ES2905557T3

ES2905557T3 - Receptor de antígeno quimérico anti-CD30 y su uso

Info

Publication number: ES2905557T3
Application number: ES14756036T
Authority: ES
Inventors: Markus Chmielewski; Andreas Hombach; Hinrich Abken
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2022-04-11
Anticipated expiration: 2034-08-26
Also published as: CN105940102A; DK3039040T3; EP3039040A1; JP2016528899A; CN105940102B; US10808035B2; US12404338B2; EP3995512A1; EP3039040B1; US20200407458A1; WO2015028444A1; JP6285553B2; US20160200824A1

Abstract

Polipéptido de receptor de antígeno quimérico (CAR), conteniendo el CAR al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: i) un péptido scFv de HRS3 de dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30 de SEQ ID NO: 2, ii) opcionalmente un dominio espaciador; iii) un dominio transmembrana; y iv) un dominio citoplasmático que comprende: - un dominio de señalización de CD28 citoplasmático que tiene SEQ ID NO: 6 y que carece del motivo de unión a Ick, y - un dominio de señalización de RI gamma de Fcépsilon o CD3-zeta.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor de antígeno quimérico anti-CD30 y su uso

Campo técnico

La presente invención se refiere a receptores de antígeno quiméricos (CAR) adecuados para su uso en terapia celular adoptiva para tratar un cáncer CD30+ en un sujeto que lo necesita.

Técnica anterior

La transferencia adoptiva de células T ha demostrado una eficacia significativa en el tratamiento de tumores malignos y puede ser curativa en pacientes con diversas enfermedades, incluyendo la leucemia. Habitualmente, las células T derivadas del paciente se modifican por ingeniería ex vivo para expresar un receptor de células T recombinante (TCR), alternativamente, un receptor de antígeno quimérico (CAR). Dicho receptor de antígeno quimérico se compone normalmente de un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de un anticuerpo y un dominio de activación de células T intracelular derivado de un endodominio del receptor de células T de señalización. A diferencia del TCR fisiológico, el CAR se compone de una sola cadena de polipéptido que combina la unión a antígenos a través del resto extracelular con una maquinaria de activación de células T proporcionada por el resto de señalización intracelular. Por tanto, debido al dominio de unión derivado de anticuerpo, las células T modificadas con CAR reconocen su diana, habitualmente un antígeno de la superficie celular, independientemente de la presentación por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y no se ven comprometidas por variantes de células tumorales con una posesión de antígeno reducida o deficiente, que representa un mecanismo observado comúnmente de escape inmunitario tumoral.

Durante los últimos años, los CAR están en el punto de mira de amplias actividades de investigación. En particular, la capacidad citolítica de las células T con CAR está en el punto de mira de la terapia celular adoptiva. Recientes ensayos clínicos para tratar el cáncer han puesto de manifiesto el potencial de la terapia adoptiva con células T redirigidas con cAr . Por ejemplo, los pacientes con neuroblastoma tratados con células T con CAR específicas de gangliósido GD2 mostraron algunos efectos antitumorales alentadores, aunque las células T sólo persistieron durante un breve periodo. Estudios adicionales demostraron el concepto de que las células T modificadas por ingeniería con CAR pueden iniciar una respuesta antitumoral productiva en pacientes que padecen leucemia linfocítica crónica y aguda. El enfoque de las células T con ^cA^rdifiere de otras estrategias de inmunoterapia mediada por anticuerpos, por ejemplo, mediante el uso de inmunotoxinas, en la medida en que se usan células modificadas por ingeniería en lugar de moléculas individuales.

En los últimos años, se han realizado esfuerzos en la optimización del diseño de CAR, véase, por ejemplo, Bridgeman J.S., et al., Curr Gene Ther 2010, 10, 77-90. Sin embargo, siguen existiendo muchos desafíos, en particular, la necesidad de una respuesta antitumoral más eficaz y la prolongación de la supervivencia de las células T que permita la persistencia a largo plazo de dichas células T modificadas por ingeniería en el organismo. Además, aún no se han identificado las señales coestimuladoras necesarias para mantener la persistencia y la activación de las células T durante la aplicación clínica. Por tanto, todavía queda trabajo para optimizar cAr para diversos enfoques, incluyendo inmunoterapia adoptiva.

Ya en 1999, Hombach A., et al., J. Immunotherapy, 1999, 22(6), 473-480, describieron un receptor quimérico de células T con especificidad para el antígeno CD30 asociado con el linfoma de Hodgkin. En ese documento se identifica que la reticulación específica del receptor quimérico induce toxicidad celular sin restricción por CMH contra células diana CD30+ pero no contra células CD30-. Dado que CD30 se expresa no sólo en las células tumorales sino también en células B activadas normales, se dudó en usar CD30 como diana. La suposición se vio respaldada por el informe de Savoldo et al., Blood, 2007, 110(7), 2620 - 2630, que demuestra que las células T con CAR presentan una citólisis aumentada de líneas celulares linfoblastoides de tipo de células B benignas (líneas celulares LCL). El CAR usado en ese documento es un CAR de “primera generación” sin un dominio de CD28 intracelular. Hombach A. et al., Gene Therapy, 2010, 17, 1206-1213 describen la modificación del dominio espaciador Fc de lgG1 en el resto extracelular de CAR para evitar la activación inespecífica por parte de células positivas para el receptor de Fc y el inicio involuntario de una respuesta inmunitaria innata.

En Kofler et al., 2011, Mol. Ther. 19, 760-767 se describe una molécula de CAR que tiene un endodominio de CD28 combinado con un endodominio de CD3zeta y un ectodominio de scFv derivado de anticuerpo específico para CEA. En ese documento se describe que una deleción del resto de unión a Ick en el endodominio de CAR de CD28 mejora la actividad antitumoral redirigida en presencia de células T reguladoras (Treg) sin que se vea afectada la secreción, la proliferación y la citólisis de interferón-gamma. Se especula que los CAR con el endodominio de CD28 modificado agilizan la implementación de la terapia adoptiva con células T en pacientes con una variedad de tipos de cáncer que están muy infiltrados por células Treg.

Hombach et al., Cancer Research, 1998, 58 (6), 1116-1119 identifican un receptor quimérico anti-CD30 que media la activación de células T independiente de CD3-zeta contra células de linfoma de Hodgkin en presencia de CD30 soluble.

Riddell S.R. y Protzer U., Gene therapy, 2010, 17, 1191-1192 describen la obtención de la molécula de CAR tratando en general la cuestión del injerto de receptores de antígeno quiméricos para redirigir células T.

