ES2876009T3

ES2876009T3 - Polipéptido heterodimerizado

Info

Publication number: ES2876009T3
Application number: ES13868831T
Authority: ES
Inventors: Tomoyuki Igawa; Futa Mimoto; Hitoshi Katada; Hirotake Shiraiwa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2021-11-11
Anticipated expiration: 2033-12-26
Also published as: WO2014104165A1; JPWO2014104165A1; US20150344570A1; JP6719507B2; KR102249779B1; DK2940135T3; DK2940135T5; CN105102618A; JP6433297B2; EP2940135B9; EP2940135B1; EP2940135A1; EP2940135A4; JP2018188445A; HK1217731A1; CN105102618B; US10766960B2; KR20150097786A

Abstract

Una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG, en donde la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que la región Fc de IgG está compuesta por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, y en donde la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que se altera una función de la región Fc de IgG en comparación con la de una molécula de unión a antígeno caracterizada por que la región Fc de IgG está compuesta por un homodímero que comprende solo el primer polipéptido y en comparación con la de una molécula de unión a antígeno caracterizada por que la región Fc de IgG está compuesta por un homodímero que comprende solo el segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido o el segundo polipéptido se introduce con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes apartados (a) a (aj): (a) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (b) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es S; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (c) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (d) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (e) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es S; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (f) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (g) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (h) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (i) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (j) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (k) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es Q; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (l) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es I; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (m) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es M; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (n) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (o) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es A; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (p) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es G; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (q) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es H; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (r) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (s) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (t) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es Q; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (u) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es I; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (v) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es M; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (w) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (x) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es A; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (y) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es G; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (z) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es H; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (aa) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (ab) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (ac) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A; (ad) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (ae) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es I; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (af) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (ag) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (ah) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (ai) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; y (aj) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; y la combinación de mutaciones seleccionadas de (ak) a (aq) se introduce en el otro polipéptido: (ak) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es K; y el aminoácido en la posición 334 es E; (al) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es M; y el aminoácido en la posición 334 es E; (am) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; y el aminoácido en la posición 334 es E; (an) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es F; y el aminoácido en la posición 334 es E; (ao) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es I; y el aminoácido en la posición 334 es E; (ap) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es Y; y el aminoácido en la posición 334 es E; y (aq) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es H; y el aminoácido en la posición 334 es E; en donde la molécula de unión a antígeno es una cualquiera de las indicadas a continuación en los puntos (A) a (D): (A) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (h), (r) a (z) y (ad) a (aj); y la combinación de mutaciones (ak) se introduce en el otro polipéptido; (B) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (f), (g), (j), (aa), (ab) y (ac); y la combinación de mutaciones (an) se introduce en el otro polipéptido; (C) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (c), (e) a (g) e (i) a (q); y la combinación de mutaciones (al) se introduce en el otro polipéptido; o (D) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (c), (e) a (h) y (aa) a (ac); y la combinación de mutaciones (am) se introduce en el otro polipéptido.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido heterodimerizado

Campo técnico

La presente invención proporciona regiones constantes de anticuerpos cuya secuencia de aminoácidos se ha modificado a partir de una región constante de anticuerpos naturales, anticuerpos que comprenden dichas regiones constantes, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y métodos su producción.

Antecedentes de la técnica

Los anticuerpos están captando atención como productos farmacéuticos ya que son muy estables en la sangre y tienen pocos efectos secundarios (documentos no de patente 1 y 2). Casi todos los productos farmacéuticos de anticuerpos actualmente en el mercado son anticuerpos de la subclase IgG1 humana. Hasta ahora, se han realizado muchos estudios sobre la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (denominada en lo sucesivo ADCC) y la citotoxicidad dependiente de complemento (denominada en lo sucesivo CDC) que son funciones efectoras de los anticuerpos de clase IgG; y dentro de la clase IgG humana, se ha notificado que los anticuerpos de la subclase IgG1 tienen la actividad ADCC y la actividad CDC más altas (documento no de patente 3). Además, la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCP), que es la fagocitosis de células diana mediada por anticuerpos de clase IgG, también se muestra como una de las funciones efectoras de los anticuerpos (documentos no de patente 4 y 5).

Para que un anticuerpo IgG presente ADCC, CDC o ADCP, la región Fc del anticuerpo debe unirse a un receptor de anticuerpo que está presente en la superficie de células efectoras tales como las células citotóxicas, linfocitos citolíticos y macrófagos activados (denominados en lo sucesivo FcyR) y diversos componentes del complemento. En los seres humanos, las isoformas FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa y FcYRIIIb se han considerado constituyentes de la familia de proteínas FcyR, y también se han presentado los alotipos respectivos (documento no de patente 6).

La mejora de las funciones efectoras citotóxicas tales como la ADCC, ADCP y CDC está llamando la atención como un medio prometedor para mejorar los efectos antitumorales de los anticuerpos. Se ha informado sobre la importancia de las funciones efectoras de los anticuerpos mediadas por FcyR para sus efectos antitumorales utilizando modelos de ratón (documentos no de patente 7 y 8). Además, se observó una correlación entre los efectos clínicos en seres humanos y el alotipo polimórfico de alta afinidad (V158) y el alotipo polimórfico de baja afinidad (F158) de FcYRIIIa (documento no de patente 9). Estos informes mostraron que anticuerpos que tienen una región Fc que se ha optimizado para la unión específica a FcyR median una función efectora más fuerte y, como resultado, demuestran efectos antitumorales más eficaces.

El equilibrio entre las actividades de unión de un anticuerpo hacia un receptor activador consistente en FcyRIa, FcYRIIa, FcYRIIIa y FcYRIIIb, y un receptor inhibidor consistente en FcYRIIb es un elemento importante cuando se optimiza la función efectora del anticuerpo. El uso de una región Fc que mejora la actividad de unión a receptores activadores y disminuye la actividad de unión a receptores inhibidores puede conferir a los anticuerpos funciones efectoras óptimas (documento no de patente 10). Por el contrario, el uso de una región Fc que tiene una actividad de unión sostenida o disminuida a receptores activadores y una actividad de unión mejorada a receptores inhibidores puede conferir un efecto inmunosupresor a los anticuerpos (documento no de patente 11). Con respecto a la unión entre una región Fc y FcyR, se ha demostrado que, para la unión entre la región Fc y FcyR, son importantes varios restos de aminoácidos de la región bisagra del anticuerpo y el dominio CH2, y la cadena de azúcar añadida a Asn en la posición 297 (numeración EU) que está unida al dominio CH2 (documentos no de patente 12, 13 y 14). Se han realizado investigaciones sobre variantes de la región Fc que tienen diversas propiedades de unión a FcyR principalmente en este sitio de unión, y se han obtenido variantes de la región Fc que tienen mayores actividades de unión para activar FcyR (documentos de patente 1 y 2). Por ejemplo, Lazar et al. han aumentado con éxito la unión de FcYRIIIa (V158) humano aproximadamente 370 veces mediante la sustitución de la Ser en la posición 239, la Ala en la posición 330 y la Ile en la posición 332 (numeración EU) de la IgG 1 humana por Asp, Leu y Glu, respectivamente (documento no de patente 15 y documento de patente 2). La proporción entre la unión de FcYRIIIa y la unión de FcYRIIb (proporción A/I) de esta variante aumenta aproximadamente 9 veces en comparación con la del tipo silvestre. Además, Lazar et al. han mejorado con éxito la unión a FcYRIIb aproximadamente 430 veces (documento no de patente 16). Shinkawa et al. han mejorado con éxito la unión de FcYRIIIa aproximadamente 100 veces al eliminar la fucosa de la cadena de azúcar añadida a la Asn en la posición 297 (numeración EU) (documento no de patente 17).

En el método mencionado anteriormente, se introducen las mismas alteraciones de aminoácidos o las mismas modificaciones de la cadena de azúcar en ambas regiones Fc de la cadena H de un anticuerpo. Al mismo tiempo, se ha notificado que la región Fc del anticuerpo muestra una unión 1:1 con FcyR y reconoce a FcyR de manera asimétrica en la bisagra inferior y la región CH2 (documento no de patente 18). Teniendo en cuenta la interacción asimétrica entre la región Fc y FcyR, se puede considerar optimizar la interacción entre IgG y FcyR de forma más precisa mediante la introducción de una o más alteraciones diferentes en cada una de las cadenas H. Se ha descrito el concepto de anticuerpos heterodimerizados como tecnología para aumentar la actividad de unión a FcyR (documento no de patente 19) y los estudios sobre diversas variantes de IgG1 y heterodímeros han revelado mutantes simples o dobles con selectividad o actividad de unión alterada a FcyR (véase, p. ej., el documento no de patente 20 y el documento de patente 5). Además, se han notificado métodos para optimizar la interacción con FcyR mediante la modificación asimétrica de la región Fc a través de la introducción de diferentes alteraciones en cada una de las regiones Fc de la cadena H del anticuerpo basados en esta idea (documentos de patente 6 y 7). Sin embargo, las regiones Fc optimizadas de manera asimétrica no muestran necesariamente una excelente actividad de unión a FcYRIIIa en comparación con las regiones Fc optimizadas de manera simétrica (documento de patente 6). Dependiendo del tipo de alteraciones introducidas, la optimización asimétrica de la región Fc ha mejorado con éxito la unión a FcYRIIIa en varias decenas de veces en comparación con las de una IgG nativa y ha mejorado la actividad de ADCC. Sin embargo, por otro lado, la actividad de ADCC es aproximadamente la misma o incluso más débil que la de un anticuerpo afucosilado en el que se ha eliminado la fucosa de la cadena de azúcar de tipo N de las dos cadenas H, que se produjo utilizando la tecnología convencional (documento de patente 7).

Documentos de la técnica anterior

[Documentos de patente]

[Documento de patente 1] WO 2000/042072

[Documento de patente 2] WO 2006/019447

[Documento de patente 3] WO 2009/041062

[Documento de patente 4] WO 2006/106905

[Documento de patente 5] WO 2012/058768

[Documento de patente 6] WO 2012/058768

[Documento de patente 7] WO 2012/125850

[Documentos no de patente]

[Documento no de patente 1] Nature Biotechnology, 23, 1073-1078 (2005)

[Documento no de patente 2] Eur. J. Pharm. Biopharm, 59(3), 389-96 (2005)

[Documento no de patente 3] Chemical Immunology, 65, 88 (1997)

[Documento no de patente 4] Cancer Res., 68, 8049-8057 (2008)

[Documento no de patente 5] Blood, 113, 3735-3743 (2009)

[Documento no de patente 6] Immunol. Lett. 82, 57-65 (2002)

[Documento no de patente 7] Pro. Nat. Acad. Sci. 95: 652-656 (1998)

[Documento no de patente 8] Nature Medicine, 6: 443-446 (2000)

[Documento no de patente 9] Blood 99: 754-758 (2002)

[Documento no de patente 10] Science, 310, 1510-1512 (2005)

[Documento no de patente 11 ] Science, 291,484-486 (2001)

[Documento no de patente 12] Chemical Immunology, 65, 88 (1997)

[Documento no de patente 13] Eur. J. Immunol. 23, 1098 (1993)

[Documento no de patente 14] Immunology, 86, 319 (1995)

[Documento no de patente 15] Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006)

[Documento no de patente 16] Mol. Immun. 45, 3926-3933 (2008)

[Documento no de patente 17] J. Biol. Chem, 278, 3466-3473 (2003)

[Documento no de patente 18] J. Biol. Chem., 276: 16469-16477 (2001)

[Documento no de patente 19] Hisafumi Okabe: Tecnologías de ingeniería de anticuerpos innovadoras patentadas en Chugai Parmaceutical"

[Documento no de patente 20] J. Biol. Chem., 276: 6591-6604 (2001)

Compendio de la invención

[Problemas a resolver por la invención]

La presente invención se logró teniendo en cuenta las circunstancias anteriores. Un objetivo de la presente invención es proporcionar moléculas de unión a antígeno con una región Fc compuesta de polipéptidos heterodimerizados que muestran una función mejorada de la región Fc con respecto a las moléculas de unión a antígeno convencionales con una región Fc compuesta de polipéptidos homodimerizados; composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión a antígenos; y métodos para producirlas. Además, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para mejorar la función de una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc en comparación con la de una molécula de unión a antígeno convencional con una región Fc compuesta de polipéptidos homodimerizados.

[Medios para resolver los problemas]

Los presentes inventores realizaron una investigación específica para resolver los problemas mencionados anteriormente. Como resultado, los presentes inventores produjeron polipéptidos heterodimerizados que tienen una región Fc que consiste en dos polipéptidos con diferentes secuencias de aminoácidos (un primer polipéptido y un segundo polipéptido), y produjeron con éxito polipéptidos heterodimerizados que comprenden una región Fc con función mejorada con respecto a los homodímeros convencionales en los que la región Fc está compuesta solo por el primer polipéptido o solo por el segundo polipéptido.

De manera más específica, la presente invención proporciona los siguientes apartados [1] a [12]:

[1] Una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG, en donde la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que la región Fc de IgG está compuesta por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, y en donde la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que se altera una función de la región Fc de IgG en comparación con la de una molécula de unión a antígeno caracterizada por que la región Fc de IgG está compuesta por un homodímero que comprende solo el primer polipéptido y en comparación con la de una molécula de unión a antígeno caracterizada por que la región Fc de IgG está compuesta por un homodímero que comprende solo el segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido o el segundo polipéptido se introduce con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes apartados (a) a (aj):

(a) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(b) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es S; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(c) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(d) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(e) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es S; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(f) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(g) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(h) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(i) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(j) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(k) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es Q; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(l) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es I; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(m) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es M; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(n) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(o) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es A; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(p) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es G; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(q) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es H; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(r) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; (s) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(t) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es Q; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(u) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es I; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(v) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es M; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(w) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(x) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es A; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(y) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es G; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(z) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es H; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(aa) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(ab) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(ac) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(ad) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(ae) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es I; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(af) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(ag) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es E; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(ah) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(ai) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; y

(aj) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; y la combinación de mutaciones seleccionadas de (ak) a (aq) se introduce en el otro polipéptido:

(ak) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es K; y el aminoácido en la posición 334 es E;

(al) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es M; y el aminoácido en la posición 334 es E;

(am) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; y el aminoácido en la posición 334 es E;

(an) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es F; y el aminoácido en la posición 334 es E;

(ao) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es I; y el aminoácido en la posición 334 es E;

(ap) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es Y; y el aminoácido en la posición 334 es E; y (aq) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es H; y el aminoácido en la posición 334 es E;

en donde la molécula de unión a antígeno es una cualquiera de las indicadas a continuación en los puntos (A) a (D):

(A) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (a) a (h), (r) a (z) y (ad) a (aj); y la combinación de mutaciones (ak) se introduce en el otro polipéptido;

(B) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (f), (g), (j), (aa), (ab) y (ac); y la combinación de mutaciones (an) se introduce en el otro polipéptido;

(C) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (c), (e) a (g) e (i) a (q); y la combinación de mutaciones (al) se introduce en el otro polipéptido; o

(D) se introduce el primer polipéptido o el segundo polipéptido con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en (c), (e) a (h) y (aa) a (ac); y la combinación de mutaciones (am) se introduce en el otro polipéptido.

[2] La molécula de unión a antígeno de [1], en donde la alteración de la función de la región Fc es al menos una o más alteraciones seleccionadas del grupo que consiste en la potenciación de la actividad de unión, el debilitamiento de la actividad de unión y la mejora de la selectividad de la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno a uno o más receptores de Fcy.

[3] La molécula de unión a antígeno de [2], en donde el receptor o receptores Fcy es al menos uno o más receptores seleccionados del grupo que consiste en FcYRIa, FcYRIIa R, FcYRIIa H, FcYRIIb, FcYRIIIaF y FcYRINaV,

[4] La molécula de unión a antígeno de [2] o [3], en donde la alteración de la función de la región Fc es la mejora de la selectividad de la actividad de unión a uno o más receptores Fcy.

[5] La molécula de unión a antígeno de [4], en donde la mejora de la selectividad de la actividad de unión a uno o más receptores de Fcy se refiere a la selectividad entre uno o más receptores de Fcy activadores y un receptor de Fcy inhibidor.

[6] La molécula de unión a antígeno de [5], en donde entre los receptores de Fcy mencionados anteriormente, el receptor o receptores de Fcy activadores es al menos uno o más receptores seleccionados del grupo que consiste en FcYRIa, FcYRIIa R, FcYRIIa H, FcYRIIIaF y FcYRIIIaV, y el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb.

[7] La molécula de unión a antígeno de [5] o [6], en donde la actividad de unión al receptor o receptores de Fcy activadores se mejora selectivamente en comparación con la actividad de unión al receptor de Fcy inhibidor.

[8] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de los puntos [1] a [7], en donde se introduce además una alteración de aminoácidos para conferir diferencia en los puntos isoeléctricos del primer polipéptido y el segundo polipéptido y en donde la alteración de aminoácidos para conferir diferencia en los puntos isoeléctricos se caracteriza por la introducción de una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Ala en la posición 231, Glu en la posición 233, Leu en la posición 242, Val en la posición 263, Glu en la posición 272, Gly en la posición 316, Leu en la posición 358, Ser en la posición 364, Ser en la posición 383, Pro en la posición 387 y Val en la posición 397 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del polipéptido del primer polipéptido o del segundo polipéptido; y la introducción de una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Thr en la posición 139, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Tyr en la posición 198, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Lys en la posición 274, Tyr en la posición 278, Lys en la posición 288, Lys en la posición 290, Gly en la posición 316, Lys en la posición 317, Lys en la posición 320, Lys en la posición 324, Thr en la posición 335, Ser en la posición 337, Lys en la posición 338, Lys en la posición 340, Gly en la posición 341, Leu en la posición 358, Lys en la posición 360, Gln en la posición 362, Ser en la posición 383, Asn en la posición 384, Gly en la posición 385, Gln en la posición 386, Asn en la posición 390 y Val en la posición 422 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido.

[9] La molécula de unión a antígeno de uno cualquiera de los puntos [1] a [8], en donde la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o una molécula de fusión de Fc tal como una proteína de fusión de Fc-péptido o una proteína de fusión de Fc-armazón.

[10] Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno de una cualquiera de [1] a [9] y un vehículo médicamente aceptable.

[11] Un método para alterar la función de una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG, que comprende las etapas de heterodimerizar la región Fc introduciendo mutaciones de aminoácidos de las moléculas de unión a antígeno de acuerdo con [1 ] en el primer polipéptido y el segundo polipéptido que constituyen la región Fc, y alterar la función de la región Fc en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero.

[12] Un método para producir una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG según la reivindicación 1, que comprende las etapas de heterodimerizar la región Fc introduciendo las mutaciones de aminoácidos de acuerdo con [1] en el primer polipéptido y el segundo polipéptido que constituyen la región Fc, y alterar la función de la región Fc en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la estructura de un complejo de región Fc y FcRn. FcRn se une a CH2 y CH3 de cada cadena H del anticuerpo, y se une a todo el anticuerpo de forma simétrica.

La Fig. 2 muestra la estructura de un complejo de IgA y FcaR que es un receptor de IgA. FcaR se une a Ca2 y Ca3 de cada cadena H de IgA, y se une a todo el anticuerpo de forma simétrica.

La Fig. 3 muestra la estructura de un complejo de región Fc y Fcy RIII. En relación con la cadena H, CH2 y CH3, los que están en el lado izquierdo de la figura se denominan cadena H^a, CH^a2 y CH^a3 y los que están en el lado derecho se denominan cadena H^b, CH^b2 y CH^b3, respectivamente.

La Fig. 4 muestra interacciones detalladas entre A327 en cada cadena H y Fcy RIII. (A) muestra la interacción entre A327 en CH^a2 y Fcy RIII. (B) muestra la interacción entre A327 en CH^b2HB y Fcy RIII. En Fcy RIII, los colores negro, gris y blanco indican la porción básica, porción neutra y porción ácida, respectivamente.

La Fig. 5 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos en los que se han introducido D356K, H435R y/o K439E. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5) y GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5).

La Fig. 6 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos en los que se ha introducido G237A. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID n O: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5), GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6, 4 y 5) y GpH7-A26/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6 y 5). La Fig. 7 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido G237L. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5), GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7, 4 y 5) y GpH7-A29/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7 y 5).

La Fig. 8 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido L328E. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5), GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8, 4 y 5) y GpH7-A42/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8 y 5).

La Fig. 9 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido L328D. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5), GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9, 4 y 5) y GpH7-A43/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9 y 5).

La Fig. 10 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido L234E. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5), GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 10 y 5) y GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 10 y 5).

La Fig. 11 muestra la comparación de las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido L234D. La actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5) a cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5), GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 11 y 5) y GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 11 y 5).

La Fig. 12 muestra interacciones de P329 en la región Fc con Fcy RIII. En relación con la cadena H, CH2 y CH3, los que están en el lado izquierdo de la figura se denominan cadena H^a, CH^a2 y CH^a3 y los que están en el lado derecho se denominan cadena H^b, CH^b2 y CH^b3, respectivamente. Esta figura muestra que Pro en la posición 329 (numeración EU) en la región Fc interacciona con Fcy RIII principalmente a través de CH^a2 que es un dominio CH2. En relación con la cadena H, CH2 y CH3, los que están en el lado izquierdo de la figura se denominan cadena H^a, CH^a2 y CH^a3 y los que están en el lado derecho se denominan cadena H^b, CH^b2 y CH^b3, respectivamente. La Fig. 13 muestra la comparación de los efectos sobre las actividades de unión a Fcy R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido P329R, P329K, P329D o P329E. La actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) para cada Fcy R se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 12 y 5), GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 13 y 5), GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 14 y 5), GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 15 y 5), GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 12 y 5), GpH7-B13/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 13 y 5), GpH7-B14/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 14 y 5) y GpH7-B15/GpL16-k0 (SEC ID NO: 15 y 5).

La figura 14 muestra la comparación de las actividades de unión a cada FcyR de un anticuerpo heterodimerizado con G237A introducido en una de las cadenas H, cuando P329R se introduce en la misma cadena H o en la otra cadena H. La actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) para cada FcyR se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 12 y 5), GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16, 4 y 5), GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6, 4 y 5), GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6, 12 y 5) y GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 17, 4 y 5).

La figura 15 muestra la comparación de las actividades de unión a cada FcyR de un anticuerpo heterodimerizado con L234D introducido en una de las cadenas H, cuando P329R se introduce en la misma cadena H o en la otra cadena H. La actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) para cada FcyR se definió como 100. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 12 y 5), GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16, 4 y 5), GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 11 y 5), GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16, 11 y 5) y GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 18 y 5).

La Fig. 16 muestra la comparación de las actividades de unión a FcYRIa de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se han introducido alteraciones idénticas. El eje horizontal muestra los valores Ho/Con y el eje vertical muestra los valores He/Co. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIa del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para una de las cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ iD NO: 3, 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar, y multiplicar el resultado por 100. Ho/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIa del anticuerpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para las dos cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIa del anticuerpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 17 muestra la comparación de las actividades de unión a FcYRIIa R de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se han introducido alteraciones idénticas. El eje horizontal muestra los valores Ho/Con y el eje vertical muestra los valores He/Co. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIa R del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para una de las cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIa R del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar. Ho/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIa R del anticuerpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para las dos cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIa R del anticuerpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 18 muestra la comparación de las actividades de unión a FcYRIIa H de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se han introducido alteraciones idénticas. El eje horizontal muestra los valores Ho/Con y el eje vertical muestra los valores He/Co. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIa H del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para una de las cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIa H del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar. Ho/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIa H del anticuerpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para las dos cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIa H del anticuerpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 19 muestra la comparación de las actividades de unión a FcYRIIb de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se han introducido alteraciones idénticas. El eje horizontal muestra los valores Ho/Con y el eje vertical muestra los valores He/Co. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para una de las cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar. Ho/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIb del anticuerpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para las dos cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIb del anticuerpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 20 muestra la comparación de las actividades de unión a FcyRI 11 a de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados en los que se han introducido alteraciones idénticas. El eje horizontal muestra los valores Ho/Con y el eje vertical muestra los valores He/Co. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para una de las cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar. Ho/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo homodimerizado variante GpH7-B3/GpL16-k0, que utiliza una variante de GpH7-B3 mutada para las dos cadenas H, por la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5), que utiliza el GpH7-B3 sin mutar, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 21 muestra un diagrama conceptual que compara la unión a FcyR de cada uno de los anticuerpos homodimerizados y los anticuerpos heterodimerizados que usan cadenas H en las que se han introducido alteraciones. Cuando un punto representado está contenido dentro de Región i, significa que la alteración introducida en la región Fc tiene el efecto de producir He/Con > 100, Ho/Con < 100, He/Con > Ho/Con. Cuando un punto representado está contenido dentro de la Región ii, significa que la alteración introducida en la región Fc tiene el efecto de producir He/Con > 100, Ho/Con > 100, He/Con > Ho/Con. Cuando un punto representado está contenido dentro de la Región iii, significa que la alteración introducida en la región Fc tiene el efecto de producir He/Con > 100, Ho/Con > 100, He/Con < Ho/Con.

La Fig. 22 muestra el número de combinaciones que se producen cuando se introducen tres tipos de alteraciones en cualquiera de las cadenas H de un anticuerpo heterodimerizado. Cada uno de los círculos rellenos (•), triángulos rellenos (A) y cuadrados rellenos (■) se refiere a una alteración diferente.

La Fig. 23 muestra la interacción entre FcyRIII y cada uno de los restos S239, A330 y 1332 en la región Fc del anticuerpo. Citado en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006.

La Fig. 24 muestra la comparación de las actividades de unión a FcyR activador y FcyR inhibidor. Es un diagrama conceptual que compara las actividades de unión de cada variante a FcyR activador y FcyR inhibidor. El eje vertical muestra la actividad de cada variante hacia el FcyR activador (receptor activador) y el eje horizontal muestra la actividad de unión de cada variante al FcyR inhibidor (receptor inhibidor). Las actividades de unión del anticuerpo natural al FcyR activador y FcyR inhibidor se establecieron cada una en 100. Cuando una variante tiene una actividad de unión mejorada al FcyR activador con respecto al anticuerpo natural y una actividad de unión disminuida al FcyR inhibidor, el anticuerpo se representa en la Región a (área de sombra). Cuando una variante tiene una actividad de unión mejorada al FcyR inhibidor con respecto al anticuerpo natural y una actividad de unión disminuida al FcyR activador, el anticuerpo se representa en la Región c (área sombreada).

La Fig. 25 muestra la comparación de las actividades de unión a FcyR activador y FcyR inhibidor. Es un diagrama conceptual que compara las actividades de unión de cada variante a FcyR activador y FcyR inhibidor. El eje vertical muestra la actividad de unión de un anticuerpo natural al FcyR activador (receptor activador) y el eje horizontal muestra la actividad de unión al FcyR inhibidor (receptor inhibidor). Las actividades de unión del anticuerpo natural al FcyR activador y FcyR inhibidor se establecieron cada una en 100. Cuando el valor obtenido al dividir la actividad de unión de una variante al FcyR activador por la actividad de unión al FcyR inhibidor es 1,2 o mayor, el anticuerpo se representa en la Región b (área de sombra). Cuando el valor obtenido al dividir la actividad de unión de una variante al FcyR activador por la actividad de unión al FcyR inhibidor es 0,8 o menor, el anticuerpo se representa en la Región d (área sombreada). La Fig. 26 muestra la comparación de las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado a FcYRIa y FcYRIIb. Es un diagrama que compara las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado alterado a FcYRIa, que es un FcyR activador, y a FcYRIIb, que es un FcyR inhibidor. El eje horizontal muestra los valores de Ho/Con para el FcyR inhibidor y el eje vertical muestra los valores de He/Con para el FcyR activador. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 que tiene una región Fc mutada, por la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) en el que no se han introducido alteraciones, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 27 muestra la comparación de las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado a FcYRIIa R y FcYRIIb. Es un diagrama que compara las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado alterado a FcYRIIa R que es un FcyR activador y a FcYRIIb que es un FcyR inhibidor. El eje horizontal muestra los valores de He/Con para el FcyR inhibidor y el eje vertical muestra los valores de He/Con para el FcyR activador. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que tiene una región Fc mutada, por la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) en el que no se han introducido alteraciones, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 28 muestra la comparación de las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado a FcYRIIa H y FcYRIIb. Es un diagrama que compara las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado alterado a FcYRIIa H que es un FcyR activador y a FcYRIIb que es un FcyR inhibidor. El eje horizontal muestra los valores de He/Con para el FcyR inhibidor y el eje vertical muestra los valores de He/Con para el FcyR activador. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que tiene una región Fc mutada, por la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) en el que no se han introducido alteraciones, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 29 muestra la comparación de las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado a FcYRIIIa y FcYRIIb. Es un diagrama que compara las actividades de unión de un anticuerpo heterodimerizado alterado a FcYRIIIa, que es un FcyR activador, y a FcYRIIb, que es un FcyR inhibidor. El eje horizontal muestra los valores de He/Con para el FcyR inhibidor y el eje vertical muestra los valores de He/Con para el FcyR activador. He/Con es un valor obtenido al dividir la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado variante GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 que tiene una región Fc mutada, por la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) en el que no se han introducido alteraciones, y multiplicar el resultado por 100.

La Fig. 30 muestra la comparación de los efectos de las combinaciones de L234Y, G236W y S298A, con S239D, A330L e I332E sobre la estabilidad térmica de los anticuerpos. Es un gráfico que compara los cambios en el contenido de monómeros después de realizar un estudio de estabilidad en condiciones aceleradas de calor (40 °C durante dos semanas o cuatro semanas) para anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados con L234Y, G236W y S298A, anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados con S239D, A330L e I332E, y anticuerpos heterodimerizados en los que se introducen L234Y, G236W y S298A en una de las cadenas H y se introducen S239D, A330L e I332E en la otra cadena H. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-Gld/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31, 4 y 5), GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 41 y 5), GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31, 32 y 5), GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 40, 41 y 5) y GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31,41 y 5).

La Fig. 31 muestra un resultado de examinar las actividades de ADCC de anticuerpos heterodimerizados. La línea celular utilizada para la evaluación fue SK-pca13a y la relación E/T fue 50. Se utilizaron PBMC humanas como células efectoras. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5), GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 41 y 5), GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31,4 y 5), GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 40, 41 y 5), GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31, 32 y 5) y GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 31, 41 y 5). El eje vertical muestra la actividad citotóxica del anticuerpo y el eje horizontal muestra la concentración de anticuerpo (pg/ml).

La Fig. 32 muestra los restos de aminoácidos que constituyen las regiones Fc de IgG1 (SEQ ID NO: 76), IgG2 (SEQ ID NO: 77), IgG3 (SEQ ID NO: 78) e IgG4 (SEQ ID NO: 79), y su relación con la numeración EU de Kabat (también denominada en el presente documento ÍNDICE EU).

La Fig. 33 muestra un resultado de examinar las actividades de ADCC de los anticuerpos heterodimerizados con Fc descritos en el Ejemplo 12. La línea celular utilizada para la evaluación fue SK-pca13a y la relación E/T fue 50. Se utilizaron PBMC humanas como células efectoras. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5), GpH7-Kn033/GpH7-HI033/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 51, 56 y 5), GpH7-Kn032/GpH7-HI032/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 53, 58 y 5), GpH7-Kn045/GpH7-HI048/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 54, 59 y 5), GpH7-Kn056/GpH7-HI055/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 55, 60 y 5) y GpH7-Kn037/GpH7-HI036/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 52, 57 y 5). El eje vertical muestra la actividad citotóxica del anticuerpo y el eje horizontal muestra la concentración de anticuerpo (pg/ml).

La Fig. 34 muestra un resultado de examinar la actividad DE ADCC del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. La línea celular utilizada para la evaluación fue SKE18 y la relación E/T fue 50. Se utilizaron PBMC humanas como células efectoras. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84, 85 y 106), H240-Kn032 /H240-H1032/L73-k0 (SEQ ID NO: 86, 87 y 106), H240-Kn061 /H240-H1071/L73-k0 (SEQ ID NO: 81,82 y 106) y H240-afucosyl_Gld (la secuencia de aminoácidos de H240-afucosyl_Gld es igual que la de H240-G1d (SEQ ID NO: 83), pero sin la fucosa)/L73-k0 (SEQ ID NO: 83 y 106). El eje vertical muestra la actividad citotóxica del anticuerpo y el eje horizontal muestra la concentración de anticuerpo (pg/ml).

La Fig. 35 muestra la actividad de unión a FcgRI de un mutante puntual que usa el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 como molde. La KD relativa en el eje vertical muestra el valor obtenido al dividir la KD (mol/l) de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 para FcgRI por la KD de cada variante. Los números en el eje horizontal muestran los rangos cuando las KD relativas se disponen en orden ascendente.

La Fig. 36 muestra la actividad de unión a FcgRIIa R de un mutante puntual que usa el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 como molde. La KD relativa en el eje vertical muestra el valor obtenido al dividir la KD (mol/l) de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 para FcgRIIa R por la KD de cada variante. Los números en el eje horizontal muestran los rangos cuando las KD relativas se disponen en orden ascendente.

La Fig. 37 muestra la actividad de unión a FcgRIIa H de un mutante puntual que usa el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 como molde. La KD relativa en el eje vertical muestra el valor obtenido al dividir la KD (mol/l) de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 para FcgRIIa H por la KD de cada variante. Los números en el eje horizontal muestran los rangos cuando las KD relativas se disponen en orden ascendente.

La Fig. 38 muestra la actividad de unión a FcgRIIb de un mutante puntual que usa el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 como molde. La KD relativa en el eje vertical muestra el valor obtenido al dividir la KD (mol/l) de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 para FcgRIIb por la KD de cada variante. Los números en el eje horizontal muestran los rangos cuando las KD relativas se disponen en orden ascendente.

La Fig. 39 muestra la actividad de unión a FcgRIIIa F de un mutante puntual que usa el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 como molde. La KD relativa en el eje vertical muestra el valor obtenido al dividir la KD (mol/l) de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 para FcgRIIIa F por la KD de cada variante. Los números en el eje horizontal muestran los rangos cuando las KD relativas se disponen en orden ascendente.

La Fig.40 muestra la actividad de unión a FcgRIIIa V de un mutante puntual que usa el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 como molde. La KD relativa en el eje vertical muestra el valor obtenido al dividir la KD (mol/l) de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 para FcgRIIIa V por la KD de cada variante. Los números en el eje horizontal muestran los rangos cuando las KD relativas se disponen en orden ascendente.

La Fig. 41 muestra un resultado de examinar la actividad de ADCC de un anticuerpo heterodimerizado, H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0. La línea celular utilizada para la evaluación fue MIAPaCa-2 y la relación E/T fue 25. Se utilizaron PBMC humanas como células efectoras. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84, 85 y 106), H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 (SEQ ID NO: 81, 82 y 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID NO: 83 y 106) y H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 (SEQ ID NO: 90, 91 y 106). El eje vertical muestra la actividad citotóxica del anticuerpo y el eje horizontal muestra la concentración de anticuerpo (pg/ml).

La Fig. 42 muestra un resultado de examinar la actividad de ADCC de un anticuerpo mejorado derivado del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0. La línea celular utilizada para la evaluación fue DLD-1 y la relación E/T fue 50. Se utilizaron PBMC humanas como células efectoras. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84, 85 y 106), H240-afucosyl_Gld/L73-k0 (SEQ ID NO: 83 y 106), H240-Kn113/H240-H1076/L73-k0 (SEQ ID NO: 92, 91 y 106), H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0 (SEQ ID NO: 93, 91 y 106) y H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0 (SEQ ID NO: 94, 91 y 106). El eje vertical muestra la actividad citotóxica del anticuerpo y el eje horizontal muestra la concentración de anticuerpo (pg/ml).

La Fig. 43 muestra un resultado de examinar la actividad de ADCC de un anticuerpo heterodimerizado, H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0, etc. La línea celular utilizada para la evaluación fue DLD-1 y la relación E/T fue 50. Se utilizaron PBMC humanas como células efectoras. Las muestras utilizadas para la evaluación y sus secuencias fueron H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 (SEQ ID NO: 84, 85 y 106), H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID NO: 83 y 106), H240-Kn067/H240-H1068/L73-k0 (SEQ ID NO: 95, 96 y 106), H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0 (SEQ ID NO: 99, 96 y 106) y H240-Kn126/H240-H1068/L73-k0 (SEQ ID NO: 100, 96 y 106). El eje vertical muestra la actividad citotóxica del anticuerpo y el eje horizontal muestra la concentración de anticuerpo (pg/ml).

La Fig. 44 muestra una estructura cristalina de tipo Fc (WT)/FcgR2a R (ID de PDB = 3RY6, J. Imunol. 2011, 187, 3208-321). La figura ilustra las cadenas laterales de Gln 127, Leu132 y Phe160, que son tres restos que difieren entre el tipo FcgRIIa R y FcgRIIb en la región cercana a la interfaz de interacción entre el tipo FcgRIIa R y Fc en esta estructura. Los restos de aminoácidos correspondientes en FcgRIIb se muestran usando códigos de una letra entre paréntesis.

La Fig. 45 muestra un complejo de Fc (Kn120H1068)/dominio extracelular de FcgRIIb cuya estructura se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina. Con respecto al dominio CH2 y al dominio CH3, los que se encuentran a la izquierda se denominan dominio A y los que se encuentran a la derecha se denominan dominio B, respectivamente.

La Fig. 46 muestra una estructura alrededor de la Lys127 (Gln en el tipo FcgRIIa R) de la región extracelular de FcgRIIb en el complejo de Fc (Kn120/H1068)/región extracelular de FcgRIIb cuya estructura se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina. Como no se observó la densidad electrónica de la cadena lateral para Tyr296 de Fc (Kn120/H1068), no se construyeron modelos para la cadena lateral distintos del átomo de Ca. La Fig. 47 muestra una estructura alrededor de la Ser132 (Leu en el tipo FcgRIIa R) de la región extracelular en el complejo de dominio extracelular de Fc (Kn120/H1068)/FcgRIIb cuya estructura se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina. Como no se observó la densidad electrónica de la cadena lateral para D327 de Fc (Kn120/H1068), no se construyeron modelos para la cadena lateral distintos del átomo de Ca.

La Fig. 48 muestra una estructura alrededor de la Tyr160 (Phe en el tipo FcgRIIa R) de la región extracelular de FcgRIIb en el complejo de Fc (Kn120/H1068)/región extracelular de FcgRIIb cuya estructura se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina.

La Fig. 49 muestra un complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb cuya estructura se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina. Con respecto al dominio CH2 y el dominio CH3, los que se encuentran a la izquierda se denominan dominio A y los que se encuentran a la derecha se denominan dominio B, respectivamente.

La Fig. 50 muestra una comparación de los dominios A de CH2 entre la estructura del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb determinada por análisis de rayos X de la estructura cristalina y la estructura del complejo de Fc (WT)/región extracelular de FcgRIIa (código PDB: 3RY6) determinado por análisis de rayos X de estructura cristalina. En la figura, la estructura del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb se representa por una línea gruesa, y la estructura del complejo de Fc (WT)/región extracelular de FcgRIIa se representa por una línea delgada. El dominio A de CH2 solo se ilustra en la estructura del complejo de Fc (WT)/región extracelular de FcgRIIa.

La Fig. 51 muestra una estructura alrededor de la Ser239 del dominio B de CH2 de Fc (BP208) en el complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb, que se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina.

La Fig. 52 muestra una estructura alrededor de la Ser239 del dominio A de CH2 de Fc (BP208) en el complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb, que se ha determinado por análisis de rayos X de la estructura cristalina.

La Fig. 53 muestra los resultados de la cromatografía analítica de intercambio catiónico para un anticuerpo alterado representativo, H240-AK072/H240-BH076/L73-k0. A: H240-AK072/H240-BH076/L73-k0; B: H240-FA021/H240-FB084/L73-k0.

La Fig. 54 muestra los resultados de la cromatografía de intercambio catiónico para fraccionamiento (A) y la recromatografía analítica de intercambio catiónico para las fracciones recogidas (B) de H240-FA021/H240-FB084/L73-k0 que es un anticuerpo alterado representativo, H240-AK072/H240-BH076/L73-k0.

[Modo para llevar a cabo la invención]

Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la presente invención descrita en la presente memoria.

La presente descripción proporciona polipéptidos caracterizados por que están compuestos por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden una región Fc introducida con mutaciones, en donde la función de la región Fc está alterada en comparación con un polipéptido que comprende una región Fc sin la introducción de mutaciones. Se proporcionan además métodos para producir los polipéptidos y métodos para modificar la función de polipéptidos que contienen la región Fc.

En la presente descripción, el "polipéptido caracterizado por que está compuesto por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido" puede ser un complejo polipeptídico compuesto por un primer polipéptido y un segundo polipéptido, así como otros polipéptidos múltiples.

En la presente memoria, "primer polipéptido" y "segundo polipéptido" significan polipéptidos que constituyen una región Fc de anticuerpo. Los términos "primer polipéptido" y "segundo polipéptido" significan que sus secuencias son diferentes entre sí y, preferiblemente, al menos son diferentes las secuencias del dominio CH2. Los polipéptidos pueden ser, por ejemplo, polipéptidos que constituyen la región Fc de una IgG natural, o polipéptidos producidos alterando los polipéptidos que constituyen la región Fc de una IgG natural (nativa).

"IgG natural" se refiere a polipéptidos que pertenecen a una clase de anticuerpos codificados prácticamente por genes de inmunoglobulina gamma y comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica a las de las IgG que se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, una IgG humana natural se refiere a una IgG 1 humana, IgG2 humana natural, IgG3 humana natural, IgG4 humana natural o similar. Las IgG naturales también incluyen mutantes producidos espontáneamente a partir de ellas.

Los "polipéptidos" de la presente invención generalmente se refieren a péptidos o proteínas de aproximadamente diez aminoácidos o más de longitud. Además, generalmente son polipéptidos derivados de organismos, pero no están limitados de forma particular y, por ejemplo, pueden ser polipéptidos que comprenden una secuencia diseñada artificialmente. Además, pueden ser cualquiera de los polipéptidos naturales, polipéptidos sintéticos, polipéptidos recombinantes o similares. Las moléculas de proteína de la presente invención se refieren a moléculas que comprenden el polipéptido.

Los ejemplos preferidos de los polipéptidos de la presente invención incluyen anticuerpos. Los ejemplos más preferidos incluyen IgG naturales, particularmente IgG humanas naturales. "IgG naturales" se refiere a polipéptidos que pertenecen a una clase de anticuerpos codificados prácticamente por genes de inmunoglobulina gamma y que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica a las de las IgG que se encuentran en la naturaleza. Por ejemplo, una IgG humana natural significa una IgG1 humana natural, IgG2 humana natural, IgG3 humana natural, IgG4 humana natural o similar. Las IgG naturales también incluyen mutantes producidos espontáneamente a partir de ellas.

Aunque en la región constante de la cadena ligera del anticuerpo está presente una región constante de tipo IgK (Kappa, cadena k), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6 e IgL7 (Lambda, cadena A), puede ser cualquier región constante de cadena ligera. Para la región constante de IgK (Kappa) humana y la región constante de IgL7 (Lambda) humana, se describe una pluralidad de secuencias de alotipo debidas al polimorfismo genético en "Sequences of proteins of immunological interest", Publicación NIH N.° 91-3242, y cualquiera de ellas puede usarse de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. Además, en la presente descripción, una región constante de cadena ligera puede ser una región constante de cadena ligera que se ha alterado con sustituciones, adiciones, deleciones, inserciones y/o modificaciones de aminoácidos, o similares. Para la región Fc del anticuerpo, por ejemplo, existen regiones Fc de los tipos IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. Por ejemplo, se puede usar una región Fc de anticuerpo IgG humano como región Fc de anticuerpo de la presente invención, y se prefieren las regiones Fc de anticuerpo IgG1 humano. Las regiones Fc que se pueden usar como una región Fc de la presente invención son, por ejemplo, las derivadas de regiones constantes de IgG naturales o, específicamente, una región constante derivada de IgG1 humana natural (SEQ ID NO: 76), una región constante derivada de IgG2 humana natural (SEQ ID NO: 77), una región constante derivada de IgG3 humana natural (SEQ ID NO: 78) y una región constante derivada de IgG4 humana natural (SEQ ID NO: 79). La Fig. 32 muestra las secuencias de la región constante de la IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4 naturales. Las regiones constantes de IgG naturales también incluyen mutantes producidos espontáneamente a partir de ellas. Para las regiones constantes de los anticuerpos IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana, se describe una pluralidad de secuencias de alotipo debidas al polimorfismo genético en "Sequences of proteins of immunological interest", Publicación NIH N.° 91 -3242, y cualquiera de ellas puede usarse en la presente invención. En particular, para la secuencia de IgG 1 humana, la secuencia de aminoácidos en las posiciones 356 a 358 (numeración EU) puede ser DEL o EEM.

Además, Se ha notificado que la fuerza de interacción entre una región Fc de anticuerpo y Fcy R depende de la concentración de iones Zn2+ (Immunology Letters 143 (2012) 60-69). El anticuerpo muestra una interacción más fuerte entre la región Fc y FcgR cuando la concentración de iones Zn2+ de la región Fc es mayor. La quelación de Zn2+ por His310 e His435 presentes en CH3 de la región Fc del anticuerpo abre cada dominio CH2 de la región Fc en una posición distal. Esto facilita la interacción entre el dominio CH2 y FcgR, y se mejora la interacción entre la región Fc y FcgR. Una región Fc ilustrativa de la presente descripción incluye una región Fc en la que la His en la posición 310, la His en la posición 435, la His en la posición 433 y/o la Asn en la posición 434 (numeración EU) está quelada con Zn2+.

En la presente invención, "región Fc" se refiere a una región que consiste en una región de bisagra o una parte de la misma, un dominio CH2 y un dominio CH3 en una molécula de anticuerpo. De acuerdo con la numeración EU (también denominada en la presente memoria ÍNDICE EU), una región Fc de clase IgG se refiere a, por ejemplo, una región desde la cisteína en la posición 226 hasta el extremo C, o desde la prolina en la posición 230 hasta el extremo C, pero no se limita a esto.

La región Fc puede obtenerse preferiblemente volviendo a eluir fracciones adsorbidas en una columna de proteína A o columna de proteína G después de digerir parcialmente anticuerpos monoclonales IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o similares utilizando una proteasa tal como la pepsina. La proteasa no está particularmente limitada siempre que pueda digerir un anticuerpo de longitud completa para producir Fab y F(ab')2 de una manera restrictiva estableciendo apropiadamente condiciones de reacción enzimática tales como el pH; y los ejemplos incluyen pepsina y papaína.

En la presente memoria, "heterodimerización" significa constituir un único polipéptido a partir de dos polipéptidos con diferentes secuencias de aminoácidos, y "heterodímero" significa un polipéptido compuesto por dos polipéptidos con diferentes secuencias de aminoácidos. Además, "homodimerización" significa constituir un único polipéptido a partir de dos polipéptidos que tienen las mismas secuencias de aminoácidos, y "homodímero" significa un polipéptido compuesto por dos polipéptidos que tienen las mismas secuencias de aminoácidos; o un polipéptido compuesto por polipéptidos que tienen las mismas secuencias de aminoácidos excluyendo las alteraciones realizadas con el propósito de una heterodimerización eficaz o las alteraciones realizadas con el propósito de una purificación eficaz de heterodímeros; o un polipéptido compuesto de polipéptidos que comprenden los mismos aminoácidos excluyendo las alteraciones que no se han realizado con el propósito de mejorar la función de Fc. En la presente descripción, "heterodímero" u "homodímero" significan preferiblemente "heterodimerización" u "homodimerización" para la región Fc, o preferiblemente significa "heterodimerización" u "homodimerización" para CH2 en la región Fc. Además, "polipéptido original" significa un polipéptido antes de la introducción de alteraciones tales como mutaciones de aminoácidos.

La mutación de aminoácidos de la presente invención puede usarse sola o en combinación con múltiples mutaciones de aminoácidos.

Cuando se utilizan múltiples mutaciones de aminoácidos en combinación, el número de mutaciones combinadas no está particularmente limitado y puede establecerse apropiadamente dentro de un intervalo que puede conseguir los objetivos de la invención, y los ejemplos incluyen de dos o más a 30 o menos y, preferiblemente, de dos o más a 15 o menos.

Cuando se combinan múltiples mutaciones de aminoácidos, las mutaciones de aminoácidos pueden introducirse en solo uno de los dos polipéptidos que constituyen la región Fc, o pueden distribuirse de manera apropiada en ambos polipéptidos.

Además, en la presente invención, para lograr un mayor efecto de modificación de la función en la región Fc, es preferible introducir al menos una mutación de aminoácido que mejore la función de la región Fc cuando la mutación se introduce solo en uno de los polipéptidos, en comparación con cuando no se introduce ninguna mutación y cuando la mutación se introduce en ambas regiones Fc de los dos polipéptidos.

El sitio que se va a alterar no está particularmente limitado siempre que esté en una región Fc, y se puede establecer apropiadamente dentro de un intervalo que pueda lograr los objetivos de la presente descripción; y los ejemplos incluyen la región bisagra, la región CH2 y la región CH3.

Más preferiblemente, el sitio que se va a alterar es un dominio CH2. El dominio CH2 se refiere a las posiciones 231 a 340 (numeración EU) y el dominio CH3 se refiere a las posiciones 341 a 447 (numeración EU). Por ejemplo, cuando se introducen mutaciones en la secuencia de aminoácidos de una región constante derivada de IgG1 humana, pueden modificarse restos de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas entre 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411,412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431,432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441,442, 443, 444, 445, 446 y 447 (numeración EU).

De manera más específica, cuando se introducen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 humana, pueden modificarse restos de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas entre 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431,432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441,442, 443, 444, 445, 446 y 447 (numeración EU).

De manera más específica, cuando se introducen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 humana, pueden modificarse restos de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas entre 226, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281,282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301,302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311,312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321,322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 337, 330, 331,332, 333, 334, 334, 339 y 340 (numeración EU).

De manera más específica, cuando se introducen alteraciones en la secuencia de aminoácidos de una región constante de IgG1 humana, pueden modificarse restos de aminoácidos en una o más posiciones seleccionadas entre 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 295, 296, 298, 300, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331,332, 333, 334, 335, 336 y 337 (numeración EU).

En la presente invención, alteración de aminoácidos significa cualquier sustitución, deleción, adición, inserción y modificación, o una combinación de las mismas. En la presente invención, la alteración de aminoácidos puede reformularse como mutación de aminoácidos y ambas expresiones se utilizan como sinónimos.

Sustitución

Cuando se sustituyen restos de aminoácidos, La sustitución por un resto de aminoácido diferente se realiza con el objetivo de alterar aspectos tales como los aspectos (a)-(c) que se describen a continuación:

(a) estructura de la cadena principal del polipéptido en la región de estructura laminar o estructura helicoidal; (b) carga eléctrica o hidrofobicidad en el sitio diana; o

(c) tamaño de la cadena lateral.

Los restos de aminoácidos se clasifican en los siguientes grupos según sus propiedades generales de cadena lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu e ile;

(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr, asn y gln;

(3) ácidos: asp y glu;

(4) básicos: his, lys y arg;

(5) restos que afectan a la orientación de la cadena: gly y pro; y

(6) aromáticos: trp, tyr y phe.

La sustitución entre restos de aminoácidos dentro de cada uno de estos grupos de aminoácidos se denomina sustitución conservativa, y la sustitución de restos de aminoácidos entre diferentes grupos se denomina sustitución no conservativa.

Las sustituciones en la presente invención pueden ser sustituciones conservativas o sustituciones no conservativas, o una combinación de sustituciones conservativas y sustituciones no conservativas.

Además de las mutaciones de aminoácidos introducidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria, los polipéptidos de la presente descripción pueden comprender además alteraciones adicionales. Por ejemplo, se pueden seleccionar alteraciones adicionales de cualquiera de las sustituciones, deleciones y modificaciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas.

Por ejemplo, los polipéptidos de la presente descripción se pueden alterar arbitrariamente dentro de un intervalo que no cambie prácticamente la función pretendida del polipéptido. Cuando el polipéptido proporcionado es un anticuerpo, se pueden alterar su cadena pesada y su cadena ligera. Por ejemplo, tales mutaciones se pueden realizar mediante la sustitución conservativa de restos de aminoácidos. Además, aunque una alteración cambie la función pretendida de un polipéptido de la presente descripción, también se puede llevar a cabo la alteración siempre que el cambio en la función esté en un intervalo dentro de los objetivos de la presente invención.

La alteración de la secuencia de aminoácidos de la presente descripción incluye la modificación postraduccional. Una modificación postraduccional específica puede ser la adición o deleción de una cadena de azúcar. Por ejemplo, en la región constante de IgG 1, el resto de aminoácido en la posición 297 (numeración UE) puede estar modificado en la cadena de azúcar. La estructura de la cadena de azúcar para la modificación no está limitada. Generalmente, los anticuerpos expresados en células eucariotas comprenden glicosilación en la región constante. Por lo tanto, los anticuerpos expresados en células tales como las que se muestran a continuación normalmente se modifican por algún tipo de cadena de azúcar:

- células de mamíferos productoras de anticuerpos

- células eucariotas transformadas con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un anticuerpo

Las células eucariotas que se muestran en la presente memoria incluyen células de levadura y células animales. Por ejemplo, las células CHO y las células HEK293H son células animales representativas utilizadas en la transformación con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica un anticuerpo. Por otro lado, también se incluyen en el anticuerpo de la presente invención los que carecen de glicosilación en este sitio. Pueden obtenerse anticuerpos cuya región constante no está glicosilada expresando un gen que codifica un anticuerpo en células procariotas tales como Escherichia coli.

En la presente descripción, otras alteraciones incluyen específicamente, por ejemplo, adición de ácido siálico a la cadena de azúcar de una región Fc (MAb. sep-oct de 2010; 2(5): 519-27).

Cuando el polipéptido de la presente descripción es un anticuerpo, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos que mejoran la actividad de unión a FcRn (J. Immunol. 1 de enero de 2006; 176(1): 346-56; J Biol Chem. 18 de agosto de 2006; 281(33): 23514-24; Int. Immunol. diciembre de 2006; 18(12): 1759-69; Nat Biotechnol. febrero de 2010; 28(2): 157-9; documentos WO 2006/019447; WO 2006/053301; y WO/2009/086320), y se pueden introducir sustituciones de aminoácidos para mejorar la heterogeneidad o estabilidad del anticuerpo (documento WO/2009/041613) en una porción de la región constante del anticuerpo.

Para producir un polipéptido heterodimerizado de la presente descripción, es necesario que se asocien polipéptidos que tienen aminoácidos que difieren entre sí, o que un polipéptido heterodimerizado de interés se separe de otros polipéptidos homodimerizados.

Para la asociación de polipéptidos que tienen diferentes aminoácidos entre sí y que comprenden una región Fc, se puede aplicar una técnica para suprimir la asociación involuntaria entre cadenas H mediante la introducción de repulsión electrostática en la interfaz de la segunda región constante de la cadena H del anticuerpo (CH2) o la tercera región constante de la cadena H (CH3) (documento WO 2006/106905).

En la tecnología de supresión de la asociación no intencionada entre cadenas H mediante la introducción de repulsión electrostática en la interfaz de CH2 o CH3, los ejemplos de restos de aminoácidos en contacto en la interfaz de otras regiones constantes de la cadena H incluyen el resto en la posición 356 (numeración EU), el resto en la posición 439 (numeración EU), la región frente al resto en la posición 357 (numeración EU), el resto en la posición 370 (numeración EU), el resto en la posición 399 (numeración EU) y el resto en la posición 409 (numeración EU) en el dominio CH3.

De manera más específica, por ejemplo, en un anticuerpo que contiene dos tipos de dominios CH3 de la cadena H, se puede producir el anticuerpo en el que de uno a tres pares de restos de aminoácidos seleccionados de los restos de aminoácidos que se muestran a continuación en (1) a (3) en el primer dominio CH3 de la cadena H tienen el mismo tipo de carga:

(1) restos de aminoácidos en las posiciones 356 y 439 (numeración EU) que son restos de aminoácidos contenidos en el dominio CH3 de la cadena H;

(2) restos de aminoácidos en las posiciones 357 y 370 (numeración EU) que son restos de aminoácidos contenidos en el dominio CH3 de la cadena H; y

(3) restos de aminoácidos en las posiciones 399 y 409 (numeración EU) que son restos de aminoácidos contenidos en el dominio CH3 de la cadena H.

Además, se puede producir un anticuerpo en el que de uno a tres pares de restos de aminoácidos correspondientes a los pares de restos de aminoácidos indicados anteriormente en (1) a (3) que tienen el mismo tipo de carga en el primer dominio CH3 de la cadena H tienen cargas opuestas a las restos de aminoácidos correspondientes en el primer dominio CH3 de la cadena H mencionado anteriormente, en donde los pares de restos de aminoácidos se seleccionan de los pares de restos de aminoácidos indicados anteriormente en (1) a (3) en el segundo dominio CH3 de la cadena H que difiere del primer dominio CH3 de la cadena H.

Los restos de aminoácidos respectivos de (1) a (3) mencionados anteriormente se colocan cerca uno del otro cuando se asocian. Los expertos en la técnica pueden encontrar sitios que correspondan a los restos de aminoácidos mencionados anteriormente de (1) a (3) mediante el modelado por homología y similares utilizando software disponible en el mercado para el dominio CH3 de la cadena H deseada o la región constante de la cadena H, y se pueden alterar restos de aminoácidos de estos sitios cuando sea apropiado.

En los anticuerpos mencionados anteriormente, por ejemplo, los "restos de aminoácidos cargados" se seleccionan preferiblemente entre restos de aminoácidos incluidos en cualquiera de los grupos (X) o (Y) siguientes:

(X) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D); y

(Y) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

En los anticuerpos mencionados anteriormente, la expresión "que tienen el mismo tipo de carga" significa que, por ejemplo, los dos o más restos de aminoácidos son restos de aminoácidos incluidos en cualquiera de los grupos (X) e (Y) mencionados anteriormente. La expresión "que tienen la carga opuesta" significa que, por ejemplo, cuando al menos uno de los dos o más restos de aminoácidos es un resto de aminoácido incluido en cualquiera de los grupos (X) e (Y) mencionados anteriormente, los restos de aminoácidos restantes son restos de aminoácidos incluidos en el otro grupo.

Preferiblemente, en el anticuerpo mencionado anteriormente, el primer dominio CH3 de la cadena H y el segundo dominio CH3 de la cadena H pueden estar reticulados por enlaces disulfuro.

En la presente invención, los restos de aminoácidos que se van a alterar no se limitan a los restos de aminoácidos de la región constante del anticuerpo o la región variable del anticuerpo descrita anteriormente. Los expertos en la técnica pueden encontrar restos de aminoácidos que forman la interfaz en mutantes polipeptídicos o heteromultímeros mediante modelado por homología y similares utilizando software disponible comercialmente, y pueden alterar los restos de aminoácidos en esos sitios para regular la asociación.

También pueden usarse otras tecnologías conocidas para la asociación de polipéptidos de la presente descripción que tienen diferentes aminoácidos y que comprenden una región Fc. Los polipéptidos que tienen diferentes aminoácidos y que comprenden una región Fc pueden asociarse eficazmente entre sí sustituyendo una cadena lateral de aminoácidos presente en una de las regiones variables de la cadena H del anticuerpo por una cadena lateral más grande (botón) y sustituyendo una cadena lateral de aminoácidos presente en la región variable opuesta de la otra cadena H por una cadena lateral más pequeña (ojal), para permitir la colocación del botón dentro del ojal (documento WO 1996/027011; y Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant AM et al. Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).

