JPH07509137A - 異種抗体の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　異種抗体の生産 （１）１９９０年１月１２日出願の米国特許用ａ　Ｈａ　０７／４６６．００Ｂ の、 （２）部分継続出願たる１９９０年Ｉ＋月８日出願の米国特許用Ｉｌｌ　Ｉｋ　 ０７／６１０．５１５の、また（３）部分継続出願たる１９９２年７月２４日出 願の米国特許用ＩＩ　ｌｋ　０７／９１９，２９７の、さらに、部分継続出願で あり、上８己の出願人の全ての菖己載は、引用により本願に組込む　（ｉｎｃｏ ｒｐｏｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｒｅｆ＠ｒｅｎｃｅｌ。

本発明の技術分野は、生存している鴫乳類の宿主における、異種の特異的結合タ ンパクの生産に関する。

霊−思 トランスジェニックな動物を生産するための能力は、マウスの胚の幹細胞を培養 するための能力、及びマウスの生殖系列への次の遺伝（伝達）の為に、これらの 細胞に遺伝子の修飾を導入するための能力の出現で革命をもたらされた。このよ うに一つは、宿主に外来遺伝子、特に異種の結合タンパクを生産するヒトの遺伝 子の挿入により新規な生産物を作ることができる、動物の檜を生産するために、 内生の遺伝子を修飾する機会をもつ、動物のモデルにおけるインビボのこのよう な遺伝子の発現は、遺伝子の機能、遺伝子の発現の制御、そのプロセシング、種 々の薬剤又はその類似物に対する反応のための研究に供することができる。更に 、稽々の病気を模擬するものを含む新しいフェノタイプ（表現型）を有する動物 が、生産されるかもしれない。

例えば、優性の突然変異を導入し、又は、劣性の突然変異を補充することに興味 がもたれる。特別の遺伝子によって、所望される突然変異を獲得することの困難 性は、大いに改められるだろう。いくつかの遺伝子の標的は、比較的修飾になじ み易いことを立証した一方で、池の標的は、修飾に橘めて抵抗があることを立証 した。

トランスジェニックな動物を創生ずるための条件のために、トランスジェニック な動物の生産の成功を高める新しい方法を提供することにかなり興味がある。

特には、何回キロベースも含んでいる大きいＤＮＡフラグメントを挿入すること が望まれる。このことは、哺乳類の細胞に完全な形態で大きいフラグメントを挿 入するための能力、統合の効率、そのフラグメントに存在する遺伝子の機能的な 能力、子孫への生殖系列の遺伝について、大いに関係がある。更には、大きいＤ ＮＡフラグメントの挿入のためのこのような手法は、継続しているヒトゲノムプ ロジェクトにおいて、識別された大きいＤＮＡフラグメントの機能の決定に役立 特には、マウスのような小さい研究用動物において、異積の特異的結合タンパク 、例えば、ヒトのモノクローナル抗体の生産に大きな関心がある。モノクローナ ル抗体は、診断と治−の両方に有用性がある。特異的なエピトープに結合するた めの能力により、それらは、そのエピトープを有する分子を識別するために独特 な利用をされる。或いは、それら自身により、又は、もう一つの半分との結合に おいて、診断や治療に特異的な部位に対して、管理される。

モノクローナル抗体は、エピトープに対する結合領域を規定するために、−緒に 結合する重鎮（Ｈ鎖）と軽Ｍ（Ｌ鎖）を含む。それぞれの鎖は、可変領域と定常 領域とからなる。定常領域のアミノ酸配列は、抗体を産生ずる宿主と同様に、抗 体の特別なイソタイプに対して特異的である。

定常領域の配列と抗体が産生される種Ｔｓｐｅｃｉｅｓ）との間の関係の為に、 宿主の血管系への異種の抗体の導入は、免疫応答を引き起こす、慢性疾病の場合 には、異積の抗体が反復的に導入されるが、この場合に抗体を投与することは非 実用的である。抗体が急速に破壌され、有害な作用が現れることがあるためであ る。それゆえ、同型間の又は同種異型の抗体の源を提供するために、多くの努力 がなされた。一つの技術は、即ち、組換えＤＮＡ技術を利用するものであり、即 ち、宿主からのａｍと軽鎖に対する遺伝子が識別され、定常領域をコードする領 域が単離される。これらの領域は、次いで、特異的エピトープに向けられたもう 一つの積に由来するイムノグロブリン遺伝子の部分をコードする可変領域に結合 された。

結果として得られた部分的にキメラな異種抗体は、完全な異種抗体を用いるより もかなり有用性が高いが、未だ多くの不都合な点がある。可変領域及び定常領域 の識別、単離、結合は、実質的な作業を要する。更に、ある積由来の定常領域を 別の積由来の可変領域に結合することは、可変領域の特異性と親和性を、可変領 域の所望の特性が失われるように、変える可能性がある。

また、可変領域において、種特異的なフレームワークと高頻度可変（超可変）ｔ Ｒ域の配列もある。これらのフレームワークと高頻度可変（超可変）の配列は、 望ましくない抗原反応を生じることがある。

それ故に、関心のある抗原で宿主を免疫することにより、宿主に投与のための同 種異系の抗体を生産することが、強く望まれている。霊長り特にヒトに対してこ のアプローチは実際的でない、生産されたヒトの抗体は、関心のあるエピトープ に対して予め免疫された宿主からの、入手可能な牌朧の偶然の存在に基づいてい た。ヒトの末梢血のリンパ球が、モノクローナル抗体の生産に使用されつるが、 これらは、融合に成功せずに、大抵ＩｇＭのみに至った。更に、多くの治療や診 断の適用において、ヒトのタンパク即ち所望の標的に対するヒト抗体反応を作る ことは特に困難である。

それ故に、ヒトのための同種異型（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）の抗体を生産するた めに別のルートを見つけることには、大いに関ＬＬ＋がある。

ＬＩＩ Ｔｈｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｃａｐｅｃｃｈｉ　（１９８７）＋　１ｔＬＬ＋　Ｌｌ ：５０３−５１２　ａｎｄ　Ｋｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓ園１ｔｈｉｅｓｌ１９８ ９３゜：　８９３２−８９３５は、胚性幹細胞における相同組換えによるβ２− マイクログロブリンの遺伝子座の不活性化に関して記載する＊　Ｂｅｒ＋＋ａｎ 　ＬＩＪＬｌ、　（１９８８１、Ｌ且ＪＬＩＪ二ニア２７−７３１１ハ、ヒ）１ ｇ　ＶＨ４（ｉ＝子座ｅｌｌ＋、７記載する。　Ｂｕｒｋｅ、　ＬＬｉＬ、　（ ＋９８７）、’　＋８０６−８１２は、ＷＩＩＢ合成染色体（ＹＡＳ）ベクター に関して、記載する。更に、Ｇａｒｚａ　Ｌｕ１１．　（＋９８９１．　Ｌ１１ １ｊ工」ユｉｎ５＋６４１−６４６及びＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎ　ＬＬＬｉ−Ｎ９ ８９１＋　ム上■工Ｌｌ　：　ｌ　３４８−１３５１もまた参照される。５ａｋ ａｎｏらは、Ｓａｋａｎ０、　Ｌｕ１ｌ、　（１９８１）狂ｈＢ１」Ｏ二５６２ −５６５にイムノグロブリンのＨ［遺伝子の多様性セグメントに関して記載して いる。　Ｔｕｃｋｅｒ　ＬＬＪＬＬ　（１９８１１゜゛　８・７６８４−７６８ ８は、マウスのＩｇＡのＨ鎖の遺伝子配列を記載する＊　Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅ ｉｎ　ａｄｎ　Ｋｒｕｗｉｎｋｅｌ　（１９８７）、　・＋３５１−１３５７は 、マウスの可変なＨ層領域に関して記載する。更に、Ｊｏｙｎｅｒ　ＬＬＪｌ、 　＋１９８９１．　：ｌ５３−１５５．　Ｔｒａｖｅｒ　Ｕｆｆｌ、　（１９８ ９＋、　’　：５８９ｇ−５９０２、Ｐａｃｈｎｉｓ　ＬＬＪ」、　（＋９９０ １．　’２エムよ」７：５１０９−５１１３　トＰＣＴ出ＩＩＩ　ＰＣＴ／ＬＩ Ｓ９１１００２４５４　！！：た〜参照される＊　Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ　ｅｔ 　ａｌ、。

°　・　・６７０９−６７１３　（１９８９）；−り巳よＪ：２１−２４　（１ ９９０）ｉ　Ｉ：ｌ３２３−１３２６　（１９９１１は、ヒトＨ１ｌを有するモ ノクローナル抗体に関して記載する＊　Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、巳 り立１−」」」−：４２５６−４２６０　（１９９０）は、ヒトＤＮＡ断片を含 む酵母合成染色体（ＹＡＳ）のライブラリの構成に関して記載する。酵母合成染 色体（ＹＡＳ）ベクターは、Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌ」ＩＬ］−２３６ ：８０６−１１１２　（＋９８７１に、記載されている。　Ｐａｖａｎ　ｅｔ　 ａｌ、。

−ＬｌＪ」４１０（８１：　４１６３−４１６９　（１９９０）ニ＋！、相同組 換工又はポリエチレングリコール−媒介スフェロプロスト融合を用いた胎生期ガ ン細胞へのトランスフォーメーション（形質転換）を用いて、酵母合成染色体（ ＹＡＳ）のヒトー誘導インサート内へのネオマイシン抵抗性カセットの挿入に関 して記載されている＊　Ｐａｃｈｎｉｓ　ａｔ　ａｌｏ、　’　７：５１０９− ５１１３　＋１９９０）、及びＧｎｉｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１　１Ｇ（７１ ：１６２９−１６３４　（＋９９１）は、鴫乳類の細胞内への、ヒトＤＮＡを有 する酵母合成染色体（ＹＡＳ）の移入に関して記載する。Ｅｌｉｃｅｉｒｉ　ｅ ｔ　ａｌ、　：２１７９−２１８３Ｆ＋９９１１には、ヒト遺伝子を有する酵母 合成染色体（ＹＡＳ）のマウス細胞での発現に関する記載がある。　Ｈｕｘｌｅ ｙ　ｅｔ　ａｌ、、ロ」ｌｉｌ」：　７４２−７５０　（１９９１）は、ヒトＨ ＰＲＴｉｌｌ伝子を含む酵母合成染色体（ＹＡＳ）のマウス細胞での発現に関し て記載する＊　Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｂ（５）：２３９１−２ ３９５　（１９９２１は、異型接合の胚性幹細胞を選択的に相同に突然変異した 細胞に成長させるための高１度の０４１８の利用に関して記載する。マウスの繊 維芽細胞との酵母のプロトプラスト融合に関しては、Ｔｒａｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ 、。

６：５８９８−５９０２　（１９８９１及びＰａｃｈｎｉｓ　ｅｔａｌ、、　’ 　＋５１０９−５１１３　（＋９９０）に記載されている＋　Ｄａｖｉｅｓ　ａ ｔ　ａｌ−、゛−ＬＬシー」ｏ：２６９３−２６９８　（＋９９２）は、ＹＡＣ ｓのターゲティングによる変性（ｔａｒｇｅｔｅｄ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ） に関して記載する。　Ｚａｃｈａｕ、’　：ｌ−６（１９９０）は、ヒトのイム ノグロブリンＬＭ（カッパー）（ＩｇＫ）の遺伝子座について記載する。　Ｍａ ｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、　田五Ｌｌｌｌ：８ｇ−９４（１９９３１及び５ｈｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、■■」Ｑ：３６４１−３６４５　（１９９１１は、ＹＡＣｓ にあるヒトのイムノグロブリンＨ頗（ＩｇＨ）の遺伝子座のクローニングに関し て記載する。

Ｌｉ互ｌ］ 適当な抗原で宿主を免疫することによって、ヒト以外の生体の宿主内で、ｎ種間 に特異的（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ　５ｐｅｃｉｆｉｃ）な結合タンパクが生産さ れる。

好ましいヒト以外の宿主は、次のような特徴を持つものである。（１）イムノグ ロブリンの重鎖を内生できないこと、（２）イムノグロブリンの軽鎖を実質的に 内生できないこと、（３）１１種のイムノグロブリン又はイムノグロブリンの構 造類似体を生産するための、３Ｉ橿のイムノグロブリンの軽鎖及び重鎖を生産す ることができること、このような宿主は、内生のイムノグロブリンのための全体 の遺伝子座（１ｏｃｕｓ）が、部分的に或いは完全に異種のイムノグロブリンの ための遺伝子座（ｆｏｃｕｓ）によって置換されているか、異種のイムノグロブ リンのための遺伝子座が宿主細胞の染色体に挿入され、かつ内生のイムノグロブ リン領域が不活性化されているものである。

ｌｊＯ又は軽鎖の為のイムノグロブリンの遺伝子座を、不活性化又は置換のため に、（同種間で）相同組換えを行うことによって、これらの種々の代替物（ａｌ ｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ）が得られるだろう。

更には、少なくとも　１００　ｋｂの大きさの断片の異種ＤＮＡを特にはヒトＤ ＮＡを、宿主動物に特にはマウスに、挿入するための新規な方法が提供される。

その方法は、幹細胞のゲノムに組み込むために胚の幹細胞（ＥＳセル）内に、少 なくとも１００　ｋｂの異ＨＤＮＡ断片を含む酵母の人工的な染色体（ＹＡＣ） を導入し、ＹＡＣに存在するマーカーによって、組み込まれたＹＡＣを含む幹細 胞を選択し、胚の中にＹＡＣ含有含有上Ｓセルり入れ、胚からキメラマウスを産 生ずることによる。キメラな動物は、ＹＡＣに対して異型接合である動物を提供 するために交配される。異型接合の動物は、組み込まれたＹＡＣに対して同型接 合の子孫を産出するために交配される。

を 図１は、実施例■に示す、マウスのＩｌ鎖（Ｈ鎖）Ｊ域の不活性化ベクターのダ イヤグラムを示す。

図２は、実施例ＩＩに示す、プラスミドｐｍＨ６Ｊと標的マウスのＨＩ［Ｊ遺伝 子のＤＮＡ制限マツプのダイヤグラムを示す。

図３は、実施例ＩＩに示す、マウス株の１ｇＭアロタイプをスティンする抗体の フローシトメトリーブロットを示す。

図４は、実施例Ｉ＋に示す、マウスストレインのＩｇＭアロタイプをスティンす る抗体のフローシトメトリーヒストグラムを示す。

図５は、実施例１■に示す、マウスのイムノグロブリンカッパ一定常領域遺伝子 の不活性化ベクターのダイヤグラムを示す。

図６は、実施例■に示す、プラスミドｐＫ、ＴＫ／Ｎｅｏの誘導の仕方のダイヤ グラムを示す。

図７は、実施例ＩＩ＋に示す、Ｈｌｍ　（Ｌ鎖）標的位置の制限マツプのダイヤ グラムを示す。

図８は、実施例■に示す、カッパーＬ鎖Ｊ及び定常領域の不活性化のための標的 ベクターと、ターゲティング実験のデザインのダイヤグラムを示す。

図９は、実施例■に示す、カッパーＬＩＩＪを不活性化するベクターと、定常領 域の構成のダイヤグラムを示す。

ｃｉＩＩＯは、実施例■に示す、カッパーＬｇＪ及び定常領域の不活性化のため のベクターの最終除去のダイヤグラムを示す。

図１１は、実施例■に示す、ＬＲＪ及び定常領域除去セルのサザン分析の図式表 示を示す。

図１２Ａ−Ｅは、実施例■に示す、ＥＳクローン内に統合されたｙＨＰＲＴ及び 酵母ゲノムＤＮＡを特性付けるサザンプロット分析の結果を示す写真である。

（Ａ＝ヒトの反復Ａｌｕシーケンス； Ｂ、Ｃ＝右（Ｂ）及び左（Ｃ）ＹＡＣアームの、ｐＢＲ３２２−特異シーケンス 。

Ｄ＝酵母反復シーケンス； Ｅ：酵母シングルコピー遺伝子り１玉」）Ａｌｕ及びＴｙシーケンスでプローブ されたｙＨＰＲＴのより短い露光時間（Ｉの４８ｈｒに対し、ＩＩは１２ｈｒ） も示す。分子量マーカの位置を示す。右（ａ）及び左（ｂ）ベクターアームの構 成及びｐＢＲ３２２−ＪＳ導のＹＡＣベクター断片の位置が示される。

（Ｃ＝テロミア；＝酵母−誘専のシーケンス；０−酵母動原体１＝ｐＢＲ３２２ −誘導ノシーケンス、＝ヒト挿入；＝ＥｃｏＲＩクローニングサイト）１　＝　 Ｈｉ　ｎ　ｄ　Ｉｎサイト）図１３Ａ−Ｄは、実施例■に示す、ＥＳセルクロモ ソーム内の３ｙＨＰＲＴと酵母ゲノムシーケンスの統合を検出するためのｉｎ　 ５ｉｔｕ・ハイブリダイゼーションの結果を示す写真である。

（Ａ、Ｂ＝メタフェーズが、ビオチニレイトされた（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ）ヒトゲノムシーケンスへとハイブリダイズされたＥＳＹ８−７セルから拡がる 。

Ｃ＝メタフェーズが拡がる、又は Ｄ＝ビオチニレイトされた酵母の反復ＤＮＡシーケンスへとハイブリダイズされ たＥＳＹ８−６セルからインターフェーズ核） 図１４Ａ、Ｂ、Ｃは、実施例■に示す、インビトロＥＳ分別におけるｙＨｐＲｒ の安定保存と、マウスの生殖系統を通じてのトランスミッションを示す。

（Ａ：ａ、ｂ＝胚体、及び分別したセルタイプ；Ｃ＝血島 ｄ＝収縮筋 ｅ＝神社セル ｆ＝ＥｓＹクローンにより形成された神経小管Ｂ・ａ＝ヒトＡｌｕプローブ； ｂ＝酵ｇＪＴｙシーケンスを用いて分別したＥＳＹ５−２．３−６．８−５及び ８−６（２０μｇ）及びｙＨＰＲＴ　ｉｎＡＢ１３８０（４０ｎｇ）から抽出さ れたＤＮＡのサザンプロット分析 Ｃａ−ヒトＡｌｕ及びｂ＝Ｔｙシーケンスを用いＥＳＹキメラセル３９４／９５ −２から誘導された２アグーチ子ｉ　（４−２及び４−３）からの尾ＤＮＡ（２ ０μｇ）のサザンブロットの分析、８−６及びＴｙでプローブしたｙＨＰＲＴの 短い方の露光（１２ｈｒ）を示す（ＩＩ　）。

ｔ＆１５Ａ、Ｂは、実施例■に示す、様々なマウス組織内における、ヒトＨＰＲ Ｔ遺伝子の発現を示す電気泳動ゲルの写真である。（１５Ａ＝対照マウス又はＥ ＳＹ４−３アグーチ子孫ＥＳ、ＥＳＹ３−１及びＨｕｔ７８セル、肺臓、肝臓内 における逆転写−ＰＣＲを用いての、ヒトＨＰＲＴ　ｍＲＮＡの検出。

１５Ｂ＝１５ＡからのサンプルにおけるＲＴ−ＰＣＲによる、マウスγ−インタ ーフェロン受容体ｍＲＮＡの検出； Ｍ＝サイズマーカ） 図１６は、実施例■に示す、ヒトイムノグロブリンＨ鎖位置、及びヒトＨ１ｌｉ 置換ＹＡＣベクターのダイヤグラムを示す。

１Ｍ１７は、実施例■に示す、マウス交配系統のダイヤグラムを示す。

図１８は、本発明の方法により産生される宿主動物の幾つかの遺伝子型を示す。

を 定常の及び／又は可変の領域で、或いはその他の重要なエフェクター（ｅｆｆｅ ｃｔｏｒ）ペプチド配列をもつ、新規なトランスジェニックヒト以外の宿主、特 には哺乳類の宿主、通例マウスが提供され、かかる宿主は、抗原に対する免疫応 答を組込むことができ、その応答は、異ｆ―の特には霊長類、更にはヒトの有す る抗体を、産生ずる。ＣトランスジェニックＪ　（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）の語 は、遺伝子工学的に処理された変異（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ膳ｏｄｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ）を含む動物を意味し、特には、本発明に関して、その細胞の全部に（ｉ ｎ　ａｌｌ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｃｅｌｌ）、ヒトのイムノグロブリン遺伝子の導入 を意味する。宿主し内生のイムノグロブリンのサブユニットをコードする遺伝子 座（１ｏｃｉ）の不活性化又は異種ＤＮＡ。

例えばヒトのイムノグロブリンをコードするＤＮＡ。

の導入の結果として、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）のイムノグロブリン或いは その構造類似体を生産できることを、特徴とする。これらの修飾（変異）は、Ｃ −末端で機能的なペプチドに結合される可変領域結合部位のアセンブリを提供す る（　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｒｅｇｉ。

れｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ）　、異種定常領域の少なくとも一部を保存する０ 機能的なペプチドは多くの形ＩＩ（ｆｏｒ園３）或いは構造（ｃｏｎｆｏｒｓｅ ｔａｉｏｎｓ）をとることができ・酵素、成長因子、結合タンパク、リガンド、 サイトカイン、エフェクタータンパク（ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　 、キレートタンパク（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の役割をする。

その抗体はＩｇＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭのような何隻かのイソタイプであるか、イ ソタイプ内の（小区分である）サブタイプであっても良い。

最初の方針において、個別のステップとして、ヒトのような異種の軽鎖及び＠鎖 のイムノグロブリン遺伝子が宿主の生殖系列（例えば端出細胞又は卵母細胞）に 導入される。そして別のステップでは、対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ）宿主の遺伝子は、相同的組み換えを用いた不活性化によって非機能的（機能を 有しないよう）にさせられる。ヒトの重鎮及び軽鎖のイムノグロブリンの遺伝子 は、適当な真槍又は原核の微生物内で再構生され、結果として生じたＤＮＡフラ グメントは、適当な宿主内に、例えば受精させたマウスの卵母細胞の前核或いは 胚の幹細胞内に導入される。内生の宿主のイムノグロブリンの遺伝子座（１ｏｃ ｉ）の不活性化は、宿主細胞、特には胚の幹細胞或いは受精させたマウスの卵母 細胞の前核における相同的組み換えによる、適当な遺伝子座の標的ディスラプシ ョン（ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）によって達成される。標的デ ィスラプション（ターゲテイングとも略称する）には、標的座の損傷又は欠失、 或いは遺伝子座内への挿入、例えば選択性のあるマーカー（５ｅｌｅｃｔａｂｌ ｅ　ｍａｒｋｅｒ）の挿入に伴って起こる標的座内の欠失が伴う。胚の幹細胞の 場合において、キメラな動物は、変異された胚の幹細胞から誘導され、産生じ、 更に生殖系列を通じて遺伝子変異を遺伝（伝達）することができる、不活性化さ れた内生の遺伝子座を持つ系統と、導入されたヒトのイムノグロブリンの遺伝子 座を持つ宿主との交配は、その産生される抗体が全く異種のもの、例えばヒトの ものである、動物をつくる。

もう一方の第二の方針では、ヒトの重鎮及び軽鎖のイムノグロブリンの遺伝子座 の少なくとも部分（ｐｏｒｔｉｏｎｓ）が、胚の幹細胞における相同組換えによ って、相当する内生のイムノグロブリンの遺伝子座を直接置換するために用いら れる。この場合に、内生のイムノグロブリンの不活性化及びＷ換は同時に起こる ０次には、胚の幹細胞誘導細胞が生殖系列に寄与して、キメラな動物の創生即ち 産生・生殖（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）が生じる。

構造、個々のドメイン（１ｎｄｉｖｉｓｕａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ）をコードする エキソンの相対的配座、及びスプライス部位及び転写要素の配座は、変更の程度 として理解されるので、これらの方針は、Ｉｌ［［ＩＩの動物のイムノグロブリ ン頗の遺伝子座の既知の構造を基礎とする。ヒトの場合には、イムノグロブリン の重鎖（Ｉ　ｇ　Ｈｂ−）の配座は１４番目の染色体にある。５°−３′方向へ の翻訳において、配座は、可変領域遺伝子（Ｖ、）の大きいクラスター、多様性 （Ｄ）領域遺伝子を含み、その後には結合（Ｊ、）ＩＩ域遺伝子（連関遺伝子） 及び定状部（Ｃ＋＋）の遺伝子クラスターが続く、その配座の大きさは、約１　 、５００から約２，５００　ｋｂ　（キロベース）ま〒であると評価される。Ｂ −細胞の発達の間、生殖系列のＩｇＨ配座からの断続的な遺伝子セグメントがＤ ＮＡの物理的並び換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｓｅｎｔ）に依って一一列に並べら れる（　ｊｕｘｔａｐｏｓｅｄ）　ｅ機能的重１１１ｇポリペプチドを生産させ るために、■１、Ｄ、Ｊ、領域からの３つの断続的なりＮＡ上セグメント特異的 に連続して起こる方法で（ｉｎ　ａ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ 　ｆａｓｈｉＯｎ）、結合されねばならない、即ち、最初にＪｌｌにＤが結合し 、次にはＤＪ、ｌにＶ、が結合し、機能的なユニットｖ、ｌＤＪ、が生じる。一 度、Ｖ　＋＋Ｄ　Ｊ　＊が形成されたなら、エキソンとイントロンからなる特異 的Ｖ層ＤＪＩＩＣ前ユニットを鋳型として利用して、Ｉｇ配座の翻訳に続いて、 特異的重鎖が生じる。

イムノグロブリンの軽［（ＩｇＬ）のために、２つの配座がある。即ち、ヒトの ２番目の染色体にあるカッパー配座とヒトの２２番目の染色体にあるラムダ配座 である。ＩｇＬ配座の構造は、Ｄ領域が存在しない点を除けば、ＩｇＨ配座のそ れに類似している。ＩｇＨの並び換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅｓｅｎｔ）に引き続 いて、軽鎖の配座の並び換え（ｒｅａｒｒａｎｇｅ＋５ｅｎｔ）が・カッパー頗 又はラムダ鎖のＪＬにｖＬが結合することによつて、同様に行われる。ラムダ配 座及びカッパー配座の大きさは、それぞれ約１，０ＯＯｋｂから２．０ＯＯｋｂ 程度である。特にＢ−細胞における、並べ換えられた（　ｒｅａｒｒａｎｇｅｍ ｅｎｔ）ＩｇＨ及びＩｇに又はＩｇλ軽鎖の発現は、抗体分子を産生させる。

