RS62012B1

RS62012B1 - Antitela za il-17c

Info

Publication number: RS62012B1
Application number: RS20210775A
Authority: RS
Inventors: Jan Dominik Haas; Jürgen Klattig; Nick Ernest René Vandeghinste
Original assignee: Morphosys Ag; Galapagos Nv
Priority date: 2016-02-19
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2021-07-30
Also published as: CL2018002340A1; SMT202100361T1; PL3416983T3; ZA201806249B; IL260733A; US10259869B2; CU20180087A7; US20190048071A1; TW201734041A; EA201891594A1; ES2877376T3; CN108699143B; IL260733B2; MA43088A1; EP3416983B1; KR20180109977A; US11987621B2; MD3416983T2; BR112018016798A2; CA3014842A1

Description

OPIS

Polje pronalaska

[0001] Predmetna aplikacija odnosi se na antitela ili fragmente antitela koji stupaju u interakciju sa humanim IL-17C. Pronalazak se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelijedomaćine sposobne da eksprimiraju navedena antitela i njihove fragmente, na farmaceutske kompozicije koje sadrže navedena antitela i njihove fragmente, kao i na primenu navedenih antitela i njihovih fragmenata u terapiji specifičnih bolesti.

Stanje tehnike

[0002] IL-17C je sekretovani homodimer iz familije IL17 proteina. Pokazano je da IL-17C stimuliše oslobađanje TNF-α i IL-1β iz monocitne ćelijske linije THP-1 in vitro (Li et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 773-8). IL-17C može da indukuje ekspresiju iRNK koje kodiraju inflamatorne citokine, kao što su IL-1β, IL-6 i IL-23 u ćelijama peritonealnih eksudata (PECS) i u 3T3 ćelijskoj liniji (Yamaguchi et al. (2007) J. Immunol 179, 7128-36).

[0003] Uloga IL-17C kao proinflamatornog citokina uključenog u odbranu domaćina, utvrđena je u nekoliko istraživanja (Chang et al. (2011) Immunity 35, 611-621, Song et al. (2011) Nature Immunology 12, 12, Ramirez-Carrozzi et al. (2011) Nature Immunology 12, 12). Nedavno je pokazano da ovaj citokin ima značajnu ulogu u progresiji specifičnih tumora i kanceroznog tkiva (Xinyang Song (2014) Immunity 40, 140-152).

[0004] Nedavno je u WO 2013/057241 eksperimentalno pokazano da inhibicija IL-17C može da bude perspektivan pristup u terapiji inflamatornih poremećaja. Specifična antitela primenjena u WO 2013/057241 bila su surogat antitela specifična za mišji IL-17C, za koja je pokazano da nisu reaktivna prema humanom IL-17C. Predložena su i dodatna antitela koja antagonizuju delovanje IL-17C (na primer, u WO 1999/060127), ali su to poliklonska antitela ili surogat antitela koja se specifično vezuju samo za mišji IL-17C.

[0005] Stoga postoji potreba za izučavanjem i identifikovanjem antitela koja se vezuju za humani IL-17C u cilju ublažavanja bolesti i poremećaja povezanih IL-17C kod ljudi.

Sažetak pronalaska

[0006] Predmetno otkriće obezbeđuje nova antitela i fragmente antitela. Obelodanjena antitela i fragmenti antitela vezuju se za humani IL-17C i unakrsno reaguju sa IL-17C iz makaki majmuna i miša. Uz to, obelodanjena antitela inhibiraju vezivanje IL-17C za njegov receptor kod relevantnih vrsta – čoveka, miša i makaki majmuna – sa vrednošću IC50od 80 pM ili manje. Kao što je obelodanjeno i ilustrovano primerima, naznačena antitela su dokazano efikasna u različitim in vivo mišjim modelima atopijskog dermatitisa i psorijaze.

[0007] Obelodanjena antitela ili fragmenti antitela nadmoćna su u pogledu efektivnosti i predstavljaju podesna i perspektivna jedinjenja za primenu u terapiji ljudi koji boluju od atopijskog dermatitis ili psorijaze.

[0008] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili fragmente antitela koji se vezuju za humani IL-17C, sa CDR regionima prema Tabeli 1. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje specifična antitela ili fragmente antitela koji poseduju varijabilni region teškog lanca i varijabilne CDR regione lakog lanca, koji obuhvataju aminokiselinske sekvence prema Tabeli 1 predmetne specifikacije.

[0009] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela ili fragmente antitela koja kompetiraju sa opisanih specifičnim antitelima ili fragmentima antitela. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje specifična antitela ili fragmente antitela koji se vezuju za iste epitope kao i specifična antitela ili fragmenti antitela koja su ovde obelodanjeni.

[0010] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovana antitela ili fragmente antitela predmetnog otkrića za primenu u lečenju.

[0011] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke tretiranja subjekata koji boluju od inflamatornog poremećaja, administriranjem navedenom subjektu efektivne količine antitela ili fragmenata antitela prema pronalasku. Poželjan navedeni subjekt je čovek.

[0012] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže izolovana antitela ili fragmente antitela prema pronalasku, i farmaceutski pogodan nosač.

[0013] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili fragmente antitela prema pronalasku.

[0014] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektore koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili fragmente antitela prema pronalasku.

[0015] Predmetni pronalazak takođe obelodanjuje ćeliju domaćina koja sadrži vektor ili nukleinsku kiselinu koja kodira antitela ili fragmente antitela, prema pronalasku.

[0016] U navedenim antitelima i fragmentima antitela postoji korisnost. Takođe, korisnost postoji i u postupku identifikacije ovih antitela i fragmenata koji je obuhvaćen patentnim zahtevima.

[0017] Upotreba antitela i fragmenata antitela obuhvaćenih pronalaskom sastoji se u promeni biološke aktivnosti humanog IL-17C. Konkretno, navedena antitela ili fragmenti antitela imaju potencijalnu terapeutsku primenu u terapiji inflamatornih poremećaja, kao što su, reumatoidni artritis, psorijaza, plućna inflamacija, COPD i/ili terapija atopijskog dermatitisa (AD), uključujući umerenu do jake forme AD.

Kratak opis slika

[0018]

Slika 1: MAB#1 antitelo dozno-zavisno sprečava zadebljavanje uha indukovano površinskom primenom MC903 na koži uha. Podaci su predstavljeni kao srednje vrednosti ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) (n=8 po grupi). Statistička značajnost prema MC903+MOR03207 izračunata je primenom ANOVA testa i post hoc Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001. (DEX: deksametazon; EtOH: etanol)

Slika 2: MAB#1 antitelo dozno-zavisno smanjuje inflamaciju uha indukovanu površinskom primenom MC903 na koži uha. Inflamacija uha je procenjena na 5. dana in vivo odslikavanjem. Levi panel: kvantifikacija intenziteta signala u koži uha. Pojedinačne tačke (n=8 po grupi) predstavljaju prosečan intenzitet za oba uha; podaci predstavljaju srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost prema MC903+MOR03207 izračunata je primenom ANOVA testa i Dunnett-ovog testa višestrukih poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Desni panel: reprezentativne slike mišjih ušiju životinja iz različitih grupa, dobijene na Bruker In-vivo Xtreme Imageru, 24 h nakon injekcije Prosense 680 probe. (DEX: deksametazon; EtOH: etanol) Slika 3: MAB#1 antitelo dozno-zavisno smanjuje zadebljavanje epidermisa i dermisa, indukovano površinskom aplikacijom MC903 na kožu uha. Rezultati predstavljaju pojedinačne podatke (n=8 po grupi) i srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost prema MC903+MOR03207 grupu izračunata je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Levi panel: podaci se odnose na debljinu epitela; Desni panel: podaci se odnose na debljinu dermisa.

Slika 4: MAB#1 antitelo dozno-zavisno inhibira MC903-posredovano povećanje ekspresije TSLP i IL-33 u uhu i nivo TARC u plazmi. Rezultati predstavljaju pojedinačne podatke (n=8 po grupi) i srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost u odnosu naMC903+MOR03207 grupu određena je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Gornji levi panel: podaci za ekspresiju TSLP proteina u uhu; Donji levi panel: podaci za ekspresiju IL-33 proteina u uhu; Gornji desni panel: podaci za nivo TARC proteina u plazmi.

Slika 5: Terapeutska administracija MAB#1 antitela dozno-zavisno smanjuje debljanje uha indukovano površinskom primenom MC903 na koži uha. Podaci su prikazani kao srednje vrednosti ± SEM (n=10 po grupi). Statistička značajnost u odnosu na MC903+MOR03207 grupu određena je primenom ANOVA testa i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. DEX: deksametazon; EtOH: etanol.

Slika 6: Terapeutska administracija MAB#1 antitela dozno-zavisno smanjuje inflamaciju uha indukovanu površinskom primenom MC903 na koži uha.

Inflamacija uha je procenjena na 12. dana primenom in vivo odslikavanja, a intenzitet signala u ušima je predstavljen grafički. Pojedinačne tačke (n = 10 po grupi) predstavljaju prosečan intenzitet za oba uha; podaci su prikazani kao srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost u odnosu na MC903+MOR03207 određena je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. DEX: deksametazon; EtOH: etanol.

Slika 7: Terapeutska administracija MAB#1 antitela dozno-zavisno smanjuje debljanje epidermisa i dermisa kože, indukovano površinskom aplikacijom MC903 na kožu uha. Podaci su prikazani kao individualne tačke (n = 10 po grupi) i srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost u odnosu na MC903+MOR03207 određena je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Levi panel: podaci se odnose za debljanje epidermisa; Desni panel: podaci se odnose na debljanje dermisa. DEX: deksametazon; EtOH: etanol.

Slika 8: Terapeutska administracija MAB#1 antitela dozno-zavisno smanjuje infiltraciju eozinofila, T-ćelija i mastocita u potkožno tkivo. Podaci su prikazani kao individualne tačke (n = 10 po grupi) i srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost u odnosu na MC903+MOR03207 određena je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Levi gornji panel: podaci za eozinofile; Gornji desni panel: podaci za mastocite; Donji levi panel: podaci za T-ćelije. DEX: deksametazon; EtOH: etanol.

Slika 9: Terapeutska administracija MAB#1 antitela smanjuje ekspresiju IL-33, IL-4 i S100A9, koji ostaju i dalje povećani 16. dana (11 dana nakon prekida MC903 aplikacije). Podaci su prikazani kao pojedinačne tačke (n=10 po grupi) i srednje vrednosti (horizontalne linije) ± SEM. Statistička značajnost u odnosu na MC903+MOR03207 odrešena je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja: * p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001. Gornji levi panel: podaci za ekspresiju S100A9 iRNK u uhu; Donji levi panel: podaci za ekspresiju IL-4 iRNK u uhu; Gornji desni panel: podaci za proteinski nivo IL-33 u uhu.

Slika 10: MAB#1 antitelo smanjuje makroskopske kliničke znake inflamacije slične AD-u u modelu spontanog i hroničnog perutanja kože repa. Klinička ocena kožne inflamacije miša izvedena je na početku (nedelja 0) i na kraju (nedelja 6) tretmana. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SD za svaku eksperimentalnu grupu (n = 8 po grupi). Statistička značajnost prema izotipu antitela kojim je tretirana grupa izračunata je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja (*p < 0.05; **p < 0.01; *** p < 0.001).

Slika 11: MAB#1 antitelo smanjuje ekcematoznu inflamaciju kože očnih kapaka kod u modelu spontanog i hroničnog perutanja kože repa. Inflamacija kože očnih kapaka ocenjena je na kraju tretmana (nedelja 6). Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SD za svaku eksperimentalnu grupu (n = 8 po grupi). Statistička značajnost prema izotipu antitela kojim je tretirana grupa izračunata je primenom ANOVA i Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja (*p < 0.05; **p < 0.01; *** p < 0.001).

Detaljan opis pronalaska

[0019] Pronalazak se odnosi na veliki broj antitela ili fragmenata antitela koja prepoznaju humani IL-17C.

Definicije:

[0020] Termin "IL-17C" odnosi se na protein poznat kao interleukin 17C.

