ES2874584T3 - Virus del herpes redirigido con una fusión de glicoproteína H - Google Patents

Virus del herpes redirigido con una fusión de glicoproteína H Download PDF

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Abstract

Virus del herpes infeccioso recombinante, que comprende (a) un ligando polipeptídico heterólogo, en el que el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con el extremo N-terminal de la glicoproteína H (gH) madura o de una gH truncada hasta el aminoácido 48 de la SEQ ID NO: 1, o insertado en la gH dentro de la región N-terminal comenzando en cualquiera de los aminoácidos 19 a 23 y acabando en el aminoácido 48, y en el que el ligando polipeptídico heterólogo no es la glicoproteína D (gD) del virus del herpes, ni un fragmento de la misma, que se une específicamente a un ligando celular de gD, y (b) una gD alterada que tiene unión reducida o inespecífica a ligandos celulares de gD, en el que la gD comprende un ligando polipeptídico heterólogo fusionado con el extremo N-terminal de la gD madura o de una gD truncada, o insertado en la gD.

Description

DESCRIPCIÓN
Virus del herpes redirigido con una fusión de glicoproteína H
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al sector de la terapia de enfermedades. Más específicamente, se refiere a un virus del herpes redirigido que tiene un polipéptido heterólogo fusionado con la glicoproteína H, en el que el polipéptido selecciona como diana células específicas, en particular células enfermas. También se refiere a un ácido nucleico que comprende el genoma del virus del herpes de la presente invención, a un vector que comprende este ácido nucleico y a una célula que comprende el ácido nucleico o el vector. Además, se refiere a la destrucción de células utilizando el virus del herpes de la presente invención y a procedimientos para hacerlo crecer in vitro.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La carga de las enfermedades y patologías que no se pueden tratar, y menos curar, sigue siendo elevada, a pesar del gran número de descubrimientos que, en las últimas décadas, se trasladaron a terapias o curas y que tuvo como resultado mejoras para la salud y la calidad de vida de los seres humanos. Entre ellas destacan numerosas formas de cánceres, en particular formas metastásicas de cánceres, que se tratan con quimio-radioterapia o medicamentos biológicos, o combinaciones de los mismos, con un éxito muy limitado.
En las últimas dos décadas, se han realizado numerosos esfuerzos para emplear los virus del herpes simple (HSV) como agentes oncolíticos (o-HSV) para tratar cánceres y metástasis. Ejemplos son HSV modificados por ingeniería genética, que portan deleciones de algunos de los genes virales para atenuar los virus y otorgan cierto grado de especificidad por el cáncer. Estos virus, ejemplificados por el virus denominado HSV-1716, portan la deleción de una o ambas copias del gen Y 134.5, cuyo producto contrasta la defensa del anfitrión ejercida por la activación de PKR (proteína cinasa R). Los HSV que portan la deleción del gen ^34.5 obtienen su especificidad parcial del cáncer por el hecho de que las células no cancerosas crean una respuesta innata contra los mismos, de tal manera que se dificulta la replicación viral; por el contrario, algunas de las células cancerosas muestran defectos en la respuesta innata y, por tanto, permiten la replicación del HSV con A ^34.5 y, en consecuencia, la destrucción de las células cancerosas. Una debilidad de estos o-HSV es que las células cancerosas son heterogéneas, y e1HSV con A ^ 34.5 sólo puede destruir la fracción de células cancerosas defectuosas en cuanto a la respuesta de PKR. Por motivos de seguridad y para conseguir una especificidad por el cáncer mejorada, en algunos casos, los HSV con A ^34.5 se han modificado por ingeniería para portar deleciones adicionales, ejemplificadas por la deleción del gen UL 39 que codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa, la deleción de ICP 47, etc. Estas deleciones adicionales dan como resultado una atenuación adicional de los o-HSV.
Para superar el efecto oncolítico limitado resultante de la atenuación, los o-HSV que portan la deleción del gen Y 134.5, o una combinación de deleciones, se han modificado adicionalmente para codificar una quimiocina o citocina. Los dos ejemplos pertinentes son T-VEC y M032. El o-HSV, denominado inicialmente Onco-Vex y renombrado posteriormente como T-Vec, codifica GM-CSF, que favorece el reclutamiento y la maduración de monocitos y células dendríticas y, por tanto, aumenta la respuesta del paciente tratado a su propio tumor. El efecto es una potenciación del aclaramiento de tumores por el sistema inmunitario del paciente tratado. En un ensayo clínico de fase III, mejoró el desenlace de pacientes que portaban melanoma metastásico. El segundo ejemplo es M032, un HSV con A Y 134.5 modificado por ingeniería para codificar la secuencia de IL12. Se predice que este virus favorecerá una respuesta Th1. Está abierto el reclutamiento de pacientes afectados por glioblastoma para el tratamiento con M032 en un ensayo de fase I. Las principales limitaciones de los virus atenuados son dobles, (i) su replicación global disminuida, lo que representa un obstáculo tanto in vivo como con respecto a la producción de reservas de virus lo suficientemente grandes como para producir inóculos eficaces; y (ii) su especificidad por el cáncer limitada debido a su capacidad para entrar y ser secuestrados por células normales. Se espera que estas dos limitaciones sean perjudiciales para la eficacia clínica del tratamiento.
Un enfoque para superar estas limitaciones ha sido la modificación por ingeniería genética de o-HSV que muestran un tropismo altamente específico para las células cancerosas y que, por lo demás, no se atenúan. Este enfoque se ha definido como redirección del tropismo de HSV a receptores específicos de los cánceres. E1HSV entra en las células mediante la fusión de su envoltura con las membranas celulares; estas son la membrana plasmática o la membrana que limita las vesículas endocitósicas. En el último caso, la unión del virus a la superficie celular está seguida por la captación del virus por parte de la célula en las vesículas endocitósicas y, posteriormente, por la fusión de la envoltura del virión con la membrana de la vesícula endocitósica. La envoltura del virión es la estructura más externa de la partícula de HSV; consiste en una membrana que porta varias glicoproteínas codificadas por virus que se activan en forma de cascada para fomentar la fusión de la envoltura de1HSV con las membranas celulares. Estas glicoproteínas son gC y gB, que median una primera unión de la partícula de HSV al sulfato de heparano de la superficie celular. Después de eso, la gD interacciona con, como mínimo, dos receptores de superficie celular alternativos independientes, denominados Nectina 1 y HVEM o HVEA. El sitio de unión de Nectina 1 o de HVEM en gD difiere. La interacción de gD con uno de los dos receptores alternativos induce cambios conformacionales en gD, que se cree que activan las glicoproteínas gH/gL aguas abajo (que forman un heterodímero) y gB, en forma de cascada. La gB ejecuta la fusión de la envoltura del virión con la membrana celular.
La redirección de HSV a receptores específicos del cáncer conlleva modificaciones genéticas de gD, de tal manera que alberga secuencias heterólogas que codifican un ligando específico. Tras la infección con el virus recombinante que codifica la glicoproteína quimérica gD-ligando, se forman viriones descendientes que portan en su envoltura la glicoproteína quimérica gD-ligando, en lugar de wt-gD. El ligando interacciona con una molécula expresada específicamente en la célula cancerosa seleccionada, o en un grupo de cánceres, y permite la entrada del o-HSV recombinante en la célula cancerosa seleccionada. Ejemplos de ligandos que se han utilizado con éxito para la redirección de HSV son IL13a, uPaR, un anticuerpo monocatenario contra HER2 y un anticuerpo monocatenario contra EGFR.
Estudios previos han dado a conocer la construcción de dos recombinantes denominados R-LM113 y R-LM249, ambos redirigidos al receptor de cáncer HER2. Para conseguir un alto grado de especificidad por el cáncer, la interacción de gD con sus receptores naturales Nectina 1 y HVEM fue abolida a través de deleciones de porciones específicas de la molécula de gD. R-LM113 porta la deleción de la secuencia de gD madura correspondiente a los a A 6-38. R-LM249 porta la deleción de la región central de la gD madura, correspondiente a los AA 61-218. En ambos virus, las secuencias delecionadas se reemplazaron por la secuencia que codifica un anticuerpo monocatenario (scFv) derivado de trastuzumab, un anticuerpo monoclonal contra HER2.
La redirección a través de la modificación de glicoproteínas distintas de gD se ha intentado con gC. Los ligandos insertados fueron EPO e IL13. El virus que porta la quimera gC-EPO se unió a las células que expresan los receptores de EPO; sin embargo, esta unión no condujo a una entrada infecciosa; más bien, el virus se degradó, posiblemente porque fue absorbido y acabó en los lisosomas; en general, esta estrategia no tuvo como resultado un virus redirigido viable. La quimera gC-IL13 estaba presente en un virus que portaba una segunda copia de IL13 en el gen gD. El virus fue redirigido. Dado que todos los HSV redirigidos viables portan el ligando de redirección en gD, a partir de esos estudios no se puede deducir si la gC-IL13 contribuía o no a la redirección al receptor alfa2 de IL13.
Según el conocimiento de los inventores, nunca se ha descrito la redirección a través de modificaciones genéticas de gB de HSV. La gH ha sido modificada por una fusión de scFv en la Patente WO 2009/013448.
Pertinentes para la presente invención son los hallazgos previos de Cairns et al. (Journal of Virology, junio de 2003, vol. 77, n.° 12, pág. 6731 -6742), resumidos en lo siguiente. En un intento de entender qué papel desempeña gL en el heterodímero gH/gL, se introdujo la deleción del gen gL en el virus del herpes denominado virus de la pseudorrabia (PrV), un virus del herpes porcino con alta homología con el HSV humano. El PrV con A gL no era viable, puesto que no podía infectar, por lo que no se podía replicar. Los pases ciegos en serie de este virus dieron lugar a un mutante espontáneo, denominado PrV-A gLPass, que portaba una glicoproteína quimérica compuesta por la secuencia de gD fusionada con el extremo N-terminal de gH. Posteriormente también se modificó por ingeniería una quimera esencialmente similar con los genes de HSV correspondientes. Porta la secuencia que codifica el péptido señal de gD y el ectodominio de gD madura (aa 1-308) fusionado con el extremo N-terminal de la gH madura. Los ejemplos en los que gH estaba delecionada parcialmente no dieron lugar a ninguna molécula funcional. La propiedad de la glicoproteína gD-gH, en la que todo el ectodominio de gD estaba fusionado con el extremo N-terminal de gH (denominada quimera 22 en Cairns et al., anteriormente), es pertinente en este caso. Cabe señalar que, en el virus wt (wild-type, de tipo natural), la activación ejercida por la gD unida al receptor en gH/gL se produce necesariamente a través de señalización intermolecular. Los inventores se refieren a la misma como señalización trans, en oposición a una señalización que se produce de manera intramolecular, denominada en el presente documento señalización cis. Un descubrimiento sorprendente de los inventores de la presente invención es que la activación de gH se puede producir en cis. Este es el caso para las construcciones R-VG803 y R-VG809, en las que el scFv activa el resto gH en la propia quimera. La quimera 22 de Cairns et al., anteriormente, se empleó en ensayos de complementación. Específicamente, la quimera 22 redujo la infección de un virus gD-/-gH+/+, o de un virus gH-/-gD+. No se sometió a prueba la complementación de un virus gD-/-gH-/- con doble deleción. Existen dos diferencias clave entre el informe previo y el hallazgo de la presente invención. En primer lugar, en los ensayos de complementación (Cairns et al., anteriormente), wt-gD en el virus gH-/-gD+ puede haber activado en trans al resto gH que forma parte de la quimera gD-gH. Por el contrario, el resto gD, que forma parte de la quimera, puede haber activado en trans a wt-gH presente en los viriones gD-/-gH+. En cualquier caso, la activación solo puede haber tenido lugar en trans, tal como concluyeron Cairns et al., anteriormente. No se proporcionar evidencias de la activación en cis de la quimera gD-gH y el experto en la materia no la habría considerado posible. En segundo lugar, independientemente del mecanismo de activación, en el sistema del complemento la activación de gH estaba mediada por gD, que tiene un sitio de unión para gH, y no por un ligando heterólogo. Estos resultados no establecieron ni sugirieron que se pudieran introducir secuencias heterólogas (secuencias distintas de secuencias virales), denominadas en el presente documento ligando, en el extremo N-terminal de gH, y menos si un ligando heterólogo introducido en el extremo N-terminal de gH puede ejercer la función de redirigir el tropismo de HSV a un receptor celular capaz de unirse al ligando modificado por ingeniería.