Hombach A. et al., Journal of Immuno Therapy, 1999, 22 (6), 473-480 se refieren a la caracterización de un receptor quimérico de células T con especificidad para el antígeno CD30 asociado al linfoma de Hodgkin.

Además, el documento DE 19640733 A1 describe un método para inhibir la proliferación, la formación de tumores así como la metástasis de células que expresan el antígeno CD30.

Di Stasi A., et al., 2009, Blood, 113 (25), 6392 a 6402, identifican linfocitos T que coexpresan CCR4 y un receptor de antígeno quimérico que selecciona como diana CD30 que tiene una migración dirigida y una actividad antitumoral mejoradas en un modelo de tumor de Hodgkin que también describe linfocitos T que no contienen CCR4 sino una molécula de CAR que selecciona como diana CD30.

Chmielewski M., et al., Gene Therapy, 2011, 18, 62 a 72, describen que la señalización conjunta de CD28 no afecta al umbral de activación en un ataque de células T redirigidas por un receptor de antígeno quimérico.

Además, en Hombach et al., Current Molecular Medicine, 2013, 13(1), 1-10, se proporciona un resumen de la terapia adoptiva del cáncer con células T redirigidas por CAR. En ese documento se resumen los efectos de CAR, incluyendo la actividad de coestimulación, así como la mejora y la prolongación de la respuesta de células T antitumorales redirigidas. Además, se describen los efectos adversos de este tipo de terapia adoptiva, incluyendo la “tormenta de citocinas” y la “represión de células T”.

Además del efecto beneficioso de las células T que expresan CAR en la terapia adoptiva, se conocen efectos secundarios adversos que actualmente dificultan el desarrollo preferido de la terapia respectiva, tal como se mencionó anteriormente. Tal como se describe en los documentos a los que se hace referencia, el desarrollo de CAR da como resultado CAR de segunda y tercera generación, que albergan uno o dos dominios de señalización coestimuladores, tratando de superar los mismos. Sin embargo, un problema pendiente de la terapia adoptiva basada en CAR es que las células T modificadas por ingeniería que expresan el CAR no distinguen entre las células cancerosas malignas (células tumorales) y las células sanas (células no tumorales). Por tanto, un problema importante de la terapia con células T con CAR específicas para el cáncer es minimizar los efectos secundarios sobre los tejidos sanos. Dado que el efecto antitumoral requiere la presencia de células T con CAR a largo plazo, se desea además mejorar la persistencia, la supervivencia y la proliferación de las células T con CAR.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas, y se refiere a un receptor de antígeno quimérico adecuado para su uso en terapia celular adoptiva para tratar un cáncer CD30+, incluyendo leucemia CD30+ o linfoma CD30+, en un sujeto que lo necesita. Cabe destacar que, cuando se expresa en células T, el receptor de antígeno quimérico es tóxico para las células de leucemia CD30+ o las células de linfoma CD30+, pero no es tóxico para las células CD30+ no tumorales (sanas) en dicho sujeto. Además, la expresión del CAR en linfocitos mejora su persistencia y amplificación. Una característica del CAR, tal como se establece en las reivindicaciones, es que carece del dominio Ick en el dominio intracelular de CD28. En una realización particular, el CAR es un polipéptido de SEQ ID NO: 3 codificado por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 4 u homólogos del mismo.

En aspecto adicional, la presente invención se refiere a células T que expresan el CAR de la invención, y a su uso en el tratamiento de cánceres CD30+ tal como se define en las reivindicaciones.

También se contemplan en la invención ácidos nucleicos codificantes correspondientes, vectores, células huésped y kits, tal como se define en las reivindicaciones.

Por último, la invención también se refiere a un método in vitro para mejorar la persistencia y la amplificación de los linfocitos mediante la expresión del CAR de la invención a través de ingeniería genética.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Composición modular de la molécula de CAR n.° 1138 con SEQ ID NO: 3 codificada por un ácido nucleico de SEQ ID NO: 4.

Figura 2: Las células T humanas modificadas por ingeniería expresan el CAR n.° 1138. Se aislaron células T periféricas humanas de la sangre de un donante sano y se modificaron por ingeniería de manera retroviral mediante la transducción del vector n.° 1138. Después de 12 horas, se analizó la expresión de CAR n.° 1138 mediante FACS de dos colores, según SOP_tumorgenetics_FACS, usando un anticuerpo Fc policlonal de cabra anti-IgG humana marcado con PE y el anticuerpo monoclonal murino anti-CD3 humano marcado con FITC, UCHT1.

Figura 3: Las células T modificadas por ingeniería eliminan las células de linfoma CD30+ y menos células madre hematopoyéticas CD34+ CD30+. Se cultivaron células T con CAR n.° 1138, células T sin CAR después de la transducción simulada (células T negativas para n.° 1138) y células T no modificadas (sin) conjuntamente con células madre hematopoyéticas CD34+ alogénicas, inducidas a expresar CD30, y células Myla CD30+ marcadas con CFSE durante 24 horas. Las células se tiñeron con el anticuerpo monoclonal (AcM) anti-CD34-PE AC136 (20 pl). Se añadieron el patrón de recuento (5 pl/prueba) y 7-AAD (5 pl/prueba) y se analizaron las células mediante FACS estableciendo recuentos para 1.000 acontecimientos de perlas convencionales. La prueba se realizó por triplicado y se determinó el número total de células diana.

Figura 4: Se cultivaron células T con CAR n.° 1138 y sin CAR n.° 1138, respectivamente, conjuntamente con células madre hematopoyéticas CD34+ alogénicas y células Myla CD30+ marcadas con CFSE durante 24 horas. Las células se tiñeron con el AcM anti-CD34-PE AC136 (20 pl). Se añadieron el patrón de recuento (5 pl/prueba) y 7-AAD (5 pl/prueba) y se analizaron las células mediante FACS estableciendo recuentos para 1.000 acontecimientos de perlas convencionales. Se determinó el número de células muertas (7-AAD+) en cada población diana y se representó como el % de células muertas de las células diana totales mediante la siguiente fórmula: porcentaje de células diana muertas = (número de células diana 7-AAD+ / número de células diana totales) * 100. La prueba se realizó por triplicado.

