ES2877513T3 - Péptidos CD31 mejorados - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que consiste de: a) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 582 a 589 de SEQ ID NO: 2; b) un fragmento de al menos 6 aminoácidos consecutivos de (a); c) la secuencia de aminoácidos correspondiente a (a) o (b) en otro CD31 de mamífero; o d) una secuencia de aminoácidos correspondiente a (a), (b) o (c) en donde la secuencia completa de aminoácidos del péptido está invertida, en donde el término invertido significa una inversión de la cadena de aminoácidos del extremo C-terminal al extremo N-terminal, en donde dicho péptido es soluble en agua y en donde dicho péptido tiene la actividad biológica de ejercer una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células T in vitro.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos CD31 mejorados

Campo de la invención

La presente invención describe péptidos sintéticos correspondientes y relacionados con fragmentos de CD31 que favorecen las funciones fisiológicas endoteliales mientras inhiben la activación de plaquetas y leucocitos, y su uso en el tratamiento de enfermedades. Estos péptidos encuentran uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y trombóticas, en particular cuando se inmovilizan sobre dispositivos médicos en contacto con fluidos corporales.

Antecedentes

Trastornos trombóticos

En una persona sana, existe un equilibrio homeostático entre las fuerzas procoagulantes (coagulación) y las fuerzas anticoagulantes y fibrinolíticas. Numerosos factores genéticos, adquiridos y ambientales pueden inclinar la balanza a favor de la coagulación, lo que lleva a la formación patológica de trombos en las venas (por ejemplo, trombosis venosa profunda), arterias (por ejemplo, aterotrombosis, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico) o cámaras cardíacas. Los trombos pueden obstruir el flujo sanguíneo en el sitio de formación o desprenderse y embolizarse para bloquear un vaso sanguíneo distante (por ejemplo, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular).

La evidencia acumulada muestra que la aterotrombosis, una de las principales enfermedades mortales del mundo, está relacionada con la activación inapropiada de los leucocitos sanguíneos y las plaquetas que conduce a una respuesta inflamatoria destructiva dentro de la pared vascular y a la oclusión y/o ruptura trombótica debido a la cascada fibrinolítica. En consecuencia, una restauración de la regulación celular fisiológica en la interfaz entre la sangre y la pared del vaso representaría una opción terapéutica innovadora para combatir la aterotrombosis.

Trastornos inflamatorios y autoinmunitarios.

Los trastornos inflamatorios subyacen a una gran cantidad de enfermedades humanas. El sistema inmunológico a menudo está involucrado con trastornos inflamatorios, demostrados tanto en reacciones alérgicas como en algunas miopatías, con muchos trastornos del sistema inmunitario que dan como resultado una inflamación anormal. Las enfermedades no inmunitarias con orígenes etiológicos en procesos inflamatorios incluyen cáncer, aterosclerosis y cardiopatía isquémica. En los trastornos autoinmunitarios, el sistema inmunitario produce anticuerpos contra un antígeno endógeno. Las células recubiertas de anticuerpos, como cualquier partícula extraña recubierta de manera similar, activan el sistema del complemento, lo que da como resultado una lesión tisular. Los trastornos autoinmunitarios incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Graves y diabetes mellitus. La vasculitis sistémica, la insuficiencia venosa crónica y las enfermedades vasculares relacionadas con la aterosclerosis también se incluyen dentro de los trastornos autoinmunoinflamatorios en los que el tejido diana es la pared vascular y los órganos y tejidos cercanos.

Varios mecanismos pueden explicar el ataque del cuerpo a sí mismo. Los autoantígenos se pueden volver inmunogénicos porque se alteran química, física o biológicamente. Ciertos productos químicos se acoplan a las proteínas del cuerpo, haciéndolas inmunogénicas (como en la dermatitis de contacto). Los fármacos pueden producir varias reacciones autoinmunitarias al unirse covalentemente a proteínas séricas o tisulares (véase más abajo). La fotosensibilidad ejemplifica la autoalergia inducida físicamente: La luz ultravioleta altera las proteínas de la piel, a las que el paciente se vuelve alérgico. En modelos animales, la infección persistente con un virus de ARN que se combina con los tejidos del hospedero altera biológicamente los autoantígenos, lo que da como resultado un trastorno autoalérgico parecido al LES. La mayoría de las enfermedades autoinmunitarias humanas son impulsadas por células inmunitarias adaptativas específicas a un antígeno (linfocitos de células T y B). Los clones de células T y B que responden a epítopos antigénicos específicos son responsables del inicio y/o la propagación de estas enfermedades. De manera similar, las respuestas específicas de las células T y B dirigidas por antígenos son responsables del rechazo de los aloinjertos de órganos. Además de las células inmunitarias adaptativas, las células del sistema inmunitario innato, que no son específicas a un antígeno determinado, también participan en la patogénesis de trastornos inflamatorios crónicos (autoinmunitarios), como granulocitos, monocitos-macrófagos, células dendríticas y células asesinas naturales.

CD31 (PECAM-1)

El CD31 es un receptor de transmembrana homofílico de cadena simple presente exclusiva y constitutivamente en todas las células endoteliales, plaquetas y leucocitos. El CD31 consiste en una glicoproteína de cadena simple de 130 kDa que comprende seis dominios extracelulares similares a Ig, un segmento transmembrana corto y una cola citoplasmática. La cola citoplasmática contiene dos motivos importantes basados en tirosina (alrededor de Y663 e Y686) que forman sitios de acoplamiento específicos para moléculas adaptadoras que contienen SH2 que se asocian preferentemente con fosfatasas y actúan como Motivo deinhibición delInmunorreceptor basado en Tirosina (ITIM). La estructura de CD31 se muestra en la tabla más abajo.

