y modificaciones similares son evidentes para los expertos en la técnica.

EJEMPLO 1: GENERACIÓN DE CONSTRUCCIONES QUE SE DIRIGEN A FSHR HUMANO Y DE RATÓN.

Los presentes inventores generaron una nueva construcción completamente murina como se describe en el presente documento contra FSHR de ratón que incluye la versión de ratón de todas las señales satisfactoriamente usadas en pacientes humanos. Para elegir como diana FSHR, los presentes inventores sintetizaron una construcción que expresaba un péptido señal, seguido por las dos subunidades (alfa y beta) de FSH endógena, separadas por un conector (véase la FIG. 1). Este motivo de direccionamiento se clonó en marco con un dominio de bisagra de IgG murina, tal como CD8a, seguido por el dominio transmembranario de CD8a, el dominio intracelular del mediador coestimulante (por ejemplo, 4-1BB o CD28 murino), finalmente, el dominio activante CD3Z.

Los presentes inventores también han generado construcciones con las secuencias humanas correspondientes (véase la FIG. 5, Tabla 1, SEQ ID NO: 1 y 2). Se generan variantes humanas de las construcciones que expresan FSHR para definir la formulación principal y demostrar la relevancia de los experimentos en ratones. Se transducen linfocitos T HLA-A2+ humanos (>50 % de caucásicos son A2+) de donantes sanos con reservas retro- o lentivirales que contienen la construcción dirigida a FSH, que se optimiza para las pruebas citotóxicas.

Se generan construcciones en marco similares a las secuencias de ratón descritas anteriormente para comparar CD28 frente a 4-1BB/CD137. CD28 es un motivo coestimulante intracelular alternativo debido a que, aunque los linfocitos T que expresan 4-1BB/CD137 presentaron persistencia potenciada en modelos de xenoinjerto en experimentos publicados con linfocitos T-CAR, no está claro que la supervivencia a largo plazo de linfocitos T sea preferible con respecto a las inyecciones múltiples. Además, se prueban las dos variantes humanas de la subunidad alfa de la FSH humana (NM_000735.3 frente a NM_001252383.1). Estas dos subunidades tienen longitudes diferentes y tienen el potencial de promover diferentes afinidades de unión.

En general, las 8 variantes clonadas (en marco) para la expresión en vectores virales son: 1) CGa (larga)+4-1BB; 2) CGa (larga)+CD28; 3) CGa (corta)+4-1 BB; y 4) CGa (corta)+CD28 (véase la FIG. 8).

Se diseñan otras construcciones usando solo la subunidad beta de FSH (que proporciona especificidad por la unión a FSHR) y con una región de unión de 15 aa de la subunidad beta que también se une a FSHR, por ejemplo, el fragmento de aminoácidos 19-32 de SEQ ID NO: 2 de FSHp u otros fragmentos de FSHp identificados anteriormente.

EJEMPLO 2: LAS CONSTRUCCIONES DE FSH RESPONDEN ESPECÍFICAMENTE A CÉLULAS TUMORALES FSHR+.

Se prueba vectores retrovirales (pSFG) frente a lentivirales (pELNS) para transducir la construcción que lleva FSHR en linfocitos T humanos. No existe demostración formal de que los vectores lentivirales sean superiores para la transducción ex vivo. Y, lo que es más importante, las preocupaciones referentes al riesgo de oncogénesis insercional después de la transferencia génica en el linfocito T son despreciables después de la seguridad de una década usando vectores retrovirales. El vector pSFG se ha usado en particular muchas veces para transducción retroviral similar de linfocitos T en ensayos clínicos41- 42.

Se generan reservas retrovirales o lentivirales que expresan estas construcciones y se usan para transducir linfocitos T humanos de donantes HLA-A2 sanos (>50 % de caucásicos). Se usaron reservas retrovirales para transducir los esplenocitos de linfocitos T activados por CD3/CD28, que se clasificaron por FACS basándose en la coexpresión de GFP. Entonces se probó la especificidad de la unión de linfocitos T modificados que expresan las construcciones de ácidos nucleicos de FSH del Ejemplo 1 contra células de cáncer de ovario ID8-Defb29/Vegf-a transducidas con FSHR o con vector vacío. Como se muestra en la FIG. 2, la incubación conjunta de linfocitos T transducidos con la construcción que se dirige a FHSR, pero no linfocitos T que llevan una construcción que se dirige a mesotelina irrelevante (K1), provocaron la secreción de IFN-y. Para apoyar la especificidad del reconocimiento de FSHR, no ocurrió la secreción de IFN-y en presencia de células tumorales transducidas con vector vacío (naturalmente FSHR-).

EJEMPLO 3: LA ADMINISTRACIÓN INTRATUMORAL DE LINFOCITOS T QUE EXPRESAN LA CONSTRUCCIÓN DE FSH RETRASA LA PROGRESIÓN DE TUMORES DE MAMA FSHR+.

Para obtener información sobre la posible eficacia y seguridad de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR in vivo en ratones inmunocompetentes, los presentes inventores también transdujeron células de cáncer de mama A7C11, una estirpe celular generada a partir de un tumor mutado p53/KRas autóctono, con FSHR de ratón. Entonces se expusieron ratones singénicos con tumores de los flancos y se administraron con 106 linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR idénticamente tratados o linfocitos T transducidos con vector vacío mediante inyección intraperitoneal. Como se muestra en la FIG. 3, una administración única de los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR fue suficiente para retrasar significativamente la progresión de tumores de los flancos establecidos, sin efectos secundarios perceptibles. Estos resultados respaldan el uso de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR contra tumores ortotópicos de ovario, solo o en combinación con otras inmunoterapias clínicamente disponibles.

El uso de FSH de ratón como motivo de direccionamiento es mucho más predictivo de los efectos de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR que el uso de construcciones que se dirigen a FSHR humano en ratones inmunodeficientes, debido a que: 1) los linfocitos T que expresan FSH de ratón se dirigen a células sanas posiblemente no identificadas que expresan FSHR endógeno (a diferencia de los linfocitos T que expresan FSH humana administrada en ratones inmunodeficientes); 2) ciertos linfocitos T, por ejemplo, los linfocitos CER-T, pueden reforzar la inmunidad antitumoral policlonal potenciando las respuestas preexistentes de linfocitos T mediante la diseminación de antígenos y la disminución de la carga inmunosupresora; y 3) interacciones entre FSH y su receptor específico están altamente conservadas.

Para demostrar el potencial citotóxico de los linfocitos T que contienen la construcción de FSHR, en concreto contra células tumorales FSHR+, los presentes inventores incubaron nuevamente las construcciones de FSHR o linfocitos T transducidos con vector vacío con células \D8-Defb29/Vegf-a33 FSHR+ (tumor de ovario) o A7C1134 (una estirpe celular generada en el laboratorio de tumores de mama mutados p53/KRas autóctonos 34) (relación 40:1 durante 24 h) y se determinó la destrucción citotóxica contando células tumorales negativas para azul de tripano (vivas). Como se muestra en las F\G. 7A y 7B, los linfocitos T FSH CER, pero no los linfocitos transducidos con vector vacío, eliminaron ambos tipos de células tumorales. Se obtuvieron resultados comparables en un ensayo de MTS (no mostrado), que respalda además que los motivos que se dirigen a FSH son capaces de provocar actividad citotóxica de linfocitos T mediada por CER en un modo específico de FSHR.

EJEMPLO 4: LA EFICACIA FRENTE A LA TOXICIDAD DE LINFOCITOS T MODIFICADOS QUE EXPRESAN LIGANDO DE FSH EN MODELOS PRECLÍNICOS DE CÁNCER DE OVARIO EN HOSPEDADORES INMUNOCOMPETENTES.

Para definir las consecuencias inmunológicas del uso de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR en modelos preclínicos de tumores inmunocompetentes que incluyen todos los tejidos sanos donde FSH endógena podría unirse posiblemente (como ocurrirá en los pacientes), los presentes inventores han generado nuevas construcciones de ácidos nucleicos con los homólogos de ratón de todos los dominios de direccionamiento y activantes. Véase la Tabla 3, F\G. 6C y SEQ \D NO. 4 y 5.

Los presentes inventores prueban la hipótesis de que los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR muestran actividad selectiva en las células que expresan FSHR, alterando la progresión tumoral, mientras que no poseen efectos adversos significativos en el ratón. Estos resultados definen el efecto de esta terapia prometedora sobre el cáncer de ovario y garantizan su seguridad para la futura traducción de este enfoque en la clínica.

Los presentes inventores usan tumores \D8- Vegf/Defb29 ortotópicos agresivos que se han transducido y seleccionado con FSHR de ratón. Los presentes inventores validan la aplicabilidad general de los hallazgos seleccionados usando células \D8 parentales transducidas y/o un modelo de tumor inducible dependiente de p53 autóctono o las estirpes celulares derivadas de los presentes inventores.

EJEMPLO 5. ENSAYO CLÍNICO DE RATÓN: DEFINE LA EFICACIA DE LINFOCITOS T MODIFICADOS QUE SE DIRIGEN A FSHR CONTRA CÁNCERES DE OVARIO HUMANOS.

Los presentes inventores generaron construcciones con todos los dominios humanos (véase la F\G. 5), que se usan en la cohorte establecida de los presentes inventores de xenoinjertos derivados de tumor primario en ratones NSG. Usando tumores y linfocitos T de los mismos pacientes, los presentes inventores imitan un ensayo clínico limitado que resume la heterogeneidad del cáncer de ovario clínico. Los presentes inventores suponen que los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR son eficaces contra cánceres de ovario FSHR+ establecidos de diferentes pacientes, y sinergizan con intervenciones combinatorias que se dirigen a TME.