Los inventores de la presente invención han demostrado que, de hecho, esto se puede realizar y que la gH se puede modificar para redirigir el virus del herpes.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un virus del herpes infeccioso recombinante, que comprende
(a) un ligando polipeptídico heterólogo, en el que el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con el extremo N-terminal de la glicoproteína H (gH) madura o de una gH truncada hasta el aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, o insertado en la gH dentro de la región N-terminal comenzando en cualquiera de los aminoácidos 19 a 23 y acabando en el aminoácido 48, y en el que el ligando polipeptídico heterólogo no es la glicoproteína D (gD) del virus del herpes, ni un fragmento de la misma, que se une específicamente a un ligando celular de gD, y
(b) una gD alterada que tiene unión reducida o inespecífica a ligandos celulares de gD,
en el que la gD comprende un ligando polipeptídico heterólogo fusionado con el extremo N-terminal de la gD madura o de una gD truncada, o insertado en la gD.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende el genoma del virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, en el que el genoma codifica el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gH, tal como se define en (a), y la gD alterada que comprende el ligando polipeptídico heterólogo, tal como se define en (b).
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico del tercer aspecto.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, el ácido nucleico del tercer aspecto o el vector del cuarto aspecto.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, para su utilización médica.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para destruir una célula utilizando el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para hacer crecer el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, en células.
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1: disposiciones del genoma de los recombinantes R-VG803, R-VG811, R-VG809, R-VG805 y R-VG807. El genoma de HSV-1 está representado como una línea enmarcada por repeticiones internas (IR). La secuencia de BAC enmarcada por Lox-P está insertada en la región intergénica UL3-UL4. El marcador fluorescente rojo m-Cherry está insertado en la región intergénica UL37 y UL38. R-VG803 porta la inserción de scFv-HER2, enmarcado por ligadores de Ser-Gly, entre los AA 23-24 de gH. R-VG811 porta la inserción de scFv-HER2, enmarcado por ligadores de Ser-Gly, entre los AA 23-48 de gH. R-VG809 es por lo demás idéntica a R-VG803. Además, porta la deleción de los AA 6-38 de la gD madura. R-VG805 es por lo demás idéntica a R-VG809; además, porta la inserción de scFv-EGFR en lugar de los AA 6-38 de la gD madura. R-VG807 es por lo demás idéntica a R-VG809; además, porta la inserción de scFv-HER2 en lugar de los AA 6-38 de la gD madura.
Figura 2: R-VG803 y R-VG 809 expresan la glicoproteína scFv-gH quimérica. Se sometieron lisados de células Vero infectadas con R-VG803, R-VG809 o R-LM5 a pAg E. Se detectó gH mediante inmunotransferencia. Los números a la izquierda representan la posición de migración de los marcadores de PM de 130K y 95K.
Figura 3: R-VG803 infecta células que expresan HER2 como único receptor (células J-HER2), así como células positivas para los receptores de gD naturales, y el virus descendiente se extiende de célula a célula en células J-HER2. Las células J no expresan ningún receptor para wt-HSV. J-HER2, J-Nectina1, J-HVEM sólo expresan el receptor indicado. (A) Las células indicadas se infectaron con R-VG803 (1 UFP/célula tal como se titula en células J-HER2) y se monitorizaron mediante microscopía de fluorescencia roja. (B) Las células J-HER2 se infectaron con R-VG803 (0,01 UFP/célula), se mantuvieron en medio que contenía MAb 52S y se monitorizaron diariamente mediante fluorescencia roja. El aumento del tamaño de placas indica extensión de célula a célula.
Figura 4: caracterización de las rutas de entrada de R-VG803 en células J-HER2 (A-B) y de las rutas de entrada de R-VG803 y R-VG809 en células SK-OV-3 (C). (A, B) El trastuzumab inhibe la infección por R-VG803 de células J-HER2. Las células J-HER2 se infectaron con R-VG803 en presencia de trastuzumab (trastuz) (28 |xg/ml) o IgG de control. La infección se monitorizó mediante microscopía de fluorescencia (A) o citometría de flujo (B). (C) Efectos de trastuzumab y MAb contra HD1 sobre la infección de células SK-OV-3 con R-VG803 o R-VG809. Se incubó previamente R-VG803 con HD1 (concentración final de 1 |xg/ml) y, a continuación, se dejó que infectaran a las células SK-OV-3, en triplicados. Cuando se indicó, se trataron previamente las células con trastuzumab (concentración final de 28 |xg/ml). El grado de infección se cuantificó 24 horas después por medio de citometría de flujo (BD Accuri C6) y se expresó como porcentaje en relación con las células infectadas con virus sin tratar. Cada valor representa el promedio de triplicados.
Figura 5: R-VG809 infecta células que expresan HER2 como único receptor (J-HER2, CHO-HER2), así como a células SK-OV-3, y no puede infectar J-HVEM, J-Nectina ni células humanas y animales negativas para la expresión de HER2 y positivas para los receptores de gD naturales. Las células se infectaron a 3 UFP/célula y se monitorizó la infección 24 horas después.
Figura 6: R-VG805 infecta células J-HER2, J-EGFR, CHO-EGFR, U251-EGFR-vIII, y no puede infectar células J-Nectina1 y J-HVEM, así como células wt-CHO-KI negativas para el receptor.
Figura 7: infección con R-VG811 de células J-HER2, SK-OV-3, así como J-Nectina1 y J-HVEM (A), y determinación del grado de infección por el virus (B-D). (A) R-VG811 infecta células J-HER2, SK-OV-3, así como J-Nectina1 y J-HVEM. (B) Comparación de la cantidad de células infectadas obtenida tras la transfección de R-VG811, o ADN-BAC de R-VG803, en células J-HER2 o SK-OV-3. (C-D) Cuantificación de la infección en células transfectadas con ADN_BAC por medio de detección con m-Cherry.
Figura 8: curva de replicación de R-VG803 y R-VG809, en comparación con R-LM113, R-LM249 y R-LM5 en células J-HER2 o SK-OV-3. (A) Curvas de crecimiento de R-VG803 y de R-LM113 en J-HER2, (B) curvas de crecimiento de R-VG803, R-VG809 y R-LM5 en J-HER2. R-VG803, R-VG809, R-LM113, R-LM249 y R-LM5 en células SK-OV-3 (C). Las células se infectaron a 0,1 UFP/célula (A, C) o 0,01 UFP/célula (B) de virus titulado en la misma línea celular, recogido en los tiempos indicados. El virus descendiente se tituló en células J-HER2 (A, B) o SK-OV-3 (C). Los resultados son el promedio de, como mínimo, dos experimentos independientes.
Figura 9: capacidad de destrucción por parte de R-VG803 y R-VG809 de células SK-OV-3, en comparación con la capacidad de destrucción por parte de R-LM113, R-LM249 y R-LM5. Los resultados se muestran como viabilidad de células SK-OV-3, infectadas con los virus indicados a 2 UFP/célula, tal como se determina mediante AlamarBlue, en monocapas por triplicado. La figura representa el promedio de triplicados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Antes de que la presente invención se describa con detalle a continuación, se debe entender que la presente invención no se limita a la metodología, los protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende habitualmente un experto habitual en la materia.
Preferentemente, los términos utilizados en el presente documento se definen tal como se describe en “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza).
En lo siguiente, se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, se debe entender que se pueden combinar de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos y las realizaciones preferentes descritos de manera diversa no se deben interpretar como que limitan la presente invención únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Esta descripción se debe entender como que respalda y engloba realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos dados a conocer y/o preferentes. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud se debe considerar dada a conocer por la descripción de la presente solicitud, a menos que el contexto indique lo contrario.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se deben entender como que implican la inclusión de un número entero o una etapa, o un grupo de números enteros o etapas, indicado pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa, o grupo de números enteros o etapas. Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen los referentes en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un virus del herpes infeccioso recombinante, que comprende
(a) un ligando polipeptídico heterólogo, en el que el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con el extremo N-terminal de la glicoproteína H (gH) madura o de una gH truncada hasta el aminoácido 48 de la SEQ ID NO: 1, o insertado en la gH dentro de la región N-terminal comenzando en cualquiera de los aminoácidos 19 a 23 y acabando en el aminoácido 48, y en el que el ligando polipeptídico heterólogo no es la glicoproteína D (gD) del virus del herpes, ni un fragmento de la misma, que se une específicamente a un ligando celular de gD, y
(b) una gD alterada que tiene unión reducida o inespecífica a ligandos celulares de gD, en el que la gD comprende un ligando polipeptídico heterólogo fusionado con el extremo N-terminal de la gD madura o de una gD truncada, o insertado en la gD.
El término virus del herpes “recombinante”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un virus del herpes que ha sido modificado por ingeniería genética para expresar una proteína heteróloga. En la técnica se conocen bien procedimientos para crear virus del herpes recombinantes, véase, por ejemplo, Sandri-Goldin et al., Alpha Herpesviruses: Molecular and Cellular Biology, Caister Academic Press, 2006.
El término virus del herpes “infeccioso”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un virus del herpes que es capaz de entrar en una célula diana y de producir proteínas codificadas por el genoma viral, incluyendo las proteínas heterólogas comprendidas en el mismo. En un significado preferente, el virus del herpes también es capaz de producir virus descendientes en la célula diana en la que entra.
El término “virus del herpes”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un miembro de la familia Herpesviridae de virus de ADN bicatenario, que provocan infecciones latentes o líticas. Los virus del herpes comparten todos una estructura común: todos los virus del herpes están compuestos por genomas de ADN lineal bicatenario relativamente grande que codifica 100-200 genes atrapados dentro de una cubierta proteica icosaédrica, denominada cápside, que a su vez está envuelta en una capa proteica, denominada tegumento, que contiene tanto proteínas virales como ARNm virales, y una membrana bicapa lipídica, denominada envoltura. Esta partícula completa también se denomina virión.
El término polipéptido “heterólogo”, tal como se utiliza en el presente documento, con respecto al virus del herpes se refiere a un polipéptido que no es nativo del virus del herpes. Como mínimo, no es nativo de la cepa del virus del herpes particular utilizada, sin embargo, en un significado preferente, tampoco es nativo de ningún otro virus del herpes. El término también excluye proteínas derivadas de un virus del herpes, que están alteradas genéticamente, es decir, tales proteínas del virus del herpes alteradas genéticamente no son polipéptidos heterólogos dentro del significado definido del término. En una realización particular, el ligando polipeptídico heterólogo no es la glicoproteína D (gD) del virus del herpes, ni un fragmento de la misma, que se une específicamente a un ligando celular de gD.
El término “fusionado” o “fusión”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la unión de dos polipéptidos diferentes mediante enlaces peptídicos, ya sea directa o indirectamente a través de uno o varios ligadores peptídicos. En una realización preferente relacionada con gH, el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con el extremo N-terminal de la gH madura o de una gH madura truncada. En una realización preferente relacionada con gD, el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con el extremo N-terminal de la gD madura o de una gD madura truncada.
Un ligador peptídico tiene una longitud entre 1 y 30 aminoácidos, preferentemente de 5 a 15 aminoácidos, más preferentemente de 8-12 aminoácidos, y puede consistir en cualquier aminoácido. Preferentemente, comprende el/los aminoácido(s) Gly y/o Ser, más preferentemente comprende, como mínimo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en Gly y Ser. De la manera más preferente, consiste en los aminoácidos Gly y/o Ser. Los ligadores basados en Gly y Ser son preferentes porque proporcionan flexibilidad, buena solubilidad y resistencia a la proteólisis.
El término glicoproteína “madura”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una glicoproteína que carece del péptido señal N-terminal. Con respecto a gH, se refiere preferentemente a gH que carece de los aminoácidos 1-18 de la gH, según la SEQ ID NO: 1, o una región correspondiente de una gH homóloga. Con respecto a gD, se refiere, preferentemente, a gD que carece de los aminoácidos 1-25 de la gD, según la SEQ ID NO: 4, o una región correspondiente de una gD homóloga.
El término glicoproteína “truncada”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una glicoproteína del virus del herpes, preferentemente una glicoproteína del virus del herpes madura que carece de una porción N-terminal. En una realización particular, la gH está truncada hasta (es decir, el truncamiento incluye) cualquiera de los aminoácidos 18 a 48 (es decir 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 o 48), en particular, el aminoácido 23, 24 o 48 de la gH, según la SEQ iD nO: 1 (un truncamiento hasta el aminoácido 18 da como resultado la gH madura). En otra realización particular, la gD está truncada hasta (es decir, el truncamiento incluye) cualquiera de los aminoácidos 25 a 64 (es decir 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 o 64), en particular, el aminoácido 64 de la gD, según la SEQ ID NO: 4 (un truncamiento hasta el aminoácido 25 da como resultado la gD madura).