Los ITIM de CD31 intracelulares no se fosforilan en condiciones de reposo porque CD31 no posee una actividad quinasa intrínseca. Las moléculas de CD31 se unen entre sí mediante un enlace trans-homofílico de los dominios 1-2 similares a Ig entre las células que interactúan. Esta unión trans-homofílica es necesaria para desencadenar la agrupación de las moléculas de CD31 en el plano de la membrana, que a su vez requiere una secuencia de yuxtamembrana cis-homofílica. La fosforilación de los ITIM intracelulares de CD31 se vuelve entonces posible porque sus ITIM se pueden exponer a la actividad de las tirosina quinasas que son transportadas cerca por otros receptores de membrana asociados a grupos (como por ejemplo el receptor de células T). La fosforilación de los ITIM intracelulares desencadena el reclutamiento y la activación de fosfatasas intracelulares que contienen SH2. En dependencia de los adaptadores de señalización asociados al receptor de membrana más cercano, la activación de fosfatasas que contienen SH2 puede conducir a la activación de cascadas de señalización (por ejemplo, GAB/ERK/MAPK, que impulsa la adherencia y el crecimiento de células endoteliales, expresión de foxp3 y diferenciación de linfocitos en el fenotipo regulador, que impulsa el desprendimiento activo célula-célula) o su inhibición (por ejemplo, JAK/STAT, que previene la activación de leucocitos y plaquetas). En consecuencia, la función de CD31 varía según el tipo de célula.

La presencia de CD31 a alta densidad en los bordes intercelulares endoteliales ha llevado previamente a la hipótesis de que CD31 funciona como una molécula de adhesión celular en las células endoteliales, implicada en la extravasación de leucocitos. Sin embargo, CD31 se excluye de las uniones estrechas de células endoteliales y la evidencia experimental muestra más bien que previene la extravasación de leucocitos ya que esta última aumenta en los ratones deficientes de CD31. El CD31 endotelial se fosforila en tirosina bajo esfuerzo mecánico y su función es necesaria para estabilizar la estructura endotelial y la angiogénesis.

El CD31 se convierte en tirosina fosforilada después de la activación y agregación de plaquetas. Esto representa un mecanismo de retroalimentación negativa porque la agrupación de CD31 inhibe la agregación plaquetaria y la formación de trombos desacoplando la transducción de señales a través de varios receptores activadores. Las propiedades inmunorreguladoras de CD31 están soportadas por el hecho de que la señalización de CD31 impulsa la repulsión mutua de los leucocitos sanguíneos y modula el equilibrio entre las señales inhibidoras y estimulantes de las células inmunitarias tanto innatas como adaptativas. El acoplamiento mecánico de los dominios extracelulares distales similares a Ig de CD31 induce una señalización inhibidora de afuera hacia adentro desencadenada por la fosforilación de sus ITIM y el reclutamiento y activación de fosfatasas que contienen SH2.

Zehnder y otros. (1995, Blood. 85(5):1282-8) identificaron un anticuerpo CD31 que inhibía la reacción de linfocitos mixtos (MLR) de una manera específica y dependiente de la dosis. Descubrieron además que un péptido CD31 correspondiente al epítopo de este anticuerpo, es decir, a los 23 aminoácidos proximales a la membrana de CD31, inhibía fuertemente la MLR. Ellos plantearon la hipótesis de que los 23 aminoácidos proximales a la membrana de CD31 constituyen una región funcionalmente importante, y que el péptido CD31 interfiere con la activación de los linfocitos compitiendo por los epítopos de unión. Sin embargo, Zehnder y otros fallaron en enseñar si la señalización mediada por CD31 es activada o inhibida por el péptido CD31.

Chen y otros, (1997, Blood. 89(4):1452-9) demostraron que este péptido retrasó la aparición de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y aumentó la supervivencia a largo plazo en un modelo murino de la enfermedad. Plantearon la hipótesis de que el péptido CD31 inhibe una vía común en la activación de las células T. Nuevamente, Chen y otros no lograron dilucidar el papel que desempeña el péptido CD31 en la activación de las células T. En particular, estos trabajos anteriores no evaluaron el efecto putativo del péptido en la cascada de señalización de CD31 y más precisamente en el estado de fosforilación de los ITIM de CD31.

Por un mecanismo aún desconocido, CD31 se "pierde" en ciertos linfocitos circulantes. Su pérdida se observa con la activación de los linfocitos y recientemente se ha demostrado que la ausencia de señalización de los linfocitos CD31, a su vez, intensifica las respuestas inmunitarias patológicas involucradas en el desarrollo de la aterotrombosis.

Se informa una forma soluble de CD31, debido a una variante transcrita que carece del segmento transmembrana, y por lo tanto, actualmente se piensa que la cantidad individual de CD31 circulante está determinada genéticamente. En consecuencia, varios estudios previos intentaron encontrar una correlación entre los niveles plasmáticos de CD31 soluble y el riesgo de aterotrombosis u otras enfermedades inflamatorias. Sin embargo, independientemente de los polimorfismos genéticos específicos analizados, los datos mostraron un amplio intervalo de valores de CD31 en plasma y los resultados de estos diferentes estudios fueron contradictorios.

Por tanto, existe la necesidad de comprender mejor la función biológica de CD31. Esto permitiría la provisión de terapias más eficientes para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la activación de células T.