Estableciendo la eficacia y la posible toxicidad de los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR en una variedad de modelos preclínicos, los presentes inventores proporcionan un fundamento mecanístico para la prueba de dichos linfocitos T como una posible terapia contra el cáncer de ovario. Usando FSHR como diana tumoral específica y un ligando que comprende una secuencia de FSH como motivo de direccionamiento, los presentes inventores superan algunos de los retos que han evitado el éxito de una variedad de tecnologías contra tumores epiteliales.

Para definir el espectro completo de actividades de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR in vivo en hospedadores inmunocompetentes, los presentes inventores han generado linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR completamente murinos. Se tratan ratones que tienen tumor de ovario (FSHR+ y FSHR-) establecido (CD45.2+) (n>10/grupo) con 106 linfocitos T modificados que se dirigen a anti-FSHR i.p. (CD45.1+, congénitos) 7 días después de la exposición al tumor. Los ratones de control reciben linfocitos T transducidos con vector vacío. Los presentes inventores comparan la supervivencia, como una lectura de eficacia indiscutible. Se administran inyecciones adicionales de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR dependiendo de estos resultados. En diferentes ratones, en los días 14, 21 y 28 después de la exposición al tumor, los presentes inventores siguen la recirculación y la persistencia de linfocitos T CD4 y CD8 transferidos (en concreto CD45.1+). Se incluyen muestras de bazo, ganglios linfáticos drenantes (mediastinales), médula ósea y lechos tumorales (lavado peritoneal). Se incluye un exhaustivo análisis de marcadores de activación (por ejemplo, CD44, CD69, CD27, CD25) frente a de agotamiento (por ejemplo, PD-1, Lag3) en linfocitos transferidos. Además, se analiza la posible diferenciación de memoria central de linfocitos T modificados (congénicos) que se dirigen a FSHR en MO y ganglios linfáticos, como un posible factor pronóstico de injerto a largo plazo y protección duradera.

EJEMPLO 6: EFECTOS DE LINFOCITOS T MODIFICADOS QUE SE DIRIGEN A FSHR SOBRE LA INMUNIDAD ANTITUMORAL PREEXISTENTE.

Los presentes inventores determinan los efectos que los linfocitos T-CER modificados que se dirigen a FSHR tienen sobre las respuestas inmunitarias antitumorales en curso, mediante la diseminación de antígenos y la reducción de la carga inmunosupresora. Para ese fin, los presentes inventores tratan ratones que tienen tumores con linfocitos T-CER modificados que se dirigen a FSHR frente a linfocitos T transducidos con vector vacío y clasifican por FACS los linfocitos T endógenos (CD3+CD8+CD45.2+) de tumor y localizaciones linfáticas, en los días 7 y 14 después de la transferencia adoptiva (días 14 y 21 después del tumor). Se cuantifica la magnitud de las respuestas inmunitarias antitumorales atribuibles a los linfocitos T preexistentes influidas por el tratamiento mediante análisis ELISPOT de IFNy y granzima B. Los marcadores de activación frente a los de agotamiento en linfocitos T endógenos definen aún más los efectos de los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR. Para definir la protección inmunitaria contra reapariciones posiblemente provocadas por estas intervenciones combinatorias, los ratones se vuelven a exponer si rechazaron sus tumores.

EJEMPLO 7 - TOXICIDAD A CORTO Y LARGO PLAZO POSIBLEMENTE INDUCIDA POR LINFOCITOS T MODIFICADOS QUE SE DIRIGEN A FSHR.

La principal preocupación en los protocolos de transferencia adoptiva de linfocitos T a corto plazo es la aparición de un síndrome de liberación de citocinas, una respuesta inflamatoria sistémica que induce fiebre no infecciosa y está asociada con altos niveles de TNFa y IL-6.

Los presentes inventores monitorizan en primer lugar la temperatura y los niveles de citocinas en ratones tratados frente a ratones de control, además de signos obvios de enfermedad (por ejemplo, pelaje erizado). Si un síndrome de liberación de citocinas fue una manifestación frecuente, los presentes inventores definen si el uso de corticoides o el agotamiento de IL6 podría convertirlo en un acontecimiento razonable. No se ha informado que el FSHR se exprese en tejido normal fuera del ovario o los testículos; por lo tanto, los presentes inventores no esperan efectos secundarios a largo plazo. Sin embargo, los presentes inventores monitorizan cualquier alteración macroscópica en ratones tratados durante hasta 4 meses después del tratamiento.

EJEMPLO 8 - ENSAYO CLÍNICO DE RATÓN EN XENOINJERTOS DERIVADOS DE PACIENTE.

Los presentes inventores injertan carcinoma de ovario avanzado reciente que reciben los presentes inventores (~2-3 especímenes/mes). Los especímenes nuevos son entregados mediante mensajería en 2 h después de la extirpación, y se injertan trozos de ~1 mm3 en la bolsa ovárica de ratones NSG (gravemente inmunodeficientes), mediante un procedimiento quirúrgico optimizado. Y, lo que es más importante, los presentes inventores reciben sangre periférica de los mismos pacientes, y las capas leucocíticas se crioconservan inmediatamente. En los últimos 2 meses, los presentes inventores han expuesto ~35 ratones a 7 especímenes diferentes. La mayoría de los tumores fueron palpables y visibles en ~45 días, aunque su progreso es lento. Cada mes llegan aproximadamente 2-3 especímenes recientes nuevos. Los presentes inventores generan xenoinjertos para >10 tumores primarios de diferentes pacientes. Los ratones se usan para definir la eficacia de los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR contra tumores de ovario humanos heterogéneos. Para eso, los presentes inventores expanden CD3/CD28 y transducen la construcción que se dirige a FHSR en linfocitos T del mismo paciente, imitando así su posible aplicación clínica.

Los presentes inventores han generado linfocitos T modificados que se dirigen a FSH con la FSH endógena humana correspondiente, los dominios de bisagra y transmembranarios y los motivos 4-1BB coestimulante y CD3Z activante mostrados en la FIG. 1 (todas las secuencias humanas - véase la FIG. 5). Los presentes inventores determinan la expresión de FSHR en cada xenoinjerto mediante análisis de transferencia Western, para definir cómo predice la eficacia. Se pueden transducir y transferir linfocitos T de donantes sanos con HLA equivalentes.

Para definir la eficacia de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR contra cáncer de ovario, los presentes inventores usan sangre periférica autóloga para los especímenes de cáncer de ovario humano injertados de los presentes inventores (> 3 ratones/tumor; 10 pacientes diferentes). Los linfocitos T se expanden y transducen con construcciones de ácidos nucleicos que se dirigen a FSHR humano o el vector vacío (y/o T19-CAR humano irrelevante), y se transfieren adoptivamente a ratones NSG que tienen xenoinjerto expuestos al mismo tiempo. Se monitoriza el crecimiento tumoral mediante palpación y ultrasonidos, y los ratones se sacrifican cuando los tumores sobresalen del abdomen, o antes si los ratones muestran signos de malestar o enfermedad avanzada. El crecimiento tumoral, las metástasis y la supervivencia se cuantifican como una lectura de eficacia. Cómo el crecimiento tumoral se afecta en función de la expresión de FSHR se define usando análisis de TW en especímenes quirúrgicos equivalentes. Los presentes inventores disocian especímenes de tumor para determinar la acumulación de linfocitos T transferidos en presencia frente a en ausencia de la diana (los ratones NSG no tienen linfocitos endógenos). Se determina la persistencia de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR en las localizaciones de médula ósea y ganglios linfáticos y se correlaciona con la expresión del receptor de hormona elegido como diana (FSHR) y la eficacia.

EJEMPLO 9: MODULACIÓN DE LA INMUNOSUPRESIÓN PARA POTENCIAR EL EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE LINFOCITOS T MODIFICADOS QUE SE DIRIGEN A FSHR CONTRA CÁNCER DE OVARIO.

Un posible reto de las intervenciones de transferencia adoptiva de linfocitos T contra los tumores sólidos es la posibilidad de que las redes de inmunosupresores en el TME supriman la actividad protectora de linfocitos T exógenos. Para modular el microentorno del tumor con el fin de reducir sus efectos inmunosupresores, y aumentar la supervivencia, se aplican métodos complementarios con los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR. Para provocar el rechazo tumoral y la sostenida protección, los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR se combinan con la administración de inhibidores de PD-1 clínicamente disponibles (o bloqueantes de PD1 solos en grupos de control). Se monitoriza la eficacia en función de la expresión de PD-L1 en células tumorales. Alternativamente, los presentes inventores bloquean otras vías inmunosupresoras en el microentorno del cáncer de ovario en ratones que reciben linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR, que incluyen TGF-p (para el que se han desarrollado recientemente Ab de bloqueo) e IL-10.

En resumen, los ejemplos anteriores muestran que los presentes inventores se dirigieron al receptor acoplado a la proteína G (FSHR) que se expresa sobre la superficie de células de cáncer de ovario en la mayoría de los tumores y no se han usado en intervenciones basadas en linfocitos T. Para potenciar tanto la especificidad como las interacciones receptor:ligando, los presentes inventores usan la hormona endógena como motivo de direccionamiento, proporcionándose así un fundamento para la prueba clínica de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR que llevan los homólogos humanos de estos motivos. Los presentes inventores usan el ligando endógeno (una hormona), a diferencia del anticuerpo anti-FSHR o fragmentos de anticuerpos, como ligando para garantizar la eficacia o especificidad. Los presentes inventores muestran que los linfocitos T modificados dirigidos contra FSHR son seguros y no inducen toxicidad obvia in vivo.

