ES2873098T3 - Sistema y método de liberación multifásica de factores de crecimiento - Google Patents

Sistema y método de liberación multifásica de factores de crecimiento Download PDF

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Abstract

Un sistema para la liberación multifásica de factores de crecimiento, tales como proteínas morfogenéticas óseas (BMP), preferentemente BMP-2 o BMP-7, en un sitio de tratamiento, el sistema comprende: (a) un vehículo de suministro que comprende al menos un primer factor de crecimiento y un polímero, el vehículo de suministro está adaptado para liberar el al menos un primer factor de crecimiento en un perfil de liberación inicial durante un primer período de tiempo; y (b) un portador que comprende una pluralidad de partículas que tienen al menos un segundo factor de crecimiento en sus superficies, el portador está adaptado para liberar el al menos un segundo factor de crecimiento en un perfil de liberación sostenida durante un segundo período de tiempo, y en donde el portador comprende partículas de sulfato de calcio dihidratado.

Description

DESCRIPCIÓN
Sistema y método de liberación multifásica de factores de crecimiento
Campo de la invención
Esta invención se refiere a sistemas y métodos para liberar sustancias biológicas. En particular, la invención se refiere a la liberación de factores de crecimiento asociados con bioimplantes. Más particularmente, la invención proporciona un sistema para la liberación multifásica de factores de crecimiento y un sistema que comprende un vehículo de suministro y un portador para el uso en un método de liberación multifásica de factores de crecimiento.
Antecedentes de la invención
Los factores de crecimiento (FC) son péptidos y proteínas que estimulan el crecimiento y/o la diferenciación de las células mediante la interacción de los FC con receptores específicos de la superficie celular. Los factores de crecimiento desempeñan un papel integral en la reparación y regeneración de tejidos y la aplicación exógena de FC puede usarse para estimular la reparación de diversos tejidos y órganos, incluidos huesos, cartílagos, piel y mucosas y para mejorar la reparación de tejidos mediante la estimulación de la angiogénesis en el sitio de reparación.
La superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFp) de factores de diferenciación y crecimiento secretados en mamíferos tiene más de 30 miembros. Estas proteínas diméricas se caracterizan por una estructura conservada basada en siete nudos de cistina. Regulan la proliferación, diferenciación y migración de muchos tipos de células y tienen funciones importantes en la morfogénesis, organogénesis, mantenimiento de tejidos y cicatrización de heridas. La superfamilia de factores de crecimiento TGFp puede subdividirse en varias subfamilias que incluyen la subfamilia beta del factor de crecimiento transformante, la proteína morfogenética ósea (BMP) y la familia del factor de crecimiento y diferenciación (GDF) (también llamada subfamilia BMP) y la subfamilia de inhibina y activina.
La subfamilia BMP de la superfamilia TGFp comprende al menos veinte proteínas, incluidas BMP-2, BMP-3 (también conocida como osteogenina), BMP-3b (también conocida como factor de crecimiento y diferenciación 10, GDF-10), BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (también conocida como proteína osteogénica-1, OP-1), BMP-8 (también conocida como proteína osteogénica-2, OP-2), BMP-9, BMP-10, BMP-11 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 8, GDF-8 o miostatina), BMP-12 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 7, GDF-7), BMP-13 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 6, GDF-6), BMP-14 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 5, GDF-5) y BMP-15 (para una revisión, ver por ejemplo, Azari y otros Opinión de expertos Invest Drugs 2001; 10: 1677-1686).
Se ha demostrado que las BMP estimulan la síntesis de matriz en condroblastos; estimular la actividad de la fosfatasa alcalina y la síntesis de colágeno en los osteoblastos, inducir la diferenciación de los precursores mesenquimales tempranos en células osteogénicas (osteoinducción), regular la quimiotaxis de monocitos y células mesenquimales y regular la diferenciación de células neurales (para una revisión, ver por ejemplo, Azari y otros Expert Opin Invest Drugs 2001; 10: 1677-1686 y Hoffman y otros Apl. Microbiol. Biotech 2001; 57: 294-308).
Una de las muchas funciones de las proteínas BMP es inducir la formación de cartílago, hueso y tejido conectivo en vertebrados. Los miembros más osteoinductores de la subfamilia BMP son BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8 y BMP-9 (ver, por ejemplo, Hoffman y otros, Appl. Microbiol Biotech 2001,57-294-308; Yeh y otros, J Cellular Biochem., 2005; 95-173-188; y Boden, Orthopaedic Nursing 2005,24: 49-52). Esta capacidad osteoinductora de las BMP se ha considerado durante mucho tiempo muy prometedora para una variedad de aplicaciones terapéuticas y clínicas, incluida la reparación de fracturas; fusión de la columna vertebral; tratamiento de enfermedades esqueléticas, regeneración de defectos óseos, mandibulares y del cráneo; y en aplicaciones orales y dentales tales como dentogénesis y cementogénesis durante la regeneración de heridas periodontales, injerto de extracción de alveolos, aumento del reborde alveolar y aumento del seno. Actualmente, la BMP-2 humana recombinante vendida como INFUSE® por Medtronic está aprobada por la FDA para el uso en cirugía de fusión espinal, para la reparación de fracturas no unidas y para el uso en cirugía oral, mientras que la BMP-7 humana recombinante se vende como OP-1® por Stryker está aprobado como una alternativa al autoinjerto en la pseudoartrosis recalcitrante de huesos largos y para las fusiones de la columna lumbar posterolateral (intertransversa) de revisión, donde el autoinjerto y la extracción de médula ósea no son factibles o no se espera que promuevan la fusión.
Otros factores de crecimiento recombinantes que se han usado de forma exógena para mejorar la reparación ósea incluyen varios TGFp (ver Clokie y Bell, J. Craniofacial Surg. 2003, 14: 268-77), miembros de la superfamilia de factores de crecimiento de fibroblastos (FCF) (ver Kawaguchi y otros, (2007) J. Orthopaedic Res. 25 (4): 480-487), miembros de la superfamilia de factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) (ver Hollinger y otros, 2008 JBJS 90 (s1): 48-54) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Street y otros, 2002 PNAS 99: 9656-61).
Para que estos factores de crecimiento sean eficaces, deben estar activos y disponibles en una concentración suficiente en el momento en que las densidades críticas de las células sensibles apropiadas estén presentes en el sitio de reparación. La corta vida media, la inestabilidad térmica, la sensibilidad a las proteasas y/o la solubilidad de los FC requieren su administración en combinación con un portador para lograr este requisito.
Se han evaluado varios portadores para el suministro de FC. Estos incluyen esponjas de colágeno fibroso, hidrogeles de gelatina, geles de fibrina, heparina, polímeros de fase inversa como los poloxámeros, portadores compuestos de ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) o sus copolímeros (PLGA), portadores de PLGA conjugados a heparina y materiales inorgánicos tales como fosfatos de calcio. Por ejemplo, el bioimplante (GEM-21S®) que se usa para la regeneración periodontal usa fosfato tricálcico beta (P-TCP) como portador de rhPDGF-BB (consulte http://www.osteohealth.com/GEM21S.aspx).
Sin embargo, estos portadores tienen una eficacia limitada, debido a la pérdida de la actividad del factor de crecimiento cuando se asocian con el portador, la liberación ineficaz del FC en el sitio de implantación y/o la protección deficiente frente a la proteólisis y la degradación. Por ejemplo, el bioimplante Infuse® usa una esponja de colágeno de tipo I como portador de rhBMP-2. La rhBMP-2 se libera en una ráfaga del portador y la vida media de la BMP dentro del sitio de la herida es de 1-3 días (Winn y otros, 1998, Adv. Drug Del. Rev.31:303; Friess y otros, 1999, Intl. J. Pharm., 187:91.). En el momento en que las células madre mesenquimales que regeneran el hueso han migrado al sitio de la herida, solo están presentes fracciones de un por ciento de la cantidad original de BMP cargada para estimular estas células a producir hueso. La solución actual para garantizar un nivel efectivo de BMP restante en estos momentos posteriores es aumentar significativamente la cantidad de BMP que se carga inicialmente. Estas dosis aumentadas aumentan el riesgo de complicaciones, incluida la formación de hueso más allá del sitio del implante, respuestas autoinmunes y potencialmente cáncer. Además, esto aumenta drásticamente el costo del implante.
Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de materiales y métodos que liberen factores de crecimiento con un perfil que minimice la cantidad de factor de crecimiento que se necesita cargar para lograr el efecto terapéutico requerido.
El documento WO 2010/000061 describe un método para retener factores de crecimiento sobre un sustrato para su liberación en una región de tratamiento que inmoviliza un antagonista del factor de crecimiento sobre un sustrato y une el factor de crecimiento al antagonista.
Una estrategia es encapsular el FC en una matriz polimérica biodegradable que libera el FC con un perfil de liberación sostenida durante muchos días. Por ejemplo, las BMP se han combinado con ácido poliláctico (PLA) o ácido poliláctico co-glicólico (PLGA) para producir perfiles de liberación sostenida. Sin embargo, la incorporación de BMP en PLA o PLGA puede desnaturalizar la BMP reduciendo su actividad y es difícil manipular el perfil de liberación para optimizar la eficacia del bioimplante. Además, la velocidad de degradación de estos portadores es típicamente de manera que grandes cantidades de FC permanecen bloqueadas mucho tiempo después de que se completa la curación. En consecuencia, es necesario cargar grandes cantidades de FC en estos polímeros para garantizar que haya suficiente FC presente en los momentos apropiados.
Otra estrategia es inmovilizar químicamente el FC directamente sobre la superficie del portador. Sin embargo, esto puede resultar en una pérdida parcial o total de la actividad del FC, y puede restringir la actividad del FC de manera que solo aquellas células en contacto con el portador puedan interactuar con el FC y responder (ver Steinmuller-Nethl, D. y otros, Biomaterials, 2006, 27: 4547-56) lo que podría ser indeseable ya que el efecto podría limitarse a la interfaz inmediata con el portador y no a todo el sitio de la herida.
La composición del portador puede influir en el suministro del FC. El sulfato de calcio se ha considerado conveniente como sustituto óseo y portador de FC porque es osteoconductor, biodegradable, biocompatible y no tóxico (Chen y otros, J. Craniofacial Surg., 2010, 21: 188-197). Sin embargo, también se sabe que el sulfato de calcio tiene una velocidad de degradación rápida cuando se añade al hueso in situ y poca capacidad osteoinductora, lo que ha limitado su utilidad en implantes óseos.
Una estrategia para gestionar la degradación del sulfato de calcio in situ ha sido controlar la velocidad de degradación alterando las estructuras cristalinas y añadiendo polímeros (por ejemplo, Quitosano) a la mezcla de implante de sulfato de calcio (Chen y otros, Supra). Los gránulos de sulfato de calcio revestidos con polímero que se han impregnado con BMP pueden disminuir la velocidad de reabsorción del sulfato de calcio y aumentar la resistencia a la compresión y la osteoinducción de la mezcla (Chen y otros, Supra).
Los compuestos que contienen hidroxiapatita (HAp), un componente mineral importante del hueso, y hemihidrato de sulfato de calcio (CSH, yeso de París) se han usado en injertos ortopédicos (por ejemplo, Damien, C y otros, J. Biomed. Estera. Res., 1990, 24: 639-654; Damien, C y otros, Spine, 2002, 16S: S50-S58; Parsons, J. y otros, Annals NY Acad. Sci.). Cuando se mezcla CSH con solución salina estéril o agua, inmediatamente comienza a gelificarse. Mientras está en el estado de gel HAp, los factores de crecimiento y/o varios componentes de la matriz pueden mezclarse junto con el CSH para formar el compuesto de injerto, que puede insertarse o inyectar en un defecto óseo donde se fija in situ. En tales métodos, CSH actúa inicialmente como aglutinante. Sin embargo, la subsiguiente reabsorción de sulfato de calcio deja una matriz porosa con espacio para el crecimiento óseo, que puede ser estimulado por los factores de crecimiento en el compuesto endurecido. De manera similar, se conocen composiciones para suministrar proteínas osteogénicas que incluyen CSH, una mezcla de polímeros particulados porosos y una proteína osteogénica (patente de Estados Unidos 5,385,887 y Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2008/0233165). En cada uno de estos métodos, se requiere la degradación del sulfato de calcio para la liberación del factor de crecimiento. Por tanto, la regeneración ósea depende de la velocidad de degradación del sulfato de calcio.
Se conocen injertos óseos que contienen hueso particulado y un componente sólido biocompatible que comprende CSH y un producto de fosfato de calcio, pero no implican el uso de CSH o fosfato de calcio como portador del factor de crecimiento (Publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2011/0208305).
En la naturaleza, durante la cicatrización de heridas, están presentes múltiples FC dentro del sitio de la herida y el tejido circundante en concentraciones variables en diferentes momentos. Por ejemplo, inmediatamente después de la fractura ósea, las plaquetas en el sitio de la lesión liberarán inicialmente grandes cantidades de PDGF, con una fuerte disminución de los niveles de proteínas dentro del sitio de la fractura durante los días siguientes (ver Tyndall y otros, Clinical Orthopedics and Related Research, 2003, 408: 319-330). Por el contrario, BMP-2 se expresa en todas las etapas del proceso de curación de la fractura (ver Rasubala y otros Revista Británica de Cirugía Oral y Maxilofacial, 2003, 41: 173-178), aunque la cantidad de BMP-2 varía con el tiempo (ver Meyer y otros J Bone Jt. Surg 2003, 85-A: 1243-1254). Se estima que la concentración de estos factores de crecimiento es órdenes de magnitud más bajas que las usadas durante la aplicación terapéutica de FC exógeno debido al emparejamiento de la concentración con los requisitos celulares y los efectos sinérgicos de los múltiples factores de crecimiento. Producir un sistema que permita el suministro de factores de crecimiento con perfiles de liberación multifásica y la liberación de múltiples factores de crecimiento con diferentes perfiles de liberación permitiría el uso de bioimplantes con perfiles de liberación de FC que imitan más de cerca la liberación de FC durante el proceso de curación natural que los bioimplantes actuales que liberan un solo factor de crecimiento en una ráfaga o con liberación sostenida.