Los inventores informaron previamente que la supuesta pérdida de CD31 en linfocitos T activados/de memoria es en realidad incompleta y es el resultado del desprendimiento de CD31 entre el 5to y el 6to dominio extracelular similares a Ig (descritos en la publicación de patente internacional WO2010/000741). El dominio extracelular desprendido de CD31 (también denominado "CD31 desprendido") se libera luego a la circulación, donde está presente junto con una variante de corte y empalme soluble de CD31. Además, demostraron que un alto riesgo de aterotrombosis está relacionado con el aumento de CD31 desprendido y la disminución de la variante de empalme CD31 en la circulación, y no con el nivel total de CD31 circulante.

El hallazgo de que el CD31 no se pierde en los linfocitos de la sangre sino que solo se escinde brindó una oportunidad única para rescatar su función inmunorreguladora fisiológica dirigiéndose a la porción residual de la molécula.

El trabajo anterior del inventor mostró que los péptidos correspondientes a los aminoácidos yuxtamembrana del ectodominio de CD31 son capaces de rescatar la función inmunorreguladora fisiológica de CD31, incluso en pacientes que aparentemente tienen perdida de CD31 de la superficie de sus linfocitos T circulantes. Demostraron que tales péptidos son capaces de prevenir la progresión de la enfermedad y la formación de aneurismas en un modelo de ratón para la aterosclerosis. Los péptidos tienen propiedades únicas en comparación con las formas solubles de CD31 que comprenden todos o la mayoría de los dominios similares a Ig de CD31. De hecho, estos péptidos son altamente homofílicos ya que tienen un Kd de 10-7 M, según lo evaluado por análisis BIAcore. Por lo tanto, son capaces de activar la señalización de CD31 mediante el enlace de la parte yuxtaproximal de la membrana de CD31 extracelular que permanece expresada después de su escisión, mediante una fuerte homooligomerización. Por el contrario, alternativamente el CD31 soluble empalmado carece de los primeros 10 aminoácidos yuxtaproximales a la membrana y muestra una unión homofílica débil con el péptido de 23 meros (Kd de 17 pM, según lo evaluado por análisis BIAcore). Además, in vitro, solo los péptidos identificados por los inventores son capaces de acoplar la vía ITIM aguas abajo de la isoforma truncada de CD3l, y por tanto, son capaces de restaurar la señalización de CD31 en linfocitos T que aparentemente tienen perdida de CD31.

El Documento WO2010/000741 por ejemplo, describe un péptido aislado que consiste de un fragmento de al menos 6 aminoácidos de la secuencia definida por los aminoácidos del 579 al 601 del CD31 humano o de una secuencia correspondiente a un CD31 de mamífero no humano, en donde dicho péptido ejerce una inhibición dosis dependiente de la proliferación de células T in vitro. El Documento WO2010/000741 describe particularmente un péptido de 10 aminoácidos, llamado PepReg, y corresponde a los aminoácidos 581-590 de la secuencia de CD31 murina descrita en la presente descripción SEQ ID NO: 2. El péptido PepReg es, por ejemplo, capaz de suprimir la proliferación de células T in vitro y de detener el desarrollo de la enfermedad en la fase creciente y reducir la extensión de la enfermedad en la fase de meseta en un modelo in vivo de EAE (Encefalomielitis autoinmune experimental).

Descripción de la invención

Los inventores identificaron un péptido específico de 8 aminoácidos dentro de la parte yuxtaproximal de la membrana de CD31 extracelular, que es de particular utilidad para inhibir la activación de plaquetas y leucocitos y en el tratamiento de un trastorno trombótico o inflamatorio. El hecho de que esta secuencia sea soluble en agua es una ventaja desde el punto de vista farmacológico. Además, demostraron que las secuencias de péptidos correspondientes a este fragmento de 8 aminoácidos que comprende inversiones, y/o aminoácidos no naturales, como los enantiómeros D, también retienen estas actividades o demuestran una actividad mejorada. La incorporación de aminoácidos no naturales en péptidos destinados a uso terapéutico es de utilidad para aumentar la estabilidad del péptido, en particular estabilidad in vivo.

La presente invención se define en las reivindicaciones.

Por tanto, la solicitud describe un péptido que consiste de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 582 a 589 de CD31 murino SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos correspondiente a esta secuencia en otro CD31 de mamífero, como un CD31 humano (SEQ ID NO 1) CD31 porcino (SEQ ID NO 4) o CD31 bovino (SEQ ID NO 3). Las secuencias correspondientes se pueden identificar haciendo referencia al alineamiento de la Figura 1 o cualquier otro alineamiento realizado como se describe en la presente descripción. Por tanto, la invención también proporciona un péptido aislado que consiste de una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 593 al 600 de SEQ ID NO: 1. La solicitud también describe péptidos que consiste de las secuencias descritas anteriormente en donde la posición de dos o más aminoácidos está invertida o desplazada. También se describen péptidos como se describió anteriormente en donde uno o más aminoácidos están en forma de enantiómero D. Preferiblemente, el péptido es un péptido aislado.

Preferiblemente, el péptido descrito en la presente descripción es soluble en un solvente orgánico o no orgánico, como agua.

También se describen péptidos que comprenden una secuencia que consiste de un fragmento de dicha secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 582 al 589 de SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos correspondiente a esta secuencia en otro CD31 de mamífero, como un CD31 humano (SEQ ID NO 1) CD31 porcino (SEQ ID NO 4) o CD31 bovino (SEQ ID NO 3). Las secuencias correspondientes se pueden identificar haciendo referencia al alineamiento de la Figura 1 o cualquier otro alineamiento realizado como se describe en la presente descripción. Un "fragmento" se refiere a una secuencia de aminoácidos consecutivos. Por ejemplo, dicho fragmento puede ser un fragmento de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos.