Figura 5: Las células T y B CD30+ persisten en la sangre periférica de ratones SCID humanizados en presencia de células T con CAR n.° 1138 anti-CD30. A ratones SCID se les injertó el sistema hematopoyético humano para albergar células B y T humanas en la sangre periférica. En el día 0, se transfirieron de manera adoptiva mediante inyección i.v. células T humanas del mismo donante y modificadas por ingeniería con el CAR n.° 1138. Se registraron las células T CD30+ CD4+ (A) y las células B CD30+ CD19+ (B) de sangre periférica en el día -5 antes del tratamiento y en el día 50 después del tratamiento con células T con CAR n.° 1138 anti-CD30 mediante citometría de flujo.

Figura 6: Las células T con CAR n.° 1138 anti-CD30 se acumulan preferiblemente durante el cultivo in vitro. Se injertaron linfocitos de sangre periférica con los respectivos CAR. Después de la transducción, las células se cultivaron en medio Xvivo15 complementado con FCS al 10% e IL-2 (500 U/ml). El medio se reemplazó una vez a la semana y la IL-2 se añadió cada tres días. Se registraron las células T CD3+ para determinar la expresión de CAR utilizando anticuerpos Fc anti-IgG1 humana conjugados con PE y anti-IgG de ratón conjugados con FITC en el momento indicado después del inicio del cultivo.

Figura 7: La figura 7a muestra un diagrama de flujo del diseño experimental. En la figura 7b se muestra la lisis de células diana de células B autólogas por células T con CAR anti-CD30 según la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Los inventores tienen como objetivo proporcionar células T modificadas por ingeniería genética que contengan un receptor de antígeno quimérico mediante lo cual dichas células T presenten una actividad tóxica sobre células cancerosas CD30+, incluyendo células de leucemia CD30+ o células de linfoma CD30+, mientras que no sean tóxicas para las células no cancerosas CD30+, incluyendo células de leucemia CD30+ o células de linfoma CD30+ en dicho sujeto. Es decir, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico adecuado para su uso en la terapia celular adoptiva para tratar cáncer CD30+ en particular, células de linfoma CD30+ o de leucemia CD30+ en un sujeto que lo necesita, mediante lo cual el receptor de antígeno quimérico contiene al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30 de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2; opcionalmente un dominio espaciador; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización citoplasmático tal como se define en la reivindicación 1; mediante lo cual, cuando se expresa en células T, el receptor de antígeno quimérico es tóxico para células cancerosas CD30+, en particular, células de leucemia CD30+ o células de linfoma CD30+, mientras que no es tóxico para células no cancerosas CD30+ en dicho sujeto.

En este sentido, el término “células cancerosas CD30+” se refiere a células malignas o neoplásicas que expresan la molécula CD30.

Además, el término “células no cancerosas CD30+” se refiere a células benignas (sanas) que expresan la molécula CD30, como células T, células B o células madre activadas.

Los términos “células no tumorales” y “células tumorales”, así como “células no cancerosas” y “células cancerosas” se usan de manera intercambiable en el presente documento, a menos que se defina de otro modo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “comprender” o “que comprende”, así como los términos “contener” o “que contiene”, se refieren a la realización de “consistir” o “que consiste”.

El término “homólogo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas, o bien ADN o bien polipéptidos, que tienen una homología de secuencia de una determinada cantidad, concretamente de al menos el 70%, como al menos el 80%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% de la secuencia de ácido nucleico o de la secuencia de aminoácidos a la que se refiere. Homología se refiere a la magnitud de la identidad entre dos secuencias. Las secuencias homólogas tienen características iguales o similares, en particular, tienen propiedades iguales o similares de la secuencia identificada. Por ejemplo, el homólogo de la secuencia de scFv de ^hRS3 de SEQ ID NO: 2 tiene la misma especificidad de unión o similar a la molécula CD30 que la molécula de scFv de HRS3. Además, los homólogos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para el mismo péptido pero pueden variar en su secuencia debido a la degeneración del código genético. Además, la identidad se refiere a la presencia de moléculas de aminoácido o ácido nucleico idénticas en el orden descrito para la secuencia a la que se refiere. Es decir, en el caso de una identidad de al menos el 90%, el 90% o más de las moléculas de ácido nucleico y aminoácido, respectivamente, son idénticas en las posiciones respectivas. A menos que se identifique de otro modo, los términos “homología” e “identidad” se usan de manera intercambiable en el presente documento. Además, el término “modificadas por ingeniería genética” se refiere a las células manipuladas por ingeniería genética. Es decir, las células contienen una secuencia heteróloga que no está presente de manera natural en dichas células. Normalmente, la secuencia heteróloga se introduce mediante un sistema de vectores u otros medios para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, incluyendo liposomas. La molécula de ácido nucleico heteróloga puede integrarse en el genoma de dichas células o puede estar presente de manera extracromosómica, por ejemplo, en forma de plásmidos. El término también incluye realizaciones de introducir en la célula polipéptidos de CAR aislados y modificados por ingeniería genética.

Generalmente, los CAR son proteínas de fusión, que consisten en un dominio de reconocimiento extracelular de tipo anticuerpo fusionado con proteínas de señalización intracelulares de células T. Normalmente, el ectodominio que contiene la región de reconocimiento de antígeno comprende un péptido señal y una unidad de reconocimiento de antígeno. Según la presente invención, el ectodominio comprende un dominio de cadena sencilla anti-CD30. El dominio de cadena sencilla es un dominio de cadena sencilla de scFv de HRS3 de SEQ ID NO: 2.

El ectodominio puede estar separado del dominio transmembrana por la presencia de un dominio espaciador. Dicho dominio espaciador opcional une el dominio de unión a antígeno al dominio transmembrana y se prefiere que dicho dominio transmembrana sea lo suficientemente flexible como para permitir que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento de antígeno.

El dominio transmembrana es normalmente una hélice alfa hidrófoba que abarca la membrana. También pueden usarse otros dominios transmembrana. Por último, el endodominio representa el dominio de señalización en la parte citoplasmática del CAR.

Se ha reconocido que una célula T que contiene el CAR tal como se describe, es decir, que contiene un CAR que comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal que tiene la siguiente composición: un dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30, opcionalmente, un dominio espaciador, un dominio transmembrana, un dominio citoplasmático puede presentar actividad tóxica de manera distintiva entre células cancerosas CD30+ y células no cancerosas CD30+. Por tanto, las células T de la presente invención superan los problemas conocidos en la técnica de los efectos citotóxicos tanto en células CD30+ cancerosas, incluyendo células de leucemia CD30+ o células de linfoma CD30+, como en células CD30+ sanas, por ejemplo, tal como se describe en la técnica.

En una realización de la presente invención, el CAR comprende una secuencia líder que está ubicada de manera N-terminal con respecto al dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30.

El dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30 es un péptido scFv de HRS3, en particular, de SEQ ID NO: 2. Se ha reconocido en el presente documento que un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30 de la región variable (scFv), en particular, de HRS3, permite mostrar la actividad deseada, en particular, ser tóxico para células de leucemia CD30+ o células de linfoma CD30+ mientras que no es tóxico para células de leucemia CD30+ o células de linfoma CD30+.

En otra realización, el dominio espaciador de la molécula de CAR es un dominio de región bisagra-CH2CH3 de lgG1, preferiblemente, el dominio espaciador es un dominio de región bisagra-CH2CH3 de IgG1 mutado codificado por SEQ ID NO: 5.

En algunas realizaciones, entre el dominio espaciador y el dominio transmembrana puede estar ubicado un ligador. Por ejemplo, en el CAR de SEQ ID NO: 3 está ubicado un ligador de 4 aminoácidos entre el dominio espaciador y el dominio transmembrana.

Además, el receptor de antígeno quimérico contiene el dominio transmembrana de la molécula CD28 que carece del dominio Ick codificado por SEQ ID NO: 6.

El dominio de señalización o endodominio o dominio intracelular, que se usan de manera intercambiable en el presente documento, contiene además una cadena de señalización de la cadena gamma del receptor de FcÉpsilon (receptor de lgE) o CD3 zeta. Por ejemplo, el dominio intracelular es un dominio de señalización de CD3 zeta codificado por SEQ ID NO: 7. En otra realización, el dominio intracelular es el dominio de señalización de la cadena gamma del receptor de Fc épsilon codificado por SEQ ID NO: 8. El dominio de señalización es responsable de la activación de la actividad citotóxica en células T o de la secreción de interferón-gamma por las células T, respectivamente.

La molécula de CAR es una molécula de CAR denominada de “segunda generación”. Las moléculas de CAR de segunda generación tienen dominios de señalización mejorados que contienen además un segundo dominio de señalización, por ejemplo, derivado de CD28. Las moléculas de CAR de “tercera generación” contienen un dominio de señalización coestimulador combinado, por ejemplo, CD28 en combinación con CD137 (OX40) o CD134 (4-1BB). Una visión general sobre las moléculas de CAR se proporciona, por ejemplo, en Gilham D.E. et al., Trends in Molecular Medicine, 2012, 18(7), 377-384.

En una realización preferida de la presente invención, el receptor de antígeno quimérico es un CAR en el que el receptor de antígeno quimérico es un polipéptido de SEQ ID NO: 3. Dicho CAR también se denomina en el presente documento n.° 1138.

El CAR n.° 1138 anti-CD30 se expresa sobre la superficie de las células T y se compone de la parte extracelular del fragmento de cadena sencilla anti-CD30 de la región variable (scFv) del anticuerpo HRS3 y del dominio de CH2CH3 de lgG1 humana modificado como espaciador entre el scFv y el dominio transmembrana. La modificación del dominio de lgG1 consiste en mutaciones puntuales para convertir la secuencia de aminoácidos de tipo natural PELLGGP X¹³MISRT (SEQ ID NO: 9) en PpVA-GP X¹³MIART (SEQ ID NO: 10), lo que reduce la unión involuntaria del dominio Fc del CAR a los receptores de Fc de otras células, tales como células inmunitarias innatas, que mediarían involuntariamente su activación y la activación de las células T con CAR. La parte proximal de la membrana intracelular y transmembrana de CAR n.° 1138 se deriva de CD28 humano y se fusiona a la parte intracelular de CD3zeta humano. La secuencia de CD28 está mutada en P560 > A560, P563 > A563, P564 > A564 (Kofler et al., Mol. Ther. 19, 760 - 767 (2011). De ese modo, el sitio de unión de CD28 para la cinasa Ick se destruye con la consecuencia de que se impide la activación de la ruta de señalización de Ick y la subsiguiente secreción de IL-2 mediada por CAR. Los modelos preclínicos implican que en estas condiciones se reduce la represión mediada por células Treg de las funciones efectoras de las células T con CAR.

Tal como se demuestra en los ejemplos, las células T (células T o bien CD4⁺o bien CD8⁺) actúan de manera diferente sobre células CD30+, es decir, las células cancerosas CD30⁺son destruidas mientras que las células no cancerosas CD30⁺permanecen vivas en presencia de células T con CAR n.° 1138.

Como ejemplo, las células T que expresan el CAR n.° 1138 no son tóxicas contra las células madre hematopoyéticas CD30⁺CD34⁺humanas sanas, mientras que las células de linfoma CD30⁺son eliminadas.

Además, tal como se demuestra en el ejemplo, las células T que contienen el CAR n.° 1138 según la presente invención no muestran actividad tóxica hacia células B y T humanas sanas en un modelo de ratón. No se produjo ninguna actividad autoinmunitaria significativa hacia células sanas autólogas y no se produjeron efectos secundarios peores. Además, no se alteró la respuesta inmunitaria de los linfocitos contra los patógenos, lo que permitió una protección inmunitaria celular contra el patógeno sometido a prueba.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso del receptor de antígeno quimérico según la presente invención en terapia celular adoptiva para tratar cáncer CD30+ en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, el cáncer CD30+ puede ser linfoma de Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfocítica aguda, linfoma cutáneo, micosis fungoide, enfermedades linfoproliferativas, mastocitosis sistémica, tumores malignos derivados de células madre o células madre cancerosas u otros.

Es decir, sorprendentemente las células T con el receptor de antígeno quimérico según la presente invención permiten tratar cáncer CD30⁺en un sujeto que lo necesita sin dañar las células CD30⁺no cancerosas presentes en el sujeto que va a tratarse. A diferencia de las observaciones anteriores con una enorme variedad de CAR que tenían diferentes dominios de unión a antígeno, el dominio de anticuerpo anti-CD30 permite eliminar las células CD30⁺malignas mientras que las células CD30⁺benignas no se ven afectadas.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al polipéptido de SEQ ID NO: 3 que representa el polipéptido de CAR designado n.° 1138 en el presente documento, o un homólogo del mismo que tiene una identidad de al menos el 90% mediante lo cual dicho polipéptido o su homólogo, cuando se expresa en una célula T, es un receptor de antígeno quimérico que presenta un efecto tóxico sobre células cancerosas CD30⁺mientras que no es tóxico en células no cancerosas CD30⁺. Por ejemplo, el polipéptido de SEQ ID NO: 3 está codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4.