Además, también pueden usarse otras tecnologías conocidas para la asociación de polipéptidos que tienen diferentes aminoácidos y que comprenden una región Fc. La asociación de polipéptidos que tienen diferentes secuencias se puede inducir eficazmente mediante la asociación complementaria de CH3, mediante el uso de un dominio CH3 modificado por ingeniería genética producido cambiando parte del CH3 de una de las cadenas H de un anticuerpo por una secuencia derivada de IgA correspondiente a esa porción, e introduciendo una secuencia derivada de IgA correspondiente en la porción complementaria del CH3 en la otra cadena H (Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). También pueden usarse esta tecnología conocida para inducir eficazmente la asociación de polipéptidos que tienen diferentes aminoácidos y que comprenden una región Fc.

Además, también se pueden usar tecnologías para la producción de anticuerpos heterodimerizados usando la asociación de CH1 y CL de anticuerpos, y la asociación de VH y VL, que se describen en el documento WO 2011/028952.

Además, incluso en los casos en los que no se pueden formar de manera eficaz polipéptidos heterodimerizados, se pueden obtener polipéptidos heterodimerizados separándolos y purificándolos de polipéptidos homodimerizados. Cuando se produce un polipéptido heterodimerizado que consiste en un primer polipéptido y un segundo polipéptido que tienen secuencias diferentes entre sí, los polipéptidos homodimerizados que consisten en solo dos primeros polipéptidos y el polipéptido homodimerizado que consiste en solo dos segundos polipéptidos se mezclan como impurezas. Se pueden utilizar tecnologías conocidas como método para eliminar eficazmente estos dos tipos de polipéptidos homodimerizados. Se ha informado de un método que puede purificar dos tipos de homodímeros y el anticuerpo heterodimerizado de interés mediante cromatografía de intercambio iónico, creando una diferencia en los puntos isoeléctricos mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos en las regiones variables de los dos tipos de cadenas H (documento WO 2007114325). Hasta la fecha, como método para purificar anticuerpos heterodimerizados, se ha informado de un método que usa Proteína A para purificar un anticuerpo heterodimerizado que comprende una cadena H de IgG2a de ratón que se une a la Proteína A y una cadena H de IgG2b de rata que no se une a la Proteína A (documentos WO 98050431 y WO 95033844).

Además, un anticuerpo heterodimerizado solo se puede purificar de manera eficaz mediante el uso de cadenas H en las que los restos de aminoácidos en el sitio de unión de IgG-Proteína A, en posiciones 435 y 436 (numeración EU), se sustituyen por aminoácidos que producen diferentes afinidades por la Proteína A, tales como Tyr o His, para cambiar la interacción de cada una de las cadenas H con la Proteína A, y usando una columna de Proteína A.

Se pueden usar en combinación una pluralidad de estas sustituciones y tecnologías, por ejemplo, dos o más de ellas. Además, estas alteraciones se pueden realizar por separado en el primer polipéptido y el segundo polipéptido cuando sea necesario. Los polipéptidos de la presente descripción también pueden ser los producidos basándose en los productos de las alteraciones mencionadas anteriormente.

La secuencia de aminoácidos se puede alterar mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen el método de mutagénesis dirigida (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, y Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152: 271-275; Zoller, MJ y Smith, M. (1983) Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos de fragmentos de ADN clonados en vectores M13. Methods Enzymol. 100: 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M y Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer W y Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNAMethods. Enzymol. 154, 350-367; y Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82: 488-492), el método de mutación por PCR y el método de mutación por casete, pero no se limitan a los mismos.

En la presente invención, la expresión "función de la región Fc" se refiere a, por ejemplo, la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc (mejora de la actividad de unión o reducción de la actividad de unión), selectividad de una región Fc por la isoforma del receptor de Fcy (mejora de la selectividad de la actividad de unión), estabilidad fisicoquímica de una región Fc, actividad de ADCC y actividad de ADCP. En este caso, la selectividad de la isoforma del receptor de Fcy de una región Fc significa la unión selectiva a isoformas específicas del receptor de Fcy. La estabilidad fisicoquímica de una región Fc significa, por ejemplo, la estabilidad térmica de una región Fc, estabilidad frente a proteasas, estabilidad frente al tratamiento químico, estabilidad frente a ciclos de congelación-descongelación, estabilidad durante el almacenamiento, estabilidad en condiciones ácidas, fotoestabilidad, estabilidad frente a tensiones asociadas a la agitación o concentración, o mantenimiento de la solubilidad en una amplia gama de condiciones de solución. Además, una función de la región Fc puede referirse a una función que combina dos o más funciones de la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc, selectividad por isoformas del receptor de Fcy de una región Fc y estabilidad fisicoquímica de una región Fc; y esto significa, por ejemplo, una función que combina la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc y la selectividad por una isoforma del receptor de Fcy de una región Fc, una función que combina la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de una región Fc, una función que combina la selectividad por la isoforma del receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de la región Fc, y una función que combina la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc, la selectividad por isoformas del receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de una región Fc.

En la presente invención, "alteración de la función de la región Fc" significa, por ejemplo, una potenciación, reducción o similar de la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc cuando la función de la región Fc se refiere a la actividad de unión al receptor de Fcy de la región Fc. Una mejora de la selectividad significa, por ejemplo, la potenciación de la actividad de unión a un receptor de Fcy y, al mismo tiempo, el mantenimiento o reducción de las actividades de unión a otros receptores Fcy. Como alternativa, una mejora de la selectividad significa, por ejemplo, la reducción de la actividad de unión a ciertos receptores de Fcy mientras se mantienen o se potencian las actividades de unión a otros receptores de Fcy. Además, por ejemplo, cuando la función de la región Fc se refiere a la selectividad de un subtipo de receptor de Fcy de una región Fc, "alteración de la función de la región Fc" significa una mejora o disminución de la selectividad por el subtipo de receptor de Fcy de la región Fc. Como alternativa, por ejemplo, cuando la función de la región Fc se refiere a la estabilidad fisicoquímica de una región Fc, "alteración de la función de la región Fc" significa una mejora o disminución de la estabilidad fisicoquímica de la región Fc, supresión de una disminución de la estabilidad, o similares; y, más específicamente, significa, por ejemplo, una mejora o disminución del valor de Tm del dominio CH2, la supresión de una disminución en el valor de Tm, o similares.

Por ejemplo, la mejora de las funciones combinadas de la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc, la selectividad por una isoforma del receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de una región Fc no necesariamente tiene que ser una mejora en cada una de las actividades de unión al receptor de Fcy de una región Fc, la selectividad por una isoforma del receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de una región Fc en comparación con un control, y la mejora es aceptable siempre que se mejore la función de la región Fc en su conjunto. Por el contrario, por ejemplo, la disminución de las funciones combinadas de la actividad de unión al receptor de Fcy de una región Fc, la selectividad por una isoforma del receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de una región Fc no necesariamente tiene que ser la disminución de cada una de las actividades de unión al receptor de Fcy de una región Fc, la selectividad por una isoforma del receptor de Fcy de una región Fc y la estabilidad fisicoquímica de una región Fc en comparación con un control, y la disminución es aceptable siempre que disminuya la función de la región Fc en su conjunto.

En la presente invención, "Receptores de Fcy" (denominados en la presente memoria receptores de Fcy, FcyR o FcgR) se refiere a receptores que pueden unirse a la región Fc de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 y, en sentido práctico, significa cualquier miembro de la familia de proteínas codificadas por los genes del receptor de Fcy. En los seres humanos, esta familia incluye FcyRI (CD64), incluyendo las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), incluyendo las isoformas FcYRIIa (incluidos los alotipos H131 (tipo H) y R131 (tipo R)), FcYRIIb (incluyendo FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16) incluyendo las isoformas FcYRIIIa (incluidos los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (incluidos los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2), y cualquier FcyR humano, isoforma o alotipo de FcyR aún por descubrir, pero no se limita a esto. Los FcyR incluyen FcyR derivados de ser humano, ratón, rata, conejo y mono, pero no se limita a ellos, y pueden proceder de cualquier organismo. Los FcyR de ratón incluyen FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2 o FcyRIV), y cualquier FcyR de ratón, o isoformas o alotipos de FcyR aún por descubrir, pero no se limitan a los mismos. Los ejemplos favorables de tales receptores de Fcy incluyen FcyRI humano (CD64), FcYRIIa (CD32), FcYRIIb (CD32), FcYRIIIa (CD16) y/o FcYRIIIb (CD16).

En el caso de los FcyR, hay receptores activadores que portan el motivo activador de inmunorreceptores basado en tirosina (ITAM) y un receptor inhibidor que porta el motivo inhibidor de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM). Los FcyR se clasifican en los FcyR activadores: FcyRI, FcYRIIa R, FcyRII H, FcYRIIIa y FcYRIIIb y el FcyR inhibidor: FcYRIIb.

La secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcyRI se establecen en NM_000566.3 y NP_000557.1, respectivamente;

la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIa se establecen en BC020823.1 y AAH20823.1, respectivamente;

la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIb se establecen en BC146678.1 y AAI46679.1, respectivamente;

la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIIa se establecen en BC033678.1 y AAH33678.1, respectivamente; y

la secuencia polinucleotídica y la secuencia de aminoácidos de FcYRIIIb se establecen en BC128562.1 y AAI28563.1, respectivamente (el número de registro RefSeq).

En FcYRIIa, hay dos alotipos, uno donde el aminoácido en la posición 131 de FcYRIIa es histidina (tipo H) y el otro donde este aminoácido está sustituido con arginina (tipo R) (J. Exp. Med, 172: 19-25, 1990). En FcYRIIb, hay dos alotipos, uno donde el aminoácido en la posición 232 de FcYRIIb es isoleucina (tipo I) y el otro donde este aminoácido está sustituido con treonina (tipo T) (Arthritis. Rheum. 46: 1242-1254 (2002)). En FcYRIIIa, hay dos alotipos, uno donde el aminoácido en la posición 158 de FcYRIIIa es valina (tipo V) y el otro donde este aminoácido está sustituido con fenilalanina (tipo F) (J. Clin. Invest. 100(5): 1059-1070 (1997)). Además, en FcYRIIIb, hay dos alotipos, el tipo NA1 y el tipo NA2 (J. Clin. Invest. 85: 1287-1295 (1990)).

Una de las sustancias (el ligando) en la observación de una interacción se inmoviliza en una película fina de oro en un chip sensor y al hacer brillar la luz desde el reverso del chip sensor para que tenga lugar una reflexión total en la interfaz entre la película fina de oro y el vidrio, se forma una porción de intensidad de reflexión reducida en parte de la luz reflejada (señal SPR). Cuando se hace fluir la otra de las sustancias (el analito) en observación de una interacción sobre la superficie del chip sensor y el ligando se une al analito, la masa de la molécula de ligando inmovilizada aumenta y cambia el índice de refracción del disolvente en la superficie del chip sensor. La posición de la señal SPR cambia como resultado de este cambio en el índice de refracción (por otro lado, la posición de la señal regresa cuando esta unión se disocia). El sistema Biacore indica la cantidad de desplazamiento mencionado anteriormente o, más específicamente, la variable de tiempo de masa, mediante la representación del cambio de masa en la superficie del chip sensor en la ordenada como datos de medición (sensorgrama). La cantidad de analito unido al ligando capturado en la superficie del chip sensor se determina a partir del sensorgrama (cantidad de cambio en la respuesta en el sensorgrama antes y después de la interacción con el analito). Sin embargo, dado que la cantidad de unión también depende de la cantidad de ligando, es necesario realizar la comparación en condiciones en las que se considera que la cantidad de ligando es prácticamente la misma. Los parámetros cinéticos tales como las constantes de velocidad de asociación (ka) y las constantes de velocidad de disociación (kd) se determinan a partir de la curva del sensorgrama, y las afinidades (KD) se determinan a partir de la relación de estas constantes. En el método BIACORE, se usa preferiblemente un método para medir la inhibición. Un ejemplo del método para medir la inhibición se describe en Proc. Natl. Acad. Sci USA (2006) 103 (11), 4005-4010.

Se puede determinar si la actividad de unión hacia cada tipo de receptor de Fcy no se ve afectada, aumenta o disminuye en un polipéptido o en una región Fc, por ejemplo, mediante el uso de Biacore (GE Healthcare), que es un analizador de interacción que utiliza los fenómenos de resonancia de plasmón de superficie (SPR), como se muestra en los ejemplos. Biacore incluye cualquier modelo como Biacore T100, T200, X100, A100, 4000, 3000, 2000, 1000 y C. Para el chip sensor, puede usarse cualquier chip sensor para Biacore tal como CM7, CM5, CM4, CM3, C1, SA, NTA, L1, HPA y Au. Para el tampón de proceso, además de HBE-EP+, puede usarse un tampón producido mediante el uso de HEPES, ácido fosfórico, ACES, Tris, ácido cítrico y similares para ajustar el pH a un pH casi neutro tal como 7,4. Las mediciones se pueden realizar en el intervalo de 4 °C a 37 °C. Una proteína para capturar anticuerpos tales como la proteína A, Proteína G o Proteína L, que captura un anticuerpo, anticuerpo anti-IgG humana, Fab anti-IgG humana, anticuerpo anti-cadena L humana, anticuerpo anti-Fc humana, proteína antigénica o péptido antigénico se inmoviliza en un chip sensor mediante métodos de acoplamiento tales como el acoplamiento de amina, acoplamiento de disulfuro o acoplamiento de aldehído. Como analito se aplican diversos tipos de receptores de Fcy tales como el receptor de Fcy de tipo I, IIa R, de tipo IIa H, IIb, de tipo IIb, IIIa F, de tipo V y IIIb y se miden las interacciones para obtener sensorgramas. En este punto, las mediciones se pueden realizar ajustando la concentración del receptor de Fcy a un nivel en el intervalo de varios pM a varios pM de acuerdo con la fuerza de interacción tal como la KD de la muestra que se va a medir. La constante de disociación (KD) se obtiene basándose en la medición y, observando si el valor de KD aumenta o disminuye, se puede determinar si la actividad de unión de una región Fc o un polipéptido de la presente invención a varios receptores Fcy aumenta o disminuye. Cuando la captura se lleva a cabo mediante la proteína de captura de anticuerpos inmovilizada en el chip sensor, el nivel de cambio en los valores del sensorgrama antes y después de aplicar diversos receptores de Fcy como analitos para los anticuerpos en el chip sensor se usa como indicador; y según el grado de incremento del valor, se puede determinar si la actividad de unión del polipéptido o región Fc de la presente invención a varios receptores de Fcy aumenta o disminuye. Como alternativa, también es posible inmovilizar varios receptores de Fcy, en lugar de anticuerpos, en los chip sensores y hacer que interaccionen con una muestra de anticuerpo a evaluar. Puede determinarse si la actividad de unión de la región Fc o el polipéptido de la presente invención a los diversos receptores de FcY aumenta o disminuye a partir de la disminución o aumento de los valores de KD calculados a partir de los sensorgramas de interacción, o del grado de aumento en los sensorgramas, o del grado de aumento en los sensorgramas antes y después de permitir que reaccione la muestra de anticuerpo.

Específicamente, la actividad de unión de una región Fc hacia un receptor de FcY puede medirse mediante el cribado del Ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado (ALPHA), el método BIACORE, que utiliza el fenómeno de resonancia de plasmón de superficie (SPR), o similares, además de ELISA o clasificación de células activadas por fluorescencia (Fa CS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005-4010).

El cribado ALPHA se realiza mediante la tecnología ALPHA que utiliza dos perlas, una donadora y otra aceptora, y se basa en los siguientes principios. Solo se detectan señales luminiscentes cuando las moléculas unidas a las perlas donadoras interaccionan físicamente con moléculas unidas a las perlas aceptoras, y los dos tipos de perlas están muy próximos entre sí. El fotosensibilizador excitado por láser en las perlas donadoras convierte el oxígeno ambiental en oxígeno singlete en estado excitado. El oxígeno singlete se dispersa alrededor de las perlas donadoras y, cuando llega a las perlas aceptoras adyacentes, se induce una reacción quimioluminiscente en las perlas y finalmente se emite luz. Cuando las moléculas unidas a las perlas donadoras no interaccionan con las moléculas unidas a las perlas aceptoras, no se produce la reacción quimioluminiscente porque el oxígeno singlete producido por las perlas donadoras no llega a las perlas aceptoras.

Por ejemplo, un polipéptido de prueba biotinilado se une a la estreptavidina en las perlas donadoras, y el receptor de Fcy con etiqueta de glutatión S transferasa (GST) se une a las perlas aceptoras. En ausencia de un polipéptido competidor, el polipéptido de prueba interacciona con el receptor de Fcy y produce señales de 520-620 nm. Un polipéptido no etiquetado compite con el polipéptido de prueba por la interacción con el receptor de Fcy. Las actividades de unión relativas se pueden determinar cuantificando la disminución de la fluorescencia observada como resultado de la competición. La biotinilación de polipéptidos usando sulfo-NHS-biotina y similares es bien conocida. El método para expresar el receptor de Fcy y GST en una célula portadora de un gen de fusión producido al fusionar un polinucleótido que codifica el receptor de Fcy en el mismo marco de lectura que un polinucleótido que codifica GST en un vector expresable, y la realización de la purificación utilizando una columna de glutatión se adopta apropiadamente como método para etiquetar un receptor de Fcy con GST. Las señales obtenidas se analizan preferiblemente, por ejemplo, ajustándolas a un modelo de competencia de un sitio que utiliza un análisis de regresión no lineal utilizando un software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).

El etiquetado no se limita al uso de GST y puede usarse cualquier etiqueta tal como la etiqueta de histidina, MBP, CBP, etiqueta Flag, etiqueta HA, etiqueta V5 y etiqueta c-myc. Además, la unión de un polipéptido de prueba a las perlas donadoras no se limita a la unión mediante la reacción de biotina-estreptavidina. En particular, cuando un polipéptido de prueba es un anticuerpo o péptido portador de Fc tal como un polipéptido de fusión Fc, se puede considerar un método de unión a un polipéptido de prueba a través de una proteína que reconoce Fc, tal como la Proteína A o la Proteína G, en las perlas donadoras.

La reducción de la unión a FcyR o de la actividad de unión a FcyR se refiere a la unión a FcyR con una actividad de unión sustancialmente más débil que la del polipéptido precursor cuando los ensayos se realizan usando prácticamente la misma cantidad de polipéptidos a comparar.

Los polipéptidos heterodimerizados con una unión a FcyR o actividad de unión a FcyR atenuada, disminuida o reducida se refiere a los que se unen a FcyR con una actividad de unión sustancialmente más débil que la de los polipéptidos homodimerizados cuando los ensayos se realizan usando prácticamente la misma cantidad de polipéptidos a comparar.

Por ejemplo, en los valores de KD medidos por los métodos de medición mencionados anteriormente, la relación del valor de KD (valor de KD del polipéptido precursor/valor de KD del polipéptido mutado) es preferiblemente de 0,99 o menos, 0,95 o menos, 0,9 o menos, 0,8 o menos, 0,7 o menos, 0,5 o menos, 0,3 o menos y 0,1 o menos y, más preferiblemente, 0,08 o menos, 0,05 o menos, 0,02 o menos, 0,01 o menos y 0,001 o menos. En la presente memoria, la relación del valor de KD también se denomina relación de KD.

Los valores de KD medidos por los métodos de medición mencionados anteriormente aumentan preferiblemente en 1 pM o más y, más preferiblemente, aumentan en 10 pM, 100 pM, 1 nM o más, 2 nM o más, 3 nM o más, 5 nM o más, 10 nM o más, 20 nM o más, 50 nM o más, 100 nM o más o 1 pM o más. Los valores de KD medidos por los métodos de medición mencionados anteriormente son preferiblemente de 1 pM o más y, preferiblemente, de 10 pM o más, 100 pM o más, 1 nM o más, 10 nM o más, 100 nM o más, 500 nM o más, 1 pM o más, 3 pM o más o 5 pM o más.

La potenciación, aumento o mejora de la unión a FcyR o de la actividad de unión a FcyR se refiere a la unión a FcyR con una actividad de unión sustancialmente más fuerte que la del polipéptido precursor cuando los ensayos se realizan usando prácticamente la misma cantidad de polipéptidos a comparar.

Los polipéptidos heterodimerizados con una unión a FcyR o actividad de unión a FcyR potenciada, aumentada o mejorada se refiere a los que se unen a FcyR con una actividad de unión sustancialmente más fuerte que la de los polipéptidos homodimerizados cuando los ensayos se realizan usando prácticamente la misma cantidad de polipéptidos a comparar.

Por ejemplo, en los valores de KD medidos por los métodos de medición mencionados anteriormente, la relación del valor de KD (valor de KD del polipéptido precursor/valor de KD del polipéptido mutado) es preferiblemente de 1,1 o más, 1,2 o más, 1,3 o más, 1,5 o más, 1,8 o más, 2 o más o 3 o más y, más preferiblemente, 5 o más, 10 o más, 100 o más, 250 o más o 1000 o más. En la presente memoria, la relación del valor de KD también se denomina relación KD.

Los valores de KD medidos por los métodos de medición mencionados anteriormente disminuyen preferiblemente en 1 pM o más y, más preferiblemente, disminuyen en 10 pM, 100 pM, 1 nM o más, 2 nM o más, 3 nM o más, 5 nM o más, 10 nM o más, 20 nM o más, 50 nM o más, 100 nM o más o 1 pM o más.

Los valores de KD medidos por los métodos de medición mencionados anteriormente son preferiblemente de 5 pM o menos y, más preferiblemente, 3 pM o menos, 1 pM o menos, 0,5 pM o menos, 0,1 pM o menos, 0,01 pM o menos, 1 nM o menos, 0,1 nM o menos, 0,001 nM o menos o 1 pM o menos.

Cuando la alteración de la función de la región Fc del polipéptido es un aumento de la actividad de unión a un receptor de Fcy, pueden introducirse mutaciones de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc mencionada anteriormente. El tipo y variedad de la mutación de aminoácidos a introducir no están particularmente limitados.

Se ha notificado que la fuerza de la interacción entre una región Fc de anticuerpo y FcyR depende de la concentración de iones Zn2+ (Immunology Letters 143 (2012) 60-69). El anticuerpo muestra una interacción más fuerte entre la región Fc y FcgR cuando la concentración de iones Zn2+ de la región Fc es mayor. La quelación de Zn2+ por His310 e His435 presentes en CH3 de la región Fc del anticuerpo abre cada dominio CH2 de la región Fc en una posición distal. Esto facilita la interacción entre el dominio CH2 y FcgR, y se mejora la interacción entre la región Fc y FcgR. Además, se describe un anticuerpo, que incluye una región Fc en la que His en la posición 310, la His en la posición 435, la His en la posición 433 y/o la Asn en la posición 434 (numeración EU) está quelada con Zn2+.

Cuando el receptor de Fcy es FcYRIa, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región i de las Tablas 2-1 y 2-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando el receptor de Fcy es FcYRIa, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región ii de las Tablas 2-1, 2-2 y 2-3 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

Cuando el receptor de Fcy es FcYRIIa R, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región i de las Tablas 3-1 y 3-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIa R, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región ii de las Tablas 3-1 y 3-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

Cuando el receptor de Fcy es FcYRIIa H, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región i de la Tabla 4 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIa H, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región ii de la Tabla 4 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

Cuando el receptor de Fcy es FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región i de la Tabla 5 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región ii de la Tabla 5 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

Cuando el receptor de Fcy es FcYRIIIa, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región i de la Tabla 6 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIIa, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región ii de la Tabla 6 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIIa, más específicamente, al menos una o más (por ejemplo, dos o tres) mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y; la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y o Q; la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W; la sustitución del aminoácido S en la posición 239 (numeración UE) por M; la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D; la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración UE) por E; la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A; la sustitución del aminoácido K en la posición 326 (numeración UE) por D; la sustitución del aminoácido A en la posición 327 (numeración UE) por D; la sustitución del aminoácido L en la posición 328 (numeración UE) por W; la sustitución del aminoácido A en la posición 330 (numeración UE) por M o K; y la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración EU) por E o L pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Incluso más específicamente, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIIa, al menos una o más (por ejemplo, dos o tres) mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la sustitución del aminoácido S en la posición 239 (numeración EU) por D; la sustitución del aminoácido A en la posición 330 (numeración UE) por L; y la sustitución del aminoácido I en la posición 332 (numeración EU) por E pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos que constituyen la región Fc, el primer polipéptido o el segundo polipéptido, y al menos una o más (por ejemplo, dos o tres) mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y; la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W; y la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración EU) por A puede introducirse en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido.

Incluso más específicamente, cuando el receptor de Fcy es FcYRIIIa, se puede introducir una mutación en al menos uno o más (por ejemplo, dos o tres) aminoácidos seleccionados entre Leu en la posición 234, Leu en la posición 235, Gly en la posición 236, Ser en la posición 239, la His en la posición 268, Asp en la posición 270, Ser en la posición 298, Ala en la posición 327, Leu en la posición 328 y Lys en la posición 334 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos que constituyen la región Fc, el primer polipéptido o el segundo polipéptido; y se puede introducir una mutación en al menos uno o más (por ejemplo, dos o tres) aminoácidos seleccionados entre Asp en la posición 270, Lys en la posición 326, Ala en la posición 330 y Lys en la posición 334 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido.

El aminoácido que a alterar se puede seleccionar de forma apropiada y, preferiblemente, al menos una o más (por ejemplo, dos o tres) mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y o Q;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido S en la posición 239 (numeración UE) por M;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración UE) por E;

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A;

la sustitución del aminoácido A en la posición 327 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido L en la posición 328 (numeración UE) por W; y

la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración UE) por L pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos que constituyen la región Fc, el primer polipéptido o el segundo polipéptido; y al menos una o más (por ejemplo, dos o tres) mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración UE) por E;

la sustitución del aminoácido K en la posición 326 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido A en la posición 330 (numeración UE) por M o K; y

la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración EU) por E pueden introducirse en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido.

Más preferiblemente, cualquier conjunto de mutaciones de (i) a (vi) puede introducirse en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos que constituyen la región Fc, el primer polipéptido o el segundo polipéptido; y cualquier conjunto de mutaciones de (vii) a (ix) puede introducirse en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido:

(i) la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D; y

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A;

(ii) la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración UE) por E; y

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A;

(iii) la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Q;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido S en la posición 239 (numeración UE) por M;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración UE) por E; y

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A;

(iv) la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A; y

la sustitución del aminoácido A en la posición 327 (numeración UE) por D;

(v) la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido S en la posición 239 (numeración UE) por M;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A; y

la sustitución del aminoácido A en la posición 327 (numeración UE) por D;

(vi) la sustitución del aminoácido L en la posición 234 (numeración EU) por Y;

la sustitución del aminoácido L en la posición 235 (numeración UE) por Y;

la sustitución del aminoácido G en la posición 236 (numeración UE) por W;

la sustitución del aminoácido S en la posición 239 (numeración UE) por M;

la sustitución del aminoácido H en la posición 268 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido S en la posición 298 (numeración UE) por A;

la sustitución del aminoácido A en la posición 327 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido L en la posición 328 (numeración UE) por W; y

la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración UE) por L;

(vii) la sustitución del aminoácido K en la posición 326 (numeración EU) por D;

la sustitución del aminoácido A en la posición 330 (numeración UE) por M; y

la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración UE) por E;

(viii) la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración EU) por E;

la sustitución del aminoácido K en la posición 326 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido A en la posición 330 (numeración UE) por M; y

la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración UE) por E;

(ix) la sustitución del aminoácido D en la posición 270 (numeración EU) por E;

la sustitución del aminoácido K en la posición 326 (numeración UE) por D;

la sustitución del aminoácido A en la posición 330 (numeración UE) por K; y

la sustitución del aminoácido K en la posición 334 (numeración EU) por E.

Los heterodímeros que son buenos para mejorar la unión a los receptores de Fcy activadores y para inducir funciones efectoras son polipéptidos caracterizados por estar compuestos por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido o el segundo polipéptido pueden comprender una región Fc introducida con las mutaciones de (i) o (ii):

(i) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G o H; el aminoácido en la posición 235 es Y o Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M o I; el aminoácido en la posición 268 es D; y el aminoácido en la posición 298 es A; o

(ii) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es A, K, M, F, I, Y o H; y el aminoácido en la posición 334 es E.

De manera más específica, en el primer polipéptido o en el segundo polipéptido, las mutaciones de (iii) o (iv) pueden introducirse en la región Fc, y en el otro polipéptido, las mutaciones de (v) pueden introducirse en la región Fc:

(iii) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G o H; el aminoácido en la posición 235 es Y o Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M o I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D; o

(iv) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es L, S, F, E, V, D, Q, I, M, T, A, G o H; el aminoácido en la posición 235 es Y o Q; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M o I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 270 es E; y el aminoácido en la posición 298 es A;

(v) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es A, K, M, F, I, Y o H; y el aminoácido en la posición 334 es E.

Específicamente, para mejorar la actividad de unión hacia el receptor IIIa de Fcy, en el primer polipéptido o en el segundo polipéptido, el aminoácido en la posición 234 de acuerdo con la numeración EU en (iii) mencionado anteriormente es preferiblemente E, D, T o L. Además, para mejorar la actividad de unión hacia el receptor IIIa de Fcy y para reducir la actividad de unión hacia el receptor IIb de Fcy, el aminoácido en la posición 234 de acuerdo con la numeración EU en (iv) mencionado anteriormente es, más preferiblemente, L, F, E o D.

Para mejorar la actividad de unión al receptor IIa de Fcy, en el primer polipéptido o en el segundo polipéptido, el aminoácido en la posición 234 de acuerdo con la numeración EU en (iii) mencionado anteriormente es preferiblemente V, I, T, M o L. Entre ellos, Se prefiere I, T o L; y en este caso, también sería posible aumentar la actividad de unión hacia el receptor IlIa de Fcy.

Los heterodímeros que potencian la unión a los receptores de Fcy activadores y son buenos para inducir funciones efectoras son preferiblemente heterodímeros donde:

en el primer polipéptido o en el segundo polipéptido, de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V, E, D, T, I, L o F, y el aminoácido en la posición 239 es M o I en (iii) mencionado anteriormente, y en el otro polipéptido, el aminoácido en la posición 330 de acuerdo con la numeración EU es A o K en (v) mencionado anteriormente; o

en el primer polipéptido o en el segundo polipéptido, de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es F, E, D, S o L, y el aminoácido en la posición 239 es M o I en (iv) mencionado anteriormente, y en el otro polipéptido, el aminoácido en la posición 330 de acuerdo con la numeración EU es A, F o K en (v) mencionado anteriormente.

De manera más específica, los ejemplos incluyen combinaciones de mutaciones de aminoácidos introducidas como se describe en los ejemplos.

La selectividad de la actividad de unión se puede determinar midiendo las actividades de unión del polipéptido hacia las respectivas isoformas del receptor de Fcy y después determinando sus relaciones. Por ejemplo, la cantidad de unión y el valor de KD hacia un FcyR pueden usarse como un indicador de la actividad de unión.

En la presente memoria, "mejora de la selectividad de la actividad de unión" significa que, por ejemplo, la relación de actividades de unión de un polipéptido de prueba a isoformas del receptor de Fcy (actividad de unión del polipéptido de prueba a una primera isoforma de receptor de FcY/actividad de unión del polipéptido de prueba a la segunda isoforma de receptor de Fcy) aumenta en 0,1 o más o, preferiblemente, 0,2 o más, 0,5 o más, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 5 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 50 o más, 70 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 500 o más o 1000 o más, cuando se compara con la relación de actividades de unión de un polipéptido precursor del polipéptido de prueba a las isoformas del receptor de Fcy (actividad de unión del polipéptido precursor del polipéptido de prueba a la primera isoforma del receptor de FcY/actividad de unión del polipéptido precursor del polipéptido de prueba a la segunda isoforma del receptor de Fcy) determinada basándose en el método de medición mencionado anteriormente. Además, la disminución de la selectividad de la isoforma del receptor de Fcy significa que, por ejemplo, la relación de actividades de unión de un polipéptido de prueba a isoformas del receptor de Fcy se reduce en 0,1 o más o, preferiblemente, en 0,2 o más, 0,5 o más, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 5 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 30 o más, 50 o más, 70 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 500 o más, o 1000 o más cuando se compara con la relación de actividades de unión del péptido precursor del polipéptido de prueba a las isoformas del receptor de Fcy, determinada basándose en el método de medición mencionado anteriormente.

En la presente memoria, como indicador de la selectividad también se puede usar, por ejemplo, la relación A/I que muestra la relación de las actividades de unión hacia el FcyR activador y el FcyR inhibidor. Los valores obtenidos dividiendo la KD del polipéptido de prueba para FcYRIIb por la KD del polipéptido de prueba para FcYRIIa de tipo H o de tipo R se usaron como las respectivas relaciones A/I. La relación A/I es preferiblemente 1,1 o más, 1,5 o más, 2 o más, 3 o más, o 5 o más y, más preferiblemente, 6 o más, 8 o más o 9 o más.

En la presente memoria, como indicador de selectividad se puede usar, por ejemplo, la relación FcYRIIIa F/FcYRIIb que es un valor obtenido dividiendo la KD para FcYRIIb por la KD para FcYRIIIa F. Los valores obtenidos dividiendo la Kd del polipéptido de prueba para FcYRIIb por la KD del polipéptido de prueba para FcYRIIIa se definieron como las respectivas relaciones FcYRIIIa F/FcYRIIb. La relación FcYRIIIa F/FcYRIIb es preferiblemente 1,1 o más, 1,5 o más, 2 o más, 3 o más, o 5 o más y, más preferiblemente, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 70 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 110 o más, 120 o más, 130 o más, 140 o más, 150 o más, 200 o más, 210 o más, 220 o más, 230 o más o 240 o más.

Cuando la alteración de la función de la región Fc del polipéptido es la mejora de la selectividad de la actividad de unión a un receptor de Fcy, se puede introducir una mutación de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc mencionada anteriormente. El tipo y variedad de la mutación de aminoácidos a introducir no están particularmente limitados.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIa, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es la potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región a de las Tablas 19-1, 19-2, 19-3 y 19-4 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región b de las Tablas 19-1, 19-2, 19-3, 19-4 y 19-5 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIa, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región c de las Tablas 23-1 y 23-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región d de las Tablas 23-1 y 23-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIIa R, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es la potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa R con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región a de la Tabla 20-1 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa R con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región b de las Tablas 20-1,20-2 y 20-3 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIIa R, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa R con respecto a FcYRIIb, al menos una mutación de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región c de la Tabla 24-1 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa R con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región d de las Tablas 24-1 y 24-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIIa H, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es la potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa H con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región a de la Tabla 21-1 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa H con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región b de las Tablas 21-1,21-2 y 21-3 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIIa H, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa H con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región c de las Tablas 25-1 y 25-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIIa H con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región d de las Tablas 25-1,25-2 y 25-3 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIIIa, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es la potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIIIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región a de la Tabla 22-1 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una potenciación selectiva de la actividad de unión a FcYRIIIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región b de las Tablas 22-1, 22-2 y 22-3 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que el receptor de Fcy activador es FcYRIIIa, el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb, y la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIIIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región c de las Tablas 26-1 y 26-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc. Además, cuando la mejora de la selectividad es una reducción selectiva de la actividad de unión a FcYRIIIa con respecto a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en la Región d de las Tablas 26-1, 26-2, 26-3 y 26-4 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En la presente memoria, la potenciación selectiva de la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado significa cualquiera de los siguientes casos:

(i) se potencia la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado, y las actividades de unión a receptores distintos del receptor de Fcy deseado permanecen sin cambios o disminuyen;

(i) se potencia la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado, y las actividades de unión a receptores distintos del receptor de Fcy deseado también se potencian, pero el grado de potenciación de la actividad de unión a receptores distintos del receptor de Fcy deseado es menor que el grado de potenciación de la actividad de unión al receptor de Fcy deseado; o

(iii) disminuye la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado, pero el grado de reducción de la actividad de unión es menor que el grado de reducción de las actividades de unión a receptores de Fcy distintos del receptor de Fcy deseado.

Además, la reducción selectiva de la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado significa cualquiera de los siguientes casos:

(i) disminuye la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado, y las actividades de unión a receptores distintos del receptor de Fcy deseado permanecen sin cambios o se potencian;

(i) disminuye la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado, y las actividades de unión a receptores distintos del receptor de Fcy deseado también disminuyen, pero el grado de reducción de la actividad de unión a receptores distintos del receptor de Fcy deseado es menor que el grado de reducción de la actividad de unión al receptor de Fcy deseado; o

(iii) se potencia la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado, pero el grado de potenciación de la actividad de unión es menor que el grado de potenciación de las actividades de unión a receptores de Fcy distintos del receptor de Fcy deseado.

En la presente memoria, la estabilidad fisicoquímica de un polipéptido significa, por ejemplo, estabilidad termodinámica de un polipéptido, que se puede determinar usando, por ejemplo, el valor de Tm del dominio CH2 como indicador. Los valores de Tm se pueden medir mediante dicroísmo circular (CD), calorimetría diferencial de barrido (DSC) o fluorimetría diferencial de barrido (DSF).

El cambio en la elipticidad molar media del resto (0) que acompaña a un aumento de temperatura se mide mediante CD para calcular el valor de Tm. El instrumento de medición incluye, por ejemplo, un medidor de dispersión de dicroísmo circular (JASCO Corporation). Cuando los espectros de CD se miden a una longitud de onda adecuada (por ejemplo, 208 nm o 222 nm) mientras se aumenta la temperatura, 0 aumenta a cierta temperatura y se convierte en un valor constante a temperaturas más altas. La temperatura a la que se alcanza un valor de punto medio entre 0 a baja temperatura y 0 a alta temperatura se considera la Tm. Para la medición, es posible usar, por ejemplo, una solución de proteína preparada utilizando ácido cítrico, Tris, solución de fosfato, o similares, a una concentración de varios cientos de gg/ml.

La DSC mide el cambio en calorías que acompaña a un aumento de temperatura para calcular el valor de Tm. El instrumento de medición incluye MicroCal VP-DSC y Micro Cal Capillary DSC (ambos de DKSH Japón). En las celdas de medición se introducen una solución de proteína y un tampón y, cuando se miden las diferencias de temperatura entre las celdas mientras se eleva la temperatura, se observa un cambio a una reacción endotérmica a partir de una determinada temperatura. Esta temperatura se considera la Tm. Para la medición, es posible usar, por ejemplo, una solución de proteína preparada utilizando tampón citrato, TBS, PBS, tampón histidina, o similares, a una concentración de varias decenas de gg/ml a varios centenares de gg/ml.

La DSF detecta la exposición de restos hidrófobos que acompaña a un aumento de temperatura mediante el uso de un reactivo fluorescente (por ejemplo, SYPRO Orange) que se une específicamente a restos hidrófobos para calcular el valor de Tm. Se mezclan una solución de proteína y un reactivo de fluorescencia en las relaciones adecuadas y, cuando se miden las intensidades de fluorescencia mientras se eleva la temperatura utilizando un instrumento de RT-PCR, se observa un aumento de la intensidad de fluorescencia a una determinada temperatura. Esta temperatura se considera la Tm. Los ejemplos del instrumento de medición incluyen Rotor-Gene Q (QIAGEN) y el sistema de análisis de PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Para la medición, es posible usar, por ejemplo, una solución de proteína preparada utilizando PBS, tampón histidina, o similares, a una concentración de varias decenas de gg/ml a varios centenares de gg/ml.

En la presente memoria, la estabilidad fisicoquímica mejorada de un polipéptido significa que, por ejemplo, el valor de Tm del dominio CH2 en la región Fc de un polipéptido de prueba determinado basándose en el método de medición mencionado anteriormente aumenta en 0,1 grados o más, preferiblemente 0,2 grados o más, 0,3 grados o más, 0,4 grados o más, 0,5 grados o más, 1 grado o más, 2 grados o más, 3 grados o más, 4 grados o más, 5 grados o más o 10 grados o más en comparación con el valor de Tm del dominio CH2 en la región Fc de un polipéptido de control. Además, una estabilidad física mejorada de un polipéptido se refiere a una reducción suprimida de la estabilidad física de un polipéptido; y por ejemplo, la reducción del valor de Tm del dominio CH2 en la región Fc de un polipéptido de prueba se suprime en relación con el valor de Tm del dominio CH2 en la región Fc de un polipéptido de control en 0,1 grados o más, preferiblemente 0,2 grados o más, 0,3 grados o más, 0,4 grados o más, 0,5 grados o más, 1 grado o más, 2 grados o más, 3 grados o más, 4 grados o más, 5 grados o más o 10 grados o más, según se determina basándose en el método de medición mencionado anteriormente.

En la presente memoria, "reducción de la estabilidad física de un polipéptido" significa que el valor de Tm del dominio CH2 en la región Fc de un polipéptido de prueba determinado basándose en el método de medición mencionado anteriormente se reduce en 0,1 grados o más, preferiblemente 0,2 grados o más, 0,3 grados o más, 0,4 grados o más, 0,5 grados o más, 1 grado o más, 2 grados o más, 3 grados o más, 4 grados o más, 5 grados o más o 10 grados o más en comparación con el valor de Tm del dominio CH2 en la región Fc de un péptido de control.

Además, la presente descripción incluye polipéptidos caracterizados por que están compuestos por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden una región Fc introducida con mutaciones, en donde la función de la región Fc está alterada en comparación con un polipéptido que comprende una región Fc sin introducción de mutaciones.

En el polipéptido, la alteración de la función de la región Fc puede ser una alteración que mejore aún más la estabilidad fisicoquímica, además de al menos una o más alteraciones seleccionadas del grupo que consiste en potenciación de la actividad de unión, reducción de la unión y mejora de la selectividad de la actividad de unión del polipéptido a un receptor de Fcy; y siempre que esté alterada alguna de estas funciones, se puede decir que está alterada la función de la región Fc de la presente descripción.

Como se emplea en esta memoria, la expresión "cuando se introducen mutaciones de aminoácidos en la región Fc tanto en el primer polipéptido como en el segundo polipéptido, la función de la región Fc no se altera "significa que cuando se introducen las mismas mutaciones de aminoácidos tanto en el primer polipéptido como en el segundo polipéptido, la función deseada no se mejora. Por ejemplo, significa que cuando se pretende potenciar la actividad de unión de un polipéptido a un receptor de Fcy, la actividad de unión no cambia o disminuye; cuando se pretende reducir la actividad de unión, la actividad de unión no cambia o se potencia; cuando se pretende mejorar la selectividad de la actividad de unión, la selectividad no se mejora; y cuando se pretende mejorar la estabilidad fisicoquímica del polipéptido, la estabilidad no cambia o disminuye. En cuanto a la mutación de aminoácidos, la expresión "cuando se introduce en una sola de las regiones Fc, se altera la función de la región Fc" significa que la función deseada mejora cuando la mutación de aminoácidos se introduce solo en el primer polipéptido o en el segundo polipéptido. Por ejemplo, significa que cuando se pretende potenciar la actividad de unión de un polipéptido a un receptor de Fcy, la actividad de unión se mejora; cuando se pretende reducir la actividad de unión, la actividad de unión disminuye; cuando se pretende mejorar la selectividad de la actividad de unión, la selectividad se mejora; y cuando se pretende mejorar la estabilidad fisicoquímica de un polipéptido, la estabilidad se mejora.

La presente descripción también incluye un polipéptido que se caracteriza por que la región Fc está compuesta por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, y que se caracteriza por tener una Tm más alta que la de un polipéptido caracterizado por que el polipéptido está compuesto por un homodímero que comprende solo el primer polipéptido o está compuesto por un polipéptido caracterizado por que la región Fc está compuesta por un homodímero que comprende solo el segundo polipéptido. Junto con una alteración que mejora la estabilidad fisicoquímica, es decir, que tiene una Tm alta, el polipéptido también puede tener alteraciones adicionales en la función de la región Fc.

En un caso en el que la alteración adicional de la función de la región Fc es la potenciación de la actividad de unión a FcYRIa, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en las Tablas 31-1, 31-2 y 31-3 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que la alteración adicional de la función de la región Fc es la potenciación de la actividad de unión a FcYRIIa R, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en las Tablas 32-1 y 32-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que la alteración adicional de la función de la región Fc es la potenciación de la actividad de unión a FcYRIIa H, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en las Tablas 33-1 y 33-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que la alteración adicional de la función de la región Fc es la potenciación de la actividad de unión a FcYRIIb, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en las Tablas 34-1 y 34-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En un caso en el que la alteración adicional de la función de la región Fc es la potenciación de la actividad de unión a FcYRIIIa, al menos una o más mutaciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las mutaciones de aminoácidos descritas en las Tablas 35-1 y 35-2 de la presente memoria pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc.

En la presente descripción, la combinación del primer polipéptido y el segundo polipéptido en el que se introducen las mutaciones de aminoácidos no está limitada particularmente, y los ejemplos incluyen combinaciones de diferentes tipos/o el mismo tipo de polipéptidos seleccionados de los polipéptidos descritos en las SEQ ID NO: 2 a 4 y 6 a 60. Además, los ejemplos preferidos incluyen una combinación de polipéptidos que comprenden el primer polipéptido y el segundo polipéptido descritos en los ejemplos de la presente memoria (una combinación de las cadenas H de dos anticuerpos y la cadena L de un solo anticuerpo).

El polipéptido de la presente invención puede ser una molécula de unión a antígeno. En la presente invención, mientras que la molécula de unión al anticuerpo no está particularmente limitada en cuanto al tipo, los ejemplos preferidos incluyen un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o una molécula de fusión de Fc tal como una proteína de fusión de Fc-péptido o una proteína de fusión de Fc-armazón.

Además, se proporciona un anticuerpo como polipéptido de la presente invención.

El término "anticuerpo/anticuerpos" en la presente invención se usa en el sentido más amplio, y siempre que se muestre la actividad biológica deseada, comprende cualquier anticuerpo tal como anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, variantes de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos poliespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.

Con respecto a los anticuerpos de la presente invención, el tipo de antígeno y el origen del anticuerpo no están limitados y pueden ser cualquier tipo de anticuerpo. El origen de los anticuerpos no está particularmente limitado, pero los ejemplos incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata y anticuerpos de conejo.

Los métodos para producir los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante el método de hibridoma (Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975)), o el método de recombinación (Patente de Estados Unidos N°. 4.816.567). Como alternativa, pueden aislarse de una biblioteca de anticuerpos en fagos (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 -597 (1991)). Como alternativa, pueden aislarse de un solo clon de células B (N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011)).

Un anticuerpo humanizado también se denomina anticuerpo humano remodelado. Específicamente, se conocen anticuerpos humanizados preparados mediante el injerto de las CDR de un anticuerpo animal no humano tal como un anticuerpo de ratón contra un anticuerpo humano y similares. También se conocen tecnologías de ingeniería genética habituales para obtener anticuerpos humanizados. Específicamente, por ejemplo, la PCR de extensión solapante se conoce como un método para injertar CDR de anticuerpo de ratón en FR humanas.

Se puede producir un vector para expresar un anticuerpo humanizado insertando un ADN que codifica una región variable de anticuerpo en la que están ligadas tres CDR y cuatro FR y un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano en un vector de expresión de manera que estos ADN se fusionen en el mismo marco de lectura. Después de que este vector de integración se introduzca por transfección en un hospedador para establecer células recombinantes, estas células se cultivan y el ADN que codifica el anticuerpo humanizado se expresa para producir el anticuerpo humanizado en el cultivo de las células (véase la publicación de patente europea N.° EP 239.400 y la publicación de patente internacional N°. WO 1996/002576).

Cuando sea necesario, se puede sustituir un resto de aminoácido en una FR de modo que las CDR de un anticuerpo humano remodelado formen un sitio de unión a antígeno apropiado. Por ejemplo, se puede introducir una mutación en la secuencia de aminoácidos de una FR aplicando el método de PCR utilizado para injertar CDR de ratón en FR humanas.

Puede obtenerse un anticuerpo humano deseado mediante inmunización con ADN utilizando un animal transgénico que tenga el repertorio completo de genes de anticuerpos humanos (véanse las publicaciones internacionales N.° WO 1993/012227, WO 1992/003918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096 y WO 1996/033735) como animal para la inmunización.

Además, se conocen tecnologías para obtener un anticuerpo humano mediante "panning" (técnica de aislamiento de anticuerpos mediante inmunoadsorción) usando una biblioteca de anticuerpos humanos. Por ejemplo, una región V de anticuerpo humano se expresa en la superficie de un fago como un anticuerpo monocatenario (scFv) mediante el método de presentación en fagos. Puede seleccionarse el fago que expresa scFv que se une al antígeno. La secuencia de ADN que codifica la región V del anticuerpo humano unido al antígeno se puede determinar analizando los genes del fago seleccionado. Después de determinar la secuencia de ADN del scFv que se une al antígeno, se puede preparar un vector de expresión fusionando la secuencia de la región V en el mismo marco de lectura que la secuencia de una región C de anticuerpo humano deseada, y luego insertándola en un vector de expresión adecuado. El vector de expresión se introduce en células de expresión adecuadas, tales como las descritas anteriormente, y el anticuerpo humano se puede obtener expresando el gen que codifica el anticuerpo humano. Estos métodos ya se conocen (véanse las publicaciones internacionales N.° WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438 y WO 1995/15388).

Las regiones variables que constituyen los anticuerpos de la presente invención pueden ser regiones variables que reconocen cualquier antígeno.

En la presente memoria, no existe una limitación particular sobre el antígeno, y puede ser cualquier antígeno. Los ejemplos del antígeno incluyen 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, Activina, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activina RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Adresinas, adiponectina, ADP ribosil ciclasa-1, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alérgeno, alfaI-antiquimotripsina, alfaIantitripsina, alfa-sinucleína, antagonista de alfa-V/beta-1, aminina, amilina, beta amiloide, región variable de cadena pesada de inmunoglobulina amiloide, región variable de cadena ligera de inmunoglobulina amiloide, Andrógeno, ANG, angiotensinógeno, Ligando-2 de angiopoyetina, anti-Id, antitrombina III, Ántrax, APAF-1, Ap E, APJ, apo A1, apo amiloide A sérico, Apo-SAA, APP, APRIL, AR, a Rc , ART, Artemina, ASPÁRTICO, Factor natriurético auricular, Péptido natriurético auricular, Péptidos natriuréticos auriculares A, Péptidos natriuréticos auriculares B, Péptidos natriuréticos auriculares C, integrina av/b3, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, Antígeno protector de Bacillus anthracis, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, BeI, BCMA, BDNF, b-ECGF, beta-2-microglobulina, betalactamasa, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, Estimulador de linfocitos B (BIyS), BMP, BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (Osteogenina), BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMP, BOK, Bombesina, Factor neurotrófico derivado del hueso, hormona del crecimiento bovina, BPDE, BPDE-ADN, BRK-2, BTC, molécula de adhesión celular de linfocitos B, C10, inhibidor de C1, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a (complemento 5a), CA125, CAD-8, Cadherina-3, Calcitonina, AMPc, Anhidrasa carbónica-IX, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno asociado a carcinoma, Cardiotrofina-1, Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C/DPPI, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina H, Catepsina L, Catepsina O, Catepsina S, Catepsina V, Catepsina X/Z/P, c Bl , CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/Eotaxina, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-alfa, CCL21/SLC, CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/eotaxina-2, CCL25/TECK, CCL26/eotaxina-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M1P-1-alfa, CCL3L1/LD-78-beta, CCL4/MIP-1-beta, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1-gamma, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61, CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFt R, GMPc, receptor de CGRp, CINC, CKb8-1, Claudin18, ClC, toxina de Clostridium botulinum, toxina de Clostridium difficile, toxina de Clostridium perfringens, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, factor del complemento 3 (C3), factor del complemento D, globulina transportadora de corticosteroides, Receptor del factor 1 estimulante de colonias, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/Fractalquina, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-alfa, CXCL10, CXCL11/I-TAC, CXCL12/SDF-1-alfa/beta, CXCL13/BCA-1, CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungquina. CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig, CXCL1O/IP-10, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cistatina C, antígeno asociado a tumores de citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, Factor acelerador de la degradación, Ligando de proteína tipo Delta 4, des(1 -3)-IGF-1 (IGF-1 de cerebro), Dhh, DHICA oxidasa, Dickkopf-1, digoxina, Dipeptidil peptidasa IV, DK1, DNAM-1, DNasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGf R (ErbB-1), proteína 7 que contiene dominio de tipo EGF, Elastasa, elastina, EMA, EMMPRIN, ENA, ENA-78, Endosialina, receptor de endotelina, endotoxina, Encefalinasa, eNOS, Eot, Eotaxina, Eotaxina-2, eotaxini, EpCAM, Efrina B2/EphB4, Receptor de tirosina quinasa epha2, Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), Receptor de ErbB2, Receptor de tirosina quinasa ErbB3, ERCC, EREG, eritropoyetina (EPO), Receptor de eritropoyetina, E-selectina, ET-1, Exodus-2, Proteína F de RSV, F10, F11, F12, F13, F5, F9, Factor Ia, Factor IX, Factor Xa, Factor VII, factor VIII, Factor VIIIc, Fas, FcalphaR, FcepsilonRI, FcgammaIIb, FcgammaRI, FcgammaRIIa, FcgammaRIIIa, FcgammaRIIIb, FcRn, FEN-1, Ferritina, fGf , FGF-19, FGF-2, Receptor de FGF-2, FGF-3, FGF-8, FGF-ácido, FGF-básico, FGFR, FGFR-3, Fibrina, proteína de activación de fibroblastos (FAP), factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de fibroblastos-10, fibronectina, FL, FLIP, Flt-3, Ligando FLT3, Receptor de folato, hormona estimulante del folículo (FSH), Fractalquina (CX3C), cadena pesada libre, cadena ligera libre, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, receptor de G-CSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (Miostatina), GDF-9, GDNF, Gelsolina, GFAP, GF-CSF, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GF-p1, glicoproteína de la envoltura gH, GITR, Glucagón, Receptor de glucagón, Receptor del péptido 1 similar al glucagón, Glut 4, Glutamato carboxipeptidasa II, receptores de hormonas glicoproteicas, glicoproteína IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), Glipican-3, GM-CSF, Receptor de GM-CSF, gp130, gp140, gp72, granulocitos-CSF (G-CSF), GRO/MGSA, Factor de liberación de la hormona del crecimiento, GRO-p, GRO-y , Hapteno de H. pylori (NP-cap o NIP-cap), HB-Eg F, HCC, HCC 1, glucoproteína de la envoltura gB de HCMV, HCMV Ul , Factor de crecimiento hematopoyético (HGF), gp120 de Hep B, heparanasa, cofactor de heparina II, factor de crecimiento hepático, Antígeno protector de Bacillus anthracis, Glicoproteína E2 del virus de la hepatitis C, Hepatitis E, Hepcidina, Her1, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus del herpes simple (Vh S), HGF, HGFA, Antígeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), Proteínas de la envoltura del VIH tales como GP120, Bucle V3 de gp 120 MIB de VIH, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk, HSP47, Hsp90, glucoproteína gD de VHS, miosina cardíaca humana, citomegalovirus humano (HCMV), hormona del crecimiento humana (hGH), seroalbúmina humana, activador del plasminógeno de tipo tisular humano (t-PA), Huntingtin, HVEM, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IgA, receptor de IgA, IgE, IGF, proteínas de unión a iGf , IGF-1, IGF-1 R, iGf -2, IGFBP, iGf R, IL, IL-1, IL-10, receptores de IL-10, IL-11, receptores de IL-11, IL-12, receptores de IL-12, IL-13, receptores de IL-13, IL-15, receptores de IL-15, IL-16, receptores de lL-16, IL-17, receptores de IL-17, IL-18 (IGIF), receptores de IL-18, IL-1 alpha, lL-1 beta, receptores de IL-1, IL-2, receptores de IL-2, IL-20, receptores de IL-20, IL-21, receptores de IL-21, IL-23, receptores de IL-23, receptores de IL-2, IL-3, receptores de IL-3, IL-31, receptores de IL-31, receptores de IL-3, IL-4, receptores de IL-4, IL-5, receptores de IL-5, IL-6, receptores de IL-6, IL-7, receptores de IL-7, IL-8, receptores de IL-8, IL-9, receptores de IL-9, complejo inmunitario de inmunoglobulina, inmunoglobulinas, INF-alfa, receptores INF-alfa, INF-beta, receptores INF-beta, INF-gamma, receptores INF-gamma, IFN tipo I, receptor de IFN tipo I, influenza, inhibina, Inhibina a, Inhibina p, iNOS, insulina, cadena A de insulina, cadena B de insulina, factor de crecimiento insulínico 1, factor de crecimiento insulínico 2, proteínas de unión al factor de crecimiento insulínico, integrina, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa-V/beta-3, integrina alfa-V/beta-6, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa5/beta6, integrina alphao (alfaV), integrina alfa0, integrina beta1, integrina beta2, integrina beta3 (GPIIb-IIIa), IP-10, I-TAC, JE, calicleína, Calicreína 11, Calicreína 12, Calicreína 14, Calicreína 15, Calicreína 2, Calicreína 5, Calicreína 6, Calicreína L1, Calicreína L2, Calicreína L3, Calicreína L4, Calistatina, KC, KDR, Factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), Factor de crecimiento de queratinocitos-2 (KGF-2), KGF, receptor de tipo inmunoglobulina de linfocitos citolíticos, ligando kit (KL), tirosina quinasa Kit, laminina 5, LAMP, LAPP (amilina, polipéptido amiloide de los islotes), LAP (TGF-1), péptido asociado a latencia, TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LDL, receptor de LDL, LECT2, Lefty, Leptina, hormona luteinizante (LH), antígeno Y de Lewis, antígeno relacionado con el antígeno Y de Lewis, LFA-1, LFA-3, receptores de LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, Lptn, L-Selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, Surfactante pulmonar, Hormona luteinizante, Linfotactina, Receptor de Linfotoxina Beta, Receptor de lisoesfingolípidos, Mac-1, macrófago-CSF (M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, maspin, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 aa), MDC (69 aa), megsin, Mer, familia MET de receptores de tirosina quinasa, METALOPROTEASAS, Glicoproteína de membrana OX2, Mesotelina, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), proteína microbiana, FIM, MIG, MIP, MIP-1a, MIP-1 p, MIP-3a, MIP-3p, MIP-4, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, m Mp -3, Mm P-7, MMP-8, MMP-9, proteína atrayente de monocitos, factor inhibidor de colonias de monocitos, péptido asociado a gonadotropina de ratón, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucina (Mud), sustancia inhibidora mülleriana, Mug, MuSK, Glicoproteína asociada a mielina, factor inhibidor del progenitor mieloide 1 (MPIF-I), NAIP, Nanocuerpos, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-Cadherina, n Ca M, Neprilisina, Molécula de adhesión de células neurales, neroserpina, Factor de crecimiento neuronal (NGF), Neurotrofina-3, Neurotrofina-4, Neurotrofina-6, Neuropilina 1, Neurturina, NGF-beta, NGFR, NKG20, N-metionil-hormona de crecimiento humana, nNOS, NO, Nogo-A, Receptor de Nogo, proteína no estructural tipo 3 (NS3) del virus de la hepatitis C, NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGG1, Oncostatina M, OP-2, OPG, OPN, OSM, receptores de OSM, factores osteoinductivos, osteopontina, OX40L, OX40R, LDL oxidado, p150, p95, PADPr, hormona paratiroidea, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cdherina, PCNA, PCSK9, PDGF, receptor de PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, pGF, pG|2, PGJ2, PIGF, PlN, PLA2, Factor de crecimiento placentario, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP), lactógeno placentario, inhibidor del activador del plasminógeno-1, factor de crecimiento plaquetario, plgR, pLP, cadenas de poliglicol de diferente tamaño (p. ej., PEG-20, PeG-30, PEG40), PP14, precalicreína, proteína priónica, procalcitonina, Proteína de muerte celular programada 1, proinsulina, prolactina, Proproteína convertasa PC9, prorrelaxina, antígeno prostático específico de membrana (PSMA), Proteína A, Proteína C, Proteína D, Proteína S, Proteína Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, Ligando-1 de glicoproteína de P-selectina, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, relaxina, Cadena A de relaxina, Cadena B de relaxina, renina, F del virus respiratorio sincitial (Rs V), Ret, reticulon 4, Factores reumatoides, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, Esclerostina, SDF-1, SDF1a, SDF1p, SERINA, Amiloide P sérico, Seroalbúmina, sFRP-3, Shh, Toxina II de tipo Shiga, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, receptor 1 de esfingosina 1-fosfato, ácido lipoteicoico estafilocócico, Stat, STEAP, STEAP-II, factor de células madre (SCF), estreptoquinasa, superóxido dismutasa, sindecano-1, TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteína 72 asociada a tumores), TARC, TB, TCA-3, Receptor de células T alfa/beta, TdT, TeCK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, Tenascina, TERT, fosfatasa alcalina testicular similar a PLAP, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta panespecífico, TGF-beta Rll, TGF-beta Rllb, TGF-beta Rlll, TGF-beta R1 (ALK-5), TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, TGF-I, Trombina, trombopoyetina (TPO), Receptor de linfoproteína del estroma tímico, Ck-1 de timo, hormona estimulante de tiroides (TSH), tiroxina, globulina de unión a tiroxina, Tie, TIMP, TIQ, Factor tisular, inhibidor de proteasa de factor tisular, proteína de factor tisular, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, Receptor de TNF I, Receptor de TNF II, TNF-alfa, TNF-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1/LIT/TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF R1 CD120a/p55-60), TNFRSF1B (TNF Rll CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35/TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10 (Ligando TRAIL Apo-2/TL2), TNFSF11 (Ligando ODF de TRANCE/RANK/Ligando OPG), TNFSF12 (Ligando TWEAK Apo-3/Ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1/THANK/TNFSF20), TNFSF14 (Ligando LIGHT HVEM/LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (Ligando GITR Ligando AITR/TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina/DIF/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (Ligando gp34 de OX40/TXGP1), TNFSF5 (Ligando CD40 CD154/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Ligando Fas Ligando Apo-1/Ligando APT1), TNFSF7 (Ligando CD70 de CD27), TNFSF8 (Ligando CD153 de CD30), TNFSF9 (Ligando 4-1 BB Ligando CD137), TNF-a, TNF-p, TNIL-I, metabolito tóxico, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TrA iL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta, Glicoproteína transmembrana NMB, Transtiretina, TRF, Trk, TROP-2, Glicoproteína de trofoblasto, TSG, TSLP, Factor de necrosis tumoral (TNF), antígeno CA 125 asociado a tumor, antígeno asociado a tumor que expresa carbohidrato relacionado con Y de Lewis, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Uroquinasa, VAP-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vaspina, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherina, VE-Cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, Receptor de VEGF (VEGFR), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Antígenos virales, Receptor de VitB12, Receptor de vitronectina, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, Factor de von Willebrand (vWF), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-1-beta, XCL1/Linfotactina, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD.

