ES2877376T3 - Anticuerpos para IL-17C - Google Patents

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ES2877376T3 ES17705873T ES17705873T ES2877376T3 ES 2877376 T3 ES2877376 T3 ES 2877376T3 ES 17705873 T ES17705873 T ES 17705873T ES 17705873 T ES17705873 T ES 17705873T ES 2877376 T3 ES2877376 T3 ES 2877376T3
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Jan Dominik Haas
Jürgen Klattig
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Galapagos NV
Morphosys GmbH
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Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende (a) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 7, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15 o (b) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 28.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos para IL-17C
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que interactúan con IL-17C humana. La invención se refiere también a ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras capaces de expresar dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos y usos de dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos para el tratamiento de enfermedades específicas.
Antecedentes
IL-17C es un homodímero secretado de la familia de la proteína IL17. Se ha demostrado in vitro que la IL-17C estimula la liberación de TNF-a e IL-1p a partir de la línea celular monocítica THP-1 (Li y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 97, 773-8). IL-17C puede inducir la expresión de ARNm de citocinas inflamatorias, tales como IL-1p, IL-6 e IL-23 en células de exudado peritoneal (PECS; del inglés, peritoneal exudates cells) y la línea celular 3T3 (Yamaguchi y col. (2007) J. Immunol 179, 7128-36).
El papel de IL-17C se ha propuesto como una citocina proinflamatoria relevante para la defensa de hospedadores en diversos estudios (Chang y col. (2011) Immunity 35, 6 l1 -621, Song y col. (2011) Nature Immunology 12, 12, Ramirez-Carrozzi y col. (2011) Nature Immunology 12, 12). También se ha demostrado recientemente un papel potencial en la progresión de tumores específicos y tejidos cancerosos (Xinyang Song (2014) Immunity 40, 140-152).
Recientemente, en el documento WO 2013/057241 se ha evaluado experimentalmente que la inhibición de IL-17C es un enfoque prometedor para tratar trastornos inflamatorios. Sin embargo, los anticuerpos respectivos utilizados en el documento WO 2013/057241 fueron anticuerpos sustitutos específicos para IL-17C de ratón, pero se demostró que no resultaron reactivos en absoluto respecto a la IL-17C humana. Además, ya se han sugerido anticuerpos adicionales que son antagónicos de IL-17C (por ejemplo, en el documento WO 1999/060127), pero son anticuerpos de sueros policlonales o sustitutos que solo se unen específicamente a IL-17C.
Por consiguiente, existe una necesidad de estudiar e identificar los anticuerpos que se unen a IL-17C humana para mejorar las enfermedades o trastornos relacionados con IL-17C en seres humanos.
Sumario de la invención
La presente divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos nuevos. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos desvelados en el presente documento se unen a la IL-17C humana y reaccionan de forma cruzada también con IL-17C del mono cinomolgo y del ratón. Además los anticuerpos desvelados inhiben la unión de IL-17C a su receptor en todas las especies relevantes (ser humano, ratón y mono cinomolgo) con una concentración CI50 de 80 pM o menos. Como se desvela y ejemplifica en el presente documento, dichos anticuerpos demostraron ser eficaces en diversos modelos de ratón in vivo para dermatitis atópica y psoriasis.
Por tanto, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos desvelados son superiores en términos de eficacia y proporcionan compuestos adecuados y prometedores para el tratamiento de seres humanos que tienen, por ejemplo, dermatitis atópica o psoriasis.
La presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a la IL-17C humana que tiene regiones CDR de acuerdo con la Tabla 1 de la presente memoria descriptiva. La presente divulgación proporciona también anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos que tienen una región variable de cadena pesada y unas regiones CDR de cadena ligera variable que comprenden las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la Tabla 1 de la presente memoria descriptiva.
La presente divulgación proporciona también anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos que compiten con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos desvelados en el presente documento. La presente divulgación proporciona también anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos desvelados en el presente documento.
La presente divulgación proporciona también los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de la presente divulgación para su uso en medicina.
La presente divulgación proporciona también procedimientos para tratar un sujeto afectado por un trastorno, tal como un trastorno inflamatorio, mediante la administración a dicho sujeto de una cantidad eficaz de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación. Preferentemente dicho sujeto es un ser humano.
La presente divulgación proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de la presente divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La presente divulgación proporciona también ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación.
La presente divulgación proporciona también vectores que comprenden ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación.
La presente divulgación proporciona también una célula hospedadora que comprende un vector o ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación.
Hay utilidad en los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos reivindicados. Asimismo, hay utilidad en el procedimiento reivindicado para identificar tales anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
La utilización de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos reivindicados es para alterar la actividad biológica de IL-17C humana. En particular, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos reivindicados son para uso terapéutico, tal como el tratamiento de trastornos inflamatorios de tipo, por ejemplo, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación pulmonar, EPOC y/o el tratamiento de la dermatitis atópica (DA), incluyendo la DA moderada a grave.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: El MAB n.° 1 evita de forma dependiente de la dosis el engrasamiento de la oreja inducido por la aplicación tópica de MC903 sobre la piel de la oreja.
Los datos se expresan como valores medios ± error típico de la media (ETM) (n=8 por grupo). La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. (DEX: dexametasona; EtOH: etanol)
Figura 2: El MAB n.° 1 reduce de forma dependiente de la dosis la inflamación de la oreja inducida por la aplicación tópica de MC903 sobre la piel de la oreja.
La inflamación de la oreja se evaluó el Día 5 utilizando la obtención de imágenes in vivo. Panel izquierdo: cuantificación de la intensidad de señal en las orejas. Los puntos de datos individuales (n=8 por grupo) representan la intensidad promedio de ambas orejas; los datos se muestran también como valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANo Va y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Panel derecho: las imágenes representativas de las orejas de ratón de animales de diferentes grupos de tratamiento se tomaron en el generador de imágenes Bruker In-vivo Xtreme 24h después de la inyección de la sonda Prosense 680. (DEX: dexametasona; EtOH: etanol)
Figura 3: El MAB n.° 1 reduce de forma dependiente de la dosis el engrasamiento de la capa epidérmica y dérmica de la piel inducido por la aplicación tópica de MC903 sobre la piel de la oreja.
Los datos se presentan como puntos de datos individuales (n=8 por grupo) y valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANo Va y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Panel izquierdo: datos para el grosor epidérmico; Panel derecho: datos para el grosor dérmico.
Figura 4: El MAB n.° 1 inhibe de forma dependiente de la dosis el aumento mediado por MC903 en la expresión en TSLP e IL-33 en la oreja y los niveles de TARC en plasma.
Los datos se presentan como puntos de datos individuales (n=8 por grupo) y valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente al grupo MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Panel izquierdo arriba: datos para la expresión de la proteína TSLP en la oreja; Panel izquierdo abajo: datos para la expresión de la proteína IL-33 en la oreja; Panel derecho arriba: datos para los niveles de la proteína TARC en plasma.
Figura 5: La administración terapéutica de MAB n.° 1 reduce de forma dependiente de la dosis el engrosamiento de la oreja inducido por la aplicación tópica de MC903 sobre la piel de la oreja.
Los datos se expresan como valores medios ± ETM (n=10 por grupo). La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. DEX: dexametasona; EtOH: etanol.
Figura 6: La administración terapéutica de MAB n.° 1 reduce de forma dependiente de la dosis la inflamación de la oreja inducida por la aplicación tópica de MC903 sobre la piel de la oreja.
La inflamación de la oreja se evaluó el Día 12 utilizando la obtención de imágenes in vivo y la intensidad de señal en las orejas se representa gráficamente. Los puntos de datos individuales (n=10 por grupo) representan la intensidad promedio de ambas orejas; los datos se muestran también como valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANo Va y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. DEX: dexametasona; EtOH: etanol.
Figura 7: La administración terapéutica de MAB n.° 1 reduce de forma dependiente de la dosis el engrosamiento de la capa epidérmica y dérmica de la piel inducido por la administración tópica de MC903 sobre la piel de la oreja.
Los datos se presentan como puntos de datos individuales (n=10 por grupo) y valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Panel izquierdo: datos para el grosor epidérmico; Panel derecho: datos para el grosor dérmico. DEX: dexametasona; EtOH: etanol.
Figura 8: La administración terapéutica de MAB n.° 1 reduce de forma dependiente de la dosis la infiltración dérmica de eosinófilos, linfocitos T y mastocitos.
Los datos se presentan como puntos de datos individuales (n=10 por grupo) y valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente a MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANo Va y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Panel izquierdo arriba: datos para los eosinófilos; Panel derecho arriba: datos para los mastocitos; Panel izquierdo abajo: datos para los linfocitos T. DEX: dexametasona; EtOH: etanol.
Figura 9: La administración terapéutica de MAB n.° 1 reduce la expresión de IL-33, IL-4 y S100A9, que todavía estuvo aumentada el Día 16 (11 días después de detener la aplicación de MC903).
Los datos se presentan como puntos de datos individuales (n=10 por grupo) y valores de la media (líneas horizontales) ± ETM. La significación estadística frente al grupo MC903+MOR03207 se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001. Panel izquierdo arriba: datos para la expresión de ARNm de S100A9 en la oreja; Panel izquierdo abajo: datos para la expresión de ARNm de IL-4 en la oreja; Panel derecho arriba: datos para los niveles de proteína IL-33 en la oreja.
Figura 10: El MAB n.° 1 reduce los signos clínicos macroscópicos de inflamación de tipo DA en el modelo de cola escamosa espontánea y crónica
La puntuación clínica de la inflamación cutánea para cada ratón se hizo al comienzo (semana 0) y al final (semana 6) del tratamiento. Los datos son la media ± DT para cada grupo de tratamiento (n=8 por grupo). La significación estadística frente al grupo tratado con anticuerpo de isotipo se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (*p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).
Figura 11: El MAB n.° 1 reduce la inflamación de los párpados de tipo eccematosa en el modelo de cola escamosa espontánea y crónica.
La inflamación de la piel de párpado se puntuó al final del tratamiento (semana 6). Los datos son la media ± DT para cada grupo de tratamiento (n=8 por grupo). La significación estadística frente al grupo tratado con anticuerpo de isotipo se calculó utilizando un ANOVA y la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (*p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001).
Descripción detallada de la invención
La divulgación pertenece a un número de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reconocen la IL-17C humana.
Definiciones:
El término "IL-17C" se refiere a una proteína conocida como interleucina 17C.