Esta información de los antecedentes se proporciona con el propósito de dar la información conocida que el solicitante considera de posible importancia para la presente invención. No se pretende ninguna admisión necesariamente, ni debería interpretarse que ninguna de la información precedente constituye materia anterior en contra de la presente invención.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona, en un aspecto, un sistema para la liberación multifásica de factores de crecimiento en un sitio de tratamiento. La presente invención proporciona además un sistema que comprende un vehículo de suministro y un portador para el uso en un método de liberación multifásica de factores de crecimiento. Para este propósito, el sistema de la invención puede proporcionarse como bioimplante o similar. En un aspecto, el método de la invención proporciona al menos un factor de crecimiento en una liberación inicial seguido por el suministro de al menos un factor de crecimiento en un "perfil de liberación sostenida". La invención usa un sistema de suministro para la liberación inicial y un portador para la liberación sostenida.
En un aspecto, el mismo factor de crecimiento se libera en los perfiles de liberación inicial y sostenida. En otro aspecto, se liberan diferentes factores de crecimiento, con un primer factor de crecimiento liberado en un perfil inicial y un segundo factor de crecimiento liberado en un perfil de liberación sostenida. Como sabrán los expertos en la técnica, se cree que la liberación de dos factores de crecimiento diferentes de formas tan diferentes imita más de cerca el sistema de liberación del factor de crecimiento natural en un sitio de tratamiento.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un portador que proporciona una liberación sostenida de al menos un factor de crecimiento, combinado con un vehículo de suministro que proporciona una liberación inicial de al menos un factor de crecimiento. La combinación del portador y el vehículo de suministro da como resultado un perfil de liberación multifásica del factor o factores de crecimiento. En modalidades preferidas, la cantidad de portador y vehículo de suministro se varía para controlar la liberación de al menos un FC, en donde la cantidad de vehículo de suministro y el portador se proporcionan en una relación de aproximadamente 0,5 a 4,0:1 (v:v). En modalidades preferidas, la cantidad de vehículo de suministro usada está entre 0,5 y 10,0 ml. En modalidades particularmente preferidas, se usan 0,75-2,5 ml de vehículo de suministro con 1 cm3 de portador. En modalidades particularmente preferidas, 1,0 ml de vehículo de suministro y 0,5 cm3 de portador se usan.
En modalidades preferidas, el factor de crecimiento ("FC") es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFP). En modalidades particularmente preferidas, el factor de crecimiento es una proteína morfogenética ósea (BMP).
En un aspecto de la presente invención, el portador ("CAR") está formado por partículas de fosfato de calcio con un tamaño menor de 80 micra y preferiblemente menor de 45 micras dispersos dentro de una matriz polimérica que da como resultado una estructura más grande. En un aspecto, la estructura se recubre además con una capa de hidroxiapatita.
En una modalidad, el al menos un FC se aplica como líquido a las partículas de calcio y luego se liofiliza sobre las partículas antes de combinarse con la matriz polimérica. En algunas modalidades, el 100 % del FC liofilizado está asociado con las partículas. En otras modalidades, menos del 100 % del FC liofilizado está asociado con las partículas y el resto no está asociado con las partículas. Tal composición que comprende partículas asociadas a FC y FC liofilizado que no está asociado con partículas puede combinarse con un vehículo de suministro de manera que las partículas no asociadas se distribuyan en el vehículo de suministro, donde posteriormente pueden liberarse.
En otro aspecto de la presente invención, el portador se forma mezclando uno o más polvos de fosfato de calcio con una solución líquida que contiene al menos un factor de crecimiento para producir un cemento de fosfato de calcio. En un aspecto, el cemento se muele luego en partículas con un diámetro de al menos 100 micrómetros y preferiblemente entre 0,3 y 3 mm de diámetro.
En otro aspecto de la presente invención, el portador comprende partículas de una o más sales de calcio, todas con un diámetro de al menos 100 micrómetros y preferiblemente entre 0,3 y 3 mm. A continuación, se liofiliza un factor de crecimiento sobre la superficie de las partículas portadoras.
En modalidades preferidas, el vehículo de suministro es un polímero de fase inversa. En modalidades particularmente preferidas, el polímero de fase inversa es un poloxámero, más particularmente poloxámero 407 (también llamado Pluronic ™ F127) a una concentración de al menos 12% y preferiblemente entre 20 y 40 %. En algunas modalidades particularmente preferidas, las cantidades de P407 y el portador se varían para influir en la cantidad de FC liberada del portador y, opcionalmente, del vehículo de suministro.
Como se indicó anteriormente, en un aspecto, el portador y el vehículo de suministro liberan el mismo factor de crecimiento mientras que en otro aspecto, el portador y el vehículo de suministro liberan diferentes factores de crecimiento. En otro aspecto más de la invención, el portador y el vehículo de suministro están adaptados cada uno para liberar combinaciones de dos o más factores de crecimiento, siendo la combinación liberada por cada uno la misma o diferente.
Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona un sistema para la liberación multifásica de factores de crecimiento en un sitio de tratamiento, comprendiendo el sistema:
- un vehículo de suministro que comprende al menos un primer factor de crecimiento y un polímero; y
- un portador que comprende una pluralidad de partículas que tienen al menos un segundo factor de crecimiento en sus superficies;
- en donde:
- el vehículo de suministro está adaptado para liberar el al menos un primer factor de crecimiento en un perfil de liberación inicial durante un primer período de tiempo;
- el portador está adaptado para liberar el al menos un segundo factor de crecimiento en un perfil de liberación sostenida durante un segundo período de tiempo, y en donde el portador comprende partículas de sulfato de calcio dihidratado.
En otro aspecto, la invención proporciona un sistema que comprende un vehículo de suministro y un portador para el uso en un método de liberación multifásica de factores de crecimiento, el método comprende:
- entregar al menos un primer factor de crecimiento con un perfil de liberación inicial durante un primer período de tiempo por medio del vehículo de suministro; y
- entregar al menos un segundo factor de crecimiento en un perfil de liberación sostenida por medio de un portador,
en donde el vehículo de suministro comprende el al menos un primer factor de crecimiento y un polímero, y en donde el portador comprende una pluralidad de partículas que tienen el al menos un segundo factor de crecimiento en sus superficies, y en donde el portador comprende partículas de sulfato de calcio dihidratado o una mezcla de partículas de sulfato de calcio dihidratado y partículas de fosfato de calcio.
La presente invención también proporciona, en un aspecto, un sistema y un sistema para el uso para la liberación de al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, en un sitio de tratamiento, en donde las partículas "portadoras" de sulfato de calcio alojan el al menos un factor de crecimiento en su superficie. Para este propósito, el sistema de la invención puede proporcionarse como bioimplante o similar.
En un aspecto de la presente invención, el portador comprende una mezcla de partículas de sulfato de calcio dihidratado y fosfato de calcio. En modalidades preferidas, la relación de partículas de sulfato de calcio a fosfato de calcio es aproximadamente 1:1 o 2:1.
En algunos aspectos de la presente invención, el al menos un factor de crecimiento se libera en una sola fase del portador de calcio. En este aspecto, el vehículo de suministro no libera FC. En otros aspectos, el al menos un factor de crecimiento experimenta una liberación multifásica del portador de calcio y el vehículo de suministro. En modalidades preferidas, la cantidad de portador y vehículo de suministro se varía para controlar la liberación de al menos un FC, en donde la cantidad de vehículo de suministro y el portador se proporcionan en una relación de aproximadamente 0,5-4:1 (v:v). En modalidades preferidas, la cantidad de vehículo de suministro usada está entre 0,5 y 10,0 ml. En modalidades particularmente preferidas, se usan 0,5-2,5 ml de vehículo de suministro por cm3 de portador. En modalidades particularmente preferidas, 1,0 ml de vehículo de suministro y 0,5 cm3 de portador se usan. En una modalidad, el al menos un FC se aplica como líquido a las partículas de calcio y luego se liofiliza sobre las partículas antes de combinarse con la matriz polimérica.
En una modalidad, el FC se liofiliza de manera que parte del FC esté asociado con el portador y parte del FC esté separado del portador. Cuando el vehículo de suministro se añade al portador, el FC separado se asocia con el vehículo de suministro.
En modalidades preferidas, la distribución del al menos un FC sobre las partículas de calcio se altera variando el volumen de la solución que contiene el FC con relación a la proteína que se va a liofilizar sobre las partículas. La cantidad de FC unido a las partículas de calcio puede aumentarse disminuyendo el volumen de solución usada para suministrar el FC. En modalidades preferidas, la liofilización de FC sobre partículas portadoras se lleva a cabo en una relación 1: 1: 0,5, en donde 1 unidad de FC se mezcla con 1 unidad de solución y se liofiliza sobre 0,4 unidades de portador. En modalidades particularmente preferidas, se añaden aproximadamente 1,0 mg de FC a aproximadamente 1,0 ml de solución para liofilizar sobre aproximadamente 0,5 cm3 de partículas de calcio.
Breve descripción de las figuras.
La invención se describirá ahora con referencia a las figuras adjuntas, que se describen brevemente más abajo.
La Figura 1 ilustra un perfil de liberación sostenida exhibido por el portador de la invención.
La Figura 2 ilustra el perfil de liberación inicial exhibido por el vehículo de suministro de la invención.
La Figura 3 ilustra diferentes perfiles de liberación basados en una cantidad de factor de crecimiento en el vehículo de suministro y el portador. Se observa un perfil de liberación multifásica cuando se incorporan factores de crecimiento tanto en el vehículo de suministro como en el portador (50-50).
La Figura 4 ilustra la in vivo actividad de los bioimplantes donde se libera un factor de crecimiento como se muestra en la Figura 3 de acuerdo con el método de la invención.
La Figura 5 ilustra la formación de hueso nuevo (hueso) sobre partículas de fosfato de calcio (CaP) cuando se implantó en un ratón un bioimplante producido de acuerdo con el método de la invención.
La Figura 6 ilustra el aspecto histológico del hueso nuevo (hueso) formado en un portador (portador) cuando se implantó en un ratón un bioimplante producido de acuerdo con el método de la invención.
La Figura 7 ilustra un perfil de liberación de factor de crecimiento sostenido corto producido por un portador producido de acuerdo con el método de la invención.
La Figura 8 ilustra cómo puede alterarse un perfil de liberación sostenida cambiando las propiedades del portador producido de acuerdo con el método de la invención.
La Figura 9A-D ilustra un portador liofilizado, en donde se varió el volumen de solución liofilizada pero se fijó la proteína total liofilizada. Se representan los grupos de tratamiento 1 (A), 3 (B) y 5 (C).
La Figura 10 AB ilustra el aspecto histológico de hueso nuevo formado alrededor de los componentes portadores de fosfato de calcio (A) y sulfato de calcio (B) usados en un bioimplante producido de acuerdo con el método de la invención.
Descripción detallada de la invención
Los factores de crecimiento (FC) juegan un papel integral en la reparación y regeneración de tejidos y los FC exógenos pueden usarse para estimular la reparación de diversos tejidos y órganos. Para que los factores de crecimiento exógenos sean eficaces para estimular la reparación, deben retenerse en el sitio que requiere reparación y protegerse de la inactivación, el secuestro o la degradación. Para lograr esto se usan portadores. Sin embargo, la liberación de factores de crecimiento de portadores conocidos no es ideal y no puede modificarse fácilmente. La presente invención se basa en: i) el descubrimiento de que la liberación multifásica de factores de crecimiento de un bioimplante aumenta la eficacia del implante; y ii) el descubrimiento de que el uso de sulfato de calcio como portador del factor de crecimiento puede mejorar la potencia de los bioimplantes que contienen FC.
Los presentes inventores han desarrollado métodos y materiales para mejorar la eficacia de, por ejemplo, bioimplantes mejorando la cinética de liberación o el perfil de liberación de los factores de crecimiento en los sitios de implantación, mientras se mantiene la actividad de los factores de crecimiento. En un aspecto, la presente invención proporciona un sistema y método de suministro de factor de crecimiento que comprende un portador que contiene al menos un factor de crecimiento, combinado con un vehículo de suministro que también contiene al menos un factor de crecimiento. El al menos un factor de crecimiento liberado por el portador y el vehículo de suministro puede ser el mismo o diferente.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un sistema y método de suministro de factor de crecimiento que tiene una eficacia mejorada debido al uso de un portador que comprende una pluralidad de partículas de sulfato de calcio dihidratado que comprenden al menos un FC en su superficie, combinado con un vehículo de suministro que opcionalmente puede contener al menos un FC. Por el contrario, los intentos previos de usar sulfato de calcio como portador de FC implicaron incorporar o impregnar partículas de sulfato de calcio con el factor de crecimiento en lugar de revestir la superficie de las partículas de calcio con un FC. En la presente invención, no se requiere la degradación del sulfato de calcio para la liberación de FC.
En modalidades preferidas, la cantidad de portador y vehículo de suministro se varía para controlar la liberación de al menos un FC, en donde la cantidad de vehículo de suministro y el portador se proporcionan en una relación de aproximadamente 0,5-4,0:1 (v v). En modalidades preferidas, la cantidad de vehículo de suministro usada está entre 0,5 y 10,0 ml. En modalidades particularmente preferidas, se usan 0,5-2,5 ml de vehículo de suministro por cm3 de portador. En modalidades particularmente preferidas, 1,0 ml de vehículo de suministro y 0,5 cm3 de portador se usan.
En una modalidad, el al menos un FC se aplica como líquido a partículas de calcio pequeñas (<80 micrómetros) y luego se liofilizan sobre las partículas antes de combinarse con una matriz polimérica para producir la estructura portadora.
En otra modalidad, el FC se aplica como un líquido a partículas grandes (> 100 micras) y luego se liofiliza con las partículas dando como resultado una distribución de FC asociado a partículas y libre de partículas.