Se permiten una o más alteraciones de restos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos que constituyen las regiones variables siempre que se mantengan sus actividades de unión a antígenos. Cuando se altera una secuencia de aminoácidos de una región variable, no existe una limitación particular sobre el sitio de alteración y el número de aminoácidos alterados. Por ejemplo, se pueden alterar de manera apropiada aminoácidos presentes en CDR y/o FR. Cuando se alteran aminoácidos en una región variable, la actividad de unión se mantiene preferiblemente sin limitación particular; y por ejemplo, en comparación con antes de la alteración, la actividad de unión es del 50 % o más, preferiblemente del 80 % o más y, más preferiblemente, del 100 % o más. Además, la actividad de unión puede aumentarse por alteraciones de aminoácidos. Por ejemplo, la actividad de unión puede ser 2, 5 o 10 veces mayor o similar con respecto a antes de la alteración. En los anticuerpos de la presente invención, la alteración de la secuencia de aminoácidos puede ser al menos una de una sustitución, adición, deleción, inserción y modificación de restos de aminoácidos.

Por ejemplo, la modificación de la glutamina N-terminal de una región variable en ácido piroglutámico por piroglutamilación es una modificación bien conocida por los expertos en la técnica. Por tanto, cuando el extremo N de la cadena pesada es glutamina, los anticuerpos de la presente descripción comprenden las regiones variables en las que la glutamina se modifica a ácido piroglutámico.

Las regiones variables de anticuerpos de la presente invención pueden tener cualquier secuencia y pueden ser regiones variables de anticuerpos de cualquier origen, tales como anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de cabra, anticuerpos de camello, anticuerpos humanizados producidos por humanización de estos anticuerpos no humanos y anticuerpos humanos. Los "anticuerpos humanizados", también denominados "anticuerpos humanos remodelados", son anticuerpos en los que las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, se han trasplantado en las CDR de un anticuerpo humano. Se conocen métodos para identificar CDR (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). También se conocen sus tecnologías de recombinación genética habituales (véanse la publicación de solicitud de patente europea N.° EP 125023 y el documento WO 96/02576). Además, estos anticuerpos pueden tener varias sustituciones de aminoácidos introducidas en sus regiones variables para mejorar su unión al antígeno, farmacocinética, estabilidad y antigenicidad. Las regiones variables de los anticuerpos de la presente descripción pueden unirse a antígenos repetidamente debido a su dependencia del pH en la unión de antígenos (documento WO/2009/125825).

En las regiones constantes de cadena ligera del anticuerpo están presentes regiones constantes de tipo cadena k y de tipo cadena A, pero es aceptable cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera. Además, las regiones constantes de cadena ligera de la presente descripción pueden ser regiones constantes de cadena ligera con alteraciones de aminoácidos tales como sustituciones, adiciones, eliminaciones, inserciones y/o modificaciones.

Por ejemplo, para las regiones constantes de cadena pesada de un anticuerpo de la presente descripción, pueden usarse regiones constantes de cadena pesada de anticuerpos IgG humanos y se prefieren regiones constantes de cadena pesada de anticuerpos IgG 1 humanos.

Las regiones variables que constituyen un anticuerpo de la presente invención pueden ser regiones variables que reconocen cualquier antígeno. Pueden alterarse uno o varios restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que constituyen una región variable de cadena pesada siempre que se mantenga la actividad de unión al antígeno.

Además, la alteración de regiones variables se lleva a cabo con el objetivo de incrementar la actividad de unión, mejorar la especificidad, disminuir el pl, conferir una propiedad dependiente del pH a la unión del antígeno, mejorar la estabilidad térmica de la unión, mejorar la solubilidad, proporcionar estabilidad a la modificación química, mejorar la heterogeneidad derivada de la cadena de azúcar, evitar el epítopo de células T que reduce la inmunogenicidad identificado por predicción in silico, o por un ensayo in vitro con células T, introducir el epítopo de células T que activa las células T reguladoras, o similares (mAbs 3: 243-247, 2011).

Además, un polipéptido de la presente descripción puede ser una molécula de proteína de fusión de Fc producida uniendo una región Fc con otra proteína, un péptido biológicamente activo, o similares (proteína de fusión de Fcpéptido), o una molécula de proteína de fusión de Fc producida uniendo una región Fc con una matriz extracelular compuesta de polímeros tales como colágeno o ácido poliláctico (proteína de fusión de Fc-armazón).

Los ejemplos de otra proteína o péptido biológicamente activo incluyen receptores, moléculas de adhesión, ligandos y enzimas, pero no se limitan a los mismos.

Los ejemplos preferidos de moléculas de proteína de fusión de Fc de la presente invención incluyen proteínas con dominio Fc fusionado a una proteína receptora que se une a una diana, y estos ejemplos incluyen proteína de fusión de Fc-TNFR, proteína de fusión Fc-IL1R, proteína de fusión de Fc-VEGFR y proteína de fusión de Fc-CTLA4 (Nat Med. enero de 2003; 9(1): 47-52; BioDrugs. 2006; 20(3): 151-60). Además, una proteína a fusionar con un polipéptido de la presente descripción puede ser cualquier molécula siempre que se una a una molécula diana, y los ejemplos incluyen moléculas de scFv (documento WO 2005/037989), moléculas de anticuerpo de un solo dominio (documentos WO 2004/058821; WO 2003/002609), moléculas similares a anticuerpos (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469; y Protein Science 2006, 15: 14-27) tales como DARPins (documento WO 2002/020565), Aficuerpo (Affibody) (documento WO 1995/001937), Avímero (documentos WO 2004/044011; WO 2005/040229) y Adnectina (documento WO 2002/032925). Además, los anticuerpos y las moléculas de proteína de fusión de Fc pueden ser anticuerpos multiespecíficos que se unen a múltiples tipos de moléculas diana o epítopos tales como anticuerpos biespecíficos.

Además, los anticuerpos de la presente descripción incluyen productos de modificación de anticuerpos. Dichos productos de modificación de anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos ligados a diversas moléculas tales como polietilenglicol (PEG) y sustancias citotóxicas. Dichos productos de modificación de anticuerpos pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos de la presente descripción. En este campo ya se han establecido métodos para modificar anticuerpos.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser anticuerpos biespecíficos. "Anticuerpo biespecífico" se refiere a un anticuerpo que tiene, en una sola molécula de anticuerpo, regiones variables que reconocen diferentes epítopos. Los epítopos pueden estar presentes en una sola molécula o en diferentes moléculas.

Los polipéptidos de la presente descripción se pueden preparar por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden preparar mediante los métodos que se describen a continuación, pero los métodos no se limitan a ellos.

Existen diversas combinaciones de célula hospedadora/vector de expresión conocidas para la preparación de anticuerpos mediante la introducción de genes aislados que codifican el polipéptido en hospedadores apropiados. Todos estos sistemas de expresión son aplicables al aislamiento de las moléculas de unión a antígeno de la presente invención. Las células eucariotas adecuadas utilizadas como células hospedadoras incluyen células animales, células vegetales y células fúngicas. Específicamente, las células animales incluyen, por ejemplo, las siguientes células.

(1) células de mamífero: CHO (línea celular de ovario de hámster chino), COS (línea celular de riñón de mono), mieloma (Sp2/O, NS0 y similares), BHK (línea celular de riñón de cría de hámster), HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano con ADN de adenovirus (Ad)5 cortado), célula PER.C6 (línea celular de retina embrionaria humana transformada con los genes E1A y E1B del adenovirus tipo 5 (Ad5)), Hela, Vero, o similares (Current Protocols in Protein Science (mayo de 2001, Unidad 5.9, Tabla 5.9.1));

(2) células de anfibios: ovocitos de Xenopus o similares; y

(3) células de insectos: sf9, sf21, Tn5 o similares.

Se expresan un ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo en el que uno o más restos de aminoácidos en la región Fc se han sustituido por otros aminoácidos de interés y un ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo. Un ADN que codifica una cadena pesada en la que uno o más restos de aminoácidos en la región Fc se han sustituido por otros aminoácidos de interés se puede preparar, por ejemplo, obteniendo un ADN que codifica la región Fc de una cadena pesada natural e introduciendo una sustitución apropiada de modo que un codón que codifica un aminoácido particular en la región Fc codifique otro aminoácido de interés.

Como alternativa, también se puede preparar un ADN que codifica una cadena pesada en la que uno o más restos de aminoácidos en la región Fc se han sustituido por otros aminoácidos de interés diseñando y luego sintetizando químicamente un ADN que codifica una proteína en la que uno o más restos de aminoácidos en la región Fc de la cadena pesada natural se han sustituido por otros aminoácidos de interés. La posición y el tipo de sustitución de aminoácidos no están particularmente limitados. Además, la alteración no se limita a la sustitución, y la alteración puede ser cualquiera de deleción, adición, inserción o combinación de las mismas.

Como alternativa, un ADN que codifica una cadena pesada en la que uno o más restos de aminoácidos en la región Fc se han sustituido por otros aminoácidos de interés se puede preparar como una combinación de ADN parciales. Tales combinaciones de ADN parciales incluyen, por ejemplo, la combinación de un ADN que codifica una región variable y un ADN que codifica una región constante, y la combinación de un ADN que codifica una región Fab y un ADN que codifica una región Fc, pero no se limitan a los mismos. Además, un ADN que codifica una cadena ligera se puede preparar de manera similar como una combinación de ADN parciales.

Los métodos para expresar los ADN descritos anteriormente incluyen los métodos descritos a continuación. Por ejemplo, un vector de expresión de cadena pesada se construye insertando un ADN que codifica una región variable de cadena pesada en un vector de expresión junto con un ADN que codifica una región constante de cadena pesada. Del mismo modo, un vector de expresión de cadena ligera se construye insertando un ADN que codifica una región variable de cadena ligera en un vector de expresión junto con un ADN que codifica una región constante de cadena ligera. Como alternativa, estos genes de cadena pesada y ligera pueden insertarse en un solo vector.

Al insertar un ADN que codifica el anticuerpo de interés en un vector de expresión, el ADN se inserta de modo que el anticuerpo se exprese bajo el control de una región reguladora de la expresión, tal como un potenciador o un promotor. A continuación, se transforman células hospedadoras con este vector de expresión para expresar el anticuerpo. En estos casos, se puede usar una combinación apropiada de hospedador y vector de expresión.

Los ejemplos de los vectores incluyen vectores M13, vectores pUC, pBR322, pBluescript y pCR-Script. Como alternativa, cuando se pretende subclonar y escindir el ADNc, además de los vectores descritos anteriormente, pueden usarse pGEM-T, pDIRECT, pT7 y similares.

Los vectores de expresión son particularmente útiles cuando se usan vectores para producir los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, cuando una célula hospedadora es E. coli tal como JM109, DH5a, HB101 y XL1-Blue, los vectores de expresión deben portar un promotor que permita una expresión eficaz en E. coli, por ejemplo, promotor de lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341: 544-546; FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), promotor araB (Better et al., Science (1988) 240: 1041-1043), promotor de T7, o similar. Dichos vectores incluyen pGEX-5X-1 (Pharmacia), "sistema QIAexpress" (QIAGEN), pEGFP o pET (en este caso, el hospedador es preferiblemente BL21 que expresa la ARN polimerasa de T7) además de los vectores descritos anteriormente.

Los vectores pueden contener secuencias señal para la secreción de polipéptidos. Como secuencia señal para la secreción de polipéptidos, puede usarse una secuencia señal pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169: 4379) cuando se secreta un polipéptido en el periplasma de E. coli. El vector se puede introducir en las células hospedadoras mediante el método de lipofectina, método de fosfato de calcio y método de DEAE-Dextrano, por ejemplo.

Además de vectores de expresión de E. coli, los vectores para producir los polipéptidos de la presente descripción incluyen vectores de expresión de mamíferos (por ejemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.

1990, 18(17): p5322), pEF y pCDM8), vectores de expresión derivados de células de insectos (por ejemplo, el "sistema de expresión de baculovirus Bac-to-BAC" (GIBCO BRL) y pBacPAK8), vectores de expresión derivados de plantas (por ejemplo, pMH1 y pMH2), vectores de expresión derivados de virus animales (por ejemplo, pHSV, pMV y pAdexLcw), vectores de expresión retrovirales (por ejemplo, pZ-IPneo), vectores de expresión de levadura (por ejemplo, "kit de expresión de Pichia" (Invitrogen), pNV11 y SP-Q01) y vectores de expresión de Bacillus subtilis (por ejemplo, pPL608 y pKTH50), por ejemplo.

Cuando se intenta conseguir la expresión en células animales tales como células CHO, COS, NIH3T3 y HEK293, los vectores deben tener un promotor esencial para la expresión en las células, por ejemplo, el promotor de SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277: 108), el promotor de MMTV-LTR, promotor de EF1a (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322), el promotor Ca G (Gene. (1990) 18: 5322) y el promotor de c Mv y, más preferiblemente, tienen un gen para seleccionar células transformadas (por ejemplo, un gen de resistencia a fármacos que permite la evaluación usando un agente (neomicina, G418, o similar)). Los vectores con tales características incluyen pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV y pOP13, por ejemplo. Asimismo, en algunos casos, la proteína EBNA1 puede coexpresarse adicionalmente con el fin de aumentar el número de copias del gen y, en este caso, se usa un vector que tiene un punto de iniciación de la replicación OriP. (Biotechnol. Bioeng. 20 de octubre de 2001; 75(2): 197-203; y Biotechnol. Bioeng. 20 de septiembre de 2005; 91 (6): 670-7.)

Además, puede usarse el siguiente método para la expresión génica estable y la amplificación del número de copias de genes en las células: se introducen células CHO deficientes en una ruta de síntesis de ácidos nucleicos con un vector que porta un gen DHFR que compensa la deficiencia (por ejemplo, pCHOI) y el vector se amplifica usando metotrexato (MTX). Como alternativa, se puede utilizar el siguiente método para la expresión génica transitoria: se transforman células COS con un gen que expresa el antígeno T de SV40 en su cromosoma con un vector con un origen de replicación de SV40 (pcD y similares). También se pueden usar orígenes de replicación derivados del virus del polioma, adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Para amplificar el número de copias de genes en las células hospedadoras, los vectores de expresión pueden portar además marcadores de selección tales como el gen de la aminoglucósido transferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina-guanina fosforribosiltransferasa de E. coli (Ecogpt) y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr).

Los anticuerpos se pueden recoger, por ejemplo, cultivando células transformadas y luego separando los anticuerpos del interior de las células transformadas o del medio de cultivo. Los anticuerpos se pueden separar y purificar utilizando una combinación apropiada de métodos tales como centrifugación, fraccionamiento con sulfato de amonio, precipitación salina, ultrafiltración, 1q, FcRn, proteína A, columna de proteína G, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel.

Como método eficaz para producir anticuerpos biespecíficos, se puede utilizar la tecnología de botones en ojales. Específicamente, para producir un polipéptido heterodimerizado de la presente descripción, es necesario tener asociación entre polipéptidos que tienen aminoácidos que difieren entre sí, o separar el polipéptido heterodimerizado de interés de los otros polipéptidos homodimerizados.

Para la asociación de polipéptidos que tienen diferentes aminoácidos entre sí y que comprenden una región Fc, se puede aplicar una tecnología para suprimir la asociación involuntaria entre cadenas H mediante la introducción de repulsión electrostática en la interfaz de la segunda región constante de la cadena H del anticuerpo (CH2) o la tercera región constante de la cadena H (CH3) (documento WO 2006/106905).

(X) ácido glutámico (E) y ácido aspártico (D); y

(Y) lisina (K), arginina (R) e histidina (H).

En la presente descripción, los restos de aminoácidos que se van a alterar no se limitan a los restos de aminoácidos de la región constante del anticuerpo o la región variable del anticuerpo descrita anteriormente. Los expertos en la técnica pueden encontrar restos de aminoácidos que forman la interfaz en mutantes polipeptídicos o heteromultímeros mediante modelado por homología y similares utilizando software disponible comercialmente, y pueden alterar los restos de aminoácidos en esos sitios para regular la asociación.

Además, incluso en los casos en los que no se pueden formar de manera eficaz polipéptidos heterodimerizados, se pueden obtener polipéptidos heterodimerizados separándolos y purificándolos de polipéptidos homodimerizados.

Cuando se produce un polipéptido heterodimerizado que consiste en un primer polipéptido y un segundo polipéptido que tienen secuencias diferentes entre sí, los polipéptidos homodimerizados que consisten en solo dos primeros polipéptidos y el polipéptido homodimerizado que consiste en solo dos segundos polipéptidos se mezclan como impurezas. Se pueden utilizar tecnologías conocidas como método para eliminar eficazmente estos dos tipos de polipéptidos homodimerizados. Se ha informado de un método que puede purificar dos tipos de homodímeros y el anticuerpo heterodimerizado de interés mediante cromatografía de intercambio iónico, creando una diferencia en los puntos isoeléctricos mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos en las regiones variables de los dos tipos de cadenas H (documento WO 2007114325).

Con respecto a la alteración de aminoácidos para conferir diferencia en puntos isoeléctricos, la alteración de aminoácidos a introducir no está particularmente limitada siempre que se produzca una diferencia entre los puntos isoeléctricos de los dos polipéptidos de asociación, y también puede incluir alteraciones de aminoácidos realizadas para otros fines tales como para disminuir la inmunogenicidad. Los aminoácidos alterados son preferiblemente aminoácidos en posiciones con poca influencia sobre la actividad de unión hacia un receptor de Fcy. Además, puede ser una alteración de aminoácidos que aumenta la actividad de unión a un receptor de Fcy deseado. Para tales alteraciones, es preferible introducir al menos una mutación de aminoácido en una posición de aminoácido

, Tyr en la , Lys en la , Lys en la , Ser en la

, Pro en la posición 387, Asn en la posición 390, Val en la posición 397 y Val en la posición 422 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del primer polipéptido y/o el segundo polipéptido. Además, es preferible introducir una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Thr en la posición 139, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Glu en la posición 272, Lys en la posición 274, Lys en la posición 288, Lys en la posición 290, Leu en la posición 358, Lys en la posición 360, Gln en la posición 362, Ser en la posición 383, Asn en la posición 384, Gly en la posición 385, Gln en la posición 386, Asn en la posición 390, Val en la posición 397 y Val en la posición 422 (numeración EU). Además, es más preferible introducir una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Lys en la posición 274, Lys en la posición 288, Leu en la posición 358, Asn en la posición 384 y Val en la posición 397 (numeración EU).

De manera más específica, es preferible que una mutación se introduzca en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Ala en la posición 231, Glu en la posición 233, Leu en la posición 242, Val en la posición 263, Glu en la posición 272, Gly en la posición 316, Leu en la posición 358, Ser en la posición 364, Ser en la posición 383, Pro en la posición 387 y Val en la posición 397 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los polipéptidos del primer polipéptido y el segundo polipéptido; y preferiblemente se introduce una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Thr en la posición 139, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Tyr en la posición 198, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Lys en la posición 274, Tyr en la posición 278, Lys en la posición 288, Lys en la posición 290, Gly en la posición 316, Lys en la posición 317, Lys en la posición 320, Lys en la posición 324, Thr en la posición 335, Ser en la posición 337, Lys en la posición 338, Lys en la posición 340, Gly en la posición 341, Leu en la posición 358, Lys en la posición 360, Gln en la posición 362, Ser en la posición 383, Asn en la posición 384, Gly en la posición 385, Gln en la posición 386, Asn en la posición 390 y Val en la posición 422 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido. Además, es preferible que una mutación se introduzca en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Glu en la posición 272, Leu en la posición 358, Ser en la posición 383 y Val en la posición 397 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos; y preferiblemente se introduce una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Thr en la posición 139, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Lys en la posición 274, Lys en la posición 288, Lys en la posición 290, Leu en la posición 358, Lys en la posición 360, Gln en la posición 362, Ser en la posición 383, Asn en la posición 384, Gly en la posición 385, Gln en la posición 386, Asn en la posición 390 y Val en la posición 422 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido. Además, es más preferible que se introduzca una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Leu en la posición 358 y Val en la posición 397 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos; y que se introduzca una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Lys en la posición 274, Lys en la posición 288 y Asn en la posición 384 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido.

La alteración de aminoácidos no está particularmente limitada siempre que la alteración se realice para producir una diferencia en los puntos isoeléctricos entre los dos polipéptidos de asociación después de la alteración.

Los ejemplos de una alteración preferida para aumentar el punto isoeléctrico incluyen la sustitución del aminoácido en la posición 196 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 231 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 242 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 263 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 272 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 316 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 364 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 358 por Lys, la sustitución del aminoácido en la posición 383 por Lys, la sustitución del aminoácido de la posición 387 por Lys y la sustitución del aminoácido de la posición 397 por Lys (numeración EU). Los ejemplos de una alteración preferida para disminuir el punto isoeléctrico incluyen la sustitución del aminoácido en la posición 137 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 138 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 139 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 147 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 198 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 203 por Asp, la sustitución del aminoácido en la posición 214 por Thr, la sustitución del aminoácido en la posición 274 por Gln, la sustitución del aminoácido en la posición 278 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 288 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 290 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 316 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 317 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 320 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 324 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 335 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 337 por Asp, la sustitución del aminoácido en la posición 338 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 340 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 341 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 358 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 360 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 362 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 383 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 384 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 385 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 386 por Glu, la sustitución del aminoácido en la posición 390 por Glu y la sustitución del aminoácido en la posición 422 por Glu (numeración EU).

Cuando se combinan alteraciones de aminoácidos que se realizan con un fin diferente a producir una diferencia en los puntos isoeléctricos, por ejemplo, para reducir la antigenicidad, pueden combinarse la sustitución del aminoácido en la posición 138 por Ser, la sustitución del aminoácido en la posición 192 por Asn, la sustitución del aminoácido en la posición 193 por Phe y la sustitución del aminoácido en la posición 199 con Thr (numeración EU).

En este caso, "inmunogenicidad reducida" significa que un anticuerpo no provoca la producción de anticuerpos en cantidad suficiente para reducir la eficacia continua de la administración de anticuerpos en al menos la mayoría de los individuos que reciben el anticuerpo durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la eficacia terapéutica.

El nivel de inmunogenicidad en humanos puede predecirse utilizando el programa de predicción de unión de MHC de clase II Propred (http://www.imtech.res.in/raghava/propred) con un análisis del valor umbral del 1 % de todos los alelos. Otros programas que se pueden utilizar incluyen:

- Rankpep (http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html); y

- Epibase (software patentado de Algonomics: algonomics.com).

En comparación con la molécula donadora inicial, los polipéptidos con inmunogenicidad reducida no contienen péptidos que se predice que se unirán a alelos del MHC de clase II altamente expresados en la población diana o un número reducido de péptidos (Flower et al. (Drug Discov Today (2004) 9(2): 82-90)).

El análisis funcional de la unión del MHC de clase II se puede realizar generando péptidos solapantes que correspondan a la proteína de interés y probando su capacidad para evocar la activación de células T (ensayo de proliferación de células T) o reemplazando los péptidos con un péptido de unión al MHC de clase II conocido como péptido reportero (Hammer et al. (J. Exp. Med. (1994) 180: 2353-2358).

Hasta ahora, como método para purificar un anticuerpo heterodimerizado, se ha notificado un método que usa proteína A para purificar un anticuerpo heterodimerizado que comprende una cadena H de IgG2a de ratón que se une a la proteína A y una cadena H de IgG2b de rata que no se une a la proteína A (documentos WO 98050431 y WO 95033844).

Además, un anticuerpo heterodimerizado solo se puede purificar de manera eficaz utilizando cadenas H en las que los restos de aminoácidos en las posiciones 435 y 436 (numeración UE), que son el sitio de unión entre la IgG y la Proteína A, se sustituyen por aminoácidos tales como Tyr e His que tienen diferente afinidad por la Proteína A para cambiar la interacción entre cada una de las cadenas H y la Proteína A, y mediante el uso de una columna de Proteína A. Se pueden utilizar en combinación una pluralidad, por ejemplo, dos o más, de estas sustituciones y tecnologías. Además, cuando sea apropiado, estas alteraciones se pueden aplicar por separado al primer polipéptido y al segundo polipéptido. Los polipéptidos de la presente descripción pueden ser los producidos basándose en los polipéptidos a los que se han aplicado las alteraciones mencionadas anteriormente.

La presente descripción también proporciona un método para producir un polipéptido que comprende una región Fc, que comprende las etapas de heterodimerizar la región Fc introduciendo una mutación de aminoácido en el primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituye la región Fc, e introduciendo una mutación de aminoácido para alterar la función de la región Fc en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero.

Los ejemplos incluyen un método de producción que comprende las siguientes etapas de:

(a) en un polipéptido que comprende una región Fc, introducir una mutación de aminoácido en el primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituye la región Fc;

(b) determinar la función de la región Fc del heterodímero que consiste en el primer polipéptido y el segundo polipéptido en el que se introduce una mutación en la etapa (a); y

(c) seleccionar un polipéptido con la función de la región Fc alterada en comparación con el polipéptido precursor o en comparación con cuando la región Fc se homodimeriza mediante la introducción de la mutación de aminoácidos.

En este método de producción, después de la etapa (a), se puede realizar la siguiente etapa:

(d) presentar el polipéptido heterodimerizado que contiene la región Fc que consiste en el primer polipéptido y el segundo polipéptido en los ribosomas, fagos o levaduras presentados.

Se prefiere un método para producir un polipéptido que comprende una región Fc que comprende las etapas de:

(a) alterar un ácido nucleico que codifica el polipéptido de modo que la función de la región Fc se altere en comparación con el polipéptido precursor o en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero mediante la introducción de una mutación de aminoácidos;

(b) introducir el ácido nucleico en una célula hospedadora y cultivar la célula para expresar el polipéptido; y (c) recoger el polipéptido de un cultivo de células hospedadoras.

También se incluyen en la presente invención anticuerpos y moléculas de proteína de fusión de Fc producidas mediante el método de producción.

El tipo y variedad de mutaciones de aminoácidos introducidas por el presente método no están particularmente limitados, pero los ejemplos incluyen mutaciones de aminoácidos implicadas en la alteración de cada función de la región Fc descrita en el presente documento (más específicamente, las mutaciones de aminoácidos descritas específicamente en las tablas de los ejemplos).

La presente invención también proporciona un método para alterar la función de un polipéptido que comprende una región Fc, que comprende las etapas de heterodimerizar la región Fc mediante la introducción de una mutación de aminoácido en el primer polipéptido y/o el segundo polipéptido que constituyen la región Fc para alterar la función de la región Fc en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero mediante la introducción de la mutación de aminoácido.

Los ejemplos incluyen métodos de alteración que comprenden las siguientes etapas de:

En este método de alteración, después de la etapa (a), se puede realizar la siguiente etapa:

(d) presentar el polipéptido heterodimerizado que contiene la región Fc que consiste en el primer polipéptido y el segundo polipéptido presentado en ribosomas, fagos o levaduras.

Se prefiere un método para alterar un polipéptido que comprende una región Fc que comprende las etapas de:

También se incluyen en la presente invención anticuerpos y moléculas de proteína de fusión de Fc alteradas por el método de alteración.

Además, La presente descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que se caracterizan por estar compuestos por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido comprenden una región Fc introducida con mutaciones, en donde la función de la región Fc está alterada en comparación con un polipéptido que comprende una región Fc en la que no se han introducido mutaciones. Los ácidos nucleicos proporcionados pueden estar en cualquier forma, tal como ADN o ARN.

La presente descripción también proporciona vectores que portan los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El tipo de vector puede seleccionarse de manera apropiada por los expertos en la técnica dependiendo de las células hospedadoras en las que se va a introducir el vector. Los vectores incluyen, por ejemplo, los descritos anteriormente.

Además, la presente descripción se refiere a células hospedadoras transformadas con los vectores descritos anteriormente. Los expertos en la técnica pueden seleccionar las células hospedadoras apropiadas. Las células hospedadoras incluyen, por ejemplo, las descritas anteriormente.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el polipéptido de la presente invención.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular, además de los anticuerpos o moléculas de proteína de fusión de Fc, que son los polipéptidos de la presente invención, con vehículos farmacéuticamente aceptables mediante métodos conocidos. Por ejemplo, las composiciones se pueden usar por vía parenteral, cuando los anticuerpos o moléculas de proteína de fusión de Fc se formulan en una solución o suspensión estéril para inyección usando agua o cualquier otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las composiciones se pueden formular combinando de manera apropiada los anticuerpos o moléculas de proteína de fusión de Fc con vehículos o medios farmacológicamente aceptables, específicamente, agua esterilizada o solución salina fisiológica, aceites vegetales, emulsionantes, agentes de suspensión, tensioactivos, estabilizantes, agentes saporíferos, excipientes, vehículos, conservantes, agentes aglutinantes y similares, mezclándolos en una dosis unitaria y en la forma requerida por las implementaciones farmacéuticas generalmente aceptadas. Los ejemplos específicos de vehículos incluyen ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa de calcio, carmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicéridos de cadena media, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 60, sacarosa, carboximetilcelulosa, almidón de maíz, sal inorgánica y similares. El contenido del ingrediente activo en tal formulación se ajusta de modo que se pueda obtener una dosis apropiada dentro del intervalo requerido.

Se pueden formular composiciones estériles para inyección utilizando vehículos tales como agua destilada para inyección, según protocolos estándar.

Las soluciones acuosas utilizadas para inyección incluyen, por ejemplo, soluciones salinas fisiológicas e isotónicas que contienen glucosa u otros adyuvantes tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio. Estos pueden usarse junto con solubilizantes adecuados tales como alcohol, específicamente etanol, polialcoholes tales como propilenglicol y polietilenglicol, y tensioactivos no iónicos tales como Polysorbate 80™ y HCO-50.

Los aceites incluyen aceites de sésamo y aceites de soja, y se pueden combinar con solubilizantes tales como benzoato de bencilo o alcohol bencílico. Estos también se pueden formular con tampones, por ejemplo, tampones de fosfato o tampones de acetato de sodio; analgésicos, por ejemplo, hidrocloruro de procaína; estabilizantes, por ejemplo, alcohol bencílico o fenol; o antioxidantes. Las inyecciones preparadas normalmente se dividen en alícuotas en ampollas apropiadas.

La administración se lleva a cabo preferiblemente por vía parenteral y, específicamente, incluye inyección, administración intranasal, administración intrapulmonar y administración percutánea. Por ejemplo, se pueden administrar inyecciones de forma sistémica o local mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal o inyección subcutánea.

Además, el método de administración puede seleccionarse de manera apropiada de acuerdo con la edad y los síntomas del paciente. Puede seleccionarse una dosis única de la composición farmacéutica que contiene un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido, por ejemplo, desde el intervalo de 0,0001 a 1.000 mg por kg de peso corporal. Como alternativa, la dosis puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 a 100.000 mg/paciente. Sin embargo, la dosis no se limita a estos valores. La dosis y el método de administración varían dependiendo del peso corporal, edad y síntomas del paciente, y los expertos en la técnica pueden seleccionarlos de manera apropiada.

En la presente descripción, las composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos proporcionados descritos anteriormente son útiles como ingredientes activos para agentes terapéuticos o agentes preventivos para cánceres, enfermedades inflamatorias inmunitarias y similares.

Como se emplean en esta memoria, los códigos de tres letras y de una sola letra para los respectivos aminoácidos son los siguientes:

Alanina: Ala (A)

Arginina: Arg (R)

Asparagina: Asn (N)

Ácido aspártico: Asp (D)

Cisteína: Cys (C)

Glutamina: Gln (Q)

Ácido glutámico: Glu (E)

Glicina: Gly (G)

Histidina: His (H)

Isoleucina: Ile (I)

Leucina: Leu (L)

Lisina: Lys (K)

Metionina: Met (M)

Fenilalanina: Phe (F)

Prolina: Pro (P)

Serina: Ser (S)

Treonina: Thr (T)

Triptófano: Trp (W)

Tirosina: Tyr (Y)

Valina: Val (V)

Ejemplos

A continuación en la presente memoria, la presente invención se describirá adicionalmente de forma específica con referencia a los ejemplos, pero no debe considerarse limitada a los mismos.

[Ejemplo 1] Explicación del concepto de mejora del reconocimiento de FcyR por anticuerpos heterodimerizados

Un anticuerpo interacciona a través de su región Fc con diversas moléculas tales como FcRn, FcyR y complementos. Una sola molécula de FcRn, que es un ligando de Fc, se une a cada una de las cadenas pesadas (cadenas H) de un anticuerpo. Por tanto, dos moléculas de FcRn se unen a una única molécula de anticuerpo (Fig. 1). In vivo, FcRn se expresa en la membrana celular. Por tanto, un anticuerpo reconoce dos moléculas de FcRn de manera simétrica a través de los sitios idénticos en sus respectivas cadenas H in vivo (Nature, 372: 379-383, 1994). Además, de manera similar a la relación entre IgG y FcRn, una sola molécula de IgA, que pertenece a la misma familia de inmunoglobulinas que IgG, reconoce de manera simétrica dos moléculas de FcaR, que es un receptor de IgA (Fig. 2) (Nature, 423: 614-620, 2003).

Sin embargo, a diferencia de FcRn y otros, solo una molécula de FcyR se une a una molécula de un anticuerpo (Fig. 3) (JBC, 276: 16469-16477, 2001). IgG reconoce FcyR a través de los dominios CH2 de las dos cadenas H; sin embargo, los sitios de interacción de FcyR son diferentes entre las dos cadenas H. Por ejemplo, cuando la cadena H que se muestra en el lado izquierdo de la Fig. 3 se define como cadena H^ay la del lado derecho como cadena H^b, Ala en la posición 327 (numeración EU) en cada una de las cadenas H^ay H^binteracciona con FcyR. Sin embargo, existe una diferencia entre las propiedades de los restos asociados con los que interaccionan las respectivas cadenas H (Fig.

4). La cadena H^ainteracciona con FcyRIII de manera hidrófoba en el Trp de las posiciones 87 y 110 (numeración EU), mientras que la cadena H^binteracciona con FcyRIII en la His de la posición 131 (numeración EU). Por lo tanto, cuando la Ala en la posición 327 (numeración UE) se sustituye por un aminoácido altamente hidrófobo tal como Trp, puede reducir la actividad de unión a FcyR de la cadena H^baunque tenga el efecto de mejorar la actividad de unión a FcyR de la cadena H^a. Por tanto, es necesario considerar el efecto asimétrico de las dos cadenas H en FcyR para optimizar la interacción de la región Fc de IgG con FcyR por alteración de aminoácidos. Sin embargo, en la técnica anterior, se ha introducido la misma alteración en las dos cadenas H para optimizar la interacción de la región Fc de IgG con FcyR (documentos WO 2006/019447 y WO 2000/042072). Sin embargo, al considerar la interacción asimétrica de la región Fc de IgG con FcyR, la interacción entre IgG y FcyR se puede optimizar más finamente introduciendo diferentes alteraciones en las cadenas H. Es decir, la interacción con FcyR se puede optimizar más finamente utilizando un anticuerpo heterodimerizado resultante de la introducción de diferentes alteraciones en las dos cadenas H para optimizar la interacción de la región Fc con FcyR en comparación con un anticuerpo homodimerizado resultante de la introducción de la misma alteración en las cadenas H, que se ha realizado en la técnica anterior.

[Ejemplo 2] Prueba del concepto de mejora del reconocimiento de FcyR por anticuerpos heterodimerizados

Se evaluó si la actividad de unión a FcyR de un anticuerpo se puede optimizar más finamente usando un anticuerpo heterodimerizado introducido con diferentes alteraciones en las dos cadenas H en comparación con un anticuerpo homodimerizado de la técnica anterior.

Convencionalmente, se han buscado alteraciones que potencian la unión a FcyR usando un anticuerpo homodimerizado resultante de la introducción de la misma alteración en las dos cadenas H de un anticuerpo. Sin embargo, como se describe en el Ejemplo 1, un anticuerpo interacciona con FcyR de manera asimétrica y, cuando se introduce la misma alteración en las dos cadenas H, la alteración en una cadena H podría potenciar la actividad de unión a FcyR, mientras que la alteración en la otra cadena H podría inhibir la unión. La actividad de unión a FcyR no aumenta necesariamente en un anticuerpo homodimerizado resultante de la introducción de dicha alteración en las dos cadenas H. Sin embargo, un anticuerpo heterodimerizado resultante de la introducción de la alteración en solo una de las dos cadenas H puede tener una actividad de unión a FcyR aumentada.

Para probar esta hipótesis, con respecto a la unión de FcyR, un anticuerpo heterodimerizado que comprende un primer polipéptido en el que solo se ha introducido una cadena H con una alteración que se cree que altera la actividad de unión a FcyR y un segundo polipéptido sin la alteración anterior se comparó con un anticuerpo homodimerizado que comprende el primer polipéptido en el que solo se ha introducido una cadena H con la alteración que se cree que altera la actividad de unión a FcyR. Basándose en el concepto anterior, cuando la actividad de unión a FcyR aumenta por la alteración, el anticuerpo homodimerizado es siempre superior al anticuerpo heterodimerizado. Sin embargo, si un anticuerpo Fc reconoce FcyR de manera asimétrica, es de esperar que el anticuerpo heterodimerizado muestre una mayor actividad de unión a FcyR que el anticuerpo homodimerizado dependiendo del tipo de alteración.

La región variable de la cadena H de un anticuerpo usada fue la región variable de un anticuerpo anti-glipican-3 que contiene CDR de pH7 del anticuerpo anti-glipican-3 con cinética mejorada en plasma, descrito en el documento WO 2009/041062. La región variable se denomina GpH7 (SEQ ID NO: 1). Las regiones constantes de las cadenas H del anticuerpo descritas a continuación se utilizaron en combinación con GpH7. Cuando la región constante de cadena H de un anticuerpo se denomina H1, la secuencia de la cadena H del anticuerpo que tiene la región variable GpH7 se denomina GpH7-H1. Las alteraciones de aminoácidos se indican de una manera tal como D356K. La primera letra alfabética (por ejemplo, "D" de D356K) es un código de una letra que representa el resto de aminoácido antes de la alteración, y el siguiente número (por ejemplo, "356" de D356K) indica la posición de la alteración (numeración EU). La última letra alfabética (por ejemplo, "K" de D356K) es un código de una letra que representa el resto de aminoácido después de la alteración. Se prepararon GpH7-Gld (SEQ ID NO: 2) resultante de la eliminación de Gly y Lys C-terminal de una lgG1 que tiene la región variable GpH7; GpH7-A5 (SEQ ID NO: 3) resultante de la introducción de las mutaciones D356K y H435R en GpH7-Gld; y GpH7-B3 (SEQ ID NO: 4) resultante de la introducción de K439E en GpH7-Gld de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Las mutaciones D356K y K439E se introdujeron en cada cadena H para permitir la formación eficaz del heterodímero de las respectivas cadenas H cuando se produjo un anticuerpo heterodimerizado que comprendía dos tipos de cadenas H (documento WO 2006/106905). H435R, que es una alteración que inhibe la unión de la Proteína A, se introdujo para permitir la separación eficaz de las formas heterodimerizada y homodimerizada (véanse los ejemplos de referencia 3, 4 y 5). Al mismo tiempo, la cadena L de anticuerpo usada fue GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5), que es la cadena L del anticuerpo glipican-3 con cinética mejorada en plasma descrita en el documento WO 2009/041062.

Se introdujeron mutaciones para demostrar el concepto del anticuerpo heterodimerizado en los polipéptidos precursores GpH7-A5 y GpH7-B3 para construir variantes modificadas, y se evaluaron las variantes. Los vectores de expresión construidos se utilizaron para transfectar células FreeStyle293 (Invitrogen) de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos expresados se purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Al expresar un anticuerpo homodimerizado, se usó un vector de expresión insertado con la cadena L del anticuerpo GpL16-k0 junto con un vector de expresión insertado con un tipo de secuencia de la cadena H del anticuerpo. Cuando se expresó un anticuerpo heterodimerizado, se usaron un vector de expresión en el que se había insertado la cadena L del anticuerpo GpL16-k0, utilizado para el anticuerpo homodimerizado anterior, y un vector de expresión en el que se había insertado una secuencia resultante de la introducción de una alteración adicional en GpH7-A5 que tiene la alteración D356K como una cadena H del anticuerpo, y un vector de expresión en el que se había insertado una secuencia resultante de la introducción de una alteración adicional en GpH7-B3 que tiene la alteración K439E como la otra cadena H del anticuerpo, para conseguir una expresión eficaz del anticuerpo heterodimerizado. El anticuerpo expresado y purificado se denomina, por ejemplo, GpH7-H1/GpH7-H2/GpL16-k0, cuando el vector de expresión utilizado para expresar una cadena H de anticuerpo del anticuerpo heterodimerizado es GpH7-H1, el vector de expresión para la otra cadena H del anticuerpo es GpH7-H2 y el vector de expresión para la cadena L del anticuerpo es GpL16-k0. En este sistema, una secuencia introducida con las alteraciones D356K y H435R corresponde a H1, y una secuencia introducida con la alteración K439E corresponde a H2. Por ejemplo, cuando los vectores de expresión utilizados para expresar la cadena H y la cadena L del anticuerpo de un anticuerpo homodimerizado son respectivamente GpH7-H1 y GpL16-k0, el anticuerpo homodimerizado se denomina GpH7-H1/GpL16-k0. Los anticuerpos preparados se usaron para medir la actividad de unión a FcyR mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2.

En primer lugar, se evaluó si las alteraciones D356K y H435R introducidas en GpH7-A5, y la alteración K439E introducida en GpH7-B3 para formar y purificar heterodímeros tenían un efecto sobre la actividad de unión a FcyR en comparación con la IgG nativa. Como control, GpH7-G1d/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 2 y 5, respectivamente) se expresó utilizando plásmidos insertados con GpH7-Gld y GpL16-k0 como cadena H y cadena L del anticuerpo, respectivamente, y se purificaron según el método del Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, se prepararon el anticuerpo homodimerizado GpH7-A5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se introdujeron D356K y H435R, el anticuerpo homodimerizado GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se introdujo K439E y el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente) en el que en una de las cadenas H se introdujeron D356K y H435R y en la otra K439E. Estos anticuerpos y su actividad de unión a cada FcyR se compararon de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2, y el resultado se resume en la Fig. 5.

El resultado de la medición mostró que no había diferencia significativa en la actividad de unión a cada FcyR entre GpH7-G1d/GpL16-k0 y GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Además, con respecto a cada FcyR, GpH7-A5/GpL16-k0 y GpH7-B3/GpL16-k0 retuvieron al menos aproximadamente el 80 % de la actividad de unión de GpH7-G1d/GpL16-k0. Basándose en el resultado anterior, se determinó que la unión a FcyR de GpH7-AS/GpH7-B3/GpL16-k0, GpH7-A5/GpL16-k0 y GpH7-B3/GpL16-k0 no se había reducido significativamente en comparación con GpH7-G1d/GpL16-k0 y, por lo tanto, las variantes resultantes de la introducción de mutaciones en cada cadena H de estos anticuerpos se pueden comparar para determinar la actividad de unión a cada FcyR.

A continuación, se construyó GpH7-A26 (SEQ ID NO: 6) resultante de la introducción de la mutación G237A en GpH7-A5 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando GpL16-k0 como cadena L y GpH7-A26 y GpH7-B3 como cadena H, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEC ID NO: 6, 4 y 5, respectivamente) en el que solo se había introducido G237A en una de las cadenas H se expresó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, utilizando GpH7-A26 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A26/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 6 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido G237A, se expresó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la actividad de unión de estos anticuerpos a cada FcyR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 6). El resultado mostró que el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0 tenía actividades de unión aumentadas a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A26/GpL16-k0 en el que se introdujo la misma alteración en ambas cadenas H tenía actividades de unión reducidas a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estos resultados demuestran que, G237A es una alteración que aumenta las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en una sola cadena H, mientras que reduce las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introducen en las dos cadenas H.

A continuación, GpH7-A29 (SEQ ID NO: 7) resultante de la introducción de la mutación G237L en GpH7-A5 se construyó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando GpL16-k0 como cadena L y GpH7-A29 y GpH7-B3 como cadena H, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEC ID NO: 7, 4 y 5, respectivamente) en el que solo se había introducido G237L en una de las cadenas H se expresó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, utilizando GpH7-A29 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A29/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 7 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido G237L, se expresó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Estos anticuerpos y sus actividades de unión a cada FcyR se evaluaron según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 7). El anticuerpo heterodimerizado GpH7-A29/GpH7-B3/GpL16-k0 había aumentado las actividades de unión a FcYRIIa R y de unión a FcyRII en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A29/GpL16-k0 cuyas dos cadenas H tenían la misma alteración tenía una actividad de unión reducida a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estos resultados demuestran que, G237L es una alteración que tiene el efecto de aumentar las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en una sola cadena H, mientras que reduce las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en las dos cadenas H.

A continuación, GpH7-A42 (SEQ ID NO: 8) resultante de la introducción de la mutación L328E en GpH7-A5 se construyó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando GpL16-k0 como cadena L y GpH7-A42 y GpH7-B3 como cadena H, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEC ID NO: 8, 4 y 5, respectivamente) en el que solo se había introducido L328E en una de las cadenas H se expresó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, utilizando GpH7-A42 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L, se expresó el anticuerpo homodimerizado GpH7-A42/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 8 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido L328E según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la actividad de unión de estos anticuerpos a cada FcyR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 8). El anticuerpo heterodimerizado GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0 tenía una actividad de unión aumentada a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A42/GpL16-k0 en cuyas dos cadenas H se había introducido la misma alteración tenían una actividad de unión a FcYRIIa R reducida y una actividad de unión a FcYRIIb aumentada en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0; sin embargo, el grado de aumento fue mayor en GpH7-A42/GpH7-B3/GpL16-k0, en el que solo en una de las cadenas H se había introducido L328E. Estos resultados demuestran que L328E es una alteración que es más eficaz para aumentar las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en una sola cadena H en comparación a cuando se introduce en las dos cadenas H.

A continuación, GpH7-A43 (SEQ ID NO: 9) resultante de la introducción de la mutación L328D en GpH7-A5 se construyó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando GpL16-k0 como cadena L y GpH7-A43 y GpH7-B3 como cadena H, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEC ID NO: 9, 4 y 5, respectivamente) en el que solo se había introducido L328D en una de las cadenas H se expresó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, utilizando GpH7-A43 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A43/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 9 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido L328D, se expresó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la actividad de unión de estos anticuerpos a cada FcyR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 9). El anticuerpo heterodimerizado GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0 tenía una actividad de unión aumentada a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, el anticuerpo homodimerizado GpH7-A43/GpL16-k0 en cuyas dos cadenas H se introdujo la misma alteración tenía una actividad de unión a FcYRIIa R reducida y una actividad de unión a FcyRII aumentada en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0; sin embargo, el grado de aumento fue mayor en GpH7-A43/GpH7-B3/GpL16-k0, en el que solo en una de las cadenas H se había introducido L328D. Estos resultados demuestran que L328D es una alteración que es más eficaz para aumentar las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en una sola cadena H en comparación a cuando se introduce en las dos cadenas H.

A continuación, GpH7-B16 (SEQ ID NO: 10) resultante de la introducción de la mutación L234E en GpH7-B3 se construyó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando GpL16-k0 como cadena L y GpH7-A5 y GpH7-B16 como cadena H, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0 (SEC ID NO: 3, 10 y 5, respectivamente) en el que solo se había introducido L234E en una de las cadenas H se expresó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, utilizando GpH7-B16 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L, el anticuerpo homodimerizado GpH7-B16/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 10 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido L234E, se expresó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la actividad de unión de estos anticuerpos a cada FcyR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 10). El anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B16/GpL16-k0 tenía actividades de unión aumentadas a FcYRIIIa F y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, el anticuerpo homodimerizado GpH7-B16/GpL16-k0 en cuyas dos cadenas H se había introducido la misma alteración tenía actividades de unión reducidas a FcYRIIIa F y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estos resultados demuestran que L234E es una alteración que es eficaz para aumentar las actividades de unión a FcYRIIIa F y FcYRIIb cuando se introduce en una sola cadena H, mientras que reduce las actividades de unión a FcYRIIIa F y FcYRIIb cuando se introduce en las dos cadenas H.

A continuación, GpH7-B17 (SEQ ID NO: 11) resultante de la introducción de la mutación L234D en GpH7-B3 se construyó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando GGpL16-k0 como cadena L y GpH7-A5 y GpH7-B17 como cadena H, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 (SEC ID NO: 3, 11 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido L234D se expresó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Del mismo modo, utilizando GpH7-B17 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L, el anticuerpo homodimerizado GpH7-B17/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 11 y 5, respectivamente) en cuyas dos cadenas H se había introducido L234D, se expresó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la actividad de unión de estos anticuerpos a cada FcyR de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 11). El anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B17/GpL16-k0 tenía una actividad de unión aumentada a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, el anticuerpo homodimerizado GpH7-B17/GpL16-k0 en cuyas dos cadenas H se había introducido la misma alteración tenía actividades de unión reducidas a FcYRIIa R y FcYRIIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estos resultados demuestran que L234D es una alteración que es eficaz para aumentar las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en una sola cadena H, mientras que reduce las actividades de unión a FcYRIIa R y FcYRIIb cuando se introduce en las dos cadenas H.

Los hallazgos anteriores demuestran que, incluso si un anticuerpo homodimerizado en cuyas dos cadenas H se ha introducido la misma alteración presenta una actividad de unión a FcyR reducida, es posible aumentar la actividad de unión a FcyR construyendo un anticuerpo heterodimerizado en el que solo se ha introducido la alteración en una de las cadenas H.

Por tanto, los hallazgos anteriores demuestran que se puede proporcionar una propiedad superior de unión a FcyR de un dominio Fc de anticuerpo utilizando un anticuerpo heterodimerizado en cuyas dos cadenas H se han introducido diferentes alteraciones, en comparación con un anticuerpo homodimerizado preparado mediante un método convencional para introducir la misma alteración en las dos cadenas H.

[Ejemplo 3] Confirmación de la dirección del reconocimiento de FcyR de anticuerpos heterodimerizados

Como se muestra en el Ejemplo 2, se demostró que, usando anticuerpos heterodimerizados, se puede conseguir una mayor actividad de unión a FcyR en comparación con los anticuerpos homodimerizados. Cuando se introdujeron las alteraciones descritas en el Ejemplo 2 en las dos cadenas H de un anticuerpo, la actividad de unión a FcyR se redujo bastante en comparación con el anticuerpo natural. Este hallazgo sugiere que dicha alteración da como resultado un aumento en la actividad de unión a FcyR cuando se introduce en una cadena H de un anticuerpo heterodimerizado; sin embargo, cuando la mutación se introduce en las dos cadenas H, tras la unión a FcyR, el resto después de la alteración aumenta la unión en una cadena, mientras que inhibe la interacción con FcyR en la otra cadena. En la presente memoria, el estado en el que FcyR se une en la dirección desde el lado de profundidad de la Fig. 3 se define como "unión en la dirección X", mientras que de manera opuesta, la unión desde la parte frontal se define como "unión en dirección Y". Se especuló que en el anticuerpo heterodimerizado solo se altera la dirección X o la dirección Y de las actividades de unión a FcyR, mientras que en el anticuerpo homodimerizado, se alteran de la misma manera las actividades de unión a FcyR en la dirección X y la dirección Y.

Para demostrar la hipótesis experimentalmente, los presentes inventores encontraron alteraciones que inhiben principalmente la unión a FcyR solo en la dirección X o en la dirección Y, e introdujeron tal alteración en una de las cadenas H, e introdujeron en la misma o en la otra cadena H una alteración que potencia la actividad de unión a FcyR, para verificar la inhibición de la actividad de unión a FcyR. Los presentes inventores se propusieron encontrar un método para usar en combinación con la alteración anterior. Se buscó información conformacional para alteraciones que estén involucradas en la unión a FcyR de un anticuerpo, pero que solo están involucradas en la unión en una sola de las cadenas H. Como resultado, se encontró P329 como candidato. P329 en la cadena H^aforma un núcleo hidrófobo con Trp en las posiciones 87 y 110 en FcyRIII, mientras que P329 en la cadena H^bno interacciona directamente con FcyRIII (Nature, 372: 379-383, 1994) (Fig. 12). Por ejemplo, se pensó que la sustitución de P329 de la cadena H^Apor un resto cargado eléctricamente provoca el colapso del núcleo hidrófobo y da como resultado la inhibición de la unión en la dirección X que se muestra en la Fig. 12; sin embargo, se predijo que no hay un impacto significativo en la unión en la dirección Y, porque P329 de la cadena H^B, que no está involucrado en la unión en la dirección Y en el otro lado, permanece sin sustituir.

Se introdujeron mutaciones, R, K, D y E con carga eléctrica, en GpH7-B3 en P329 para producir, respectivamente, las secuencias GpH7-B12, GpH7-B13, GpH7-B14 y GpH7-B15 (SEC ID NO: 12 a 15), y se construyeron vectores de expresión en los que se insertaron estas secuencias mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los vectores de expresión construidos se combinaron cada uno con GpH7-A5 y GpL16-k0 para expresar anticuerpos heterodimerizados, o se combinaron con GpL16-k0 solo pero no con otras cadenas H para expresar anticuerpos homodimerizados. Estos anticuerpos se expresaron y purificaron de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos purificados resultantes son los siguientes: los anticuerpos heterodimerizados GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0, GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0 y GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0; y los anticuerpos homodimerizados GpH7-B12/GpL16-k0, GpH7-B13/GpL16-k0, GpH7-B14/GpL16-k0 y GpH7-B15/GpL16-k0. Los anticuerpos preparados se utilizaron para evaluar la actividad de unión a cada FcyR mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. El resultado se muestra en la Fig. 13.

La actividad de unión a FcyR de GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 y GpH7-A5/GpH7-B13/GpL16-k0, que son anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido P329R y P329K, respectivamente, fue aproximadamente de 1/5 a 1/4 de la actividad de unión a cada FcyR de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, no se observó la unión a FcyR para los anticuerpos homodimerizados GpH7-B12/GpL16-k0 y GpH7-B13/GpL16-k0. Por otro lado, en cuanto a FcYRIa, la actividad de unión a FcyR de GpH7-A5/GpH7-B14/GpL16-k0 y GpH7-A5/GpH7-B15/GpL16-k0, que son los anticuerpos heterodimerizados en los que se había introducido P329D y P329E, respectivamente, fue de aproximadamente 1/5 a 1/4 de la actividad de unión a cada FcyR de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0; en cuanto a FcyR distintos de FcYRIa, retuvieron el 50 % o más de la actividad de unión. Los anticuerpos homodimerizados GpH7-B14/GpL16-k0 y GpH7-B15/GpL16-k0 solo retuvieron la actividad de unión a FcYRIa, y la actividad fue 1/5 o menos de la actividad de unión a FcYRIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. En GpH7-B12 y GpH7-B13 se introducen restos básicos, mientras que en GpH7-B14 y GpH7-B15 se introducen restos ácidos. Por tanto, se pensó que la actividad de unión a FcyR se inhibe más fuertemente sustituyendo P329 por un resto básico tal como Arg y Lys. El resultado que muestra que la actividad de unión a FcyR se mantenía cuando se introducía una alteración en una sola cadena H, mientras que la unión era casi indetectable cuando se introducía la misma alteración en las dos cadenas H, apoya la hipótesis de que la sustitución de P329 por un resto hidrófilo en una cadena H inhibe la unión en una dirección aunque se conserva la unión en la otra dirección.

A continuación, se evaluó si las mutaciones G237A y L234D que potencian la actividad de unión a FcyR por heterodimerización, que se encontraron como se describe en el Ejemplo 2, potencian la interacción con FcyR exclusivamente en una dirección, comparando la actividad de unión a cada FcyR de cada variante que se había preparado de forma que tenía la alteración P329R en combinación con las alteraciones anteriores. Se construyeron vectores de expresión en los que se habían insertado GpH7-B12 (SEQ ID NO: 12) resultantes de la introducción de la mutación P329R en GpH7-B3 de manera que P329R se introduce en la misma cadena H que K439E; GpH7-A48 (SEQ ID NO: 16) resultante de la introducción de la mutación P329R en GpH7-A5 de manera que P329R se introduce en la misma cadena H que D356K y H435R; GpH7-A45 (SEQ ID NO: 17) resultante de la introducción de las mutaciones G237A y P329R en GpH7-A5; y GpH7-B41 (SEQ ID NO: 18) resultante de la introducción de las mutaciones L234D y P329R en GpH7-B5, mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando estos vectores de expresión y el vector de expresión GpL16-k0 correspondiente a una cadena L de anticuerpo, los anticuerpos se expresaron de tal manera que P329R y G237A o L234D se introducen únicamente en una de las cadenas H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 (Tabla 1).