ＩｇＨ１配座を単離し、複製し、翻訳するために、酵母の人工的染色体（ｙｅａ ｓｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）即ちＹＡＣを利用するこ とができる。異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）のＤＮＡを持つＹＡＣは、酵母のス フェロプラスト化即ちＥＳ細胞の融合、微量注入法（ｍ１ｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉ ｏｎ）及びリボフエクンヨン（１ｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）を含めた積々の方法に よって、ＥＳ細胞又は卵母細胞内へ尋人される。ＹＡＣは宿主ゲノム内へ、ラン ダムに（即ち非相同的に）統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）する、即ち組込まれる。

もし、ＥＳ宿主細胞内へ５Ｉ積ＤＮＡを持つＹＡＣを尋人するために、酵母のス フェロプラスト・ＥＳ細胞融合が行われるが、その場合、一つの酵母宿主細胞中 の２個又はそれ以上のＹＡＣが同じ宿主ＥＳＩＩ胞内へと同時に尋人できる。こ のアプローチの利点は、例えばヒトの重鎖及び軽鎖のイムノグロブリン配座のよ うな、夫々異積のＤＮＡを含む多様な（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）　ＹＡＣｓを、宿主 細胞内の一つの染色体中へ導入させることがてきることにある。このことにより 、完全なヒトイムノグロブリンを生産することができる宿主を産生ずるために、 個別の（１ｎｄｉｖｉｓｕａｌ）１８１ｇ遺伝子（ｇｅｎｅｓ）を含んでいる動 物を繁殖する必要性がなくなる。例えば、単一のＹＡＣを含む酵母の菌株（５ｔ ｒａｉｎ）は、ＨＰＲＴのような哺乳類の選択的マーカーや、ＹＡＣのアーム（ ａｒ＋ｏ）内のＬｊＬ１２−のような酵母の選択的マーカーを導入するために、 ｐＬｔＪＴＯ（後述）のようなベクターでターゲティングされる（　ｔａｒｇｅ ｔｅｄ）。ターゲティングされた菌株からの染色体ＤＮＡ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｓ ａｌ　ＤＮＡ）は、第二の異なったＹＡＣを含む、第二の（たいてい半数体であ る）酵母菌のＬｌユ」突然変異体の形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒ園＞に使用され る０次いでＬｙｓ＋コロニーは、２ＭのＹＡＣを含むクローンを識別し、それら の大きさが変更していないことを確認するために、パルスフィールドゲル電気泳 動（ＰＦＯＥ）によって分析される。その後に、異なった選択的マーカー、例え ば（もし宿主がＬｔｌ」突然変異体であるなら）ＬＪＬＦＬｉを持つ付加的なＹ ＡＣ（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ＹＡＣｓ）を、形質転換によって付加させても構 わない。あるいはまた、酵母のＹＡＣ含有株が哺乳類の選択的マーカー（例えば ＨＰＲＴ）を尋人するために、ｐＬＵＴｏのようなベクターでターゲティングさ れ、上述のように、法には反対の（ｏｐｐｏｓｉｔｅ）交配型の第二のＹＡＣ含 有株と交配される。上記のような二倍体の酵母細胞中に、２（ｌＩのＹＡＣの存 在が確認される。二倍体の酵母株は融合に直接利用されるか、標準的な手法を用 いて減数分裂や胞子形成（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅ口ｅｓｉｓ／　５ｐｏｒｕｌ ａｔｉｏｎ）を行わせる。次いで、減数分裂の産生物は、２個のＹＡＣを含む半 数体のクローンを識別するためにスクリーニングされる。上記の各アプローチで は、第二のＹＡＣは、第一のＹＡＣの導入の前に、ＨＰＲＴ或いは他の選択的マ ーカーでターゲテイングにされる。同様に、各ＹＡＣが異なる酵母の選択的マー カーを含むなら、株の増殖期において、両方のＹＡＣは保持されて、遺伝的に選 択されうる。次Ｖ）でＥＳ細胞との砲台を、単一のＹＡＣを含む酵母細胞で行う のと同じ方法で行う。多くの酵母の染色体は、ＹＡＣといっしょに統合（組込） されるので、一つのＹＡＣ（例えばＹＡＣマーカーがＨＰＲＴで、ＥＳ細胞がＨ ＰＲＴ−であるなら、ＨＡＴ”クローン）に存在する哺乳類の選択的マーカーを 発現するＥＳクローンの実質的な部分は、組込まれた双方（二つ）のＹＡＣを持 つことが予想される。サザン分析及び／又はＰＣＲのような方法がこのようなり ローンを識別するために利用される。パルスフィールドゲル電気泳動を介したサ ザン分析は、ＹＡＣ統合の程度を特徴づけるためにｌＩＩ　ＩＴＩされる。

全体のＩｇＨ，、配座は、１個若しくは数個のＹＡＣクローン内に、Ｎｅｏ、Ｈ ＰＲＴ、ＧＰＴ、β−ｇａ１などのような哺乳類のマーカーと共に含有されるこ とができる。同じことが、Ｉｇｌｌｊｌｌの配座につし）ても当てはまる。相同 な重複領域を持つＹＡＣ間での、相同組換えによる完全（１ｎｔａｃｔ）な生殖 系列のＬｇ遺伝子座の再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）は、酵母内で達 成される。この方法において、ヒトのＩｇ＊をコードするＤＮＡフラグメントの 単離物が入手できる。或いはまた、単一のＹＡＣで完全な生殖系列の配座を、直 接的にクローン化させることができる。

抗体に高い親和性を有する暢広いスペクトルを獲得するために、一つのＹＡＣ（ ｏｎｅ）がＶ領域全体（ｅｎｔｉｒｅ　Ｖ　ｒｅｇｉｏｎ）を含む必要はない０ 種々の■領域の遺伝子のファミリーは、ヒトのｖｌｌ域のクラスター内に挿入（ １ｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）される。このように、■領域の完全な補体よりもむ しろ、ヒトの重鎖及び軽鎖の工ｇ配座（Ｂｅｒｍａｎ　（Ｊ　Ｊ、、　ＥＭＢＯ Ｊ、　（１９８８）　Ｌ７２７−７３８）のＶ領域の既知の遺伝子のサブセット を獲得することによって、トランスジェニックな宿主は免疫され、強い免疫応答 を組込ませることができ、親和性の高い抗体を提供する。この方法において、染 色体の比較的小さいＤＮＡフラグメントが、使用される０例えば、１ｇ、配座の ６７０　ｋｂのフラグメントはＮ　Ｏｔ　Ｉ　−Ｎ　ｏ　ｔＩ制限断片に含まれ ることが報告されている。そしてこれは、ｖｌｌ［ｌｔの変種を提供するために 利用される（Ｂｅｒｍａｎ　ｅＪ　Ｌｌ、Ｉ　■」）　ａ多様性の増加は、種々 のＤ領域とＪｌｔ域及び体細胞突然変異を伴う組換えによってもまた４ＩＥ供さ れる。

宿主のイムノグロブリンの遺伝子座暫非機能的にさせる（機能を有しないものに する）ため、相同組換えを行うことができ、それによって内生のイムノグロブリ ンの産生を阻害する（内生イムノグロブリン重鎮及び軽鎖の）遺伝子座にＤＮＡ が導入される。２１ｉ１の重鎖対立遺伝子及び２＋ｉ１の軽鎖遺伝子座、（ラム ダ遺伝子座を無視することもできるが）それぞれ２Ｍの対立遺伝子を持つカッパ ーとラムダ、があるので、対立遺伝子のそれぞれを不活性化させる多重遺伝子導 入（■Ｕｌｔｉｐｌｅ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）が生ずるはずである 。相同組換えは、遺伝子座のそれぞれを、相同なりＮＡの導入によって機能的に 不活性にさせ、胚の幹細胞内の標的配座を乱しくディスラブド）或いは欠失でき る構造（ｉ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を経由して、受容胞胚への修飾（変異）細胞 の導入を続いて行う、後続の交配（ｂｒｅｅｄｉｎｇ）によって、不活性化され た遺伝子座の生殖系列の遺伝（伝達）が可能となる。それゆえに、異型接合の子 孫の育種ないし交配（ｂｒｅｅｄｌを選択し、異型接合の親から同型接合の子孫 を選ぶことができる。

第二の、上述されたもう一つの方針では、類似する内生のイムノグロブリンとの 相同組換えに使用される構造に属するヒトイムノグロブリン遺伝子座のフラグメ ントを少なくとも促進することにより、工程の数を、減少させることができる。

その結果、ヒトの遺伝子座は、少なくとも宿主のイムノグロブリン遺伝子座に代 わってＩｔａされ、宿主のイムノグロブリン遺伝子座の不活性化が生じる１本発 明の特別の関心事としては、単一の（遺伝子座の）不活性化のためのトランスフ ォーメーション（遺伝子導入）を用いることであり、その後、同型接合の子孫を 生産するために、異型接合の子孫を交配させる。ヒトの遺伝子座を置換し、或い は不活性化のために宿主の遺伝子座へ挿入する場合、トランスフォーメーション の数は、三つのトランスフォーメーションに限ることができる。そして、既に指 摘したように、余り用いない遺伝子座を無視することが選択でき、その場合トラ ンスフォーメーションは二つのトランスフォーメーションに限定できる。さらに 、各遺伝子座に対して、各別の工程として、不活性化を行うことを、不活性化さ れた一つ又はそれ以上の遺伝子座を予め持った子孫からの胚の幹細胞を用いて、 選択できる。トランスフォーメーション法のみを用い、そしてヒトの遺伝子座が ランダムな仕方でヒトのゲノムに組込まれる場合には、合計８以上のトランスフ ォーメーションが要求される。

不活性化の為には、その遺伝子座のイムノグロブリンのサブユニットの発現の阻 害が生じる、標的遺伝子座にある。任意の損ｍ（ｌｅｓｉｏｎ）が用いられる。

かくて、この損１よ、Ｖ、Ｊ、Ｃ領域におけるエンハンサ−１例えば５′又は３ ゛のエンハンサ−或いはイントロンを含む領域内とすることができ、重鎮の場合 は、Ｄ領域又はその組み合わせにある。これらの操作については、転写の失敗或 いはメツセージのプロセシングの失敗等の何らかの原因で、Ｉｇの生殖系列並べ 換えが阻害されるか、内生のイムノグロブリンをコードする機能的なメツセージ が生産できないかが、重要な要素である。このような損傷は、標的遺伝子の削除 （ｄｅｌｅｔｉ。

ｎ）、外来遺伝子の挿入、挿入或いは削除の組み合わせ、内生の遺伝子での削除 の導入を伴った若しくは伴わない、ｌＩ！種の配列を用いた置換、の形態を取る 。

イムノグロブリンのサブユニットの遺伝子座を不活性化することに関心があると き、損傷は、イムノグロブリンのサブユニットの遺伝子座、例えば定１＠領域又 はＪ領域の遺伝子座に含まれるエキリンの１以上に導入することが好ましい、こ のようにして、この領域に機能的なエキリンを欠くターゲテイング構造が作られ るが、このターゲティング構造は、Ｊ及び／又はＣ１Ｉ域に隣接する配列、及び Ｊ及び／又はＣ領域から上流及び／又は下流を含むか、或いはＪ又はＣエキリン に不活性化挿入（遺伝子）を有する全部又は部分の領域を含みうる。望ましくは 、通常少なくともエキリン配列（シーケンス）の約７５％が、好ましくは少なく とも約９０％が削除される。

望ましくは、マーカー遺伝子が、ターゲテイング構造に使用され、削除された配 列を置換する０種々のマーカーが、特には陽性の選択性を与えるものが、利用さ れる。特に関心があるのは、ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼ（’ｎ ｅｏ’）に対する遺伝子の発現から生じる、０４１８耐性の利用である。

ターゲティング構進において、標的遺伝子（ターゲットジーン）の上流及び／又 は下流は、相同的二重交叉（ａ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｄｏｕｂｌｅ　ｃｒｏ ｓｓｏｖｅｒ）が生じたかどうか（ネガティブ選択）の識別を与える遺伝子とす ることができる。この目的のために、ヘルペスシンプレックスウィルスのチミジ ンキナーゼ遺伝子が使用される。これは、チミジンキナーゼ遺伝子を発現する細 胞は１機能的なＨＳ　Ｖ　−ｔ　ｋ　（Ｍａｎｓｏｕｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ ｔｕｒｓ３−１Ｊ：Ｐ３４ｇ−３５２（＋９８８１）を含む細胞の細胞毒作用に より、アサイクロヴイル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）やガンサイクロヴイルＴｇａｎ ｅｙｃｌｏｖｉｒ）のような、ヌクレオシＩＩ物の利用で段されるからである。

これらのヌクレオシドの類縁物に対する感受性の欠如は、Ｈ３Ｖ−チミジンキナ ーゼ遺伝子の欠如を示す。それ故に、相同組換えが生じた場合には二重交叉（ｄ ｏｕｂｌｅ　ｃｒｏｓｇｏｖｅｒ）もまた生じたことをホす。

ゲノムにおけるマーカー遺伝子の存在は、組込が起こったことを示すけれども、 相同的組込が起こったかどうかを決めることが、なお必要である。これは、いく つかの方法によって達成できる。主として、サザンプロットハイプリダイゼーシ ョンによるＤＮＡの分析は、統合の位置を規定するのに利用される。挿入のため のプローブ及び相同的組込が生じるだろう領域をフランキングする５′及び３′ 側での配列を使用することにより、相同的なターゲティングが起こったことを立 証することができる。

ＰＣＲはまた、相同組換えの存在を検出するのに有利に利用される。ターゲティ ング構造内の配列に相補的である。又は、このＨＲ造の外側若しくは標的遺伝子 座の配列に相補的であるＰＣＲプライマーが、用いられる。この方法においては 、相同組換えが起こった場合には、相補的な鎖（ｓｔｒａｎｄｓ）に存在する両 方のプライマーを有するＤＮＡ分子だけを獲得することができる０例えばサザン プロット分析を用いることにより、予測された大きさのフラグメントを立証する ことによって、相同組換えの発生を裏付けられる。

ターゲツティング横進は、宿主細胞において機能する複製系を更に含む場合もあ る。主として、これらのＷｉ製系は、ンミアン（Ｓｉｍｉａｎｌウィルス　４０ 、エプスタイン−パーウィルス、ポリオーマウィルス、パピローマウィルスなど のようなウィルスの複製系を包含する。

積々の転写開始システムは、ウィルス遺伝子由来からか、罎乳類の遺伝子由来か らのどちらかが利用される。

例えば、ＳＶ４０、メタロチオネイン−■及びＩＩ遺伝子、β−アクチン遺伝子 、アデノウィルスの初期遺伝子及び後期遺伝子、ホスフォグリセレートキナーゼ 遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ遺伝子などである。プロモーターに加えて、野 生型エンハンサ−が、マーカー遺伝子の発現を更に強めるために、利用される場 合もある。

相同的組換えのためのターゲティング構造を調製するに際し、原核生物、特に　 ゛　（大腸菌）の複製系が、ターゲティング横進の調製、制限地図又は配列、所 望の配列の増量及び単離のような、各操作後のサブクローニングのために含まれ る場合もある。置換したい場合には、異種のＤＮＡ挿入部が長い場合には、一般 には約５０ｋｂｐより長く、通常は約１００ｋｂｐより長く、更に通常は約１０ ００ｋ　ｂ　Ｐより長くない場合には、酵母の人工的染色体（ＹＡＣ）がターゲ ティングＩＩＩ造のために利用される。

一旦、ターゲティング横進が調製され、例えば原核の配列（ｐｒｏｃａｒｙｏｔ ｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）のようなあらゆる不所望な配列が除去されたなら、 その構過は、ＥＳ細胞のような、標的細胞（ターゲットセル）内にすぐに導入さ れる。標的細胞内へＤＮＡを尋人するために、あらゆる便利な技術が利用できる 。その技術には、プロトプラスト畿合（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ） 　（の利用）が含まれる０例えば、酵母スフェロプラスト：細胞間の重合、リボ フェクション（ｌ１ｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）　、　エレクトロポレーション、リン 酸カルシウム媒介ＤＮＡ）う＞　スフ　７−　（’Ｊ　ジ酸カルシウム法ｃａｌ ｃｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｍｓｄｉａｔｅｄ　ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｒ ）　、直接ｌｌ１ｉｌ微注射（微量注入）がある。

標的細胞のトランスフォーメーション成し１はトランスフェクション（ｔｒａｎ ｓｆｅｃｔｉｏｎ）の後・標的細胞は・先に指摘した、ネオマイシン耐性及びア サイクロヴイル耐性又はガンサイクロヴイル耐性のような、陽性マーカー及び／ 又は陰性マーカーによって選択される。

所望のフェノタイプ（表現型）を示す細胞は、リストリクジョン分析（ｒｅｓｔ ｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ）　、エレクトロポレーション、サザン分析 、ＰＣＲなとにより更に分析される。標的遺伝子座に損傷の存在を示すフラグメ ントを識別することにより、相同組換えが起こり標的遺伝子座の複製が不活性化 された細胞を識別することができる。

上記の工程は、キメラな動物に発展する宿主の胞胚内へ細胞がＷｉ微注射される ことによって、胚の幹細胞におけるＨ［の遺伝子座を不活性化させるために、最 初に行われる。次に、キメラな動物が異型接合の宿主を得るために育を自（ｂｒ ｅｅｄ）される。異型接合の宿主を　・交配することにより、同型接合の宿主が 得られる。或いはまた、胚の幹細胞を単離し、第二のＩｇＨの遺伝子座を不活性 化するために、トランスフオームされる。

この工程は、所望の遺伝子座が全て不活性化されるまで繰り返される。もう一つ の方法としては、Ｌ頗の遺伝子座を最初に不活性化してもよい、ＬＩＩのイムノ グロブリンを生産するための能力を完全に除去するために、ラムダとカッパーの 両方のＬｌｌｌのイムノグロブリンの遺伝子座を不活性にすることが望まれる。

任意の段階で、異１の遺伝子座を挿入することができる。

既に指摘したように、標的遺伝子座は、類似する（アナロガスな）異種の遺伝子 座で置換される。この方法においては、遺伝子座の位置に関連するあらゆる制御 が異種のイムノグロブリンの遺伝子座と実質的に同じとなるように、異種の遺伝 子座は、類似する宿主の遺伝子座として実質上同じ領域に配置される。例えば、 ヒトＩｇＨ遺伝子座の可変領域（■、Ｄ、Ｊ配列を含む）又はその部分を単離し 、そしてマウスの遺伝子座からの配列でヒト遺伝子座の配列をフランキングする ことができ、この配列として、宿主の遺伝子座において、好ましくは少なくとも 約５ｋｂｐまで、より好ましくは少なくとも約１０ｋｂｐまでの配列とし、この 領域に、組換え操作にて、ヒトのフラグメントを挿入でき、宿主のイムノグロブ リンの遺伝子座の内生の可変領域を、ヒトのイムノグロブリンの遺伝子座に゛置 換する。この方式において、宿主のエンハンサ−により活性化させる一方で、内 生のイムノグロブリンのサブユニットを生産するための宿主の能力を害う（ｄｉ ｓｒｕＰｔ）。

宿主において、異種の結合タンパクの生産を提供するために、宿主は、必要な酵 素を供給する能力があることが必要であって、更に他には、抗体の産主に与える 因子（ｆａｃｔｏｒｓ）が必要であるが、イムノグロブリンのＨｌｌとＬ鎖のサ ブユニットの発現の能力をもつ内生の遺伝子は欠如していなければならない、こ のように、それらの酵素、及び、生殖系列の並べ換え、スプライシング、体細胞 突然変異などに関係する他の因子が、宿主内において機能する。欠如しているも のは、内生のイムノグロブリンの生産に関係する種々のエキリンを含む機能的な 天然の領域である。

尋人された異種のＤＮＡの組込は、利用する特別な方針に依存してランダムとな るか又は相同性を示す。

このように、トランスフォーメーションを用いることによって、又は、反復的な 工程を用いることによって、或いは、交配と組合せることで、ＬＩＩ又はＨ鎖の 内生イムノグロブリンを実質的に欠如した、異種の結合タンパクを生産すること ができる、トランスジェニック動物が得られる。「トランスフォーメーション」 の語により、生きている細胞にＤＮＡを導入する、あらゆる技術が！ａ図される ０例えば、フンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）　、　Ｐ　Ｅ　Ｇ媒 介細胞融合（ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏ口）、トランスフ ォーメーション（遺伝子導入ないし形質転換）　（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏ ｎ）　、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）　、トランスダク ション（形質導入）　（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）　、ｘ　レフトロポレーシ ョン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　、　リボフェクション（１ｉｐｏｆ ａｃｔｉｏｎ）　、バイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）などである 。

一度、異種の遺伝子座が、相同組換え又はランダム組込のどちらか一方により、 宿主のゲノムに導入されると、さらに、種々のトランスジェニック動物又はキメ ラな動物から誘導された動物を適当に交配することにより、不活性化された内生 のイムノグロブリンの遺伝子座を有する宿主動物が生産されると、内生のイムノ グロブリンを生産する元来の能力に欠けるが、異種渾（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ　 ５ｏｕｒｃｅ）のレパートリ−の重要な部位を少なくとも有する、異種のイムノ グロブリンを生産する能力を持った、宿主を生産することができる。

３積の宿主のＩｇ遺伝子座（Ｈｌｌ、カッパー、ラムダ）のそれぞれについての 二つのコピーは機能的に不活性化されると、次に、ヒトＩｇＨ及びヒトエピカッ パー及び／又はラムダ遺伝子座を含む宿主は、宿主の抗体又は宿主／ヒトキメラ の抗体を作ることなく、純粋なヒト抗体分子を生産することができる。このよう な宿主の株は、特異的抗原で免疫することにより、特異的ヒト抗体を生産するマ ウスのＢ細胞の生産で応答する。そしてそのＢ細胞は、マウスのミエローマ細胞 と融合され、ヒトのモノクローナル抗体の生産を安定に継続するために他の方法 で、不壊死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅ）される。継続的に安定したモノクロー ナル抗体の生産をＮ　？１ｊするための方法に関する技術は周知である。

本発明の方法論及び方針は完全なイムノグロブリンを生産するのに、限定される 必要はないが、定常領域の部分１例えばＣ□、Ｃ□、Ｃ０又はＣ０、又はこれら の組合せに結合される領域を提供するための機会を提供する。別法としては、Ｃ ｗ、Ｃｈ、又はＣ？領領域エキリンの１以上が、異なったタンパクをコードする 配列にＷ換されるか、結合される。そのようなタンパクとは、例えばプラスミノ ーゲンアクチベーター（ｐｔａｓｗｉｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）　、ス ーパーオキサイドディスムターゼ（５ｕｐｅｒａｘｉｄｅ　ｄｉｓｓｕｔａｓｅ ）などの酵素、例えばリシン（ｒｉｃｉｎ）　、アブリン（ａｂｒｉｎ）　、ジ フテリアＮＦのようなｓｗｒ＆ａｔ性薬剤、レセプターリガンド（ｒｅｃｅｐｔ ｏｒ　ｌｉｇａｎｄ）などである１例えば、ＷＯ３９１０７１４２；ＷＯ３９１ ０９３４４，ＷＯ３８１０３５５９が参照される。定常領域のエキリンに興味の タンパクを挿入することによって、又は、変性した定常領域のエキリンに対する 可変領域のスプライシングを施すことによって、生じた結合タンパクは、イムノ グロブリンとは異なったＣ−末ｊｌｌｌｌｌ域を持つ、挿入された遺伝子を有す る終止配列（＊　５ｔｏｐ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を提供することにより、生成タ ンパクは、Ｃ−末端領域に挿入されたタンパクを持つ。もし所望するなら、可変 領域に他のタンパクが結合するための適当なスプライシング部位を有する構造を 提供することにより、定常領域は、完全に他のタンパクで置換される。

イムノグロブリン或いはイムノグロブリン類似物を生産するトランスジェニック な宿主由来のＢ＃胞は、ハイブリドーマを生産するためのマウスの骨髄性細胞と の融合に利用される、或いは、他の便利な工程により不壊死化される１例えばガ ン遺伝子とのトランスフェクションである。これらの不壊死化された細胞は、継 代培養で増殖させて、或いは、腹水症をつくるために適合性宿主（ｃｏ園ｐａｔ ｉｂｌｅ　ｈｏｓｔ）の腹膜内へと挿入される。

本発明は、ポリクローナル−ヒトー抗血滴又はヒトのモノクローナル抗体又は抗 体の類似物を提供する。

哺乳類の宿主が、抗原で免疫されると、その結果生じたヒト抗体は、アフィニテ ィーカラムの使用により。

他のタンパク、プロティンＡなどのようなＦｃ結結合部部分ｇｏｉｅｔｙ）を有 するタンパクから分離することができる。

発明は、次に示す、ヒト以外の宿主の実施態様を含む（図１８参照）。

１、不活性な内生のＬ鎖イムノグロブリン遺伝子に対して異型接合の動物（同型 接合の動物は近親交配（ｉｎｔｅｒｂｒｅｅｄｉｎｇ）により得られる）。

Ｌ不活性な内りのＨＨイムノグロブリン遺伝子に対して異型接合の動物（同型接 合の動物は近親交配により４０られる）。

■０機能的な内生のＬＨとＨ［のイムノグロブリン遺伝子に対して同型接合で、 外来遺伝子（即ち、一つのコピーを含む）、好ましくはヒト、Ｈ鎖イムノグロブ リン遺伝子に対して単接合の動物（同型接合の動物は近親交配により得られる） 。