Lo más relevante para la presente solicitud, la actividad citotóxica de linfocitos T modificados que se dirigen a células tumorales FSHR+ refuerzan las respuestas de linfocitos preexistentes mediante la diseminación de antígenos, potenciando así la inmunidad antitumoral policlonal. Además, los presentes inventores definen si el direccionamiento combinatorio de redes supresoras que operan en el microentorno del cáncer de ovario desencadena tanto linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR como linfocitos que infiltran tumores de vías tolerogénicas que podrían amortiguar su actividad protectora.

Así, la presente solicitud es innovadora en múltiples niveles conceptuales y experimentales. Los presentes inventores hacen uso de un conjunto de xenoinjertos de cáncer de ovario primario recientes ortotópicamente injertados para reflejar la heterogeneidad de la enfermedad humana en términos de expresión de FSHR y variabilidad de respuestas. En concreto, los presentes inventores prevén que los estudios anteriores demuestren que los ratones que tienen cáncer de ovario tratados con linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR muestran supervivencia significativamente elevada (incluso rechazo de tumor en algunos casos), en comparación con los controles que reciben linfocitos T transducidos con vector vacío. Correspondientemente, los presentes inventores identifican linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR in vivo en ratones tratados durante periodos relativamente largos, a diferencia de los linfocitos T de control. Debido a que la médula ósea es un reservorio de linfocitos T de memoria en nuestro sistema que es donde los presentes inventores observan nichos de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR persistentes. Los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR son menos sensibles a mecanismos de agotamientos en perlas tumorales. Juntos, estos resultados se interpretan como evidencia para el potencial terapéutico de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR, y allanan el camino para pruebas clínicas posteriores.

Se prevé que los datos demuestren que los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR inducen un refuerzo significativo en la actividad antitumoral inferior a la óptima, pero medible, de linfocitos T preexistentes, como se cuantifica por análisis de ELISPOT. La actividad combinada de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR y linfocitos endógenos confiere correspondientemente protección contra la reaparición en los ratones que rechazan tumores establecidos. Esto enfatiza el potencial de los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR para provocar memoria inmunológica policlonal contra la recaída del tumor, aunque los tumores pierden FSHR dirigido en el proceso.

Se espera que los datos muestren la ausencia de efectos adversos significativos a largo plazo (por ejemplo, autoinmunidad) para cáncer de ovario, ya que la expresión de FSHR está restringida al ovario (incluyendo todas las células nucleadas). Los presentes inventores no pueden descartar que la administración aguda de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR de como resultado síntomas de tipo gripe, pero es poco probable que provoquen un síndrome de liberación de citocinas. Juntos, estos datos adicionales respaldan el uso de linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR en pacientes con cáncer de ovario.

Se prevé que los datos muestren que >50 % de tumores primarios con el tiempo crecen exponencialmente en ratones NSG y permiten el injerto en serie en diferentes ratones. 50-70 % de estos tumores expresan FSHR de superficie. Aunque los presentes inventores han mostrado la factibilidad de las células de ovario cultivadas humanas injertadas (que se podría usar como enfoque de respaldo o complementario), este recurso resume la heterogeneidad de la enfermedad humana.

Se prevé que los datos muestren que los linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR también son eficaces contra los cánceres de ovario humanos xenoinjertados que expresan FSHR, pero no contra tumores de FSHR. Correspondientemente, los presentes inventores prevén que los tumores con niveles más altos de expresión de FSHR sean respondedores superiores. Por consiguiente, los presentes inventores encuentran persistencia potenciada de linfocitos T modificados, infiltrados más fuertes (debido a la proliferación inducida por FSHR) y menos agotamiento en los hospedadores que tienen tumor FSHRalto. Estos resultados soportan además tanto la especificidad como el potencial terapéutico de composiciones que se dirigen a FSHR, como se describe en el presente documento.

La combinación de inhibidores de PD-1 con linfocitos T modificados que se dirigen a FSHR promueve el rechazo de tumores PD-L1+, mientras que solo se observa un retraso significativo en la progresión maligna usando tratamientos individuales. Dado el éxito clínico emergente de los bloqueantes de PD-1, los presentes inventores esperan que sean en general superiores a otras intervenciones que se dirigen a la inmunosupresión, que podrían ser, sin embargo, más eficaces en tumores PD-L1-. Las intervenciones combinatorias que integran inmunoterapias celulares y moleculares tienen implicaciones obvias para las posteriores pruebas clínicas.

EJEMPLO 10 - EXPRESIÓN DE VARIANTES DE CER EN LINFOCITOS T HUMANOS.

Los presentes inventores usan sangre periférica de la aféresis de donantes HLA-A2+ sanos (>50 % de caucásicos), para minimizar las reacciones alógenas cuando linfocitos T transducidos se incuban conjuntamente con células tumorales (A2+). Los presentes inventores usan métodos y recursos como se han descrito 529304445. Brevemente, se disminuyen los monocitos del producto de aféresis y se expanden los linfocitos T en 5 % de suero AB humano normal usando anticuerpos anti-CD3 (OKT3) y anti-CD28 (clon 9.3) conjugados con perlas (relación 3:1 de perla/células CD3+). En el día 1 después de la estimulación, los linfocitos T se exponen a sobrenadante de retro- o lentivirus que codifica las variantes de construcción dirigidas a FSH (MOI~ 3), en placas recubiertas de retronectina en presencia de 50 UI/mL de IL-2 y 1 ng/mL de IL-7, seguido por inoculación centrífuga (1000 g, 45 min, 4 °C). En el día 2, se cambian los medios y se repite la inoculación centrífuga, seguido por hasta 12 días de expansión. Después de la finalización del cultivo celular, se retiran las perlas magnéticas mediante separación magnética y las células se lavan y se resuspenden en PlasmaLyte A (Baxter). La eficiencia de transducción se determina por citometría de flujo usando anticuerpos primarios contra FSHp humana (clon 405326) expresada fuera de células infectadas, e IgG anti-ratón marcada con PE como anticuerpos secundarios. La transducción de linfocitos T HLA-A2+ humanos se optimiza para pruebas citotóxicas de todas las variantes.

EJEMPLO 11 - LA ACTIVIDAD ANTITUMORAL DE VARIANTES DE CER DIRIGIDAS A FSH IN VITRO.

Se usa un ensayo in vitro de luciferasa para probar la eficacia, es decir, la actividad citotóxica, de las variantes de linfocitos T dirigidas a FSH generadas como se describe en los ejemplos anteriormente. Los presentes inventores usan células de cáncer de ovario humano HLA-A2+ OVCAR319, que también se conoce que expresan altos niveles de FSHR20-46. Usando linfocitos T HLA-A2+ OVCAR3 (que expresan el tipo de HLA más común presente en el 50 % de los caucásicos y el 35 % de los afroamericanos), los presentes inventores pueden usan linfocitos T de una amplia variedad de donantes sin provocar una respuesta aloinmunitaria. Los presentes inventores restringen así la provocación de la destrucción citotóxica al reconocimiento específico del receptor FSHR. Los presentes inventores también miden la producción de IFN-y por linfocitos T transducidos en respuesta a células tumorales que expresan FSHR. Se seleccionan las dos variantes de linfocitos T que expresan FSHR que muestran la mejor actividad citotóxica combinada y producción de IFN-y para la posterior prueba in vivo.

La transfección con el vector retroviral pBABE-luc-puro hace que las células OVCAR3 expresen luciferasa de luciérnaga espontáneamente, y permite la selección por un gen de resistencia a puromicina.

Se usan como efectores linfocitos T transducidos con la construcción dirigida a FSH HLA-A2+ humana como se describe en el presente documento. Si se transduce más del 60 % de los linfocitos T, los linfocitos T se consideran listos para su uso en los ensayos. Si se transduce menos del 60% de los linfocitos T, los presentes inventores enriquecen los linfocitos T transducidos por clasificación por FACS para las células FSH+.

Después de la selección clonal y la expansión de luciferasa que expresa OVCAR3 (OVCAR3-luc), los presentes inventores siembran 10.000 células por pocillo y cultivan conjuntamente con linfocitos T que expresan las diferentes variantes de construcción de FSH en relaciones 1:1 (células tumorales: linfocitos T), 1:5, 1:10 y 1:20. Los presentes inventores también tienen una condición sin linfocitos T como control negativo (sin muerte celular) y otra tratada con Triton X como control positivo para muerte máxima de células tumorales. 18 horas después de sembrar las células en cultivo conjunto, los presentes inventores retiran los medios, lavan los pocillos, lisan las células y añaden el sustrato de luciferasa. Los presentes inventores miden la cantidad de señal de luciferasa para determinar la lisis específica de células OVCAR3-luc por los linfocitos T-CER dirigidos a FSH.

EJEMPLO 12 - PRODUCCIÓN DE IFN-r EN RESPUESTA A FSHR POR TODAS LAS VARIANTES DE LINFOCITOS T-CER.

Otro parámetro posiblemente importante para la eficacia terapéutica es la producción de citocinas efectoras que pueden influir en el inmunoentorno in vivo.

Complementariamente, los presentes inventores cultivan conjuntamente células OVCAR3 y linfocitos T que expresan las diferentes variantes de construcción dirigida a FSH y recogen los sobrenadantes a las 18 horas para determinar la producción de IFNy por ELISA con relaciones entre células tumorales y linfocitos T de 1:1, 1:10 y 1:20. Si el tiempo lo permite, los presentes inventores también determinan la producción de IFN-y por tinción intracelular de linfocitos T transfectados dirigidos a FSH incubados con células tumorales FSHR+, así como otras citocinas tales como TNF-a (ELISA) y granzima B (tinción intracelular).

