ES2875338T3 - Métodos de beta-glucano y composiciones que afectan al microentorno tumoral - Google Patents

Abstract

β(1,6)-[Poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-β(1,3)-D-glucopiranosa soluble y un anticuerpo anti-PD-1 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es un inhibidor del punto de control inmunitario.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de beta-glucano y composiciones que afectan al microentorno tumoral

Antecedentes

Esta divulgación se refiere a combinaciones de p-glucano soluble y agente antineoplásicos que afectan al microentorno tumoral, incluyendo agentes antineoplásicos que mitigan la inmunosupresión. El p-glucano es un PAMP fúngico y se reconoce por la molécula de reconocimiento de patrones C3 en el suero, así como el receptor de reconocimiento de patrones, el receptor 3 del complemento (CR3) en los inmunocitos innatos, incluyendo neutrófilos y monocitos. El pglucano (p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa), un p-glucano polisacárido derivado de levaduras, se está desarrollando como agente inmunoterápico en combinación con anticuerpos monoclonales antitumorales de varios cánceres. El p-glucano posibilita que los inmunocitos efectores innatos destruyan células tumorales recubiertas con complemento a través de un mecanismo dependiente de CR3 del complemento. Numerosos modelos de tumor en animales han demostrado que la administración de p-glucano soluble en combinación con un anticuerpo dirigido al tumor, activador del complemento provoca un crecimiento tumoral significativamente reducido y una supervivencia global mejorada en comparación con cualquier agente en solitario.

Los cánceres, sin embargo, no son solamente masas de células malignas, sino "órganos" complejos, que reclutan y usan muchas otras células no transformadas. Las interacciones entre células malignas y no transformadas crean el microentorno tumoral (TME). Las células que no son malignas del TME tienen una función dinámica y, a menudo, promotora del tumor en diversos estadios de carcinogénesis. Una red compleja y dinámica de citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y enzimas inflamatorias y remodeladoras de la matriz dirigen la comunicación intercelular dentro del tejido afectado. Para combatir de manera eficaz el cáncer, por lo tanto, deben desarrollarse tratamientos para suprimir la naturaleza promotora del tumor del TME.

Vasilakos et al., Cancer Research, 2010, Vol. 70, N.° 8, Supl., Resumen 5627, describe estudios que comparan la actividad antitumoral de tres beta-1,3/1,6 glucanos solubles estructuralmente distintos in vivo en un modelo de linfoma singénico de ratón. A ratones portadores de tumor se les administra mAb antitumor más beta glucano 2x/semana durante 4 semanas. La actividad antitumoral se basó en la inhibición del crecimiento tumoral en el sitio de implante del tumor y la supervivencia a largo plazo potenciada. Además, se identificaron inmunocitos innatos cruciales responsables de la actividad antitumoral al centrarse en la función de los neutrófilos. Además, la caracterización de inmunocitos humanos pertinentes y sus receptores de beta glucano se mostró al centrarse en el receptor 3 del complemento (CR3) y dectina-1. La unión de beta glucano a inmunocitos y la identificación de receptores pertinentes se determinaron por citometría de flujo usando anticuerpo específico de beta glucano y beta glucanos marcados con fluorescencia. Los hallazgos clave fueron que los beta glucanos solubles, que difieren estructuralmente, no inducen actividad antitumoral similar, y la actividad antitumoral se anula en ratones deficientes de granulocitos; y que los glucanos solubles se unen a neutrófilos humanos de una manera dependiente de CR3.

El documento WO 2006/121168 A1 (16 de noviembre de 2006) describe anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente con PD-1 con alta afinidad. También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, vectores de expresión, células hospedadoras y métodos para expresar los anticuerpos. También se describen inmunoconjugados, moléculas biespecíficas y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos. También se describen métodos para detectar PD-1, así como métodos para tratar diversas enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades infecciosas, usando anticuerpos anti-PD-1. También se describen métodos para usar una poliinmunoterapia, tal como la combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1, para tratar una enfermedad hiperproliferativa, tal como cáncer. También se describen métodos para alterar los acontecimientos adversos relacionados con el tratamiento con dichos anticuerpos individualmente.

Sumario de la invención

Un aspecto de la invención es p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y un anticuerpo anti-PD-1 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en el que el anticuerpo anti-PD-1 es un inhibidor del punto de control inmunitario.

En una realización, la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-1 están en una sola formulación o en formulaciones separadas.

En una realización, la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa se deriva de levaduras. En una realización, la levadura es Saccaromyces cerevisiae.

En una realización, la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa estimula el sistema inmunitario del sujeto.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo no activador del complemento o en el que el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo activador del complemento.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo IgG⁴.

En una realización, el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab o pembrolizumab.

En una realización, la p(1,6Hpoli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-1 se administran por vía intravenosa.

En una realización, el método comprende además la administración de bavituximab, ipilimumab o tremelimumab, o en el que el método comprende además la administración de un anticuerpo dirigido a tumor.

Breve descripción

En el presente documento se describen usos y composiciones de p-glucano soluble en combinación con agente antineoplásicos que afectan al microentorno tumoral. En una realización, el agente antineoplásico puede ser un inhibidor del punto de control inmunitario. En otra realización, el agente antineoplásico puede ser un agente antiangiogénico. La politerapia también puede incluir un anticuerpo dirigido a tumor.

No se pretende que el sumario anterior describa cada realización divulgada o toda implementación de la tecnología descrita en el presente documento. La siguiente descripción ilustra más detalladamente realizaciones ilustrativas. En varios lugares a lo largo de la solicitud, se proporciona orientación a través de listas de ejemplos, que son ejemplos que pueden usarse en diversas combinaciones. En cada caso, la lista citada sirve únicamente como grupo representativo y no debe interpretarse como una lista excluyente.

Breve descripción de las figuras

FIG. 1A-1D. Caracterización morfológica y funcional de macrófagos M1 y M2 humanos cultivados in vitro.

FIG. 2A-2D. Caracterización morfológica, fenotípica y funcional de macrófagos M2 tratados con p-glucano soluble. FIG. 3A-3D. Evaluaciones de proliferación de linfocitos T CD4 y modulación de la producción de IFN-y e IL-4 en macrófagos M1 y M2 tratados con p-glucano a partir de sujetos de alta unión y sujetos de baja unión.

FIG. 4. Evaluaciones de proliferación de linfocitos T y modulación de IFN-y en macrófagos M2 y M2a tratados con p-glucano en condiciones inmunosupresoras.

FIG. 5A-5E. Evaluaciones de p-glucano sobre la proliferación de linfocitos T CD4/CD8 y activación en presencia de Treg.

FIG. 6A-6B. Caracterización de células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros humanos cultivados in vitro (imMoDC) y células dendríticas derivadas de monocitos maduros (mMoDC).

FIG. 7A-7D. Evaluaciones del efecto de p-glucano sobre la maduración de MoDC.

FIG. 8A-8C. Resultados de proliferación de linfocitos T CD4 aumentada por M2-p-glucano debido al contacto célula a célula.

FIG. 9. Resultados de proliferación de linfocitos T CD4 aumentada por M2-p-glucano debido a factores solubles. FIG. 10. Análisis de macrófagos M2 tratados con p-glucano en sujetos de alta unión frente a sujetos de baja unión. FIG. 11A-11B. Resultados de la evaluación funcional de M2-p-glucano derivado de monocitos de sujetos de baja unión en presencia de suero de un sujeto de alta unión.

FIG. 12A-12B. Regulación por aumento de PD-L1 sobre macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en presencia de citocinas inmunosupresoras (TCM).

FIG. 13. Regulación por aumento de PD-L1 en MiaPaCa.

FIG. 14A-14B. Efectos de p-glucano soluble sobre células supresoras derivadas mieloides (MDSC).

FIG. 15. Evaluación de expresión de PD-L1 inducida por p-glucano en células tumorales.

FIG. 16A-16D. Resultados de estudio en ratones usando IMPRIME PGG en combinación con anticuerpo DC101. FIG. 17A-17N. Efecto in vivo sobre el microentorno tumoral de p-glucano soluble y bevicizumab.

FIG. 18A-18C. Efectos sobre el microentorno tumoral de p-glucano soluble y anticuerpo anti-PD-1.

FIG. 19A-19C. Resultados de estudio en ratones usando IMPRIME PGG en combinación con anticuerpo anti-PD-1.

Descripción detallada de realizaciones ilustrativas

Los p-glucanos son polímeros de glucosa derivados de diversas fuentes microbiológicas y vegetales incluyendo, por ejemplo, levaduras, bacterias, algas, algas marinas, champiñones, avena y cebada. De estos, los p-glucanos de levaduras se han evaluado ampliamente sobre sus propiedades inmunoestimulantes. Los p-glucanos de levaduras pueden estar presentes como diversas formas tales como, por ejemplo, levaduras intactas, zimosano, partículas de glucano completo purificadas, polisacárido de zimosano solubilizado o p-glucanos solubles altamente purificados de diferentes pesos moleculares. Estructuralmente, los p-glucanos de levaduras están compuestos de monómeros de glucosa organizados como una cadena principal de glucopiranosa con uniones p-(1,3) con ramificaciones periódicas de glucopiranosa p-(1,3) unidas a la cadena principal mediante enlaces glucosídicos p-(1,6). Las diferentes formas de p-glucanos de levaduras pueden funcionar de forma diferente de otras. El mecanismo a través del que los p-glucanos de levaduras ejercen sus efectos inmunomoduladores pueden verse influido por las diferencias estructurales entre diferentes formas de los p-glucanos tales como, por ejemplo, su naturaleza en partículas o soluble, conformación terciaria, longitud de la cadena principal, longitud de la cadena lateral y frecuencia de las cadenas laterales. Las funciones inmunoestimulantes de los p-glucanos de levaduras también dependen de los receptores acoplados en diferentes tipos celulares en diferentes especies, que de nuevo, pueden depender de las propiedades estructurales de los p-glucanos.