■０機能的な内生のＬＭとＨｊｌｌのイムノグロブリン遺伝子に対して同型接合 で、外来遺伝子、好ましくはヒト、Ｌｇｌイムノグロブリン遺伝子に対して単接 合の動物（同型接合の動物はｉｉ親交配により得られる）。

ｖ９カテゴリー■の動物をカテゴリー１■からの動物と雑種形成すること（ｅｒ ｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇ）により得られる、不活性な内生のＨＨ及び１ｄｌｌの イムノグロブリン遺伝子に対して異型接合の動物（同型接合の動１よ近親交配に より得られる）。

■、不活性な内生のＨ鎖及びＬｌｌのイムノグロブリン遺伝子に対して異型接合 で、カテゴリー■の勤柳をカテゴリーＶかもの動物と雑種形成することにより得 られる、外来遺伝子、好ましくはヒト、Ｈ鎖イムノグロブリン遺伝子に対して、 単接合の動物（不活性な内生の遺伝子座に対して同型接合で、外来遺伝子に対し て同型又は異型である動物は、近親交配により得られる）。

■、不活性な内生のＨ１＋及びＬ鎖のイムノグロブリン遺伝子に対して異型接合 で、カテゴリー■の動物をカテゴリーＶからの動物と雑種形成することにより得 られる、外来遺伝子、好ましくはヒト、Ｌｉｌイムノグロブリン遺伝子に対して 、単接合の動物（不活性な内生の遺伝子座に対して同型接合で、外来遺伝子に対 して同型又は異型である動物は、近親交配により得られる）。

■、不活性な内生のＨ鎖及びＬｌｌのイムノグロブリン遺伝子に対して同型接合 であるか、又は異型接合であって、カテゴリー■と■の動物を雑種形成すること により得られる、外来遺伝子、好ましくは、ヒトＬＪＩ及びＨＨのイムノグロブ リン遺伝子に対して、単接合である動物（不活性な内生の遺伝子座に対して同型 接合で、外来遺伝子に対して同型又は単接合である動物は、近親交配により得ら れる）。

好ましい実施態様では、カテゴリー■の同型接合の動物がヒトの抗体の生産に使 用される。

■６機能的な内生のＨｊｌｌ及びＬ鎖のイムノグロブリン遺伝子に対して同型接 合で、カテゴリーｍと■の動物を２１４形成することにより得られる、外来遺伝 子、好ましくは、ヒトＨｍ及びＬｍのイムノグロブリン遺伝子に対して、単接合 である動物（同型接合の動物は近親交配により得られる）。

Ｘ、不活性な内生のＨ鎖のイムノグロブリン遺伝子に対して異型接合で、カテゴ リーＩＩと■の動物をＩｌｌ影形成ることにより得られる、外来遺伝子、好まし くは、ヒトＨｇｔ及びＬｗｌのイムノグロブリン遺伝子に対して、単接合である 動物（不活性な内生の遺伝子座に対して同型接合で、外来遺伝子に対して同型又 は単接合である動物は、近親交配により得られる）６Ｘ１．不活性な内生のＬＨ ４のイムノグロブリン遺伝子に対して異型接合で、カテゴリーＩと■の動物を６ １１１１形成することにより得られる、外来遺伝子、好ましくは、ヒトＨ鎖及び Ｌｍのイムノグロブリン遺伝子に対して、単接合であや勤′１ｌＪ（不活性な内 生の遺伝子座に対して同型接合で、外来遺伝子に対して同型又は単接合である動 物は、近親交配により得られる）。

本発明は、また、ヒト以外の、例えば、ホ乳原の宿主への、大きな連続的な、異 種のＤＮＡシー、ケンスを導入する方法を提供する。通常、導入シーケンスは、 少くとも１００ｋｂであろうし、より普通には約２００ｋｂ、一般的には約２０ ０〜＋０００ｋｂに亘る。かくて、関心のある遺伝子座、例えば、イムノグロブ リン座、Ｔ−セル受容体座、主要組織適合性座、ｖ４撞染色体座、等で、目的と する１又は複数の遺伝子を含み得、また、下記の如く特性付けられていてもいな くてもよい。即ち、これらには、例えば、低密度リボプロティン（ＬＤＬ）受容 体、ψ　アポリボプロティン（＾ｐｏ）　Ｂ＋＾ｐｏＥ、システィックフィブロ シストランス膜、コンダクタ−レギュレーター、ディストロフィン、又は、部分 染色体トリソミー（例えば染色体２１．７．　ＩＱ）に関わりつる異種染色体の 領域、及びウィルスなどがある。ＤＮＡとしては、野性型又は優勢突然変位を創 出したり、相補的な劣勢突然変位をつくったりして多積の病気を研究するための 、欠陥性（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）遺伝子とであってもよい。後者としては、例え ば、ＬＤＬ受容体及び＾ｐＯβ遺伝子をハイパ■又は■は、ヘモフイリアのため 、システィックフィブロンストランス腹伝達レギュレータは、システィックフィ ブロシスのため、さらに、シイストロフィン遺色子は筋ジストロフィのために、 導入できる。　ＹＡＣを用いて導入される八き異積ＤＮＡは、ホ乳類ソースから 又は無を椎動物等でありうる。かくて、宿主に対して多くの新しい能力を与える ことができ、ＤＮＡの異種源に関係する遺伝子的応答を創出することができ、ま た抗体の生産、転写ファクターの特異（５ｐｅｃｉｆｉｃ）な組合せの提供、メ タポリツクシステムの提供、優勢又は対応する劣勢突然変位の導入専が可能とな る。異積ＤＮＡは、ＹＡＣ内にあるとき修飾されつる。酵母の中では相同組換え が、有効であり、相同ＤＮＡの座−特異性の組込高率で生じる相同のＤＮＡが他 の関心あるＤＮＡをフランク（ｆｌａｎｋ）　シ、かくて、ＥＳセルに異種＋１ ＮＡを導入する前にそれを修飾することができる。このようにして、欠陥遺伝子 を宿主に導入でき、その宿主は、その欠陥遺伝子を発現して、異種宿主が病状と なった状態を擬することができ、欠陥プロティンの他の異種プロティン又は外来 性プロティンとの相互反応の様々なメカニズムを研究でき、また、遺伝子又は遺 伝システムを研究できる。

一般的に、大きなりＮＡ上セグメント、本願に詳細に記す如く、移す（ないし導 入、ｔｒａｎｓｆｅｒ）ためには・ＹＡＣｓ（（注）　ＹＡＣの複数形はＹＡＣ ｇと表わす、他の略号のセントロミア（動原体ＣＥＮ）　、即ち、複製のオリジ ン、及び目的ＤＮＡを結合するテロメア（末端小粒子ＥＬ）を含む多積のセント ロミア、テロミアを用いることができ、殊に、酵母染色体４及び５から１セント ロミアがよい。ＹＡＣは、それが統合（組込）されるセルの選別ないしスクリー ニングをさせるためのマーカーを有する。必ずしも全てのマーカーが効果的な選 別を行う訳ではない。特に、ＩＩＰＲＴ遺伝子、より好ましくは、ヒトＨＰＲＴ 、がＹＡＣを有するＨＰＲＴ−欠失ＥＳセルの効果的選別を可能とすることが判 った。その他の判っている選別ないしスクリーニング可能なマーカーとしては、 ヒグロマイシン、ネオマイシン、β−ｇａｌ、　ＧＰＴがある。　ＥＳセルは、 ＥＳセルを取出すことができる、ヒト以外の任意の宿主から導くことができ、そ れは、培養で増殖でき、生存可能性かつ機能性を維持し、それに対しての選別マ ーカーが存在し、そして、ＥＳセルが胚内に導入できる場合には、宿主を生殖系 列を含んで、増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）できるこれらの能力の大部分は、例 えばマウス、ラットなどのげっ歯口により、樹立されており、やや程度は低いが 、ギニア豚〒も樹立されている。マウスは、不壊死化（ｉａｍｏｒｔａｌｉｚａ ｔｉｏｎ）のために抗体又はβ−リンホサイトの生産のために用いられている。

マウスは、取扱いが容易なため、大量生産〒き、広汎な免疫レパートリをもつこ とが知られており、マウスが通常、選択されよう、　ＥＳセルの他の種類のもの が、利用可能になれば、それらは当然本発明に従って採用できる。特に関心があ るのは、実験小動物ないしトメスティックな動物で、特に、マウス、ラットを含 むげつ歯口、兎、牛、豚、ハムスター、馬、犬、羊、ギニャ豚、或いは、ニワト リ、七面鳥等の鳥である。　ＥＳセルは、一つ又は複数の突然変異を有するもの とでき、例えば、特定の能力を欠くようにできる。さらに、ある積の受精卵は本 発明で利用できよう。

ＹＡＣは、現在のヒトＹＡＣライブラリーの標準的手法を用いたスクリーニング により得ることができ、それには、Ｃｅｎｔｒｅ　ｄ’Ｅｔｕｄｅ　ｄｕ　Ｐｏ ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｓｅ　Ｈｕｍａｎ　（Ｃ，Ｅ、Ｐ、Ｈｏ）パロ（仏）及びＷ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖ、　Ｓｔ、　５ｏｕｓ、　ＮＯ（米）がある、或 いは、　ＹＡＣは、本願に詳述する通り、容易に調製できる。即ち、それは、一 方のアームにセントロミアとテロミアを備え、他方のアームにテロミアを備えた 酵母のフランキングセグメントを、目的ＤＮＡと結合させることにより得られる ０通例、酵母の宿主セルを選別することができる一つ又は複数のマーカーがある 。酵ｆｆｉ選別には、特に、ＩＩ母宿主の突然変異と相補性ををする（　ｃｏｓ ｐｌｅ■ａｎｔ）マーカーがよく、かかるマーカーとしては、ＹＡＣ上でアミノ 酸、プリンないしピリミジン、ＵＲ＾３．　ＴＲＰＩ、　ＬＹＳ２．＾ＤＥ２の 生産に関与して、Ｗｉ主中でのｕｒａ３．　ｔｒｐｌ、　ＣＢ２及びＡｄｅ２突 然変真と相補性を有する遺伝子などがある。１１＋補性（ｃｏｓｐｌｓｓｅｎｔ ａｔｉｏｎ）を与えるため、大抵は、全体のＹＡＣを持７た酵母のみが選択性媒 体（培養晶−ｅｄｉｕｍ）中で生存できるだろう。ＹＡＣの両アームが保持され たことの遺伝的な検証に加え、パルスフィールドゲル電気泳動などの方法を用い て、ＹＡＣの完全性ないし銃体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙｌを確認することが望ま れる。

ＹＡＣをもつこれらの酵母宿主は、次いで、ＥＳセル内への導入のためのＹＡＣ の源として用いることができる。

ＹＡＣの導入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、従来法に従った酵母のスフェロプラスト を調製することによって、効果的に行うことができる。外壁を、温和な条件下に 、等張媒体中にて変性して、スフェロプラストを高率で生産できる。エクスポネ ンシャルに増殖するＥＳセルは、プロテアーゼ処Ｍ（例えばトリプシン処理）を 施し、スフェロプラストと結合させる。好都合にも、酵母スフェロプラストをベ レット化でき、ＥＳセルをベレットでスピン（５ｐｉｎ）　Ｌ、ＰＥＧ等の融合 処理剤（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）に１〜２分間さらす、セルは次いで 再懸濁（分散）され、適当な血清フリー媒体中でインキュベート（熟成）される 、セルは、次いでフィーダーセル上にプレート化され、選択性マーカーによって 選別に供される。　ＨＰＲ７遺伝子のためには、選別のためＨＡＴ媒体を用いる ことができる。生存している融合コロニーを、次いて、ビックして取出し、増殖 し、分析する。

分析は、制限酵素分析をサザンプロット法又はパルスフィールドゲル電気泳動法 と組合せて行うか、又はＰＣＲ法により、少なくとも一つはＤＮＡインサートと 相補的であり、ヒトＤＮＡシーケンスの検出のため、＾１ｕのように異［ＤＮＡ 内に存在する反復シーケンスでプローブされた適当なプライマーを用いて行うこ とができる。

Ｔｙ、Ｙ’、ｒＤ　Ｎ　Ａ、デルタシーケンスは酵母シーケンスのプローブとし て用いられる。　ＹＡＣ末端のプローブは、ＹＡＣのインテグリテイを確認する ために用いられる。宿主ゲノム内に統合（組込）された完全な（ないしは実質的 に完全な）　ＹＡＣＤ　Ｎ　Ａを示すセルは次いで以降のステップで用いられる 。あるクローンによっては、醇ｆｆ１ＤＮＡの僅か一部のみか、はとんど又は全 く何もマウスの遺伝子中に組込まれないものがある。統合（組込）された酵ｆＢ ＤＮＡは、オリジナル酵母ゲノム的９０％から、約１０％未満にまでに亘る。

好適な実施態様において、ヒト以外のトランスジェニック宿主の効果的な生産は 、大きな、（少くとも１００ｋｂ　）異ｔｌｉＤＮＡ断片を、実質的に完全な形 で、宿主の胚性幹細胞（ＥＳセル）又は受精卵（ｌＦｇｏｔｅｌへと統合（組込 ）することができる方法を用いて行う、異種ＤＮＡの尋人は、一つの方法として はＥＳセルを酵母スフェロプラストと砲台して効率的にできるが、この際、スフ ェロプラストは、ｌ００ｋｂＤ　Ｎ　Ａを含むＹＡＣｓと選択マーカーを含み、 マーカーを含むＹＡＣＤ　Ｎ　ＡがＥＳセルゲノムに組込まれるような条件下に て行う、他の方法としては、精製ＹＡＣをＥＳセルへ遺伝子導入（トランスフェ クト　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ即ち外来性遺伝子の尋人）することによって行う。ゲ ノムへと組込まれたＹＡＣを含むＥＳセルは、次いでＥＳセル中で機能性である マーカーにより選別される。例えば、ヒボキサンチンホスホリボシルトランスフ ェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子をＨＰＲ？欠損Ｅ欠損用ＳセルＨＰＲＴ−ＥＳセル ）内で用いることができる。遺伝子導入組込（ｔｒａｎｓｆｏｒ■ａｔｉｏｎ） 胚幹繕胞から動物を産生させるには、セルは、適当な媒体中（例えば牛胎児血清 インハンスドＤＭＥＭ）でフィーダ一層の上へプレートできる。ＥＳセルは、単 一のターゲティング座（ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｆｏｃｕｓ）　（異型接合の場合） をもつものでよく、或いは、ホモジェノタイゼーンヨン法によって双方の座をタ ーゲティングしたもの（同型接合）でもよい。

ホモジェノタイゼーション（同型接合体の形成）は、両方の染色体に遺伝子ター ゲティング事象を有するセルを成長させるための選択的圧力を用いる。２つのタ ーゲティングされた対立遺伝子を有するセルは、選択性媒体を用い、コロニーが 成長するに十分な時間の後、検出することができる。そのためコロニーは、ビッ クし、分析して、統合（組込）又は相同組換えが生じているかどうか分析される 。既述の通り、　ＰＣＲをプライマーと共に、構成（骨格）シーケンスの中又は 外で、しかし標的部位に対し、用いることができる。

相同の組換えを示すコロニーは、次いで胚操作と胞胚への注入のために用いるこ とができる。選別されたＥＳセルは、その後、微量注入法その他の方法により経 内に導入される１例えば、マウス（−ｕｒｉｎｅ）の胞胚は雌から排卵の３．５ ０後子宮をフラッシュして得られる。

修飾ＥＳセルは次いでトリブシナイズし、少なくとも１以上、１５までのセルを 胞胚の胞胚腔内へと注入する。

注入の後、１以上約１０までの胞胚を偏性受胎の雌の各子宮角部に戻す。雌は満 期まで進行させ、生成するキメラ動物を分析してその体性セル内にＹＡＣがある か否かを調べる。「キメラ」の語は、１つより多くのソース（例えば、宿主と他 の動物）から導かれた細胞をもつ動物を意味する。例えば本発明では、キメラネ ズミ動物は遺伝子工学的に迅理した修飾、特にヒト遺伝子を、そのいくつかのセ ル（例えば、修飾された胚幹セルから発達（展開）するセル）中に、有する。産 出されたキメラ宿上因にある組込ＹＡＣの存否を次に分析する。キメラ宿主は、 交配によりＥＳセルゲノムの生殖系列での遺伝、受継（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏ ｎｌを評価し、例えばキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させる。キ メラ宿主は非キメラ宿主と同型（ｓｙｎｇｅｎｅｔｉｃ）又は同種異型（ａｌｌ ｏｇｅｎｅｉｃ）に交配させることができ、それにより、ＹＡＣをその生殖セル にもつキメラをスクリーンする。

遺伝子修飾について異種接合な子孫は、次いで互いにかけ合わされ（ｉｎｔｅｒ ｂｒｅｅｄ）、修飾に関して同型接合な子孫で、機能性のＹＡＣ橋成をその子孫 へ安定して伝えるものをつくる。

異［Ｄ　ＮＡの大きなセグメントをヒト以外の宿主（特にげっ歯口、そして通例 にはマウス（■ｕｒｉｎｅ）動物）へ導入するための方法としては、ＤＮＡの安 定な統合（組込）をもたらす。挿入された遺伝子は、機能を有することが認めら れ、結集するキメラ宿主は、組込ＤＮＡの生殖系列への遺伝を達成することがで きる。キメラ宿主の交配（ｂｒｅｅｄ）の後、トランスジェニックな異種接合の 宿主が産生され、さらに多くの目的のために用いることができる同型接合の動物 を産生ずるために交配（ｍａｔｅｌされる。この目的としては、産物の生産、例 えば、結合蛋白、例えばイムノグロブリン、多くの薬剤のス？リーン、遺伝子治 療、撞々の病気の研究、不十分にマツプ化された巨大なりＮＡフラグメントの機 能と制御の研究などの目的がある。

以下の実施例は、説明の手段としてのみ提供されるものであって、限定のために あるのではない。

実験 実Ｊ１１男■ ■、マウスのｆｆｉ鎮Ｊ（Ｊｌｌ）Ｊ＋！伝子の不活性化Ａ、襟的にしている不 活性化ベクターの形成（ｃｏｎｓｔｒｏｃｔｉｏｎ） マウスの重鎖Ｊ遺伝子及びフランキング（ｆｌａｎｋｉｎＯ配列を含んでいる、 ６．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントが、５ａｋａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ ８１１，Ｎａｔｕｒｅ　Ｚ９０＋５６２−５６５に記載されたプローブを用いて 、Ｂｕｌｂ／ｃマウスの胚の遺伝子ライブラリーからクローン化される。このフ ラグメント（ｍＤＪ）がＥｃｏＲＩ−切断（ｄｉｇｅｓｔｅｄ）ｐｕｃ　ｌ　９ プラスミド（ｐｍＤＪ）内に挿入される。

４ＭのＪ遺伝子を含む２．９ｋｂのフラグメントが、Ｘｈｏｌ−ＳｃａＩダイジ エスチョン（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）　（ｐｍＤδＪＮｅ　ｏ、図１参照）により 切り出される。Ｈｅｒｐｅｓ　５ｉｓｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓのチミジンキナーゼ 遺伝子（Ｈｊ３Ｖ−ｔｋ）のプロモーター及びポリオーマのエンハンサーにより 駆動されるネオマイシン抵抗性（ｎｅｏｓｙｃｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｌ　 ｉｌｌ壬子含む、＋＋５０　ｂｐＸ　ｈ　ｏ　ｌ　−ＢａｍＨＩフラグメントが 、ｐＭｃｌＮｅｏ　（Ｔｈｏｍａｓｉｎｄ　Ｃａｐｅｃｃｈｉ　（＋９８７１． 　Ｃｅ１ｌ、　５１．５０３−５１２）から単離される。ＢａｍＨＩ末端を５ｃ ａＩ末端に変換するために、合成のアダプター（ａｄａｐｔｏｒｌがこのフラグ メントの上に加えられる。結果として生じたフラグメントは、ネオマイシンの５ ゛から３゛までの配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏ口）及び重鎖のプロモーターが同 一である不活性化ベクター（ｐｍＤ６Ｊ、Ｎｅｏ）を形成するために。

ＸｈｏＩ−５ｃａＩ　ｐｍＤ６Ｊに結合される。このプラスミドは、ＥＳ細胞に トランスフェクションする前に、ＮｄｅＩダイジエスチョンによって線状化され る。相同的組換えのｅｖｅｎｔを駆動している配列は、ネオマイシン遺伝子の５ −及び３′にそれぞれ配座された、３ｋｂ及び０．５ｋｂのフラグメントである 。

Ｂ、培養、電気泳動、及びＥＳＩｉ胞の選択性ＥＳ細胞系列Ｅ　１４　Ｔ　Ｇ　 ２　ａ　（Ｈｏｏｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３ ２６：２９２−２９５）が、基本的には（ＤＯ＠ｔｓｃｈ−ａｎ　ｅｔ　ａｌ、 　（＋９８５１．　Ｊ、　Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘｐ、　Ｍｏｒｐｈｏｌ、　８ ７：２７−４５）の記載に従って、初期胚の繊維芽細胞−支持層（ｆｉｂｒｏｂ ｌａｇｔ−ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒｓ）を処理したマイトマイシン（■ｉｔａ ｍｙｃｉｎ）で培養される。胚の繊維芽細胞は。

ネオマイシンのトランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）　（Ｇｏｓｓｌｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　（＋９１１６１．　ＰＮＡＳ　８３：９０６５−９０６９）に対し て相同の雄と交配され、１４〜１７日未満のＣ５７ＢＬ／６雌からの胚から調製 される。これらの細胞は、０４１８を含む培養基で成長することができる。エレ クトロポレーション（電気穿孔法）の条件は、（Ｂｏｇｇｓ　ｅｔａｌ、　（１ ９８６）、　Ｅｘ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　（ＮＹ）　１４９：９８８−９９４） の記載に従った。ＥＳ細胞はトリプシン処理され、４×１０７／ｍＬの濃度で、 培養基中に再懸濁され、第一の実験では、１２ｎＭの濃度の標的ＤＮＡ構造物（ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の存在下でエレクトロボレートされ、第二の実験では、５ ｎＭのＤＮＡ１１度でエレクトロボレートされる。５ｍｍの長さで、断面積が１ ００ｍｍ２のエレクトロポレーションセルでは、１５０−２５０μＦの静電容置 で３００Ｖの電圧が、最適であることがわかる。ｓｘｔｏｓｇのエレクトロポレ ートセルが、１５％の胎児牛血清（ＦＢＳ）及び０．１ｍＭ２−メルカプトエタ ノールが補充された、Ｄｕｌｌｂｅｃｃｏ’　ｓ変性Ｅａｇｌｅ°慕培養基（Ｄ ＭＥＭ）の存在下で、（径）１００ｍｍの皿で、マイトマイシン処理繊維芽細胞 の上で平奢反培養される。エレクトロポレーションの後に、培養基は２ｏｏｕｇ ／ｒｎＬのＧ４１８を含む培養基に２４時間置換される。

エレクトロポレーションから１０−１４日後に生じたコロニーは、ＰＣＲ分析用 にキャビラ１ノーとベットで吸い出される。それぞれの吸し）出されたコロニー の半量は、マイトマイシン＋［＆珊支持細胞（−ｉｔｏｍｙｅｉｎ−ｔｒｅａｔ ｅｄ　ｆｅｅｄｅｒ　ｃｅ口Ｓ）が既に撒かれた２４六プレートに保存される。

残りの半量は、３−４のブールに分１す、約０．５ｍＬのＰＢＳを含むエツベン ドルフチューブに移され、ＰＣＨによる相同ＦＪ組換えが分析される。

ＰＣＲ反応の条件は、基本的には（区ｉｓ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉ＠５（１９８ ８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｉ、　＋６：８８８７−８Ｊ１９３） の８己載に従う、ベレット化したｆｌ、Ｅ　Ｓ細胞は５μＬのＰＢＳで再！！濁 し、各チューブに５５μＬの水を４加して溶菌させる。各チューブを９５℃で１ ０分間加熱することによって、ＤＮＡアーゼが不活性化される。プロテイナーゼ にで５５℃、３０分間処理した後、ＰＣＲバッファー：１．５μｇの各プライマ ー、３ＵのＴａｑポリメラーゼ、１０％のＤＭＳｏ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ　 を含む２０μＬの反応混合液が入っているチューブに、溶解液の３０μＬをそれ ぞれ移す、ＰＣＲ展開（ＰＣＲｅｘｐａｎｓｉｏｎ）は、サーモサイクラ−（ｔ ｈｅｒｓｏｃｙｅｌｅｒ）を用いて、９２℃で６５秒間融解し、６５℃で１０分 間のアニーリングとエクステンションタイム（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｔｉｍｅ） を、５５サイクル行う、二つのプライム化したオリゴヌクレオチドは、テＧＧＣ ＧＧＡＣＣＧＣ丁ＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＣとＴＡＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣ丁Ｃ ＣＴＴＡＣであり、それは、それぞれネオマイシン遺伝子の開始コドンの３′側 の６５０塩基とマウスの重鎖遺伝子に位置する配列で。

挿入部位の３′側の１１００塩基に相当する０反応混合嬢の２０μＬをアガロー スゲルで電気泳動し、ナイロン膜（ゼータ結合）に転写した。フィルターは、３ ２Ｐ−標識した、Ｊ−Ｃ１ｌｌ域の９９１ｂｐのＸｂａＩフラグメントで検査さ れる。

実施例！！ ｒｌ、Ｅｓ１１胞における、マウスのＩ　ｇｌｌ［Ｊ　（Ｊｍ）遺伝子の削除（ ｄｅｌｅｔｉｏｎ） Ａ１組撓ターゲティングベクターの形成（Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔ ｈｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）マウスの イムノグロブリンの重鎮のＪｌｌｌ域の遺伝子及びフランキング（ｆｌａｎｋｉ ｎｇ）配列を含み、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの胚の遺伝子ライブラリーからクローン 化され、ｐＵｃ１８（ｐＪＨ）に挿入された、６．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメ ントは、４個のＪ遺伝子を含む約２゜３ｋｂのフラグメントを削除するために、 ＸｈｏＩ及びＮａｅ　Ｉで切断された（図２Ａ参照）、ＢａｍＨＩ部位でプラン トされ（ｂｌｕｎｔｅｄ）　、　Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｓ＋ｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ のチミジンキナーゼ遺伝子（Ｈ３Ｖ−ｔｋ）のプロモーター及びポリオーマのエ ンハンサ−により駆動されるネオマイシン抵抗性遺伝子を含む、約１．１ｋｂの フラグメントが、ｐＭｃｌＮｅｏ（丁ｈｏｓａｓ　ａｎｄ　Ｃａｐｅｃｅｈｉ　 （１９８７）、　Ｃｅ１ｌ、　５１．５０３−５１２１から単離された。このフ ラグメントは、削除ベクター（ｐｍＨ６Ｊ。

