ES2873956T3 - Péptidos y métodos de uso - Google Patents

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Thomas Polakowski
Frank Osterkamp
Rudolf Hartmann
Matthias Paschke
Bettina Hartlieb
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Abstract

Un péptido que se une a e inhibe la actividad de la proteína S una secuencia de aminoácidos por lo menos un 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924).

Description

DESCRIPCIÓN
Péptidos y métodos de uso
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere de manera general a péptidos que se unen a la Proteína S y a usos de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La hemostasis se basa en la cascada de coagulación compleja, en donde una serie de eventos mediados por factores de coagulación sanguínea lleva a la conversión de protrombina en trombina. La activación del factor X (FX) es el evento central de las vías tanto intrínseca como extrínseca de la cascada de la coagulación. La vía extrínseca se ha propuesto como el principal activador de la cascada de la coagulación (Mackman et al., Arterioscler. Thromb. Casc. Biol.,27, 1687-1693 (2007)). El factor tisular circulante (TF) y el factor VII activado (FVIIa) interactúan para formar el "complejo extrínseco", que media la activación del FX. La cascada de la coagulación se amplifica por la vía intrínseca, durante la cual la activación sucesiva de los factores XII, XI, IX y VIII da como resultado la formación del complejo "intrínseco" FIXa-FVIIIa que también media la activación del FX. El FX activado promueve la formación de trombina, que es necesaria para que el cuerpo cree fibrina y frene eficazmente el sangrado. La coagulación está regulada por disminución por la vía anticoagulante mediada por la Proteína C. La trombina en complejo con trombomodulina activa la Proteína C. La Proteína C activada con su cofactor, la Proteína S, degrada e inactiva los factores sanguíneos activados V (FVa) y VIII (FVIIIa).
Los trastornos hemorrágicos graves, como la hemofilia, son el resultado de la alteración de la cascada de coagulación sanguínea. La terapia de reemplazo del factor es el tratamiento más común para los trastornos de la coagulación sanguínea. Sin embargo, los factores de coagulación sanguínea típicamente se depuran del torrente sanguíneo poco después de la administración. Para ser eficaz, un paciente debe recibir infusiones intravenosas frecuentes de concentrados de factor recombinante o derivados de plasma, lo cual es incómodo, es caro y requiere mucho tiempo. Además, la eficacia terapéutica de la terapia de reemplazo del factor puede disminuir drásticamente con la formación de anticuerpos inhibidores. Existen pocas opciones terapéuticas para pacientes con anticuerpos anti-Factor.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención incluye un péptido que se une e inhibe la actividad de la Proteína S que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924). Por ejemplo, en varias realizaciones, el péptido comprende además una secuencia de aminoácidos por lo menos aproximadamente un 80% idéntica a EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924). La invención incluye un péptido que comprende (o consiste de) una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO: 1-2916, 2920 y 2924.
Además, la invención proporciona métodos para usar el péptido o péptidos de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un péptido como se ha definido anteriormente para su uso en un método para inhibir la actividad de la Proteína S en un sujeto. También se proporciona un péptido como se ha definido anteriormente para su uso en un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o que está en riesgo de padecer una enfermedad. La invención también proporciona un péptido como se ha definido anteriormente para su uso en un método para mejorar la formación de trombina, un método para incrementar la formación de coágulos sanguíneos en un sujeto y un método para tratar una enfermedad o trastorno, como un trastorno de la coagulación sanguínea. Los métodos comprenden administrar a un sujeto un péptido descrito en la presente en una cantidad eficaz para lograr un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad eficaz para inhibir la actividad de la Proteína S, mejorar la formación de trombina, mejorar la formación de coágulos sanguíneos, o tratar el trastorno de la coagulación sanguínea en el sujeto.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
La Figura 1A-C es un gráfico que proporciona la afinidad de unión (CI50 media [nM]) de varios péptidos descritos en la presente medidos mediante el ensayo LANCE IC50 usando JBS0684 como péptido trazador.
La Figura 2A-JJ es un gráfico que proporciona las secuencias de aminoácidos de varios péptidos descritos en la presente.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona péptidos que se unen a la Proteína S y bloquean la actividad inhibidora (es decir, anticoagulante) de la Proteína S dentro de la cascada de coagulación sanguínea. La Proteína S funciona como un cofactor de la Proteína C activada (APC) para degradar los factores Va (FVa) y VlIIa (FVIIIa). La inhibición de la Proteína S reduce la degradación de FVa y FVIIIa mediada por la Proteína C, lo que permite que los factores sanguíneos funcionen en la cascada de coagulación sanguínea para producir trombina y, en última instancia, fibrina. La Proteína S es una glicoproteína dependiente de vitamina K de 70 kD, de 635 aminoácidos de longitud, que comprende un dominio de ácido Y-carboxi-glutámico (dominio Gla), un módulo sensible a la trombina, dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (dominios EGF) y región que tiene similitud con la globulina de unión a hormonas sexuales. La Proteína se encuentra libre en el plasma y también forma complejos para complementar la proteína de unión a la proteína C4b (C4BP). La Proteína S libre sirve como cofactor de APC; la forma complejada no tiene actividad de cofactor. La Proteína S aumenta la afinidad de APC por las membranas que contienen fosfolípidos, mejora la escisión mediada por APC en R306 en FVa y mejora la inactivación de FVIIIa mediada por APC. Walker, J. Biol. Chem., 256(21), 11128-11131 (1981); Rosing et al., J. Biol. Chem., 270(46), 27852-27858 (1995). La Proteína S también interfiere con la coagulación independientemente de APC, por ejemplo, uniéndose a FXa y FVa. Hackeng, J. Biol. Chem., 269(33), 21051-21058 (1994). La secuencia de la Proteína S humana se proporciona como SEQ ID NO: 2917 (secuencia de ácidos nucleicos proporcionada como SEQ ID NO: 2918). La invención proporciona péptidos de unión a la Proteína S que bloquean una o más de las actividades de la Proteína S, mejorando de este modo opcionalmente la formación de trombina. Se pretende que "péptido" incluya péptidos tradicionales (es decir, que tienen una estructura principal peptídica tradicional) así como peptidomiméticos (es decir, polímeros similares a proteínas que tienen estructuras principales modificadas y, opcionalmente, cadenas laterales que se encuentran en aminoácidos).
En la presente se proporcionan las secuencias de aminoácidos de varios péptidos. Los aminoácidos convencionales se identifican de acuerdo con sus códigos estándar de una letra o de tres letras. En la Tabla 1 y en otros lugares de la presente se describen ejemplos de aminoácidos no convencionales y bloques de construcción de péptidos adicionales con su, por ejemplo, código de tres o cuatro letras/números (con la excepción de Ttds y Dopa, que son abreviaturas comunes de letras cuatro). Las estructuras químicas de los aminoácidos y bloques de construcción no convencionales se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de patente de Estados Unidos N° 2013/0252896.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos proporcionados en la presente se representan en un formato de secuencia de péptidos típico. Por ejemplo, el código de tres letras o el código de una letra de un aminoácido indica la presencia del aminoácido en una posición específica dentro de la secuencia de péptidos. El código para cada aminoácido o bloque de construcción no convencional está conectado con el código para el aminoácido o bloque de construcción siguiente y/o anterior en la secuencia por un guion en muchos casos. Los aminoácidos adyacentes están conectados por un enlace químico (típicamente un enlace amida). La formación del enlace químico elimina un grupo hidroxilo del grupo 1-carboxilo del aminoácido cuando se encuentra a la izquierda del aminoácido adyacente (por ejemplo, aminoácido Hle-adyacente), y elimina un hidrógeno del grupo amino del aminoácido cuando se encuentra a la derecha del aminoácido adyacente (por ejemplo, el aminoácido adyacente-Hle). Se entiende que ambas modificaciones pueden aplicarse al mismo aminoácido y aplicarse a aminoácidos convencionales adyacentes presentes en secuencias de aminoácidos sin guiones ilustrados explícitamente. Cuando un aminoácido contiene más de un grupo amino y/o carboxi en la cadena lateral del aminoácido, se usan generalmente el grupo 2- o 3-amino y/o el grupo 1-carboxi para la formación de enlaces peptídicos. Para algunos aminoácidos no convencionales, se usa un código de tres letras donde la primera letra indica la estereoquímica del átomo C-a. Por ejemplo, una primera letra mayúscula indica que la forma L del aminoácido está presente en la secuencia del péptido, mientras que una primera letra minúscula indica que la forma D del aminoácido correspondiente está presente en la secuencia del péptido. Cuando se usa un código de una letra, una letra minúscula representa un D-aminoácido, mientras que una letra mayúscula representa un L-aminoácido. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se presentan en la presente en la dirección del extremo N- a C-terminal .
Los extremos C-terminales de varias secuencias peptídicas descritas en la presente se ilustran a menudo explícitamente mediante la inclusión de un OH, NH2 , o una abreviatura de una amina de terminación específica enlazada al código de amino ácido C-terminal a través de un guion. Los extremos N-terminales de varios péptidos descritos en la presente se ilustran explícitamente mediante la inclusión de un hidrógeno (para un extremo N-terminal libre), o una abreviatura de un ácido carboxílico de terminación específico u otro grupo químico enlazada al código de aminoácidos N-terminales mediante un guion.
La invención incluye un péptido que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 60% de identidad, por lo menos un 65%, por lo menos un 70%, por lo menos un 75%, por lo menos un 80%, por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95% o un 100% de identidad con la secuencia de aminoácidos EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924). Como se usa en la presente, "por lo menos un 60% de identidad" y términos similares abarcan cualquier número entero de, por ejemplo, del 60% al 100%, como 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% y similares. También, El término "por lo menos [porcentaje] de identidad" abarca cualquier porcentaje que sea mayor o igual al número de aminoácidos idénticos (o bloques de construcción de péptidos) dividido por el número total de aminoácidos (o bloques de construcción) del péptido de la invención ([por lo menos porcentaje de identidad] > [número de aminoácidos o bloques de construcción idénticos] / [número total de aminoácidos o bloques de construcción del péptido de la invención]). El cálculo del porcentaje de identidad de aminoácidos (o nucleótidos) alineados de dos o más secuencias es bien conocido en la técnica y se determina convencionalmente usando programas informáticos conocidos. Por ejemplo, el alineamiento de dos o más secuencias para determinar el porcentaje de identidad de secuencia se realiza opcionalmente usando el algoritmo descrito por Altschul et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-402 (1997)) como se incorpora en los programas BLAST (herramienta de búsqueda de alineamiento local básica), disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Information. El péptido se une preferiblemente a la Proteína S e inhibe la actividad de la Proteína S.
La invención incluye péptidos que comprenden una estructura cíclica. A este respecto, la invención incluye péptidos que comprenden estructuras cíclicas dentro del péptido (por ejemplo, uno o más giros formados por enlace entre aminoácidos), péptidos que comprenden una estructura cíclica formada por la interacción de un aminoácido terminal con un aminoácido dentro de la secuencia peptídica, y péptidos ciclados de la cabeza a la cola. Los péptidos de la invención, en algunos casos, comprenden enlaces disulfuro intramoleculares. En algunas realizaciones, los enlaces disulfuro intramoleculares están formados por residuos de cisteína. También se proporcionan péptidos que comprenden estructuras cíclicas formadas por residuos que no son de cisteína, o un residuo que no es de cisteína y un residuo de cisteína. Los aminoácidos o fracciones químicas no convencionales adecuados para la ciclación incluyen, pero no se limitan a, ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico (FA19205), ácido 3-(2-{2-[2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (FA19204), ácido 3-{2-[2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico (FA19203), ácido [2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acético (FA03202), (S)-Homocisteína (Hci), D-Homo-cisteína (hci), Aminoetiltiol (Cea), y c.
Los péptidos descritos en la presente están, en algunas realizaciones, conjugados o unidos a una o más fracciones en el extremo N- y/o C-terminal o en los residuos internos del péptido. Las fracciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, carboxifluoresceína-Ttds (FAM-Ttds), una etiqueta de prolina-glutamato ("PE"), palmitoilo (Palm), 2-fenil acetilo, 3-fenil propionilo, 2-(naft-2-il)acetilo, hexanoilo, 2-metil propionilo, 3-metil butanoilo, 2-naftilsulfonilo, acetilo, ácido aminooxiacético (AOA), ácido levulínico (Lev), ácido pentinoico (Pyn), 1-naftilsulfonilo, C, c, N-etilmaleiimido etilmaleiimido cisteína (C(NEM)), ácido 3-[2-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-etoxi]-propiónico (FA19205), Ácido 3-(2-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propiónico (FA19204), ácido 3-{2-[2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propiónico (FA19203), ácido [2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acético (FA03202), K(Tdts-maleimid), ácido 2-Amino-6-s-(2-aminooxiAminooxi-acetilamino)-hexanoíco L-lisina (K(Myr)), £-(Miristil-Ttds)-L-lisina (K(Ttds-Myr)), £-(Palmitil-Ttds)-L-lisina (K(Ttds-Palm)), £-(Miristil-y-glutamil-Ttds)-L-lisina (K(Ttds-YGlu-Mir)), £-(4-(p-Iodofenil) butiril))-L-lisina (K(AlbuTag)), £-(4-(Pentil)-benzolsulfonamidil)-L-lisina (K(4PBSA)), (S)-4-Benzoilfenilalanina (Bpa), Bpa-K(Bio)-C, C(Atf-Bio), C(Atf-LC-Bio), C(FeBABE), C(MalCy5), C(PEG), £-(Acetil)-L-lisina (K(Ac)), K(Ttds), K(TtdsyGlu), K(Glutar), K(Ttds-Mal), T, Ttds, o Ttds-K(Bio). K(Bio) es £-(Biotinil)-L-lisina. C(Atf-Bio) es ácido 2-Amino-3-[2-(2-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro-benzoilamino)-6-{6-[5-(2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanoilamino]-hexanoilamino}-hexanoilamino)-etildisulfanil]-propiónico. C(Atf-LC-Bio) es ácido 2-Amino-3-[2-(2-[6-(4-azido-2,3,5,6-tetrafluoro-benzoilamino)-hexanoilamino]-6-{6-[5-(2-oxo-hexahidro-tieno[3,4-d]imidazol-6-il)-pentanoilamino]-hexanoilamino}-hexanoilamino)-etildisulfanil]-propiónico. C(FeBABE) es un Fe(III)-complejo de ácido 2-Amino-3-({4-[2,3-bis-(bis-carboximetil-amino)-propil]-fenilcarbamoil}-metilsulfanil)-propiónico. Este es un ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)-complejo de Fe (III) enlazado al azufre de la cadena lateral de la cisteína mediante un enlace tioéter y un espaciador aromático. C(MalCy5) es 2-{5-[1-(5-{2-[3-(2-Amino-2-carboxi-etilsulfanil)-2,5-dioxopirrolidin-1 -il]-etil-carbamoil}-pentil)-3,3-dimetil-1,3-dihidro-indol-2-iliden]-penta-1,3-dienil}-1,3,3-trimetil-3H-indolio. Este es el colorante Cy5 conjugado con el azufre de la cisteína mediante un enlace tioéter basado en maleimida.