El término “glicoproteína H” o “gH”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una glicoproteína de la envoltura del virión de 110 kDa que desempeña un papel en la infectividad del virus del herpes. En particular, en forma de un heterodímero con la glicoproteína L del virus del herpes. En el presente documento, está representada por gH de HSV-1, según la SEQ ID NO: 1 (precursor de gH o gH de longitud completa, que incluye la secuencia señal; la gH madura carece de esta secuencia señal, es decir, los residuos 1-18 de la SEQ ID NO: 1). Sin embargo, los homólogos de gH se hallan en todos los miembros de la familia del virus del herpes y, de este modo, las secuencias homólogas pueden variar (véanse también a continuación los homólogos preferentes). Por tanto, los homólogos de gH de HSV-1 también están englobados por la presente invención. En una realización preferente, tales homólogos de gH de HSV-1 tienen una secuencia de aminoácidos que es, como mínimo, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia, según la SEQ ID NO: 1, y conservan, preferentemente como tipo natural (es decir, sin modificar), la capacidad de formar un heterodímero con la glicoproteína L del virus del herpes. Como mínimo, entre los virus del herpes humano y de mono, la gH está conservada. Se conocen las estructuras cristalinas de la porción extracelular de tres proteínas gH: una de la gH de HSV-2 del virus del herpes alfa (Chowdary et al., Nat Struct Mol Biol 2010 17:882-888), una del PrV porcino (Backovic et al., PNAS 2012 107(52) 22635-22640), también un virus del herpes alfa, y una del virus de Epstein-Barr (Matsuura et al., PNAS, 2010 107(52) 22641-22646), un virus del herpes gamma. Son sustancialmente similares, por ejemplo, en todas las estructuras cristalinas está presente una organización en dominios estructuralmente similares.
El término “gD” o “glicoproteína D” se refiere a un componente de la envoltura del virión del virus del herpes que desempeña un papel esencial en la entrada de HSV en las células. La gD se une a moléculas celulares, concretamente Hv Em y Nectina-1, tras la interacción inicial de las glicoproteínas gC y gB del virus del herpes con proteoglicanos de sulfato de heparano. En el presente documento está representada por gD de HSV-1, según la SEQ ID NO: 4 (precursor de gD o gD de longitud completa), que incluye la secuencia señal; la gD madura carece de esta secuencia señal, es decir, los residuos 1-25 de la SEQ ID NO: 4). Sin embargo, los homólogos de gD (véanse también a continuación los homólogos preferentes) se hallan en otros miembros de la familia del virus del herpes y, de este modo, las secuencias homólogas pueden variar. Por tanto, los homólogos de gD de HSV-1 también están englobados por la presente invención. En una realización preferente, tales homólogos de gD de HSV-1 tienen una secuencia de aminoácidos que es, como mínimo, el 70 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % idéntica a la secuencia, según la SEQ ID NO: 4, y conservan, como tipo natural (es decir, sin modificar), la capacidad de unirse a HVEM y Nectina-1 o, más general, a receptores celulares que permiten que el homólogo de gD fomente, en forma de cascada, la fusión de la envoltura vírica con las membranas celulares.
En una realización preferente, el virus del herpes se selecciona entre el grupo que consiste en virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus de la varicela-zóster (virus del herpes humano 3 (HHV-3)), virus de la pseudorrabia (PRV) del virus del herpes alfa porcino, virus del herpes alfa1 de chimpancé (ChHV), virus del herpes de Papiine 2 (HVP2), virus del herpes de cercopitecino 2 (CeHV2), virus del herpes de macacino 1 (MHV1), virus del herpes de Saimiriine 1 (HVS1), virus del herpes de callitricino 3 (CalHV3), virus del herpes de Saimiriine 2 (HVS2), virus del herpes bovino 1 (BoHV-1), virus del herpes bovino 5 (BoHV-5), virus del herpes equino 1 (EHV-1), virus del herpes equino 2 (EHV-2), virus del herpes equino 5 (EHV-5), virus del herpes canino 1 (CHV), virus del herpes felino 1 (FHV-1), virus de la enteritis de pato (DEV), virus del herpes alfa del murciélago de la fruta 1 (FBAHV1), virus del herpes bovino 2 (BoHV-2), virus del herpes de lepórido 4 (LHV-4), virus del herpes equino 3 (EHV-3), virus del herpes equino 4 (eHv -4), virus del herpes equino 8 (EHV-8), virus del herpes equino 9 (EHV-9), virus del herpes de cercopitecino 9 (CeHV-9), virus del herpes de suido 1 (SuHV-1), virus de la enfermedad de Marek (MDV), serotipo 2 del virus de la enfermedad de Marek (MDV2), virus del herpes de falcónido de tipo 1 (FaHV-1), virus del herpes aviar 3 (GaHV-3), virus del herpes aviar 2 (GaHV-2), virus del herpes asociado a la enfermedad de pulmones-ojos-tráquea (LETV), virus del herpes aviar 1 (GaHV-1), virus del herpes de psitácido 1 (PsHV-1), virus del herpes humano 8 (HHV-8), virus del herpes humano 4 (HHV-4), virus del herpes de quelónido 5 (CHHV5), virus del herpes de atelino 3 (AtHV3) o virus del herpes de Meleagride 1 (MeHV-1). Estos virus tienen todos, como mínimo, una gH con una homología clara con la gH de HSV-1/-2. En una realización más preferente, el virus del herpes es HSV-1 o HSV-2.
El término “insertado” o “inserción”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la incorporación de un polipéptido en otro polipéptido, en la que el polipéptido incorporado se une al polipéptido huésped mediante enlaces peptídicos, ya sea directa o indirectamente a través de uno o varios ligadores peptídicos, más específicamente a través de un ligador peptídico N-terminal y/o C-terminal con respecto al inserto. Aunque la fusión de un ligando peptídico con la gH/gD madura también se puede ver como una inserción en el precursor de gH/gD, según las SEQ ID NO 1/4, respectivamente, una inserción de este tipo se denomina en el presente documento fusión N-terminal, puesto que el virión porta la glicoproteína madura. Por tanto, el término “inserción” se refiere, preferentemente, a una inserción en una glicoproteína madura, en particular gH y gD.
El ligando polipeptídico heterólogo está insertado dentro de la región N-terminal de gH comenzando en cualquiera de los aminoácidos 19 a 23 (preferentemente 19) y acabando en el aminoácido 48 de la gH, según la SEQ ID NO: 1, o una región correspondiente de una gH homóloga. En una realización más preferente, está insertado dentro de la región N-terminal de gH comenzando en el aminoácido 19 y acabando en el aminoácido 48 de la gH, según la SEQ ID NO: 1, o una región correspondiente de una gH homóloga. En otra realización más preferente, está insertado dentro de la región N-terminal de gH comenzando en el aminoácido 23 y acabando en el aminoácido 48 de la gH, según la SEQ ID NO: 1, o una región correspondiente de una gH homóloga. En todas estas realizaciones, los aminoácidos que definen el inicio y el final de una región están incluidos en la región, es decir, la inserción puede ser o bien N-terminal o bien C-terminal respecto al aminoácido inicial o final. En el caso particular de una inserción N-terminal del residuo 19 de la SEQ ID NO: 1, la inserción también se puede ver como una fusión con el extremo N-terminal de la gH madura. Por tanto, para distinguir los términos “inserción” y “fusión” claramente, este caso particular se excluye, preferentemente, de las posibles inserciones y se clasifica como una fusión con el extremo N-terminal de la gH madura tal como se describe.
Además, en todas estas realizaciones, dicha región se puede reemplazar por la inserción. En el caso particular de la inserción que reemplaza una región que comprende el residuo 19 de la SEQ ID NO: 1, la inserción también se puede ver como una fusión con el extremo N-terminal de una gH madura truncada. Por tanto, para distinguir los términos “inserción” y “fusión” claramente, este caso particular se excluye, preferentemente, de las posibles inserciones y se clasifica como una fusión con el extremo N-terminal de una gH madura truncada tal como se describe.
En la realización más preferente, el ligando está insertado entre el aminoácido 23 y el aminoácido 24 de la gH, según la SEQ ID NO: 1, o una región correspondiente (en este caso, correspondiente a dichos aminoácidos 23 y 24) de una gH homóloga.
En una realización particular, uno o varios aminoácidos de gH de la región N-terminal, tal como se especificó anteriormente, están delecionados. En una realización relacionada, la gH está truncada, tal como se especificó anteriormente.
El término “región correspondiente de una gH homóloga” se refiere a una región de una gH que se alinea con una región dada de gH de HSV-1 (preferentemente la región de la inserción, tal como se definió anteriormente), según la SEQ ID NO: 1, cuando se utiliza el algoritmo de Smith-Waterman y los siguientes parámetros de alineación: MATRIZ: BLOSUM62, APERTURA DE HUECO: 10, EXTENSIÓN DE HUECO: 0,5. En el caso de que solo una parte o partes de la región dada de gH de HSV-1 se alinee con la secuencia de una gH homóloga utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores, el término “región correspondiente de una gH homóloga” se refiere a la región que se alinea con la(s) parte(s) de la región dada de gH de HSV-1. En otras palabras, en este caso, la región en la gH homóloga, en la que el ligando está insertado o que está reemplazada por el ligando, comprende solo los aminoácidos que se alinean con la(s) parte(s) de la región dada de gH de HSV-1. Además, en el mismo caso, el término “región correspondiente de una gH homóloga” puede referirse a una región que está flanqueada por secuencias flanqueantes correspondientes, en la que las secuencias flanqueantes correspondientes son secuencias de la gH homóloga que se alinean, utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores, con secuencias que flanquean la región dada anterior (preferentemente la región de la inserción, tal como se definió anteriormente) de gH de HSV-1. Estas secuencias flanqueantes de gH de HSV-1 tienen una longitud de, como mínimo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos (la secuencia flanqueante en el extremo N-terminal de gH, es decir, N-terminal, cualquier residuo de aminoácido 19 a 23, según la SEQ ID NO: 1, puede ser más corta, es decir, tal como se especifica pero hasta una longitud de 18, 19, 20, 21 o 22 residuos de aminoácido) y se alinean con la secuencia de una gH homóloga utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores.
La gH homóloga es, preferentemente, gH del virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus de la varicela-zóster (virus del herpes humano 3, h Hv -3), virus de la pseudorrabia (PRV) del virus del herpes alfa porcino, virus del herpes alfa1 de chimpancé (ChHV), virus del herpes de Papiine 2 (HVP2), virus del herpes de cercopitecino 2 (CeHV2), virus del herpes de macacino 1 (MHV1), virus del herpes alfa del murciélago de la fruta 1 (FBAHV1), virus del herpes de Saimiriine 1 (HVS1), virus del herpes de callitricino 3 (CalHV3), virus del herpes de Saimiriine 2 (HVS2), virus del herpes bovino 1 (BoHV-1), virus del herpes bovino 5 (BoHV-5), virus del herpes equino 1 (EHV-1), virus del herpes equino 2 (EHV-2), virus del herpes equino 5 (EHV-5), virus del herpes canino 1 (CHV), virus del herpes felino 1 (FHV-1), virus del herpes de cercopitecino 9 (CeHV-9), virus de la enteritis de pato (DEV, AnHV-1), virus del herpes bovino 2 (BoHV-2), virus del herpes de lepórido 4 (LHV-4), virus del herpes equino 3 (EHV-3), virus del herpes equino 4 (EHV-4), virus del herpes equino 8 (EHV-8), virus del herpes equino 9 (EhV-9), virus de la enfermedad de Marek (MDV), serotipo 2 del virus de la enfermedad de Marek (MDV2), virus del herpes aviar 3 (GaHV-3), virus del herpes aviar 2 (GaHV-2), virus del herpes asociado a la enfermedad de pulmones-ojos-tráquea (LETV), virus del herpes aviar 1 (GaHV-1), virus del herpes de psitácido 1 (PsHV-1), virus del herpes humano 8 (HhV-8), virus del herpes humano 4 (HHV-4), virus del herpes de falcónido de tipo 1 (FaHV-1), virus del herpes de quelónido 5 (c HhV5), virus del herpes de atelino 3 (AtHV3) o virus del herpes de Meleagride 1 (MeHV-1). Estos virus del herpes y HSV-1 tienen secuencias de gH que son altamente conservadas con respecto a la de HSV-1. Más preferentemente, la gH homóloga es gH del virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus del herpes alfa1 de chimpancé (CHHV), virus del herpes de Papiine 2 (HVP2), virus del herpes de cercopitecino 2 (CeHV2), virus del herpes de macacino 1 (MHV1), virus del herpes alfa del murciélago de la fruta 1 (FBAHV1), virus del herpes bovino 2 (BoHV-2) o virus del herpes de lepórido 4 (LHV-4). De la manera más preferente, la gH homologa es gH del virus del herpes simple 2 (HSV-2).