El polipéptido se compone del dominio de cadena sencilla de scFv del anticuerpo anti-CD30 HRS3, un dominio espaciador que es un dominio de la región bisagra-CH2CH3 de IgG1 mutado, un dominio transmembrana derivado de CD28 que carece de dominio Ick, y el dominio intracelular de CD3 zeta según la reivindicación 1.

Además, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la presente invención. Además, se proporcionan vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico según la presente invención que codifica para el polipéptido tal como se describe. El experto conoce bien los sistemas de vectores y vectores adecuados, en particular, los vectores que permiten la transfección y transducción de células eucariotas, en particular, células T.

Además, la presente invención proporciona una célula, línea celular o una célula huésped que contiene el vector según la presente invención o una molécula de ácido nucleico según la presente invención. Preferiblemente, dicha célula, línea celular o célula huésped es una célula T, por ejemplo, una célula T CD4+ o una célula T CD8+.

Además, la presente invención proporciona un kit según la reivindicación 14 que contiene el vector según la presente invención, la célula, línea celular o célula huésped según la presente invención, o el polipéptido según la presente invención o una molécula de ácido nucleico según la presente invención o mezclas de los mismos para su uso en la producción de células T que expresan el receptor de antígeno quimérico. El kit según la presente invención puede contener componentes adicionales que incluyen medios para introducir el vector o el polipéptido en moléculas de ácido nucleico en las células. El experto conoce bien los medios adecuados para hacerlo.

Además, la presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico tal como se define en el presente documento para su uso para mejorar la persistencia y la proliferación de cualquier linfocito modificado por ingeniería genética que exprese dicho receptor de antígeno quimérico n.° 1138 u homólogos del mismo. Es decir, los presentes inventores se dieron cuenta sorprendentemente de que, a diferencia de la amplia variedad de otros receptores de antígeno quiméricos, el receptor de antígeno quimérico n.° 1138 según la presente invención confiere una persistencia y amplificación mejoradas de los linfocitos modificados por ingeniería genética tal como se demuestra en los ejemplos. Por tanto, se supera la deficiencia clínicamente relevante de las células T con CAR conocidas hasta ahora, en las que la persistencia de las células T modificadas por ingeniería en el sujeto era demasiado corta y el número de células T modificadas por ingeniería disminuía rápidamente.

La presente invención se describe adicionalmente por medio de ejemplos. Dichos ejemplos ilustran la invención sin limitarla a los mismos.

Ejemplos

Preparación del elemento de prueba

Se produjo el vector retroviral que codifica para el CAR n.° 1138 según el SOP-GL-VectProd usando una envoltura pseudotipada de Galv. En resumen, la producción de partículas de vector se realizó de manera transitoria en la línea de células de riñón embrionario humano 293T después de la transfección de ADN mediada por Polyfect®. Se pseudotiparon las partículas de vector con Galv. No se determinó el título del vector.

Se realizó la transducción de linfocitos sanguíneos humanos según técnicas convencionales (Cheadle, E.J., et al., Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy. Capítulo 36, en: “Antibody engineering: methods and protocols”, 2a edición, Ed. P. Chames, Meth. Mol. Biol. 907, 645 - 666 (2012), doi: 10.1007/978-1-61779-974-7_36). En resumen, se transdujeron linfocitos humanos con un sobrenadante de células 293T transfectadas durante 2 días. El 20-35% de las células T humanas expresaron el CAR n.° 1138, tal como se mide en el día 2 mediante citometría de flujo usando un anticuerpo dirigido al dominio extracelular CH2 CH3 de lgG1 del CAR. Para comparación, el CAR n.° 1175, véase Hombach A, et al., Gene Ther. Octubre de 2010; 17(10):1206-13. doi: 10.1038/gt.2010.91. Epub 17 de junio 2010, se expresó en el 17-30% de células T humanas tal como se mide mediante el mismo procedimiento. Pueden registrarse células T CD4+ y CD8+ que expresan el CAR n.° 1138 sobre la superficie celular mediante el uso del anticuerpo 9G10 que se une específicamente al dominio scFv de HRS3 del CAR. Las células T modificadas por ingeniería con el CAR n.° 1138 se unen específicamente a células que expresan CD30 y se activan, lo que se indica mediante la secreción aumentada de citocinas, incluyendo lFN-y, mediante el aumento en la proliferación y en la citólisis de células diana CD30+. Cabe destacar que sólo se secretan niveles de fondo de IL-2 cuando las células T se estimulan mediante el CAR n.° 1138. Sin embargo, la IL-2 se secreta en cantidades fisiológicas cuando las células T se estimulan mediante su TCR fisiológico y CD28. La activación de las células T con n.° 1138 es específica de antígeno tal como se define por la especificidad del CAR, ya que las células CD30' no desencadenan la activación de las células T. El c D30 soluble, que se acumula en el suero de pacientes con linfoma CD30+, no bloquea la activación de células T mediada por CAR en concentraciones de hasta 10 pg/ml [Hombach A, et al., Cancer Res. 15 de marzo de 1998; 58(6): 1116-9]. Esto se debe al hecho de que el CAR debe reticularse mediante la unión de múltiples copias del antígeno seleccionado como diana con el fin de desencadenar la activación de células T, lo que sólo puede producirse cuando CD30 se inmoviliza sobre superficies o se expresa sobre la superficie de células diana, pero no se produce cuando la proteína CD30 está presente en disolución.

Ejemplo 1: Actividad de células T modificadas con CAR n.° 1138 hacia células CD30+ sanas y tumorales Modificación por ingeniería de células T con CAR n.° 1138

Se evaluó el injerto de células T periféricas humanas con el CAR n.° 1138 mediante citometría de flujo de dos colores 12 horas después de la transducción. La figura 2 muestra un análisis de transferencia puntual de células T modificadas por ingeniería con CAR. El número de células T con expresión de CAR n.° 1138 fue del 16,5% de todas las células T.

Purificación de células T con CAR n.° 1138 y células T de control

Se cultivaron células T con n.° 1138 durante 60 horas, se marcaron con el anticuerpo anti-IgG humana-Fc-FITC, que se une al CAR, y el anticuerpo anti-CD3-PE, que identifica las células T, y se clasificaron usando el clasificador celular FACSAria III. Se establecieron puertas para las células T CD3+ con ^cA^rn.° 1138+ y células T CD3+ con CAR n.° 1138'. Volvieron a analizarse alícuotas de las células clasificadas mediante FACS. La pureza de las células T CD3+ con n.° 1138+ y las células T CD3+ con n.° 1138’ fue del 94,4% y del 99,6%, respectivamente.