En un aspecto, la secuencia de aminoácidos de un péptido comprende una sustitución conservadora, en donde un residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica e incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina y cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina). Se apreciará, sin embargo, que un practicante no se limita a sustituciones conservadoras; el péptido resultante conserva la capacidad de unirse a la Proteína S y regula por disminución, total o parcialmente, la actividad de la Proteína S. Por ejemplo, la Figura 1 describe péptidos que son mutantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos de JBS2512 (SEQ ID NO: 2) y que conservan las características de unión a la Proteína S.
En un aspecto, el péptido de la invención consiste de 60 aminoácidos o menos, 55 aminoácidos o menos, 40 aminoácidos o menos, 35 aminoácidos o menos, o 30 aminoácidos o menos. Opcionalmente, el péptido consiste de 25 aminoácidos o menos, 20 aminoácidos o menos, 15 aminoácidos o menos, o 10 aminoácidos o menos. En varias realizaciones, el péptido comprende 15-35 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35 residuos de aminoácidos). En algunos aspectos, los aminoácidos se eliminan del péptido descrito en la presente desde dentro de la secuencia de aminoácidos, en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal. Tales fragmentos de péptidos pueden comprender 3-14 residuos de aminoácidos (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de aminoácidos). El péptido de la invención está, en varias realizaciones, fusionado o complejado con un segundo dominio peptídico que, por ejemplo, se une a otro objetivo (como una región diferente de la Proteína S o una proteína diferente) o aumenta la vida media o la estabilidad del péptido de la invención. En tales fusiones o complejos, el tamaño del péptido de la invención es exclusivo del segundo péptido o dominio peptídico heterólogo.
En un aspecto, el péptido comprende además uno o más aminoácidos que facilitan la síntesis, manipulación o uso del péptido, que incluyen pero no se limitan a, una o dos lisinas en el extremo N-terminal y/o extremo C-terminal para aumentar la solubilidad del péptido. Las proteínas de fusión adecuadas incluyen pero no se limitan a, proteínas que comprenden un péptido de la invención (por ejemplo, péptido de unión a Proteína S) enlazado con uno o más polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, o aminoácidos que generalmente no se reconocen como parte de la secuencia de proteínas. En un aspecto, un péptido de fusión comprende las secuencias de aminoácidos completas de dos o más péptidos o, alternativamente, comprende porciones (fragmentos) de dos o más péptidos. En algunos aspectos, un péptido (por ejemplo, péptido de unión a Proteína S) está operativamente enlazado, por ejemplo, a uno o más de los siguientes: una proteína marcadora, un péptido que facilita la purificación, una secuencia de péptidos que promueve la formación de proteínas multiméricas, o un fragmento de cualquiera de los anteriores. Los compañeros de fusión adecuados incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta His, una etiqueta FLAG, una etiqueta estreptocócica y una etiqueta myc.
Opcionalmente, el péptido de la invención se fusiona con una o más entidades que mejoran la vida media del péptido. La vida media puede aumentarse, por ejemplo, aumentando el peso molecular del péptido de unión a la Proteína S para evitar la depuración renal y/o incorporando un ligando para la ruta de reciclaje mediada por el receptor nFc. En una realización, el péptido de la invención se fusiona o se conjuga químicamente con un polipéptido de albúmina o un fragmento del mismo (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA) o albúmina de suero bovino (BSA)). El fragmento de albúmina comprende un 10%, 25%, 50% o 75% de la proteína de albúmina de longitud completa. Un conjugado de péptido-albúmina ejemplar es JBS3754 (SEQ ID NO: 999), que es JBS3216 (SEQ ID NO: 462) conjugado con albúmina. JBS3761 también es un ejemplo de fusión de albúmina (SEQ ID NO: 1005). Alternativa o adicionalmente, el péptido de la invención se fusiona o forma un complejo con un dominio de unión a albúmina o ácido graso que se une a albúmina cuando se administra in vivo. Un ejemplo de un dominio de unión a albúmina es "etiqueta albu", un fracción derivada del ácido 4-(p-yodofenil)-butanoico (Dumelin et al., Angew Chem Int Ed Engl 47:3196-3201 (2008)). Otros compañeros de fusión adecuados incluyen, pero no se limitan a, un multímero de prolina-alanina-serina (PASilación) y un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, una porción Fc de un anticuerpo).
En una realización, dos o más péptidos de la invención se fusionan entre sí, se enlazan mediante un dominio de multimerización o se unen mediante enlaces químicos para generar un complejo peptídico. Los péptidos del multímero pueden ser iguales o diferentes. Por tanto, la invención proporciona un homodímero (es decir, un dímero que comprende dos péptidos idénticos), un homomultímero (es decir, un complejo que comprende tres o más péptidos idénticos), un heterodímero (es decir, un dímero que comprende dos péptidos diferentes) y heteromultímero (es decir, un complejo que comprende tres o más péptidos, en donde por lo menos dos de los péptidos son diferentes) que comprende o consiste de cualquiera de los péptidos descritos en la presente, opcionalmente unidos por uno o más conectores. Un multímero representativo es JBS3179 (SEQ ID NO: 433), un tetrámero de monómeros JBS2572 (SEQ ID NO: 62) acoplado mediante un fracción de PEG de cuatro brazos de 40 kD.
A este respecto, la invención proporciona un complejo peptídico que comprende un primer péptido y un segundo péptido. Cualquiera de los péptidos descritos en la presente son subunidades adecuadas (por ejemplo, primer péptido o segundo péptido) para el complejo peptídico. En algunas realizaciones, el complejo peptídico comprende de 25 a 100 aminoácidos, por ejemplo, de 30 a 80 aminoácidos, de 30 a 60 aminoácidos o de 30 a 50 aminoácidos. El nivel de inhibición de por lo menos una actividad de la Proteína S (por ejemplo, unión de la Proteína S a FVa, unión de fosfolípidos o actividad del cofactor de APC) mediada por el complejo peptídico es opcionalmente mayor que el nivel de inhibición logrado por el primer péptido o el segundo péptido (solo u, opcionalmente, en combinación) en varias realizaciones de la invención. Las características funcionales y las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de los péptidos de unión a la Proteína S monoméricos descritos en la presente también son aplicables a los complejos peptídicos descritos en la presente. De manera similar, las descripciones de modificaciones a péptidos de unión a Proteína S monoméricos también se refieren a complejos de péptidos.
En varios aspectos de la divulgación, las subunidades peptídicas (por ejemplo, primer péptido y segundo péptido) del complejo peptídico se fusionan entre sí directamente o se enlazan mediante una fracción conectora. Cualquier fracción conectora es adecuada para su uso en el contexto del complejo peptídico. La fracción conectora, en algunos aspectos ^de la invención, forma un puente^ de una distancia de aproximadamente 1 Á a aproximadamente 100 Á, por ejemplo, de aproximadamente 5 Á a aproximadamente 80 Á (de aproximadamente 5 Á a aproximadamente 50 Á), de aproximadamente 10^ Á a aproximadamente 70 Á (de aproximadamente 10 Á a aproximadamente 60 Á, de aproximadamente 10 Á a aproximadamente 50 Á, de aproximadamente 10 Á a aproximadamente 40 Á, o de aproximadamente 10 Á a aproximadamente 30 Á), en una de sus conformaciones. Por tanto, el conector tiene opcionalmente de aproximadamente 1 Á a aproximadamentê 1 0 0 Á de longitud, por ejemplo, de aproximadamente 5 Á a aproximadamente 50 Á o de aproximadamente 10 Á a aproximadamente 30 Á de longitud en una de sus conformaciones. También se contemplan conectores de mayor longitud (de más de aproximadamente 100 Á). Por ejemplo, también se contemplan polímeros biocompatibles, que tienen opcionalmente un peso molecular de aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 60 kDa, para su uso en el complejo peptídico. Los ejemplos de polímeros biocompatibles incluyen, pero no se limitan a, PEG, PSA, multímero de prolina-alaninaserina y almidón de hidroxietilo. Una descripción adicional de fracciones conectoras y grupos reactivos se proporciona en la Publicación de Patente Internacional N° WO 2011/143209.
En un aspecto, la fracción conectora comprende la estructura Z1-20 , en donde Z es un bloque de construcción de oligómeros. Los ejemplos de bloques de construcción de oligómeros incluyen, pero no se limitan a, un aminoácido, hidroxiácido, etilenglicol, propilenglicol o una combinación de cualquiera de los anteriores. Por ejemplo, la fracción conectora es opcionalmente un aminoácido, un dipéptido, un tripéptido o un polipéptido que comprende de 4 a 20 aminoácidos. En algunas realizaciones, Z es G, s, S, a, A, Bal, Gaba, Ahx, Ttds o una combinación de cualquiera de los anteriores (como un péptido ten-mer que comprende A, S o una combinación de A y S). Si se desea, la fracción de enlace comprende una amina, éter, tioéter, maleimida, disulfuro, amida, éster, alqueno, cicloalqueno, alquino, trizoilo, carbamato, carbonato o hidrazona.
No se pretende que los términos "primer péptido" y "segundo péptido" impliquen un orden físico particular de los péptidos, sino simplemente que distingan diferentes subunidades del complejo peptídico. Las subunidades del complejo peptídico pueden enlazarse en cualquiera de una serie de configuraciones siempre que el primer péptido y el segundo péptido interactúen con un objetivo (por ejemplo, Proteína S). Por ejemplo, el extremo C-terminal del primer péptido está conectado al extremo N-terminal del segundo péptido, el extremo N-terminal del primer péptido está conectado al extremo C-terminal del segundo péptido, el extremo N- o C-terminal del primer (o segundo) péptido está conectado a un punto de unión interno en el segundo (o primer) péptido, o el primer y el segundo péptidos están conectados a través de puntos de unión internos (es decir, puntos de unión localizados dentro de la secuencia de aminoácidos del péptido y no en el extremo N- o C-terminal). Puede usarse más de un conector, por ejemplo, una primera fracción de enlace se une al extremo N-terminal del primer péptido y al extremo C-terminal del segundo péptido, y una segunda fracción de enlace (que puede ser del mismo tipo de fracción o un tipo diferente de fracción) se une al extremo C-terminal del primer péptido y se une al extremo N-terminal del segundo péptido. Aunque el análisis de posibles configuraciones se refiere al primer y al segundo péptidos, se apreciará que pueden enlazarse péptidos adicionales al primer y/o el segundo péptidos como se describe en la presente.
Los derivados se incluyen en la invención e incluyen péptidos que se han modificado químicamente de alguna manera distinta de la adición, deleción o sustitución de aminoácidos. A este respecto, un péptido proporcionado en la presente se une químicamente con polímeros, lípidos, otras fracciones orgánicas, y/o fracciones inorgánicas. Ejemplos de modificaciones de péptidos y proteínas se dan en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996). Los péptidos descritos en la presente comprenden opcionalmente un grupo funcional que facilita la conjugación con otra fracción (por ejemplo, una fracción peptídica). Los grupos funcionales ejemplares incluyen, pero no se limitan a, isotiocianato, isocianato, acil azida, éster NHS, cloruro de sulfonilo, aldehído, epóxido, oxirano, carbonato, agente de arilación, imidoéster, carbodiimida, anhídrido, derivados de haluro de alquilo (por ejemplo, derivados de haloacetilo), maleimida, aziridina, derivados de acriloilo, agentes de arilación, reactivos de intercambio de tiol-disulfuro (por ejemplo, disulfuros de piridilo o tiol de TNB), diazoalcano, carboxildiimadazol, carbonato de N,N'-disuccinilo, cloroformiato de N-hidroxisuccinimidilo y derivados de hidrazina. La maleimida es útil, por ejemplo, para generar un péptido de unión a Proteína S que se une con albúmina in vivo.