La IL-17C humana tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q9P0M4):
MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLA
RGAKWGQALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQR
SISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLV
LRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSV (SEQ ID No.: 1)
La IL-17C de ratón tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q8K4C5):
MSLLLLGWLPTGMTHQDPPSWGKPRSHRTLRCYSAEELSHGQAPPHLLTRS
ARWEQALPVALVASLEATGHRRQHEGPLAGTQCPVLRPEEVLEADTHERSIS
PWRYRIDTDENRYPQKLAVAECLCRGCINAKTGRETAALNSVQLLQSLLVLRR
QPCSRDGTADPTPGSFAFHTEFIRVPVGCTCVLPRSTQ (SEQ ID No.: 2)
La IL-17C de mono cinomolgo tiene la secuencia de aminoácidos de (XP_005592825.1):
MTLLPGLLFLTWLHACLAHQDPFLRGHPHTHGTPRCYSAEELPLGQAPPHLLA
RGAKWGQALPVALVSSLEAAGHRRRHDRPSAATQCPVLRPEEVLEADTHQR
SISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDPRTGRETAALNSVRLLQSLLV
LRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIRVPVGCTCVLPRSV (SEQ ID No.: 3)
El término "IL17RA" se refiere a una proteína conocida como receptor A de la interleucina 17. La IL17RA humana tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q96F46):
MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTC
LDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELS
VLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFWDPDQEYEVTVHHLPKPIPDG
DPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNES
THYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQ
PFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCM
TWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDWLKFAQ
FLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQ
ALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYWCYFSEVSCDGD
VPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQL
RAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPL
VREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVA
AVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMA
SPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSV
QSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFR
QLQKNSGWDTMGSESEGPSA (SEQ ID No.: 4)
El término "IL17RE" se refiere a una proteína conocida como receptor E de la interleucina 17. La IL17RE humana tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q8NFR9):
MGSSRLAALLLPLLLIVIDLSDSAGIGFRHLPHWNTRCPLASHTDDSFTGSSAYIPCRT
WWALFSTKPWCVRVWHCSRCLCQHLLSGGSGLQRGLFHLLVQKSKKSSTFKFYRR
HKMPAPAQRKLLPRRHLSEKSHHISIPSPDISHKGLRSKRTQPSDPETWESLPRLDS
QRHGGPEFSFDLLPEARAIRVTISSGPEVSVRLCHQWALECEELSSPYDVQKIVSGG
HTVELPYEFLLPCLCIEASYLQEDTVRRKKCPFQSWPEAYGSDFWKSVHFTDYSQH
TQMVMALTLRCPLKLEAALCQRHDWHTLCKDLPNATARESDGWYVLEKVDLHPQL
CFKFSFGNSSHVECPHQTGSLTSWNVSMDTQAQQLILHFSSRMHATFSAAWSLPG
LGQDTLVPPVYTVSQARGSSPVSLDLIIPFLRPGCCVLVWRSDVQFAWKHLLCPDVS
YRHLGLLILALLALLTLLGWLALTCRRPQSGPGPARPVLLLHAADSEAQRRLVGALA
ELLRAALGGGRDVIVDLWEGRHVARVGPLPWLWAARTRVAREQGTVLLLWSGADL
RPVSGPDPRAAPLLALLHAAPRPLLLLAYFSRLCAKGDIPPPLRALPRYRLLRDLPRL
LRALDARPFAEATSWGRLGARQRRQSRLELCSRLEREAARLADLG (SEQ ID No.: 5)
La IL17RE murina tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q8BH06):
MGSPRLAALLLSLPLLLIGLAVSARVACPCLRSWTSHCLLAYRVDKRFAGLQWGWF
PLLVRKSKSPPKFEDYWRHRTPASFQRKLLGSPSLSEESHRISIPSSAISHRGQRTK
RAQPSAAEGREHLPEAGSQKCGGPEFSFDLLPEVQAVRVTIPAGPKASVRLCYQW
ALECEDLSSPFDTQKIVSGGHTVDLPYEFLLPCMCIEASYLQEDTVRRKKCPFQSWP
EAYGSDFWQSIRFTDYSQHNQMVMALTLRCPLKLEASLCWRQDPLTPCETLPNATA
QESEGWYILENVDLHPQLCFKFSFENSSHVECPHQSGSLPSWTVSMDTQAQQLTL
HFSSRTYATFSAAWSDPGLGPDTPMPPVYSISQTQGSVPVTLDLIIPFLRQENCILVW
RSDVHFAWKHVLCPDVSHRHLGLLILALLALTALVGWLVLLGRRLLPGSGRTRPVLL
LHAADSEAQRRLVGALAELLRTALGGGRDVIVDLWEGTHVARIGPLPWLWAARERV
AREQGTVLLLWNCAGPSTACSGDPQAASLRTLLCAAPRPLLLAYFSRLCAKGDIPRP
LRALPRYRLLRDLPRLLRALDAQPATLASSWSHLGAKRCLKNRLEQCHLLELEAAKD
DYQGSTNSPCGFSCL (SEQ ID No.: 6)
Las expresiones "antagonista de IL-17C" y "un antagonista de IL-17C", se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier molécula que inhibe la actividad o función de la IL-17C. La expresión "antagonista de IL-17C" incluye, aunque no de forma limitativa, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a IL-17C. Preferentemente, un antagonista de IL-17C en la presente divulgación es un anticuerpo específico para la IL-17C humana. Tal anticuerpo puede ser de cualquier tipo, tal como un anticuerpo murino, uno de rata, uno quimérico, uno humanizado o uno humano.
El término "anticuerpo" como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro que interacciona con un antígeno. Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR; del inglés, complementarity determining regions), intercaladas con regiones que son más conservadas, denominadas regiones marco (FR; del inglés, framework regions). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR ordenadas desde el extremo amino al extremo carboxi, en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos camelizados y anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase. Tanto las cadenas ligeras como pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional.
La expresión "fragmento de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que retiene(n) la capacidad de interaccionar específicamente (por ejemplo, mediante unión, impedimento estérico, estabilización de la distribución espacial) con un antígeno. Entre los ejemplos de fragmentos de unión se incluyen, pero no se limitan a, un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, VH y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro a la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando procedimientos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite hacerlos como una sola cadena de proteínas en la que las regiones VL y VH se agrupan en parejas para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); véanse, por ejemplo, Bird y col., (1988) Science 242:423-426; y Huston y col., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única se conciben también para que estén abarcados por la expresión "fragmento de anticuerpo". Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se identifican selectivamente para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpos pueden incorporarse también a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136). Los fragmentos de anticuerpos pueden injertarse en armazones basados en polipéptidos tales como fibronectina tipo III (Fn3) (véase la patente de Estados Unidos n.° 6.703.199, que describe monocuerpos polipeptídicos de fibronectina). Los fragmentos de anticuerpos pueden incorporarse en moléculas de cadena simple que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de sitios de unión a antígeno (Zapata y col., (1995) Protein Eng. 8:1057-1062; y la patente de Estados Unidos n.° 5.641.870).
Un "anticuerpo humano" o un "fragmento de anticuerpo humano", como se utiliza en el presente documento, incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones tanto marco como c Dr se derivan de secuencias de origen humano. Asimismo, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de tales secuencias. El origen humano incluye, por ejemplo, secuencias de líneas germinales humanas o versiones mutadas de secuencias de líneas germinales humanas o un anticuerpo que contiene secuencias marco consenso derivadas del análisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, como se describe en Knappik y col., (2000) J Mol Biol 296:57-86).
Las estructuras y localizaciones de dominios variables de inmunoglobulinas, por ejemplo, las CDR, pueden definirse utilizando esquemas de numeración bien conocidos, por ejemplo, el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia o una combinación de Kabat y Chothia (véanse, por ejemplo, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat y col.; Lazikani y col., (1997) J. Mol. Bio. 273:927-948); Kabat y col., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed., Publicación NIH n.° 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services; Chothia y col., (1987) J. Mol. Biol.
196:901-917; Chothia y col., (1989) Nature 342:877-883; y Al-Lazikani y col., (1997) J. Mol. Biol. 273:927-948.
Un "anticuerpo humanizado" o un "fragmento de anticuerpo humanizado" se define en el presente documento como una molécula de anticuerpo que tiene regiones de anticuerpo constantes derivadas de secuencias de origen humano y las regiones de anticuerpo variables o partes de los mismos o solo las CDR se derivan de otras especies. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado puede ser injerto de CDR, en el que las CDR del dominio variable son de origen no humano, al tiempo que uno o más marcos del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (si lo hay) es de origen humano.
La expresión "anticuerpo quimérico" o "fragmento de anticuerpo quimérico" se define en el presente documento como una molécula de anticuerpo que tiene regiones de anticuerpo constantes derivadas de o que se corresponden con, secuencias encontradas en una especie y regiones de anticuerpo variables derivadas de otras especies. Preferentemente, las regiones de anticuerpo constantes se derivan de o se corresponden con, secuencias encontradas en seres humanos y las regiones de anticuerpo variables (por ejemplo, regiones VH, VL, CDR o FR) se derivan de secuencias encontradas en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, rata, conejo o hámster.
El término "aislado" se refiere a un compuesto, que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que está sustancialmente libre de otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Además, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos. Por tanto, en algunos aspectos, los anticuerpos proporcionados son anticuerpos aislados que se han separado de anticuerpos con una especificidad diferente. Un anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo aislado puede ser un anticuerpo monoclonal recombinante. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de una diana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, especies homólogas).
La expresión "anticuerpo recombinante", como se utiliza en el presente documento, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o segregan por medios no existentes en la naturaleza. Por ejemplo, anticuerpos aislados de una célula hospedadora transformada para expresar el anticuerpo, anticuerpos seleccionados y aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualesquier otros medios que impliquen el empalme de todo o una porción de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias a otras secuencias de ADN o anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado del mismo. Preferentemente, tales anticuerpos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de líneas germinales humanas. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, si bien se derivan y relacionan con las secuencias de VH y VL de líneas germinales humanas, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos in vivo. Un anticuerpo recombinante puede ser un anticuerpo monoclonal. En una realización, los anticuerpos y fragmento de anticuerpo desvelados en el presente documento se aíslan de la biblioteca de anticuerpos Ylanthia® como se desvela el documento US 13/321.564 o el documento US 13/299.367.
La expresión "anticuerpo monoclonal", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal representa un sitio de unión único que tiene una especificidad de unión y afinidad por epítopos particulares únicas.