Humani IL-17C ima sledeću aminokiselinsku sekvencu prema (UniProt Q9P0M4):

Mišji IL-17C ima aminokiselinsku sekvencu prema (UniProt Q8K4C5):

IL-17C makaki majmuna ima aminokiselinsku sekvencu prema (XP_005592825.1):

[0021] Termin "IL17RA" odnosi se na protein poznat kao receptor interleukina 17 tipa A. Humani IL17RA ima aminokiselinsku sekvencu prema (UniProt Q96F46):

[0022] Termin "IL17RE" odnosi se na protein poznat kao receptor interleukina 17 tipa E. Humani IL17RE ima aminokiselinsku sekvencu prema (UniProt Q8NFR9):

[0023] Mišji IL17RE ima aminokiselinsku sekvencu prema (UniProt Q8BH06):

[0024] Termini "antagonist IL-17C" i "IL-17C antagonist", koriste se uzajamno kao sinonimi, a odnose se na molekul koji inhibira aktivnost ili funkciju IL-17C. Termin "antagonista IL-17C" obuhvata, bez ograničenja, antitela i fragmente antitela koji se specifično vezuju za IL-17C. Poželjno, antagonista IL-17C prema predmetnom pronalasku predstavlja antitelo specifično za humani IL-17C. Ovakvo antitelo može biti bilo kog tipa, kao što je mišje, pacovsko, himerno, humanizovano ili humano antitelo.

[0025] Termin "antitelo", u značenju kako je ovde primenjeno, odnosi se na protein koji stupa u interakciju sa antigenom, a koji se sastoji od najmanje dva teška (Heavy -H) lanca i dva laka (Light - L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki težak lanac sačinjen je od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region je sastavljen od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti na podregione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (Complementarity determining region - CDR), prošarani su konzerviranijim regionima, koji nose oznaku okvirni regioni (Frame region - FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR regiona i četiri FR regiona, poređana od amino-terminusa prema karboksi-terminusu sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Varijabilni regioni teškog lanca i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da učestvuju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (na primer, efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. Termin “antitelo” obuhvata, na primer, monoklonska antitela, humana antitela, humanizovana antitela, kamilizovana antitela i himerna antitela. Antitela mogu pripadati bilo kom izotipu (na primer, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA ili IgY), klasi (na primer, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklasi. I laki i teški lanci su podeljeni u regione strukturne i funkcionalne homologije.

[0026] Fraza "fragment antitela", u predmetnom kontekstu, odnosi se na jedan ili više delova antitela, koji zadržavaju sposobnost da specifično reaguju (na primer, vezivanjem, steričnim ometanjem, stabilizacijom prostorne distribucije) sa antigenom. Primeri vezujućih fragmenata obuhvataju, bez ograničenja, Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnom vezom u regionu šarke; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji sadrži VL i VH domene jednog kraka antitela; dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji sadrži VH domen; i izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR). Takođe, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana različitim genima, oni mogu biti spojeni, primenom rekombinantnih postupaka, sintetičkim veznikom koji im omogućava da se povežu u jedan proteinski lanac, u kojem se VL i VH regioni sparuju u monovalentne molekule (poznate pod imenom jednolančani Fv (scFv); videti, na primer, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; i Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Ovakva jednolančana antitela takođe su obuhvaćena terminom “fragment antitela”. Ovi fragmenti antitela dobijaju se primenom konvencionalnih postupaka koji su poznati u stanju tehnike, a a zatim se testira sposobnost fragmenata da se primene na isti način kao intaktna antitela. Fragmenti antitela mogu se ugraditi u jednodomenska antitela, maksitela, minitela, intratela, diatela, triatela, tetratela, v-NAR ibis-scFv (videti, na primer, Hollinger and Hudson, (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136). Fragmenti antitela mogu se ugraditi u molekulske skele na bazi polipeptida, kao što je fibronektin tip III (Fn3) (videti, U.S. Pat. No. 6,703,199, koji obelodanjuje fibronektin polipeptid monotela). Fragmenti antitela mogu se ugraditi u jednolančane molekule koji sadrže par tandemskih Fv segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa polipeptidima komplementarnosti lakog lanca, formiraju par antigen-vezujuća mesta (Zapata et al., (1995) Protein Eng.8:1057-1062; i U.S. Pat. No.5,641,870).

[0027] "Humano antitelo" ili "fragment humanog antitela", kako je ovde primenjeno, obuhvata antitela i fragmente antitela, koji poseduju varijabilne regione u kojima su okvirni i CDR regioni dobijeni od sekvenci humanog porekla. Dalje, ako antitelo sadrži konstantni region, taj konstantni region je takođe poreklom od humanih sekvenci. Humano poreklo obuhvata, na primer, humane germinativne sekvence, ili mutirane verzije humanih germinativnih sekvenci ili antitela koja sadrže konsenzusne okvirne sekvence dobijene analizom humanih okvirnih sekvenci, na primer, kao što je opisano kod Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86).

[0028] Strukture i položaj varijabilnih domena imunoglobulina, na primer, CDR, mogu se definisati primenom dobro poznatih shema numerisanja, na primer, primenom Kabatove sheme, Chothia sheme, ili kombinacije Kabat i Chothia sheme (videti, na primer, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.; Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio.273:927-948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no.91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; and Al-Lazikani et al., (1997) J. Mol. Biol.273:927-948.

[0029] "Humanizovano antitelo" ili "fragment humanizovanog antitela” definiše se kao molekul antitela koji poseduje konstantne regione antitela poreklom od sekvenci humanog porekla i varijabilne regione antitela ili njihove delove, ili samo CDR regione poreklom od neke druge vrste. Na primer, humanizovano antitelo može imati ugrađen CDR, naznačeno time da su CDR domeni varijabilnih regiona poreklom od neke druge vrste, dok je jedna ili više okvirnih sekvenci varijabilnog domena humanog porekla i konstantni domen (ako je prisutan) je humanog porekla.

[0030] Termin "himerno antitelo" ili "fragment himernog antitela” označava molekul antitela, koji poseduje konstantne regione antitela poreklom od jedne vrste ili koji odgovaraju sekvencama jedne vrste i varijabilne regione antitela poreklom od druge vrste. Poželjno je da su konstantni regioni antitela dobijeni od ili da odgovaraju sekvencama poreklom od čoveka, a da su varijabilni regioni antitela (na primer, VH, VL, CDR ili FR regioni) poreklom od sekvenci iz životinje koja nije čovek, na primer, iz miša, pacova, zeca ili hrčka.

[0031] Termin "izolovan" odnosi se na jedinjenje koje može biti na primer, antitelo ili fragment antitela, koji je suštinski slobodno od drugih antitela ili fragmenata antitela, koja imaju drugačiju specifičnost. Štaviše, izolovano antitela ili fragment antitela može biti suštinski slobodan od ostalog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. Stoga u nekim aspektima, obezbeđena antitela su izolovana antitela, koju su odvojena od antitela različite specifičnosti. Izolovano antitelo može biti monoklonsko antitelo. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu ciljnog molekula može biti unakrsno reaktivno sa srodnim antigenima, na primer, poreklom iz drugih vrsta (na primer, homologih vrsta).

[0032] Termin "rekombinantno antitelo", kako je ovde korišćen, obuhvata sva antitela koja su dobijena, eksprimirana, kreirana ili izdvojena na način koji ne postoji u prirodi. Na primer, antitela izolovana iz ćelije-domaćina koja je tako modifikovana tako da eksprimira antitela, antitela izabrana i izolovana iz rekombinantne, kombinovane biblioteke humanih antitela i antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana i izolovana na neki drugi način koji uključuje obradu celog ili dela gena za humani imunoglobulin, sekvence drugih DNK ili antitela izolovana iz životinje (na primer, miša), koja je transgena ili transhromozomska za humane gene imunoglobulina ili antitela dobijena u hibridoma ćelijama. Rekombinantna antitela poseduju poželjno, varijabilne regione u kojima su okvirne sekvence i CDR regioni dobijeni od humanih germinativnih sekvenci imunoglobulina. U nekim oblicima izvođenja, ova rekombinantna antitela mogu se podvrgnuti in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi), pa aminokiselinske sekvence VH i VL regiona ovih rekombinantnih antitela mogu biti sekvence koje, iako poreklom ili srodne humanim germinativnim VH i VL sekvencama, ne moraju prirodno postojati unutar repertoara germinativnih antitela in vivo. Rekombinantna antitela mogu biti monoklonska antitela. U jednom obliku izvođenja, obelodanjena antitela i fragmenti antitela izolovani su iz Ylanthia® biblioteke antitela, obelodanjene u US 13/321,564 ili US 13/299,367.

[0033] Termin "monoklonsko antitelo", u predmetnom kontekstu, odnosi se na preparat molekula antitela u čiji sastav ulazi jedan tip molekula. Kompozicija monoklonskog antitela ima jedinstveno vezujuće mesto i ima jedinstvenu vezujuću specifičnost i afinitet za konkretne epitope.

[0034] Fraze "vezuje se specifično" ili "specifično se vezuje za", "specifična prema/za" ili "specifično prepoznaje", i slične, odnose se na merljive i ponovljive interakcije, kao što su vezivanje između ciljnog molekula i antitela ili fragmenta antitela, što determiniše prisustvo ciljnog molekula u prisustvu heterologne populacije molekula, uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo ili fragment antitela koji se specifično vezuje za ciljni molekul (što može biti antigen ili epitop antigena), može biti antitelo ili fragment antitela koji se vezuju za ciljni molekul sa većim afinitetom, avidnošću, lakoćom i/ili tokom dužeg vremena nego što je to slučaj kada se vezuje za druge mete. U nekim oblicima izvođenja, antitela ili fragmenti antitela specifično se vezuju za epitop proteina koji je konzerviran kod istog tog proteina poreklom iz različitih vrsta. U narednom obliku izvođenja, specifično vezivanje može da uključi, ali ne obavezno, ekskluzivno vezivanje. Opisana antitela ili fragmenti antitela specifično se vezuju za humani IL-17C. Poželjno, obelodanjena antitela ili fragmenti antitela specifični za IL-17C, specifično vezuju molekule IL-17C druge vrste, kao što je IL-17C iz miša, pacova, rezus majmuna i/ili makaki majmuna. Još je poželjnije da su antitela ili fragmenti antitela obelodanjeni pronalaskom, specifični za humani human IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišji IL-17C. Postupci određivanja specifičnog vezivanja dva molekula poznati su u stanju tehnike, i obuhvataju, na primer, standardni ELISA test. Ocenjivanje se može izvršiti standardnim kolorimetrijskim postupkom (na primer, pomoću sekundarnih antitela konjugovanih sa peroksidazom rena i tetrametil benzidininom i vodonik peroksidom). Reakcija u nekim bunarićima može da se proceni merenjem optičke gustine, na primer, na 450 nm. Uobičajeni šum pozadine (= negativna reakcija) može biti 0.1 OD; tipična pozitivna reakcija može biti 1 OD. To znači da odnos pozitivne/negativne reakciji može biti veći od 5. Uobičajeno je da se tokom određivanja specifičnosti vezivanja ne koristi samo jedan referentni antigen, već grupa od tri ili pet nesličnih antigena, kao što su proteini mleka u prahu, BSA, transferin i slično.

[0035] Termin "avidnost” koristi se da opiše ukupnu jačinu svih veza i interakcija između proteina. Avidnost se razlikuje od afiniteta koji opisuje jačinu jedne veze. Kao takva, avidnost predstavlja kombinovanu sinergističku jačinu vezujućih afiniteta (funkcionalni afinitet), a ne zbir pojedinačnih veza. U antitelima prema pronalasku, oba antigen-vezujuća mesta iz VH/VL parova istovremeno stupaju u interakciju sa IL-17C. Iako svaka pojedinačna veza može lako da se razgradi (zavisno od relativnog afiniteta), budući da istovremeno postoje mnoge vezujuće interakcije, privremeno razdvajanje jedne vezujuće interakcije neće dovesti do udaljavanja molekula i veza će se održati. Ukupni efekat je sinergistički, i rezultuje snažnim vezivanjem antigena i antitela.

[0036] Termin "afinitet", u predmetnom kontekstu, odnosi se na snagu interakcija između polipeptida i ciljnog molekula na jednom mestu. U okviru svakog mesta, vezujući region polipeptida stupa u interakciju, preko slabih ne-kovalentnih veza, sa mnogim mestima na ciljnom molekulu; što je broj interakcija veći, to je veći afinitet.