En un aspecto, la invención incluye péptidos descritos en la presente modificados covalentemente para incluir una o más uniones poliméricas solubles en agua. Un polímero soluble en agua (u otra fracción química) se une a cualquier residuo de aminoácido, aunque en algunas realizaciones se prefiere la unión al extremo N- o C-terminal. Los polímeros útiles incluyen, pero no se limitan a, PEG (por ejemplo, PEG de aproximadamente 40 kD, 30 kD, 20 kD, 10 kD, 5 kD o 1 kD de tamaño), polioxietilenglicol, polipropilenglicol, monometoxi-polietilenglicol, dextrano, almidón de hidroxietilo, celulosa, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, ácido polisálico (PSA), polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de cualquiera de los anteriores. En un aspecto, el péptido de la invención es un péptido PEGilado. Las fracciones de PEG están disponibles en diferentes formas, por ejemplo, lineales o ramificados. Los péptidos PEGilados ejemplares incluyen JBS3755 (SEQ ID NO: 1000), que comprende la secuencia de aminoácidos de JBS3216 (SEQ ID NO: 462) unida a fracciones de PEG lineales de 20 kD en el extremo N-terminal a través de Ahx (ácido 6 -aminohexanoico) y el extremo C-terminal a través del grupo £ amino de Lys, y JBS3757 (SEQ ID NO: 1002), en donde las fracciones de PEG de 20 kD están ramificadas. Para un análisis adicional de las uniones poliméricas solubles en agua, ver las Patentes de Estados Unidos N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; y 4.179.337. Otras fracciones útiles para mejorar la vida media o la estabilidad del péptido se describen en la presente e incluyen, por ejemplo, albúmina (opcionalmente modificada para permitir la conjugación con el péptido de la invención), cadenas de ácidos grasos (por ejemplo, ácido graso C12-C18, como un ácido graso C14, o ácidos dicarboxílicos, como un ácido octadecadno dicarboxílico (oddc)), un anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, una porción Fc de un anticuerpo), y multímeros de prolina-alanina-serina.
En otro aspecto, un derivado peptídico incluye una fracción de direccionamiento específica para un tipo de célula, tejido y/u órgano particular. Alternativamente, el péptido se enlaza a una o más fracciones químicas que facilitan la purificación, detección, multimerización, unión con un compañero de interacción, y caracterización de la actividad del péptido. Una fracción química ejemplar es la biotina. Otras fracciones adecuadas para la conjugación con el péptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, un fotosensibilizador, un colorante, un colorante fluorescente, un radionúclido, un complejo que contiene radionúclidos, una enzima, una toxina y un agente citotóxico. Los fotosensibilizadores incluyen, por ejemplo, P Photofrin, Visudyne, Levulan, Foscan, Metvix, Hexvix®, Cysview™, Laserphyrin, Antrin, Photochlor, Photosens, Photrex, Lumacan, Cevira, Visonac, BF-200 ALA, y Amphinex. Si se desea, se conjuga con el péptido una etiqueta His, una etiqueta FLAG, una etiqueta estreptocóccica o una etiqueta myc.
Además, en un aspecto, los péptidos de la invención se acilan en el aminoácido N-terminal del péptido. En otro aspecto, los péptidos de la invención se amidan en el aminoácido C-terminal del péptido. En otro aspecto adicional, los péptidos de la invención se acilan en el aminoácido N-terminal del péptido y se amidan en el aminoácido C-terminal del péptido.
Los derivados también incluyen péptidos que comprenden aminoácidos modificados o no proteinogénicos o un grupo conector modificado (ver, por ejemplo, Grant, Synthetic Peptides: A User’s Guide, Oxford University Press (1992)). Los aminoácidos modificados incluyen, por ejemplo, aminoácidos en los que el grupo amino y/o carboxilo se reemplaza con otro grupo. Los ejemplos no limitativos incluyen aminoácidos modificados que incorporan tioamidas, ureas, tioureas, acilhidrazidas, ésteres, olefinas, sulfonamidas, amidas de ácido fosfórico, cetonas, alcoholes, amidas de ácido borónico, benzodiazepinas y otros heterociclos aromáticos o no aromáticos (ver Estiarte et al., Burgers Medicinal Chemistry, 6a edición, Volumen 1, Parte 4, John Wiley & Sons, Nueva York (2002)). Los aminoácidos no proteinogénicos incluyen, pero no se limitan a, p-alanina (Bal), norvalina (Nva), norleucina (Nle), ácido 4-aminobutírico (Y-Abu), ácido 2-aminoisobutírico (Aib), 6- ácido aminohexanoico (s-Ahx), ornitina (Orn), hidroxiprolina (Hyp), taurina, sarcosina, citrulina (Cit), ácido cisteico (Coh), ciclohexilalanina (Cha), metionina sulfóxido (Meo), metionina sulfona (Moo), homoserina metilesterina (Hsm), propargilglicina (Eag), 5-fluorotriptófano (5Fw), 6-fluorotriptófano (6Fw), 3',4'-dimetoxifenil-alanina (Ear), 3',4'-difluorofenilalanina (Dff), 4'-fluorofenil -alanina (Pff), 1 -naftil-alanina (1 Ni), 2-naftilalanina (2Ni), 1 -metiltriptófano (1Mw), penicilamina (Pen), homoserina (Hse), tbutilglicina, t-butilalanina, fenilglicina (Phg), benzotienilalanina (Bta), L-homo-cisteína (Hcy), N-metil-fenilalanina (Nmf), 2-tienilalanina (Thi), 3,3-difenilalanina (Ebw), L-alfa-t-butilglicina (Tle), Bpa, homofenilalanina (Hfe) y S-bencil-L-cisteína (Ece). Estos y otros aminoácidos no proteinogénicos pueden existir como isómeros D o L. Los ejemplos de conectores modificados incluyen, pero no se limitan a, el conector flexible 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (Ttds), glicina, ácido 6-aminohexanoico, beta-alanina (Bal), ácido pentinoico (Pyn) y combinaciones de Ttds, glicina, ácido 6-aminohexanoico y Bal.
Los homólogos de los aminoácidos que constituyen los péptidos de la invención pueden ser los indicados en la Tabla 1. En cualquier realización, uno o más aminoácidos del péptido de la invención se sustituyen por un aminoácido o bloque de construcción indicado en la Tabla 1.
TABLA 1
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continuación
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En algunas realizaciones, los enlaces peptídicos (CO-NH) que unen aminoácidos dentro del péptido de la invención se invierten para crear un péptido "retro-modificado", es decir, un péptido que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la dirección opuesta (enlaces NH-CO) en comparación con el péptido de referencia. El péptido retro-modificado comprende la misma quiralidad de aminoácidos que el péptido de referencia. Un péptido "inverso-modificado" es un péptido de la invención que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la misma dirección que un péptido de referencia, pero la quiralidad de los aminoácidos está invertida. Por tanto, cuando el péptido de referencia comprende L-aminoácidos, el péptido "inverso-modificado" comprende D-aminoácidos y viceversa. Los péptidos inverso-modificados comprenden enlaces peptídicos CO-NH. Un péptido "retro-inverso modificado" se refiere a un péptido que comprende residuos de aminoácidos ensamblados en la dirección opuesta y que tienen quiralidad invertida. Un análogo retro-inverso ha invertido los extremos terminales y la dirección invertida de los enlaces peptídicos (es decir, NH-CO), mientras mantiene aproximadamente la topología de la cadena lateral que se encuentra en el péptido de referencia. Los peptidomiméticos retro-inversos se elaboran usando métodos estándar, incluyendo los métodos descritos enMeziere et al, J. Immunol., 159, 3230-3237 (1997). Los péptidos retroinversos parciales son péptidos en los que solo una parte de la secuencia de aminoácidos se invierte y se reemplaza con residuos de aminoácidos enantioméricos.
Los péptidos de la invención se elaboran de varias maneras. En un aspecto, los péptidos se sintetizan mediante técnicas de síntesis en fase sólida que incluyen las descritas en Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl., 10, 394-414 (1985); Larsen et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 6247 (1993); Smith et al., J. Peptide Protein Res., 44, 183 (1994); O’Donnell et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 6070 (1996); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, pp. 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, pp. 257-527 (1976). La invención contempla péptidos sintéticos. Alternativamente, el péptido se expresa de manera recombinante mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica un péptido de la invención en las células huésped, que se cultivan para expresar el péptido. Tales péptidos se purifican a partir de los medios de cultivo o sedimentos celulares.
La invención también incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un péptido de la invención. Los métodos para preparar moléculas de ADN y/o ARN son bien conocidos en la técnica. Si se desea, se incorpora una secuencia codificante de péptidos en un vector de expresión. Un experto en la técnica apreciará que cualquiera de varios vectores de expresión conocidos en la técnica son adecuados en el contexto de la invención como, pero no limitados a, plásmidos, complejos de plásmido-liposoma y vectores virales. Cualquiera de estos vectores de expresión se prepara usando técnicas estándar de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2 a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994). Opcionalmente, el ácido nucleico está operativamente enlazado a una o más secuencias reguladoras como un promotor, activador, potenciador, señal cap, señal de poliadenilación u otra señal implicada en el control de la transcripción o traducción.
Cualquiera de los péptidos (o complejos de péptidos) de la invención o ácidos nucleicos que codifican los péptidos también se proporciona en una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica). A este respecto, el péptido (o complejo de péptidos) se formula con un portador, tampón, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable (es decir, farmacológicamente aceptable), como se describe más adelante en la presente. Opcionalmente, el péptido está en forma de una sal fisiológicamente aceptable, que está abarcada por la invención. Por "sales fisiológicamente aceptables" se entiende cualquier sal que sea farmacéuticamente aceptable. Algunos ejemplos de sales apropiadas incluyen acetato, clorhidrato, bromhidrato, sulfato, citrato, tartrato, glicolato y oxalato. Si se desea, la composición comprende uno o más agentes farmacéuticamente eficaces adicionales.
El péptido proporcionado en la presente se une a la Proteína S e inhibe por lo menos una actividad de la Proteína S como, pero no limitado a, una actividad que regula por disminución la cascada de coagulación sanguínea. Sin estar limitado por ningún mecanismo de acción específico, el péptido puede inhibir la unión (competitiva o alostéricamente) de la Proteína S a la Proteína C activada (APC), Factor V o superficies lipídicas, limitando de este modo la inhibición natural de la coagulación por la Proteína S. Con la actividad de la Proteína S disminuida, FVa y FVIIIa no se degradan tan fácilmente y FXa se inhibe menos, lo que da como resultado una conversión mejorada de protrombina en trombina.
En un aspecto, el péptido de la invención muestra actividad antagonista de la Proteína S en modelo y/o sistemas plasmáticos. Un ensayo ejemplar basado en plasma examina la generación de trombina dependiente de Proteína S/APC iniciada a través de la vía de coagulación extrínseca (Nicolaes, Blood Coagul. Fibrinolysis, 8:28 (1997)). La Proteína S mejora el efecto anticoagulante de APC en plasma. La formación de trombina se desencadena en el plasma que carece sustancialmente de actividad de FVIII o FIX (por ejemplo, la actividad del factor de coagulación residual es inferior al 1%) en presencia de un péptido candidato. La formación de trombina se detecta usando, por ejemplo, un sustrato fluorogénico o cromogénico. Thrombinoscope BV (Maastricht, Países Bajos) proporciona un sistema para medir la actividad de la trombina. La conversión de protrombina se mide usando, por ejemplo, un Thrombograph™ (Thermo Scientific, Waltham, MA), y los datos resultantes se compilan en un trombograma automatizado calibrado (CAT) generado por el software Thrombinoscope™ disponible de Thrombinoscope BV. En varias realizaciones, el péptido demuestra una EC50 de aproximadamente 20 nM a aproximadamente 100 |j M (por ejemplo, de aproximadamente 40 nM a aproximadamente 50 |j M) en el ensayo de generación de trombina dependiente de Proteína S/APC.
En ciertas realizaciones, el péptido inhibidor de la Proteína S aumenta la cantidad de pico de trombina generada durante el ensayo y/o disminuye el tiempo necesario para lograr la formación del pico de trombina. Por ejemplo, el péptido mejora la generación de trombina regulada por Proteína S en ausencia de FVIII (por ejemplo, en plasma desprovisto de FVIII) hasta por lo menos un 1% del nivel de generación de trombina dependiente de Proteína S en plasma normal. Generalmente, el plasma normal (no afectado) contiene de aproximadamente 0,5 U/ml a aproximadamente 2 U/ml de Factor VIII. En consecuencia, en algunos casos, un péptido que se une a la Proteína S (por ejemplo, péptido inhibidor de la Proteína S) mejorará la formación de trombina en ausencia de FVIII hasta por lo menos aproximadamente un 1% del observado en presencia de 0,5 U/ml a 2 U/ml de FVIII.
El péptido se administra a un modelo animal de deficiencia de trombina o hemofilia para caracterizar la actividad inhibidora de la Proteína S in vivo. Tales modelos in vivo son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ratones a los que se administran anticuerpos anti-FVIII para inducir hemofilia A (Tranholm et al., Blood, 102, 3615-3620 (2003)); modelos de inactivación del factor de coagulación como, pero no limitados a, ratones con inactivación de FVIII (Bi et al., Nat. Genet., 10(1), 119-121 (1995)) y ratones con inactivación de FIX (Wang et al., PNAS, 94(21), 11563-66 (1997)); hemofilia-A inducida en conejos (Shen et al., Blood, 42(4), 509-521 (1973)); y perros Chapel Hill HA (Lozier et al., PNAS, 99, 12991-12996 (2002)).