図２Ｂ参照）を形成するために、ｐＪＨが削除されたＸｈｏｌ−ＮａｅＩに挿入 された。削除ベクターでは、ネオマイシン及び１１鎖の遺伝子の転写の配向（ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）は同じである。この プラスミドは、ＥＳ細胞にトランスフェクションする前に、Ｎｄｅｌダイジエス チョンによフて線状化された。相同組換えを駆動している配列は、それぞれネオ マイシン遺伝子の５′側と３゛側に位置する、約２．８ｋｂと１．ｌｋｂのフラ グメントである。

Ｂ、ＥＳ細胞の培養、エレクトロポレーション、選択ＥＳ細胞系列Ｅ　ｌ　４　 Ｔ　Ｇ　２　ａ　（Ｒｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　５ａｉｔｈｉｅｓ　（１９８９）、 　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　８６：８９３２−８９３５）は、　（Ｋｏｌｌａｒ　ａ ｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ　（１９８９）、　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、　８６：８９３ ２−８９３５）の記載に従って、胚の繊維芽細胞支持層（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ 　ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒｓ）が処理されたマイトマイシンＣで培養された。

ＥＳ細胞はトリプシン処理され、ＨＢＳバッフｙ　−（ｐＨ７，０５；　１３７ ｍＭ　Ｍａｉｌ、５ｍＭ　ＫＣＩ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２．　０゜７ｍＭ　Ｎａ２ ＨＰＯ４，２１ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，ｌ）　で　、　２Ｘ１０７／ｍＬの 濃度に再懸濁された。線状化された不活性化ベクターの５０μｇ　／　ｍ　Ｌの 存在下で、エレクトロポレートされた。エレクトロポレーションは、２４０ボル ト、静電容量５００μＦを用い、ＢｉｏＲａｄ　ＧａｎｅＰｕｌｓｅｒで行われ た。５ｘ１０６のエレクトロボレートされた細胞は、１５％胎児牛血清及びＱ、 １ｍＭ２−メルカプトエタノールを補充した、Ｄｕｌｂｅｃｃａ’ｓ　ｍｏｄｉ ｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉａ（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　）の存在下で、１０ ０ｍｍの皿に、繊維芽細胞処理されたマイトマイシンＣの上に置かれた。培養基 は、エレクトロポレーションの２４時間後に、２００μｇ　／　ｍ　Ｌの０４１ ８を含む培養基に置換された。エレクトロポレーションから１２−１４日後に、 成長して生じた０４１８−抵抗性ＥＳコロニーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）を利用した分析のために、キャピラリーとベットで吸い出された。

吸い出されたコロニーの半量は、既に支持細胞で処理されたマイトマイシンＣが 入った、２４六プレートの個々の六に入れられた。残りの半量は、４つのプール に分けられ、Ｑ、３ｍＬのＰＢＳを含むエツベンドルフチューブに移され、細胞 の溶解液はＰＣＲ分析用に、Ｊｏｙｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９１Ｎａｔｕ ｒｅ、　３３８：　１５３−１５５の記載に従って、調製された。ＰＣＲ反応に は、５−２０μＬの細胞溶解液、１μＭの各プライマー、１．５ＵのＴａｑポリ メラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰｓを使用した。Ｐ、ＣＲの増幅は、９４℃で１ 分融解、５５℃で２分アニーリング、７２℃で３分エクステンションを、サーマ ルサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社製）を用いて、４５サ イクル行った。二つのプライミングオリゴヌクレオチドは、　ＡＣＧＧτ＾ＴＣ ＧＣＣ（ｉｃＴｊ：ＣＣＧＡＴ及び＾ＧＴＣＡＣＴＧＴＡＡＡＧＡＣＴＴＣＧＧ ＧＴ人で、あって、それはそれぞれ、ネオマイシン遺伝子のＢａｍＨＩ断片の５ ″側の約１２０塩基及びマウスのｒｉｍの１．ｉＩｌ伝子に配置された配列で、 挿入部位の３−側の約１６０塩基に相当する。成功した相同組換えは、約、１． ４ｋｂフラグメントを生ぜしめる。反応混合液のイＯμＬが、１％アガロースゲ ル上で電気、泳動され、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕ■ｂｒｏｓｉｄ ｅ）で染色され、ナイロン膜に転写される（遺伝子のスクリーン）、マウスの！ ｌ鎖の挿入部位の３″側に配置される３２Ｐ−標識ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩの約１ ゜４ｋｂフラグメントで、探索された（図２参照）、更なる分析のために、ゲノ ムＤＮＡがＥＳＩＩ胞から調製され、製進者により推薦された制限酵素で切断さ れた。

フラグメントは、１％アガロースゲルで、分離された。

ＤＮＡはナイロン膜に転写され（遺伝子のスクリーン）、上述の様にして、３２ Ｐ−標識されたフラグメントで探索された。

Ｃ，Ｇ４１８−耐性ＥＳコロニーの分析最初の実験において、プールされたコロ ニーのＰＣＲ分析により、１３６のＧ４１８−耐性コロニーを表４ｋｂ）の一つ の陽性ＰＣＲシグナルが検出された。

のＧ４１８−耐性コロニーについて同様の分析により、１、ＥＳ６１−１、ＥＳ ６５−１．ＥＳＩＩＯ−１−）２つのコピーがある）の標的ディスラプション（ 乱れが増殖され（ｅｘｐａｎｄｅｄ）　、ゲノムＤＮＡが調製され、ＨｉｎｄＩ ［ｌ或いは５ａｃＩで切断され、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌプローブを用いる上記の 様なサザン分析により分析された。

相同的組換えによるネオマイシン遺伝子の挿入によって、Ｊ遺伝子の置換が、Ｅ ｃｏＲＩ−Ｐｓｔｌプローブで検出可能な、Ｈｉｎｄ０１フラグメントに生じる 。

それは、天然の遺伝子座における同等のフラグメントより長い約１．９ｋｂであ り、削除されたＪ遺伝子領域に配座された２つのＨｉ　ｎｄｍ片の損失による（ 図２ＣＩ照）、Ｈｉｎｄｌｎの切断による５個の陽性クローンのそれぞれのサザ ン分析は、重鎖Ｊ選壬子の二つのコピーの一つはディステブトされた事を示すパ ターンを与えた。３個の標識されたフラグメントが検出された０、一つのフラグ メント（約７６０ｂｐ）は、同じ強度（１ｎｔｅｎｓｉｔｙ）で未処理の細胞に 存在するのと同一の大きさであり、一つの７ラグメント（約２．３ｋｂ）は、未 処理の細胞に存在するのと同一の大きさであるが、ＰＣＲ陽性クローンの強度は 減少しており、約４．２ｋｂの付加的なフラグメントは、相同組換えで予測され た大きさであり、ＰＣＲ陽性クローンにのみ存在する。同様に、相同組換えによ るネオマイシン遺伝子でのＪ遺伝子の置換は、１個のＳａｃ　Ｉ片の損失及びＥ ｃｏＲＩ−ＰｓｔＩプローブで検出可能な、フラグメントの出現が生じる。そし てそれは、自然の遺伝子座での同等のフラグメントより小さい５７０ｂｐである （図２Ｃ参照）、５ａｃＩ切断（ｄｉｇｅ＋＋ｔｉｏｎ）によるクローンのサザ ン分析は、１個の天然物と１個の標的対立遺伝子の予想されたパターンを与えた 。：（一つは）約４．Ｏｋｂフラグメントで、未処理細胞で検出されたものと同 一の大きさであるが、５個の陽性クローンより強度は減少している。そして、約 ３゜４ｋｂの付加的フラグメントは、標的にされた相同的組換えで予想された大 きさであり、確認されたクローンにのみ存在する。ネオマイシン遺伝子に対する プローブでのサザンプロットのりハイブリッド化（ｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ）は、Ｈｉｎｄｍと５ａｃＩの切断（ｄｉｇｅ婁ｔｉｏｎ）から生じ、ター ゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｅｖｅｎｔ）により予測されたようなプロー ブにハイブリッドされた、４．２ｋｂと３．４ｋｂの７ラグメントだけを示した 。

Ｄ、昌が欠失したキメラなマウスの産生［ｏｌｌｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、１９８９ 　ｆｓｕｐｒａ）によって８己載された様な、４−５週令の排卵過度の雌から、 ３．５日目のＣ５７Ｂ　Ｌ　／　６　Ｊ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ、　Ｂａｒ　Ｂａｒｂｏｒ、　ＭＥ）の胞胚が得られた。ＥＳ細胞はト リプシン処理され、新鮮なりＭＥＭ培養基で１回洗浄し、１０％胎児牛血清、２ ０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，５を含むＤＭＥＭ培養基で、約１ｘ１０６／ｍＬ に希釈された。１０から１５の細胞が、各胞胚の胞胚腔に注入された０次に、胞 胚を含むＥＳ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＸＤＢＡ／２又はＣ５７Ｂ　Ｌ　／　６ 　Ｊ　ｘ　ＣＢ　Ａの１１世代の偏性妊娠の雌の一つの子宮の角部（ｈｏｒｎ） に外科的に移された。

ＥＳ１１胞の子孫への貢献は、子供の皮の色（ｃｏａｔｃａｌｏｒ）の試験によ って、目視的に判断された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは濃い黒色である。ＥＳ細 胞の親系列（ｐａｒｅｎｔ　１ｉｎｅ）のＥ１４ＴＧ２ａは、１２９１０１ａの 胚から単離された。それは、アグーチの遺伝子座に優性なＡｙ対立遺伝子、ｐ遺 伝子座には劣性なピンクの目を薄くする（　ｐｉｎｋ−ｅｙ＠５−ｄｉｌａｔｅ ）対立遺伝子、Ｃ遺伝子座には劣性なＣｃｈ対立遺伝子の、３個の皮の色の遺伝 子を持つ、動物の形成にＥＳ細胞が関与したキメラな子孫は、アグーチでクリー ム色の毛の皮を持キメラなマウスの生殖系列の遺伝の能力は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ マウスと交配することで、アグーチ色を持つＦｌ子孫を与えることにより評価さ れた。これらのアグーチマウスの５０％は、変異した重鎖の対立遺伝子を遺伝す ることが期待され、そのことは、尾から単離されたＤＮＡのサザンプロット分析 によりＮ認することができる。

ターゲテインクにされた（　ｔａｒｇｅｔｅｄ）重鎖対立遺伝子の一つを持つ、 Ｊｌｌ−ターゲテイングＥＳ細胞系列のＥＳ６５−１は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウ スの胞胚の中に注射された。生存している子供の約４５％はキメラであった。２ ３８−２と２４４−３の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの雄と交配させた、２匹のキメラな 雌は、アグーチの子孫の比率でいうと、１００％及び１５％の頻度で、生殖系列 が遺伝した子孫を産んだ、相同的な子孫からのＤＮＡのサウザンプロット分析は 、テストした５匹のアグーチ子孫の中２匹には、１−の対立遺伝子に加えて、タ ーゲティング重鎮が存在することを示した。

突然変異のためのマウスの相同性は、Ｊ、が削除された（δＪ＠）ｊｌ！！！接 合体として識別された雄と雌のマウスを交雑することによりて、獲得された。こ れらの交配の子孫は、サウザンプロット分析により、２個の標的Ｉ１１対立遺伝 子の存在が調べられた。

Ｅ、キメラマウス由来のａｌｌ胞の分析Ｊ、領領域削除が１重鎖の遺伝子座を不 活性化するのに十分であるなら、ＩｇＭ−発現Ｂ細胞の先達及び抗体の産生を完 全に阻害するにちがいない−Ｊｓ遺伝子座がｎ型接合であるマウスは、Ｃ５７Ｂ Ｌ／６Ｊから誘導される、１個の完全な機能的重鎮対立遺伝子及び、ＥＳ細胞（ １２９／　Ｏｌａ　５ｔｒａｉｎ）から誘導されるＪ、−削除ｌ鎖対立遺伝子（ Ｊ＊−ｄｅｌｅｔｅｄ　ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎａｌｌｅｌｅ）とを持つ、１２ ９株と８６株では、Ｉｇの重鎖のアロタイプが異なる。Ｂを発現している抗体に ついてフローサイトメトリー法（ｆｌｏｗ　ｅｙｔｏ＋５ｅｔｒｙ　ａｎａｌｙ ｓｉｘ）を用いて、アロタイプ特異的モノクローナル抗体でもって、Ｅ　Ｓ　− ｆｉｌｌ尋Ｂ細胞（ＩｇＭａアロタイプ）は、Ｂ６−！ＩＩ導Ｂ細胞（ＩｇＭｂ アロタイプ）とは識別することができる。

これらの抗体の特異性は、図３　（Ａ−Ｃ）に示される。末梢血のリンパ球は、 Ｂ細胞に特異的なマーカー、Ｂ２２０に対する抗体、及び、１ｇＭアロタイプに 対する抗体で、染色された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＢ細胞は、ＩｇＭｂ アロタイプに対する抗体で染色されたが、ＩｇＭａアロタイプに対する抗体ては 染色されなかった（図３Ｂ）、１２９１０１ａマウスから誘導されたＢ細胞は、 ＩｇＭａアロタイプに対する抗体で染色されたが、ＩｇＭｂアロタイプに対する 抗体では染色されなかった（図３Ａ）。ｆｉｌｌの完全なＥＳ−誘導重鎖対立遺 伝子及び１個の完全なＣ５７ＢＬ／６Ｊ−誘導重鎖対立遺伝子を持つ、異型接合 体（ａ／ｂＦ１）マウスにおいては、両方のアロタイプが、等量ｒ！在する（図 ３Ｃ）。

Ｊ、削除重鎮対立遺伝子は１２９　／　Ｏｌ　ａの親からであった場合に、Ｊｌ ｌ削除のために異型接合であるマウス由来のＢ細胞を分析したなら、ＩｇＭ”ア ロタイプに対して陽性を示す細胞はなかった。全てのＢ細胞は、完全なＣ５７Ｂ Ｌ／６ＪｌｌＩ対立遺伝子由来の工ｇ　Ｍ　ｂに対して陽性であった（図３Ｄ） 、これらの結果は、Ｊ、削除重鎖の遺伝子座が不活性化され、機能的なＩｇＭ抗 体をコードすることができないことを示した。Ｊ、削除の為に同型接合であるマ ウスもまた、機能的な抗体を産生ずるための能力につぃて分析された。同型接合 の突然変異マウスからの末梢血のリンパ球が、Ｂ細胞に特異的なマーカーである Ｂ２２０を用い、アロタイプ特異的マーカーと共に、フローサイトメトリーによ り分析された（図４参照）、対照マウス（図４Ｄ−Ｆ）に比して、突然変異マウ スでは、Ｂ２２０十細胞は検出されず、ＩｇＭ産生細胞が検出された（図４Ａ− （：）。更には、突然変異マウスは、血清中に検出可能なＩｇＭを持たない、こ れらの結果は、二つの重鎖の対立遺伝子からＪＨ領領域削除することが、成熟Ｂ 細胞へのＢＩＩＩｉ胞の発達及び抗体の産生の完全なる阻害を導く。

Ｆ、同型接合の突然変異ＥＳ＠胞の発生Ｂ＃ｇ胞におけるＪ、削除の効果は、二 つの重鎖の対立遺伝子を持っＥＳ細胞を生み出すことによってもまた分析するこ とができ、そのＥＳ細胞は、突然変異により多くのリンパ系細胞の同型接合体を 含むキメラなマウスを生産するために利用される。

同型接合の６昌突然変ｎＥＳ細胞は、標的対立遺伝子のホモゲノート化（ｈｏｍ ｏｇｅｎｏｔｉｚａｔｉｏｎ）に選択性を示す０４１８のレベル（１，４ｍｇ／ ｍＬ）まで異型接合の突然変異ＥＳクローンα、ＥＳＩＩＯ−，１の１１１１を 処理することによって、生み出された。野生型の重鎖対立遺伝子を喪失し、更に 第二の標的対立遺伝子をＮ１ｑしたものを目的として、７個の生きているコロニ ーが、Ｓａｃ　Ｉ断片を用いて、サザンプロット分析によりスクリーニングされ た。３ｆｇｉのクローンの中の１＠、Ｅ　Ｓ　Ｄ　Ｋ　２０７　ハ、親Ｍ列ＥＳ ＩＩＯ−１７７）ように、約８０％の細胞は、二つの標的対立遺伝子が存在する ことを示唆する、４０ｇ１の染色体を持つことを示した。同型接合の突然変異Ｅ Ｓ細胞は、Ｃ５，７ＢＬ／６Ｊの胞胚にｎａ注射さ、れて、キメラ２なマウスが 生まれた。

Ｇ、同型接合のキメラ由来のＢ細胞の分析キメラなマウス由来のＢ細胞が、Ｂ細 胞の発達及び抗体産生におけるＪｌｌの削除の効果を決定するために分析された 。ＥＳ細胞・系列（１２９１０１ａ）由来のリンパ球は、１２９由来のリンパ球 を見つけるが８６由来のリンパ球を見つけない、Ｌｙ−９，１マーカーに対する モノクローナル抗体によって、胞胚−誘導（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）リンパ球とは識 別し得る。更に、二つの細胞株は、既に述べたように、１ｇＭアロタイプが異な る。

分析されたキメラは、野生型Ｅ１４ＴＧ２ａのＥＳ細胞、又は、標的のＪｌｌ領 域で、異型接合体（ＥＳｌｌｏ−１，、ＥＳ６５−１）であるか、同型接合体（ ＥＳＤＫ２０７）である、ＥＳｉｉ胞から誘導された。末梢血の単核細胞が１． Ｂ細胞に特異的なマー１−Ｂ２２０に対する抗体、及び、Ｌｙ９．１或いは１ｇ Ｍアロタイプのどちらかに対する抗体でもって、染色された。

次いで、２色のフローサイトメトリーにより分析された。Ｔ細胞の直系における キメラ現象を評価するために、細胞が、Ｔ細胞のマーカーＴｈｙ１．２に対する 抗体及び抗−、、、Ｌ　ｙ−９、１抗体でもって、染色された。

親のマウスの株に由来する細胞の染色は、アッセイの特異性及び選択性のコント ロール（対照）とした。

キメラ現象が同程度のマウスは、皮の色（ｃｏａｔ　ｃｏｌｏｒ）により判断さ れるのだが、比較された。ＥＳ−誘導Ｂ細胞とＴ細胞は、野生型のＥ１４ＴＧ２ ａのＥＳ細胞から発生したキメラなマウスの末梢血で検出され、この細胞系列に おける、インビボでリンパ系細胞を産み出すための能力がＦＩｌ認された。単一 のＪｗ−標的ＥＳ６５−１及びＥＳｌｌＱ−１１１胞から発生したキメラな動物 は、単一で、完全な、ＥＳ細胞−誘導Ｉｇ重重速遺伝子座含む、Ｂ２２０＋／Ｉ ｇＭａ＋／Ｌｙ−９゜１４Ｂ細胞の存在を立証した。

ＷＴ及び一つが欠如したキメラ（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｃｈｉｍｅｒ ａｓ）と比較すると、同型接合の突然変異ＥＳＤＫ２０７ｇ胞系列から発生した マウスは、末梢血において、Ｌ３Ｔ−９，１４／Ｂ２２０＋又はＩｇＭａ＋／Ｂ ２２０＋１のＢ細胞を欠いていた。ＥＳ−ＩＩＩ専ｔ、ｙ−９゜１＋／Ｂ２２０ ÷細胞が、末梢血の単核細胞の全プールの１２％を占めたので、ＥＳＤＫ２０７ −１Ｉ尋Ｂ１１胞の観察された欠如は、リンパ球が生成されないことに依るもの ではなかった。これらのうち、約半分はＴｈ３１−１．２＋Ｔ細胞であった。こ のように、二つの対立遺伝子からのＪ、ＩＩ域の欠如は、Ｉ　ｇＭ”を生産する 成！！１Ｂ細胞の発達を阻害する。同様なことが、キメラなすいｍｓ＋胞でも観 察された。

キメラは、ＥＳＩＩ胞から誘導された血清ＩｇＭの存在についてもテストされた 。ＩｇＭ”レベルは、野生型ＥＳ＃胞及び一つの標的突然変ｊ１Ｍ兜遺伝子を持 つ＃　ｍ　（ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ａ　８ｒｎｇｌｅ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｍ ｕｔａｔｉｏｎ）からのキメラにおいて高値であった。しかし、ＥＳＤＫ２０７ 細胞系列から誘導されたマウスでは、Ｉ　ｇＭ”は検出されなかった。

更に、分析は、ＥＳＤＫ２０７マウスの骨髄は、宿主の繊維芽細胞から誘導され た正常ＩｇＭ”Ｂ細胞を含むが、ＥＳ−誘導ＩｇＭ”Ｂ細胞を欠くことを示した １すれども、ＤＫ２０７−誘導骨髄は、ＥＳ細胞から誘導されたＢ２２０ｄｕｌ ｌ／Ｌｙ−９，１＋である細胞の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ＞を含む、それ故 に、骨髄には、ＥＳ＠胞−ＭｓＢ細胞の＃躯体の小集団（５ｕｂｐｏｐｕＬａｔ ｉｏｎ）を多分含むだろう、そして、その成熟は、１ｗ領域の同型接合の欠如に より阻害される。

骨髄細胞ハ、Ｌｙ−９，１，Ｂ２２０及びＣＤ４３又はＴｈｙ−１，２に対する 抗体を用い、３色のフローサイトメトリーでもまた分析された。その結果は、Ｅ Ｓ−誘導細胞の大多数がＣＤ４３陽性であることを示し、そのことは、成熟が初 期に阻害されることと一致する。非常に若いＢ細胞の前駆体の存在から予想され たように、細胞の多くは、Ｔｈｙ−１，２についても陽性を示した。これらのデ ータは、Ｊ、領域の欠如は、並べ換えや機能的ＩｇＭを産生ずるための重鎖の遺 伝子座の不活性化が起こっていることを示す、ＩｇＨの並べ換えの欠如により、 Ｂ細胞の成熟の阻害が生じ、！３１１胞の前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ＋ｓ） は、初期段階での発達を制限される。

実施例ｍ （Ｃｋ）Ｉｆ域を含むマウスＩｇのカッパーの軽鎖の欠如 Ａ、置換ターゲティングベクターの形成（Ｃｏｎｍｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔ ｈｅ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）カッパー 領域は、置換型ベクター（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｔｙｐｅ　ｖｅｃｔｏｒ） で不活性化された。その結Ｌカッパー遺伝子座の定常領域が削除され、相同組換 えを通じて、０４１８薬Ｆｉｌ＋耐性マーカーで置換された。相同組換えは、定 常ＩＩ域の側にある（　ｆｌａｎｋ）相同の領域により駆動された（Ｉ２Ｉ５参 照）。

マウスのカッパ一定常端域を含んで延在する（　５ｐａｎ１３．１．６ｋｂのＨ ｐ　ａ　Ｉ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメントを有するマウスＣｋｊｌ壬子の 存在を目的として、ラムダファージによりクローン化された、１２９１０１ａマ ウスの胎児肝ＤＮＡ　（遺壬子層：　ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのゲノムライ ブラリーがスクリーニングされた（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ　ａｎｄ　Ｚａｃｈａｕ 　（１９８０１Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１１：１６９３ −１７０６）　、このプローブとハイブリダイゼーションすることにより、ラム ダファージのクローンが確認され、次いでこれを精製し、ＣｋＤＮＡの材料とし て使用された。ファージＤＮＡの分析は、カッパーの定常ＩＩ域のプローブが５ ．６ｋｂのＳ　ｐ　ｈ　Ｉ　／　Ｂ　＆ｍＨＩフラグメントとハイブリダイゼー シヨンされたことを示した。このフラグメントは、カブバーＪ領域の遺伝子、イ ントロンのエンハンサ−要素（１ｎｔｒｏｎｉｃｅｎｈａｎｃｅｒ　ｅｌｅｍｅ ｎｔ）及びカッパーの定常領域を含んだ、それは、単離され、プラスミドｐＵＣ ２１８の５ｐｈＩ及びＢａｍＨＩ部位へとサブクローニングし、プラスミドｐＵ ｃ２１８１５．６カツパーを得た。

削除ベクター（ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｖｅｃｌｏｒ）を構成するために、カッパ一 定常領域の５′領域を含むフラグメント、陰性の選択のための（ｆｏｒ　ｎｅｇ ａｔｉｖｅ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）チミジンキナーゼ遺伝子、カッパ一定常領域 に相同な３′領域が一緒に連結（ｌｉｇａｔｅ）された（図６参照）。

プラスミドｐＵｃ２１８１５．６カツパー由来の４゜ＯｋｂのＳ　ｐ　ｈ　Ｉ　 ／　Ｂ　ｓ　ｕ　３６１フラグメントは、ベクターｐＳＫ、Ａの５ｐｈＩ及びＢ ｓｕ３６１部位へとサブクローニングされ、プラスミドｐＳＫ、Ａ１５’Ｋを得 た。ベクターｐｓＫ、Ａは、ｐＨ１ｕａｓｅｒｉｐｔのＫｐｎ工とＳａｃ　Ｉ部 位の間に挿入された合成ポリリンカー： を持ツｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−の修飾物である。

