ES2874149T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9 - Google Patents

Abstract

Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, en el que dicho ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una cadena sentido comprende una primera secuencia y una cadena antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es totalmente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y en el que dicho ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, inhibe la expresión de dicho gen PCSK9 en el que dicha parte del ARNm que codifica para PCSK9 consiste en la secuencia de las posiciones 408-426 del número de registro NM_174936.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n.° 60/799.458, presentada el 11 de mayo de 2006; la solicitud provisional estadounidense n.° 60/817.203, presentada el 27 de junio de 2006; la solicitud provisional estadounidense n.° 60/840.089, presentada el 25 de agosto de 2006; la solicitud provisional estadounidense n.° 60/829.914, presentada el 18 de octubre de 2006; y la solicitud provisional estadounidense n.° 60/901.134, presentada el 13 de febrero de 2007.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) y a su uso en la mediación de la interferencia por ARN para inhibir la expresión del gen PCSK9 y al uso del ARNbc para tratar procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de PCSK9, tales como hiperlipidemia.

Antecedentes de la invención

La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia de la subtilisina serina proteasa. Las otras ocho subtilisina proteasas de mamífero, PCSK1-PCSK8 (también denominadas PC1/3, PC2, furina, PC4, PC5/6, PACE4, PC7 y S1P/SKI-1) son proproteína convertasas que procesan una amplia variedad de proteínas en la ruta secretora y desempeñan funciones en diversos procesos biológicos (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol.

24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003) FASEB J. 17, 1215-1227 y Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748). Se ha propuesto que PCSK9 desempeña un papel en el metabolismo del colesterol. La expresión del ARNm de PCSK9 está regulada por disminución por la alimentación con colesterol en ratones (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), regulada por incremento por estatinas en células HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459) y regulada por incremento en ratones transgénicos de la proteína de unión a elementos reguladores de esterol (SREBP) (Horton, J. D., (2003) Proc. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032), similar a las enzimas biosintéticas de colesterol y al receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR). Además, se ha descubierto que las mutaciones de aminoácido de PCSK9 están asociadas a una forma de hipercolesterolemia autosómica dominante (Hchola3) (Abifadel, M., et al. (2003) Nat. Genet. 34, 154-156, Timms, K. M., (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422). PCSK9 también puede desempeñar un papel en la determinación de los niveles de colesterol LDL en la población general, ya que los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) se han asociado con los niveles de colesterol en una población japonesa (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).

Las hipercolesterolemias autosómicas dominantes (ADH) son enfermedades monogénicas en las que los pacientes presentan niveles elevados de colesterol total y LDL, xantomas tendinosos y aterosclerosis prematura (Rader, D. J., (2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803). La patogénesis de las ADH y de una forma recesiva, la hipercolesterolemia autosómica recesiva (ARH) (Cohen, J. C., (2003) Curr. Opin. Lipidol. 14, 121-127), se debe a defectos en la captación de LDL por parte del hígado. La ADH puede estar provocada por mutaciones de LDLR, que impiden la captación de LDL, o por mutaciones en la proteína de LDL, apolipoproteína B, que se une a LDLR. La ARH está provocada por mutaciones en la proteína ARH que son necesarias para la endocitosis del complejo LDLR-LDL a través de su interacción con clatrina. Por tanto, si las mutaciones de PCSK9 son causantes en las familias de Hchola3, parece probable que PCSK9 desempeñe un papel en la captación de LDL mediada por el receptor.

Los estudios de sobreexpresión apuntan a un papel de PCSK9 en el control de los niveles de LDLR y, por tanto, de la captación de LDL por parte del hígado (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). La sobreexpresión mediada por adenovirus de PCSK9 humano o de ratón durante 3 ó 4 días en ratones da lugar a niveles elevados de colesterol total y LDL; este efecto no se observa en animales con inactivación de LDLR (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., et al. (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865­ 48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). Además, la sobreexpresión de PCSK9 da lugar a una fuerte reducción de la proteína LDLR hepática, sin afectar a los niveles de ARNm de LDLR, a los niveles de la proteína SREBP o a la razón entre núcleo y citoplasma de la proteína SREBP. Estos resultados indican que PCSK9, o bien directa o bien indirectamente, reduce los niveles de proteína LDLR mediante un mecanismo postranscripcional.

Se han diseñado mutaciones de pérdida de función en PCSK9 en modelos de ratón (Rashid et al., (2005) PNAS, 102, 5374-5379., y se han identificado en individuos humanos Cohen et al., (2005), Nature Genetics., 37, 161-165. En ambos casos, la pérdida de la función de PCSK9 conduce a la reducción del colesterol total y del colesterol LDLc. En un estudio retrospectivo de resultados a lo largo de 15 años, se demostró que la pérdida de una copia de PCSK9 reduce el LDLc y conduce a una mayor protección riesgo-beneficio de desarrollar cardiopatías cardiovasculares (Cohen et. al., 2006 N. Engl. J. Med., 354., 1264-1272). Evidentemente, las evidencias obtenidas hasta la fecha indican que la reducción de los niveles de PCSK9 reducirá el LDLc.

Recientemente, se ha demostrado que las moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) bloquean la expresión génica en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia por ARN (iARN). El documento WO 99/32619 (Fire et al.) da a conocer el uso de un ARNbc de al menos 25 nucleótidos de longitud para inhibir la expresión génica en C. elegans. También se ha demostrado que el ARNbc degrada el ARN diana en otros organismos, incluyendo plantas (véase, por ejemplo, el documento WO 99/53050, Waterhouse et al.; y el documento WO 99/61631, Heifetz et al.), Drosophila (véase, por ejemplo, Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200) y mamíferos (véase el documento WO 00/44895, Limmer; y el documento DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.). Este mecanismo natural se ha convertido ahora en el centro de atención para el desarrollo de una nueva clase de agentes farmacéuticos para el tratamiento de trastornos provocados por la regulación aberrante o no deseada de un gen.

A pesar de los importantes avances en el campo de iARN y de los avances en el tratamiento de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, sigue siendo necesario contar con agentes que puedan inhibir la expresión del gen PCSK9 y que puedan tratar enfermedades asociadas a la expresión del gen PCSK9, tales como hiperlipidemia.

Sumario de la invención

La invención proporciona una solución al problema del tratamiento de enfermedades que pueden modularse mediante regulación por disminución de la proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) usando ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para silenciar la expresión de PCSK9.

La invención proporciona ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), así como composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula o un mamífero usando tal ARNbc. La invención también proporciona composiciones y métodos para tratar estados patológicos que pueden modularse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, tales como hiperlipidemia. El ARNbc de la invención comprende una cadena de ARN (la cadena antisentido) que tiene una región de menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y que es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm del gen PCSK9.

En una realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen PCSK9. El ARNbc comprende al menos dos secuencias complementarias entre sí. El ARNbc comprende una cadena sentido que comprende una primera secuencia y una cadena antisentido que comprende una segunda secuencia. La cadena antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9 y la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud. El ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa PCSK9, inhibe la expresión del gen PCSK9 en al menos un 40%.

Por ejemplo, las moléculas de ARNbc de la invención pueden estar compuestas por una primera secuencia del ARNbc que se selecciona del grupo que consiste en las secuencias sentido de la tabla 1 y la tabla 2 la segunda secuencia se selecciona del grupo que consiste en las secuencias antisentido de las tablas 1 y la tabla 2. Las moléculas de ARNbc de la invención pueden estar compuestas por nucleótidos que se producen de manera natural o pueden estar compuestas por al menos un nucleótido modificado, tal como un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato y un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. Alternativamente, el nucleótido modificado puede elegirse del grupo de: un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxilo, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural. Generalmente, tal secuencia modificada se basará en una primera secuencia de dicho ARNbc seleccionada del grupo que consiste en las secuencias sentido de las tablas 1 y la tabla 2 y una segunda secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias antisentido de las tablas 1 y la tabla 2.

En otra realización, la invención proporciona una célula que comprende uno de los ARNbc de la invención. La célula es generalmente una célula de mamífero, tal como una célula humana.

En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un organismo, generalmente un sujeto humano, que comprende uno o más de los ARNbc de la invención y un portador o vehículo de administración farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la invención proporciona un método para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, que comprende las siguientes etapas:

(a) introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), en el que el ARNbc comprende al menos dos secuencias complementarias entre sí. El ARNbc comprende una cadena sentido que comprende una primera secuencia y una cadena antisentido que comprende una segunda secuencia. La cadena antisentido comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9 y en la que la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y en la que el ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa PCSK9, inhibe la expresión del gen PCSK9 en al menos un 40%; y

(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen PCSK9, inhibiendo así la expresión del gen PCSK9 en la célula.

En otra realización, la invención proporciona métodos de tratamiento, prevención o gestión de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, por ejemplo, hiperlipidemia, que comprenden administrar a un paciente que necesita tal tratamiento, prevención o gestión una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de uno o más de los ARNbc de la invención.

En otra realización, la invención proporciona vectores para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, que comprenden una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una cadena de uno de los ARNbc de la invención.

En otra realización, la invención proporciona una célula que comprende un vector para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula. El vector comprende una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una cadena de uno de los ARNbc de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la estructura del lípido ND-98.

La figura 2 muestra los resultados del examen in vivo de 16 ARNip de PCSK9 específicos para ratones (AL-DP-9327 hasta AL-DP-9342) dirigidos contra diferentes regiones de ORF del ARNm de PCSK9 (con el primer nucleótido correspondiente a la posición de ORF indicada en el gráfico) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). La razón de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAPDH en los lisados hepáticos se promedió en cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo de control tratado con PBS o con un grupo de control tratado con un ARNip no relacionado (factor de coagulación sanguínea VII).

La figura 3 muestra los resultados del examen in vivo de 16 ARNip de PCSK9 de reacción cruzada de ser humano/ratón/rata (AL-DP-9311 hasta AL-DP-9326) dirigidos contra diferentes regiones de ORF del ARNm de PCSK9 (con el primer nucleótido correspondiente a la posición de ORF indicada en el gráfico) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). La razón de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAPDH en los lisados hepáticos se promedió en cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo de control tratado con PBS o con un grupo de control tratado con un ARNip no relacionado (factor de coagulación sanguínea VII).

El silenciamiento del ARNm de PCSK9 dio lugar a la reducción de los niveles de colesterol sérico total.

Los ARNip más eficaces en cuanto a inactivación del mensaje de PSCK9 mostraron el efecto de reducción de colesterol más pronunciado (aproximadamente el 20-30%).

La figura 4 muestra los resultados del examen in vivo de 16 ARNip de PCSK9 específicos para ratones (AL-DP-9327 hasta AL-DP-9342) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Los niveles de colesterol sérico total se promediaron en cada grupo de tratamiento y se compararon con un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNip no relacionado (factor de coagulación sanguínea VII).

La figura 5 muestra los resultados del examen in vivo de 16 ARNip de PCSK9 de reacción cruzada de ser humano/ratón/rata (AL-DP-9311 hasta AL-DP-9326) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Los niveles de colesterol sérico total se promediaron en cada grupo de tratamiento y se compararon con un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNip no relacionado (factor de coagulación sanguínea VII).

La figura 6 muestra una comparación de los resultados in vitro e in vivo del silenciamiento de PCSK9.

La figura 7A y la figura 7B muestran los resultados in vitro del silenciamiento de PCSK9 usando hepatocitos primarios de mono.