Como se utiliza en el presente documento la expresión "se une específicamente a", "específicamente se une a", es "específico de/para" o "reconoce específicamente" o similar, se refiere a interacciones medibles y reproducibles tales como la unión entre una diana y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que es determinante de la presencia de la diana en presencia de una población heterogénea de moléculas, incluyendo moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a una diana (que puede ser un antígeno o un epítopo de un antígeno) es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a esta diana con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que con la que se une a otras dianas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a un epítopo sobre una proteína que está conservada entre la proteína de diferentes especies. En otra realización, la unión específica puede incluir, pero no requiere la unión exclusiva. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos desvelados en el presente documento se unen específicamente a IL-17C humana. Preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos desvelados específicos para IL-17C humana se unen específicamente a IL-17C de otra especie, tal como IL-17C de ratón, rata, mono rhesus y/o mono cinomolgo. Incluso más preferentemente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos desvelados en el presente documento son específicos para IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón. Los procedimientos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, un ensayo ELISA convencional. La puntuación puede llevarse a cabo mediante un desarrollo del color convencional (por ejemplo, anticuerpo secundario con peróxido de rábano rusticano y tetrametilbencidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en ciertos pocillos se puntúa mediante densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (=reacción negativa) puede ser Do 0,1; la reacción típica positiva puede ser DO 1. Esto significa que la diferencia positiva/negativa puede ser de más de 5 veces. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza utilizando no un solo antígeno de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tales como leche en polvo, BSA, transferrina o similares.
El término "avidez" se utiliza para describir la resistencia combinada de interacciones de enlaces múltiples entre proteínas. La avidez es distinta de la afinidad que describe la resistencia de un enlace simple. Como tal, la avidez es la resistencia sinérgica combinada de afinidades de enlaces (afinidad funcional) en vez de la suma de enlaces. Con los anticuerpos de la presente divulgación, ambos sitios de unión a antígeno de los pares VH/VL interaccionan simultáneamente con IL-17C. Si bien cada interacción de unión individual puede romperse fácilmente (dependiendo de la afinidad relativa), debido a que muchas interacciones de unión están presentes al mismo tiempo, la desunión transitoria de un sitio individual no permite a la molécula que se difunda y es probable que la unión de ese sitio se restablezca. El efecto global es sinérgico, una unión de antígeno a anticuerpo fuerte.
Como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la resistencia de la interacción entre el polipéptido y su diana en un solo sitio. Dentro de cada sitio, la región de unión del polipéptido interacciona a través de fuerzas no covalentes débiles con su diana en numerosos sitios; cuantas más interacciones, mayor afinidad.
El término "Kd", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de disociación, que se obtiene de la proporción de Kd respecto a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para las fracciones de unión a antígeno, como por ejemplo los anticuerpos monoclonales, pueden determinarse usando procedimientos bien establecidos en la técnica. Los procedimientos para determinar la Kd de una fracción de unión a antígeno, como por ejemplo un anticuerpo monoclonal, son la SET (titulación en equilibrio soluble; del inglés, soluble equilibrium titration) o la resonancia del plasmón superficial utilizando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®. En la presente divulgación un anticuerpo específico para IL-17C normalmente tiene una constante de disociación (Kd) (kd/ka) de menos de 5x10-2 M, menos de 10-2 M, menos de 5x10-3 M, menos de 10-3 M, menos de 5x10-4 M, menos de 10-4 M, menos de 5x10-5 M, menos de 10-5 M, menos de 5x10-6 M, menos de 10-6 M, menos de 5x10-7 M, menos de 10-7 M, menos de 5x10-8 M, menos de 10-8 M, menos de 5x10-9 M, menos de 10-9 M, menos de 5x10-10 M, menos de 10-10 M, menos de 5x10-11 M, menos de 10-11 M, menos de 5x10-12 M, menos de 10-12 M, menos de 5x10-13 M, menos de 10-13 M, menos de 5x10-14 M, menos de 10-14 M, menos de 5x10-15 M o menos de 10-15 M o inferior.
"Compite de forma cruzada" significa la capacidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otras fracciones de unión a antígeno para interferir con la unión de otros anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o fracciones de unión a antígeno a un antígeno específico en un ensayo de unión competitivo convencional. La capacidad o extensión en la que un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otras fracciones de unión a antígeno, es (son) capaz (capaces) de interferir con la unión de otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo o fracciones de unión a antígeno a un antígeno específico y por tanto, si puede decirse que compite de forma cruzada de acuerdo con la invención, puede determinarse utilizando ensayos de unión de competición convencionales. Un ensayo adecuado implica el uso de la tecnología Biacore (por ejemplo, mediante el uso del instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Upsala, Suecia)), que puede medir la extensión de las interacciones utilizando la tecnología de resonancia del plasmón superficial. Otro ensayo para medir la competición cruzada utiliza el enfoque basado en ELISA. En la solicitud de patente internacional n.° WO 2003/48731 se describe un procedimiento de alto rendimiento para anticuerpos de "unión de epítopos" basado en su competición cruzada. La competición cruzada está presente si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo objeto de investigación reduce la unión de uno de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 para IL-17C en un 60% o más, específicamente en un 70 % o más y más específicamente en un 80 % o más y si uno de los anticuerpos descritos en la Tabla 1 reduce la unión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo para IL-17C en un 60% o más, específicamente en un 70 % o más y más específicamente en un 80 % o más.
El término "epítopo" incluye cualquier región proteica que se reconozca específicamente por un anticuerpo o fragmento del mismo o un receptor de linfocitos T o que interaccione de otra manera con una molécula. Generalmente, los epítopos son de agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcar y habitualmente, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Tal como se apreciará por un experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que un anticuerpo pueda unirse específicamente podría ser un epítopo.
"Se une al mismo epítopo que" significa la capacidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otra fracción de unión a antígeno para unirse a un antígeno específico y unirse al mismo epítopo que el anticuerpo ejemplificado cuando se utiliza la misma técnica de mapeo de epítopos para comparar los anticuerpos. Los epítopos del anticuerpo ejemplificado y otros anticuerpos pueden determinarse utilizando técnicas de mapeo de epítopos. Las técnicas de mapeo de epítopos son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, los epítopos conformacionales se pueden identificar fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tal como mediante, por ejemplo, intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional.
Las composiciones de la presente divulgación pueden utilizarse para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. La presente divulgación, por tanto, incluye una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo funcional) como se desvela en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable a este efecto. En un aspecto relacionado, la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar un trastorno inflamatorio. Tal procedimiento contiene las etapas de administración a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo funcional) como se describe o contempla en el presente documento.
La presente divulgación proporciona procedimientos terapéuticos que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de IL-17C como se desvela a un sujeto que necesita tal tratamiento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", como se utiliza en el presente documento, se refiere a la cantidad de un anticuerpo de IL-17C necesaria para provocar la respuesta biológica deseada. De acuerdo con la invención objeto, la cantidad eficaz terapéutica es la cantidad de un anticuerpo de IL-17C necesaria para tratar y/o evitar una enfermedad.
"Sujeto" o "especie", como se utiliza en este contexto se refiere a cualquier mamífero, incluyendo roedores, tales como ratón o rata y primates, tales como mono cinomolgo (Macaca fascicularis), mono rhesus (Macaca mulatta) o seres humanos (Homo sapiens). Preferentemente el sujeto es un primate, más preferentemente un ser humano.
Realizaciones:
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
(a) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 7, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15 o
(b) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 28.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
(a) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 10, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15 o
(b) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 28.
En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
(a) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 7, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15 o
(b) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15 o
(c) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 28.
(d) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 28.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL 17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une específicamente a IL-17C humana.
En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal.
En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es del isotipo IgG. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es IgG1.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 y comprende adicionalmente una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 y comprende adicionalmente una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 y comprende adicionalmente una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 y comprende adicionalmente una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 o una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29.
En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 42.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 55.
En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado.
En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C para su uso en el tratamiento de un trastorno o afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C.
En una realización, la presente divulgación se refiere a una composición de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico o una pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a una composición de vectores que comprende un vector o una pluralidad de vectores que comprende la secuencia de ácido nucleico o pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se desvela en la Tabla 1.
En una realización, la presente divulgación se refiere a una célula que comprende una composición de vectores que comprende un vector o una pluralidad de vectores que comprende la secuencia de ácido nucleico o pluralidad de secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se desvela en la Tabla 1.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se desvela en la Tabla 1 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C bloquea la unión de IL-17C al receptor de IL-17C. En una realización adicional, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C bloquea la unión de IL-17C al receptor de IL-17C, en el que dicho receptor es IL17RE. En otra realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo bloquea la unión de IL-17C a IL17RE. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une de forma bivalente a un homodímero de IL-17C y forma un complejo que consiste en dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un homodímero de IL-17C y en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo bloquea la unión de IL-17C a IL17RE.
En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C bloquea la unión de IL-17C a uno o más receptores de IL-17C. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29.
En realizaciones alternativas, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL-17C bloquea la unión de IL-17C a los receptores de IL-17C, en los que los receptores de IL-17C incluyen IL17RE e IL17RA. En realizaciones alternativas, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL-17C bloquea la unión de IL-17C a IL17RE e IL17RA. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C bloquea la unión de IL-17C a IL17RE con una concentración CI50 de menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En ciertos aspectos, la concentración CI50 puede determinarse mediante ELISA; SET, FACS o MSD (descubrimiento a mesoescala; en inglés, Meso Scale Discovery). En otro aspecto, la concentración CI50 puede determinarse mediante el procedimiento como se describe en el presente documento en el Ejemplo 3. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ iD NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ iD NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado es específico para IL-17C humana. En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado específico para IL-17C reacciona de forma cruzada con IL-17C de otras especies, tal como IL-17C de ratón, rata, mono rhesus y/o mono cinomolgo. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón. En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28 o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29.
En todavía otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado se une específicamente a IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón y bloquea la unión de IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón a su receptor específico IL17RE con una concentración CI50 de menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En otro aspecto, dicho anticuerpo está en formato de IgG1. En otra realización, dicha concentración CI50 se determina en un ensayo de inhibición de receptores, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 3.
En todavía otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado se une específicamente a IL-17C humana y bloquea la unión de IL-17C humana a IL17RE humana con una concentración CI50 de menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En otro aspecto, dicho anticuerpo está en formato de IgG1. En otras realizaciones, dicha concentración CI50 se determina en un ensayo de inhibición de receptores, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 3.
En todavía otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado se une específicamente a IL-17C de mono cinomolgo y bloquea la unión de IL-17C de mono cinomolgo a IL17RE de mono cinomolgo con una concentración CI50 de menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En otro aspecto, dicho anticuerpo está en formato de IgG1. En otras realizaciones, dicha concentración CI50 se determina en un ensayo de inhibición de receptores, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 3.
En todavía otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado se une específicamente a IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón y bloquea la unión de IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón, a IL17RE humana, IL17RE de mono cinomolgo e IL17RE de ratón, respectivamente, cada uno con una concentración CI50 de menos de 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En una realización preferida, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15, o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15, o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28, o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29. En otro aspecto, dicho anticuerpo está en formato de IgG1. En otras realizaciones, dicha concentración CI50 se determina en un ensayo de inhibición de receptores, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 3.