[0037] Termin "KD", kako je ovde primenjen, odnosi se na konstantu disocijacije, koja se dobija kao odnos Kdi Ka(odnosno, Kd/Ka) i izražava se u molarnim koncentracijama (M). KDvrednosti za antigen-vezujuće komponente, kao što su monoklonska antitela, mogu se odrediti primenom postupaka dobro opisanih u stanju tehnike. Vrednosti KDantigen-vezujuće komponente, na primer, monoklonskog antitela, mogu se odrediti postupcima kao što su SET (titracija ravnotežne rastvorljivosti) ili rezonancijom površinskih plazmona, primenom biosenzorskog sistema, kao što je Biacore® sistem. U predmetnom pronalasku, antitelo specifično za IL-17C tipično ima konstantu disocijacije (KD) (koff/kon) manju od 5×10-2M, manju od 10-2M, manju od 5×10-3M, manju od 10-3M, manju od 5×10-4M, manju od 10-4M, manju od 5×10-5M, manju od 10-5M, manju od 5×10-6M, manju od 10-6M, manju od 5×10-7M, manju od 10-7M, manju od 5×10-8M, manju od 10-8M, manju od 5×10-9M, manju od 10-9M, manju od 5×10-10M, manju od 10-10M, manju od 5×10-11M, manju od 10-11M, manju od 5×10-12M, manju od 10-12M, manju od 5×10-13M, manju od 10-13M, manju od 5×10-14M, manju od 10-14M, manju od 5×10-15M, ili manju od 10-15M ili još niže.

[0038] "Unakrsno kompetira" označava sposobnost antitela, fragmenta antitela ili drugih antigenvezujućih komponenti da interferiraju sa vezivanjem drugih antitela, fragmenata antitela, ili antigen-vezujućih komponenti sa specifičnim antigenom, standardnim kompetitivnim testom vezivanja. Sposobnost ili domet do kojeg je antitelo, fragment antitela ili druga antigen-vezujuća komponenta sposobna da interferira sa vezivanjem drugog antitela, fragmenta antitela ili antigenvezujuće komponente za specifični antigen, i time da se može reći da unakrsno kompetira prema pronalasku, može se odrediti primenom standardnog kompetitivnog testa. Jedan pogodan test uključuje primenu Biacore tehnologije (na primer, primenu BIAcore 3000 instrumenta (Biacore, Uppsala, Sweden)), koja meri domet interakcija primenom tehnologije rezonancije površinskih plazmona. Drugi test za merenje unakrsne kompetitivnosti zasniva se na ELISA testu. Visokopropusni proces “binovanja epitopa” antitela zasniva se na njihovoj unakrsnoj kompetitivnosti, što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2003/48731. Unakrsna kompetitivnost postoji ako antitelo ili fragment antitela smanjuje vezivanje drugih antitela predstavljenih u Tabeli 1 za IL-17C za 60% ili više, konkretno, za 70% ili više i još konkretnije, za 80% ili više i ako jedno od antitela iz Tabele 1 smanjuje vezivanje naznačenog antitela ili fragmenta antitela, za IL-17C za 60% ili više, specifično za 70% ili više i još specifičnije, za 80 % ili više.

[0039] Termin "epitop" obuhvata svaki proteinski region koji je specifično prepoznat od antitela ili fragmenta antitela ili T-ćelijskog receptora ili nekom drugom interakcijom sa molekulom. Načelno, epitopi su hemijski aktivne površinske grupacije molekula, kao što su aminokiseline ili ugljeni hidrati ili molekuli šećera na bočnim lancima i načelno mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifično naelektrisanje. Kao što će biti jasno stručnjaku iz oblasti, praktično sve za šta se antitelo specifično vezuje može biti epitop.

[0040] "Vezuje isti epitop kao" označava sposobnost antitela, fragmenta antitela ili druge antigen-vezujuće komponente da veže specifični antigen, a vezivanje za isti epitop, kao i reprezentativno antitelo, kada se koristi isti postupak mapiranja epitopa, za upoređivanje antitela. Tehnike mapiranja epitopa su poznate u stanju tehnike. Na primer, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina, kao što su, na primer, vodonik/deuterijum izmena, kristalografija x-zraka, i dvodimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca.

[0041] Kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu se koristiti u terapeutskim ili profilaktičkim primenama. Predmetni pronalazak, dakle, obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo (ili njegov funkcionalni fragment), kao što je opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U jednom sličnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja nekog inflamatornog poremećaja. Takav postupak se sastoji od administriranja, subjektu koji ima takvu potrebu, efektivne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži antitelo (ili funkcionalni fragment antitela), kao što je opisano ili predviđeno.

[0042] Predmetni pronalazak obezbeđuje terapeutske postupke koji se sastoje od administracije terapeutski efektivne količine IL-17C antitela, kao što je opisano, osobi koja potrebu za takvim tretmanom. “Terapeutski efektivna količina” ili “efektivna količina”, u značenju kako je ovde primenjeno, označava količinu IL-17C antitela, neophodnu da se izazove željeni biološki odgovor. U skladu sa predmetom pronalaska, terapeutski efektivna količina je količina IL-17C antitela neophodna da se bolest izleči i/ili spreči.

[0043] "Subjekt" ili "vrsta", kao što je primenjeno u ovom kontekstu, odnosi se na svakog sisara, uključujući glodare, kao što je miš, pacov i na primate, kao što je makaki majmun (Macaca fascicularis), rezus majmun (Macaca mulatta) ili čovek (Homo sapiens). Poželjno je da je subjekt primat, a najpoželjnije je da je primat čovek.

Oblici izvođenja:

[0044] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela, specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži

(a) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 15, ili,

(b) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 28.

[0045] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili na fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili HCDR1 region prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28.

[0046] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži

(a) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 15, ili

(b) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 28.

[0047] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži HCDR1 region prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28.

[0048] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži (a) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 15, ili

(b) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 15, ili

(c) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 28.

(d) HCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 28.

[0049] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili na fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili HCDR1 region prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili HCDR1 region prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28, ili HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28.

[0050] U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela se specifično vezuju za humani IL-17C.

[0051] U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela je monoklonsko antitelo ili njegov fragment.

[0052] U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela je humano, humanizovano ili himerno antitelo ili fragment antitela. U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo ili fragment antitela je IgG izotip. U narednom obliku izvođenja, antitelo ili fragment antitela je IgG1.

[0053] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, i dalje sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 17 ili laki lanac prema SEQ ID No.: 16, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15 i dodatno sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 17 ili laki lanac prema SEQ ID No.: 16, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28 i dodatno sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 30 ili laki lanac prema SEQ ID No.: 29, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28, i dodatno sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 30 ili laki lanac prema SEQ ID No.: 29.

[0054] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16.

[0055] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29.

[0056] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 43 i laki lanac prema SEQ ID No.: 42.

[0057] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment antitela sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 56 i laki lanac prema SEQ ID No.: 55.

[0058] U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska antitelo ili fragment antitela je izolovano antitelo ili fragment antitela.

[0059] U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska antitelo ili fragment antitela je rekombinantno antitelo ili fragment antitela.

[0060] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, za primenu u lečenju poremećaja ili stanja povezanih sa neželjenim prisustvom IL-17C.

[0061] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju nukleinske kiseline, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da antitelo ili fragment sadrži

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, prema LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28.

[0062] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju vektora koja sadrži vektor ili više vektora, koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili fragment antitela obelodanjen u Tabeli 1.

[0063] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na ćeliju koja sadrži kompozicija vektora ili više vektora koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili fragment antitela, kao što je obelodanjeno u Tabeli 1.

[0064] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili fragment antitela, kao što je obelodanjeno u Tabeli 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

[0065] U jednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, blokira vezivanje IL-17C za receptor za IL-17C. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C blokira vezivanje IL-17C za receptor za IL-17C, naznačeno time da je receptor IL17RE. U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da je navedeno antitelo ili fragment antitela blokira vezivanje IL-17C za IL17RE. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili HCDR1 region prema SEQ ID No.: 10, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 11, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 12, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

[0066] U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 i teški lanac i laki lanac imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% najmanje 95% identičnosti sa sekvencom teškom lanca prema SEQ ID No.: 17 ili 30 i lakog lanca prema SEQ ID No.: 16 ili 29.

[0067] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, naznačeno time da se antitelo ili fragment antitela dvovalentno vezuje za homodimer IL-17C i formira kompleks koji se sastoji od navedenog antitela ili fragmenta i jednog homodimera IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela blokira vezivanje IL-17C za IL17RE.

[0068] U nekim oblicima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C blokira vezivanje IL-17C za jedan ili više receptora za IL-17C. U narednom aspektu navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

[0069] U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 ili teški lanac i laki lanac koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa teškim lancem prema SEQ ID No.: 17 ili 30 ili lakim lancem prema SEQ ID No.: 16 ili 29.

[0070] U alternativnim oblicima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL-17C, blokira vezivanje IL-17C za receptore za IL-17C, naznačeno time da receptori za IL-17C obuhvataju IL17RE i IL17RA. U alternativnim oblicima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL-17C, blokira vezivanje IL-17C za IL17RE i IL17RA. U nekim oblicima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifično za IL-17C blokira vezivanje IL-17C za IL17RE, sa IC50vrednostima manjim od 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U nekim aspektima IC50koncentracije se mogu odrediti primenom ELISA testa; SET, FACS ili MSD (Meso Scale Discovery). U narednim aspektima, IC50koncentracije se mogu odrediti postupcima koji su opisani u Primeru 3. U narednim oblicima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 ili teški lanac i laki lanac koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa teškim lancem prema SEQ ID No.: 17 ili 30 i lakim lancem prema SEQ ID No.: 16 ili 29.

[0071] U jednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela je specifičan za humani IL-17C. U narednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C unakrsno reaguje sa IL-17C iz drugih vrsta, kao što je IL-17C iz miša, pacova, rezus majmuna i/ili makaki majmuna. U narednom obliku izvođenja, antitelo ili fragment antitela je specifičan za humani IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišji IL-17C. U narednom obliku izvođenja, antitelo ili fragment antitela je specifičan za humani IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišji IL-17C. U narednom obliku izvođenja, antitelo ili fragment antitela je specifičan za humani IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišji IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 ili teški i laki lanac koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa teškim lancem prema SEQ ID No.: 17 ili 30 i sa lakim lancem prema SEQ ID No.: 16 ili 29.

[0072] U još jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifično se vezuje za humani IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišji IL-17C i blokira vezivanje humanog IL-17C, IL-17C makaki majmuna i mišjeg IL-17C za njihove specifične receptore IL17RE, sa IC50koncentracijama manjim od 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U narednom aspektu, navedeno antitelo je IgG1. U narednom obliku izvođenja, navedena IC50koncentracija je određena primenom testa inhibicije receptora, kao što je opisano u Primeru 3.

[0073] U narednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifično se vezuje za humani IL-17C i blokira vezivanje humanog IL-17C za humani IL17RE, sa vrednošću IC50manjom od 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U narednom aspektu, antitelo je IgG1 tip. U narednim oblicima izvođenja, navedena IC50vrednost je određena je testom inhibicije vezivanja za receptor, kao što je opisano u Primeru 3.

[0074] U narednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifično se vezuje za IL-17C iz makaki majmuna i blokira vezivanje IL-17C iz makaki majmuna za IL17RE iz makaki majmuna, sa vrednošću IC50manjom od 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U narednom aspektu, antitelo je IgG1 tip. U narednim oblicima izvođenja, navedena vrednost IC50određena je testom inhibicije vezivanja za receptor, kao što je opisano u Primeru 3.

[0075] U još jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifično se vezuje za humani IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišji IL-17C i blokira vezivanje humanog IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišjeg IL-17C za humani IL17RE, IL17RE iz makaki majmuna i mišji IL17RE, sa vrednošću IC50manjom od 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U poželjnom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 ili teški lanac i laki lanac koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa teškim lancem prema SEQ ID No.: 17 ili 30 i lakim lancem prema SEQ ID No.: 16 ili 29. U narednom aspektu navedeno antitelo i fragment antitela je IgG1 tip. U narednim oblicima izvođenja, navedena vrednost IC50određena je testom inhibicije vezivanja za receptor, kao što je opisano u Primeru 3.