La figura 8 muestra la actividad in vivo de los ARNip formulados con LNP-01 frente a pcsk-9.

La figura 9 muestra la actividad in vivo de las moléculas parentales 9314 y 10792 químicamente modificadas formuladas con LNP-01 en diferentes momentos. Las versiones claramente modificadas de 10792 muestran una actividad de silenciamiento in vivo.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona una solución al problema del tratamiento de enfermedades que pueden modularse mediante regulación por disminución del gen PCSK9, usando ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para silenciar el gen PCSK9, proporcionando así un tratamiento para enfermedades tales como hiperlipidemia.

La invención proporciona ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), así como composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula o un mamífero usando el ARNbc. La invención también proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de estados patológicos y enfermedades que pueden modularse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9. El ARNbc dirige la degradación específica de la secuencia del ARNm a través de un proceso conocido como interferencia por ARN (iARN).

El ARNbc de la invención comprende una cadena de ARN (la cadena antisentido) que tiene una región de menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y que es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm del gen PCSK9. El uso de estos ARNbc permite la degradación dirigida de un ARNm que está involucrado en el transporte de sodio. Usando ensayos celulares y animales, los presentes inventores han demostrado que dosificaciones muy bajas de estos ARNbc pueden mediar específica y eficientemente la iARN, dando como resultado una inhibición significativa de la expresión del gen PCSK9. Por tanto, los métodos y las composiciones de la invención que comprenden estos ARNbc son útiles para tratar procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de PCSK9, tales como en el tratamiento de la hiperlipidemia.

La siguiente descripción detallada revela cómo elaborar y usar el ARNbc y las composiciones que contienen ARNbc para inhibir la expresión del gen PCSK9 diana, así como composiciones y métodos para tratar enfermedades que pueden modularse mediante regulación por disminución de la expresión de PCSK9, tales como hiperlipidemia. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden un ARNbc que tiene una cadena antisentido que comprende una región de complementariedad de menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y que es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARN del gen PCSK9, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, determinados aspectos de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el ARNbc de la invención junto con un portador farmacéuticamente aceptable, métodos de uso de las composiciones para inhibir la expresión del gen PCSK9 y métodos de uso de las composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades que pueden modularse mediante regulación por disminución de la expresión de PCSK9.

I. Definiciones

Por comodidad, a continuación se indica el significado de determinados términos y expresiones usados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas. Si hay una discrepancia aparente entre el uso de un término en otras partes de esta memoria descriptiva y su definición proporcionada en esta sección, prevalecerá la definición en esta sección.

“G”, “C”, “A” y “U” representan generalmente un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término “ribonucleótido” o “nucleótido” también puede referirse a un nucleótido modificado, tal como se detalla más adelante, o a un resto de reemplazo sustituto. El experto es consciente de que la guanina, la citosina, la adenina y el uracilo pueden reemplazarse por otras moléculas sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que porta tal molécula de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que contenga inosina como base puede experimentar apareamiento de bases con nucleótidos que contengan adenina, citosina o uracilo. Por tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina pueden reemplazarse en las secuencias de nucleótidos de la invención por un nucleótido que contenga, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden tales restos de reemplazo son realizaciones de la invención.

Tal como se usa en el presente documento, “PCSK9” se refiere a la proteína o al gen de la proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (también conocida como FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1). Las secuencias de ARNm de PCSK9 se proporcionan como humana: NM_174936; de ratón: NM_153565 y de rata: NM_199253.

Tal como se usa en el presente documento, “secuencia diana” se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción del gen PCSK9, incluyendo ARNm que es un producto del procesamiento del ARN de un producto de la transcripción primaria.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena que comprende una secuencia” se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe por la secuencia referida usando la nomenclatura convencional de nucleótidos.

Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique lo contrario, el término “complementario”, cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar una estructura dúplex en determinadas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, tal como entenderá el experto. Tales condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones rigurosas, en las que las condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6,4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas, seguido de lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, tales como condiciones fisiológicamente relevantes que pueden encontrarse dentro de un organismo. El experto podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiado para una prueba de complementariedad de dos secuencias según la aplicación final de los nucleótidos hibridados.

Esto incluye el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos con el oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos en toda la longitud de la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. Tales secuencias pueden denominarse en el presente documento “totalmente complementarias” entre sí. Sin embargo, cuando una primera secuencia se denomina en el presente documento “sustancialmente complementaria” con una segunda secuencia, las dos secuencias pueden ser totalmente complementarias o pueden formar uno o más, pero generalmente no más de 4, 3 ó 2 pares de bases de apareamiento erróneo tras la hibridación, conservando la capacidad para hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos están diseñados para formar, tras la hibridación, una o más proyecciones monocatenarias, tales proyecciones no se considerarán como apareamientos erróneos con la determinación de la complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en el que el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es totalmente complementaria al oligonucleótido más corto, puede seguir denominándose “totalmente complementaria” a los efectos de la invención.

Las secuencias “complementarias”, tal como se usan en el presente documento, también pueden incluir, o estar formadas en su totalidad por, pares de bases que no sean de Watson-Crick y/o pares de bases formados por nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridarse.

Los términos “complementario”, “totalmente complementario” y “sustancialmente complementario” pueden usarse en el presente documento con respecto al apareamiento de bases entre la cadena sentido y la cadena antisentido de un ARNbc, o entre la cadena antisentido de un ARNbc y una secuencia diana, tal como se entenderá a partir del contexto de su uso.

Tal como se usa en el presente documento, un polinucleótido que es “sustancialmente complementario a al menos una parte de” un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, que codifica para PCSK9). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de PCSK9 si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica para PCSK9.

El término “ARN bicatenario” o “ARNbc”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura dúplex que comprende dos cadenas de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, tal como se definió anteriormente. Las dos cadenas que forman la estructura dúplex pueden ser diferentes porciones de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN independientes. Cuando se trata de moléculas de ARN independientes, tales ARNbc se denominan a menudo en la bibliografía ARNip (“ARN de interferencia corto”). Cuando las dos cadenas forman parte de una molécula más grande y, por tanto, están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva formando la estructura dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina “bucle de horquilla”, “ARN de horquilla corta” o “ARNhc”. Cuando las dos cadenas están conectadas covalentemente por medios distintos a una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva formando la estructura dúplex, la estructura de conexión se denomina “ligador”. Las cadenas de ARN pueden tener el mismo o diferente número de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos de la cadena más corta del ARNbc menos las proyecciones presentes en el dúplex. Además de la estructura dúplex, un ARNbc puede incluir una o más proyecciones de nucleótidos. Además, tal como se usa en esta memoria descriptiva, el “ARNbc” puede incluir modificaciones químicas para ribonucleótidos, incluyendo modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos e incluyendo todos los tipos de modificaciones dadas a conocer en el presente documento o conocidas en la técnica. Cualquiera de tales modificaciones, tal como se usa en una molécula de tipo ARNip, se engloba en el “ARNbc” para los fines de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, una “proyección de nucleótidos” se refiere al nucleótido o a los nucleótidos no apareado(s) que sobresale(n) de la estructura dúplex de un ARNbc cuando el extremo 3' de una cadena del ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa. “Romo” o “extremo romo” significa que no hay nucleótidos desapareados en ese extremo del ARNbc, es decir, que no hay proyección de nucleótidos. Un ARNbc con “extremos romos” es un ARNbc de bicatenario en toda su longitud, es decir, no hay ninguna proyección de nucleótidos que sobresalga en ningún extremo de la molécula. Para mayor claridad, las caperuzas químicas o los elementos químicos no nucleotídicos conjugados con el extremo 3' o 5' de un ARNip no se tienen en cuenta a la hora de determinar si un ARNip tiene una proyección o tiene extremos romos.

El término “cadena antisentido” se refiere a la cadena de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia diana. Tal como se usa en el presente documento, el término “región de complementariedad” se refiere a la región de la cadena antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo, una secuencia diana, tal como se define en el presente documento. Cuando la región de complementariedad no es totalmente complementaria a la secuencia diana, los apareamientos erróneos son más tolerados en las regiones terminales y, si están presentes, se encuentran generalmente en una región o regiones terminal(es), por ejemplo, dentro de los 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos del extremo 5' y/o 3'.

El término “cadena sentido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la cadena de un ARNbc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la cadena antisentido.

“Introducir en una célula”, cuando se refiere a un ARNbc, significa facilitar la captación o absorción en la célula, tal como lo entienden los expertos en la técnica. La absorción o captación de ARNbc puede producirse mediante procesos celulares activos o difusivos sin ayuda, o mediante agentes o dispositivos auxiliares. El significado de este término no se limita a las células in vitro; un ARNbc también puede “introducirse en una célula”, en el que la célula forma parte de un organismo vivo. En tal caso, la introducción en la célula incluirá la administración al organismo. Por ejemplo, para la administración in vivo, el ARNbc puede inyectarse en un sitio tisular o administrarse sistémicamente. La introducción in vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica, tales como electroporación y lipofección.

Los términos “silenciar” e “inhibir la expresión de”, en la medida en que se refieren al gen PCSK9, se refieren en el presente documento a la supresión, al menos parcial, de la expresión del gen PCSK9 tal como se manifiesta mediante una reducción de la cantidad de ARNm transcrito a partir del gen PCSK9 que puede aislarse de una primera célula o un primer grupo de células en la(s) que se transcribe el gen PCSK9 y se ha(n) tratado de manera que se inhibe la expresión del gen PCSK9, en comparación con una segunda célula o un segundo grupo de células sustancialmente idéntica(s) a la primera célula o el primer grupo de células pero que no se ha(n) tratado de esta manera (células de control). El grado de inhibición suele expresarse en cuanto a

{[(ARNm en las células de control) -(ARNm en las células tratadas)]/(ARNm en las células de control)}x100%

Alternativamente, el grado de inhibición puede darse en cuanto a una reducción de un parámetro que esté funcionalmente unido a la transcripción del gen PCSK9, por ejemplo, la cantidad de proteína codificada por el gen PCSK9 que es secretada por una célula, o el número de células que muestran un determinado fenotipo, por ejemplo, apoptosis. En principio, el silenciamiento del gen PCSK9 puede determinarse en cualquier célula que exprese la diana, o bien de manera constitutiva o bien mediante ingeniería genómica, y mediante cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se necesita una referencia para determinar si un ARNbc dado inhibe la expresión del gen PCSK9 en un grado determinado y, por tanto, se engloba por la presente invención, el ensayo proporcionado en los ejemplos siguientes servirá como tal referencia.

Por ejemplo, en determinados casos, la expresión del gen PCSK9 se suprime en al menos un 20%, un 25%, un 35% o un 50% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. En algunas realizaciones, el gen PCSK9 se suprime en al menos un 60%, un 70% o un 80% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. En algunas realizaciones, el gen PCSK9 se suprime en al menos un 85%, un 90% o un 95% mediante la administración del oligonucleótido bicatenario de la invención. Las tablas 1 y 2 proporcionan una amplia gama de valores de inhibición de la expresión obtenidos en un ensayo in vitro usando diversas moléculas de ARNbc de PCSK9 a diversas concentraciones.