En todavía otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado inhibe la activación impulsada por IL-17C humana, IL-17C de mono cinomolgo e IL-17C de ratón de un gen indicador de NF-kB en células NIH3T3 con una concentración CI50 de menos de 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En una realización preferida, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15, o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 10, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 11, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 12, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15, o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28, o
la región HCDR1 de la SEQ ID NO: 23, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 24, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 25, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29. En otro aspecto, dicho anticuerpo está en formato de IgG1. En otras realizaciones, dicha concentración CI50 se determina en un ensayo indicador de NF-kB impulsado por IL-17C, como se describe en el presente documento en el Ejemplo 4.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado es específico para IL-17C humana codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado es específico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización adicional, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal específico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado es específico para IL-17C humana codificada por la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado específico para IL-17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado específico para IL-17C es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. En una realización adicional, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano recombinante. En una realización adicional, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano recombinante aislado. En una realización adicional, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano recombinante o anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano recombinante aislado es monoclonal.
En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o una cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 29 o una cadena pesada y una cadena ligera que tiene al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 o 30 y con la cadena ligera de la SEQ ID NO: 16 o 29.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado comprende una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena ligera humana. En una realización adicional, dicha región constante de cadena pesada humana comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 y la región constante de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 16 o dicha región constante de cadena pesada humana comprende las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID: 30 y la región constante de cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 29.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo desvelado es del isotipo IgG. En todavía otra realización, dicho anticuerpo es IgG1.
En una realización, dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento de anticuerpo bivalente.
Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo pueden identificarse utilizando cualquiera de las técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, Nueva Jersey. Por ejemplo, los epítopos pueden determinarse mediante, por ejemplo, la síntesis de manera concurrente de grandes cantidades de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos con porciones de la molécula proteica y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos aún están unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en la materia y se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.708.871; Geysen y col., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen y col., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. De manera similar, los epítopos se pueden identificar fácilmente mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos tal como mediante, por ejemplo, intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, citado anteriormente. También pueden identificarse regiones antigénicas de proteínas utilizando gráficos de antigenicidad e hidropatía convencionales, tales como los calculados utilizando, por ejemplo, el software Omiga versión 1.0, disponible por el Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el procedimiento de Hopp/Woods, Hopp y col., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828; para determinar los perfiles de antigenicidad y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte y col., (1982) J.Mol. Biol. 157:105-132; para los gráficos de hidropatía.
En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende 6 CDR definidas por Kabat de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 1. En otro aspecto, la divulgación pertenece a un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado que comprende 6 CDR definidas por Kabat de cada uno de los anticuerpos en la Tabla 1.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende 6 CDR definidas por Chotia de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 1. En otro aspecto, la divulgación pertenece a un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado que comprende 6 CDR definidas por Chotia de cada uno de los anticuerpos en la Tabla 1.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación se refiere a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo desvelados en la Tabla 1, en los que dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden unirse a IL-17C con una afinidad de aproximadamente menos de 100 nM, más preferentemente menos de aproximadamente a 60 nM y todavía más preferentemente menos de aproximadamente 30 nM. Adicionalmente se prefieren anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unan a IL-17C con una afinidad de menos de aproximadamente 10 nM y más preferentemente menos de aproximadamente 3 nM.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación se refiere a los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo desvelados en la Tabla 1, en los que dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden unirse a IL-17C con una afinidad monovalente de aproximadamente menos de 100 nM, más preferentemente menos de aproximadamente a 60 nM y todavía más preferentemente menos de aproximadamente 30 nM. Adicionalmente se prefieren anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unan a IL-17C con una afinidad monovalente de menos de aproximadamente 10 nM y más preferentemente menos de aproximadamente 3 nM.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a anticuerpos o fragmentos de anticuerpo específicos para IL17C, en los que dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos tienen una afinidad monovalente para IL-17C con una constante de disociación (Kd) de menos de 5x10-2 M, menos de 10-2 M, menos de 5x10-3 M, menos de 10-3 M, menos de 5x10-4 M, menos de 10-4 M, menos de 5x10-5 M, menos de 10-5 M, menos de 5x10-6 M, menos de 10-6 M, menos de 5x10-7 M, menos de 10-7 M, menos de 5x10-8 M, menos de 10-8 M, menos de 5x10-9 M, menos de 10-9 M, menos de 5x10'1° M, menos de 10-10 M, menos de 5x10-11 M, menos de 10-11 M, menos de 5x10-12 M, menos de 10-12 M, menos de 5x10-13 M, menos de 10-13 M, menos de 5x10-14 M, menos de 10-14 M, menos de 5x10-15 M o menos de 10-15 M y en los que dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en un formato bivalente tienen una afinidad por IL-17C con una constante de disociación (Kd) que es al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 10000 veces, 100000 veces menor que la constante de disociación (Kd) en un formato monovalente. En una realización adicional la afinidad bivalente de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se determina en formato de IgG, en la que la afinidad monovalente de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se determina en formato de Fab.
Las composiciones de la presente divulgación son preferentemente composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C como se desvela en el presente documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un trastorno inflamatorio o cáncer. Tales vehículos, diluyentes y excipientes son bien conocidos en la técnica y el experto en la materia encontrará una formulación y una ruta de administración más adecuadas para tratar un sujeto con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de IL-17C de la presente divulgación.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C como se desvela en el presente documento para su uso en el tratamiento de un trastorno o afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C. En otra realización, dicha afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C es un trastorno inflamatorio o cáncer. En otra realización, dicho trastorno inflamatorio es artritis reumatoide, psoriasis, inflamación pulmonar, EPOC y/o dermatitis atópica (DA), incluyendo la DA moderada a grave. En una realización preferida, dicho trastorno inflamatorio es dermatitis atópica (DA) y/o DA moderada a grave.
En otra realización, la presente divulgación se refiere al uso de dichas composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C como se desvela en el presente documento en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno o afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C. En otra realización, dicha afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C es un trastorno inflamatorio o cáncer. En otra realización, dicho trastorno inflamatorio es artritis reumatoide, psoriasis, inflamación pulmonar, EPOC y/o dermatitis atópica (DA), incluyendo la DA moderada a grave. En una realización preferida, dicho trastorno inflamatorio es dermatitis atópica (DA) y/o DA moderada a grave.
En otra realización, la presente divulgación se refiere al uso de dicha composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno o afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C. En otra realización, dicha afección asociada con la presencia indeseada de IL-17C es un trastorno inflamatorio o cáncer. En otra realización, dicho trastorno inflamatorio es artritis reumatoide, psoriasis, inflamación pulmonar, EPOC y/o dermatitis atópica (DA), incluyendo la DA moderada a grave. En una realización preferida, dicho trastorno inflamatorio es dermatitis atópica (DA) y/o DA moderada a grave.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un procedimiento para tratar dermatitis atópica (DA) y/o dermatitis atópica moderada a grave (DA) en un sujeto, comprendiendo el procedimiento administrar una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de IL-17C de la presente divulgación. En una realización, dicho sujeto es resistente, no responde o responde inadecuadamente al tratamiento mediante corticosteroides tópicos (CST) o un inhibidor de calcineurina. En otra realización, el sujeto es un sujeto que lo necesita. En una realización preferida, dicho sujeto es un ser humano. En aspectos alternativos dicho sujeto es un roedor, tal como una rata o un ratón.
En otra realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para la profilaxis de un trastorno inflamatorio en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar un antagonista de IL-17C a dicho sujeto. "Profilaxis" como se utiliza en este contexto se refiere a procedimientos que se dirigen a prevenir el inicio de una enfermedad o que retrasan el inicio de una enfermedad. En algunas realizaciones, dicho sujeto es un ser humano. En aspectos alternativos dicho sujeto es un roedor, tal como una rata o un ratón.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para IL-17C de la presente divulgación se administran por vía subcutánea. En otros aspectos, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para IL-17C de la presente divulgación se administran por vía intravenosa, intraarticular o intraespinal.
En una realización, la divulgación pertenece a un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado que comprende una VH y una VL de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 1.
En otra realización, la divulgación pertenece a un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado que comprende una cadena pesada (IgG1) y una cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 1.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de cadena pesada y/o secuencia de cadena ligera de un anticuerpo que se une a IL-17C, comprendiendo el ácido nucleico
una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 58, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 59, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 60, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 64, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 65 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 66, o
una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 61, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 62, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 63, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 64, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 65 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 66, o
una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 33, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 34, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 35, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 39, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 40 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 41, o
una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 36, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 37, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 38, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 39, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 40 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 41, o
una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 46, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 47, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 48, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 52, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 53 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 54, o
una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 49, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 50, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 51, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 52, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 53 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 54.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una región VH de la SEQ ID NO: 19 y una región de VL de la SEQ ID NO: 18 o una región VH y una región VL que tienen al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la región VH de la SEQ ID NO: 19 y/o la región VL de la SEQ ID NO: 18.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una región VH de la SEQ ID NO: 68 y una región de VL de la SEQ ID NO: 67 o una región VH y una región VL que tienen al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la región VH de la SEQ ID NO: 68 y/o la región VL de la SEQ ID NO: 67.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una región VH de la SEQ ID NO: 32 y una región de VL de la SEQ ID NO: 31 o una región VH y una región VL que tienen al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de identidad con la región VH de la SEQ ID NO: 32 y/o la región VL de la SEQ ID NO: 31.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una cadena pesada (IgG1) de la SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 44.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una cadena pesada (IgG1) de la SEQ ID NO: 70 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 69.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una cadena pesada (IgG1) de la SEQ ID NO: 71 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 57.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una VH y una VL de cualquiera de los anticuerpos de la Tabla 1.
En otra realización, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado en el que el ácido nucleico comprende una cadena pesada (IgG1) y una cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos en la Tabla 1.
En otra realización, la divulgación se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo o fragmento del mismo monoclonal aislado de cualquiera de los anticuerpos de la Tabla 1.
Tabla 1: Secuencias de los anticuerpos
Figure imgf000017_0001
(continuación)
Figure imgf000018_0001
(continuación)
Figure imgf000019_0001
(continuación)
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continuación
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Ejemplos de trabajo
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA análisis de la varianza
BSA albúmina de suero bovino
BW peso corporal
CDR región determinante de complementariedad DDL dispersión dinámica de la luz
DMEM medio Eagle modificado por Dulbecco
CE50 concentración eficaz al 50 %
ECD dominio extracelular
ECL electroluminiscencia
ELISA enzimoinmunoanálisis de adsorción
EtOH etanol
Fab fragmento de unión a antígeno
FBS suero fetal bovino
Fc fragmento constante
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
i.p. vía intraperitoneal
i.v. vía intravenosa
concentración inhibitoria al 50 %
IFN-y interferón gamma
ig inmunoglobulina
IHC inmunohistoquímica
IL-17R receptor de interleucina 17
IL-xx interleucina xx
Kd constante de disociación
MC903 calcipotriol
MPEK queratocitos primarios de ratón
ARNm ácido ribonucleico mensajero
NF-kB factor kappa B nuclear
p.o. per os, vía oral
PBS solución salina tamponada con fosfato
qPCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
qRT-PCR reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
ETM error típico de la media
Th2 linfocitos T auxiliares tipo 2
Ejemplo 1: Generación de antígeno, fragmentos Fab y anticuerpos
1.1 Generación de antígenos y control de calidad
Se alinearon las secuencias de aminoácidos de IL-17C humana, de mono cinomolgo y de ratón.