[0076] U još jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela inhibira aktivaciju NF-κB reporterskog gena, posredovanu humanim IL-17C, IL-17C iz makaki majmuna i mišjim IL-17C, u NIH3T3 ćelijama, sa vrednošću IC50manjom od 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U poželjnom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 23, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 24, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 25, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 ili teški lanac i laki lanac koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa teškim lancem prema SEQ ID No.: 17 ili 30 i lakim lancem prema SEQ ID No.: 16 ili 29. U narednom aspektu, navedeno antitelo je IgG1 tip. U narednom obliku izvođenja, navedena vrednost IC50određena je testom NF-κB reporterskog gena indukovanog IL-17C, kao što je opisano u Primeru 4.

[0077] U jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela je specifičan za humani IL-17C, kodiran sekvencom prema SEQ ID No.: 1. U jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela je specifičan za polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 1. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela je monoklonsko antitelo specifično za polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence prema SEQ ID No.: 1. U narednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela je specifično za humani IL-17C kodiran aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID No.: 1 i predstavlja monoklonsko antitelo ili fragment antitela.

[0078] U jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C je monoklonsko antitelo ili fragment antitela.

[0079] U jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela specifičan za humani IL-17C je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U nekim oblicima izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela specifično za IL-17C predstavlja izolovano antitelo ili fragment antitela. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela je rekombinantno antitelo ili fragment antitela. U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela je rekombinantno humano antitelo ili fragment antitela. U narednom obliku izvođenja, navedeno rekombinantno humano antitelo ili fragment antitela ili izolovano rekombinantno humano antitelo ili fragment antitela je monoklonsko antitelo.

[0080] U narednom obliku izvođenja, navedeno antitelo ili fragment antitela obuhvata teški lanac prema SEQ ID No.: 17 i laki lanac prema SEQ ID No.: 16 ili teški lanac prema SEQ ID No.: 30 i laki lanac prema SEQ ID No.: 29 ili teški lanac i laki lanac koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa tečlim lancem prema SEQ ID No.: 17 ili 30 i lakim lancem prema SEQ ID No.: 16 ili 29.

[0081] U jednom obliku izvođenja, obelodanjeno antitelo ili fragment antitela obuhvata konstantni region humanog teškog lanca i konstantni region humanog lakog lanca. U narednom obliku izvođenja, navedeni konstantni region humanog teškog lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 17 i konstantni region humanog lakog lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 16 ili navedeni konstantni region teškog lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 30 i konstantni region humanog lakog lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 29.

[0082] U jednom obliku izvođenja obelodanjeno antitelo ili fragment antitela je IgG izotip. U narednom obliku izvođenja navedeno antitelo je IgG1.

[0083] U jednom obliku izvođenja, navedeni fragment antitela je fragment bivalentnog antitela.

[0084] Regioni datog polipeptida koji obuhvataju epitop, mogu se identifikovati primenom brojnih postupaka mapiranja epitopa poznatih u stanju tehnike. Videti, na primer, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Na primer, epitopi se mogu determinisati konvencionalnim sintetisanjem velikog broja peptida u čvrstoj fazi, peptida koji odgovaraju delovima proteinskog molekula, i reagovanjem antitelima sa peptidima koji su vezani za čvrstu podlogu. Takvi postupci su opisani u stanju tehnike, na primer, U.S. Patent No. 4,708,871 ; Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715. Slično tome, epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije aminokiselina, kao što je na primer, pomoću vodonik/deuterijum izmene, kristalografije X-zraka i dvodimenzionalne nuklearno magnetne rezonance. Videti, na primer, prethodno navedenu publikaciju Epitope Mapping Protocols. Antigeni delovi proteina mogu se takođe identifikovati primenom standardnih grafika antigenosti i hidropatije, koji se mogu dobiti primenom kompjuterskog programa Omiga, v.1.0, od Oxford Molecular Group. Za određivanje profila antigenosti ovaj kompjuterski program primenjuje Hopp/Woods postupak (Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828), a za grafike hidropatije postupak po Kyte-Doolittle (Kyte et al., (1982) J.Mol. Biol.157:105-132).

[0085] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo ili fragment antitela koji sadrži 6 CDR regiona definisanih prema Kabatu, iz bilo kog antitela navedenog u Tabeli 1. U narednom aspektu, otkriće se odnosi na izolovana monoklonska antitela ili njihove fragmente, koji sadrže 6 CDR regiona, prema Kabatu, poreklom iz svakog od antitela prikazanih u Tabeli 1.

[0086] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitela ili fragmente antitela koja sadrže 6 CDR, koje je definisao Chothia, bilo kog antitela prikazanog u Tabeli 1. U narednom aspektu, otkriće se odnosi na izolovana monoklonska antitela ili njihove fragmente, koji sadrže 6 CDR regiona, koje je definisao Chothia, svakog od antitela prikazanih u Tabeli 1.

[0087] U nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitela ili fragmente antitela obelodanjene u Tabeli 1, naznačeno time da navedena antitela ili fragmenti antitela mogu da se vežu za IL-17C, sa afinitetom koji je određen koncentracijom manjom od 100 nM, poželjnije, manjom od 60 nM, i još poželjnije manjom od oko 30 nM. Dalje su pogodna antitela ili fragmenti antitela koji se vezuju za IL-17C sa afinitetom koji je određen koncentracijom manjom od 10 nM, i još poželjnije, manjom od 3 nM.

[0088] U nekim oblicima izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitela ili fragmente antitela, obelodanjene u Tabeli 1, naznačeno time da navedena antitela ili fragmenti antitela, mogu da se vežu za IL-17C, monovalentnim afinitetom određenim koncentracijom manjom od 100 nM, poželjnije, manjom od 60 nM, i još poželjnije, manjom od 30 nM. Dalje su pogodna antitela ili fragmenti antitela koji se vezuju za IL-17C, monovalentnim afinitetom koji je određen koncentracijom manjom od 10 nM, i još poželjnije, manjom od 3 nM.

[0089] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitela ili fragmente antitela, specifične za IL-17C, naznačeno time da navedena antitela ili fragmenti antitela imaju monovalentni afinitet prema IL-17C, sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 5×10-2M, manjom od 10-2M, manjom od 5×10-3M, manjom od 10-3M, manjom od 5×10-4M, manjom od 10-4 M, manjom od 5×10-5 M, manjom od 10-5M, manjom od 5×10-6M, manjom od 10-6M, manjom od 5×10-7M, manjom od 10-7M, manjom od 5×10-8M, manjom od 10-8M, manjom od 5×10-9M, manjom od 10-9M, manjom od 5×10-10M, manjom od 10-10M, manjom od 5×10-11M, manjom od 10-11M, manjom od 5×10-12M, manjom od 10-12M, manjom od 5×10-13M, manjom od 10-13M, manjom od 5×10-14M, manjom od 10-14M, manjom od 5×10-15M, ili manjom od 10-15M i naznačeno time da navedena bivalentna antitela ili fragmenti antitela imaju afinitet prema IL-17C, definisan konstantom disocijacije (KD) koja je najmanje 2-puta, 5-puta, 10-puta 100-puta, 1.000-puta, 10.000-puta, 100.000-puta manja od konstante disocijacije (KD) monovalentne forme. U narednom obliku izvođenja, bivalentni afinitet navedenih antitela ili fragmenata antitela određen je u IgG formatu, naznačeno time da je monovalentni afinitet navedenih antitela ili fragmenata antitela određen u Fab formatu.

[0090] Poželjno je da su kompozicije prema predmetnom pronalasku, farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, kao što je opisano, i farmaceutski prihvatljiv nosač, diluent, ekscipijens, za terapiju inflamatornog poremećaja ili kancera. Pogodni nosači, diluenti i ekscipijensi su poznati u stanju tehnike, i iskusan stručnjak će naći formulaciju i put administracije koji najviše odgovara lečenju konkretnog subjekta, antitelima ili fragmentima antitela specifičnim za IL-17C, prema predmetnom pronalasku.

[0091] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment antitela specifičan za IL-17C, kao što je obelodanjeno, za primenu u lečenju poremećaja ili stanja povezanih sa neželjenim prisustvom IL-17C. U narednom obliku izvođenja, navedeno stanje povezano sa neželjenim prisustvom IL-17C je inflamatorni poremećaj ili kancer. U narednom obliku izvođenja, navedeni inflamatorni poremećaj je reumatoidni artritis, psorijaza, plućna inflamacija, COPD i/ili atopijski dermatitis (AD), uključujući umereno-do-jake forme AD. U poželjnom obliku izvođenja, navedeni inflamatorni poremećaj je atopijski dermatitis (AD) i/ili umereni-do-jaki AD.

[0092] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na navedene farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17-C, u pripremi medikamenta za lečenje poremećaja ili stanja povezanog sa neželjenim prisustvom IL-17C. U narednom obliku izvođenja, navedeno stanje povezano sa neželjenim prisustvom IL-17C je inflamatorni poremećaj ili kancer. U narednom obliku izvođenja, navedeni inflamatorni poremećaj je reumatoidni artritis, psorijaza, plućna inflamacija, COPD i/ili atopijski dermatitis (AD), uključujući umereni-do-jaki AD. U poželjnom obliku izvođenja, navedeni inflamatorni poremećaj je atopijski dermatitis (AD) i/ili umereni-do-jaki AD.

[0093] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na primenu navedene farmaceutske kompozicije u lečenju poremećaja ili stanja povezanog sa neželjenim prisustvom IL-17C. U narednom obliku izvođenja, navedeno stanje povezano sa neželjenim prisustvom IL-17C je inflamatorni poremećaj ili kancer. U narednom obliku izvođenja, navedeni inflamatorni poremećaj je reumatoidni artritis, psorijaza, plućna inflamacija, COPD i/ili atopijski dermatitis (AD), uključujući umereni-do-jaki AD. U poželjnom obliku izvođenja, navedeni inflamatorni poremećaj je atopijski dermatitis (AD) i/ili umereni-do-jaki AD.

[0094] U narednom aspektu, obezbeđen je postupak lečenja atopijskog dermatitisa (AD) i/ili umerenog-do-jakog atopijskog dermatitisa (AD) kod subjekta, gde se postupak sastoji od administriranja terapeutski efektivne količine antitela ili fragmenta antitela specifičnog za IL-17C, prema pronalasku. U jednom obliku izvođenja, navedeni subjekt je rezistentan, ili ne odgovara ili neadekvatno odgovara na terapiju postojećim površinskim kortikosteroidima (TCS) ili inhibitorom kalcineurina. U narednom obliku izvođenja, subjekt je subjekt kod kojeg postoji potreba za lečenjem. U poželjnom obliku izvođenja, navedeni subjekt je čovek. U alternativnom aspektu navedeni subjekt je glodar, na primer, pacov ili miš.

[0095] U narednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na profilaktički postupak lečenja inflamatornog poremećaja kod subjekta, gde navedeni postupak obuhvata administraciju antagoniste IL-17C, navedenom subjektu. U ovom kontekstu "profilaksa" se koristi da označi postupke čiji je cilj da spreče pojavu bolesti ili da odlože pojavu bolesti. U alternativnim aspektima, navedeni subjekt je glodar, na primer, pacov ili miš.

[0096] U nekim oblicima izvođenja, antitela ili fragmenti antitela specifični za IL-17C prema pronalasku primenjuju se potkožno. U narednim aspektima, antitela ili fragmenti antitela specifični za IL-17C prema pronalasku se primenjuju intravenski, intra-artikularno ili intraspinalno.

[0097] U jednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, koji sadrži VH i VL iz bilo kog antitela obelodanjenog u Tabeli 1.

[0098] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosu na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, koji sadrži teški lanac (IgG1) i laki lanac bilo kog antitela obelodanjenog u Tabeli 1.

[0099] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira sekvencu teškog lanca i/ili lakog lanca antitela koje se vezuje za IL-17C, gde nukleinska kiselina sadrži

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 58, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 59, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 60, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 64, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 65 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 66, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 61, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 62, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 63, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 64, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 65 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 66, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 33, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 34, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 35, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 39, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 40 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 41, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 36, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 37, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 38, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 39, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 40 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 41, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 46, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 47, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 48, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 52, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 53 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 54, ili

HCDR1 region prema SEQ ID No.: 49, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 50, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 51, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 52, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 53 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 54.