En modalidades preferidas, la distribución del al menos un FC entre estar asociado con las partículas y estar separado o "libre" de las partículas se altera variando el volumen de la solución que contiene el FC con relación a la cantidad de partículas con las que se incuba. antes de la liofilización. La cantidad de FC unido a las partículas puede aumentarse disminuyendo el volumen de solución usada para suministrar el FC. En modalidades preferidas, la liofilización de FC sobre partículas portadoras se lleva a cabo en una relación de 1:1:0,5, en donde 1 unidad de FC se mezcla con 1 unidad de solución y se liofiliza en 4 unidades de portador. En modalidades particularmente preferidas, se añaden aproximadamente 1,0 mg de FC a aproximadamente 1,0 ml de solución para liofilizar en aproximadamente 0,5 cm3 de partículas de calcio.
El sistema y el método de la invención pueden usarse para una variedad de aplicaciones terapéuticas y clínicas, que incluyen: reparación de fracturas; injertos de hueso; fusión de la columna vertebral; y regeneración de defectos óseos, mandibulares y del cráneo. Para tales aplicaciones, el sistema de la invención se proporciona preferiblemente sobre o en forma de bioimplante.
Definiciones
A menos que se definan de cualquier otra manera más abajo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por una persona experta en la técnica a la que pertenece esta invención.
Como se usa en la presente descripción, el término "bioimplante" se refiere a un material que es adecuado para la implantación y contiene un factor de crecimiento exógeno o biológicamente activo. Como se analiza más detalladamente en la presente descripción, el sistema de la presente invención se usa preferiblemente aplicándolo a un bioimplante. A continuación, el bioimplante se proporciona dentro del cuerpo de un sujeto en donde el sistema libera al menos un factor de crecimiento en un perfil de liberación multifásica.
Como se usa en la presente, el término "factor de crecimiento" se refiere a péptidos y proteínas que estimulan el crecimiento y/o la diferenciación de las células mediante la interacción de los FC con receptores específicos de la superficie celular. Ejemplos de factores de crecimiento incluyen las proteínas morfogenéticas óseas (BMP), el factor de crecimiento transformante beta (TGFP), los factores de crecimiento similares a la insulina (IGF), los factores de crecimiento de fibroblastos (FCF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y el crecimiento del endotelio vascular. factor. En modalidades preferidas, los factores de crecimiento son BMP.
Por "recombinante" se entiende una proteína producida por una célula hospedadora transgénica transfectada transitoriamente, transfectada de manera estable o transgénica de acuerdo con lo dirigido por una construcción de expresión que contiene el ADNc de esa proteína. El término "recombinante" también abarca las sales farmacéuticamente aceptables de dicho polipéptido.
Como se usa en la presente, "polipéptido" o "proteína" se refiere a un polímero de monómeros de aminoácidos que son alfa aminoácidos unidos a través de enlaces amida. Por lo tanto, los polipéptidos tienen una longitud de al menos dos residuos de aminoácidos y normalmente son más largos. Generalmente, el término "péptido" se refiere a un polipéptido que tiene sólo unos pocos residuos de aminoácidos de longitud. Un polipéptido, en contraste con un péptido, puede comprender cualquier número de residuos de aminoácidos. Por tanto, el término polipéptido incluía péptidos, así como también secuencias más largas de aminoácidos.
Como se usa en la presente, los términos "proteína morfogenética ósea" o "proteína morfogénica ósea" o "BMP" se usan indistintamente y se refieren a cualquier miembro de la subfamilia de proteínas morfogenéticas óseas (BMP) de la superfamilia de crecimiento del factor de crecimiento transformante beta (TGFP). y factores de diferenciación, que incluyen BMP-2, BMP-3 (también conocida como osteogenina), BMP-3b (también conocida como factor de crecimiento y diferenciación 10, Gd F-10), BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (también conocida como proteína osteogénica-1, OP-1), BMP-8 (también conocida como proteína osteogénica-2, OP-2), BMP-9, BMP-10, BMP-11 (también conocida como crecimiento y factor de diferenciación 8, GDF-8 o miostatina), BMP-12 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 7, GDF-7), BMP-13 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 6, GDF-6), BMP-14 (también conocido como factor de crecimiento y diferenciación 5, GDF-5) y BMP-15.
Los términos "proteína morfogenética ósea" y "BMP" también abarcan variantes alélicas de BMP, variantes conservadoras de función de BMP y BMP mutantes que retienen la actividad de BMP. La actividad de BMP de tales variantes y mutantes puede confirmarse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica (ver la sección Ensayos para medir la actividad de BMP, a continuación) o como se describe en el Ejemplo 1.
En modalidades preferidas, la BMP es BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 o BMP-9. En modalidades particularmente preferidas, la BMP es BMP-2, BMP-4 o BMP-7.
En modalidades preferidas, la BMP es una BMP de mamífero (por ejemplo, BMP-2 de mamífero o BMP-7 de mamífero). En modalidades particularmente preferidas, la BMP es una b Mp humana (hBMP) (por ejemplo, hBMP-2 o hBMP-7).
Como se usa en la presente descripción, el término "armazón" se refiere a un material cuyo propósito es proporcionar una estructura que soporte la adhesión celular, la migración y el crecimiento hacia el interior en un sitio de reparación de tejido.
Como se usa en la presente descripción, el término "portador" se refiere a un material que comprende uno o varios componentes y está adaptado para liberar al menos un factor de crecimiento en un sitio de tratamiento en un perfil de "liberación sostenida" durante un período de tiempo. En un aspecto, el período de tiempo que tarda el portador en liberar el al menos un factor de crecimiento es de varios días a varias semanas. Preferentemente, el portador está adaptado para liberar el al menos un factor de crecimiento durante un período de semanas.
En modalidades preferidas, el portador también actúa como un armazón o matriz. Como se discutió anteriormente, en un aspecto de la invención, el portador está formado por partículas de fosfato de calcio dispersas dentro de una matriz o armazón de polímero macroporoso. En un aspecto, el armazón o matriz se recubre además con una capa de hidroxiapatita. En otro aspecto de la invención, el portador está formado por partículas de sulfato de calcio. En otro aspecto más de la invención, el portador es una mezcla de partículas de sulfato de calcio y fosfato de calcio. En una modalidad, el al menos un factor de crecimiento se aplica como líquido a las partículas de calcio y luego se liofiliza sobre las partículas antes de combinar las partículas con la matriz polimérica. En modalidades preferidas, el portador es un sólido.
Como se usa en la presente, el término "vehículo de suministro" se refiere a un material que sirve para transportar el portador. En un aspecto de la invención, el vehículo de suministro comprende o se asocia con al menos un factor de crecimiento y está adaptado para liberar el al menos un factor de crecimiento en un sitio de tratamiento en un perfil de liberación inicial durante un período de tiempo. En otros aspectos, el vehículo de suministro no comprende inicialmente un factor de crecimiento. Más bien, se combina posteriormente con un FC que no está asociado con el portador antes de su uso, produciendo así la fase inicial de liberación de FC. En un aspecto, el período de tiempo que tarda el vehículo de suministro en liberar el al menos un factor de crecimiento es de varias horas a varios días. En una modalidad preferida de la invención, el vehículo de suministro libera la mayor parte del al menos un factor de crecimiento en una "liberación inicial" o "perfil de liberación inicial" que dura un período de horas. Preferentemente, el vehículo de suministro está adaptado para liberar al menos el 80 % del factor o factores de crecimiento contenidos en él (o asociados con ellos) dentro de un período de 72 horas. En modalidades preferidas, el vehículo de suministro es un líquido o un gel.
En un aspecto, el vehículo de suministro de la presente invención puede usarse para facilitar la manipulación de las partículas del portador, en donde la combinación del vehículo y el vehículo de suministro da como resultado la formación de un gel o masilla.
En un aspecto, el material que forma el vehículo de suministro tiene forma de gel. En modalidades preferidas, el vehículo de suministro es un polímero de fase inversa. Como se usa en la presente, el término "fase inversa" se refiere a la propiedad por la cual el polímero experimenta una transición dependiente de la temperatura reversible de un líquido a un gel. En un aspecto, la temperatura de transición está entre 15 °C y 37 °C. Preferentemente, la temperatura de transición está entre 15 °C y 25 °C. Como sabrán los expertos en la técnica, los materiales de "fase normal" aumentan su viscosidad con una disminución de la temperatura. Por el contrario, los materiales de fase inversa muestran una disminución de la viscosidad a medida que la temperatura desciende por debajo de su temperatura de transición.
En modalidades particularmente preferidas, el polímero de fase inversa es un poloxámero, más particularmente Pluronic ™ F127 (también conocido como poloxámero 407 o P407).
En modalidades particularmente preferidas, la solución de polímero P407 está entre el 20 y el 40 %
En modalidades preferidas, la cantidad de portador y vehículos de suministro usados en un bioimplante se altera para influir en la cantidad de FC liberada del bioimplante.
Como se usa en la presente, el término "liberación sostenida" o "perfil de liberación sostenida" se refiere a la liberación de al menos un factor de crecimiento, por el portador, durante un período de varios días o semanas, siendo la cantidad liberada durante un período inicial similar a o menos que la cantidad liberada durante el mismo período después de varios días o semanas de implantación. Preferentemente, un perfil de liberación sostenida dura al menos una semana. Como entenderán los expertos en la técnica, típicamente, la cantidad de factor de crecimiento liberado en un perfil de liberación sostenida durante los primeros tres días será menor que la cantidad liberada durante los siete días siguientes.
Como se usa en la presente, el término "liberación inicial" o "perfil de liberación inicial" se refiere a la liberación inicial, por el vehículo de suministro, de una gran cantidad de al menos un factor de crecimiento seguido de cantidades progresivamente más pequeñas liberadas durante un período de horas o días. En un aspecto, un perfil de liberación inicial da como resultado el suministro de al menos el 80 % del factor o factores de crecimiento cargados en un período de aproximadamente 72 horas. Un perfil de lanzamiento inicial se ilustra en la Figura 2.
Como se usa en la presente, el término "liberación multifásica" se refiere a una liberación inicial del al menos un factor de crecimiento durante un período de tiempo inicial, seguida de una liberación "sostenida" del al menos un factor de crecimiento durante un segundo período de tiempo. Preferentemente, el período de tiempo inicial es aproximadamente de varias horas y el segundo período de tiempo es aproximadamente de varios días a semanas. Dicho perfil de liberación también puede denominarse "liberación bifásica", ya que se produce en dos etapas. En modalidades preferidas, la liberación inicial la proporciona el sistema de suministro de la invención y la liberación "sostenida" la proporciona el portador de la invención.
Como se usa en la presente, el término "potencia" se refiere a una medida de la actividad del fármaco expresada en términos de la cantidad requerida para producir un efecto de intensidad dada.
En un aspecto de la invención, el componente de vehículo de suministro comprende al menos el 10 % y no más del 50 % de la cantidad total de factor (s) de crecimiento suministrado por el sistema de la invención y el componente de portador comprende al menos el 50 % de la Cantidad total de factores de crecimiento entregados por el sistema.
Ensayos para medir la actividad de BMP
Los ensayos para caracterizar in vitro e in vivo la función de las BMP recombinantes se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,761,471; patente de Estados Unidos núm. 4.789.732; patente de Estados Unidos núm. 4.795.804; patente de Estados Unidos núm. 4.877.864; patente de Estados Unidos núm.
5.013.649; patente de Estados Unidos núm. 5,166,058; patente de Estados Unidos núm. 5,618,924; patente de Estados Unidos núm. 5,631,142; Patente de Estados Unidos núm. 6.150.328; patente de Estados Unidos núm.
6.593.109; Clokie y Urist, Plast. Reconstruir. Surg. 2000; 105: 628-637; Kirsch y otros, EMBO J 2000; 19: 3314-3324; Vallejo y otros, J. Biotech. 2002; 94: 185-194; Peel y otros, J. Craniofacial. Surg. 2003; 14: 284-291; y Hu y otros, Growth Factors, 2004; 22: 29-33).
Dichos ensayos incluyen: ensayos in vivo para cuantificar la actividad osteoinductora de una BMP después de la implantación (por ejemplo, en el músculo del cuarto trasero o en el área torácica) en un roedor (por ejemplo, una rata o un ratón) (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,761,471; patente de Estados Unidos núm.4,789,732; patente de Estados Unidos núm. 4,795,804; patente de Estados Unidos núm. 4,877,864; patente de Estados Unidos núm. 5,013,649; patente de Estados Unidos núm. 5,166,058; patente de Estados Unidos núm. 5,618,924; patente de Estados Unidos núm. 5,631,142; Patente de Estados Unidos núm. 6,150,328; patente de Estados Unidos núm.
6,503,109; Kawai y Urist., Clin. Orthop. Relat. Res., 1988; 222: 262-267; Clokie y Urist, Plast. Reconstruir. Surg., 2000; 105: 628-637; y Hu y otros, Growth Factors, 2004; 22: 29-33); ensayos in vivo para cuantificar la actividad de una BMP para regenerar defectos de trefina del cráneo en mamíferos (por ejemplo, ratas, perros o monos) (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,761,471 y patente de Estados Unidos núm. 4.789.732); in vitro ensayos para cuantificar la actividad de una BMP para inducir la proliferación de in vitro células de cartílago cultivadas (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4.795.804); in vitro ensayos para cuantificar la actividad de una BMP para inducir la actividad de la fosfatasa alcalina en in vitro células musculares cultivadas (por ejemplo, células C2C12, ATCC Número CRL-1772) o células del estroma de la médula ósea (por ejemplo, células W-20 murinas, ATCC Número CRL-2623) (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6.593.109; Ruppert y otros, Eur J Biochem 1996; 237: 295­ 302; Kirsch y otros, EMBO J, 2000; 19: 3314-3324; Vallejo y otros, J Biotech, 2002; 94: 185-194; Peel y otros, J Craniofacial Surg., 2003; 14: 284-291; y Hu y otros, Growth Factors, 2004; 22: 29-33); in vitro ensayos para cuantificar la actividad de una BMP para inducir la expresión del receptor 2 de FCF (FCFR3) en líneas de células progenitoras mesenquimales cultivadas (por ejemplo, células C3H10T1-2 murinas) (ver, por ejemplo, Vallejo y otros J Biotech 2002; 94: 185-194); in vitro ensayos para cuantificar la actividad de una BMP para inducir la síntesis de proteoglicanos en células de yemas de extremidades de pollo (ver, por ejemplo, Ruppert y otros, Eur J Biochem 1996; 237: 295-302); e in vitro ensayos para cuantificar la actividad de una BMP para inducir el tratamiento con osteocalcina en células del estroma de la médula ósea (por ejemplo, células W-20 murinas; ATCC Número CRL-2623) (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6,593.109).