Sin secuencia líder, se comparte una homología de un 79 % entre las tres especies.
Figure imgf000026_0001
La IL-17C de diferentes especies se adquirió de diferentes proveedores o se produjo internamente y se solubilizó, en caso necesario. Por 100 |jg de proteína se añadieron 4 j l de reactivo de biotinilación del módulo de biotinilación de ECL™ y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente en oscuridad con agitación suave. Posteriormente, la proteína biotinilada se purificó utilizando columnas de centrifugación ZebaTM Desalt y se determinó la DO280nm.
Los antígenos se biotinilaron utilizando el módulo de biotinilación ECL™ (GE Healthcare; n.° 1061918). Tras la biotinilación el producto se purificó utilizando las columnas de centrifugación ZebaTM Desalt (Pierce; n.° 89889).
La IL-17C de ratón, de cinomolgo y humana biotinilada y no biotinilada se sometieron a un control de calidad que comprende análisis en condiciones no reductoras de desnaturalización, reducción y desnaturalización, en SDS-PAGe y en estado natural mediante cromatografía de exclusión por tamaño a alta presión (HP-SEC) y dispersión dinámica de la luz (DDL).
La HP-SEC se realizó en un sistema de HPLC Dionex UltiMate 3000 Titanium (Dionex Corporation, Germering, Alemania) junto con Wyatt miniDAWN Treos y Wyatt Optilab rEX (Wyatt Technology Europe, Dernbach, Alemania). Para la separación se utilizó una columna Tosoh TSK-Gel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Alemania). Para cada muestra, se cargaron 15 jg de proteína en la columna, la separación se realizó en un caudal de 0,5 ml/min y se registró y analizó la absorción UV a 280 nm. El tampón de ejecución se compuso de NaH2PO449 mM, Na2HPO4 51 mM, K2SO4100 mM, Tween-80 al 0,0005 % a pH 6,8.
Todos los experimentos de DDL se realizaron usando un sistema de cubetas DynaPro Titan (Wyatt Technology Europe, Dernbach, Alemania) con concentraciones de proteína entre 0,2 y 1,0mg/ml. En caso de precipitación o formación de partículas, la muestra se centrifugó a 10,000 g durante 5 minutos antes del experimento.
El dominio extracelular (ECD) del receptor E de IL-17 de ratón (UniProt Q8BH06, isoforma 1) y el receptor E de IL-17 humana (UniProt Q8NFR9) se clonaron en el vector de expresión pMAX_vk_Fc2_His utilizando Kpnl y EcoRV dando como resultado construcciones de fusión de Fc2_H de extremo C terminal. Además del líder natural (AG00158) se generó una segunda construcción con un líder de Vk (AG00159).
Ambas construcciones se expresaron transitoriamente en células HKB11. La suspensión celular se aumentó a escala tres días tras la transfección y el sobrenadante del cultivo celular se recogió 6 días después de la transfección. Después de la filtración estéril, la solución se sometió a cromatografía de afinidad de la proteína A. El intercambio de tampón se realizó en PBS y las muestras se filtraron estériles (tamaño de poro 0,2 jm ). Las concentraciones de proteína se determinaron mediante espectrofotometría UV. La pureza de los productos se analizó en condiciones no reductoras de desnaturalización, reducción y desnaturalización, en SDS-PAGE y en estado natural mediante HP-SEC y DDL.
1.2. Selecciones y generación de Fab / Anticuerpo
Para la generación de anticuerpos se utilizó la biblioteca MorphoSys Ylanthia® para seleccionar los fragmentos Fab contra la IL-17C humana. La biblioteca MorphoSys Ylanthia® (Tiller y col. mAbs 5:3, 1-26; Mayo/Junio (2013) y patente de Estados Unidos n.° 8.728.981) es una biblioteca de fagémidos disponible comercialmente y emplea la tecnología CysDisplay® para presentar el Fab sobre la superficie de fagos (Lohning y col., WO2001/05950).
Para identificar los anticuerpos específicos de IL-17C se utilizaron diferentes estrategias de selección (en inglés, panning). Cada estrategia de selección comprendió al menos 3 rondas individuales de selección contra los antígenos respectivos, incluyendo la IL-17C humana (SEQ ID NO: 1) y la IL-17C de ratón.
Los clones aislados se identificaron cuando maduraron, modificaron por ingeniería genética y/o se hicieron líneas germinales con el fin de aumentar la afinidad y/o funcionalidad. Posteriormente, se cribaron varios cientos de clones y se analizó la funcionalidad rigurosamente en ensayos in vitro que comprenden, por ejemplo, la evaluación de la unión a IL-17C humana, de cinomolgo y de ratón a través de SET, la inhibición de la unión a IL-17C humana, de mono cinomolgo y de ratón a su IL-17RE respectivo y la inhibición funcional de IL-17C (ensayo indicador de NF-kB impulsado por IL-17RE en células NIH3T3 de ratón y expresión de CSF3 mediada por IL-17C en queratocitos primarios de ratón (MPEK; del inglés, mouse primary keratinocytes)).
Finalmente, se seleccionaron dos moléculas líder preferidas (MAB n.° 1 y MAB n.° 2) y se describen adicionalmente en los ejemplos de trabajo como se esboza más adelante.
Ejemplo 2: Determinación de la afinidad en formato de Fab monovalente e IgG bivalente
La afinidad de Fab monovalente y de IgG bivalente se determinó mediante SET. Por tanto, se titularon los Fab humanos en IL-17C humana, de cinomolgo y de ratón para la determinación de KD. Se titularon las IgG purificadas respectivamente en IL-17C humana, de cinomolgo y de ratón para la determinación de CE50.
La titulación en equilibrio de solución (SET) se realizó básicamente como se describe en la literatura (Friquet y col., (1985) J. Immunol. Meth. 77: 305-19). Con el fin de mejorar la sensibilidad y precisión del procedimiento de s Et , se transfirió de un ELISA clásico a una tecnología basada en ECL (Haenel y col. (2005) Anal Biochem. 339,1: 182-84).
Los resultados respectivos para MAB n.° 1 y MAB n.° 2 se muestran en la Tabla 2 y Tabla 3, respectivamente.
Ejemplo 3: Caracterización de Fab o IgG específicos de IL-17C para la actividad de inhibición del receptor
Los Fab o IgG específicos de IL-17C purificados, se analizaron respectivamente en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de IL-17C a su receptor específico IL-17RE. Por tanto, las placas de 384 pocillos MA6000 (descubrimiento a mesoescala, MSD) se revistieron con 30 pl de proteína quimérica IL17RE/Fc a 75 ng/ml en PBS a 4 °C durante la noche. Al día siguiente se preincubó una serie de diluciones de anticuerpos (concentraciones de 0,001 a 100 nM) durante 30 min a TA con un volumen igual de IL-17C humana/de cinomolgo o de ratón biotinilada para determinar una concentración CI50 para la inhibición de unión al receptor. Después del bloqueo de las placas durante 1h con BSA al 2,5 % en PBST, los complejos de anticuerpo-ligando formados previamente se añadieron durante 1h al IL17RE/Fc revestido y la unión al receptor se detectó a través de estreptavidina-ECL utilizando un generador de imágenes por sectores de MSD.
Ambos anticuerpos (MAB n.° 1 y MAB n.° 2) inhibieron igualmente la interacción de IL-17C humana/de cinomolgo o ratón con IL-17RE en el formato de Fab y de IgG. Las concentraciones CI50 en el intervalo de pM de doble dígito se observaron para ambos anticuerpos en formato de IgG en las tres especies relevantes clínicamente. Los resultados se muestran en las filas 3 y 4 en la Tabla 2 y en la Tabla 3, respectivamente.
Ejemplo 4: Prueba funcional en el ensayo indicador de NF-kB impulsado por IL-17C
Se analizaron adicionalmente IgG específicas de IL-17C purificadas en cuanto a su capacidad de inhibir la actividad biológica de IL-17C humana, de ratón y de cinomolgo en un ensayo basado en células funcionales que monitoriza la activación impulsada por IL-17C de un gen indicador de NF-kB en células NIH3T3 que sobreexpresan IL-17RE murino.
Las células NIH3T3 se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10 % y Pen/Strep al 1 % a 37 °C, 5 % de CO2. Para el ensayo, las células NIH3T3 se transfectaron en suspensión con una cantidad total de ADN de 100 ng (20 ng de construcción de expresión de IL-17RE de ratón, 50 ng de construcción indicadora de NF-kB luciferasa y 30 ng de pBluescript) utilizando el agente de transfección Polyplus jet-PEI. En resumen, el ADN se diluyó en 5 pl de NaCl 150 mM (por pocillo) y se prepararon 0,2 pl de jet-PEI en 8 pl de NaCl 150 mM (por pocillo). Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, la solución JetPEI® se añadió a la solución de ADN y se incubó adicionalmente durante 20-30 minutos a temperatura ambiente. Las células NIH3T3 se diluyeron para tener -40.000 células en 87 pl de medio. Las células se añadieron a la mezcla de ADN-JetPEI I® (87 pl de células y 13 pl de mezcla de ADN-JetPEI I®/pocillo) y el volumen final se transfirió a placas de 96 pocillos.
Tras una incubación durante la noche a 37 °C en un incubador de CO2 al 5 % humidificado, se retiró el medio y se reemplazó jetPEI® con 90 pl de medio que contenía FBS al 5 % y Pen/Strep al 1 %. Se añadieron a las células 10 pl de una dilución de anticuerpos en serie en DPBS que se preincubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con un volumen igual de IL-17C recombinante purificada (IL-17C humana (Novus n.° NBP1-42910), mIL-17C de ratón (R&D Systems n.° 2306-ml-025) o IL-17C de cinomolgo (producida internamente)). La concentración final de IL-17C fue 0,5 ng/ml.
Tras incubar las placas a 37 °C en un incubador de CO2, se añadieron 100 pl de SteadyLite Plus (Perkin Elmer), seguido de la lectura de la luminiscencia en el Envision (Perkin Elmer).
Ambos anticuerpos redujeron eficazmente la activación del gen indicador de NF-kB mediada por IL-17RE en presencia de IL-17C humana, de ratón y de cinomolgo. Los resultados respectivos pueden encontrarse en la fila 5 de la Tabla 2 y de la Tabla 3, respectivamente.