El ligando polipeptídico heterólogo está insertado de manera N-terminal respecto al dominio H1A de gH. Insertado de manera N-terminal a este respecto no significa adyacente al dominio H1A en el lado N-terminal, sino en cualquier parte en el lado N-terminal del dominio H1A. El dominio H1A de gH es un subdominio del dominio HI de gH. El dominio HI se extiende desde el aminoácido 49 a 327 de la proteína gH, según la SEQ ID NO: 1, y el dominio H1A se extiende desde el aminoácido 49 a 115 de la proteína gH, según la SEQ ID NO: 1 (Chowdary et al., 2010). Muchas proteínas gH tienen un dominio H1A, que se puede identificar por alineación de secuencias con la SEQ ID NO: 1, o por similitud estructural dentro del dominio HI como es el caso para gH del virus de la varicela-zóster (virus del herpes humano 3). No todos los virus del herpes pueden tener una gH con una región correspondiente a los aminoácidos 1 a 48 de la proteína gH, según la s Eq iD NO: 1. Sin embargo, cada gH madura tiene, como mínimo, algún/algunos aminoácido(s), por ejemplo, 1, 2 o 3, de manera N-terminal respecto al dominio H1A. Un ejemplo es el EBV, en el que solo 1 residuo precede al dominio H1A en el péptido maduro (suponiendo que el dominio H1A comienza en el primer residuo visible en la estructura de rayos X, es decir, para la posición 19 del EBV del precursor de gH). En el caso de una gH en la que esta región precedente sea muy corta, por ejemplo, 10 o menos, 5 o menos o 3 o menos aminoácidos, se prevé que la inserción está detrás (es decir, C-terminal) de estos residuos y que, opcionalmente, estos residuos están duplicados detrás de la inserción, es decir, entre la inserción y el dominio H1A.
En una realización del primer aspecto de la presente invención, el virus del herpes tiene una virulencia reducida con respecto a la virulencia del virus de tipo natural o tiene una capacidad de replicación que es diferente en células enfermas frente a células no enfermas. El término “virulencia del virus de tipo natural” se refiere a la capacidad de infectar, en particular de entrar en las células, que tiene el virus del herpes de tipo natural, es decir, no recombinante. En una realización particular, la virulencia reducida es una capacidad reducida o incluso eliminada de unirse a los receptores de superficie celular diana a los que se une el virus de tipo natural. Tales receptores de superficie celular diana incluyen, por ejemplo, HVEM (sinónimos utilizados en la técnica: HveA y TNFRSF14) y Nectina-1 (sinónimos utilizados en la técnica: HveC y PVRL1), a los que se une gD, proteoglicanos de sulfato de heparano a los que se unen gB y gC, glicoproteína asociada a la mielina MAG, receptor alfa de tipo 2 similar a inmunoglobina emparejada (PILRalfa), DC-SIGN y cadena pesada 9 de miosina no muscular MYH9/NMHC-IIA a los que se une gB e integrina ITGB3/avp3 a la que se une gH-gL, integrina alfavbeta6 e integrina alfavbeta8 a las que se une gH (Gianni T, Salvioli S, Chesnokova LS, Hutt-Fletcher LM, Campadelli-Fiume G. PLoS Pathog.
2013;9(12):e1003806). La unión reducida o eliminada se puede conseguir, por ejemplo, delecionando o alterando las glicoproteínas virales (por ejemplo, gD, gB o gC), o partes de las mismas, que están implicadas en la interacción con receptores de superficie celular diana.
El término “capacidad de replicación” se refiere al número de veces que un virus del herpes se puede copiar a sí mismo en una célula infectada en un momento dado. Preferentemente, cuando la capacidad de replicación es diferente en células enfermas frente a células no enfermas, es mayor en células enfermas que en células no enfermas (es decir, aumentada para células enfermas), o menor en células no enfermas que en células enfermas (es decir, disminuida para células no enfermas).
El virus del herpes infeccioso recombinante comprende una gD alterada que tiene unión reducida o inespecífica a ligandos celulares de gD o carece de gD.
En una realización más preferente, el virus del herpes tiene una gD que tiene una deleción de aminoácidos comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 26 a 33 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 31 a 63 (preferentemente comenzando en el residuo 31 y acabando en el residuo 63), y/o comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 65 a 86 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 235 a 243 (preferentemente comenzando en el residuo 86 y acabando en el residuo 243) de la gD, según la SEQ ID NO: 4, o una región correspondiente de una gD homóloga. Con respecto a la gD madura, que carece del péptido señal de 25 aminoácidos N-terminal, esta significa una deleción de aminoácidos comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 1 a 8 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 6 a 38 (preferentemente comenzando en el residuo 6 y acabando en el residuo 38), y/o comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 40 a 61 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 210 a 218 (preferentemente comenzando en el residuo 61 y acabando en el residuo 218) de la gD madura, respectivamente. En las mismas, los residuos inicial y final están comprendidos en la deleción. El término “región correspondiente de una gD homóloga” se refiere a una región de una gD que se alinea con una región dada de gD de HSV-1 (preferentemente la deleción tal como se describió anteriormente), según la SEQ ID NO: 4, cuando se utiliza el algoritmo de Smith-Waterman y los siguientes parámetros de alineación: MATRIZ: BLOSUM62, APERTURA DE HUECO: 10, EXTENSIÓN DE HUECO: 0,5. En el caso de que solo una parte o partes de la región dada de gD de HSV-1 se alinee con la secuencia de una gD homóloga utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores, el término “región correspondiente de una gD homóloga” se refiere a la región que se alinea con la(s) parte(s) de la región dada de gD de HSV-1. En otras palabras, en este caso, la deleción en la gD homóloga comprende solo los aminoácidos que se alinean con la(s) parte(s) de la región dada de gD de HSV-1. Además, en el mismo caso, el término “región correspondiente de una gD homóloga” puede referirse a una región que está flanqueada por secuencias flanqueantes correspondientes, en la que las secuencias flanqueantes correspondientes son secuencias de la gD homóloga que se alinean, utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores, con secuencias que flanquean la región dada anterior (preferentemente la deleción tal como se describió anteriormente) de gD de HSV-1. Estas secuencias flanqueantes de gD de HSV-1 tienen una longitud de, como mínimo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos (la secuencia flanqueante en el extremo N-terminal de la gD, es decir, N-terminal respecto a cualquier residuo de aminoácido 26 a 33, según la SEQ ID NO: 4, puede ser más corta, es decir, tal como se especifica pero hasta una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 residuos de aminoácido) y se alinean con la secuencia de una gD homóloga utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores. La gD homóloga es, preferentemente, gD de HSV-2, gD del virus del herpes alfa1 de chimpancé (CHHV), gD del virus del herpes de macacino 1 (MHV1), gD del virus del herpes de Papiine 2 (HVP2), gD del virus del herpes de cercopitecino 1 (CeHV1), gD del virus del herpes de cercopitecino 2 (CeHV2), gD virus del herpes de Saimiriine 1 (HVS1), gD del virus del herpes bovino 1 (BoHV-1), gD del virus del herpes bovino 5 (BoHV-5), gD del virus del herpes equino 1 (EHV-1), gD del virus del herpes equino 3 (EHV-3), gD del virus del herpes equino 4 (EHV-4), gD del virus del herpes equino 8 (EHV-8), gD del virus del herpes equino 9 (EHV-9), gD del virus del herpes canino 1 (CHV), gD del virus del herpes felino 1 (FHV-1), gD del virus de la enteritis de pato (DEV), gD del virus del herpes de alce (ElkHV), gD del virus del herpes rangiferino (RanHV), gD del virus del herpes de cérvido 1 (CerHV-1), virus del herpes de lepórido 4 (LHV-4), virus del herpes de cérvido 2 (CerHV-2), gD del virus del herpes caprino 1 (CapHV-1), gD del virus del herpes bufalino 1 (BuHV1), gD del virus del herpes alfa del murciélago de la fruta 1 (FBAHV1), gD del virus del herpes de macropódido 1 (MaHV-1), virus del herpes de falcónido 1 (FaHV-1), gD del virus del herpes de macropódido 2 (MaHV-2), gD del virus de la pseudorrabia porcino (PrV), virus del herpes de fócido 1 (PHHV-1), virus de la enfermedad de Marek (MDV), virus del herpes de pavo (HVT), virus del herpes de Meleagride 1 (MeHV-1), gD del virus del herpes aviar 1 (GaHV-1), gD del virus del herpes aviar 2 (GaHV-2) o gD del virus del herpes de buitre (VHV). Más preferentemente, la gD homóloga es la gD de HSV-2, gD del virus del herpes alfa1 de chimpancé (CHHV), gD del virus del herpes de Papiine 2 (HVP2), de virus del herpes de macacino 1 (MHV1), gD del virus del herpes de cercopitecino 1 (CeHV1), gD del virus del herpes alfa del murciélago de la fruta 1 (FBAHV1), gD del virus del herpes de cercopitecino 2 (CeHV2), gD del virus del herpes de macropódido 2 (MaHV-2) o gD del virus del herpes de Saimiriine 1 (HVS1). De la manera más preferente, la gD homóloga es la gD de HSV-2.
En otra realización del primer aspecto de la presente invención, el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con un dominio que es equivalente funcionalmente al extremo N-terminal de gD y está presente en una proteína cuya función es equivalente a la gD de HSV, por ejemplo, gp42 del virus del herpes humano 4 (EBV), BZLF2 del virus del herpes de macacino, ORF44 del virus del herpes de callitricino 3 o BZLF2 del virus del herpes linfotrópico porcino 1.
El virus del herpes también puede estar atenuado, por ejemplo, mediante deleciones en o alteraciones de los genes virales ^34.5, UL39 y/o ICP47. El término “atenuado” se refiere a un virus del herpes debilitado o menos virulento. Es preferente una atenuación condicional, en la que la atenuación afecta solo a células no enfermas no dirigidas por el virus del herpes mediante la redirección, según la presente invención. Por tanto, solo las células enfermas (por ejemplo, células cancerosas) a las que se redirige el virus del herpes están afectadas por la virulencia completa del virus del herpes. Una atenuación condicional se puede conseguir, por ejemplo, mediante la sustitución de la región promotora del gen ^34.5, UL39 y/o ICP47 con un promotor de un gen humano que se expresa exclusivamente en células cancerosas (por ejemplo, el promotor survivina). Modificaciones adicionales de una atenuación condicional pueden incluir la sustitución de regiones reguladoras responsables de la transcripción de genes IE, como la región promotora ICP-4, con regiones promotoras de genes expresados exclusivamente en células enfermas, por ejemplo, cancerosas (por ejemplo, el promotor survivina). Este cambio dará como resultado un HSV condicional en replicación, que se puede replicar en células cancerosas pero no en células normales. Una modificación adicional del virus puede incluir la inserción de elementos de secuencia sensibles a microARN (miR), que son abundantes en células normales pero no en tumorales, en la región sin traducir 3’ de genes de HSV esenciales, como ICP4. El resultado será de nuevo un virus cuya replicación es incompetente solo en células normales.
El término “genes IE” se refiere a genes tempranos inmediatos, que son genes activados de manera transitoria y rápida en respuesta a un estímulo celular.
En otra realización del primer aspecto de la presente invención, el virus del herpes comprende un ligando polipeptídico heterólogo fusionado con el extremo N-terminal de la gD madura o de una gD truncada, o insertado en la gD (también denominada en el presente documento gD modificada). En una realización preferente, el ligando polipeptídico heterólogo insertado en la gD está insertado de manera C-terminal respecto a cualquiera de los aminoácidos 26 a 243 de la gD, según la SEQ ID NO: 4 (1 a 218 de la gD madura) o reemplaza una secuencia de aminoácidos comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 26 a 33 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 31 a 63 (preferentemente comenzando en el residuo 31 y acabando en el residuo 63), y/o comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 65 a 86 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 235 a 243 (preferentemente comenzando en el residuo 86 y acabando en el residuo 243) de la gD, según la SEQ ID NO: 4, o una región correspondiente de una gD homóloga. De nuevo, el término “región correspondiente de una gD homóloga” se refiere a una región de una gD que se alinea con una región dada de gD de HSV-1 (preferentemente la secuencia de aminoácidos que se va a reemplazar tal como se describió anteriormente), según la SEQ ID NO: 4, cuando se utiliza el algoritmo de Smith-Waterman y los siguientes parámetros de alineación: MATRIZ: BLOSUM62, APERTURA DE HUECO: 10, EXTENSIÓN DE HUECO: 0,5. En el caso de que solo una parte o partes de la región dada de gD de HSV-1 se alinee con la secuencia de una gD homologa utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores, el término “región correspondiente de una gD homóloga” se refiere a la región que se alinea con la(s) parte(s) de la región dada de gD de HSV-1. En otras palabras, en este caso, la secuencia que se va a reemplazar en la gD homóloga comprende solo los aminoácidos que se alinean con la(s) parte(s) de la región dada de gD de HSV-1. Además, en el mismo caso, el término “región correspondiente de una gD homóloga” puede referirse a una región que está flanqueada por secuencias flanqueantes correspondientes, en la que las secuencias flanqueantes correspondientes son secuencias de la gD homóloga que se alinean, utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores, con secuencias que flanquean la región dada anterior (preferentemente la secuencia de aminoácidos que se va a reemplazar tal como se describió anteriormente) de gD de HSV-1. Estas secuencias flanqueantes de gD de HSV-1 tienen una longitud de, como mínimo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 o 50 aminoácidos (la secuencia flanqueante en el extremo N-terminal de gD, es decir, N-terminal respecto a cualquier residuo de aminoácido 26 a 33, según la SEQ ID NO: 4, puede ser más corta, es decir, tal como se especifica pero hasta una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 residuos de aminoácido) y se alinean con la secuencia de una gD homóloga utilizando el algoritmo y los parámetros anteriores. La gD homóloga es tal como se especificó anteriormente con respecto a la deleción de gD.