Varios péptidos se unen a la Proteína S desde cualquier fuente incluyendo, pero no limitado a, ratón, rata, conejo, perro, gato, vaca, caballo, cerdo, cobaya y primate. En una realización, el péptido se une a la Proteína S humana. Opcionalmente, el péptido de la invención se une a la Proteína S de más de una especie (es decir, el péptido tiene reactividad cruzada entre múltiples especies). En ciertos aspectos, el péptido se une a la Proteína S con una consistente de disociación (Kd) menor o igual a 1 x 10- 4 M, menor o igual a 1 x 10- 5 M, menor o igual a 1 x 10- 6 M, o menor o igual a 1 x 10- 7 M, o menor o igual a 1 x 10- 8 M, o menor o igual a 1 x 10- 9 M, o menor o igual a 1 x 10- 10 M.
La afinidad puede determinarse usando, por ejemplo y sin limitación, uno cualquiera, dos o más de una variedad de técnicas, como un ensayo ELISA de afinidad (EC50), un ensayo ELISA competitivo (IC50), un ensayo LANCE IC50 competitivo (por ejemplo, un ensayo TR-FRET homogéneo basado en europio descrito en la presente) y/o un ensayo de resonancia de plasmones superficiales (BIAcore™). Opcionalmente, cuando se usa un ensayo de afinidad (EC50) basado en ELISA (por ejemplo, el ensayo descrito en el Ejemplo 1), el péptido demuestra una EC50 de 1 x 1 0 - 4 M, menor o igual a 1 x 10-5 M, menor o igual a 1 x 1 0 - 6 M, menor o igual a 1 x 1 0 - 7 M, menor o igual a 1 x 10-8 M, o menor o igual a 1 x 10-9 M. Cuando se caracteriza usando un ensayo ELISA competitivo (IC50) o ensayo LANCE CI50, el péptido de la invención demuestra opcionalmente una IC50 menor o igual a aproximadamente 10.000 nM. Por ejemplo, el péptido muestra una IC50 menor o igual a aproximadamente 5.000 nM, menor o igual a aproximadamente 1.000 nM, o menor o igual a aproximadamente 500 nM. En un aspecto, el péptido demuestra una IC50 menor o igual a aproximadamente 250 nM, menor o igual a aproximadamente 100 nM, menor o igual a aproximadamente 50 nM, o menor o igual a aproximadamente 10nM (por ejemplo, menor o igual a aproximadamente 9 nM, menor o igual a aproximadamente 8 nM, menor o igual a aproximadamente 7 nM, menor o igual a aproximadamente 6 nM, menor o igual a aproximadamente 5 nM, menor o igual a aproximadamente 4 nM, menor o igual a aproximadamente 3 nM, o menor o igual a aproximadamente 1 nM). Opcionalmente, los ensayos competitivos utilizan JBS0684 (SEQ ID NO: 1) como "trazador" (es decir, péptido competidor). Por tanto, en varias realizaciones, el péptido se une a la Proteína S humana con una IC50 de menos de 25 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 3 nM o menos de 1 nM en un ensayo de LANCE competitivo usando un péptido que comprende (o que consiste de) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (JBS0684) como trazador. Los péptidos ejemplares y sus valores de IC50 se proporcionan en la Figura 1.
Otro ensayo adecuado para caracterizar los péptidos de la invención es un ensayo koff, que examina la liberación de un péptido de la Proteína S. El resultado del ensayo koff no es la constante de tasa de disociación, sino un porcentaje de péptido competidor bloqueado de unirse a la Proteína S por un péptido de prueba un período de incubación con la Proteína S. Un ensayo de koff ejemplar incluye los siguientes pasos: 1) incubación de una placa de microtitulación recubierta con Proteína S con una cantidad de péptido de prueba que da como resultado aproximadamente un 90% de ocupación de Proteína S; 2) eliminación del péptido de prueba no unido; 3) adición de un péptido trazador biotinilado (es decir, competidor) (por ejemplo, JBS0684) que compite con el péptido de prueba por la unión a la Proteína S; 4) incubación durante un período de tiempo durante el cual el trazador ocupa los sitios de unión liberados por el péptido de prueba; 5) eliminación del trazador no unido y del péptido de prueba; y 6 ) detección del trazador unido mediante una reacción cromogénica usando un conjugado de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. La señal resultante es indicativa de los sitios de unión liberados por el péptido de prueba. Un péptido de prueba que no se disocia de la Proteína S durante el período de incubación produce una señal más débil en comparación con un analito que se disocia completamente. Opcionalmente, el péptido demuestra una koff menor o igual a 1 x 1 0 - 3 s-1, menor o igual a 1 x 1 0 - 4 s-1, menor o igual a 1 x 1 0 - 5 s-1, menor o igual a 1 x 1 0 - 6 s-1, o menor o igual que 1 x 1 0 - 7 s-1.
Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la técnica reconoce que las varias fracciones a las que un agente de unión no debería unirse de manera detectable para ser biológicamente (por ejemplo, terapéuticamente) eficaz sería exhaustivo y poco práctico enumerar. Por lo tanto, el término "se une específicamente" se refiere a la capacidad de un péptido para unirse a la Proteína S con mayor afinidad de la que se une a una proteína de control no relacionada que no es la Proteína S. Por ejemplo, el péptido puede unirse a la Proteína S con una afinidad que es por lo menos 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. En algunas realizaciones, el péptido se une a la Proteína S con mayor afinidad de la que se une a un "anti-objetivo, ”Una proteína u otra sustancia de origen natural en los humanos a la que la unión del péptido podría provocar efectos adversos. Como los péptidos inhibidores de la Proteína S ejercen su actividad en el torrente sanguíneo y/o en el endotelio, las proteínas plasmáticas representan anti-objetivos potenciales. La Proteína S también es una proteína de múltiples dominios que alberga dominios altamente homólogos con otras proteínas del sistema de coagulación proteínas que contienen dominios Gla (por ejemplo, GAS6 , Factor VII, Factor IX, Factor X, Proteína C, proteína Z y protrombina), dominios similares a EGF (por ejemplo, GAS6 , Factor VII, Factor IX, Factor X, Proteína C, Proteína Z y trombomodulina) y dominios similares a laminina G (por ejemplo, GAS6 ). Las proteínas que tienen estos dominios también son anti-objetivos potenciales. En varias realizaciones, la GAS6 humana es el anti-objetivo debido a su homología con la Proteína S (42% de identidad, 57% de secuencia consenso). Por tanto, en un aspecto, el péptido de la invención se une a la Proteína S con un afinidad que es por lo menos 5, 10, 15, 25, 50, o 100 veces mayor que la afinidad para un anti-objetivo, como GAS6 humana (probado usando cualquier método adecuado, como un ensayo de resonancia de plasmones de superficie (por ejemplo BIAcore)).
Opcionalmente, el péptido de la invención demuestra una o más características deseadas descritas en la presente, y la secuencia de aminoácidos de un péptido puede modificarse para optimizar la unión, estabilidad y/o actividad, si se desea. Un péptido ejemplar une la Proteína S con una Kd menor o igual a 10 pM y/o muestra una afinidad de unión por la Proteína S que es por lo menos 10 veces mayor que la afinidad de unión por un anti­ objetivo. Alternativa o adicionalmente, el péptido mejora la generación de trombina en plasma deficiente en Proteína S suplementado con Proteína S y APC o plasma inhibido/deficiente en FVIII con una EC50 (medida usando cualquier ensayo adecuado, como los ensayos descritos en la presente) menor o igual a 10 pM y/o mejora la generación de trombina dependiente de Proteína S en ausencia de actividad de Factor VIII hasta por lo menos aproximadamente un 20% (por ejemplo, 40%) del nivel de formación de trombina en plasma que contiene actividad normal de Factor VIII. Alternativa o adicionalmente, el péptido alcanza un nivel deseado de estabilidad en plasma (por ejemplo, el 50% o más de una dosis permanece en el plasma humano después de seis horas o 12 horas, o el 50% o más de una dosis permanece en el plasma del ratón después de cuatro u ocho horas) y/o demuestra una vida media deseada in vivo (por ejemplo, por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez horas) y/o demuestra un nivel deseado de solubilidad. Alternativa o adicionalmente, el péptido de la invención muestra un nivel deseado de biodisponibilidad, como un nivel deseado de biodisponibilidad después de la administración intravenosa o subcutánea (por ejemplo, mayor o igual al 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% o 50%) y/o demuestra un nivel deseado de actividad inhibidora de la Proteína S a una dosis dada in vivo.
La invención incluye además un método in vitro para inhibir la Proteína S. El método comprende poner en contacto la Proteína S con un péptido descrito en la presente. Se contempla cualquier grado de inhibición de la actividad de la Proteína S. Por ejemplo, un péptido de la invención reduce la inhibición por Proteína S de la cascada de coagulación en por lo menos aproximadamente un 5% (por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 10%, por lo menos aproximadamente un 25% o por lo menos aproximadamente un 30%). En algunas realizaciones, el péptido reduce la actividad de la Proteína S en por lo menos aproximadamente un 50%, por lo menos aproximadamente un 75% o por lo menos aproximadamente un 90% en comparación con la actividad de la Proteína S en ausencia del péptido.
En un aspecto de la invención, los péptidos de la invención se usan para detectar y/o cuantificar la Proteína S in vitro. Un método ejemplar para detectar y/o cuantificar la Proteína S en una muestra comprende (a) poner en contacto una muestra con un péptido de la invención y (b) detectar la unión del péptido a la Proteína S. El método es útil para la terapia y el diagnóstico de enfermedad en donde la Proteína S es un marcador de diagnóstico adecuado. Los complejos péptido-Proteína S se detectan directa o indirectamente. Las fracciones de detección se usan ampliamente en la técnica para identificar sustancias biológicas e incluyen, por ejemplo, colorante (por ejemplo, colorante fluorescente), radionúclidos y complejos que contienen radionúclidos y enzimas. Las fracciones que permiten la detección se unen o conjugan opcionalmente al péptido. En algunos aspectos, la unión péptido-Proteína S se detecta indirectamente. A este respecto, el péptido se pone opcionalmente en contacto con un compañero de interacción que se une al péptido de la invención sin interferir significativamente con la unión péptido-Proteína S, y se detecta el compañero de interacción. Los compañeros de interacción ejemplares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno, anticalinas y miméticos de anticuerpos, aptámeros, estreptavidina, avidina, neutravidina y spiegelmers. Opcionalmente, el compañero de interacción comprende una fracción de detección para facilitar la detección de un complejo péptido-compañero de interacción. El péptido, en algunas realizaciones, se modifica para facilitar la unión de un compañero de interacción. Por ejemplo, en un aspecto, el péptido de la invención se conjuga con biotina, que está unida por un compañero de interacción que comprende estreptavidina. Un compañero de interacción ejemplar comprende estrepavidina fusionada con peroxidasa de rábano picante, que se detecta, por ejemplo, en un ensayo tipo ELISA. Alternativamente, el péptido de la invención se modifica para incluir un epítopo de anticuerpo y se detecta la unión del anticuerpo correspondiente al complejo péptido-Proteína S.
Los complejos péptido-Proteína S y los complejos de compañero de interacción-péptido se identifican usando cualquiera de varios métodos, como, pero no limitados a, ensayos bioquímicos (por ejemplo, ensayos enzimáticos), espectroscopia (por ejemplo, detección basada en densidad óptica, fluorescencia, FRET, BRET, TR-FRET, polarización de fluorescencia, electroquimioluminiscencia o NMR), tomografía por emisión de positrones (PET) y tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Las fracciones detectables que facilitan la detección de fluorescencia de complejos péptido-Proteína S o complejos de compañero de interacción-péptido incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, Alexa Fluor® 350, Marina Blue™, Cascade Yellow™, Alexa Fluor® 405, Pacific Blue™, Pacific Orange™, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Oregon Green® 488, Alexa Fluor® 500, Oregon Green® 514, Alexa Fluor®) 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 555, Tetramethylrhodamine, Alexa Fluor® 546, Rhodamine B, Rhodamine Red™-X, Alexa Fluor®) 568, Alexa Fluor® 594, Texas Red®, Texas Red®-X, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor®) 633, Alexa Fluor® 635, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, Alexa Fluor® 750, B-Phycoerythrin, R-Phycoerythrin, Allophycocyanin, BODiPy®, Cy3, Cy5, Ta MrA, y proteínas fluoresecentes (GFP y derivados de los mismos).
La invención también proporciona un péptido de la invención para su uso en un método para diagnosticar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, o que está en riesgo de padecer una enfermedad o trastorno, en donde la enfermedad o trastorno está asociado o provocado por la actividad de la Proteína S aberrante. El método comprende administrar al sujeto el péptido de la invención y detectar el complejo Proteína S-péptido. La detección de complejos se ha descrito anteriormente. La presencia del complejo indica la presencia de Proteína S, permitiendo de este modo el diagnóstico de una enfermedad o trastorno asociado con la Proteína S (por ejemplo, una enfermedad o trastorno que (i) puede tratarse inhibiendo la Proteína S o (ii) comprende síntomas que pueden mejorarse o prevenirse inhibiendo la Proteína S). Si no se desea la administración del péptido al sujeto, se obtiene una muestra biológica del sujeto, se pone en contacto con el péptido como se describe en la presente, y se detectan los complejos de Proteína S-péptido. Se apreciará que los métodos de uso de los péptidos descritos en la presente también incluyen el uso de cualquiera de los complejos de péptidos descritos en la presente.