（ｐ４２−Ｌ２）プラスミドｐ　Ｋ　Ｊ　ｔ　ｋ　（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｘ、ｅ ｔ　ａｌ、　（＋９９１）　Ｃｓ１１６５：１１５３−１１６３）由来のマウス のホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）の遺伝子プロモーターにより起動され るヘルペスチミジンキナーゼ（Ｔｎ　ｄ　ＩＩＩフラグメントが、配列：５　／ 　ＡＧＣＴＧＧＭＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＴＴＧＧＧＧＭＣＧＣＣＧＧ　３　’。

を有するＨｉｎｄｍ／ＮｏｔＩアダプターを用いて、ｐＳＫ、Ａ１５°に＋７） ＥｃｏＲＩとＮＯｔ工部位に挿入された。その結果生じたプラスミド、ｐＳＫ、 Ａ１５’　Ｋ／ＴＫにおいて、ＴＫ遺伝子とカッパーの定常領域の遺伝子は、転 写方向は反対であるが、互いに隣接している。

ｐＭｃＩＮｅｏからの１．１ｋｂのＸ　ｈ　ｏ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨＩフラグメ ントは、ネオマイシンに対する抵抗性を表わす哺乳類の薬剤選択性マーカーを含 むが、プラスミドｐＳＫ、ＢのＸｈｏ　ＩとＢａｍＨＩ部位へとクローニングさ れ、プラスミドｐＳＫ、Ｂ／Ｎｅｏを得た。ベクターｐＳＫ、Ｂは、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔのＫｐｎＩとＳａｃ　Ｉ部位の間に挿入された合成ポリリンカー： を持ツｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−の修飾物である。

ｐＵｃ２１８７５．６カツパー由来の１．１ｋｂのＢ　ｇ　Ｉ　ＩＩ　／　Ｂ　 ａ　ｍ　ＨＩフラグメントは、カッパー領域ルカリンホスファターゼ処理ｐＳＫ 、Ｃベクターへとクローニングされ、（ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　１ｎｔｏ　Ｂａ ｍＨＩ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ、ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｔｒ ｅａｔｅｄ　ｐＳＫ、Ｃｖｅｃｔｏｒ、）ベクターｐＳＫ、Ｃは、ｐＢｌｕｅｓ ｅｒｉｐｔのＫｐｎｌと５ｓｅｒ部位の間に挿入された合成ポリリンカー：を持 ツｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−の修飾物である。その結果生じたプラスミ ド、りＳＫ、Ｃ／３’　Ｋは、プラスミドのポリリンカーにおいて、５ｓｅｒ部 位からＫｐｎＩ部位の方向へ転写が進行するように、配向される。

最後の標的プラスミドは、（Ａ）　ｐＳＫ、Ａ１５’に／ＴＫ由来の６．１ｋｂ のＮ　ｏ　ｔ　Ｉ　／　Ｎ　ｄ　ｅ　Ｉフラグメント、（Ｂ）ｐＳＫ、Ｂ／Ｎｅ ｏ由来の１．２ｋｂのＮ　ｄ　ｅ　Ｉ　／　Ｓ　ａ　ｃ　Ｉフラグメント、（Ｃ ）プラスミドｐＫ、ＴＫ／ｎｅｏを作るために連結されたｐＳＫ、Ｃ／３’　Ｋ 由来の１．０ｋｂのＳ　ａ　ｃ　Ｉ　／　Ｎ　ｏ　ｔ■フラグメントを用いた、 ３つの部分の連結で構成される。

Ｂ、ＥＳ細胞内のカッパー削除ベクターのエレクトロボレー／コン ｐＫ、ＴＫ／ｎｅｏ由来の精製プラスミドＤＮＡは、ＰＶｕ　Ｉで切断され、フ ェノール／クロロホルムとエタノールで沈澱させて、抽出された。ＤＮＡは、沈 澱後に、１０ｍＭ）リス−塩ａ　（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ）　、ｉｍＭ　ＥＤＴＡに て、１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌの濃度に再懸濁された。

一ニング（Ｈｏｏｐｅｒ、　ａｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２ ６：２９２−２９５）は、１５％の熱不活性化胎児牛血清、マウス白血病阻害因 子（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬからのＥＳＧＲＯｌｌｏｏＯＵ　／ｍＬ璽０．１ｍＭβ −メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ　／　ｍ　Ｌペニシリン を補充した、ｊ、５ｇ／Ｌグルコース含有Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＜　Ｊ、Ｒ，Ｈ，Ｂ ｉｏ、ｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、５％ＣＯＺ下、３７℃で培養された。

その細胞は、基本的には、（Ｋｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ（１９８ ９１５ｕｐｒａ）、の記載に従って、マイトマイシン処理初期胚の繊維芽細胞支 持層にて培養された。胚の繊維芽細胞は、β２−マイクログロブリンの同型接合 の標的突然変異を有する１４日口の胚から調製された（Ｋ。

１１ｅｒ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ　（＋９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８ ：１２２７−１２３０）。これらの支持細胞は、０４１８を含む培養基中で成長 することができる。

８０％の融合（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃＦ）で、ＥＳ細胞が、エレクトロポレーショ ンのためにトリプシン処理、簡単な遠心による濃縮、ＨＥＰＥＳ−バッファー塩 溶液で、２　Ｘ　１０７ｃｅｌｌｓ／　ｍ　Ｌに再懸濁することによって、調製 された。細胞は室温で平衡化され（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ）、添加された標 的ベクターＤＮＡ（２０μｇ）を線状化した。混合液は、バイオラット社のシー ンパルサー（Ｂｉｏｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）を用い、９６０μＦ、２ ５０Ｖでエレクトロボレートされた。１１胞は１０分間室温に放置されてから、 マイトマイシン処理繊維芽細胞支持（層）　（３Ｘ　１０６　ｆｅｅｄｅｒ　ｃ ｅｌｌｓ／　Ｐｌａｔｅ）のいれた４Ｘ１０ｃｍの皿の上に置いた。３７℃で４ ８時間のインキューベーションの後、細胞に、ネオマイシン抵抗性を選択するた めに、１５、Ｏμｇ／、ｍＬのＧ４１８含有培養基を与えた。更に４８時間後に 、チミジンキナーゼ遺伝子の欠失を選択するように、細胞には、１５０μｇ　／ 　ｍ、　Ｌの０４１８と２μＭのガンサイクロヴられた。

ｃ、ｍ的ＥＳ細胞の分析 ０４１８及びガンサイクロヴイア（ｇａｎｅｙｃｌｏｖｉｒ）を有する薬剤を選 択してから１０日後に、個々の生存しているコロニーが、取り出され、９６大プ レートにて１滴のトリプシンにより解離され、３２℃で２分間インキニーベート された。それぞれのコロニーからの細胞は、２４穴プレートに、マイトマイシン Ｃも理支持細胞及び０４１８含有選択的培養基を入れ、しかし、ガンサイクロヴ イア（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）は入れない、そのｌ穴に移された。それから５ −８日後に、夫々の穴の細胞の２０％が凍結され、残りは、ゲノムＤＮＡを調製 するために使用された。その細胞は、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）、１ ００ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、プロテイナーゼに自ｍ 　ｇ　／　ｍ　Ｌ　）の（混合溶液の）０．４ｍＬで、５０℃で一晩インキユベ ートすることにより、溶解された。ＤＮＡはフェノール抽出及びエタノール沈澱 により精製され、７０％エタノールで洗浄され、１０ｍＭトリス−塩酸とｌｔｎ Ｍ　ＥＤＴＡの２０μＬで再懸濁された。

サザン分析は、各サンプルのＢ　ｇ　Ｉ　１１切断ゲノムＤＮＡを用いて行なわ れた。標的ベクターの３′相同フラグメントに隣接している領域を含む、約１． ２ｋｂのＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｂ　ｇ　ｌ　ｍフラグメントは、プローブとし て利用された。自然のＥＳ細胞の遺伝子座は、約２゜３ｋｂのフラグメントを与 え、一方、標的ＥＳＩＩＩＩの遺伝子座は、約５．７ｋｂのフラグメントを与え た。

大きさの増加は、削除ベクターの構成期間における、Ｂｇｌ１１１部位の損失に よるものである。

１６６１ｉ１のクローンのサザン分析は、意図した突然変異体（１ｎｔｅｎｄｅ ｄ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）を持つ２積の細胞系列を示した。これらのクローンは、 ｎｅｏ遺伝子を有する（　５ｐｉｎｓ）約１．１ｋｂのフラグメントでフィルタ ーを再検索する（　ｒｅｐｒｏｂｉｎｇ）ことにより、更に分析された。予期し たように、プローブは、ターゲティング（ｔａｒｇｅｔｅｄ）対立遺伝子に対し てのみ、ハイブリダイゼーションした。２つの陽性クローン、１Ｌ２−８５０、 Ｉｎ２−９７２からのゲノムＤＮＡは、解凍され、増幅された後、初めの観察が 再確認された。三つ目のプローブ、カッパーＪ領域の遺伝子座を含んでいる約１ ．７ｋｂのＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ　／　Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩフラグメントは、標的 ベクターの５″末端からの正しい組込パターンをチェックするために使用された 。このプローブとＥｃｏＲＩで切断されたゲノムＤＮＡを用いたところ、約１５ ｋｂのフラグメントが、自然の対立遺伝子内に検出され、約５ｋｂのフラグメン トがターゲティングの遺伝子座から検出される。付加的なＥｃｏＲＩ部位が、標 的している相同的組換えの期間に、ｎｅｏ遺伝子により導入される（図７参照） 。

Ｄ、生殖系列のキメラの発生 修飾されていないＥ１４−１１１胞は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胞胚への注射の後に、 高い頻度で生殖系列に貢献することが分かった。ターゲティングされたカッパー 領域を含む、生殖系列のキメラを発生させるために、ターゲティング細胞系列Ｉ Ｌ２−８５０及びＩｎ２−９７２は、初期の支持細胞の上で成長させ、次にトリ プシン処理されてから、１５％胎児牛（ｃａｌｆ）血清、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ 　（ｐＨ７，３）、抗生物質、β−メルカプトエタノールが４加されたＤＭＥＭ を含む、注射の溶媒に再懸濁された。ＥＳ細胞は、各胞胚に注射され、次に、注 射された胞胚は、偏性妊娠のマウスの雌の子宮の角部の一つに移植された。キメ ラな子供は、キメラな皮の色により識別された。キメラな雄がＣ５７ＢＬ／６Ｊ の雌から生まれ、ｌ　２９　／　Ｏｌ　ａ誘導ＥＳｉｉｒ！の生殖系列の遺伝は 、子孫のアグーチの皮の色により検出された。

ＩＩｌ胞系列ＩＬ２−９７２から（その皮の色により判断したとき、約４０％の ９５℃胞が誘導された）１匹のキメラな雄は、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊの雌と交配され た場合、アグーチ子係の百分率により決められたとき、２５％の頻度で生殖系列 の遺伝を生じた。細胞系列１Ｌ２−８５０からの、キメラな雄、約４０％、７０ ％、９０％のキメラは、それぞれ、９０％、６３％、３３％の頻度で、生殖系列 の遺伝を生じた。Ｉｎ２−８５０由来の７０％キメラな雄から生じたアグーチ子 孫の間では、テストされた１２匹の中８匹のＦ１動物は、尾のサンプルから誘導 されたゲノムＤＮＡを用いた、サザン分析（プローブとして上記の、１．２ｋｂ のＢａ　ｍ　ＨＩ　／　Ｂ　ｇ　Ｉ　Ｈフラグメントを用いたＢｇｌＩＩ断片（ ｄｉｇｅｓｔ））により標的Ｃｋ突然変異に対するカッパー遺伝子座において、 異型接合体であることが分かった。更に、８匹のＦｌの動物のこのグループから 、Ｃｋ突然変異に対して、両方とも異型接合である、雄と雌を繁殖させると、サ ザン分析により確認されたように、この突然変異に対する同型接合であることが 分かる１匹の雄の子孫を生じた。

Ｅ、カッパー遺伝子座が標的にされたマウスから得られたＢ細胞の分析 軽鎖の定常領域（Ｃｋ）、結合置載（Ｊｋ）、或いはＣｋとＪｋの両方の欠失の 為に、もし、カッパー（に）の軽鎖の遺伝子座が不活性化されるなら、に−発現 Ｂ細胞の発達に完全なる阻害が生ずるはずである。完全なるＣｋの欠失（ΔＣｋ ）の一つのコピーを有するマウスの胚の幹細胞は、キメラなマウスを産生ずる為 に上述の記載に従い、マウスの胞経内へと導入された。こららのキメラなマウス は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６　（Ｂ６）マウスと交配（繁殖）され、尾のＤＮＡの サザンブロツティングにより、ΔＣｋ突然変異の存在を目的として、そのＦｌの 子孫が、分析された。ΔＣｋ突然変異を有するＦ１マウス同士が交配（Ｉｌ！殖 ）され、Ｆ２の子孫が、ΔＣｋに対して同様の分析がなされた。

５匹のＦ２子孫の１匹が、同型接合のＣｋ欠失を持つことがホされた。もう１匹 は、ΔＣｋと野生型Ｃｋ対立遺伝子を有する異型接合であった。３匹の他の子孫 は野生型であった。ｐａｎ−Ｂｌｉ胞マーカー（Ｂ２２０）又はに軽鎖と反応す る、蛍光抗体で染色された、抹消血のＢａ胞のフローサイトメトリック分析によ り、に−陽性Ｂ細胞の存在或いは非存在が、分析された。同型接合のΔＣｋＦ２ マウスに関し、に−陽性Ｂ１１胞は検出されなかった。ｊＩ型接合においては、 野生型対立遺伝子及び非機能的ΔＣｋ対立遺伝子の存在と一致する、に−陽性Ｂ 細胞の頻度は、減少した。これらの結果は、染色体からのＣｋの欠失が、マウス のＢ細胞による、にの発現を阻害することを立証した。

実施例■ マ　ロ　“　′　バ　− 雫。

一一一１ ターゲティングベクターは、カッパ一部位の定常領域及びＪ領域をまず削除し、 それを定常領域をフランクする相同領域を用いた相同組換えにより、３つの要素 と置換える置換型ベクターとしてデザインされた（図８）。

相同の一方又は両方の領域をフランクするジフテリアトキシン遺伝子（Ａｌｌ） は、いくつかのケースにおいて、ネガティブ選別マーカーとして含有された。こ の３つの要素は、０４１８菓剤抵抗マーカー、Ｊ領域の上流に位置するカッパ一 部位の領域と相同なマウスＤＮＡの、付加的なりＮＡ相同（ＡＤＨ）シーケンス 、及びチミジンキナーゼ遺伝子から成る。ベクターにこのＡＤＨシーケンスが含 まれる結果、この最初のターゲティングは当該部位にＡＤＨの第２コピーをブレ イスする。この複製は、次いで断片間でシーケンスを選別圧力を印加して所定の （目的とする）シーケンスの削除を行うことに用いられた。この場合、細胞は、 ガンサイクロヴイルｆｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）選別に生残るため２つの断片間 にあるチミジンキナーゼ遺伝子を削除する。

、　′　−ぺ　。

実施例ｍで述べた如く、相同の領域は、２つのプローブを用いてスクリーンした １２９マウス胎児肝臓ゲノムライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から導出され た。このサックローンは、Ｊｌｌｌ域、イントロンエンノＡンサー要素及びカン バーＬ鎖部位の定常領域を含んで塾また。第２のブロー１は、Ｊ領域の２．８ｋ ｂ上流にある、０．８Ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片　（Ｖａｎ　Ｎｅ５ｓ　ａｔ　ａｌ 、（１９８１１，ｃｉＬＬ　Ｌｌ＝　５９３−６０２）であった、このプローブ に陽性のラムダクローンからのファージＤＮＡは、このプローブが５．５ｋｂ　 ５ａｃｌ断片にハイブリッド化されたことを示し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｓ ｃ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の５ａｃｌサイトへとサブクローンされてプラス ミドｐｓ１５’カッパーを与えた（図８）。

相同５′領域、チミジンキナーゼ遺伝子、ＡＤＨ１抗ネオマイシン遺伝子及びジ フテリアトキシン遺伝子により場合によりフランクされた相同３°領域（図９） を含む不活性化ベクターは、３つのプラスミド（図８）から成っていた。これら のプラスミドとは、（＆）ネガティブ選別マーカーとしての、マウスのホスホグ リセレート・キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモータにより駆動されるジフテリア ・トキシン遺伝子（ＤＴ）を有する又は有しない相同５′断片、（ｂｌｐＮｃＩ Ｎｅｏ　（丁ｈｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｃａｐｅｃｃｈｉ　（１９１１７Ｌ　Ｃ−巳 」Ｌ」、　５１：５０３−１２）からのＤＳＨ及び０４１８選別性ネオマイシン （ｎｅｏ）遺伝子と共に、ネガティブ選別マーカーとしてのマウスのホスホグリ セレート・キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）プロモータにより駆動されるヘルブスチミ ジンキサーゼ遺伝子いｋ）、及び （ｃｌＤ　Ｔ遺伝子により駆動されるＰＧＫを有しなＬ％相同３′断片、である 、これらの３つのプラスミド（図８）は、いずれも、ポリリンカー（ｐｏｌｙｌ ｉｎｋｅｒ）の変異によるプラスミド　ｐＢｌｕｅｓｃｒＬｐｔ　Ｓｔ−から導 出されたｐｓＫ、Ａ、　ｐｓｌＢ及び　ｐｓｔ、ｃから成る。

プラスミド　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ−のポリリンカーは、Ｋｐｎｌ　と 　ＳａＣ＋サイトの間でクローニングにより変異され、このポリリンカーは、下 記のオリゴヌクレオチドにより規定される。即ちニ プラスミド　ｐｓｉ、＾をつくるため ＧＣＡＴＡＴＧＣＣＴＧＡＧＧＧＴＡＡＧＣＡＴＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴＣ ＴＡプラスミド　ｐＳＫ、８をつくるため プラスミド　ｐＳＫ、Ｂをつくるため ＡＡＧＣＴＴＡＴＡＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＡ ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴ−：ｌＩ、及び プラスミド　ｐｓＫ、ｃをつくるため ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＴ ＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧ　ＴＡＣ−３／である。

ジフテリアトキシン遺伝子カセットがつくられ、遺伝子はＰＧＫプロモーターと 中成長ホルモン・ポリアゾニレ−ジョン・シグナルによってフランクされた（ｌ ｌｏｙｅｈｉｋ　ＬＬ」」、　（１９８４１，’、ト、し−」」：３９４４−３ ９４８；　Ｐｆａｒｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、　ＬＬＬｊ：１１５−１ ２２１．　ｐＴ）１−１　由来の２．３１ｂのＸｂａｌ／ＥｃｏＲＩ断片（Ｍａ ｚｙｅｌｌ　ＬＬＪＬｌ、　（１９８６）、　：　４６６０−４６６４１゜（上 記断片は、ヒトメタロチオネイン（ｈＭ丁ＩＩ）プロモータにより駆動されるジ フテリアトキシンＡｌｌを含む）が、Ｘｂａｌ及び　ＥｃｏＲＩにより切断され た　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−へとクローンされ、プラスミド　ｐｓｌＤＴ を与えた。

ｐＳＫ、ＤＴの　ｈＭＴＩ＋プロモータは、ｐＫＪＩ由来のＰＧＫプロモータに より置換えられた（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｅｚ　艷１−」」、　（＋９９１）、　ｃ ＬＬＬＬ、　Ｌｌ：Ｉ＋５３−１１６３１．　ｐＫＪｌ　由来ノ０．５ｋｂ　ｘ ｂａｌ／Ｐｓｔｌ断片が、ｐＳＫ、ＤＴかもの３．１ｋｂ　Ｘｂａｌ／Ｎｃｏｌ 断片とオリゴヌクレオチド ５°−ＧＧＧＡＡＧＣＣＧＣＣＧＣ−３°及ヒ５’　−ＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧ ＣＴＴＣＣＣ丁ＧＣ＾−３＋ を用いて形成された　Ｐｓｔｌ／Ｎｃａｌアダプターを用いて結合され、プラス ミド　ｐｓｌｐｇｋＤ丁を与えた。オリゴヌクレオチドブライマー ５’　−ＣＡＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧ−３’　及Ｕ 　５’　−ＣＴＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＣＡＣ，ＣＧＣ＾ −３′を用いて生還壬子ＤＮＡのＰＣＲ増幅により得られた、中成長ホルモン・ ポリアゾニレ−ジョン・シグナルを含む、２４８ｂｐ断片がクローンされて　ｐ ｃＲｌｏｏｏ　（Ｉｎｖｉｔｒ。

ｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ＾）にされた、ポリアゾニレ−ジ ョンシーケンスは次いでＩ（ｉｎｄ　ｍ　／Ｐｖｕ１１断片としてのＤＴ遺伝子 の後ろでＨｉｎｄ　ｍ及び０ｐａｌで切断されたｐＳＫ、ｐｇｋＤＴへとクロー ンされて、プラスミドｐｓｌｐｇｋＤＴｂｏｖＧｔｌを得た。ｐｓＫ、ｐｇｋＤ ＴｂｏｖＧＨからのＤＴＪ伝子壬子ットは、２．］ｋｂのＥｃｏＲＩ／１ｌｉｎ ｄｌｌ＋断片として、オリゴヌレオチド ５°−ＡＧＣＴＧＧＡＡＣＣＣＣＴＴＧＣ−３’　及ｔＦ　５’　−ＧＧＣＣＧ ＣＡＡＧＧＧＧ丁ＴＣＣ−３パ から形成されたＨｉｎｄｌｌＩ　／ＮｏｔＩアダプターを用いて、移動され、フ ラスミトｐＳＫ、Ａ／ＤＴヲｆｌ＋　タ。ＰｓＫ、Ａ及ｔＦ　ｐｓＫ、Ａ７Ｄ丁 の双方のｓｐｈ　ＩとＢｓｕ３６１サイトの間でカッパ一部位の相同５″領域が クローンされた。この目的のため、４、Ｏｋｂ　５ｐｈｌ／Ｂ＋ｕ　３６１断片 （これは、部分的Ｂｓｕ３６＋　（ダイジェストに続くプラスミド・サブクロー ンｐＵｃ２１８１５．６カツパーの完全Ｓｐｈ＋ダインエストによって得られる ）が、ｐ！１．Ａ又はｐＳＫ、＾／ＤＴと結付（リゲート　ｌｉｇａｔａ）され 、夫々フ−ｙ　７．　ミ）’　ｐＳＫ、Ａ１５°に及ｔＦ　ｐｓＫ、Ａ／ＤＴ１ ５’Ｋを得る。プラスミドｐＳＫ、＾／ＤＴ１５°に内では、ＤＴ遺伝子の５′ −末端とカッパー断片は、互いに逆向きの転写配向をとって隣接していた。

プラスミドｐＫＪｔｋ（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚ　ＥＬ」ユ、　（１９９１）、　 ｃｉＵＵＬ！＋　１１５３−１１６３１からのＰＧＫｔｋｉｌｌ伝子はｐｓＫ、 壬子ユニークＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌ＋サイトの間で、２．７ｋｂのＥｃａ Ｒ４／Ｈｉｎｄｒ［Ｉとしてクローンされ、ｐＳＫ、Ｂ／ＴＫを得る。ＡＤＨの ために用いた０、８ｋｂ　ＥｃｏＲ＋断片が、ｐｓＫ、５′カツパーかもクロー ンされ、ｐＳＫ、Ｂ／ＴＫのＥｃｏＲＩサイトへとリゲートされ、ｐＳＫ、Ｂ／ （ＴＫｌｏ、８Ｋ　）を得、ｔｋ遺伝子とカッパー断片の５゛−末端は互いに逆 向きの転写配向をとって隣接していた。　ｐＭｃｌＮｅｏからの１．ｌｋｂのｎ ｅｏ遺伝子は、ｐＳＫ、Ｂ／（ＴＫｌｏ、８Ｋ）の同じ座の間で、Ｘｈｏｌ／Ｂ ａｍＨＩ断片としてクローンされて、ｐｓＫ、Ｂ／（ＴＫｌｏ、８に／Ｎｅｏｌ を得る。

相同３”断片を含むプラスミドｐＳＫ、Ｃ／３’　Ｋは、Ｂａ＠）ＩＴで切断さ れたｐＳＫ、Ｃによりリゲートして構成され、アルカリ性ホスファターゼで処理 して、ｐＵｃ２１８１５．６カツパーから単離された１、ｌｋｂのＢｇｌｌｌ／ Ｂａ＋ｍ１（ｒ断片を得る。　ｐＳＫ、Ｃ／３’に内で、カッパー断片は、転写 がプラスミド・ポリリンカーにおいてＳａｃ　＋からＫｐｎｌサイトの方へ向っ て進行するように配向されていた。ｐＳＫ、　ｐｇｋＤＴｂｏｖＧＨからの２． １ｋｂ　ＤＴカセットは、ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌ断片としてｐＳＫ、Ｃの 同じ座位へとクローンされ、ｐｓＫ、ｃ／３’　Ｋ／ＤＴを得た。

三部分リゲーションを行い最終ターゲティングプラスミド（図９）を得た。ｐＳ Ｋ　、Ａ１５°に由来の４．Ｏｋｂ　Ｎｏｔｌ／Ｎｄｅ　Ｉ断片、ｐＳＫ、ｂ／ （ＴＫｌｏ、８に／Ｎｅｏ）（プラスミドの５ａｃｌパーシャル切断次いでＮｄ ｅｌ切断によって得られた）由来の４．８ｋｂ　Ｎｄｅｌ／５ａｃｌ断片、及び ｐＳＫ、Ｃ／３°に由来の４．Ｏｋｂの５ａｃｌ／Ｎｏｔｌ断片が単離され互い にリゲートされ、ｐＫ。