Aislamiento de células madre hematopoyéticas CD34+ alogénicas

Se aislaron células CD34+ de sangre periférica de un donante voluntario tras la movilización con GM-CSF mediante centrifugación de densidad y clasificación celular magnética (MACS). Se marcaron las células con un AcM anti-CD34 conjugado con PE y se analizaron alícuotas de células fraccionadas y no clasificadas mediante FACS. La pureza de las células CD34+ aisladas fue del 94,4%.

Marcaje con CFSE de células Myla

Se marcaron células Myla con CFSE 1,25 pM y se mezclaron con células madre hematopoyéticas CD34+ aisladas. Las células CD34+ que se identificaron mediante el AcM anti-CD34-PE y las células Myla CFSE+ pueden discriminarse claramente y ambas poblaciones pueden analizarse por separado para determinar su viabilidad.

Toxicidad redirigida de células T con CAR n.° 1138 hacia células de linfoma CD30+ frente a células madre hematopoyéticas CD30+ CD34+.

Se incubaron conjuntamente células de linfoma MyLa CD30+ junto con células madre hematopoyéticas sanas CD30+ CD34+ con células T modificadas por ingeniería con CAR n.° 1138 anti-CD30. Como controles, se incubaron conjuntamente las mismas células CD30+ con células T sin CAR (“células T negativas para n.° 1138”) derivadas del mismo donante y preparación celular.

Se determinó el número total de células diana mediante FACS y se normalizó usando un patrón de recuento. Se identificaron las células madre hematopoyéticas CD34+ CD30+ mediante la tinción con el anticuerpo monoclonal anti-CD34-PE y la ausencia del marcador CSFE, que es diferente a las células Myla teñidas con CFSE. Se realizó la prueba por triplicado y los datos se resumen en la figura 3. El número de células madre hematopoyéticas CD34+ no disminuye en presencia de células T sin CAR (sin), con CAR (células T con n.° 1138) o en presencia de células T que carecen del CAR después del procedimiento de transducción (células T negativas para n.° 1138). A diferencia de las células sanas CD34+ CD30+, el número de células Myla CD30+ marcadas con CFSe disminuyó sustancialmente debido a la muerte mediada por células T con CAR (células T con n.° 1138), además de la esperada alorreactividad de las células T (células T negativas para n.° 1138).

Para determinar la toxicidad de células T con CAR n.° 1138 contra células CD30+ sanas y tumorales, se determinó el número de células diana muertas de manera directa mediante citometría de flujo. Se identificaron células sanas CD34+ CD30+ mediante el anticuerpo anti-CD34-PE y se discriminaron de las células de linfoma Myla marcadas con CFSE. Las células diana viables y muertas se determinaron mediante tinción con 7-AAD. Los datos se resumen en la figura 4.

Conclusiones

Se comprobó la toxicidad de células T con el CAR n.° 1138 anti-CD30 contra células madre hematopoyéticas CD30+ CD34+ humanas sanas, en comparación con la selección como diana de células de linfoma CD30+. Células T de un donante sano se modificaron por ingeniería para expresar el CAR n.° 1138 y células T sin CAR del mismo lote de transducción se purificaron por clasificación celular. Se usó el procedimiento para comparar la toxicidad específica mediada por el CAR frente a cualquier toxicidad no específica inducida por el propio proceso de transducción. Se registró la toxicidad de las células T con n.° 1138 purificadas para determinar la reactividad hacia las células madre hematopoyéticas alogénicas CD34+. Además, se registró la toxicidad contra las células de linfoma CD30+ simultáneamente a la toxicidad contra las células madre hematopoyéticas CD30+ CD34+ en el mismo ensayo, mezclando las células diana marcadas de manera diferente. El procedimiento permite estimar la toxicidad directa y por vecindad en el mismo ensayo. El tiempo de observación para el grupo de prueba y el grupo de control fue de 24 horas.

Se encontró que el número de células de linfoma Myla CD30+ marcadas con CFSE disminuyó específicamente cuando se incubaron conjuntamente con células T con n.° 1138 en comparación con la incubación conjunta con células T negativas para n.° 1138. En consonancia con ello, el número de células diana Myla muertas aumentó sustancialmente en la incubación conjunta con células T con n.° 1138. Por el contrario, ni el número absoluto de células madre hematopoyéticas sanas CD34+ disminuyó ni aumentó el número de células CD34+ muertas. Cabe destacar que no se observó ninguna toxicidad directa ni por vecindad contra las células madre hematopoyéticas CD34+, aunque sí se produce una muerte específica de células tumorales CD30+ por parte de las células T con n.° 1138 en la proximidad de las células CD34+ CD30+. En conjunto, las células T con CAR n.° 1138 no mostraron toxicidad contra las células madre hematopoyéticas CD30+ CD34+ sanas, mientras que sí hubo toxicidad específica hacia las células de linfoma CD30+.

Ejemplo 2: No hay actividad tóxica de células T modificadas por ingeniería con CAR n.° 1138 hacia células B y T humanas sanas en un modelo de ratón

Selección de la dosis

Se aislaron células madre hematopoyéticas CD34+ humanas de sangre de cordón umbilical. Se trasplantaron 3x105 células madre hematopoyéticas CD34+ en ratones recién nacidos Rag2'A con cadena gamma común'7' para injertar el sistema hematopoyético humano. A los animales injertados con éxito se les trasplantaron 2,5x106 células T por ratón mediante una única inyección en la vena de la cola.

Animales/mantenimiento de animales

Especie: Ratón

Raza/estirpe: Rag2'1' cy/-Selección de especies: El modelo de ratón con deficiencia de células T y B se usó para injertar el sistema hematopoyético humano; el sistema hematopoyético reconstituido imita estrechamente la situación humana.

Identificación de los animales

Tabla 1

Trasplante de hematopoyesis humana

Se injertaron células madre hematopoyéticas CD34+ humanas aisladas de sangre del cordón umbilical (SOP-RepopCD34, apéndice 6) en ratones Rag2 '/'cy/' y se monitorizaron para determinar el establecimiento satisfactorio de linfocitos humanos maduros después de 5 semanas mediante el registro por citometría de flujo de células T CD45+ y células T CD4+ CD45+ humanas en la sangre periférica.

Grupos experimentales

Los animales se asignaron a tres grupos de prueba según el plan de estudio. Se emplearon los siguientes grupos.