Ensayos para medir la unión y liberación de BMP
Pueden usarse varios ensayos para medir la unión y liberación de BMP recombinante de un portador. Por ejemplo, la cantidad de proteína BMP recombinante puede cuantificarse mediante cualquiera de las técnicas bien conocidas en la técnica, incluidas las transferencias puntuales, inmunoensayos (por ejemplo, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas, ELISA), medición del aumento de radiactividad presente en el tampón de liberación cuando el bioimplante incorpora BMP radiomarcada y cromatografía (por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión, HPLC y cromatografía de intercambio iónico).
Tales métodos se conocen bien en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1999; Gosling, ed., Immunoassays: A Practical Approach, Oxford University Press. 2000; Oliver, ed., HPLC of Macromolecules: A Practical Approach., Oxford University Press, 1998; Millner, ed., High Resolution Chromatography: A Practical Approach. Oxford University Press, 1999; Hockfield y otros, Selected Methods for Antibody and Nucleic Acid Probes. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1993; Gore, ed., Spectrophotometry and Spectrofluorimetry: A Practical Approach. Oxford University Press, 2000).
Por ejemplo, se han descrito protocolos para el análisis de radioinmunoensayo de proteínas BMP (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4,857,456). Por ejemplo, se han descrito protocolos para el análisis de inmunotransferencia de proteínas BMP (ver, por ejemplo, Wang y otros Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 2220-2224). Por ejemplo, los estuches de ELISA para la cuantificación de los niveles de proteína de BMP-2 humana, de rata o de ratón están disponibles comercialmente, por ejemplo, en R&D Systems (núm. de catálogo DBP200, PDBP200 o SBP200). Por ejemplo, los estuches de ELISA para la cuantificación de los niveles de proteína de BMP-7 humana están disponibles comercialmente, por ejemplo, en R&D Systems (catálogo núm. DY354 o DY354E).
Estuches
El sistema descrito en la presente descripción puede estar contenido en un estuche. En una modalidad, el estuche comprende los componentes necesarios para fabricar el vehículo de suministro y el portador, así como también los factores de crecimiento necesarios. Es decir, el estuche comprendería los componentes necesarios para fabricar el vehículo de suministro y el portador, así como también al menos un factor de crecimiento que está asociado con, o posteriormente se asociará con, el vehículo de suministro y al menos un factor de crecimiento asociado con el portador.
El estuche comprende preferiblemente un recipiente que comprende el portador sobre el que puede cargarse o recubrirse el factor o factores de crecimiento asociados.
Preferentemente, el vehículo de suministro y cualquier factor de crecimiento asociado se mantienen en contenedores separados, que pueden combinarse en el momento de su uso. Esto sería particularmente preferible en los casos en los que el vehículo de suministro puede comprender un líquido o un gel. En tal caso, cuando el vehículo de suministro comprende ambos factores de crecimiento asociados y un líquido o gel, los factores de crecimiento asociados pueden mantenerse en un recipiente separado como un polvo liofilizado. En el momento del uso, el factor o factores de crecimiento, en forma de polvo, pueden combinarse con el vehículo de suministro de líquido o gel.
En una modalidad preferida, el estuche de la invención comprendería al menos tres contenedores para cada uno de los siguientes: 1) el componente del vehículo de suministro; 2) el al menos un primer factor de crecimiento (es decir, el factor o factores de crecimiento asociados con el vehículo de suministro); y 3) el portador y al menos un segundo factor de crecimiento (es decir, el factor o factores de crecimiento asociados con el portador). En uso, el al menos un primer factor de crecimiento, en forma de polvo, se combina con el vehículo de suministro en forma de líquido o gel y la mezcla se aplica luego al portador sobre el que se precargó el al menos un segundo factor de crecimiento.
En otra modalidad preferida, el estuche comprendería al menos dos contenedores, cada uno de los cuales comprendería lo siguiente: 1) el componente del vehículo de suministro; y 2) el portador de sulfato de calcio y el menos un factor de crecimiento asociado con el portador y otro factor de crecimiento que no está asociado con el portador. En uso, el vehículo de suministro en forma de líquido o gel se aplica al portador y FC asociado (GF unido o cargado) y al factor de crecimiento que no está asociado con el portador (FC "libre"). El f C libre luego se incorpora al vehículo de suministro.
En una modalidad preferida, el portador está compuesto por una mezcla de partículas de sulfato de calcio y fosfato de calcio. En modalidades particularmente preferidas de la presente invención, el portador está compuesto por una mezcla de partículas de sulfato de calcio y fosfato de calcio en una relación de aproximadamente 1:1 o 2:1. Preferentemente, el portador se recubre con al menos un factor de crecimiento.
En otra modalidad preferida más, el estuche comprendería al menos tres contenedores para cada uno de los siguientes: 1) el componente del vehículo de suministro; 2) el al menos un primer factor de crecimiento (es decir, el factor o factores de crecimiento asociados con el vehículo de suministro); y 3) el portador de sulfato de calcio y el menos un segundo factor de crecimiento (es decir, el factor o factores de crecimiento asociados con el portador). En uso, el al menos un primer factor de crecimiento, en forma de polvo, se combina con el vehículo de suministro en forma de líquido o gel y la mezcla se aplica luego al portador sobre el que se precargó el al menos un segundo factor de crecimiento.
En una modalidad preferida, el portador está compuesto por una mezcla de partículas de sulfato de calcio y fosfato de calcio. En modalidades particularmente preferidas de la presente invención, el portador está compuesto por una mezcla de partículas de sulfato de calcio y fosfato de calcio en una relación de aproximadamente 1:1 o 2:1. Preferentemente, el portador se recubre con al menos un factor de crecimiento.
En un aspecto, el estuche de la invención puede comprender cualquier reactivo y/o instrumentos y/o instrucciones y/o recipientes necesarios de acuerdo con sea necesario.
Ejemplos
La presente invención se describirá ahora por medio de los siguientes ejemplos. Estos ejemplos ilustran los nuevos descubrimientos de los inventores de que un perfil de liberación multifásica de un factor de crecimiento, como rhBMP-2, producido al cargar parte de BMP dentro de un portador que libera BMP con una liberación sostenida y parte de BMP dentro de un vehículo de suministro que libera BMP con una liberación inicial es más eficaz que los portadores que solo producen una liberación por ráfaga o una liberación sostenida. Estos ejemplos también ilustran que el sulfato de calcio dihidratado o una mezcla de sulfato de calcio dihidratado y fosfato de calcio puede usarse como portador de un factor de crecimiento, tal como BMP, en sistemas, métodos y composiciones mejorados para aumentar la potencia del bioimplante.
Como resultará obvio para un experto en la técnica, es posible colocar un factor de crecimiento dentro del portador y un factor de crecimiento diferente dentro del vehículo de suministro, dando como resultado diferentes perfiles de liberación de cada factor de crecimiento.
Se debe entender que los ejemplos proporcionados en este documento están destinados únicamente a ilustrar la presente invención y no a limitar el alcance de la invención de ninguna manera. Igualmente, la invención no se limita a ninguna modalidad preferida particular descrita en la presente descripción. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invención pueden resultar evidentes para los expertos en la técnica al leer la presente memoria descriptiva. Por lo tanto, la invención se limita solamente por los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tales reivindicaciones tienen derecho.
Ejemplo 1: Fabricación de un portador compuesto de liberación sostenida que contiene BMP mediante encapsulación en PLGA.
Este ejemplo demuestra cómo formar un portador que contiene rhBMP-2 y que libera el factor de crecimiento en un perfil de liberación sostenida.
Materiales y Métodos
Se adquirió PLGA 75/25 con viscosidad inherente de 1,33 dL/g (PM = 205000-210000) de Birmingham Polymers Inc. (Birmingham, AL). El fosfato de tetracalcio (TTCP) se obtuvo de Taihei Chemical Industrial Co. (Osaka, Japón) y el fosfato de dicalcio anhidro (DCPA) y el dimetilsulfóxido (DMSO) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (MO, EE.UU.). Las partículas de azúcar se adquirieron de Tate & Lyle North America Inc. (Toronto, Canadá).
Se prepararon partículas de fosfato de calcio reabsorbibles mezclando TTCP equimolar y DCPA con agua destilada desionizada (ddH2O) al 100 % de humedad relativa durante 24 h. El reactivo se trituró y se tamizó a través de un tamiz de 45 pm.
Se preparó BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) en tampón de formulación (1,5 mg/ml, pH 4,5; 5 mm de ácido glutámico, 2,5 % de glicina, 0,5 % de sacarosa y 0,01 % de Tween™ 80 con ddH2O). La solución de proteína se añadió a viales que contenían CaP en polvo y se agitó durante al menos 15 minutos. A continuación, el polvo se congeló y se liofilizó.
Las partículas con (CaP-BMP) o sin (CaP) BMP se usaron luego para hacer bloques de andamio de partículas de CaP-PLGA mediante inversión de fase/lixiviación de partículas de la siguiente manera: Se disolvió PLGA en DMSO a una concentración del 11,5 % (p/v). Para esta solución, las partículas de CaP y CaP-BMP se mezclaron completamente de acuerdo con una relación CaP/PLGA de 2:1 (p/p). Se dispersaron cristales de azúcar con intervalos de tamaño de 0,85-1,18 mm en el CaP/PLGA y la mezcla se solidificó a -18 °C en un molde. El PLGA se precipitó y los cristales de azúcar se lixiviaron sumergiéndolos en tres cambios de ddH2O.
Se depositó una capa de hidroxiapatita sobre y a lo largo de los andamios compuestos macroporosos de la siguiente manera: cilindros secos de PLGA/CaP, que medían 2 mm de diámetro y 2 mm de longitud, se humedecieron previamente en etanol al 70 % y se sumergieron en 60 ml de 3xSBF durante un período de 9 días a 37 ° C. El SBF se preparó de la siguiente manera: a 1,8 l de ddH2O con agitación vigorosa se añadieron secuencialmente las siguientes sales: 29,711 g de NaCl, 2,206 g de CaCl2-2H2O, 10 ml de HCl 1 M, 0,852 Na2HPO4. El volumen final se llevó a 2 litros. La solución de SBF se cambió a diario. Después del recubrimiento, las muestras de 3PCC se enjuagaron en ddH2O y secado al aire.
Esto dio como resultado la formación de un portador compuesto macroporoso (3PS) que es capaz de liberar rhBMP-2 con un perfil de liberación sostenida durante al menos siete días. Estos resultados se ilustran en la Figura 1.
Ejemplo 2: Fabricación de un portador de liberación sostenida que contiene BMP mediante encapsulación en un cemento de fosfato de calcio.
El presente ejemplo demuestra cómo formar un portador de cemento de fosfato de calcio (CPC) que contiene rhBMP-2 que tiene un perfil de liberación sostenida.
Materiales y Métodos
El fosfato de tetracalcio (TTCP) se obtuvo de Taihei Chemical Industrial Co. (Osaka, Japón) y el fosfato de dicalcio anhidro (DCPA) se obtuvo de Sigma Chemical Co. Los gránulos macroporosos de fosfato de calcio bifásico (Eclipse) se adquirieron de Citagenix (Laval Qc, Canadá). Se preparó BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) en tampón de formulación (1,5 mg/ml, pH 4,5; ácido glutámico 5 mm, glicina al 2,5 %, sacarosa al 0,5 % y Tween ™ 80 al 0,01 % con ddH2O).
Se prepararon partículas de cemento de fosfato de calcio reabsorbible mezclando TTCP equimolar y DCPA con solución de rhBMP-2. El reactivo se trituró y se tamizó a través de un tamiz de 300 y 100 pm y se retuvieron las partículas entre 100 y 300 pm.
Esto dio como resultado la formación de partículas portadoras de cemento de fosfato de calcio en las que se incorporó rhBMP-2. Tras la implantación en un animal, la BMP se libera de forma sostenida durante un período de al menos varias semanas.
Para producir un portador de liberación sostenida basado en CPC que también actuara como portador macroporoso, se mezclaron partículas de CPC (0,1 a 0,3 mm) en gránulos de fosfato de calcio macroporoso (1-2 mm) en una relación 1:1 (p/p).
Ejemplo 3: Fabricación de un portador de liberación sostenida que contiene BMP mediante el uso de un recubrimiento que se une a BMP.
El presente ejemplo demuestra cómo formar un portador que tiene un perfil de liberación sostenida aplicando un revestimiento de unión a BMP. Uno de estos métodos consiste en recubrir un portador con un anticuerpo o proteína de unión a BMP como se describe en nuestro número de solicitud pendiente Solicitud de Estados Unidos núm.
13/002,444.
Materiales y Métodos
Los anticuerpos anti-BMP-2 humana policlonal de conejo purificados se adquirieron de Cell Sciences, (Canton MA., Cat #PA0025). Se adquirieron gránulos macroporosos de fosfato de calcio bifásico (BCP) (Eclipse) de Citagenix (Laval, Qc, Canadá).