ＤＴ（ＴＫｌｏ、８に／Ｎｅｏｌを得る＋ｐｓｉ、＾／ＤＴ１５°に由来の６． Ｉｋｂ　Ｎｏｔｌ／Ｎｄｅｌ断片、ｐＳＫ、Ｂ／（ＴＫｌｏ、８に／Ｎｅｏ）由 来の４．８ｋｂのＮｄｅｌ／Ｓａｃ＋断片、及びｐＳＫ、ｃ／３’　Ｋ／ＤＴ（ プラスミドのＳａｃ＋パーシャル切断により、次いでＮｄｅＩ切断によって得ら れた）由来の６．Ｉｋｂの５ａｃｌ／Ｎｏｔｌ断片が単離され互いにリゲートさ れてｐＫ、ＤＴ／（ＴＫｌｏ、８に／Ｎｅｏ）／ＤＴを得た。電気穿孔法のため 、精製されたプラスミドＤＮＡはまずｐｖｕＩ又は＾ｐａＬＩで切断され、次い でフェノール／クロロフォルムによって抽出され、エタノール−加により沈降さ せた後遠心分離を施した。結果上じたＤＮＡベレットはｌ０５ＭのＴｒｉｓ−Ｈ ＣＩ、ＩｓＭ　ＥＤＴ＾（ＴＥＩ溶液中にＩＢ／ｍｌの濃度で再！！濁され９た 。

ヘ　ヘ 胚性幹細胞ＭＥＩ４−ｊを実施例■のように培養した。

細胞は、室温で平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）Ｌ、ｐｖｕＩ　（既述）で線 状化したＤ　Ｎ　Ａ　（２０μｇ）を４加した。この混合物に実施例■のように 、電気穿孔法を施した。

−一１＋ Ｇ４１８による薬剤選別を７〜１０日行った後、各生存コロニーを取出し、実施 例■のようにトリプシン液滴中に解離させた。

サザン分析を、各サンプルからのＢｇ■切断したゲノムＤＮＡを用いて行った。

ネイティブＥＳＩＩ胞部位からは、２．３ｋｂの断片が検出され、ターゲテイン グ処理したＥＳ細胞の座からはより大きな４．９ｋｂの断片が検出された。（こ の検出には、ターゲテイングベクタ内の３′相同のために用いられた断片と隣接 のオリジナルファージ（ｐｈａｇｅ）Ｄ　Ｎ　Ａから単離された１、２ｋｂのＢ ａｇ）１１／Ｂｇｌ■をプローブとして用いた。）断片は寸法が増大したが、そ れはＢｇｌｌｒ／Ｂａ論Ｈ１断片中のＢｇｌＩＩサイトがターゲティングブラス ミド内で、リゲーションにおいてＢａ５ａｌサイトへの８ｇｌｌｌサイトの結合 の結果、欠失し、そして、チミジンキナーゼ遺伝子内にあった新しいＢｇＩＩＩ 座が、標的座へ導入された結果である。

サザン分析による上述の選別から、即ち、３つの興ったターゲテイングプラスミ ドを用いた実験により導かれた全部で１０３クローンのスクリーンから目的とす る突然変異を有する５つの細胞系が確認された（表１）表　１ ＥＩ４−１でのＣｋＩＪＩターゲティング結果解きほぐしくｔｈａｗｅｄ）伸長 させた後陽性クローン（クローン６２５，６０４．６目、６５３）の４つからつ くられたゲノムＤＮＡの追加分析によれば、最初の結果が再確認された。第２プ ローブ、カッパ一部位のＪ領域に亘りて存在する１、７ｋｂのＨｉｎｄＤＩ　／ Ｂｇｌ　１１断片を用い、ターゲティングベクタの５′末端における相同ターゲ ティングを観察して正しいインテグレーションパターンがチェックされた。かく て、このプローブをゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断片と共に用いることにより、 未修飾の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）かも１５ｋｂの断片が検出された。これに 対し、ターゲティングした対立遺伝子からは、７．ＩＩｋｂの断片が、相同イン テグレーションの間にチミジンキナーゼ遺伝子への新しいＥｃｏＲＩサイトの導 入の結果として、観察された（図１１）。

、　＋　１　−０．１ 相同時にターゲティングしたカッパ一部位から所望の削除を行うため、クローン ６５３からの細胞をフィーダーｍ胞の上に、０．５−１ｘｌＯ”七ｋ　／　ＩＯ ｃａｌｍ　ノ濃度でガンサイクロヴイル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）２　μＭ及 び０４１８０５０μｇ／醜ｌ）の栗剤併存下に、プレートした。前記両栗剤併存 下で５日間の生長の後、クローンを既述のように２４個のウェルプレートに取出 し、０４１８のみの単独選別下に生長させた。さらに５−８日の後、各ウェルの 細胞の各２０％を凍結し、残部は既述の如くゲノムＤＮＡを調製するのに用いた 。

各サンプルからのＢａｍＨｒ切断したゲノムＤＮＡを用いて、サザン分析を行っ た。

ターゲティングベクターにおいてＡＤＨとして用いた０、８ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断 片をプローブとして用いて、ネイティブなＥＳセル部位からは！２．７ｋｂの断 片が検出された。

これに対し、クローン６５３かものＤＮＡを用いての定常領域をターゲティング したＥＳセル部位（図１１）からは、より大きな１５．８ｋｂ断片が検出された 。断片の寸法は、ｔｋジーン、ＡＤＨ，及びｎｅｏジーンを、１２．７ｋｂのＢ ａ−ＩＩＩ断片へ挿入したことにより増大した。また、ｎｅｏジーンの３′末端 に導入された新しい１ａｓＨＩサイトがあった。制限マツプの分析により予見さ れた通り、Ｊ／定常ｌ＋域を削除したセルからのＤＮＡを用いる、非標的（ｕｎ ｔａｒｇｅｔｅｄｌ対立遺伝子からの１２．７ｋｂ断片に加えて、修飾（変性） 部位からは５．５ｋｂ断片が検出された。

プレートされた１、５Ｘ１０’ＥＳセル（クローン６５３）からつくられた２つ のクローンのサザン分析による選別により、一つの細胞系（クローン６５川が目 的としたＪ及び定常各領域（「Ｊ／定常領域」という）の削除を有することが確 認された。

ｔｈａｗｅｄ及び伸長されたクローン６５３ＢからつくられたゲノムＤＮＡの更 なる分析により、上記最初の観察が再ＶＩｌｕされた。　０．８ｋｂ　ＥｃｏＲ Ｉ断片を用い、この切断は、他の２つの制限ダイジェスト（ｄｉｇｅｓｔｓ）で チェックされたくこれらのダイジェストはターゲティングベクターの５”及び３ °末端で切除される領域（ｅｘｃｉｓｅｄｒｅ山ｎ）の外側を切断するべきもの である）ｅかくて。

非切除クローン６５３からのゲノムＤＮＡのＢｇｍダイジェストにより、このプ ローブを用いて、非修飾及び修飾の両方の対立遺伝子から、２．６ｋｂ断片が検 出された。

これに対しターゲティング対立遺伝子のみからは付加的に４．９ｋｂの断片が検 出された（図１１）、この４．９ｋｂ断片は、前に用いた１、２ｋｂ　Ｂａｍ１ ｌｌ　／ＢｇｌＩＩにより検出されたものと同じものであった。クローン６５３ ＢからのＤＮＡを用いての１ｇｌＩｒダイジェストは、５．８ｋｂ断片を、非修 飾対立遺伝子からの２．６ｋｂ断片に加えて、明らかにした。　０．８ｋｂ　Ｅ ｃｏＲＩ断片でプローブされたクローン６５３Ｄ　Ｎ　Ａの５ａＣ１ダイジエス トは、５．５ｋｂ断片を非修飾及び修飾両方の対立遺伝子から、そして３．１ｋ ｂ断片をターゲティングした対立遺伝子のみから、示したＣ図１１）、この５． ５ｋｂ断片は、クローン６５３ＢからのＤＮＡ中にも、付加的な２．０ｋｂ断片 と共に検出された。これらノ５．８ｋｂ断片と２．０ｋｂ　５ｃａｌ断片ハ、Ｊ 　ＩＩ　ｔ４　、　ｔｋシーン及びＡＤＨの一つのコピーを含めてＩＯ，３ｋｂ のＤＮＡを削除した。

精密な切除ステップのための、予見された制限マツプの分析結果と一致した。

ｕコＬ」二ｘ−ト１Ｌ１」Ｌ工ＬＬ■１１１Ｌ■」非修飾Ｅ１４−１セルは、Ｃ ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞への注入後高い開度で生殖系に寄与した。ターゲティング ＥＳ細胞系６９１からのセルは、唯一カッバ一定常領域がネガティブ選別によら ずに相同組換えによって削除されているが、上記セルを微量注入（謹１ｃｒｏｉ ｎｊｅｃｔ）して、実施例Ｉｎに記載した如く、キメラ動物がつくられた。ター ゲティングしたＥＳ細胞系６５３Ｂ　（カッパ一定常／Ｊ各領域が削除されてい る）からのセルを、同様に微量注入して、以下同様にしてキメラ動物をつくった 。キメラｐｕｐｓはキメラコート（ｃｏａｔｌの色により確認される。生殖系ト ランスミッション（ｇｅｒｓｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ即ち修飾ＥＳ セルの由来の生殖細胞を有すること）は、Ｆ１オフスプリングのアグーチコート 色によって検出される。

実施例Ｖ Ａ　い−ロ一二ゝ ヒトＨＩｔ　ＶＨｌ６−Ｄ−Ｊ−ＣμｍＣａ　ＩＩ域に亘る（ｓｐａｎ）Ｓｐｅ ＋断片（Ｂｅｒｍａｎ　ＬＬｉｌ、　（１９８８）　ＥＪＪＬｕ−ノ、　７：ｐ ７２？−７３８；図１５参照）をヒトＹＡＣライブラリ（Ｂｕｒｋｅ、　ＬＬｉ Ｌ、＋」ｄｕ」、　Ｌ３Ｊ：　ｐ８０６−８１２１から、Ｂｅｒｓａｎ　ＬＬＪ Ｉ　＋１９８８）ＥＪＪ−Ω−Ｊ＝Ｊ：Ｐ７２７−７３８に記載のＤＮＡプロー ブを用いて、単離する。約１００ｋｂと評価される一つのクローンが得られる。

単離ＹＡＣクローンは、パルスフィールドゲル電気泳動（Ｂ　ｕ　ｒ　ｋ　ＬＬ ＪＬｌ、上掲書：　Ｂｒｏｗｎｓｔｅｌｎ　ＬＬＪｄ＋　Ｌｃｉｔｎ（ｌニー、 ｇＪＪ：　Ｐ１３４８−１３５１）により、ヒトＨ頗のための放射性同位体ラベ ルしたプローブ（Ｂ　ｅ　ｒ　ｍ　ａ　ｎ　ＬＬＪＬ１＋　上掲書）を用いて、 特性付けられる。

ロー・　しへ 高い分子量のＤＮＡを、対象とするＹＡＣ（即ちＩｇＨ部位からの前託の５ｐｅ ｌ断片を含むＹＡＣ）を含む酵母セルから、寒天プラグ中にて調製する。このＤ ＮＡをＣＩＩＥＦゲル装置寸法（長さ）について分画し、低融点のアガロースゲ ルから切出す。ゲル断片は、ポリアミンにより平衡化し１次いで溶融し、アガロ ースをアガラーゼで切断処理する０次いでポリアミンコートしたＤＮＡを受精し た（ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ）マウス胚の雄の前核中へ注入し、この胚は外科的に 擬受胎雌の子宮へ、上述の如く、導入する。新生代のトランジェニックな性質は 、尾から単離したＤＮＡのスロット−プロットにより分析し、ヒトＨｖＡの生成 を、少量の血清をとり、ラビットの抗ヒト抗体でＩｇ鎖の存在をテストすること により分析する。

徴置注入法に対する別法として、ＹＡＣＤＮＡをマウスのＥＳセル内にＥＳセル 　酵母原形質融合によって導入する　（Ｔｒａｖｅｒ　ＬＬＬＬ、　（１９８９ ）　’　。

、ＵＳＡ、　８６；Ｐ５８９１１−５９０２；　Ｐａｃｈｎｉｓ　ＬＬ」」、、 　（＋９９０１．　同Ｊｉ　Ｐ５１０９−５１１３）　、第１に、ＰＭＣＩＮｅ ｏ、１ｐ１７又は他のホ乳動物選択性マーカーと酵母選択性マーカーをプラスミ ド内のノンエッセンンヤルなＹＡＣベクターシーケンス中へ挿入する。この構成 物は、ＩｇＨＹＡＣを含有する酵母株を形質転換するのに用いられ、ｐＭｃｌＮ ｅｏ　（又は他の選択性マーカー）が相同組換えによりＩｇＨＹＡＣのベクター シーケンス中へと組込まれる。修飾されたＹＡＣは、次に、プロトプラスト融合 法（Ｔｒａｖｅｒ　ｌ」１、、　（１９８９１；　Ｐａｃｈｎｉｓ　匝１．．　 ＋９９’ｏ）によりＥＳセル内に導入され、生成する抗Ｇ４１８−ＥＳセル（又 は他の選択性フェノタイプ）（これは完全艦ヒトＩｇＨシーケンスを含む）がキ メラマウスの生殖に用いられる。他の方法どして、ｊｌｌ製ＹＡＣを、例えば、 リポソーム法（１ｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）又はリン酸カルシウム（媒介ＤＮＡ導 入）法によって、ＥＳセルへ導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）する。

犬ｍ −マ　ヘ ヒ　ゝ゛−ゝ　ロ一二１ Ｖ　−８−・ ロー５　、 ワシントン大学ヒトＹＡＣライブラリ（ｌｌａｓｈｉｎｇｔｏｎ　０ｎｉｖ、　 Ｓｔ、、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）からのＤＮＡプールをスクリーンすルタメ、ヒ トＶＩＩ６シー　ン（Ｖ６Ａ＝５’　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＧＣＴＧＡＡ　 ＴＴＣＴＧＧ　ＣＴＧ　３’　トＶ６Ｂ＝５°ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣＡＧＣＣ ＧＴＧＴＣＣＴＧ　Ｇ　３’）を用いた。次いで陽性プールはコロニー融合によ りスクリーンされ、一つの陽性マイクロタイタープレートウェル、Ａ２８７−Ｃ ＩＯが同定された。　２０５ｋｂ及１１２１５ｋｂ＋７）、　２　つノ異ツタ長 さの、ＶＨ６−含有ＹＡＣが、微量滴定（５ｉｃｒｏｔｉ、ｔｅｒ）ウェルから 単離された。　ＶＨｌ６に加え、この２つのｒｇＨＹＡＣｓの中の小さい方、Ａ ２ｇ？−Ｃ１Ｏ（２０５ｋｂ）は、下記のシーケンスのためのプローブへと聯合 された：デルタ、　ｓｕ、　ＪＨ，Ｄ、　ＶＨＩ、　ＶＨ２及ｔＦＶＨ４、一方 上記２つのＩｇ）ｌ　ＹＡＣｓの中の大きな方、＾２８７−Ｃ１Ｏ（２１５ｋｂ ｌ、デルタ、ＪＨ，Ｄ、　ＶＨＩ、　ＶＨ２及ヒＶＨ４ノブロープへと融合され たが、りは除く、このＹＡＣｓは、少なくとも５ＶＨジーンからのシーケンスを 含み、これらのジーンとは、２つのＶＨｌ、一つのＶＨ２、一つのＶＨ４及び一 つのＶＨ６のジーンであっ、た、制限ダイジェスト結果の分析により、　２０５ に、ｂ　ＹＡ、ｆ：はＤジーンクラスタ−のいくつか（しかし全てではなく）を 除去し、当該ＹＡＣの残余は完全な形と見受けられ、生殖系の形（ｇ＠ｒｍｌｉ ｎｅ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に現われる。　２０５ｋｂ　ＹＡＣの　Ｐ ＣＲ及び詳細な制限ダイジェスト分析は幾つか（５ｅｖｅｒａｌ）の異ったＤシ ーンファミリーメンバーの存在を示した。

２１Ｓｋｂ　ＹＡＣは、完全なメイジャーＤシーンクラスタを含むように見受け られるが、ｍｕジーンの除去する（約１Ｏｋｂの）欠失を有した。この欠失（ｄ ｅｌｅｔｉｏｎ）はＪＨ及び−Ｕのジーンの間に位置するＪＨクラスタ又はエン ハンサには影響しないように見受けられる。

上述の２つの関連するＩｇＨＹＡＣｓの推定光の親（ｐｒ。

ｇｅｎｉｔｏｒ）−即ちｖＨｚジーンとデルタジーンの間の全てのゲノム領域を 含む２２５−２３０ｋｂのＹＡＣ（５ｈｉｎ　ａｔ　ａｌ、、　１９９＋、前掲 ）（図１５参照）は、＾２８７−ＣＩＧ微量滴定ウェル内には確認されなかった 。かくて、ｍｌＩ　ＹＡＣを、ライブラリの継代（ｐａｓｓａｇｉｎｇ）の間に それが喪失されたとの仮定の下に親ＹＡＣのサーチを行うために、＾２８７−Ｃ ＩＧ微量滴定プレートウェルの早い方の一分が調べられた。＾２８７−ＣＩＯの 微量滴定ウェルは、−線接種（ｗａｇｈｉｎｇｔｏｎ　Ｌｌｎｉｖ、、　Ｓｔ、 　Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）され、分析したＩＯクローン中の２つが、他の明らかに 無関係のＹＡＣと共に２３０ｋｂのＩｇｌ（ＹＡＣを含んでいた。クローン１は ＩｇＨＹＡＣに加え、約２２０ｋｂのＹＡＣを含み、クローン３はさらに約４０ ０ｋｂのＹＡＣを含んでいた。このＩｇＨＹＡＣは−Ｕ、完全なりプロフィル（ ＢａｍＨＩ切断に基づく、下掲参照）及びＪｌｌを含んでいた。クローン１から のＩｇＨＹＡＣは減数分裂分離により、　Ａ２ｇ？−ＣＩＯ／ＡＢ１３８０及び ＹＰＨ８５７（遺伝子型＝阿ａＴａ　ＬＩＬＩＪ　ＬＬＪＪ　ＬＬＬＬ３　ｕム ｉｌｌ　ＣｊＪＬｌ　ｈｉｍ、ｌ　Ｌｔｕｊ　出２）のクロスにおいて物理的に 分離して、＾２ｇ？−ＣＩＯ（２３０ｋｂｌ／ＭＰ３１３１得り、（ホス）ＩＩ 伝壬子　＝ＭＡＴａ　ＬｉＬ２１ＬＪＬ２ＬＬＪ２ｈｉＬ１１■ｕ江坦ａ■はＥ 上２　、　−　ホ　マ　−− ９，１〜 ＹＡＣ右アームターゲティングヘクター　ｐＬＵＴＯ（１５，６ｋｂ）が、　６ ．Ｉｋｂ　ｌａｍＨＩ断片（Ｒａ１ｄ　ＬＬＪＬＩ−。

Ｊ：　Ｐ４２９９−４３０３　（＋９９０１）上において含まれるヒトＨＰＲＴ ミニジーンをｐｒ、ｕｓのポリリンカー内のＢａｍＨＩサイ　ト　（Ｈｅｒ禦ａ ｎｓｏｎ　ＬＬＪＬｌｌｌｌ「紅ｉ　ｋｌ：　Ｐ４９４３−４９３８（＋９９１ １）へとサブクローニングすることによって生成された。　２３０ｋｂ　［にＨ ＹＡＣ及びｊｌｌ［５１Ｑｌｉ　ＹＡＣ）ｉｌ　方ｔ　含ｔｊ　Ａ２ｇ？−ＣＩ Ｏ／ＡＢＩ３８０カルチャーが線状化したｐｔ、ｕｔｏと共にトランスフオーム され、Ｌｙｇ＋トランスフォーマントが選別された。　Ｌｙｓ＋クローンは、■ Ｕの存在チェックのためコロニー融合によりスクリーンされた。一つのクローン が同定され、それは単一　ＹＡＣ（約２４５ｋｂ）を含み、−ＵのプローブＨＰ Ｒ丁及び１．ＬＬＺへと融合された。

ｐＬＩＩＴ（１’　ターゲテイングシタ２３０ｋｂ＋７）　Ａ２８７−ＣＩＯＹ ＡＣ１７）サザン分析が、クローンされたヒトＩｇＨシーケンスの完全な、再組 換されていない（ｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）性質を立証するための様々なプロ ーブを用いて、行われた。

大部分のケースにおいて、Ｂａ５ＨＩ、　Ｈｉｎｄｎｌ及びΣｃｏＲＩ切断の結 果が１１１３８　（ヒト胚のｆｅｔａｌ肺−由来のセル系ＰＩ統）　、　Ａ２８ ７−ＣＩＯ由来の２０５ｋｂ及び２１５ｋｂ欠失誘尋体、並びに公表された値に 対する制限データと比較された。

ＤＩｌｌ域プローブ（０，４５Ｎｃｏｌ／Ｐｓｔｒ断片；　Ｂ＠ｒｎａｌ　ｅｔ 　ａｌ、。

１９ｇ＋１）による融合により決定されたダイノル−シティ（Ｄ）シーンプロフ ィルは予期された４つのＤシーンセグメントＤＩ　〜Ｄ４　（Ｓｉｅｂｅｎｌｉ ｓｔ　ｅｔ　１１．、　＋９８１ｉ　ｍＪｉＬ；　Ｐ６３１−６３５）を示した ０例えばｌ１ａｓＨ［によ）て、３．１ｌｋｂ、　４．５ｋｂ、　６．９　ｋｂ 及び７．８ｋｂの４つの制限断片が＾２８７−ＣＩＯ及び　１１１３ｇに認めら れた。　１１１１３８は、さらにもう一つの大きなバンドで染色体１６　Ｄ５領 域から由来すると推定されるものをもって１１な（Ｎａｔｓｕｄｉ　ａｔ　ａｌ 、　１９８ｇ、　ＥＪｌ［７：Ｐ４Ｏ１０−１０５１）　、　Ｄファミリーに特 異的なファミリー及びプローブによるＰｃｔ及びサザン分析は、２１５ｋｂ削除 −誘導ＹＡＣ（これは２３０ｋｂ　ＹＡＩ：と同じ１［＜ターンの完全なりｍｌ Ｉ域を壱つように見えた）内に、ＴｅのＤシーンファミリーの各々の２〜４個の 存在を証した：　ＤＭ、　ＤＮ、　ＤＫ、　ＯＡ、　ＤＸＰ及ｔＦＤＬＲ，Ａ２ ｇ？−ＣＩｏ　２３０ｋｂＹＡＣ（プライマー　ＥｎＡ＝５°ＴＴＣＣＧＧ　Ｃ ＣＣＣＧＡ　ＴＯＣＧＯＧＡＣτＧＣ３°　とＥｎＢｌ＝５’　ＣＣＴ　ＣＴＣ ＣＣＴ　ＡＡＧ　ＡＣτ３’）由来のクローニングされたＰＣＲ産生物からシー ケンスされ完全であると確認された、Ｊ−霞Ｕイントロンエンハンサ−も、４８ ０ｂｐ　ＰＣＲ産生物によりプローブされたとき、ｌａｍＨＩ、　ＥｃｏＲＩ、 及びＨｉｎｄＩｎで汎そ予測された各寸法の単一制限断片を生成した。　ＪＨ領 領域、Ｄ　Ｈ’Ｑ　５２及び全ＪＨ領域に亘る約６ｋｂの！ｌａｍＨＩ／Ｈｉｎ ｄｌｎ断片プローブで評価された（　Ｒａｖｅｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　１９８１ ．　江比上；　ｐ５８３−５９１）　−Ａ２８７−ＣＩＯは汎そ予測して各寸法 の制限断片を生じた。

さらに、同一寸法の制限断片がエンハンサ−及びＪＨプローブによフて検出され た（　Ｒａｖｅｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、土掻；５ｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９ ９１．土掻）、＾２８７−ＣＩＯ及びＷ！３８にて検出された約＋１１ｋｂ　ｌ ａｍＨＩ　ＪＨ断片も、融合して０．９Ｅｂ　ｍＵブロー１シーケンスになった （　Ｒａｖａｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、土掻）　、　０．９ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片 −Ｕプローブ（１Ｉａｖｓ＋ｔｃｈ　ａｔ　ａｌ。

、土掻）との融合は、予測された寸法に近い制限断片を示した（　１ａｖｅｔｅ ｈ　ｅｔ　ａｌ、、土掻＋　１ｉｈｉｎ　ａｔ　ａｌ、、土掻）　：即ち＞　１ ２ｋｂ　Ｂａａｌｌｌ　（予測値は約１７ｋｂ）　ｉ　０．９　ｋｂＥｃｏＲｌ 　（予測値ハ０．９ｋｂ）　及ｔＦ　ＦＪ　１２ｋｂＦＩ　Ｉｉｎｄｍ　（予Ｉ Ｉは約１１ｋｂ）である、　１１３８はＡ２１１？−１：１０と同一寸法のＢａ ａｌｌｌ断片を生じた。　ＪＨ及びＤＨＱ５２領域は削除誘導ＹＡＩ：ｓの双方 からシーケンスされ、双方共生殖系コンフイギエレーションにあった。デルタは エキソンＩｐｃｉ履物（これは、プライマーＤＩ１１＝５°Ｃ＾＾ＡＧＧ　ＡＴ Ａ　ＡＣＡ　ＧＣＣＣＴＧ３’及び　ＤＩＤ＝５°＾ＧＣＴＧＧ　ＣＩＯＣＴＴ 　ＧＴＣＡＴＧ　３’　の間の約ｌａｏ　ｂｐを含む）で分析された。＾２８７ −ＣＩＯの制限断片は文献からの予測値（５ｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、土掻）並び に１１３８について決定した値に近かった。　ＹＡＣの３゛クロ一ニング座位は 、デルタの第１　ＥｅｏＲＩサイト３’　（５ｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

土掻）、又は他のＥｅｏＲＩサイトさらなる３′でありうる。

Ｗｉｌｌ、　ＶＨ４及びＶＨ６（Ｂｅｒｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、土掻）のための、 及びＶＨ２（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９８４゜；　Ｐ５１９４ −５１９８）　（Ｄ　タめ）ｖＨシーンプローブが、ＹＡＣの可変シーンコンテ ンツを評価するために用いられた。　Ａ２１１７−ＣＩＯは、予測した値に近似 する２つのＶＨＩジーンを含む（５ｈｉｎ　ａｔ　ａｌ、、土掻；　Ｍａｔｓｕ ｄａｅｔ　ａｌ、、　＋９９３．土掻）；３つの酵素による制限分析は、予測し た断片寸法に近い値を与えた１例えば、ＥＣ０ＲＩにより観察されたバンドは、 ３．４ｋｂ及び７　、８ｋｂであった（予測値は３．４ｋｂと７．２ｋｂ）　。