Estos experimentos se realizan (al menos) por triplicado y se repiten 3 veces, para lograr significación estadística (P<0,05) usando la prueba de Mann-Whitney. Los presentes inventores identifican dos variantes de linfocitos T transfectadas con construcción dirigida a FSH para la investigación y el desarrollo adicional en un sistema in vivo. Los presentes inventores seleccionan la variante de CER dirigida a FSH que proporciona, en orden de prioridad: 1) el mayor % de lisis de células específicas OVCAR3-luc en las diferentes relaciones; 2) se seleccionan los mayores niveles de secreción de IFN-y . Donde haya diferentes mejores candidatos en diferentes relaciones, los presentes inventores eligen aquél con la mayor lisis específica a una relación más baja. Si todas las variantes muestran actividad similar, los presentes inventores priorizan el uso de vectores retrovirales, la inclusión de CD28 en lugar de 4-1BB y la variante de CGa más corta. Si no existen diferencias, los presentes inventores eligen la variante que muestra la mayor eficiencia de transducción.

Si la destrucción dirigida a FSHR de células OVCAR3 es inferior a la óptima, los presentes inventores usan células de cáncer de ovario Caov-3 (ATCC N° HTB-75), que también expresan conjuntamente FSHR y HLA-A2. En este caso, se usa esta estirpe celular para la posterior prueba in vivo.

EJEMPLO 13 - VARIANTES DE CONSTRUCCIÓN DE FSHR PROBADAS IN VIVO EN XENOINJERTOS DE CÁNCER DE OVARIO

Los presentes inventores comparan la eficacia in vivo de las dos variantes de linfocitos T-CER principales en los ejemplos anteriores. Se injertan células OVCAR3 (HLA-A2+19; FSHR+20) en la bolsa ovárica de ratones NSG (gravemente inmunodeficientes)9. Se tratan ratones que tienen tumores ortotópicos con linfocitos T-CER HLA-A2+ del siguiente modo. Trozos de tumor (~1 mm3) derivan de células de carcinoma de células claras de ovario TOV-21G implantadas en el flanco de ratones inmunodeficientes injertados en la bolsa ovárica de ratones NSG en ~ 1 mes. Se tomó el ovario expuesto por crecimiento maligno y se comparó con el ovario contralateral izquierdo. El tumor (figura no mostrada) fue particularmente agresivo y creció en ~21 días. Los presentes inventores también han expuesto ratones con o trozos de tumor (ovario derecho) o suspensiones de células individuales de los mismos especímenes de cáncer de ovario primario recién disociado.

Para definir la eficacia de los linfocitos T transducidos con la construcción dirigida a FSH contra cáncer de ovario FSHR+, los presentes inventores usan las dos variantes de linfocitos T-CER que muestran la mejor actividad citotóxica combinada y producción de IFN-y . Si todas las variantes muestran actividad similar, los presentes inventores dan prioridad al uso de vectores retrovirales, la inclusión de CD28 en lugar de 4-1BB y la variante CGa más corta. Los ratones que muestran tumores de ovario ortotópico establecidos de tamaño similar por ultrasonidos y/o palpación (> 5 ratones/grupo) reciben linfocitos T transducidos con las dos variantes de linfocitos T transducidos con la construcción que se dirige a FSHR, o transducidos con vector vacío, como control alternativo. Si se logra <60 % de transducción, los linfocitos T positivamente transducidos se clasifican por FACS y se deja que reposen durante 2 h antes del tratamiento. Se administran 107 linfocitos T transducidos con la construcción dirigida a FSHR/inyección y dos inyecciones 14 días separadas (i.p. en PBS) para estos análisis. Se monitoriza el crecimiento tumoral mediante palpación y ultrasonidos, y los ratones se sacrifican cuando los tumores sobresalen del abdomen, o antes si muestran signos de malestar o enfermedad avanzada. El crecimiento tumoral, las metástasis y la supervivencia se cuantifican primero como una lectura de eficacia indiscutible.

EJEMPLO 14 - LA PERSISTENCIA DE LAS DOS VARIANTES DE LINFOCITOS T-CER IN VIVO EN RATONES QUE TIENEN TUMOR.

Un parámetro importante asociado a la protección a largo plazo es la persistencia de linfocitos T de memoria central transducidos con la construcción dirigida a FSH que puede producir nuevas ondas de linfocitos T efectores tras la reaparición tumoral. Para determinar qué variante de linfocito T-CER persiste durante más tiempo in vivo, los presentes inventores tratan idénticamente ratones que crecen con OVCAR3 diferentes (> 5 ratones/grupo) con linfocitos T transducidos con la construcción dirigida a FSH, y monitorizan donde se juntan y persisten. En primer lugar, la acumulación de linfocitos T transferidos en los días 14 y 28 después de la transferencia adoptiva se determina mediante análisis de FACS usando tejido tumoral disociado, médula ósea (un depósito de linfocitos T de memoria central), ganglios linfáticos y muestras del bazo. Los presentes inventores usan CD3 humano, ya que los ratones NSG no tienen linfocitos endógenos. Se determinan sus atributos de memoria (CD62L+CD45RA-CD122+CD127+) en las localizaciones linfática y de MO. Si los ratones rechazan tumores tras la administración de linfocitos T dirigidos a FSH, los presentes inventores vuelven a exponerlos a tumores del flanco OVACR3, y comparan la progresión tumoral con aquella en ratones NSG sin tratamiento previo (sin tratar).

Basándose en nuestras observaciones previas, los presentes inventores prevén que 5 ratones por grupo deben proporcionar un nivel de significancia del 5 % y potencia del 95 % para detectar diferencias del 20 % o mayores, usando pruebas de Mann-Whitney o de Wilcoxon. Los experimentos usan al menos 5 ratones/grupo (más una repetición) y se analizan según estos parámetros estadísticos. Los presentes inventores identifican así la variante de linfocitos T dirigida a FSH principal que se usa para la optimización preclínica final. El candidato seleccionado muestra una combinación de, en orden de importancia: 1) eficacia más fuerte frente a crecimiento tumoral establecido; 2) diferenciación de memoria central en localizaciones linfáticas o de médula ósea; y 3) persistencia global superior in vivo.

Los presentes inventores proponen que la persistencia de linfocitos T dirigidos a FSH es importante para remisiones a largo plazo, según la evidencia clínica que trata la leucemia12-38-48. Si ambas variantes de linfocitos T transducidos con la construcción que se dirige a FSH expresan CD28 y no persisten durante al menos 2 semanas, los presentes inventores también prueban la eficacia in vivo de linfocitos T que llevan las construcciones usando 4-1 BB. Si se lograra reducción tumoral comparable, los presentes inventores seleccionarían CD28 como dominio coestimulante.

Los presentes inventores complementan estos experimentos con el uso de células de cáncer de ovario Caov-3, que expresan niveles incluso más altos del receptor de FSH y son HLA-A2+.

EJEMPLO 15: DOSIS MÁXIMA TOLERADA (DMT) PARA ADMINISTRACIONES DE DOSIS ÚNICA

El plan experimental para definir la DMT implica: (1) administrar una dosis única (2x106, 107 y 5x107) de linfocitos T de ratón en ratones inmunocompetentes que tienen tumor; (2) administrar una dosis única (2x106, 107 y 5x107) de linfocitos T humanos en ratones inmunocompetentes que tienen tumor humano; y (3) administrar una dosis única (2x106, 107 y 5x107) de linfocitos T de ratón en ratones inmunocompetentes sin tumor. Después de obtener una DMT de dosis única de estos experimentos, se realizan los siguientes experimentos: (4) administrar múltiples dosis de DMT (linfocitos T de ratón) en ratones inmunocompetentes que tienen tumor en los días 21,28 y 32; (5) administrar múltiples dosis de DMT (linfocitos T humanos) en ratones inmunocompetentes que tienen tumor humano (3 veces, separadas una semana); y (6) administrar múltiples dosis de DMT (linfocitos T de ratón) en ratones inmunocompetentes sin tumor en los días 0, 7 y 14. Los resultados de estos experimentos definen la DMT de múltiples dosis.

Estos experimentos proporcionan un fundamento para el posterior desarrollo de linfocitos T-CER dirigidos a FSH para el tratamiento de cáncer de ovario. Permiten la identificación de una variante principal que se va a usar para intervenciones clínicas. Para allanar el camino para las pruebas clínicas inmediatas, los presentes inventores determinan la dosis máxima tolerada (DMT) de infusión única de nuestro CER principal dirigido a FSH. Los presentes inventores evalúan la toxicidad específica de receptor de FSH dependiente de tumor, y no específica, después de la infusión de linfocitos T-CER dirigidos a FSH.

Aumento gradual de dosis única in vivo en ratones inmunocompetentes.