T l 1

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de las regiones constantes de la cadena H de los respectivos anticuerpos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-'': cuando no hay una mutación particular). También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

La combinación de G237A y P329R se evaluó utilizando GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como polipéptido para la introducción de alteraciones; GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 y GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 como variantes en las que se ha introducido P329R en una de las cadenas H; GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0 como variante en la que G237A se ha introducido en la misma cadena que P329R; y GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0 como variante en la que G237A se ha introducido en la otra cadena distinta de la cadena en la que se ha introducido P329R. Se compararon en cuanto a la actividad de unión a cada FcyR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Fig. 14).

Cuando se comparó GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 en el que se había introducido P329R en una de las cadenas H con GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0, no se observaron diferencias significativas en el patrón de unión a FcyR. Por tanto, se pensó que P329R no tiene influencia sobre la unión de FcyR incluso cuando se introduce en una cadena H en la que se han introducido D356K y H435R o cuando se introduce en una cadena H en la que se ha introducido K439E.

Por otro lado, GpH7-A26/GpH7-B3/GpL16-k0, que es un anticuerpo heterodimerizado en el que se ha introducido G237A solo en una de las cadenas H, mostró una unión potenciada a FcYRIIa R y IIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Sin embargo, en comparación con GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 en el que se ha introducido P329R solo en una de las cadenas H, GpH7-A26/GpH7-B12/GpL16-k0 en el que se ha introducido G237A en la otra cadena H presentó una unión a FcyR reducida y, por lo tanto, no se observó el efecto de G237A para potenciar la unión a FcYRIIa R y IIb. Al mismo tiempo, en comparación con GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se había introducido P329R solo en una de las cadenas H, GpH7-A45/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se había introducido G237A en la misma cadena H que P329R mostró una unión potenciada a FcYRIIa R y IIb y, por lo tanto, se observó el efecto de G237A para mejorar la unión a FcYRIIa R y IIb. Como la unión entre el anticuerpo y FcyR se inhibía fuertemente cuando G237A se introducía en la cadena distinta de la cadena en la que se había introducido P329R, los resultados anteriores muestran que, cuando G237A introducido en GpH7-A5 se combina con P329R introducido en GpH7-B3, reconocen la unión entre el anticuerpo y FcyR en la misma dirección.

La alteración L234D también se evaluó de la misma manera (Fig. 15). GpH7-A5/GpH7-B 17/GpL16-k0, que es un anticuerpo heterodimerizado en el que se ha introducido L234D solo en una de las cadenas H, mostró una unión potenciada a FcYRIIa R y IIb en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Sin embargo, en comparación con GpH7-A48/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se había introducido P329R solo en una de las cadenas H, GpH7-A48/GpH7-B17/GpL16-k0 en el que se había introducido L234D en la otra cadena H, presentó una unión reducida a FcyR distinta de FcYRIa; y, por lo tanto, no se observó el efecto de L234D para potenciar la unión a FcYRIIa R y IIb. Al mismo tiempo, en comparación con GpH7-A5/GpH7-B12/GpL16-k0 en el que se ha introducido P329R solo en una de las cadenas H, GpH7-A5/GpH7-B41/GpL16-k0 en el que se había introducido L234D en la misma cadena H que P329R, mostró una unión potenciada a FcYRIIa R y IIb; y, por lo tanto, se observó el efecto de L234D para potenciar la unión a FcYRIIa R y Ilb. Como la unión entre el anticuerpo y FcyR se inhibía fuertemente cuando L234D se introducía en la cadena distinta de la cadena en la que se había introducido P329R, los resultados anteriores muestran que, cuando L234D introducido en GpH7-B3 se combina con P329R introducido en GpH7-A5, reconocen la unión entre el anticuerpo y FcyR en la misma dirección.

Es decir, tanto G237A como L234D aumentan (/reducen) la actividad de unión a FcyR de un anticuerpo en la misma dirección que P329R.

De este modo, la hetero-alteración potenciaba la unión a FcyR exclusivamente en la dirección X o en la dirección Y. Este hallazgo demuestra que la interacción con FcyR se potencia de forma asimétrica en los anticuerpos heterodimerizados.

[Ejemplo 4] Comparación de la unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado con la del anticuerpo homodimerizado

Como se describe en el Ejemplo 2, los presentes inventores revelaron que la unión de FcyR de un anticuerpo a través de su dominio Fc se puede potenciar introduciendo diferentes alteraciones en las dos cadenas H de un anticuerpo en lugar de introducir la misma alteración en las dos cadenas H. Por tanto, para descubrir alteraciones con tal propiedad, los presentes inventores llevaron a cabo el experimento que se describe a continuación.

Para construir variantes de GpH7-B3, los aminoácidos que se cree que están implicados en la unión a FcyR y los aminoácidos que los rodean en GpH7-B3 (SEQ ID NO: 4) construido como se describe en el Ejemplo 2, específicamente, Leu en la posición 234 (numeración EU), Leu en la posición 235 (numeración EU), Gly en la posición 236 (numeración EU), Gly en la posición 237 (numeración EU), Pro en la posición 238 (numeración EU), Ser en la posición 329 (numeración EU), Asp en la posición 265 (numeración EU), Val en la posición 266 (numeración EU), Ser en la posición 267 (numeración EU), His en la posición 268 (numeración EU), Glu en la posición 269 (numeración EU), Asp en la posición 270 (numeración EU), Pro en la posición 271 (numeración EU), Gln en la posición 295 (numeración EU), Tyr en la posición 296 (numeración EU), Ser en la posición 298 (numeración EU), Tyr en la posición 300 (numeración EU), Ser en la posición 324 (numeración EU), Asn en la posición 325 (numeración EU), Lys en la posición 326 (numeración EU), Ala en la posición 327 (numeración EU), Leu en la posición 328 (numeración EU), Pro en la posición 329 (numeración EU), Ala en la posición 330 (numeración EU), Pro en la posición 331 (numeración EU), Ile en la posición 332 (numeración EU), Glu en la posición 333 (numeración EU), Lys en la posición 334 (numeración EU), Thr en la posición 335 (numeración EU), Ile en la posición 336 (numeración EU) y Ser en la posición 337 (numeración EU) se sustituyeron, cada uno, por 18 tipos de aminoácidos excluyendo el aminoácido original y la cisteína. Cada variante de GpH7-B3 se denominó "A_B", donde A representa la información sobre el tipo de aminoácido indicado por el código de una letra y la numeración UE del resto alterado, y B indica la información sobre el aminoácido después de la sustitución. Por ejemplo, cuando la Leu en la posición 234 (numeración EU) se sustituye por Gly, la B3_variante se llama L234_01G. Con fines descriptivos, en la información sobre el aminoácido después de la sustitución, se añade un número específico para el aminoácido antes de cada código de una letra. Específicamente, los símbolos utilizados son los siguientes: 01G para Gly; 02A para Ala; 03V para Val, 04F para Phe; 05P para Pro; 06M para Met; 071 para Ile; 08L para Leu; 09D para Asp; 10E para Glu; 11K para Lys; 12R para Arg; 13S para Ser; 14T para Thr; 15Y para Tyr; 16H para His; 18N para Asn; 19Q para Gln; y 20W para Trp.

Se prepararon anticuerpos homodimerizados en los que en las dos cadenas H se había introducido una mutación mediante el siguiente procedimiento. Los anticuerpos se expresaron usando una variante de GpH7-B3 como cadena H y GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5) como cadena L. Los anticuerpos se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos homodimerizados en los que se ha introducido una mutación en las dos cadenas H preparados de esta manera se denominan Ab Ho.

Se prepararon anticuerpos heterodimerizados en los que en una sola cadena H se había introducido una mutación mediante el siguiente procedimiento. Los anticuerpos se expresaron usando una variante de GpH7-B3 y GpH7-A5 (SEQ ID NO: 3) como cadena H y GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5) como cadena L. Los anticuerpos se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos heterodimerizados en los que se ha introducido una mutación en solo una de las cadenas H preparados de esta manera se denominan Ab He.

Como anticuerpo homodimerizado de control, se preparó GpH7-B3/GpL16-k0 usando GpH7-B3 (SEQ ID NO: 4) como cadena H y GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5) como cadena L según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Este anticuerpo de control homodimerizado se denomina Ab HoCon. Como se evaluó en el Ejemplo 2, la actividad de unión de Ab HoCon a cada FcyR no se altera significativamente en comparación con la IgG 1 nativa.

Como anticuerpo heterodimerizado de control, se preparó GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 utilizando GpH7-A5 (SEQ ID NO: 3) y GpH7-B3 (SEQ ID NO: 4) como cadena H y GpL16-k0 (SEQ ID NO: 5) como cadena L según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Este anticuerpo heterodimerizado de control se denomina Ab HeCon. Como se evaluó en el Ejemplo 2, la actividad de unión de Ab HeCon a cada FcyR no se alteró significativamente en comparación con la IgG1 nativa.

En los Ab Ho, Ab He, Ab HeCon y Ab HoCon se ensayó la actividad de unión a FcYRIa, FcYRIIa(R), FcYRIIa(H), FcYRIIb y FcYRIIIa según el método descrito en el Ejemplo de referencia 2. En cuanto al resultado del ensayo para cada FcyR, se trazó un gráfico mediante el siguiente procedimiento. La actividad de unión de Ab He a cada FcyR se dividió por la de Ab HeCon y luego se multiplicó por 100; esto se conoce como He/Con. La actividad de unión de Ab Ho a cada FcyR se divide por la de Ab HoCon y luego se multiplica por 100; esto se conoce como Ho/Con. En cuanto a los anticuerpos homodimerizados y heterodimerizados preparados utilizando una variante de GpH7-B3 que comprende una alteración de interés, los valores de Ho/Con y He/Con se representaron en los ejes horizontal y vertical, respectivamente. Los resultados de los FcyR respectivos, es decir, FcYRIa, FcYRIIa(R), FcYRIIa(H), FcYRIIb y FcYRIIIa, se resumen en las Fig. 16 a 20. Basándose en los valores de He/Con y Ho/Con, cada alteración se puede interpretar de la siguiente manera.

1. Cuando los valores de He/Con y Ho/Con son 100: significa que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado Ab He y el anticuerpo homodimerizado Ab Ho, que comprenden una variante de GpH7-B3 introducida con una mutación de interés, son equivalentes a la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado de control y del anticuerpo homodimerizado de control, respectivamente.

2. Cuando los valores de He/Con y Ho/Con son 100 o menos: significa que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado Ab He y el anticuerpo homodimerizado Ab Ho, que comprenden una variante de GpH7-B3 introducida con una mutación de interés, son más débiles que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado de control y del anticuerpo homodimerizado de control, respectivamente.

3. Cuando los valores de He/Con y Ho/Con son 100 o más: significa que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado Ab He y el anticuerpo homodimerizado Ab Ho, que comprenden una variante de GpH7-B3 introducida con una mutación de interés, son más fuertes que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado de control y del anticuerpo homodimerizado de control, respectivamente.

4. Cuando el valor de He/Con es mayor que el valor de Ho/Con: significa que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado Ab He que comprende una variante de GpH7-B3 introducida con una mutación de interés es más fuerte que la actividad del anticuerpo homodimerizado Ab Ho.

5. Cuando el valor de He/Con es menor que el valor de Ho/Con: significa que la actividad de unión a FcyR del anticuerpo heterodimerizado Ab He que comprende una variante de GpH7-B3 introducida con una mutación de interés es más débil que la actividad del anticuerpo homodimerizado Ab Ho.

Basándose en la interpretación de los puntos 1 a 5 anteriores, los puntos de datos en las Fig. 16 a 20 se pueden clasificar como se muestra en la Fig. 21.

Cuando está presente una alteración en la Región i en la Fig. 21, significa que la alteración, cuando se introduce en las dos cadenas H de un anticuerpo homodimerizado, reduce su unión a FcyR, mientras que la misma alteración, cuando se introduce en una sola cadena H de un anticuerpo heterodimerizado, tiene el efecto de potenciar su unión a FcyR. Es decir, la alteración potencia la unión de FcyR del anticuerpo heterodimerizado únicamente. En cuanto a cada FcyR, las alteraciones comprendidas en la Región i se resumen en la Tabla 2 (Tablas 2-1 a 2-3), Tabla 3 (Tablas 3-1 y 3-2), Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6.

Cuando una alteración está presente en la Región ii en la Fig. 21, significa que la alteración correspondiente al punto que potencia la unión a FcyR, cuando se introduce en las dos cadenas H de un anticuerpo homodimerizado, o cuando se introduce solo en una cadena H de un anticuerpo heterodimerizado, tiene un efecto para potenciar la unión más fuerte en el anticuerpo heterodimerizado. Específicamente, las alteraciones en esta región tienen un mayor efecto de potenciación de la unión de FcyR en el anticuerpo heterodimerizado que en el anticuerpo homodimerizado. En cuanto a cada FcyR, las alteraciones comprendidas en la Región ii se resumen en la Tabla 2 (Tablas 2-1 a 2-3), Tabla 3 (Tablas 3-1 y 3-2), Tabla 4, Tabla 5 y Tabla 6.

En cada tabla, He/Con relacionado con la actividad de unión a FcYRIa, FcYRIIa H, FcYRIIa R, FcYRIIb y FcYRIIIa se denominan He/Con_1a, He/Con_2aH, He/Con_2aR, He/Con_2b y He/Con_3a, respectivamente; Ho/Con relacionado con la actividad de unión a FcYRIa, FcYRIIa H, FcYRIIa R, FcYRIIb y FcYRIIIa se denominan Ho/Con_1a, Ho/Con_2aH, Ho/Con_2aR, Ho/Con_2b y Ho/Con_3a, respectivamente.

Cuando una alteración está presente en la Región iii en la Fig. 21, significa que la alteración correspondiente al punto, cuando se introduce en las dos cadenas H de un anticuerpo homodimerizado, o cuando se introduce solo en una cadena H de un anticuerpo heterodimerizado, potencia la unión a FcyR, y el efecto de potenciación de la unión es más fuerte en el anticuerpo homodimerizado. Específicamente, las alteraciones en esta región tienen un mayor efecto de potenciación de la unión de FcyR en el anticuerpo homodimerizado que en el anticuerpo heterodimerizado.

En las tablas siguientes, las alteraciones de aminoácidos se indican de una manera tal como A327_03V. La primera letra alfabética (por ejemplo, "A" de A327_03V) es un código de una letra que representa el resto de aminoácido antes de la alteración, y el siguiente número (por ejemplo, "327" de A327_03V) indica la posición de la alteración (numeración EU). El último número y una letra alfabética (por ejemplo, "03V" de A327_03V) indican una letra alfabética donde el resto de aminoácido después de la alteración se muestra con el código de una letra (representando el número el tipo de aminoácido la letra alfabética). Esto se indica de la siguiente manera: 01G (Gly), 02A (Ala), 03V (Val), 04F (Phe), 05P (Pro), 06M (Met), 07I (Ile), 08L (Leu), 09D (Asp), 10E (Glu), 11K (Lys), 12R (Arg), 13S (Ser), 14T (Thr), 15Y (Tyr), 16H (His), 17C (Cys), 18N (Asn), 19Q (Gln) y 20W (T rp). Por tanto, por ejemplo, "A327_03V" significa "una sustitución de A por V en la posición de aminoácido 327 (numeración EU)".

T l 2-11

continuación

-

T l 2-

Con respecto a FcYRIa, se muestran las alteraciones comprendidas en las Regiones i y ii (Fig.21).

T l -1

continuación

T l -2

continuación

Con respecto a FcYRIIa R, se muestran las alteraciones comprendidas en las Regiones i y ii (Fig. 21).

Tabla 4

Con respecto a FcYRIIa H, se muestran las alteraciones comprendidas en las Regiones i y ii (Fig. 21).

T l

continuación

Con respecto a FcYRIIb, se muestran las alteraciones comprendidas en las Regiones i y ii (Fig. 21).

T l 1

continuación

Con respecto a FcYRIIIa, se muestran las alteraciones comprendidas en las Regiones i y ii (Fig. 21).

Se cree que las alteraciones reveladas en este ejemplo, junto con el ejemplo 2, apoyan el concepto de mejora de la capacidad de reconocimiento de FcyR por el anticuerpo heterodimerizado descrito en el Ejemplo 1. Se cree que las alteraciones en la Región i en la Fig. 21 reducen la actividad de unión a FcyR cuando se introducen en las dos cadenas H de una manera convencional, y no se han reconocido como alteraciones que potencien la unión. Los presentes inventores, sin embargo, lograron demostrar que tales alteraciones también mejoran la actividad de unión a FcyR introduciéndolas en solo una de las dos cadenas H.

[Ejemplo 5] Método para determinar combinaciones de alteraciones de anticuerpos heterodimerizados

Como se describe en el Ejemplo 3, el efecto de una alteración en la unión de FcyR de un anticuerpo heterodimerizado difiere en la dirección dependiendo de la alteración. Por este motivo, cuando se combinan varias alteraciones para potenciar o reducir adicionalmente la unión a FcyR de un anticuerpo heterodimerizado, es necesario unificar la dirección del efecto de cada alteración sobre la unión a FcyR. Si se introdujeron dos alteraciones de manera que sus efectos para potenciar la unión a FcyR de un anticuerpo son diferentes en la dirección, los efectos de las alteraciones se aniquilarían entre sí y no se observaría el efecto de potenciar la unión a pesar de la combinación de alteraciones para potenciar la unión a FcyR. Sin embargo, no existe un método para predecir de antemano en qué cadena H debe introducirse una alteración. Por lo tanto, para encontrar un método de combinación apropiado, generalmente necesitan prepararse anticuerpos en los que se introducen alteraciones de interés en la misma cadena o en diferentes cadenas H, y se comparan entre sí para determinar la actividad de unión a FcyR. Por ejemplo, cuando se introducen los tres tipos diferentes de alteraciones en un anticuerpo homodimerizado, se puede preparar un solo tipo de anticuerpo en el que se ha introducido cada alteración en las dos cadenas H. En el caso de un anticuerpo heterodimerizado, sin embargo, es necesario determinar en qué cadena H debe introducirse cada alteración. En este caso, como se muestra en la Fig. 22, hay un máximo de cuatro combinaciones para probar; es decir, el número de variantes que deben prepararse para la evaluación de las combinaciones de alteración es muy grande, y esto es ineficaz. Por lo tanto, los presentes inventores probaron un método para identificar la dirección en la que una alteración de interés tiene un efecto sobre la unión a FcyR de un anticuerpo combinando la alteración con P329R que inhibe la unión a FcyR de un anticuerpo desde una sola dirección.

Los presentes inventores examinaron cómo se alteraba la unión a FcYRIIIa cuando se introdujeron cada una de las alteraciones L234Y, G236W y S298A que potencian la unión a FcYRIIIa en la misma cadena H que P329R o en la otra cadena H de un anticuerpo heterodimerizado que puede encontrarse en el Ejemplo 4. En primer lugar, se expresaron variantes de interés y se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1, usando GpH7-A5 como cadena H; y GpL16-k0 como cadena L; y como la otra cadena H, GpH7-HA5 (SEQ ID NO: 19), GpH7-HA6 (SEQ ID NO: 20) y GpH7-HA11 (SEQ ID NO: 21) resultantes de la introducción de L234Y, G236W y S298A, respectivamente, en GpH7-B12 en el que se había introducido la alteración P329R. Además, se expresaron y prepararon anticuerpos de interés según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1, usando como cadena H, GpH7-A48 (SEQ ID NO: 16) resultante de la introducción de P329R en GpH7-A5; y GpL16-k0 como cadena L; y como la otra cadena H, GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID NO: 22), GpH7-B3-03-20W (SEQ ID NO: 23) y GpH7-B3-15-02A (SEQ ID NO: 24) resultantes de la introducción de L234Y, G236W y S298A, respectivamente, en GpH7-B3. Los anticuerpos así obtenidos se denominaron GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 19 y 5, respectivamente), GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0 (SEC ID NO: 3, 20 y 5, respectivamente), GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0 (SEC ID NO: 3, 21 y 5, respectivamente), GpH7-A48/GpH7-B3-01 -15Y/GpL16-k0 (SEC ID NO: 16, 22 y 5, respectivamente), GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 (SEC ID NO: 16, 23 y 5, respectivamente) y GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 16, 24 y 5, respectivamente). Las variantes se compararon entre sí con respecto a la actividad de unión a FcYRIIIa según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Los efectos de la combinación de L234Y, G236W y S298A con P329R se resumen en la Tabla 7.

T l 7

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). La actividad de unión a Fc^YRIIIa se indica como una actividad de unión relativa cuando se establece la unión a Fc^YRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente) como 100. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Basándose en el resultado, se compararon las alteraciones para la actividad de unión a Fc^YRIIIa cuando cada alteración se ha introducido en la misma cadena H que P329R o en la cadena H diferente de la cadena en la que se ha introducido P329R. En el caso de L234Y, la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-HA5/GpL16-k0 correspondiente al primer caso fue 60, mientras que la actividad de unión de GpH7-A48/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 correspondiente al último caso fue 11; de este modo, la unión de FcyR se inhibió cuando se introdujo la alteración en la cadena H diferente a la cadena en la que se introdujo P329R. En el caso de G236W, la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-HA6/GpL16-k0 correspondiente al primer caso fue 56, mientras que la actividad de unión de GpH7-A48/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 correspondiente al último caso fue 13; de este modo, la unión de FcyR se inhibió cuando se introdujo la alteración en la cadena H diferente a la cadena en la que se introdujo P329R. En el caso de S298A, la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-HA11/GpL16-k0 correspondiente al primer caso fue 84, mientras que la actividad de unión de GpH7-A48/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 correspondiente al último caso fue 47; de este modo, la actividad de unión a Fc^YR se inhibió cuando se introdujo la alteración en la cadena H diferente a la cadena en la que se introdujo P329R. Por todas las alteraciones, la unión de Fc^YRIIIa se inhibió cuando se introdujo una alteración en la cadena H diferente a la cadena en la que se introdujo P329R, como se describe en el último caso. Si la cadena H en la que se había introducido P329R correspondía a la cadena H^ade la Fig. 3, se cree que P329R inhibe la unión en la dirección X. Como las combinaciones que dieron como resultado una inhibición significativa de la unión son aquellas en las que L234Y, G236W o S298A se habían introducido en la cadena H diferente de la cadena en la que se introdujo P329R, en este caso las alteraciones se habrían introducido en la cadena H^b. Como el efecto para potenciar la unión a Fc^YRIIIa se inhibió notablemente cuando se produjo cualquiera de las alteraciones L234Y, G236W y S298A introducidas en la cadena H diferente de la cadena en la que se introdujo P329R, todas las alteraciones, cuando se introducen en la cadena H^b, potenciaron la unión a Fc^YRIIIa desde la dirección X, que se inhibe por P329R. Por lo tanto, se pensó que la unión a Fc^YRIIIa se puede potenciar aún más introduciendo estas alteraciones en la misma cadena H.

La hipótesis descrita anteriormente se probó evaluando si la unión a FcyR se potencia al introducir dos de L234Y, G236W y S298A en la misma cadena H o en cadenas H diferentes. Se construyeron vectores de expresión en los que se habían insertado GpH7-TA1 (SEQ ID NO: 25), GpH7-TA2 (SEQ ID NO: 26) y GpH7-TA3 (SEQ ID NO: 27), resultantes de la introducción de L234Y, G236W y S298A en GpH7-A5, respectivamente; y vectores de expresión en los que se habían insertado GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID NO: 22), GpH7-B3-03-20W (SEQ ID NO: 23) y GpH7-B3-15-02A (SEQ ID NO: 24), resultantes de la introducción de L234Y, G236W y S298A en GpH7-B3, respectivamente, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, Se construyeron vectores de expresión en los que se había insertado lo siguiente: GpH7-TA4 (SEQ ID NO: 28) resultante de la introducción de L234Y y G236W en GpH7-A5; GpH7-TA5 (SEQ ID NO: 29) resultante de la introducción de L234Y y S298A en GpH7-A5; y GpH7-TA6 (SEQ ID NO: 30) resultante de la introducción de G236W y S298A en GpH7-A5. Estos se combinaron de la manera que se muestra en la Tabla 8, y se añadió GpL16-k0 como cadena L a cada combinación. Se expresaron y prepararon anticuerpos de interés según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. En cuanto a las muestras expresadas, La información sobre las cadenas H y los sitios de mutación, y los resultados del ensayo sobre la unión a FcYRIIIa del anticuerpo se resumen en la Tabla 8.

T l

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (''-'': cuando no hay una mutación particular). La actividad de unión a FcYRIIIa se indica como una actividad de unión relativa cuando se establece la unión a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El efecto de la combinación de L234Y y G236W se evaluó basándose en el resultado que se muestra en la Tabla 8. La actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-TA2/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 en la que L234Y y G236W se introdujeron en diferentes cadenas H fue 130, y no aumentó en comparación con la actividad de unión de 131 de GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 en el que se había introducido L234Y solo, mientras que se redujo en comparación con la actividad de unión de 140 de GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 en el que se había introducido G236W solo. Al mismo tiempo, la actividad de unión de GpH7-TA4/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se habían introducido L234Y y G236W en la misma cadena H fue 168, y aumentó en comparación con la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 en el que se había introducido L234Y solo y GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 en el que se había introducido G236W solo. Como se predijo, este resultado demuestra que L234Y y G236W, cuando se introducen en la misma cadena H, aumentan aún más la actividad de unión a FcYRIIIa.

A continuación, se evaluó el efecto de la combinación de L234Y y S298A basándose en la Tabla 8. La actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 en el que se habían introducido L234Y y S298A en diferentes cadenas H fue 142, y aumentó en comparación con la actividad de unión de 131 de GpH7-A5/GpH7-B3-01 -15Y/GpL16-k0 en el que se había introducido L234Y solo, mientras que se redujo en comparación con la actividad de unión de 163 de GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 en el que se había introducido S298A solo. Es decir, como la actividad de unión de GpH7-TA1/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 no aumentó en comparación con cuando se introdujo S298A solo, se puede decir que el efecto de aumentar adicionalmente la actividad de unión a FcYRIIIa no se proporcionó cuando se introdujeron S298A y L234Y en diferentes cadenas H. Al mismo tiempo, la actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-TA5/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se habían introducido L234Y y S298A en la misma cadena H fue 208, y aumentó en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3-01-15Y/GpL16-k0 en el que se había introducido L234Y solo y GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 en el que se había introducido S298A solo. Como se predijo, este resultado demuestra que L234Y y S298A, cuando se introducen en la misma cadena H, aumentan adicionalmente la actividad de unión a FcYRIII.

Posteriormente, se evaluó el efecto de la combinación de G236W y S298A basándose en la Tabla 8. La actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-TA3/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 en el que se habían introducido G236W y S298A en diferentes cadenas H fue 70, y disminuyó en comparación con la actividad de unión de 140 de GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 en el que se había introducido g 236W solo, y la actividad de unión de 163 de GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 en el que se había introducido S298A solo. Al mismo tiempo, la actividad de unión de GpH7-TA6/GpH7B3/GpL16-k0 en el que se habían introducido G236W y S298A en la misma cadena H fue 228, y aumentó en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3-03-20W/GpL16-k0 en el que se había introducido G236W solo y GpH7-A5/GpH7-B3-15-02A/GpL16-k0 en el que se había introducido S298A solo. Como se predijo, este resultado demuestra que G236W y S298A, cuando se introducen en la misma cadena H, aumentan aún más la actividad de unión a FcYRIIIa.

Como se predijo inicialmente, estos resultados demuestran que L234Y, G236W y S298A, solo cuando se introducen en la misma cadena H, potencian la unión. Estos datos apoyan que L234Y, G236W y S298A, cuando están presentes en la misma cadena, mejoran la unión a FcyR desde la misma dirección. Es decir, esto muestra que se puede determinar un método para combinar de manera apropiada dos alteraciones basándose en un resultado predicho a partir del resultado de la comparación de la actividad de unión a FcYRIIIa, combinando P329R con cada una de las alteraciones. En otras palabras, la combinación con P329R es un método útil para predecir un método de combinación de alteraciones en anticuerpos heterodimerizados. Este método se puede utilizar para revelar otras combinaciones útiles de alteraciones.

Se consideraron combinaciones de dos o más alteraciones basándose en el resultado de la comparación de la actividad de unión a FcyRIII combinando P329R con cada una de las alteraciones. Se demostró que L234Y y G236W, G236W y S298A, y S298A y L234Y, cuando se introducen en la misma cadena H, respectivamente, mejoran la interacción con FcYRIIIa desde la misma dirección. Es decir, a partir de este resultado, se pensó que L234Y, G236W y S298A potencian la actividad de unión a FcYRIIIa desde la misma dirección y, por lo tanto, era de esperar que estas alteraciones, cuando se introducen en la misma cadena H, potenciaran al máximo la actividad de unión a FcYRIIIa. Para evaluar esta hipótesis, se construyeron GpH7-TA4, GpH7-TA5 y GpH7-TA6 introduciendo en GpH7-A5 cada uno de los grupos de alteración de L234Y y G236W, L234Y y S298A, y G236W y S298A; GpH7-B3-01 -15Y, GpH7-B3-03-20W y GpH7-B3-15-02A se construyeron introduciendo L234Y, G236W y S298A, respectivamente, en GpH7-B3; los vectores de expresión en los que se habían insertado las construcciones anteriores se prepararon de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 1. Los vectores se combinaron de manera que las tres alteraciones, L234Y, G236W y S298A, se introdujeran en cualquiera de las cadenas H; y se añadió GpL16-k0 como cadena L; y se expresaron y prepararon anticuerpos de interés según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, Se construyó GpH7-TA7 (SEQ ID NO: 31) resultante de la introducción de tres alteraciones, L234Y, G236W y S298A en GpH7-A5 y se combinó con GpH7-B3 y GpL16-k0 para expresar y purificar un anticuerpo de interés según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. En la Tabla 9 se muestra una lista de anticuerpos preparados como se describe en la presente memoria y el resultado de la comparación de la actividad de unión a FcYRIIIa entre anticuerpos.

T l

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 (''-'': cuando no hay una mutación particular). La actividad de unión a FcYRIIIa se indica como una actividad de unión relativa cuando se establece la actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Como se predijo a partir del resultado de la comparación de la actividad de unión a FcYRIIIa combinando P329R con cada alteración, GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se habían introducido L234Y, G236W y S298A en la misma cadena H presentaron la unión a FcYRIIIa potenciada más fuertemente. Es decir, el resultado demuestra que se puede predecir un método para combinar de manera apropiada dos o más alteraciones comparando la actividad de unión a FcYRIIIa que combina P329R con cada alteración.

[Ejemplo 6] Comparación de un anticuerpo homodimerizado convencional y un nuevo anticuerpo heterodimerizado basado en un anticuerpo heterodimerizado

Los resultados que se muestran en las Tablas 7, 8 y 9 del Ejemplo 5 demuestran que las heteroalteraciones que potencian por separado la actividad de unión a FcYRIIIa, cuando se combinan de manera apropiada, pueden potenciar adicionalmente la unión a FcYRIIIa. Específicamente, se demostró que las alteraciones L234Y, G236W y S298A, cuando se introducen en la misma cadena H, aumentan aún más la actividad de unión a FcyR.

A continuación, los presentes inventores examinaron si aunque se combinaran múltiples alteraciones, el anticuerpo heterodimerizado resultante todavía tenía la característica del anticuerpo heterodimerizado de que el anticuerpo heterodimerizado en el que se habían introducido múltiples alteraciones presenta una unión de FcyR potenciada más fuertemente que el anticuerpo homodimerizado en el que se habían introducido las múltiples alteraciones correspondientes. Específicamente, se prepararon GpH7-TA7 y GpH7-TA45 (SEQ ID NO: 32) resultantes de la introducción de L234Y, G236W y S298A en GpH7-A5 y GpH7-B3, respectivamente, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Como se muestra en la Tabla 10, los anticuerpos heterodimerizados GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 y GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0 en los que L234Y, G236W y S298A se introdujeron en una sola cadena H, y el anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que L234Y, G236W y S298A se introdujeron en las dos cadenas H, se expresaron y purificaron según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se comparó la unión a FcYRIIIa de estos anticuerpos según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 10).

T l 1

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 cuando no hay mutación). La actividad de unión a FcYRIIIa se indica como una actividad de unión relativa cuando se establece la unión a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El resultado que se muestra en la Tabla 10 demuestra que el anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que se introdujeron L234Y, G236W y S298A en las dos cadenas mostró una unión a FcYRIIIa reducida en comparación con los anticuerpos heterodimerizados GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 y GpH7-A5/GpH7-TA45/GpL16-k0 en los que se introdujeron L234Y, G236W y S298A en una sola de las cadenas. Esto muestra que la característica de las alteraciones L234Y, G236W y S298A de que aumentan la actividad de unión a FcyR de un anticuerpo heterodimerizado pero reducen la actividad de unión a FcyR de un anticuerpo homodimerizado, se conserva aunque se combinen múltiples alteraciones.

A continuación, los presentes inventores examinaron si un anticuerpo heterodimerizado en el que se habían introducido L234Y, G236W y S298A en una sola de las cadenas H conservaba la direccionalidad de la unión a FcYRIIIa analizada en el Ejemplo 3.

Se prepararon GpH7-TA8 (SEQ ID NO: 33) y GpH7-B12 (SEQ ID NO: 12) resultantes de la introducción de P329R en GpH7-TA7 y GpH7-B3, respectivamente, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Como se muestra en la Tabla 11, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que L234Y, G236W y S298A se habían introducido en la misma cadena H que P329R, y el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0 en el que L234Y, G236W y S298A se habían introducido en una cadena H diferente de la cadena en la que se había introducido P329R se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. En cuanto a la actividad de unión a FcyRIII, estos anticuerpos se compararon con el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se había introducido L234y , G236W y S298A según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 11).

T l 111

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). La actividad de unión a Fc^YRIIIa se indica como una actividad de unión relativa cuando se establece la unión a Fc^YRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El resultado mostrado en la Tabla 11 demuestra que el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que el grupo de alteraciones L234Y, G236W y S298A se introdujo en la misma cadena H que P329R, y el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0 en el que el grupo de alteraciones l234Y, G236W y S298A se introdujo en una cadena H diferente de la cadena en la que se introdujo P329R, presentaron ambos actividades de unión a Fc^YRIIIa reducidas en comparación con GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0. La actividad de unión a Fc^YRIIIa de GpH7-TA7/GpH7-B12/GpL16-k0 fue 11 y se redujo notablemente en comparación con la actividad de 150 de GpH7-TA8/GpH7-B3/GpL16-k0. Este resultado muestra la característica de que la actividad de unión a FcyR se reduce notablemente si múltiples de las alteraciones L234Y, G236W y S298A se introducen en una cadena H, cuando se introducen en la cadena H diferente de la cadena en la que se introdujo P329R, lo cual se observó en el Ejemplo 3 para las alteraciones L234Y, G236W y S298A.

Los hallazgos anteriores demuestran que una combinación apropiada de alteraciones que mejoran la unión a Fc^YR puede aumentar adicionalmente la actividad de unión a FcyR mientras se conserva la característica de un anticuerpo heterodimerizado.

[Ejemplo 7] Comparación con la técnica anterior: comparación entre variantes heterodimerizadas y anticuerpos alterados con aminoácidos que potencian la unión a Fc^YRIIIa

Ya se conocen alteraciones que aumentan la actividad de ADCC mediante la potenciación de la unión a Fc^YRIIIa. Por ejemplo, las alteraciones S239D, I332E y A330L se conocen como mutaciones que potencian al máximo la unión a Fc^YRIIIa cuando se introducen en las dos cadenas H de un anticuerpo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 4005-4010, 2006). Se demostró que la actividad antitumoral de un anticuerpo aumentaba mediante la potenciación de la actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). La potenciación de la unión a Fc^YRIIIa de un anticuerpo es un medio eficaz para potenciar la utilidad de los anticuerpos como productos farmacéuticos. Sin embargo, como se muestra en los Ejemplos anteriores, se cree que existen limitaciones en la potenciación de la actividad de unión a FcyR utilizando anticuerpos homodimerizados. Por lo tanto, se pensó que la actividad de unión a FcyR se puede aumentar adicionalmente mediante heteroalteración.

Como se menciona en el Ejemplo 1, el dominio Fc de un anticuerpo interacciona con FcyR de manera asimétrica. En el caso de un anticuerpo en el que se han introducido las alteraciones S239D, I332E y A330L, en vista de la estructura tridimensional, se cree que, en la cadena H^a, todos los restos alterados de S239D, I332E y A330L están involucrados en la potenciación de la interacción con FcyR, mientras que en la cadena H^b, otros restos distintos de S239D están fuera de contacto con FcyR y no contribuyen a la potenciación de la actividad de unión a FcyR (Fig. 23). Es decir, a la luz de la asimetría de interacción entre el dominio Fc y FcyR, cada alteración introducida por la tecnología de alteración de anticuerpos convencional no tiene suficiente capacidad de interacción con Fc^YR y se cree que esto es suficiente para optimizar la interacción anticuerpo/Fc^YR. Por ejemplo, en el caso de las alteraciones descritas anteriormente S239D, I332E y A330L, se cree que la unión a Fc^YRIIIa puede potenciarse adicionalmente mediante la introducción de alteraciones que potencian la interacción con Fc^YRIIIa en el lado de la cadena H^b, en lugar de introducir las alteraciones anteriores en la cadena H^b. Es decir, la unión a FcyR podría mejorarse adicionalmente utilizando la tecnología de la presente invención para producir anticuerpos heterodimerizados mediante la introducción de diferentes alteraciones en cada cadena H del anticuerpo (denominado en lo sucesivo, "tecnología de anticuerpos heterodimerizados") en lugar de utilizar la tecnología para introducir la misma alteración en las dos cadenas H del anticuerpo (denominado en lo sucesivo "técnica anterior" o "tecnología de anticuerpos homodimerizados").

En vista de la estructura tridimensional del complejo Fc/FcYRIIIa, contrariamente a S239D, I332E y A330L, se cree que S298 interacciona con FcyR solo en la cadena H^bcomo se muestra en la Fig. 23 (JBC, 276: 16469-16477, 2001). Por lo tanto, se cree que, cuando se introduce una alteración en S298, el resto después de la mutación de sustitución también interacciona con FcyRIIIa en el lado de la cadena H^b. Como se ve en el Ejemplo 5, se cree que L234Y y G236W potencian la interacción con FcyR desde la misma dirección que S298A. Es decir, se cree que, cuando S239D, A330L e I332E se introducen en la misma cadena H, y L234Y, G236W y S298A se introducen en la otra cadena H, todas las alteraciones introducidas pueden interaccionar con FcyR al mismo tiempo, dando como resultado una mejora adicional de la interacción con FcyR.

Para evaluar la hipótesis anterior, los presentes inventores llevaron a cabo los siguientes experimentos. La dirección del reconocimiento de FcyR por cada alteración se determinó según el método descrito en el Ejemplo 5, utilizando anticuerpos en los que se había introducido en la cadena H la alteración L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L o I332E, y P329R se había introducido en la misma cadena H o en una diferente. Se construyeron vectores de expresión en los que se insertaron las siguientes secuencias según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1:

GpH7-A5; GpH7-A48 (SEQ ID NO: 16) resultante de la introducción de P329R en GpH7-A5; GpH7-HA7 (SEQ ID NO: 34) resultante de la introducción de S239D y P329R en GpH7-B3; GpH7-HA15 (SEQ ID n O: 35) resultante de la introducción de A330L y P329R en GpH7-B3; GpH7-HA18 (SEQ ID n O: 36) resultante de la introducción de I332E y P329R en GpH7-B3; GpH7-HA5 (SEQ ID NO: 19) resultante de la introducción de L234Y y P329R en GpH7-B3; GpH7-HA6 (SEQ ID NO: 20) resultante de la introducción de G236W y P329R en GpH7-B3; GpH7-HA11 (SEQ ID NO: 21) resultante de la introducción de S298A y P329R en GpH7-B3; GpH7-B3-06-09D (SEQ ID NO: 37) resultante de la introducción de S239D en GpH7-B3; GpH7-B3-20-08L (SEQ ID NO: 38) resultante de la introducción de A330L en GpH7-B3; GpH7-B3-22-10E (SEQ ID NO: 39) resultante de la introducción de I332E en GpH7-B3; GpH7-B3-01-15Y (SEQ ID NO: 22) resultante de la introducción de L234Y en GpH7-B3; GpH7-B3-03-20W (SEQ ID NO: 23) resultante de la introducción de G236W en GpH7-B3; y GpH7-B3-15-02A (SEQ ID NO: 24) resultante de la introducción de S298A en GpH7-B3. Los vectores de expresión para las respectivas cadenas H se combinaron de manera que cada una de las alteraciones L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L e I332E estuviera presente en la misma cadena H que P329R o en la cadena H diferente de la cadena en la que estaba P329R, y el vector de expresión GpL16-k0 para la cadena L se combinó con ellos. Se expresaron y prepararon anticuerpos de interés según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos preparados se usaron para ensayar la actividad de unión a FcYRIIIa. El resultado de la evaluación usando P329R en la dirección del reconocimiento de FcYRIIIa por L234Y, G236W, S298A, S239D, A330L e I332E se resumen en la Tabla 12.

T l 12

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). La actividad de unión a FcYRIIIa se indica como una actividad de unión relativa cuando se establece la unión a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como 100. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Basándose en el resultado, en cuanto a cada alteración, se compara la actividad de unión a FcYRIIIa entre la situación en la que cada alteración se introduce en la misma cadena H que P329R y la situación en la que se introduce en la cadena H diferente de la cadena en la que se introdujo P329R. En el caso de S239D, la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-HA7/GpL16-k0 correspondiente al primer caso fue 3, mientras que la actividad de unión de GpH7-A48/GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0 correspondiente al último caso fue 123; de este modo, la unión a FcYRIIIa se inhibió cuando la alteración se introdujo en la misma cadena H que P329R. En el caso de A330L, la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-HA15/GpL16-k0 correspondiente al primer caso fue 32, mientras que la actividad de unión de GpH7-A48/GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0 correspondiente al último caso fue 60; de este modo, la unión a FcYRIIIa se inhibió cuando la alteración se introdujo en la misma cadena H que P329R. En el caso de I332E, la actividad de unión de GpH7-A5/GpH7-HA18/GpL16-k0 correspondiente al primer caso fue 35, mientras que la actividad de unión de GpH7-A48/GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0 correspondiente al último caso fue 189; de este modo, la unión a FcYRIIIa se inhibió cuando la alteración se introdujo en la misma cadena H que P329R. En cuanto a todas las alteraciones, la unión a FcYRIIIa se inhibió cuando la alteración se introdujo en la misma cadena H que P329R, es decir, el primer caso. Si la cadena H en la que se había introducido P329R correspondía a la cadena H^ade la Fig. 23, se cree que P329R inhibe la unión desde la dirección X. Como las combinaciones que inhiben significativamente la unión son aquellas en las que S239D, A330L o I332E se habían introducido en la misma cadena H que P329R; es decir, en este caso, las alteraciones se introdujeron en la cadena H^a. Como el efecto para potenciar la unión a FcYRIIIa se inhibió notablemente cuando cualquiera de las alteraciones S239D, A330L e I332E se había introducido en la misma cadena H que P329R, todas las alteraciones, cuando se introducen en la cadena H^a, potencian la unión a FcYRIIIa desde la dirección X que se inhibe por P329R. Por lo tanto, se cree que la unión a FcYRIIIa se puede potenciar adicionalmente introduciendo estas alteraciones en la misma cadena H. Basándose en el Ejemplo 5, se consideró que L234Y, G236W y S298A, cuando se introducen en la cadena H^b, potencian la unión desde la dirección X. Como se analizó en los Ejemplos 5 y 6, se puede encontrar un método para combinar de manera apropiada las alteraciones respectivas combinándolas con P329R. Basándose en los resultados anteriores, para potenciar la unión a FcYRIIIa desde la dirección X como se muestra en la Fig. 3, S239D, A330L e I332E tienen que introducirse en la cadena H^a, mientras que L234Y, G236W y S298A tienen que introducirse en la cadena H^b. Por lo tanto, se pensó que la unión a FcYRIIIa desde la dirección X puede potenciarse adicionalmente introduciendo los respectivos grupos de alteración en diferentes cadenas H.

Para evaluar la hipótesis anterior, se construyeron vectores de expresión en los que se insertaron las siguientes secuencias según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1:

GpH7-A57 (SEQ ID NO: 40) resultante de la introducción de S239D, A330L e I332E en GpH7-A5;

GpH7-B78 (SEQ ID NO: 41) resultante de la introducción de S239D, A330L e I332E en GpH7-B3;

GpH7-TA7 (SEQ ID NO: 31) resultante de la introducción de L234Y, G236W e S298A en GpH7-A5; y

GpH7-TA45 (SEQ ID NO: 32) resultante de la introducción de L234Y, G236W y S298A en GpH7-B3. Usando los vectores de expresión y GpH7-A5, GpH7-B3 y GpL16-k0, se expresaron y prepararon los siguientes anticuerpos según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1:

hetero GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se han introducido L234Y, G236W y S298A, y en la otra se ha introducido S239D, A330L y I332E; GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que solo en una de las cadenas H se han introducido L234Y, G236W y S298A;

GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se han introducido L234Y, G236W y S298A; GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que solo en una de las cadenas H se han introducido S239D, a 330L y I332E; y GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se han introducido S239D, A330L e i332E. Los anticuerpos preparados se compararon con respecto a la actividad de unión a FcYRIIIa usando, como indicador, KD para FcYRIIIa que se determinó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. El resultado de la evaluación sobre el efecto de la combinación de L234Y, G236W y S298A con S239D, A330L e I332E se resumen en la Tabla 13.

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). El valor obtenido al dividir la KD de GpH7-G1d/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se define como "relación 1 de KD", mientras que el valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación 2 de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

En vista del resultado de la Tabla 13, cuando GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que D356K, H435R y K439E se habían introducido cada una en una cadena H se compara con GpH7-G1d/GpL16-k0, que es una IgG1 nativa, la diferencia en la actividad de unión a FcYRIIIa es de 0,75 veces y no se observó una diferencia significativa. Por lo tanto, se pensó que las alteraciones D356K, H435R y K439E no afectan a la actividad de unión a FcYRIIIa.

Se evaluó el efecto de cada alteración sobre los anticuerpos homodimerizados utilizados por la técnica anterior. La actividad de unión a FcyRIII del anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E aumentó aproximadamente 260 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Por el contrario, la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A se redujo a 0,49 veces. Esto demuestra que solo el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E tiene el efecto de potenciar la actividad de unión a FcYRIIIa de los anticuerpos homodimerizados.

Los anticuerpos heterodimerizados en los que en solo una de las cadenas H se introdujo cada grupo de alteración se evaluaron para determinar el efecto de cada grupo de alteración. La actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E aumentó aproximadamente 30 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A aumentó 5,1 veces. Este resultado demuestra que el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E tiene el efecto más fuerte para aumentar la actividad de unión a FcYRIIIa.

En cada grupo de alteración se evaluó la diferencia en su efecto entre el anticuerpo homodimerizado y el anticuerpo heterodimerizado. En cuanto a S239D, A330L e I332E, la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado aumentó 30 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, mientras que la actividad del anticuerpo homodimerizado aumentó aproximadamente 260 veces, lo que demuestra que las alteraciones, cuando se introducen en anticuerpos homodimerizados, aumentan aún más la actividad de unión a FcYRIIIa. Al mismo tiempo, En cuanto a L234Y, G236W y S298A, la actividad de unión a FcyRIII del anticuerpo heterodimerizado aumentó 5,1 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0; sin embargo, la actividad del anticuerpo homodimerizado se redujo a 0,49 veces. Este resultado muestra que el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A, solo en anticuerpos heterodimerizados, tiene el efecto de mejorar la actividad de unión a FcyRIII, como se analizó en el Ejemplo 5.

Quedó demostrado que, en anticuerpos homodimerizados, solo el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E tiene el efecto de mejorar la unión de FcYRIIIa, y además en anticuerpos heterodimerizados, el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E potencian más fuertemente la unión a FcYRIIIa. Basándose en el concepto convencional, si se considera la combinación del grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E con el grupo de las alteraciones L234Y, G236W, se podría predecir que el efecto de potenciar la unión a FcYRIIIa es el más fuerte en el anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introduce solo el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E, que potencian fuertemente la unión a FcYRIIIa tanto del anticuerpo heterodimerizado como del anticuerpo homodimerizado. Sin embargo, la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que S239D, A330L e I332E se introdujeron en una cadena H y L234Y, G236W y S298A se introdujeron en la otra cadena H aumentó aproximadamente 350 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0; el efecto para potenciar la unión fue más fuerte que en el caso del anticuerpo homodimerizado en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E. Esto confirma la hipótesis de que, cuando el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E y el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A se introducen en diferentes cadenas H, todas las alteraciones introducidas potencian la actividad de unión a FcYRIIIa tanto en la cadena H^acomo en la cadena H^b, y el efecto es mayor que en el caso en el que el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E se introducen en las dos cadenas H.

Es decir, está demostrado que el uso de anticuerpos heterodimerizados, en lugar de anticuerpos homodimerizados convencionales, permite una optimización más fina de la interacción asimétrica entre el dominio Fc y FcYRIIIa para diseñar dominios Fc que tengan una actividad de unión más fuerte.

En vista de la Fig. 23, se pensó que A330L e I332E interaccionan con FcyR solo en la cadena H^a, mientras que S239D interacciona con FcyR tanto en la cadena H^acomo en la cadena H^b. De hecho, la KD para FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en solo una de las cadenas H se introdujo S239D, A330L e I332E fue 5,4E-8, mientras que la KD del anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 fue 6,2E-9; de este modo, la actividad de unión a FcYRIIIa aumentó 8,7 veces. Si se considera que la diferencia en la actividad de unión se debe a la participación de S239D en la potenciación de la unión en las dos cadenas H, se cree que esta diferencia se eliminará al introducir S239D en las dos cadenas H. Para evaluar esta hipótesis, se construyó GpH7-A53 (SEQ ID NO: 42) resultante de la introducción de S239D en GpH7-A5 y se combinó con GpH7-B78 en el que se habían introducido S239D, A330L e I332E, y la expresión y preparación se realizaron según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. El efecto de la combinación de S239D y S239D, A330L e I332E se evaluó comparando la unión a FcYRIIIa entre los anticuerpos heterodimerizados y homodimerizados con S239D, A330L y I332E según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 14).

T l 14

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

La Tabla 14 muestra que la actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-A53/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujo S239D, A330L e I332E y en la otra se introdujo S239D aumentó 4,9 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0, en el que solo en una de las cadenas H se había introducido S239D, A330L e I332E; mientras que la actividad se redujo solo 1,8 veces con respecto a GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E. Este resultado demuestra que S239D interacciona con FcYRIIIa en las dos cadenas H, como se mencionó anteriormente en relación con la hipótesis. Se pensó que la interacción con FcYRIIIa se puede potenciar adicionalmente introduciendo la alteración anterior.

Los presentes inventores probaron si la actividad de unión a FcYRIIIa puede aumentarse adicionalmente mediante la introducción de S239D en el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se había introducido L234Y, G236W y S298A y en la otra se había introducido S239D, A330L e I332E. Se construyó GpH7-TA22 (SEQ ID NO: 43) introduciendo S239D en GpH7-TA7, y después se insertó en un vector de expresión; y el vector de expresión resultante se combinó con GpL16-k0, y se obtuvo GpH7-B78 introduciendo S239D, A330L e I332E en GpH7-B3; y el anticuerpo de interés se expresó y preparó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, se preparó el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0 introduciendo L234Y, G236W, S239D y S298A en una cadena H, y S239D, A330L e I332E en la otra cadena H. Para evaluar el efecto de la combinación de S239D con S239D, A330L e I332E, los anticuerpos se compararon en cuanto a la actividad de unión a FcYRIIIa según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 15).

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

La Tabla 15 muestra que la actividad de unión de GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0 resultante de la introducción de S239D en la cadena H que no contiene S239D en el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujo L234Y, G236W y S298A y en la otra cadena H S239D, A330L e I332E aumentó 3,2 veces con respecto a GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0. Este resultado demuestra que la unión a FcYRIIIa puede potenciarse adicionalmente usando S239D.

A continuación, los presentes inventores consideraron la introducción adicional de las alteraciones Y296W y K334G que potencian la unión a FcYRIIIa, que se revelaron como se describe en el Ejemplo 4.

En primer lugar, se consideró en qué cadena H debería introducirse Y296W. Se construyó GpH7-TA52 (SEQ ID NO: 44) resultante de la introducción de la mutación Y296W en GpH7-TA7, y se expresó y preparó en combinación con GpH7-B78 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, se construyó GpH7-TA58 (SEQ ID NO: 45) resultante de la introducción de Y296W en GpH7-B78, y se expresó y preparó en combinación con GpH7-TA22 según el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Para evaluar los efectos de las combinaciones con Y296W, los anticuerpos preparados se compararon en cuanto a la actividad de unión a FcYRIIIa según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 16).

La columna "Muestra" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los respectivos anticuerpos; y la columna "SITIO De MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 cuando no hay ninguna mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El resultado mostró que Y296W, cuando se introdujo en la cadena H diferente de la cadena en la que se introdujeron L234Y, G236W y S298A, aumentaba la actividad de unión a FcYRIIIa solo 1,2 veces después de la introducción en comparación con la situación anterior; mientras que Y296W, cuando se introdujo en la misma cadena H, aumentó la actividad de unión a FcYRIIIa 1,8 veces con respecto a GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0. Por este resultado, se cree que Y296W, cuando se introduce en la misma cadena H que L234Y, G236W y S298A, tiene el efecto de potenciar la unión a FcYRIIIa.

A continuación, se construyó GpH7-TA54 (SEQ ID NO: 46) resultante de la introducción de Y296W en GpH7-TA22, y se expresó y preparó en combinación con GpH7-B78 según el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Además, se construyó GpH7-TA58 (SEQ ID NO: 45) resultante de la introducción de Y296W en GpH7-B78, y se expresó y preparó en combinación con GpH7-TA22 según el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Para evaluar el efecto de la combinación con Y296W, los anticuerpos preparados se compararon en cuanto a la actividad de unión a FcYRIIIa según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 17).

La columna "Muestra" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de los anticuerpos respectivos; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcyRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El resultado que se muestra en la Tabla 17 demuestra que, cuando Y296W se introdujo en la cadena H que es diferente de la cadena en la que se introdujo L234Y, G236W y S298A, no había diferencia en la actividad de unión a FcYRIIIa después de la introducción en comparación con la situación anterior. Cuando Y296W se introdujo en la misma cadena H que L234Y, G236W y S298A, la actividad de unión a FcYRIIIa aumentó 1,3 veces con respecto a GpH7-TA22/GpH7-B78/GpL16-k0. Por este resultado, se pensó que Y296W, cuando se introduce en la misma cadena H que L234Y, G236W y S298A, tiene el efecto de mejorar la actividad de unión a FcYRIIIa.

A continuación, K334G también se evaluó de la misma manera. se construyó GpH7-TA40 (SEQ ID NO: 47) resultante de la introducción de K334G en GpH7-TA7, y se expresó y preparó en combinación con GpH7-B78 según el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Además, se construyó GpH7-TA50 (SEQ ID NO: 48) resultante de la introducción de K334G en GpH7-B78, y se expresó y preparó en combinación con GpH7-TA7 según el método descrito en el Ejemplo de referencia 1. Para evaluar el efecto de las combinaciones con K334G, los anticuerpos preparados se compararon con respecto a la unión a FcYRIIIa según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2 (Tabla 18).

La columna "Muestra" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de las regiones constantes de la cadena H de cada anticuerpo; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 cuando no hay ninguna mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El resultado que se muestra en la Tabla 18 demuestra que, cuando K334G se introdujo en la misma cadena H que L234Y, G236W y S298A, la actividad de unión a FcYRIIIa se reduce a la mitad después de la introducción en comparación con la situación anterior. Cuando K334G se introdujo en la cadena H diferente, la actividad de unión a FcYRIIIa aumentó 1,2 veces con respecto a GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0. Por este resultado, se pensó que K334G, cuando se introdujo en la cadena H diferente de la cadena en la que se introdujeron L234Y, G236W y S298A, tiene el efecto de mejorar la actividad de unión a FcYRIIIa.

[Ejemplo 8] Mejora de la selectividad por FcyR activador o FcyR inhibidor

Existen FcyR activadores que tienen ITAM y FcyR inhibidores que tienen ITIM. Los FcyR activadores representativos (receptor activador) incluyen FcYRIa, FcYRIIa y FcYRIIIa, mientras que los FcyR inhibidores representativos (receptor inhibidor) incluyen FcYRIIb. En cuanto a los anticuerpos dirigidos al cáncer, se cree que la relación entre la actividad de unión y el FcyR activador, cuyo mecanismo de acción se basa en la actividad de ADCC o la actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) contra la actividad de unión al FcYR inhibidor, desempeña un papel importante (Nature Medicine, 6: 443-446, 2000).

Para los anticuerpos dirigidos al cáncer, es deseable aumentar su actividad de unión al FcyR activador mientras se reduce su actividad de unión al FcyR inhibidor. Específicamente, son alteraciones deseables, tales como las comprendidas en la Región a que se muestra en la Fig. 24, las alteraciones que permiten que un anticuerpo se una al FcyR activador con más fuerza que el anticuerpo nativo, y que se una al FcyR inhibidor más débilmente que el anticuerpo nativo, es decir, alteraciones que potencian la unión de una manera selectiva al FcyR activador. También, son alteraciones deseables, tales como las de la Región b que se muestran en la Fig. 25, alteraciones que permiten que la relación entre la actividad de unión al FcyR activador y la actividad de unión al FcyR inhibidor sea mayor que la del anticuerpo nativo. Se puede decir que tales alteraciones aumentan selectivamente la actividad de unión al FcyR activador en comparación con el FcYR inhibidor.

Los anticuerpos heterodimerizados Ab He en los que en una de las cadenas H se introdujo una alteración se ensayaron para determinar sus actividades de unión a cada FcyR activador y FcyR inhibidor según el método descrito en el Ejemplo 4. El resultado se resume en las Figs. 26, 27, 28 y 29 para evaluar la relación de la actividad de unión a cada FcyR activador y FcyR inhibidor para cada anticuerpo heterodimerizado. Los FcyR activadores en las Fig. 26, 27, 28 y 29 son FcYRIa, FcYRIIa (R), FcYRIIa (H) y FcYRIIIa, respectivamente.

Las alteraciones presentes en la región de la Fig. 26 correspondientes a a y b en las Figs. 24 y 25 se presentan en la Tabla 19 (Tabla 19-1 a 19-5). Del mismo modo, en cuanto a FcYRIIa (R) (Fig. 27), FcYRIIa (H) (Fig. 28) y FcYRIIIa (Fig. 29), las alteraciones presentes en la región correspondiente a a y b se presentan en la Tabla 20 (Tabla 20-1 a 20-3), Tabla 21 (Tabla 21 -1 a 21 -3) y Tabla 22 (Tabla 22-1 a 22-3).

T l 1 -1

continuación

T l 1 -2

continuación

T l 1 -

continuación

T l 1 -4

continuación

T l 1-1

continuación

La tabla muestra una lista de alteraciones que potencian selectivamente la unión a FcYRIa en comparación con FcYRIlb.