Algunas enfermedades y trastornos, como la trombofilia, la trombosis venosa y la embolia pulmonar, están relacionadas con niveles reducidos de Proteína S. La deficiencia de Proteína S puede ser hereditaria o resultar de, por ejemplo, deficiencia de vitamina K, tratamiento con warfarina, embarazo, infección y enfermedad hepática. Para detectar una deficiencia, el método implica opcionalmente cuantificar la Proteína S. Si la Proteína S en la muestra biológica está por debajo de un umbral deseado, se inicia el tratamiento de la enfermedad o trastorno. En algunos casos, el tratamiento comprende terapia de anticoagulación (como terapias con heparina o warfarina).
Los péptidos descritos en la presente se unen preferiblemente a la Proteína S y, por lo tanto, son útiles para purificar la Proteína S (por ejemplo, la Proteína S recombinante) de una muestra biológica (por ejemplo, un fluido biológico, como suero), extracto de fermentación, preparaciones de tejido, medio de cultivo, y similares. Los péptidos también son útiles para purificar proteínas que interactúan con la Proteína S, como pero no limitadas a, C4BP. La invención incluye métodos para usar el péptido de la invención en la producción comercial de Proteína S o en un método para caracterizar Proteína S. Por ejemplo, la invención incluye un método para purificar Proteína S. El método comprende poner en contacto una muestra que contiene Proteína S con un péptido como se define en la presente en condiciones apropiadas para formar un complejo entre la Proteína S y el péptido; eliminar el complejo de la muestra; y, opcionalmente, disociar el complejo para liberar la Proteína S. Las condiciones ejemplares apropiadas para formar un complejo entre la Proteína S y el péptido se describen en los Ejemplos. En algunas realizaciones, el péptido se inmoviliza en un soporte, por ejemplo, un soporte sólido, para facilitar la recuperación de la Proteína S. Por ejemplo, en una realización, el péptido se inmoviliza en la fase estacionaria de cromatografía (por ejemplo, sílice, perlas de cromatografía de afinidad, o resinas cromatográficas), se aplica una muestra que comprende Proteína S a la fase estacionaria de tal manera que se forman complejos Proteína S-péptido, el resto de la muestra se retira de la fase estacionaria y la Proteína S se eluye de la fase estacionaria. A este respecto, los péptidos de la invención son, en un aspecto, adecuados para su uso en técnicas de cromatografía de afinidad.
También se proporciona un péptido de la invención para su uso en un método para mejorar la formación de trombina en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto un péptido proporcionado en la presente en condiciones eficaces para inhibir la Proteína S. A este respecto, el péptido se administra en una cantidad y en condiciones eficaces para potenciar la formación de trombina en el sujeto. En varios aspectos de la invención, el sujeto es "deficiente en factor de coagulación", lo que significa que el sujeto padece una deficiencia en uno o más factores sanguíneos necesarios para la formación de trombina como FVIII, FIX o FXI. De hecho, en una realización, el sujeto es deficiente en FVIII. Las deficiencias de factores de coagulación se identifican examinando la cantidad de factor en una muestra clínica. Los médicos clasifican la hemofilia de acuerdo con la magnitud de la deficiencia del factor de coagulación. Los sujetos que padecen hemofilia leve tienen aproximadamente del 5% al 30% de la cantidad normal (1 U/ml) de Factor VIII o Factor IX. La hemofilia moderada se caracteriza por aproximadamente del 1% al 5% de los niveles normales de Factor VIII, Factor IX o Factor XI, mientras que los sujetos que padecen hemofilia grave tienen menos del 1% de la cantidad normal de Factor VIII, Factor IX o Factor XI. Las deficiencias pueden identificarse indirectamente mediante la prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT). El método incluye además potenciar la formación de trombina en un sujeto que no padece una deficiencia de factor de coagulación. El método comprende administrar a un sujeto (por ejemplo, un sujeto que comprende niveles fisiológicos normales de factor de coagulación) un péptido proporcionado en la presente en condiciones eficaces para potenciar la formación de trombina.
En un aspecto, el péptido es para su uso en un método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos en un sujeto. El método para aumentar la formación de coágulos sanguíneos comprende administrar al sujeto un péptido descrito en la presente en una cantidad y en condiciones eficaces para aumentar la formación de coágulos sanguíneos. Se apreciará que el método no necesita restaurar completamente la cascada de coagulación para lograr un efecto beneficioso (por ejemplo, terapéutico). Se contempla cualquier mejora o aumento de la formación de trombina o coágulos sanguíneos que reduzca la aparición o la gravedad de los síntomas asociados con las deficiencias del factor de coagulación. Los métodos para determinar la eficacia del método para promover la formación de trombina y la coagulación sanguínea se conocen en la técnica y se describen en la presente.
La invención incluye además un péptido de la invención para su uso en un método para tratar un trastorno de la coagulación sanguínea en un sujeto, el método comprendiendo administrar al sujeto uno o más péptidos (o complejos de péptidos) de la invención (es decir, uno o más de los péptidos descritos en la presente), en una cantidad y en condiciones eficaces para tratar el trastorno de la coagulación sanguínea en el sujeto. Los "trastornos de la coagulación" incluyen trastornos hemorrágicos (por ejemplo, hipocoagulación) provocados por una actividad deficiente del factor de coagulación sanguínea y una actividad plaquetaria deficiente. Los factores de coagulación sanguínea incluyen, entre otros, Factor V (FV), FVII, FVIII, FiX, FX, FXI, FXIII, FII (responsable de la hipoprotrombinemia) y factor de von Willebrand. Las deficiencias del factor están provocadas, por ejemplo, por una vida media in vivo más corta del factor, propiedades de unión alteradas del factor, defectos genéticos del factor y una concentración en plasma reducida del factor. Los trastornos de la coagulación pueden ser congénitos o adquiridos. Los trastornos de la coagulación también se derivan del desarrollo de inhibidores o autoinmunidad (por ejemplo, Anticuerpos) contra factores de coagulación. En un ejemplo, el trastorno de la coagulación es la hemofilia A. Alternativamente, el trastorno de la coagulación es la hemofilia B o la hemofilia C.
Los trastornos plaquetarios están provocados por una función plaquetaria deficiente o un número de plaquetas anormalmente bajo en circulación. El bajo recuento de plaquetas puede deberse, por ejemplo, a una subproducción, secuestro de plaquetas o destrucción incontrolada de plaquetas. La trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) puede estar presente por varias razones, que incluyen quimioterapia y otras terapias con fármacos, radioterapia, cirugía, pérdida accidental de sangre y otras condiciones de enfermedad. Las condiciones de enfermedad ejemplares que implican trombocitopenia son: anemia aplásica; trombocitopenia idiopática o inmune (PTI), incluyendo la púrpura trombocitopénica idiopática asociada con cáncer de mama; PTI asociada con VIH y púrpura trombocitopénica trombótica relacionada con VIH; tumores metastásicos que provocan trombocitopenia; lupus eritematoso sistémico, incluyendo el síndrome de lupus neonatal, esplenomegalia; síndrome de Fanconi; deficiencia de vitamina B12; deficiencia de ácido fólico; anomalía de May-Hegglin; síndrome de Wiskott-Aldrich; enfermedad hepática crónica; síndrome mielodisplásico asociado con trombocitopenia; hemoglobinuria paroxística nocturna; trombocitopenia aguda profunda después de terapia con C7E3 Fab (Abciximab); trombocitopenia aloinmune, incluyendo trombocitopenia aloinmune materna; trombocitopenia asociada con anticuerpos antifosfolípidos y trombosis; trombocitopenia autoinmune; trombocitopenia inmune inducida por fármacos, incluyendo trombocitopenia inducida por carboplatino y trombocitopenia inducida por heparina; trombocitopenia fetal; trombocitopenia gestacional; síndrome de Hughes; trombocitopenia lupoide; pérdida de sangre accidental y/o masiva; trastornos mieloproliferativos; trombocitopenia en pacientes con enfermedades malignas; púrpura trombocitopenia trombótica, incluyendo microangiopatía trombótica que se manifiesta como púrpura trombocitopénica trombótica/síndrome urémico hemolítico en pacientes con cáncer; púrpura postransfusional (PTP); anemia hemolítica autoinmune; perforación oculta del divertículo yeyunal; aplasia pura de glóbulos rojos; trombocitopenia autoinmune; nefropatía epidémica; insuficiencia renal aguda asociada a rifampicina; trombocitopenia de Paris-Trousseau; trombocitopenia aloinmune neonatal; hemoglobinuria paroxística nocturna; cambios hematológicos en el cáncer de estómago; síndromes urémicos hemolíticos (por ejemplo, afecciones urémicas en la infancia); y manifestaciones hematológicas relacionadas con infección viral incluyendo trombocitopenia asociada a virus de la hepatitis A y a CMV. Los trastornos plaquetarios también incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Von Willebrand, disfunción plaquetaria paraneoplásica, trombastenia de Glanzman, y enfermedad de Bernard-Soulier. Los trastornos hemorrágicos adicionales incluyen, pero no se limitan a, afecciones hemorrágicas inducidas por traumas; una deficiencia en uno o más factores de contacto como FXI, FXII, precalicreína y cininógeno de alto peso molecular (HMWK); deficiencia de vitamina K; un trastorno del fibrinógeno, incluyendo afibrinogenemia, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia; y deficiencia de alfa2-antiplasmina. En una realización, el péptido de la invención se usa para tratar sangrado excesivo, como sangrado excesivo provocado por cirugía, traumatismo, hemorragia intracerebral, enfermedad hepática, enfermedad renal, trombocitopenia, disfunción plaquetaria, hematomas, hemorragia interna, hemartrosis, hipotermia, menstruación, embarazo y dengue hemorrágico. Todo lo anterior se considera "trastornos de la coagulación sanguínea" en el contexto de la divulgación.
En un aspecto, el péptido de la invención es para su uso en un método para revertir los efectos (en su totalidad o en parte) de uno o más anticoagulantes en un sujeto. Se conocen en la técnica numerosos anticoagulantes e incluyen, por ejemplo, heparina; derivados de cumarina, como warfarina o dicumarol; TFPI; AT III; lupus anticoagulante; péptido anticoagulante de nematodos (NAPc2); Inhibidores de FVIIa; FVIIa bloqueado en el sitio activo (FVIIai); FIXa bloqueado en el sitio activo (FIXai); inhibidores de FIXa; inhibidores de FXa incluyendo fondaparinux, idraparinux, DX-9065a y razaxaban (DPC906); FXa bloqueado en el sitio activo (FXai); inhibidores de FVa o FVIIIa, incluyendo Proteína C activada (APC) y trombomodulina soluble; inhibidores de trombina, incluyendo hirudina, bivalirudina, argatroban y ximelagatrán; y anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a un factor de coagulación (por ejemplo, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXIII, FII, factor von Willebrand, precalicreína o cininógeno de alto peso molecular (HMWK)).
Como se usa en la presente, "tratar" y "tratamiento" se refiere a cualquier reducción en la gravedad y/o aparición de síntomas asociados con una enfermedad o trastorno (por ejemplo, un trastorno de la coagulación sanguínea). Un experto en la técnica apreciará que cualquier grado de protección o mejora de un trastorno o síntoma asociado con el mismo es beneficioso para un sujeto, como un paciente humano. La calidad de vida de un paciente se mejora reduciendo en cualquier grado la gravedad de los síntomas en un sujeto y/o retrasando la aparición de los síntomas. Por consiguiente, el método en un aspecto se realiza tan pronto como sea posible después de que se haya determinado que un sujeto está en riesgo de desarrollar un trastorno de la coagulación sanguínea (por ejemplo, una deficiencia en un factor de coagulación (por ejemplo, FVIII, FIX, o FXI) o se detectan anticuerpos inhibidores) o tan pronto como sea posible después de que se detecte un trastorno de la coagulación sanguínea (por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C). En un aspecto adicional, el péptido se administra para proteger, en su totalidad o en parte, contra la pérdida excesiva de sangre durante una lesión o cirugía.
En vista de lo anterior, la invención proporciona un péptido (o complejo de péptidos) para su uso en medicina, es decir, para su uso en un método para el tratamiento de un sujeto, como un método para el tratamiento de una enfermedad en la que es beneficiosa la inhibición de la Proteína S. En un aspecto, la enfermedad o trastorno es un trastorno de la coagulación sanguínea. El sujeto padece una enfermedad o trastorno o corre el riesgo de padecer una enfermedad o trastorno (o un evento biológico adverso, como una pérdida excesiva de sangre). El método comprende administrar al sujeto el péptido (o complejo de péptidos) en una cantidad y en condiciones eficaces para tratar o prevenir, total o parcialmente, la enfermedad o trastorno. La invención proporciona además un péptido (o complejo de péptidos) para su uso en la fabricación de un medicamento. Por ejemplo, el péptido (o complejo de péptidos) puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea, como se describe con detalle en la presente.
En algunas realizaciones, es ventajoso administrar a un sujeto un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido o complejo de péptidos de la invención. Dicho ácido nucleico, en un aspecto, se proporciona en lugar de, o además de, un péptido o complejo de péptidos. Los vectores de expresión, las secuencias reguladoras de ácidos nucleicos, los métodos de administración y similares se describen adicionalmente en la presente y en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 20030045498.