Para determinar la DMT para infusión única, se realiza un aumento gradual de dosis única en tanto ratones inmunocompetentes que tienen tumor como sin tumor. Así, aunque el ratón NOD/SCID/yc-/- (NSG) es el mejor modelo disponible para evaluar la eficacia preclínica de linfocitos T-CER para tumores que expresan FSHR, el modelo de ratón de xenoinjerto de tumor es una especie no relevante para la determinación de algunos aspectos de la toxicología para este linfocito T-CER particular, debido a que el componente de FSH humana puede no unirse a FSHR de ratón normal y, por lo tanto, este ratón podría quedarse corto en la predicción de la toxicidad. Por este motivo, los presentes inventores usan en primer ligar construcciones de linfocitos T-CER dirigidas a FSH que contienen el homólogo de ratón exacto de cada motivo identificado, que se va a expresar por linfocitos T primarios murinos. El objetivo de estos experimentos iniciales es tener un sistema donde el receptor de hormona endógeno (FSHR de ratón) esté presente en el ovario y tejidos sanos posiblemente no identificados. Estos estudios prueban la capacidad del hospedador para orquestar reacciones inflamatorias similares a las que se podrían observar en pacientes con cáncer en presencia de un sistema inmunitario intacto. La expresión de CER dirigido a FSH en linfocitos T primarios de ratón se realiza con vectores retrovirales independientemente de los resultados de la fase I, ya que los lentivirus no infectan los linfocitos de ratón. Se han seleccionado dosis basándose en los 5 años de experiencia con transferencia adoptiva de linfocitos T en diversos modelos preclínicos 7.30.43.4950, que incluyen el uso de linfocitos CER dirigidos a FSH para tratar tumores FSHR+ en ratones inmunocompetentes (FIG. 3). La dosis "habitual" eficaz y no tóxica es 107 células, aunque los presentes inventores han mostrado eficacia por debajo de esta dosis. Los ratones se infunden con 2 x 106, 107, o 5 x 107 linfocitos T transducidos con vector vacío, linfocitos T-CER dirigidos a FSH o HBSS. Debido a que también se ha informado que la expresión del FSHR está presente en el endotelio alterado encontrado en lesiones metastásicas (pero no en vasos sanguíneos sanos)51, así como en las células epiteliales en cáncer de próstata52, los presentes inventores realizan dos experimentos independientes para cada protocolo; uno utilizó ratones macho y el otro utilizó ratones hembra, con 5 ratones por grupo en cada experimento. Estos experimentos definen la toxicidad en ambos sexos sin excluir la posible presencia de FSHR endógeno en tejidos masculinos o femeninos sanos.

En tanto machos como hembras, se administran células de cáncer de ovario ID8-Defb29/Vegf-a transducidas con FSHR para generar tumores de ovario diseminados por toda la cavidad peritoneal. Estos tumores, aunque son más lentamente y ligeramente menos reproducibles, también crecen en ratones macho. Los ratones que tienen tumor se infunden con linfocitos T o HBSS 5 días después de la inyección del tumor. Debido a que la administración habitual de otros linfocitos T-CAR en la clínica implica la linforreducción28 previa, los presentes inventores irradian subletalmente los ratones (300 rads) 5 h antes de la transferencia adoptiva de linfocitos T. Todas las células tumorales y linfocitos T se infunden i.p. inicialmente, debido a que esta es la vía aprobada por el NCI para el direccionamiento de cáncer de ovario en la clínica53. Si dos o más ratones en una dosis de linfocitos T particular muestran signos de toxicidad, se sacrifican para el análisis todos los ratones en esas dosis y controles tratados con HBSS emparejados. En ese caso, se evalúa la administración i.v. de linfocitos T-CER.

Aumento gradual de dosis única in vivo en ratones que tienen cáncer de ovario humano.

Estos experimentos complementarios se realizan en ratones NSG que tienen cáncer de ovario OVCAR3 (FSHR+), que es el mejor modelo disponible para evaluar la eficacia preclínica de linfocitos T-CER para tumores que expresan FSHR (supervivencia). Los CER dirigidos a FSH se expresan con el vector viral desarrollado para las pruebas clínicas. Se usan linfocitos T humanos reducidos en monocitos de la aféresis de donantes sanos HLA-A2+ para la transducción de la variante de linfocitos T-CER dirigidos a FSH (humana). Debido a que los ratones NSG no tienen linfocitos T, NK o B, los linfocitos T transferidos adoptivamente experimentan la expansión homeostática de todas formas, que hace innecesaria la linforreducción (irradiación subletal). El objetivo de estos estudios es identificar posibles efectos secundarios restringidos al uso de linfocitos T humanos. Por ejemplo, se conoce que la IL-6 humana señaliza en receptores de ratón y, por lo tanto, se podría detectar un posible síndrome de liberación de citocinas.

En ambos conjuntos de experimentos, se monitorizan las siguientes lecturas:

Se monitoriza el estado de salud de los ratones y se clasifica en una escala de 1 a 4: 1 - normal y sano; 1,5 - cierto letargo, camina un poco lento; 2 - se mueve lentamente y arrastra ligeramente una extremidad; 2,5 - arrastra las extremidades cuando se mueve; 3 - postura encorvada y poco movimiento; 3,5 - tumbado sobre un lado, ningún movimiento o poco movimiento después de tocarlo; 4 - muerte. Se sacrifica una cohorte de ratones (>5/grupo) entre 6 y 20 horas después de la infusión de linfocitos T y se registra su estado de salud. Se registran las posibles diferencias en la presencia CER frente a HBSS, y entre la presencia frente a la ausencia de tumor. Si los ratones experimentaron signos de deterioro de la salud de grado 3-4, se recoge suero para la cuantificación de los niveles circulantes de IL-6, ya que esta citocina es responsable del síndrome de liberación de citocinas observado en algunos pacientes.

Los presentes inventores también miden y registran el peso corporal en cada día de la infusión de linfocitos T y los tres días posteriores. Los presentes inventores continúan monitorizando el peso corporal durante todos los experimentos. Si los ratones experimentaron >10 % de pérdida de peso corporal en 24 h se sacrifican. De otro modo, el peso corporal registrado se compara con ratones de control, y también en presencia frente a en ausencia de un tumor.

Se analizan las secciones de tejido en un modo cegado en todos los ratones sacrificados. Se examinan el hígado, el páncreas, el bazo, el intestino delgado, el intestino grueso, el corazón, el riñón y el pulmón para signos de daño tisular en la tinción H&E, así como la presencia de infiltrados inflamatorios (CD45+) por IHC. Se compara la acumulación de leucocitos en tejidos sanos en ratones tratados con linfocitos T-CER frente a HBSS, y también en presencia frente a ausencia de tumor. Se monitoriza además la presencia de glóbulos rojos en el espacio alveolar o las vías respiratorias para detectar hemorragia aguda.

Se monitoriza la supervivencia en ratones sin tumor frente a con tumor que reciben una infusión única de linfocitos T-CER frente a linfocitos T de control. Si los ratones infundidos con la mayor dosis (5 x107 células) de linfocitos T-CER dirigidos a FSH padecen toxicidad aguda intensa, se sacrifican independientemente de si tienen tumores.

Estos experimentos definen la dosis máxima tolerada para la infusión única de los linfocitos T dirigidos a FSH de los presentes inventores.

Dosis máxima tolerada para administraciones de dosis múltiples

La DMT de dosis única es probable entre 2 x 106 y 5 x 107 de linfocitos T-CER dirigidos a FSH. Para determinar la toxicidad de múltiples administraciones de linfocitos T-CER dirigidos a FSH análogas a una pauta terapéutica en un ámbito clínico, se evalúan la toxicidad dependiente de tumor, específica de receptores de FSH y no específica después de la infusión de linfocitos T-CER dirigidos a FSH. Se usan tanto xenoinjertos humanos como sistemas de ratón inmunocompetente para predecir posibles efectos secundarios en un ámbito clínico.

Para determinar si múltiples infusiones en esta dosis darían como resultado toxicidad basándose en la acumulación in vivo de linfocitos T o sensibilización al hospedador, se tratan ratones que tienen tumor y que no tienen tumor con tres infusiones de la DMT de linfocitos T-CER, la misma cantidad de linfocitos T transducidos con vector vacío (control), o HBSS. Los ratones inmunocompetentes que tienen cáncer de ovario ID8-Defb29/Vegf-a transducido con FSHR reciben linfocitos T de ratón primarios transducidos con la versión de ratón del CER dirigido a FSH de los presentes inventores. Se tratan células de cáncer de ovario humano OVCAR3 FSHR+HLA-A2+ que crecen en ratones inmunodeficientes con linfocitos T-CER dirigidos a FSH HLA-A2+ humana. Para maximizar la probabilidad de toxicidad asociada al tumor, se tratan ratones en momentos de tiempo posteriores, una vez se han establecido los tumores. Los ratones con tumores de ovario ID8-Defb29/Vegf-a ortotópico empiezan el tratamiento en el día 21 después de la exposición al tumor, cuando es evidente la ascitis en ausencia de tratamiento. Las inyecciones se repiten separadas 7 días (días 28 y 32 después de la exposición al tumor). Para ratones que tienen el tumor OVCAR3, los tratamientos se inician cuando los tumores son palpables o se han establecido claramente, como se ha determinado por ultrasonidos. Las inyecciones posteriores se administran separadas una semana. No se espera que los ratones NSG que reciben linfocitos T humanos muestren signos de GVHD antes de 30 días desde la primera infusión, que proporciona un tiempo de evolución suficientemente largo para definir la toxicidad en función de la eficacia. Tratando los tumores en etapas avanzadas, los presentes inventores prevén un beneficio significativo de la supervivencia para los ratones tratados con linfocitos T-CER dirigidos a FSH, pero los presentes inventores no esperan una eliminación tumoral total. Los ratones NSG tratados con linfocitos T-CER humanos se sacrifican en el día 28 después de la primera administración de linfocitos T. Nuevamente, se usan 5 ratones por grupo para cada experimento.