Los gránulos de BCP estériles se pesaron en una cabina de bioseguridad y se colocaron en tubos de TPP estériles (Mandel Scientific, Guelph ON, Canadá). La solución de anticuerpo se diluyó en solución salina tamponada con fosfato hasta una concentración final de 150, 300 y 600 ng de anticuerpo en 1 ml de PBS, se esterilizó por filtración y se aplicó al portador en una relación 1:1 v/v. Las muestras se agitaron durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente, antes de congelarse y liofilizarse. A continuación, se aplicó la solución de BMP a los gránulos, se dejó en remojo durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se congeló y volvió a liofilizar.
Esto dio como resultado la formación de gránulos de BCP recubiertos con anticuerpo que se unieron y liberaron lentamente la rhBMP-2 de forma sostenida.
La cantidad de rhBMP-2 que puede unirse puede aumentarse aumentando la cantidad de anticuerpo usado. La velocidad de liberación puede aumentarse mediante el uso de anticuerpos con menor afinidad o avidez.
Ejemplo 4: Producción de un vehículo de suministro que contiene BMP mediante el uso de F127
El presente ejemplo demuestra cómo preparar un vehículo de suministro que contiene rhBMP-2 mediante el uso de F127.
Materiales y Métodos
El poloxámero se preparó de la siguiente manera: Se enfriaron 100 ml de agua destilada a 4 °C y se añadieron lentamente varias cantidades de poloxámero 407 con agitación durante un período de varias horas, hasta que toda la pastilla sólida se disolvió formando una solución final que oscilaba entre el 12 y el 33 %. Después, la solución de poloxámero se esterilizó en un autoclave (121 °C, 20 minutos, 30 psi). Después de la esterilización, la solución de poloxámero se mantuvo a 4 °C hasta su uso.
Se añadió polvo de BMP-2 humana recombinante liofilizada (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) a la solución de poloxámero y se mezcló lentamente.
Alternativamente, se añadió rhBMP-2 de la solución (1 mg/ml, pH 4,5; ácido glutámico 5 mm, glicina al 2,5 %, sacarosa al 0,5 % y Tween 80 al 0,01 %) en una relación de 1/10 o 1/20 (v/v).
Esto dio como resultado la formación de un vehículo de suministro que liberó más del 80 % de rhBMP -2 durante los dos primeros días (como se ilustra en la Figura 2).
Ejemplo 5: Producción de un bioimplante con perfil de liberación multifásica
El presente ejemplo demuestra cómo formar un bioimplante 3PS-F127 que contiene rhBMP-2 que libera rhBMP-2 con un perfil de liberación multifásica.
Materiales y Métodos
El portador 3PS (como se describe en el Ejemplo 1) que contiene 0, 4,55 o 9,1 gg de rhBMP-2 por 5 mg de portador se preparó y se almacenó en tubos Eppendorf. Se almacenó un vehículo de suministro que contenía 0, 4,55 o 9,1 gg de rhBMP-2 en 45,5 gg de F127 (preparado como se describe en el Ejemplo 4) en tubos Eppendorf a 4 °C. Inmediatamente antes de su uso, se pipeteó el F127 sobre el portador 3PS y el portador se mezcló en el vehículo de suministro.
Este bioimplante 3PS-F127 se usó luego para medir la liberación de BMP in vitro y actividad de formación ósea in vivo como se describe más abajo.
Las relaciones de portador a vehículo de suministro pueden variarse para producir gel (relación 1:1 v:v) o masillas (relación 2:1 v:v). Además, la relación de BMP a portador o el tamaño de partícula del portador puede variarse para alterar el perfil de liberación sostenida. Finalmente, la cantidad de rhBMP-2 en el portador y el vehículo de suministro puede variarse para alterar la cantidad de rhBMP-2 liberada inicialmente durante las primeras horas en comparación con la cantidad liberada durante las siguientes semanas.
Ejemplo 6: Un ensayo in vitro para la liberación de BMP de bioimplantes.
El presente ejemplo describe cómo medir la liberación de rhBMP-2 de los diversos bioimplantes descritos en los Ejemplos 1 a 5.
Materiales y Métodos
Los bioimplantes que contenían cantidades conocidas de rhBMP-2 preparados como en los Ejemplos 1 a 5 se transfirieron a tubos Eppendorf. La cantidad total de rhBMP-2 usada fue de 9,1 gg de rhBMP-2 por 5 mg de portador y 45,5 gl de F127, o de 20 gg de rhBMP-2 a 10 mg de portador por 100 gl de F127.
A continuación, las muestras se incubaron con agitación con una solución de 1 ml de tampón de liberación que comprendía solución salina tamponada con fosfato (PBS) BSA al 1 % a 37 °C. El tampón se eliminó y se reemplazó con tampón de liberación reciente después de varios tiempos (por ejemplo, 1, 2, 5, 7 y 10 días) y las soluciones recolectadas se almacenaron con viales de 1,5 ml a -20 °C para análisis adicionales.
La cantidad de BMP-2 liberada en el tampón se midió mediante el uso de un ELISA comercial (Quantikine ™ hBMP-2 ELISA, RnD Systems). El ELISA se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados
No se detectó BMP en el tampón de liberación recogido de ninguno de los bioimplantes que no se habían cargado con BMP. Las muestras del portador que se habían cargado con rhBMP-2 demostraron una liberación sostenida de rhBMP-2 durante el período del estudio, mientras que las muestras en el vehículo de suministro solo se liberaron en un "perfil de liberación inicial".
Cuando se combinaron el portador y el vehículo de suministro, se obtuvieron varios perfiles de liberación en dependencia del componente en donde se cargó la BMP. Cuando se cargó el 100 % de rhBMP-2 (9,1 gg) dentro del portador 3PS (5 mg) que luego se mezcló con F127 al 33 % (45,5 gl), el perfil de liberación de BMP coincidió con el patrón sostenido, donde la cantidad de BMP liberada sobre los primeros 2 días fue de 5 ng, entre los días 3 y 5 fue de 8 ng y entre los días 5 y 7 fue de 10 ng (Figura 3; 100-0).
Cuando se cargó el 100 % de la rhBMP-2 (9,1 gg) dentro del 33 % de F127 (45,5 gl) y luego se mezcló con el portador 3PS (5 mg) que no tenía BMP dentro, se liberó la BMP donde la cantidad de BMP liberado durante el primer día 1 fue de 2363 ng, durante el segundo día fue de 381 ng y luego 12 ng el tercer día (Figura 3; 0-100).
Cuando la BMP se distribuyó entre el portador y el vehículo de suministro, el bioimplante demostró un perfil de liberación bifásica, con una liberación inicial intermedia seguida de una liberación sostenida de BMP (Figura 3; 50-50).
Ejemplo 7: Un ensayo in vitro para probar la actividad de las BMP liberadas.
El presente ejemplo describe cómo determinar si la rhBMP-2 liberada de los bioimplantes retiene su actividad. Para demostrar que la rhBMP liberada es biológicamente activa, pueden cultivarse células sensibles con el liberado y medir su respuesta al factor de crecimiento. Tales ensayos son conocidos en la técnica (ver Peel y otros, J. Craniofac. Surg.
2003, 14: 284-291).
Materiales y Métodos
Se prepararon materiales con o sin rhBMP-2 como se describe en los Ejemplos 1 a 5. Los liberados se prepararon como se describe en el Ejemplo 3 excepto que el tampón era un medio esencial mínimo alfa con suero bovino fetal al 15 % y antibióticos (aMEM FBS al 15 % AB)
Las células C2C12 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos a 0,5 x 105 células/ml, 1 ml de alfa MEM 15 % de FBS por pocillo. Después de varios periodos entre 24 y 72 horas se retiró el medio y se aplicaron los diversos relevados. Los controles negativos incluyeron células C2C12 cultivadas con aMEM reciente FBS al 15 % AB. Los controles positivos incluían células C2C12 incubadas con aMEM FBS al 15 % AB que contenían 25, 50 y 100 ng/ml de rhBMP-2. Después de 48 horas, las células se lisaron en 1 ml de tampón de lisis celular (Cellytic Sigma Aldrich) y se midió la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) de los lisados celulares mediante el uso del ensayo de paranitrofenol fosfato (Sigma Aldrich). El contenido de proteína celular de los lisados se midió mediante el uso de Coomassie Plus Reagent (Fisher) y se usó para normalizar la actividad de ALP al número de células en cada pocillo.
Generalmente, para determinar si ha habido alguna pérdida en la actividad del BMP cuando se asocia con el portador o el vehículo de suministro, se realiza una curva de actividad estándar de los resultados de ALP/PTN para los estándares rhBMP-2 que no se han asociado con el portador o el vehículo de suministro determinado. La concentración de rhBMP-2 activa en los liberados puede determinarse a partir de esta curva estándar y se expresa como un porcentaje de la cantidad total de rhBMP-2 presente en los liberados de acuerdo con se determina mediante ELISA.
Ejemplo 8: Evaluación de la actividad osteoinductora de implantes BMP multifásicos.
El presente ejemplo describe cómo determinar la actividad osteoinductora de bioimplantes que contienen BMP in vivo. Para evaluar la capacidad de los bioimplantes para inducir la formación de hueso, se usó el ensayo de la bolsa de músculo de ratón. En este modelo, el bioimplante se coloca en una bolsa de músculo hecha en las extremidades posteriores del ratón y el tamaño del hueso inducido formado es proporcional a la cantidad de BMP probada. Tales ensayos son conocidos en la técnica (ver por ejemplo Barr y otros, Oral Surg. Oral Med. Pathol oral. Radiol oral. Endod., 2010; 109: 531-40.)
Materiales y Métodos
Los bioimplantes se prepararon como se describe en los Ejemplos 1 y 5. Bajo anestesia, se prepararon bolsas bilaterales en los músculos del muslo de las extremidades traseras de ratones c D-1 machos de 37-42 días, mediante disección roma. A continuación, los bioimplantes se colocaron en cápsulas de gelatina estériles que se habían colocado en la bolsa muscular. El músculo se juntó y la piel se cerró con clips Mitchel.
Los animales se sacrificaron el día 28 postoperatorio. Se recogieron las extremidades posteriores y se fijaron con formalina tamponada al 10 %. Después de la fijación, se tomaron imágenes de las muestras mediante el uso de un escáner microCT (General Electric Healthcare eXplore ™ Locus SP). Las muestras se escanearon y reconstruyeron mediante el uso del software del fabricante a una resolución de 59 pm. Después de la reconstrucción de la imagen, se determinó una región de interés (ROI). Esta área abarcó todas las áreas que contienen el hueso inducido por bioimplantes. Estos pueden distinguirse fácilmente de los huesos esqueléticos de acuerdo con su ubicación y densidad.
Para analizar la cantidad y calidad de hueso dentro del ROI, los vóxeles de las imágenes de mCT se segmentaron en fases óseas y no óseas. La segmentación se logró determinando un valor umbral para la escala de grises del vóxel en donde el vóxel se contaba como hueso. El volumen total (TV), volumen óseo (BV), densidad mineral del volumen total (TV-MD), densidad mineral del volumen óseo (BV-MD), contenido mineral del volumen total (TV-MC), mineral Se determinó el contenido del volumen óseo (BV-MC) y la fracción de volumen óseo (BVF) del ROI para cada muestra. Los valores se ajustaron para la presencia de calcio debido al portador mediante el uso de un valor de umbral superior que seleccionaba solo portador y restándolo de los valores obtenidos mediante el uso de un umbral más bajo que incluía portador más hueso nuevo (ver Humber y otros, Cirugía bucal, Medicina bucal, Patología bucal, Radiología bucal y Endodoncia. 2010. 109: 372-384).
Una vez terminado el análisis de microCT, las muestras se incrustaron en resina de espuelas o se descalcificaron en ácido fórmico y se incrustaron en cera. Las muestras incrustadas en resina se evaluaron mediante retrodispersión SEM mientras que las muestras incrustadas en cera se cortaron y tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron mediante microscopía óptica para evaluar los tipos de tejido presentes en el sitio de implantación.
Resultados
Se combinaron un portador y un vehículo de suministro como se describe en el Ejemplo 5.
El análisis de MicroCT mostró que los bioimplantes con todas las BMP dentro del portador 3PS, que tenían un perfil de liberación sostenida de BMP, producían los huesecillos más pequeños de hueso (Figura 4; 100-0), bioimplantes con todas las BMP dentro del vehículo de suministro F127, que tenían un perfil de liberación de BMP de ráfaga produjeron huesecillos de tamaño intermedio (Figura 4; 0-100), mientras que los bioimplantes con 50 % de BMP cargada en el portador y 50 % cargada en el vehículo de suministro, que tenía un perfil de liberación de BMP multifásico, produjeron los huesecillos de hueso más grandes (Figura 4; 50-50).
La SEM de retrodispersión mostró que a los 28 días se formó hueso en todo el bioimplante y sobre las partículas de fosfato de calcio que se habían incorporado al PLGA (Figura 5). La histología confirmó que el tejido formado era hueso (Figura 6).
Ejemplo 9: Un ensayo in vivo para la liberación de BMP de bioimplantes.
El presente ejemplo describe cómo medir la liberación de rhBMP-2 de los diversos bioimplantes descritos en los Ejemplos 1, 2, 3, 4 o 5 después de la implantación en un animal. Los métodos para hacerlo se conocen bien en la técnica. Ver, por ejemplo, uludag y otros. J Biomed Mater Res, 46, 193-202, 1999.
Materiales y Métodos
La hBMP-2 recombinante está radiomarcada con lodine125 (I-125) por Perkin Elmer. La rhBMP-2 radiomarcada (caliente) se mezcla con rhBMP-2 sin marcar (fría) para producir una mezcla fría caliente de 1: 100.
Los bioimplantes que contienen cantidades conocidas de rhBMP-2 se preparan como en los Ejemplos 1 a 5. Estos bioimplantes se implantan luego en animales como se describe en el Ejemplo 8. En varios momentos se sacrifican los animales y se diseca el sitio del implante. A continuación, se pesa el tejido disecado y se determina la cantidad de radiactividad mediante el uso de un contador gamma.