Ejemplo 5: Expresión génica impulsada por IL-17C en queratinocitos humanos primarios
Los queratinocitos expresan endógenamente los receptores IL-17RE e IL-17RA, los cuales se necesitan para la señalización funcional de IL-17C. Se utilizaron, por tanto, queratinocitos primarios humanos derivados de individuos sanos y queratinocitos primarios de ratón derivados de ratones C57BL/6 para determinar la capacidad de la IgG1 MAB n.° 1 y de la IgG1 MAB n.° 2 para inhibir la actividad biológica de IL-17C humana y de ratón respectivamente en un contexto más fisiológico.
Se obtuvieron NHEK (queratinocitos epidérmicos humanos normales; del inglés, normal human epidermal keratinocytes) de Lonza y se cultivaron en medio de crecimiento de queratinocitos con suplementos (KGM-Gold™ Bullet kit, Lonza), siguiendo el protocolo del fabricante. Las NHEK que se subcultivaron y se crioconservaron, en el pase 3 se descongelaron y se sembraron inmediatamente en medio de cultivo celular k Gm a 30.000 células/pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Después de 2 días, el medio se retiró y se cambió a KGM-Gold sin hidrocortisona antes de la adición de hIL-17C (Novus n.° NBP1-42910) y hTNFa (Peprotech n.° 300-01A) a concentraciones finales de 10 ng/ml cada una.
Para analizar los anticuerpos, primero se preincubó IL-17C humana durante 30 minutos a temperatura ambiente con un volumen igual de una dilución en serie de anticuerpo preparada en DPBS. Las células se estimularon con IL-17C recombinante (preincubada con o sin una dilución de anticuerpo) en presencia de TNFa. Se sabe que la coestimulación con IL-17C y TNFa da como resultado la inducción sinérgica de diversos genes y se demostró que es necesaria ya que la IL-17C sola tiene un efecto limitado sobre la expresión de los genes investigados.
Las células se cultivaron durante 48 horas y a continuación, se extrajo el ARN total utilizando el kit RNeasy 96 (Qiagen), se transcribieron de forma inversa utilizando los reactivos de transcripción inversa de TaqMan® (Applied Biosystems) y se determinó la expresión de los genes beta-defensina 2 DEFB4A (humano) o CSF3 (ratón) mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). En resumen, se prepararon 10 pl de reacciones de PCR utilizando la mezcla maestra de PCR universal de TaqMan®/No AmpErase® UNG y los conjuntos de cebador/sonda del ensayo de expresión génica bajo demanda prediseñados para DEF4B o CSF3 (n.° Hs00823638_m1, todo Applied Biosystems). La qPCR se realizó en un instrumento de PCR en tiempo real ViiA7™ (Applied Biosystems). La expresión génica se normalizó para un gen constitutivo con p-actina (conjunto de cebadores TaqMan n.° 4310881E) o GAPDH (conjunto de cebadores TaqMan n.° 4310893E).
Se demostró que ambos anticuerpos (MAB n.° 1 y MAB n.° 2) redujeron eficazmente la expresión génica de 2 DEFB4A (humano) o CSF3 (ratón) respectivamente y se confirmó su capacidad para neutralizar la actividad biológica de IL-17C humana y también la IL-17C de ratón (Tabla 2 y Tabla 3).
Visión de conjunto de la caracterización in vitro funcional:
Los resultados respectivos del análisis in vitro se resumen en la Tabla 2 para el MAB n.° 1 y en la Tabla 3 para el MAB n.° 2. Las secuencias de aminoácidos y las de ácidos nucleicos de las regiones variables y de las CDR de los dos anticuerpos se muestran en la Tabla 1. Ambos anticuerpos cumplieron con los criterios respectivos y se consideraron como moléculas potenciales para el desarrollo clínico.
Tabla 2: Sumario de la caracterización in vitro del MAB n.° 1
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Tabla 3: Sumario de la caracterización in vitro del MAB n.° 2
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Ejemplo 6: Ensayo de competición cruzada basada en ELISA
La competición cruzada de un anticuerpo anti-IL-17C u otro agente de unión a IL-17C puede detectarse utilizando un ensayo ELISA de acuerdo con el siguiente procedimiento convencional.
El principio general del ensayo ELISA implica revestir de un anticuerpo anti-IL-17C (tal como MAB n.° 1 o MAB n.° 2) los pocillos de una placa ELISA. A continuación, se añade en solución una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-IL-17C potencialmente competitivo de forma cruzada (es decir, no unido a la placa ELISA). Posteriormente, se añade a los pocillos una cantidad limitada de IL-17C-Fc.
El anticuerpo que reviste los pocillos y el anticuerpo en solución competirán por la unión del número limitado de moléculas de IL-17C. A continuación, la placa se lava para eliminar las moléculas de IL-17C que no se han unido al anticuerpo revestido y también para eliminar el segundo anticuerpo en fase de solución, así como cualquier complejo formado entre el segundo anticuerpo en fase de solución e IL-17C. La cantidad de IL-17C unida se mide, a continuación, utilizando un reactivo de detección de IL-17C apropiado. Por tanto, IL-17C puede fusionarse con una etiqueta, por ejemplo, Fc, Flag, etc., que puede detectarse mediante un agente específico de etiqueta adecuado.
Un anticuerpo en solución que sea competitivo de forma cruzada con el anticuerpo revestido podrá provocar una disminución en el número de moléculas de IL-17C a las que el anticuerpo revestido pueda unirse, en relación con el número de moléculas de IL-17C a las que el anticuerpo revestido pueda unirse en ausencia del segundo anticuerpo en fase de solución.
Este ensayo se describe con más detalle para dos anticuerpos denominados Ab-X y Ab-Y más adelante. En el caso en que se elige Ab-X para ser el anticuerpo inmovilizado, este se reviste en los pocillos de la placa ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada para minimizar la unión no específica de los reactivos que se añaden posteriormente. A continuación, se añade una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa ELISA, de modo que los moles de sitios de unión de IL-17C de Ab-Y por pocillo sean al menos 10 veces mayores que los moles de sitios de unión de IL-17C de Ab-X que se usan, por pocillo, durante el revestimiento de la placa ELISA. Se añade IL-17C de modo que los moles de IL-17C añadidos por pocillo sean al menos 25 veces menos que los moles de los sitios de unión de IL-17C de Ab-X que se utilizan para revestir cada pocillo. Tras un período de incubación adecuado, se lava la placa ELISA y se añade un reactivo de detección específico para el antígeno IL-17C para medir la cantidad de moléculas de IL-17C unidas específicamente por el anticuerpo anti-IL-17C revestido (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pocillos con el anticuerpo revestido (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo de fase de solución (en este caso Ab-Y), tampón solo (es decir, sin IL-17C) y reactivos de detección. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pocillos con el anticuerpo revestido (en este caso, Ab-X), tampón de segundo anticuerpo en fase de solución solo (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), reactivos de detección de IL-17C. El ensayo ELISA necesita ejecutarse de tal manera que tenga la señal de control positivo de al menos 6 veces la señal de fondo.
Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y por IL-17C) resultantes de la elección de cuál anticuerpo usar como anticuerpo de revestimiento y cuál usar como segundo anticuerpo (competidor), el ensayo de bloqueo de cruzamiento necesita ejecutarse en dos formatos: 1 ) el formato 1 es cuando Ab-X es el anticuerpo que reviste la placa ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución y 2) el formato 2 es cuando Ab-Y es el anticuerpo que reviste la placa ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.
Ejemplo 7: Modelo de psoriasis inducida por IL-23 en ratones
Para examinar la eficacia in vivo y el potencial terapéutico, ambos anticuerpos candidatos se evaluaron adicionalmente en un modelo de psoriasis inducida por IL-23 en ratones.
El modelo de psoriasis inducida por IL-23 en ratones se llevó a cabo esencialmente como describen Rizzo H. y col. J Immunol (2011) Vol. 186(3) págs. 1495-1502.
En resumen, se indujeron lesiones cutáneas en ratones Balb/C mediante inyección intradérmica de IL-23 en las orejas (1 |jg) durante 4 días consecutivos (Día 1 a Día 4). La medición del grosor total de la oreja se realizó diariamente hasta el Día 5, en el que se sacrificaron los ratones. En el momento del sacrificio, los pabellones auriculares de las orejas se extrajeron y cortaron longitudinalmente en 2 mitades. Una mitad se fijó en formalina para un análisis histológico en profundidad del grosor epidérmico/dérmico de la piel de la oreja. La segunda mitad se sumergió en RNAlater para el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) de los niveles de expresión del ARNm de las citocinas proinflamatorias IL-17A, IL-22 e IL-1p relevantes para la enfermedad y las proteínas antimicrobianas LCN2, S100A8 y S100A9. Se trataron grupos (n=10) de ratones inyectados con IL-23 con los anticuerpos MAB n.° 1 o MAB n.° 2 que se administraron dos veces i.p. en una dosis de 10 mg/kg (una vez 3 días antes y una vez justo antes de la primera inyección intradérmica de IL-23).
Cada anticuerpo se probó en 2 experimentos independientes divididos en 3 estudios diferentes. En cada estudio se incluyeron los siguientes grupos de control (cada n=10):
Un grupo de control de ratones no recibió inyecciones diarias de IL-23, sino que recibió una inyección intradérmica diaria del mismo volumen de una solución de BSA/PBS. Este grupo se trató con un anticuerpo de isotipo de control negativo MOR03207 (2x 10 mg/kg, i.p.).
Para cada uno de los estudios, se siguió el grosor total de la oreja y el grosor epidérmico a lo largo del tiempo y se utilizaron puntos de datos individuales por animal para determinar el % de prevención del engrosamiento mediado por IL-23. Los datos de expresión de qPCR se expresaron usando la ecuación Rq (cantidad relativa) (Rq = 2-ACt, en la que ACt = Ct (gen de interés) - Ct (gen constitutivo)) después de la normalización respecto a los niveles de expresión de ciclofilina A utilizados como gen constitutivo. Para todas las mediciones, los datos de la media ± ETM de los grupos se compararon con un análisis de la varianza de una vía (ANOVA) y una prueba post hoc de comparaciones múltiples de Dunnett utilizando el software PRISM. Un valor "p" de <0,05 se consideró estadísticamente significativo (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p <0,001; ns: no significativo)
En síntesis, la administración de ambas IgG candidatas MAB n.° 1 y MAB n.° 2 (2x10 mg/kg) mejoró la inflamación cutánea inducida por IL-23, demostrando la eficacia in vivo y el potencial terapéutico de ambos anticuerpos. Ambos anticuerpos tuvieron efectos similares a nivel de engrosamiento epidérmico inducido por IL-23 y un impacto similar a nivel de expresión génica inducida por IL-23. (véase la Tabla 4).