El péptido CD31 descrito en la presente descripción puede comprender un cambio de quiralidad como, por ejemplo, la sustitución de uno o más aminoácidos naturales (enantiómero L) con los enantiómeros D correspondientes. Los enantiómeros D de los aminoácidos se denominan con la misma letra que su enantiómero L correspondiente, pero en minúsculas. Así, por ejemplo, el enantiómero L de la arginina se denomina "R", mientras que el enantiómero D se denomina "r". Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los aminoácidos del péptido pueden estar en forma de enantiómero D. Los péptidos pueden comprender aminoácidos modificados o no naturales, como se describe más abajo.

El péptido CD31 descrito en la presente descripción puede comprender una secuencia invertida, específicamente una inversión de la cadena de aminoácidos (desde el extremo C-terminal al extremo N-terminal). Se puede invertir la secuencia de aminoácidos completa del péptido o se puede invertir una porción de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, se puede invertir una secuencia consecutiva de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos. La referencia en la presente descripción a aminoácidos "invertidos" se refiere a la inversión de la secuencia de aminoácidos consecutivos en la secuencia. El péptido puede comprender una retroinversión en la que uno o más aminoácidos de origen natural (enantiómero L) se reemplazan con los enantiómeros D correspondientes, junto con una inversión de la cadena de aminoácidos (desde el extremo C-terminal hasta el Extremo N-terminal).

Por tanto, el péptido de la invención puede tener la secuencia:

H-RVFLAPWK-OH (SEQ ID NO 5), correspondiente a la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 582 al 589 de SEQ ID NO: 2; (P8F)

H-kwpalfvr-OH (SEQ ID NO 6), correspondiente a la secuencia invertida de los aminoácidos 582 al 589 de SEQ ID NO: 2 en forma de enantiómero D, específicamente una retroinversión de dicha secuencia; (P8RI)

H-RVILAPWK-OH (SEQ ID NO 7), correspondiente a la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 593-600 de SEQ ID NO: 1;

H-kwpalivr-OH (SEQ ID NO 8), correspondiente a la secuencia invertida de aminoácidos 593-600 de SEQ ID NO: 1 en forma de enantiómero D, específicamente una retroinversión de dicha secuencia.

En modalidades preferidas, el péptido de la invención comienza con el motivo RV.

También se describen ácidos nucleicos aislados que codifican los péptidos descritos en la presente descripción, y composiciones farmacéuticas que comprenden dichos péptidos, como se describe más abajo.

Además del fragmento de CD31, el péptido puede comprender opcionalmente secuencias heterólogas a CD31. Estas secuencias heterólogas pueden por ejemplo, corresponder a una molécula portadora como la hemocianina de lapa californiana (KLH), la albúmina de suero bovino (BSA), la ovoalbúmina (OVA), la tiroglobulina (THY) o el péptido antigénico múltiple (MAP). Por tanto, la solicitud describe péptidos que comprenden un péptido descrito en la presente descripción documento además de la secuencia heteróloga.

La secuencia de péptidos CD31 de acuerdo con la invención se deriva preferiblemente de la secuencia de CD31 humano o murina. Sin embargo, la secuencia de CD31 se puede derivar de cualquier secuencia de CD31 de mamífero no humano. La Figura 1 muestra un alineamiento entre las secuencias de CD31 humano, murino, bovino y porcino. El experto en la técnica puede identificar fácilmente la secuencia correspondiente en otra proteína CD31 de mamífero no humano al realizar una alineación de secuencia con las secuencias mostradas en la Figura 1. Los métodos para la alineación de secuencias y la determinación de la identidad de la secuencia se conocen bien en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de un software informático disponible públicamente como BioPerl, BLAST, BLAST-2, CS-BLa St , FASTA, ALIGN, ALIGN-2, LALIGN, Jaligner, matcher o software Megalign (DNASTAR) y algoritmos de alineación como los algoritmos Needleman-Wunsch y Smith-Waterman.

Los péptidos CD31 descritos en la presente descripción pueden tener la actividad biológica de ejercer una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células T in vitro y/o de inhibir la reacción de linfocitos mixtos (MLR); inhibición de la agregación plaquetaria; inhibición de la activación plaquetaria; inhibición de la generación de trombina por plaquetas y/o inhibición de la expresión de VCAM-1 de células endoteliales. Su actividad biológica se puede medir, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 1, 2, 3 o 4 o en Zehnder y otros. 1995, Blood. 85(5):1282-8, Fornasa y otros.

2010, J Immunol 184: 6585-6591; Fornasa y otros, 2012, Cardiovascular Research 94: 30-37.

El ensayo de proliferación de células T puede comprender la comparación de la radiactividad incorporada en células T cultivadas en presencia o en ausencia del compuesto a ensayar. Este ensayo se puede realizar, por ejemplo, de la siguiente manera:

- proporcionar una placa de pocillos múltiples que comprende medio completo complementado con anticuerpos anti-CD3;

- complementar los pocillos con concentraciones crecientes del compuesto a ensayar;

- colocar en una placa las células mononucleares de sangre periférica (o células del bazo, o células de los ganglios linfáticos);

- cultivar las células durante aproximadamente 72 horas;

- agregar (3H) timidina y cultivar las células durante aproximadamente 16 horas;

- medir la radiactividad; y

- comparar la radiactividad medida en presencia del compuesto a ensayar con la radiactividad medida en ausencia de dicho compuesto, y/o en presencia de un compuesto de referencia, y/o en presencia de un control negativo.