Para determinar si los recuentos están asociados con la proteína, el tejido se homogeneiza en 0,5 ml de PBS 0,5 % de BSA. Se añaden dos ml de ácido tricloroacético al 10 % helado al homogeneizado y luego se mantiene durante al menos 1 hora a 4°C. A continuación, se centrifuga el homogeneizado y se elimina el sobrenadante. A continuación, se mide la radiactividad del precipitado mediante el uso de un contador gamma.
La radiactividad asociada con los implantes se corrige por la desintegración y se estima la cantidad total de BMP que queda en el implante.
Ejemplo 10: Producción de un portador con un perfil de liberación sostenida corto.
El presente ejemplo describe medios para producir un portador que libera un factor de crecimiento con un perfil de liberación sostenida corto.
Materiales y Métodos
Se adquirieron gránulos macroporosos de fosfato de calcio bifásico (BCP) (Eclipse) de Citagenix (Laval, Qc, Canadá). Se preparó BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2, Induce Biologics Inc) en tampón de formulación (1,5 mg/ml, pH 4,5; 5 mm de ácido glutámico, 2,5 % de glicina, 0,5 % de sacarosa y 0,01 % de Tween™ 80 con ddH2Ü).
La solución estéril de rhBMP-2 se incubó con gránulos de BCP estéril en una relación de 9,1 pg por 5 mg o 4,55 pg por 5 mg (BMP por BCP) durante 15 minutos con agitación. A continuación, las muestras se congelaron y liofilizaron asépticamente.
Después de la liofilización, los portadores se pesaron en alícuotas de 5 mg y se colocaron en tubos Eppendorf estériles. Algunos tubos tenían 33 % de F127 (45,5 pl añadidos). A continuación, se determinó el perfil de liberación de BMP como se describe en el Ejemplo 6.
Resultados
Los portadores que no estaban recubiertos con F127 (BCP) mostraron un perfil de liberación por ráfaga con la mayor cantidad de BMP liberada durante el primer día y luego cantidades decrecientes de BMP liberadas en cada punto de tiempo posterior. La mezcla de BCP con F127 (BCP-Pol) dio como resultado un perfil de liberación sostenida corto en donde se recogieron cantidades similares de BMP cada día durante los primeros 4 días (Figura 7).
Ejemplo 11: Alteración del perfil de liberación sostenida del portador.
El presente ejemplo describe un medio para alterar el perfil de liberación de un portador.
Materiales y Métodos
Se adquirieron PLGA con diferentes viscosidades inherentes y pesos moleculares de Birmingham Polymers Inc. (Birmingham, AL). A continuación, se fabricaron portadores mediante el uso de estos PLGA como se describe en el Ejemplo 1. El perfil de liberación de BMP de estos portadores se determinó de acuerdo con el método del Ejemplo 6. Resultados
Todos los portadores produjeron perfiles de liberación sostenida. Sin embargo, la cantidad de BMP liberada difirió en dependencia de la viscosidad/peso molecular del PLGA usado. Los portadores fabricados con PLGA de baja viscosidad (Pol-1) liberaron más rhBMP-2 que los que usaron PLGA de alta viscosidad (Pol-2) durante las 12 semanas de duración del estudio (Figura 8).
Ejemplo 12: Alteración de la distribución de proteínas unidas y no unidas durante la liofilización.
El presente ejemplo describe un medio para alterar la distribución de una proteína entre unida a las partículas portadoras y el liofilizado no unido variando el volumen de solución liofilizada, pero manteniendo fijo el contenido total de proteína y portador. Este medio permite la distribución de proteína entre la proteína asociada al portador y la proteína asociada al vehículo de suministro si posteriormente se añade un vehículo de suministro al recipiente de liofilización.
Materiales y Métodos
Diseño experimental'. Para probar el efecto que tiene sobre la distribución del material liofilizado la variación del volumen de tampón de proteína añadido al portador antes de la liofilización, se varió la relación de volumen de portador a proteína líquida y la cantidad total de proteína (albúmina de suero bovino, "BSA") y el portador se fijaron en 1 mg y 400 mg, respectivamente.
Con base en los criterios anteriores, el estudio se diseñó como se establece en la Tabla 1, en donde el volumen de solución de proteína añadida (es decir, 2,0, 1,5, 1,0, 0,75 y 0,5 ml/vial) y la concentración de proteína añadida (es decir, 0,5, 0,67, 1,0, 1,33 y 2,0 mg/ml).
Tabla 1: Diseño experimental.
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Preparación de la muestra: Se preparó BSA en tampón de formulación (FB) a 2 mg/ml; 1,5 mg/ml; 1 mg/ml; 0,75 mg/ml 0,5 mg/m y 0 mg/ml. Se añadieron 400 mg del portador en cada vial que contenía BSA y FB. Se colocaron varios volúmenes de solución de proteína en cada vial en las relaciones proporcionadas en la Tabla 1 y los viales se mantuvieron a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, los viales se congelaron y liofilizaron. Después de la liofilización, se examinó cada vial y se categorizó y fotografió el aspecto del liofilizado de proteína (Figura 9 A-C).
Puntuación: La distribución de la proteína liofilizada se puntuó entre 0 y 4, donde 0 representaba que no había partículas liofilizadas claras visibles y 4 representaba una clara separación del portador y la proteína con una lámina de proteína liofilizada visible.
Mediciones de proteínas: Para cuantificar la cantidad de proteína unida al portador y la cantidad liofilizada por separado de los gránulos, los materiales liofilizados se transfirieron del vial a un tubo de centrífuga y se añadió 1 ml de PBS al tubo de centrífuga y al vial. Los recipientes se agitaron con vórtex y la solución de enjuague se recogió y centrifugó. Se analizó el contenido de proteína de los sobrenadantes mediante el uso del ensayo de proteína Coomassie-Plus de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad de proteína unida se calculó restando las cantidades de proteína liberadas de los gránulos y el vial de la cantidad de proteína cargada (1000 pg).
Resultados
Hubo una diferencia significativa en la distribución del liofilizado entre el grupo 1, que tenía la concentración de proteína más baja (es decir, 0,5 mg/ml) y los grupos 3 (1,0 mg/ml), 4 (1,33 mg/ml) y 5 (2,0 mg/ml) (Tabla 2). Las muestras del grupo 1 tenían algo de liofilizado de proteína visible en las paredes del vial (Figura 9A). No se observó liofilizado entre las partículas portadoras en las muestras del grupo 1. En las muestras del grupo 3, se vio algo de liofilizado de proteína en las paredes de vidrio del vial. Sin embargo, también fueron visibles grandes trozos de proteína liofilizada que se asemejaban a copos de nieve blancos o translúcidos entre las partículas portadoras en las muestras del grupo 3 (Figura 9B). En las muestras del grupo 5, se formaron bordes distintos de proteína en la superficie del vial de vidrio (Figura 9C). Estos bordes de proteína proyectaban trozos de proteína liofilizada. También se observaron trozos entre las partículas portadoras en las muestras del grupo 5.
Tabla 2: Distribución de proteína liofilizada unida a gránulos y libre.
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La medición de la proteína unida indicó que había diferencias significativas entre las cantidades de proteína unida basadas en el volumen de solución añadido antes de la liofilización. Específicamente, la cantidad de proteína unida cambió del 68 % al 39 % cuando el volumen de solución usado para suministrar 1 mg de proteína se cambió de 0,5 ml a 2 ml por 400 mg de portador (Tabla 3, ver proteína unida en los grupos 1 y 5, respectivamente).
Tabla 3: Mediciones de proteínas
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El análisis post Hoc del grupo de proteínas unidas indicó que había diferencias significativas entre: el grupo 1 y los grupos 3, 4 y 5; grupo 2 y grupos 4 y 5; y grupo 3 y grupo 5 (Tabla 4).
Tabla 4: Comparaciones de proteína unida.
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Ejemplo 13: Efecto de la variación del portador y la cantidad de P407 sobre la liberación de BMP.
El presente ejemplo describe un medio para variar el perfil de liberación de BMP del portador variando la cantidad de vehículo de suministro y portador usado.
Materiales y Métodos
Diseño Experimental: Para probar el efecto que tiene la variación de la cantidad de vehículo de suministro y portador en el perfil de liberación de BMP, se varió la cantidad de portador (fosfato de calcio bifásico BCP) y la cantidad de vehículo de suministro (gel de P407 al 33 %) en bioimplantes en donde la cantidad de BMP añadido a las partículas portadoras se fijó a 40 gg/muestra y la BMP se liofilizó sobre los gránulos portadores. El diseño del estudio se describe con más detalle en la Tabla 5.
Tabla 5: Diseño del estudio.
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Preparación de materiales: Se adquirieron gránulos de BCP macroporosos estériles (0,5-1 mm de diámetro) que comprendían 80 % de P-fosfato tricálcico, 20 % de hidroxiapatita de Citagenix Inc. (Laval, QC). La BMP-2 (1 mg/ml) se preparó por Induce Biologics Inc. Se preparó un gel de poloxámero 407 (P407) al 33 % añadiendo 33 g de poloxámero 407 (BASF) a agua fría. A continuación, la solución se esterilizó en autoclave. El gel de poloxámero se mantuvo a 2-8 °C después de la esterilización.
Se liofilizó BMP sobre los portadores como sigue. Se pesó la cantidad requerida de portador y se Colocó en un tubo Eppendorf estéril. Se añadió la cantidad deseada de BMP-2 al portador y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de congelar. Una vez congelados, los tubos Eppendorf se Colocaron en un liofilizador de mesa y se liofilizaron durante la noche. Todos los procedimientos se realizaron asépticamente para mantener la esterilidad.
Liberación de BMP: Las muestras liofilizadas se pesaron y se Colocaron en tubos Eppendorf a los que se añadió gel P407 y se dejó en remojo durante 20 minutos. Después de esto, se añadió 1 ml de PBS BSA al 0,1 % a cada tubo que luego se Colocó en un agitador en una incubadora a 37 °C y se agitó suavemente. En cada momento de recogida (días 1, 2, 3, 4, 7) se retiraron los tubos, se centrifugaron y se extrajo el PBS BSA y se añadió PBS BSA nuevo. El PBS BSA recogido se almacenó congelado hasta que se analizó.
Métodos analíticos: La cantidad de BMP liberada en las soluciones se determinó mediante el uso de un ELISA BMP-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Análisis Estadístico: Los datos se probaron para determinar la normalidad y la varianza igual. Los datos distribuidos normalmente con la misma varianza se probaron para detectar diferencias significativas mediante el uso de ANOVA de 2 vías (se usó el Portador y P407 como factores). Todos los demás datos se probaron mediante el uso de ANOVA ordinal. Las pruebas posteriores a Hoc se realizaron todas por pares mediante el uso del método Student-Newman-Keuls. Todas las pruebas estadísticas se realizaron mediante el uso de Sigma Stat v3,5.
Resultados
La adición de P407 ralentizó la liberación de BMP hasta por 7 días (Tabla 6). Este fue un resultado sorprendente ya que se informó anteriormente que los geles P407 eran efectivos para ralentizar la liberación del fármaco durante solo unas horas, después de lo cual se había dispersado en el tampón. La cantidad de P407 afectó la liberación de BMP durante los primeros 7 días. A partir del día 4, la cantidad de P407 usada inicialmente determina si hay una diferencia entre los grupos sin P407 y P407+ (Tabla 6). La cantidad de portador presente afectó la liberación de b Mp en presencia o ausencia de P407, desde el día 2 al 7, con una cantidad creciente de portador que redujo la cantidad de BMP liberada (Tabla 6).
Tabla 6: Liberación de BMP durante siete días a partir de bioimplantes que contienen varias cantidades de gel P407 y partículas de BCP.
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Tabla 7: Análisis estadístico de la liberación de BMP durante siete días de bioimplantes que contienen varias cantidades de gel P407. ANOVA de 2 vías (valores P).
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Los datos del primer día mostraron que se liberó significativamente más BMP del portador en ausencia de P407 que cuando estaba presente (Tabla 8).
Si bien no se consideró que la cantidad de portador solo afectara la liberación de BMP el día 1, hubo una interacción entre la cantidad de portador y la cantidad de P407. Específicamente 20 mg de portador, la cantidad de gel P407 usada influyó significativamente en las BMP liberadas (30 v 120 y 30 v 60) mientras que en muestras con 40 u 80 mg de portador esto no se observó (Tabla 8).
Tabla 8: Tabla ANOVA para los resultados del primer día.
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Los datos del segundo día mostraron que tanto la cantidad de portador como la cantidad de P407 impactaron significativamente en la liberación de BMP, produciéndose interacciones (Tabla 9). La cantidad de P407 necesaria para el efecto dependía de la cantidad de portador.
Tabla 9: Tabla ANOVA para los resultados del segundo día.
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Los resultados del día tres indicaron que la cantidad de portador xue el Tactor principal que axectó la liberación de b MP. Sin embargo, la cantidad de gel de P407 se acercó a lo significativo en varios grupos (Tabla 10).
Tabla 10: Tabla ANOVA para los resultados del día tres
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Los resultados del día cuatro indicaron que tanto la cantidad de portador como del gel P407 afectaron la liberación de BMP, aunque no pareció haber interacción entre los dos (Tabla 11). No hubo diferencias en la cantidad de gel P407, siempre que se hubieran usado más de 30 pl de gel. La liberación de BMP difirió entre las 3 cantidades de portador usadas (Tabla 11).
Tabla 11: Tabla ANOVA para los resultados del día cuatro.
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Los resultados del día siete fueron similares a los del día 4, y tanto la cantidad de partículas portadoras como el gel P407 afectaron la liberación de BMP (Tabla 12). Sin embargo, en este momento debió usarse una cantidad mínima de 60 pl de gel P407 por implante.
Tabla 12: Tabla ANOVA para los resultados del día siete.