En general, las inmunoterapias con p-glucano pueden incluir administrar a un sujeto cualquier forma adecuada de pglucano o cualquier combinación de dos o más formas de p-glucano. Los p-glucanos adecuados y la preparación de p-glucanos adecuados a partir de sus fuentes naturales se describen en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° US2008/0103112 A1. En algunos casos, el p-glucano puede derivarse de una levadura tal como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En determinados casos, el p-glucano puede ser o puede derivar de p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa, también denominado PGG (IMPRIME PGG, Biothera, Eagan, MN), una forma altamente purificada y bien caracterizada de p-glucano derivado de levaduras soluble. Además, las inmunoterapias basadas en p-glucano pueden implicar el uso de, por ejemplo, un p-glucano modificado y/o derivatizado tal como los descritos en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US12/36795. En otros casos, la inmunoterapia de p-glucano puede implicar administrar, por ejemplo, un p-glucano en partículas-soluble o una preparación de p-glucano en partículas-soluble, de los que cada uno de ellos se describe en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.981.447.

Los fármacos inmunoterápicos antineoplásicos destruyen las células cancerosas a través de múltiples modalidades: 1) activación directa de inmunocitos innatos, 2) activación directa de inmunocitos adaptativos, 3) activación indirecta tanto de inmunocitos innatos como de adaptativos haciendo que las células tumorales sean más inmunógenas u obstaculizando la inmunosupresión inducida por el tumor.

Las células mieloides en el microentorno tumoral (TME), incluyendo macrófagos M2, neutrófilos N2 y células supresoras derivadas mieloides (MDSC), pueden promover la inmunosupresión provocando directamente el agotamiento funcional de los linfocitos T citotóxicos o aumentando indirectamente la potencia supresora de los linfocitos T reguladores (Treg). Esto da lugar a un equilibrio inmunoestimulante frente a inmunosupresor desviado en el TME. El entorno inmunoestimulante del TME está conformado en gran medida por la presencia de linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK, macrófagos M1 citolíticos e inductores de fagocitosis, neutrófilos N i citotóxicos, linfocitos B inductores de respuesta humoral y células dendríticas inmunógenas presentadoras de antígeno (DC). Las citocinas y quimiocinas inmunoestimulantes tales como interferón gamma (IFN-y), interleucina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), etc. son coordinadores de la actividad inmunoestimulante. Los inmunocitos que desvían la naturaleza inmunosupresora del TME son linfocitos Th2 antiinflamatorios, neutrófilos N2, macrófagos M2, Treg y DC tolerógenas. Las citocinas y quimiocinas inmunosupresoras tales como factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p), interleucina-10 (IL-10), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), interleucina-4 (IL-4), etc. coordinan la actividad inmunosupresora.

El p-glucano soluble, debido a que es un patrón molecular asociado al patógeno (PAMP) que se une a C D IIb en células de origen mieloide, concretamente neutrófilos y monocitos, se une a y aumenta las funciones inmunoestimulantes de los neutrófilos N i y los macrófagos M i y disminuye las funciones inmunosupresoras de MDSC, los neutrófilos N2 y los macrófagos M2. Esta modulación da lugar a interferencias entre diferentes subconjuntos de células innatas y adaptativas en el TME y finalmente inclina el equilibrio hacia la inmunoestimulación. Más específicamente, una vez unido a monocitos de la sangre periférica, el p-glucano soluble modula la diferenciación de monocitos en macrófagos en condiciones de polarización Ml/antitumorigénica frente a M2/protumorigénica de modo que se potencia la polarización M i que aumenta las funciones inmunoestimulantes de macrófagos y se inhibe la polarización M2 que disminuye las funciones inmunosupresoras de macrófagos. El p-glucano soluble afecta directamente a la repolarización M2 al fenotipo M i y dirige la polarización Thl, y los inmunocitos innatos sensibilizados con p-glucano soluble generan citocinas para influir indirectamente en la proliferación de linfocitos T CD4 y CD8, incluso en presencia de Treg, y finalmente dirige la polarización Thi. Por tanto, el p-glucano soluble actúa como un PAMP para conseguir la funcionalidad completa del sistema inmunitario innato, para generar interferencia con el sistema inmunitario adaptativo mediante presentación potenciada del antígeno y para potenciar la eficacia antitumoral de anticuerpos dirigidos a tumor, tratamientos antiangiogénicos e inhibidores del punto de control.

El p-glucano soluble provoca una respuesta inmunitaria adaptativa mediante los dos subconjuntos de células innatas que se sabe que conectan las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas, los macrófagos derivados de monocitos y las células dendríticas y regulará por aumento la expresión de PD-Li tanto en macrófagos derivados de monocitos como en células dendríticas. A pesar de la regulación por aumento de PD-Li, los macrófagos derivados de monocitos y las células dendríticas tratados con p-glucano soluble potencian la activación y proliferación de linfocitos T, y la respuesta inmunitaria coordinada provocada por el p-glucano soluble provoca una respuesta inmunitaria parecida a la resistencia inmunitaria adaptativa, es decir, la regulación por aumento de la expresión superficial de PD-Li.

El p-glucano soluble puede combinarse con mAb que mitigan la inmunosupresión dirigidos a tumor, no activadores del complemento. Por ejemplo, el p-glucano soluble puede combinarse con inhibidores del punto de control inmunitario anti-PD-Ll (mAb IgGi con Fc manipulado) en el tratamiento de varios cánceres, incluyendo, melanoma, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, etc. La eficacia de anticuerpos anti-PD-1/PD-L1 puede depender del nivel de expresión de PD-L1 en tumores. Uno de los mecanismos de la expresión de PD-L1 en tumores se denomina resistencia inmunitaria adaptativa donde la expresión de PD-L1 se induce de forma adaptativa como consecuencia de respuestas inmunitarias dentro del microentorno tumoral (por ejemplo, producción de interferón gamma por linfocitos T activados). El p-glucano soluble induce directa o indirectamente polarización Th1. Este efecto regula por aumento la expresión de PD-L1 en células tumorales, y de este modo potencia la actividad antitumoral de anticuerpos anti-PD-1/PD-L1. Ejemplos de estos inhibidores del punto de control son nivolumab y pembrolizumab.

El p-glucano soluble puede combinarse con mAb no dirigidos a tumor, no activadores del complemento que potencian la coestimulación inmunitaria. Algunos ejemplos incluyen a) mAb anti-CD40 (mAb IgG2), que abordan células dendríticas y b) potenciadores anti-OX40, anti-41BB, de la coestimulación de linfocitos T en el tratamiento de varios cánceres. Estos también incluyen anticuerpos anti-PD-1 tales como, por ejemplo, nivolumab.

El p-glucano soluble puede combinarse con micromoléculas que mitigan la inmunosupresión no dirigidas a tumor, no activadoras del complemento y/o micromoléculas que mitigan la inmunosupresión dirigidas a tumor, no activadoras del complemento. Puede usarse un adyuvante en vacunas contra el cáncer para dirigir la polarización Th1. Puede usarse terapéuticamente para disminuir los mecanismos supresores en enfermedades crónicas (es decir, TB) para acelerar la eliminación completa de la infección. Finalmente, puede usarse para desviar el equilibrio Th2-Th1 en enfermedades autoinmunitarias Th2-dominantes (alergias, asma, enfermedades atópicas) a un entorno Th1-polarizado.

Aunque pueden preferirse agentes que mitigan la inmunosupresión no activadores del complemento, especialmente para agentes no dirigidos a tumor, los métodos descritos en el presente documento también pueden realizarse con agentes que mitigan la inmunosupresión activadores del complemento. Ejemplos de dichos agentes son bavituximab, ipilimumab y tremelimumab.

También se describe en el presente documento la coadministración de un p-glucano con otro agente farmacéutico, que, como se usa en el presente documento, puede ser una preparación de anticuerpo o una preparación de micromoléculas o cualquier preparación administrada para influir en el TME. Como se usa en el presente documento, "coadministrado" se refieren a dos o más componentes de una combinación administrados de modo que los efectos terapéuticos o profilácticos de la combinación puedan ser mayores que los efectos terapéuticos o profilácticos de cualquier componente administrado en solitario. Dos componentes pueden coadministrarse simultánea o secuencialmente. Los componentes coadministrados simultáneamente pueden proporcionarse en una o más composiciones farmacéuticas. La coadministración secuencial de dos o más componentes incluye casos en que los componentes se administran de modo que ambos componentes están biodisponibles simultáneamente después de administrar los dos. Independientemente de si los componentes se coadministran simultánea o secuencialmente, los componentes pueden coadministrarse en un solo sitio o en diferentes sitios.

También como se describe en el presente documento, el método puede incluir administrar a un sujeto una composición que incluye un resto de p-glucano conjugado con un anticuerpo, un anticuerpo terapéutico, un anticuerpo antitumoral o un fragmento de anticuerpo tal como la parte Fc de un anticuerpo. El p-glucano soluble modificado y/o derivatizado, incluyendo conjugados de p-glucano de un resto de p-glucano y un anticuerpo se describen en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US 12/36795, que también puede aplicarse a conjugados de fragmentos de anticuerpo. El resto de p-glucano puede ser, o puede derivar de un p-1,3/1,6 glucano. En este contexto, "derivado de" reconoce que un conjugado puede prepararse necesariamente creando un enlace covalente que remplaza uno o más átomos del pglucano. Como se usa en el presente documento, "derivado de un p-1,3/1,6 glucano" se refiere a una parte del pglucano que permanece como parte de un conjugado después de remplazar uno o más átomos del p-glucano para formar el enlace covalente del conjugado.

El p-glucano, el anticuerpo o la preparación de micromoléculas, y/o la combinación de ambos componentes puede formularse en una composición junto con un "vehículo". Como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye cualquier disolvente, medio de dispersión, excipiente, recubrimiento, diluyente, agente antibacteriano y/o antifúngico, agente isotónico, agente de retardo de la absorción, tampón, solución transportadora, suspensión, coloide y similares. El uso de dichos medios y/o agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el p-glucano o el anticuerpo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también pueden incorporarse ingredientes activos complementarios.

Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otra manera, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con el p-glucano y/o el agente farmacéutico sin provocar ningún efecto biológico indeseable o sin interactuar de una manera perjudicial con ninguno de los otros componentes de la composición farmacéutica en que está contenido.

El p-glucano, el agente farmacéutico y/o la combinación de ambos componentes puede formularse en una composición farmacéutica. En algunas realizaciones, el p-glucano y el agente farmacéutico pueden proporcionarse en una sola formulación. En otras realizaciones, el p-glucano y el agente farmacéutico pueden proporcionarse en formulaciones separadas. Una composición farmacéutica puede formularse en diversas y múltiples formas adaptadas a una o más vías de administración preferidas. Por tanto, una composición farmacéutica puede administrarse mediante una o más vías conocidas incluyendo, por ejemplo, oral, parenteral (por ejemplo, intradérmica, transcutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.) o tópica (por ejemplo, intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutánea, rectal, etc.). Una composición farmacéutica o una parte de la misma, puede administrarse a una superficie mucosa, tal como por administración a, por ejemplo, la mucosa nasal o respiratoria (por ejemplo, mediante pulverizador o aerosol). Una composición farmacéutica o una parte de la misma, también puede administrarse mediante una liberación mantenida o retardada.

Una formulación puede presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y puede prepararse por métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Los métodos de preparación de una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen la etapa de poner el p-glucano y/o el agente farmacéutico en asociación con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, una formulación puede prepararse poniendo de manera uniforme y/o íntima el compuesto activo en asociación con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en las formulaciones deseadas.

El p-glucano, el agente farmacéutico y/o la combinación de ambos componentes pueden proporcionarse en cualquier forma adecuada incluyendo, aunque sin limitación, una solución, una suspensión, una emulsión, un pulverizador, un aerosol o cualquier forma de mezcla. La composición puede administrarse en formulación con cualquier complemento, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la formulación puede administrarse en una forma de dosificación tópica convencional tal como, por ejemplo, una crema, una pomada, una formulación en aerosol, un pulverizador sin aerosol, un gel, una loción y similares. La formulación puede incluir además uno o más aditivos incluyendo tales como, por ejemplo, un adyuvante, un potenciador de la penetración de la piel, un colorante, una fragancia, un saborizante, un hidratante, un espesante y similares.

En algunas realizaciones, el p-glucano puede derivarse de levaduras tales como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, el p-glucano puede incluir un p-1,3/1,6 glucano tal como, por ejemplo, p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa.

En algunas realizaciones, el método puede incluir administrar suficiente p-glucano para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg al sujeto, aunque, en algunas realizaciones, los métodos pueden realizarse administrando el p-glucano en una dosis fuera de este intervalo. En algunas realizaciones, el método incluye administrar suficiente p-glucano para proporcionar una dosis de aproximadamente 10 |jg/kg a aproximadamente 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 4 mg/kg.

Como alternativa, la dosis puede calcularse usando el peso corporal actual obtenido justo antes del inicio del ciclo de tratamiento. Para las dosificaciones calculadas de esta manera, se calcula el área superficial corporal (m2) antes del inicio del ciclo de tratamiento usando el método de Dubois: m2 = (peso en kg0425 x estatura en cm0725) x 0,007184. En algunas realizaciones, por lo tanto, el método puede incluir administrar suficiente p-glucano para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 10 mg/m2.

En algunas realizaciones, el método puede incluir administrar suficiente anticuerpo que se una específicamente al pglucano para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg al sujeto, aunque, en algunas realizaciones, los métodos pueden realizarse administrando el anticuerpo en una dosis fuera de este intervalo. En algunas realizaciones, el método incluye administrar suficiente anticuerpo para proporcionar una dosis de aproximadamente 10 jg /kg a aproximadamente 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 100 jg/kg a aproximadamente 1 mg/kg.

Como alternativa, la dosis puede calcularse usando el peso corporal actual obtenido justo antes del inicio del ciclo de tratamiento. Para las dosificaciones calculadas de esta manera, se calcula el área superficial corporal (m2) antes del inicio del ciclo de tratamiento usando el método de Dubois: m2 = (peso en kg0425 x estatura en cm0725) x 0,007184. En algunas realizaciones, por lo tanto, el método puede incluir administrar suficiente anticuerpo para proporcionar una dosis de, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 10 mg/m2.

En algunas realizaciones, el p-glucano y el agente farmacéutico pueden coadministrarse, por ejemplo, de una sola dosis a múltiples dosis a la semana, aunque, en algunas realizaciones, el método puede realizarse coadministrando el p-glucano y el agente farmacéutico a una frecuencia fuera de este intervalo. En determinadas realizaciones, el pglucano y el agente farmacéutico pueden administrarse de aproximadamente una vez al año a una vez a la semana.

El término "y/o" significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos cualesquiera o más de los elementos enumerados; el término "comprende" y las variaciones del mismo no tienen un significado limitante cuando estos términos aparecen en la descripción y en las reivindicaciones; salvo que se especifique de otro modo, "un/o", "una", "el/la", y "al menos uno/a" se usan indistintamente y significan uno/a o más de uno/a; y las menciones de intervalos numéricos mediante los puntos finales incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

En la descripción precedente, pueden describirse realizaciones particulares de manera aislada por motivos de claridad. Salvo que se especifique expresamente de otro modo que los rasgos característicos de una realización particular son incompatibles con los rasgos característicos de otra realización, determinadas realizaciones pueden incluir una combinación de rasgos característicos compatibles descritos en el presente documento en relación con una o más realizaciones.

Para cualquier método divulgado en el presente documento que incluya etapas diferenciadas, las etapas pueden llevarse a cabo en cualquier orden factible. Y, según lo apropiado, puede llevarse a cabo simultáneamente cualquier combinación de dos o más etapas.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Establecimiento y caracterización de macrófagos M1 y M2 humanos cultivados in vitro: Se enriquecieron monocitos CD14+ de sangre completa humana usando gradiente de Ficoll y separación con microesferas magnéticas. Los monocitos enriquecidos (5 x 105 células por ml) entonces se cultivaron en condiciones de medio (XVivo 10) de polarización M1 (Lonza Group) complementado con suero autólogo al 5% y 100ng/ml de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humano recombinante (rhGM-CSF) (R&D Systems) o medio (XVivo 10) de polarización M2 complementado con suero autólogo al 10 % y 50 ng/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humano recombinante (rhM-CSF) (R&D Systems) durante 6 días. En experimentos realizados para evaluar el efecto de p-glucano, en primer lugar se incubó sangre completa con vehículo (tampón de citrato de sodio) o 25 |jg/ml de p-glucano soluble durante 2 horas a 37 °C y después se aislaron y diferenciaron los monocitos. La morfología se comprobó antes de recoger los macrófagos para el análisis fenotípico. Se recogió el medio de cultivo del cultivo de macrófagos del día 6 (MCM), se centrifugó para eliminar el sedimento celular contaminado y después se congeló para el posterior análisis de citocinas por ELISA o se usó para establecer un cocultivo con linfocitos T CD4 estimulados con CD3 y CD28 (MCM-T CD4) para la evaluación de marcadores superficiales o la proliferación de linfocitos T CD4. Los macrófagos se usaron para establecer un cocultivo con linfocitos T CD4 estimulados con CD3 y CD28 o solamente con CD3 (Mac-T CD4) en el día 6 para la evaluación de la modulación de marcadores superficiales o el efecto sobre la proliferación de linfocitos T CD4. Para el estudio de proliferación de Mac-linfocitos T CD4, se cultivaron macrófagos M1 o M2 con linfocitos T CD4 autólogos, marcados con CFSE, estimulados con CD3 y CD28 o solamente con CD3 a una relación de 1:10. La proliferación de linfocitos T se midió al final del experimento (día 9-día 11) por citometría de flujo, y los resultados se muestran gráficamente como picos de dilución de CFSE. La evaluación de linfocitos T estimulados solamente con CD3 se hizo siempre en el día 11. Los resultados cuantitativos se presentan como el índice de división (el número promedio de divisiones celulares que experimentó una población) calculado para cada uno de los pocillos triplicados en cada una de las condiciones de cultivo. Los sobrenadantes de cultivo de cocultivos de Mac-linfocitos T CD4 se recogieron para posterior análisis de citocinas.

Para la evaluación de la modulación de marcadores superficiales de Mac-linfocitos T CD4, se cocultivaron macrófagos M2 con linfocitos T como se describe anteriormente y las células se recogieron en el día 8, el día 9 y el día 10 para realizar tinción de receptores superficiales tanto en macrófagos M2 como en linfocitos T.

Para el estudio de proliferación de MCM-linfocitos T CD4, se cultivaron linfocitos T CD4 marcados con CFSE estimulados con CD3 y CD28 con MCM al 50 %. La proliferación de linfocitos T se midió en el día 11 como se describe anteriormente. Los sobrenadantes de cultivo de los cocultivos de MCM-linfocitos T CD4 se recogieron para posterior análisis de citocinas. La evaluación de marcadores superficiales de MCM-linfocitos T CD4 se realizó como se describe anteriormente.

Se prepararon macrófagos M1 y M2 y se caracterizaron como se describe anteriormente para A) morfología, B) fenotipo, C) evaluación funcional de proliferación de Mac-linfocitos T CD4 y D) análisis de citocinas en los cocultivos. La fig. 1A-fig. 1C incluyen resultados representativos de 5 experimentos diferentes.

Según la bibliografía, la morfología de M1 parecía más redondeada y M2 eran más alargados como fibroblastos (FIG.

1A). La expresión de marcadores específicos de M1/M2 se evaluó por citometría de flujo. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1

continuación

Coherente con la bibliografía con respecto al fenotipo, los macrófagos M1 normalmente expresaban niveles mayores de HLA-DR y CD274 (PD-L1), mientras que los macrófagos M2 expresaban niveles mayores de CD163 y CD14. Adicionalmente, en comparación con macrófagos M2 diferenciados in vitro, los macrófagos M1 también ayudaban significativamente a que los linfocitos T CD4 proliferaran como se muestra en la fig. 1B. Simultáneamente con la proliferación potenciada, se observó producción aumentada de interferón gamma (IFN-y) en los sobrenadantes de cocultivos de M1 y linfocitos T CD4 (FIG. 1C).