Tal como se usa en el presente documento en el contexto de la expresión de PCSK9, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares se refieren al alivio o a la mitigación de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución del gen PCSK9. En el contexto de la presente invención, en la medida en que se refiere a cualquiera de los otros estados que se mencionan a continuación en el presente documento (distintos de los procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución del gen PCSK9), los términos “tratar”, “tratamiento” y similares se refieren al alivio o a la mitigación de al menos un síntoma asociado a tal estado, o a la ralentización o inversión de la progresión de tal estado. Por ejemplo, en el contexto de la hiperlipidemia, el tratamiento implicará una disminución de los niveles séricos de lípidos.

Tal como se usan en el presente documento, las expresiones “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, la prevención o la gestión de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución del gen PCSK9 o un síntoma manifiesto de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución del gen PCSK9. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz puede determinarla fácilmente el médico habitual, y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución del gen PCSK9, los antecedentes y la edad del paciente, la etapa de los procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9 y la administración de otros procesos antipatológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9.

Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un ARNbc y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “cantidad farmacológicamente eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de un ARN eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo previsto. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera eficaz cuando hay al menos una reducción del 25% en un parámetro medible asociado a una enfermedad o un trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o ese trastorno es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reducción del 25% en ese parámetro.

El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos, y se describen con más detalle a continuación. El término excluye específicamente un medio de cultivo celular.

Tal como se usa en el presente documento, una “célula transformada” es una célula en la que se ha introducido un vector a partir del cual puede expresarse una molécula de ARNbc.

II. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc)

En una realización, la invención proporciona moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula o un mamífero, en las que el ARNbc comprende una cadena antisentido que comprende una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión del gen PCSK9 y en las que la región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud, generalmente de 19-24 nucleótidos de longitud, y en las que dicho ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa dicho gen PCSK9, inhibe la expresión de dicho gen PCSK9 en al menos un 40%. El ARNbc comprende dos cadenas de ARN que son lo suficientemente complementarias como para hibridarse y formar una estructura dúplex. Una cadena del ARNbc (la cadena antisentido) comprende una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria y, en general, totalmente complementaria, a una secuencia diana, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión del gen PCSK9, la otra cadena (la cadena sentido) comprende una región que es complementaria a la cadena antisentido, de tal manera que las dos cadenas se hibridan y forman una estructura dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Generalmente, la estructura dúplex tiene entre 15 y 30, más generalmente entre 18 y 25, aún más generalmente entre 19 y 24 y lo más generalmente entre 19 y 21 pares de bases de longitud. Del mismo modo, la región de complementariedad con la secuencia diana tiene entre 15 y 30, más generalmente entre 18 y 25, aún más generalmente entre 19 y 24 y lo más generalmente entre 19 y 21 nucleótidos de longitud. El ARNbc de la invención puede comprender además una o más proyecciones de nucleótidos monocatenarias. El ARNbc puede sintetizarse mediante métodos convencionales conocidos en la técnica, tal como se comenta más adelante, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tales como los disponibles comercialmente de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En una realización preferida, el gen PCSK9 es el gen PCSK9 humano. En realizaciones específicas, la cadena antisentido del ARNbc comprende una cadena seleccionada de las secuencias sentido de las tablas 1 y 2 y una segunda secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias antisentido de las tablas 1 y 2. Los agentes antisentido alternativos que se dirigen a otra parte de la secuencia diana proporcionada en las tablas 1 y 2 pueden determinarse fácilmente usando la secuencia diana y la secuencia de PCSK9 flanqueante.

En realizaciones adicionales, el ARNbc comprende al menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de los grupos de secuencias proporcionados en las tablas 1 y 2. En otras realizaciones, el ARNbc comprende al menos dos secuencias seleccionadas de este grupo, en el que una de las al menos dos secuencias es complementaria a otra de las al menos dos secuencias, y una de las al menos dos secuencias es sustancialmente complementaria a una secuencia de un ARNm generado en la expresión del gen PCSK9. Generalmente, el ARNbc comprende dos oligonucleótidos, en el que un oligonucleótido se describe como la cadena sentido en las tablas 1 y 2 y el segundo oligonucleótido se describe como la cadena antisentido en las tablas 1 y 2.

El experto sabe que los ARNbc que comprenden una estructura dúplex de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares de bases han sido aclamados como particularmente eficaces para inducir interferencia por ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han encontrado que ARNbc más cortos o más largos también pueden ser eficaces. En las realizaciones descritas anteriormente, en virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótidos proporcionadas en las tablas 1 y 2, los ARNbc de la invención pueden comprender al menos una cadena de una longitud mínima de 21 nt. Puede esperarse razonablemente que los ARNbc más cortos que comprenden una de las secuencias de las tablas 1 y 2 menos sólo unos pocos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser igualmente eficaces en comparación con los ARNbc descritos anteriormente. Por tanto, la invención contempla los ARNbc que comprenden una secuencia parcial de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de las tablas 1 y 2 y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un ensayo FACS tal como se describe en el presente documento en no más del 5, el 10, el 15, el 20, el 25 o el 30% de inhibición con respecto a un ARNbc que comprende la secuencia completa. Otros ARNbc que se escinden dentro de la secuencia diana proporcionada en las tablas 1 y 2 pueden elaborarse fácilmente usando la secuencia de PCSK9 y la secuencia diana proporcionada.

Además, los agentes de iARN proporcionados en las tablas 1 y 2 identifican un sitio en el ARNm de PCSK9 que es susceptible a la escisión basada en iARN. Como tal, la presente invención incluye además agentes de iARN que se dirigen dentro de la secuencia seleccionada como diana por uno de los agentes de la presente invención. Tal como se usa en el presente documento, se dice que un segundo agente de iARN se dirige dentro de la secuencia de un primer agente de iARN si el segundo agente de iARN escinde el mensaje en cualquier lugar dentro del ARNm que es complementario a la cadena antisentido del primer agente de iARN. Un segundo agente de este tipo consistirá generalmente en al menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1 y 2 acopladas a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en el gen PCSK9. Por ejemplo, los últimos 15 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (menos las secuencias de AA añadidas) combinados con los siguientes 6 nucleótidos del gen PCSK9 diana producen un agente monocatenario de 21 nucleótidos que se basa en una de las secuencias proporcionadas en las tablas 1 y 2.

El ARNbc de la invención puede contener uno o más apareamientos erróneos con la secuencia diana. En una realización preferida, el ARNbc de la invención no contiene más de 3 apareamientos erróneos. Si la cadena antisentido del ARNbc contiene apareamientos erróneos con una secuencia diana, es preferible que el área de apareamiento erróneo no esté situada en el centro de la región de complementariedad. Si la cadena antisentido del ARNbc contiene apareamientos erróneos con la secuencia diana, es preferible que el apareamiento erróneo se restrinja a 5 nucleótidos de cualquier extremo, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 ó 1 nucleótido del extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una cadena de ARNbc de 23 nucleótidos que es complementaria a una región del gen PCSK9, el ARNbc generalmente no contiene ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos en la invención pueden usarse para determinar si un ARNbc que contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana es eficaz para inhibir la expresión del gen PCSK9. La consideración de la eficacia de los ARNbc con apareamientos erróneos en la inhibición de la expresión del gen PCSK9 es importante, especialmente si se sabe que la región de complementariedad particular en el gen PCSK9 tiene una variación de secuencia polimórfica dentro de la población.

En una realización, al menos un extremo del ARNbc tiene una proyección de nucleótidos monocatenaria de 1 a 4, generalmente de 1 ó 2 nucleótidos. Los ARNbc que tienen al menos una proyección de nucleótidos tienen propiedades inhibidoras inesperadamente superiores a las de sus homólogos con extremos romos. Además, los presentes inventores han descubierto que la presencia de una sola proyección de nucleótidos refuerza la actividad de interferencia del ARNbc, sin afectar a su estabilidad general. El ARNbc que tiene una sola proyección ha demostrado ser particularmente estable y eficaz in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo celular, sangre y suero. Generalmente, la proyección monocatenaria se sitúa en el extremo 3'-terminal de la cadena antisentido o, alternativamente, en el extremo 3'-terminal de la cadena sentido. El ARNbc también puede tener un extremo romo, generalmente situado en el extremo 5' de la cadena antisentido. Tales ARNbc tienen estabilidad y actividad inhibidora mejoradas, permitiendo así la administración a dosificaciones bajas, es decir, menos de 5 mg/kg de peso corporal del receptor al día. Generalmente, la cadena antisentido del ARNbc tiene una proyección de nucleótidos en el extremo 3', y el extremo 5' es romo. En otra realización, uno o más de los nucleótidos de la proyección se reemplazan por un tiofosfato nucleosídico.

En aún otra realización, el ARNbc se modifica químicamente para potenciar la estabilidad. Los ácidos nucleicos de la invención pueden sintetizarse y/o modificarse mediante métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en “Current protocols in nucleic acid chemistry”, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.Uu . Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a, modificaciones en 2', modificaciones en otros sitios del azúcar o de la base de un oligonucleótido, introducción de bases no naturales en la cadena del oligonucleótido, unión covalente a un ligando o a un resto químico y reemplazo de los enlaces fosfato internucleotídicos por enlaces alternativos tales como tiofosfatos. Puede emplearse más de una de estas modificaciones.

La unión química de las dos cadenas independientes de ARNbc puede lograrse mediante una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo, introduciendo enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrófobas, interacciones de Van der Waals o de apilamiento; mediante la coordinación de iones metálicos o mediante el uso de análogos de purina. Generalmente, los grupos químicos que pueden usarse para modificar el ARNbc incluyen, sin limitación, azul de metileno; grupos bifuncionales, generalmente bis-(2-cloroetil)amina; N-acetil-N'-(pglioxilbenzoil)cistamina; 4-tiouracilo; y psoraleno. En una realización, el ligador es un ligador de hexa-etilenglicol. En este caso, los ARNbc se producen mediante síntesis en fase sólida y el ligador de hexa-etilenglicol se incorpora según métodos convencionales (por ejemplo, Williams, D.J., y K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670). En una realización particular, el extremo 5' de la cadena antisentido y el extremo 3' de la cadena sentido están unidos químicamente mediante un ligador de hexaetilenglicol. En otra realización, al menos un nucleótido del ARNbc comprende un grupo fosforotioato o fosforoditioato. El enlace químico en los extremos del ARNbc se forma generalmente mediante enlaces de triple hélice. Las tablas 1 y 2 proporcionan ejemplos de agentes de iARN modificados de la invención.

En aún otra realización, los nucleótidos en una o ambas cadenas sencillas pueden modificarse para evitar o inhibir las actividades de degradación de las enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, determinadas nucleasas. Las técnicas para inhibir la actividad de degradación de las enzimas celulares contra los ácidos nucleicos se conocen en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones de 2'-amino, modificaciones de azúcar 2'-amino, modificaciones de azúcar 2'-F, modificaciones de azúcar 2'-alquilo, modificaciones de la estructura principal sin carga, modificaciones de morfolino, modificaciones de 2'-O-metilo y fosforamidato (véase, por ejemplo, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). Por tanto, al menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos de un ARNbc se reemplaza por un grupo químico, generalmente por un grupo 2'-amino o 2'-metilo. Además, al menos un nucleótido puede modificarse para formar un nucleótido bloqueado. Tal nucleótido bloqueado contiene un puente de metileno que conecta el 2'-oxígeno de la ribosa con el 4'-carbono de la ribosa. Los oligonucleótidos que contienen el nucleótido bloqueado se describen en Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) y Obika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404). La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad por las secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fusión en varios grados (Braasch, D.A. y D.R.

Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).

La conjugación de un ligando con un ARNbc puede potenciar su absorción celular, así como su direccionamiento a un tejido particular o su captación por tipos específicos de células, tales como células hepáticas. En determinados casos, se conjuga un ligando hidrófobo con el ARNbc para facilitar la permeación directa de la membrana celular y/o la captación a través de las células hepáticas. Alternativamente, el ligando conjugado con el ARNbc es un sustrato para la endocitosis mediada por el receptor. Estos enfoques se han usado para facilitar la permeación celular de oligonucleótidos antisentido, así como de agentes de ARNbc. Por ejemplo, se ha conjugado el colesterol con diversos oligonucleótidos antisentido, dando lugar a compuestos que son sustancialmente más activos en comparación con sus análogos no conjugados. Véase M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103. Otros compuestos lipófilos que se han conjugado con oligonucleótidos incluyen ácido 1-pirenobutírico, 1,3-bis-O-(hexadecil)glicerol y mentol. Un ejemplo de ligando para la endocitosis mediada por el receptor es el ácido fólico. El ácido fólico entra en la célula mediante endocitosis mediada por receptores de folato. Los compuestos de ARNbc que portan ácido fólico se transportarían eficientemente a la célula a través de la endocitosis mediada por receptores de folato. Li y colaboradores informan de que la unión de ácido fólico al extremo 3' de un oligonucleótido dio lugar a un aumento de 8 veces de la captación celular del oligonucleótido. Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540. Otros ligandos que se han conjugado con oligonucleótidos incluyen polietilenglicoles, grupos de hidratos de carbono, agentes de reticulación, conjugados de porfirina, péptidos de administración y lípidos tales como colesterol.

En determinados casos, la conjugación de un ligando catiónico con los oligonucleótidos da como resultado una resistencia mejorada a las nucleasas. Ejemplos representativos de ligandos catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio. Curiosamente, se ha informado de que los oligonucleótidos antisentido conservan su alta afinidad de unión al ARNm cuando el ligando catiónico se dispersa por todo el oligonucleótido. Véase M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 y sus referencias.

El ARNbc conjugado con ligando de la invención puede sintetizarse mediante el uso de un ARNbc que porta una funcionalidad reactiva colgante, tal como la derivada de la unión de una molécula de unión al ARNbc. Este oligonucleótido reactivo puede reaccionar directamente con ligandos comercialmente disponibles, con ligandos sintetizados que portan una variedad de grupos protectores o con ligandos que tienen una molécula de unión unida a los mismos. Los métodos de la invención facilitan la síntesis de ARNbc conjugados con ligandos mediante el uso, en algunas realizaciones preferidas, de monómeros de nucleósidos que se han conjugado adecuadamente con ligandos y que, además, pueden estar unidos a un material de soporte sólido. Tales conjugados ligando-nucleósido, opcionalmente unidos a un material de soporte sólido, se preparan según algunas realizaciones preferidas de los métodos de la invención mediante la reacción de un ligando de unión al suero seleccionado con un resto de unión situado en la posición 5' de un nucleósido u oligonucleótido. En determinados casos, un ARNbc que porta un ligando aralquilo unido al extremo 3' del ARNbc se prepara, en primer lugar, uniendo covalentemente un bloque de construcción monomérico a un soporte de vidrio de tamaño de poro controlado mediante un grupo aminoalquilo de cadena larga. A continuación, los nucleótidos se unen mediante técnicas de síntesis en fase sólida convencionales al bloque de construcción monomérico unido al soporte sólido. El bloque de construcción monomérico puede ser un nucleósido u otro compuesto orgánico compatible con la síntesis en fase sólida.

El ARNbc usado en los conjugados de la invención puede elaborarse de manera conveniente y rutinaria mediante la bien conocida técnica de síntesis en fase sólida. El equipo para tales síntesis lo comercializan varios proveedores, incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Adicional o alternativamente, puede emplearse cualquier otro medio para tal síntesis conocido en la técnica . También es conocido el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como fosforotioatos y derivados alquilados.

Las enseñanzas relativas a la síntesis de oligonucleótidos modificados particulares pueden encontrarse en las siguientes patentes estadounidenses: patentes estadounidenses n.os 5.138.045 y 5.218.105, que se refieren a oligonucleótidos conjugados con poliaminas; patente estadounidense n.° 5.212.295, que se refiere a monómeros para la preparación de oligonucleótidos que tienen enlaces de fósforo quirales; patentes estadounidenses n.os 5.378.825 y 5.541.307, que se refieren a oligonucleótidos que tienen estructuras principales modificadas; patente estadounidense n.° 5.386.023, que se refiere a oligonucleótidos con la estructura principal modificada y a la preparación de los mismos mediante acoplamiento reductor; patente estadounidense n.° 5.457.191, que se refiere a bases nitrogenadas modificadas basadas en el sistema de anillo de 3-desazapurina y a métodos de síntesis de las mismas; patente estadounidense n.° 5.459.255, que se refiere a bases nitrogenadas modificadas basadas en purinas sustituidas en N-2; patente estadounidense n.° 5.521.302, que se refiere a procedimientos para preparar oligonucleótidos que tienen enlaces de fósforo quirales; patente estadounidense n.° 5.539.082, que se refiere a ácidos nucleicos peptídicos; patente estadounidense n.° 5.554.746, que se refiere a oligonucleótidos que tienen estructuras principales de p-lactama; patente estadounidense n.° 5.571.902, que se refiere a métodos y a materiales para la síntesis de oligonucleótidos; patente estadounidense n.° 5.578.718, que se refiere a nucleósidos que tienen grupos alquiltio, en los que tales grupos pueden usarse como ligadores de otros restos unidos en cualquiera de las diversas posiciones del nucleósido; patentes estadounidenses n.os 5.587.361 y 5.599.797, que se refieren a oligonucleótidos que tienen enlaces fosforotioato de alta pureza quiral; patente estadounidense n.° 5.506.351, que se refiere a procedimientos para la preparación de 2'-O-alquilguanosina y compuestos relacionados, incluyendo compuestos de 2,6-diaminopurina; patente estadounidense n.° 5.587.469, que se refiere a oligonucleótidos que tienen purinas sustituidas en N-2; patente estadounidense n.° 5.587.470, que se refiere a oligonucleótidos que tienen 3-desazapurinas; patente estadounidense n.° 5.223.168 y patente estadounidense n.° 5.608.046, que se refieren ambas a análogos de 4'-desmetil-nucleósidos conjugados; patentes estadounidenses n.os 5.602.240 y 5.610.289, que se refieren a análogos de oligonucleótidos con la estructura principal modificada; patentes estadounidenses n.os 6.262.241 y 5.459.255, que se refieren, entre otras cosas, a métodos de síntesis de 2'-fluoro-oligonucleótidos.

En los nucleósidos unidos específicos de secuencia que portan moléculas de ligando y ARNbc conjugado con ligando de la invención, los oligonucleótidos y oligonucleósidos pueden ensamblarse en un sintetizador de ADN adecuado usando precursores de nucleótidos o nucleósidos convencionales, o precursores de conjugados de nucleótidos o nucleósidos que ya portan el resto de unión, precursores de nucleótidos o nucleósidos conjugados con ligandos que ya portan la molécula de ligando, o bloques de construcción que portan ligandos no nucleosídicos. Cuando se usan precursores de conjugados de nucleótidos que ya portan un resto de unión, normalmente se completa la síntesis de los nucleósidos unidos específicos de secuencia y, a continuación, se hace reaccionar la molécula de ligando con el resto de unión para formar el oligonucleótido conjugado con ligando. Los conjugados de oligonucleotídicos que portan una variedad de moléculas, tales como esteroides, vitaminas, lípidos y moléculas indicadoras, se han descrito previamente (véase Manoharan et al., solicitud PCT WO 93/07883). En una realización preferida, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la invención se sintetizan mediante un sintetizador automatizado usando fosforamiditas derivadas de conjugados ligando-nucleósido además de las fosforamiditas convencionales y las fosforamiditas no convencionales que están disponibles comercialmente y se usan de manera rutinaria en la síntesis de oligonucleótidos.

La incorporación de un grupo 2'-O-metilo, 2'-O-etilo, 2'-O-propilo, 2'-O-alilo, 2'-O-aminoalquilo o 2'-desoxi-2'-fluoro en los nucleósidos de un oligonucleótido confiere propiedades de hibridación potenciadas al oligonucleótido. Además, los oligonucleótidos que contienen estructuras principales de fosforotioato tienen estabilidad de nucleasa potenciada. Por tanto, los nucleósidos unidos funcionalizados de la invención pueden aumentarse para incluir uno o ambos de una estructura principal de fosforotioato o un grupo 2'-O-metilo, 2'-O-etilo, 2'-O-propilo, 2'-O-aminoalquilo, 2'-O-alilo o 2'-desoxi-2'-fluoro. Una lista resumida de algunas de las modificaciones de oligonucleótidos conocidas en la técnica se encuentra, por ejemplo, en la publicación PCT WO 200370918.

En algunas realizaciones, las secuencias de nucleósidos funcionalizados de la invención que poseen un grupo amino en el extremo 5' se preparan usando un sintetizador de ADN y, a continuación, se hacen reaccionar con un derivado de éster activo de un ligando seleccionado. Los derivados de éster activo los conocen bien los expertos en la técnica. Los ésteres activos representativos incluyen ésteres de N-hidrosuccinimida, ésteres tetrafluorofenólicos, ésteres pentafluorofenólicos y ésteres pentaclorofenólicos. La reacción del grupo amino y el éster activo produce un oligonucleótido en el que el ligando seleccionado se une en la posición 5' a través de un grupo de unión. El grupo amino en el extremo 5' puede prepararse usando un reactivo 5'-amino-modificador de C6. En una realización, las moléculas de ligando pueden conjugarse con oligonucleótidos en la posición 5' mediante el uso de una fosforamidita de ligando-nucleósido en la que el ligando está unido al grupo 5'-hidroxilo directa o indirectamente a través de un ligador. Tales fosforamiditas de ligando-nucleósido se usan normalmente al final de un procedimiento de síntesis automatizado para proporcionar un oligonucleótido conjugado con ligando que porta el ligando en el extremo 5'. Los ejemplos de estructuras principales o enlaces internucleósidos modificados incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilos, incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales, fosfinatos fosforamidatos, incluyendo 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces normales 3'-5', análogos de los mismos unidos en 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están unidos en 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes estadounidenses representativas relacionadas con la preparación de los enlaces que contienen átomos de fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050; y 5.697.248.

Los ejemplos de estructuras principales o enlaces internucleósidos modificados que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos (es decir, oligonucleósidos) tienen estructuras principales que están formadas por enlaces interazúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces interazúcares mixtos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces interazúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen componentes mixtos de N, O, S y CH².