Alternativamente, el ensayo de proliferación de células T puede comprender el uso de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), como se describe en Nature Protocols, 2007, 2: 2049-2056 y en Fornasa y otros, 2012, Cardiovascular Research 94: 30-37:

- Incorporar la cantidad óptima de la sonda fluorescente (CFSE) en células mononucleares de sangre periférica (o células del bazo o células de los ganglios linfáticos) en presencia de medio de cultivo completo

- proporcionar una placa de múltiples pocillos que comprende células teñidas con CFSE y el estímulo (anticuerpos anti-CD3)

- complementar los pocillos con concentraciones crecientes del compuesto a ensayar;

- Comparar del número de células hijas (proliferación) según la intensidad de la tinción fluorescente mediante citometría de flujo

Alternativamente, la activación leucocitaria se puede evaluar comparando los niveles de expresión del marcador de activación temprana de CD69 de los leucocitos (células mononucleares sanguíneas o células del bazo, o células de los ganglios linfáticos) cultivados en presencia o en ausencia del compuesto que se va a ensayar. Este ensayo se puede realizar, por ejemplo, de la siguiente manera:

- proporcionar (células mononucleares sanguíneas o células del bazo, o células de los ganglios linfáticos) o subpoblación de leucocitos purificados;

- estimular dichas células mediante la adición de un estímulo apropiado (anticuerpos purificados anti-CD3 y células dendríticas derivadas de médula ósea; o LPS o una lectina como ConA, PHA, PWM);

- cultivar las células hasta 48 horas; y

- analizar dichas células para la expresión del marcador de activación temprana CD69, por ejemplo, mediante citometría de flujo; y

- comparar la expresión de CD69 en presencia del compuesto a ensayar.

Los péptidos CD31 de acuerdo con la invención se pueden preparar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, como síntesis en fase sólida, síntesis en fase líquida o ingeniería genética. Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente al extremo C-terminal del péptido a sintetizar se une a un soporte insoluble en disolventes orgánicos, y por repetición alterna de reacciones, una en donde los aminoácidos con su grupo amino y los grupos funcionales de la cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno a uno en orden desde el extremo C-terminal al extremo N-terminal, y otra donde se liberan los aminoácidos unidos a la resina o al grupo protector de los grupos amino de los péptidos, de esta manera se prolonga la cadena peptídica. Después de la síntesis del péptido deseado, se somete a la reacción de desprotección y se corta del soporte sólido.

Los péptidos CD31 de la invención pueden comprender opcionalmente modificaciones químicas adicionales, opcionalmente dirigidas a mejorar su estabilidad y/o su biodisponibilidad. Tales modificaciones químicas tienen como objetivo la obtención de péptidos con mayor protección de los péptidos contra la degradación enzimática. in vivo, y/o mayor capacidad para atravesar barreras de membrana, aumentando así su vida media y manteniendo o mejorando su actividad biológica. Se puede emplear cualquier modificación química conocida en la técnica de acuerdo con la presente invención. Tales modificaciones químicas incluyen pero no se limitan a:

- modificaciones en los extremos N-terminal y/o C-terminal de los péptidos como, por ejemplo, acilación N-terminal (preferiblemente acetilación) o desaminación, o modificación del grupo carboxilo C-terminal en una amida o un grupo alcohol;

- modificaciones en el enlace amida entre dos aminoácidos: acilación (preferiblemente acetilación) o alquilación (preferiblemente metilación) en el átomo de nitrógeno o el carbono alfa del enlace amida que une dos aminoácidos; - modificaciones en el carbono alfa del enlace amida que une dos aminoácidos como, por ejemplo, acilación (preferiblemente acetilación) o alquilación (preferiblemente metilación) en el carbono alfa del enlace amida que une dos aminoácidos;

- de la cadena de aminoácidos (desde el extremo C-terminal hasta el extremo N-terminal);

- azapéptidos, en los que uno o más carbonos alfa se reemplazan con átomos de nitrógeno; y/o

- betapéptidos, en los que el grupo amino de uno o más aminoácidos está unido al carbono p en lugar del carbono a.

Los polipétidos incluyen secuencias de aminoácidos modificadas mediante procesos naturales, como el procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que se conocen bien en la técnica. Tales modificaciones se describen bien en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura científica voluminosa. Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo; se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en diversos grados en varios sitios de una polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden ramificarse, como un resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos postraduccionales naturales o pueden prepararse mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de un lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a las proteínas mediada por el ARN de transferencia como la arginilación y ubiquitinación.

Por un péptido "aislado", se entiende que el péptido no esté presente dentro de un organismo vivo, por ejemplo, dentro del cuerpo humano. Sin embargo, el péptido aislado puede ser parte de una composición o un kit. Preferiblemente, el péptido aislado se purifica.

Los compuestos de la invención se pueden producir mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, incluidas tecnologías de síntesis química y tecnologías recombinantes.