Las etapas de un método alternativo para cultivo in vitro y caracterización de macrófagos humanos que incluye la activación de macrófagos M1 y M2 (denominados macrófagos M1a y M2a) se resumen a continuación. Esta metodología se usó en la siguiente serie de experimentos.

WB (sin tratar o tratada con P-glucano o vehículo durante 2 horas a 37 °C)

Aislar PBMC por separación con Ficoll

Enriquecer monocitos por selección negativa

Cultivar monocitos en med ^\ io XVivo 10 durante 6 días:

Medio Ml-XVivolO complementado con suero humano al 5 % y 100 ng/nil de rhGM-CSF Medio cultivado de M la-M l con adición de 10 ng/ml de LPS y 50 ng/ml de IFN-y Medio M2-XVivol0 complementado con suero humano al 10 % y 50 ng/ml de rhM-CSF Medio cultivado de M2a-M2 con adición de 10 ng/ml de IL-4 durante las últimas 72 horas

} .

Recoger el sobrenadante de cultivo de macrófagos (MCM) y recoger

las células

Determinar la morfo ilogía por microscopía

Analizar el fenotipo por citometría de flujo

Estudiar la función de proliferación de linfocitos T estimulados con CD3/CD28 o solamente con CD3 en presencia de macrófagos (Mac-T CD4) por ensayo de dilución de CFSE

Los macrófagos M1a y M2s activados, preparados y caracterizados como se describe anteriormente, se caracterizaron para la morfología y el fenotipo. Aquí se muestran resultados representativos de 5 experimentos diferentes.

La fig. 1D muestra la morfología de macrófagos M1a y M2a. La expresión de marcadores específicos de M1a/M2a se evaluó por citometría de flujo. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

continuación

Ejemplo 2

Efecto de p-glucano sobre la repolarización M2 a M1: Se prepararon macrófagos M1 y M2 a partir de sangre completa tratada con vehículo o p-glucano como se describe anteriormente. Una expresión de un panel de marcadores específicos de M1/M2 (incluyendo HLA-DR, CD163, CD206, CD209, CD80, Cd 86 y PD-L1) se midió por citometría de flujo. El pretratamiento con p-glucano no afectó al fenotipo de macrófagos M1, sino que afectó al fenotipo de macrófagos M2. Como se muestra en la fig. 2A, la intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD163 se modula por disminución en macrófagos M2 tratados con p-glucano. Además, se potenció la expresión superficial de CD86, así como tanto los niveles de proteínas como los niveles de ARNm de PD-L1 (FIG. 2B).

A continuación, se cultivaron macrófagos M1 o M2 tratados con vehículo o p-glucano con linfocitos T CD4 autólogos marcados con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), estimulados con CD3 y CD28 y se midió la proliferación de linfocitos T al final del experimento por citometría de flujo y los resultados se presentaron cuantitativamente como índice de división (el número promedio de divisiones celulares que ha experimentado una población). La fig. 2C es un ensayo de proliferación de linfocitos T de dilución de CFSE representativo realizado cocultivando linfocitos T con macrófagos M2 tratados con p-glucano, y los resultados muestran la capacidad de los macrófagos M2 tratados con p-glucano de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4.

Los sobrenadantes de cultivo del ensayo de proliferación de linfocitos T de dilución de CFSE (FIG. 2B) también se midieron para los niveles de IFN-gamma por ELISA. La fig. 2D es un gráfico representativo de los niveles de IFN-gamma que muestra un aumento simultáneo en la producción de IFN-gamma. Por tanto, el p-glucano afecta a la repolarización M2 a M1 y dirige la polarización Th1 antitumorigénica.

Ejemplo 3

Efecto de p-glucano sobre repolarización M2 a M1 en células de sujetos de alta unión frente a sujetos de baja unión: Los estudios previos que evalúan la unión de p-glucano soluble a neutrófilos y monocitos revelaron que los sujetos tienen diferentes capacidades de unión. Estudios adicionales encontraron que el p-glucano soluble se unía a al menos algunos inmunocitos de sujetos de alta unión, y los sujetos de alta unión también tenían niveles mayores de anticuerpos anti-p-glucano naturales. Los estudios funcionales identificaron puntos de corte generales de unión y niveles de anticuerpo, que se usaron para identificar a los sujetos como de alta unión (alta respuesta a p-glucano) y de baja unión (baja respuesta a p-glucano).

Para este fin, se realizaron evaluaciones de macrófagos M1/M2 derivados de monocitos tratados con p-glucano soluble de sujetos de alta unión y sujetos de baja unión. Posteriormente se evaluaron los macrófagos M1 y M2 de sujetos de alta unión y sujetos de baja unión para A) fenotipo, B) potenciación de proliferación de linfocitos T c D4 y C) modulación de producción de IFN-y e IL-4. La fig. 3A-fig. 3C son resultados representativos de 4 experimentos diferentes.

Se evaluó la expresión de un panel de marcadores por citometría de flujo para macrófagos M1 y M2 derivados de sujetos de alta unión tratados con vehículo y p-glucano (se evaluó CD163 dos veces). Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 3.

T - l ni n

CD163 y CD86 se evaluaron por citometría de flujo para macrófagos M1 y M2 derivados de sujeto de baja unión tratados con vehículo y p-glucano. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 4.

Tabla 4-Sueto de baa^ unión

El resultado clave es que los macrófagos M2 tratados con p-glucano tenían menor expresión de CD163, uno de los marcadores clave de M2. De forma interesante, este resultado fue específico para sujetos de alta unión ya que la expresión de CD163 se mantenía igual entre los macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano.

A continuación, se evaluó la capacidad de macrófagos M1/M2 derivados de monocitos tratados con p-glucano soluble de sujetos de alta unión y sujetos de baja unión para potenciar la proliferación de linfocitos T CD4 estimulados con CD3 y CD28. La fig. 3A muestra los resultados del ensayo de proliferación de linfocitos T CD4 en un sujeto de alta unión, mientras que la fig. 3B muestra los resultados en un sujeto de baja unión. Los macrófagos M2 tratados con pglucano tenían una capacidad significativamente mayor de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4 estimulados con CD3 y CD28 en comparación con la observada con los macrófagos M2 tratados con vehículo en sujetos de alta unión, mientras que no había proliferación potenciada en sujetos de baja unión. Además, los macrófagos M1 tratados con p-glucano no mostraron diferencias en esta capacidad funcional en comparación con los macrófagos M2 tratados con vehículo en sujetos de alta unión o sujetos de baja unión.

Entonces se evaluó la modulación de la producción de IFN-y e IL-4 de los macrófagos M2 tratados con vehículo y pglucano. Simultáneamente con la proliferación potenciada, se observó producción significativamente aumentada de IFN-y, pero no de IL-4 en cocultivos de macrófagos M2 tratados con p-glucano y linfocitos T CD4 en sujetos de alta unión (FIG. 3C), pero no en sujetos de baja unión (FIG. 3D). Por tanto, los macrófagos M2 derivados de monocitos tratados con p-glucano son similares a M1 en sujetos de alta unión.

Ejemplo 4

Efecto de p-glucano sobre la repolarización M2 a M1 en condiciones inmunosupresoras: Se realizó la evaluación fenotípica y funcional de macrófagos M2a tratados con p-glucano y M2 tratados con p-glucano en presencia de citocinas inmunosupresoras. Se prepararon macrófagos m 2 o M2a como se describe anteriormente. El día 3, se añadió medio acondicionado de tumor (TCM) a los cultivos de macrófagos M2 para justificar un 70 % del volumen del cultivo y después se evaluó para la expresión de CD163 y la actividad funcional en el día 6. El TCM de BxPC3, una línea celular de cáncer pancreático, ha demostrado contener varias citocinas inmunosupresoras incluyendo M-CSF, TGF-beta, IL-4, etc. Se cultivaron macrófagos M2a en IL-4 como se describe anteriormente.

Los macrófagos M2a tratados con p-glucano cultivados en IL-4 y los macrófagos M2 cultivados en TCM se evaluaron en primer lugar para la expresión de CD163 y CD86. CD163 y CD86 se evaluaron por citometría de flujo y se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5-Condiciones inmunosu resoras

Como se observa en experimentos previos de diferenciación de M2 usando M-CSF, los monocitos tratados con pglucano cultivados en TCM también mostraron una notable regulación por disminución de CD163. Además, los macrófagos M2 tratados con p-glucano tenían mayor expresión de HLA-DR (datos no mostrados).

Entonces se realizó una evaluación funcional de la capacidad de modular la proliferación de linfocitos T CD4 mediante el ensayo de proliferación de linfocitos T CD4 (tres o seis réplicas en cada condición). Los macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en TCM y los macrófagos M2a cultivados en IL-4 mantuvieron la capacidad de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4 en comparación con la observada con los macrófagos M2 y M2a tratados con vehículo. Simultáneamente con la proliferación potenciada, se observó producción significativamente aumentada de IFN-y en cocultivos de macrófagos y linfocitos T CD4 (FIG. 4).

Los ejemplos anteriores demuestran que el p-glucano soluble tiene la capacidad de inhibir la polarización M2 y de inducir más células similares a M1 como se demuestra por la expresión reducida de CD163, la expresión aumentada de CD86 y por la inhibición de la capacidad de M2 de suprimir la proliferación de linfocitos T CD4. Incluso en condiciones inmunosupresoras, simuladas por la presencia de IL-4 en combinación con M-CSF o medio acondicionado de tumor (TCM), el p-glucano soluble podía inhibir la polarización M2 y potenciar su capacidad de ayudar a la proliferación de linfocitos T CD4. La potenciación de la proliferación de linfocitos T CD4 por M2-p-glucano soluble estuvo acompañada con un aumento en la citocina proinflamatoria de polarización Th1, IFN-y, y sin cambios en la producción de la citocina inmunosupresora IL-4.