Las patentes estadounidenses representativas relacionadas con la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes estadounidenses n.os 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

En determinados casos, el oligonucleótido puede modificarse mediante un grupo distinto de ligando. Se han conjugado varias moléculas distintas de ligando con oligonucleótidos para potenciar la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido, y los procedimientos para realizar tales conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Tales restos distintos de ligando han incluido restos lipídicos, tales como colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, dodecanodiol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett, 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantanacético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett, 1995, 36:3651), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados oligonucleotídicos se han enumerado anteriormente. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de oligonucleótidos que portan un ligador amino en una o más posiciones de la secuencia. A continuación, el grupo amino se hace reaccionar con la molécula que va a conjugarse usando reactivos de acoplamiento o activación adecuados. La reacción de conjugación puede llevarse a cabo con el oligonucleótido todavía unido al soporte sólido o tras la escisión del oligonucleótido en fase de disolución. La purificación del conjugado oligonucleotídico mediante HPLC suele proporcionar el conjugado puro. El uso de un conjugado de colesterol es particularmente preferido, ya que un resto de este tipo puede aumentar la selección como diana de células células hepáticas, un sitio de expresión de PCSK9.

Agentes de iARN codificados por vectores

El ARNbc de la invención también puede expresarse a partir de vectores virales recombinantes de manera intracelular in vivo. Los vectores virales recombinantes de la invención comprenden secuencias que codifican para el ARNbc de la invención y cualquier promotor adecuado para expresar las secuencias de ARNbc. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, las secuencias promotoras de la ARN pol III U6 o H1 y el promotor de citomegalovirus. La selección de otros promotores adecuados está dentro de la habilidad en la técnica. Los vectores virales recombinantes de la invención también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNbc en un tejido particular o en un entorno intracelular particular. El uso de vectores virales recombinantes para administrar el ARNbc de la invención a las células in vivo se comenta con más detalle a continuación.

El ARNbc de la invención puede expresarse a partir de un vector viral recombinante, o bien como dos moléculas de ARN independientes y complementarias, o bien como una única molécula de ARN con dos regiones complementarias.

Puede usarse cualquier vector viral que pueda aceptar las secuencias de codificación para la(s) molécula(s) de ARNbc que va(n) a expresarse, por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adenoasociados (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), rabdovirus, virus de la leucemia murina); virus del herpes, y similares. El tropismo de los vectores virales puede modificarse mediante el pseudotipado de los vectores con proteínas de la envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus, o mediante la sustitución de diferentes proteínas de la cápside viral, según sea apropiado.

Por ejemplo, los vectores lentivirales de la invención pueden pseudotiparse con proteínas de superficie del virus de la estomatitis vesicular (VSV), la rabia, el Ébola, el Mokola y similares. Los vectores de AAV de la invención pueden elaborarse para dirigirse a diferentes células mediante modificación por ingeniería de los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la cápside. Por ejemplo, un vector de AAV que expresa una cápside del serotipo 2 en un genoma del serotipo 2 se denomina AAV 2/2. Este gen de la cápside del serotipo 2 en el vector de AAV 2/2 puede reemplazarse por un gen de la cápside del serotipo 5 para producir un vector de AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresan diferentes serotipos de proteínas de la cápside están dentro de la habilidad en la técnica; véase, por ejemplo, Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801.

La selección de vectores virales recombinantes adecuados para su uso en la invención, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNbc en el vector y métodos de administración del vector viral a las células de interés están dentro de la habilidad en la técnica. Véase, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap.

2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; y Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406.

Los vectores virales preferidos son aquellos derivados de AV y AAV. En una realización particularmente preferida, el ARNbc de la invención se expresa como dos moléculas de ARN monocatenario independientes y complementarias a partir de un vector de AAV recombinante que comprende, por ejemplo, los promotores de ARN U6 o H1, o el promotor de citomegalovirus (CMV).

Un vector de AV adecuado para expresar el ARNbc de la invención, un método para construir el vector de AV recombinante y un método para administrar el vector a las células diana se describen en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

Los vectores de AAV adecuados para expresar el ARNbc de la invención, los métodos para construir el vector de AV recombinante y los métodos para administrar los vectores a las células diana se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente estadounidense n.° 5.252.479; patente estadounidense n.° 5.139.941; solicitud de patente internacional n.° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional n.° WO 93/24641.

III. Composiciones farmacéuticas que comprenden ARNbc

En una realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un ARNbc, tal como se describe en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica que comprende el ARNbc es útil para tratar una enfermedad o un trastorno asociado con la expresión o actividad del gen PCSK9, tal como procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, tales como hiperlipidemia. Tales composiciones farmacéuticas se formulan basándose en el modo de administración. Un ejemplo son las composiciones formuladas para su administración al hígado por vía parenteral.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran en dosificaciones suficientes para inhibir la expresión del gen PCSK9. Los presentes inventores han descubierto que, debido a su eficacia mejorada, las composiciones que comprenden el ARNbc de la invención pueden administrarse a dosificaciones sorprendentemente bajas. Una dosificación de 5 mg de ARNbc por kilogramo de peso corporal del receptor al día es suficiente para inhibir o suprimir la expresión del gen PCSK9 y puede administrarse sistémicamente al paciente. En general, una dosis adecuada de ARNbc estará en el intervalo de 0,01 a 5,0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, generalmente en el intervalo de 1 microgramo a 1 mg por kilogramo de peso corporal al día. La composición farmacéutica puede administrarse una vez al día, o el ARNbc puede administrarse en dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo del día o incluso mediante infusión continua o administración a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNbc contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente menor para lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede componerse para su administración durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que proporcione una liberación sostenida del ARNbc durante un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida se conocen bien en la técnica.

El experto apreciará que determinados factores pueden influir en la dosificación y el tiempo necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero sin limitarse a, la gravedad de la enfermedad o el trastorno, los tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un único tratamiento o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosificaciones eficaces y las semividas in vivo de los ARNbc individuales englobados por la invención pueden realizarse usando metodologías convencionales o basándose en pruebas in vivo usando un modelo animal apropiado, tal como se describe en otra parte en el presente documento.

Los avances en genética de ratones han generado varios modelos de ratón para el estudio de diversas enfermedades humanas, tales como los procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9. Tales modelos se usan para las pruebas in vivo del ARNbc, así como para determinar una dosis terapéuticamente eficaz.

Puede usarse cualquier método para administrar un ARNbc de la presente invención a un mamífero. Por ejemplo, la administración puede ser directa; oral; o parenteral (por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intraventricular, intramuscular o intraperitoneal, o por goteo intravenoso). La administración puede ser rápida (por ejemplo, mediante inyección) o puede producirse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, mediante infusión lenta o administración de formulaciones de liberación lenta).

Normalmente, cuando se trata a un mamífero con hiperlipidemia, las moléculas de ARNbc se administran sistémicamente por vía parenteral. Por ejemplo, los ARNbc, conjugados o no conjugados o formulados con o sin liposomas, pueden administrarse por vía intravenosa a un paciente. Para ello, una molécula de ARNbc puede formularse en composiciones tales como disoluciones acuosas estériles y no estériles, disoluciones no acuosas en disolventes habituales tales como alcoholes o disoluciones en bases oleosas líquidas o sólidas. Tales disoluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Para la administración parenteral, intratecal o intraventricular, una molécula de ARNbc puede formularse en composiciones tales como disoluciones acuosas estériles, que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados (por ejemplo, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores farmacéuticamente aceptables).

Además, las moléculas de ARNbc pueden administrarse a un mamífero como medio biológico o abiológico, tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.271.359. La administración abiológica puede llevarse a cabo mediante una variedad de métodos, incluyendo, sin limitación, (1) cargar liposomas con una molécula de ácido ARNbc proporcionada en el presente documento y (2) formar un complejo entre una molécula de ARNbc y lípidos o liposomas para formar complejos de ácido nucleico-lípido o ácido nucleico-liposoma. El liposoma puede estar compuesto por lípidos catiónicos y neutros habitualmente usados para transfectar células in vitro. Los lípidos catiónicos pueden formar complejos (por ejemplo, asociarse a la carga) con ácidos nucleicos cargados negativamente para formar liposomas. Los ejemplos de liposomas catiónicos incluyen, sin limitación, lipofectina, lipofectamina, Lipofectace y DOTAP. Los procedimientos para formar liposomas se conocen bien en la técnica. Las composiciones de liposomas pueden formarse, por ejemplo, a partir de fosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dimiristoilfosfatidilglicerol o dioleoilfosfatidiletanolamina. Hay numerosos agentes lipófilos comercialmente disponibles, tales como Lipofectin.RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, California) y Effectene.TM. (Qiagen, Valencia, California). Además, los métodos de administración sistémica pueden optimizarse usando lípidos catiónicos comercialmente disponibles, tales como DDAB o DOTAP, que pueden mezclarse cada uno de los cuales con un lípido neutro tal como DOPE o colesterol. En algunos casos, pueden usarse liposomas tales como los descritos por Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997)). En otras realizaciones, pueden usarse policationes tales como polietilenimina para lograr la administración in vivo y ex vivo (Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996)). Puede encontrarse información adicional sobre el uso de liposomas para la administración de ácidos nucleicos en la patente estadounidense n.° 6.271.359, la publicación PCT WO 96/40964 y Morrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8):1002-7.

La administración biológica puede llevarse a cabo mediante una variedad de métodos, incluyendo, sin limitación, el uso de vectores virales. Por ejemplo, pueden usarse vectores virales (por ejemplo, vectores de adenovirus y virus del herpes) para administrar moléculas de ARNbc a las células hepáticas. Pueden usarse técnicas convencionales de biología molecular para introducir uno o más de los ARNbc proporcionados en el presente documento en uno de los muchos vectores virales diferentes desarrollados previamente para administrar ácido nucleico a las células. Estos vectores virales resultantes pueden usarse para administrar el uno o más ARNbc a las células mediante, por ejemplo, una infección.

Los ARNbc de la presente invención pueden formularse en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Un “portador farmacéuticamente aceptable” (también denominado en el presente documento “excipiente”) es un disolvente farmacéuticamente aceptable, un agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos o sólidos, y pueden seleccionarse teniendo en cuenta la forma de administración prevista, a fin de proporcionar el volumen, la consistencia y otras propiedades químicas y de transporte pertinentes. Los portadores farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitación: agua; solución salina; aglutinantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, gelatina o sulfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, almidón, polietilenglicol o acetato de sodio); disgregantes (por ejemplo, almidón o glicolato sódico de almidón); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio).

Además, el ARNbc que selecciona como diana el gen PCSK9 puede formularse en composiciones que contienen el ARNbc mezclado, encapsulado, conjugado o asociado de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una composición que contiene uno o más agentes de ARNbc que seleccionan como diana el gen PCSK9 puede contener otros agentes terapéuticos tales como otros agentes reductores del contenido de lípidos (por ejemplo, estatinas).

Métodos para el tratamiento de enfermedades que pueden modularse mediante regulación por disminución de la expresión de PCSK9

Los métodos y las composiciones descritos en el presente documento pueden usarse para tratar enfermedades y estados que pueden modularse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden usarse para tratar la hiperlipidemia y otras formas de desequilibrio lipídico, tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y los estados patológicos asociados con estos trastornos, tales como enfermedades cardíacas y circulatorias.

Métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9

En aún otro aspecto, la invención proporciona un método para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un mamífero. El método comprende administrar una composición de la invención al mamífero de manera que se silencie la expresión del gen PCSK9 diana. Debido a su alta especificidad, los ARNbc de la invención seleccionan como diana específicamente los ARN (primarios o procesados) del gen PCSK9 diana. Las composiciones y los métodos para inhibir la expresión de estos genes PCSK9 usando ARNbc pueden realizarse tal como se describe en otras partes en el presente documento.