-

continuación

T l 2-21

continuación

-

continuación

La tabla muestra una lista de alteraciones que potencian selectivamente la unión a FcYRIIa (R) en comparación con FcYRIlb.

Tabla 21-1

continuación

T l 21-2

continuación

T l 21-

continuación

La tabla muestra una lista de alteraciones que potencian selectivamente la unión a FcYRIIa (H) en comparación con FcyRII.

T l 22-1

continuación

T l 22-2

continuación

T l 22-1

continuación

La tabla muestra una lista de alteraciones que mejoran selectivamente la unión a FcYRIIIa en comparación con FcYRIlb.

Por otro lado, FcYRIIb, el único FcyR inhibidor, juega un papel importante en enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias (J. Exp. Med., 203, 2157-2164, 2006; J. immunol., 178, 3272-3280, 2007). También se ha demostrado que los anticuerpos que tienen un dominio Fc con actividad de unión a FcYRIIb aumentada pueden ser eficaces en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias causadas por células B (Mol. Immunology 45, 3926 3933, 2008). En el caso de anticuerpos destinados al tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y enfermedades inflamatorias, la actividad de ADCC y la actividad de ADCP a través de la activación de FcyR puede agravar las condiciones patológicas. Por lo tanto, es deseable aumentar la actividad de unión al FcyR inhibidor mientras se reduce la actividad de unión al FcyR activador tanto como sea posible. Específicamente, al igual que las alteraciones presentes en la Región c en la Fig. 24, deseablemente, las alteraciones tienen el efecto de aumentar la actividad de unión al FcyR inhibidor en comparación con el anticuerpo nativo y de reducir la actividad de unión al FcyR activador. Se puede decir que tales alteraciones son alteraciones que mejoran selectivamente la actividad de unión al FcyR inhibidor en comparación con el FcyR activador. Además, al igual que las alteraciones presentes en la Región d en la Fig. 25, deseablemente, las alteraciones tienen el efecto de aumentar la relación entre la actividad de unión al FcyR inhibidor y la actividad de unión al FcyR activador en comparación con el anticuerpo nativo. Se puede decir que tales alteraciones son alteraciones que aumentan selectivamente la actividad de unión al FcyR inhibidor en comparación con el FcyR activador.

Basándose en las Fig. 26, 27, 28 y 29 sobre la evaluación de la relación entre la actividad de unión al FcyR inhibidor y el FcyR activador para cada uno de los anticuerpos heterodimerizados anteriores, para las alteraciones que se muestran en cada figura, las presentes en las Regiones correspondientes a c y d en las Fig. 24 y 25 se resumen como una lista en la Tabla 23 (Tablas 23-1 y 23-2), Tabla 24 (Tablas 24-1 y 24-2), Tabla 25 (Tablas 25-1 a 25-3), Tabla 26 (Tablas 26-1 a 26-4).

Tabla 23-1

continuación

-

continuación

La tabla muestra una lista de alteraciones que potencian selectivamente la unión a FcYRIIb en comparación con FcYRIa.

T l 24-1

continuación

T l 24-21

La tabla muestra una lista de alteraciones que potencian selectivamente la unión a FcYRIIb en comparación con FcYRIIa(R).

T l 2 -11

continuación

T l 2-21

continuación

T l 2 -

continuación

La tabla muestra una lista de alteraciones que potencian selectivamente la unión a FcYRIIb en comparación con FcYRIIa(H).

T l 2 -1

continuación

-

continuación

-

continuación

T l 2 -4

La tabla muestra una lista de alteraciones que mejoran selectivamente la unión a FcYRIIb en comparación con FcYRIIIa.

[Ejemplo 9] Evaluación de anticuerpos heterodimerizados para determinar la estabilidad fisicoquímica

Cuando los anticuerpos se desarrollan como productos farmacéuticos, es de esperar que los anticuerpos tengan una alta estabilidad fisicoquímica. Por ejemplo, en cuanto a la alteración de anticuerpos donde las mutaciones S239D, A330L e I332E se introducen en las dos cadenas de los anticuerpos, se ha notificado que el dominio Fc del anticuerpo se vuelve termodinámicamente inestable debido a la alteración introducida (Molecular Immunology, 45, 1872-1882, 2008), y tal estabilidad térmica reducida dificulta el desarrollo de anticuerpos como productos farmacéuticos. Para aumentar la utilidad de los anticuerpos como productos farmacéuticos y simplificar el desarrollo, también es importante aumentar la actividad de unión a FcyR y mantener la estabilidad fisicoquímica. En el caso de anticuerpos homodimerizados, se introducen alteraciones en las dos cadenas H, y esto significa que una molécula de anticuerpo en la que se introduce un solo tipo de alteración tiene la alteración en dos sitios. En el caso de anticuerpos heterodimerizados, por el contrario, es posible elegir si se introduce una alteración en cualquiera de las cadenas H y, por lo tanto, incluso cuando se introduce un solo tipo de alteración, se introduce en un solo sitio por molécula de anticuerpo. Como se analizó en el Ejemplo 7, dependiendo del tipo de alteración, en cuanto al efecto para aumentar la actividad de unión a FcYRIIIa, a veces es suficiente introducir una alteración en una cadena H. Si una alteración tiene el efecto de reducir la estabilidad fisicoquímica de un anticuerpo, se puede conferir al anticuerpo el efecto de aumentar la actividad de unión a FcyRIII introduciendo la alteración en una sola cadena H mientras se minimiza la desestabilización fisicoquímica del anticuerpo.

Para evaluar esta hipótesis, los presentes inventores evaluaron qué resto de S239D, A330L e I332E contribuía realmente a la desestabilización del dominio CH2. Se prepararon vectores de expresión en los que se insertaron las siguientes secuencias según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1: GpH7-B3-06-09D (SEQ ID NO: 37), GpH7-B3-20-08L (SEQ ID NO: 38) y GpH7-B3-22-10E (SeQ ID NO: 39) resultantes de la introducción de las alteraciones S239D, A330L e I332E, respectivamente, en GpH7-B3. Usando GpL16-k0 como cadena L, se expresaron y prepararon anticuerpos de interés según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, como control, se expresó y preparó un anticuerpo de interés usando GpL16-k0 y GpH7-B3 que no contiene la alteración. Se compararon los anticuerpos respectivos con respecto a la Tm del dominio CH2 mediante un ensayo de desplazamiento térmico según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5 (Tabla 27). En lo sucesivo en la presente memoria, a menos que se especifique otra cosa, Tm significa Tm del dominio CH2.

T l 27

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; la columna "H" indica los nombres de la región constante de la cadena H de cada anticuerpo; la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-B3/GpL16-k0 cuando no hay una mutación particular); la columna ''Tm'' indica la Tm de cada anticuerpo; y la columna ''ATm'' indica la diferencia en la Tm entre cada anticuerpo y GpH7-B3/GpL16-k0. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Cuando el anticuerpo homodimerizado GpH7-B3-06-09D/GpL16-k0 en el que se introdujo S239D, el anticuerpo homodimerizado GpH7-B3-20-08L/GpL16-k0 en el que se introdujo A330L y el anticuerpo homodimerizado GpH7-B3-22-10E/GpL16-k0 en el que se introdujo I332E se compararon con GpH7-B3/GpL16-k0, su Tm se redujo en 3 °C, 1 °C y 8 °C, respectivamente. Este resultado demuestra que, de las tres alteraciones, I332E tenía el mayor efecto para reducir la Tm de CH2, por tanto, se cree que I332E también contribuye a la disminución de la Tm de un anticuerpo en el que se ha introducido el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E.

La cadena lateral de I332E está rodeada por aminoácidos hidrófobos tales como V240, V323 y L328. En un anticuerpo en el que se ha introducido I332E, la interacción hidrófoba con restos circundantes se suprime debido a la sustitución de Ile hidrófoba por Glu hidrófilo, y se cree que esto contribuye a la desestabilización del dominio Fc. Al mismo tiempo, como se analizó en el Ejemplo 7, la interacción de I332E con FcYRIIIa se produce exclusivamente en cualquiera de las cadenas H. Por este motivo, se pensó que cuando 1332 permanece sin sustituir en la otra cadena H que no está implicada en la interacción con FcYRIIIa, se puede mantener la estabilidad termodinámica al tiempo que se confiere el efecto de mejorar la unión a FcYRIIIa. A continuación, los presentes inventores introdujeron I332E en una sola cadena H y evaluaron si la Tm está elevada en comparación con cuando se introduce I332E en las dos cadenas H. Se construyeron vectores de expresión en los que se habían insertado GpH7-A44 (SEQ ID NO: 49) y GpH7-B80 (SEQ ID NO: 50) resultantes de la introducción de I332E en GpH7-A5 y GpH7-B3, respectivamente. Se combinaron con GpH7-B3, GpH7-A5 y GpL16-k0 para expresar y preparar los siguientes anticuerpos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1: los anticuerpos heterodimerizados GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0 y GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0 en los que en una sola de las cadenas H se introdujo I332E, y el anticuerpo homodimerizado GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujo I332E. Se preparó GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 como control. Se evaluó la actividad de unión de FcYRIIIa de cada anticuerpo según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Además, los anticuerpos se compararon con respecto a la Tm del dominio CH2 mediante un ensayo de desplazamiento térmico según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5 (Tablas 28 y 29).

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de cada anticuerpo; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 cuando no hay ninguna mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 para FcYRIIIa por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

La tabla muestra la Tm de CH2 de anticuerpos con sustitución I332E en una cadena H y anticuerpos con sustitución I332E en las dos cadenas H.

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de cada anticuerpo; la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular); la columna "Tm" indica la Tm de cada anticuerpo; y la columna "ATm" indica la diferencia en la Tm entre cada anticuerpo y GpH7-B3/GpL16-k0. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

El resultado que se muestra en la Tabla 28 demuestra que la actividad de unión a FcYRIIIa del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0 en el que en solo una de las cadenas H se introdujo I332E aumentó aproximadamente 3 veces con respecto a GpH7- A5/GpH7-B3/GpL16-k0, mientras que la actividad de GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0 aumentó aproximadamente 4 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Por este resultado, se pensó que el efecto de I332E para aumentar la actividad de unión a FcyRIII no se altera significativamente independientemente de cuándo se introduce I332E en GpH7-A5 o se introduce en GpH7-B3. Al mismo tiempo, la actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujo I332E aumentó aproximadamente 7 veces con respecto a GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Estos hallazgos revelaron que I332E tiene un efecto para aumentar suficientemente la actividad de unión a FcYRIIIa aunque se introduzca en una sola cadena H, si no se introduce en las dos cadenas H, como se considera basándose en la estructura tridimensional.

Además, el resultado que se muestra en la Tabla 29 reveló que la Tm de los anticuerpos heterodimerizados GpH7-A5/GpH7-B80/GpL16-k0 y GpH7-A44/GpH7-B3/GpL16-k0 en los que I332E se introdujo en una sola cadena H, disminuyó en ambos casos 4 °C en comparación con la Tm de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, que es su molécula Fc parental. Por lo tanto, se pensó que no hay diferencia en la influencia de I332E sobre la Tm del anticuerpo independientemente de cuándo se introduce I332E en GpH7-A5 o GpH7-B3. Al mismo tiempo, la Tm del anticuerpo homodimerizado GpH7-A44/GpH7-B80/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujo I332E disminuyó 10 °C en comparación con la de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. La Tm del anticuerpo heterodimerizado en el que en una sola de las cadenas H se introdujo I332E se mantuvo 6 °C más alta que la del anticuerpo homodimerizado en el que en las dos cadenas H se introdujo I332E. Este resultado demuestra que la disminución de la Tm puede suprimirse utilizando un anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una, no en las dos, cadenas H se introduce I332E. Esto muestra que la tecnología de anticuerpos heterodimerizados es útil para mantener la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo.

La alteración I332E es superior en términos del efecto para potenciar la unión a FcYRIIIa; sin embargo, si se utilizan anticuerpos homodimerizados convencionales con ella, su estabilidad termodinámica se reduce significativamente, y esto supone un problema cuando los anticuerpos se utilizan como productos farmacéuticos. Sin embargo, los resultados mostrados en las Tablas 28 y 29 demuestran que el uso de un anticuerpo heterodimerizado permite aprovechar el efecto de I332E para potenciar la unión a FcYRIIIa mientras se mantiene la estabilidad fisicoquímica del anticuerpo. Por este hallazgo, se cree que los anticuerpos heterodimerizados son una tecnología excelente para ajustar con mayor precisión la actividad de unión a FcyR y la estabilidad fisicoquímica de los anticuerpos.

GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 tiene S239D, A330L e I332E en una sola cadena H y, por lo tanto, posiblemente conserva una Tm alta en comparación con GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que las dos cadenas H tienen S239D, A330L e I332E. Por lo tanto, los anticuerpos heterodimerizados y homodimerizados resultantes de la combinación del grupo de las alteraciones L234Y, G236W e S298A con el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E descritas en el Ejemplo 7 se ensayaron con respecto a la Tm según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5.

Para evaluar esto, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujo el grupo de las alteraciones L234Y, G236W, y S298A y en la otra cadena H se introdujo el grupo de las alteraciones S239D, A330L y I332E; el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en solo una de las cadenas H se introdujo el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A; el anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujo el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A; el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en solo una de las cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E, y el anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E, se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. La influencia de la combinación de L234Y, G236W y S298A con S239D, El efecto de A330L e I332E sobre la Tm se evaluó comparando la Tm del dominio CH2 de los anticuerpos respectivos mediante un ensayo de desplazamiento térmico según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5 (Tabla 30).

La columna "Muestra" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H de cada anticuerpo; la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-G1d/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular); la columna "Tm" indica la Tm de cada anticuerpo; y la columna "ATm" indica la diferencia en la Tm entre cada anticuerpo y GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Se comparó GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se habían introducido las alteraciones D356K/H435R y K439E para aumentar la eficacia de la formación de anticuerpos heterodimerizados con GpH7-G1d/GpL16-k0 que es una IgG1 nativa. La Tm de CH2 se redujo 1 °C.

Se evaluó el efecto de cada grupo de alteración sobre los anticuerpos homodimerizados de la tecnología de la técnica anterior. La Tm del anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E disminuyó 20 °C en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, no se observó disminución de la Tm para el anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas se introdujo el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A. Por lo tanto, se pensó que el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A no tiene el efecto de disminuir la Tm de los anticuerpos homodimerizados.

Los anticuerpos heterodimerizados en los que en solo una de las cadenas H se introdujo cada grupo de alteración se evaluaron para determinar el efecto de cada grupo de alteración. La Tm del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujo S239D, A330L e I332E disminuyó 8 °C en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, no se observó una disminución de Tm para el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y, G236W y S298A. Por estos hallazgos, se pensó que el grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A tampoco tienen el efecto de disminuir la Tm de los anticuerpos heterodimerizados.

La Tm de GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E disminuyó 21 °C en comparación con la IgG1 nativa. La Tm de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que solo una de las cadenas H tiene las alteraciones S239D, A330L e I332E era de 60 °C y conservó la Tm 10 °C o más por encima de la del anticuerpo homodimerizado. Como se muestra en la Tabla 13 del Ejemplo 7, la unión a FcYRIIIa del anticuerpo homodimerizado con S239D, A330L e I332E aumentó aproximadamente 9 veces con respecto a la del anticuerpo heterodimerizado con S239D, A330L e I332E. S239D, a 330L e I332E, cuando se introducen en las dos cadenas H, potencian fuertemente la unión a FcYRIIIa, pero reducen significativamente la Tm.

Además, la Tm de GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron L234Y, G236W y S298A solo disminuyó 1 °C en comparación con el anticuerpo nativo. Se pensó que la disminución de la Tm se debía a la influencia de las alteraciones D356K/H435R y K439E usadas para construir el anticuerpo heterodimerizado como se analizó anteriormente, en lugar de deberse a L234Y, G236W y S298A. Esto también se muestra por el hecho de que la Tm de GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron l234Y, G236W y S298A también se redujo solo 1 °C.

Por último, la Tm de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que una de las cadenas H tiene L234Y, G236W y S298A y la otra cadena H tiene S239D, A330L e I332E disminuyó 10 °C en comparación con el anticuerpo nativo, y fue casi equivalente a la de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E. Sin embargo, como se muestra en la Tabla 13 del Ejemplo 7, la unión a FcYRIIIa de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 se potencia 10 veces o más en comparación con la de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0.

Es decir, se demostró que, mediante el uso del anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y, G236W y S298A y en la otra se había introducido S239D, A330L e I332E, se puede potenciar la unión a FcYRIIIa, y además, la Tm puede aumentar 10 °C o más, en comparación con el anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 con S239D, A330L e I332E.

A continuación, las muestras descritas anteriormente sometidas a medición de la Tm se evaluaron adicionalmente para determinar la estabilidad termodinámica mediante el estudio de estabilidad térmica en condiciones aceleradas descrito en el Ejemplo de Referencia 6 (a 40 °C durante dos o cuatro semanas) (Fig. 30).

Cuando se comparó GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 con el anticuerpo nativo GpH7-G1d/GpH7-G1d/GpL16-k0, los contenidos de monómero del primero y el segundo se redujeron en un 1,27 % y un 1,86 % después de cuatro semanas, respectivamente, y no hubo una diferencia significativa. Por lo tanto, se pensó que las alteraciones D356K/H435R y K439E utilizadas para construir el anticuerpo heterodimerizado casi no tienen influencia sobre el cambio en el contenido de monómero en el estudio de estabilidad térmica en condiciones aceleradas.

Con respecto a GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E, el contenido de monómero se redujo aproximadamente un 16 % después de cuatro semanas. Al mismo tiempo, el contenido de monómero de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que solo una de las cadenas H tiene las alteraciones S239D, A330L e I332E se redujo un 9,63 % después de cuatro semanas. Por lo tanto, se demostró que el efecto de mantener de manera más estable el contenido de monómero se conseguía mediante el uso de anticuerpos heterodimerizados en los que en solo una de las cadenas H se había introducido S239D, A330L e I332E.

Además, el contenido de monómero de GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron L234Y, G236W y S298A y de GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y, G236W y S298A solo se redujeron un 1,78 % y un 1,42 % después de cuatro semanas, respectivamente. No hubo una diferencia clara en el cambio del contenido de monómero en comparación con el anticuerpo nativo. Por lo tanto, se pensó que L234Y, G236W y S298A no afectan al contenido de monómero en el estudio de estabilidad térmica en condiciones aceleradas, se introduzcan en una cadena H o en las dos cadenas H.

Por último, el contenido de monómero de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que una de las cadenas H tiene L234Y, G236W y S298A y la otra cadena H tiene S239D, A330L e I332E se redujo un 2,47 % después de cuatro semanas. El contenido de monómero se redujo solo ligeramente en comparación con el 1,86 % del anticuerpo nativo. Por lo tanto, se demostró que, mediante el uso del anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que una de las cadenas H tiene L234Y, G236W y S298A y la otra cadena H tiene S239D, A330L e I332E, se puede potenciar la unión a FcYRIIIa, y además, se puede conseguir el efecto de conservar el contenido de monómero a un alto nivel en el estudio de estabilidad térmica en condiciones aceleradas en comparación con el anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 con S239D, A330L e I332E.

Por lo tanto, se demostró que, en comparación con los anticuerpos homodimerizados convencionales, la tecnología de anticuerpos heterodimerizados no solo es capaz de potenciar la unión a FcyR, sino que también mejora la estabilidad y, por lo tanto, aumenta el valor de los anticuerpos como productos farmacéuticos más que los anticuerpos homodimerizados.

[Ejemplo 10] Búsqueda de alteraciones que mejoran la unión a FcyR pero no reducen la estabilidad

Como se describe en el Ejemplo 9, la actividad de unión a FcyR aumenta al introducir alteraciones en la cadena H. Sin embargo, tales alteraciones pueden reducir la estabilidad fisicoquímica de CH2, es decir, reducir la Tm. Sin embargo, como se describe en el Ejemplo 9, estas propiedades son desfavorables, en particular cuando los anticuerpos se utilizan como productos farmacéuticos. Como se describe en el Ejemplo 9, es útil utilizar el anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una de las cadenas H se han introducido alteraciones para potenciar la actividad de unión a FcyR mientras se suprime la desestabilización de CH2. Específicamente, con respecto a las alteraciones que disminuyen la Tm de los anticuerpos homodimerizados aunque se observe que potencian la actividad de unión a FcyR de los anticuerpos homodimerizados convencionales, tales como las que corresponden a las Regiones ii y iii mostradas en la Fig. 21, su heterodimerización permite que la Tm sea más alta que la de los anticuerpos homodimerizados mientras se aumenta la actividad de unión a FcyR en comparación con el anticuerpo nativo.

Para encontrar tales alteraciones, los anticuerpos homodimerizados en las Regiones ii y iii que se muestran en la Fig. 21 se ensayaron con respecto a la Tm según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5. En las Tablas 31 a 35 se muestra una lista de alteraciones que reducen la Tm en comparación con el anticuerpo nativo.

La Tabla 31 (Tablas 31-1 a 31-3) muestra datos para Ia donde la Tm es 68 °C o menos para la Región ii o iii; La Tabla 32 (Tablas 32-1 y 32-2) muestra datos para IIaR donde la Tm es 68 °C o menos para la Región ii o iii; La Tabla 33 (Tablas 33-1 y 33-2) muestra datos para IIaH donde la Tm es 68 °C o menos para la Región ii o iii; La Tabla 34 (Tablas 34- 1 y 34-2) muestra datos para IIb donde la Tm es 68 °C o menos para la Región ii o iii; La Tabla 35 (Tablas 35-1 y 35- 2) muestra datos para IIIa donde la Tm es 68 °C o menos para la Región ii o iii.

Pueden producirse anticuerpos que tienen una unión a FcyR mejorada en comparación con el anticuerpo nativo y cuya estabilidad no se reduce significativamente mediante el uso de un anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una de las cadenas H se introducen estas alteraciones.

T l 1-1

continuación

T l 1-21

continuación

T l 1-1

continuación

T l 2-11

continuación

T l 2-21

continuación

-

continuación

T l -21

T l 4-11

continuación

-

continuación

T l -11

continuación

-

[Ejemplo 11] Ensayo de actividad de ADCC de anticuerpos heterodimerizados con capacidad mejorada para reconocer FcYRIIIa

Como se analizó en el Ejemplo 7, usando el anticuerpo heterodimerizado, la actividad de unión a FcYRIIIa se incrementó con éxito más que la de las variantes producidas por la tecnología de anticuerpos homodimerizados convencional. Los anticuerpos inducen a las células NK a través de FcYRIIIa para que presenten citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo contra células que expresan el antígeno diana. Para evaluar si los anticuerpos heterodimerizados no solo han aumentado la actividad de unión a FcYRIIIa, sino que también han aumentado la actividad de ADCC, se ensayó la actividad de ADCC en los anticuerpos heterodimerizados con mayor actividad de unión a FcYRIIIa mostrados en la Tabla 13 del Ejemplo 7, en anticuerpos homodimerizados y en la IgG 1 nativa, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 7. Los resultados se muestran en la Fig. 31.

Basándose en los resultados mostrados en la Fig. 31, cuando GpH7-G1d/GpL16-k0, que es una IgG 1 nativa, se compara con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se introdujeron cada una de las alteraciones D356K, H435R y K439E en una cadena H, no hay una diferencia significativa en la actividad de ADCC. Por lo tanto, se pensó que las alteraciones D356K, H435R y K439E no afectan a la actividad de ADCC.

A continuación, se examinaron anticuerpos homodimerizados en los que se introdujo una alteración que aumenta la actividad de unión a FcYRIIIa en las dos cadenas H de forma convencional, para evaluar si la misma tendencia que se observa en el efecto potenciador de la unión también se observa para la actividad de ADCC. Se comparó GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A con GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E. Con respecto a la actividad de unión a FcYRIIIa, la unión de GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 se potenció notablemente en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, mientras que la unión de GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 se redujo. Del mismo modo, la actividad de ADCC de GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 aumentó más que la de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, mientras que la actividad de GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 se redujo en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Por lo tanto, en cuanto a los anticuerpos homodimerizados, se observó una correlación entre el nivel de actividad de unión a FcYRIIIa y el de la actividad de ADCC.

A continuación, se examinaron anticuerpos heterodimerizados en los que en solo una de las cadenas H se introdujo una alteración que aumenta la actividad de unión a FcYRIIIa para evaluar si se observa la misma tendencia que se observa en el efecto potenciador de la unión para la actividad de ADCC. Se comparó GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A con GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E. Las actividades de unión a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 y GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 aumentaron en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Se observó la misma tendencia para la actividad de ADCC. Además, la actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 aumentó más que la de GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0; sin embargo, se obtuvo la misma tendencia para la actividad de ADCC. Por lo tanto, no solo los anticuerpos homodimerizados, sino también los anticuerpos heterodimerizados, tienen una correlación entre el nivel de actividad de unión a FcYRIIIa y la actividad de ADCC.

A continuación, con respecto a cada uno de los grupos de las alteraciones L234Y, G236W y S298A, y las alteraciones S239D, A330L e I332E, se evaluó si los anticuerpos heterodimerizados y los anticuerpos homodimerizados tienen una correlación entre los efectos para potenciar la actividad de unión a FcYRIIIa y la actividad de ADCC. En primer lugar, cuando GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0, que es un anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una de las cadenas H se introdujo el grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E, se comparó con GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0, que es un anticuerpo homodimerizado en el que en las dos cadenas H se introdujo el grupo, el efecto para potenciar la actividad de unión a FcYRIIIa fue mayor en el anticuerpo homodimerizado que en el anticuerpo heterodimerizado; sin embargo, no hubo diferencia para la actividad de ADCC. Además, cuando GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0, que es un anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una de las cadenas H se introdujo el grupo de alteraciones L234Y, G236W e S298A, se comparó con GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0, que es un anticuerpo homodimerizado en el que en las dos cadenas H se introdujo el grupo, con respecto a la actividad de unión a FcYRIIIa, la unión del anticuerpo heterodimerizado se potenció más fuertemente que la de GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0, mientras que se redujo la unión del anticuerpo homodimerizado. Se observó la misma tendencia para la actividad de ADCC. Por lo tanto, se pensó que el efecto del grupo de las alteraciones L234Y, G236W y S298A para aumentar la actividad de unión a FcYRIIIa desde una sola dirección se refleja en la actividad de ADCC. Por estos resultados, se pensó que en anticuerpos heterodimerizados en los que en solo una de las cadenas H se ha introducido un grupo de alteraciones, y en anticuerpos homodimerizados en los que en las dos cadenas H se ha introducido el grupo, existe una correlación entre el nivel de actividad de unión a FcYRIIIa y la actividad de ADCC.

Posteriormente, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y, G236W y S298A y en la otra cadena H se introdujeron S239D, A330L e I332E se compararon con el anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D, A330L e I332E. Con respecto a la actividad de unión a FcYRIIIa, los dos tenían actividades de unión notablemente aumentadas en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Se observó la misma tendencia para la actividad de ADCC. Además, la actividad de unión a FcYRIIIa de GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 aumentó más que la de GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0, y GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 también presentó un actividad de ADCC más fuerte.

Como se ha descrito anteriormente, con respecto a los grupos de las alteraciones L234Y, G236W y S298A, y las alteraciones S239D, A330L e I332E, se observó que el último grupo de alteraciones, S239D, A330L e I332E, tiene un efecto más fuerte para aumentar la actividad de ADCC independientemente de cuándo se introduce en una cadena H o en las dos cadenas H. Por otro lado, se demostró que, cuando el grupo de alteraciones L234Y, G236W e S298A y el grupo de las alteraciones S239D, A330L e I332E se introducen respectivamente en diferentes cadenas H, el efecto para aumentar la actividad de ADCC es más fuerte que cuando S239D, A330L e I332E, que tienen un fuerte efecto para aumentar la actividad de ADCC en anticuerpos heterodimerizados y homodimerizados, se introducen en las dos cadenas H.

Es decir, se demostró que la correlación entre el nivel de actividad de unión a FcYIIIa y el nivel de ADCC, tal como la que se observó en anticuerpos homodimerizados de la tecnología de la técnica anterior, también se observa cuando se comparan anticuerpos heterodimerizados entre sí y cuando se comparan anticuerpos heterodimerizados y homodimerizados. Esto revela que el uso de la tecnología de anticuerpos heterodimerizados permite la preparación de anticuerpos que tienen una actividad de ADCC superior a la de los obtenidos por tecnologías convencionales.

[Ejemplo 12] Comparación de anticuerpos homodimerizados convencionales y nuevos anticuerpos heterodimerizados en relación con FcYRIIa

Como se describe en el Ejemplo 1, se cree que FcYRIIIa desempeña un papel importante en la eficacia farmacológica de productos farmacéuticos de anticuerpos. Además, se ha destacado el papel que desempeña FcYRIIa en la eficacia farmacológica de los productos farmacéuticos de anticuerpos derivados de IgG1, aparte de FcYRIIIa.

En el caso de FcYRIIa, hay alotipos denominados tipos R y H, que tienen Arg e His en la posición del aminoácido 131, respectivamente, y se sabe que difieren en la actividad de unión a IgG2 humana (Tissue Antigens 2003, 61, 189-202). Se sabe que la susceptibilidad a la infección varía dependiendo de la diferencia en el alotipo de FcYRIIa (Tissue Antigens 2003: 61: 189-202). Se cree que esto se debe a que la actividad de unión a IgG2 de FcYRIIa varía dependiendo de la diferencia en el alotipo y, como resultado, difiere el mecanismo de resistencia a los patógenos a través de la IgG2 (Infection and Immunity 1995, 63, 73-81). Al mismo tiempo, se sabe que las células que expresan FcyRIV de ratón corresponden a células que expresan FcYRIIa humano, y se ha notificado que FcyRIV desempeña un papel importante en la eficacia farmacológica de un anticuerpo anti-CD20 en un modelo de ratón. Estos hallazgos sugieren que, en seres humanos, FcYRIIa desempeña un papel similar (The Journal of Experimental Medicine 2004: 199: 1659-1669; The Journal of Experimental Medicine 2006, 203, 743-753; Immunity 2005, 23, 41-51). De hecho, se ha notificado que, un anticuerpo en el que se potencia la actividad de unión a FcYRIIa de la región Fc en comparación con IgG 1 potencia la actividad de fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) mediada por macrófagos en comparación con IgG1 (Molecular Cancer Therapeutics 2008, 7, 2517-2527). Además, en un modelo de xenoinjerto de ratón, un anticuerpo anti-CD19 que tiene un dominio Fc con ADCP potenciada presenta un efecto antitumoral más fuerte que el de la IgG1 (Nature Medicine 2000, 6, 443-446). El dominio Fc de este anticuerpo tiene una mayor actividad de unión a FcYRIIa de mono. CD19 se expresa en la superficie de células B. Se ha notificado que este anticuerpo, cuando se administra a monos, potencia la eliminación de células B en comparación con un anticuerpo anti-CD19 que tiene la región Fc de IgG 1 (Science 2005, 310, 1510-1512).

Por estos informes, es de esperar que la eficacia de los productos farmacéuticos de anticuerpos, en particular, el efecto antitumoral, pueda mejorarse adicionalmente aumentando la actividad de unión a FcYRIIa además de potenciar la actividad de unión a FcYRIIIa. Se han producido anticuerpos con estas características utilizando tecnologías convencionales (Molecular Cancer Therapeutics 2008, 7, 2517-2527). Sin embargo, como se cree que FcYRIIa se une a un dominio Fc de anticuerpo de manera asimétrica, se considera que la actividad de unión a FcYRIIa se puede incrementar adicionalmente usando la tecnología de anticuerpos heterodimerizados como se describe en el Ejemplo 11. Para evaluar esto, se seleccionaron alteraciones que aumentan la actividad de unión a todos los receptores FcYRIIIa, FcgRIIa de tipo R y FcgRIIa de tipo H en comparación con la IgG nativa basándose en el resultado que se muestra en el Ejemplo 4, y se combinaron para introducir las mutaciones que potencian la actividad de unión a todos los receptores FcYRIIIa, FcgRIIa de tipo R y FcgRIIa de tipo H, y se produjeron anticuerpos heterodimerizados para tener una combinación de cadenas H con unión diferencial a FcyR. Se evaluó la actividad de unión de los anticuerpos a cada FcyR.

Al mismo tiempo, a diferencia de estos FcyR activadores, FcYRIIb, que es un FcyR inhibidor, induce una señal intracelular que suprime la respuesta inmunitaria. Se ha notificado que en ratones knockout para FcYRIIb (con inactivación del gen de FcYRIIb), el efecto antitumoral de los anticuerpos aumenta (Nature Medicine 2000, 6, 443-446) y se promueve la eliminación de células B mediada por anticuerpos (The Journal of Experimental Medicine 2006, 203, 743-753), lo que demuestra que el FcYRIIb desempeña un papel importante en la eficacia farmacológica de los anticuerpos in vivo. Al mismo tiempo, se ha observado una correlación entre el efecto antitumoral de la subclase de IgG de ratón y la relación entre la actividad de unión a FcyR activadores frente a la actividad de unión a FcyR inhibidores (relación A/I) de cada subclase de IgG (Science 2005, 310, 1510-1512). Estos informes sugieren que las relaciones A/I son importantes para la función efectora de los anticuerpos a través de la inmunidad. Específicamente, cuando se producen anticuerpos para que tengan una relación A/I más alta, se potencia su función efectora y tales anticuerpos son útiles. Sin embargo, era previsible que fuera extremadamente difícil aumentar la relación A/I aumentando la actividad de unión a FcYRIIa sin aumentar la actividad de unión a FcYRIIb, debido a que la homología de secuencia entre FcYRIIa, que es un FcyR activador, y FcYRIIb, que es un FcyR inhibidor, es del 93 %, que es extremadamente alta, en sus dominios extracelulares. Al igual que FcYRIIIa y FcYRIIa, se cree que FcYRIIb se une a un dominio Fc de anticuerpo de manera asimétrica. Con tecnologías convencionales, la interacción con FcyR solo puede regularse introduciendo la misma alteración en las dos cadenas H de un anticuerpo. Por el contrario, el uso de la tecnología de anticuerpos heterodimerizados permite una regulación más precisa y, por lo tanto, permite mejorar la relación A/I incluso entre FcYRIIa y FcYRIIb cuyas secuencias son muy similares. Por lo tanto, los presentes inventores también evaluaron, desde este punto de vista, si la tecnología de anticuerpos heterodimerizados es superior a las tecnologías convencionales.

En esta evaluación, para formar eficazmente anticuerpos heterodimerizados, se utilizó la tecnología de botones en ojales para la región constante de la cadena H del anticuerpo. La tecnología de botones en ojales es una tecnología que permite la promoción de la heterodimerización de las cadenas H y la preparación eficiente de anticuerpos heterodimerizados de interés mediante la sustitución de una cadena lateral de aminoácido con una cadena lateral más grande (botón) en el dominio CH3 de una cadena H y la sustitución de una cadena lateral de aminoácidos con una cadena lateral más pequeña (ojal) en el dominio CH3 de la otra cadena H de forma que el botón se coloque en el ojal (Nature, 372, 379-383 (1994)). Una cadena H en cuya región constante se han introducido las alteraciones Y349C y T366W con la intención de que tengan cadenas laterales de aminoácidos más grandes en el dominio CH3 se denomina "cadena de botón". Cuando se introduce una alteración adicional en esta cadena, el nombre de la región constante de la cadena H comienza con el símbolo "Kn", que va seguido de un número de tres dígitos, tal como Kn001. Una cadena H en cuya región constante se han introducido las alteraciones D356C, T366S, L368A e Y407V con la intención de que tenga cadenas laterales de aminoácidos más pequeñas en el dominio CH3 se denomina "cadena de ojal". Cuando se introduce una alteración adicional en esta cadena, el nombre de la región constante de la cadena H comienza con el símbolo "Hl", que va seguido de un número de tres dígitos y, por lo tanto, se denomina, por ejemplo H1001. Además, cuando las regiones constantes de la cadena H del anticuerpo son Kn001 y H1001, las secuencias de las cadenas H de un anticuerpo cuyas regiones variables tienen GpH7 se denominan GpH7-Kn001 y GpH7-H1001, respectivamente. Un anticuerpo purificado después de la expresión se denomina, por ejemplo, GpH7-Kn001/GpH7-H1001/GpL16-k0 cuando la secuencia correspondiente a una cadena H del anticuerpo utilizada para expresar el anticuerpo heterodimerizado es GpH7-Kn001, y la secuencia correspondiente a la otra cadena H del anticuerpo es GpH7-H1001, y la secuencia correspondiente a la cadena L del anticuerpo es GpL16-k0.

En primer lugar, se construyeron GpH7-Kn033 (SEQ ID NO: 51) resultante de la introducción de las alteraciones Y349C y T366W en la región constante para GpH7-Gld, y GpH7-H1033 (SEQ ID NO: 56) resultante de la introducción de las alteraciones D356C, T366S, L368A e Y407V en la región constante para GpH7-Gld según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Cuando se expresaron anticuerpos heterodimerizados, se utilizaron los siguientes vectores de expresión para una expresión eficaz de los mismos:

un vector de expresión en el que se había insertado GpL16-k0 para la cadena L del anticuerpo; para una cadena H del anticuerpo, un vector de expresión en el que se había insertado una secuencia en la que se había introducido una alteración adicional en GpH7-Kn033 (SEQ ID NO: 51) con introducción de las alteraciones Y349C y T366W; y, para la otra cadena H del anticuerpo, un vector de expresión en el que se había insertado una secuencia en la que se había introducido una alteración adicional en GpH7-H1033 (SEQ ID NO: 56) con introducción de las alteraciones D356C, T366S, L368A y Y407V.

Los anticuerpos cuya unión a todos los receptores FcYRIIIa, FcYRIIa de tipo R y FcYRIIa de tipo H que se pretende mejorar se produjeron como se describe a continuación, basándose en la información obtenida en el Ejemplo 4 sobre la influencia de cada alteración sobre la unión de un anticuerpo a cada FcyR. Cuando se introdujeron diferentes alteraciones en las regiones constantes de las respectivas cadenas H de un anticuerpo, se utilizaron GpH7-Kn033 y GpH7-H1033 como polipéptidos parentales. GpH7-Kn045 (SEQ ID NO: 54) resultante de la introducción de L234Y, L235Y, G236A, H268D e S298A en GpH7-Kn033; GpH7-Kn056 (SEQ ID NO: 55) resultante de la introducción de L234Y, L235Y, G236A, H268D, Q295L e S298A en GpH7-Kn033; GpH7-Hl048 (SEQ ID NO: 59) resultante de la introducción de G236A, S239D, A330K e I332E en GpH7-H1033; y GpH7-H1055 (SEQ ID NO: 60) resultante de la introducción de G236A, S239D, Q295L, A330M e I332e en GpH7-H1033, se construyeron según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

A continuación, se combinaron las respectivas cadenas H de la manera descrita a continuación, y los anticuerpos se expresaron de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 1. GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en G1d se expresó utilizando GpH7-Kn033 y GpH7-H1033 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L. El anticuerpo heterodimerizado GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 se expresó usando GpH7-Kn045 y GpH7-H1048 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L. El anticuerpo heterodimerizado GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0 se expresó usando GpH7-Kn045 y GpH7-H1055 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L. El anticuerpo heterodimerizado GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 se expresó usando GpH7-Kn056 y GpH7-Hl055 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L.

Los anticuerpos basados en el uso de tecnologías convencionales para la comparación se prepararon con referencia a Pro. Nat. Acad. Sci., 103, 4005-4010 (2006) como se describe a continuación. La alteración G236A/S239D/I332E, que, según se ha notificado, mejora la unión a todos los receptores FcYRIIIa, FcYRIIa de tipo R y FcYRIIa de tipo H, se introdujo en GpH7-Kn033 y GpH7-H1033 para construir GpH7-Kn037 (SEQ ID NO: 52) y GpH7-H1036 (SEQ ID NO: 57), respectivamente. Además, la alteración S239D/A330L/I332E, que, según se ha notificado, mejora la unión a FcYRIIIa, se introdujo en GpH7-Kn033 y GpH7-H1033 para construir GpH7-Kn032 (SEQ ID NO: 53) y GpH7-Hl032 (SEq ID NO: 58), respectivamente. Estas cadenas H se combinaron y los anticuerpos se expresaron de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 1. El anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, resultante de la introducción de G236A/S239D/I332E en las dos cadenas H de GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en Gld, se expresó utilizando GpH7-Kn037 y GpH7-Hl036 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L. El anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn032/GpH7Hl032/GpL16-k0, resultante de la introducción de S239D/A330L/I332E en las dos cadenas H de GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en Gld, se expresó utilizando GpH7-Kn032 y GpH7-Hl032 como cadena H y GpL16-k0 como cadena L.

Se evaluó la actividad de unión de estos anticuerpos a cada FcyR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. El resultado se resume en la Tabla 36. Al mismo tiempo, la relación de KD de cada anticuerpo se muestra en la Tabla 37, y la relación A/I, que es la relación de KD para FcYRIIIa, se resume en la Tabla 38.

La tabla muestra la actividad de unión a cada FcyR de anticuerpos heterodimerizados con unión potenciada a FcYRIIa y IIIa.

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "Kn" y "HI" indican los nombres de las regiones constantes de la cadena de botón y la cadena de ojal de cada anticuerpo; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 cuando no hay ninguna mutación particular).

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "Kn" y "HI" indican los nombres de las regiones constantes de la cadena de botón y la cadena de ojal de cada anticuerpo; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 para FcyR por la KD de cada anticuerpo se definió como "relación de KD". También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

T l

La tabla muestra la relación entre la actividad de unión al FcyR activador y la actividad de unión al FcyR inhibidor.

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "Kn" y "HI" indican los nombres de las regiones constantes de la cadena de botón y la cadena de ojal de cada anticuerpo; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 ("-": cuando no hay una mutación particular). El valor obtenido dividiendo la KD de GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 para FcYRIIb por la KD de cada anticuerpo para FcYRIIa de tipo H y de tipo R se definió como "relación A/I" para cada tipo. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Los resultados que se muestran en las Tablas 36 y 37 demuestran que, con respecto a GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron G236A/S239D/I332E, su unión a FcYRIIa de tipo H se potenció 22 veces, su unión a FcYRIIa de tipo R se potenció 43 veces y su unión a FcYRIIIa F se potenció 161 veces en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en G1d. Al mismo tiempo, el resultado que se muestra en la Tabla 38 demuestra que la relación A/I de GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 fue 8,6 para FcYRIIa de tipo H y 13 para FcYRIIa de tipo R, que aumentaron en comparación con, respectivamente, los valores 6,2 y 4,9 de GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0.

Los resultados que se muestran en las Tablas 36 y 37 demuestran que, con respecto a GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D/A330L/I332E, su unión a FcYRIIa de tipo H se potenció 1,2 veces, su unión a FcYRIIa de tipo R se potenció 3,0 veces y su unión a FcYRIIIa F se potenció 381 veces en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-Hl033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en G1d. Al mismo tiempo, el resultado que se muestra en la Tabla 38 demuestra que la relación A/I de GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 fue 0,93 para FcYRIIa de tipo H y 1,8 para FcYRIIa de tipo R, que se redujeron en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0.

Los resultados que se muestran en las Tablas 36 y 37 demuestran que, con respecto a GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL 16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A y en la otra cadena H G236A/S239D/A330K/I332E, su unión a FcYRIIa de tipo H se potenció 52 veces, su unión a FcYRIIa de tipo R se potenció 154 veces y su unión a FcYRIIIa F se potenció 419 veces en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en G1d. El resultado también muestra que, para los tipos H y R, la actividad de unión a FcYRIIa aumentó en comparación con el anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron G236A/S239D/I332E de la tecnología de la técnica anterior. Además, la actividad de unión a FcYRIIIa F aumentó ligeramente en comparación con el anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D/A330L/I332E de la tecnología de la técnica anterior. El resultado que se muestra en la Tabla 38 demuestra que la relación A/I de GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 fue 9,5 para FcYRIIa de tipo H y 22 para FcYRIIa de tipo R, que aumentaron en comparación con cualquiera de GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 y GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0. El resultado demuestra que, utilizando la tecnología de anticuerpos heterodimerizados, las actividades de unión a FcYRIIa y FcYRIIIa F de GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 aumentan y el anticuerpo se une de forma más selectiva al FcyR activador, en comparación con cuando se utiliza la tecnología convencional.

Los resultados que se muestran en las Tablas 36 y 37 demuestran que, con respecto a GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/ GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y/L235Y/G236A/H268D/S298A y en la otra cadena H se introdujeron G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E, su unión a FcYRIIa de tipo H se potenció 21 veces, su unión a FcYRIIa de tipo R se potenció 56 veces y su unión a FcYRIIIa F se potenció 985 veces en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en G1d. El resultado también muestra que, para los tipos H y R, la actividad de unión a FcYRIIa fue casi equivalente a la del anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron G236A/S239D/I332E de la tecnología de la técnica anterior. La actividad de unión a FcYRIIIa F aumentó en comparación con el anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D/A330L/I332E de la tecnología de la técnica anterior. El resultado que se muestra en la Tabla 38 demuestra que la relación A/I de GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0 fue 8,3 para FcYRIIa de tipo H y 18 para FcYRIIa de tipo R, que aumentó en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 y GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0; y en comparación con GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, fue casi equivalente para FcYRIIa de tipo H y aumentó para FcYRIIa de tipo R. Este resultado demuestra que, utilizando la tecnología de anticuerpos heterodimerizados, en GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0, la actividad de unión a FcyRIII aumenta adicionalmente mientras que su actividad de unión a FcYRIIa aumenta en un grado comparable, y el anticuerpo se une de forma más selectiva al FcyR activador, en comparación con cuando se utiliza la tecnología convencional.

Los resultados que se muestran en las Tablas 36 y 37 demuestran que, con respecto a GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se introdujeron L234Y/L235Y/G236A/H268D/Q295L/S298A y en la otra cadena H se introdujeron G236A/S239D/Q295L/A330M/I332E, su unión a FcYRIIa de tipo H se potenció 20 veces, su unión a FcYRIIa de tipo R se potenció 44 veces y su unión a FcYRIIIa F se potenció 1114 veces en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, que es una molécula resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales solo en G1d. Este resultado también muestra que, para los tipos H y R, la actividad de unión a FcYRIIa fue equivalente a la del anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron G236A/S239D/I332E de la tecnología de la técnica anterior. La actividad de unión a FcYRIIIa F aumentó en comparación con el anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se introdujeron S239D/A330L/I332E de la tecnología de la técnica anterior. El resultado que se muestra en la Tabla 38 demuestra que la relación A/I de GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 fue 8,7 para FcYRIIa de tipo H y 16 para FcYRIIa de tipo R, que aumentó en comparación con GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 y GpH7-KnO32/GpH7-Hl032/GpL16-k0; y en comparación con GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, fue casi equivalente para FcYRIIa de tipo H y aumentó para FcYRIIa de tipo R. El resultado demuestra que, utilizando la tecnología de anticuerpos heterodimerizados, en GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0, la actividad de unión a FcyRIII aumenta adicionalmente mientras que su actividad de unión a FcYRIIa aumenta en un grado comparable, y el anticuerpo se une de forma más selectiva al FcyR activador, en comparación con cuando se utiliza la tecnología convencional.

[Ejemplo 13] Comparación con la tecnología convencional: evaluación de la estabilidad térmica de anticuerpos heterodimerizados con mayor actividad de unión a FcYRIIa y FcYRIIIa

Como se describe en el Ejemplo 9, los anticuerpos homodimerizados obtenidos por la tecnología convencional, aunque tienen una mayor actividad de unión a FcyR, son fisicoquímicamente inestables, lo que ha reducido su valor como productos farmacéuticos. Por otro lado, se reveló que la tecnología de anticuerpos heterodimerizados era conveniente para regular el efecto de cada alteración para potenciar la actividad de unión a FcyR y la influencia del aspecto fisicoquímico, y que era posible potenciar la actividad de unión a FcyR sin reducir la estabilidad fisicoquímica. Este ejemplo prueba si los anticuerpos con actividades de unión potenciadas a FcYRIIa y FcYRIIIa, que son FcyR activadores, análogamente no tienen reducida la estabilidad fisicoquímica, en particular, la estabilidad termodinámica. En cada anticuerpo evaluado con respecto a su actividad de unión a FcyR en el Ejemplo 11 se ensayó la Tm de la región CH2 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 5. El resultado se resume en la Tabla 39.

La tabla muestra la Tm de anticuerpos con actividades de unión a FcYRIIa y FcYRIIIa aumentadas.

El resultado que se muestra en la Tabla 39 demuestra que todos los anticuerpos heterodimerizados GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0, GpH7-Kn045/GpH7-Hl055/GpL16-k0 y GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 retuvieron una Tm alta en comparación con los anticuerpos homodimerizados GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 y GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 de la técnica anterior. Como se describe en el Ejemplo 11, los anticuerpos heterodimerizados tienen propiedades más adecuadas para conseguir la función efectora mediada por FcyR en comparación con los anticuerpos homodimerizados convencionales. Específicamente, el hallazgo descrito anteriormente demuestra que la unión a FcyR puede regularse con precisión sin reducir la estabilidad fisicoquímica de los anticuerpos utilizando la tecnología de anticuerpos heterodimerizados.

[Ejemplo 14] Efecto de una combinación de alteraciones que mejoran la selectividad por FcYRIIIa F, un FcyR activador.

Como se describe en el Ejemplo 8, son útiles las tecnologías para mejorar la selectividad por FcyR activadores y FcyR inhibidores. Este ejemplo prueba si la heterodimerización es eficaz para aumentar la relación entre la unión a FcYRIIIa F, un Fcy activador, y la unión a FcYRIIb, un FcyR inhibidor, es decir, es eficaz para mejorar la selectividad, como se describe en el Ejemplo 8. Específicamente, se combinaron L234Y, G236W y S298A (Región a que se muestra en la Tabla 22-1), que son alteraciones que aumentan la relación entre la unión a FcYRIIIa F, un Fcy activador, y la unión a FcYRIIb, un FcyR inhibidor, con las alteraciones S239D, A330L e I332E evaluadas en el Ejemplo 7, para probar si se puede lograr una mejora en la selectividad en anticuerpos heterodimerizados en comparación con anticuerpos homodimerizados.

Para evaluar esto, se construyeron vectores de expresión en los que se habían insertado GpH7-A57 (SEQ ID NO: 40) resultantes de la introducción de todas las alteraciones S239D, A330L e I332E en GpH7-A5; GpH7-B78 (SEQ ID NO: 41) resultante de la introducción de todas las alteraciones S239D, A330L e I332E en GpH7-B3; GpH7-TA7 (SEQ ID n O: 31) resultante de la introducción de todas las alteraciones L234Y, G236W y S298A en GpH7-A5; y GpH7-TA45 (SEQ iD NO: 32) resultante de la introducción de todas las alteraciones L234Y, G236W y S298a en GpH7-B3, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando estos vectores de expresión y GpH7-A5, GpH7-B3 y GpL16-k0, se expresaron y prepararon hetero GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A y en la otra se habían introducido S239d , A330L y I332E; GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en solo una de las cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A; GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A; GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en solo una las cadenas H se habían introducido S239D, A330L y I332E; y GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos preparados se ensayaron con respecto a las KD para FcYRIIIa y FcYRIIb según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 2. Se evaluó si cada anticuerpo mejoraba con respecto a la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa usando, como indicador, la relación FcYRIIIa/FcYRIIb que se obtiene dividiendo la KD de cada anticuerpo para FcYRIIb por la KD de cada anticuerpo para FcYRIIIa. El resultado de la evaluación se resume en la Tabla 40.

La columna "MUESTRA" indica los nombres de los anticuerpos; las columnas "HI" y "H2" indican los nombres de la región constante de la cadena H en cada anticuerpo; y la columna "SITIO DE MUTACIÓN" indica mutaciones que son diferentes en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 ("-": utilizado cuando no hay una mutación particular). Debajo de "Relación FcYRIIIa F/FcYRIIb" se indican los valores obtenidos dividiendo la KD de cada anticuerpo para FcYRIIb por la KD de cada anticuerpo para FcYRIIIa F. También se muestran las SEQ ID NO para las secuencias de aminoácidos de la cadena H y la cadena L de cada anticuerpo.

Cuando, según los resultados mostrados en la Tabla 40, una IgG1 nativa GpH7-G1d/GpL16-k0 se compara con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que se han introducido cada una de las alteraciones D356K, H435R y K439E en una cadena H, la relación FcYRIIIa/FcYRIIb es 2,5 y 1,9, respectivamente, y no existe una gran diferencia entre ellos. Esto sugiere que las alteraciones D356K, H435R y K439E no afectan la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa.

Se verificó el efecto de cada alteración sobre anticuerpos homodimerizados de la técnica anterior. La relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E fue 100 y aumentó en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, la relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 en el que en las dos cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A fue 5,3. En cuanto a los anticuerpos homodimerizados, se demostró que la combinación de S239D, A330L e I332E tiene el mayor efecto para mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa.

Posteriormente, en anticuerpos heterodimerizados en los que en solo una de las cadenas H se había introducido cada grupo de alteración se evaluó el efecto de cada grupo de alteración. La relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido S239D, A330L e I332E fue 7,9 y aumentó en comparación con GpH7-A5/GpH7-B3/GpL16-k0. Al mismo tiempo, la relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 en el que en una de las cadenas H se habían introducido L234Y, G236W y S298A fue 14. Estos resultados demuestran que, con respecto a los anticuerpos heterodimerizados, el grupo de alteraciones L234Y, G236W y S298A tiene el mayor efecto para aumentar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa.

Se evaluó la diferencia en el efecto de cada grupo de alteración en anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados. En cuanto a S239D, A330L e I332E, la relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado con estas alteraciones fue 7,9 mientras que la del anticuerpo homodimerizado con ellas fue 100. Estos resultados demuestran que S239D, A330L e I332E tienen el efecto de mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa tras la heterodimerización, y el efecto se potencia adicionalmente tras la homodimerización. Por otro lado, en cuanto a L234Y, G236A e S298A, la relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado con estas alteraciones fue 14, mientras que la del anticuerpo homodimerizado con ellas fue 5,3. Estos resultados demuestran que L234Y, G236A y S298A tienen el efecto de mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa tras la heterodimerización, pero el efecto se reduce con la homodimerización. Los resultados demuestran que el grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E en anticuerpos homodimerizados tiene un efecto para mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa mayor que el grupo de alteraciones L234Y, G236A e S298A, mientras que el grupo de alteraciones L234Y, G236A y S298A en anticuerpos heterodimerizados tiene un efecto para mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa mayor que el grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E.

Se demostró que la relación FcYRIIIa/FcYRIIb del anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B78/GpL16-k0 con el grupo de alteraciones L234Y, G236A y S298A en combinación con el grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E fue 244 y, por lo tanto, su efecto para mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa fue mayor en comparación con el anticuerpo heterodimerizado GpH7-TA7/GpH7-B3/GpL16-k0 que en solo una de las cadenas H tenía el grupo de alteraciones L234Y, G236A e S298A, el anticuerpo homodimerizado GpH7-TA7/GpH7-TA45/GpL16-k0 que en las dos cadenas H tiene el grupo de alteraciones L234Y, G236A e S298A, el anticuerpo heterodimerizado GpH7-A5/GpH7-B78/GpL16-k0 que en solo una de las cadenas H tiene el grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E, y el anticuerpo homodimerizado GpH7-A57/GpH7-B78/GpL16-k0 que en las dos cadenas H tiene el grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E. Se cree que estos resultados son una suma del efecto del grupo de alteraciones L234Y, G236A y S298A en un anticuerpo heterodimerizado para mejorar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa y el efecto del grupo de alteraciones S239D, A330L e I332E en un anticuerpo heterodimerizado. Específicamente, se reveló que los anticuerpos heterodimerizados muestran un efecto excelente en la mejora de la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa en comparación con los anticuerpos homodimerizados.

Específicamente, se demostró que el uso de anticuerpos heterodimerizados, en lugar de anticuerpos homodimerizados convencionales, permite una optimización más precisa de la interacción asimétrica entre la región Fc y FcYRIIIa y el diseño de regiones Fc que tengan una mayor selectividad de la actividad de unión a FcYRIIIa.

[Ejemplo 15] Medición de la actividad de ADCC de anticuerpos heterodimerizados que presentan una unión potenciada a FcgRIIa

La actividad de ADCC de GpH7-G1d/GpL16-k0, GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0, GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0, GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0, GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 y GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0, preparados en el Ejemplo 12, se evaluó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 7.

Los resultados se resumen en la Fig. 33.

Cuando se compararon las actividades de ADCC de GpH7-G1d/GpL16-k0 y GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 basándose en la Fig. 33, estos anticuerpos tenían una actividad de ADCC. Este resultado demuestra que la tecnología de botones en ojales, incluso cuando se introduce en una región Fc de anticuerpo, no afecta a la unión a FcyR o a la actividad de ADCC.

Los dos anticuerpos heterodimerizados GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 y GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 descritos en el Ejemplo 12 presentaron una mayor actividad de ADCC en comparación con el anticuerpo GpH7-Kn033/GpH7-H1033/GpL16-k0 antes de la introducción de alteraciones. Al mismo tiempo, Los anticuerpos heterodimerizados GpH7-Kn045/GpH7-Hl048/GpL16-k0 y GpH7-Kn056/GpH7-Hl055/GpL16-k0 mostraron una actividad de ADCC comparable a la del anticuerpo homodimerizado GpH7-Kn037/GpH7-Hl036/GpL16-k0 que en las dos cadenas H tiene la alteración G236A/S239D/I332E que, según se ha notificado, potencia la unión a FcgRIIa R y a FcgRIIa H y la actividad de ADCP, y comparable a la del anticuerpo GpH7-Kn032/GpH7-Hl032/GpL16-k0 resultante de la aplicación de la potenciación de la actividad de ADCC existente.

Específicamente, como se ha mostrado en el Ejemplo 12, GpH7-Kn045/GpH7-H1048/GpL16-k0 y GpH7-Kn056/GpH7-H1055/GpL16-k0 no solo presentan una unión potenciada adicionalmente a FcgRIIa R y FcgRIIa H en comparación con la técnica existente, sino que también tienen un efecto de potenciación de la actividad de ADCC comparable al de la técnica de potenciación de la actividad de ADCC existente. Específicamente, los anticuerpos heterodimerizados evaluados en la presente memoria son superiores a la técnica existente en que no solo tienen un efecto potenciador de la actividad de ADCC comparable al conseguido por la técnica existente, sino que también presentan una unión potenciada a FcgRIIa H y FcgRIIa R.

[Ejemplo 16] Preparación de anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 que presenta unión potenciada a FcgRIIIa

Como se describe en el Ejemplo 11, se demostró que los anticuerpos heterodimerizados con mayor actividad de unión a FcYRIIIa tenían una actividad de ADCC mejorada. En el ejemplo 11, el efecto se demostró con anticuerpos contra GPC3. Se evaluó si se puede observar el mismo efecto para otros antígenos mediante la realización de un experimento similar utilizando un anticuerpo anti-epirregulina (EREG). En la presente memoria, la secuencia de la región variable de la cadena H del anticuerpo contra EREG se denomina H240 (SEQ ID NO: 80), y su secuencia de la cadena L que incluye las regiones variable y constante se denomina L73-k0 (SEQ ID NO: 106).