La cantidad de péptido administrada a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, como un humano) y las condiciones de administración (por ejemplo, cadencia de administración, vía de administración, régimen de dosificación) son suficientes para afectar a la respuesta biológica deseada durante un marco temporal razonable. Meramente a modo de ilustración, en un aspecto, el método comprende administrar, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más. Dada la naturaleza crónica de muchos trastornos de la coagulación sanguínea, se prevé que un sujeto recibirá el péptido de la invención durante un curso de tratamiento que durará semanas, meses o años, y puede requerir una o más dosis diarias o semanales. En otras realizaciones, el péptido de la invención se administra para tratar una afección aguda (por ejemplo, sangrado causado por cirugía o traumas, o inhibidor de factores/episodios autoinmunes en sujetos que reciben terapia de reemplazo de coagulación) durante un periodo de tratamiento relativamente corto, por ejemplo de uno a 14 días.
Los métodos adecuados para administrar una composición fisiológicamente aceptable, como una composición farmacéutica que comprende un péptido descrito en la presente, son bien conocidos en la técnica. Dependiendo de las circunstancias, se aplica o instila una composición farmacéutica en las cavidades corporales, se absorbe a través de la piel o las membranas mucosas, se ingiere, se inhala y/o se introduce en la circulación. En un aspecto, se administra por vía intravenosa, intraarterial o intraperitoneal una composición que comprende un péptido de la invención para introducir el péptido de la invención en la circulación. La administración no intravenosa también es apropiada, particularmente con respecto a terapias de bajo peso molecular. En ciertas circunstancias, es deseable administrar una composición farmacéutica que comprenda el péptido de la invención por vía oral, tópica, sublingual, vaginal, rectal, pulmonar; mediante inyección por vía intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intranasal, uretral o enteral; por sistemas de liberación sostenida; o mediante dispositivos de implantación. Si se desea, el péptido se administra regionalmente mediante administración intraarterial o intravenosa alimentando una región de interés, por ejemplo, a través de la arteria femoral para su administración a la pierna. En una realización, el péptido se incorpora a una micropartícula como se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N°. 5.439.686 y 5.498.421, y las Publicaciones de Patente de Estados Unidos 2003/0059474, 2003/0064033, 2004/0043077, 2005/0048127, 2005/0170005, 2005/0142205, 2005/142201, 2005/0233945, 2005/0147689. 2005/0142206, 2006/0024379, 2006/0260777, 2007/0207210, 2007/0092452, 2007/0281031, y 2008/0026068. Alternativamente, la composición se administra mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Cuando se usa un dispositivo de implantación, en un aspecto el dispositivo se implanta en cualquier tejido adecuado y la administración de la molécula deseada se realiza en varios aspectos mediante difusión, bolo de liberación programada o administración continua. En otros aspectos, el péptido se administra directamente al tejido expuesto durante procedimientos quirúrgicos o el tratamiento de la lesión, o se administra mediante transfusión de procedimientos sanguíneos. Los enfoques de administración terapéutica son bien conocidos por los expertos en la técnica, algunos de los cuales se describen con más detalle, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.399.363.
Para facilitar la administración, el péptido o complejo de péptidos en una realización se formula en una composición fisiológicamente aceptable que comprende un portador (es decir, vehículo, adyuvante, tampón o diluyente). Los portadores estériles fisiológicamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen, sin limitación, soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, ver la Patente de Estados Unidos N° 5.466.468). Una composición farmacéutica que comprende un péptido proporcionado en la presente se coloca opcionalmente dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones sobre el uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración de reactivos, así como, en ciertas realizaciones, las cantidades relativas de ingredientes o diluyentes excipientes que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.
Cuando sea apropiado, el péptido o complejo de péptidos de la invención se administra en combinación con otras sustancias y/u otras modalidades terapéuticas para lograr un efecto biológico adicional o aumentado. Los cotratamientos incluyen, pero no están limitados a, factores de coagulación recombinantes o derivados del plasma, tratamientos de profilaxis de la hemofilia, inmunosupresores, antagonistas de anticuerpos inhibidores del factor plasmático (es decir, anti-inhibidores), antifibrinolíticos, antibióticos, terapia hormonal, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) o sustancias antiinflamatorias esteroides), procoagulantes y analgésicos. En un aspecto, el método es una terapia complementaria a los regímenes tradicionales de tratamiento con factor de reemplazo que implican la administración de, por ejemplo, FXIII, FXII, FXI (por ejemplo, HEMOLEVEN® (Laboratoire francais du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, Francia) y concetrado de FXI (BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, UK)), FX, FIX (por ejemplo, BENEFIX® Factor IX de coagulación (Wyeth, Madison, NJ); ALPHANINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); MONONINE® (CSL Behring, King of Prussia, PA); BEBULIN-VH™ (Baxter, Deerfield, IL); PROFILNINE® SD (Grifols, Los Angeles, CA); o PROPLEX T™ (Baxter, Deerfield, IL)), FVIII (por ejemplo, ADVATE™ (Baxter, Deerfield, IL); HELIXATE® FS (CSL Behring, King of Prussia, PA); REFACTO® (Wyeth, Madison, NJ), XYNTHA™ (Wyeth, Madison, NJ), KOGENATE® y KOGENATE® FS (Bayer, Pittsburgh, PA); ALPHANATE® (Grifols, Los Angeles, CA); HEMOPHIL M™ (Baxter, Deerfield, IL); KOATE®-DVI (Talecris Biotherapeutics-USA, Research Triangle Park, NC); o MONARC-M™ (Baxter, Deerfield, IL)), FVIIa (e.g., NOVOSEVEN® FVIIa (Novo Nordisk, Princeton, NJ) y concentrado de FVII (Baxter Bioscience, Viena, Austria, o BioProducts Laboratory, Elstree, Hertfordshire, UK)), FV, FVa, FII, y/o FIII, a un sujeto. En algunos casos, el sujeto también recibe FEIBA VH Immuno (Baxter BioScience, Viena, Austria), que es una fracción de plasma humano estéril liofilizado con actividad de desvío del inhibidor del factor VIII. FEIBA VH Immuno™ contiene aproximadamente unidades iguales de actividad de desvío del inhibidor del factor VIII y factores del complejo de protrombina (Factores II, VII, IX y X y Proteína C). Otros co-tratamientos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, precalicreína, cininógeno de alto peso molecular (HMWK), factor de von Willebrand, factor tisular y trombina. Alternativa o adicionalmente, el péptido se co-formula con uno o más péptidos de unión a Proteína S diferentes, como uno o más péptidos diferentes de la invención. En un aspecto, la administración del péptido permite una reducción en la dosis de co-terapéutica requerida para lograr una respuesta biológica deseada. También opcionalmente, el péptido (o complejo de péptidos) es parte de un régimen terapéutico que incluye la administración de un péptido de unión al inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), como los péptidos que se unen al TFPI descritos en la Publicación de Patente Internacional N° WO 2013/141965.
Por tanto, la invención incluye un péptido de la invención (o múltiples péptidos, o un complejo de péptidos), en combinación con una o más sustancias adicionales adecuadas para su uso en la administración a un sujeto, cada una de las cuales se administra de acuerdo con un régimen adecuado para ese medicamento. Las estrategias de administración incluyen la administración concurrente (es decir, la administración sustancialmente simultánea) y la administración no concurrente (es decir, la administración en diferentes momentos, en cualquier orden, solapando o no) del péptido (o complejo de péptidos) y uno o más agentes adicionales adecuados. Se apreciará que diferentes componentes se administran opcionalmente en la misma composición o en composiciones separadas, y mediante la misma vía de administración o diferentes vías de administración.
La invención proporciona además un método para identificar un compuesto de unión a la Proteína S, como un péptido de unión a la Proteína S. En un aspecto, el método comprende (a) poner en contacto la Proteína S con un péptido descrito en la presente y un compuesto de prueba (que puede ser un segundo péptido) en condiciones que permitan la formación de complejos de Proteína S-péptido. El método comprende además (b) medir los complejos de Proteína S-péptido formados en el paso (a), y (c) comparar el número de complejos de Proteína S-péptido formados en presencia del compuesto de prueba con el número de complejos de Proteína S-péptido formados en ausencia del compuesto de prueba. Una reducción en el número de complejos de Proteína S-péptido formados en presencia del compuesto de prueba en comparación con el número de complejos de Proteína S-péptido formados en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un compuesto de unión a Proteína S. En un aspecto, el método comprende además formar complejos de Proteína S-péptido en ausencia del compuesto de prueba para la comparación en el paso (c), aunque esto no es necesario ya que la información puede obtenerse por separado (por ejemplo, a partir de estándares de referencia preparados con anterioridad).
La Proteína S, el péptido y el compuesto de prueba se combinan simultánea o secuencialmente, opcionalmente con pasos de lavado antes y/o después de la adición del péptido y/o el compuesto de prueba. En una realización, la Proteína S se pone en contacto con un péptido descrito en la presente en condiciones que permiten la formación de complejos de Proteína S-péptido, se elimina el péptido no unido y los complejos de Proteína S-péptido restantes se ponen en contacto con un compuesto de prueba. Se detecta el desplazamiento del péptido de los complejos de Proteína S-péptido, y se indica que el compuesto de prueba es un compuesto de unión a Proteína S. El desplazamiento se detecta, por ejemplo, midiendo el número de complejos de Proteína S-péptido antes y después de la exposición al compuesto de prueba.
Los complejos de Proteína S-péptidos de unión se detectan y/o miden (cuantifican) usando cualquier medio de detección adecuado, incluyendo los medios de detección conocidos en la técnica para detectar péptidos en una muestra. Por ejemplo, en una realización de la invención, el péptido de la invención comprende un marcador que genera una señal. Los marcadores ejemplares se describen en la presente e incluyen, por ejemplo, radionúclidos, colorantes fluorescentes, isótopos, sustratos de enzimas y enzimas. El método comprende medir la señal generada por los complejos de Proteína S-péptido y comparar la señal generada por los complejos de Proteína S-péptido formados en presencia del compuesto de prueba con la señal generada por los complejos de Proteína S-péptido formados en ausencia del compuesto de prueba. Una reducción en la señal de una muestra que comprende los complejos de Proteína S-péptido expuestos al compuestos de prueba (en comparación con la señal generada por una muestra similar de complejos de Proteína S-péptido no expuesta al compuesto de prueba) indica que se ha inhibido o alterado la formación de complejos, y que el compuesto de prueba es un compuesto de unión a Proteína S.
Los métodos de la invención para identificar compuestos de unión a Proteína S son particularmente adecuados para las varias técnicas de cribado de alto rendimiento conocidas en la técnica. Cualquier "compuesto de prueba" (por ejemplo, molécula pequeña, péptido, proteína (como un anticuerpo o fragmento del mismo), peptidomimético o polinucleótido (ADN o ARN)) es adecuado para el cribado usando los métodos descritos en la presente. Si se desea, se criba una colección, población o biblioteca de compuestos de prueba para la unión de la Proteína S (y, opcionalmente, la actividad anti-Proteína S) usando los métodos descritos en la presente. Los métodos de cribado de alto rendimiento abarcados por la invención incluyen procedimientos automatizados que permiten el cribado de decenas a cientos de miles de compuestos de prueba.
EJEMPLOS
La invención se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que limiten la invención.
Ejemplo 1
El siguiente ejemplo describe la producción y selección de los péptidos descritos en la presente y la caracterización de la unión a la Proteína S.
Los péptidos se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida de Fmoc principalmente con el extremo N-terminal acetilado y el extremo C-terminal amidado. Los productos en bruto se purificaron hasta >90% por HPLC y se liofilizaron como sales de TFA. Los péptidos liofilizados se almacenaron a <-15° C. Las secuencias de péptidos de unión a Proteína S se identificaron usando una biblioteca de presentación de ARNm y un panel de ensayos de selección. El método de presentación de ARNm se describe, por ejemplo, en la Publicación de Patente Internacional N° WO 2005/051985 y Liu et al., Methods in Enzymology, 318, 268-293 (2000). En resumen, el ARNm se enlaza directamente a su péptido codificado a través de una molécula de puromicina. Los complejos péptido-ARN se expusieron a Proteína S de longitud completa en una serie de rondas de selección durante las cuales se aislaron y enriquecieron los complejos péptido-ARN candidatos unidos a Proteína S. El ARN que codifica los péptidos con las propiedades deseadas se transcribió de manera inversa para obtener el ADN codificante.
Las rondas de selección incluyeron pasos de selección de rigurosidad moderada y alta, así como condiciones competitivas basadas en anticuerpos anti-Proteína S inhibidores. El proceso de selección comenzó con cinco rondas de selección de rigurosidad progresiva. Una biblioteca que consistía de ~1013 complejos aleatorios de péptido-ARNm de 20 mer se incubó durante 1 hora con Proteína S humana biotinilada 100 nM inmovilizada en perlas de estreptavidina paramagnéticas. La unión de fusiones de péptido/ARNm a perlas de Proteína S y perlas de control de estreptavidina no recubiertas se monitorizó mediante medición de centelleo de complejos péptido-ARNm marcados radiactivos. Los complejos de péptido-ARNm no unidos se eliminaron mediante cuatro pasos de lavado. Posteriormente, las fusiones de péptido/ARNm unidas a las perlas recubiertas de Proteína S se amplificaron y se sometieron a la siguiente ronda de selección. Se observó un enriquecimiento progresivo de los complejos péptido-ARNm de unión a Proteína S durante cinco rondas de selección. Por ejemplo, la selección de péptidos de alta rigurosidad identificados en la ronda 2 eliminó ~99% de la población, dejando una subpoblación de aglutinantes de alta afinidad.