Tabla 4: Sumario de la eficacia in vivo en el modelo de IL-23
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Ejemplo 8: Modelo de ratón MC903 de dermatitis atópica
La eficacia del anticuerpo MAB n.° 1 en la dermatitis atópica se examinó en un modelo de ratón de inflamación cutánea no infecciosa de dermatitis atópica en el que la aplicación tópica del análogo de vitamina D3 de bajo contenido calcémico MC903 (calcipotriol) induce una dermatitis atópica similar a una lesión cutánea caracterizada por una piel roja y escamosa, acompañada por una hiperplasia epidérmica e infiltración dérmica de diversos tipos de células, así como un aumento de la citocina Th2 en la piel e IgE sérica elevada (Li M y col. Proc Natl Acad Sci USA (2006) Vol.
103(31) págs. 11736-11741; Li M y col. J Invest Dermatol. (2009) Vol. 129(2). págs. 498-502).
8.1 Animales
Se obtuvieron ratones BALB/c (hembras, 8 semanas de edad) de Janvier Labs (Francia). Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (0700-1900). La temperatura se mantuvo a 22 °C y se proporcionaron alimentos y agua ad libitum.
8.2. Procedimientos experimentales
Con el fin de inducir una respuesta similar a la DA, se aplicaron tópicamente 2 nmol de MC903 (Tocris, disuelto en etanol) en un volumen de 20 j l en ambas orejas de los ratones durante 5 días consecutivos. Un grupo de control sin enfermedad recibió la misma cantidad de etanol (EtOH).
La gravedad de la inflamación de la piel (eritema y engrasamiento) se observó diariamente. El grosor de la oreja se midió con un calibrador electrónico (Mitutoyo). La inflamación se evaluó adicionalmente utilizando una técnica de obtención de imágenes in vivo. Con ese fin, la sonda Prosense 680 (1,6 nmol, Perkin Elmer) se administró por vía intraperitoneal 24 horas antes de la obtención de imágenes. La obtención de imágenes se realizó con el sistema de obtención de imágenes Bruker In-vivo Xtreme. Las imágenes se capturaron mediante una cámara CCD de 4MP sumamente enfriada (f-stop 1.1, agrupación (en inglés, binning) 2x2, tiempo de adquisición de 5 segundos, Ex 630 nm, Em 700 nm). Para el corregistro anatómico, se tomó una imagen de reflectancia (f-stop 2,8, tiempo de adquisición de 0,175 segundos). Todas las imágenes se tomaron con un campo de visión de 190x190 y las imágenes se analizaron utilizando el software Molecular Imaging versión 7.1 (Bruker Biospin, Billerica, Massachusetts, Estados Unidos). Para cada grupo, los valores medios y el error típico de la media (ETM) se calcularon utilizando para cada ratón el valor medio de la oreja izquierda y de la oreja derecha.
En el momento del sacrificio, se recogieron muestras de la piel de la oreja y se fijaron en formaldehído al 4% antes embeberlas en parafina. Se tiñeron cortes de 4 pm de grosor con hematoxilina y eosina (tinción H&E) para la evaluación histomorfométrica del grosor epidérmico mediante el análisis de imágenes con el software Sisn'Com (Francia). Se midieron cinco campos por oreja (campo de alta potencia x20) cubriendo la oreja completa de arriba a abajo y se promediaron los 5 valores por oreja y por ratón (oreja izquierda/derecha). Se preparó un conjunto adicional de cortes de tejido para la tinción IHC de IL-17C utilizando el anticuerpo MAB biotinilado anti-IL-17C (y el anticuerpo de control negativo de isotipo MOR03207 biotinilado). El procesamiento y la tinción se realizaron esencialmente como se ha descrito anteriormente.
Se tomaron también muestras de piel de oreja para el análisis de expresión de citocinas usando qPCR o ELISA. Las piezas de tejido de oreja para el análisis génico de qPCR se sumergieron en la solución de estabilización RNAlater® (Ambion) y se almacenaron a -20 °C. Las muestras de piel de oreja para la cuantificación a nivel de proteína se congelaron de forma instantánea en N2 líquido y se almacenaron a -80 °C. Para el análisis de expresión génica, el tejido se rompió y lisó en una solución de lisis de ARN usando un homogeneizador Precellys (microtubos llenos de perlas de ceramida de 1,4 mm, 3 veces 3 ciclos de 15 s a 6000 rpm). El ARN total se extrajo adicionalmente usando el kit de ARN NucleoSpin® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Macherey-Nagel) y 300 ng se sometieron a transcripción inversa usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems™. Se usaron 5 pl de ADNc diluido 10 veces en reacciones de PCR cuantitativas en tiempo real usando la tecnología SYBR Green con cebadores específicos de genes de Qiagen. La qPCR se realizó en el sistema de PCR en tiempo real ViiA™ 7 (Applied Biosystems). La expresión génica se normalizó respecto a la expresión de 3 genes constitutivos diferentes (ciclofilina, b-actina y GAPDH) y se expresó como nivel relativo de ARNm de la expresión génica específica, como se obtiene mediante el procedimiento de 2'ñCt, con ACt=Ctgen - Mediageom valor de Ct (genes constitutivos). Para la cuantificación de la expresión a nivel de proteína, los tejidos se rompieron y lisaron primero en 250 pl de tampón de lisis (reactivo de extracción de proteína tisular T-PER™ (Pierce) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Protease Inhibitor Cocktail, Roche) y cóctel inhibidor de fosfatasa Halt ™ (Phosphatase Inhibitor Cocktail, Pierce)) usando el homogeneizador Precellys (microtubos rellenos de perlas metálicas de 2,8 mm, 10 min 14000 rpm a 4 °C). La cantidad de TSLP en las orejas se determinó utilizando kits de ELISA DuoSet de ratón para TSLP de R&D System. La cantidad se normalizó respecto al contenido de proteína total en el lisado que se determinó usando el reactivo de ensayo de proteínas Coomassie (Thermo Fisher) en referencia a la proteína de BSA convencional. Los datos se expresaron como la cantidad de citocina en oreja, la cual se calculó utilizando la fórmula: concentración de citocina en la muestra / concentración de proteína en la muestra x contenido de proteína de oreja total.
La significación del efecto de un tratamiento en cada una de las lecturas se evaluó con el software Prism®, utilizando un ANOVA de una vía seguido de una prueba post hoc de comparaciones múltiples de Dunnett frente al grupo de control MC903 MOR03207 con *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.
8.3. Eficacia del MAB n.° 1 en un modelo de ratón de dermatitis atópica (profiláctica)
Se evaluó la eficacia de diversas dosis de MAB n.° 1 en el modelo de dermatitis atópica de MC903 en un escenario profiláctico. En resumen, se indujeron lesiones cutáneas en ratones BALB/c mediante la administración tópica de 2 nmol de MC903 (disuelto en etanol) en ambas orejas durante 5 días consecutivos; los ratones se sacrificaron el Día 8. El MAB n.° 1 se administró i.p. 3 veces, es decir, 3 días antes, al inicio y 4 días después de la primera aplicación de MC903. Se evaluaron los efectos sobre la hinchazón de la oreja, la inflamación de la oreja, la hiperplasia epidérmica, el grosor dérmico y la expresión génica. Un grupo de ratones que recibió un anticuerpo de control de isotipo negativo (MOR03207) sirvió como elemento de comparación. La dexametasona (5 mg/kg en metilcelulosa al 0,5%, administrada diariamente por vía oral (p.o.) desde el primer día de aplicación de MC903) se utilizó como elemento de comparación activo. Los ratones se dividieron aleatoriamente en grupos iguales (n = 10).
La gravedad de la inflamación de la piel (eritema y engrosamiento) se siguió durante el transcurso del experimento. El grosor total de la oreja se midió utilizando un medidor de grosor Mitutoyo durante el transcurso del experimento. La inflamación se evaluó adicionalmente el Día 5 utilizando una técnica de obtención de imágenes in vivo (como se describe en 8.2 ).
El etanol (como vehículo de control) no tuvo efecto sobre las orejas. Por el contrario, las orejas tratadas con MC903 enrojecieron y se hincharon. El tratamiento con MAB n.° 1 en dosis de 2 mg/kg o superiores evitó significativamente el engrasamiento de las orejas. El efecto del MAB n.° 1 fue máximo en una dosis de 10 mg/kg y fue comparable al efecto de la dexametasona (Figura 1). En línea con estas observaciones, la inflamación de la oreja (evaluada mediante la obtención de imágenes in vivo el Día 5) aumentó claramente en animales tratados con MC903 y se redujo mediante el MAB n.° 1 con un efecto significativo y casi máximo observado en una dosis de 10 mg/kg (Figura 2).
Para confirmar la reducción del grosor de la oreja mediante el MAB n.° 1, las secciones histológicas de las orejas recogidas el Día 8 se tiñeron con hematoxilina y eosina para la evaluación histomorfométrica del grosor epidérmico y dérmico. Se capturaron valores de cinco campos por oreja cubriendo la oreja completa de arriba a abajo y se promediaron por ratón. El MAB n.° 1 en dosis de 10 mg/kg y superiores evitó significativamente el aumento en grosor tanto de la capa epidérmica como de la dérmica (Figura 3).
8.3.1 Efecto del MAB n.° 1 sobre la expresión génica
Para caracterizar adicionalmente el efecto del MAB n.° 1 en el modelo de inflamación cutánea similar a la dermatitis atópica de MC903, se analizó la expresión de diversos genes relevantes para la dermatitis atópica a nivel de ARNm mediante qPCR o a nivel de proteína, mediante enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA). La expresión de proteínas TSLP e IL-33 en las orejas y el nivel de TARC en plasma aumentaron mediante la aplicación de MC903 y se inhibieron significativamente tras un tratamiento con MAB n.° 1 en dosis de 10 mg/kg o más (Figura 4). Se observó un efecto inhibidor similar con el MAB n.° 1 en varios otros genes que estaban auto-regulados en las orejas tratadas con MC903, como IL-31 (una citocina ligada a la picazón en la dermatitis atópica), la Th2-citocina IL-4 y otros genes que se ha demostrado que se auto-regulan en la dermatitis atópica humana, como S100A8/9 e IFN-y. Viceversa, se demostró que el MAB n.° 1 previene la regulación negativa de FLG2 en orejas tratadas con MC903, lo que podría sugerir un papel potencial del MAB n.° 1 en la restauración de la función de barrera.