En una realización preferente del primer aspecto de la presente invención, el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gH y/o gD se une a una molécula diana, o a una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula. Preferentemente, se une específicamente a una molécula, o a una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula. El término “se une específicamente”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de dicha molécula en una población heterogénea de proteínas y, en particular, células, tales como en un organismo, preferentemente un cuerpo humano. De este modo, el ligando especificado se une a su molécula diana particular y no se une en una cantidad sustancial a otras moléculas presentes en las células o a otras moléculas con las que el ligando puede entrar en contacto en un organismo. En general, un ligando que “se une específicamente” a una molécula diana tiene una constante de afinidad en equilibrio superior a aproximadamente 105 (por ejemplo, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 y 1012 o más) moles/litro por esa molécula diana. En general, el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gH se puede unir a la misma molécula, o a una diferente, o a una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula que el ligando polipeptídico fusionado con o insertado en la gD. Se cree que la unión a la misma molécula aumenta el grado de unión a la molécula, mientras que la unión a moléculas diferentes otorga una especificidad dual, y permite: 1) un mantenimiento de la especificidad celular en el caso de que una de las moléculas ya no esté presente en la superficie celular, por ejemplo, en el caso de una célula tumoral mutada; 2) lidiar con la heterogeneidad tumoral: los tumores son heterogéneos y, con frecuencia, una molécula específica de tumor no se expresa en todas las células tumorales; por tanto, la dirección dual permite al virus entrar en las células utilizando o bien el primer receptor dirigido o bien el segundo, aumentando de ese modo el número de células tumorales que se pueden infectar.
En una realización, el ligando polipeptídico heterólogo se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un derivado de anticuerpo y un mimético de anticuerpo. El anticuerpo, derivado de anticuerpo o mimético de anticuerpo puede ser monoespecífico (es decir, específico de una molécula diana, o de una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula) o multiespecífico (es decir, específico de más de una molécula diana, o de una parte de la misma, accesible en la superficie de la misma célula, o una diferente), por ejemplo, biespecífico o triespecífico (véase, por ejemplo, Castoldi et al., Oncogene. 12 de diciembre de 2013;32(50):5593-601; Castoldi et al., Protein Eng Des Sel. Octubre de 2012;25(10):551-9). La dirección simultánea de más de una molécula diana, o de una parte de la misma, accesible en la superficie de la misma célula aumenta la especificidad del virus. La dirección simultánea de más de una molécula diana, o de una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula diferente permite lidiar con la heterogeneidad tumoral, tal como se describió anteriormente.
El término “derivado de anticuerpo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende, como mínimo, un dominio variable de anticuerpo, pero que no tiene la estructura global de un anticuerpo, tal como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY o IgW, aunque aun así es capaz de unirse a una molécula diana. Dichos derivados pueden ser, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpo funcionales (es decir, que se unen a la diana, particularmente que se unen a la diana de manera específica), tales como Fab, Fab2, scFv, Fv o partes de los mismos, u otros derivados o combinaciones de las inmunoglobulinas, tales como nanocuerpos, diacuerpos, minicuerpos, anticuerpos de dominio único de camélido, dominios únicos o fragmentos Fab, dominios de las cadenas pesada y ligera de la región variable (tales como Fd, VL, incluyendo Vlambda y Vkappa, VH, VHH), así como minidominios que consisten en dos cadenas beta de un dominio de inmunoglobulina conectado por, como mínimo, dos bucles estructurales. Preferentemente, el derivado de anticuerpo es monovalente. Más preferentemente, el derivado es un anticuerpo monocatenario que, de la manera más preferente, tiene la estructura VL-ligador peptídico-VH o VH-ligador peptídico-VL.
El término “mimético de anticuerpo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a compuestos orgánicos que, al igual que los anticuerpos, se pueden unir específicamente a antígenos, pero que no están relacionados estructuralmente con los anticuerpos. Habitualmente son péptidos o proteínas artificiales con una masa molar de aproximadamente 3 a 20 kDa. Ejemplos no limitativos de miméticos de anticuerpo son aficuerpos, afilinas, afímeros, afitinas, anticalinas, avímeros, DARPin, finómeros, péptidos del dominio Kunitz, monocuerpos, dominio Z de la proteína A, gamma B cristalina, ubiquitina, cistatina, Sac7D de Sulfolobus acidocaldarius, lipocalina, dominio A de un receptor de membrana, motivo de repetición de anquirina, dominio SH3 de Fyn, dominio Kunitz de inhibidores de proteasas, el 10° dominio de tipo III de fibronectina, ligandos heterobivalentes o heteromultivalentes sintéticos (Josan et al., Bioconjug Chem. 2011 22(7): 1270-1278; Xu et al., PNAS 2012 109 (52) 21295-21300; Shallal et al., Bioconjug Chem. 201425(2) 393-405) o ligandos peptídicos sintéticos, por ejemplo, de una biblioteca de péptidos (al azar). Los ligandos peptídicos sintéticos tienen secuencias de aminoácidos que no se producen de manera natural que funcionan para unirse a una molécula diana particular. En general, los ligandos peptídicos, dentro del contexto de la presente invención, son secuencias de aminoácidos restringidas (es decir, que tienen algún elemento de estructura como, por ejemplo, la presencia de aminoácidos que inician un giro p o una lámina plegada p, o, por ejemplo, ciclados por la presencia de residuos de Cys unidos por disulfuro) o no restringidas (lineales) de menos de aproximadamente 50 residuos de aminoácido y, preferentemente, menos de aproximadamente 40 residuos de aminoácido. De los ligandos peptídicos de menos de aproximadamente 40 residuos de aminoácido, son preferentes los ligandos peptídicos de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 30 residuos de aminoácido.
En una realización, la célula es una célula enferma. En particular, puede ser una célula tumoral, una célula infectada de manera crónica o una célula senescente.
En el caso de una célula tumoral, la enfermedad subyacente es un tumor, preferentemente seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer suprarrenal, cáncer de ano, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro/SNC, tumores, cáncer de mama, cáncer primario oculto, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia Ewing de tumores, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de la cavidad bucal y de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores de hipófisis, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma - cáncer de partes blandas en adultos, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Las enfermedades tumorales preferentes son cánceres positivos para HER-2 (como cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, osteosarcoma y glioblastoma multiforme), cánceres positivos para EGFR (como cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, cáncer colorrectal y de páncreas), cánceres positivos para EGFR-vIII (como glioblastoma multiforme), cánceres positivos para PSMA (como cáncer de próstata), linfoma positivo para CD20+ y tumores relacionados con EBV.
En el caso de una célula infectada de manera crónica, la enfermedad subyacente es una enfermedad infecciosa crónica, tal como tuberculosis, malaria, hepatitis viral crónica (HBV, virus de la hepatitis D y HCV), síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA, provocado por el HIV, virus de la inmunodeficiencia humana) o trastornos relacionados con EBV: enfermedades autoinmunitarias sistémicas (lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren) y esclerosis múltiple (EM).
En el caso de una célula senescente, la enfermedad subyacente es una enfermedad asociada a senescencia, tal como (i) enfermedades genéticas raras, denominadas síndromes, caracterizadas por un envejecimiento prematuro: síndrome de Werner (SW), síndrome de Bloom (SB), síndrome de Rothmund-Thomson (SRT), síndrome de Cockayne (SC), xerodermia pigmentosa (XP), tricotiodistrofia o síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (SPHG) o (ii) trastornos relacionados con la edad habituales: obesidad, diabetes de tipo 2, sarcopenia, artrosis, fibrosis pulmonar idiopática y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cataratas, enfermedades neurodegenerativas o trastornos relacionados con el tratamiento del cáncer.
En una realización, en cuanto a la molécula diana, o una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula, la molécula diana es una proteína, un glicolípido o un glicósido. Preferentemente, la proteína es un receptor celular. En el caso de una célula tumoral, es preferente que la proteína de superficie celular sea un antígeno asociado a cáncer, tal como HER2, EGFR, EGFRvIII, EGFR3 (ERBB3), MET, FAP, PSMA, CXCR4, ITGB3, CEA, CAIX, mucinas, proteína de unión a folato, GD2, VEGFR1, VEGFR2, CD20, CD30, CD33, CD52, CTLA4, CD55, integrina aVp3, integrina a5p1, IGF1R, EPHA3, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13Ralfa, UPAR, tenascina, PD-1, PD-L1, glicoproteína 72 asociada a tumor, gangliósido GM2, A33, antígeno Y de Lewis o MUC1. En el caso de una célula senescente, la molécula diana es cualquier proteína de superficie que sea expresada por la célula senescente como, por ejemplo, CXCR2 o el receptor de IL-1.
En una realización, la molécula diana, o una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula enferma no es accesible de manera natural en la superficie de la célula, es decir, no es accesible en la superficie de una célula no enferma (es decir, sana) del mismo tipo y/o tejido y, preferentemente, no es accesible en la superficie de ninguna otra célula del mismo organismo. En una realización relacionada en cuanto a enfermedades por infecciones crónicas, la molécula diana es una molécula derivada de un patógeno (por ejemplo, un virus, una bacteria o un parásito) que infectó la célula y se expresa en la superficie de la célula infectada (tal como HBsAg de HBV, gp120 de HIV, E1 y E2 de HCV, LMP1 y LMP2 de EBV). En otra realización, el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gD no se une a ninguna molécula, ni a una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula, pero anula la unión a receptores de HSV naturales. Tal como se indica, en esta realización, el ligando fusionado con o insertado en la gD tiene el propósito de anular la capacidad de gD de unirse a sus receptores naturales. La dirección a la célula diana se logra mediante la fusión con o inserción en una glicoproteína diferente del virus, en particular gH.
En otra realización, el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gH o gD se une a una molécula heteróloga, o a una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula. El término “molécula heteróloga”, tal como se utiliza en el presente documento, con respecto a células se refiere a una molécula que no es nativa de la célula. En particular, no se produce y/o no se puede producir de manera natural (es decir, de manera no recombinante) por la célula. Preferentemente, en el caso de un polipéptido, no está codificado por el genoma nativo (es decir, inalterado de manera recombinante) de la célula. En esta realización, la célula seleccionada como diana por la gH o gD que se une a la molécula heteróloga, o a una parte de la misma, accesible en la superficie de la célula se puede utilizar para el crecimiento, es decir, la propagación, del virus. El modo de propagación es específico para esta célula, y otras células (tales como células de un paciente que se va a tratar utilizando este virus del herpes) no serán seleccionadas como diana por la gH o gD que se une a la molécula heteróloga, o a una parte de la misma.
En una realización adicional del primer aspecto de la presente invención, el virus del herpes infeccioso recombinante comprende un marcador detectable heterólogo, preferentemente en un casete de expresión. El término “marcador detectable”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a marcadores y etiquetas utilizados habitualmente en el sector, por ejemplo, marcadores enzimáticos, tales como fosfatasas y peroxidasas, transportadores de membrana, tales como el cotransportador unidireccional NaI, los radiomarcadores p Et o SPEC o marcadores fluorescentes. Los marcadores fluorescentes incluyen, por ejemplo, GFP y variantes de GFP, por ejemplo, GFP mutantes que tienen un espectro de fluorescencia diferente, RFP (por ejemplo, RFP de mCherry) y variantes de RFP, por ejemplo, GFP mutantes que tienen un espectro de fluorescencia diferente, proteína fluorescente inducible por bilirrubina UnaG, dsRed, eqFP611, Dronpa, TagRFP, KFP, EosFP, Dendra e IrisFp. Para la visualización de tumores, el transportador de membrana cotransportador unidireccional NaI es particularmente adecuado.
Preferentemente, el marcador detectable está insertado en una región que no interfiere en la infección de la célula por el virus o en la multiplicación del virus en la célula o en la propagación del virus que. En particular, la región no interrumpe ninguna superposición ni ninguna unidad de transcripción (sentido o antisentido). Preferentemente, el marcador detectable está insertado en una secuencia intergénica del genoma del virus del herpes, más preferentemente entre las secuencias intergénicas UL37 y UL38, UL3 y UL4 o US1 y US2.