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Discusión
Tomados en conjunto, estos resultados muestran que es posible variar el perfil de liberación de BMP variando la cantidad de P407 y el portador usados. Estos resultados también muestran que, por el contrario de los informes anteriores sobre el uso de P407 para el suministro de fármacos durante un período de unas pocas horas, el uso de gel P407 en combinación con un portador da como resultado la inhibición de la liberación de proteínas por hasta 7 días. Se contempla en la presente descripción que, después de que la mayor parte del P407 se haya disuelto en las primeras horas, una capa delgada de gel de P407 podría permanecer en la superficie del portador, ralentizando la velocidad de liberación de proteínas.
Ejemplo 14: Evaluación de la liberación de proteínas in vitro de diferentes partículas portadoras.
El presente ejemplo describe bioimplantes que comprenden partículas de sulfato de calcio deshidratado (CSD) sobre las que se liofilizó rhBMP-2. Estos bioimplantes produjeron una liberación mayor y más consistente de BMP durante 14 días con relación a los bioimplantes que comprenden 2 tipos de partículas de fosfato de calcio como portador.
Materiales y Métodos
Diseño Experimental: Se probaron tres portadores: sulfato de calcio dihidratado (CSD), hidroxiapatita (HAp) y fosfato de calcio bifásico (BCP) en bioimplantes, en donde la relación de BMP con el portador era de 40 pg:20 mg, la relación del portador con el vehículo de suministro (es decir, P407) fue de 200 pl:20 mg y en donde la BMP se liofilizó sobre gránulos portadores. El diseño experimental se expone además en la Tabla 13.
Tabla 13: Comparación de portadores.
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Preparación de materiales: Se adquirieron gránulos de BCP macroporosos estériles (0,5-1 mm de diámetro) que comprendían 80 % de P-fosfato tricálcico, 20 % de hidroxiapatita de Citagenix Inc. (Laval, QC). Se prepararon gránulos de CSD estériles (0,5-1,2 mm) triturando gránulos de Osteoset (Wright Medical Technology Canada Ltd., Mississauga, ON) y tamizando entre tamices de 1,18 mm y 0,5 mm. Se obtuvieron gránulos de hidroxiapatita estériles de Tissue Regeneration Therapeutics (Toronto, ON). La BMP-2 (1 mg/ml) se preparó por Induce Biologics Inc. Se preparó un gel de poloxámero 407 (P407) al 33 % añadiendo 33 g de poloxámero 407 (BASF) a agua fría. A continuación, la solución se esterilizó en autoclave. El gel de poloxámero se mantuvo a 2-8 °C después de la esterilización.
Liofilización de BMP sobre partículas portadoras: Se pesó la cantidad requerida de portador y se Colocó en un tubo Eppendorf estéril. Se añadió la cantidad deseada de BMP-2 al portador y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de congelar. Una vez congelados, los tubos Eppendorf se Colocaron en un liofilizador de mesa y se liofilizaron durante la noche. Todos los procedimientos se realizaron asépticamente para mantener la esterilidad.
Liberación in vitro de BMP: Se añadieron 80 pl de gel P407 al portador y la rhBMP-2 asociada y se dejó en remojo durante 20 minutos. Después de esto, se añadió 1 ml de PBS BSA al 0,1 % a cada tubo que luego se Colocó en un agitador en una incubadora a 37 °C y se agitó suavemente. En cada momento de recogida (días 1,2, 3, 4, 7, 10 y 14) se retiraron los tubos, se centrifugaron y se eliminó el PBS BSA y se añadió PBS BSA nuevo. El PBS BSA recolectado se almacenó congelado hasta que se analizó.
Métodos analíticos: La cantidad de BMP liberada en las soluciones se determinó mediante el uso de un ELISA BMP-2 (R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis Estadístico: Los datos se probaron para determinar la normalidad y la varianza igual. Los datos distribuidos normalmente con igual varianza se probaron para detectar diferencias significativas mediante el uso de ANOVA. Todos los demás datos se probaron mediante el uso de ANOVA ordinal. Las pruebas posteriores a Hoc se realizaron todas por pares mediante el uso del método Student-Newman-Keuls. Todas las pruebas estadísticas se realizaron mediante el uso de Sigma Stat v3,5.
Resultados
Las pruebas posteriores a Hoc indicaron que las partículas portadoras de sulfato de calcio liberaron más BMP que las partículas portadoras de BCP en todos los puntos de tiempo analizados (Tabla 14). Las partículas portadoras de CSD también liberaron más BMP que las partículas portadoras de HaP en el día 1, día 2 y día 7. La liberación de BMP de las partículas portadoras de HAP difirió de la BCP en los días 7 y 10.
Tabla 14: Liberación de BMP de varias partículas portadoras.
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Discusión
Estos resultados muestran que las partículas portadoras de CSD liberaron más BMP-2 que las otras partículas portadoras probadas en total durante 14 días y en todos los puntos de tiempo menos en el día 3.
Ejemplo 15: Producción de un portador de BMP que tiene una potencia mejorada in vivo con relación a los portadores conocidos usados en bioimplantes de BMP multifásicos.
El presente ejemplo describe la evaluación de varios componentes portadores para determinar cuál produce más hueso cuando se usa como parte de un bioimplante de BMP multifásico. En este ejemplo, "crecimiento óseo mejorado" o "capacidad mejorada para la formación de huesecillos óseos" se refiere a un aumento en el tamaño y/o densidad de los huesecillos óseos con relación a los portadores conocidos que comprenden la misma BMP. Los resultados de este estudio muestran que los bioimplantes que usan partículas de CSD, sobre las que se liofilizó rhBMP-2, produjeron huesecillos de hueso más grandes cuando se implantaron que los bioimplantes que contienen hidroxiapatita o portadores de fosfato de calcio bifásico.
Materiales y Métodos
Diseño Experimental: Para identificar un portador con una capacidad de producción ósea relativamente alta, se probaron sulfato de calcio dihidratado (CSD), hidroxiapatita (HAp) y fosfato de calcio bifásico (BCP) en bioimplantes en donde la relación de BMP con el volumen del implante se fijó en 40 pg:20 mg, la relación del portador al vehículo de suministro (es decir, P407) se fijó en 200 pl:20 mg y se liofilizó la BMP sobre gránulos portadores. El diseño experimental se expone además en la Tabla 15.
Tabla 15: Comparación de portadores
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Preparación de materiales: Se adquirieron gránulos de BCP macroporosos estériles (0,5-1 mm de diámetro) que comprendían 80 % de P-fosfato tricálcico, 20 % de hidroxiapatita de Citagenix Inc. (Laval, QC). Se prepararon gránulos de CSD estériles (0,5-1,2 mm) triturando gránulos de Osteoset (Wright Medical Technology Canada Ltd., Mississauga, ON) y se tamizaron entre tamices de 1,18 mm y 0,5 mm. Se obtuvieron gránulos de hidroxiapatita estériles de Tissue Regeneration Therapeutics (Toronto, ON). La BMP-2 (1 mg/ml) se preparó por Induce Biologics Inc. Se preparó un gel de poloxámero 407 (P407) al 33 % añadiendo 33 g de poloxámero 407 (BASF) a agua fría. A continuación, la solución se esterilizó en autoclave. El gel de poloxámero se mantuvo a 2-8 °C después de la esterilización. Se liofilizó BMP sobre los portadores de la siguiente manera: se pesó la cantidad requerida de portador y se Colocó en un tubo Eppendorf estéril. Se añadió la cantidad deseada de BMP-2 al portador y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de congelar. Una vez congelados, los tubos Eppendorf se Colocaron en un liofilizador de mesa y se liofilizaron durante la noche. Todos los procedimientos se realizaron asépticamente para mantener la esterilidad.
Modelo Quirúrgico: La osteoinductividad de los diversos bioimplantes se evaluó en el ensayo de bolsa de músculo de ratón (Barr y otros Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2010; 109(4):531-40).
Las muestras en las que se iba a mezclar poloxámero con el portador se prepararon vertiendo los gránulos del portador en una bandeja de acero inoxidable estéril. El poloxámero se mantuvo en hielo y la cantidad apropiada de gel de poloxámero se aplicó mediante pipeta a los gránulos portadores. El portador y el gel se mezclaron y luego se Colocaron cuidadosamente en una cápsula de gelatina que luego se Colocó en la bolsa muscular.
Los ratones macho IGS (aproximadamente 22 g) tenían bolsas intramusculares formadas en el músculo bíceps femoral mediante disección roma. A continuación, se Colocó el bioimplante en la bolsa. Luego, la piel se juntó y se cerró mediante el uso de clips de Michel.
Los ratones se controlaron diariamente. Originalmente, los ratones iban a ser sacrificados después de 28 días. Sin embargo, debido a que algunos implantes formaron tanto hueso que se produjo un puente entre la Columna y el fémur, lo que restringió la movilidad de los ratones, todos los ratones fueron sacrificados después de 18 días. Después del sacrificio de los animales, se disecaron las extremidades traseras y se fijaron mediante el uso de formalina tamponada neutra.
Métodos analíticos: La cantidad de hueso formado por los bioimplantes se determinó mediante micro CT. Los valores apropiados se ajustaron para la presencia de calcio del portador residual como se describió previamente (Humber y otros Oral Surg. Oral Med Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. Marzo de 2010; 109(3):372-84). En resumen, se obtuvieron imágenes de la región donde se había Colocado el implante mediante el uso de un escáner microCT eXplore™ Locus SP de General Electric Healthcare. El portador residual y cualquier masa nueva que se hubiera formado alrededor del implante en el músculo (Colectivamente llamado huesecillo) se delineó cada 10 cortes para definir la región de interés (ROI).
El material portador era más denso que el hueso nuevo. Por lo tanto, fue posible determinar los valores de umbral para el hueso nuevo y el portador por separado mediante la obtención de imágenes de muestras múltiples de cada grupo y tomando un promedio de los valores de la escala de grises. A los efectos de la estandarización, se usó el valor umbral de portador más bajo obtenido para un material (es decir, CSD) para todos los portadores (es decir, 1835). De manera similar, se usó un valor único para el hueso nuevo (es decir, 555).
Los análisis se realizaron mediante el uso de los 2 valores umbrales (es decir, 1835 y 555). El umbral superior distinguía el portador del hueso y el tejido blando, mientras que el inferior distinguía hueso portador del tejido blando. Restando los valores del umbral superior de los valores del umbral inferior, se determinaron los valores para el hueso únicamente. Se midieron siete parámetros diferentes mediante el uso del microCT. La Tabla 16 describe los parámetros obtenidos directamente del microCT y cualquier umbral que haya afectado el resultado. La Tabla 17 describe los parámetros derivados y cómo se calculan.
Tabla 16: Parámetros informados proporcionados por microCT.
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Tabla 17: Parámetros calculados (umbral inferior-umbral superior).
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Las dos medidas usadas para determinar la actividad osteoinductora fueron el volumen total (TV) y el volumen óseo ajustado (aBV).
Histología: Después del análisis de micro CT, las muestras se descalcificaron y procesaron para microscopía óptica. Análisis Estadístico: Los parámetros de microCT se probaron para determinar la normalidad y la varianza igual. Los datos distribuidos normalmente con la misma varianza se probaron para detectar diferencias significativas mediante el uso de ANOVA. Todos los demás datos se probaron mediante el uso de ANOVA ordinal. Las pruebas post-Hoc se realizaron todas por pares mediante el uso del método Student-Newman-Keuls. Todas las pruebas estadísticas se realizaron mediante el uso de Sigma Stat v3,5.
Resultados
Comparación de Portadores: Los resultados de microCT indicaron que los portadores CSD producían huesecillos más grandes que cualquiera de los portadores basados en fosfato de calcio en el volumen total (Tabla 18). También hubo una tendencia a que los huesecillos de CSD contengan más hueso nuevo que cualquiera de los portadores que contienen fosfato de calcio (Tabla 19).
Tabla 18: Volumen Total (mm3)
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Prueba post Hoc: Todos los procedimientos de comparación múltiple por pares (método de Student-Newman-Keuls). CSD frente a HAP (P <0,05); CSD frente a BCP (P <0,05); HAP vs BCP (sin diferencia significativa).
Tabla 19: Volumen Óseo Ajustado (mm3)
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Histología: La evaluación histológica indicó que para todos los bioimplantes, los huesecillos comprendían principalmente una capa de hueso que rodeaba una mezcla de hueso, cartílago y tejido de la médula. No hubo signos de inflamación en ninguno de los implantes.
Los gránulos residuales de fosfato de calcio fueron visibles en los bioimplantes que contienen BCP o HAp, mientras que la CSD parece reabsorberse rápidamente y solo se observaron unos pocos gránulos de CAS.
Estos resultados muestran que cuando se liofilizó BMP-2 sobre portadores de CSD, el bioimplante CSD-P407 produjo huesecillos óseos más grandes que contienen más hueso que los otros portadores sobre los que se liofilizó BMP-2.
Ejemplo 16: Producción de un bioimplante que tiene una potencia aumentada mediante la distribución de BMP tanto en el portador como en el vehículo de suministro en comparación con los bioimplantes en los que el BMP estaba solo en el portador.
El presente ejemplo describe la evaluación de sulfato de calcio y fosfato de calcio individualmente y como una mezcla, como portadores de BMP que podrían mejorar la producción ósea con relación a ACS en ensayos de bolsa de músculo de ratón, en donde se determina una relación preferida de BMP en el portador con relación al vehículo de suministro (es decir, P407) y una relación preferida de sulfato de calcio a fosfato de calcio bifásico.
Materiales y Métodos
Diseño Experimental: Para identificar un portador con una capacidad de producción de hueso relativamente alta, se probaron mezclas de sulfato de calcio deshidratado (CSD) y fosfato de calcio bifásico (BCP) en las relaciones de 1:0, 3:1, 1:1 y 0:1. Además, la relación de BMP en el portador frente al vehículo de suministro F127 se varió de manera que se probaron las relaciones de 100:0, 90:10 y 70:30 de CSD:BCP. Cada variable se probó en un bioimplante en donde la relación de BMP al volumen del implante fue 40 pg: ~50 pl, basado en un objetivo de <1 mg/cc y en donde la relación de portador a F127 fue de 30:45. El diseño experimental se expone además en la Tabla 20.