Basándose en los resultados del Ejemplo 4, se prepararon nuevas variantes que tenían cadenas H que presentan una unión potenciada a FcgRIIIa. En la presente memoria, se utilizó la técnica de botones en ojales descrita en el Ejemplo 12 como técnica de heterodimerización. Específicamente, se prepararon H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84) resultante de la introducción de alteraciones Y349C y T366W en la región constante de H240-G1d (SEQ ID NO: 83) y H240-H1033 (SEQ ID NO: 85) resultante de la introducción de alteraciones D356C, T366S, L368A e Y407V en la región constante de H240-Gld según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. A continuación, se preparó H240-Kn061 (SEQ ID NO: 81) introduciendo L234Y, L235Y, G236W, H268D y S298A en H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84) según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se construyó H240-Hl071 (SEQ ID NO: 82) introduciendo K326D, A330M y K334E en H240-H1033 (SEQ ID NO: 85) según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. El anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 se expresó combinando H240-Kn061, H240-H1071 y L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

Las variantes en las que se introdujeron S239D, A330L e I332E, que, según se ha notificado, potencian la unión a FcYRIIIa, se construyeron de la misma manera que se describe en el Ejemplo 12, para utilizarse con fines comparativos. Específicamente, se prepararon H240-Kn032 (SEQ ID NO: 86) y H240-Hl032 (SEQ ID NO: 87), resultantes de la introducción de S239D, A330L e I332E en H240-Kn033 (SEQ iD NO: 84) y H240-H1033 (SEQ iD NO: 85), respectivamente, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. El anticuerpo homodimerizado H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0 se expresó combinando H240-Kn032, H240-Hl032 y L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

A continuación, se preparó un anticuerpo afucosilado, que según se ha notificado, potencia la unión a FcgRIIIa (Glycobiol. Vol. 17 no. 1 pp. 104-118 (2006)). La función del transportador de fucosa se inhibe en las células donde la expresión del gen del transportador de fucosa se ha suprimido artificialmente en los dos cromosomas homólogos. Pueden obtenerse anticuerpos que carecen de fucosa utilizando tales células (documento WO 2006/067913, etc.). Como alternativa, también se pueden obtener anticuerpos que carecen de fucosa produciendo anticuerpos en células con expresión forzada de beta 1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III y alfa-manosidasa II de Golgi (Ferrara et al., Biotechnol. Bioeng. (2006) 93 (5), 851-861). Se expresaron H240-Gld (SEQ ID NO: 83) y L73-k0 (SEQ ID NO: 106) en combinación y se obtuvo el anticuerpo H240-afucosyl_G1d/L73-k0 (SEQ ID NO: 83 y 106) afucosilando H240-G1d/L73-k0 usando las tecnologías descritas anteriormente conocidas por los expertos en la técnica.

Además, se expresó H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 como control combinando H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84), H240-H1033 (SEQ ID NO: 85) y L73-k0 (SEQ ID NO: 106) según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

La actividad de unión de los anticuerpos a cada FcgR se evaluó según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8 y los resultados se resumen en la Tabla 41.

T l 41

Los resultados que se muestran en la Tabla 41 demuestran que la unión del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, en particular, a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V se potenció en comparación con H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Dado que el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 es una variante resultante de la introducción de L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A y K326D/A330M/K334E en H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, se puede decir que se potenció la unión de las alteraciones introducidas a FcgR.

Los resultados que se muestran en la Tabla 41 demuestran que la unión a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 se potenció en comparación con H240-afucosyl_G1d/L73-k0 y H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 resultante de la aplicación de la técnica de potenciación de la actividad de ADCC existente. Este resultado demuestra que el anticuerpo heterodimerizado presenta el fuerte efecto de potenciar la unión a FcgRIIIa en comparación con la técnica de potenciación de la actividad de ADCC basada en anticuerpos homodimerizados convencional y la técnica de potenciación de la actividad de ADCC basada en afucosilación.

Además, con respecto a la unión a FcgRIIa, que se cree que es importante para la potenciación de la actividad de ADCP, la unión de FcgRIIa H del anticuerpo heterodimerizado se potenció en comparación con los dos anticuerpos, y su unión a FcgRIIa R se potenció con respecto a H240-afucosyl_G1d/L73-k0 y fue comparable a la de H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0.

Se evaluó si el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado, es decir, tiene una actividad de unión a FcgR potenciada en comparación con los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo. En el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, se ha introducido L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A en H240-Kn061, que es una de las cadenas H, y se ha introducido K326D/A330M/K334E en H240-Hl071, que es la otra cadena H. El anticuerpo heterodimerizado se comparó con los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo para evaluar si el anticuerpo heterodimerizado tiene una actividad de unión más fuerte a cada FcgR. Específicamente, se construyeron H240-Hl134 (SEC ID NO: 88) resultante de la introducción de L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A en H240-H1033 y H240-Kn132 (SEC ID NO: 89) resultante de la introducción de K326D/A330M/K334E en H240-Kn033 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando estos vectores de expresión, se expresaron el anticuerpo homodimerizado H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A y el anticuerpo homodimerizado H240-Kn132/H240-H1071/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen K326D/A330M/K334E según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se midió la unión a FcgRIIIaF y FcgRIIIa V de anticuerpos homodimerizados y anticuerpos heterodimerizados H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, de los que cada una de las cadenas H tiene L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A o K326D/A330M/K334E, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se resumen en la Tabla 42.

Los resultados que se muestran en la Tabla 42 demuestran que la actividad de unión a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, que tiene en una de las cadenas H L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A y en la otra cadena H tiene K326D/A330M/K334E, es más fuerte que la actividad del anticuerpo homodimerizado H240-Kn061/H240-Hl134/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A y el anticuerpo homodimerizado H240-Kn132/H240-Hl071/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen K326D/A330M/K334E. Concretamente, se demostró que H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado, que es que tiene una actividad de unión a FcgR potenciada en comparación con los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo.

Posteriormente, se compararon las actividades de ADCC de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, H240-Kn032/H240H1032/L73-k0, H240-afucosyl_G1d/L73-k0 y H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 9. Los resultados se resumen en la Fig. 34.

Los resultados mostrados en la Fig. 34 demuestran que H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 presenta una actividad de ADCC significativamente más fuerte en comparación con H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Además, la actividad de ADCC fue más fuerte que la de H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 y H240-afucosyl_G1d/L73-k0 resultante de la aplicación de la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC. Concretamente, se demostró que H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 presenta una actividad de ADCC más fuerte que la conseguida con la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC.

[Ejemplo 17] Preparación de variantes adicionales usando el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como molde y evaluación de las mismas

En el Ejemplo 16 anterior se descubrió H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 que presenta una actividad de ADCC superior. Para revelar más variantes con actividad superior, se preparó un total de aproximadamente 420 tipos de variantes en las que los aminoácidos en las posiciones 231 a 242 (numeración EU) se han sustituido por 18 tipos de aminoácidos excluyendo Cys y el aminoácido original en cada una de las cadenas H de H240-Kn061 y H240-Hl071, utilizando H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como molde según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la unión de los anticuerpos a cada FcgR. Específicamente, se calculó el valor de KD de cada variante para cada FcgRI, FcgRIIa R, FcgRIIa H, FcgRIIb, FcgRNIa F y FcgRIIIa V según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8, y el valor de KD de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 para cada uno de FcgRI, FcgRIIa R, FcgRIIa H, FcgRIIb, FcgRIIIa F y FcgRIIIa V se dividió por el valor de KD obtenido anteriormente. El valor resultante se definió como KD relativa y se utilizó como indicador de evaluación. Específicamente, como indicador de la evaluación se utilizó el número de veces que cambió el valor de KD de cada variante para cada FcgR tomando el valor de KD de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 como 1. Cuando la KD relativa es mayor, significa que la unión de la variante a cada FcgR se potencia más fuertemente en comparación con H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0.

Los gráficos en los que los valores de KD relativa de las variantes respectivas para FcgRI, FcgRIIa R, FcgRIIa H, FcgRIIb, FcgRIIIa F o FcgRIIIa V se muestran en el eje vertical y los números de rango cuando se disponen las KD relativas en orden ascendente se muestran en el eje horizontal, se representan en las Fig. 35, 36, 37, 38, 39 y 40, respectivamente.

Por el resultado del análisis, se descubrieron variantes que potencian la unión a uno cualquiera o varios de FcgRIIa R, FcgRIIIa F y FcgRIIIa V sin potenciar la unión a FcgRIIb con respecto a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. Las alteraciones y las cadenas H con las alteraciones introducidas se resumen en la Tabla 43 (alteraciones que potencian la unión a FcgRIIa R y FcgRIIIa sin potenciar la unión a FcgRIIb). Se seleccionaron alteraciones en las que la KD relativa es 1 o menos para FcgRIIb y el valor de la KD relativa es 1,3 o más para uno cualquiera o varios de los receptores FcgRIIa R, FcgRIIIa F y FcgRIIIa V.

Los valores mostrados en la Tabla 43 anterior indican la KD relativa de cada variante para cada FcgR.

Las alteraciones tienen el efecto de potenciar la unión a FcgRIIa, que desempeña un papel importante en la actividad de ADCP, y la unión a FcgRIIIa, que desempeña un papel importante en la actividad de ADCC sin potenciar la unión a FcgRIIb, un FcgR inhibidor. Por lo tanto, se puede esperar una actividad antitumoral más fuerte, dado que la introducción de estas alteraciones incrementa las actividades de ADCC y ADCP sin potenciar la acción inmunosupresora del anticuerpo.

Además, se descubrieron variantes que potencian la unión a FcgRIIa H y FcgRIIa R sin reducir la unión a FcgRIIIa con respecto a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. Las alteraciones y las cadenas H con las alteraciones introducidas se resumen en la Tabla 44 (alteraciones que potencian la unión a FcgRIIa sin reducir la unión a FcgRIIIa). Se seleccionaron alteraciones en las que la KD relativa es 0,7 o más para FcgRIIIa F y FcgRIIIa V y la KD relativa es 1,5 o más para FcgRIIa H y FcgRIIa R.

T l 441

Los valores mostrados en la Tabla 44 anterior indican la KD relativa de cada variante para cada FcgR.

Las alteraciones potencian la unión a FcgRIIa, que desempeña un papel importante en la actividad de ADCP, sin reducir la unión a FcgRIIIa, que desempeña un papel importante en la actividad de ADCC, y algunas de las alteraciones potencian la unión a FcgRIIIa. Por lo tanto, se puede esperar una actividad antitumoral más fuerte introduciendo las alteraciones y aumentando así las actividades de ADCC y ADCP, o bien la actividad de ADCC o ADCP.

Además, se descubrieron variantes que reducen la unión a FcgRIIb sin reducir la unión a FcgRIIIa con respecto a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. Las alteraciones y las cadenas H con las alteraciones introducidas se resumen en la Tabla 45 (alteraciones que reducen la unión a FcgRIIb manteniendo al mismo tiempo la unión a FcgRIIIa). Se seleccionaron alteraciones en las que la KD relativa es 1 o más para FcgRIIIa F y FcgRIIIa V y la KD relativa es 0,5 o menos para FcgRIIb.

T l 4

Los valores mostrados en la Tabla 45 anterior indican la KD relativa de cada variante para cada FcgR.

Las alteraciones reducen la unión a FcgRIIb, un FcgR inhibidor, sin reducir la unión a FcgRIIIa, que desempeña un papel importante en la actividad de ADCC. Por lo tanto, se puede esperar una actividad antitumoral más fuerte, ya que la introducción de las alteraciones reduce la acción inmunosupresora del anticuerpo sin reducir la actividad de ADCC.

Además, dado que el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado, es decir, se une más fuertemente a FcgR que los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo, se cree que las variantes obtenidas introduciendo las alteraciones en H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tienen la misma característica de un anticuerpo heterodimerizado.

[Ejemplo 18] Alteraciones que pueden sustituir las alteraciones introducidas en el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0

Basándose en los resultados mostrados en las Fig. 35, 36, 37, 38, 39 y 40 obtenidos en el Ejemplo 17, se evaluó si las alteraciones en el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 eran sustituibles por otras alteraciones. En la presente memoria, "alteración sustituible" se refiere a una alteración que, cuando se introduce, da como resultado una unión a FcgRIIIa F y a FcgRIIIa V 0,7 veces o más veces mayor, y una unión a FcgRIIb 1,3 veces o menos veces mayor que la unión antes de la introducción de la alteración.

Con respecto a las variantes preparadas en el Ejemplo 17, se introdujeron alteraciones en anticuerpos en las posiciones de aminoácidos 231 a 242 (numeración EU). En el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, se han introducido L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A en la cadena H H240-Kn061 y se han introducido K326D/A330M/K334E en la cadena H H240-H1071. De las alteraciones introducidas en la cadena H H240-Kn061, puede evaluarse si L234Y, L235Y y G236W son sustituibles con otros aminoácidos basándose en los resultados mostrados en el Ejemplo 17.

Los sitios de alteración incluyen las posiciones 234, 235 y 236 (numeración EU) en la cadena H H240-Kn061, que es una de las cadenas H de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, pero no incluye los sitios de alteración introducidos en la cadena H H240-H1071, que es la otra cadena H. De las variantes preparadas en este experimento, se cree que las que tienen alteraciones introducidas en las posiciones 234, 235 y 236 (numeración EU) en la cadena H H240-Kn061, las que tienen una unión a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V 0,7 veces o más veces mayor y una unión a FcgRIIb 1,3 veces o menos veces mayor en comparación con H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, tienen una actividad comparable o superior a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. Por lo tanto, se pensó que eran posibles sustituciones sin reducir las excelentes propiedades del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. Con respecto a las alteraciones que cumplen las condiciones descritas anteriormente, las alteraciones y cadenas H en las que se introducen estas alteraciones se resumen en la Tabla 46 (alteraciones que permiten conservar una actividad comparable o que confieren una actividad superior a la de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0).

T l 4

En la Tabla 46 que se muestra arriba, "CADENA H EN LA QUE SE HA INTRODUCIDO LA ALTERACIÓN" significa a cadena H de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 que es sustituible; y en "ALTERACIÓN", el número representa el número de resto según la numeración EU, la primera letra alfabética representa el aminoácido correspondiente al número de resto indicado en H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, y la última letra alfabética representa el aminoácido sustituible.

Según estos resultados, entre las alteraciones introducidas en la región constante de la cadena H de H240-Kn061, los aminoácidos y sitios sustituibles se resumen como se muestra en la Tabla 47 (sitios de alteración en H240-Kn061, en el que se puede sustituir una alteración conservando una actividad comparable a la de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, y aminoácidos sustituibles).

T l 47

En la Tabla 47 que se muestra arriba, "POSICIÓN ALTERADA" se refiere al número de resto según la numeración EU en H240-Kn061; y "AMINOÁCIDO SUSTITUIBLE" se refiere a un aminoácido, que incluso cuando se sustituye en ese sitio por un aminoácido de los mostrados en esta tabla, permite tener una actividad comparable a la de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, es decir, un aminoácido que se puede sustituir.

De las alteraciones introducidas en H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, con respecto a H268D y S298A de H240-Kn061 y K326D, A330M y K334E de H240-H1071, no se han introducido alteraciones en los sitios correspondientes en el experimento descrito en el Ejemplo 17. Por lo tanto, a continuación también se analiza la presencia o ausencia de alteraciones sustituibles en los sitios descritos anteriormente basándose en los resultados mostrados en el Ejemplo 4. Específicamente, según los resultados mostrados en el Ejemplo 4, se seleccionaron tres alteraciones que dieron como resultado un valor de He/Con_3aF de 130 o más y que presentaron el efecto más fuerte en los sitios, es decir, las que mostraron un aumento de 1,3 o más veces en comparación con la situación previa a la introducción de la alteración en He/Con_3aF como indicador de la unión a FcgRIIIa F en un anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una de las cadenas H se había introducido una alteración. Los resultados se resumen en la Tabla 48 (sitios de alteración de alteraciones sustituibles por la alteración H268D, S298A, K326D, A330M o K334E de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0; aminoácidos sustituibles; y actividad de unión a FcgRIIIa F resultante).

T l 41

En la Tabla 48 que se muestra arriba, "POSICIÓN ALTERADA" se refiere al número de resto según la numeración EU. "AMINOÁCIDO SUSTITUIBLE" se refiere a las tres alteraciones que dan como resultado un aumento de 1,3 o más veces en comparación con la situación previa a la introducción de la alteración en He/Con_3aF como indicador de la unión a FcgRIIIa F, en un anticuerpo heterodimerizado en el que se había introducido una alteración en una sola cadena H como se describe en el Ejemplo 4, y que presenta el efecto más fuerte en los sitios. "He/Con _3aF" es un valor definido en el Ejemplo 4.

Según los resultados mostrados en la Tabla 48, los aminoácidos sustituibles en cada sitio de alteración se resumen en la Tabla 49 (sitios de alteración sustituibles de alteración H268D, S298A, K326D, A330M o K334E en H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 y aminoácidos sustituibles).

T l 41

Basándose en la Tabla 49, incluso si D de H268D se sustituye por E o A en H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0, se cree que se consigue una actividad comparable. Del mismo modo, incluso si D de K326D es T o I, o incluso si M de A330M es P o F, o incluso si D de K334D es E o I, se cree que se consigue una actividad comparable. Al mismo tiempo, en cuanto a S298A, no se pudieron encontrar alteraciones que se considerara que consiguen una actividad comparable.

Además, dado que el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado, es decir, potencia la actividad de unión a FcgR con respecto a los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo, se cree que las variantes obtenidas al introducir las alteraciones en H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tienen la misma característica del anticuerpo heterodimerizado.

[Ejemplo 19] Introducción de D270E en el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 y evaluación del mismo

A continuación, para mejorar aún más H240-Kn061/H240-Hl071, los presentes inventores intentaron potenciar adicionalmente la unión a FcgRIIIa, que se cree que aumenta la actividad de ADCC, y reducir adicionalmente la unión a FcgRIIb, que se cree que reduce la actividad antitumoral de un anticuerpo a través de señales inmunosupresoras. Específicamente, D270E, una alteración encontrada en el Ejemplo 4, que potencia la unión a FcgRIIIa y reduce la unión a FcgRIIb, se introdujo en las dos cadenas H de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0. Las secuencias obtenidas al introducir D270E en H240-Kn061 y H240-H1071 se denominaron H240-Kn072 (SEQ ID NO: 90) y H240-H1076 (SEQ ID NO: 91), y se combinaron con L73-k0 para expresar y preparar el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo 1. Junto con este anticuerpo, se ensayó la actividad de unión de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0, H240-afucosyl_G1d/L73-k0 y H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 a cada FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se resumen en la Tabla 50.

T l

continuación

La Tabla 50 muestra que, de manera similar a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 se une más fuertemente a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V que H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 y H240-afucosyl_G1d/L73-k0 resultantes de la aplicación de la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC y, además, se une más fuertemente que H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0. La unión a FcgRIIb de H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 se redujo con respecto a las de H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 y H240-afucosyl_G1d/L73-k0 producidos por la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC y, además, se redujo con respecto a la de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0.

Específicamente, como la introducción de D270E potencia la unión a FcgRIIIa que aumenta la actividad de ADCC, se espera una actividad de ADCC más fuerte, y como la unión a FcgRIIb que transduce las señales inmunosupresoras está alterada, se espera una reducción de la acción inmunosupresora del anticuerpo. Por lo tanto, se cree que H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 presenta un efecto antitumoral superior al de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0.

A continuación, la actividad de ADCC de H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 se comparó con las de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0, H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 y H240-afucosyl_Gld/L73-k0. Los resultados se muestran en la Fig. 41.

Los resultados mostrados en la Fig. 41 demuestran que H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 presenta una actividad de ADCC que es significativamente más fuerte que la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Además, la actividad de ADCC de H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 fue más fuerte que la del anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_Gld/L73-k0 resultante de la aplicación de la técnica de potenciación de la actividad de ADCC existente, y fue comparable a la de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0.

Estos resultados demuestran que el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 no solo tiene una actividad de ADCC más fuerte que la conseguida por la técnica de potenciación de la actividad de ADCC existente, sino que también presenta una unión reducida a FcgRIIb y, por lo tanto, es un anticuerpo mucho mejor que los obtenidos por la técnica existente.

Además, dado que el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado, es decir, se une más fuertemente a FcgR que los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo, Se cree que H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0 obtenido mediante la introducción de D270E en las dos cadenas H de H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tiene la misma característica del anticuerpo heterodimerizado.

[Ejemplo 20] Mejora adicional del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0

Los presentes inventores intentaron mejorar adicionalmente H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, que se descubrió en el Ejemplo 19. Específicamente, H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 se combinó con las alteraciones Y234E, Y235N, Y235Q y S239M que, cuando se introducen en H240-Kn061, además confieren propiedades superiores a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 descubierto en el Ejemplo 18.

Se prepararon H240-Knl 13 (SEQ ID NO: 92) resultante de la introducción de Y234E e Y235N en H240-Kn072, H240-Kn1 15 (SEQ ID NO: 93) resultante de la introducción de S239M en H240-Kn072 y H240-Kn125 (SEQ ID NO: 94) resultante de la introducción de Y235Q y S239M en H240-Kn072 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se prepararon H240-Kn113/H240-HL076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0 y H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 combinando H240-Hl076 como cadena H, L73-k0 como cadena L y H240-Kn1 13, H240-Kn1 15 y H240-Kn125 como la otra cadena H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos descritos anteriormente se evaluaron para determinar la unión a cada FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8, junto con la IgG1 H240-Gld/L73-k0 nativa, H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 modificado a partir de la misma mediante la tecnología de botones en ojales, el anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_Gld/L73-k0 obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC y el anticuerpo homodimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 en cuyas dos cadenas H se había introducido una alteración potenciadora de la actividad de ADCC S239D/A330L/I332E. Los resultados se resumen en la Tabla 51.

continuación

En comparación con H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0 mostró una unión comparable a FcgRIIb, un FcgR inhibidor, y una unión potenciada a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V que desempeñan un papel importante en la actividad de ADCC. En cuanto a la unión a FcgRIIb, un FcgR inhibidor, el grado de unión fue comparable incluso cuando se comparó con el anticuerpo nativo IgG1. Con respecto a FcgRIIIa, la unión a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V estaba más potenciada que en el anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73-k0 obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC y en el anticuerpo homodimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 en cuyas dos cadenas H se habían introducido las alteraciones S239D/A330L/I332E potenciadoras de la actividad de ADCC. Los hallazgos descritos anteriormente sugieren la posibilidad de que H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0 no aumente las acciones inmunosupresoras en comparación con la IgG1 nativa y presente un efecto antitumoral más fuerte que el del anticuerpo afucosilado resultante de la aplicación de la alteración existente de potenciación de la actividad de ADCC y el del anticuerpo homodimerizado.

En comparación con H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-H1076/L73-k0 mostró una unión potenciada a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V, que desempeñan un papel importante en la actividad de ADCC. Además, la unión a FcgRIIa R y FcgRIIa H, que son importantes para la actividad de ADCP, estaba más potenciada que en la IgG1 H240-Gld/L73-k0 nativa, en H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales, el anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_Gld/L73-k0 obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC y el anticuerpo homodimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 en cuyas dos cadenas H se habían introducido alteraciones potenciadoras de la actividad de ADCC S239D/A330L/I332E.

Como ocurrió con H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 mostró una unión más potenciada a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V, que desempeñan un papel importante en la actividad de ADCC, que H240-Knl 15/H240-Hl076/L73-k0, conservando al mismo tiempo la unión a FcgRIIb, un FcgR inhibidor, a un nivel comparable al de IgG1. H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 presentó una unión potenciada a FcgRIIa H, un alotipo de FcgRIIa, así como una unión reducida a FcgRIIb y una unión potenciada a los dos alotipos de FcgRIIIa en comparación con el anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73-k0 obtenido mediante la técnica existente de mejora de la actividad de ADCC y el anticuerpo homodimerizado H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0 en cuyas dos cadenas H se había introducido una alteración S239D/A330L/I332E potenciadora de la actividad de ADCC. Por lo tanto, es de esperar que H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 aumente las actividades de ADCP y ADCC y también reduzca las acciones inmunosupresoras con más fuerza que el anticuerpo homodimerizado y el anticuerpo afucosilado resultante de la aplicación de la alteración potenciadora de la actividad de ADCC existente.

A continuación, las actividades de ADCC de H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0 y H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 se compararon con las de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 y el anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73-k0 obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC. Los resultados se muestran en la Fig. 42.

Como se muestra en la Fig. 42, todos los anticuerpos heterodimerizados presentaron una actividad de ADCC mucho mejor que el anticuerpo afucosilado obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC.

Los perfiles de unión a cada FcgR y el resultado de la comparación de la actividad de ADCC con las tecnologías existentes demuestran que Y234E, Y235N, Y235Q e S239M, que se introdujeron en H240-Kn072 de H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, son alteraciones que confieren a H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 características superiores adicionales.

Dado que el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado, es decir, se une más fuertemente a FcgR que los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo, es de esperar que H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0 obtenido mediante la introducción de D270E en las dos cadenas H de H240-Kn061/H240-Hl071/L73-k0 tenga la misma característica del anticuerpo heterodimerizado. Del mismo modo, también se cree que H240-Kn113/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn115/H240-Hl076/L73-k0 y H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 obtenidos mediante la introducción de alteraciones adicionales en H240-Kn072/H240-H1076/L73-k0, tienen la misma característica del anticuerpo heterodimerizado.

[Ejemplo 21] Preparación de anticuerpos heterodimerizados que presentan una unión potenciada a FcgRIIa y FcgRIIIa Basándose en el resultado mostrado en el Ejemplo 4, se prepararon variantes con cadenas H que presentan una unión potenciada a FcgRIIa y FcgRIIIa. Específicamente, se produjo H240-Kn067 (SEQ ID NO: 95) introduciendo L234Y, L235Y, G236W, H268D, S298A, y A327D en H240-Kn033 (SEQ ID NO: 84), y se produjo H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96) introduciendo D270E, K326D, A330K y K334E en H240-H1033 (SEQ ID NO: 85), según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. El anticuerpo heterodimerizado H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0 se expresó combinando H240-Kn067, H240-Hl068 y L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

En primer lugar, se evaluó si el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0 tenía la característica de un anticuerpo heterodimerizado, es decir, potencia la actividad de unión a FcgR con respecto a los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo. En el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, se ha introducido L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D en H240-Kn067 como cadena H y se ha introducido D270E/K326D/A330K/K334E en H240-Hl068 como la otra cadena H. A continuación, se construyeron H240-Hl136 (SEQ ID NO: 97) resultante de la introducción de L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D en H240-H1033 y H240-Kn133 (SEQ ID NO: 98) resultante de la introducción de D270E/K326D/A330K/K334E en H240-Kn033 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Usando estos vectores de expresión, se expresaron el anticuerpo homodimerizado H240-Kn067/H240-Hl136/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D y el anticuerpo homodimerizado H240-Kn113/H240-Hl068/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen D270E/K326D/A330K/K334E según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se analizaron los anticuerpos homodimerizados y el anticuerpo heterodimerizado H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, una de cuyas cadenas H tiene L234Y/L235Y/G236W/H268D/S298A/A327D y la otra cadena H tiene D270E/K326D/A330K/K334E con respecto a la unión a FcgRIIa H, FcgRIIa R, FcgRIIIaF y FcgRIIIa V según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se resumen en la Tabla 52.

T l 2

Además, basándose en esta variante, H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0 se combinó con las alteraciones Y235Q y S239M que, cuando se introducen en H240-Kn061, confieren además a H240-Kn061/H240-H1071/L73-k0 características superiores como se descubrió en el Ejemplo 18. Específicamente, H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99) resultante de la introducción de S239M en H240-Kn067 y H240-Kn126 (SEQ ID NO: 100) resultante de la introducción de Y235Q en H240-Kn120 se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se prepararon H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 combinando H240-Hl068 como una cadena H y L73-k0 como la cadena L con H240-Kn067, H240-Kn120 y H240-Kn126 como la otra cadena H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Los anticuerpos descritos anteriormente se ensayaron para determinar la unión a cada FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se resumen en la Tabla 53.

Este resultado demuestra que H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 presentan una unión a FcgRIIIa comparable o mejorada en comparación con los anticuerpos con actividad de ADCC potenciada existentes: H240-afucosyl_G1d/L73-k0 y H240-Kn032/H240-Hl032/L73-k0. Además, la unión a FcgRIIa R y FcgRIIa H, que desempeñan un papel importante en la actividad de ADCP, se potenció en comparación con cada una de las tecnologías existentes. El hallazgo descrito anteriormente sugiere que todos los anticuerpos heterodimerizados H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 producidos en la presente memoria tienen una actividad de ADCC comparable o más fuerte y una actividad de ADCP superior a las conseguidas con las tecnologías existentes.

En particular, H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0 presentó una unión más potenciada a FcgRIIa R y FcgRIIa H incluso en comparación con el anticuerpo homodimerizado H240-Kn037/H240-Hl036/L73-k0 cuyas dos cadenas H tienen alteraciones G236A/S239D/I332E que, según se ha notificado, potencian la unión a FcgRIIa R y FcgRIIa H además de aumentar la actividad de ADCP. Específicamente, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 presenta una unión más potenciada a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V que los anticuerpos obtenidos mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC, y presenta una unión más potenciada a FcgRIIa R y FcgRIIa H que los anticuerpos obtenidos por la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCP. Por lo tanto, H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0 es un anticuerpo que puede tener actividades de ADCC y ADCP más fuertes que los anticuerpos obtenidos por las tecnologías existentes.

Posteriormente, según el Ejemplo de Referencia 9, la actividad de ADCC de cada variante se comparó con la del anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_Gld/L73-k0 obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC. El resultado se muestra en la Fig. 43.

El resultado mostrado en la Fig.43 demuestra que todos los anticuerpos heterodimerizados producidos esta vez tienen una actividad de ADCC comparable o superior a la del anticuerpo afucosilado obtenido mediante la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC.

Los perfiles de unión a cada FcgR y el resultado de la comparación de la actividad de ADCC con las tecnologías existentes demuestran que todos los anticuerpos H240-Kn067/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn126/H240-Hl068/L73-k0 preparados esta vez son anticuerpos heterodimerizados que es muy probable que tengan una actividad de ADCC comparable o superior a la conseguida con la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC existente, así como una mayor actividad de ADCP a través de la unión a FcgRIIa.

[Ejemplo 22] Evaluación del anticuerpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 con respecto a la actividad de unión a cada FcgR y actividad de ADCC

Anteriormente, en la presente memoria, se evaluó la unión de H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, que es un anticuerpo heterodimerizado resultante de la aplicación de la tecnología de botones en ojales, a cada FcgR y la actividad de ADCC. En la presente memoria, se evaluó si la característica de un anticuerpo heterodimerizado que consiste en que un anticuerpo heterodimerizado que comprende dos cadenas H diferentes tiene una mayor actividad de unión a FcgR que los anticuerpos homodimerizados que comprenden cada cadena H del mismo también se observa incluso cuando se usa D356K, H435R, K439E como técnica alternativa de producción de anticuerpos heterodimerizados.

En primer lugar, se construyó H240-AK072 (SEQ ID NO: 104) introduciendo L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A, una alteración introducida en H240-Kn072 que es una cadena H de H240-Kn072/H240-Hl076/L73-k0, en H240-A5E (SEQ ID NO: 102) resultante de la introducción de D356K y H435R en H240-G1dE (SEQ ID NO: 101), que es un alotipo de H240-Gld (SEQ ID NO: 83). A continuación, se construyó H240-BH076 (s Eq ID NO: 105) introduciendo D270E/K326D/A330M/K334E, que se introdujo en H240-H1076 como la otra cadena H, en H240-B3E (SEQ ID NO: 103) resultante de la introducción de K439E en H240-G1 DE. El anticuerpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 se expresó y preparó combinando H240-AK072, H240-BH076 y L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo 1. De forma similar, se combinaron H240-AK072 y L73-k0, y H240-BH076 y L73-k0 para expresar y preparar los anticuerpos homodimerizados H240-AK072/L73-k0 y H240-BH076/L73-k0. Los anticuerpos se compararon en cuanto a la unión a cada FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se resumen en la Tabla 54.

T l 4

Los resultados descritos anteriormente confirman que el anticuerpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 tiene la característica de un anticuerpo heterodimerizado que consiste en que se une a FcgR con más fuerza que los anticuerpos homodiméricos H240-AK072/L73-k0 y H240-BH076/L73-k0, cada uno de los cuales comprende una cadena H del mismo.

A continuación, se combinaron y expresaron H240-A5E, H240-B3E y L73-k0 para preparar H240-A5E/H240-B3E/L73-k0 según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la unión de H240-G1d/L73-k0, H240-A5E/H240-B3E/L73-k0, H240-afucosyl_Gld/L73-k0 y el anticuerpo heterodimerizado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 a cada FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se resumen en la Tabla 55.

T l

Los resultados muestran que la unión de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V se potenció en comparación con H240-G1d/L73-k0 y el anticuerpo afucosilado H240-afucosyl_G1d/L73-k0 obtenido con la técnica existente de potenciación de la actividad de ADCC. Al mismo tiempo, dado que la actividad de unión a FcgR fue comparable entre H240-G1d/L73-k0 y H240-A5E/H240-B3E/L73-k0, se pensó que el aumento de la actividad de unión de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 se debía a las alteraciones L234Y/L235Y/G236W/H268D/D270E/S298A y D270E/K326D/A330M/K334E introducidas en cada una de las cadenas H.

[Ejemplo 23] Análisis de rayos X de la estructura cristalina de un complejo de Fc (Kn120/Hl068) y región extracelular de FcgRIIb

H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0 producido como se describe en el Ejemplo 21 no solo tenía una mayor actividad de unión a FcgRIIIa y FcgRIIa de tipo H y al alotipo FcgRIIa R, sino que también tenía una mayor actividad de unión a FcgRIIb, un receptor inhibidor. Se cree que la unión potenciada a FcgRIIb produce efectos inmunosupresores. Por lo tanto, la reducción de la unión a FcgRIIb podría conseguir una potenciación adicional de la actividad de ADCC, que es un objetivo de la presente invención.

Sin embargo, el 93 % de la secuencia de aminoácidos de la región extracelular de FcgRIIa y FcgRIIb coincide, y estos receptores presentan una alta homología entre sí. Además, según un análisis basado en la estructura cristalográfica (J. Imunol. 2011, 187, 3208-3217) del complejo entre Fc de IgG1 nativa (en adelante abreviado como Fc (WT)) y la región extracelular de FcgRIIa de tipo R, cerca de las interfaces de interacción entre ambas proteínas, solo tres aminoácidos (Gln127, Leu132 y Phe160) en el FcgRIIa de tipo R fueron diferentes en comparación con FcgRIIb (Fig. 44). Por este motivo, se predijo que era extremadamente difícil reducir la actividad de unión a FcgRIIb solo mientras se conservaba la actividad de unión a FcgRIIa de tipo R. Entonces, los presentes inventores consideraron que, si obtenían información sobre la estructura cristalográfica del complejo entre la porción Fc (Fc (Kn120/Hl068)) de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y la región extracelular de FcgRIIb e investigaban las mutaciones de aminoácidos a introducir con más detalle, aumentaría la posibilidad de revelar una alteración que redujera selectivamente la actividad de unión a FcgRIIb. Por lo tanto, se analizó el complejo entre Fc (Kn120/Hl068) y la región extracelular de FcgRIIb mediante análisis de rayos X de la estructura cristalina.

Como resultado, los presentes inventores consiguieron determinar la estructura tridimensional del complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb a una resolución de 2,78 Á mediante análisis de rayos X de la estructura cristalina. La estructura obtenida como resultado del análisis se muestra en la Fig. 45. Se reveló que la región extracelular de FcgRIIb estaba unida e intercalada entre dos dominios CH2 de Fc, que se asemeja a las estructuras tridimensionales de los complejos previamente analizados entre Fc (WT) y las respectivas regiones extracelulares de FcgRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011,108, 12669-126674), FcgRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem.

2011,276, 16469-16477) y FcgRIIa.

Posteriormente, se describieron las estructuras alrededor de tres restos de aminoácidos, que están cerca de la interfaz de unión a Fc y son diferentes entre FcgRIIa de tipo R y FcgRIIb. La Fig. 46 muestra la estructura alrededor de Lys127 (Gln en FcgRIIa de tipo R). El resto más cercano en FcgRIIb es Ala en la posición 298 (numeración EU) situada en el dominio B de CH2 de Fc que se muestra en la Fig. 46. Este resto está en contacto directo con FcgRIIb en la interfaz de unión. Por lo tanto, se pensó que sería difícil introducir cualquier resto voluminoso capaz de interaccionar con Lys127. Otros restos de aminoácidos circundantes están demasiado lejos de la Lys127 y no se pudieron encontrar mutaciones capaces de interaccionar directamente. La Fig. 47 muestra la estructura alrededor de la Ser132 (Leu en FcgRIIa de tipo R). Este resto también está demasiado lejos de Fc y no se pudieron encontrar mutaciones capaces de interaccionar directamente con esta Ser. Por último, la Fig. 48 muestra la estructura alrededor de Tyrl60 (Phe en FcgRIIa de tipo R). Esta Tyr forma un enlace de hidrógeno con el oxígeno del carbonilo de la cadena principal de Gly en la posición 236 (numeración EU) en el dominio A de CH2 de Fc. En este caso, puede reducirse la actividad de unión a FcgRIIb sola introduciendo una mutación en Gly236 en la posición 236 (numeración EU), si la mutación provoca un cambio en la estructura del bucle y, por lo tanto, elimina el enlace de hidrógeno. Además, cuando se introduce una mutación con cualquier cadena lateral voluminosa en la posición de la Gly en la posición 236 (numeración EU), se predice que la cadena lateral interacciona directamente con la cadena lateral en la posición 160 en FcgRIIa o FcgRIIb, y la actividad de unión a FcgRIIb puede reducirse selectivamente usando la diferencia entre Phe160 en FcgR2a de tipo R y Tyrl60 en FcgRIIb.

Método experimental

[Expresión y purificación de Fc (Kn0120/H1068)]

Se preparó una región Fc (Kn0120/Hl068) como se indica a continuación. En primer lugar, se sustituyó la Cys en la posición 220 (numeración EU) de H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99) y H240-Hl68 (SEQ ID NO: 96) por Ser. Posteriormente, se clonó mediante PCR la secuencia genética de Fc (Kn0120) y Fc (Hl068) desde el aminoácido Glu en la posición 236 (numeración EU) hasta su extremo C. Utilizando esta secuencia genética clonada, se llevaron a cabo la producción de vectores de expresión y la expresión y purificación de Fc (Kn0120) y Fc (Hl068) según el método del Ejemplo de Referencia 1. La Cys en la posición 220 (numeración EU) forma un enlace disulfuro con la Cys de la cadena L en la IgG1 general. La cadena L no se coexpresa cuando se prepara la región Fc sola y, por lo tanto, este resto se sustituyó por Ser para evitar la formación de enlaces disulfuro innecesarios.

[Expresión y purificación de la región extracelular de FcgRIIb]

Esta región se preparó según el método del Ejemplo de Referencia 8.

[Purificación del complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb]

A 1,5 mg de la muestra de la región extracelular de FcgRIIb obtenida para la cristalización, se añadieron 0,15 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-2622) expresado y purificado de Escherichia co licomo proteína de fusión de glutatión S-transferasa. Se dejó que esta mezcla permaneciera a temperatura ambiente durante tres días en tampón de Bis-Tris 0,1 M a pH 6,5 y se escindió el N-oligosacárido, dejando IZ-acetilglucosamina unida directamente a Asn. Posteriormente, esta muestra de región extracelular de FcgRIIb sometida a tratamiento de escisión de carbohidratos se concentró mediante ultrafiltración con MWCO de 10000 y se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex20010/300) usando una columna equilibrada en HEPES 20 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,1 M. Además, a la fracción de la región extracelular de FcYRIIb con carbohidratos escindidos que se obtuvo, se le añadió Fc(Kn0120/Hl068) para que la relación molar de la región extracelular de FcgRIIb estuviera presente en un ligero exceso, y después de la concentración por ultrafiltración con MWCO de 10.000, se obtuvo una muestra del complejo de Fc (Kn0120/H1068)/región extracelular de FcgRIIb mediante purificación por cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300) usando una columna equilibrada en HEPES 25 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,1 M.

[Cristalización del complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb]

Se concentró una muestra del complejo de Fc (Kn120/H1068)/región extracelular de FcgRIIb hasta aproximadamente 10 mg/ml mediante ultrafiltración con MWCO de 10.000 y se llevó a cabo la cristalización mediante el método de difusión de vapor de gota colgante en combinación con el método de siembra. Se utilizó una placa VDXm (Hampton Research) para la cristalización. Utilizando una solución de depósito que contenía Bis-Tris 0,1 M (pH 6,0), PEG3350 al 14,4 % y sulfato de amonio 0,2 M, se prepararon gotas de cristalización en una proporción de mezcla de solución de depósito: muestra de cristalización = 0,85 pl: 0,85 pl. A continuación, se realizó una siembra en estrías utilizando Seeding Tool (Hampton Research) para transferir cristales de siembra desde los cristales del complejo obtenido en las mismas condiciones. Las gotas se dejaron en reposo a 20 °C. Esto produjo cristales columnares con éxito.

[Medición de datos de difracción de rayos X de un cristal de complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb]

Uno de los cristales individuales obtenidos del complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb se empapó en una solución de Bis-Tris 0,1 M, pH 6,0, PEG3350 al 17,5 %, sulfato amónico 0,2 M, glicerol al 16 % (v/v). El cristal se extrajo de la solución utilizando un alfiler con un pequeño bucle de nailon unido y se congeló en nitrógeno líquido; y posteriormente se midieron los datos de difracción de rayos X en la instalación de radiación sincrotrón Photon Factory BL-17A en la High Energy Accelerator Research Organization. Durante la medición, el cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178 °C para mantenerlo en un estado congelado y se recogieron un total de 360 imágenes de difracción de rayos X utilizando el detector Quantum 315r CCD (ADSC) unido a una línea de haz con rotación del cristal 0,5 ° cada vez. La determinación de los parámetros de la celda, la indexación de los puntos de difracción y el procesamiento de datos de difracción de las imágenes de difracción obtenidas se realizaron utilizando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010, 43: 186-190), el paquete XDS (Acta. Cryst. 2010, D66: 125-132) y Scala (Acta. Cryst. 2006, D62: 72-82); y, finalmente, se obtuvieron datos de intensidad de difracción con una resolución de hasta 2,78 Á. El cristal pertenece al grupo espacial P41212 y tiene los siguientes parámetros de celda; a = 152,94 Á, b = 152,94 A, c = 82,24 A, a = 90°, p = 90°, y = 90°.

[Análisis cristalográfico de rayos X del complejo de Fc(Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb]

La estructura cristalina del complejo de Fc(Kn120/Hl068)/región extracelular de FcYRIIb se determinó mediante el método de sustitución molecular utilizando el programa Phaser ((J. Appl. Cryst. 2007, 40: 658-674). A partir del tamaño de la red cristalina obtenida y el peso molecular del complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb, se predijo que el número de complejos en la unidad asimétrica sería uno. De las coordenadas estructurales del código de PDB: 3SGJ que es la estructura cristalina del complejo de Fc(WT)/región extracelular de FcgRIIIa, las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 239-340 de la cadena A y las posiciones 239-340 de la cadena B se tomaron como coordenadas separadas y se utilizaron respectivamente como modelos para buscar los dominios CH2 de Fc. Las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 341 -444 de la cadena A y las posiciones 341 -443 de la cadena B se tomaron como un solo conjunto de coordenadas de las mismas coordenadas estructurales del código de PDB: 3SGJ; y esto se utilizó como un modelo de búsqueda de los dominios CH3 de Fc. Por último, a partir de las coordenadas estructurales del código de PDB: 2FCB que es una estructura cristalina de la región extracelular de FcgRIIb, se tomaron las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 6-178 de la cadena A y se usaron como modelo para buscar FcgRIIb. Se determinaron la orientación y posición de cada modelo de búsqueda en la red cristalina para el dominio CH3 de Fc, la región extracelular de FcgRIIb y el dominio CH2 de Fc, basándose en la función de rotación y la función de translación para obtener el modelo inicial de la estructura cristalina del complejo de Fc (Kn120/Hl068)/región extracelular de FcgRIIb. Cuando se realizó el refinamiento de cuerpo rígido que mueve los dos dominios CH2 de Fc, los dos dominios CH3 de Fc y la región extracelular FcgRIIb en el modelo inicial obtenido, el factor de fiabilidad cristalográfica, el valor de R se convirtió en 41,4 % y el valor de R libre se convirtió en 42,6 % para datos de intensidad de difracción de 25 Á a 3,0 Á en este punto. Además, se realizaron el refinamiento estructural utilizando el programa REFMAC5 (Acta Cryst. 2011, D67, 355-367) y la revisión del modelo para observar los mapas de densidad electrónica cuyo coeficiente tiene 2Fo-Fc o Fo-Fc, que se calculan basándose en el factor estructural Fo determinado experimentalmente, el factor estructural calculado Fc y la fase calculada utilizando el modelo, mediante el programa Coot (Acta Cryst. 2010, D66: 486-501) y se realizó el refinamiento del modelo repitiendo estos pasos. Por último, como resultado de la incorporación de moléculas de agua en el modelo basado en los mapas de densidad electrónica que utilizan 2Fo-Fc o Fo-Fc como coeficiente, y el siguiente refinamiento, el factor de fiabilidad cristalográfica, los valores de R y el valor de R libre del modelo que contiene 4964 átomos distintos de hidrógeno se convirtieron en 22,8 % y 27,7 % para 24274 datos de intensidad de difracción de resolución de 25 Á a 2,78 Á, respectivamente.

[Ejemplo 24] Preparación de anticuerpos que conservan la actividad de unión a FcgRIIaR o que tienen una actividad de unión a FcgRIIaR aumentada y que tienen una actividad de unión a FcgRIIb reducida

La variante H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 descubierta en el Ejemplo 21 tenía una mayor actividad de unión a FcgRIIaR y FcgRIIaH que son importantes para la actividad de ADCP, y además, su actividad de unión a FcgRIIb inhibidor aumentó hasta aproximadamente 50 veces la de la IgG1 nativa. Para conseguir una alta actividad de ADCP, es preferible reducir la actividad de unión al FcgRIIb inhibidor tanto como sea posible. Por lo tanto, los presentes inventores buscaron alteraciones que permitieran la reducción de la actividad de unión a FcgRIIb y que al mismo tiempo retuvieran la actividad de unión a los receptores FcgRIIaR y FcgRIIaH activadores. Como se describe en el Ejemplo 23, el resultado del análisis cristalográfico del complejo entre Fc de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y la región extracelular de FcgRIIb mostró que Tyrl60 en FcgRIIb formaba un enlace de hidrógeno con el oxígeno del carbonilo de la cadena principal de Gly236 presente en el dominio A de CH2 de Fc (Kn120/Hl068). En FcgRIIaR y FcgRIIaH, la posición correspondiente está ocupada por Phe160, y es poco probable que esté presente la interacción descrita anteriormente. Esto sugiere la posibilidad de que, si la interacción con Tyrl60 en FcgRIIb puede eliminarse introduciendo una alteración en Gly236, puede reducirse la actividad de unión a FcgRIIb al mismo tiempo que se conserva la actividad de unión a FcgRIIa de tipo R, es decir, la actividad de unión a FcgRIIb puede reducirse selectivamente. Específicamente, los presentes inventores consideraron que la interacción con Y160 podría eliminarse si se introdujera la reversión de G236 y la alteración de la estructura del bucle sustituyendo G236 por Ser, Val, Ile o Thr en la cadena H derivada de H240-Hl068 que interacciona con Y160 de FcgRIIb en la unión entre FcgRIIb y H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0. Al mismo tiempo, aunque está alejada, la Lys127 de FcgRIIb puede estar en interacción electrostática con E294 del dominio A de CH2 de Fc (Kn120/Hl068). Por lo tanto, los presentes inventores consideraron la posibilidad de que la interacción con FcgRIIb pudiera reducirse induciendo repulsión electrostática sustituyendo E294 por Lys o Arg cargadas positivamente.

Se prepararon H240-Kn179 (SEQ ID NO: 107) y H240-Kn180 (SEQ ID NO: 108) resultantes de la introducción de cada uno de E294R y E294K en H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99) y H240-Hl073 (SEQ ID NO: 109), H240-Hl085 (SEQ ID NO: 110), H240-Hl086 (SEQ ID NO: 111) y H240-Hl089 (SeQ ID NO: 112) resultantes de la introducción de cada uno de G236S, G236V, G236I y G236T en H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96) según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl085/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl086/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn179/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0 se prepararon combinando cada uno de H240-Kn120 y H240-Kn180 como cadena H, L73-k0 como cadena L y H240-Hl073, H240-Hl085, H240-Hl086 y H240-Hl089 como la otra cadena H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Las variantes descritas anteriormente se evaluaron para determinar su unión a FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se muestran en la Tabla 56. La KD sombreada en gris de H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0 mostrada en la tabla se calculó bajo el supuesto de que la kd es 5 x 10-5 s-1 o menos, porque el valor de kd para FcgRIa era menor que el límite de medición 5 x 10-5 s-1 fuera del intervalo medible de 5 x 10-5 s-1 a 1 s-1 para la constante de disociación (kd) en el Biacore4000 usado en el ensayo.

T l

Además, los valores obtenidos dividiendo la KD de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada uno de FcgRIIaR, FcgRI-IaH y FcgRIIb por la KD de cada variante, la KD relativa determinada al considerar 1 la KD de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para FcgRIIaR, FcgRIIaH o FcgRIIb, se muestran en la Tabla 57.

T l 7

Los resultados demuestran que los seis tipos de alteraciones producidas para esta evaluación conservaron o aumentaron las actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIaH y redujeron la actividad de unión a FcgRIIb en comparación con H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

Posteriormente, las alteraciones examinadas en la Tabla 57 se combinaron para reducir adicionalmente la actividad de unión a FcgRIIb. En este experimento, los presentes inventores pretendían suprimir adicionalmente la actividad de unión a FcgRIIb mediante el uso combinado de la introducción de E294K o E294R en H240-Kn120 y la introducción de G236T en H240-H1068. Como se muestra en la Tabla 57, todas las alteraciones reducen las actividades de unión a FcgRIIIa F y FcgRIIIa V. Entonces, además de estas alteraciones, se introdujeron I332E, que se ha notificado que aumenta la actividad de unión a FcgRIIIa, y la alteración Y235N que aumenta la actividad de unión a FcgRIIIa como se describe en el Ejemplo 18, con el objetivo de suprimir adicionalmente la actividad de unión a FcgRIIb y aumentar la actividad de unión a FcgRIIIa.

Se prepararon H240-Kn192 (SEQ ID NO: 113) resultante de la introducción de Y235N y E294K en H240-Kn120 (SEQ ID NO: 99), H240-Kn193 (SEC ID NO: 114) resultante de la introducción de Y235N y E294R en H240-Kn120 (s Ec ID NO: 99) y H240-Hl204 (SEC ID NO: 115) resultante de la introducción de G236T e I332E en H240-Hl068 (SEQ ID NO: 96) según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0 y H240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0 se prepararon combinando cada uno de H240-Kn192 y H240-Kn193 como cadena H, L73-k0 como cadena L y H240-Hl089 y H240-Hl204 como la otra cadena H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Las variantes descritas anteriormente se evaluaron para determinar su unión a FcyR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se muestran en la tabla 58. La KD sombreada en gris de H240-Kn120/H240-Hl073/L73-k0 mostrada en la tabla se calculó bajo el supuesto de que la kd es 5 x 10-5 s-1 o menos, porque el valor de kd para FcYRIa era menor que el límite de medición 5 x 10-5 s-1 fuera del intervalo medible de 5 x 10-5 s-1 a 1 s-1 para la constante de disociación (kd) en el Biacore4000 usado en el ensayo.

Además, los valores obtenidos dividiendo la KD de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada uno de FcgRIIaR, FcgRI-IaH y FcgRIIb por la KD de cada variante, la KD relativa determinada al considerar 1 la KD de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para FcgRIIaR, FcgRIIaH o FcgRIIb, se muestran en la Tabla 59.

T l

H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0 y H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0, resultantes de la introducción de E294K o E294R en H240-Kn120 y la introducción de G236T en H240-H1068, presentaron, los dos, una unión potenciada a FcgRIIaR y FcgRIIaH en comparación con H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, mientras que su unión a FcgRIIb se redujo a 0,4 veces la de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0. Además, el efecto para reducir la unión a FcgRIIb fue de 1,5 veces a dos veces en comparación con H240-Kn120/H240-Hl089/L73-k0, H240-Kn179/H240-H1068/L73-k0 y H240-Kn180/H240-Hl068/L73-k0, de los que solo una cadena tiene cada alteración.

tanto H240-Kn192/H240-Hl204/L73-k0 como H240-Kn193/H240-Hl204/L73-k0 resultantes de la introducción de I332E e Y235N en las variantes anteriores, conservaron la unión a FcgRIIaR, FcgRIIaH y FcgRIIb y potenciaron la unión a FcgRIIIaF y FcgRIIIaV a dos y 8 veces, respectivamente, en comparación con H240-Kn179/H240-Hl089/L73-k0 y H240-Kn180/H240-Hl089/L73-k0 antes de la introducción de las alteraciones.

[Ejemplo 25] Aumento de la actividad de unión del anticuerpo heterodimerizado H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 a FcgR activador

En el ejemplo 24, se produjeron variantes que tenían una actividad de unión reducida a FcgRIIb inhibidor mientras que retenían o potenciaban la unión a FcgRIIaR y FcgRIIaH mediante la introducción de alteraciones en H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0. En este examen, los presentes inventores intentaron aumentar la actividad de unión a los FcgR activadores: FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV.

Se prepararon H240-Kn138 (SEQ ID NO: 116) resultante de la introducción de L328W en H240-Kn120; H240-Kn173 (SEQ ID NO: 117) resultante de la introducción de I332Q en H240-Kn120; H240-Kn178 (SEQ ID NO: 118) resultante de la introducción de K334Y en H240-Kn120; H240-Kn166 (SEQ ID NO: 119) resultante de la introducción de L328A en H240-Kn120; H240-Kn172 (SEQ ID NO: 120) resultante de la introducción de I332M en H240-Kn120; y H240-Kn149 (SEQ ID NO: 121) resultante de la introducción de L328W y K334L en H240-Kn120, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Además, se prepararon H240-Hl147 (SEQ ID NO: 122) resultante de la introducción de L328W en H240-Hl068; H240-Hl170 (SEQ ID NO: 123) resultante de la introducción de L328A en H240-Hl068; H240-Hl174 (SEQ ID NO: 124) resultante de la introducción de I332E en H240-Hl068; H240-Hl150 (SEQ ID NO: 125) resultante de la introducción de I332T en H240-Hl068; H240-H1182 (SEQ ID NO: 126) resultante de la introducción de A231H en H240-Hl068; y H240-Hl177 (SEQ ID NO: 127) resultante de la introducción de I332Q en H240-Hl068, como la otra cadena H. H240-Kn120/H240-Hl170/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl15 0/L73-k0, H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0, H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0, H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0, H240-Kn166/H240-Hl170/L73-k0, H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0 y H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0 se prepararon según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 usando L73-k0 (SEQ ID NO: 106) como cadena L, H240-Kn138 (SEQ ID NO: 116), H240-Kn173 (SEQ ID NO: 117), H240-Kn178 (SEQ ID NO: 118), H240-Kn149 (SEQ ID NO: 121), H240-Kn166 (SEQ ID NO: 119) y H240-Kn172 (SEQ ID NO: 120) como cadena H y H240-H1170 (SEQ ID NO: 123), H240-H1150 (SEQ ID NO: 125), H240-H1174 (SEQ ID NO: 124), H240-H1182 (SEQ ID NO: 126), H240-H1147 (SEQ ID NO: 122) y H240-H1177 (SEQ ID NO: 127) como la otra cadena H. Estas variantes se evaluaron para determinar la unión a FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se muestran en la Tabla 60.

Además, los valores obtenidos dividiendo la KD de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada uno de FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIa F y FcgRIIIa V por la KD de cada variante, la KD relativa determinada al considerar 1 la KD de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para cada uno de FcgRIIaR, FcgRIIaH y FcgRIIb, se muestran en la Tabla 61.

Tabla 61

Las variantes que se muestran en esta tabla presentan una unión potenciada a al menos uno de los FcgR de FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

H240-Kn120/H240-H1170/L73-k0 resultante de la introducción de L328A en H240-H1068 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0 tiene actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIaH aumentadas 2,3 veces en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

H240-Kn120/H240-Hl150/L73-k0 resultante de la introducción de I332T en H240-H1068 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIaH aumentada 1,2 veces con respecto a H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 conservando al mismo tiempo la actividad de unión a FcgRIIaR.

H240-Kn138/H240-Hl068/L73-k0 resultante de la introducción de L328W en H240-Kn120 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIaH aumentada 1,6 veces con respecto a H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 conservando al mismo tiempo la actividad de unión a FcgRIIaR.

H240-Kn120/H240-Hl174/L73-k0 resultante de la introducción de I332E en H240-H1068 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIIaF aumentada 4,3 veces y la actividad de unión a FcgRIIIaV aumentada 10 veces en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

H240-Kn173/H240-Hl068/L73-k0 resultante de la introducción de I332Q en H240-Kn120 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIIaF aumentada 1,2 veces con respecto a H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 conservando al mismo tiempo la actividad de unión a FcgRIIIaV.

H240-Kn178/H240-Hl068/L73-k0 resultante de la introducción de K334Y en H240-Kn120 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIIaF aumentada 1,6 veces y la actividad de unión a FcgRIIIaV aumentada 1,9 veces en comparación con H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0.

H240-Kn120/H240-Hl182/L73-k0 resultante de la introducción de A231H en H240-H1068 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIIaV aumentada 1,2 veces en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

H240-Kn138/H240-Hl147/L73-k0 resultante de la introducción de L328W en las dos cadenas H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIaR aumentada 1,8 veces en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

H240-Knl66/H240-H1170/L73-k0 resultante de la introducción de L328A en las dos cadenas H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIaH aumentada 1,9 veces en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

H240-Kn172/H240-Hl177/L73-k0 resultante de la introducción de I332M en H240-Kn120 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y la introducción de I332Q en H240-Hl068 que es la otra cadena H, tiene la actividad de unión a FcgRIIIaV aumentada 1,6 veces con respecto a H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 conservando al mismo tiempo la actividad de unión a FcgRIIIaF.

H240-Kn149/H240-Hl068/L73-k0 resultante de la introducción de L328W y K334L en H240-Kn120 que es una cadena H de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 tiene la actividad de unión a FcgRIIaH aumentada 1,6 veces con respecto a H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 conservando al mismo tiempo las actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIIaV.

Los resultados descritos anteriormente sugieren que las variantes tienen una fuerte actividad de ADCP o ADCC en comparación con H240-Kn120/H240-H1068/L73-k0.

[Ejemplo 26] Preparación de anticuerpo heterodimerizado con mayor actividad de unión a FcgRIIb

En seres humanos, se han presentado FcYRIa (CD64A), FcYRIIa (CD32A), FcYRIIb (CD32B), FcYRIIIa (CD16A) y FcYRIIIb (CD16B) como isoformas de la familia de proteínas FcyR humana, y también se han presentado sus alotipos (Immunol Lett, 82(1-2), 57-65, 2002). FcYRIa, FcYRIIa y FcYRIIIa tienen funciones inmunoactivadoras y se denominan FcyR activadores, mientras que FcYRIIb tiene funciones inmunosupresoras, y se denomina FcyR inhibidor (Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010).