Ejemplo 5

Efecto de p-glucano sobre la proliferación de linfocitos T CD4/CD8 y activación en presencia de Treg: Para obtener plasma, se trató sangre completa durante 6 horas con 25 pg/ml de p-glucano o vehículo, se centrifugó y se retiró el plasma. Se cultivaron 50000 PBMC autólogos marcados con CFSE en el plasma tratado durante 3 días en presencia de 50000 microesferas de CD3/28 activadoras de linfocitos T (DYNABeA d S Human T-Activator CD3/CD28 para la expansión y activación de linfocitos T). Al final del cultivo, los PBMC se tiñeron con CD4 y CD8 y se midió la proliferación de linfocitos T por dilución de CFSE. Como se muestra mediante los diagramas de dilución de CFSE representativos en la fig. 5A, el plasma de sangre completa tratada con p-glucano proporcionó una potenciación significativa en la proliferación tanto de CD4 como de CD8 en comparación con los controles tratados con vehículo.

A continuación, para mostrar el efecto del p-glucano soluble sobre la activación de linfocitos CD4 y CD8, se realizó de nuevo el ensayo de proliferación de linfocitos T descrito anteriormente. El día 3, sin embargo, las células se tiñeron para los marcadores de activación, incluyendo la producción de granzima B y la regulación por aumento de CD25. Los gráficos mostrados en la fig. 5B demuestran que el plasma tratado con p-glucano potencia la actividad de linfocitos CD4 y CD8.

La potenciación en la proliferación fue máxima cuando la sangre completa se tratada durante el periodo de incubación de 6 horas antes del aislamiento del plasma, lo que indica que este efecto sobre la proliferación de linfocitos T es el resultado de un mecanismo indirecto (es decir, la liberación de citocinas por los inmunocitos innatos). Para determinar si la potenciación de la proliferación de linfocitos T por p-glucano es directa o indirecta, se realizaron ensayos de proliferación de linfocitos T como se describe anteriormente, excepto que el plasma de sangre completa sin tratar (vehículo) se trató entonces con p-glucano o vehículo antes de añadir PBMC autólogos. Se cuantificó la dilución de CFSE mediante el índice de división usando el programa informático FLOWJO y se representó como el factor de cambio sobre el control de vehículo. Los resultados mostrados en la fig. 5C indican que el efecto potenciado del pglucano se debe a mecanismos indirectos.

Como estos cultivos de PBMC contienen Treg, la capacidad supresora de los Treg parece alterarse en presencia de p-glucano soluble y se realizaron estudios para determinar si el p-glucano afectaba a la supresión de Treg. Se añadió plasma de sangre completa tratada con p-glucano tratada con vehículo (descrito anteriormente) a 25000 linfocitos T CD4 autólogos marcados con CFSE aislados (CD4+CD25') junto con números crecientes de Treg autólogos aislados (CD4+CD25+), dando como resultado pocillos con relaciones crecientes. Las células entonces se estimularon con 50 000 microesferas de CD3/28 activadoras de linfocitos T durante 3 días. Posteriormente se midió la proliferación mediante dilución de CFSE y se cuantificó por el índice de división, que se usó para calcular el % de supresión de Treg en el cocultivo. % de supresión = 100-(índice de división de pocillo de Treg/índice de división de pocillo de 1:0)/100. Los resultados se muestran en la fig. 5D. El plasma de sangre completa tratada con p-glucano mostró disminuciones significativas en la capacidad supresora de los Treg en comparación con el plasma de sangre completa tratada con vehículo.

La supresión de Treg por p-glucano también provocó producción potenciada de IFN-gamma. El ensayo de supresión de Treg se realizó como se describe anteriormente, y después de 3 días de cocultivo, se analizaron los sobrenadantes para la producción de IFN-gamma. La fig. 5E muestra los resultados de la producción de IFN-gamma de pocillos cultivados a una relación de linfocitos T a Treg de 8:1. Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que el pglucano afecta a la proliferación de CD4 y CD8 junto con la función Treg, provocando una función efectora adaptativa antitumoral potenciada.

Ejemplo 6

Establecimiento y caracterización de células dendríticas derivadas de monocitos inmaduros humanos cultivados in vitro (imMoDC) y células dendríticas derivadas de monocitos maduros (mMoDC): Dado que los macrófagos y las células dendríticas son los dos tipos clave de células presentadoras de antígeno que conectan la inmunidad innata y adaptativa, también se evaluó el efecto fenotípico y funcional del p-glucano soluble sobre células dendríticas derivadas de monocitos humanos (MoDC). Se cultivaron monocitos enriquecidos de sangre completa tratada con p-glucano soluble o vehículo en medio que contenía las citocinas apropiadas, GM-CSF más IL-4, para la diferenciación de células dendríticas. Las etapas incluidas en el método para el cultivo in vitro y caracterización de MoDC humanas se resumen a continuación.

Sangre completa (sin tratar o tratada con p-glucano soluble o vehículo durante 2 horas a 37 °C)

Aislar PBMC por separación con Ficoll

Enriquecer monocitos por selección negativa

Cultivar monocitos en medio XVivo 15 (complementado con suero autólogo humano al 10 %, 50 ng/ml de rhGM-CSF ) durante 6-7 días

Inducir maduración de Mo 'DC por LPS (50

ng/ml) durante 48-72 horas

Morf .ología determinada por microscopía

Análisis fenotípico por citometría de flujo

Estudio funcional mediante reacción de linfocitos mixtos alogénicos (alo-MLR)

Las imMoDC y mMoDC, preparadas como se describe anteriormente, se muestran en la fig. 6A. La morfología de las mMoDC se caracteriza por la presencia de proyecciones largas o dendritas.

Las mMoDC se evaluaron para la expresión de CD80, CD83, CD86 y HLA-DR por citometría de flujo, y se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6

Las mMoDC mostraron expresión superficial aumentada de los marcadores y maduración y coestimulantes CD80, CD83, CD86, así como HLA-DR. Además, estas mMoDC también mostraron inmunogenia en una reacción de linfocitos mixtos alogénicos (cuatro réplicas en cada condición), desencadenando la expansión de linfocitos T CD4 y CD8 aumentada (FIG. 6B).

Ejemplo 7

Efecto de p-glucano sobre la maduración de MoDC: Se realizó la evaluación fenotípica y funcional de mMoDC preparadas a partir de sangre completa tratada con p-glucano soluble de un sujeto de alta unión y un sujeto de baja unión. Las mMoDC de un sujeto de alta unión y un sujeto de baja unión se prepararon como se describe anteriormente. Las mMoDC se evaluaron para la expresión de CD80, CD83, CD86 y HLA-Dr por citometría de flujo, y se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 7.

Tabla 7-mMoDC

La expresión aumentada de CD80, CD86, CD83 y HLA-DR en mMoDC tratadas con p-glucano derivadas de sujetos de alta unión indica que estas mMoDC son más maduras que las derivadas de sujetos de baja unión.

Las mMoDC tratadas con p-glucano derivadas de sujetos de alta unión también mostraron inmunogenia aumentada en alo-MLR (cuatro réplicas en cada condición), de nuevo desencadenando la expansión de linfocitos T CD4 y CD8 aumentada (FIG. 7A) sobre las células derivadas de sujetos de baja unión (FIG. 7B).

Además, las mMoDC tratadas con p-glucano derivadas de sujetos de alta unión pudieron modular la producción de IFN-y sobre células derivadas de sujetos de baja unión y mMoDC tratadas con vehículo (FIG. 7C).

Las MoDC derivadas de monocitos tratados con p-glucano son más maduras incluso en condiciones inmunosupresoras. Las MoDC se prepararon como se describe anteriormente. Se añadió TCM para justificar un 70 % del volumen del cultivo en el día 0 y estuvo presente en todo el periodo de cultivo. Las mMoDC cultivadas en presencia de TCM se evaluaron posteriormente para los cambios fenotípicos. Se calculó la mediana de MFI para la tinción de control de isotipo y la tinción de antígenos superficiales y los resultados se muestran en la tabla 8.

Tabla 8-Condiciones inmunosu resoras

Ejemplo 8

El contacto célula a célula y factores solubles aumentan la proliferación de linfocitos T CD4 por macrófagos M2 tratados con p-glucano: Usando la proliferación de linfocitos T CD4 como lectura, se estudió la necesidad del contacto célula a célula o uno o más factores solubles en el inicio de la proliferación por macrófagos M2 tratados con p-glucano. Para estudiar el contacto célula a célula entre macrófagos y linfocitos T, se midió la proliferación de linfocitos T CD4 cuando se cocultivaban con macrófagos M2 tratados con p-glucano en ausencia de coestimulación con CD28 y se estudió la modulación de marcadores de activación superficiales tanto en macrófagos M2 tratados con p-glucano como en linfocitos T en el cocultivo.

La evaluación del contacto célula a célula se realizó de la siguiente manera: se utilizaron cocultivos de macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano y linfocitos T CD4 estimulados con CD3 y CD28 frente a solamente con CD3 para medir la proliferación de linfocitos T CD4 y la producción de IFN-y.

Como se muestra en la fig. 8A, los macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados con linfocitos T CD4 en ausencia de anticuerpo exógeno contra CD28 demostraron capacidad significativamente mayor de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4. Simultáneamente con la proliferación potenciada, se observó producción significativamente aumentada de IFN-y en cocultivos de macrófagos M2 tratados con p-glucano y linfocitos T CD4 (FIG. 8B).

También se midieron los cambios en la expresión de marcadores superficiales tanto en macrófagos como en linfocitos T estimulados con CD3 y CD28. Los macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano los linfocitos T CD de los cocultivos se evaluaron por citometría de flujo para la modulación de moléculas coestimulantes o coinhibidoras. La fig.

8C y la tabla 9 son resultados representativos de 2 experimentos diferentes.

Tabla 9

De todos los marcadores superficiales ensayados, se observó un aumento significativo en la expresión superficial de CD86 (día 8) y PD-L1 (día 9) en la superficie de macrófagos M2 tratados con p-glucano en comparación con la de macrófagos M2 tratados con vehículo. Se observó expresión aumentada de PD-1 (día 9) en la superficie de linfocitos T cocultivados con macrófagos M2 tratados con p-glucano.