Se monitorizan las mismas lecturas que se ha descrito anteriormente, es decir, estado de salud, peso corporal, histología y supervivencia. Los presentes inventores no esperan identificar signos de toxicidad después de la segunda y tercera administraciones. Los presentes inventores comparan cómo la presencia frente a la ausencia de un tumor influye en la toxicidad. En el inesperado caso de que se observe una toxicidad significativa después de inyecciones repetidas, los presentes inventores disminuyen gradualmente la segunda y tercera infusión, empezando con el 50 % de la DMT previamente determinada, y administrando la dosis completa en la última inyección. Se prueban reducciones posteriores (50 %) de las dos últimas inyecciones si la toxicidad persiste. Se evalúa el peso corporal empezando en el día de cada infusión de linfocitos T y tres días después. Los presentes inventores monitorizan el peso corporal durante todo el experimento. Los presentes inventores prevén una ligera disminución (~1 %) en el peso corporal un día después de estas infusiones, que refleja probablemente el estrés de la manipulación y la inyección. Sin embargo, los presentes inventores no esperan pérdidas de peso importantes. Si ocurren, los presentes inventores disminuyen gradualmente la segunda y tercera inyecciones. Los presentes inventores recogen hígado, páncreas, bazo, intestino delgado, intestino grueso, corazón, riñón y pulmón de todos los ratones sacrificados y generan secciones histológicas para el análisis de daño tisular obvio e infiltrados inflamatorios. Se comparan patrones histológicos después del tratamiento con linfocitos T de control frente a linfocitos T-CER, y la administración en presencia frente a en ausencia de tumor. La supervivencia se monitoriza en ratones sin tumor frente a con tumor que reciben dosis múltiples de linfocitos T-CER frente a linfocitos T de control. Los presentes inventores no esperan diferencias en la supervivencia de ratones que no tienen tumor. Sin embargo, los presentes inventores prevén que los ratones que tienen tumor avanzado que reciben dosis múltiples de linfocitos T-CER dirigidos a FSH presentarán supervivencia significativamente mayor que los tratados con linfocitos T de control (transducidos con vector vacío). Se registra la supervivencia en todos los grupos.

EJEMPLO 16 - EVALUACIÓN DE BIOMARCADORES

Es importante la capacidad de monitorizar la FC/FD de los linfocitos T infundidos para la interpretación de resultados, la determinación de mecanismo y la identificación de posibles efectos adversos en una fase temprana en la clínica. Además, una consideración importante es que el CER puede llegar a ser inmunogénico3132. La expresión de una hormona endógena en el CER dirigido a FSH de los presentes inventores minimiza los posibles efectos secundarios. Se crean epítopes novedosos en la unión de fusión de dominios de señalización humanos que no se yuxtaponen normalmente (por ejemplo, las regiones de unión de CD28 y CD3Z, o las regiones de unión de CGa y la región de bisagra). La inmunogenicidad del CER puede conducir al rechazo de los linfocitos T adoptivamente transferidos y provocar reacciones inflamatorias. Como un medio para entender la función in vivo de linfocitos T-CER dirigidos a FSH y los efectos secundarios teóricos, los presentes inventores evalúan los biomarcadores específicos de actividad celular en el suero. Se analiza el suero usando ELISA y ensayos habituales para los siguientes marcadores:

Las citocinas son factores pronósticos importantes de tanto la actividad in vivo de linfocitos T-CAR contra células tumorales (por ejemplo, lisis tumoral) como posibles reacciones alérgicas/inflamatorias. Las siguientes citocinas inflamatorias se determinan por ELISA en el suero de ratones tratados y de control: IL-6, IFN-y y TNF-a. De esos, se espera que la IL-6 muestre la correlación más fuerte con alteraciones obvias del comportamiento o cambios en el peso corporal, según la evidencia clínica54. Los presentes inventores prevén algunos aumentos en al menos la IL-6 en los primeros 3 días después de la administración de linfocitos T-CER, en comparación con la infusión de HBSS. Este supuesto mecanismo de toxicidad es bien entendido en la clínica y se conocen intervenciones eficaces (normalmente bloqueantes esteroideos o de IL-6) y se ponen en práctica comúnmente. Estos marcadores de inflamación son útiles en ensayos clínicos para monitorizar pacientes y determinar la dosis inicial. Los presentes inventores no esperan elevaciones sostenidas de citocinas inflamatorias sistémicas >3 días después del tratamiento, aunque, sin embargo, se monitorizan. Se registran los posibles cambios y se correlacionan con respuestas clínicas. Se usan estos marcadores indirectos para determinar el nivel mínimo de efecto biológico previsto.

La hiperferritinemia, que alcanza el punto máximo en los días 2-3, es otro marcador indirecto importante de un síndrome de liberación de citocinas en la clínica57. Los presentes inventores determinan la concentración de ferritina en suero en ratones de control frente a tratados, y se correlacionan los niveles con deterioro de la salud, pérdida de peso y cambios histológicos.

Se mide la creatinina como un indicador del posible daño de la función renal. Se comparan los valores en ratones de control con aquellos en ratones que reciben linfocitos T-CER dirigidos a FSH. Nuevamente, los presentes inventores no prevén daño renal debido a la administración de linfocitos T-CER.

Se determina AST como un indicador del posible daño al hígado. Se correlacionan los análisis histológicos de los tejidos del hígado con los valores de AST, que incluye el posible crecimiento tumoral en el hígado, ya que el cáncer de ovario es una enfermedad peritoneal. Se comparan los valores en ratones de control que reciben HBSs con los de ratones infundidos con linfocitos T-CER. Según la evidencia clínica con otras formulaciones de CER, los presentes inventores no esperan que el tratamiento con linfocitos T dirigidos a FSH afecte adversamente el hígado.

Los presentes inventores creen, basándose en la información clínica de que un factor pronóstico importante de protección a largo plazo cuando se eligen como diana determinantes tumorales son verdaderamente específicos, es la persistencia de linfocitos T adoptivamente transferidos. Los presentes inventores analizan la acumulación de linfocitos T-CER dirigidos a FSH en ganglios linfáticos, médula ósea y tejido tumoral (si no se rechazan los tumores) de diferentes ratones NSG que tienen xenoinjerto (>5/grupo). Analizando los ganglios linfáticos disociados y la médula ósea en los días 7 y 14 después de la transferencia adoptiva (antes de que tenga lugar GVHD56), la citometría de flujo determina el fenotipo de linfocitos T-CER persistentes (CD3+, ya que los ratones NSG no tienen linfocitos T o B) en términos de adquisición de atributos de memoria (linfocitos CD45RA-CD62L+CCR7+CD122+). Así, aunque los ratones inmunodeficientes son probablemente permisivos, la presencia de un dominio coestimulante en linfocitos T humanos transferidos promueve el injerto a largo plazo y la diferenciación de memoria. Esto se interpreta como un factor pronóstico de eficacia terapéutica posterior, pero puede tener una reflexión en los niveles de citocinas circulantes.

Para más seguridad, se usan inicialmente en los ratones dosis de masa muy inferiores a la dosis tóxica, aunque la dosis se aumenta gradualmente lentamente a medida que los pacientes se monitorizan para signos de toxicidad. En un estudio conocido, la dosis máxima tolerada (DMT) en ratones NSG con mesotelioma humano tratados con linfocitos T-CAR anti-mesotelina fue 50 x107 células/ratón. Los presentes inventores prevén resultados similares o mejores, dada la especificidad de la diana de los presentes inventores. Basándose en la evidencia preclínica con diferentes protocolos de transferencia adoptiva de linfocitos T 73043, la administración es hasta 3 inyecciones a la semana. Sin embargo, los protocolos clínicos se basan en infundir linfocitos T-CAR en el transcurso de 3 días28. Si se observa toxicidad significativa después de la tercera inyección semanal, se ajustan las de linfocitos T-CER para su tolerancia cuando se administran durante 3 días consecutivos.

EJEMPLO 17 - NIVEL DE EFECTO BIOLÓGICO PREVISTO MÍNIMO (MABEL)

El nivel de efecto biológico previsto mínimo para los seres humanos se basa en la dosis o concentración más baja para los animales requerida para producir datos de actividad in vivo y/o in vitro en sistemas animales/humanos. MABEL se define mediante datos de dosis-respuesta de estudios in vivo en ratones NSG que tienen tumor humano tratados con linfocitos T-CER. Se generan curvas de dosis/concentración-efecto derivadas de datos experimentales y se extrapolan de animal a humano para iniciar cuidadosos aumentos graduales de dosis. El punto de partida es la dosis que corresponde al efecto biológico mínimo, usando los biomarcadores definidos anteriormente como marcadores indirectos.

Para determinar MABEL, se exponen diferentes ratones NSG a células de cáncer de ovario OVCAR3 (FSHR+) inyectadas en la bolsa ovárica (n>5/grupo). Cuando los tumores son palpables y muestran tamaño similar por ultrasonidos (~300 mm3), se expresan CER dirigidos a FSH con el vector viral en linfocitos T humanos expandidos en CD3/CD28 de la aféresis de donantes sanos HLA-A2+. Se transduce una variante de linfocito T-CER dirigida a FSH seleccionada (humana) y se administra la máxima dosis de linfocitos T-CER sin efectos adversos observados. Los ratones de control reciben HBSS. Se determinan nuevamente IL-6, IFN-y , TNF-a y ferritina en suero en los momentos de tiempo donde se observan los aumentos (es decir, se espera que ocurra solo en los 3 primeros días). Basándose en este nivel basal, se tratan de forma idéntica diferentes cohortes de ratones que tienen tumor con dosis de linfocitos T-CER disminuidas gradualmente en 50 %, hasta que desaparece cualquier aumento en las citocinas anteriormente mencionadas (en comparación con ratones de control) (llega a ser el mismo que en el grupo de control). Esta cantidad de linfocitos T-CER dirigidos a FSH, calculada en términos de peso corporal, se usa para definir la dosis inicial para intervención humana.