FcYRIIb es el único FcyR expresado en células B (Eur J Immunol 19, 1379-1385, 1989). Se ha notificado que la interacción de la región Fc del anticuerpo con FcyRI Ib suprime la respuesta inmunitaria primaria de las células B (J Exp Med 129, 1183-1201, 1969). Además, se notifica que cuando FcYRIIb en células B y un receptor de células B (BCR) se entrecruzan a través de un complejo inmunitario en la sangre, se suprime la activación de las células B y se suprime la producción de anticuerpos por las células B (Immunol Lett 88, 157-161, 2003). En esta transducción de señales inmunosupresora mediada por BCR y FcYRIIb, es necesario el motivo inhibidor de inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM) contenido en el dominio intracelular de FcYRIIb (Science, 256, 1808-1812, 1992; Nature, 368, 70-73, 1994). Cuando ITIM se fosforila tras la señalización, se recluta inositol polifosfato 5-fosfatasa que contiene SH2 (SHIP), se inhibe la transducción de otras cascadas de señales de FcyR activador y se suprime la respuesta inmunitaria inflamatoria (Science, 290, 84-89, 2000). Además, se ha notificado que la agregación de FcgRIIb solo suprime transitoriamente la entrada de calcio debido al entrecruzamiento de BCR y la proliferación de células B de una manera independiente de BCR sin inducir la apoptosis de las células B productoras de IgM (J Imunol, 181,5350-5359, 2008).

Además, FcYRIIb también se expresa en células dendríticas, macrófagos, neutrófilos activados, mastocitos y basófilos. FcYRIIb inhibe las funciones de FcyR activadores tales como la fagocitosis y la liberación de citocinas inflamatorias en estas células, y suprime las respuestas inmunitarias inflamatorias (Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010).

La importancia de las funciones inmunosupresoras de FcYRIIb se ha dilucidado hasta ahora a través de estudios usando ratones con inactivación de FcYRIIb. Hay informes de que en ratones con inactivación de FcYRIIb, la inmunidad humoral no está regulada adecuadamente (J Immunol, 163, 618-622, 1999), aumenta la sensibilidad hacia la artritis inducida por colágeno (CIA) (J Exp Med, 189, 187-194, 1999), y se presentan síntomas similares al lupus y síntomas similares al síndrome de Goodpasture (J Exp Med, 191,899-906, 2000).

Además, se ha informado de que la insuficiencia reguladora de FcYRIIb está relacionada con enfermedades autoinmunitarias humanas. Por ejemplo, se ha notificado la relación entre el polimorfismo genético en la región transmembrana y la región promotora de FcYRIIb, y la frecuencia de desarrollo del lupus eritematoso sistémico (LES) (Hum, Genet, 117, 220-227, 2005; J Biol Chem, 282, 1738-1746, 2007; Arthritis Rheum, 54, 3908-3917, 2006; Nat Med, 11, 1056-1058, 2005; J Immunol, 176, 5321-5328, 2006) y la disminución de la expresión de FcYRIIb en la superficie de las células B en pacientes con LES (J Exp Med, 203, 2157-2164, 2006; J Immunol. 178, 3272-3280, 2007).

A partir de modelos de ratón y hallazgos clínicos como tales, se considera que el FcYRIIb desempeña la función de controlar las enfermedades autoinmunitarias y las enfermedades inflamatorias principalmente a través de la participación de células B, y es una molécula diana prometedora para controlar las enfermedades autoinmunitarias y las enfermedades inflamatorias.

Se sabe que la IgG1, utilizada principalmente como un producto farmacéutico de anticuerpos disponible comercialmente, no solo se une a FcYRIIb, sino que también se une fuertemente a FcyR activadores (Blood, 113, 3716-3725, 2009). Sería posible desarrollar productos farmacéuticos de anticuerpos que tengan mayores propiedades inmunosupresoras en comparación con las de IgG1, utilizando una región Fc con unión potenciada a FcYRIIb o selectividad mejorada de unión a FcYRIIb en comparación con FcyR activadores. Por ejemplo, se ha sugerido que el uso de un anticuerpo que tiene una región variable que se une a BCR y una región Fc con unión potenciada a FcYRIIb puede inhibir la activación de células B (Mol Immunol, 45, 3926-3933, 2008). Se ha notificado que el entrecruzamiento de FcYRIIb en las células B y la IgE unida a un receptor de células B suprime la diferenciación de las células B en células plasmáticas, lo cual provoca como resultado la supresión de la producción de IgE; y en ratones en los que se han trasplantado PBMC humanas, se mantienen las concentraciones de IgG e IgM humanas mientras que se reduce la concentración de IgE humana (Acad News, doi: 10,1016, jaci.2011.11.029). Además de IgE, se ha notificado que cuando FcgRIIB y CD79b que forman un complejo de receptor de células B se entrecruzan por un anticuerpo, se suprime la proliferación de células B in vitro y se alivian los síntomas en el modelo de artritis por colágeno (Arthritis Rheum, 62, 1933-1943, 2010).

Además de las células B, se ha notificado que el entrecruzamiento de FcsRI y FcgRIIb en mastocitos usando moléculas, en donde la porción Fc de una IgG con unión potenciada a FcgRIIb se fusiona con la porción Fc de IgE que se une a un receptor de IgE FcsRI, causa la fosforilación de FcgRIIb, suprimiendo así la entrada de calcio dependiente de FcsRI. Esto sugiere que es posible la inhibición de la desgranulación a través de la estimulación de FcgRIIb mediante la potenciación de la unión a FcgRIIb (Immunol let, doi: 10.1016/j.imlet.2012.01.008).

Por consiguiente, se sugiere que un anticuerpo que tiene una región Fc con actividad de unión a FcYRIIb mejorada es prometedor como agente terapéutico para enfermedades inflamatorias tales como enfermedades autoinmunitarias.

Además, se ha sugerido que mutantes con unión potenciada a FcgRIIb son agentes terapéuticos prometedores para el cáncer, así como agentes terapéuticos para enfermedades inflamatorias tales como enfermedades autoinmunitarias. Hasta ahora, se ha observado que FcgRIIb desempeña un papel importante en la actividad agonista de anticuerpos agonistas contra la familia de receptores anti-TNF. Específicamente, se ha sugerido que la interacción con FcgRIIb es necesaria para la actividad agonista de los anticuerpos contra CD40, DR4, DR5, CD30 y CD137, que están incluidos en la familia de receptores de TNF (Science, 333, 1030-1034, 2011; Cancer Cell 19, 101-1113, 2011; J Clin Invest 2012, doi:10.1172/JCI61226; J Immunol 171, 562-, 2003; Blood, 108, 705-, 2006; J Immunol 166, 4891, 2001). Un documento no de patente (Science, 333, 1030-1034, 2011) muestra que el uso de anticuerpos con unión potenciada a FcgRIIb aumenta el efecto antitumoral de anticuerpos anti-CD40. Por consiguiente, es de esperar que anticuerpos con FcgRIIb potenciado tengan el efecto de potenciar la actividad agonista de anticuerpos agonistas entre los que se incluyen anticuerpos contra la familia de receptores anti-TNF.

Se han presentado anticuerpos que tienen un Fc con actividad de unión mejorada a FcYRIIb (Mol Immunol, 45, 3926 3933, 2008). En este documento, la actividad de unión a FcYRIIb se mejoró añadiendo alteraciones tales como S267E/L328f , G236D/S267E y S239D/S267E en la región Fc del anticuerpo. En el documento, el anticuerpo en el que se introduce la mutación S267E/L328F se une más fuertemente a FcYRIIb. Por lo tanto, al potenciar adicionalmente la unión a FcYRIIb, es de esperar que se pueda potenciar la función descrita anteriormente mediada por FcYRIIb.

Además, los anticuerpos con la mutación S267E/L328E introducida mantienen el mismo nivel de unión a FcYRIa y FcYRIIa de tipo H que una IgG1 de origen natural. Sin embargo, otro informe muestra que esta alteración potencia la unión a FcYRIIa de tipo R varios cientos de veces al mismo nivel de unión a FcYRIIb, lo que significa que la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIb no mejora en comparación con el FcYRIIa de tipo R (Eur J Immunol 23, 1098-1104, 1993).

Aunque la unión a FcYRIIb se hubiera potenciado en comparación con la de IgG1, se considera que solo el efecto de potenciación de la unión a FcYRIIa y no la potenciación de la unión a FcYRIIb influye en células tales como las plaquetas que expresan FcYRIIa pero no expresan FcYRIIb (Nat Rev Immunol, 10, 328-343, 2010). Por ejemplo, se sabe que el grupo de pacientes a los que se les administró bevacizumab, un anticuerpo contra VEGF, tiene un mayor riesgo de tromboembolia (J Natl Cancer Inst, 99, 1232-1239, 2007). Además, Se ha observado tromboembolia de manera similar en pruebas de desarrollo clínico de anticuerpos contra el ligando CD40, y el estudio clínico se interrumpió (Arthritis Rheum, 48, 719-727, 2003). En los dos casos de estos anticuerpos, se realizaron estudios posteriores utilizando modelos animales y han sugerido que los anticuerpos administrados agregan las plaquetas a través de la unión al FcgRIIa presente en las plaquetas y forman coágulos de sangre (J Thromb Haemost, 7, 171-181, 2008; J Immunol, 185, 1577-1583, 2010). En el lupus eritematoso sistémico, que es una enfermedad autoinmunitaria, las plaquetas se activan a través de un mecanismo dependiente de FcYRIIa, y se ha notificado que la activación plaquetaria se correlaciona con la gravedad de los síntomas (Sci Transl Med, Vol. 2, número 47, 47-63, 2010). Aunque se potencie la unión a FcgRIIb, la administración de un anticuerpo con unión potenciada a FcgRIIa a pacientes que ya tienen un alto riesgo de desarrollar tromboembolia aumentará el riesgo de desarrollar tromboembolia, por eso es extremadamente peligroso.

Además, se ha notificado que los anticuerpos con unión potenciada a FcgRIIa potencian la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos mediada por macrófagos (ADCP) (Mol Cancer Ther 7, 2517-2527, 2008). Cuando los antígenos de los anticuerpos son fagocitados por macrófagos, al mismo tiempo también se fagocitan los propios anticuerpos. En ese caso, los fragmentos de péptidos derivados de esos anticuerpos también se presentan como antígeno y la antigenicidad puede aumentar, aumentando así el riesgo de producción de anticuerpos contra anticuerpos (anti-anticuerpos). De manera más específica, la potenciación de la unión a FcgRIIa aumentará el riesgo de producción de anticuerpos contra los anticuerpos, y esto disminuirá notablemente su valor como productos farmacéuticos.

De manera más específica, el valor como productos farmacéuticos se reducirá considerablemente cuando se potencia la unión a FcgRIIa, lo cual lleva a un mayor riesgo de formación de trombos a través de la agregación plaquetaria, mayor antigenicidad y mayor riesgo de producción de anti-anticuerpos.

Desde este punto de vista, la región Fc mencionada anteriormente con unión a FcgRIIb potenciada muestra una unión a FcgRIIa de tipo R notablemente potenciada en comparación con la de una IgG1 de origen natural. Por lo tanto, su valor como producto farmacéutico para pacientes portadores de FcgRIIa de tipo R se reduce considerablemente. Los tipos H y R de FcYRIIa se observan en caucásicos y afroamericanos con aproximadamente la misma frecuencia (J Clin Invest, 97, 1348-1354, 1996; Arthritis Rheum, 41, 1181-1189, 1998). Por lo tanto, si se utiliza esta región Fc para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias, el número de pacientes que pueden utilizarla de forma segura y que aprovechan sus efectos como producto farmacéutico será limitado.

Además, en células dendríticas deficientes en FcgRIIb o células dendríticas en las que la interacción entre FcgRIIb y la porción Fc del anticuerpo está inhibida por un anticuerpo anti-FcgRIIb, se ha notificado que las células dendríticas maduran espontáneamente (J Clin Invest 115, 2914-2923, 2005; Proc Natl Acad Sci USA, 102, 2910-2915, 2005). Este informe sugiere que FcgRIIb está suprimiendo activamente la maduración de las células dendríticas en un estado estacionario en el que no se produce inflamación y similares. FcgRIIa se expresa en la superficie de las células dendríticas además de FcgRIIb; por lo tanto, aunque se potencie la unión a FcgRIIb inhibidor y también se potencie la unión al FcgR activador, tal como FcgRIIa, como resultado se puede promover la maduración de las células dendríticas. De manera más específica, se considera que, para proporcionar anticuerpos con una acción inmunosupresora, es importante mejorar no solo la actividad de unión a FcgRIIb, sino también la relación de la actividad de unión a FcgRIIb con respecto a la actividad de unión a FcgRIIa.

Por lo tanto, cuando se considera la generación de productos farmacéuticos que utilizan la acción inmunosupresora mediada por la unión de FcgRIIb, existe la necesidad de una región Fc que no solo tenga actividad de unión a FcgRIIb potenciada, sino que también tenga una actividad de unión a FcgRIIa, a los tipos H y a los alotipos de R, que se mantenga a un nivel similar o se debilite a un nivel más bajo que el de una IgG1 de origen natural.

Paralelamente, hasta ahora se han notificado casos en los que se introdujeron alteraciones de aminoácidos en la región Fc para aumentar la selectividad de la actividad de unión a FcYRIIb (Mol Immunol, 40, 585-593, 2003). Sin embargo, todas las variantes que se dice que tienen una selectividad mejorada por FcYRIIb como se notifica en este documento mostraron una unión a FcYRIIb disminuida en comparación con la de una IgG1 de origen natural. Por lo tanto, se considera que es difícil que estas variantes induzcan realmente una reacción inmunosupresora mediada por FcYRIIb con más fuerza que la IgG 1.

Además, dado que FcgRIIb desempeña un papel importante en los anticuerpos agonistas mencionados anteriormente, se espera que la potenciación de su actividad de unión potencie la actividad agonista. Sin embargo, cuando la unión a FcgRIIa se potencia de manera similar, se presentan actividades no deseadas tales como la actividad de ADCC y la actividad de ADCP, y esto puede causar efectos secundarios. También desde este punto de vista, es preferible poder potenciar selectivamente la actividad de unión a FcgRIIb.

Por estos resultados, en la producción de productos farmacéuticos de anticuerpos para su uso en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y cáncer utilizando FcYRIIb, es importante que, en comparación con las de una IgG de origen natural, se mantengan o disminuyan las actividades de unión a los dos alotipos de FcYRIIa, y se potencie la unión a FcYRIIb. Sin embargo, FcyRIIb comparte una identidad de secuencia del 93 % en la región extracelular con la FcYRIIa, que es uno de los FcyR activadores, y son muy similares estructuralmente. Existen alotipos de FcYRIIa, tipo H y tipo R, en los que el aminoácido en la posición 131 es His (tipo H) o Arg (tipo R) y, sin embargo, cada uno de ellos reacciona de manera diferente con los anticuerpos (J Exp Med, 172, 19-25, 1990). Por lo tanto, para producir una región Fc que se una de forma selectiva a FcYRIIb, el problema más difícil puede ser conferir a la región Fc del anticuerpo la propiedad de actividad de unión a FcYRIIb mejorada de forma selectiva, lo que implica distinguir estas secuencias homólogas y disminuir o no aumentar la actividad de unión hacia cada alotipo de FcYRIIa, aumentando al mismo tiempo la actividad de unión hacia FcYRIIb. Hasta ahora, no se han obtenido variantes que tengan suficiente selectividad por FcgRIIb. El documento US 2009/0136485 presenta variantes con actividad de unión a FcYRIIb potenciada; sin embargo, el grado de potenciación es bajo y existe una demanda de desarrollo de variantes que tengan propiedades similares a las descritas anteriormente.

En esta evaluación, los presentes inventores investigaron la preparación de variantes cuya actividad de unión se haya incrementado de una manera selectiva para FcgRIIb usando anticuerpos heterodimerizados. Como región variable de la cadena H del anticuerpo se utilizó la región variable IL6R (SEQ ID NO: 128), que es la región variable de un anticuerpo contra el receptor de interleucina 6 humana descrito en el documento WO 2009/125825. Además, se produjo IL6R-Gld (SEQ ID NO: 129) que contenía G1d que carece de la Gly C-terminal y la Lys de la IgG1 humana, y luego se introdujo K439E en IL6R-Gld para construir IL6R-B3 (SEQ ID NO: 130). Al mismo tiempo, se introdujeron E233D, G237D, P238D, H268D, P271G y A330R en IL6R-B3 para construir IL6R-BP208 (SEQ ID NO: 131). Además, se introdujeron S267E y L328F en IL6R-B3 para construir IL6R-BP253 (SEQ ID NO: 132) que tiene un región Fc existente con actividad de unión a FcgRIIb aumentada. Como cadena L del anticuerpo común se usó la cadena L de tocilizumab, IL6R-L (SEQ ID NO: 133), y se usó en combinación con cada cadena H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 para producir homodímeros IL6R-B3/IL6R-L, IL6R-BP208/IL6R-L e IL6R-BP253/IL6R-L. Estas variantes se evaluaron para determinar la actividad de unión a FcgR la, FcgR IIaR, FcgR IIaH, FcgR IIb y FcgR IIIaV según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se muestran en la Tabla 62. Cuando una celda está rellena de color gris en la Tabla 62, significa que se concluyó que la unión de FcgR a IgG era demasiado débil como para analizarla adecuadamente mediante análisis cinético. Por lo tanto, cuando la interacción entre cada uno de los anticuerpos alterados y FcgR era débil, y se determinó que el análisis correcto era imposible mediante el análisis cinético mencionado anteriormente, las KD para tales interacciones se calcularon usando la siguiente ecuación del modelo de unión 1:1 descrita en el Manual de software Biacore T100 BR1006-48 Edición AE.

El comportamiento de las moléculas que interaccionan de acuerdo con el modelo de unión 1:1 en Biacore se puede describir mediante la Ecuación 1 que se muestra a continuación.

[Ecuación 1]

Req= C^Rmáx/ (KD+C) RI

Req: un gráfico de los niveles de unión en estado estacionario frente a la concentración de analito

C: concentración

RI: contribución en bruto del índice de refracción en la muestra

Rmáx: capacidad de unión a analitos de la superficie

Cuando se reordena esta ecuación, la KD se puede expresar como la Ecuación 2 que se muestra a continuación.

[Ecuación 2]

KD= C^Cmáx/(Req-RI)-C

La KD se puede calcular sustituyendo los valores de Rmáx, RI y C en esta ecuación. Los valores de RI y C se pueden determinar a partir del sensorgrama de los resultados de la medición y las condiciones de medición. La Rmáx se calculó de acuerdo con el siguiente método. Como objetivo de comparación, para los anticuerpos que tenían interacciones suficientemente fuertes evaluadas simultáneamente en la misma ronda de medición, el valor de Rmáx se obtuvo mediante ajuste global utilizando el modelo de unión de Langmuir 1:1, y después se dividió por la cantidad de anticuerpo de comparación capturado en el chip sensor y se multiplicó por la cantidad capturada de un anticuerpo alterado a evaluar.

T l 2

Los valores obtenidos dividiendo la KD de IL6R-B3/IL6R-L para cada uno de FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH y FcgRIIb por la KD correspondiente de cada variante modificada, la KD relativa determinada al considerar 1 la KD de IL6R-B3/IL6R-L para FcgRIIaR, FcgRIIaH o FcgRIIb, se muestran en la Tabla 63.

Como se muestra en la Tabla 63, IL6R-BP253/IL6R-L, que es un anticuerpo existente con la actividad de unión a FcgRIIb aumentada, tiene la actividad de unión a FcgRIIb aumentada aproximadamente 350 veces y la actividad de unión a FcgRIIaR aumentada aproximadamente 500 veces en comparación con el anticuerpo IgG1 humano (IL6R-B3/IL6R-L) sin la introducción de la alteración. Al mismo tiempo, la actividad de unión a FcgRIIb de IL6R-BP208/EL6R-L es aproximadamente 100 veces y, por tanto, inferior a la del anticuerpo existente con una actividad de unión a FcgRIIb aumentada; sin embargo, su actividad de unión a FcgRIIaR es 1,3 veces y comparable a la del tipo IgG1. Por lo tanto, IL6R-BP208/IL6R-L es un anticuerpo excelente en selectividad para FcgRIIb.

Posteriormente, los presentes inventores consideraron que, con el fin de mejorar la actividad de unión a FcgR2b y la selectividad, es necesario obtener información sobre la estructura cristalográfica del complejo entre la región extracelular de FcgRIIb y Fc (BP208), que es la Fc de IL6R-BP208/IL6R-L, y evaluar con mayor precisión las mutaciones de aminoácidos a introducir. Por lo tanto, el complejo entre Fc (BP208) y la región extracelular de FcgRIIb se analizó mediante cristalografía de rayos X de acuerdo con el método experimental que se describe a continuación.

[Expresión y purificación de Fc (BP208)]

Se preparó una región Fc (BP208) como se indica a continuación. En primer lugar, la Cys en la posición 220 (numeración EU) de IL6R-BP208 se sustituyó por Ser. Posteriormente, la secuencia genética de Fc (BP208) desde Glu en la posición 236 (numeración EU) hasta su extremo C se clonó mediante PCR. Utilizando esta secuencia genética clonada, se llevaron a cabo la producción de vectores de expresión y la expresión y purificación de Fc (BP208) según el método del Ejemplo de Referencia 1. La Cys en la posición 220 (numeración EU) forma un enlace disulfuro con la Cys de la cadena L en la IgG1 general. La cadena L no se coexpresa cuando se prepara la región Fc sola y, por lo tanto, este resto se sustituyó por Ser para evitar la formación de enlaces disulfuro innecesarios.

[Expresión y purificación de la región extracelular de FcgRIIb]

Esta región se preparó según el método del Ejemplo de Referencia 8.

[Purificación del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb]

A 1,5 mg de la muestra de la región extracelular de FcgRIIb obtenida para la cristalización, se añadieron 0,15 mg de Endo F1 (Protein Science 1996, 5: 2617-2622) expresado y purificado de Escherichia co licomo proteína de fusión de glutatión S-transferasa. Se dejó que esta mezcla permaneciera a temperatura ambiente durante tres días en tampón de Bis-Tris 0,1 M a pH 6,5 y se escindió el N-oligosacárido, dejando W-acetilglucosamina unida directamente a Asn. Posteriormente, esta muestra de región extracelular de FcgRIIb sometida a tratamiento de escisión de carbohidratos se concentró mediante ultrafiltración con MWCO de 5000 y se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (Superdex20010/300) usando una columna equilibrada en HEPES 20 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,1 M. Además, a la fracción de la región extracelular de FcgRIIb con carbohidratos escindidos que se obtuvo, se le añadió Fc (BP208) para que la relación molar de la región extracelular de FcgRIIb estuviera presente en un ligero exceso, y después de la concentración por ultrafiltración con MWCO de 10.000, se obtuvo una muestra del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb mediante purificación por cromatografía de filtración en gel (Superdex200 10/300) usando una columna equilibrada en HEPES 25 mM a pH 7,5 que contenía NaCl 0,1 M.

[Cristalización del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb]

Una muestra de complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb se concentró hasta aproximadamente 10 mg/ml usando un filtro de ultrafiltración con MWC0 de 10000 y se cristalizó usando el método de difusión de vapor de gota colgante en combinación con el método de siembra. Se utilizó una placa VDXm (Hampton Research) para la cristalización. Utilizando una solución de depósito que contenía Bis-Tris 0,1 M (pH 6,5), PEG3350 al 19 % y fosfato de potasio dibásico 0,2 M, se prepararon gotas de cristalización en una proporción de mezcla de solución de depósito: muestra de cristalización = 0,85 pl: 0,85 pl. Los cristales del complejo obtenido en las mismas condiciones se trituraron con Seed Bead (Hampton Research) para preparar una solución de cristales seminales. Se añadieron 0,15 pl de una solución diluida producida a partir de la solución de cristales seminales a las gotas de cristalización, que se sellaron en los pocillos que contenían los depósitos y se dejaron en reposo a 20 °C. Esto produjo con éxito cristales en forma de placa.

[Medición de datos de difracción de rayos X de un cristal de complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb] Uno de los cristales individuales obtenidos del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb se empapó en una solución de Bis-Tris 0,1 M, pH 6,5, PEG3350 al 24 %, fosfato de potasio dibásico 0,2 M, etilenglicol al 20 % (v/v). El cristal se extrajo de la solución utilizando un alfiler con un pequeño bucle de nailon unido y se congeló en nitrógeno líquido; y posteriormente se midieron los datos de difracción de rayos X mediante BL32XU en Spring-8. Durante la medición, el cristal se colocó constantemente en una corriente de nitrógeno a -178 °C para mantenerlo en un estado congelado y se recogieron un total de 300 imágenes de difracción de rayos X utilizando el detector MX-225HE CCD (RAYONIX) unido a una línea de haz con rotación del cristal 0,6 ° cada vez. La determinación de los parámetros de la celda, la indexación de los puntos de difracción y el procesamiento de datos de difracción de las imágenes de difracción obtenidas se realizaron utilizando el programa Xia2 (J. Appl. Cryst. 2010, 43: 186-190), el paquete XDS (Acta. Cryst.

2010, D66: 125-132) y Scala (Acta. Cryst. 2006, D62: 72-82); y, finalmente, se obtuvieron datos de intensidad de difracción con una resolución de hasta 2,81 Á. El cristal pertenece al grupo espacial C2221 y tiene los siguientes parámetros de celda; a = 156,69 Á, b = 260,17 Á, c = 56,85 Á, a = 90°, p = 90°, y = 90°.

[Análisis cristalográfico de rayos X del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb]

La estructura cristalina del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcYRIIb se determinó mediante el método de sustitución molecular utilizando el programa Phaser ((J. Appl. Cryst. 2007, 40: 658-674). A partir del tamaño de la red cristalina obtenida y el peso molecular del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb, se predijo que el número de complejos en la unidad asimétrica sería uno. De las coordenadas estructurales del código de PDB: 3SGJ que es la estructura cristalina del complejo de Fc(WT)/región extracelular de FcgRIIIa, las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 239-340 de la cadena A y las posiciones 239-340 de la cadena B se tomaron como coordenadas separadas y se utilizaron respectivamente como modelos para buscar los dominios CH2 de Fc. Las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 341-444 de la cadena A y las posiciones 341-443 de la cadena B se tomaron como un solo conjunto de coordenadas de las mismas coordenadas estructurales del código de PDB: 3SGJ; y esto se utilizó como un modelo de búsqueda de los dominios CH3 de Fc. Por último, a partir de las coordenadas estructurales del código de PDB: 2FCB que es una estructura cristalina de la región extracelular de FcgRIIb, se tomaron las partes de restos de aminoácidos de las posiciones 6-178 de la cadena A y se usaron como modelo para buscar la región Fc (BP208). Los presentes inventores intentaron determinar las orientaciones y posiciones de cada modelo de búsqueda de dominios CH3 de Fc, región extracelular de FcgRIIb y dominio CH2 de Fc en las redes cristalinas usando la función de rotación y la función de translación, pero no pudieron determinar la posición de uno de los dominios CH2. A continuación, tomando como referencia la estructura cristalina del complejo de Fc (WT)/región extracelular de FcgRIIIa, se determinó la posición del último dominio A de CH2 a partir de un mapa de densidad electrónica que se calculó basándose en la fase determinada a partir de las tres partes restantes. Por lo tanto, los presentes inventores obtuvieron un modelo inicial para la estructura cristalina del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb. Cuando se realizó el refinamiento de cuerpo rígido que mueve los dos dominios CH2 de Fc, los dos dominios CH3 de Fc y la región extracelular FcgRIIb en el modelo inicial obtenido, el factor de fiabilidad cristalográfica, el valor de R se convirtió en 42,6 % y el valor de R libre se convirtió en 43,7 % para datos de intensidad de difracción de 25 Á a 3,0 Á en este punto. Además, se realizaron el refinamiento estructural utilizando el programa REFMAC5 (Acta Cryst. 2011, D67, 355-367) y la revisión del modelo para observar los mapas de densidad electrónica cuyo coeficiente tiene 2Fo-Fc o Fo-Fc, que se calculan basándose en el factor estructural Fo determinado experimentalmente, el factor estructural calculado Fc y la fase calculada utilizando el modelo, mediante el programa Coot (Acta Cryst. 2010, D66: 486-501) y se realizó el refinamiento del modelo repitiendo estos pasos. Por último, como resultado de la incorporación de moléculas de agua en el modelo basado en los mapas de densidad electrónica que utilizan 2Fo-Fc o Fo-Fc como coeficiente, y el siguiente refinamiento, el factor de fiabilidad cristalográfica, los valores de R y el valor de R libre del modelo que contiene 4794 átomos distintos de hidrógeno se convirtieron en 24,4 % y 27,9 % para 27259 datos de intensidad de difracción de resolución de 25 Á a 2,81 Á, respectivamente.

La estructura tridimensional del complejo de Fc (BP208)/región extracelular de FcgRIIb se determinó a una resolución de 2,81 Á mediante el análisis de la estructura. La estructura obtenida como resultado del análisis se muestra en la Fig. 49. Se reveló que la región extracelular de FcgRIIb estaba unida e intercalada entre dos dominios CH2 de Fc, que se parece a las estructuras tridimensionales de los complejos previamente analizados entre Fc (WT), que es la región Fc de la IgG nativa, y las respectivas regiones extracelulares de FcgRIIIa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2011, 108, 12669-126674), FcgRIIIb (Nature, 2000, 400, 267-273; J. Biol. Chem. 2011,276, 16469-16477) y FcgRIIa.

Sin embargo, una observación detallada de Fc (BP208) reveló una alteración en la estructura del bucle en 233-239 después de la región bisagra en el dominio A de CH2 debido a la influencia de las mutaciones introducidas G237D y P238D en comparación con la región Fc (WT) unida a FcgRIIa (Fig. 50). El resultado mostró que la amida de la cadena principal de G237 en Fc (BP208) formaba un fuerte enlace de hidrógeno con la cadena lateral de Tyrl60 en FcgRIIb. En FcgRIIa, está presente una Phe en lugar de esta Tyr160, y es incapaz de formar dicho enlace de hidrógeno. Esto sugiere que el enlace de hidrógeno descrito anteriormente contribuye de manera importante a la adquisición de la selectividad, es decir, a la mejora de la actividad de unión a FcgRIIb y la reducción de la unión a FcgRIIa.

Basándose en los resultados del análisis estructural, los presentes inventores evaluaron con precisión las posibles alteraciones para aumentar adicionalmente la actividad, y encontraron S239 como candidato para el sitio de introducción de la alteración. Como se muestra en la Fig. 51, la Ser239 del dominio B de CH2 se encuentra en una posición hacia la que sobresale la Lys117 de FcgRIIb de una manera estructuralmente natural. Sin embargo, como no se observó la densidad electrónica para la Lys117 de FcgRIIb mediante el análisis descrito anteriormente, se cree que la Lys117 no adquiere una estructura definida y tiene solo un efecto limitado sobre la interacción con Fc (BP208) en esta situación. Cuando S239 del dominio B de CH2 se modifica a D o E con carga negativa, se puede esperar una interacción electrostática con la Lys117 cargada positivamente de FcgRIIb, obteniéndose como resultado una actividad de unión a FcgRII mejorada.

Por otro lado, una observación de la estructura de S239 en el dominio A de CH2 sugiere que la cadena lateral de este aminoácido, mediante la formación de un enlace de hidrógeno con la cadena principal de G236, estabiliza la estructura del bucle en las posiciones 233 a 239, incluyendo D237 que forma un enlace de hidrógeno con la cadena lateral de la Tyr160 de FcgRIIb, después de la región bisagra (Fig. 52). La estabilización de la estructura del bucle en la conformación de unión suprime la reducción de entropía tras la unión y tiene como resultado un aumento de la energía libre de unión, lo cual conduce a la mejora de la actividad de unión. Al mismo tiempo, cuando S239 del dominio A de CH2 se modifica a D o E, la estructura del bucle se vuelve inestable debido a la pérdida del enlace de hidrógeno con la cadena principal de G236. Además, puede producirse repulsión electrostática a D265 en las proximidades, lo que lleva a una mayor desestabilización de la estructura del bucle. La energía para la desestabilización actúa disminuyendo la energía de interacción con FcgRIIb, dando como resultado una actividad de unión reducida. Específicamente, en el caso de un anticuerpo homodimerizado en cuyas dos cadenas H se han introducido S239D o S239E, el efecto de potenciación de la actividad de unión debido a la interacción electrostática del dominio B de CH2 con Lys117 de FcgRIIb se contrarresta con el efecto de reducción de la actividad de unión debido a la desestabilización de la estructura del bucle en el dominio A de CH2 y, por lo tanto, puede no tener como resultado una potenciación de la actividad de unión. Por otro lado, en el caso de un anticuerpo heterodimerizado en el que en solo una de las cadenas H se ha introducido S239D o S239E, como se mantiene la estabilización de la estructura del bucle por S239 del dominio A de CH2, se pensó que la actividad de unión aumentaba correspondiendo a la interacción electrostática recién formada con Lys117 de FcgRIIb debido a la introducción de S239D o S239E en el dominio B de CH2.

Para evaluar la hipótesis descrita anteriormente, los presentes inventores intentaron producir anticuerpos con actividad de unión a FcgRIIb aumentada adicionalmente mediante la introducción de la mutación S239D o S239E en la región Fc de una cadena H sola usando IL6R-BP208/IL6R-L como molde. Como una cadena H del anticuerpo se produjeron IL6R-BP256 (SEQ ID NO: 134) resultante de la introducción de S239D en IL6R-BP208, e IL6R-BP257 (SEQ ID NO: 135) resultante de la introducción de S239E en IL6R-BP208. Además, como la otra cadena H se produjeron IL6R-A5 (SEQ ID NO: 136) resultante de la introducción de mutaciones D356K y H435R en IL6R-G1d, e IL6R-AP002 (SEQ ID NO: 137) resultante de la introducción de E233D, G237D, P238D, H268D, P271G y A330R en IL6R-A5 (SEQ ID NO: 136) . Como la cadena L del anticuerpo común se usó IL6R-L (SEQ ID NO: 133) que es la cadena L de tocilizumab, y los anticuerpos homodimerizados IL6R-B3/IL6R-L, IL6R-BP208/IL6R-L, IL6R-BP253/IL6R-L, IL6R-BP256/IL6R-L e IL6R-BP257/IL6R-L, y los anticuerpos heterodimerizados IL6RAP002/IL6R-BP256/IL6R-L e IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L se prepararon junto con las respectivas cadenas H según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Se evaluó la actividad de unión de las variantes a FcgR la, FcgR IIaR, FcgR IIaH y FcgRIIb según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8. Los resultados se muestran en la Tabla 64.

Cuando una celda está rellena de color gris en la Tabla 64, significa que se concluyó que la unión de FcgR a IgG era demasiado débil como para analizarla adecuadamente mediante análisis cinético. Por lo tanto, cuando la interacción entre cada uno de los anticuerpos alterados y FcgR era débil, y se determinó que el análisis correcto era imposible mediante el análisis cinético mencionado anteriormente, las KD para tales interacciones se calcularon usando la siguiente ecuación del modelo de unión 1:1 descrita en el Manual de software Biacore T100 BR1006-48 Edición AE.

[Ecuación 1]

Req= C^Rmáx/ (KD+C) RI

C: concentración

RI: contribución en bruto del índice de refracción en la muestra

Rmáx: capacidad de unión a analitos de la superficie

[Ecuación 2]

KD= C^Rmáx/(Req-RI)-C

Al mismo tiempo, los valores obtenidos dividiendo la KD de IL6R-B3/IL6R-L para cada uno de FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH y FcgRIIb por la KD de cada variante, la KD relativa determinada al considerar 1 la KD de II,6R-B3/II,6R-L para cada uno de FcgRIIaR, FcgRIIaH y FcgRIIb, y los valores obtenidos dividiendo la KD de cada variante para FcgRIIaR por la KD para FcgRIIb se muestran en la Tabla 65.

T l

Como se muestra en la Tabla 65, IL6R-BP256/IL6R-L e IL6R-BP257/IL6R-L resultantes de la introducción de S239D o S239E en las dos cadenas H de IL6R-BP208/IL6R-L, mostraron una actividad de unión a FcgRIIb reducida así como una actividad de unión a FcgRIIaR reducida en comparación con la variante IL6R-BP208/IL6R-L antes de la introducción. Al mismo tiempo, la unión a FcgRIIb de IL6RAP002/IL6R-BP256/IL6R-L e IL6R-AP002/IL6R-BP257/IL6R-L resultantes de la introducción de S239D o S239E en una cadena H de IL6R-BP208/IL6R-L aumentaron 752 veces y 657 veces, respectivamente y, por lo tanto, sus actividades de unión a FcgRIIb fueron más altas que las conseguidas por la técnica existente. Además, las actividades de unión a FcgRIIaR aumentaron 7,7 veces y 8,3 veces, respectivamente, mientras que la de IL6R-BP208/IL6R-L aumentó 1,3 veces. En la tabla, KD(IIaR)/KD(IIb) representa un valor obtenido al dividir la KD de cada variante para FcgRIIaR por la KD para FcgRIIb. Cuando el valor es mayor, significa que la selectividad por FcgRIIb es mayor. El valor para IL6R-BP253/IL6R-L, que es un anticuerpo existente con mayor actividad de unión a FcgRIIb, es 0,3, lo que sugiere que la selectividad no ha mejorado en comparación con el tipo IgG1, mientras que el valor para IL6R-BP208/IL6R-L es 26,3, lo que implica que tiene una alta selectividad por FcgRIIb. En este experimento, IL6R-AP002/IL6R-BP256/IL6R-L e IL6RAP002/IL6R-BP257/IL6R-L, resultantes de la introducción de S239D o S239E en una cadena H de IL6R-BP208/IL6R-L, mostraron valores de KD(IIaR)/KD(IIb) de 34,3 y 27,7, respectivamente, y mejoraron más que IL6R-BP208/IL6R-L.

El resultado de la evaluación integral de variantes utilizando el tipo IgG1 (GpH7-B3/GpL16-k0) como molde, que se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 4, muestra que S239D y S239E tienen los efectos que se muestran en la Tabla 66. En la tabla, Ho/Con_2aR y Ho/Con_2b representan los niveles de actividad de unión a FcgRIIaR y FcgRIIb cuando se toman como 100 los del anticuerpo homodimerizado de control. Al mismo tiempo, He/Con_2aR y He/Con_2b representan los niveles de unión a FcgRIIaR y FcgRIIb cuando se toman como 100 los del anticuerpo heterodimerizado de control.

T l

La Tabla 66 muestra que las alteraciones S239D y S239E introducidas en este experimento, cuando se introducían en la IgG1 nativa tanto en una como en las dos cadenas, mejoraban la unión a FcRIIaR y FcgRIIb. Sin embargo, las alteraciones, cuando se introducían en las dos cadenas H de IL6R-BP208/IL6R-L, reducían las actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIb, y solo cuando se introducían en una cadena H, aumentaban las actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIb. El resultado demuestra que el efecto de las alteraciones es diferente del obtenido utilizando el tipo IgG1 como molde. Por lo tanto, se demostró que estas alteraciones consiguen el efecto descrito anteriormente solo cuando se introducen en IL6R-BP208/IL6R-L.

[Ejemplo 27] Diseño de la secuencia de aminoácidos de región constante para mejorar la capacidad de separar y purificar homodímeros y heterodímeros

[Selección del sitio de sustitución de restos]

La coexpresión de dos tipos de cadenas H (denominadas cadena A y cadena B) en la fabricación de anticuerpos heterodimerizados da como resultado la formación de: un anticuerpo homodimerizado resultante de la dimerización de cadenas H, ambas de las cuales son cadenas A, un anticuerpo homodimerizado resultante de la dimerización de cadenas H, ambas de las cuales son cadenas B, y un anticuerpo heterodimerizado resultante de la dimerización de cadenas H de las que una es la cadena A y la otra es la cadena B. Un método conocido para separar y purificar eficazmente anticuerpos heterodimerizados de interés es controlar el punto isoeléctrico de un anticuerpo y la capacidad de retención y separación en una columna de intercambio iónico mediante la sustitución de restos de aminoácidos en cada región variable (documento WO 2007/114325). Sin embargo, como cada anticuerpo tiene una secuencia diferente en sus regiones variables, particularmente en la región CDR, el método descrito anteriormente tiene una versatilidad limitada. Entonces, como método más versátil para sustituir restos en anticuerpos para purificar anticuerpos heterodimerizados, los presentes inventores investigaron un método para controlar el punto isoeléctrico y la capacidad de retención y separación en una columna de intercambio iónico mediante la sustitución de restos solo en la región constante de un anticuerpo.

En general, se cree que la separación en una columna de intercambio iónico depende de las cargas eléctricas en la superficie de las moléculas y, en muchos casos, la condición de separación se examina considerando el punto isoeléctrico de una molécula diana. Por lo tanto, en este ejemplo, también era de esperar que la separación en una columna de intercambio iónico mejorara sustituyendo restos de aminoácidos que constituyen la región constante del anticuerpo de una manera que provocara una diferencia de punto eléctrico entre los anticuerpos homodimerizados y los anticuerpos heterodimerizados a separar.

Al mismo tiempo, se ha sugerido que en la separación por cromatografía de intercambio iónico, no solo está implicado un modo de intercambio iónico puro, sino también una interacción hidrófoba (Peng Liu et al., J Chromatogr A. 2009, 30 de octubre; 1216(44): 7497-504). Por este motivo, en la separación y purificación basadas en el método descrito anteriormente, es posible utilizar cromatografía hidrófoba además de cromatografía de intercambio iónico.

Los métodos de sustitución de restos para alterar el punto isoeléctrico incluyen métodos para sustituir un resto neutro por un resto básico o ácido y métodos para sustituir un resto básico o ácido por un resto neutro. Los enfoques más eficaces incluyen métodos para sustituir un resto cargado positivamente por un resto cargado negativamente y métodos para sustituir un resto cargado negativamente por un resto cargado positivamente.

En los métodos descritos anteriormente, cada parte de una secuencia de anticuerpo puede ser candidata para el sitio de sustitución de un resto que da como resultado un cambio de punto isoeléctrico. Sin embargo, la sustitución aleatoria que da lugar a una secuencia no nativa puede aumentar el riesgo de inmunogenicidad y no es un método apropiado desde el punto de vista del uso farmacéutico.

Los restos pueden sustituirse para minimizar el número de epítopos de células T implicados en la inmunogenicidad, para minimizar el aumento del riesgo de inmunogenicidad. Un medio posible incluye el uso de secuencias de subclases de IgG. Las subclases de IgG humanas incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Sustituyendo porciones de una secuencia de anticuerpo por secuencias de diferentes subclases de acuerdo con un método descrito en el documento WO 2007/114325, el punto isoeléctrico se puede alterar mientras se suprime el aumento en el número de epítopos de células T.

Los métodos alternativos disponibles incluyen herramientas de predicción de epítopos de células T in silico tales como Epibase.

Epibase Light (Lonza) es una herramienta in silico para calcular la capacidad de unión entre el péptido de 9 unidades y el alelo DRB1 principal utilizando el algoritmo FASTER (Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3): 405-18). Esta herramienta permite la identificación de epítopos de células T que se unen fuerte o moderadamente al MHC de clase II.

El cálculo refleja la proporción de abundancia de los alotipos de DRB1. Para este fin, es posible utilizar la siguiente proporción de abundancia en poblaciones caucásicas.

DRB1*1501(24,5 %), DRB1*0301(23,7 %), DRB1*0701(23,3 %), DRB1*0101(15,0 %), DRB1 *1101(11,6 %), DRB1*1302(8,2 %), DRB1*1401/1454(4,9 %), DRB1*0901(2,3 %), DRB1*1502(0,5 %), DRB1*1202(0,1 %)

Todos los epítopos de cada secuencia de anticuerpo modificada que presentan una unión fuerte o moderada se identifican mediante un algoritmo FASTER, y posteriormente se muestran los epítopos críticos después de excluir las secuencias de la línea germinal humana y la secuencia de la unión de la región variable y la región constante. El número de epítopos de células T aumentados mediante la sustitución de cada resto en cualquier secuencia por cualquier resto de aminoácido se calcula utilizando la función de aleatorización de esta herramienta. Esto permite la selección de sitios de sustitución de restos que dan como resultado un cambio de punto isoeléctrico sin aumentar el número de epítopos de células T.

Se analizaron H240-AK072 (SEQ ID NO: 104) y H240-BH076 (SEQ ID NO: 105) mediante Epibase. La Tabla 67 muestra, para H240-AK072, el número de epítopos de células T que pueden cambiarse mediante la sustitución de cualquier resto, mientras que la Tabla 68 muestra este número para H240-BH076. Basándose en los resultados, se puede seleccionar la sustitución de restos que dé como resultado un cambio de punto isoeléctrico sin aumentar los epítopos de células T.

Tabla 672

E U N . ° S e c u e n c ia A K 072 A c D E F G H I K L M N p Q R S T V w Y

_

Tabla 67-3

Ċ

Tabla 67-4

Ċ

Tabla 67-5

Ċ

Tabla 67-6

Tabla 68-2

Tabla 68-3

Ċ

Tabla 68-4

Ċ

Tabla 68-5

Ċ

Tabla 68-6

Mediante los métodos descritos anteriormente y una combinación de los mismos, se diseñaron variantes de H240-AK072 y H240-BH076 descritas a continuación (Tablas 69 y 70) con respecto a los sitios de sustitución de restos para alterar el punto isoeléctrico.

[Construcción del vector de expresión para anticuerpos alterados H240-AK072/H240-BH076/L73-k0]

En primer lugar, para construir ADNc para el anticuerpo modificado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0, se diseñaron ADN de oligos sintéticos utilizando H240-AK072 o H240-BH076 como molde de tal manera que produjeran una mutación en cada uno de los restos de aminoácidos seleccionados. A continuación, se construyeron vectores de expresión de células animales que portaban genes de interés usando cada ADN de oligo sintético según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1.

[Expresión y purificación del anticuerpo alterado H240-AK072/H240-BH076/L73-k0]

Para evaluar los anticuerpos alterados de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0, se prepararon anticuerpos modificados según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1 coexpresando en combinaciones dadas una cadena L (L73-k0, SEQ ID NO: 106) y cada cadena H resultante de la introducción de una alteración en H240-AK072 o H240-BH076 (la cadena H resultante de la introducción de una alteración en H240-AK072 se denomina cadena A, mientras que la cadena H resultante de la introducción de una alteración en H240-BH076 se denomina cadena B) de modo que cada uno de los anticuerpos resultantes tuviera cadena A y cadena B en cualquiera de las combinaciones. Las SEQ ID NO de las cadenas A y B representativas se muestran en la Tabla 71.

T l 71

[Ejemplo 28] Evaluación fisicoquímica de las variantes de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0

[Medición de la diferencia de tiempo de retención mediante cromatografía de intercambio catiónico]

Cada anticuerpo se ensayó en las siguientes condiciones.

Fase móvil A: MES-NaOH 20 mM, pH 6,0

Fase móvil B: MES-NaOH 20 mM, NaCl 200 mM, pH 6,0

Columna: Bio Pro SP-F (YMC)

Caudal: 0,5 ml/min

Gradiente: 10 % B (0-5 min), 10-60 % B (5-55 min)

Detección: Abs. 280 nm

La figura 53 muestra un cromatograma representativo. El pico en una posición temprana de elución corresponde al anticuerpo homodimerizado de cadena B-cadena B, mientras que el pico principal corresponde al anticuerpo heterodimerizado de cadena A-cadena B. En la cadena A se introduce una sustitución de restos (H435R) para reducir la unión a la proteína A. Los anticuerpos utilizados en este experimento se eliminan en la etapa de purificación con rProtein A Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare) durante el proceso de preparación mediante el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. Por lo tanto, el anticuerpo homodimerizado de cadena A-cadena A apenas se detecta en las condiciones descritas anteriormente. Los presentes inventores calcularon:

diferencia de tiempo de retención ART (min) = (tiempo de retención para el pico de anticuerpo heteromérico) - (tiempo de retención para el pico de anticuerpo homomérico de cadena B), como indicador para evaluar la separación de anticuerpos heterodimerizados y homodimerizados. La Tabla 72 muestra los resultados de la evaluación de diversas variantes. Los resultados demuestran que la diferencia de tiempo de retención entre el anticuerpo heteromérico y el anticuerpo homomérico se hace mayor dependiendo de la introducción de sustituciones de restos diseñadas y sus combinaciones.

[Evaluación del contenido de agregados por el método de cromatografía de filtración en gel]

Se evaluó el contenido de agregados de los anticuerpos purificados mediante análisis SEC usando el sistema ACQUITY UPLC H-Class (Waters). Como fase móvil se usó tampón fosfato 50 mM, pH 7,0, que contenía cloruro de sodio 300 mM (Isekyu) y como columna analítica se usó BEH200 SEC (Waters). Las mediciones se realizaron a una longitud de onda de 215 nm. Los datos se analizaron utilizando Empower2 (Waters). Los componentes eluidos en el lado de mayor peso molecular en relación con los monómeros se consideraron colectivamente el agregado y se calculó su contenido. La Tabla 72 muestra los resultados de la evaluación para las diversas variantes. Los resultados sugieren que las variantes respectivas conservan la estabilidad con respecto a la polimerización, ya que el contenido de agregado no aumentó drásticamente en comparación con H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 antes de la alteración.

[Evaluación de anticuerpos alterados con respecto al punto medio de temperatura de desnaturalización térmica (Tm) por fluorimetría diferencial de barrido]

La estabilidad térmica de los anticuerpos se evaluó determinando su punto medio de temperatura de desnaturalización térmica (Tm) mediante fluorimetría diferencial de barrido usando Rotor-Gene Q (QIAGEN). Se ha notificado que este método muestra una excelente correlación con la evaluación de Tm utilizando un calorímetro diferencial de barrido, que es un método ampliamente conocido para evaluar la estabilidad térmica de anticuerpos (Journal of Pharmaceutical Science 2010, 4: 1707-1720).

Después de diluir 5000 veces SYPRO orange concentrado (Molecular Probes) con PBS (Sigma), se mezclaron con él soluciones de anticuerpos para preparar muestras de medición. Se pusieron 20 pl de cada una de las muestras en tubos de medición y se aumentó la temperatura de 30 °C a 99 °C. La temperatura se elevó 0,4 °C y la mezcla se dejó en reposo durante aproximadamente 6 segundos, y se determinó la intensidad de la fluorescencia a 470 nm (longitud de onda de excitación)/555 nm (longitud de onda fluorescente).

A partir de los datos, la temperatura a la que se observó la transición de fluorescencia se calculó como T m usando el programa informático Rotor-Gene Q Series (QIAGEN). De la misma manera que se notifica en Molecular Immunology 37 (2000) 697-706 y similares, la Tm del dominio CH2 se definió como Tm1 correspondiente a la primera transición. Al mismo tiempo, los valores de Tm estaban próximos entre CH3 y Fab de los anticuerpos analizados y se consideró difícil compararlos por separado. Por lo tanto, los valores de Tm usados en esta evaluación son valores de Tm1. La Tabla 72 muestra los resultados de la evaluación para diversas variantes. Los resultados sugieren que las respectivas variantes conservan la estabilidad estructural, porque los valores de Tm no se redujeron drásticamente en comparación con H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 antes de la alteración.

[Tabla 72]

DIVERSOS DATOS DE PROPIEDADES FÍSICAS

Nombre A RT (min) Tm (°C) AGREGADO(%)

H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 5,241 63,0 2,34

H240-FA020/H240-FB059/L73-k0 17,283 62,6 1,78

H240-FA020/H240-FB082/L73-k0 17,206 62,7 1,50

H240-FA020/H240-FB083/L73-k0 19,658 62,5 3,38

H240-FA020/H240-FB084/L73-k0 19,433 62,6 3,51

H240-FA021/H240-FB059/L73-k0 17,886 62,0 1,28

H240-FA021/H240-FB082/L73-k0 17,705 62,2 1,15

H240-FA021/H240-FB083/L73-k0 20,203 62,0 2,49

H240-FA021/H240-FB084/L73-k0 20,084 62,1 3,05

H240-FA030/H240-FB059/L73-k0 24,494 59,9 0,62

H240-FA030/H240-FB082/L73-k0 24,624 59,8 0,58

H240-FA030/H240-FB083/L73-k0 26,710 59,9 1,96

H240-FA030/H240-FB084/L73-k0 26,767 60,0 1,98

H240-FA024/H240-FB059/L73-k0 27,505 59,9 0,67

H240-FA024/H240-FB082/L73-k0 28,482 59,7 0,63

H240-FA024/H240-FB083/L73-k0 31,255 59,7 1,87

H240-FA024/H240-FB084/L73-k0 31,171 59,8 1,74

[Evaluación de la separación en la purificación por cromatografía de intercambio iónico]

Se evaluó la separación de cada muestra en un método de purificación por cromatografía de intercambio iónico utilizando AKTA avant25 (GE healthcare). La fase móvil utilizada fue tampón MES 20 mM, pH 6,0 y tampón MES 20 mM, pH 6,0, que contiene cloruro de sodio 500 mM. La columna utilizada fue Hi Trap SP HP 1 ml (Ge healthcare). La purificación se llevó a cabo mediante un método de gradiente utilizando una mezcla de dos soluciones. Los datos de purificación se recogieron a una longitud de onda de 280 nm. El resultado de la elución se evaluó utilizando Unicorn6.1 (GE healthcare). La Fig. 54 muestra un resultado de evaluación para la variante de H240-FA021/H240-BF084/L73-k0. El resultado demuestra que, introduciendo las sustituciones de restos recientemente identificadas en este experimento, los anticuerpos homodimerizados y heterodimerizados pueden separarse y purificarse mediante purificaciones que utilizan medio de columna utilizado a gran escala.

[Ejemplo 29] Evaluación inmunológica de las variantes de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0

[Evaluación de la actividad de unión a FcyR mediante el método de resonancia de plasmón de superficie]

Se analizó la interacción de los anticuerpos de interés con FcgR según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 8.

Los resultados de la evaluación para diversas variantes se muestran en la Tabla 73. Los resultados demuestran que la capacidad de unión a FcyR de la variante H240-FA021/H240-BF084/L73-k0, que se confirmó que estaba separada en la Fig. 54, era comparable a la de H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 antes de la alteración.

[Tabla 73]

DATOS DE ACTIVIDAD DE UNIÓN A FcyR

Nombre KD (1a) KD (2aR) KD (2aH) KD (2b) KD (3aF) KD (3aV) e x p e r im e n t o N.2

H240- 1, 10E-10 2,40E-07 7,20E-08 1,30E-06 2,90E-09 9,90E-10 1

AK072/H240-BH076/L73-k0

H240- 8,90E-11 2,90E-07 9,30E-08 1,60E-06 4,40E-09 1,30E-09 1

FA024/H240-FB059/L73-k0

H240- 9,50E-11 3,30E-07 1,10E-07 1,90E-06 4,70E-09 1,30E-09 1

FA024/H240-FB064/L73-k0

H240- 1,50E-10 3,00E-07 9,50E-08 1,70E-06 5,00E-09 1,40E-09 1

FA024/H240-FB065/L73-k0

H240- 1,20E-10 2,50E-07 8,50E-08 1,50E-06 4,80E-09 1,40E-09 1

FA030/H240-FB059/L73-k0

H240- 5,70E-11 2,90E-07 9,60E-08 1,80E-06 5,30E-09 1,50E-09 1

FA030/H240-FB064/L73-k0

H240- 1,00E-10 3,40E-07 9,90E-08 2,40E-06 4,60E-09 1,10E-09 1

FA030/H240-FB065/L73-k0

H240- 1,00E-10 2,80E-07 8,60E-08 1,40E-06 5,00E-09 1,30E-09 1

FA012/H240-FB056/L73-k0

H240- 8,20E-11 2,60E-07 8,50E-08 1,50E-06 3,90E-09 1,20E-09 1

FA030/H240-FB059/L73-k0

H240- 9,20E-11 3,00E-07 8,80E-08 1,90E-06 4,30E-09 1,30E-09 1

FA030/H240-FB082/L73-k0

H240- 8,10E-11 2,80E-07 s2bf-0s 1,50E-06 3,90E-09 1,20E-09 1

FA030/H240-FB083/L73-k0

H240- 1,20E-10 2,70E-07 8,80E-08 2,50E-06 4,20E-09 1,30E-09 1

FA030/H240-FB084/L73-k0

H240- 1,30E-10 2,40E-07 8,00E-08 1,50E-06 4,60E-09 1,30E-09 1

FA024/H240-FB082/L73-k0

H240- 9,50E-11 2,50E-07 7,90E-08 1,50E-06 4,60E-09 1,20E-09 1

FA024/H240-FB084/L73-k0

H240- 1,20E-10 2,80E-07 6,90E-08 1,50E-06 3,70E-09 1,20E-09 2

AK072/H240-BH076/L73-k0

(continuación)

Nombre KD (1a) KD (2aR) KD (2aH) KD (2b) KD (3aF) KD (3aV) EXPERIMENTO N.2 H240- 1,70E-10 2,50E-07 6,90E-08 1,30E-06 4,30E-09 1,10E-09 2 FA009/H240-FB001/L73-k0

H240- 7,60E-11 3,50E-07 1,10E-07 1,70E-06 6,30E-09 1,50E-09 2 FA012/H240-FB001/L73-k0

H240- 3,60E-11 4,40E-07 1,20E-07 3,30E-06 6,40E-09 1,70E-09 2 FA030/H240-FB001/L73-k0

H240- 1,80E-09 3,70E-07 1,10E-07 2,00E-06 6,70E-09 1,90E-09 2 FA024/H240-FB001/L73-k0

H240- 1,10E-10 2,30E-07 6,10E-08 1,40E-06 3,00E-09 8,40E-10 2 FA009/H240-FB017/L73-k0

H240- 9,30E-11 3,30E-07 8,40E-08 1,80E-06 4,20E-09 1,30E-09 2 FA009/H240-FB015/L73-k0

H240- 1,20E-10 3,10E-07 8,00E-08 1,60E-06 3,40E-09 1,00E-09 2 FA009/H240-FB033/L73-k0

H240- 1,20E-10 2,50E-07 6,40E-08 1,40E-06 3,90E-09 1,10E-09 2 FA009/H240-FB020/L73-k0

H240- 1,30E-10 2,50E-07 7,00E-08 1,40E-06 4,40E-09 1,00E-09 2 FA009/H240-FB016/L73-k0

H240- 5,10E-11 2,70E-07 7,20E-08 1,40E-06 4,30E-09 8,90E-10 2 FA009/H240-FB052/L73-k0

H240- 5,10E-11 2,80E-07 7,00E-08 2,20E-06 3,70E-09 7,80E-10 2 FA009/H240-FB021/L73-k0

H240- 5,00E-11 2,70E-07 7,40E-08 1,70E-06 4,40E-09 1,10E-09 2 FA009/H240-FB047/L73-k0

H240- 1,10E-10 2,40E-07 7,90E-08 1,40E-06 3,70E-09 1,20E-09 3 AK072/H240-BH076/L73-k0

H240- 6,90E-11 2,80E-07 9,20E-08 1,30E-06 4,40E-09 1,70E-09 3 FA021/H240-FB059/L73-k0

H240- 6,00E-11 2,30E-07 7,70E-08 1,60E-06 4,20E-09 1,50E-09 3 FA021/H240-FB082/L73-k0

H240- 7,80E-11 2,40E-07 6,90E-08 1,30E-06 3,90E-09 1,40E-09 3 FA021/H240-FB083/L73-k0

H240- 3,30E-11 2,30E-07 6,90E-08 1,30E-06 3,30E-09 1,30E-09 3 FA021/H240-FB084/L73-k0

H240- 3,80E-11 2,50E-07 7,70E-08 1,30E-06 3,50E-09 1,30E-09 3 FA020/H240-FB059/L73-k0

H240- 7,90E-11 2,70E-07 6,90E-08 1,20E-06 3,40E-09 1,10E-09 3 FA020/H240-FB082/L73-k0

H240- 1,20E-10 2,30E-07 6,50E-08 1,00E-06 3,40E-09 1,10E-09 3 FA020/H240-FB083/L73-k0

H240- 6,80E-11 2,20E-07 5,70E-08 1,40E-06 3,50E-09 1,00E-09 3 FA020/H240-FB084/L73-k0

[Evaluación del riesgo de inmunogenicidad usando una herramienta de predicación de inmunogenicidad in silico, Epibase]

La utilidad clínica y la eficacia de los productos farmacéuticos de anticuerpos están limitadas por los anticuerpos anti fármaco (ADA). Los ADA afectan a la eficacia de los fármacos y a la cinética de los productos farmacéuticos de anticuerpos y, algunas veces, causan efectos secundarios graves. Se han notificado muchos factores que influyen en la inmunogenicidad y, en particular, se cree que es importante que los antígenos contengan epítopos de células T. Las herramientas in silico disponibles para predecir tales epítopos de células T incluyen Epibase (Lonza), iTope/TCED (Antitope) y EpiMatrix (EpiVax). Se ha notificado que podrían predecirse las secuencias que contienen epítopos de células T presentes en proteínas de interés utilizando las herramientas descritas anteriormente (Expert Opin Biol Ther.