En una realización, el método comprende administrar una composición que comprende un ARNbc, en la que el ARNbc comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN del gen PCSK9 del mamífero que va a tratarse. Cuando el organismo que va a tratarse es un mamífero, tal como, por ejemplo, un ser humano, la composición puede administrarse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, las vías oral o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica o aérea (aerosol). En las realizaciones preferidas, las composiciones se administran mediante infusión o inyección intravenosa.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en las pruebas de la invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Ejemplos

Desplazamiento génico del gen PCSK9

El diseño del ARNip se llevó a cabo para identificar en dos selecciones separadas

a) ARNip que seleccionan como diana PCSK9 humano y ARNm o bien de ratón o bien de rata, y

b) todos los ARNip reactivos humanos con especificidad prevista para el gen PCSK9 diana.

Se usaron las secuencias de ARNm de PCSK9 humano, de ratón y de rata: se usó la secuencia humana NM_174936.2 como secuencia de referencia durante todo el procedimiento de selección del ARNip.

En la primera etapa, se identificaron tramos nonadecaméricos conservados en ser humano y ratón y secuencias de ARNm de PCSK9 humano y de rata, lo que dio lugar a la selección de ARNip con reactividad cruzada para ser humano y ratón y ARNip con reactividad cruzada para dianas humanas y de rata.

En una segunda selección, se identificaron ARNip que seleccionan como diana específicamente PCSK9 humano. Se extrajeron todas las posibles secuencias nonadecaméricas de PCSK9 humano y se definieron como secuencias diana candidatas. Las secuencias con reactividad cruzada para ser humano y mono y aquellas con reactividad cruzada para ratón, rata, ser humano y mono se enumeran todas ellas en las tablas 1 y 2. Las versiones químicamente modificadas de esas secuencias y su actividad en ensayos in vitro e in vivo también se enumeran en las tablas 1 y 2 y se proporcionan ejemplos en las figuras 2-8.

Para clasificar las secuencias diana candidatas y sus correspondientes ARNip y seleccionar los adecuados, se tomó como parámetro de clasificación su potencial de interacción previsto con dianas irrelevantes (potencial fuera de la diana). Los ARNip con bajo potencial fuera de la diana se definieron como preferibles y se supuso que eran más específicos in vivo.

Para predecir el potencial fuera de la diana específico del ARNip, se hicieron las siguientes suposiciones:

1) las posiciones 2 a 9 (contando de 5' a 3') de una cadena (región semilla) pueden contribuir más al potencial fuera de la diana que la parte restante de la secuencia (región no semilla y región del sitio de escisión)

2) las posiciones 10 y 11 (contando de 5' a 3') de una cadena (región del sitio de escisión) pueden contribuir más al potencial fuera de la diana que la región no semilla

3) las posiciones 1 y 19 de cada cadena no son relevantes para las interacciones fuera de la diana

4) puede calcularse una puntuación fuera de la diana para cada gen y cada cadena, basándose en la complementariedad de la secuencia de la cadena de ARNip con la secuencia del gen y la posición de los apareamientos erróneos

5) el número de regiones fuera de la diana previstas, así como la puntuación más alta de regiones fuera de la diana, deben considerarse para el potencial fuera de la diana

6) las puntuaciones fuera de la diana deben considerarse más relevantes para el potencial fuera de la diana que el número de regiones fuera de la diana

7) suponiendo el posible aborto de la actividad de la cadena sentido por las modificaciones internas introducidas, sólo será relevante el potencial fuera de la diana de la cadena antisentido

Para identificar posibles genes fuera de la diana, las secuencias candidatas nonadecaméricas se sometieron a una búsqueda de homología con respecto a las secuencias de ARNm humano disponibles públicamente.

Se extrajeron las siguientes propiedades fuera de la diana para cada secuencia de entrada nonadecamérica para cada gen fuera de la diana para calcular la puntuación fuera de la diana:

Número de apareamientos erróneos en la región no semilla

Número de apareamientos erróneos en la región semilla

Número de apareamientos erróneos en la región del sitio de escisión

La puntuación fuera de la diana se calculó considerando los siguientes supuestos 1 a 3:

Puntuación fuera de la diana = número de apareamientos erróneos de semillas * 10

+ número de apareamientos erróneos del sitio de escisión * 1,2

+ número de apareamientos erróneos no de semillas * 1

El gen fuera de la diana más relevante para cada ARNip correspondiente a la secuencia de entrada nonadecamérica se definió como el gen con la menor puntuación fuera de la diana. Por consiguiente, la puntuación fuera de la diana más baja se definió como la puntuación fuera de la diana relevante para cada ARNip.

Síntesis de ARNbc

Fuente de reactivos

Cuando la fuente de un reactivo no se indique específicamente en el presente documento, tal reactivo podrá obtenerse de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular con un criterio de calidad/pureza para su aplicación en biología molecular.

Síntesis de ARNip

Los ARN monocatenarios se produjeron mediante síntesis en fase sólida a escala 1 amolar usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de tamaño de poro controlado (CPG, 500Á, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. El ARN y el ARN que contiene 2'-O-metilnucleótidos se generaron mediante síntesis en fase sólida empleando las correspondientes fosforamiditas y 2-O-metilfosforamiditas, respectivamente (Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques de construcción se incorporaron en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena de oligorribonucleótidos usando química convencional de fosforamiditas nucleosídicas, tal como se describe en Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU. Los enlaces fosforotioato se introdujeron reemplazando la disolución de oxidante de yodo por una disolución del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd, Glasgow, Reino Unido) en acetonitrilo (1%). Otros reactivos auxiliares se obtuvieron de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).

La desprotección y la purificación de los oligorribonucleótidos brutos mediante HPLC de intercambio aniónico se llevaron a cabo según los procedimientos establecidos. Los rendimientos y las concentraciones se determinaron mediante absorción UV de una disolución del respectivo ARN a una longitud de onda de 260 nm usando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, UnterschleilJheim, Alemania). El ARN bicatenario se generó mezclando una disolución equimolar de cadenas complementarias en tampón de hibridación (fosfato de sodio 20 mM, pH 6,8; cloruro de sodio 100 mM), se calentó en un baño de agua a 85 - 90°C durante 3 minutos y se enfrió hasta temperatura ambiente durante un periodo de 3 - 4 horas. La disolución de ARN hibridado se almacenó a -20°C hasta su uso.

Para la síntesis de ARNip conjugados con 3'-colesterol (denominado a continuación en el presente documento -Chol-3'), se usó un soporte sólido adecuadamente modificado para la síntesis de ARN. El soporte sólido modificado se preparó de la siguiente manera:

Dietil-2-azabutano-1,4-dicarboxilato, AA

Se añadió una disolución acuosa 4,7 M de hidróxido de sodio (50 ml) a una disolución con agitación y helada de clorhidrato de glicinato de etilo (32,19 g, 0,23 moles) en agua (50 ml). A continuación, se añadió acrilato de etilo (23,1 g, 0,23 moles) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente hasta que se comprobó la finalización de la reacción mediante CCF. Después de 19 h, se sometió a reparto la disolución con diclorometano (3 x 100 ml). Se secó la fase orgánica con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó. Se destiló el residuo para obtener AA (28,8 g, 61%).

Ester etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-amino)-hexanoil]-amino}-propiónico, AB

Se disolvió ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9,12 g, 25,83 mmol) en diclorometano (50 ml) y se enfrió con hielo. Se añadió diisopropilcarbodiimida (3,25 g, 3,99 ml, 25,83 mmol) a la disolución a 0°C. A continuación, se añadió dietilazabutano-1,4-dicarboxilato (5 g, 24,6 mmol) y dimetilaminopiridina (0,305 g, 2,5 mmol). Se llevó la disolución hasta temperatura ambiente y se agitó adicionalmente durante 6 h. Se comprobó la finalización de la reacción mediante CCF. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y se añadió acetato de etilo para precipitar la diisopropilurea. Se filtró la suspensión. Se lavó el filtrado con ácido clorhídrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio al 5% y agua. Se secó la fase orgánica combinada sobre sulfato de sodio y se concentró para dar el producto bruto, que se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAc al 50%/hexanos) para dar 11,87 g (88%) de AB.

Ester etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil]-propiónico, AC

Se disolvió éster etílico del ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-amino}-propiónico, AB (11,5 g, 21,3 mmol) en piperidina al 20% en dimetilformamida a 0°C. Se continuó agitando la disolución durante 1 h. Se concentró la mezcla de reacción a vacío, se añadió agua al residuo y se extrajo el producto con acetato de etilo. Se purificó el producto bruto por conversión en su sal de clorhidrato.

Ester etílico del ácido 3-({6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}etoxicarbonilmetil-amino)-propiónico, AD

Se llevó la sal de clorhidrato de éster etílico del ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-amino]-propiónico, AC (4,7 g, 14,8 mmol) a diclorometano. Se enfrió la suspensión hasta 0°C en hielo. A la suspensión se le añadió diisopropiletilamina (3,87 g, 5,2 ml, 30 mmol). A la disolución resultante se le añadió cloroformiato de colesterilo (6,675 g, 14,8 mmol). Se agitó la mezcla de reacción durante la noche. Se diluyó la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con ácido clorhídrico al 10%. Se purificó el producto mediante cromatografía ultrarrápida (10,3 g, 92%).

Éster etílico del ácido 1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-cidopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidin-3-carboxílico, AE

Se suspendió t-butóxido de potasio (1,1 g, 9,8 mmol) en 30 ml de tolueno seco. Se enfrió la mezcla hasta 0°C en hielo y se añadieron lentamente 5 g (6,6 mmol) de diéster AD con agitación en el plazo de 20 minutos. Se mantuvo la temperatura por debajo de 5°C durante la adición. Se continuó la agitación durante 30 minutos a 0°C y se añadió 1 ml de ácido acético glacial, seguido inmediatamente por 4 g de NaH² PO⁴ ^ ²O en 40 ml de agua. Se extrajo la mezcla resultante dos veces con 100 ml de diclorometano cada una y se lavaron los extractos orgánicos combinados dos veces con 10 ml de tampón fosfato cada una, se secaron y se evaporaron hasta sequedad. Se disolvió el residuo en 60 ml de tolueno, se enfrió hasta 0°C y se extrajo con tres porciones de 50 ml de tampón carbonato de pH 9,5 frío. Se ajustaron los extractos acuosos a pH 3 con ácido fosfórico y se extrajeron con cinco porciones de 40 ml de cloroformo que se combinaron, se secaron y se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna usando acetato de etilo al 25%/hexano para obtener 1,9 g de bcetoéster (39%).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilíco del ácido [6-(3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1-il)-6-oxo-hexil]-carbámico, AF

Se añadió metanol (2 ml) gota a gota durante un periodo de 1 h a una mezcla a reflujo de b-cetoéster AE (1,5 g, 2,2 mmol) y borohidruro de sodio (0,226 g, 6 mmol) en tetrahidrofurano (10 ml). Se continuó agitando a temperatura de reflujo durante 1 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, se añadió HCl 1 N (12,5 ml), se extrajo la mezcla con acetato de etilo (3 x 40 ml). Se secó la fase de acetato de etilo combinada sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró a vacío para obtener el producto que se purificó mediante cromatografía en columna (MeOH al 10%/CHCls) (89%).