En una realización adicional del primer aspecto, el virus del herpes infeccioso recombinante comprende uno o varios casetes de expresión que expresan uno o varios de los siguientes
i) una o varias proteínas terapéuticas, tales como inmunomoduladores con actividad proinflamatoria o antiinflamatoria (incluyendo citocinas, preferentemente citocinas que estimulan la respuesta inmunitaria como GM-CSF o IL12), anticuerpos, derivados de los mismos o miméticos de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos, derivados de los mismos o miméticos de anticuerpo contra inhibidores del punto de control (por ejemplo, p DL1 , PD1, CTLA4), o proteínas que pueden modificar el microentorno de una enfermedad (por ejemplo, colagenasa), en particular el microentorno de un tumor,
ii) uno o varios antígenos, epítopos/neoepítopos o una cadena de epítopos/neoepítopos heterólogos o autólogos, o
iii) una o varias enzimas de conversión de profármacos, tales como valaciclovir y proteína cinasa del citomegalovirus humano, CYP2B1, citosina desaminasa, purina-desoxinucleósido fosforilasa, carboxilesterasa, acetilcolinesterasa, butirilcolinesterasa, paraoxonasa, metaloproteinasas de matriz, fosfatasa alcalina, p-glucuronidasa, valaciclovirasa, plasmina, carboxipeptidasa G2, penicilina amidasa, p-lactamasa o p-galactosidasa (ejemplos de Yang et al., Acta Pharmaceutica Sinica B 2011 1(3)143-159).
En una realización particular del primer aspecto, el virus del herpes infeccioso recombinante tiene una gH modificada con una secuencia de aminoácidos, según la SEQ ID NO: 2 (gH como en la construcción R-VG803, R-VG805 y R-VG809 de los ejemplos; scFv-HER2 entre los aa 23-24 de la gH de tipo natural) o la SEQ ID NO: 3 (gH como en la construcción R-VG811 de los ejemplos; scFv-HER2 que reemplaza a los aa 24-47 de la gH de tipo natural), careciendo ambas de la secuencia señal (residuos 1-18 de las SEQ ID NO: 2 y 3, respectivamente), o una variante funcional de las misma que tiene una identidad de secuencia de, como mínimo, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % y, opcionalmente, una gD modificada con una secuencia de aminoácidos, según la SEQ ID NO: 5 (gD como en la construcción R-LM113 de los ejemplos, scFv HER2 que reemplaza a los aa 31 a 63 de gD de tipo natural), la SEQ ID NO: 6 (gD como en la construcción R-LM249 de los ejemplos, scFv HER2 que reemplaza los aa 86-243 de la gD de tipo natural), la SEQ ID NO: 7 (gD como en la construcción R-VG805 de los ejemplos, scFv EGFR que reemplaza los aa 31 a 63 de la gD de tipo natural), la SEQ ID NO: 8 (gD como en la construcción R-VG807 de los ejemplos, scFv-HER2 que reemplaza los aa 31 a 63 de la gD de tipo natural) o la SEQ ID NO: 9 (gD como en la construcción R-VG809 de los ejemplos, deleción de los aa 31 a 63 de la gD de tipo natural), careciendo todas ellas de la secuencia señal (residuos 1-25 de las SEQ ID NO 5-9), o una variante funcional de las mismas que tiene una identidad de secuencia de, como mínimo, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %. El término “funcional” a este respecto, aparte de gD, según la SEQ ID NO: 9, significa que la gH y/o gD es capaz de mediar la infección de una célula que porta HER2 y/o EGFR, respectivamente, en su superficie. Con respecto a gD, según la SEQ ID NO: 9, significa que la gD con la deleción y sin inserción no es capaz de mediar la infección de ninguna célula, en particular mediante HVEM o Nectina-1.
En otra realización particular del primer aspecto, el virus del herpes infeccioso recombinante tiene una gH modificada con una secuencia de aminoácidos, según la SEQ ID NO: 2 o 3, en el que la gH comprende cualquier ligando peptídico heterólogo, tal como se definió anteriormente, en lugar de scFv-HER2 (particularmente no scFv-HER2), o una variante funcional del mismo que tiene una identidad de secuencia de, como mínimo, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % y, opcionalmente, una gD modificada con una secuencia de aminoácidos, según cualquiera de las SEQ ID NO: 5-9, en el que la gD de las SEQ ID NO: 5-9 comprende cualquier ligando peptídico heterólogo, tal como se definió anteriormente, en lugar del definido en estas secuencias (scFv-HER2 y scFv-EGFR, respectivamente; cualquier significa, en particular, no el ligando peptídico heterólogo definido en estas secuencias). El término “funcional” a este respecto, aparte de gD, según la SEQ ID NO: 9, significa que la gH y/o gD es capaz de mediar la infección de una célula que porta una molécula en su superficie a la que se une el ligando peptídico heterólogo comprendido en gH/gD. Con respecto a gD, según la SEQ ID NO: 9, significa que la gD con la deleción y sin inserción no es capaz de mediar la infección de ninguna célula, en particular mediante HVEM o Nectina-1.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere al virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad.
En una realización preferente, dicha enfermedad es una enfermedad tumoral, una enfermedad infecciosa crónica o una enfermedad asociada a senescencia.
La enfermedad tumoral se selecciona, preferentemente, entre el grupo que consiste en cáncer suprarrenal, cáncer de ano, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, cáncer de cerebro/SNC, tumores, cáncer de mama, cáncer primario oculto, enfermedad de Castleman, cáncer de cuello uterino, cáncer de colon/recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia Ewing de tumores, cáncer de ojo, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, linfoma de la piel, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer de nasofaringe, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de la cavidad bucal y de orofaringe, osteosarcoma, cáncer de ovarios, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores de hipófisis, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma - cáncer de partes blandas en adultos, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.
Preferente, las enfermedades tumorales son cánceres positivos para HER-2 (como cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de estómago, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, osteosarcoma y glioblastoma multiforme), cánceres positivos para EGFR (como cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma multiforme, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de mama, cáncer colorrectal y de páncreas), cánceres positivos para EGFR-vIII (como glioblastoma multiforme), cánceres positivos para PSMA (como cáncer de próstata), linfoma positivo para CD20+ y tumores relacionados con EBV.
La enfermedad infecciosa crónica se selecciona, preferentemente, entre el grupo que consiste en tuberculosis, malaria, hepatitis viral crónica (HBV, virus de la hepatitis D y HCV), síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA, provocado por el HIV, virus de la inmunodeficiencia humana) o trastornos relacionados con EBV, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias sistémicas (lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren) y esclerosis múltiple (EM).
La enfermedad asociada a senescencia se selecciona, preferentemente, entre el grupo que consiste en (i) enfermedades genéticas raras, denominadas síndromes progeroides, caracterizadas por un envejecimiento prematuro: síndrome de Werner (SW), síndrome de Bloom (SB), síndrome de Rothmund-Thomson (SRT), síndrome de Cockayne (SC), xerodermia pigmentosa (XP), tricotiodistrofia o síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (SPHG) o (ii) trastornos relacionados con la edad habituales: obesidad, diabetes de tipo 2, sarcopenia, artrosis, fibrosis pulmonar idiopática y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cataratas, enfermedades neurodegenerativas o trastornos relacionados con el tratamiento del cáncer.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que comprende el genoma del virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, en el que el genoma codifica el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gH, tal como se define en (a), y la gD alterada que comprende el ligando polipeptídico heterólogo, tal como se define en (b). Se debe entender que el ácido nucleico, en particular el genoma, no codifica, preferentemente, la gH modificada y, opcionalmente, la gD modificada como proteínas maduras, sino como precursores que incluyen las secuencias señal (residuos 1-18 de la SEQ ID NO: 1 y residuos 1-25 de la SEQ ID NO: 4). Ejemplos representativos son gH y gD, según las SEQ ID NO 2, 3 y 5-9.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un vector que comprende el ácido nucleico del tercer aspecto. En la técnica se conocen vectores adecuados, e incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales (por ejemplo, bacterianos, de levaduras o humanos), bacteriófagos, vectores virales (por ejemplo, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados), en particular vector de baculovirus, o sustancias modificadas por nanoingeniería (por ejemplo, ormosiles).
En una realización, el vector está modificado, en particular mediante una deleción, inserción y/o mutación de uno o varios residuos de ácido nucleico, de tal manera que su virulencia está atenuada, preferentemente en el caso de un vector viral, o que se replica de manera condicional en células enfermas pero no en células no enfermas. Por ejemplo, se incluye la sustitución de la región promotora del gen ^34.5 con un promotor de un gen humano que se expresa exclusivamente en células cancerosas (por ejemplo, el promotor survivina), que dará como resultado un fenotipo atenuado en células no cancerosas y un fenotipo no atenuado en células cancerosas. Modificaciones adicionales pueden incluir la sustitución de regiones reguladoras responsables de la transcripción de genes IE, como la región promotora ICP-4, con promotores de genes expresados exclusivamente en células cancerosas (por ejemplo, el promotor survivina). Este cambio producirá un HSV condicional en replicación, que se puede replicar en células cancerosas pero no en células normales. Las células del cultivo celular para la propagación de los descendientes del virus proporcionarán altos niveles de proteínas activadoras de promotores específicos para permitir la producción de altos rendimientos de virus.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula que comprende el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, el ácido nucleico del tercer aspecto o el vector del cuarto aspecto. Preferentemente, la célula es una célula de cultivo celular. En la técnica se conocen bien cultivos celulares y técnicas de cultivo adecuados, véase, por ejemplo, Peterson et al., Comp Immunol Microbiol Infect Dis.
1988;11 (2):93-8.
En un sexto aspecto, la presente invención se refiere al virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, para su utilización como medicamento.
En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para destruir una célula utilizando el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto. En una realización, se pueden destruir células en un cultivo celular que portan la molécula diana en su superficie, por ejemplo, para poner a prueba la eficacia lítica del virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto. En otra realización, la célula es una célula enferma obtenida de un paciente, por ejemplo, una célula tumoral de un paciente con cáncer y, opcionalmente, propagada. Esta célula está infectada y, por tanto, se destruye por el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto. La destrucción exitosa de células obtenidas del paciente es indicativa de la especificidad celular del virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, in vivo en el paciente, es decir, del éxito terapéutico. En una realización adicional, también se pueden obtener células no enfermas del mismo paciente o de un sujeto que no padece la enfermedad que padece el paciente como control (células que no portan la molécula diana en su superficie), como indicación de si las células no enfermas son susceptibles o no de infección por el virus del herpes infeccioso recombinante. En aún otra realización, se destruyen células enfermas comprendidas en una población de células (por ejemplo, tejido tal como sangre) que comprende células no enfermas y células enfermas (por ejemplo, células cancerosas tales como células de leucemia) después del aislamiento de la población de células del paciente (por ejemplo, leucocitaféresis). Esto es para obtener una población de células libre de células enfermas, por ejemplo, sangre libre de células enfermas, tales como células de leucemia, en particular para un posterior trasplante de la población de células a un paciente, preferentemente al mismo paciente del que se aisló la población de células. En el caso de sangre y leucemia, por ejemplo, este procedimiento permite una reinfusión de sangre libre de células tumorales.
En un octavo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para hacer crecer el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, en células. En la técnica se conocen bien técnicas y condiciones adecuadas para hacer crecer el virus del herpes en células, véase, por ejemplo, Peterson et al., (Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 1988;11 (2):93-8). En una realización particular, el virus del herpes infeccioso recombinante del primer aspecto, comprende una gH y gD modificadas tal como se describió anteriormente. Preferentemente, las células en las que se hace crecer el virus del herpes portan una molécula diana a la que se une o bien (i) el ligando de la gH modificada o bien (ii) el ligando de la gD modificada. En el caso de (i), el ligando de la gD modificada se une a una molécula de una célula que se va a seleccionar como diana in vivo, preferentemente una célula enferma en un paciente, y el ligando de la gH modificada se une a una molécula de una célula que se va a seleccionar como diana en un cultivo celular; en el caso de (ii), el ligando de la gH modificada se une a una molécula de una célula que se va a seleccionar como diana in vivo, preferentemente una célula enferma en un paciente, y el ligando de la gD modificada se une a una molécula de una célula que se va a seleccionar como diana en un cultivo celular.
La presente invención se describe por medio de los siguientes ejemplos que se deben interpretar simplemente como ilustrativos y no limitativos del alcance de la presente invención. Cabe señalar que, en los ejemplos, las referencias a residuos de aminoácido con respecto a gH se refieren a la proteína precursora, según la SEQ ID NO: 1, y las referencias a residuos de aminoácido con respecto a gD se refieren a la proteína madura (SEQ ID NO: 4 que carece de los residuos 1-25).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: construcción de recombinantes de HSV que expresan gH modificadas genéticamente que portan un anticuerpo monocatenario (scFv) dirigido a Her2 (scFv-HER2), sin o con deleción en el gen de HSV, y que portan mCherry como gen indicador.
A) R-VG803: Inserción de scFv-HER2 entre los aa 23 y 24 de gH de HSV por medio de recombinación de HSV-BAC y galK.