Tabla 2

Células CD3+, n.° 1175 Terapia celular adoptiva de animales con hematopoyesis humana: inyección i.v. en la vena de la cola de células T CD3+ con CAR n.° 1138 en ratones receptores Rag2-/-cy/- con hematopoyesis humana autóloga establecida; control: trasplante de células T CD3+ con CAR n.° 1175.

Injerto de células hematopoyéticas humanas en ratones receptores Rag2-/-cy/-.

Se evaluó el injerto del trasplante de células madre hematopoyéticas CD34+ humanas y el posterior establecimiento de la hematopoyesis humana en la sangre periférica de los ratones mediante registro por citometría de flujo de células CD4+ y CD45+ humanas 5 semanas después del trasplante. El sistema hematopoyético humano injertado en 12/21 ratones se indicó mediante células T CD4+ CD45+ humanas en la sangre periférica. Los ratones Rag2-/-cy/- con injerto fingido y no tratados no albergan estas células. Se injertó el mismo donante de células de sangre de cordón umbilical CD34+ en cada uno de los ratones de camada A, B, C, D y E. Sólo los ratones que se injertaron con éxito se usaron para la terapia celular adoptiva.

Expresión de CAR n.° 1138 por células T humanas modificadas por ingeniería

Se modificaron por ingeniería células T CD3+ humanas (del mismo donante que las células CD34+) ex vivo para expresar el CAR n.° 1138 específico para CD30 o, como control, el CAR n.° 1175 específico para CEA. El CAR n.° 1175 alberga el scFv específico de c Ea BW431/26 en lugar del scFv específico de CD30 de HRS3 del CAR n.° 1138 y se usó como control durante todo el estudio. La expresión de CAR en células T CD3+ humanas se registró mediante detección por citometría de flujo tanto del dominio “espaciador” extracelular de IgG humana del CAR como de CD3 humano.

Se transfirieron células T modificadas por ingeniería con CAR al ratón correspondiente con el sistema hematopoyético autólogo mediante inyección i.v. (2,5 x 106 células T con CAR por ratón).

Toxicidad de las células T con CAR n.° 1138 in vivo

1. Recuentos en sangre periférica y peso corporal

No se observaron anomalías evidentes en el grupo de prueba durante el periodo de observación. El porcentaje de linfocitos (aprox. el 70%), monocitos (aprox. el 10%) y granulocitos (aprox. el 20-25%) en el compartimento celular de la sangre periférica del grupo de prueba no difirió del observado en los animales de control que no recibieron células T o que recibieron células T con el CAR n.° 1175 de control.

Se registró el número de células T y B CD30+ en la sangre periférica de los ratones en presencia o ausencia de células T con n.° 1138 anti-CD30 o células T con n.° 1175 anti-CEA como control mediante citometría de flujo en el día -5 antes de la terapia con células T y en los días 7, 14, 22, 29, 36, 43, 50 después de la terapia con células T. No se registró ninguna alteración en el número de células T CD30+ CD4+ y células B CD30+ CD19+ en presencia de células T con n.° 1138 después de la terapia celular adoptiva durante el periodo de observación de 7 semanas en comparación con el día -5 antes de la terapia con células T. El número de células T CD30+ CD4+ fue el mismo en comparación con los ratones que recibieron células T específicas de CEA con n.° 1175 como control.

El peso corporal de los ratones individuales se determinó semanalmente. No se registró ninguna alteración sustancial en el peso corporal de los ratones individuales durante el tiempo de observación. Además, no se registraron diferencias entre los grupos experimentales.

2. No hay toxicidad tras la estimulación de CAR n.° 1138 in vivo

Se expusieron células T con CAR n.° 1138 anti-CD30 in vivo mediante la administración de células de hibridoma 9G10 irradiadas que producen el anticuerpo antiidiotípico 9G10 dirigido contra el dominio scFv de HRS3 del CAR n.° 1138. El anticuerpo 9G10 está presente sobre la superficie celular de la célula productora del anticuerpo y activa fuertemente las células T modificadas por ingeniería con n.° 1138 mediante la reticulación con CAR. En estas condiciones de prueba, el número de células T CD30+ CD4+ o de células B CD30+ CD19+ en la sangre periférica de los ratones tratados no se vio alterado (figura 5).

3. Sin respuesta inmunitaria alterada después la infección por VCML como patógeno de prueba

Para explorar si la respuesta inmunitaria de los linfocitos contra los patógenos se altera en presencia de células T con n.° 1138, el sistema inmunitario humano injertado en ratones Rag2'/'cy/- se expuso a infección con el virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML) en el día 7 después de la terapia adoptiva con células T con n.° 1138.

Este ensayo se basa en el hecho de que la infección sistémica por VCML en un huésped inmunocompetente está controlada por células T CD8+ y CD4+ específicas que se activan, producen un infiltrado inflamatorio en el lugar de la infección y expresan transitoriamente CD30 en niveles elevados. Los ratones Rag2-/-cy/- sin sistema inmunitario de células T y B trasplantadas no pueden producir una respuesta de células T anti-VCML. Se plantea si los ratones Rag2-/-cy-/- humanizados con sistema inmunitario humano trasplantado producen un infiltrado inflamatorio después de la infección por VCML.

Se expuso la respuesta inmunitaria contra el VCML mediante la aplicación local del virus en la almohadilla de la pata. Se trata de un ensayo de infección clásico para indicar la respuesta inmunitaria antivírica mediante la hinchazón en el lugar de la infección en el plazo algunos días.

En ese caso, se registró la hinchazón de la almohadilla de la pata en el lugar de la infección, tal como se conoce para ratones de tipo natural con plena competencia inmunitaria, por ejemplo, los ratones balb/c. No se registró ninguna pérdida de peso corporal en el ratón experimental tratado por esta vía de infección. Los datos indican que la infección local por VCML se controla localmente en ratones Rag2-/-cy-/- reconstituidos después de la terapia con células T con CAR n.° 1138 anti-CD30. Ningún ratón murió durante el estudio.

Sin embargo, se observó una pérdida de peso de aproximadamente el 30% (en promedio de desde 18 g hasta 12 g en el día 10 frente al día 27). Los ratones que recibieron células del anticuerpo 9G10 para estimular las células T con n.° 1138 anti-CD30 controlaron la infección por VCML con un peso menos drástico. A modo de comparación, los ratones humanizados Rag2-/-cy-/- después de la terapia con células T con n.° 1175 anti-CEA no mostraron pérdida de peso.