Éster 17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidi^-1 H-cidopenta[a]fenantren-3-ílico del ácido (6-{3-[bis-(4-metoxi-fenN)-fenN-metoximetil]-4-hidroxi-pirrolidin-1-N}-6-oxohexil)-carbámico, AG

Se secó diol AF (1,25 g, 1,994 mmol) mediante evaporación con piridina (2 x 5 ml) a vacío. Se añadieron piridina anhidra (10 ml) y cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (0,724 g, 2,13 mmol) con agitación. Se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Se extinguió la reacción mediante la adición de metanol. Se concentró la mezcla de reacción a vacío y al residuo se le añadió diclorometano (50 ml). Se lavó la fase orgánica con bicarbonato de sodio acuoso 1 M. Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró. Se retiró la piridina residual mediante evaporación con tolueno. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna (MeOH al 2%/cloroformo, Rf = 0,5 en MeOH al 5%/CHCh) (1,75 g, 95%).

Éster mono-(4-[bis-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-1-{6-[17-(1,5-dimetil-hexil)-10,13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-pirrolidin-3-ílico) del ácido succínico, AH

Se mezcló el compuesto AG (1,0 g, 1,05 mmol) con anhídrido succínico (0,150 g, 1,5 mmol) y DMAP (0,073 g, 0,6 mmol) y se secó a vacío a 40°C durante la noche. Se disolvió la mezcla en dicloroetano anhidro (3 ml), se añadió trietilamina (0,318 g, 0,440 ml, 3,15 mmol) y se agitó la disolución a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón durante 16 h. A continuación, se diluyó con diclorometano (40 ml) y se lavó con ácido cítrico acuoso frío (5% en peso, 30 ml) y agua (2 x 20 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró hasta sequedad. Se usó el residuo como tal para la siguiente etapa.

CPG derivatizado con colesterol, AI

Se disolvió succinato AH (0,254 g, 0,242 mmol) en una mezcla de didorometano/acetonitrilo (3:2, 3 ml). A esa disolución se le añadieron sucesivamente DMAP (0,0296 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (1,25 ml), 2,2’-ditio-bis(5-nitropiridina) (0,075 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1,25 ml). A la disolución resultante se le añadió trifenilfosfina (0,064 g, 0,242 mmol) en acetonitrilo (0,6 ml). La mezcla de reacción adquirió un color naranja brillante. Se agitó la disolución brevemente usando un agitador de acción de muñeca (5 minutos). Se añadió alquilamina de cadena larga-CPG (LCAA-CPG) (1,5 g, 61 mM). Se agitó la suspensión durante 2 h. Se filtró el CPG a través de un embudo sinterizado y se lavó sucesivamente con acetonitrilo, diclorometano y éter. Los grupos aminos que no reaccionaron se enmascararon con anhídrido acético/piridina. La carga alcanzada del CPG se midió tomando una medición UV (37 mM/g).

La síntesis de ARNip que portan un grupo bisdecilamida del ácido 5’-12-dodecanoico (denominado a continuación en el presente documento “5’-C32-”) o un grupo derivado de 5’-colesterilo (denominado a continuación en el presente documento “5’-Chol-”) se realizó tal como se describe en el documento WO 2004/065601, excepto que, en el caso del derivado de colesterilo, la etapa de oxidación se realizó usando el reactivo de Beaucage para introducir un enlace fosforotioato en el extremo 5’ del oligómero de ácido nucleico.

Las secuencias de ácido nucleico se representan a continuación usando la nomenclatura convencional y, específicamente, las abreviaturas de la tabla 1-2.

Tabla 1-2: Abreviaturas de los monómeros de nucleótidos usados en la representación de secuencias de ácido nucleico. Se entenderá que estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están mutuamente unidos por enlaces 5’-3’-fosfodiéster.

aLas letras mayúsculas representan los 2’-desox¡rr¡bonucleót¡dos (ADN), las letras minúsculas representan los ribonucleótidos (ARN)

El examen de ARNip de PCSK9 en HuH7, HepG2, Hela y hepatocitos primarios de mono descubre secuencias altamente activas

Se obtuvieron células HuH-7 del banco de células JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources) (Shinjuku, Japón, n.° de cat.: JCRB0403). Se cultivaron las células en MEM de Dulbecco (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° de cat. F0435) complementado para contener suero bovino fetal (FCS) al 10% (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° de cat. S0115), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° cat. A2213) y L-glutamina 2 mM (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° de cat. K0282) a 37°C en una atmósfera con el 5% de CO² en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania). Las células HepG2 y Hela se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD, n.° de cat. HB-8065) y se cultivaron en MEM (Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, n.° de cat. 21090-022) complementado para contener suero bovino fetal (FCS) al 10% (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° de cat. S0115), penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 pg/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° de cat. A2213), 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° cat. K-0293) y piruvato de sodio 1 mM (Biochrom AG, Berlín, Alemania, n.° cat. L-0473) a 37°C en una atmósfera con el 5% de CO² en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania).

Para la transfección con ARNip, se sembraron células HuH7, HepG2 o Hela a una densidad de 2,0 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se transfectaron directamente. La transfección de ARNip (30 nM para el examen de dosis única) se llevó a cabo con Lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, n.° de cat. 11668-019) tal como describe el fabricante.

24 horas después de la transfección, se lisaron las células HuH7 y HepG2 y se cuantificaron los niveles de ARNm de PCSK9 con el kit Quantigene Explore (Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, EE.UU., n.° de cat. QG-000-02) según el protocolo. Los niveles de ARNm de PCSK9 se normalizaron con respecto al ARNm de GAP-DH. Para cada ARNip se recogieron ocho puntos de datos individuales. Como control se usaron dúplex de ARNip no relacionados con el gen PCSK9. La actividad de un dúplex de ARNip específico de PCSK9 se expresó como porcentaje de concentración de ARNm de PCSK9 en las células tratadas en relación con la concentración de ARNm de PCSK9 en las células tratadas con el dúplex de ARNip de control.

Se obtuvieron hepatocitos primarios de macaco cangrejero (crioconservados) de In vitro Technologies, Inc. (Baltimore, Maryland, EE.UU., n.° de cat. M00305) y se cultivaron en medio InVitroGRO CP (n.° de cat. Z99029) a 37°C en una atmósfera con el 5% de CO² en una incubadora humidificada.

Para la transfección con ARNip, se sembraron células primarias de macaco cangrejero en placas recubiertas de colágeno (Fisher Scientific, n.° de cat. 08-774-5) a una densidad de 3,5 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se transfectaron directamente. La transfección de ARNip (ocho series de dilución doble a partir de 30nM) por duplicado se llevó a cabo con Lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, n.° de cat. 11668-019) tal como describe el fabricante.

16 horas después de la transfección, el medio se cambió por un medio InVitroGRO CP nuevo al que se le añadió la mezcla de antibióticos Torpedo (In vitro Technologies, Inc, n.° de cat. Z99000).

24 horas después del cambio de medio, se lisaron las células primarias de macaco cangrejero y se cuantificaron los niveles de ARNm de PCSK9 con el kit Quantigene Explore (Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, EE.UU., n.° de cat. QG-000-02) según el protocolo. Los niveles de ARNm de PCSK9 se normalizaron con respecto al ARNm de GAPDH. A continuación, se compararon las razones de PCSK9/GAPDH normalizadas con la razón de PCSK9/GAPDH del control con sólo Lipofectamine 2000.

En las tablas 1-2 (y en la figura 6) se resumen los resultados y se proporcionan ejemplos de exámenes in vitro en diferentes líneas celulares a distintas dosis. El silenciamiento del transcrito de PCSK9 se expresó como porcentaje del transcrito restante a una dosis determinada. Las secuencias altamente activas son las que tienen menos del 70% de transcrito restante tras el tratamiento con un ARNip proporcionado a una dosis menor o igual a 100 nm. Las secuencias muy activas son aquellas que tienen menos del 60% de transcrito restante tras el tratamiento con una dosis menor o igual a 100 nM. Las secuencias activas son aquellas que tienen menos del 85% de transcrito restante después del tratamiento con una dosis alta (100 nM). Los ejemplos de ARNip activos también se examinaron in vivo en ratones en formulaciones lipoides tal como se describe a continuación. Las secuencias activas in vitro también fueron generalmente activas in vivo (véase el ejemplo de la figura 6).

Examen de eficacia in vivo de ARNip de PCSK9

Procedimiento de formulación

Se usaron LNP-014HCl (PM de 1487) (figura 1), colesterol (Sigma-Aldrich) y PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) para preparar las nanopartículas de lípido-ARNip. Se prepararon disoluciones madre de cada uno en etanol: ^lN^p-01, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramida C16, 100 mg/ml. A continuación, se combinaron las disoluciones madre de LNP-01, colesterol y PEG-Ceramida C16 en una razón molar de 42:48:10. Se mezcló la disolución lipídica combinada rápidamente con el ARNip acuoso (en acetato de sodio de pH 5) de manera que la concentración final de etanol era del 35-45% y la de acetato de sodio de 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNip se formaron espontáneamente tras el mezclado. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseada, en algunos casos, la mezcla de nanopartículas resultante se extruyó a través de una membrana de policarbonato (punto de corte de 100 nm) usando una prensa extrusora de termobarril (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc). En otros casos, se omitió la etapa de extrusión. La retirada de etanol y el intercambio simultáneo del tampón se llevaron a cabo mediante diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón se cambió por solución salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7,2.

Caracterización de las formulaciones

Las formulaciones preparadas mediante el método convencional o sin extrusión se caracterizan de manera similar. Las formulaciones se caracterizan en primer lugar mediante inspección visual. Deben ser disoluciones blanquecinas translúcidas, sin agregados ni sedimentos. El tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas se miden mediante dispersión dinámica de luz usando un aparato Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, e E.UU.). Las partículas deben tener un tamaño de 20-300 nm e, idealmente, de 40-100 nm. La distribución del tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración total de ARNip en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima mediante un ensayo de exclusión de colorante. Una muestra del ARNip formulado se incuba con el colorante de unión al ARN Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de un tensioactivo que altera la formulación, Triton-X100 al 0,5%. El ARNip total en la formulación se determina mediante la señal de la muestra que contiene el tensioactivo, en relación con una curva de calibración. La fracción atrapada se determina restando el contenido de ARNip “libre” (tal como se mide mediante la señal en ausencia de tensioactivo) del contenido total de ARNip. El porcentaje de ARNip atrapado suele ser superior al 85%.

Administración de dosis en bolo

La administración de dosis en bolo de los ARNip formulados en ratones C57/BL6 (5/grupo, 8-10 semanas de edad, Charles River Laboratories, MA) se realizó mediante inyección en la vena de la cola usando una aguja 27G. Los ARNip se formularon en LNP-01 (y luego se dializaron con PBS) a una concentración de 0,5 mg/ml que permitía la administración de la dosis de 5 mg/kg en 10 |il/g de peso corporal. Los ratones se mantuvieron bajo una lámpara de infrarrojos durante aproximadamente 3 minutos antes de la administración de dosis para facilitar la inyección.

48 horas tras la administración de dosis, se sacrificaron los ratones mediante asfixia con CO². Se recogieron 0,2 ml de sangre por sangrado retroorbital y se extrajo el hígado y se congeló en nitrógeno líquido. El suero y el hígado se almacenaron a -80°C.

Los hígados congelados se trituraron usando la trituradora criogénica 6850 Freezer/Mill (SPEX CentriPrep, Inc) y los polvos se almacenaron a -80°C hasta su análisis.