Los pacientes reciben actualmente entre 107 y 108 linfocitos T transducidos con diferentes CER por kg de peso corporal en los ensayos en curso28. Considerando que los presentes inventores no han observado toxicidad perceptible en ratones a las dosis de 109/kg de peso corporal (~107 linfocitos T-CER/ratón; ~30 g/ratón; FIG. 3), los presentes inventores prevén que se puede ajustar una dosis inicial segura y aumentar gradualmente en diferentes pacientes para alcanzar un "Nivel de efecto adverso no observable" por debajo de estas cantidades. Para más seguridad, se sigue durante 3 días un enfoque de "dosis dividida" de la administración, administrando linfocitos T transducidos con CER usando 10 % del total previsto en el día 0, 30 % en el día 1 y 60 % en el día 2, empezando 2 días después de la quimioterapia28

Los presentes inventores analizan los lotes de prueba del virus inicial para determinar qué clon está produciendo un alto título de virus de CER dirigido a FSH, por tanto, análisis por qPCR como ELISA para FSH humana. Los presentes inventores transducen linfocitos T humanos con este virus, y determinan la expresión de FSHp, CD3, CD4 y CD8 por citometría de flujo, y la producción de IFN-y después del cultivo conjunto con células tumorales FSHR+ OVCAR3 (como en la FIG. 2). Los presentes inventores seleccionan los clones celulares que producen los títulos más altos para la expansión, prueba y producción del banco de células maestras. Este banco de células maestras se puede usar como una fuente de células productoras de virus para estudios adicionales.

Los presentes inventores prueban entonces el producto para asegurar la seguridad de los productos biológicos que incluyen pruebas de (1) esterilidad, (2) micoplasma, y (3) agentes virales adventicios, siguiendo las pautas de la f Da .

EJEMPLO 18 - PERSISTENCIA DE LINFOCITOS T-CER EN SANGRE PERIFÉRICA

Se define un ensayo de qPCR para determinar el tráfico y la persistencia de linfocitos T-CER adoptivamente transferidos in vivo en sangre periférica. Se diseñan cebadores y sondas TaqMan para abarcar las uniones entre la secuencia de CGa y los dominios transmembranarios del CER, que no están presentes naturalmente en ninguna célula en los pacientes. Además, se optimiza un análisis de citometría de flujo de linfocitos T-CER transferidos basándose en la detección de FSHp en linfocitos T transducidos (CD3+), marcando fluorescentemente anticuerpos anti-FSH humana disponibles, o usando un anticuerpo primario anti-FSH y un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado. El seguimiento de linfocitos T transferidos incluye anticuerpos contra CD4 y CD8 en el ensayo, para comprender mejor los mecanismos de eficacia terapéutica. Estos reactivos se prueban en una nueva cohorte de ratones NSG que tienen tumor OVCAR3 (>5) adoptivamente transferido con linfocitos T A2+ de donantes sanos transducidos con el vector de calidad clínica y procedimientos. Este experimento verifica la eficacia del nuevo reactivo contra el crecimiento tumoral.

La toxicidad primaria prevista es si los linfocitos T provocarán la inflamación por destrucción de las células tumorales que expresan la diana. Después de establecer la dosis inicial, el aumento gradual de dosis convencional se basa conservativamente en incrementos triples. Debido a que los presentes inventores usan FSH endógena, el riesgo de anafilaxia o direccionamiento inmunitario de los linfocitos T-CAR previamente descritos para scFv xenógeno (murino) es despreciable. Y, lo que es más importante, la expresión del receptor de FSH se ha limitado al ovario a lo largo de millones de años de evolución. Debido a que se extirpa rutinariamente en los pacientes con cáncer de ovario y ningún otro órgano debe unirse a la hormona FSH, los presentes inventores esperan que los linfocitos T-CER dirigidos a FSH representen una intervención segura y eficaz.

EJEMPLO 19 - USO DE CÉLULAS TALL COMO PLATAFORMA UNIVERSAL

Se han expresado construcciones de CER en células TALL-103/2 y en células TALL-104 (ATCC CRL11386; patente de EE. UU. N° 5.702.702), para redirigir su potencial citotóxico hacia tumores FSHR+ mediante ligando en vez de un scFv, pero usando de otro modo los dominios activantes satisfactoriamente usados contra leucemias.

La optimización de células TALL-103/2 como una plataforma alógena universal es una realización, debido a que crecen significativamente más rápido que las células TALL-104 in vitro y, por lo tanto, serán más fáciles de manipular para la producción a gran escala. Sin embargo, los presentes inventores también usarán células TALL-104, que transitan espontáneamente a lechos tumorales. La expresión de receptores quiméricos dirigidos a FSH potencia el potencial terapéutico de células TALL-103/2 y TALL-104, redirigiendo su actividad citotóxica hacia células de cáncer de ovario FSHR+ mediante su ligando endógeno (no inmunogénico). Los resultados preliminares muestran que la transducción del CER de FSH de los presentes inventores fortalece las células TALL-103/2 o TALL-104 para destruir células de cáncer de ovario espontáneamente que expresan FSHR significativamente más eficazmente que sus homólogos transducidos con vector vacío. Las células TALL-CER que se dirigen a FSH son capaces de destruir específicamente y eficazmente células de cáncer de ovario que expresan FSHR y suprimir la progresión maligna en modelos de cáncer de ovario clínicamente relevantes sin efectos adversos significativos. Se prevé que estos resultados se traduzcan a pacientes con cáncer de ovario en ensayos clínicos posteriores.

Los presentes inventores ya han transducido y seleccionado células TALL-103/2 y TALL-104 con retrovirus de CMSP que codifican CER dirigidos a FSHR humano. Para demostrar que la actividad citolítica espontánea (de tipo NK) de células TALL-103/2 puede ser significativamente potenciada mediante la expresión del CER dirigido a FSH de los presentes inventores, los presentes inventores realizaron otra vez los experimentos de citotoxicidad in vitro usando células OVCAR3 de cáncer de ovario humano (A2+FSHR+) como dianas. Como se muestra en la FIG. 12, las células TALL-103/2 transducidas con vector vacío mostraron, como era de esperar, cierta actividad antitumoral dependiente de la dosis contra células de cáncer de ovario. Sin embargo, la expresión del CER dirigido a FSH de los presente inventores intensificó esta estirpe celular para eliminar ~60 % de las células tumorales en relaciones efectoras:diana de tan solo 1:4. Estos experimentos respaldan el potencial de redirigir la plataforma alógena universal de los presentes inventores más específicamente contra tumores de ovario FSHR+ (70 %) mediante la expresión de CER de FSH. Es digno de mención que las células CER TALL-103/2 dirigidas a FSH crecen en los biorreactores de los presentes inventores tan eficazmente como las células parentales. Este experimento proporcionó una prueba de concepto para un sistema posiblemente más seguro y universalmente accesible; concretamente, combinar la actividad terapéutica espontánea de células TALL-103/2 o TALL 104 con el poder del receptor activante que se dirige a FSH de los presentes inventores, para maximizar su especificidad; y su actividad citotóxica antitumoral.

Y, lo que es más importante, la actividad citotóxica espontánea de células TALL-103/2 en ausencia de expresión de CAR/CER está restringida a dianas susceptibles a NK que expresan ligandos de NKG2D, tales como células leucémicas K562 y U937, mientras que las células sanas son completamente perdonadas de la destrucción citotóxica. Además, es poco probable que las células TALL-103/2 provoquen GVHD tras la administración en pacientes, debido a que expresan un único TCR (y5), como se demostró para todas las células TALL-104. Sin embargo, la actividad efectora de células TALL-103/2 se puede provocar mediante la activación de CD3 o la administración de IL-2. Junto con su crecimiento ex vivo más rápido en biorreactores, en comparación con células TALL-104 clínicamente disponibles, estos atributos hacen que las células TALL-103/2 sean plataformas alogénicas posiblemente superiores para el redireccionamiento de su potencial antitumoral mediante la expresión de CER dirigidos a FSH de los presentes inventores. Sin embargo, las células TALL-104 también son deseables para este uso ya que transitan espontáneamente a lechos tumorales.

REFERENCIAS

1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z. & Jemal, A. Cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin 64, 9-29 (2014).

2. Curiel, T.J., et al. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med 10, 942-949 (2004).3

3. Zhang, L., et al. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer. N Engl J Med 348, 203-213 (2003).

4. Cubillos-Ruiz, J.R., et al. Polyethylenimine-based siRNA nanocomplexes reprogram tumor-associated dendritic cells via TLR5 to elicit therapeutic antitumor immunity. J Clin Invest 119, 2231 -2244 (2009).

5. Cubillos-Ruiz, J.R., et al. CD277 is a Negative Co-stimulatory Molecule Universally Expressed by Ovarian Cancer Microenvironmental Cells. Oncotarget 1,329-328 (2010).

6. Huarte, E., et al. Depletion of dendritic cells delays ovarian cancer progression by boosting antitumor immunity. Cancer Res 68, 7684-7691 (2008).

7. Nesbeth, Y., et al. CCL5-mediated endogenous antitumor immunity elicited by adoptively transferred lymphocytes and dendritic cell depletion. Cancer Res 69, 6331-6338 (2009).

8. Scarlett, U.K., et al. In situ stimulation of CD40 and Toll-like receptor 3 transforms ovarian cancer-infiltrating dendritic cells from immunosuppressive to immunostimulatory cells. Cancer Res 69, 7329-7337 (2009).

9. Scarlett, U.K., et al. Ovarian cancer progression is controlled by phenotypic changes in dendritic cells. J Exp Med 209, 495-506 (2012).

10. Cubillos-Ruiz, J.R., et al. Reprogramming tumor-associated dendritic cells in vivo using microRNA mimetics triggers protective immunity against ovarian cancer. Cancer Res 72, 1683-1693 (2012).

11. Porter, D.L., Levine, B.L., Kalos, M., Bagg, A. & June, C.H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med 365, 725-733 (2011).

12. Maus, M.V., Grupp, S.A., Porter, D.L. & June, C.H. Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignancies. Blood 123, 2625-2635 (2014).

13. Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med 3, 95ra73 (2011).