2007 Mar; 7(3): 405-18).

Se puede determinar una puntuación de inmunogenicidad in silico para cada anticuerpo modificado de acuerdo con la siguiente ecuación (Ecuación 4) en el sistema de Epibase Light (Lonza).

[Ecuación 4]

Puntuación de inmunogenicidad = Suma (cada frecuencia de población de alotipo DRB1 X número de epítopos críticos)

El cálculo refleja la proporción de abundancia de los alotipos de DRB1. Para este fin, es posible utilizar la siguiente proporción de abundancia en caucásicos.

DRB1*1501 (24,5 %), DRB1*0301(23,7 %), DRB1*0701(23,3 %), DRB1*0101(15,0 %), DRB1 *1101(11,6 %), DRB1*1302(8,2 %), DRB1*1401/1454(4,9 %), DRB1*0901(2,3 %), DRB1*1502(0,5 %), DRB1*1202(0,1 %)

Se identifican todos los epítopos contenidos en cada secuencia de anticuerpo modificada que presentan una unión fuerte o moderada mediante un algoritmo FASTER y, posteriormente, los epítopos después de excluir las secuencias de la línea germinal humana y las secuencias de unión entre la región variable y la región constante se utilizan como epítopos críticos en el cálculo de la puntuación de inmunogenicidad. Cuando la puntuación es menor, significa que una secuencia tiene menor riesgo de inmunogenicidad. La Tabla 74 muestra las puntuaciones de riesgo calculadas para H240-AK072 y H240-BH076, y para variantes obtenidas de las mismas. Por lo tanto, las variantes que dan como resultado una capacidad mejorada de separación y purificación de homodímeros y heterodímeros y cuyo riesgo de inmunogenicidad no se altera mucho en comparación con H240-AK072/H240-BH076/L73-k0 se pueden producir seleccionando cualquier combinación de cadena A y cadena B.

[Tabla 74]

PUNTUACIÓN DE RIESGO DE INMUNOGENICIDAD

Nombre ^PUNTUACIÓN

_{DE RIESGO}

H240-AK072 564,6

H240-FA020 552,0

H240-FA021 552,0

H240-FA030 565,3

H240-FA024 552,0

H240-BH076 480,4

H240-FB059 480,4

H240-FB082 480,4

H240-FB083 505,1

H240-FB084 505,1

[Ejemplo 30]

En los Ejemplos 20 y 21 se identificaron anticuerpos heterodimerizados H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 y H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0, que presentan una unión mejorada a FcgR activadores. Entre las alteraciones utilizadas en estos anticuerpos heterodimerizados, se sustituyeron los aminoácidos en las posiciones 234 y 239 de H240-Kn125 y H240-Kn120 y el aminoácido en la posición 330 de H240-H1076 por otros aminoácidos para examinar si se pueden obtener mejores anticuerpos heterodimerizados.

(30-1) Examen del aminoácido en la posición 234

Y en la posición 234 (numeración EU), que está contenido en H240-Kn125 y H240-Kn120, se sustituyó por el aminoácido nativo L o V, D, Q, I, M, T, A, G, H, S, F o E; y se produjeron variantes heterodimerizadas que llevan H240-H1076 y H240-H1068 como la otra cadena según el método del Ejemplo de Referencia 1. Para comparar con la tecnología existente, se produjo un anticuerpo afucosilado (H240-afucosyl_G1d/L73-k0) y H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0 que tiene S239D/A330L/I332E para las dos cadenas. Además, entre las variantes descritas en el documento WO 2012/125850, se produjeron variantes correspondientes a W187 (una variante que tiene S239D/A330M/K334V para una de las cadenas H y L234Y/K290Y/Y296W para la otra cadena H) y M81 (una variante que tiene S239D/K334V para una de las cadenas H y L234Y/Y296W/S298C para la otra cadena H), que muestran la mayor afinidad por FcYRIIIa y se consideran las mejores variantes. Específicamente, se produjeron H240-Kn204 resultante de la introducción de L234Y/K290Y/Y296W en H240-Kn033, H240-Hl211 resultante de la introducción de S239D/A330M/K334V en H240-H1033, H240-Kn205 resultante de la introducción de L234Y/Y296W/S298C en H240-Kn033 y H240-Hl212 resultante de la introducción de S239D/K334V en H240-H1033 según el método del Ejemplo de Referencia 1. H240-Kn204/H240-Hl211/L73-k0 y H240-Kn205/H240-Hl212/L73-k0 se prepararon según el método del Ejemplo de Referencia 1, combinando H240-Kn204 como una de las cadenas H y L73-k0 como las cadenas L con H240-Hl211 como la otra cadena H, y combinando H240-Kn205 como una de las cadenas H y L73-k0 como las cadenas L con H240-Hl212 como la otra cadena H, y luego expresándolos. La unión de las variantes preparadas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV se midieron según el método del Ejemplo de Referencia 8. Los resultados de estas mediciones se resumen en la Tabla 75.

En la Tabla 75, "molde" muestra cuál de las cadenas de H240-Kn125 y H240-Kn120 se usó como molde para sustituir el aminoácido en la posición 234. "Aminoácido en la posición 234" muestra el resto de aminoácido en la posición 234 (numeración EU) en H240-Kn125 o H240-Kn120 después de la sustitución de aminoácidos. "N.° de veces para 2aR", "N.° de veces para 2aH", "N.° de veces para 2b", "N.° de veces para 3aF" y "N.° de veces para 3aV" muestran la actividad de unión relativa de cada variante a FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV, respectivamente, cuando la actividad de unión de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, una variante producida introduciendo solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado en una IgG1 nativa, se define como 1. Específicamente, son valores obtenidos dividiendo el valor de KD de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 para cada FcgR por el valor de KD de una variante individual para cada FcgR.

En comparación con H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 producido introduciendo solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado en IgG1, el anticuerpo afucosilado (H240-afucosyl_G1d/L73-k0) mostró una potenciación de la unión a FcgRIIIaF de cuatro veces y una potenciación de la unión a FcgRIIIaV de siete veces. H240-Kn032/H240-H1032/L73-k0, que lleva S239D/A330L/I332E en las dos cadenas, mostró un aumento de 32 veces de unión a FcgRIIIaF y un aumento de 16 veces de unión a FcgRIIIaV. El anticuerpo heterodimerizado preexistente H240-Kn204/H240-Hl211 (una variante que tiene S239D/A330M/K334V en una de las cadenas H y L234Y/K290Y/Y296W en la otra cadena H) mostró una potenciación de la unión a FcgRIIIaF de 21 veces y una potenciación de la unión a FcgRIIIaV de siete veces, y H240-Kn205/H240-Hl212 (una variante que tiene S239D/K334V en una de las cadenas H y L234Y/Y296W/S298C en la otra cadena H) mostró una potenciación de la unión a FcgRIIIaF de 24 veces y una potenciación de la unión a FcgRIIIaV de 11 veces. Por otro lado, las variantes producidas en este examen mostraron una potenciación de la unión a FcgRIIIaF de 69 a 223 veces y una potenciación de la unión a FcgRIIIaV de 60 a 185 veces, y todas las variantes tienen actividades de unión a FcgRIIIa más altas que las obtenidas por técnicas preexistentes. Entre ellas, H240-Kn198/H240-Hl076/L73-k0 producido sustituyendo con el aminoácido L nativo la posición 234 (numeración EU) en H240-Kn125 de H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0 mostró la mayor unión a FcgRIIIaF, y la actividad de unión fue 193 veces superior a la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. H240-Kn184/H240-Hl068/L73-k0 producido sustituyendo con el aminoácido E la posición 234 en H240-Kn120 de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 mostró la mayor unión a FcgRIIIaV, y la actividad de unión fue 141 veces superior a la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Las variantes que tienen actividades de unión al menos 100 veces mayores a FcgRIIIaF y FcgRIIIaV que las de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 son: H240-Kn201/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn202/H240-Hl076/L73-k0 y H240-Kn208/H240-Hl076/L73-k0, que se produjeron sustituyendo la posición 234 en H240-Kn125 de H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 por F, E y D, respectivamente; y H240-Kn184/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn217/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0, que se produjeron sustituyendo la posición 234 en H240-Kn120 de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 por E, D, T y L, respectivamente. Entre ellas, H240-Kn198/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn201/H240-Hl076/L73-k0, H240-Kn202/H240-Hl076/L73-k0 y H240-Kn208/H240-Hl076/L73-k0, que se produjeron sustituyendo la posición 234 en H240-Kn125 de H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0 por L, F, E y D, respectivamente, mostraron, todas ellas, una unión suprimida al FcgRIIb inhibidor al mismo o menor nivel que el de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, y son excelentes anticuerpos heterodimerizados para inducir funciones efectoras.

Las variantes que muestran mayores actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIaH que las de H240-Kn037/H240-Kn036/L73-k0 producidas por técnicas preexistentes para potenciar la unión a FcgRIIa fueron H240-Kn216/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn219/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn220/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0, que se produjeron sustituyendo la posición 234 de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 por V, I, T, M y L, respectivamente. Entre ellas, H240-Kn219/H240-Hl068/L73-k0, H240-Kn221/H240-Hl068/L73-k0 producida por sustitución con T, y H240-Kn199/H240-Hl068/L73-k0 producida por sustitución con L tienen altas actividades de unión a FcgRIIIa y son excelentes variantes.

Los resultados mencionados anteriormente mostraron que todas las variantes examinadas en la presente memoria tienen una unión a FcgRIIIa más alta que las obtenidas por la tecnología preexistente; y, en algunas de estas variantes, su actividad de unión a FcgRIIb no se potencia, o su actividad de unión a FcgRIIa es mayor que la conseguida por la tecnología preexistente. Por lo tanto, se demostró que eran mejores anticuerpos heterodimerizados que los obtenidos por la tecnología preexistente en términos de inducción de funciones efectoras de anticuerpos.

(30-2) Examen del aminoácido en la posición 330

Posteriormente, se examinó el aminoácido en la posición 330. Se ha introducido la alteración A330M en H240-Hl076 de H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0. Las cadenas en las que el aminoácido en la posición 330 se ha sustituido por Ala (forma nativa), Phe, Pro, Ile, Tyr o His se produjeron según el método del Ejemplo de Referencia 1, y se expresaron en combinación con H240-Kn125. Se utilizó L73-k0 como cadena L de anticuerpo común. La unión de las variantes producidas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV se midieron según el método del Ejemplo de Referencia 8. Estos resultados de medición se resumen en la Tabla 76.

En la Tabla, "aminoácido en la posición 330" indica el resto de aminoácido después de la sustitución en la posición 330 en H240-H1076. "N.° de veces para 2aR", "N.° de veces para 2aH", "N.° de veces para 2b", "N.° de veces para 3aF" y "N.° de veces para 3aV" muestran la actividad de unión relativa de cada variante a FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV, respectivamente, cuando la actividad de unión de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 se define como 1. H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 es una variante producida introduciendo solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado en una IgG1 nativa. Específicamente, son valores obtenidos dividiendo el valor de KD de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 para cada FcgR por el valor de KD de una variante individual para cada FcgR.

Todas las variantes producidas en este examen tienen una mayor actividad de unión a FcgRIIIa que las conseguidas por la tecnología preexistente de potenciación de la unión a FcgRIIIa; y entre las variantes examinadas, H240-Kn125/H240-Hl214/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con Phe mostró la unión más alta a FcgRIIIaF, y H240-Kn125/H240-Hl217/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con Y mostró la unión más alta a FcgRIIIaV. Con respecto a la unión a FcgRIIb, en comparación con la variante H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 producida introduciendo en la IgG1 nativa solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado, de las variantes examinadas esta vez, H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con Ile mostró la unión más baja de 0,4 veces, y H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con His mostró la unión más alta de 1,1 veces, y ambas variantes tenían la misma actividad de unión o una actividad de unión reducida a FcgRIIb en comparación con la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. La unión a FcgRIIaR de H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 fue 1,8 veces mayor que la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0; mientras que de las variantes examinadas esta vez, H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con Ile mostró la unión más baja de 1,0 veces, y H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con His mostró la unión más alta de 2,4 veces. Además, con respecto a la unión a FcgRIIaH, H240-Kn125/H240-Hl216/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con Ile mostró el valor más bajo de 2,5 veces, y H240-Kn125/H240-Hl218/L73-k0 producida sustituyendo la posición 330 con His mostró el valor más alto de 4,7 veces. Los resultados mencionados anteriormente mostraron que las variantes producidas sustituyendo con Ala, Phe, Ile, Tyr o His la posición 330 en H240-H1076 de H240-Kn125/H240-Hl076/L73-k0 tienen una unión a FcgRIIIa más alta que las producidas por la tecnología preexistente, y sus actividades de unión a FcgRIIb no se potencian. Además, varias variantes tenían mayores actividades de unión a FcgRIIa que las producidas por la tecnología preexistente, y se demostró que eran mejores anticuerpos heterodiméricos que los producidos por la tecnología preexistente en términos de inducción de funciones efectoras de anticuerpos.

(30-3) Examen del aminoácido en la posición 239

Se introduce una alteración de sustitución de Ser en la posición 239 con Met tanto en H240-Kn125 como en H240-Kn120. En este caso, se examinó si esta Met puede sustituirse por Ile. Como se muestra en la Tabla 44 del Ejemplo 17, la sustitución de la posición 239 por Ile potencia la unión a FcgRIIb más que la sustitución por Met, pero esta alteración tiene un efecto más fuerte de potenciación de la unión a FcgRIIa y FcgRIIIa.

Específicamente, la posición 239 se sustituyó por Ile en H240-Kn120 de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 y en H240-Kn125 de H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0 para producir H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0 y H240-Kn225/H240-Hl076/L73-k0, respectivamente, según el método descrito en el Ejemplo de Referencia 1. La unión de las variantes producidas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV se midieron según el método del Ejemplo de Referencia 8. Estos resultados de medición se resumen en la Tabla 77.

En la Tabla, "N.2 de veces para 2aR", "N.s de veces para 2aH", "N.s de veces para 2b", "N.s de veces para 3aF" y "N.s de veces para 3aV" muestran la actividad de unión relativa de cada variante a FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV, respectivamente, cuando la actividad de unión de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 se define como 1. H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 es una variante producida introduciendo en una IgG1 nativa solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado. Específicamente, son valores obtenidos dividiendo el valor de KD de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 para cada FcgR por el valor de KD de una variante individual para cada FcgR.

Las actividades de unión de H240-Kn225/H240-Hl076/L73-k0 producida sustituyendo con Ile la posición 239 en H240-Kn125 de H240-Kn125/H240-H1076/L73-k0 para FcgRIIIaF y FcgRIIIaV se potenciaron 264 veces y 253 veces, respectivamente, en comparación con las de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Al mismo tiempo, La unión a FcgRIIb se suprimió a 0,6 veces en comparación con la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Las actividades de unión de H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0 producida sustituyendo con Ile la posición 239 en H240-Kn120 de H240-Kn120/H240-Hl068/L73-k0 para FcgRIIIaF y FcgRIIIaV se potenciaron 138 veces y 62 veces, respectivamente, en comparación con las de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0. Los dos tipos de variantes producidas en este examen fueron mejores que las producidas por la técnicas preexistentes para mejorar la unión a FcgRIIIa. En comparación con la de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, la unión de H240-Kn229/H240-Hl068/L73-k0 a FcgRIIaR y FcgRIIaH fue de 46 y 13 veces, respectivamente, y fue mayor que la de H240-Kn037/H240-H1036/L73-k0 producida por técnicas preexistentes para potenciar la unión a FcgRIIa.

(30-4) Examen de alteraciones combinadas

En la investigación realizada hasta ahora, se han examinado los aminoácidos en las posiciones 234 y 239 de H240-Kn125 y H240-Kn120, y el aminoácido en la posición 330 de H240-H1076. En este caso, se combinaron alteraciones en las variantes obtenidas hasta el momento, que se consideran muy eficaces para potenciar las funciones efectoras de los anticuerpos, para examinar la producción de anticuerpos heterodimerizados superiores.

Específicamente, se produjeron genes de cadena pesada de anticuerpo en los que se introdujeron F, E, D, S o L en la posición 234 y se introdujeron I o M en la posición 239 de H240-Kn125. Además, se produjeron cadenas pesadas de anticuerpo en las que se introdujeron V, E, D, T, I, L o F en la posición 234 y se introdujeron M o I en la posición 239 de H240-Kn120. Para la otra cadena H del anticuerpo, se utilizó una cadena H producida introduciendo A o F en la posición 330 en H240-Hl076 o, como alternativa, H240-Hl068. Se utilizó L73-k0 como cadena L de anticuerpo común. La unión de las variantes producidas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV se midieron según el método del Ejemplo de Referencia 8. Los resultados de estas mediciones se resumen en la Tabla 78.

En la Tabla, "Molde de Kn" muestra cuál de las cadenas de H240-Kn120 y H240-Kn125 se utilizó como molde para la alteración, y "molde de HI" muestra cuál de las cadenas de H240-Hl068 y H240-H1076 se utilizó como molde. Cuando la casilla "molde de Hl" está rellena de color gris, se utilizó H240-Hl068 para una de las cadenas H de la variante. "Aminoácido en la posición 234" y "Aminoácido en la posición 239" indican el tipo de aminoácidos en las posiciones 234 y 239 de la cadena de Kn, y "Aminoácido en la posición 330" indica el tipo de aminoácido en la posición 330 de la cadena de HI después de la sustitución de aminoácidos. "N.° de veces para 2aR", "N.° de veces para 2aH", "N.° de veces para 2b", "N.° de veces para 3aF" y "N.° de veces para 3aV" muestran la actividad de unión relativa de cada variante a FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaF y FcgRIIIaV, respectivamente, cuando la actividad de unión de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 se define como 1. H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 es una variante producida introduciendo en una IgG1 nativa solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado. Específicamente, son valores obtenidos dividiendo el valor de KD de H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 para cada FcgR por el valor de KD de una variante individual para cada FcgR.

En comparación con H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0, que es una variante producida introduciendo en una IgG1 nativa solo alteraciones que promueven la formación de un anticuerpo heterodimerizado, las variantes producidas en este examen tuvieron una potenciación de 51 veces a 161 veces la actividad de unión a FcgRIIIaF y una potenciación de 34 veces a 107 veces la actividad de unión a FcgRIIIaV, y todas las variantes tenían actividades de unión más altas que las variantes obtenidas por la tecnología preexistente para potenciar la unión a FcgRIIIa. La variante que mostró la mayor potenciación de la actividad de unión a FcgRIIIaF fue H240-Kn227/H240-Hl214/L73-k0 producida sustituyendo con E la posición 234 y con I la posición 239 de H240-Kn125 y con F la posición 330 de H240-H1076. La variante que mostró la mayor potenciación de la actividad de unión a FcgRIIIaV fue H240-Kn203/H240-Hl210/L73-k0 producida sustituyendo con F la posición 234 de H240-Kn120 y con A la posición 330 de H240-Hl076. Las variantes con actividad de unión potenciada a FcgRIIIaF y FcgRIIIaV incluyen H240-Kn226/H240-Hl214/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con F y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn125, y la posición 330 se sustituye con F en H240-Hl076), H240-Kn227/H240-Hl214/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con E y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn125, y la posición 330 se sustituye con F en H240-Hl076) y H240-Kn228/H240-Hl214/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con D y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn125, y la posición 330 se sustituye con F en H240-Hl076). La unión a FcgRIIb también se mantuvo en estas variantes en el mismo grado que en H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 (de 1,0 veces a 1,4 veces).

En comparación con H240-Kn033/H240-H1033/L73-k0 de tipo silvestre, hubo una potenciación de 0,9 a 83 veces de la actividad de unión a FcgRIIaR y una potenciación de 1,2 a 33 veces de la actividad de unión a FcgRIIaH; y H240-Kn231/H240-Hl068/L73-k0 producida sustituyendo con I las posiciones 234 y 239 de H240-Kn120 mostraron la mayor potenciación de las actividades de unión. Las variantes cuyas actividades de unión a FcgRIIaR y FcgRIIaH aumentaron en comparación con las de H240-Kn037/H240-Kn036/L73-k0, que se produjeron mediante la introducción de alteraciones preexistentes que potencian la unión a FcgRIIa, fueron H240-Kn230/H240-Hl068/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con V y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn120), H240-Kn236/H240-Hl068/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con T y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn120), H240-Kn231/H240-Hl068/L73-k0 (donde las posiciones 234 y 239 se sustituyen con I en H240-Kn120), H240-Kn232/H240-Hl068/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con L y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn120) y H240-Kn235/H240-Hl068/L73-k0 (donde la posición 234 se sustituye con F y la posición 239 se sustituye con I en H240-Kn120).

Los resultados mostraron que todas las variantes examinadas aquí tienen mayores actividades de unión a FcgRIIIa que las obtenidas mediante la tecnología preexistente; y, en algunas variantes, las actividades de unión a FcgRIIa también fueron más altas que las obtenidas por la tecnología preexistente. Por lo tanto, se demostró que eran mejores anticuerpos heterodimerizados que los obtenidos por la tecnología preexistente en términos de inducción de funciones efectoras de anticuerpos.

Las SEQ ID NO de las cadenas H de las variantes examinadas se muestran en la Tabla 79.

continuación

[Ejemplo de Referencia 1] Construcción de vectores de expresión para anticuerpos y expresión y purificación de anticuerpos

Se introdujeron sustituciones de aminoácidos mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica utilizando el kit de mutagénesis dirigida QuikChange (Stratagene), PCR, o el kit de clonación In fusion Advantage PCR (TAKARA), y se construyeron los vectores de expresión. Las secuencias de nucleótidos de los vectores de expresión obtenidos se determinaron mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los plásmidos producidos se introdujeron transitoriamente en la línea celular HEK293H derivada de células de cáncer de riñón embrionario humano (Invitrogen) o en células FreeStyle293 (Invitrogen) para la expresión de anticuerpos. Los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo obtenido mediante métodos conocido por los expertos en la técnica utilizando rProtein A Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare). Para la concentración de los anticuerpos purificados, se midió su absorbancia a 280 nm usando un espectrofotómetro. A partir del valor obtenido, el coeficiente de extinción calculado por el método PACE se utilizó para calcular la concentración de anticuerpo (Protein Science 1995; 4: 2411 -2423).

[Ejemplo de Referencia 2] Preparación de FcyR y evaluación de la actividad de unión a FcyR

Se prepararon dominios extracelulares de FcgR mediante el siguiente método. En primer lugar, se sintetizó un gen del dominio extracelular de FcgR mediante un método bien conocido por los expertos en la técnica. En ese momento, se produjo la secuencia de cada FcgR basándose en la información registrada en el NCBI. Específicamente, FcgRI se produjo basándose en la secuencia del NCBI con n.° de acceso NM_000566.3, FcgRIIa se produjo basándose en la secuencia del NCBI con n.° de acceso NM_001136219.1, FcgRIIb se produjo basándose en la secuencia del NCBI con n.° de acceso NM_004001.3, FcgRIIIa se produjo basándose en la secuencia del NCBI con n.° de acceso NM_001127593.1 y FcgRIIIb se produjo basándose en la secuencia del NCBI con n.° de acceso NM_000570.3, y se unió una etiqueta His al extremo C. Además, se conoce el polimorfismo para FcgRIIa, FcgRIIIa y FcgRIIIb, y los sitios polimórficos se produjeron tomando como referencia J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25 para FcgRIIa; J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcgRIIIa; y J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691 para FcgRIIIb.

Los fragmentos de genes obtenidos se insertaron en un vector de expresión de células animales y se produjeron vectores de expresión. Los vectores de expresión producidos se introdujeron transitoriamente en células FreeStyle293 (Invitrogen) derivadas de la línea celular de cáncer de riñón embrionario humano para expresar las proteínas de interés. En cuanto al FcgRIIb utilizado para el análisis cristalográfico, la proteína de interés se expresó en presencia de kifunesina a una concentración final de 10 pg/ml, de modo que la cadena de azúcar añadida a FcgRIIb será del tipo con alto contenido de manosa. Las células se cultivaron y, después de recoger el sobrenadante de cultivo obtenido, este se pasó a través de un filtro de 0,22 pm para obtener el sobrenadante del cultivo. En principio, los sobrenadantes de cultivo obtenidos se purificaron en las siguientes cuatro etapas. Las etapas realizadas fueron, cromatografía en columna de intercambio catiónico (SP Sepharose FF) en la etapa 1, cromatografía en columna de afinidad (HisTrap HP) para la etiqueta His en la etapa 2, cromatografía en columna de filtración en gel (Superdex200) en la etapa 3 y cromatografía aséptica en la etapa 4. Sin embargo, para FcgRI, la cromatografía en columna de intercambio aniónico usando Q sepharose FF se realizó como etapa 1. Las proteínas purificadas se sometieron a mediciones de absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro; y a partir de los valores obtenidos, se calcularon las concentraciones de las proteínas purificadas usando el coeficiente de absorción calculado usando métodos tales como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411 -2423).

El análisis de la interacción entre el anticuerpo objetivo y el FcyR se llevó a cabo utilizando Biacore T100 (GE Healthcare). Se utilizó HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de funcionamiento y la temperatura de medición se fijó en 25 °C. Los chips producidos inmovilizando el péptido antigénico mediante el método de acoplamiento de amina a un chip Sensor de Serie S CM5 (GE Healthcare), o como alternativa, se utilizaron chips producidos permitiendo que péptidos antigénicos biotinilados preliminarmente interaccionaran y se inmovilizaran en un Chip Sensor de Serie S SA (certificado) (GE Healthcare). Los anticuerpos de interés se capturaron en un chip con péptido antigénico inmovilizado y se dejaron interaccionar con cada FcyR diluido con tampón de funcionamiento. Para regenerar y usar repetidamente el chip, los anticuerpos capturados en el chip se lavaron haciendo reaccionar glicina-HCl 10 mM, a un pH de 1,5.

La actividad de unión a FcyR de cada anticuerpo se evaluó principalmente usando como indicador la actividad de unión a FcyR y la constante de disociación para FcyR.

La actividad de unión a FcyR se refiere a la actividad de unión relativa a FcyR. Con respecto a la actividad de unión relativa a FcyR, en cada medición, la actividad de unión de una muestra de control se consideró el 100 (%) para calcular las actividades de unión de otros anticuerpos. La actividad de unión descrita anteriormente se definió como un valor obtenido dividiendo el nivel de cambio en el sensorgrama antes y después de la interacción de FcyR con el anticuerpo capturado por la cantidad de cada anticuerpo capturado. La razón es que la actividad de unión de FcyR depende de la cantidad de anticuerpo capturado.

La constante de disociación de cada anticuerpo para FcyR se calculó realizando un análisis cinético del resultado de la medición de Biacore. Específicamente, para calcular la constante de velocidad de asociación ka (L/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), los sensorgramas obtenidos por medición se procesaron para el ajuste global por el programa informático de evaluación Biacore utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1 y se calculó la constante de disociación KD (mol/l) a partir de los valores resultantes.

[Ejemplo de Referencia 3] Producción de vectores de expresión para genes de anticuerpos heterodimerizados y expresión de cada anticuerpo

Como región variable de cadena H del anticuerpo, se utilizaron las que se describen a continuación:

Q153 (la región variable de cadena H del anticuerpo anti-F.IX humano; SEQ ID NO: 61);

Q407 (la región variable de cadena H del anticuerpo anti-F.IX humano; SEQ ID NO: 62);

J142 (la región variable de cadena H del anticuerpo anti-F.X humano; SEQ ID NO: 63);

J300 (la región variable de cadena H del anticuerpo anti-F.X humano; SEQ ID NO: 64); y

MRA-VH (la región variable de cadena H de un anticuerpo anti-receptor de interleucina-6 humana; SEQ ID NO: 65).

Como cadena L del anticuerpo, se utilizaron las que se describen a continuación:

L180-k (la cadena L común del anticuerpo anti-F.IX humano/anticuerpo anti-F.X humano; SEQ ID NO: 66);

L210-k (la cadena L común del anticuerpo anti-F.IX humano/anticuerpo anti-F.X humano; SEQ ID NO: 67); y MRA-k (la cadena L de un anticuerpo anti-receptor de interleucina 6 humana; SEQ ID NO: 68).

Como región constante de cadena H del anticuerpo, se utilizaron las que se describen a continuación:

G4d (SEQ ID NO: 69), que se construyó a partir de IgG4 introduciendo una mutación de sustitución de Ser a Pro en la posición 228 (numeración EU) y delecionando los aminoácidos Gly y Lys C-terminales;

z72 (SEQ ID NO: 70), que se construyó a partir de G4d introduciendo una mutación de sustitución de His a Arg en la posición 435 (numeración EU), una mutación de sustitución de Tyr a Phe en la posición 436 (numeración EU) y una mutación de sustitución de Leu a Pro en la posición 445 (numeración EU);

z7 (SEQ ID NO: 71), que se construyó a partir de G4d introduciendo una mutación de sustitución de Glu a Lys en la posición 356 (numeración EU);

z73 (SEQ ID NO: 72), que se construyó a partir de z72 introduciendo una mutación de sustitución de Lys a Glu en la posición 439 (numeración EU);

z106 (SEQ ID NO: 73), que se construyó a partir de z7 introduciendo una mutación de sustitución de Lys a Gln en la posición 196 (numeración EU), una mutación de sustitución de Phe a Tyr en la posición 296 (numeración EU) y una mutación de sustitución de Arg a Lys en la posición 409 (numeración EU);

z107 (SEQ ID NO: 74), que se construyó a partir de z73 introduciendo una mutación de sustitución de Lys a Gln en la posición 196 (numeración EU), una mutación de sustitución de Phe a Tyr en la posición 296 (numeración EU), una mutación de sustitución de Arg a Lys en la posición 409 (numeración EU) y una mutación de sustitución de Phe a Tyr en la posición 436 (numeración EU); y

G1d (SEQ ID NO: 75), que se construyó eliminando los aminoácidos Gly y Lys C-terminales de IgG1. La mutación de sustitución de Glu a Lys en la posición 356 (numeración EU) y la mutación de sustitución de Lys a Glu en la posición 439 (numeración EU) se introdujeron para la formación eficaz de moléculas heteroméricas a partir de las respectivas cadenas H en la producción de anticuerpos heteroméricos ((documento WO 2006/106905) PROCESS FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDE BY REGULATION OF ASSEMBLY).

Los genes de cadena H del anticuerpo anti-F.IX humano Q153-G4d y Q153-z7 se construyeron uniendo respectivamente G4d y z7 cadena abajo de Q153. El gen de cadena H del anticuerpo anti-F.IX humano Q407-z106 se construyó uniendo z106 cadena abajo de Q407. Los genes de cadena H del anticuerpo anti-F.X humano J142-G4d, J142-z72 y J142-z73 se construyeron uniendo respectivamente G4d, z72 y z73 cadena abajo de J142. El gen de cadena H del anticuerpo anti-F.X humano J300-z107 se construyó uniendo z107 cadena abajo de J300. Los genes de cadena H del anticuerpo anti-receptor de interleucina-6 humana MRA-G1d, MRA-z106 y MRA-z107 se construyeron uniendo respectivamente G1d, z106 y z107 cadena abajo de MRA-VH

Los genes de anticuerpos respectivos (Q153-G4d, Q153-z7, Q407-z106, J142-G4d, J142-z72, J142-z73, J300-z106, MRA-G1d, MRA-z106, MRA-z107, L180-k, L210-k y MRA-k) se insertaron en vectores de expresión de células animales.

Se expresaron los siguientes anticuerpos de forma transitoria en células FreeStyle293 (Invitrogen) mediante transfección utilizando los vectores de expresión construidos. Como se ve a continuación, se dispusieron y usaron múltiples genes de anticuerpos a transfectar como nombres de anticuerpos.

MRA-G1d/MRA-k

M RA-z 106/M RA-z 107/M RA-k

Q153-G4d/J142-G4d/L180-k

Q153-G4d/J142-z72/L180-k

Q153-z7/J142-z73/L180-k

Q407-z106/J300-z107/L210-k

[Ejemplo de Referencia 4] Evaluación de las condiciones de elución del anticuerpo heterodimerizado en cromatografía de afinidad de proteína A, y separación y purificación

Como muestra para evaluar la condición de elución en cromatografía de afinidad de proteína A se utilizó un medio de cultivo celular FreeStyle293 (en adelante abreviado como CM) obtenido por expresión transitoria de Q153-G4d/J142-G4d/L180-k y Q153-G4d/J142-z72/L180-k. El CM filtrado a través de un filtro de ^0,22 gm se cargó en una columna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada con D-PBS. Los lavados 1 y 2 y las eluciones 1 a 5 mostradas en la Tabla 80 se realizaron de manera escalonada. La cantidad de CM a cargar se ajustó de manera que la cantidad de anticuerpo cargado en la columna fuera 20 mg/ml de resina. Se recogieron las fracciones eluidas en cada condición y se identificaron los componentes de cada fracción de elución mediante análisis de cromatografía de intercambio catiónico. Para preparar controles, cada CM se cargó en resina rProtein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). Como controles se utilizaron muestras purificadas mediante elución discontinua. Como la proteína G se une al dominio Fab de un anticuerpo, utilizando proteína G pueden purificarse todas las especies de anticuerpos (el anticuerpo biespecífico de interés en el que dos tipos de cadenas H están asociadas de manera heteromérica (anticuerpo heteromérico) y, como impurezas, los anticuerpos homoméricos monoespecíficos en los que están asociadas de forma homomérica cadenas H de un solo tipo) en CM, independientemente de su actividad de unión a la proteína A.

T l

continuación

El CM en el que se había expresado Q153-G4d/J142-G4d/L180-k o Q153-G4d/J142-z72/L180-k se eluyó de una columna de proteína A (Eluciones 1 a 5), y se analizaron las respectivas fracciones eluidas por cromatografía de intercambio catiónico. En cuanto a Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, el análisis reveló que a medida que la condición de elución se alteraba de 1 a 5, es decir, a medida que se reducía el pH del tampón de elución, la composición de anticuerpos de las fracciones eluidas cambiaba gradualmente en el orden del anticuerpo homomérico J142-G4d/L180-k al anticuerpo heteromérico Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, y luego al anticuerpo homomérico Q153-G4d/L180 -k. Se entiende que el orden de elución está de acuerdo con la fuerza de unión a la proteína A. Esto implica que la fuerza de unión a la proteína A del anticuerpo homomérico Q153-G4d/L180-k, que permaneció unido hasta un pH más bajo, es mayor que la de la especie homomérica J142-G4d/L180-k (anticuerpo homomérico contra FX) que eluyó a un pH elevado. Se sabe que la región variable J142 es una secuencia que no se une a la proteína A. Específicamente, la especie homomérica J142-G4d/L180-k (anticuerpo homomérico contra FX) tiene dos sitios de unión a la proteína A; el anticuerpo heteromérico Q153-G4d/J142-G4d/L180-k tiene tres sitios de unión a la proteína A; y el anticuerpo homomérico Q153-G4d/L180-k (anticuerpo homomérico contra FIX) tiene cuatro sitios de unión a la proteína A. Así quedó demostrado que, más sitios de unión a la proteína A dieron como resultado una unión a la proteína A más fuerte y, por lo tanto, se requirió un pH más bajo para la elución.

Al mismo tiempo, en cuanto a Q153-G4d/J142-z72/L180-k, se reveló que a medida que la condición de elución se alteraba de 1 a 5, la composición del anticuerpo en la fracción eluida cambiaba del anticuerpo heteromérico Q153-G4d/J142-z72/L180-k al anticuerpo homomérico Q153-G4d/L180-k. El anticuerpo homomérico J142-z72/L180-k (anticuerpo homomérico contra FX) fue casi indetectable en cada fracción de elución, y esto indica que no tiene capacidad de unión a la proteína A. Se cree que la falta de capacidad de unión a la proteína A de J142-z72 podría deberse a la mutación de sustitución introducida de His por Arg en la posición 435 (numeración EU). El anticuerpo homomérico J142-z72/L180-k (anticuerpo homomérico contra FX) no tiene sitio de unión a la proteína A; el anticuerpo heteromérico Q153-G4d/J142-z72/L180-k tiene dos sitios de unión a la proteína A; y el anticuerpo homomérico Q153-G4d/L180-k (anticuerpo homomérico contra FIX) tiene cuatro sitios de unión a la proteína A. Dado que el anticuerpo homomérico J142-z72/L180-k (anticuerpo homomérico contra FX) fluía sin unirse a la proteína A y no se detectaba en cada fracción de elución. Además, tanto en el caso de Q153-G4d/J142-G4d/L180-k como en el de Q153-G4d/J142-z72/L180-k, se sugirió que el anticuerpo heteromérico y el anticuerpo homomérico Q153-G4d/L180-k (un anticuerpo homomérico contra FIX) eran separables entre sí a pH 3,6 o a un pH inferior.

Los anticuerpos heterodimerizados se purificaron mediante cromatografía en columna de proteína A en las condiciones de purificación evaluadas como se ha descrito anteriormente.

Como muestra, se utilizó el CM de los anticuerpos enumerados a continuación.

- Q153-G4d/J142-G4d/L180-k

- Q153-G4d/J142-z72/L180-k

- Q153-z7/J142-z73/L180-k

- Q407-z106/J300-z107/L210-k

El CM filtrado a través de un filtro de ^0,22 pm se cargó en una columna rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) equilibrada con D-PBS. Se llevaron a cabo los lavados 1 y 2 y las eluciones 1 y 2 que se muestran en la Tabla 81 (se realizó la elución 1 sola para Q407-z106/J300-z107/L210-k). La condición de elución se basó en el resultado descrito anteriormente. La cantidad de CM a cargar se ajustó de manera que la cantidad de anticuerpo cargado fuera 20 mg/ml de resina. Se recogieron las fracciones eluidas en cada condición y se identificaron los componentes contenidos en cada fracción de elución mediante análisis de cromatografía de intercambio catiónico. De la misma manera que se muestra en el resultado descrito anteriormente, cada CM se cargó en resina rProtein G Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) para preparar los controles. Como controles se utilizaron muestras purificadas mediante elución discontinua.

Los resultados del análisis de cromatografía de intercambio catiónico para cada fracción eluida se muestran a continuación en las Tablas 82 a 85. Los valores representan el área del pico de elución expresada en porcentaje. Con respecto a los anticuerpos distintos de Q153-G4d/J142-G4d/L180-k, el anticuerpo homomérico contra FX era casi indetectable en cualquier fracción de elución. Se reveló que no solo el anticuerpo homomérico J142-z72 (anticuerpo homomérico contra FX) sino también los anticuerpos homoméricos J142-z73 y J300-z107 (anticuerpos homoméricos contra FX) no se unían a la proteína A. Se cree que la falta de capacidad de unión a la proteína A en el anticuerpo homomérico contra FX se debía a la mutación de sustitución de His por Arg en la posición 435 (numeración EU), que se introdujo en la región constante de cadena H del anticuerpo contra FX. El anticuerpo heteromérico, que es un anticuerpo biespecífico de interés, se detectó principalmente en la fracción de elución 1, sin embargo, aunque también se detectó a un nivel muy bajo en la fracción de elución 1, el anticuerpo homomérico contra FIX se eluyó principalmente mediante la elución 2. En comparación con Q153-G4d/J142-z72/L180-k, en los casos de Q153-z7/J142-z73/L180-k y Q407-z106/J300-z107/L210-k, la proporción del anticuerpo heteromérico (anticuerpo biespecífico de interés) aumentó considerablemente en la fracción eluida a pH 3,6. Se demostró que cuando se introducía una mutación de sustitución de Glu a Lys en la posición 356 (numeración EU) y una mutación de sustitución de Lys a Glu en la posición 439 (numeración EU) con el propósito de la formación eficaz de moléculas heteroméricas para las respectivas cadenas H además de la mutación de sustitución de His a Arg en la posición 435 (numeración EU), el anticuerpo heteromérico, que es un anticuerpo biespecífico de interés, podía purificarse hasta una pureza del 98 % o más mediante la etapa de purificación basada en proteína A sola.

El hallazgo descrito anteriormente muestra que, basándose en la diferencia en el número de sitios de unión a la proteína A entre el anticuerpo homomérico y el anticuerpo heteromérico, el anticuerpo heteromérico puede separarse y purificarse eficazmente hasta una pureza elevada utilizando solo la etapa de cromatografía de proteína A.

T l 4

T l

[Ejemplo de Referencia 5] Evaluación de Tm en anticuerpos alterados mediante fluorimetría diferencial de barrido

En esta evaluación, se evaluó la Tm de anticuerpos alterados se evaluó mediante fluorimetría diferencial de barrido utilizando Rotor-Gene Q (QIAGEN). Se ha notificado que este método muestra una excelente correlación con la evaluación de Tm utilizando un calorímetro diferencial de barrido, que es un método ampliamente conocido para evaluar la estabilidad térmica de anticuerpos (Journal of Pharmaceutical Science 2010, 4: 1707-1720).

Después de diluir 5000 veces SYPRO orange concentrado (Molecular Probes) con PBS (Sigma), se mezclaron con él soluciones de anticuerpos para preparar muestras de medición. Se pusieron 20 pl de cada una de las muestras en tubos de medición y se aumentó la temperatura a una velocidad de aumento de temperatura de 240 °C/h desde 30 °C hasta 99 °C. El cambio de fluorescencia con el aumento de temperatura se detectó a 470 nm (longitud de onda de excitación)/555 nm (longitud de onda fluorescente).

A partir de los datos, la temperatura a la que se observó la transición de fluorescencia se calculó como T m usando el programa informático Rotor-Gene Q Series (QIAGEN).

[Ejemplo de Referencia 6] Prueba de aceleración de anticuerpos heteroméricos modificados

Se realizaron pruebas de aceleración con respecto a los anticuerpos descritos en este ejemplo y se comparó la estabilidad de almacenamiento.

Después de la purificación con proteína A, se prepararon los anticuerpos a 1,0 mg/ml usando PBS que contenía ácido clorhídrico 0,2 mM y se almacenaron en una incubadora a 40 °C. Al inicio del almacenamiento, después de dos semanas de almacenamiento y después de cuatro semanas de almacenamiento, se evaluó el contenido de monómero de cada anticuerpo mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna G3000 SW^{x l}.

[Ejemplo de Referencia 7] Actividad ADCC de cada anticuerpo de prueba usando células mononucleares periféricas humanas como células efectoras

Se ensayó la actividad de ADCC de las variantes con actividad de unión a FcyR aumentada mediante la introducción de una alteración en solo una cadena H de un anticuerpo según el método descrito a continuación.

La ADCC de cada anticuerpo de prueba se ensayó usando células mononucleares de sangre periférica humana (en lo sucesivo denominadas "PBMC humanas") como células efectoras mediante el procedimiento que se describe a continuación.

(1) Preparación de soluciones de PBMC humanas

Utilizando jeringas precargadas con 200 pl de 1000 unidades/ml de solución de heparina (Novo-Heparin, 5000 unidades para inyección; Novo Nordisk), se recogieron 50 ml de sangre periférica de voluntarios sanos (varones adultos) asociados a Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. La sangre periférica se diluyó dos veces con PBS(-) y se dividió en cuatro partes iguales, cada una de las cuales se transfirió a un tubo de separación de leucocitos precentrifugado Leucosep (Greiner Bio-One) que contenía 15 ml de Ficoll-Paque PLUS. Los tubos de separación que contenían una alícuota de sangre periférica se centrifugaron a 2.150 rpm y a temperatura ambiente durante diez minutos. A continuación, se recogieron las fracciones de células mononucleares resultantes. Las células de cada fracción se lavaron una vez con medio de Eagle modificado de Dulbecco (SIGMA) que contenía FBS al 10 % (en lo sucesivo denominado "FBS al 10 %/D-MEM") y luego se suspendieron a una densidad de 5 x 106 células/ml en FBS al 10 %/D-MEM. Las suspensiones celulares se utilizaron como soluciones de PBMC humanas en los experimentos posteriores.

(2) Preparación de células diana

Se separó de la placa SK-pca13a resultante de la expresión forzada de glipican-3 humano en SK-Hep-1 y se añadieron 1,85 MBq de Cr-51 a 3 x 106 células. Las células a las que se añadió Cr-51 se incubaron en una incubadora en una atmósfera de gas de dióxido de carbono al 5 % a 37 °C durante una hora. Después, las células se lavaron una vez con FBS al 10 %/D-MEM y se suspendieron a una densidad celular de 2 x 105 células/ml en FBS al 10 %/D-MEM. La suspensión celular se utilizó como células diana en los experimentos posteriores.

(3) Prueba de liberación de cromo (actividad de ADCC)

La actividad de ADCC se evaluó basándose en la tasa de liberación de cromo específica determinada por el ensayo de liberación de cromo. En primer lugar, se añadieron soluciones de anticuerpos preparadas a cada concentración (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 y 40 pg/ml) en 50 pl a los respectivos pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en U. A continuación, se sembraron alícuotas de 50 pl de las células diana preparadas como se describe en (2) (1 x 104 células/pocillo) y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 100 pl de solución de PBMC humana preparada como se describe en (1) a cada pocillo (5 x 105 células/pocillo). Las placas se incubaron en una atmósfera de gas dióxido de carbono al 5 % en una incubadora de CO2 a 37 °C durante cuatro horas y después se centrifugaron. Se midió la radiactividad de 100 pl de sobrenadante de cultivo en cada pocillo de las placas usando un contador gamma. La tasa de liberación de cromo específica se determinó mediante la siguiente fórmula: [Tasa de liberación de cromo específica (%)] = (A-C) x 100 / (B-C)

En esta fórmula, "A" representa la radiactividad media (cpm) de 100 pl de sobrenadante de cultivo en cada pocilio. "B" representa la radiactividad media (cpm) de 100 pl de sobrenadante de cultivo en un pocillo que contiene células diana, 100 pl de solución acuosa de NP-40 al 2 % (Nonidet P-40; Nacalai Tesques) y 50 pl de FBS/D-MEM al 10 %. Además, "C" representa la radiactividad media (cpm) de 100 pl de sobrenadante de cultivo en un pocillo que contiene células diana y 150 pl de FBS/D-MEM al 10 %. La prueba se realizó por triplicado. La media y la desviación típica de la tasa de liberación de cromo específica (%) que refleja la ADCC de cada anticuerpo de prueba se calcularon basándose en el ensayo descrito anteriormente.

[Ejemplo de Referencia 8] Preparación de FcyR y evaluación de la actividad de unión a FcyR

El análisis de interacción entre el anticuerpo objetivo y el FcyR se llevó a cabo utilizando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200, Biacore A100 y Biacore 4000. Se utilizó HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de funcionamiento y la temperatura de medición se fijó en 25 °C. Se utilizaron chips producidos inmovilizando el péptido antigénico mediante el método de acoplamiento de amina en un chip Sensor de Serie S CM5 (GE Healthcare), chips producidos permitiendo que péptidos antigénicos biotinilados preliminarmente interaccionaran y se inmovilizaran en un Chip Sensor de Serie S SA (certificado) (GE Healthcare), chips producidos inmovilizando proteína L (ACTIGEN, Bio Vision) en un Chip Sensor de Serie S CM5 (GE Healthcare) o chips producidos inmovilizando proteína A/G (Thermo Scientific) en un Chip Sensor de Serie S CM5 (GE Healthcare). Los anticuerpos de interés se capturaron en estos chips y se dejaron interaccionar con cada FcyR diluido con tampón de funcionamiento. Para regenerar y usar repetidamente el chip, los anticuerpos capturados en el chip se separaron por lavado mediante la reacción con glicina-HCl 10 mM, a un pH de 1,5.

La constante de disociación de cada anticuerpo para FcyR se calculó realizando un análisis cinético del resultado de la medición de Biacore. Específicamente, para calcular la constante de velocidad de asociación ka (L/mol/s) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s), los sensorgramas obtenidos por medición se procesaron para el ajuste global por el programa informático de evaluación Biacore utilizando un modelo de unión de Langmuir 1:1. La constante de disociación KD (mol/l) se calculó a partir de los valores resultantes.

[Ejemplo de Referencia 9] Actividad de ADCC de cada anticuerpo de prueba usando células mononucleares de sangre periférica humana como células efectoras

Cada variante con alteración de Fc se analiza para determinar su actividad de ADCC según el método que se describe a continuación.

La actividad de ADCC de cada anticuerpo de prueba se ensayó usando células mononucleares de sangre periférica humana (en lo sucesivo denominadas "PBMC humanas") como células efectoras mediante el procedimiento que se describe a continuación.

(1) Preparación de soluciones de PBMC humanas

Utilizando jeringas precargadas con 200 gl de 1000 unidades/ml de solución de heparina (Novo-Heparin, 5000 unidades para inyección; Novo Nordisk), se recogieron 50 ml de sangre periférica de voluntarios sanos (varones adultos) asociados a Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. La sangre periférica se diluyó dos veces con PBS(-) y se dividió en cuatro partes iguales, cada una de las cuales se transfirió a un tubo de separación de leucocitos precentrifugado Leucosep (Greiner Bio-One) que contenía 15 ml de Ficoll-Paque PLUS. Los tubos de separación que contenían una alícuota de sangre periférica se centrifugaron a 2.150 rpm y a temperatura ambiente durante diez minutos. A continuación, se recogieron las fracciones de células mononucleares resultantes. Las células de cada fracción se lavaron una vez con medio de Eagle modificado de Dulbecco (SIGMA) que contenía FBS al 10 % (en lo sucesivo denominado "FBS al 10 %/D-MEM") y luego se suspendieron a una densidad de 5 x 106 células/ml o 2,5 x 106 células/ml en FBS al 10 %/D-MEM. Las suspensiones celulares se utilizaron como soluciones de PBMC humanas en los experimentos posteriores.

(2) Preparación de células diana

SK-pca13a resultante de la expresión forzada de epirregulina humana en SK-Hep-1, SKE18, la línea celular de cáncer de colon humano DLD-1 o la línea celular de páncreas humano MIAPaCa-2 se separaron de la placa y se añadieron 200 gl de solución de calceína 0,2 mg/ml a 1 x 106 células o 1,85 MBq de Cr-51 se agregaron a 3 x 106 células. Las células a las que se añadió calceína o Cr-51 se incubaron en una incubadora en una atmósfera de gas de dióxido de carbono al 5 % a 37 °C durante una o dos horas. A continuación, las células se lavaron una vez con FBS al 10 %/D-MEM y se suspendieron a una densidad celular de 2 x 105 células/ml en FBS al 10 %/D-MEM. La suspensión celular se utilizó como células diana en los experimentos posteriores.

(3-1) Ensayo de liberación de calceína o cromo (actividad de ADCC)

La actividad de ADCC se evaluó basándose en la tasa de liberación de calceína o cromo específica determinada por el ensayo de liberación de calceína o cromo. En primer lugar, se añadieron soluciones de anticuerpos preparadas a cada concentración (0, 0,004, 0,04, 0,4, 4 y 40 gg/ml) en 50 gl a los respectivos pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo en U. A continuación, se sembraron alícuotas de 50 gl de las células diana preparadas como se describe en (2) (1 x 104 células/pocillo) y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron 100 gl de solución de PBMC humana preparada como se describe en (1) a cada pocillo (5 x 105 células/pocillo o 2,5 x 105 células/pocillo). Las placas se incubaron en una atmósfera de gas dióxido de carbono al 5 % en una incubadora de CO2 a 37 °C durante cuatro horas y después se centrifugaron. Se midieron 100 gl de sobrenadante de cultivo en cada pocillo de las placas para determinar la fluorescencia y radiactividad de calceína usando un medidor de absorción y un contador gamma. La tasa de liberación de cromo específica se determinó mediante la siguiente fórmula:

[Tasa de liberación de calceína o cromo específica (%)] = (A-C) x 100 I (B-C).

En esta fórmula, "A" representa la fluorescencia media de calceína (longitud de onda de excitación: 485 nm; longitud de onda de fluorescencia: 535 nm) o radiactividad media (cpm) de 100 gl de sobrenadante de cultivo en cada pocillo. "B" representa la fluorescencia media de calceína (longitud de onda de excitación: 485 nm; longitud de onda de fluorescencia: 535 nm) o radiactividad media (cpm) de 100 gl de sobrenadante de cultivo en un pocillo que contiene células diana, 100 gl de solución acuosa de NP-40 al 2 % (Nonidet P-40; Nacalai Tesques) y 50 gl de FBS/D-MEM al 10 %. Además, "C" representa la fluorescencia media de calceína (longitud de onda de excitación: 485 nm; longitud de onda de fluorescencia: 535 nm) o radiactividad media (cpm) de 100 gl de sobrenadante de cultivo en un pocillo que contiene células diana y 150 gl de FBS/D-MEM al 10 %. La prueba se realizó por triplicado. La media y la desviación típica de la tasa de liberación de calceína específica (%) que refleja la ADCC de cada anticuerpo de prueba se calcularon basándose en el ensayo descrito anteriormente.

Aplicabilidad industrial

La presente descripción proporciona polipéptidos que son adecuados para productos farmacéuticos, que son polipéptidos cuyas actividades de unión se han modificado alterando secuencias de aminoácidos de una región constante de anticuerpo y cuyas propiedades físicas (por ejemplo, estabilidad y homogeneidad) se han mejorado.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG, en donde la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que la región Fc de IgG está compuesta por un heterodímero que comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, y en donde la molécula de unión a antígeno se caracteriza por que se altera una función de la región Fc de IgG en comparación con la de una molécula de unión a antígeno caracterizada por que la región Fc de IgG está compuesta por un homodímero que comprende solo el primer polipéptido y en comparación con la de una molécula de unión a antígeno caracterizada por que la región Fc de IgG está compuesta por un homodímero que comprende solo el segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido o el segundo polipéptido se introduce con la combinación de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en los siguientes apartados (a) a (aj):

(r) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es V; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(s) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es D; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es M; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

(aj) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 234 es T; el aminoácido en la posición 235 es Y; el aminoácido en la posición 236 es W; el aminoácido en la posición 239 es I; el aminoácido en la posición 268 es D; el aminoácido en la posición 298 es A; y el aminoácido en la posición 327 es D;

y la combinación de mutaciones seleccionadas de (ak) a (aq) se introduce en el otro polipéptido:

(ap) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es Y; y el aminoácido en la posición 334 es E; y

(aq) de acuerdo con la numeración EU, el aminoácido en la posición 270 es E; el aminoácido en la posición 326 es D; el aminoácido en la posición 330 es H; y el aminoácido en la posición 334 es E;

2. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde la alteración de la función de la región Fc es al menos una o más alteraciones seleccionadas del grupo que consiste en la potenciación de la actividad de unión, el debilitamiento de la actividad de unión y la mejora de la selectividad de la actividad de unión de la molécula de unión a antígeno a uno o más receptores de Fcy.

3. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 2, en donde el receptor o receptores de Fcy es al menos uno o más receptores seleccionados del grupo que consiste en FcYRIa, FcYRIIa R, FcYRIIa H, FcYRIIb, FcYRIIIaF y FcYRIIIaV.

4. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 2 o 3, en donde la alteración de la función de la región Fc es la mejora de la selectividad de la actividad de unión a uno o más receptores de Fcy.

5. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 4, en donde la mejora de la selectividad de la actividad de unión a uno o más receptores de Fcy se refiere a la selectividad entre uno o más receptores de Fcy activadores y un receptor de Fcy inhibidor.

6. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 5, en donde entre los receptores de Fcy mencionados anteriormente, el receptor o receptores de Fcy activadores es al menos uno o más receptores seleccionados del grupo que consiste en FcYRIa, FcYRIIa R, FcYRIIa H, FcYRIIIaF y FcYRIIIaV, y el receptor de Fcy inhibidor es FcYRIIb.

7. La molécula de unión a antígeno de la reivindicación 5 o 6, en donde la actividad de unión al receptor o receptores de Fcy activadores se potencia selectivamente en comparación con la actividad de unión al receptor de Fcy inhibidor.

8. La molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se introduce además una alteración de aminoácidos para conferir diferencia en los puntos isoeléctricos del primer polipéptido y el segundo polipéptido y en donde la alteración de aminoácidos para conferir diferencia en los puntos isoeléctricos se caracteriza por la introducción de una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gln en la posición 196, Ile en la posición 199, Ala en la posición 231, Glu en la posición 233, Leu en la posición 242, Val en la posición 263, Glu en la posición 272, Gly en la posición 316, Leu en la posición 358, Ser en la posición 364, Ser en la posición 383, Pro en la posición 387 y Val en la posición 397 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del polipéptido del primer polipéptido o del segundo polipéptido; y la introducción de una mutación en al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Gly en la posición 137, Gly en la posición 138, Thr en la posición 139, Lys en la posición 147, Ser en la posición 192, Leu en la posición 193, Tyr en la posición 198, Ile en la posición 199, Asn en la posición 203, Lys en la posición 214, Lys en la posición 274, Tyr en la posición 278, Lys en la posición 288, Lys en la posición 290, Gly en la posición 316, Lys en la posición 317, Lys en la posición 320, Lys en la posición 324, Thr en la posición 335, Ser en la posición 337, Lys en la posición 338, Lys en la posición 340, Gly en la posición 341, Leu en la posición 358, Lys en la posición 360, Gln en la posición 362, Ser en la posición 383, Asn en la posición 384, Gly en la posición 385, Gln en la posición 386, Asn en la posición 390 y Val en la posición 422 (numeración EU) en la secuencia de aminoácidos del otro polipéptido.

9. La molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la molécula de unión a antígeno es un anticuerpo, un anticuerpo biespecífico o una molécula de fusión de Fc tal como una proteína de fusión de Fc-péptido o una proteína de fusión de Fc-armazón.

10. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un vehículo médicamente aceptable.

11. Un método para alterar la función de una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG, que comprende las etapas de heterodimerizar la región Fc Introduciendo mutaciones de aminoácidos de las moléculas de unión a antígeno según la reivindicación 1 en el primer polipéptido y el segundo polipéptido que constituyen la región Fc, y alterar la función de la región Fc en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero.

12. Un método para producir una molécula de unión a antígeno que comprende una región Fc de IgG según la reivindicación 1, que comprende las etapas de heterodimerizar la región Fc introduciendo la o las mutaciones de aminoácidos según la reivindicación 1 en el primer polipéptido y el segundo polipéptido que constituyen la región Fc, y alterar la función de la región Fc en comparación con cuando la región Fc forma un homodímero.