Ejemplos de tecnologías de síntesis química son la síntesis en fase sólida y la síntesis en fase líquida. Como síntesis en fase sólida, por ejemplo, el aminoácido correspondiente al extremo C-terminal del péptido a sintetizar se une a un soporte insoluble en disolventes orgánicos, y por repetición alterna de reacciones, una en donde los aminoácidos con su grupo amino y los grupos funcionales de la cadena lateral protegidos con grupos protectores apropiados se condensan uno por uno en orden desde el extremo C-terminal al extremo N-terminal, y otra donde se liberan los aminoácidos unidos a la resina o al grupo protector de los grupos amino de los péptidos, de esta manera se prolonga la cadena peptídica. Los métodos de síntesis en fase sólida se clasifican en gran medida por el método tBoc y el método Fmoc, en dependencia del tipo de grupo protector utilizado. Los grupos protectores usados típicamente incluyen tBoe (t-butoxicarbonilo), CI-Z (2-clorobenciloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloxicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo), Trt (tritilo), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Clz-Bzl (2,6-diclorobencilo) para los grupos amino; NO2 (nitro) y Pmc (2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo) para los grupos guanidino); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado, se somete a la reacción de desprotección y se corta del soporte sólido. Tal reacción de corte de péptidos puede realizarse con fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometanosulfónico para el método Boc, y con TFA para el método Fmoc.

Alternativamente, el péptido se puede sintetizar mediante el uso de técnicas recombinantes. En este caso, se clona un ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la invención (denominado además "un ácido nucleico de acuerdo con la invención") en un vector de expresión. El ácido nucleico de la invención se coloca preferiblemente bajo el control de señales de expresión (por ejemplo, un promotor, un terminador y/o un potenciador) que permiten su expresión. A continuación, el vector de expresión se transfecta en una célula huésped (por ejemplo, una célula huésped humana, CHO, de ratón, de mono, fúngica o bacteriana) y la célula huésped transfectada se cultiva en condiciones adecuadas para la expresión del péptido.

El método de producción del péptido puede comprender opcionalmente las etapas de purificar dicho péptido, modificar químicamente dicho péptido y/o formular dicho péptido en una composición farmacéutica.

Preferiblemente, el péptido descrito en la presente descripción es soluble en un solvente orgánico o no orgánico, por ejemplo agua o tampones acuoso como NaCl 9 g/L, PBS, Tris o Tris-fosfato. Gracias a dicha solubilidad, el péptido se puede disolver en agua a una concentración de, por ejemplo, 1 micromolar, 10 micromolar, 50 micromolar, 100 micromolar, 500 micromolar, 1 mM, 50 mM, 100 mM o más.

Uso de péptidos CD31 para el tratamiento de trastornos trombóticos e inflamatorios

Se encontró que los péptidos CD31 de acuerdo con la invención son capaces de activar la señalización mediada por CD31, incluso en linfocitos T CD31.-(es decir, CD31desprendid°). Además, dichos péptidos son capaces de prevenir la progresión de la enfermedad y la formación de aneurismas en un modelo de ratón para aterosclerosis y mejorar la puntuación clínica en un modelo de ratón de esclerosis múltiple.

Por tanto, la descripción también proporciona un péptido de la invención para su uso en la activación de la señalización mediada por CD31. Estos péptidos ejercen preferiblemente una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células T in vitro. La activación de la señalización mediada por CD31 puede ser una activación in vitro o in vivo. También se describen métodos para activar la señalización mediada por CD31 mediante el uso de los péptidos de la invención, in vitro o in vivo. El método in vivo puede ser un método de tratamiento como se define más abajo.

Como se usa en toda la presente descripción, el término "señalización mediada por CD31" se refiere a una vía de señalización en la que está involucrado CD31. Tales vías se conocen bien en la técnica e incluyen las descritas, por ejemplo, en Newman y Newman (2003 Arterioscler Thromb Vasc Biol 23: 953-964) y en Newton-Nash y Newman (1999. J Immunol 163: 682-688).

Por tanto, la invención también proporciona un péptido de la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno trombótico o inflamatorio. Estos péptidos ejercen preferiblemente una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células T in vitro. La activación de la señalización mediada por CD31 puede ser una activación in vitro o in vivo. También se describen métodos de tratamiento de un trastorno trombótico o inflamatorio mediante el uso de los péptidos de la invención, que preferiblemente comprenden la administración de dichos péptidos a un individuo que lo necesite.

Como se usa en toda la presente descripción, el término "trastorno trombótico" incluye, pero no se limita a, aterotrombosis, aterosclerosis, síndrome coronario agudo, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad arterial periférica y aneurisma aórtico abdominal.

Como se usa en toda la presente descripción, el término "trastorno inflamatorio" incluye, pero no se limita a, enfermedades inflamatorias crónicas como enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, dermatitis atópica, angiopatía amiloide cerebral, vasculitis. El término también incluye trastornos autoinmunitarios, que incluyen, pero no se limita a, artritis reumatoide (AR), esclerosis múltiple (EM), enfermedad inflamatoria intestinal (EII), lupus eritematoso sistémico (LES), enfermedad de Graves y diabetes mellitus. Otras afecciones, como el rechazo agudo y crónico de subvenciones, incluida la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y el choque séptico, se pueden incluir en el término. Por ejemplo, los péptidos de la invención se pueden usar para tratar el choque séptico (opcionalmente en combinación con terapia con antibióticos, por ejemplo, terapia con antibióticos de amplio espectro) y en trasplantes como trasplantes de médula ósea, riñón, corazón, hígado o pulmón.

En una modalidad preferida de la invención, dicho trastorno trombótico o inflamatorio está asociado con una pérdida del fenotipo de linfocitos T CD31+. De hecho, se descubrió sorprendentemente que los péptidos CD31 restauran la señalización de CD31 incluso en individuos con un fenotipo de linfocitos T CD31-. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, los péptidos CD31 se usan preferiblemente para tratar un subgrupo de individuos y/o pacientes que tienen un fenotipo de linfocitos T CD31-.