ＶＨ４にツイテノ（測定値５．３ｋｂ、予測値５．１ｋｂ）　及ｔＦ　ＶＨ６に ライての（測定値０．８ｋｂ、予測値０．９ｋｂ）　（５ｈｉｎ　ｅｔａｌ、、 土掻；　Ｍａｔｓｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、、土掻）予測寸法ＥｃｏＲＩ断片は、＾ ２８７−ＣＩＯ内に存在した・。予測寸法ＥｃｏＲＩ断片は、ＶＨ２（ｌｌｌ定 値５．５ｋｂ、予１ｌ（Ｂ５．４ｋｂ）　ニツイテ認メラしたが、Ｂａ５ＨＩ及 びＨｉｎｄｍ断片は、予測した値とは異った６　Ｂ　ａ　ａ　ＨＩ及びＨｉ　ｎ 　ｄ　Ｉｎ断片のｐＢＲ３２２プローブとの一致融合（ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｔ　 ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、ＶＩＩ２ジーン（Ｓｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、 土掻）の５゛末端にあるＥｃｏＲＩサイトが５゜クローニングサイトであり、か くて、天然の５°Ｈｉｎｄｌ１１サイト及びＢａ５ｌ（Ｉサイトを欠失（ないし 不要ｅｌｉｍｉｎａｔｓ）することを示唆した。ＹＡＣインサートの全体の寸法 （約２２０ｋｂト評ｆｌｉすｔ’Ｌル）　ハ、３°−ｍｏｓｔ　ＶＨ２シー　ン １７）　５’末端から開始し、デルタ部位のＥｃｏＲＩサイト３°まで伸長する 完全な、非組換え（ｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）セグメントに対する予測寸法（ ５ｈｉｎ　ａｔ　ａｌ−＋１掲）によく一致する。

Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｌｌｎｉｖ、（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭｏｌヒトＹＡＣラ イブラリーからの、パルスフィールドゲル（ＰＦＧ）プールのスクリーンにおい て、ヒトカッパ一定常１１ｊｆｉ（ＣＫ）ジーン由来のプローブによって（２， ５ｋｂ　ＥｃｏｌＬＩ断片ＡＴＣＣ，Ｎｏ、　５９１７３．　Ｐａｒｋｌａｗｎ 　Ｄｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）同定された。＾８Ｏ−Ｃ７（１７０ ｋｂ）及び＾２７６−Ｆ２（３２０ｋｂ）と命名されたｙＡｃｓはカッパー削除 要素１ｕＬｅ＋　ＣＫ、　ＪＫ及びＣ−Ｊイントロンエンハンサ−を含み、ｋｄ ｅを越えて３′を伸長する（　ｅｘｔｅｎｄ３’　）　ｅ　ＪＫから５°を伸長 して、ＹＡＣｇはまた、迦合法及び／又はＰＣＲ法により決定されるＢｌ、　Ｂ ２及びＢ３ＶＫジーンをも含み、そして他のＶＫシーケンスも含みうる＋Ａ３０ −Ｃ７／ＡＢ１３８０株は、ＩｇＫ　ＹＡＣに加えて、同様な寸法の無関係、な ＹＡＣをも宿らしめた（　ｈｏｕｓｅ＋１）。従って、減数分裂分離を用いてこ れらのＹＡＣａを分離したｉ　Ａ３０−Ｃ７はＹＰＨ８５７とクロス（交配）さ せ、減数分裂産物としてＩｇＫ　ＹＡＣのみを含むもの（ＭＰ８−２１ホスト遺 伝子型＝α山」ＬＬＬ２山」巨ｉ田己月ユ―田□）。

Ａ８０〜Ｃ７及びＡＺ７６−ＦＺ　ＹＡＣｓは、ｐＬＩＩＴＱでターゲテイング 処理し、ヒト）ＩＰＲＴミニジーンをＹＡＣ右ベクターアーム中へ組込んだ。

多くの酵素を用いてのＩｇＫ　ＹＡＣｓ＾８Ｏ−Ｃ７及び＾２７６−Ｆ２の制限 分析は、これら両方のＹＡＣｓが組換えされていない（ｕｎｒｅａｒｒａｎｇｅ ｄ＋即ち、生’ＩＩ系コンフィギユレーションにある）ことを裏付ける６例えば 、Ｂａ５ＨＩ分析とこれに続＜ＣＫプローブによる融合により、期待された＋３ ｋｂ制限断片（Ｋｌｏｂｅｃｋ　ａｔ　ａｌ、、’　・−Ｌｌｌ」」ＬＬ−１１ Ｑ；　ｐ１００７−１０１２　（１９８９１）を立証する。同一寸法バンドはＪ Ｋプローブ（ＪＫＩ−５１１域を増幅するプライマーセットを用いた、１．２ｋ ｂのＰＣＲ産物）と、ゲノムマツプ（ＫＩｏｂｅｃｋ’、ｅｔ　ａｌ、、土掻） で予見された如く、聯合する。Ｂ３クラス■ジーン（プローブはＢ３ジー、ンか らの＋２３　ｂｐ　ＰＣＲ産物）は、夫々文献の値、４．５　ｋｂ、　２．３ｋ ｂに近い４．９ｋｌ）　ＢａｍＨＩと２．２　ｋｂＢｇｌｌｒ断片とを与える（ Ｌ　Ｏｒ　ｅ　ｎ　Ｚ　ｅ　ｔ　ａ　ｌ　、　【釘ム■Ｌ−」」」」」−り一遍 ｉ　ｐ４７９−４８４　（＋　９８８））、下記のカッパ一部位シーケンスにつ いての、ＩｇＫＹＡＣｓ及びヒトゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は予見されたバンド 寸法を明らかにしたＫｄｅ（１２０ｂｐ）、　ＣＫ（３０４ｂｐ）、　Ｃ−Ｊイ ントロンエンハンサ−（４５５ｂｐ）　、ＪＫＩ−５（１２０４ｂｐ）　、　Ｂ ３ＶＫ（１２３ｂｐ）　及Ｕ　ＢＩＶＫＩＩ　似シーン（２１４ｂ１１）　、　 ＣＫ、　ＪＫ及びＣ−Ｊエインハンサー領域のためのＰＣＲプライマーをデザイ ンするのに用いたシーケンスは、　Ｗｈｉｔｅｈｕｒｓｔ　ｅｔａｌ、、　’　 ；　Ｐ４９２９−４９３０　（１９９２）カａｒのもノテあり、　ＫｄｅはＫｌ ｏｂｅｃｋ　ａｎｄ　Ｚａｃｈａｕ、　７：　Ｐ４５９１−４６０３　（＋９８ ６１からのもの；Ｂ３はに１ｏｂｅｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　’　；　Ｐ６５１５ −６５２９（１９８５１から、そしてＢｌはＬｏｒｅｎｚ　ｅｔ　ａｌ、　（土 掻）からのものである。

６１ｊＯｋｂ　ｙｔｌＰＲ，Ｔは、Ｈｕｘｌｅｙ、ｅｔ　ａｌ、（１９９１）　 勤」ｊｌＬＪ−ｉｆ：　ｐ７４．２−７５０に１己載されるように、ＹＡＣライ ブラリーからり、ローニングされたヒトヒポキサンチンホスホリボン７ル・トラ ンスフェラーゼ（ＨＰＲ丁）ジーンである。７ＨＰＲＴを含む酵母株は、ウラシ ル及びトリプトファン欠乏液媒体、Ｈｕｘｌｅｙ　ｅｔ　、ａｌ、　＜１９９１ ）　（上１、掲）、中で成長された。

酵母スフェロプラストを調製するため、ｙＨＰＲＴを含む４ＱＱ＠ｌの酵母カル チャーをスピンダウン（５ｐｉｎ　ｄｏｗｎ）しイーストベレットを一度水洗し 、一度ＩＭソルビトールで洗浄した。イーストベレットは、５Ｘ１０’イースト セル／　ｍ　１の濃度にて、５ＰＥＰＩ中に再懸濁された（ＳＰＥＭ）ＩＩ　成 １！、ＩＮ／ルヒ）−ル、ｐＨ７，５ノＩＯｍＮＩＪ　ン酸Ｎａ、　ｐＨ８，０ の１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び３０５Ｍβ−メルカプトエタノール）、ザイモラー ゼ２０Ｔを１５０μｇ／ｍｌイーストセルの１度で４加し、カルチャーは、９０ ％のセルがスフェロプラストになるまで（通常＋５−ＺＯ分）、３０℃でインキ ュベートされた。セルは、ＳＴＣ（ＩＮソルビトールＨトリスｐＨ７．５，　Ｉ ＯｍＭ　ＣａＣ＋＋）で２度水洗し、２．５×１０”／ｍｌの一度でＳＴＣ中に 再懸濁した。

２、し ＨＰＲＴ−陰性ＥＳセル系　ＥＩ４７Ｇ２ａを、既述のように、培養した。

３、　エロ　ー　Ａ ゼラチンコート皿上でエキスボエンシャルに成長するＥ１４ＴＧ２ａ　ＥＳセル をトリプシン処理し、血清フリーＤＭＥＸで３度洗った２．５Ｘ１０”の酵母ス フェロプラストベレットを、注意深＜、５Ｘ１０”ＥＳセル（酵母ベレット上へ スピンダウンして）でオーバレイした．組合されタヘレットハＩＯ−ＭＣＩＩＣ ｌｌ含有ｅｖ　５０％ｐＥＧＩ５００又は５０χＰＥＧ４０００　（　Ｂｏｅｒ ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ−製）の０．５ｓｌ中に再懸濁した。室温又は３７ ℃で１．５分インキュベート後、５ｍｌの血清フリーＤＭＥＭを徐々に加え、セ ルを室温で３０分間静置した。次いで、セルはベレット化し．　ＥＳセルコンプ リートメディウム（既述）　ｌＯｓｌ中へ再懸濁させ、さらにフィーダーセルで コートした一つの１００ｍｍプレート上へプレート化した．　２４ｈｒ後メデイ ウムを新しいもので更新した。融合後４８ｈｒ　（　４８　ｈｏｕｒｓ　ｐｏｓ ｔ−ｆｕｓｉｏｎ）で、ＨＡＴ（　Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ−’Ｍヒボキサンチン、４Ｘ １０−’Ｍアミノプテリン、１．６ｘｌｏ−’チミジンを含むＥＳメディア）選 択を行った．抗日＾τＥＳコロニーが融合後７−１０日で、採用した異った融合 条件の双方からのプレート中に、観察された．　ｙＨＰＲＴ−ＥＳ　（　ｒ　Ｅ ＳＹＪとイウ）融合コロニーを取り出しフィーダーコートしたウェルの上へプレ ート化し、他の分析のために伸長させた。

４　、　−　八　ロ　−　１　ヘ　ー 折 Ｚ３７ＨＰＲＴ−ＥＳ融合コロニーから抽出してＤに＾をＨｉｎｄｍで切断し、 下記のプローブを用いてサザンプロット分析にかけた（図１２）：ヒト反復Ａｌ ｕシーケンス（Ａ）。

右（Ｂ）及び左（Ｃ）ＹＡｃヘクターアームノため１７）　ｐＢＲ３２２−特異 性シーケンス；酵母ＴＦ反復シーケンス（Ｄ）；酵母単ーコビージーン１．ＪＪ Ｊ　（　Ｅ）　、　ヒ）　ＨＰＲＴフＯ　−　フ、１、６ｋｂのフルサイズｃＤ Ｎ＾（　Ｊｏｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ−＋１１土，」工Ｕユ゛°；　Ｐ４７７−４８ １　（１９８３））がＥＳＹＳコクローン中けるヒトＨＰＲＴジーンの存在の確 認のために用いられた．＾ｌｕプローブは、ｐＢＰ６３Ａ内のＢＬＵＲＩＩ　Ａ ｌｕ要素からの３００ｂｐ　ＢａｓＨＩ断片であった（Ｐａｖａｎ　ｅｔ　ａｌ ，　江ム：　ＰＩ３００−１３０４　（＋９９０）　。

右及び左ベクターアームプローブは、夫々、１．７及び２、７ｋｐの、　ｐＢＲ ３２２から導かれたＢａｍＨＩ−ＰｖｕＩＩ断片であり、これら、ｐＹＡＣ４内 でのベクターシーケンスに対応する（スキームａ，ｂ，　Ｂｕｒｋ　ｅｔ　ａｌ ．、　ｉに　（ｉｕｉｄａ　ｔｏ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅａｚｙｍｏｌｏ ｇｙ，　Ｇｕｔｈｒｉｅ　ａｎｄ　Ｆｉｎｋ，　ｅｄｓ．、　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ，　ＩＬ４，：　Ｐ２Ｓ５−２７０　（１９９＋１）　、右アーム プローブにより検出された４．５ｋｂ断片は、ヒトインサート内で、テレノア５ °末端でのｌｉｎ＋Ｈ■サイトと第１　Ｈｉｎｄｎｌサイトとの間に亘る（スキ ームａ）、左末端プロー１により検出された３ｋｂ及び４．１ｋｂ断片は，夫々 酵母シーケンスのテレメア末端でのＨｉｎｄ［Ｉ＋サイトとＨｉｎｄｍサイト５ °との間及びセントロメアのＨｉｎｄ［ｎサイト３′からヒトインサートの中ま でに亘る（スキームｂ）、これらの２つのバンドの融合インテンシテイの差、こ れらの断片とプローブの間における相同性の程度差に関係する．酵母ＴＦ反復プ ローブＣ　Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ　ａｔ　＆１．　ＬＪ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅ ＊ｓｉｏｎ　ｉｎ　’Ｙｅ＊ｓＬ”、Ｐｒｏｃ．　ｏｆ　Ａｌｋｏ　Ｙｅａｓｔ 　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，　Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，　Ｋｏｒｈｏｌａ　ａｎｄ　Ｖａ ｉｓａｎｅｎ，　ｅｄｓ．、　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｅｈ ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅ ｓｅａｒｃｈ　、　ｌ　：　ＰＩ８９−Ｈ）Ｏ　（１９８３））はＴＦＩ含有ｐ ＪＥＦ７４２から単離された５．６ｋｂＸ　ｘｈｏｌ断片であり、それは２つの 要素間の相同性によりＴ７２の３°Ｈｉｎｄｍ断片をも検出しえた．ＩＬＬＩＺ シーンプローブは、ｐｔ，ｕｓかもの１．７ＢａｍＨｌ断片であフた（　Ｈｅｒ ｓａｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ，　’　：ｐ４９４３−４９４８　（１９９１１）。

ヒトｌ（ＰＲＴプローブ（全長で１．６ｋｂ　ｃＤＮ＾プローブ）での融合は、 分析した全てのクローンが、ＦＨＰＲ丁ＹＡＣと同じヒトＨＰＲＴジーンの１５ ，７及び　５ｋｂのエキリン含有断片を含んでいた．ヒト反復Ａｌｕシーケンス ３００ｂｐプローブでの同じプロットの報告は、分析した全てのクローンが、大 部分（全てではないにしても）　、　７ＨＰＲＴ中に存在するＡｌｕ−含有断片 を含んでいることを示した（ＶＩＪ＋ｚ）、これらのデータは、分析した大部の クローンにおいて、６［１０ｋｂヒトインサートは、ＥＳセルゲノム中への挿入 に際して、検出可能な程度には岨換え又は削除が行われていないことを示す，　 ＹＡＣベクターシーケンスの挿入を，ベクターアームに特異的なプローブを用い て調べた．右ＹＡＣベクターアームのためのプローブにより同じプロットの再融 合は，　４．５ｋｂ　Ｈｌｎｄｍ断片を検出するが、分析した２３クローン中の １０クローンにおいて，テレメアまでの右ＹＡＣアームが今なお完全であり、組 換えもなく、ヒトインサート（図１２Ｂ）に結合（ｌｉｎｋ）されていることを 、示しており、かくて、さらに、これらのクローン内でのＹＡＣの一体性を裏付 ける証拠をなす１分析した２０クローンの内１８クローンにおいて、左アームプ ローブは、３ｋｂ及び４．ｌｋｂ　Ｈ４ｎｄ１’０　７ＨＰＲＴ断片を検出シタ 力（図１２ｃ）　、　、：れは左アーム保持の高い頻度を示すものである。

ＥＳＹクローン中での７ＨＰＲＴの構造的一体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）がさら に、２つのクローン（ＥＳＹ５−２及び８−７）について評価された。ｙ）ＩＰ ＲＴを担持する酵母において次の各積プローブにより汎そ下記の通りの５つのＳ ｆｉ断片が異ったプローブによって確認された：即ち、３１５ｋｂ（Ａｌｕ、左 アーム）　、　１４５ｋｂ、　（Ａｌｕ、　ＨＰＲＴ）　；　９５ｋｂ　（Ａｌ ｕ、右アーム）、７０及び５０ｋｂ　（Ａｌｕのみ）。いずれのＥＳクローンに おいても、内Ｎ　ＨＰＲＴ及び＾ｌｕ−特異性の断片の寸法は、ｙＨＰＲＴ断片 に類似の寸法であった。双方のクローンについて検出された末端断片は、マウス の染色体内で組込まれたＹＡＣｓについて期待されたように、ＦＨＰＲＴ内より もより大きく、即ち、右末端断片に夫々対している１８５及び２００ｋｂであり 、両クローンの左末端断片は８００ｋｂ超である。これらのデータは、＾１ｕプ ロフィルと共に、これらのクローン内でのＹＡＣの構造的一体性の保持（保存） のための追加的証明を提供する。

これらの研究は、ＥＳＹ８−７ｌ図１３Ａ、　Ｂ）及び８−６メタフ工−ズ染色 体スプレソズ（５ｐｒｅａｄｓ）に対して行われた蛍光１韮山融合法により補足 され、ヒトシーケンスに対する単一の組換座（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　５ｉｔ ｅ）が検出された。ビオチニレイトされたヒトゲノムシーケンスのＥＳＹ８−７ セル（図１３＾、　Ｂ）及びビオチニレイトされた酵母の反復ＤＮＡシーケンス と融合されたＥＳＹ８−６セル（図１３Ｃ，Ｄ）の代表的なメタフェーズスブレ ッズ（■ｅｔａｐｈａｓｅ　５ｐｒｅａｄｓ）　（図１３＾、　Ｂ、　Ｃ）又は インターフェーズ核（図１３Ｄ）の顕微鏡写真を示す、ヒトプローブはヒトゲノ ム胎！Ｉ　ＤＮＡ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）から 得られた。酵母プローブは酵母反復要素をエンコードするＤＮＡ断片の下記の混 合物から成るものであった：即ちｆＵＪＬ（ｐｄｅｌｔａ６の１．０８ｋｂ　５ ａｕ３Ａ断片　（Ｇａｆｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ９．■ＩＬユニＪ：　Ｐ５８３−５ ９１　（１９８３１）　及び丁７（Ｐ２９の１．３５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−３ａｉ ｌ断片　（Ｈｅｒ＋＋ａｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ−＋　ｈＬ１Ｌ土ム２トム２ＬＬ Ｌ１　Ｐ４９４３−４９４８　（１９９１））　、　ｒＤＮＡｓ　（４，６ｋｂ 　ＢｇｌＩＩ　ｋ−＾Ｌ９Ｇ及び４．４　ｋｂ　Ｂｇｌｌｌ　−Ｂ　Ｌ９２断片 （Ｋｅｉｌ及びＲ。

ｅｄｅｒ、　江」−且Ｈｐ３７７−３８６　（１９８４））　、及びＹ°テレメ ア要素（ｐ１９８の２．Ｏｋｂ及び１．５ｋｂ　ＢｇｌＩＩ−）１ｉｎｄＩ［Ｉ 断片（Ｃｈａ口及びＴｙｅ、　ｃＪＬｌｌ　３Ｊ：　Ｐ２Ｓ５−５７３　（１９ ８３））であった。

染色体メタファーゼスブレッズ時シーケンスのビオチニレイトされたプローブと の融合及びＡｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣによる検出とさらに続くビオチン−アンチ− Ａｖｉｄｉｎ及び＾ｖｉｄｉｎ−ＦＩＴＣ増幅は、Ｔｒａｓｋ及びＰｉｎｋｅｌ により、ロユ相」Ｌｕ１ｌ　、　；ＩＪ　：　Ｐ　３８３−４００　（＋　９９ ０　＋に記載の仕方で、ツアイスの＾ｘｉ’ｏｐｈｏｔｉｉ微鏡を用いて、行わ れた。染色体は、沃化プロビジラムによりカウンタースティンされた。ホしたｕ ａｔａ写真は、ヒト又は酵母プローブで行った３つの独立な実験において走査さ れたメタフエーズスブレソズ又はインターフェーズ（中間休止期）核の９５χを 代表するものである。ヒトシーケンスに対する単一の組換え座（ｉｎｔｅｇｒａ ｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）が検出された。　（ また同じプロットがＥＳＹクローン内での酵母ゲノムＤＮ＾シーケンスの存在の 確認のため酵母Ｔｙ反ｒＪＩＬ要素シーケンスでプローブされた（図＋２Ｄ）　 、幾つかのクローンについて親（ｐａｒｅｎｔａｌ）酵母株内にあるＴＦ−含有 断片の大部分を含むことが認められたが、一方幾つかのクローンについては、Ｔ Ｖ＝含有断片の、もしあったとしても、極めて小さな断片を有することが認めら れた。

これらの結果は、幾つかのＥＳクローンにおいて、ＹＡＣＤＮ＾は完全に組換え られてはいるが、酵母ゲノムＤＮ＾はほとんどないしは全く組換えられて（ｉｎ ｔｅｇｒａｔｅ）いないことを示すａ’　ＥＳセルゲノム内の単−又は複数の座 にｍ母染色体ＤＮＡが組込まれたか否かを調べるため、蛍光１．ＬＪＪＬＩ！融 合法を、完全なＴｙプロフィルを有するＥＳＹ８−６クローンに対して行った。

組換え酵母反復プローブを用いて、単一の組換え座が検出された（図１３ｃ。

Ｄ）が、これは、解Ｃ象限度内において、全ての酵母ＤＮＡ断片は一つのブロッ クへと結合されたことを示す。

ＥＳセルの［１−Ｌ１ユｌ」な通常の選別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ） を行う能力を用いて、ＹＡＣ安定性及び組換えＤＮＡのＥＳセルのプルリボテン シーに対する影響が調べられた。異った量の酵母ＤＮＡ（ＥＳＹ５−２．３−６ ．８−６．８−７）を含む、ＥＳクローンは、非融合セルのそれと区別できない 選別パターンを示した；即ち、肢体の形成は多くの選別されたセル型を提起した （図１４＾）、サザンプロット分析を（、ａ）ヒト＾１ｕプローブ、と（ｂ）酵 母ＴＦシーケンスを用いて、選別されたＥＳＹ５−２．、３−６．８−５及び８ −６　（２０μｇ）からＡＢＩ３８０（４０Ｂｇ）中で抽出されたＤＮＡに対し て行った。

ＥＳクローンは、Ｍａｒｔｉｎ及びＥｖａｎｇ、　ｃＬＬＬＪ：　Ｐ２Ｓ５−４ ７４（＋９７５）に記すように、それをサスペンション中での集合として１０− 日日間培養することによって、訝導された。ＩＢ１基へのそれらの再付着に従っ て、ＥＳＹ−誘導肢体は、選別されたセル型を与えた。ＹＡＣ及び酵母ＤＮＡシ ーケンスは、非選択性媒体中で、４０日間の培養期間中選別されたＥＳクローン によって安定に保持されたが、このことは、安定に組込まれた外来ＤＮＡは、Ｅ Ｓセルのブルリボテ、ンシー（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を害さないことを示 す（・ＩＫ　１４Ｂ）。選別されたカルチャーは、その正常な成長とＨＡＴ−選 択性媒体へ移された際の選択性に基づき、機能的なヒトＨＰＲＴｉｌｌ−壬子を 保持した。

５、−ノーマ マウスを、生殖系列を含めて、増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）するＥＳＹセルの 能力は、ＥＳセルをマウスの胚盤胞の中へ微量注入することによって示され、キ メラマウスの産生が示された。キメラ誰をＬ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交配させ、生殖 系列はアグーチ子孫の存在によって確認された。

キメラマウスの尾から調製したゲノムＤＮ＾を分析し、ＰＣＲ分析によってマヮ スゲノム中にＦＨＰＲＴ　ＤＮＡが存在するかを調べた。　ＹＡＣ左アームの存 在は、２つのプライマー作用をするオリゴヌクレオチド、５°丁ＴＣＴＣＧＧＡ ＧＣＡＣ丁ＧＴＣＣＧＡＣＣと　５’　ＣＴＴＧＣＧＣＣＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣ Ｔ丁ＧＧＴＡＣＣＧを用いて分析したが、これらのオリゴヌクレオチドは、ｐＢ Ｒ３２２シーケンス及びＹＡＣ左ベクターアームの５ＵＰ４ジーンから導いたも のである。＾２５９ｂｐ　ＰＣＲプロダクトは、７１１ＰＲ丁及びＥＳＹセル系 を含む酵母の分析によって得た。

ＥＳＹセルｌｆ＋ＥｓＹ３−１．　ＥＳＹ３−６及ｔＦＥｓＹ５−２カａｒ産生 ＊ｈりＩ８のキメラマウスから調製したＭＤＮＡのＰＣＲ分析は、期待したＰＣ Ｒプロダクトを与えたので、これは、キメラマウスのゲノム内でのＹＡＣ左ベク ターアームの存在を証する。