Para determinar si los factores solubles secretados de macrófagos M2 tratados con p-glucano son necesarios, se realizaron mediciones de proliferación de linfocitos T CD4 cocultivados con MCM de macrófagos M2 tratados con pglucano (50 % de volumen) y se observó la modulación de marcadores de activación superficiales en linfocitos T incubados con el MCM. La fig. 9 es representativa de 2 experimentos diferentes. Cuando se evalúan por ensayo de proliferación de linfocitos T CD4, el MCM de macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivado con linfocitos T CD4 demostró capacidad significativamente mayor de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4 (FIG. 9) en comparación con MCM de macrófagos M2 tratados con vehículo. Además, se evaluaron los linfocitos T CD4 cultivados en MCM de macrófagos M2 tratados con vehículo y p-glucano para la modulación de moléculas coestimulantes o coinhibidoras (CD80, CD28, CTLA-4, 4-1BB y PD-1). Sorprendentemente, no se observaron cambios en ninguno de los marcadores de linfocitos T (datos no mostrados).

Ejemplo 9

Análisis de macrófagos M2 tratados con p-glucano en sujetos de alta unión frente a sujetos de baja unión: Como se analiza previamente, se ha demostrado que los umbrales de anticuerpo anti-p-glucano (ABA) son importantes para inmunoterapia de p-glucano. Por lo tanto, se investigó la importancia del umbral de ABA en la capacidad del p-glucano de modular la polarización M1/M2. Se determinó la capacidad del p-glucano de modular la polarización M1/M2 en sujetos de alta unión frente a sujetos de baja unión, mediante evaluaciones tanto fenotípicas como funcionales.

Se prepararon macrófagos M2 de 4 sujetos de alta unión y 4 sujetos de baja unión y se evaluaron para su capacidad de modular la proliferación de linfocitos T CD4. Se midieron los sobrenadantes de las diversas condiciones de proliferación de linfocitos T CD4 para IFN-y por ELISA. Los resultados mostrados en la fig. 10 son representativos de 4 experimentos diferentes. El factor de cambio sobre los niveles de IFN-y producidos en los cocultivos de macrófagos M2 tratados con vehículo y linfocitos T CD4 se representan para cada uno de los 4 donadores.

En sujetos de baja unión, el p-glucano no modulaba ninguno de los marcadores fenotípicos en los macrófagos derivados de monocitos en condiciones de polarización M1/M2 (datos no mostrados), y en una evaluación funcional de sujetos de baja unión mediante ensayo de proliferación de linfocitos T CD4, los macrófagos M2 tratados con pglucano ni potenciaron la proliferación de linfocitos T CD4 ni disminuyeron la producción de IFN-y.

Ejemplo 10

Estudios de cruce de suero: Como el p-glucano no lograba mostrar modulación de la polarización M1/M2 en sujetos de baja unión, se evaluó la modulación por p-glucano usando monocitos de un sujeto de baja unión en presencia de suero que contenía niveles mayores de ABA (cruce de suero de un sujeto de alta unión). Para examinar esto, se prepararon macrófagos M2 como se describe anteriormente con unas pocas modificaciones. Se centrifugó la sangre completa de un sujeto de baja unión para retirar el plasma y después se reconstituyeron las células con suero obtenido de un sujeto de alta unión. La sangre reconstituida se trató con vehículo o p-glucano (25 pg/ml) durante 2 horas a 37 °C. Los monocitos se evaluaron para la unión usando anticuerpo monoclonal específico anti-p-glucano y posterior citometría de flujo. Los monocitos tratados con vehículo o p-glucano en sangre completa se aislaron entonces y se diferenciaron en macrófagos M2, y se usaron las células M2 (datos no mostrados) o el MCM para evaluar su capacidad de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4 (seis réplicas en cada condición) y aumentar la producción de IFN-y usando métodos descritos anteriormente.

Los monocitos de la sangre completa de un sujeto de baja unión no se unían a p-glucano, pero mostraban unión significativamente mayor cuando se añadía un suero de sujeto de alta unión que contenía niveles mayores de ABA a la sangre completa del sujeto de baja unión (FIG. 11A). Además, el MCM de macrófagos M2 tratados con p-glucano de un sujeto de baja unión cruzado con el suero de un sujeto de alta unión tiene capacidad significativamente mayor de potenciar la proliferación de linfocitos T CD4 en comparación con la observada con los macrófagos M2 tratados con vehículo. Simultáneamente con la proliferación potenciada, se observó producción significativamente aumentada de IFN-y en cocultivos de macrófagos M2 tratados con p-glucano y linfocitos T CD4 (FIG. 11B).

Ejemplo 11

Regulación por aumento de PD-L1 sobre macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en presencia de citocinas inmunosupresoras (TCM): Se prepararon monocitos o macrófagos M2 como se describe anteriormente. El día 3, se añadió TCM para justificar un 7o % del volumen del cultivo y después se evaluó para la expresión de PD-L1 con TCM y después de nuevo cuando se cocultivó con linfocitos T c D4.

Los macrófagos M2 tratados con p-glucano cultivados en TCM tenían mayor expresión superficial en PD-L1 (FIG.

12A). También huevo expresión aumentada cuando se cocultivaban con linfocitos T CD4 (FIG. 12B).

Usando el sistema anterior, se determinó que el p-glucano tiene la capacidad de inhibir la polarización M2 como se demuestra por la expresión reducida de un marcador de M2 clave, CD163, y por la inhibición de la capacidad de M2 de suprimir la proliferación de linfocitos T CD4. Incluso en un entorno inmunosupresor, estimulado por la presencia de IL-4 en combinación con M-CSF (datos no mostrados) o medio acondicionado de tumor (TCM), el p-glucano podía inhibir la polarización M2 y potenciar su capacidad de ayudar a la proliferación de linfocitos T CD4. La potenciación de la proliferación de linfocitos T CD4 por M2-p-glucano estuvo acompañada con un aumento en la citocina proinflamatoria de polarización Th1, IFN-y, y sin cambios en la producción de la citocina inmunosupresora IL-4. Como se esperaba con el aumento de la activación de linfocitos T y la producción de IFN-y, se observaron aumentos en la expresión superficial de PD-L1 en macrófagos M2 tratados con p-glucano y PD-1 en linfocitos T. Los propios macrófagos M2 tratados con p-glucano, así como los factores solubles secretados por las células, son importantes para potenciar la proliferación de linfocitos T CD4. Finalmente, el p-glucano inhibía la polarización M2 solamente en las células de donadores sanos que tenían mayores niveles de ABA.

Ejemplo 12

Regulación por aumento de PD-L1 en MiaPaCa: Se cultivaron macrófagos M2 tratados con p-glucano y vehículo y macrófagos M2 tratados con p-glucano ABA con suero de sujeto de alta unión y suero de sujeto de baja unión para evaluar la expresión de PD-L1 en células tumorales. La fig. 13 muestra que los macrófagos M2 tratados con p-glucano aumentaban la expresión de PD-L1 en células tumorales en sujetos de alta unión, y sin adición de ABA, los macrófagos M2 tratados con p-glucano también aumentaban la expresión de PD-L1 en células tumorales en sujetos de baja unión.

Ejemplo 13

Efecto de p-glucano soluble sobre células supresoras derivadas mieloides (MDSC): Las MDSC se acumulan en la sangre, los ganglios linfáticos y la médula ósea y en sitios de tumor en la mayoría de pacientes y animales experimentales con cáncer e inhiben tanto la inmunidad adaptativa como la innata. Las MDSC se inducen por factores secretados por el tumor y secretados por el hospedador, de los que muchos de ellos son moléculas proinflamatorias. La inducción de MDSC por mediadores proinflamatorios dio lugar a la hipótesis de que la inflamación promueve la acumulación de MDSC que regula por disminución la vigilancia inmunitaria y la inmunidad antitumoral, facilitando de ese modo el crecimiento tumoral.

Se extrajo sangre en diversos momentos de un sujeto de estudio de casos que se sometió a tratamiento con IMPRIME PGG y se analizó para la presencia de MDSC. La primera extracción de sangre se hizo antes de la infusión, ciclo 8, día 1. Como se muestra en la fig. 14A, una gran población de MDSC, CD33+, está presente en la sangre periférica. Una segunda extracción de sangre se hizo después de la infusión, ciclo 8, día 1. Como se muestra en el segundo panel de la fig. 14A, en horas después de la infusión las MDSC desaparecen transitoriamente. La última muestra de sangre se extrajo antes de la infusión, ciclo 8, día 15. Las MDSC CD33+ están de nuevo presentes en la sangre periférica.

En otro estudio, se enriqueció sangre de cordón umbilical humana para células CD34+ y se cultivó durante 9 días para producir células CD33+CD11b+ (MDSC). Las MDSC entonces se trataron con p-glucano soluble o tampón de citrato (control) y se evaluaron para su capacidad de suprimir la proliferación de linfocitos T. El ensayo de proliferación de linfocitos T se realizó a una relación de 2:1 de linfocitos T CD8 a MDSC tratadas o sin tratar. Como se muestra en la fig. 14B, las MDSC tratadas con p-glucano eran menos supresoras para la proliferación de linfocitos T.

Estos resultados indican que el p-glucano modula la población de MDSC haciendo que dejen transitoriamente la circulación sanguínea periférica y sean menos supresoras para la proliferación de linfocitos T. Por tanto, si se administra uno o más fármacos inmunoterápicos contra el cáncer o fármacos quimioterápicos en combinación con pglucano soluble, especialmente durante el periodo de pérdida transitoria de la población de células CD33+, los tratamientos serían más eficaces contra los tumores.

Ejemplo 14

El sobrenadante de cocultivo de macrófagos M2 tratados con p-glucano/MoDC y linfocitos T induce la expresión de PD-L1 en células tumorales: se prepararon macrófagos M2 y MoDC como se describe anteriormente. Los macrófagos y las MoDC posteriormente se usaron en ensayos de proliferación de linfocitos T como se describe previamente. Los sobrenadantes de estos ensayos de proliferación se recogieron e incubaron con diversas líneas celulares tumorales, incluyendo NSCLC, de mama, pancreático, de colon y linfoma de linfocitos B. La expresión de PD-L1 en estas líneas celulares tumorales se evaluó después de 48 horas por citometría de flujo. En la fig. 15 se muestran resultados representativos de 3 experimentos diferentes.