Como se usa en la presente descripción, el término "fenotipo de linfocitos T CD31-"se usa indistintamente con el término "fenotipo de linfocitos T CD31desp^ endid°". Estos términos se refieren al fenotipo de un individuo que aparentemente perdió el CD31 en sus células T circulantes cuando se utilizan métodos convencionales de la técnica anterior para detectar CD31, por ejemplo, como los descritos en Stockinger y otros. (Immunology, 1992, 75(1):53-8), Demeure y otros. (Immunology, 1996, 88(1):110-5), Caligiuri y otros. (Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2005, 25(8):1659-64) o Caligiuri y otros, (Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(3):618-23) se usan. En tales métodos, el anticuerpo usado para detectar CD31 se une a un epítopo ubicado en cualquiera de los 1er al 5to dominios extracelulares similares a Ig.

Preferiblemente, las personas que tienen un fenotipo de linfocitos TCD31-, lo que significa que al menos el 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 % o 95 % de sus linfocitos T circulantes son linfocitos CD31desp^ endid°s. O se pueden medir la concentración plasmática de CD31 truncada derivada de células T o la frecuencia de linfocitos T CD31-, comparados con los linfocitos T CD31+.

La solicitud también describe un método para tratar o prevenir un trastorno trombótico o inflamatorio que comprende la etapa de administrar por lo tanto una cantidad efectiva de un péptido como se describe en la presente descripción, o una codificación nucleica, a un individuo que lo necesite. Dicho individuo que lo necesita preferiblemente padece o corre el riesgo de padecer un trastorno trombótico o inflamatorio. Más preferentemente, dicho individuo tiene un fenotipo de linfocitos T CD31-.

Por "cantidad efectiva" significa una cantidad suficiente para lograr una concentración de péptido, que es capaz de prevenir, tratar o ralentizar la enfermedad a tratar. Tales concentraciones pueden ser determinadas de forma rutinaria por los expertos en la técnica. La cantidad del compuesto que realmente se administra se determinará típicamente por un médico a la luz de las circunstancias pertinentes, incluida la afección que se va a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto real administrado, la edad, el peso, y la respuesta de cada paciente, la gravedad de los síntomas del paciente y similares. Los expertos en la técnica también apreciarán que la dosis puede depender de la estabilidad del péptido administrado.

Los individuos a tratar en el marco de la invención son preferiblemente individuos humanos. Sin embargo, la presente invención también contempla el uso veterinario de péptidos CD31 para tratar otros mamíferos.

Composiciones farmacéuticas

Los péptidos CD31 descritos en la presente descripción se pueden formular en una composición farmacéutica. Por tanto, la solicitud describe una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los péptidos CD31 anteriores y un vehículo fisiológicamente aceptable. Los portadores fisiológicamente aceptables se pueden preparar mediante cualquier método conocido por los expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un péptido descrito en la presente descripción incluyen todas las composiciones en donde el péptido o péptidos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito pretendido. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener portadores adecuados farmacéuticamente aceptables que comprende excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Los vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, EE. UU., 1985)., que es un texto de referencia estándar en este campo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables se pueden seleccionar de forma rutinaria de acuerdo con el modo de administración, solubilidad y estabilidad de los péptidos. Por ejemplo, las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. El uso de biomateriales y otros polímeros para la administración de fármacos, así como las diferentes técnicas y modelos para validar un modo específico de administración, se describen en la literatura.

Los péptidos de la presente invención se pueden administrar por cualquier medio que logre el propósito pretendido. Por ejemplo, la administración se puede lograr mediante varias vías diferentes que incluyen, pero no se limitan a, subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intratecal, intranasal, oral, rectal, transdérmica, bucal, tópica, local, inhalante o uso subcutáneo.

Los péptidos de la presente invención pueden unirse a un soporte sólido, como una endoprótesis. Por ejemplo, los péptidos pueden injertarse covalentemente sobre un polímero o directamente sobre una superficie de metal aminado para su uso en prótesis intravasculares como endoprótesis, tubos arteriales y válvulas mecánicas. El péptido inmovilizado prevendría la adherencia y activación de plaquetas y leucocitos a la prótesis al tiempo que promovería la aceptación/integración del dispositivo en el cuerpo al favorecer la unión y el crecimiento de las células endoteliales.

Este último uso podría incluir prótesis endovasculares, como tubos y endoprótesis, válvulas cardíacas artificiales, prótesis óseas y dentales.

Las dosis a administrar dependen de las necesidades individuales (que pueden cuantificarse midiendo el CD31 truncado específico de la célula en el plasma con el uso de nuestro método basado en perlas), del efecto deseado y de la vía de administración elegida. Se entiende que la dosis administrada será dependiente de la edad, el sexo, salud y peso del receptor, del tratamiento concurrente, si hay alguno, de la frecuencia del tratamiento, y de la naturaleza del efecto deseado. La dosis total requerida para cada tratamiento se puede administrar en múltiples dosis o en una sola dosis.

En dependencia de la vía de administración prevista, los compuestos se pueden formular como líquidos (por ejemplo, soluciones, suspensiones), sólidos (por ejemplo, pastillas, tabletas, supositorios) o semisólidos (por ejemplo, cremas, geles) o inmovilizados en la superficie de un dispositivo médico.

En una modalidad preferida, las composiciones se presentan en formas de dosificación unitarias para facilitar una dosificación precisa. El término "formas de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. Las formas típicas de dosificación unitaria incluyen ámpulas o jeringas prellenadas, premedidas de las composiciones líquidas o pastillas, tabletas, cápsulas o similares en el caso de composiciones sólidas. En tales composiciones, el compuesto de la invención es usualmente un componente menor (de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 % en peso o preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso) donde el resto son varios vehículos o portadores y auxiliares de procesamiento útiles para formar la forma de dosificación deseada.