Se sintetizaron secuencias de péptidos únicas identificadas por presentación de ARNm (296 péptidos) como variantes biotiniladas en el extremo N-terminal para facilitar las pruebas de afinidad. Los péptidos con afinidad detectable por la Proteína S en los varios ensayos de cribado descritos anteriormente se caracterizaron adicionalmente en un ensayo de unión EC50 basado en ELISA. Brevemente, se recubrieron pocillos de Nunc Polysorb MTP con 50 pl de Proteína S (3 pg/ml) y se bloquearon con extracto de levadura al 2% y Tween80 al 0,1%.
Los péptidos biotinilados se incubaron en pocilios recubiertos con Proteína S y se bloquearon los pocilios de control (sin Proteína S). Después de varios pasos de lavado, se detectó el péptido unido por estreptavidina-HRP usando TMB como sustrato cromogénico. Los valores de EC50 se obtuvieron a partir de las curvas de titulación de péptidos mediante regresión no lineal de las señales de unión corregidas de fondo y normalizadas. Las afinidades de los péptidos varían de micromolar de dos dígitos a sub-nanomolar (EC50). Los péptidos ejemplares identificados por los ensayos de presentación y cribado de ARNm incluyen JBS0684 (SEQ ID NO: 1) y JBS2512 (SEQ ID NO: 2).
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la generación de péptidos de unión a Proteína S adicionales y la caracterización de la unión a Proteína S. Este ejemplo describe además el modelo de hemofilia basado en plasma y demuestra la actividad inhibidora de la Proteína S de los péptidos descritos en la presente.
Los péptidos identificados en el Ejemplo 1 se sometieron a análisis de sustitución para investigar adicionalmente la unión a Proteína S e identificar péptidos con actividad mejorada. Por ejemplo, cada posición de aminoácido del péptido original JBS2512 se reemplazó por separado por un conjunto de ocho aminoácidos representativos (Ala, Asp, Phe, Gly, Leu, Lys, Ser, Pro). Por tanto, se crearon aproximadamente 160 nuevos candidatos a péptidos a partir de un péptido original. Cada uno de estos nuevos candidatos a péptidos portaba un único intercambio de aminoácidos en comparación con el péptido original.
Se sintetizaron los nuevos candidatos a péptidos (pureza >60%) y se cribaron para determinar su afinidad en un ensayo de unión competitiva (ELISA IC50) y su actividad en un ensayo de generación de trombina (CAT). El ELISA de competición (IC50) se realizó usando el péptido trazador biotinilado JBS0684 para competir por la unión con la Proteína S con los péptidos candidatos. Los péptidos que compiten con el trazador se unen a la misma región de Proteína S que el trazador (y entre sí). Se recubrieron placas PolySorp de noventa y seis pocillos (Nunc) con 3 pg/ml de Proteína S en tampón de recubrimiento (Na2 CO3 15 mM, NaHCO3 35 mM, pH 9,6) durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (HNaT: NaCl 175 mM, HEPES 25 mM, CaCl25 mM, Tween 80 al 0,1%, pH 7,35) y bloqueado con 100 pl de extracto de levadura al 2% en HNaT durante por lo menos 1 hora. Luego, las placas se lavaron tres veces con HNaT. Se aplicó JBS0684 a una concentración correspondiente al valor de EC90 determinado en el ELISA de unión. Se diluyó una solución madre competidora de péptido (10 mM) a 1/33,3 en HNaT sin HSA, y se preparó una dilución en serie 1/3 con HNaT con DMSO al 3%. La dilución se diluyó adicionalmente con el péptido trazador biotinilado a una proporción de 1 : 6 ( 2 0 pl de dilución del competidor y 1 0 0 pl de péptido trazador). La mezcla de péptido competidor y trazador se aplicó a la placa de microtitulación recubierta con Proteína S y se incubó durante 1,5 horas. Las placas se lavaron tres veces con HNaT. La unión de péptido-Proteína S se detectó aplicando estreptavidina conjugada con HRP a la placa de microtitulación, incubando la mezcla durante una hora, lavando la placa tres veces con HNaT, aplicando TMB (3,3'5,5'-tetrametilbencidina), y detectando la conversión cromogénica posterior de TMB por HRP. En la presente se proporcionan las mediciones de IC50 de los péptidos (ver, por ejemplo, la Tabla 3).
También se probaron los péptidos para la mejora de la generación de trombina dependiente de Proteína S/APC en plasma hemofílico usando un ensayo CAT. La Proteína S mejora la anticoagulación de APC en plasma. El ensayo CAT cuantifica el efecto de la Proteína S sobre la generación de trombina mediada por APC iniciada a través de la vía de coagulación extrínseca (Nicolaes, Blood Coagul. Fibrinolysis, 8:28 (1997)). Se añadieron APC (35 nM) y Proteína S (25 nM) al plasma empobrecido en Proteína S, y las muestras de plasma se incubaron con plasma FVIII anti-humano inactivado por calor de alto título producido en cabra (4490 UB/ml; Baxter BioScience, Viena, Austria; concentración en plasma final de 50 UB/ml). La formación de trombina en plasma fue seguida por trombografía automatizada calibrada (CAT) en un lector Fluoroskan Ascent® (Thermo Labsystems, Helsinki, Finlandia) y se cuantificó mediante la altura del pico de trombina. La generación de trombina se determinó a una concentración alta de factor tisular (TF) en ausencia y en presencia de APC a una concentración que reduce la altura del pico al ~20%. El efecto inhibidor de los péptidos descritos en la presente sobre la actividad del cofactor de APC de la Proteína S (PS) en plasma se midió en plasma normal agrupado inhibido por FVIII suplementado con APC. La inhibición de la Proteína S/APC completa (100%) es la altura del pico de trombina sin la adición de APC. La falta (0%)de inhibición de PS/APC se correlaciona con el valor de la altura del pico de trombina con una cierta cantidad de APC. Los péptidos se clasificaron por sus valores normalizados en comparación con la media de los controles de tipo salvaje, incluyendo la SD a dos concentraciones de péptido definidas (EC50 y EC90).
Las condiciones ejemplares para el ensayo CAT son las siguientes. El plasma empobrecido en Proteína S se complementó con APC 35 nM y Proteína S 35 nM. La APC madre se diluyó con TF 10 pM y PL 15 pM. Los péptidos liofilizados se disolvieron en DMSO al 100% hasta una concentración madre de 5 mM y se diluyeron adicionalmente con tampón HNABSA5 Tween80 al 0,1%. Las concentraciones en plasma de péptido finales fueron 140 nM (EC90 de tipo salvaje) y 90 nM (EC50 de tipo salvaje). En una placa Immulon 2HB (transparente) de 96 pocillos, con fondo en U (ThermoElectron) se mezclaron 80 pl de plasma (+CTI Z994-5), 10 pl de dilución de péptido y 10 pl de APC-TF-PL-MIX o calibrador. La generación de trombina se inició mediante la dispensación de 20 pl de reactivo FluCa que contenía sustrato fluorogénico y CaCl2 tamponado con HEPES(100 mM) en cada pocillo. La intensidad de la fluorescencia se registró a 37° C usando el lector Fluoroskan Ascent® (filtros de excitación de 390 nm y emisión de 460 nm). Los parámetros de las curvas de generación de trombina resultantes se calcularon usando el software Thrombinoscope™ (Thrombino scope) y el calibrador de trombina para corregir los efectos de consumo del filtro interno y del sustrato (Hemker, Pathophysiol Haemost Thromb, 33: 415 (2003)).
Tanto para el ensayo de unión competitiva como para el ensayo CAT, los péptidos candidatos se caracterizaron por tener una actividad mejor, similar o menor que la del original. El análisis reveló sustituciones mejoradas en seis posiciones diferentes localizadas dentro de las tres posiciones N-terminales y las posiciones 13, 15 y 17. Se identificaron sustituciones toleradas (sustituciones que no afectaban negativamente a la actividad) en varias posiciones, incluyendo las posiciones 1-3, 11, 13, 15, 17, 18 y 20. Los péptidos seleccionados con sustituciones potenciadoras se volvieron a sintetizar (pureza >90%) y se procesaron en el ensayo ELISA IC50, cuyos resultados se proporcionan en la Tabla 2.
TABLA 2
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Muchos péptidos de las selecciones de presentación de ARNm y el análisis de sustitución mostraron una inhibición muy buena de la actividad del cofactor de Proteína S/APC en el sistema plasmático a baja concentración de péptidos. JBS2512, por ejemplo, demostró una muy buena afinidad de unión a la Proteína S y un valor de EC50 bajo en el ensayo CAT. JBS2572 tiene una sustitución His por Leu no homóloga en la posición 3 que aumenta la afinidad y la actividad en el ensayo CAT 1,6 veces en comparación con JBS2512. En el ensayo de unión competitiva (ELISA iC50), JBS2572 demostró una IC50 de 2,5±0,3 nM. JBS2572 mejoró la generación de trombina dependiente de PS/APC en plasma hemofílico.
Los péptidos también se caracterizaron en un ensayo TR-FRET basado en europio homogéneo competitivo (ensayo LANCE IC50) usando JBS0684 como trazador (es decir, competidor para la unión a Proteína S). Los siguientes reactivos se mezclaron entre sí en un pocillo Perkin-Elmer ProxiPlate MTP (la concentración indicada es la concentración final): Proteína S marcada con Eu (10 nM), estreptavidina marcada con Ulight™ (100 nM), trazador (JBS0684 (300 nM)) y péptido (titulado en pasos de dilución de tres veces). El volumen final fue de 50 pl/pocillo. La mezcla de la reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se registró la emisión de fluorescencia a 665 nm en un lector multimodo (SpectraMax® M5, Molecular Devices) usando los siguientes ajustes del instrumento: Ex 340 nm, Em 665 nm, retardo 50 pseg, integración 100 pseg, lecturas 100. La unión de los péptidos trazadores a la Proteína S soluble marcada con europio se detectó mediante estreptavidina marcada con un fluoróforo aceptor (ULight™). La inhibición de la unión del trazador a la Proteína S por un péptido no biotinilado da como resultado una disminución de TR-FRET entre la Proteína S marcada con Eu y la estreptavidina marcada con ULight™. Los valores de IC50 se obtuvieron a partir de curvas de titulación de péptidos a una concentración de trazador consistente usando regresión no lineal de las señales de emisión de fluorescencia a 665 nm. JBS2572 demostró una IC50 de 49±6 nM usando un lector Molecular Devices M5. Se tomaron mediciones adicionales usando un lector Tecan F500, que permite el uso de concentraciones más bajas de Proteína S (2 nM) y trazadores (60 nM); el valor de IC50 de lAnCE para JBS2572 estaba en el intervalo de 10 nM.
También se determinó la afinidad de la Proteína S mediante Biacore (Biacore 3000 o Biacore T200) usando Proteína S humana de longitud completa y GAS6 humana. Brevemente, se inmovilizaron 1000 RU de Proteína S o GAS6 en un chip CMS. Para sondear la cinética de los péptidos de unión de la Proteína S con la Proteína S, los péptidos se inyectaron a varias concentraciones en un tampón HBS que contenía CaCl2 3 mM y DMSO al 1% en la celda de flujo y se permitió que interactuaran con las proteínas inmovilizadas en el chip sensor. El chip pudo regenerarse con MgCl24 M en tampón HBS. Los sensogramas se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir para la determinación de ko n y ko f f y el cálculo de Kd . Los péptidos se probaron para determinar su especificidad para la Proteína S con estudios de unión de péptidos en el GAS6 anti-objetivo. JBS2572 demostró una Kd para la unión a la Proteína S de 6 nM (ko n = 2,48x1051/Ms, ko f f = 1,48x10-31/s) a 252 C. A 37° C, la Kd fue de 3,8x10-9 (4 nM) (ko n =1, 14 x 1061/Ms, ko f f : 4,31x10-31/s).
Los ejemplos 1 y 2 proporcionan métodos ejemplares para generar y caracterizar péptidos de unión a Proteína S (por ejemplo, péptidos inhibidores de Proteína S). Se identificaron cientos de péptidos que se unen a la Proteína S humana. El análisis de sustitución de un péptido ejemplar generó péptidos de unión a Proteína S adicionales y demostró que se toleraron las sustituciones dentro del péptido de unión a Proteína S (es decir, se mantuvo la afinidad por la Proteína S) y, en algunos casos, mejoró la afinidad. Muchos péptidos se unen a la Proteína S humana con una consistente de disociación o IC50 de <10 |uM. Los Ejemplos demuestran además que los péptidos de la invención inhiben la actividad del cofactor de la Proteína S en un sistema de ensayo de plasma con una EC50 de <10 |uM. Se demostró actividad in vitro en presencia de concentraciones fisiológicas de Proteína S.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra que los péptidos de la invención muestran una afinidad reducida por las proteínas que no son Proteína S ("anti-objetivos").
La Proteína S comprende dominios altamente homólogos a regiones de otras proteínas del sistema de coagulación que contienen dominios Gla (como, por ejemplo, GAS6 (la Proteína Codificada por el gen 6 específico de detención del crecimiento), Factor VII, Factor IX, Factor X, Proteína C, Proteína Z y protrombina), dominios similares a EGF (como, por ejemplo, GAS6 , Factor VII, Factor IX, Factor X, Proteína C, Proteína Z y trombomodulina) y dominios similares a laminina G (como GAS6 ). Estas otras proteínas del sistema de coagulación, por lo tanto, son anti-objetivos potenciales. Se usó GAS6 humana para determinar la unión anti-objetivo porque es la más similar a la Proteína S (42% de identidad, 57% de secuencia consenso).