Tabla 20: Diseño experimental.
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Preparación de materiales: Se adquirieron gránulos de BCP macroporosos estériles (0,5-1 mm de diámetro) que comprendían 80 % de P-fosfato tricálcico, 20 % de hidroxiapatita de Citagenix Inc. (Laval, QC). Se prepararon gránulos de CSD estériles (0,5-1,2 mm) triturando gránulos de Osteoset (Wright Medical Technology Canada Ltd., Mississauga, ON) y tamizando entre tamices de 1,18 mm y 0,5 mm.
El estuche Infuse® se compró a Medtronic de Canada Ltd. La infusión de BMP-2 se preparó añadiendo agua para inyección al polvo de rhBMP-2 liofilizado en el estuche Infuse®. La esponja ACS se cortó en trozos de aproximadamente 5 x 5 mm y se Colocó en cápsulas Eppendorf.
Induce Biologics Inc. preparó Induce BMP-2 (1 mg/ml). Se preparó un gel de poloxámero 407 (P407) al 33 % añadiendo 33 g de poloxámero 407 (BASF) a agua fría. A continuación, la solución se esterilizó en autoclave. El gel de poloxámero se mantuvo a 2-8 °C después de la esterilización.
Se liofilizó BMP sobre los portadores de la siguiente manera: Se pesó la cantidad requerida de portador y se Colocó en un tubo Eppendorf estéril. Se añadió la cantidad deseada de BMP-2 al portador y se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de congelar. Una vez congelados, los tubos Eppendorf se Colocaron en un liofilizador de mesa y se liofilizaron durante la noche. Todos los procedimientos se realizaron asépticamente para mantener la esterilidad. Las muestras de BMP-P407 se prepararon a granel en tubos Eppendorf estériles añadiendo BMP-2 a BMP a la concentración deseada. En el momento de la cirugía, se extrajo con pipeta la cantidad apropiada de P407 del tubo.
Modelo Quirúrgico: Como se establece en el Ejemplo 15.
Métodos analíticos: Los análisis de micro CT e histología fueron los indicados en el Ejemplo 15.
Análisis Estadístico: Como el ACS por sí solo no formó huesecillos que pudieran medirse, no se incluyeron en ningún análisis estadístico.
Los parámetros de microCT se probaron para determinar la normalidad y la varianza igual. Los datos distribuidos normalmente con la misma varianza se probaron para detectar diferencias significativas mediante el uso de ANOVA. Todos los demás datos se probaron mediante el uso de ANOVA ordinal. Las pruebas posteriores a Hoc se realizaron todas por pares mediante el uso del método Student-Newman-Keuls. Todas las pruebas estadísticas se realizaron mediante el uso de Sigma Stat v3,5.
Resultados
Efecto de la distribución de BMP entre los gránulos portadores y el gel P407: Cuando se distribuyó BMP entre el gel P407 y los gránulos de CSD, se produjeron huesecillos más grandes que cuando se liofilizó toda la BMP en el CSD (volumen óseo total). (Grupo3a> Grupo2a) (Tabla 22).
Cuando se usaron los gránulos de CSD-BCP 2:1 se formó más hueso cuando se liofilizó el 70 % sobre los gránulos y el 30 % estaba en el gel P407 que cuando el 90 % se liofilizó y el 10 % estaba en el gel (volumen óseo total). (Grupo5a> Grupo7a) (Tabla 22).
Efecto de usar CSD en lugar de gránulos de BCP: En grupos con la misma distribución de BMP entre los gránulos y P407, encontramos que el uso de gránulos de CSD producía huesecillos más grandes que BCP (volumen óseo total) (GP 3a> GP 4a) (Tabla 20). Cuando se mezcló CDS con BCP, grupos con más del 50 % de CSD en la relación formaron los huesecillos más grandes (Grupo3a (100CSD)> 5a (67 % de CSD)> Grupo 7a (50 % de CSD) = 4a (0 % de CSD) (volumen óseo total) (Tabla 22).
Tabla 21: MicroCT; volumen óseo total producido.
Figure imgf000030_0001
Tabla 22: Prueba post Hoc (comparación de grupos que contienen BMP en el análisis del volumen total). Todos los procedimientos de comparación múltiple por pares (método de Student-Newman-Keuls).
Figure imgf000030_0002
(continuación)
Figure imgf000031_0001
Efecto de la distribución de BMP entre los granulos y el gel P407: Cuando se distribuyó BMP entre el gel P407 y los gránulos de CSD, se produjo más hueso que cuando se liofilizó toda la BMP en el CSD (volumen óseo ajustado). (Gp3a> Gp2a) (Tabla 24).
Efecto de usar CSD en lugar de gránulos de BCP: En grupos con la misma distribución de BMP entre los gránulos y P407, encontramos que el uso de gránulos de CSD producía huesecillos más grandes que BCP (volumen óseo ajustado) (GP 3a> GP 4a) (Tabla 24). Cuando se mezcló CDS con grupos BCP con más del 50 % de CSD en la relación se formaron los huesecillos más grandes (volumen óseo ajustado) (Gp3a (100CSD)> 5a (67 % de CSD)> 4a (0 % de CSD) (Tabla 24).
Tabla 23: Volumen Óseo Ajustado (aBV). Todos los procedimientos de comparación múltiple por pares (método de Student-Newman-Keuls).
Figure imgf000031_0002
Tabla 24: Prueba post Hoc (comparación de grupos que contienen BMP). Todos los procedimientos de comparación múltiple por pares (método de Student-Newman-Keuls):
Figure imgf000032_0001
La evaluación histológica indicó que para todos los bioimplantes, los huesecillos comprendían principalmente una capa de hueso que rodeaba una mezcla de hueso, cartílago y tejido de la médula. No hubo signos de inflamación en ninguno de los implantes.
Los gránulos de fosfato de calcio residuales fueron visibles en los bioimplantes Induce que contienen BCP, mientras que el sulfato de calcio parece experimentar una rápida reabsorción y solo se observaron unos pocos gránulos de CAS. Se observó que el hueso se formaba directamente sobre y dentro de los gránulos de CAS y BCP (Figura 10A-B).
Discusión
Los resultados de este estudio muestran que cuando la BMP se distribuyó entre la liofilización en gránulos portadores y la mezcla en el gel P407, (una distribución que da como resultado una liberación multifásica de BMP) se produjeron huesecillos más grandes con más hueso que cuando se liofilizó toda la BMP sobre los gránulos que subsecuentemente se mezclaron con gel P407 en el momento de la cirugía
Una distribución de 70/30 entre los gránulos y el gel P407 produjo huesecillos más grandes con más hueso que una distribución de 90/10 entre los gránulos y el gel P407.
En grupos con una distribución igual de BMP entre los gránulos y los gránulos de P407, la CSD produjo huesecillos más grandes con más hueso que los gránulos de BCP de tamaño similar, a pesar de que los huesecillos producidos con CSD tenían un área superficial mayor debido a que eran porosos (los gránulos de BCP eran sólidos). Cuando la CSD puede mezclarse con bioimplantes de BCP con 67 % o más de gránulos de CSD, se producen huesecillos más grandes que aquellos con 50 % o menos de gránulos de CSD.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema para la liberación multifásica de factores de crecimiento, tales como proteínas morfogenéticas óseas (BMP), preferentemente BMP-2 o BMP-7, en un sitio de tratamiento, el sistema comprende:
(a) un vehículo de suministro que comprende al menos un primer factor de crecimiento y un polímero, el vehículo de suministro está adaptado para liberar el al menos un primer factor de crecimiento en un perfil de liberación inicial durante un primer período de tiempo; y
(b) un portador que comprende una pluralidad de partículas que tienen al menos un segundo factor de crecimiento en sus superficies, el portador está adaptado para liberar el al menos un segundo factor de crecimiento en un perfil de liberación sostenida durante un segundo período de tiempo, y en donde el portador comprende partículas de sulfato de calcio dihidratado.
2. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el portador comprende además partículas de fosfato de calcio, preferentemente en donde la relación de sulfato de calcio dihidratado a partículas de fosfato de calcio es aproximadamente 1:1 o 2:1.
3. El sistema de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el polímero es poloxámero 407.
4. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las partículas del portador se combinan con el vehículo de suministro.
5. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer período de tiempo comprende horas o días y/o en donde el segundo período de tiempo comprende días o semanas.
6. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el al menos un primer factor de crecimiento y el al menos un segundo factor de crecimiento son iguales.
7. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el vehículo de suministro comprende al menos aproximadamente el 10 % de la cantidad total de los factores de crecimiento y el portador comprende al menos aproximadamente el 50 % de la cantidad total de los factores de crecimiento.
8. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la relación del vehículo de suministro al portador es de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 4:1 (v/v).
9. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el al menos un segundo factor de crecimiento se aplica al portador y luego se liofiliza sobre el portador.
10. Un sistema que comprende un vehículo de suministro y un portador para el uso en un método de liberación multifásica de factores de crecimiento, tales como proteínas morfogenéticas óseas (BMP), preferentemente BMP-2 o BMP-7, el método comprende:
- suministrar al menos un primer factor de crecimiento en un perfil de liberación inicial durante un primer período de tiempo por medio de un vehículo de suministro; y
- suministrar al menos un segundo factor de crecimiento en un perfil de liberación sostenida durante un segundo período de tiempo por medio de un portador;
en donde el vehículo de suministro comprende el al menos un primer factor de crecimiento y un polímero, y en donde el portador comprende una pluralidad de partículas que tienen el al menos un segundo factor de crecimiento en sus superficies, y en donde el portador comprende partículas de sulfato de calcio dihidratado o una mezcla de partículas de sulfato de calcio dihidratado y partículas de fosfato de calcio.
11. El sistema para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde las partículas del portador se combinan con el vehículo de suministro.
12. El sistema para el uso de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, en donde el polímero es poloxámero 407.
13. El sistema para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el primer período de tiempo comprende horas o días y/o en donde el segundo período de tiempo comprende días o semanas.
14. El sistema para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el al menos un primer factor de crecimiento y el al menos un segundo factor de crecimiento son iguales y en donde el vehículo de suministro comprende al menos aproximadamente el 10 % de la cantidad total de los factores de crecimiento y el portador comprende al menos aproximadamente el 50 % de la cantidad total de los factores de crecimiento.
15. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el sistema para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde el vehículo de suministro está adaptado para liberar al menos el 80 % del al menos un primer factor de crecimiento dentro de un período de 72 horas.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2015374114B2 (en) * 2014-12-29 2018-07-26 Bioventus, Llc Systems and methods for improved delivery of osteoinductive molecules in bone repair
KR20180079368A (ko) 2015-10-30 2018-07-10 바이오벤터스 엘엘씨 골 복구에서 골유도 분자의 증진된 전달을 위한 매트릭스
EP3468626A1 (en) 2016-06-10 2019-04-17 Bioventus LLC Protein delivery with porous metallic structure
IL266008B (en) * 2016-10-17 2022-08-01 Lidds Ab A new method for producing calcium sulphate hemihydrate with unique properties
AU2018351687B2 (en) * 2017-10-19 2024-07-11 Genera Istrazivanja D.O.O. Autologous bone graft substitute

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4761471A (en) 1980-08-04 1988-08-02 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein composition
US4789732A (en) 1980-08-04 1988-12-06 Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein composition
US4795804A (en) 1983-08-16 1989-01-03 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic agents
US4857456A (en) 1985-04-30 1989-08-15 The Regents Of The University Of California Assay of Bone morphogenetic protein (BMP) and anti-BMP antibody for the diagnosis of bone disorders
US5013649A (en) 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
US4877864A (en) 1987-03-26 1989-10-31 Genetics Institute, Inc. Osteoinductive factors
US6150328A (en) 1986-07-01 2000-11-21 Genetics Institute, Inc. BMP products
US5631142A (en) 1986-07-01 1997-05-20 Genetics Institute, Inc. Compositions comprising bone morphogenetic protein-2 (BMP-2)
WO1993009229A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
US5385887A (en) 1993-09-10 1995-01-31 Genetics Institute, Inc. Formulations for delivery of osteogenic proteins
CA2360938C (en) * 1999-02-02 2008-01-08 Warren Oliver Haggard Controlled release composite
US20070190102A1 (en) * 2000-06-30 2007-08-16 Ping Luo Method of preparing hydroxyapatite based drug delivery implant for infection and cancer treatment
US6503109B1 (en) 2000-07-19 2003-01-07 Marshall D. Duffield Swivel drive assembly
US6770695B2 (en) * 2000-08-07 2004-08-03 John L. Ricci Time release calcium sulfate matrix for bone augmentation
US20080233165A1 (en) * 2000-08-07 2008-09-25 Biolok International, Inc. Time release calcium sulfate and growth factor matrix for bone augmentation
US7671012B2 (en) * 2004-02-10 2010-03-02 Biosurface Engineering Technologies, Inc. Formulations and methods for delivery of growth factor analogs
EP1893174A2 (en) * 2005-05-10 2008-03-05 Cytophil, Inc. Injectable hydrogels and methods of making and using same
US20070248675A1 (en) * 2005-09-08 2007-10-25 Gwangju Institute Of Science And Technology Composite comprising polysaccharide-functionalized nanoparticle and hydrogel matrix, a drug delivery system and a bone defect replacement matrix for sustained release comprising the same, and the preparation method thereof
US20070255422A1 (en) * 2006-04-25 2007-11-01 Mei Wei Calcium phosphate polymer composite and method
AU2009200540A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-21 Induce Biologics Inc. Use of immobilized antagonists for enhancing growth factor containing bioimplant effectiveness
US9492375B2 (en) * 2008-07-23 2016-11-15 Warsaw Orthopedic, Inc. Foam carrier for bone grafting
WO2010017288A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 The University Of Miami Composite bone grafts, particulate bone-calcium sulfate constructs, and methods of treating joint injuries

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