[0100] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži VH region prema SEQ ID No.: 19 i VL region prema SEQ ID No.: 18, ili VH region i VL region koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa VH regionom prema SEQ ID No.: 19 i/ili VL region prema SEQ ID No.: 18.

[0101] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži VH region prema SEQ ID No.: 68 i VL region prema SEQ ID No.: 67, ili VH region i VL region koji imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa VH regionom prema SEQ ID No.: 68 i/ili VL regionom prema SEQ ID No.: 67.

[0102] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži VH region prema SEQ ID No.: 32 i VL region prema SEQ ID No.: 31, ili da VH region i VL region imaju najmanje 60%, najmanje 70 %, najmanje 80%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa VH regionom SEQ ID No.: 32 i/ili VL regionom SEQ ID No.: 31.

[0103] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži teški lanac (IgG1) prema SEQ ID No.: 45 i laki lanac prema SEQ ID No.: 44.

[0104] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži teški lanac (IgG1) prema SEQ ID No.: 70 i laki lanac prema SEQ ID No.: 69.

[0105] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži teški lanac (IgG1) prema SEQ ID No.: 71 i laki lanac prema SEQ ID No.: 57.

[0106] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži VH i VL bilo kog antitela iz Tabele 1.

[0107] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, naznačeno time da nukleinska kiselina sadrži teški lanac (IgG1) i laki lanac bilo kog antitela iz Tabele 1.

[0108] U narednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak proizvodnje izolovanog monoklonskog antitela ili njegovog fragmenta bilo kog antitela iz Tabele 1.

Tabela 1. Sekvence antitela

Radni primeri

LISTA SKRAĆENICA

[0109]

ANOVA analiza varijanse

BSA goveđi albumin seruma

BW telesna masa

CDR region koji određuje komplementarnost DLS Dinamično rasipanje svetlosti DMEM Dulbekov modifikovani Igl medijum EC5050% efektivne koncentracije

ECD vanćelijski domen

ECL elektrohemiluminescencija

ELISA enzimski imunosrbentni test

EtOH Etanol

Fab antigen-vezujući fragment

FBS serum fetusa govečeta

Fc konstantni fragment

HPLC Tečna hromatografija visokih performansi

i.p. intraperitonealno

i.v. intravenski

IC50koncentracija koja indukuje 50% inhibicije

IFN-γ Interferon-gama

Ig imunoglobulin

IHC imunohistohemija

IL-17R interleukin 17 receptor

IL-xx interleukin xx

KDkonstanta disocijacije

MC903 kalcipotriol

MPEK primarni keratinociti miša

iRNK informaciona ribonukleinska kiselina

NF-κB jedarni faktor kapa B

p.o. per os, oralno

PBS fosfatni pufer

qPCR kvantitativna lančana reakcija polimeraze

qRT-PCR kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu

SEM standardna greška srednje vrednosti

Th2 pomoćničke T ćelije tipa 2

Primer 1: Priprema antigena, Fab fragmenata i antitela

1.1 Priprema antigena i kontrola kvaliteta

[0110] Poravnate su aminokiselinske sekvence IL-17C poreklom od čoveka, makaki majmuna i miša.

[0111] Bez vodeće sekvence, sekvence iz navedene tri vrste dele 79% homologije.

[0112] IL-17C poreklom iz različitih vrsta nabavljen je od različitih snabdevača ili je proizveden u našoj instituciji i solubilisan je, po potrebi. Na 100 μg proteina, dodato je 4μl biotinilizovanog reagensa ECLTM , i inkubacija je trajala 60 minuta na sobnoj temperaturi, u mraku, uz blago mešanje. Zatim je biotinilizovani protein prečišćen primenom ZebaTM Desalt spin kolona i OD je izmerena na 280 nm.

[0113] Antigeni su biotinilizovani primenom ECL™ kompleta (GE Healthcare; #1061918). Nakon biotinizacije proizvod je prečišćen na ZebaTM Desalt spin koloni (Pierce; #89889).

[0114] Biotinilizovani i ne-biotinilizovani IL-17C iz miša, makaki majmuna i čoveka, podvrgnuti su proveri kvaliteta koja se sastojala od analiza pod denaturišućim, redukujućim i ne-redukujućim uslovima na SDS-PAGE gelu i u nativnom stanju, primenom visoko ekskluzione hromatografije pod visokim pritiskom (HP-SEC) i dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS).

[0115] HP-SEC je izvršen na Dionex UltiMate 3000 Titanium HPLC sistemu (Dionex Corporation, Germering, Germany), u kombinaciji sa Wyatt miniDAWN Treos i Wyatt Optilab rEX (Wyatt Technology Europe, Dernbach, Germany). Za razdvajanje je korišćena kolona Tosoh TSK-Gel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany). Po svakom uzorku na kolonu je naneto 15 μg proteina, a razdvajanje je izvršeno pri brzini protoka od 0.5 ml/min i analizirano apsorpcijom UV zraka na 280 nm. Radni pufer je sadržao 49 mM NaH2PO4, 51 mM Na2HPO4, 100 mM K2SO4, 0.0005% Tween-80 at pH 6.8.

[0116] Svi DLS eksperimenti su izvršeni u DynaPro Titan sistemu kiveta (Wyatt Technology Europe, Dernbach, Germany), u prisustvu proteina, u koncentracijama između 0.2 i 1.0 mg/ml. U slučaju precipitacije ili formiranja čestica, uzorak je pre eksperimenta centrifugiran 5 minuta na 10.000× g.

[0117] Vanćelijski domeni (ECD) mišjeg IL-17 receptora E (UniProt Q8BH06, izoforma 1) i humanog IL-17 receptora E (UniProt Q8NFR9), klonirani su u ekspresioni vektor pMAX_vk_Fc2_His primenom Kpnl i EcoRV, čime je nastala C-terminalna Fc2_H fuziona konstrukcija. Osim prirodne vodeće sekvence (AG00158), generisana je sekundarna konstrukcija sa Vκ-vodećom sekvencom (AG00159).

[0118] Obe konstrukcije su prolazno eksprimirane u HKB11 ćelijama. Ćelijska suspenzija je ostavljena da se uvećava tri dana nakon transfekcije, a supernatant kulture odvojen je 6 dana nakon transfekcije. Nakon sterilne filtracije, rastvor je podvrgnut hromatografiji na protein A afinitetnoj koloni. Pufer je zamenjen PBS-om i uzorci su sterilno filtrirani (veličina pora od 0.2 μm). Koncentracije proteina su određene UV-spektrofotometrijom. Prečišćenost proizvoda je analizirana pod denaturišućim, ne-redukujućim uslovima na SDS-PAGE gelu i u nativnom obliku primenom HP-SEC i DLS.

1.2. Selekcija i priprema Fab/antitela

[0119] Za pripremu antitela korišćena je biblioteka MorphoSys Ylanthia® na osnovu koje su selektovani Fab fragmenti specifični za humani IL-17C. Biblioteka MorphoSys Ylanthia® (Tiller et al. mAbs 5:3, 1-26; May/June (2013) i U.S. Patent No. 8,728,981) je komercijalna fagna biblioteka, koja primenjuje tehnologiju CysDisplay® za prikazivanje Fab fragmenata na površini faga (Lohning et al., WO2001/05950).

[0120] Antitela specifična prema IL-17C identifikovana su primenom su različitih strategija selekcije. Svaka strategija se sastojala od najmanje 3 pojedinačna ciklusa selekcije prema odgovarajućim antigenima, uključujući humani IL-17C (SEQ ID NO.: 1) i mišji IL-17C.

[0121] Identifikovani izolovani klonovi su sazreli, obrađeni su i/ili vraćeni u germinativno stanje, kako bi se povećao afinitet i/ili funkcionalnost. Trijažirano je nekoliko stotina klonova i testirana je funkcionalnost u in vitro testovima, koji su se sastojali od testova vezivanja selekcionisanih antitela za IL-17C iz čoveka, makaki majmuna i miša, inhibicije vezivanja IL-17C za odgovarajući IL-17RE iz čoveka, makaki majmuna i miša, i funkcionalnih testova inhibicije IL-17C (IL-17RE-indukovan NF-κB reporter test u mišjim NIH3T3 ćelijama i IL-17C-indukovana ekspresija CSF3 u mišjim primarnim keratinocitima (MPEK)).

[0122] Na kraju su selekcionisana dva poželjna vodeća antitela (MAB#1 i MAB#2), koja su dalje opisana u radnim primerima, kao što sledi u nastavku.

Primer 2: Određivanje afiniteta kod monovalentnog Fab i divalentnog IgG formata [0123] Određen je afinitet monovalentnog Fab i divalentnog IgG primenom SET. Prečišćeni Fab fragmenti su titrirani za IL-17C iz čoveka, makaki majmuna i miš, kako bi se odredila KD.

Odgovarajući prečišćeni IgG su titrovani za IL-17C iz čoveka, makaki majmuna i miša, radi određivanja EC50.

[0124] Titracija u rastvoru (SET) izvršena je kao što je opisano u literaturi (Friquet et al., (1985) J. Immunol. Meth. 77: 305-19). Da bi se povećala senzitivnost i preciznost SET postupka, on je umesto klasičnim ELISA testom, izvršen pomoću ECL tehnologije (Haenel et al. (2005) Anal Biochem. 339.1: 182-84).

[0125] Rezultati za MAB#1 i MAB#2 prikazani su u Tabeli 2, odnosno, Tabeli 3.

Primer 3: Karakterizacija Fab ili IgG specifičnih za IL-17C u testu inhibicije aktivnosti receptora

[0126] Prečišćeni Fab ili IgG specifični za IL-17C testirani su u smislu sposobnosti da inhibiraju vezivanje IL-17C za njegov specifični receptor, IL-17RE. U mikrotitar ploče MA6000 sa 384 bunarića (Meso Scale Discovery, MSD) naliveno je po 30 μl mišjeg himernog proteina IL17RE/Fc, pripremljenog u koncentraciji 75 ng/ml u PBS, na 4°C tokom noći. Sledećeg dana preinkubirana su serijska razblaženja antitela (koncentracije od 0.001 do 100 nM) tokom 30 min na sobnoj temperaturi, sa istom zapreminom biotinilizovanog humanog/makaki ili mišjeg IL-17C, kako bi se odredila IC50vrednost inhibicije vezivanja za receptor. Nakon blokiranja ploča rastvorom 2.5% BSA u PBST tokom 1 h, prethodno uspostavljeni kompleksi antitelo-ligand dodati su tokom 1 sata obloženim IL17RE/Fc, a vezivanje receptora je detektovano pomoću Streptavidin-ECL na MSD Sector Imager-u.

[0127] Oba antitela (MAB#1 i MAB#2) jednako se inhibirala interakciju humanog/makaki ili mišjeg IL-17C sa IL-17RE u Fab i IgG formatu. Dobijene su vrednosti IC50u dvocifrenom pM-opsegu za oba antitela u IgG formatu u sve tri klinički relevantne vrste. Rezultati su prikazani u redovima 3 i 4 u Tabeli 2 , odnosno, Tabeli 3.

Primer 4: Funkcionalno testiranje u IL-17C-indukovanom NF-κB reporter testu

[0128] Prečišćena IgG antitela specifična za IL-17C dalje su testirana u pogledu sposobnosti da inhibiraju biološku aktivnost humanog, mišjeg i makaki IL-17C, u funkcionalnom ćelijskom testu koji se zasniva na IL-17C indukovanoj aktivaciji NF-κB reporterskog gena u NIH3T3 ćelijama koje pojačano eksprimiraju mišji IL-17RE.