Los linfocitos T requieren tres señales para sus mecanismos efectores. La señal 1 es el antígeno presentado en el contexto de moléculas MHC en las células presentadoras de antígeno (APC), la señal 2 se proporciona por las moléculas coestimulantes de membrana en la APC, y la señal 3 es las citocinas producidas en el medio para la función efectora. Las moléculas coestimulantes, tales como PD-L1 pueden inhibir las funciones efectoras de los linfocitos T.

Los macrófagos y células dendríticas derivadas de monocitos tratados con p-glucano in vitro tienen mayores niveles de expresión de PD-L1, pero el tratamiento también aumenta la expresión de la molécula coestimulante CD86, (señal 2) y citocinas (señal 3), lo que permite una función efectora de linfocitos T potenciada.

La respuesta inmunitaria innata y adaptativa más amplia provocada por el p-glucano también potencia la expresión de PD-L1 en las líneas celulares tumorales. Estos resultados demuestran que la regulación por aumento de la expresión de PD-L1 inducida por p-glucano tanto en los inmunocitos como en las células tumorales hace que sea un compañero de combinación prometedor con la inmunoterapia contra el cáncer de inhibidor del punto de control.

Se igual de importante observar que el p-glucano también tiene la capacidad de compensar el efecto inhibidor de la regulación por aumento de PD-L1 por mecanismos compensadores tales como expresión aumentada de moléculas coestimulantes y producción de citocinas inmunoestimulantes.

Ejemplo 15

Efecto de p-glucano soluble en combinación con agente antiangiogénicos en el TME: La angiogénesis tumoral altera la función inmunitaria en el TME, dando como resultado un entorno inmunosupresor. Los agentes antiangiogénicos, tales como el anticuerpo anti-VEGFR2 DC101 (ramucirumab de ratón), han demostrado ser útiles en tratamiento contra el cáncer. Como el p-glucano soluble puede desviar el TME a un entorno más antitumoral, se usó en combinación con DC101 para tratar xenoinjertos subcutáneos de cáncer broncopulmonar no microcítico (NSCLC) NCI-H441 en ratones para aumentar la eficacia del anticuerpo DC101.

A ratones atímicos hembra de 6 a 8 semanas de edad se les inyectó 5 x 106 células tumorales H441 en un volumen de 0,2 ml por vía subcutánea en el flanco. A los ratones se les dosificó bisemanalmente cuando el volumen tumoral medio alcanzó aproximadamente 150 mm3 con los siguientes agentes:

• 0,2 ml/ratón de vehículo

• 1,2 mg/ratón de IMPRIME PGG (Biothera, Inc.)

• 10 mg/kg o 20 mg/kg de DC101 (clon: DC101 n.° catálogo: BE0060)

Se recogieron muestras de sangre en el día 10 y 2 horas después de la última dosis.

Los grupos de tratamiento incluían vehículo (control de PBS), IMPRIME PGG en solitario, DC101 en solitario y DC101 IMPRIME PGG. Los tumores se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento una vez que los tamaños alcanzaron una media de grupo de 150 mm3 Los resultados de los volúmenes tumorales de los grupos de tratamiento de 10 mg/kg se muestran en la fig. 16A y fig. 16B.

Como es evidente por los gráficos, IMPRIME PGG DC101 (un anticuerpo no dirigido a tumor, activador del complemento) actuaba sinérgicamente para minimizar el crecimiento del tumor. Como se muestra específicamente en la fig. 16B, un 70 % de los ratones tratados con IMPRIME PGG DC101 tuvieron más de un 75 % de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) en comparación con solamente un 30 % de los ratones tratados con DC101 en solitario. Por tanto, el p-glucano soluble en combinación con un agente antiangiogénico (que puede ser o no un anticuerpo no dirigido a tumor, activador del complemento) es un tratamiento contra el cáncer eficaz.

Se realizó análisis adicional para mostrar que los inmunocitos se activan en el TME. El día 37, después de la inyección, se recogieron los bazos y se recogieron suspensiones monocelulares por FACS. Se calculó la frecuencia o GMFI en FLOWJO después de seleccionar las células indicadas en la fig. 16C. Como se muestra en los gráficos superiores de la fig. 16C, los animales tratados con IMPRIME PGG DC101 tenían MDSC esplénicas reducidas, mientras que los gráficos inferiores muestran un aumento en los macrófagos esplénicos en los animales tratados con combinación.

También se realizó análisis adicional en tumores completos retirados de los ratones el día 37, después de la inyección. Se generaron suspensiones monocelulares de tumores H441 de acuerdo con el protocolo que utiliza un Milteny Octodissociator. Se aisló el ARN total de las suspensiones tumorales con un minikit RNeasy (QIAGEN, Venlo, Limburg). Se sintetizó ADNc de primera hebra con SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Life Technologies, Carlsbad, CA). Se realizó reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa instantánea (qRT-PCR) usando mezcla TaqMan Gene Expression Master Mix y mezcla de ensayo Taqman Gene Expression que contenía cebadores específicos de secuencia para TNFa, CD206, TGFp y ARNr 18s (Life Technologies) con un sistema Step One Plus Real-Time PCR System (Life Technologies). La cuantificación de los datos se hizo usando el método comparativo A-ACt. La cantidad de ARNm en cada muestra se normalizó usando los niveles medios de ARNr 18s. El factor de cambio de TNF-a, CD206 y TGF-p en el grupo tratado con IMPRIME PGG DC101 se comparó con el del control de vehículo y el grupo de DC101 en solitario. Como se muestra en la fig. 16D, la expresión de TNF-a aumentó mientras que la expresión de CD206 y TGF-p disminuyó en animales tratados con IMPRIME PGG DC101, lo que indica un aumento en las células con un fenotipo similar a Th1 dentro del TME.

Ejemplo 16

El p-glucano soluble en combinación con anticuerpos anti-PD-Ll potencia la supervivencia sin tumor: En otro estudio en animales, a los ratones se les inyectó células tumorales MC38 y se asignaron aleatoriamente en grupos de tratamiento. A ratones C57BL/6 hembra de 8 a 12 semanas de edad se les inyectó 1 x 106 células tumorales MC38, un adenocarcinoma de colon que expresa niveles bajos de PD-L1, en un volumen de 0,1 ml inyectado por vía subcutánea en el flanco. A los ratones se les dosificó bisemanalmente empezando en el día 3 con los siguientes agentes:

• 0,2 ml/ratón de vehículo

• 1,2 mg/ratón de IMPRIME PGG (Biothera, Inc.)

• 100 pg/ratón de anti-PDL-1 clon: 10F.9G2 BioXcell n.° catálogo: BE0101

Se recogieron muestras de sangre 1 hora antes de la dosis 1, 2 horas después de la dosis 3, el final del estudio y 2 horas después de la última dosis (día 20). Los grupos de tratamiento incluían vehículo (control de PBS), IMPRIME PGG en solitario, anticuerpo anti-PD-Ll en solitario y anti-PD-Ll IMPRIME PGG. Los tumores se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento una vez que los tamaños alcanzaron una media de grupo de 150 mm3. Los resultados se muestran en la tabla 10.

Tabla 10

De nuevo, la combinación de anticuerpo anti-PD-Ll p-glucano soluble funcionó de forma sinérgica para potenciar eficazmente la supervivencia sin tumor.

También debe apreciarse que la expresión de PD-L1 en tumores es un biomarcador para la sensibilidad al anticuerpo anti-PD-1. Por lo tanto, como el p-glucano soluble induce la expresión de PD-L1 en tumores, el p-glucano soluble también potenciará la eficacia de anticuerpos anti-PD-1. Esto se confirma por la expresión de PD-1 aumentada inducida por tratamiento con p-glucano soluble descrito anteriormente.

Ejemplo 17

Efecto in vivo en TME de p-glucano soluble y agente antiangiogénicos: A ratones que portaban tumores NSCLC H1299 se les administró bevacizumab (un anticuerpo antiangiogénico) (5 mg/kg dos veces a la semana IP durante cuatro semanas) en solitario o en combinación con IMPRIME PGG (1,2 mg/ratón dos veces a la semana IV durante cuatro semanas) como se describe anteriormente para los otros estudios en ratones. Como se muestra en la fig. 17A, el grupo de tratamiento al que se le administró la combinación de bevacizumab e IMPRIME PGG mostró un aumento en la expresión de PD-L1, la fig. 17B muestra la modulación por disminución de arginasa 1 y la fig. 17C muestra un aumento en la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) en infiltrado inmunitario innato C11b positivo del TME en comparación con la del grupo al que se le administró bevacizumab en solitario. La iNOS aumentada y la arginasa 1 disminuida son marcadores que indican un entorno inmunoestimulante M1.

Además, el día 20, después de la inyección del tumor, se recogieron los bazos y se tiñeron suspensiones monocelulares con anticuerpos de ratón y se analizaron por FACS. Se calculó la GMFI o frecuencia en Flowjo después de seleccionar las células CD11b+F4/80+CD68+ (FIG. 17D-FIG. 17F). La fig. 17D y fig. 17E muestran un aumento en iNOS y una disminución de arginasa-1, respectivamente. También se estimularon los esplenocitos durante la noche con 100 ng/ml de lipopolisacárido (LPS) y se analizaron para la producción de TNF-a. La fig. 17F muestra un aumento en TNF-a. Estos datos indican un desplazamiento en los macrófagos esplénicos a un fenotipo similar a M1 con tratamiento con IMPRIME PGG. Se analizaron arginasa-1, iNOS y CD86 en células CD11b+Gr1+ y los datos se muestran en la fig. 17G-fig. 17I. Como se muestra, la arginasa-1 disminuyó e iNOS y CD86 aumentaron, lo que indica diferenciación de MDSC esplénicas en macrófagos/neutrófilos M1/N1 con tratamiento con IMPRIME PGG. La fig. 17J muestra expresión potenciada del marcador coestimulante CD86 en MDSC granulocítica tumoral (CD11b+Lyg6+), lo que indica además diferenciación de MDSC esplénico.