Los niveles de ARNm de PCSK9 se detectaron usando el kit basado en la tecnología de ADN ramificado del sistema de reactivos QuantiGene (Genospectra) según el protocolo. Se lisaron 10-20 mg de polvo de hígado congelado en 600 ul de proteinasa K 0,16 ug/ml (Epicentre, #MPRK092) en disolución de lisis de tejidos y células (Epicentre, #MTC096H) a 65°C durante 3 horas. A continuación, se añadieron 10 ul de los lisados a 90 ul de reactivo de trabajo de lisis (1 volumen de mezcla de lisis madre en dos volúmenes de agua) y se incubaron a 52°C durante la noche en placas de captura de Genospectra con conjuntos de sondas específicas para PCSK9 de ratón y GAPDH o ciclofilina B de ratón. Las secuencias de ácido nucleico para las sondas de extensor de captura (CE), extensor de marcador (LE) y bloqueo (BL) se seleccionaron a partir de las secuencias de ácido nucleico de PCSK9, la GAPDH y la ciclofilina B con la ayuda del software QuantiGene ProbeDesigner 2.0 (Genospectra, Fremont, CA, EE.UU., n.° de cat. QG-002-02). La quimioluminiscencia se leyó en un aparato Victor2-Light (Perkin Elmer) como unidades relativas de luz. La razón de ARNm de PCSK9 con respecto a ARNm de GAPDH o ciclofilina B en los lisados hepáticos se promedió en cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNip no relacionado (factor de coagulación sanguínea VII).

El colesterol sérico total en el suero de ratón se midió usando el kit StanBio Cholesterol LiquiColor (StanBio Laboratory, Boerne, Texas, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las mediciones se realizaron en un contador multimarcador Victor21420 (Perkin Elmer) a 495 nm.

Ejemplos

Se sometieron a prueba 32 ARNip de PCSK9 formulados en liposomas LNP-01 in vivo en un modelo de ratón. El experimento se realizó a una dosis de ARNip de 5 mg/kg y al menos 10 ARNip de PCSK9 mostraron una atenuación del ARNm de PCSK9 de más del 40% en comparación con un grupo de control tratado con PBS, mientras que el grupo de control tratado con un ARNip no relacionado (factor de coagulación sanguínea VII) no tuvo ningún efecto (figuras 2-5). El silenciamiento del transcrito de PCSK9 también se correlacionó con una disminución del colesterol en estos animales (figuras 4-5). Además, hubo una fuerte correlación entre las moléculas que eran activas in vitro y las que lo eran in vivo (figura 6). También se analizaron las secuencias que contenían diferentes modificaciones químicas in vitro (tablas 1 y 2) e in vivo. Por ejemplo, las secuencias menos modificadas 9314 y 9318, y las versiones más modificadas de esa secuencia 9314-(10792, 10793 y 10796); 9318-(10794, 10795 y 10797) se sometieron a prueba tanto in vitro (en hepatocitos primarios de mono) como in vivo (9314 y 10792) formuladas en LNP-01. La figura 7 (véanse también las tablas 1 y 2) muestra que las moléculas parentales 9314 y 9318 y las versiones modificadas son todas activas in vitro. La figura 8, como ejemplo, muestra que tanto la molécula parental 9314 como las secuencias más modificadas 10792 son activas in vivo, mostrando un silenciamiento del 50-60% de PCSK9 endógeno en ratones. La figura 9 ejemplifica además la actividad de otras versiones químicamente modificadas de las parentales 9314 y 10792.

Vectores de expresión de ARNbc

En otro aspecto de la invención, las moléculas de ARNbc específicas de PCSK9 que modulan la actividad de expresión del gen PCSK9 se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Couture, A, et al. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., publicación internacional PCT n.° WO 00/22113, Conrad, publicación internacional PCT n.° WO 00/22114 y Conrad, patente estadounidense n.° 6.054.299). Estos transgenes pueden introducirse como un constructo lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede incorporarse y heredarse como un transgén integrado en el genoma del huésped. El transgén también puede construirse para permitir que se herede como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).

Las cadenas individuales de un ARNbc pueden transcribirse mediante promotores en dos vectores de expresión independientes y transfectados conjuntamente en una célula diana. Alternativamente, cada cadena individual del ARNbc puede transcribirse mediante promotores situados ambos en el mismo plásmido de expresión. En una realización preferida, un ARNbc se expresa como una repetición invertida unida por una secuencia polinucleotídica ligadora de manera que el ARNbc tenga una estructura de tallo y bucle.

Los vectores de expresión de ARNbc recombinante son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Los vectores virales que expresan ARNbc pueden construirse basándose en, pero sin limitarse a, virus adenoasociado (para una revisión, véase Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (véase, por ejemplo, Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434) y Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)); o alfavirus, así como otros conocidos en la técnica. Los retrovirus se han usado para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (véase, por ejemplo, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos y Mulligan, Proc. NatI. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; patente estadounidense n.° 4.868.116; patente estadounidense n.° 4.980.286; solicitud PCT WO 89/07136; solicitud PCT WO 89/02468; solicitud PCT Wo 89/05345; y solicitud PCT WO 92/07573). Los vectores retrovirales recombinantes que pueden transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula pueden producirse transfectando el genoma retroviral recombinante en líneas celulares de empaquetamiento adecuadas, tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349). Los vectores adenovirales recombinantes pueden usarse para infectar una amplia variedad de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769), y también tienen la ventaja de no requerir células mitóticamente activas para la infección.

El promotor que impulsa la expresión del ARNbc o bien en un plásmido de ADN o bien en un vector viral de la invención puede ser un promotor de la ARN polimerasa I eucariota (por ejemplo, el promotor de ARN ribosómico), de la ARN polimerasa II (por ejemplo, el promotor temprano de CMV o el promotor de actina o el promotor de ARNnp U1) o generalmente el promotor de la ARN polimerasa III (por ejemplo, el promotor de ARNnp U6 o el promotor de ARN 7SK) o un promotor procariota, por ejemplo, el promotor T7, siempre que el plásmido de expresión también codifique para la ARN polimerasa T7 necesaria para la transcripción de un promotor T7. El promotor también puede dirigir la expresión del transgén al páncreas (véase, por ejemplo, la secuencia reguladora de la insulina para el páncreas (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)).

Además, la expresión del transgén puede regularse con precisión, por ejemplo, usando una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tales como una secuencia reguladora que sea sensible a determinados reguladores fisiológicos, por ejemplo, los niveles de glucosa circulante, u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J.

8:20-24). Tales sistemas de expresión inducible, adecuados para el control de la expresión del transgén en células o en mamíferos, incluyen la regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de la dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranósido (EPTG). Un experto en la técnica podría elegir la secuencia reguladora/promotora adecuada en función del uso previsto del transgén de ARNbc.

Generalmente, los vectores recombinantes que pueden expresar moléculas de ARNbc se administran tal como se describe a continuación y persisten en las células diana. Alternativamente, pueden usarse vectores virales que permiten la expresión transitoria de moléculas de ARNbc. Tales vectores pueden administrarse repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, los ARNbc se unen al ARN diana y modulan su función o expresión. La administración de los vectores que expresan ARNbc puede ser sistémica, tal como, por ejemplo, mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante la administración a células diana explantadas del paciente seguida de la reintroducción al paciente, o mediante cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada.

Los plásmidos de ADN de expresión de ARNbc se transfectan normalmente en las células diana como un complejo con portadores lipídicos catiónicos (por ejemplo, Oligofectamine) o portadores basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO™). La invención también contempla transfecciones múltiples de lípidos para atenuaciones génicas mediadas por ARNbc que seleccionan como diana diferentes regiones de un único gen PCSK9 o de múltiples genes PCSK9 durante un periodo de una semana o más. La introducción satisfactoria de los vectores de la invención en las células huésped puede monitorizarse mediante diversos métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria puede señalizarse con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína verde fluorescente (GFP). La transfección estable de células ex vivo puede garantizarse usando marcadores que proporcionen a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tales como resistencia a la higromicina B.

Las moléculas de ARNbc específicas de PCSK9 también pueden insertarse en vectores y usarse como vectores de terapia génica para pacientes humanos. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, administración local (véase la patente estadounidense 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen et al. (1994) Proc. Acad. Sci. USA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se incrusta el vehículo de inserción génica. Alternativamente, cuando el vector de inserción génica completo puede producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de inserción génica.

Los expertos en la técnica están familiarizados con otros métodos y composiciones además de los expuestos específicamente en la presente divulgación, que les permitirán poner en práctica esta invención en todo el alcance de las reivindicaciones que se adjuntan a continuación en el presente documento.

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, en el que dicho ARNbc comprende al menos dos secuencias que son complementarias entre sí y en el que una cadena sentido comprende una primera secuencia y una cadena antisentido comprende una segunda secuencia que comprende una región de complementariedad que es totalmente complementaria a al menos una parte de un ARNm que codifica para PCSK9, en el que dicha región de complementariedad tiene menos de 30 nucleótidos de longitud y en el que dicho ARNbc, al entrar en contacto con una célula que expresa dicho PCSK9, inhibe la expresión de dicho gen PCSK9 en el que dicha parte del ARNm que codifica para PCSK9 consiste en la secuencia de las posiciones 408-426 del número de registro NM_174936.
2. 2. El ARNbc según la reivindicación 1, en el que dicho ARNbc comprende al menos un nucleótido modificado.
3. 3. El ARNbc según la reivindicación 2, en el que dicho nucleótido modificado se elige del grupo de un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido que comprende un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo o un grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico, un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxilo, un nucleótido bloqueado, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato y un nucleótido que comprende una base no natural.
4. 4. El ARNbc según la reivindicación 2 ó 3, en el que dicha primera secuencia es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 87 y 89 y dicha segunda secuencia es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de las SEQ ID NO: 88 y 90.
5. 5. Composición farmacéutica para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un organismo, que comprende un ARNbc y un portador farmacéuticamente aceptable, en la que el ARNbc es tal como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. 6. Método in vitro para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, comprendiendo el método:

   (a) introducir en la célula un ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc), en el que el ARNbc es tal como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4; y

   (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen PCSK9, inhibiendo así la expresión del gen PCSK9 en la célula.
7. 7. ARNbc para su uso en un método de tratamiento, prevención o gestión de procesos patológicos que pueden mediarse mediante regulación por disminución de la expresión del gen PCSK9, en el que el ARNbc es tal como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. 8. Vector para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula, comprendiendo dicho vector una secuencia reguladora operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica para al menos una cadena de un ARNbc, en el que dicho ARNbc es tal como se definió en la reivindicación 1.
9. 9. Célula aislada que comprende el ARNbc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el vector según la reivindicación 8.
10. 10. Ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para reducir el nivel de expresión de un gen PCSK9 humano en una célula, en el que dicho ARNbc es tal como se definió en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
11. 11. El ARNbc según la reivindicación 10, en el que dicho contacto reduce el nivel de expresión de dicho gen PCSK9.
12. 12. El ARNbc según la reivindicación 10, en el que dicho contacto se realiza in vitro a 30 nM o menos.
13. 13. Composición farmacéutica para reducir el nivel de expresión del gen PCSK9 en un organismo, que comprende el ARNbc según la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. 14. El ARNbc según la reivindicación 10, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno asociado a PCSK9.
15. 15. El ARNbc para uso según la reivindicación 14, en el que dicho trastorno asociado a PCSK9 es hiperlipidemia.