[0129] NIH3T3 ćelije su gajene u DMEM medijumu obogaćenim 10% FBS-om i 1% Pen/Strep na 37°C, 5% CO2. Za potrebe testa, NIH3T3 ćelije su transfektovane u suspenziji ukupnom količinom od 100 ng DNK (20 ng mišjeg IL-17RE ekspresionog konstrukta, 50 ng NF-κB luciferaznog reporterskog konstrukta i 30 ng pBluescript), pomoću Polyplus jet-PEI transfekcionog agensa. Ukratko, DNK je razblažena u 5 μl 150 mM NaCl (po bunariću) i pripremljeno je 0.2 μl jet-PEI u 8 μl 150 mM NaCl (po bunariću). Nakon 5 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, JetPEI® rastvor je dodat rastvoru DNK i sve je dalje inkubirano 20-30 minuta na sobnoj temperaturi. NIH3T3 ćelije su razblažene do broja od ~ 40,000 ćelija in 87 μl medijuma. Ćelije su dodate u DNK-JetPEI I® mešavinu (87 μl ćelija i 13 μl DNK-JetPEI I® mešavine/bunariću), i konačna zapremina je naneta na ploče sa 96 bunarića.

[0130] Nakon inkubacije preko noći na 37°C u vlažnom 5% CO2inkubatoru, medijum je uklonjen i jetPEI® zamenjen sa 90 μl medijuma koji je sadržao 5% FBS i 1% Pen/Strep. Ćelijama je dodato po 10 μl serijskih razblaženja antitela u DPBS, preinkubiranih 30 minuta na sobnoj temperaturi sa jednakom zapreminom prečišćenog rekombinantnog IL-17C (humani IL-17C (Novus #NBP1-42910), mišji mIL-17C (R&D Systems #2306-ml-025), makaki IL-17C (proizveden u laboratoriji)). Finalna koncentracija IL-17C bila je 0.5 ng/ml.

[0131] Nakon inkubacije ploča na 37°C u CO2inkubatoru, dodato je 100 μl SteadyLite Plus (Perkin Elmer), nakon čega je luminescenca očitana na uređaju Envision (Perkin Elmer).

[0132] Oba antitela su efikasno smanjila aktivaciju NF-κB reporterskog gena posredovanu IL-17RE, u prisustvu IL-17C poreklom iz čoveka, miša ili makaki majmuna. Dobijeni rezultati se mogu naći u redu 5 u Tabeli 2, odnosno, Tabeli 3.

Primer 5: Analiza IL-17C-indukovane ekspresije gena u primarnim humanim keratinocitama

[0133] Keratinocite endogeno eksprimiraju receptore IL-17RE i IL-17RA, koji su potrebni za funkcionalnu signalizaciju IL-17C. Stogu su za ispitivanje kapaciteta MAB#1 IgG1 i MAB#2 IgG1 antitela da inhibiraju biološku aktivnost odgovarajućeg humanog ili mišjeg IL-17C u fiziološkom kontekstu, korišćeni primarni keratinociti dobijeni iz zdravih donora i primarni keratinociti dobijeni iz miša.

[0134] NHEK (normalni humani epidermalni keratinociti) nabavljeni od kompanije Lonza Biosciences, kultivisani su u medijumu za keratinocite koji je obogaćen suplementima (KGM-Gold™ Bullet kit, Lonza), prema protokolu proizvođača. NHEK koje su subkultivisane i zamrznute nakon trećeg pasaža, odmrznute su i sejane u KGM ćelijskom medijumu, u gustini od 30 000 ćelija/bunariću na mikrotitar pločama za kulturu sa 96 bunarića. Nakon 2 dana, medijum je zamenjen medijumom KGM-Gold bez hidrokortizona, pre dodavanja hIL-17C (Novus #NBP1-42910) i hTNFa (Peprotech #300-01A) u finalnoj koncentraciji od 10 ng/ml.

[0135] Za testiranje antitela, humani IL-17C je najpre preinkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi sa jednakom zapreminom serijskih razblaženja antitela u DPBS. Ćelije su stimulisane rekombinantnim IL-17C (preinkubiran sa ili bez razblaženja antitela) u prisustvu TNFα. Pokazano je da ko-stimulacija ćelija IL-17C i TNFα dovodi do sinergističke indukcije različitih gena, kao i da je neophodna ko-stimulacija u prisustvu oba citokina, jer IL-17C samostalno ima ograničen uticaj na ekspresiju izučavanih gena.

[0136] Ćelije su kultivisane 48 sati, a zatim je ekstrahovana ukupna RNK, pomoću RNeasy 96 kompleta (Qiagen), reverzno je transkribovana pomoću Taqman® Reverse Transcription reagensa (Applied Biosystems), dok je ekspresija gena za beta-defensin 2 DEFB4A (humani) ili CSF3 (mišji) određena kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze (qPCR). Sažeto, pripremljeno je 10 μl PCR reakcione smeše primenom Taqman® universal PCR master miksa/No AmpErase® UNG i prethodno dizajniranih prajmerskih proba za DEF4B ili CSF3 (Assay-ondemand Gene expression primer/probe, #Hs00823638_m1, obe od Applied Biosystems). qPCR je izveden na ViiA7™ Real-Time PCR instrumentu (Applied Biosystems). Ekspresija gena je normalizovana u odnosu na ekspresiju interne kontrole, za koju je poslužio gen za β-aktin (Taqman primer set #4310881E) ili gen za GAPDH (Taqman primer set #4310893E).

[0137] Pokazano je da oba antitela (MAB#1 i MAB#2) efikasno smanjuju ekspresiju gena DEFB4A (humani) ili CSF3 (miš), a potvrđena je sposobnost antitela da neutrališu biološku aktivnost humanog IL-17C i mišjeg IL-17C (Tabela 2 i Tabela 3).

Pregled funkcionalne karakterizacije in vitro:

[0138] Rezultati in vitro testiranja zbirno su prikazani u Tabeli 2 za MAB#1 i u Tabeli 3 za MAB#2. Aminokiselinska sekvenca i sekvenca nukleinske kiseline varijabilnih regiona i CDR ovih antitela prikazane su u Tabeli1. Oba antitela su zadovoljila tražene kriterijume i smatraju se potencijalnim molekulima za dalji klinički razvoj.

Tabela 2. Sažetak in vitro karakterizacije MAB#1

Tabela 3: Sažetak karakterizacije MAB#2 antitela in vitro

Primer 6: Test unakrsne kompeticije na bazi ELISA testa

[0139] Unakrsna kompeticija anti-IL-17C antitela i drugog agensa sa IL-17C-vezujućom sposobnošću može se utvrditi primenom ELISA testa, prema sledećem standardnom postupku.

[0140] Opšti princip ELISA testa uključuje nanošenje anti-IL-17C antitela (kao što su MAB#1 ili MAB#2) na dno bunarića na mikrotitar pločama. Zatim se rastvor dodaje drugo, potencijalno unakrsno-kompetitivno anti-IL-17C antitelo u suvišku (ono koje nije vezano za dno bunarića ELISA ploče). Zatim se u bunariće dodaje ograničena količina IL-17C-Fc.

[0141] Antitelo koje je vezano za mikrotitar ploču i antitelo u rastvoru će kompetirati za vezivanje za ograničen broj IL-17C molekula. Ploča se ispira, kako bi se uklonili molekuli IL-17C koji se nisu vezali za antitelo kojim je obložena mikrotitar ploča i kako bi se uklonilo drugo, solubilno antitelo, kao i svi formirani kompleksi drugog, solubilnog antitela i IL-17C. Količina vezanog IL-17C se zatim meri primenom odgovarajuće IL-17C detekcionog reagensa. U tom smislu, IL-17C može biti fuzionisan sa nekim oznakom, na primer, Fc, Frag, itd, koje će biti detektovano odgovarajućim agensom specifičnim za obeležje.

[0142] Ukoliko je antitelo u rastvoru unakrsno-kompetitivno sa antitelom kojim je obložena mikrotitar ploča, smanjiće se broj molekula IL-17C vezanih za obloženo antitelo, u poređenju sa brojem IL-17C molekula koji će se vezati za isto antitelo kada drugo, solubilno antitelo nije prisutno u bunariću.

[0143] Sledi detaljniji opis ovog testa za dva antitela, koja nose oznake Ab-X i Ab-Y. U slučaju kada je Ab-X izabrano da bude imobilisano antitelo, ono se nanosi na dno bunarića mikrotitar ploče za ELISA, nakon čega se ploče blokiraju pogodnim rastvorom za blokiranje, kako bi se smanjilo nespecifično vezivanje reagensa koji će zatim biti dodat. Zatim se u bunariće dodaje drugo, Ab-Y antitelo u suvišku, tako da je broj molova Ab-Y IL-17C vezujućih mesta po bunariću najmanje 10 puta veći od broja molova Ab-X IL-17C vezujućih mesta kojim je dno bunarića obloženo. Zatim se dodaje IL-17C, u količini tako da je broj molova IL-17C po bunariću najmanje 25 puta manji od broja molova Ab-X IL-17C vezujućih mesta koja su korišćena za oblaganje bunarića. Nakon odgovarajućeg inkubacionog perioda, ELISA ploča se ispira, dodaje se detekcioni reagens specifičan za IL-17C antigen, kako bi se izmerila količina specifično vezanih IL-17C molekula za anti-IL-17C antitelo vezano za mikrotitar ploču (u ovom slučaju Ab-X). Signal pozadine u ovom testu se definiše kao signal koji se dobija u bunarićima sa obloženim antitelom (u ovom slučaju Ab-X), drugim solubilnim antitelom (u ovom slučaju Ab-Y), puferom (odnosno, bez IL-17C) i detekcionog reagensa. Signal pozitivne kontrole u ovom testu definiše se kao signal koji se dobija u bunarićima sa obloženim antitelom (u ovom slučaju Ab-X) i puferom (odnosno, bez drugog, solubilnog antitela), i IL-17C detekcionim reagensom. ELISA test mora da se izvede na ovaj način, kako bi signal pozitivne kontrole bio najmanje 6 puta veći od signala pozadine.

[0144] Da bi se izbegle tehnička greška (značajne razlike afiniteta između Ab-X i Ab-Y prema IL-17C) načinjena izborom antitela koja se koriste kao antitela za oblaganje mikrotitar ploče i kao druga (kompetitivna) antitela, unakrsno blokirajući test treba da se sprovede u dva formata: 1) format 1, u kojem je Ab-X antitelo kojim se oblaže ELISA ploča, a Ab-Y je kompetitivno antitelo u rastvoru i 2) format 2, u kojem je Ab-Y antitelo kojim se oblaže ELISA ploča i Ab-X je kompetitivno antitelo u rastvoru.

Primer 7: Model psorijaze indukovane IL-23 kod miša

[0145] Efikasnost i terapeutski potencijal oba antitela kandidata in vivo ispitani su i testirani u modelu psorijaze indukovane citokinom IL-23 kod miša.

[0146] Model psorijaze indukovane IL-23 kod miša suštinski je opisan u Rizzo H et al. J Immunol (2011) Vol.186(3) pp.1495-1502.

[0147] Ukratko, kožne lezije indukuju se kod miševa Balb/C soja, intradermalnom injekcijom IL-23 u kožu uha (1 μg), tokom 4 uzastopna dana (dan 1 do dan 4). Merenje debljine uha ponavlja se svaki dan sve do 5. dana, kada se miševi eutanaziraju. Uzima se uzorak ušne školjke i uzdužno se deli na dve polovine. Jedna polovina se fiksira u formalinu za potrebe histološke analize debljine epidermis i dermisa. Druga polovina se uranja u RNK reagens za kvantitativnu reverznotranskripcionu lančanu reakciju polimeraze (qRT-PCR) i analizu nivoa ekspresije iRNK koje kodiraju proinflamatorne citokine relevantne za bolest, IL-17A, IL-22 i IL-1β i antimikrobne proteine LCN2, S100A8 i S100A9. Grupe (n = 10) miševa kojima je injeciran IL-23 tretirane su antitelima MAB#1 ili MAB#2, koja su im i.p. aplikovana dva puta, u dozi od 10 mg/kg (prvi put, tri dana pre prve intradermalne injekcije i drugi put, neposredno nakon prve IL-23).

[0148] Oba antitela su testirana u dva nezavisna eksperimenta, koja su se sastojala od 3 različita istraživanja. U svako istraživanje su bile uključene sledeće kontrolne grupe (svaka n = 10):

Kontrolna grupa miševa koja nije primila dnevne doze IL-23, ali je primila interdermalne injekcije iste zapremine rastvora BSA/PBS. Ova grupa tretirana je negativnim kontrolnim izotipom antitela MOR03207 (2× 10 mg/kg, i.p.).