Los inventores modificaron por ingeniería R-VG801 mediante la inserción de la secuencia que codifica el scFv de trastuzumab entre los Aa 23 y 24 de gH. El genoma inicial fue pYEBac102, que porta secuencias de pBeloBAC enmarcadas por LOX-P insertadas entre UL3 y UL4 del genoma de HSV-1. La modificación por ingeniería se realizó por medio de recombinación de galK. De forma breve, el casete GalK con brazos de homología a gH se amplificó por medio de los cebadores gH6_galK_f ATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCTGTTGACAATTAATCATCG GCA (SEQ ID NO: 10) y gH5_galK_r TCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT
(SEQ ID NO: 11). Este casete se sometió a electroporación en bacterias SW102 que portaban pYEBac102. Los clones recombinantes que portaban el casete galK se seleccionaron en placas que contenían medio M63 ((NH4)2SO415 mM, KH2PO4100 mM, 1,8 |xg de FeSO4-7H2O, ajustado a pH7) complementado con D-biotina 1 mg/l, galactosa al 0,2 %, L-leucina 45 mg/l, MgSO4-7H2O 1 mM y cloramfenicol 12 |xg/ml. Para excluir colonias bacterianas falso positivas para galK, se sembraron en estrías también en placas a base de agar de McConkey complementadas con galactosa al 1 % y cloramfenicol 12 |og/ml y se comprobaron mediante PCR de colonias con los cebadores galK_129_f ACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG (SEQ ID NO: 28) y galK_417_r CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC (SEQ ID NO: 29). A continuación, el casete de scFv de trastuzumab enmarcado por los ligadores de Ser-Gly descritos a continuación y por los brazos de homología a gH se amplificó como dos fragmentos independientes, denominados fragmento # 1 y fragmento # 2, a partir de pSG-ScFvHER2-SG. pSG-ScFvHER2-SG porta un casete de scFv de trastuzumab enmarcado por ligadores de Ser-Gly (SEQ ID NO: 12). El fragmento # 1 se amplificó por medio de los cebadores gH23_8SG_scFv4D5_f TCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGCATAGTAGTGGCGGTGGCTC TGGATCCG (SEQ ID NO: 13) y scFv4D5_358_r GGAAACGGTTCGGATCAGCCATCGG (SEQ ID NO: 14), utilizando pSG-ScFvHER2 como molde. El fragmento # 2 se amplificó por medio de gH24_12SG_scFv4D5r ATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTACCGGATCCACCGGAACCAG AGCC (SEQ ID NO: 15) y scFv4D5_315_f GGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG (SEQ ID NO: 16) utilizando pSG-ScFvHER2 como molde. Los fragmentos # 1 y # 2 se hibridaron y extendieron para generar el casete scFv-HER2, enmarcado por los ligadores de Ser-Gly y los brazos de homología a gH. El genoma recombinante porta el scFv contra HER2 enmarcado por un ligador de Ser-Gly en el sentido 5’, con la secuencia HSSGGGSG (SEQ ID NO: 17), y un ligador de Ser-Gly en el sentido 3’, con la secuencia SSGGGSGSGGSG (SEQ ID NO: 18). El ligador entre Vl y Vh es SDMPMADPNRFRGKNLVFHS (SEQ ID NO: 19). Los clones recombinantes que portan la escisión del casete galK y la inserción de la secuencia de elección, ejemplificados por scFv-HER2, o mCherry, se seleccionaron en placas que contenían medio M63 (véase anteriormente) complementado con D-biotina 1 mg/l, desoxi-2-galactosa al 0,2 %, glicerol al 0,2 %, L-leucina 45 mg/l, MgSO4-7H2O 1 mM y cloramfenicol 12 |xg/ml. Las colonias bacterianas también se comprobaron para determinar la presencia de la secuencia de elección por medio de PCR de colonias. En R-VG801, los inventores insertaron después la proteína fluorescente roja mCherry en la región intergénica UL37-UL38. La secuencia de mCherry está bajo el promotor del CMV. En primer lugar, los inventores insertaron el casete galK, amplificado por medio de los oligonucleótidos UL37/38_galK_f CCGCAGGCGTTGCGAGTACCCCGCGTCTTCGCGGGGTGTTATACGGCCACCCTGTTGACAATTAATCATC GGCA (SEQ ID NO: 20) y UL37/38_galK_r TCCGGACAATCCCCCGGGCCTGGGTCCGCGAACGGGATGCCGGGACTTAATCAGCACTGTCCTGCTCCTT
(SEQ ID NO: 21). Posteriormente, los inventores reemplazaron la secuencia de galK por el casete promotor-mCherry, amplificado por medio de los oligonucleótidos UL37/38_CMV_mcherry_f CCGCAGGCGTTGCGAGTACCCCGCGTCTTCGCGGGGTGTTATACGGCCACCGATGTACGGGCCAGATAT ACG (SEQ ID NO: 22) y UL37/38_pA_mcherry_1958_r TCCGGACAATCCCCCGGGCCTGGGTCCGCGAACGGGATGCCGGGACTTAACCATAGAGCCCACCGCATC
C(SEQ ID NO: 23).
B) Inserción de scFv-HER2 entre los aa 23 y 48 de gH de HSV (R-VG811).
En primer lugar, los inventores modificaron por ingeniería R-VG799, mediante la inserción de la secuencia que codifica el scFv de trastuzumab entre los AA 23 y 48 de gH. El procedimiento fue el mismo que se describió anteriormente para modificar por ingeniería scFv-HER2 en gH de R-VG803, con las siguientes dos diferencias. En primer lugar, el casete galK se amplificó por medio de los cebadores gH29_galK_f CGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTCCTGTTGACAATTAATCATC GGCA (SEQ ID NO: 24) y gH5_galK_r TCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT
(SEQ ID NO: 25). En segundo lugar, el fragmento # 2 difirió del fragmento # 2 empleado para generar R-VG803 en que se amplificó por medio de gH48_12SG_scFv4D5_r CCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCACCGGATCCACCGGAACCA GAGCC (SEQ ID NO: 26) y scFv4D5_315_f GGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG (SEQ ID NO: 27). La secuencia de mCherry se insertó tal como se detalla para la construcción de R-VG803.
C) R-VG809: deleción de los AA 6-38 de gD de R-VG803.
R-VG809 es idéntico a R-VG803 y, además, porta la deleción de la secuencia correspondiente a los AA 6-38 en gD. El material inicial fue el genoma de R-VG803 BAC. Para generar la deleción de los AA 6-38 en gD, el casete galK flanqueado por los brazos de homología a gD se amplificó con los cebadores gD5_galK_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCG GCA (SEQ ID NO: 30) y gD39_galK_r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCT
T (SEQ ID NO: 31). A continuación, los inventores reemplazaron la secuencia de galK por un oligonucleótido bicatenario sintético gD_aa5_39_f_r TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCACATCCAGGCGGGCCTACC GGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGAT (SEQ ID NO: 32).
D) R-VG805: inserción de scFv-EGFR en lugar de los AA 6-38 de gD de R-VG803.
El material inicial para R-VG805 fue el genoma de R-VG803 BAC. Para generar la deleción de los AA 6-38 en gD, el casete galK flanqueado por los brazos de homología a gD se amplificó con los cebadores gD5_galK_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCG GCA (SEQ ID NO: 33) y gD39_galK_r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCT
T (SEQ ID NO: 34). A continuación, los inventores reemplazaron la secuencia de galK en BAC VG804 por un casete scFv-EGFR amplificado a partir de pTNHaa-aEGFR (proporcionado amablemente por el Dr. Steve Russel, Mayo Clinic, Rochester) por medio de los cebadores BAC_LM611_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGCCGAGGTGCAACTGCAGCA GTC (SEQ ID NO: 35) y gD39_11 SAG_EGFR_r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGACTTGCACTAGATGAAGCA CTTCCTGCGGAAGATTTGATCTCGAGTTCTGTCCCCG (SEQ ID NO: 36). El ligador en el sentido 3' tiene la secuencia SSAGSASSSAS (SEQ ID NO: 37); no hay presente ningún ligador en el sentido 5'. El ligador entre Vh y Vl es GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 38).
E) R-VG807: inserción de scFv-HER2 en lugar de los AA 6-38 de gD de R-VG803.
El material inicial para R-VG807 fue el genoma de R-VG803 BAC. Para generar la deleción de los AA 6-38 en gD, el casete galK flanqueado por los brazos de homología a gD se amplificó con los cebadores gD5_galK_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCG GCA (SEQ ID NO: 39) y gD39_galK_r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCT
T (SEQ ID NO: 40). A continuación, los inventores reemplazaron la secuencia de galK por el casete scFv HER2 amplificado a partir de pSG-ScFvHER2 por medio de los cebadores gD5_scFvHER2_f TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGTCCGATATCCAGATGACCCA GTCCC (SEQ ID NO: 41) y gD39_11 SAG_HER2_r ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGACTTGCACTAGATGAAGCA CTTCCTGCGGAAGAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACC (SEQ ID NO: 42). El ligador en el sentido 3' tiene la secuencia SSAGSASSSAS (SEQ ID NO: 43); no hay presente ningún ligador en el sentido 5'. El ligador entre Vh y Vl es SDMPMADPNRFRGKNLVFHS (SEQ ID NO: 44).
Para reconstituir los virus recombinantes, se transfectaron 500 ng de ADN de BAC recombinante en células SK-OV-3 por medio de Lipofectamine 2000 (Life Technologies). El crecimiento del virus se monitorizó mediante fluorescencia roja. La estructura de los recombinantes se verificó mediante la secuenciación de la gH y también del ORF de la gD para R-VG809, R-VG805 y R-VG807. Se generaron reservas de virus y se titularon en células SK-OV-3 o en células J-HER2.
Ejemplo 2: verificación de la inserción de scFv-HER2 en gH de R-VG803.
Se infectaron células Vero con R-VG803 (3 UFP/célula), y con R-LM5 a modo de comparación, y se recogieron 72 horas después de la infección. Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfirieron a membranas de PVDF y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo policlonal contra gH. La figura 2 muestra que scFv-HER2-gH quimérico de R-VG803 migró con una movilidad electroforética más lenta que wt-gH de R-LM5 y una Mr aparente de130 K.
Ejemplo 3: ensayo de infección con R-VG803, que porta scFv-HER2 en gH, de células J-HER2, que expresan HER2 como único receptor.
Previamente se ha demostrado que la inserción de scFv-HER2 en gD otorga a los virus recombinantes R-LM113 y R-LM249 la capacidad de entrar en células a través del receptor HER2. Para proporcionar evidencias de que la inserción de scFv-HER2 en gH otorga a R-VG803 la capacidad de entrar en células a través del receptor HER2, los inventores utilizaron células que expresan HER2 como único receptor. Las células J parentales no expresan ningún receptor para gD, por tanto no pueden activar a gD, y no se infectan por wt-HSV. Las células J-HER2 expresan de manera transgénica HER2 como único receptor. Como controles, los inventores incluyeron células J-Nectina y J-HVEM, que expresan de manera transgénica Nectina 1 o HVEM como receptores y se infectan por wt-HSV, y células humanas y animales que expresan los ortólogos HVEM/Nectina 1 humanos o animales, concretamente células HaCaT queratinocíticas, células SK-N-SH neuronales, células HeLa de cáncer, MDA-MB-231, células HFF14 fibroblásticas humanas, células BHK de hámster, así como células SK-OV-3 de cáncer de ovarios que expresan HER2 más HVEM/Nectina 1. Tal como se muestra en la figura 3 A, R-VG803 infectó las células J-HER2. La infección de J-Nectina 1, J-HVEM y de células humanas y animales con R-VG803 (figura 3 A) no fue sorprendente, ya que R-VG803 codifica wt-gD. Además, los inventores notificaron que R-VG803 puede realizar una extensión célula a célula en células J-HER2. Las células se infectaron a 0,01 UFP/célula y se monitorizaron diariamente. En el día 1, la infección involucró a células individuales. En los siguientes días, la infección involucró a grupos de células, progresivamente más grandes en cuanto a tamaño (figura 3 B).