Las interacciones con la GAS6 anti-objetivo se midieron mediante Biacore (resonancia de plasmones de superficie) (ver el Ejemplo 2). La señal máxima de la interacción de los péptidos con GAS6 humana fue mucho más baja que las señales obtenidas con la Proteína S como compañero de interacción. El análisis cinético de las señales de unión a GAS6 baja era propenso a errores, y los sensogramas se revisaron visualmente para estimar la unión anti-objetivo. JBS2572 no mostró unión específica a GAS6 a una concentración de 1 |uM. La afinidad de JBS2572 por el anti-objetivo fue por lo menos 10 veces menor (de hecho, por lo menos 150 veces menor) que la afinidad de los péptidos por la Proteína S humana. Los datos proporcionados por este ejemplo confirman que los péptidos descritos en la presente se unen específicamente a la Proteína S.
Ejemplo 4
Los péptidos con mayor afinidad por la Proteína S humana se obtuvieron de una biblioteca parcialmente aleatorizada basada en la secuencia de JBS2572 (SEQ ID NO: 62). La selección de aglutinantes de alta afinidad se logró mediante ensayos de presentación y cribado de ARNm usando métodos similares a los descritos en los Ejemplos 1 y 2. Las condiciones de selección aplicadas al grupo de péptidos dieron como resultado un aumento de las señales de unión a la Proteína S. Se secuenciaron grupos de péptidos enriquecidos de tres rondas de selección, lo que produjo las secuencias de aminoácidos de, por ejemplo, JBS3216-3223 (SEQ ID NO: 462-469) y JBS3231-3314 (SEQ ID NO: 477-560). Se modificaron químicamente varios péptidos del grupo de maduración por afinidad. JBS3319 se conjugó con una fracción de PEG de 40 kD para producir JBS3318 (SEQ ID NO: 564). Un tetrámero de monómeros de JBS3319 junto con un fracción de PEG de 10 kD de cuatro brazos produjo JBS3321 (SEQ ID NO: 567). JBS3179 (SEQ ID NO: 433) es un tetrámero de JBS3206 que comprende una fracción de PEG de 40 kD. JBS3322 (SEQ ID NO: 568) es un monómero de JBS3206 que comprende una fracción de PEG de 40 kD.
Se evaluó la afinidad de unión de la Proteína S para 18 péptidos representativos (JBS3216, JBS3218, JBS3221, JBS3223, JBS3232, JBS3235, JBS3236, JBS3258, JBS3260, JBS3263, JBS3274, JBS3281, JBS3283, JBS3284, JBS3296, JBS3297, JBS3306, y JBS3314) mediante ensayos Biacore y lAnCE IC50. La capacidad de los péptidos para inhibir la actividad de la Proteína S se determinó mediante un ensayo CAT y también se examinó la estabilidad del plasma.
Se mejoró la afinidad y la actividad de los 18 péptidos en comparación con el JBS2572 original. Los resultados demuestran que se toleran múltiples sustituciones dentro de la secuencia de aminoácidos de los péptidos descritos en la presente (es decir, no destruye la capacidad del péptido para unirse a la Proteína S). Por ejemplo, JBS3216, que comprende sustituciones en siete posiciones de aminoácidos en la secuencia de JBS2572 (posiciones 1-3, 13, 15, 17 y 20) y JBS2512, demostraron una mayor afinidad por la Proteína S (Kd = 0,2 nM) que el péptido original JBS2572 (KD = 4 nM). De hecho, los péptidos optimizados demostraron afinidades de pM (mejora de 20 veces) con una koff en el intervalo de 1x10-4 a 6x10-4 s-1. La actividad y la estabilidad se mejoraron hasta 1,5 veces. En la Tabla 4 se proporcionan resultados de Biacore ejemplares usando métodos similares a los descritos anteriormente. La estabilidad del plasma se determinó en plasma humano normal agrupado y plasma de ratón a 37° C; también se proporcionan resultados ejemplares en la Tabla 3. El análisis de estabilidad también reveló que, después de 24 horas de incubación en plasma humano, quedaba más del 80% de actividad de unión de JBS3318, JBS3179 y JBS3322, y ~50% de actividad de unión de JBS3216. También se determinó que JBS3179, JBS3318 y JBS3322 no interactuaban con GAS6 , un anti-objetivo (a 1 gM).
TABLA 3
Figure imgf000020_0001
La actividad inhibidora de los péptidos se analizó en el ensayo CAT (es decir, prueba de resistencia a APC basada en trombina) en plasma de tres individuos con hemofilia A grave. JBS3179, JBS3318 y JBS3322, por ejemplo, mejoraron la trombina dependiente de Proteína S/APC. generación en los plasmas con una EC50 inferior a 100 nM. JBS3179 demostró una EC50 de 6 nM en el ensayo CAT, y JBS3216 también mejoró eficazmente la coagulación en un ensayo CAT en plasma de pacientes con hemofilia A humana (EC50 = 85 nM). JBS3216 también mejoró la generación de trombina en varios mamíferos no humanos: mono cinomolgo, mono tití, cerdo, oveja, perro, conejo, rata y ratón.
JBS3179 también demostró una actividad in vivo beneficiosa. El péptido redujo de manera dependiente de la dosis el sangrado en un modelo de corte de cola de ratón con hemofilia cuando se administró con 25 U/kg de ADVATE, redujo significativamente el sangrado articular en un modelo de ratón de hemofilia A con hemartrosis cuando se coadministró con dosis subeficientes de FVIII y mejoró la generación de trombina ex vivo en un modelo de conejo de hemofilia inducida.
Ejemplo 5
Este ejemplo describe péptidos adicionales que se unen a la Proteína S y demuestra que la variabilidad dentro de las secuencias de aminoácidos de los péptidos descritos en la presente se tolera con respecto a la unión e inhibición de la Proteína S.
Se sintetizaron y evaluaron varios péptidos que tenían múltiples sustituciones en la secuencia de aminoácidos de JBS2572 usando los ensayos LANCE lC50 y CAT descritos anteriormente. Para los ensayos, el plasma normal combinado se suplementó con APC 3 nM y se activó con TF 6 pM y fosfolípidos 15 pM (DOPC/POPS 80/20). La APC madre se diluyó con TF-PL-MIX a 24 nM (concentración en plasma: 3 nM). En la Tabla 4 se proporcionan resultados ejemplares. El análisis se centró en las posiciones 1, 4, 5, 13, 15 y 17, y demostró que se toleran múltiples sustituciones dentro de la secuencia original y, en muchos casos, se aumenta la afinidad de unión y la actividad inhibidora en comparación con péptidos que tienen sustituciones simples dentro de la secuencia original de JBS2572.
TABLA 4
Figure imgf000021_0001
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra la capacidad de los péptidos descritos en la presente para interrumpir la unión de la Proteína S (PS) a C4BP. C4BP es una molécula similar a un pulpo que contiene siete cadenas a idénticas (MW 70 kDa) y una cadena p más pequeña (45 kDa). La Proteína S se une a la cadena p, y la formación del complejo de Proteína S con C4Bp anula la actividad del cofactor APC de la Proteína S. La consistente de disociación de la Proteína S y C4BP en presencia de iones calcio es de ~0,5 nM. Debido a esta alta afinidad, el nivel de PS libre corresponde a su exceso molar sobre C4BP que contiene la cadena p.
Para investigar el efecto de los péptidos descritos en la presente sobre los complejos PS/C4BP, se estableció un ensayo LANCE IC50 usando métodos similares a los descritos anteriormente. Se añadió JBS2572 o JBS3216 a un complejo C4BP/PS preformado. Los cambios en la concentración del complejo fueron seguidos por el registro de la señal de TR-FRET. Para ambos péptidos, se observó una disociación dependiente del tiempo y de la concentración del complejo C4BP/PS. La IC50 de JBS3216 fue de 0,3 nM y la IC50 de JBS2572 fue de 2 nM. La dependencia del tiempo de la reducción del complejo fue similar para ambos péptidos. Después de dos horas de incubación en presencia de JBS2572 o JBS3216 100 nM, el complejo C4BP/PS se redujo al 60% y 50%, respectivamente. Además, la unión de JBS2572 biotinilado a la Proteína S fue inhibida por C4BP en el ensayo LANCE IC50. Experimentos desplegables en los que JBS2697 se acopló a sefarosa de estreptavidina y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con (a) Proteína S (1,6 pmol) (b) C4BP (8,5 pmol) y (c) Proteína S (1,6 pmol) C4BP (8,5 pmol) respaldaron los resultados del ensayo LANCE IC50 modificado. JBS2697 interactuó con la Proteína S libre solo del experimento (a) con Proteína S sola y del experimento (c) con la mezcla de C4BP-Proteína S.
Estos descubrimientos demuestran que los péptidos descritos en la presente pueden reducir la fracción de complejo C4BP/PS preformado a una concentración nM de una manera dependiente del tiempo. La alteración de la interacción de C4BP/PS por los péptidos (y viceversa) puede derivarse de la inhibición competitiva o alostérica del complejo C4BP/PS. El sitio de unión de C4BP en la Proteína S se mapeó en los dominios G de laminina de la Proteína S con una Kd de 0,1-0,6 nM. Por tanto, los dominios de laminina G parecen estar implicados en la interacción entre los péptidos y la Proteína S. Los experimentos de mapeo del sitio de unión que usan proteólisis limitada respaldan la observación. La secuenciación N-terminal de fragmentos proteolíticos identificó una región protegida por péptidos dentro del dominio LG1 de la Proteína S, lo que sugiere fuertemente el dominio LG1 como región de unión al objetivo de los péptidos.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido que se une a e inhibe la actividad de la proteína S una secuencia de aminoácidos por lo menos un
60% idéntica a la secuencia de aminoácidos EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924).
2. El péptido de la reivindicación 1, en el que el residuo en la posición 4 de la secuencia de aminoácidos, numerada
de acuerdo con la SEQ ID NO: 2924, es V; el residuo en la posición 5 de la secuencia de aminoácidos, numerada de
acuerdo con la SEQ ID NO: 2924, es S; el residuo en la posición 6 de la secuencia de aminoácidos, numerada de acuerdo con la SEQ ID NO: 2924, es A, el residuo en la posición 7 de la secuencia de aminoácidos, numerada de acuerdo con la SEQ ID NO: 2924, es G; el residuo en la posición 8 de la secuencia de aminoácidos, numerada de acuerdo con la SEQ ID NO: 2924, es W; y el residuo en la posición 9 de la secuencia de aminoácidos, numerada de
acuerdo con la SEQ ID NO: 2924, es Y.
3. El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la secuencia de aminoácidos comprende por lo
menos un 70%, por lo menos un 75% de identidad, por lo menos un 80% de identidad, o por lo menos un 90%, o por
lo menos un 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos EYYVSAGW-YDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924).
4. El péptido de la reivindicación 3, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la secuencia de aminoácidos
EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEC ID NO: 2924).
5. El péptido de la reivindicación 1,
en el que el residuo en la posición 3 de la secuencia de aminoácidos, numerada de acuerdo con la SEQ ID NO:
2924, es A, E, F, G, H, I, K, L, N, P, R, T, V, W, y, o Y;
en el que el residuo en la posición 2 de la secuencia de aminoácidos, numerada de acuerdo con la SEQ ID NO:
2924, es A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, R, T, V, W, y, o Y; y
en el que el residuo en la posición 1 de la secuencia de aminoácidos, numerada de acuerdo con la SEQ ID NO:
2924, es A, D, E, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, p, Q, R, S, T, V, W o Y.
6. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el péptido se une a Proteína S
humana con una IC50 de menos de 25 nM , menos de 10 nM , menos de 5 nM , menos de 3 nM , o menos de 1 nM
en un ensayo LANCE competitivo usando un péptido que consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID
NO: 1 como un trazador.
7. El péptido de la reivindicación 1, que consiste de una secuencia de aminoácidos por lo menos un 60% idéntica a
EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924).
8. El péptido de la reivindicación 7, en el que la secuencia de aminoácidos consiste de por lo menos un 70%, por lo
menos un 75% de identidad, por lo menos un 80% de identidad, o por lo menos un 90%, o por lo menos un 95% de
identidad con la secuencia de aminoácidos EYYVSAGWYDYNTDTYYEFE (SEQ ID NO: 2924).
9. El péptido de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste de las SEQ ID NO: 1- 2916, 2920, y 2924.
10. El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el péptido se conjuga a una fracción de
polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano (HSA), un anticuerpo o fragmento del mismo, almidón de
hidroxietilo, un multímero que comprende prolina, alanina, serina, o una combinación de las mismas, un ácido graso
C12-C18, o ácido polisálico .
11. El péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde el péptido está conjugado o unido a una fracción
seleccionada del grupo que consiste de Bpa, Bpa-K(Bio)-C, C(Atf-Bio), C(Atf-LC-Bio), C(FeBABE), C(MalCy5),
C(NEM), C(PEG), K, K(Ac), K(Ttds), K(Ttds-yGlu), K(Glutar), K(Ttds-Mal), T, Ttds, o Ttds-K(Bio).
12. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un
portador farmacéuticamente aceptable .
13. Un péptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para su uso en medicina.
14. El péptido para el uso de la reivindicación 13, en donde el péptido es para su uso en el tratamiento de un
trastorno de la coagulación sanguínea.
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