[0149] U svakom od istraživanja merena je makroskopska debljina uha i debljina epidermisa i pojedinačni podaci za svaku životinju su iskorišćeni za određivanje % prevencije IL-23-indukovanog zadebljanja. Podaci dobijeni qPCR su izraženi kao Rq (relativn količina) prema jednačini (Rq=2<-ΔCt>, gde je ΔCt= Ct (gen od interesa) - Ct (interna kontrola)), nakon normalizacije u odnosu na nivo ekspresije ciklofilina A, koji je korišćen kao gen interne kontrole.

U svim merenjima, srednja vrednoste ± SEM dobijene za grupe upoređena je jednovarijantnom analizom varijanse (ANOVA) i Dunnett-ovim testom višestrukih poređenja, post hoc, primenom PRISM softverskog paketa. "p" vrednost < 0.05 smatrana je statistički značajnom (*: p<0.05; **: p<0.01; ***:p<0.001; ns: nije značajno)

[0150] Ukratko, aplikacija oba kandidata antitela, IgGs MAB#1 i MAB#2 (2×10 mg/kg) umanjila je IL-23-indukovanu inflamaciju kože, pokazujući tako in vivo efikasnost i terapeutski potencijal. Oba antitela imala su sličnu uticaj na nivo IL-23-indukovanog zadebljavanja epidermisa i sličan uticaj na nivo IL-23-indukovanog povećanja genske ekspresije (videti Tabelu 4).

Tabela 4: Sažetak efikasnosti u IL-23 modelu in vivo

Primer 8: MC903 mišji model atopijskog dermatitisa

[0151] Efikasnost MAB#1 antitela u atopijskom dermatitisu ispitana je u ne-infektivnoj inflamaciji kože u mišjem modelu atopijskog dermatitisa, u kojem površinska aplikacija niskokalcemijskog analoga vitamina D3 MC903 (kalcipotriol), izaziva atopijski dermatitis, koji se manifestuje kožnim lezijama sa crvenilom, perutanjem, hiperplazijom epidermisa i infiltracijom različitih tipova ćelija u dermis, kao i povećanjem oslobađanja Th2 citokina u koži i povećanjem nivoa IgE u serumu (Li M et al. Proc Natl Acad Sci USA (2006) Vol. 103(31) pp.11736-11741; Li M et al. J Invest Dermatol. (2009) Vol.129(2). pp.498-502).

8.1 Životinje

[0152] BALB/c miševi (8-nedelja stare ženke) nabavljene su od Janvier Labs (France). Miševi su gajeni pod uslovima 12-to časovnih ciklusa svetlo/mrak (0700-1900). Temperatura je održavana na 22°C, i životinje su imale slobodan pristup hrani i vodi.

8.2. Eksperimentalni postupci

[0153] Stanje slično AD indukovano je površinskom primenom 20 μL 2 nmol MC903 (Tocris, rastvoren u etanolu) u oba uha miševa, tokom pet uzastopnih dana. Kontrolna grupa miševa je primila istu količinu etanola (EtOH).

[0154] Ozbiljnost kožne inflamacije (eritem i zadebljavanje) praćena je svaki dan. Zadebljavanje kože uha mereno je elektronskim kaliperom (Mitutoyo). Inflamacija je dalje procenjena primenom in vivo tehnika odslikavanja. To je sprovedeno intraperitonealnom aplikacijom Prosense 680 proba (1.6 nmol, Perkin Elmer), 24 sata pre odslikavanja. Odslikavanje je obavljeno na Bruker In-vivo Xtreme Imaging sistemu. Slike su snimljene duboko ohlađenom 4MP CCD kamerom (f-stop 1.1, spajanje piksela 2×2, 5 sek vreme akvizicije, Ex 630 nm, Em 700 nm). Za istovremenu anatomsku registraciju uzete su reflektujuće slike (f-stop 2.8, 0.175 sek vreme akvizicije). Sve mikrografije su načinjene u vidnom polju 190×190, a slike su analizirane pomoću Molecular Imaging Software version 7.1 (Bruker Biospin, Billerica, MA, USA). Na osnovu srednjih vrednosti dobijenih za levo i desno uho pojedinačnog miša, izračunate su srednje vrednosti i standardna greška srednje vrednosti (sem) za svaku grupu.

[0155] U trenutku žrtvovanja, uzeti su uzorci oba uha, fiksirani su u 4% formaldehidu pre potapanja u parafin. 4 μm-preseci su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E boja) za potrebe histomorfometrijskih procena debljine epidermisa, analizom slika pomoću Sisn’Com programskog paketa (France). Izmereno je pet polja (uvećanje ×20) po svakom uhu, što je pokrilo celo uho od vrha ka bazi, a na osnovu ovih pet vrednosti dobijena je srednja vrednost po uhu po mišu (levo/desno uho). Dodatni set tkivnih preseka je pripremljen za IHC bojenje na IL-17C, pomoću anti-IL-17C biotinilovanog MAB antitela (i biotinilovanog MOR03207 izotipa negativnog kontrolnog antitela). Obrada i bojenje su izvršeni kao što je opisano ranije.

[0156] Uzorci kože uha uzeti su za analizu ekspresije citokina, primenom qPCR ili ELISA. Parčadi kože uha za qPCR gensku analizu uronjeni su u RNALater® rastvor za stabilizaciju (Ambion) i zamrznuti su na -20°C. Uzorci kože uha za kvantifikaciju na proteinskom nivou su trenutno smrznuti u tečnom N2 i čuvani na -80°C do korišćenja. Za analizu genske ekspresije, tkivo je usitnjeno i lizirano u RNK rastvoru za liziranje, pomoću Precellys homogenizatora (mikrotube ispunjene ceramidnim zrncima od 1.4 mm, centrifugiranje 3 puta 3 ciklusa od 15 sek na 6 000 rpm). Ukupna RNK je ekstrahovana pomoću NucleoSpin® RNK kompleta, prema uputstvu proizvođača (Macherey-Nagel), i 300 ng je reverzno-transkribovano primenom Applied Biosystems™ i kompleta High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. U reakcijama kvantitativnog PCR u realnom vremenu korišćeno je 5 mL 10-puta razblažene cDNK, primenom SYBR Green tehnologije i gen-specifičnih prajmera nabavljenih kod Qiagen. qPCR je izveden na ViiA™ 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Ekspresija gena je normalizovana na ekspresiju 3 različita interna gena (ciklofilin, b-aktin i GAPDH) i predstavljena kao relativan nivo iRNK specifične ekspresije gena, dobijene primenom 2<-ΔCt>postupka, gde je ΔCt = Ctgena-Geomean Ct-vrednost (interni gen). Za kvantifikaciju ekspresije na proteinskom nivou, tkivo je najpre usitnjeno i lizirano u 250 μL pufera za lizu (TPER ™ Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce), koji je obogaćen koktelom inhibitora proteaza (Protease Inhibitor Cocktail - Roche) i koktelom inhibitora fosfataza (Halt™ Phosphatase Inhibitor Cocktail (Pierce)), primenom Precellys homogenizatora (mikrotube ispunjene metalnim zrncima od 2.8 mm, 10 min 14 000 rpm na 4°C). Količina TSLP u koži uha određena je primenom TSLP mišjeg DuoSet ELISA kompleta od R&D System-a. Količina je normalizovana na ukupni sadržaj proteina u lizatu, koji je određen primenom reagensa Coomassie Protein Assay Reagent (Thermo Fisher) i BSA kao standarda proteina. Podaci su predstavljeni kao količina citokina u koži uha, izračunata primenom formule: koncentracija citokina u uzorku/koncentracija proteina u uzorku × ukupan sadržaj proteina u uhu.

[0157] Značajnost tretmana u svakom očitavanju procenjena je korišćenjem Prism® programskog paketa, i jedno-varijantne ANOVA i post-hoc Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja sa MC903 MOR03207 kontrolnom grupom, *: p<0.05; **: p<0.01 ; ***:p<0.001.

8.3. Efikasnost MAB#1 u mišjem modelu atopijskog dermatitisa (profilaksa)

[0158] Efikasnost različitih doza MAB#1 u MC903 modelu atopijskog dermatitisa procenjeno je u dizajnu profilaktičkog efekta. Ukratko, kožne lezije su indukovane u BALB/c mišu, površinskom aplikacijom 2 nmol MC903 (rastvoren u etanolu), na oba uha, tokom 5 uzastopnih dana; miševi su eutanazirani 8. dana. MAB#1 je administriran i.p.3 puta, odnosno, 3 dana pre, na početku i 4 dana nakon prve aplikacije MC903. Procenjen je uticaj na oticanje ušiju, inflamaciju kože uha, hiperplazuju epidermisa, zadebljavanje dermisa i gensku ekspresiju. Grupa miševa koja je primila izotip negativnog kontrolnog antitela (MOR03207) poslužila je za poređenje. Grupa koja je primila deksametazon (5 mg/kg u 0.5% metil celulozi, administriran dnevno, oralnim putem (p.o.), od prvog dana primene MC903) služila je za aktivno poređenje. Miševi su nasumice podeljeni u jednake grupe (n = 10).

[0159] Ozbiljnost inflamacije kože (eritem i zadebljavanje) praćena je tokom celog eksperimenta. Makroskopsko zadebljavanje kože izmereno je pomoću Mitutoyo merača debljine tokom trajanja eksperimenta. Inflamacija je dalje procenjena 5. dana, in vivo odslikavanjem, kao što je opisano u 8.2).

[0160] Etanol (kao nosač) nije imao uticaja. Suprotno tome, nakon tretmana MC903, koža uha je natekla i pocrvenela. Tretman MAB#1 antitelom, u dozama 2 mg/kg i više, značajno je umanjio zadebljavanje kože. Efekat MAB#1 bio je maksimalan pri dozi od 10 mg/kg i bio je sličan efektu deksametazona (Slika 1). U skladu sa ovim zapažanjima, inflamacija uha (procenjena in vivo odslikavanjem 5. dana), značajno se povećala kod životinja tretiranih MC903 i smanjila se tretmanom MAB#1 antitelom, sa značajnim i maksimalnim efektom doze od 10 mg/kg (Slika 2).

[0161] Da bi se potvrdilo smanjenje debljine pod delovanjem MAB#1, histološki preseci kože prikupljeni 8. dana, obojeni su hematoksilinom i eozinom, za histomorfometrijsku evaluaciju epidermisa i dermisa. Vrednosti dobijene slikanjem pet polja koja pokrivaju celu površinu kože od vrha do baze su izmerene, i izračunata je srednja vrednost za svakog miša. MAB#1 u dozi od 10 mg/kg i više, u značajnoj meri sprečava povećanje debljine epidermisa i dermisa (Slika 3).

8.3.1 Efekat MAB#1 na gensku ekspresiju

[0162] Da bi se dalje okarakterisao efekat MAB#1 u inflamatornom modelu atopijskog dermatitisa izazvanog MC903, analizirana je ekspresija različitih gena relevantnih za dermatitis na iRNK nivou primenom qPCR, ili na proteinskom nivou, primenom enzimskog imunosorbentnog eseja (ELISA). Proteinska ekspresija TSLP i IL-33 u uhu i nivo TARC u plazmi povećali su se nakon primene MC903 i značajno su inhibirani nakon tretmana MAB#1, u dozi od 10 mg/kg ili više (Slika 4). Sličan inhibitorni efekat MAB#1 uočen je na nekoliko drugih gena koji su bili ushodno regulisani u koži uha nakon delovanja MC903, kao što su IL-31 (citokin povezan sa svrabom kod atopijskog dermatitisa), Th1-citokin IL-4, i drugi geni za koje je pokazano da su ushodno regulisani kod ljudi sa atopijskim dermatitisom, kao što su S100A8/9 i IFN-γ. Takođe, MAB#1 je sprečio nishodnu regulaciju FLG2 kod miševa tretiranih MC903, što može da ukaže na potencijalnu ulogu MAB#1 u obnavljanju kožne barijere.