8.4 Eficacia del MAB n.° 1 en un modelo de ratón de dermatitis atópica (terapéutica)
Se evaluó la eficacia de diversas dosis de MAB n.° 1 en el modelo de dermatitis atópica de MC903 en un escenario terapéutico más relevante de enfermedad. En resumen, se indujeron lesiones cutáneas en ratones BALB/c antes del inicio del tratamiento mediante la administración tópica de 2 nmol de MC903 (disuelto en etanol) en ambas orejas durante 5 días consecutivos. El MAB n.° 1 se administró i.p. 4 veces, con la primera administración en el último día de la aplicación cutánea de MC903 (Día 5) y las siguientes los Días 8, 12 y 15. Los ratones se sacrificaron el Día 16. Se evaluaron los efectos sobre la hinchazón de la oreja, la inflamación de la oreja, la hiperplasia epidérmica, el grosor dérmico y la expresión génica. Además, se evaluó también el efecto sobre la afluencia de las células inmunitarias (eosinófilos, linfocitos T y mastocitos). Un grupo de ratones que recibió un anticuerpo de control de isotipo negativo (MOR03207) sirvió como elemento de comparación. La dexametasona (1 mg/kg en metilcelulosa al 0,5%, administrada p.o. empezando desde el primer día de aplicación de MC903 el Día 5 y posteriormente del Día 8 al 12 y del Día 15 al 16) se utilizó como elemento de comparación activo.
8.4.1 Efecto del MAB n.° 1 sobre el grosor total y la inflamación de la oreja
El grosor total de la oreja se midió utilizando un medidor de grosor Mitutoyo durante el transcurso del experimento. La aplicación tópica de MC903 en las orejas provocó un marcado aumento en el grosor de las orejas desde el Día 3, en comparación con las orejas tratadas con etanol (como vehículo de control para MC903). La actividad de la enfermedad fue bien inducida el Día 5 (es decir, el día del primer tratamiento) y continuó evolucionando después (aunque la aplicación de MC903 se detuvo) como se desprende de un aumento continuo en la hinchazón de las orejas en el grupo tratado con el anticuerpo de control negativo MOR03207 (Figura 5). El tratamiento con MAB n.° 1 en dosis de 0,4 mg/kg o superiores evitó significativamente el engrosamiento de las orejas desde el Día 12, con las dosis más altas de MAB n.° 1 teniendo un efecto más fuerte y reduciendo significativamente el grosor de la oreja, incluso en puntos temporales anteriores (desde el Día 8 para el MAB n.° 1 en 50 mg/kg y desde el Día 10 para dosis de 10 y 2 mg/kg). En línea con estas observaciones, la inflamación de la oreja evaluada mediante la obtención de imágenes in vivo (como se describe en 8.2) el Día 12, se incrementó todavía en los animales tratados con anticuerpo de control negativo y se redujo significativamente mediante MAB n.° 1 en todas las dosis, con el efecto máximo observado en dosis de 2 mg/kg (Figura 6).
8.4.2 Efecto del MAB n.° 1 sobre el grosor epidérmico/dérmico de la oreja
Para confirmar la reducción del grosor de la oreja mediante el MAB n.° 1, las secciones histológicas de las orejas recogidas el Día 16 se tiñeron con hematoxilina y eosina para la evaluación histomorfométrica del grosor epidérmico y dérmico. El MAB n.° 1 en dosis de 2 mg/kg y superiores evitó fuertemente el aumento en grosor tanto de la capa epidérmica como de la dérmica, en línea con las mediciones del grosor total de la oreja (Figura 7).
8.4.3 Efecto del MAB n.° 1 sobre la infiltración de células dérmicas
Para caracterizar adicionalmente el efecto del MAB n.° 1 sobre los procesos de la enfermedad en el modelo de dermatitis atópica de MC903, los presentes investigadores evaluaron el efecto sobre las infiltraciones celulares. Más específicamente, los presentes investigadores evaluaron el efecto sobre eosinófilos, linfocitos T y mastocitos mediante inmunohistoquímica (IHC) y cuantificación posterior del área que se tiñó respectivamente con anticuerpos que detectan peroxidasa de eosinófilos, marcador de linfocitos T CD3 y triptasas de mastocitos (para más detalles, véase (Marsais, 2016)). En línea con la inflamación aumentada y el grosor de la oreja, la infiltración de eosinófilos, linfocitos T y en menor extensión mastocitos, todavía era notable el Día 16 en orejas de ratones en los que la actividad de la enfermedad se indujo mediante MC903. El tratamiento de MAB n.° 1 redujo la infiltración dérmica de los tres tipos de células examinados (Figura 8). Se observó una reducción significativa en el número de eosinófilos y linfocitos T infiltrados en todas las dosis de MAB n.° 1 probadas, teniendo la dosis más alta de 50 mg/kg el efecto más fuerte reduciendo la afluencia de estos tipos de células a niveles comparables al efecto de la dexametasona. El efecto sobre la infiltración de mastocitos fue, en general, más débil pero todavía significativo: la afluencia se redujo significativamente por el MAB n.° 1 en las dosis más altas de 50 y 10 mg/kg.
8.4.4 Efecto del MAB n.° 1 sobre la expresión génica
La expresión se analizó en muestras de piel de oreja o plasma recogidas el Día 16 mediante qPCR para ocho genes relevantes para la enfermedad o mediante ELISA para TSLP e IL-33 producidas en orejas y TARC en plasma como se ha descrito en 8.2.
No se pudo observar una expresión diferencial significativa para la mayoría de los genes analizados entre los ratones de control sin la enfermedad tratados con EtOH y los ratones en los que la enfermedad se indujo mediante la aplicación de MC903 durante los primeros 5 días. Solo los niveles de expresión de ARNm de IL-33 y de IL-4, S100A9 e IFN-y estuvieron todavía aumentados. Los niveles de expresión aumentados para esos genes (excepto IFN-y) se redujeron mediante el tratamiento con MAB n.° 1 como se muestra en la Figura 9 en todos los niveles de dosis.
8.5. Resultados
El MAB n.° 1 previno la generación de una inflamación de la piel similar a la dermatitis atópica en el modelo de MC903, con un impacto significativo sobre el engrosamiento epidérmico y dérmico, la inflamación y la expresión génica similar a los linfocitos T auxiliares tipo 2 (Th2) cuando se dosificó profilácticamente en 3x10 mg/kg por vía intraperitoneal (i.p.). Se observaron ya efectos significativos en este modelo sobre el grosor total de la oreja en dosis de 3x2 mg/kg (i.p.). También en el modelo de MC903 terapéutico el MAB n.° 1 mejoró la inflamación de la piel. Se observaron efectos terapéuticos significativos sobre el grosor total de la oreja, el engrosamiento epidérmico, la inflamación y la afluencia de eosinófilos y linfocitos T en dosis de 4x0,4 mg/kg (i.p.), hasta dosis de 4x2 a 10 mg/kg (i.p.).
Ejemplo 9: Modelo de ratón de cola escamosa de dermatitis atópica
La eficacia del anticuerpo MAB n.° 1 se evaluó en el modelo de cola escamosa (en inglés, Flaky Tail). Los ratones de cola escamosa tienen una mutación en los genes Flg y Matt (Mattma/maFlgft/ft) que da como resultado una disfunción de la barrera de la piel. Estos ratones desarrollan espontáneamente dermatitis atópica y progresiva, caracterizada por un fenotipo inflamatorio Th2/Th17 y reproducen características esenciales de DA en el ser humano.
9.1. Animales y procedimientos experimentales
Los ratones de cola escamosa (Flaky tail) (Mattma/maFlgft/ft) en un fondo coisogénico de C57BL/6J se utilizaron como se describe en Fallon y col. (2009) Nat Genet. 41(5): 602-608 y en Saunders y col. (2013) J Allergy Clin Immunol 132(5): 1121-1129. Los ratones de cola escamosa hembra, de 9-10 semanas de vida, se aleatorizaron en cuatro grupos (8 ratones por grupo) y se trataron durante 6 semanas como sigue:
- Grupo I: Anticuerpo de control de isotipo negativo (MOR03207) (30 mg/kg, dos veces por semana x 6 semanas i.p.)
- Grupo II: MAB n.° 1 (3 mg/kg, dos veces por semana x 6 semanas i.p.)
- Grupo III: MAB n.° 1 (30 mg/kg, dos veces por semana x 6 semanas i.p.)
- Grupo IV: Dexametasona 2 mg/kg (dos veces por semana x 6 semanas i.p.) como elemento de comparación
La gravedad de la inflamación cutánea similar a la DA se puntuó utilizando los criterios de diagnóstico macroscópicos adaptados de la evaluación de la inflamación cutánea en el modelo de ratón NC/Nga como se describe en Saunders y col. (2013) J Allergy Clin Immunol 132(5): 1121-1129. En resumen, se aplicó un sistema de puntuación (0: ninguno; 1: leve; 2: moderado; 3: marcado) a los signos de eritema, escoriación y descamación. Las puntuaciones totales para cada ratón (con un máximo de 9) se calcularon a partir de la suma de las puntuaciones individuales para cada uno de los tres parámetros.
La aparición de lesiones eccematosas en la piel del párpado se monitorizó al final del estudio y la blefaritis se puntuó por separado por su gravedad (0: normal, 1 : eritema y/o edema palpebral, 2 : eritema, edema y descamación palpebral, 3: eritema, edema, descamación, erosión palpebral). La puntuación de blefaritis máxima (media de ambos ojos) para cada ratón es 3.
9.2. Eficacia del MAB n.° 1 en el modelo de ratón de cola escamosa espontánea y crónica de DA
La puntuación clínica de la inflamación de la piel muestra que los ratones de cola escamosa (Flaky tail) ya tenían signos de dermatitis espontánea de tipo eccematoso al inicio del tratamiento, que progresó adicionalmente durante el período de seguimiento de 6 semanas hasta convertirse en una dermatitis evidente, en animales sin tratar. El

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL-17C en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
(a) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 7, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 15 o
(b) una región HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20, una región HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, una región HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, una región LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, una región LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 y una región LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID: 28.
2. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende
(a) una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 7, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 8, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 9, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 13, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 14 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 15 o
(b) una región HCDR1 de la SEQ ID NO: 20, la región HCDR2 de la SEQ ID NO: 21, la región HCDR3 de la SEQ ID NO: 22, la región LCDR1 de la SEQ ID NO: 26, la región LCDR2 de la SEQ ID NO: 27 y la región LCDR3 de la SEQ ID NO: 28.
3. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para IL-17C humana, IL-17C de cinomolgo e IL-17C de ratón.
4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
5. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 17 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 16.
6. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 30 y una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 29.
7. Un anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 43 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 42.
8. Un anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4 y 6, en el que dicho anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 55.
9. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado.
10. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante.
11. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores para su uso como un medicamento.
12. Una composición de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico o una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. Una composición de vectores que comprende un vector o una pluralidad de vectores que comprende la secuencia de ácido nucleico o pluralidad de secuencias de ácido nucleico de la reivindicación 12.
14. Una célula que comprende la composición de vectores de la reivindicación 13.
15. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
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