６、　−　− コートカラーキメラ度３０〜６ｏχのキメラ雄をＥＳＹセル系ＥＳＹ３−１．　 ＥＳＹ５−２カラ導き、生殖系列遺伝（受継）評価のための交配に供した。即ち 、遺伝子の修飾が生殖細胞（精子又は卵母細胞）を経て動物の子孫へと伝えられ るかどうかを調べた。　ＥＳＹ３−１から導いたキメラ雄の３つ、３９４／９５ −１．３９４／９５−２．４１１−１が、夫々頻度２０％、　３ＯＬ　３０％で その子孫へとＥＳセルゲノムを伝えた。アグーチの子供（ｐｕｐｓ）からの尾Ｄ ＮＡのサザンプロット分析は、３９４／３９５−２キメラから導いた３つのマウ ス４−２、４−３．５−１のゲノム内にｙｏｐＲ’ｒが存在することを示した。

この分析から得られた＾ｌｕプロフィルは、親のＥｌｉ３−１セル系のそれと区 別不可能であった（図＋４Ｃ）が、これは６８０ｋｂのヒトインサートが忠実に マウス生殖系へ伝えられたことを示す。

ＦＨＰＲＴ含有子孫からの■ＲＮ＾−誘導ｅＤＮＡに対する、ヒトＨＰＲＴ−特 異的ＰＣＲ分析を用いて、テストされた全ての組織内でのヒトＨＰＲＴ遺伝子の 発現が検出された（図＋５Ａ。

Ｂ）。かくて、それは、伝えられたＹＡＣがその機能を確実に保持したことを示 す。この実験において、ＥＳ。

ＥＳＹ３−１及びＨｕｔ７８　（ヒト）細胞、対照マウス（Ｃ）若しくは４−３ アグーチ子孫（３９４／９５−２キメラから導出）ｎ臓及び肝臓、及びテンプレ ートＤＮＡを含まないサンプル（図１５＾で「−」で示す、）における、逆転写 （ＲＴ）−ＰＣＲによって、ヒトＨＰＲＴ　＠ＲＮＡが検出された。ポリ（Ａ＋ ）　ＲＮＡの逆転写及び特異的ｃＤＮ＾ＤＮＡンスのＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡサ イクルキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。マウスＨＰＲＴ　ｃＤ ＮＡの存在下での、ヒトＨＰＲＴ　ｃＤＮＡからの６２６ｂｐ断片の特異的増幅 は、Ｈｕｘｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１掲）に示す通りに行った。全てのＲＮ＾ サンプルのインテグリテイは、マウスγ−インターフェロン受容体に対するｃＤ ＮＡのＰＣＲ増幅によって、示された。　３５９ｂｐ断片を増幅するのに用いた プライマーはＧＴＡＴＧＴＧＧＡＧＣＡτＡＡＣＣＧＧＡ上述の結果は、酵母ス フェロプラストが、シングルコピー大分子量ＤＮＡ断片をＥＳセルへ導入するた めの有効なビークルであることを示し、またこのような分子がマウス生殖系列を 通じて安定かつ機能的に伝達されることを示す、いくつかのＥＳクローンに対す るＰＦＧＥ分析及びｉｎ　５ｉｔｕ珈合法によって補充されるＡｌｕプロフィル は、クローンの大多数（■ａｊｏｒｉｔｙ）が実質的に全てのヒトインサートを 組換えなしの形でＣｍち、「生殖系列コンフィギユレーション」において）含む ことを強く議論（ａｒｇｕｅ）　シ、クローンは高い率（４０χ）で双方のＹＡ Ｃアームを保持する。酵母ゲノムＤＮＡの顕著な取入れ（ｕｐｔａｋｅ）は、Ｅ Ｓセルの１ｎｖｉｔｒｏ及び１ｎｖｉｖｏでの適正な選別に富にならず、また生 殖系列遺伝ないしは遺伝子発現を妨げなかった。これらの方法を用いて、我々は 、ヒト以外の動物ゲノムの中へインサートとしてゲノムＤＮ＾の大きな断片を導 入でき、そこで、インサートは生Ｉ！ｉ系ＰＩ遺伝によって完全な形で伝達され る。

従って、広汎なバラエティの異種ＤＮＡがヒト以外の例えば、ホ乳動物、特に小 さな実験動物などの、新しい表現型又は新しい遺伝子型を伝達する宿主内へ導入 できる。＊例えば、小さな実験動物内ヘホ乳動物例えばヒトの遺伝子を導入し、 病気の原因を研究し、多種の莱剖のヒト遺伝子への反応を研究することができる 。

或いは、ホ乳動物宿主内へ大きな（遺伝子）座部分（ｌａｒｇｅ　１ｏｃｉ）を 導入し、例えばイムノグロブリン、Ｔ−細胞受容体、主要抗体適合性複合抗原蔓 のような蛋白質のヒト蛋白質シーケンスを得ることもできる。

−−１バー　− へ ｐＬＵＴｏＣｙＡ２ｇ？−ＣＩＯ）’ｔ’　Ｉ　−ケチ４　＞　りＬ　タ、Ｉ？ 、）ＨＩＩＹＡＣ＾２１１７−ＣＩＯを含む酵母をスフェロプラストにし、ＨＰ ＲＴ−欠失ＥＳセル系ＥＩ４．１Ｔ０３Ｂ＋と、上述の如く、融合した。

抗Ｈ＾丁ＥＳ　（ＥＳＹ）クローン（２Ｂ、　２Ｃ，２０，３＾、　３Ｂ、　５ Ｃ。

＋＋２５＾、　Ｉ＋２５Ｅ、　１００７１５００及びｔｏｏ７４０００）をビッ クしＯＮＡ分析によって伸長させた０組換えられたＹＡＣの評価は、それらのク ローンからのＨｉｎｄ０１切断ＤＮＡのサザンプロット分析により、前述のり、 　ＪＨ，μ及びＶＨ２領域に対するヒトＩｌｌプローブを用いて、行った。全て のＥＳＹクローンは、期待した＞ｌ０ｋｂのＪＨ及びμ断片を含むことが認めら れた。　２Ｄ、　５Ｃクローンを除き池の全てのＥＳＹクローンは、４．８ｋｂ 　Ｖｌ（２ｋｂ断片を含むことがａめられた。

２Ｄ、　３ｇクローンを除き他の全てのＥＳＹクローンは、期侍した１０及び７ ．６ｋｂのＤ遺伝子断片を含むことが認められた。酵母ノケノムシーケンスハ、 ２Ｂ、　２Ｄ、　＋００／＋５００及び５Ｃクローンを除いて、他の全てのＥＳ Ｙクローンにおいて、ＩＩｆＦＢ反復丁ｙ！！票との融合により、検出された。

ＥＳＹりＯ−ン２Ｂ、　３Ａ、　５Ｃは、上述の如＜　Ｃ５７Ｂ／６胎盤胞内へ 微量注入され、キメラマウス（２Ｂクローンから１０匹、３＾クローンから１匹 、５Ｃクローンから１匹）が産生された。これらのキメラ動物１０匹からの運出 のサザンプロット分析により、全てでないにしても大部分のＭｆＢ中のｙ＾２８ ７−Ｃ１０内で検出された明らかな１０＾１ｕ断片の大部分の存在と共に、ＶＨ ２及びＤ遺伝子断片の存在をも示した。産生されたキメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ Ｉ６Ｊマウスとかけ合わされて、生殖系伝達評価を行った。　２Ｂクローンから 導かれたキメラｕ　７８に−３は、ＥＳセルゲノムをその子孫へ、１００χの率 で伝えた。６匹のアグーチマウス子供（ｐｕｐｓ）の中で４匹は、尾ＤＮＡのサ ザンプロット分析により、ヒトＨｆＭシーケンスの存在を示した。

ｐＬｌｌＴｏ（Ｙ＾８Ｏ−Ｃ７１でターゲティング処理したヒトカッ）＜−ｍＹ Ａｃ　Ａ３０−Ｃ７ヲ含ｔｒｉｌａ）　（ＥＩ４．　ＩＴＧ３ＢＩ　ＥＳセル含 有）との冶金実験の結果、２つの抗ＨＡＴ　ＥＳＹクローンに４．４．１と８５ ．２．１が得られた。これらのクローンがらのＨｉｎｄｌ■切断ＤＮ＾のサザン プロット分析により、酵母のｙＡ８０−Ｃ７に検出された全ての明らかな（ａｐ ｐａｒｅｎｔ）　ｌ０ＡＩｕ断片の存在が判った。双方のクローンにも、ゲノム シーケンスは組込まれていた。ＥＳＹクローンをＣ５７ＢＩ／６５胚盤胞へ微量 注入し、キメラマウスを産生じた。

【１１」 い−　−−マ ！ノ 実施例Ｉ−Ｖｌに記したアプローチの変法として、ヒト１ｇ遺伝子を、相同組換 えを用いて、マウスのＨ−及びＬ！ＩＩイムノグロブリン部位（ｆｏｃｉ）を直 接ヒトＨ−及びＬ鎖部位によって置換（組換）することにより、マウスのＩｇ部 位へ導入する。これに続き、胚性幹細胞から導かれたセルが生殖系に寄与するキ メラトランスジェニック動物の産生を行う。

ヒ　、−。

組換えヒトシーケンスは、既述の通り、ヒトーＹＡＣライブラリから分離される ヒトＶＨｂ−Ｄ−Ｊ−Ｃμ−Ｃδ　Ｈ鎖領域を包含する、ゲノムＤＮＡの５ｐｅ ｌ　１００ｋｂ断片を含む。相同組換え過程を駆動するフランキングマウスＨＭ Ｉシーケンスは、夫々ヒトシーケンスの３”及び５°末端に、マウスＣｅ　−Ｃ ａ　Ｍｌのｌ０ｋｂ　Ｂａ＋ｓＨＩａｌと、５’Ｊ５５８断片とを含み、後者は 、マウスＨ鎖可変領域のＪ５５８断片の５”側半分を含む（ＩＫ　１６）。これ らのマウスシーケンスは、下記の方法を用いて、マウスの胚ゲノムライブラリか ら分離される。即ち、この方法は、丁ｕｃｋｅｒ　ｅｔ　ｍｌ、　（１９１１１ １、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７Ｊ：　Ｐ７６８４−７６８８及びＢｌａｎｋｅｎｓｔ ｅｉｎ　ａｎｄ　Ｋｒａｖｉｎｋｅｌ　（＋９８７．土掻誌）に夫々記載されテ イル。

＋＋５０ｂｐのＸｈｏｌからＢａ＋ｓＨＩまでの断片（これはヘルペスシンプレ ックスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモーターとボリオ ーマインハンサーにより駆動されるネオマイシン耐性遺伝子を含む）が、ｐＭｃ ＩＮｅｏ　（Ｋｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈｉｅｓ、　＋９８９．土掻誌）から単 離される。合成アダプターをこの断片に付加し、Ｘｈｏｌ末端をＢａａｌＩ（＋ 末端に亥損し、結果する断片をプラスミド中にてＢａｍＨＩマウスＣε−Ｃａに 統合する。

ヒトＨ鎖部位を含むＹＡＣクローンから、インサート各末端からのＤＮＡシーケ ンスが、逆ＰＣＲ法（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ　ｅｔａｌ、　（＋９８９１．　ＰＮ ＡＳ　ｉｌＪ：　Ｐ７４８５−７４８９）から又は、Ｅ、ｃ。

ｌｉ内でのプラスミド救助（ｒｅｓｃｕｅ）法（Ｂｕｒｋｅ　ａｔ　ａｌ　。

（１９８’７１．　Ｇａｒｚａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）＋　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　■：　Ｐ６４１−６４６；　Ｔｒａｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８９ ）によって、回収される（図８参照）。ＹＡＣの５゛ｖ６末端から単離されたヒ トシーケンスをマウスのＪ５５８シーケンスにプラスミド中で統ｕ　（ｌｉｇａ ｔｅ）−し、同様にして、　ＹＡＣの３°Ｃｄ末端から尋いたヒドン−ケンスを Ｎｅｏ及びマウスのＣε−Ｃａ（上述）を含むプラスミド中でＮｅｏｄＩ伝子へ 結壬子る。

ヒトｖ６−マウスＪ５５８セグメントを、次いで、サブクローンして半−ＹＡＣ クローニングベクターとする。このベクターは、原１ｇＨＹＡＣには存在しない 酵母選択性マーカー（［Ｌｌｉ３＞セントロミア（ＣＥＮ）及び単一のテロミア （置）を含むようにする。ヒトＣ３−Ｎｅｏ−マウスＣε−Ｃαを、同様にして サブクローンし、異った酵母選択性マーカー（ＬＩＪＪ）と単−置を含む別の牛 −ＹＡＣベクターとする。ヒトＮＧ　ＤＮＡを含む牛−ＹＡＣベクターを線状化 し、ＬＬｉ３及び■Ｌ染色体を削除され、かつＩｇＨＹＡＣを有する酵母株を形 質変換（ｔｒａｎｓｆｏｒ−）するのに用いる。ヒスチジンープロトトロフィ選 択により、ヒトＶＳ　ＤＮＡシーケンスとの間で相同組換えを行い、組換えＹＡ Ｃ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＹＡＣ）を含む酵母コロニーを得る。

ヒトＣ８ＤＮＡを含む牛ベクターＹＡ、Ｃは、次いで線状化され、前段でつくら れた酵母株を変換するのに用いる。

ロインンープロトトロフィ（ｐｒｏｔｏｔｒａｐｈｙ）選択により、完全なＩｇ ｌｌ置換ＹＡＣを含む酵母株を得る（図１６参照）。好ましくは、双方のターゲ ティング過程は、ロイシン及びヒスチジンブロトトロフィの同時選択を行う。

単、−変換ステップとして行う。これは、もとの中心性及び非中心性（ｃｅｎｔ 、ｒｉｃ＋　ａｃｅｎｔｒｉｃ）　ＹＡＣアームが図１６に図示の場合とは、逆 の配向になっている場合に特に有用である。このＹＡｃは、単離され、胚につい て前述の６１１　＜　、微量注入によりＥＳｔｂ中へ導入される。

実−嵐一伝一■ −・　１　二・拳　マ Ａ、　ロー　マ　？ ヒトのイムノグロブリン部位を含むマウスを不活性化したマウスイムノグロブリ ンジーンを有するマウスと交配し、ヒト抗体のみを産生ずるマウスをつくくる。

４つのｊＩ種接合の株から出発し、交配を３代行い、不活性マウスカッパー及び Ｈ１ｌイムノグロブリンに対してホモ接合なマウスを創出する。そのための交配 チャートを図１７に示す。

尖」１」Ｌス ロー　・ Ａ、マ イムノグロブリン部位からの組換導入されたヒトＤＮＡを含む生殖系列キメラマ ウスを、アジュバント内で抗原の注入によって免疫する。マウスは、原初免疫後 抗原で日日間追加抗原刺激（ブースト）され、これを、３５日後と５６日後に繰 り返す。交配を、免疫した動物に対して行い、抗原の免疫に対抗する血清抗体の 力価（ｔｉｔｅｒ）をテストする。最大力価を有するマウスを殺して、牌臓を取 出す。

Ｂ、　Ａ 牌細胞の融合パートナ−として用いるミエローマセルを融合に先立つ６日前、解 きほぐしくｔｈａｗ）、組織培養中で成長させる。融合の１日前、セルを牛脂児 血清を５×１０″セル／　ｍ　ｌの濃度で含む新鮮なメディウム（培養基）内へ 分割（５ｐｌｉｔ）させる、融合する日の朝セルを、２０χ牛脂児血清と２　ｘ 　ＯＰＩ　（３Ｂ／ｍｌオキサ０アセテート、　Ｏ，１ｍｇ／ｍｌヒＪレヘ−） 、０．４１Ｕ／ｍｌインシュリン）溶液で補充された、壽量のメディウムで稀釈 する。

マウスを殺した後、牌臓を無菌下で切除し、培地シャーレ内へ置く。セルは牌臓 が微細片になるまでかき裂き、大部分のセルは除去する。セルを新しい滅菌メデ ィウム内で洗い、凝集は沈澱させる。

牌臓細胞は、血清なしでメディウム中で遠心分離にかけてさらに２度洗う。第２ 回目の洗いの間に、ミエローマセルも、他の試験管中で洗う、最終洗いの後、２ つのセルベレットを結合し、一度一緒に遠心分離にかける。

セルベレットのセルが再分散されている間に、ＰＥＧの５（Ｈ＃ｍを徐々に全部 で２分間で加える。予め加温した１０１のメディウムをセル溶液に３分間で徐々 に撹拌しつつ加える。セルを遠心分離にかけ、上澄みを除く。セルを、２０χ牛 脂児血清、１ｘＯＰＩ溶液及びＩＸＡＭ溶渣（５８μにアザセリン、Ｏ，ＩｓＭ ヒボキサンチン）で補充したｌＯＯ１２メディウム中に再分散する。融合したセ ルは、９６ウエルのプレートに分画し、３７℃で１週間培養する。

上澄みを無菌下で各ウェルかも取出し、各プールに入れる。これらのプールは、 免疫抗原に対する反応性をテストする。陽性のプールをさらに、各ウェル毎にテ ストする。陽性ウェルを確認したら、セルを９６−ウェルプレートから、２０χ 牛脂児血清、１ｘＯＰＩ及びＩＸ＾Ｈて補充したメディウム０．５１１へと移す 、カルチャーが密になったらセルを５ｍｌへと増殖し、次いでさらに１０ｍ１へ と増殖する。この段階でセルを、単一の抗体を産生するセルがカルチャーの中に あるように、サブクローンする。

上述のプロセスに従って、ヒト以外のキメラ宿主、特にマウスの宿主で、ヒト抗 体又は抗原に特異的な類似物を産生ずるべく免疫されることが可能な、キメラ宿 主をつくることができる。このようにして、トランスジェニック宿主はヒト宿主 には使うことができなかった抗原で免疫できるので、ヒトモノクローナル抗体を 得ることに関連する種々の間層が解消される。さらに、ヒト宿主には許容されな いようなブースター注入剤及びアジュバント（抗原補強剤）を提供することもで きる。結果するＢ細胞は、所望の抗体の連続的な製造のための不壊死化（ｉｍ＋ ｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）のために用いることもできる。不壊死化したセル は、イムノグロブリン又は類似体をエンコードする遺伝子の単離のために用いる ことができ、さらには、１ｎ−ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（■ｕｔａｇｅｎｅｓｉ ｓ）又は抗体の性質を修飾するその他の技術のような方法により、分子の修飾を 行うこともできる。これらの修飾ジーンは次いで、不壊死化したセルへトランス フェクション（組換技術）により戻し、所望の抗体のためのホ乳動物の継続的細 胞ソースを提供することができる。本発明は、その中でヒト宿主内での抗体の生 産と類似の仕方で、ヒト抗体が生産される、ヒト抗体の好都合なソースを提供す る。動物宿主セルは、好都合にも、ヒト抗体の生産のため、宿主細胞内でヒトＤ ＮＡの活性化と組換えを提供する。

本発明によれば、ヒト抗原を備えた所定宿主ホ乳動物の免疫によって、ヒト抗原 、例えば蛋白質に対するヒト抗体が産生できる。得られる抗血清は、ヒトイムノ ゲンに特異的であり、また宿主の血清から得ることができる。免疫した宿主Ｂ＃ ｌｌ胞は、例えばミエローマセル融合、トランスフェクション、等の不壊死化の ために用いることができ、抗体、抗血清及びモノクローナル抗体はモノクローナ ル抗体を産生ずる例えばハイブリドーマのような不壊死性セルをつくるのに用い ることができ、抗体、抗血清及びモノクローナル抗体は抗体を産生するセルの種 類に応じてグリコシレート化する。抗体を産生するため！ｇ座の稀な可変領域を 探索して、稀な可変Ｉｌ域を有する抗体を得るようにするこあろう。

ＦＩＧ、　ＩＡ ＦＩＧ、旧 Ａ　ａ　ａｌｌｏｔｙｐｅ Ｂ　ｂ　ａｌｌｏｔｙｐｅ ＦＩＧ、３−１ Ｃａ／ｂＦＩ ＦＩＧ、３−２ １１戎 ρに、ＴＫ／Ｎｅ口 ＦＩＧ、　５ 天然のＥＳＩｉ胞の遺伝子座 ターゲティングされたＥＳ細胞の遺伝子座Ｊ領域のノックアウト　ベクター ＪＩＪ２　Ｊ３Ｊ４ ターゲティング図解 日ａｍＨＩ　ＸｂａｌＥｃｏＲＩ　ＥｃｏＲＩ　ＥｌａｍＨＩＮｅ。

５ａｃｌ　ＢａｍＨＩＸｈｏＩ　ＥｃｏＦＵ　ＨｉｎｄｌπＮｄａＩＧＫ　ＴＫ ｐｓＫ、Ｂ／（ＴＫｌｏ、８に／Ｎｅｏ）ｐＳＫ、Ｃ／３°に／ＤＴ ＦＩＧ、　ｌ２Ａ ＦＩＧ、　１２Ｂ Ｅ１４２−１３−１３−６５−２７−３８−５８−６８−？　ＶＨＰＲＴ「−一 一−−−−−−　ＥＳＹ　−−−−−ｍ−−−１ｙＨＰＲ丁Ｅ＋４２−１３−１ ３−６５−２７−３８−５８−６１ｆ−７１１１ＦＩＧ、　１３Ａ　ＦＩＧ、　 １３Ｂ ＦＩＧ、　１４ＣＦＩＧ、　１４Ｄ 了グーす　了り一ケ マウス　マウス ＦＩＧ、　１６ｃ マウスの交配チャート Ｆｌ　（友＆！、　Ｉ　Ａ）　Ｆｌ　（女＆！ＩＩＢ）Ｆ３　２亀り　局！催冶 ＦＩＧ、１７ 」 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，’　識別記号庁内ＩＥ理ｉ号Ｃｌ２Ｐ　２１１０８　 ９１６１−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＵ、　ＣＡ、　ＦＩ、ＪＰ、　ＫＰ、　Ｎｏ、　ＮＺ （７２）発明者　クラフォルツ、スー アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４３０５スタンフオード、ピータ−クーラ サー クル　７６ ＦＩ （７２）発明者　ブレンナー、ダニエル　ジ−アメリカ合衆国、カリフォルニア 　９４６０ルッドウッド　シティ、セントラルアヴ エニュ−８６ （７２）発明者　ケイポン、ダニエル　ジ−アメリカ合衆国、カリフォルニア　 ９４０１０ヒルスボロウ、ウッドリッジ　ロード

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１００ｋｂの異種ＤＮＡ断片を、それ自身のゲノムの中に含むよ うに、胚の幹細胞のゲノムを変異させるための改善方法であって、胚の幹細胞と 酵母のスフエロプラストー（但し、前記スフエロプラストは、前記異種ＤＮＡ断 片をもち、且つ選択の為のマーカーを含む、酵母の人工的な染色体（ＹＡＣ）を 有するもので、それによって、前記異種ＤＮＡ断片は前記胚の幹細胞のゲノムの 中に粗み込まれるようになる）−ｄを融合条件の下に結合し、マーカーによって 、前記異種ＤＮＡ断片を持つ胚の幹線胞を選択する工程を含む方法。
2. ２．人間以外の変異動物、即ち、前記動物の少なくとも数個の細胞のゲノムの中 に安定に粗み込まれた、少なくとも１００ｋｂの異種ＤＮＡ断片を持っ動物を生 産するための改良方法であって、 胚の幹細胞と酵母のスフエロプラストを融合条件の下に結合し（但し、前記スフ エロプラストは、前記異種ＤＮＡ断片をもち、且つ選択の為のマーカーを含む、 酵母の人工的な染色体（ＹＡＣ）を有するもので、それによって、前記異種ＤＮ Ａ断片は前記胚の幹細胞のゲノムの中に粗み込まれるようになる）、マーカーに よって、前記異種ＤＮＡ断片を持っている胚の幹細胞を選択し、 宿主胞胚の中に選択された胚の細胞を導入し、僞性妊娠の動物の受容体内に前記 胞胚を移植し、前記動物の少なくとも数個の細胞のゲノムの中に組み込まれた前 記異種ＤＮＡを持っているキメラな動物を生産するように前記胞胚を発現させる 、 工程を含む方法。
3. ３．人間以外の変異動物、即ち、前記動物の少なくとも数個の細胞のゲノムの中 に安定に組み込まれた、少なくとも１００ｋｂの異種ＤＮＡ断片を持つ動物を生 産するための改良方法であって、 胚の幹細胞と酵母のスフエロプラストを融合条件の下に結合し（但し、前記スフ エロプラストは、前記異種ＤＮＡ断片をもち、且つ選択の為のマーカーを含む、 酵母の人工的な染色体（ＹＡＣ）を有するもので、それによって、前記異種ＤＮ Ａ断片は前記胚の幹細胞のゲノムの中に組み込まれるようになる）、マーカーに よって、前記異種ＤＮＡ断片を持っている胚の幹細胞を選択し、 宿主胞胚の中に選択された胚の細胞を導入し、僞性妊娠の動物の受容体内に前記 胞胚を移植し、前記異種ＤＮＡを持っているキメラな動物を生産するように前記 胞胚を発現させ、 前記異種ＤＮＡ断片を持つ変異動物を生産するために、キメラな動物を同種の動 物と交配させる、工程を含む方法。
4. ４．前記マーカーは、ＨＰＲＴ遺伝子であり、前記胚の幹細胞はＨＰＲＴの欠失 変異である第１項、第２項及び第３項のいずれか一に記載の方法。
5. ５．前記異種ＤＮＡがヒトＤＮＡで、及び／又は前記異種ＤＮＡは、実質的に完 全な形のイムノグロブリンＤＮＡである、 第１項又は第２項のいずれか一に記載の方法。
6. ６．第１項又は第４項又は第５項に記載の方法に従って、変異されたゲノムを含 む胚の幹細胞。
7. ７．第２項から第５項のいずれか一に記載の方法に従って、生産された１変異動 物。
8. ８．第６項の幹細胞はゲッ歯類由来である。
9. ９．第８項の件細胞はマウス由来である。
10. １０．第７項の動物はげっ歯類である。
11. １１．第１０項の動物はマウスである。