Los datos demuestran que los ratones humanizados con células T con n.° 1138 anti-CD30 pueden llevar a cabo una respuesta inmunitaria celular tras la infección por VCML, indicada por la hinchazón de las almohadillas de las patas en todos los casos. Sin embargo, en los ratones tratados con células T con n.° 1138 anti-CD30, la respuesta a la infección por VCML puede estar asociada a un síndrome de liberación de citocinas moderado debido a la activación aguda de las células T con n.° 1138, lo que conduce a una reducción de la captación de alimentos y a la pérdida de peso. Esto contrasta con los ratones que recibieron las células T de control con CAR n.° 1175 anti-CEA que no tienen una diana en esos ratones y no se activan.

4. Patología sérica

Se registró la GOT (transaminasa glutámico-oxalacética) en suero en ratones de cada grupo experimental y, además, en un ratón de cada grupo que se infectó sistémicamente con VCML. La GOT y la GPT (transaminasa glutámico-pirúvica) en suero se determinaron por el Institut für Klinische Chemie, Uniklinik Koln, usando sus SOP. No se observaron cambios significativos en los niveles en suero de GOT en los ratones tratados durante el periodo de observación hasta 57 días después de la terapia con células T.

Conclusiones

Se sometió a prueba toxicidad de células T con n.° 1138 hacia los linfocitos CD30+ autólogos sanos en ratones Rag2'/'cy-/' totalmente reconstituidos con el sistema hematopoyético humano. Se modificaron por ingeniería células T de tres donantes con el CAR n.° 1138 anti-CD30, como control con el CAR n.° 1175 anti-CEA, y se sometió a prueba la reactividad autoinmunitaria hacia los linfocitos CD30+ sanos autólogos, en particular para determinar la eliminación de células B CD30+ CD19+ y células T CD30+ CD4+. El tiempo total de observación tanto para el grupo de prueba como para el de control fue de 60 días.

No se registraron signos de enfermedad en los ratones tratados. La frecuencia de las células B CD30+ CD19+ y de las células T CD30+ CD4+ en la sangre periférica no se alteró. Se expuso la ausencia de signos de toxicidad autoinmunitaria mediante estimulación in vivo de células T con n.° 1138 modificadas por ingeniería mediante la aplicación del anticuerpo antiidiotípico 9G10 que se une al dominio de unión del CAR e induce la señalización del CAR y la activación de las células T. No se observó ninguna alteración en la frecuencia de células B CD30+ CD19+ y células T CD30+ CD4+ en la sangre periférica.

La respuesta inmunitaria de los linfocitos contra los patógenos en los ratones humanizados tratados con células T con n.° 1138 anti-CD30 no se vio alterada, tal como demostró la infección local con el virus de la coriomeningitis linfocítica (VCML) en el día 7 después de la transferencia de células T con n.° 1138. Sin embargo, los ratones tratados sufrieron una pérdida de peso de aproximadamente el 30% (día 10 frente a día 27). Dado que los ratones con células T con n.° 1175 trasplantadas no mostraron pérdida de peso tras la infección por VCML, se concluye que la respuesta inmunitaria anti-VCML en ratones con células T con n.° 1138 produjo un síndrome de liberación de citocinas moderado debido a una activación aguda contra las células diana CD30+ que condujo a una menor captación de alimentos. Ningún ratón murió durante la infección.

En las presentes condiciones de prueba, la terapia adoptiva con células T con n.° 1138 preservó los recuentos de

Claims

REIVINDICACIONES

i. Polipéptido de receptor de antígeno quimérico (CAR), conteniendo el CAR al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal:

i) un péptido scFv de HRS3 de dominio de anticuerpo de cadena sencilla anti-CD30 de SEQ ID NO: 2, ii) opcionalmente un dominio espaciador;

iii) un dominio transmembrana; y

iv) un dominio citoplasmático que comprende:

- un dominio de señalización de CD28 citoplasmático que tiene SEQ ID NO: 6 y que carece del motivo de unión a Ick, y

- un dominio de señalización de RI gamma de Fcépsilon o CD3-zeta.
2. Polipéptido de CAR según la reivindicación 1, que comprende además una secuencia líder que está ubicada de manera N-terminal con respecto al dominio de HRS3.
3. Polipéptido de CAR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio espaciador es un dominio CH2CH3 de IgG1 codificado por SEQ lD NO: 5 o una variante del mismo que tiene una identidad de al menos el 70% con el mismo.
4. Polipéptido de CAR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio transmembrana se deriva de CD28.
5. Polipéptido de CAR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de señalización de CD3zeta es el dominio de señalización de CD3 zeta de SEQ ID NO: 7 o en el que el dominio de señalización de Rl gamma de Fc épsilon es el dominio de señalización de RI gamma de Fc épsilon de SEQ ID NO: 8.
6. Polipéptido de CAR según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el CAR es

(i) un polipéptido de SEQ ID NO: 3, o

(ii) un polipéptido de secuencia que tiene una identidad de al menos el 90% con SEQ ID NO: 3, en el que el dominio de señalización de CD28 carece del motivo de unión a Ick.
7. Célula T que comprende un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8. Célula T según la reivindicación 7, para su uso en un método de tratamiento de leucemia CD30+ o linfoma CD30+.
9. Célula T para el uso según la reivindicación 8, en la que la leucemia CD30+ o el linfoma CD30+ se selecciona del grupo que consiste en linfoma de Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfocítica aguda, linfoma cutáneo, micosis fungoide, enfermedades linfoproliferativas, mastocitosis sistémica, tumores malignos derivados de células madre, células madre cancerosas, en particular, en la que el cáncer CD30+ es un linfoma de células B, en particular, un linfoma de Hodgkin o un linfoma no Hodgkin de células B, o un linfoma de células T, en particular, micosis fungoide o linfoma de Sezary.
10. Molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. Ácido nucleico según la reivindicación 10, que tiene la secuencia de SEQ lD NO: 4.
12. Vector que comprende la secuencia de ácido nucleico según las reivindicaciones 10 u 11.
13. Célula, línea celular o célula huésped que contiene un vector según la reivindicación 12 o una molécula de ácido nucleico según las reivindicaciones 10 u 11.
14. Kit que contiene un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; un ácido nucleico según las reivindicaciones 10 u 11; un vector según la reivindicación 12; una célula y/o línea celular o célula huésped según la reivindicación 13, kit que es adecuado para su uso en la producción de células T que expresan dicho CAR.
15. Método in vitro para mejorar la persistencia y la amplificación de un linfocito expresando un receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 mediante ingeniería genética.