8.4 Efikasnost MAB#1 u mišjem modelu atopijskog dermatitisa (terapeutski efekat)

[0163] Efikasnost različitih doza MAB#1 u modelu atopijskog dermatitisa izazvanog MC903 procenjen je uslovima relevantnijim za terapeutski efekat. Ukratko, kožne lezije su indukovane u BALB/c mišu pre početka tretmana površinskom administracijom 2 nmol MC903 (rastvoren u etanolu) na kožu oba uha tokom 5 uzastopnih dana. MAB#1 je administriran i.p. 4 puta, gde je prva administracija izvršena poslednjeg dana aplikacije MC903 (5. dan) i u narednim danima 8, 12. i 15 dana. Miševi su žrtvovani 16. dana. Procenjeni su efekti na oticanje kože uha, inflamaciju kože uha, hiperplaziju epiderma, debljanje dermisa i gensku ekspresiju. Takođe je procenjen uticaj na infiltraciju imunskih ćelija (eozinofila, T-ćelija i mastocita). Grupa miševa koja je primila izotip negativnog kontrolnog antitela (MOR03207) služila je za poređenje. Deksametazon (1 mg/kg u 0.5% metil celulozi, administriran p.o. počev od poslednjeg dana aplikacije MC903, 5. dana i zatim u 8. do 12. i 15. do 16. dana), poslužio je za poređenje.

8.4.1 Efekat MAB#1 na makroskopsku debljinu i inflamaciju uha

[0164] Makroskopska debljina merena je pomoću Mitutoyo merača debljine tokom trajanja eksperimenta. Površinska primena MC903 na kožu uha izazvala je 3. dana snažno zadebljavanje u poređenju sa kožom koja je tretirana etanolom (u kojem je MC903 rastvoren). Bolest se značajno razvila 5. dana (odnosno, prvog dana tretmana) i nastavila je da se razvija nakon toga (iako je aplikacija MC903 prekinuta), što se videlo na osnovu kontinuiranog povećanja otoka u grupi koja je tretirana negativnim kontrolnim antitelom MOR03207 (Slika 5). Tretman MAB#1 antitelom, u dozi od 0.4 mg/kg i više, značajno je smanjio zadebljavanje kože 12. dana, pri čemu su veće doze MAB#1 imale snažniji efekat i značajno su smanjile debljinu uha, čak i u ranijim vremenskim tačkama (od 8. dana za MAB#1 pri 50 mg/kg, od 10. dana za doze od 10 i 2 mg/kg). U skladu sa ovim opažanjima, 12. dana, inflamacija kože, na osnovu procene in vivo odslikavanjem (koje je opisano u 8.2) bila je još uvek povećana kod životinja koje su tretirane negativnim kontrolnim antitelom, a značajno je bila smanjena u grupi tretiranoj MAB#1 antitelima, pri svim dozama, sa maksimalnim efektom uočenim pri dozi od 2 mg/kg (Slika 6).

8.4.2 Efekat MAB#1 na debljinu epidermisa/dermisa kože uha

[0165] Smanjenje debljine kože uha nakon delovanja MAB#1 potvrđeno je na histološkim presecima uzetim 16. dana, koji su obojeni hematoksilinom i eozinom, za potrebe histomorfometrijske evaluacije debljine epidermisa i dermisa. MAB#1, pri dozama od 2 mg/kg i višim, značajno je umanjilo povećanje debljine epidermisa i dermisa, što je bilo u skladu sa makroskopskim merenjima debljine kože (Slika 7).

8.4.3 Efekat MAB#1 na infiltraciju ćelija u dermis

[0166] Efekat MAB#1 na tok bolesti u modelu atopijskog dermatitisa izazvanog MC903 dalje je okarakterisan procenom broja infiltriranih ćelija. Konkretno, izvršili smo imunohistohemijsku procenu (IHC) efekta na eozinofile, T-limfocite i mastocite i kvantifikovali smo oblasti obojene odgovarajućim antitelima koja detektuju peroksidazu eozinofila, T-ćelijski marker CD3 i triptazu mastocita (za više detalja videti (Marsais, 2016)). U skladu sa pojačanom inflamacijom i zadebljavajem uha, infiltracija eozinofila, T-ćelija, i u nešto manjoj meri, mastocita, bila je izražena 16. dana, u koži uha miševa kod kojih je bolest izazvana aplikacijom MC903. Tretman MAB#1 antitelom smanjio je infiltraciju sva tri tipa ispitivanih ćelija u dermis kože (Slika 8). Značajno smanjenje broja infiltriranih eozinofila i T-ćelija uočeno je kod sve tri testirane doze MAB#1 antitela, pri čemu su doze veće od 50 mg/kg izazvale snažniji efekat u pogledu smanjenja infiltracije ovih tipova ćelija na nivo koji je sličan efektima deksametazona. Uticaj na infiltraciju mastocita bio je načelno slabiji, ali i dalje značajan: infiltracija je smanjenja MAB#1 antitelom u dozama koje su veće od 50 i 10 mg/kg.

8.4.4 Efekat MAB#1 na gensku ekspresiju

[0167] Ekspresija je analizirana na uzorcima kože i plazme prikupljenima 16. dana, primenom qPCR za osam gena koji su od značaja za ovu bolest ili ELISA testom, za TSLP i IL-33 oslobođene u koži uha, ili TARC u plazmi, kao što je opisano u 8.2.

[0168] Za većinu testiranih gena nije uočena značajna razlika ekspresije između grupe zdravih kontrola tretiranih EtOH i miševa kod kojih je bolest izazvana aplikacijom MC903 tokom prvih pet dana. Samo su nivoi IL-33 proteina i iRNK koja kodira IL-4, S100A9 i IFN-γ bili povećani. Tretman MAB#1 antitelom u svim dozama, umanjio je indukovano povećanje ekspresije ovih gena (osim IFN-γ), kao što je prikazano na Slici 9.

8.5. Rezultati

[0169] MAB#1 antitelo je sprečilo nastanak kožne inflamacije kože slične atopijskom dermatitisu u MC903 modelu, sa značajnim uticajem na zadebljavanje epidermisa i dermisa, inflamaciju i ekspresiju gena koje pokreću T pomoćničke ćelije tipa 2 (Th2), kada je primenjeno profilaktički, 3×10 mg/kg intraperitonealno (i.p.). Već je uočen značajan efekat na makroskopsko zadebljavanje kože uha u ovom modelu, pri dozama od 3×2 mg/kg (i.p.). Takođe, u terapeutskom modelu MC903, MAB#1 antitelo je smanjilo inflamaciju kože. Značajni terapeutski efekti na makroskopsku debljinu, zadebljavanje epidermisa, inflamaciju i infiltraciju eozinofila i T-ćelija uočeno je pri dozama od 4×0.4 mg/kg (i.p.), sve do doza 4×2 do 10 mg/kg (i.p.).

Primer 9: Perutanje kože uha u mišjem modelu atopijskog dermatitisa

[0170] Efikasnost MAB#1 antitela je procenjena u modelu perutanja na mišu. Miš sa perutanjem nosi mutaciju u genima Flg i Matt (Mattma/maFlgft/ft), usled čega dolazi do poremećaja funkcije kožne barijere. Ovi miševi spontano razvijaju atopiju i progresivni dermatitis, koji se odlikuje mešanim Th2/Th17 inflamatornim fenotipom i ispoljavaju kardinalne odlike AD kod ljudi.

9.1. Životinje i eksperimentalni postupci

[0171] Korišćen je miš sa perutavim repom (Matt<ma/ma>Flg<ft/ft>), sa kongenim poreklom C57BL/6J soja, kao što je opisano u Fallon et al (2009) Nat Genet. 41(5): 602-608 i Saunders et al (2013) J Allergy Clin Immunol 132(5): 1121-1129. Ženke miša sa perutavim repom, stare 9-10 nedelja nasumice su podeljene u četiri grupe (8 miševa po grupi) i tretirane su 6 nedelja na sledeći način:

- Grupa I: Izotip negativnog kontrolnog antitela (MOR03207) (30 mg/kg, ip dva puta nedeljno × 6 nedelja)

- Grupa II: MAB#1 (3 mg/kg, ip dva puta nedeljno × 6 nedelja)

- Grupa III: MAB#1(30 mg/kg, ip dva puta dnevno x 6 nedelja)

- Grupa IV: Deksametazon 2 mg/kg (ip dva puta nedeljno × 6 nedelja) kao grupa za poređenje

[0172] Težina inflamacije kože slične AD je procenjena na osnovu makroskopskih dijagnostičkih kriterijuma, prilagođenih na osnovu procene kožne inflamacije u NC/Nga mišjem modelu, kao što je opisano u Saunders et al (2013) J Allergy Clin Immunol 132(5): 1121-1129. Ukratko, procenjeni su eritem, perutanje i gubljenje površinskog sloja kože primenom sledeće skale (0: ništa; 1: blago; 2: umereno; 3: izraženo). Ukupni skor za svakog miša (maksimalno 9) izračunat je sabiranjem pojedinačnih ocena za svaki od tri parametra.

[0173] Pojava ekcematoznih lezija na koži očnih kapaka praćena je na kraju istraživanja, a upala ivica očnih kapaka (blefaritis) ocenjena je nezavisno, graduisanjem ozbiljnosti nalaza (0: normalno, 1: eritem/edem očnih kapaka, 2: eritem, edem i perutanje kože očnih kapaka, 3: eritem, edem, perutanje i erozija kože očnih kapaka). Maksimalan skor za blefaritis (srednje vrednost oba oka) za svakog miša je 3.

9.2. Efikasnost MAB#1 u modelu AD spontanog i hroničnog perutanja repa kod miša [0174] Kliničko ocenjivanje inflamacije kože prikazuje da je miš sa perutanjem kože repa imao znake spontanog ekcematoznog dermatitisa, na početku tretmana, koji se dalje razvio tokom 6-nedelja praćenja u razvijeni dermatitis, kod netretiranih životinja. Tretman MAB#1 antitelom usporava napredovanje bolesti, sa značajnim efektom koji je sličan efektu deksametazona, primećenim pri najvećoj testiranoj dozi od 30 mg/kg (Slika 10). Sličan efekat MAB#1 antitela uočen je u pogledu blefaritisa na kraju tretmana (Slika 11).

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo ili fragment antitela specifično za IL-17C, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži

(a) HCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 15, ili

(b) HCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID No.: 28.

2. Antitelo ili fragment antitela prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži

(a) HCDR1 region prema SEQ ID No.: 7, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 8, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 9, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 13, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 14 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 15, ili

(b) HCDR1 region prema SEQ ID No.: 20, HCDR2 region prema SEQ ID No.: 21, HCDR3 region prema SEQ ID No.: 22, LCDR1 region prema SEQ ID No.: 26, LCDR2 region prema SEQ ID No.: 27 i LCDR3 region prema SEQ ID No.: 28.

3. Izolovano antitelo ili fragment antitela prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačeno time da je navedeno antitelo ili fragment antitela specifično prema humanom IL-17C, IL-17C poreklom od makaki majmuna i mišjem IL-17C.

4. Antitelo ili fragment antitela prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da je navedeno antitelo ili fragment antitela humano, humanizovano ili himerno antitelo ili fragment antitela.

5. Antitelo ili fragment antitela prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži varijabilni region teškog lanca prema SEQ ID No.: 17 i varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID No.: 16.

6. Antitelo ili fragment antitela prema jednom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time da navedeno antitelo ili fragment antitela sadrži varijabilni region teškog lanca prema SEQ ID No.: 30 i varijabilni region lakog lanca prema SEQ ID No.: 29.

7. Antitelo prema jednom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time da navedeno antitelo sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 43 i laki lanac prema SEQ ID No.: 42.

8. Antitelo prema jednom od patentnih zahteva 1 do 4 i 6, naznačeno time da navedeno antitelo sadrži teški lanac prema SEQ ID No.: 56 i laki lanac prema SEQ ID No.: 55.

9. Antitelo ili fragment antitela prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da je navedeno antitelo ili fragment antitela izolovano antitelo ili fragment antitela.

10. Antitelo ili fragment antitela prema jednom od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time da je navedeno antitelo ili fragment antitela rekombinantno antitelo ili fragment antitela.

11. Antitelo ili fragment antitela prema jednom od prethodnih patentnih zahteva za primenu kao medikament.

12. Kompozicija nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili fragment antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11.

13. Vektorska kompozicija koja sadrži vektor ili više vektora koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline ili više sekvenci nukleinske kiseline, prema patentnom zahtevu 12.

14. Ćelija koja sadrži vektorsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 13.

15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment antitela prema jednom od patentnih zahteva 1 do 11 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.