14. Simoni, M., Gromoll, J. & Nieschlag, E. The follicle-stimulating hormone receptor: biochemistry, molecular biology, physiology, and pathophysiology. Endocr Rev 18, 739-773 (1997).

15. Vannier, B., Loosfelt, H., Meduri, G., Pichon, C. & Milgrom, E. Anti-human FSH receptor monoclonal antibodies: immunochemical and immunocytochemical characterization of the receptor. Biochemistry 35, 1358­ 1366 (1996).

16. Zhang, X.Y., et al. Follicle-stimulating hormone peptide can facilitate paclitaxel nanoparticles to target ovarian carcinoma in vivo. Cancer Res 69, 6506-6514 (2009).

17. Al-Timimi, A., Buckley, C.H. & Fox, H. An immunohistochemical study of the incidence and significance of human gonadotrophin and prolactin binding sites in normal and neoplastic human ovarian tissue. Br J Cancer 53, 321-329 (1986).

18. Hall, J.E. Neuroendocrine changes with reproductive aging in women. Semin Reprod Med 25, 344-351 (2007).

19. Ramakrishna, V., et al. Naturally occurring peptides associated with HLA-A2 in ovarian cancer cell lines identified by mass spectrometry are targets of HLA-A2-restricted cytotoxic T cells. Int Immunol 15, 751 -763 (2003).

20. Choi, J.H., Choi, K.C., Auersperg, N. & Leung, P.C. Overexpression of follicle-stimulating hormone receptor activates oncogenic pathways in preneoplastic ovarian surface epithelial cells. J Clin Endocrinol Metab 89, 5508­ 5516 (2004).

21. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin 59, 225-249 (2009).

22. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2008. CA Cancer J Clin 58, 71-96 (2008).

23. Coukos, G., Conejo-Garcia, J.R., Roden, R.B. & Wu, T.C. Immunotherapy for gynaecological malignancies. Expert Opin Biol Ther 5, 1193-1210 (2005).

24. Conejo-Garcia, J.R., et al. Ovarian carcinoma expresses the NKG2D ligand Letal and promotes the survival and expansion of CD28- antitumor T cells. Cancer Res 64, 2175-2182 (2004).

25. Hamanishi, J., et al. Programmed cell death 1 ligand 1 and tumor-infiltrating CD8+ T lymphocytes are prognostic factors of human ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U SA 104, 3360-3365 (2007).

26. Sato, E., et al. Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA 102, 18538-18543 (2005).

27. Urba, W.J. & Longo, D.L. Redirecting T cells. N Engl J Med 365, 754-757 (2011).

28. Maude, S.L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med 371, 1507-1517 (2014).

29. Huarte, E., et al. PILAR is a novel modulator of human T-cell expansion. Blood 112, 1259-1268 (2008). 30. Stephen, T.L., et al. Transforming Growth Factor beta-Mediated Suppression of Antitumor T Cells Requires FoxP1 Transcription Factor Expression. Immunity 41,427-439 (2014).

31. Lamers, C.H., et al. Immune responses to transgene and retroviral vector in patients treated with ex vivoengineered T cells. Blood 117, 72-82 (2011).

32. Maus, M.V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunol Res 1,26-31 (2013).

33. Conejo-Garcia, J.R., et al. Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med 10, 950-958 (2004).

34. Rutkowski, M.R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. J Vis Exp (2014).

35. Song, D.G., et al. In vivo persistence, tumor localization, and antitumor activity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimulatory signaling through CD137 (4- 1 b B). Cancer Res 71,4617-4627 (2011).

36. Milone, M.C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther 17, 1453-1464 (2009).

37. Heslop, H.E., et al. Long-term outcome of EBV-specific T-cell infusions to prevent or treat EBV-related lymphoproliferative disease in transplant recipients. Blood 115, 925-935 (2010).

38. Scholler, J., et al. Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells. Sci Transl Med 4, 132ra153 (2012).

39. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med 3, 89-101 (2011).

40. Brentjens, R.J. & Curran, K.J. Novel cellular therapies for leukemia: CAR-modified T cells targeted to the CD19 antigen. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2012, 143-151 (2012).

41. Hollyman, D., et al. Manufacturing validation of biologically functional T cells targeted to CD19 antigen for autologous adoptive cell therapy. JImmunother 32, 169-180 (2009).

42. Pule, M.A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med 14, 1264-1270 (2008).

43. Nesbeth, Y.C., et al. CD4+ T cells elicit host immune responses to MHC class II- ovarian cancer through CCL5 secretion and CD40-mediated licensing of dendritic cells. J Immunol 184, 5654-5662 (2010).

44. Porter, D.L., et al. A phase 1 trial of donor lymphocyte infusions expanded and activated ex vivo via CD3/CD28 costimulation. Blood 107, 1325-1331 (2006).

45. Terakura, S., et al. Generation of CD19-chimeric antigen receptor modified CD8+ T cells derived from virusspecific central memory T cells. Blood 119, 72-82 (2012).

46. Maines-Bandiera, S.L., et al. Epithelio-mesenchymal transition in a neoplastic ovarian epithelial hybrid cell line. Differentiation 72, 150-161 (2004).

47. Ellis, J.M., et al. Frequencies of HLA-A2 alleles in five U.S. population groups. Predominance Of A*02011 and identification of HLA-A*0231. Hum Immunol 61,334-340 (2000).

48. Ritchie, D.S., et al. Persistence and efficacy of second generation CAR T cell against the LeY antigen in acute myeloid leukemia. Mol Ther 21, 2122-2129 (2013).

49. Amatangelo, M.D., et al. Three-dimensional culture sensitizes epithelial ovarian cancer cells to EZH2 methyltransferase inhibition. Cell Cycle 12, 2113-2119 (2013).

50. Nesbeth, Y. & Conejo-Garcia, J.R. Harnessing the effect of adoptively transferred tumor-reactive T cells on endogenous (host-derived) antitumor immunity. Clin Dev Immunol 2010, 139304 (2010).

51. Siraj, A., et al. Expression of follicle-stimulating hormone receptor by the vascular endothelium in tumor metastases. BMC Cancer 13, 246 (2013).

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Una construcción de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; en donde el ligando comprende una hormona foliculoestimulante (FSH) o fragmento o modificación de la misma, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma se une al receptor de la hormona foliculoestimulante (FSHR) humana, y en donde la proteína quimérica es capaz de activar un linfocito T humano modificado que expresa la proteína quimérica.

2. La construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma comprende una subunidad FSHp, una subunidad FSHp separada por una secuencia conectora a una subunidad FSHa o una subunidad FSHp separada por una secuencia conectora a una segunda subunidad FSHp.

3. Un vector que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Una proteína quimérica que comprende un ligando, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización; en donde el ligando comprende una hormona foliculoestimulante (FSH) o fragmento o modificación de la misma, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma se une al receptor de la hormona foliculoestimulante (FSHR) humana, y en donde la proteína quimérica es capaz de activar un linfocito T humano modificado que expresa la proteína quimérica.

5. La proteína según la reivindicación 4, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma comprende una subunidad FSHp, una subunidad FSHp separada por una secuencia conectora a una subunidad FSHa o una subunidad FSHp separada por una secuencia conectora a una segunda subunidad FSHp.

6. Un linfocito T humano modificado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína quimérica que comprende un ligando, un dominio de bisagra extracelular, un dominio transmembranario, una región de señalización coestimulante y un endodominio de señalización, en donde el ligando comprende una hormona foliculoestimulante (FSH) o fragmento o modificación de la misma, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma se une al receptor de la hormona foliculoestimulante (FSHR) humana en un tumor que expresa FSHR, y en donde la proteína quimérica es capaz de activar el linfocito T humano modificado.

7. El linfocito T humano modificado según la reivindicación 6, en donde el linfocito T humano modificado no expresa la proteína Forkhead Box (Foxp1).

8. El linfocito T humano modificado según la reivindicación 6, en donde el linfocito T humano modificado es un linfocito T humano autólogo o linfocito T citolítico natural (NK) obtenido de un sujeto o un linfocito T humano o linfocito T citolítico natural (NK) de un donante compatible de trasplante de médula ósea para el sujeto.

9. El linfocito T humano modificado según la reivindicación 6, en donde la FSH o fragmento o modificación de la misma comprende una subunidad FSHp, una subunidad FSHp separada por una secuencia conectora a una subunidad FSHa o una subunidad FSHp separada por una secuencia conectora a una segunda subunidad FSHp.

10. Una composición que comprende el linfocito T humano modificado según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto humano, en donde el cáncer comprende un tumor que expresa FSHR.

12. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde dicho linfocito T humano modificado se genera a partir de un linfocito T humano autólogo o linfocito T citolítico natural (NK) obtenido del sujeto, un linfocito T humano heterólogo o linfocito T NK de un donante compatible de trasplante de médula ósea para el sujeto, o una estirpe de linfocitos T humanos.

13. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde el ligando comprende una subunidad FSHp que existe de forma natural o modificada.

14. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde el sujeto tiene cáncer de ovario.

15. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer es cáncer de la próstata, mama, colon, páncreas, vejiga urinaria, riñón, pulmón, hígado, estómago, testículo u ovario.

16. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde el cáncer se encuentra en células de los vasos sanguíneos de tumores primarios o metastásicos.

17. La composición para su uso según la reivindicación 16, en donde la composición se dirige a endotelio alterado encontrado en tumores metastásicos.

18. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde dicha composición se administra por vía sistémica por administración intraperitoneal, intravenosa, intratumoral o intranodal.

19. La composición para su uso según la reivindicación 11, para su uso en combinación con quimioterapia y reducción de los linfocitos del sujeto.

20. La composición para su uso según la reivindicación 11, en donde el tumor es un tumor epitelial.