Para la fig. 17K-fig. 17M, se recogieron los tumores en el día 20 y se digirieron con colagenasa de tipo I durante 1 hora a 37 °C. Se tiñeron suspensiones monocelulares con anticuerpos de ratón y se analizaron por FACS. Se calculó la GMFI o frecuencia en Flowjo después de seleccionar las células CD1b+. Como se muestra, PD-L1 e iNOS aumentaron mientras que arginasa-1 disminuyó, lo que indica el desplazamiento en células mieloides de indicación tumoral a un fenotipo de tipo M1. Estos datos ilustran claramente que el p-glucano soluble aumenta la eficacia de agentes antiangiogénicos y modula el TME in vivo.

Finalmente, se cultivaron suspensiones monocelulares de las células tumorales durante la noche y los sobrenadantes se midieron para TGF-p por ELISA. Los resultados se muestran en la fig. 17N. Los ratones que mostraron más de un 50 % de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) cuando se trataban con una combinación de IMPRIME PGG y bevacizumab, mostraron claramente una reducción en TGF-p.

Como se analiza previamente, hay un subconjunto de sujetos que responden mejor al tratamiento con p-glucano soluble. Los resultados de la fig. 17N muestran que estos sujetos, que responden mejor al tratamiento de combinación, también tendrían una reducción simultánea en la expresión de TGF-p. Actualmente, los fármacos que inhiben TGF-p, tales como fresolimumab, se están estudiando como tratamiento contra el cáncer. Por tanto, el subconjunto de sujetos que responden al p-glucano soluble no requeriría tratamiento adicional con un inhibidor de TGF-p. Además, se han descrito varios métodos y composiciones que transforman sujetos que no responden en sujetos que responden a inmunoterapia de p-glucano soluble en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US2013/031625. Usando estos métodos en combinación con tratamiento con p-glucano soluble y bevacizumab, todos los sujetos tendrían expresión reducida de TGF-p, lo que eliminaría la necesidad de tratamiento adicional con un inhibidor de TGF-p.

Ejemplo 18

El p-glucano soluble en combinación con anticuerpos anti-PD-1 afecta a los tumores y el TME: Inicialmente se realizaron estudios in vitro para estudiar la sinergia entre mAb anti-PD-1 humano, nivolumab (Bristol Myers Squib) (un anticuerpo que no se dirige a tumor, no activador del complemento) e IMPRIME PGG. El primer estudio utilizó una reacción de linfocitos mixtos alogénicos (MLR) usando MoDC diferenciadas a partir de monocitos tratados con IMPRIME PGG. Se trató sangre completa de un donador sano con IMPRIME PGG o vehículo durante 2 horas a 37 °C. Se generaron células dendríticas (DC) cultivando monocitos aislados de PBMC usando selección negativa con un kit de purificación de monocitos (Thermo Fisher Scientific) in vitro durante 7 días con 500 U/ml de interleucina-4 (IL-4) y 250 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Se cocultivaron linfocitos T CD4+ marcados con CFSE (1 x 105) y DC alogénicas (1 x 104) con o sin valoraciones de las dosis de nivolumab o un anticuerpo de control de isotipo IgG⁴ añadido al inicio del ensayo. Después de 5 días, se midió la proliferación de linfocitos T por ensayo de dilución de CFSE y los resultados se muestran en la fig. 18A. Como se indica en la figura, especialmente a dosis mayores de nivolumab, el tratamiento con IMPRIME PGG y nivolumab aumentó significativamente la proliferación de linfocitos T sobre el tratamiento con anticuerpo en solitario.

El segundo estudio in vitro buscó la estimulación de PBMC por el superantígeno enterotoxina B estafilocócica (SEB). Se trató sangre completa con IMPRIME PGG o vehículo durante 2 horas 37 °C. Se generaron DC cultivando monocitos aislados de PBMC usando selección negativa con un kit de purificación de monocitos (Thermo Fisher Scientific) in vitro durante 7 días con 500 U/ml de interleucina-4 (IL-4) y 250 U/ml de GM-CSF (R&D Systems). Las DC se maduraron completamente añadiendo 25 ng/ml de TNFa y 50 ng/ml de LPS en el día 5. Se cultivaron PBMC de un donador diferente con DC a relación de 10:1 durante 3 días con nivolumab o un anticuerpo de control de isotipo IgG⁴ (20 ug/ml) al inicio del ensayo junto con diluciones seriadas de SEB (Toxin Technology). Se midieron los niveles de IL-2 (BD Biosciences) e IFNy (R&D Systems) en los sobrenadantes de cultivo por análisis ELISA y los resultados se muestran en la fig. 18B y la fig. 18C. Como se indica, la combinación de nivolumab e IMPRIME p Gg potencia la función de los linfocitos T incluyendo la producción de IFNy e IL-2.

La IL-2 actúa sobre linfocitos T y se ha aprobado en los Estados Unidos y varios países europeos para el tratamiento de cánceres tales como melanoma y cáncer de células renales. Sin embargo, la administración de IL-2 puede tener efectos secundarios graves. Estos datos muestran que el tratamiento con p-glucano soluble en combinación con anticuerpo anti-PD-1 aumenta la expresión de IL-2 de modo que puede eliminarse el tratamiento adicional con IL-2.

Se realizaron estudios in vivo usando IMPRIME PGG anticuerpo anti-PD-1. IMPRIME PGG en combinación con RMP1-14, un anticuerpo anti-PD-1, se ensayó en ratones C57B1/6 portadores de cáncer de colon CT26. Se administraron por vía subcutánea 3 x 105 células CT26 de ratón. A los ratones se les administró IMPRIME PGG (1,2 mg/ratón dos veces a la semana I.V. durante cuatro semanas) en solitario o anticuerpo anti-PD-1 (200 pg/ratón dos veces a la semana IP durante tres semanas) en solitario, o una combinación de ambos después de que los tumores alcanzaran un tamaño de 40-100 mm3. Los resultados del estudio se resumen en la fig. 19A.

Los resultados muestran que la combinación de IMPRIME PGG y anticuerpo anti-PD-1 suprime sinérgicamente el crecimiento tumoral in vivo. Esto es incluso más evidente en los datos de ratones individuales mostrados en la fig. 19B (IMPRIME PGG anticuerpo anti-PD-1) y la fig. 19C (anticuerpo anti-PD-1 en solitario). Un 70% de los ratones tratados con la politerapia tuvieron tumores que se mantuvieron por debajo de 500 mm3 mientras que solamente un 40 % de los ratones tratados únicamente con anticuerpo anti-PD-1 tuvieron tumores que se mantuvieron por debajo de 500 mm3. De nuevo, como se analiza anteriormente, parece que un 30 % de los ratones no respondieron a la inmunoterapia de p-glucano soluble, que desvió lo resultados globales mostrados en la fig. 19A. Sin embargo, transformar los sujetos para que respondan a inmunoterapia de p-glucano soluble podría provocar que casi todos los sujetos mostraran supresión tumoral aumentada con politerapia.

Por tanto, tomados conjuntamente, los datos muestran que el tratamiento con p-glucano soluble in vivo puede activar las células mieloides tanto dentro del tumor como del bazo para orquestar un desplazamiento profundo en el TME, que promueve el reconocimiento y la supresión tumorales. Cualquiera de las politerapias descritas en el presente documento puede incluir también la adición de un anticuerpo dirigido a tumor, que podría ser más eficaz debido al desplazamiento en el TME.

Las patentes, solicitudes de patente y publicaciones, y material disponible electrónicamente (incluyendo, por ejemplo, presentaciones de secuencias de nucleótidos en, por ejemplo, GenBank y RefSeq, y presentaciones de aminoácidos en, por ejemplo, Swiss-Prot, PIR, PRF, PDB y traducciones de regiones codificantes anotadas en GenBank y RefSeq) citadas en el presente documento se citan para describir y divulgar más completamente la invención y el estado de la materia al que pertenece la invención. En caso de que exista alguna inconsistencia entre la divulgación de la presente solicitud y la una o más divulgaciones de cualquiera de esos documentos, prevalecerá la divulgación de la presente solicitud. La descripción detallada y los ejemplos anteriores se han proporcionado solo por motivos de claridad de comprensión. No deben entenderse limitaciones innecesarias a partir de ello. La invención no se limita a los detalles exactos mostrados y descritos.

Salvo que se indique de otro modo, todos los números que expresan las cantidades de componentes, pesos moleculares y otros que se usan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones se entienden modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, salvo que se indique lo contrario de otro modo, los parámetros numéricos expuestos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades que se busca obtener. Como mínimo, y no en un intento de limitar la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos indicados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales.

A pesar de que los intervalos numéricos y parámetros expuestos en el presente documento sean aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se presentan de la forma más precisa posible. Todos los valores numéricos, sin embargo, contienen de forma inherente un intervalo que es necesariamente el resultado de la desviación típica que se encuentra en sus respectivas mediciones de ensayo.

Todos los encabezados son por conveniencia del lector y no deben usarse para limitar el significado del texto que sigue al encabezado, salvo que así se especifique.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. p(1,6)-[Poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa soluble y un anticuerpo anti-PD-1 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene cáncer, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es un inhibidor del punto de control inmunitario.

2. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-1 están en una sola formulación o en formulaciones separadas.

3. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa procede de levaduras.

4. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la levadura es Saccaromyces cerevisiae.

5. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa estimula el sistema inmunitario del sujeto.

6. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo no activador del complemento o en donde el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo activador del complemento.

7. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo IgG⁴.

8. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab o pembrolizumab.

9. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y el anticuerpo anti-PD-1 se administran por vía intravenosa.

10. La p(1,6)-[poli-(1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa y anticuerpo anti-PD-1 para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende además la administración de bavituximab, ipilimumab o tremelimumab, o en donde el método comprende además la administración de un anticuerpo dirigido a tumor.