Para demostrar que la entrada de R-VG803 en células J-HER2 se produce a través de HER2 como receptor celular y para investigar el papel de gD en la ruta de entrada de R-VG803 en células SK-OV-3, los inventores confirmaron, en primer lugar, que la infección se produce a través del receptor HER2. Las células J-HER2 se infectaron con R-VG803 en presencia de trastuzumab, el MAb contra HER2 del que se derivó scFv-HER2. El trastuzumab bloqueó la infección de células J-HER2 con R-VG803, tal como se detectó mediante microscopía de fluorescencia (figura 4 A) y se cuantificó mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (figura 4 B). Esto valida la conclusión de que R-VG803 redirigido utiliza HER2 como portal de entrada en células J-HER2. El hallazgo de que R-VG803 puede utilizar a HER2 como receptor proporciona evidencias de que se puede modificar el tropismo de HSV mediante modificación por ingeniería de un ligando heterólogo en gH. Además, la infección de1HSV redirigido por gH, R-VG803, en células J-HER2 puede tener lugar en células que carecen de un receptor de gD, es decir en condiciones en las que gD está presente físicamente en los viriones R-VG803, pero se elimina funcionalmente puesto que no se puede activar por su receptores relacionados y no puede transmitir la activación a gH. Los inventores concluyen que la infección de R-VG803 no necesita una gD con sitios de unión al receptor funcionales. A continuación, los inventores analizaron la utilización de receptores en células SK-OV-3 que expresan ambos conjuntos de receptores, HER2 y nectina1/HVEM. La cuestión fue si se utilizaba preferentemente un receptor con respecto al otro, o si se utilizaba alternativamente cada uno. Se infectaron células SK-OV-3 con R-VG803, en presencia de MAb contra HER2 (trastuzumab), MAb contra HD1 o ambos. Los controles fueron R-LM5, que porta wt-gD y las otras modificaciones genómicas presentes en R-VG803, R-LM249 y R-LM113, concretamente la inserción de las secuencias de BAC y la inserción del marcador GFP. R-LM249 es un HSV redirigido a HER2 por medio de la inserción de scFv-HER2 en la deleción de los AA 61-218 de gD. R-LM113 es un HSV redirigido a HER2 por medio de la inserción de scFv-HER2 en la deleción de los AA 6-38 de la gD madura. R-VG809 también se incluyó (véase el ejemplo 4). La figura 4 C muestra que el MAb contra HER2 o HD1 no ejerció casi ninguna inhibición sobre R-VG803 cuando se administró individualmente, pero anuló prácticamente la infección cuando se administraron juntos. Por tanto, R-VG803 puede utilizar alternativamente HER2 o Nectina1/HVEM para infectar células SK-OV-3. La utilización de uno o los otros portales de entrada por R-VG803 depende del espectro de receptores visualizado por las células. Tal como se esperaba, R-LM249 y R-LM113 redirigidos completamente muestran un ruta de entrada dependiente de HER2. La infección con R-VG809 también se inhibe por el trastuzumab, ya sea solo o en combinación con MAb contra HD1, lo que conduce a la conclusión de que este recombinante se redirige a HER2 por medio de gH y se desdirige de nectina1/HVEM como consecuencia de la deleción de los AA 6-38 en la gD madura.
Ejemplo 4: modificación por ingeniería genética del recombinante R-VG809 redirigido a HER2 mediante la inserción de scFv-HER2 en gH y desdirigido de los receptores de gD mediante la deleción de la secuencia de gD que codifica los AA 6-38.
Los inventores modificaron por ingeniería un recombinante que portaba scFv-HER2 en gH y la deleción de porciones de sitios de unión de receptores de gD. Los dos receptores principales de gD son Nectina 1 y HVEM. El sitio de unión de HVEM en gD se asigna a los AA 1-32. El sitio de unión de Nectina 1 en gD madura es más amplio e incluye el núcleo plegado de Ig y las porciones ubicadas entre los AA 35-38, 199-201, 214-217, 219-221. Los inventores delecionaron de la gD madura de R-VG803 la región de los AA 6-38, es decir, la misma región que se delecionó previamente de R-LM113, un HSV redirigido a HER2 mediante la inserción de scFv-HER2 entre los AA 5 y 39 de la gD madura. La deleción retira todo el sitio de unión de HVEM y algunos residuos implicados en la interacción con Nectina 1, que incluyen el núcleo plegado de Ig y las porciones ubicadas entre los AA 35-38, 199-201, 214-217, 219-221. A pesar de que se delecionaron algunos AA implicados en la interacción con Nectina 1, se demostró que R-LM113 se desdirigió de Nectina 1 y de HVEM, el recombinante se desdirige tanto de HVEM como de Nectina 1. El virus recombinante denominado R-VG809 no pudo infectar ni células J-HVEM, ni tampoco células J-Nectina 1, así como células HaCaT, SK-N-SH, MDA-MB-231, HeLa, HFF14 humanas, células BHK de hámster. Mantuvo la capacidad de infectar de manera eficiente células J-HER2 y SK-OV-3 (figura 5). El tropismo de R-VG809 es sorprendentemente diferente del de R-VG803 (compárese la figura 5 con la figura 3A). Los inventores concluyen que la infección con R-VG809 a través de la gH redirigida a HER2 no requiere los sitios de unión para HVEM y para Nectina 1 en gD y, en consecuencia, la activación de gD mediada por receptores. En resumen, R-VG809 muestra un tropismo completamente redirigido, redirigido al receptor HER2 a través de gH y desdirigido de los receptores de gD. Su ruta de entrada en células SK-OV-3 se muestra en la figura 4. Se puede observar que, a diferencia de la entrada de R-VG803, la entrada de R-VG809 en células SK-OV-3 se inhibió por trastuzumab solo, lo que indica que es completamente a través del receptor HER2.
Ejemplo 5: modificación por ingeniería genética del recombinante R-VG805 redirigido a HER2 mediante la inserción de scFv-HER2 en gH y redirigido a EGFR mediante la inserción de scFv-EGFR en lugar de la región de los AA 6-38 de la gD madura. Redirección doble a dos receptores de elección diferentes más desdirección de los receptores de gD.
Los inventores modificaron por ingeniería un recombinante de HSV redirigido simultáneamente a HER2, mediante la inserción de scFv-HER2 en gH, y a EGFR, mediante la inserción de scFv-EGFR en lugar de la región de los AA 6-38 de la gD madura. De forma breve, R-VG803 se modificó para reemplazar la región endógena de los AA 6-38 de la gD madura por el scFv contra EGFR, denominado en el presente documento scFv-EGFR. De hecho, el virus recombinante denominado R-VG805 se redirigió a HER2 por medio de gH, se desdirigió de Nectina 1 y HVEM, debido a la deleción de la región de los AA 6-38 en la gD madura, y se redirigió a EGFR debido a la inserción de scFv contra EGFR en lugar de los AA 6-38 de la gD madura (figura 6). Los inventores señalan que la inserción de scFv-EFGR redirige R-VG805 también a EGFR-vIII, una variante de EGFR que porta una deleción (figura 6). Esta variante de EGFR se expresa altamente en glioblastoma humano. Estos resultados muestran que es posible modificar por ingeniería un recombinante de HSV con una redirección doble a dos receptores de elección diferentes. Ejemplo 6: modificación por ingeniería genética del recombinante R-VG807 doblemente redirigido a HER2 mediante la inserción de scFv-HER2 en gH y mediante la inserción de scFv-HER2 en lugar de la región de los AA 6-38 de la gD madura. Redirección doble a un mismo receptor de elección más desdirección de los receptores de gD.
Los inventores modificaron por ingeniería un recombinante de HSV redirigido a HER2 tanto mediante la inserción de scFv-HER2 en gH como mediante la inserción de scFv-HER2 en lugar de la región de los AA 6-38 de la gD madura. De forma breve, R-VG803 se modificó para reemplazar la región endógena de los AA 6-38 de la gD madura por scFv-HER2. El virus recombinante denominado R-VG807 está doblemente redirigido a HER2 y desdirigido de Nectina 1 y HVEM, debido a la deleción de la región de los AA 6-38 en la gD madura.
Ejemplo 7: estudio sobre el sitio de inserción para scFv-HER2 en gH. Deleción de la secuencia que codifica los AA 24-47.
Los inventores investigaron si la inserción de scFv-HER2 se puede acoplar con la deleción de la porción N-terminal de gH. La porción delecionada fue la secuencia que codifica los AA 24-47 de gH. Esta secuencia se reemplazó por scFv-HER2. El recombinante resultante se denominó R-VG811. La figura 7 muestra que R-VG811 infectó células J-HER2. Por tanto, la inserción de scFv-HER2 se puede acoplar con una deleción en gH, como mínimo, hasta el AA 48. Esto indica que el sitio de inserción puede ser C-terminal con respecto al AA 18 y N-terminal respecto a cualquier AA entre el a A 19 y el AA 48. Atanasiu et al., (MBio. 26 de febrero de 2013;4(2). pii: e00046-13. doi: 10.1128/mBio.00046-13) propusieron que “gHA 48/gL tiene una estructura intermedia en la ruta que conduce a una activación reguladora completa, y sugirieron que una etapa clave en la ruta de fusión es la conversión de gH/gL en un estado activado por la gD unida al receptor; esta gH/gL activada se parece a gHA 48/gL”. Basándose en los resultados de Atanasiu, obtenidos en el ensayo de fusión célula-célula y no en la entrada de virión-célula, un experto en la materia podría plantear la hipótesis de que la deleción de los AA 24-47 de la secuencia en gH, y su reemplazo por scFv-HER2, podría conducir a un virus más propenso a fusionarse con la membrana celular y, por tanto, capaz de una infección potenciada en relación con R-VG803. Los inventores transfectaron ADN-BAC de R-VG811 y, a modo de comparación, de R-VG803 en células SK-OV-3 y J-HER2, y determinaron el grado de infección/formación de virus a través de la cantidad de células que expresan el marcador mCherry. Las figuras 7 B-D comparan la cantidad de células infectadas obtenidas tras la transfección de ADN de R-VG811 o de R-VG803 en células J-HER2 o SK-OV-3. La cuantificación del experimento se muestra en las figuras 7 C-D. En general, la eficiencia de producción de virus infecciosos fue inferior con R-VG811 que con R-VG803, lo que indica que la deleción de los AA en el extremo N-terminal de gH, hasta el AA 48, reduce la capacidad infecciosa de los recombinantes. Por tanto, los resultados de Atanasiu et al no fueron predictivos del comportamiento de un recombinante de HSV que porta la inserción de scFv-HER2 en lugar de las secuencias de gH endógenas con los AA 24-47 delecionados.
Ejemplo 8: grado de replicación de los recombinantes.
Los inventores compararon el grado de replicación de R-VG803 y R-VG809 con el de dos recombinantes, R-LM113 y R-LM249, que se redirigen a HER2 a través de la inserción de scFv-HER2 en gD. La replicación se midió en células J-HER2, que expresan HER2 como receptor, y en células SK-OV-3, que expresan HER2 y Nectina1/HVEM

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Virus del herpes infeccioso recombinante, que comprende
(a) un ligando polipeptídico heterólogo, en el que el ligando polipeptídico heterólogo está fusionado con el extremo N-terminal de la glicoproteína H (gH) madura o de una gH truncada hasta el aminoácido 48 de la SEQ ID NO: 1, o insertado en la gH dentro de la región N-terminal comenzando en cualquiera de los aminoácidos 19 a 23 y acabando en el aminoácido 48, y en el que el ligando polipeptídico heterólogo no es la glicoproteína D (gD) del virus del herpes, ni un fragmento de la misma, que se une específicamente a un ligando celular de gD, y (b) una gD alterada que tiene unión reducida o inespecífica a ligandos celulares de gD, en el que la gD comprende un ligando polipeptídico heterólogo fusionado con el extremo N-terminal de la gD madura o de una gD truncada, o insertado en la gD.
2. Virus del herpes infeccioso recombinante, según la reivindicación 1, en el que el ligando polipeptídico heterólogo está insertado de manera N-terminal respecto al dominio H1A de gH.
3. Virus del herpes infeccioso recombinante, según la reivindicación 1, en el que el ligando polipeptídico heterólogo está insertado en la gH entre el aminoácido 23 y el aminoácido 24 de la gH, según la SEQ ID NO: 1, o una región correspondiente de una gH homóloga.
4. Virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que uno o varios aminoácidos de gH de la región N-terminal están delecionados.
5. Virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la gD tiene una deleción de aminoácidos comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 26 a 33 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 31 a 63, y/o comenzando en cualquiera de los residuos de aminoácido 65 a 86 y acabando en cualquiera de los residuos de aminoácido 235 a 243 de la gD, según la SEQ ID NO: 4, o una región correspondiente de una gD homóloga.
6. Virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho virus del herpes tiene una virulencia reducida o tiene una capacidad de replicación que es diferente en células enfermas frente a células no enfermas.
7. Virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, además, un marcador detectable heterólogo y/o uno o varios casetes de expresión que expresan uno o varios de los siguientes
i) una o varias proteínas terapéuticas,
ii) uno o varios antígenos, epítopos/neoepítopos o cadena de epítopos/neoepítopos heterólogos o autólogos, o iii) una o varias enzimas de conversión de profármacos.
8. Virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ligando polipeptídico heterólogo se une a una molécula, o a una parte de la misma, accesible en la superficie de una célula, y en el que la célula es, preferentemente, una célula enferma.
9. Virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización en medicina.
10. Ácido nucleico que comprende un genoma que codifica el virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el genoma codifica el ligando polipeptídico heterólogo fusionado con o insertado en la gH, tal como se define en la reivindicación 1 (a), y la gD alterada que comprende el ligando polipeptídico heterólogo, tal como se define en la reivindicación 1 (b).
11. Ácido nucleico, según la reivindicación 10, en el que el genoma codifica la gH modificada y la gD modificada como precursores que incluyen las secuencias señal.
12. Vector que comprende el ácido nucleico, según la reivindicación 11.
13. Célula que comprende el virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, el ácido nucleico, según la reivindicación 11, o el vector, según la reivindicación 12.
14. Procedimiento in vitro para destruir una célula utilizando el virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
15. Procedimiento in vitro para hacer crecer el virus del herpes infeccioso recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en células.
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