Los compuestos de esta invención pueden administrarse además en formas de liberación sostenida o a partir de sistemas de entrega del fármaco de liberación sostenida.

La expresión "fisiológicamente aceptable" significa abarcar cualquier vehículo que no interfiera con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico para el huésped al que se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, los ingredientes activos anteriores se pueden formular en forma de dosificación unitaria para inyección en vehículos como solución salina, solución de dextrosa, seroalbúmina y solución Ringer.

Además del vehículo farmacéuticamente aceptable, las composiciones de la invención también pueden comprender cantidades menores de aditivos, como estabilizantes, excipientes, tampones y conservantes.

La solicitud también describe una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica el péptido de la invención en el marco de, por ejemplo, un tratamiento mediante terapia génica. En este caso, el ácido nucleico está presente preferiblemente en un vector, en el que la secuencia que codifica el péptido se coloca bajo el control de señales de expresión (por ejemplo, un promotor, un terminador y/o un potenciador) que permiten su expresión. El vector puede corresponder a, por ejemplo, un vector viral como un vector adenoviral o lentiviral.

La solicitud describe además kits que comprenden una composición farmacéutica que comprende un péptido CD31 descrito en la presente descripción e instrucciones con respecto al modo de administración. Estas instrucciones pueden, por ejemplo, indicar la recomendación médica y/o la vía de administración y/o la dosis y/o el grupo de pacientes a tratar.

Prevención y tratamiento

"Tratamiento" incluye tanto el tratamiento terapéutico como el tratamiento profiláctico o preventivo, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar el trastorno o la afección patológica diana. Aquellos que necesitan del tratamiento incluyen aquellos que ya están con el trastorno así como también aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que el trastorno se debe prevenir. Los términos "terapia", "terapéutica", "tratamiento" o "tratar" incluyen reducir, aliviar o inhibir o eliminar los síntomas o el progreso de una enfermedad, así como también el tratamiento destinado a reducir, aliviar, inhibir o eliminar dichos síntomas o progreso. Los efectos convenientes del tratamiento incluyen, prevenir la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquiera de las consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, prevenir la metástasis, disminuir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejoría o mitigación del estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades descritas, los métodos y composiciones de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno o para retrasar la progresión de una enfermedad o trastorno.

Preferiblemente, se administra una cantidad efectiva, preferiblemente una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína o del vector descrito en la presente descripción. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en la dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. La cantidad efectiva puede variar de acuerdo con el fármaco o profármaco con el que se coadministra la proteína o el vector.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" del péptido de la invención puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad de la proteína, de provocar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva abarca una cantidad en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan los efectos tóxicos o perjudiciales de la proteína. Una cantidad terapéuticamente efectiva también abarca una cantidad suficiente para conferir un beneficio, por ejemplo, un beneficio clínico.

En toda la descripción, términos como "comprende", "comprendido", "que comprende" y pueden tener el significado que se les atribuye en la mayoría de las jurisdicciones de patentes, preferiblemente en la jurisdicción en cuestión; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido"," que incluye", etc. Términos como "que consiste de", "que consiste esencialmente de" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la mayoría de las jurisdicciones de patentes, preferiblemente en la jurisdicción en cuestión; por ejemplo, pueden implicar la exclusión de todos, la mayoría, o todos excepto una cantidad insignificante de otros elementos, o pueden permitir elementos que no se relatan explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan una característica básica o nueva de la invención.

El término "aproximadamente" como se usa en la presente descripción, cuando se refiere a un valor medible como una cantidad, una duración temporal y similares, significa abarcar variaciones de entre ± 20 % o ± 10 %, con mayor preferencia ± 5 %, aún con mayor preferencia ± 1 %, y aún más preferentemente ± 0,1 % del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos.

La invención se describirá a continuación en más detalle por medio de las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una alineación entre las secuencias de aminoácidos de CD31 humano, de ratón, de cerdo y de bovino. La secuencia definida por los aminoácidos 593 a 600 de SEQ ID NO: 1 (CD31 humano) y la secuencia correspondiente a CD31 de ratón, cerdo y bovino se indica mediante una línea encima de la secuencia.

La Figura 2 muestra el efecto de los péptidos P8F (SEQ ID NO 5) y P8R1 (SEQ ID NO 6) sobre la activación de células T. Se preincubaron células T Jurkat con la sonda de calcio fluo 3-AM y se estimularon reticulando el TCR con anticuerpos anti-CD3 y fragmentos F(ab')2 de anticuerpos secundarios. La figura muestra el efecto de 60 pg/ml de cada péptido sobre la movilización de calcio después de la estimulación con TCR de la siguiente manera: Sin control de péptido (cuadrados), péptido P8F (SEQ ID NO 5) (círculos) y péptido P8RI (SEQ ID NO 6) (triángulos).

La Figura 3 muestra que el P8RI inmovilizado sobre superficies sólidas aminadas inhibe la adherencia y activación de leucocitos. Las células mononucleares de sangre periférica (5x105células/ml) se transfirieron a pocillos Immulon® recubiertos con P8RI y de control y se estimularon con 1 pg/ml de LPS durante 60'. Los pocillos de Control se recubrieron con ácido acético (con EDC/S-NHS) como fuente irrelevante de grupos COOH (Control) o se dejaron sin recubrir (Vacío). Izquierda, después de 3 lavados con PBS, los pocillos de Control contenían varios leucocitos adherentes en variación con los pocillos de P8RI en los que los leucocitos estaban prácticamente ausentes. Derecha, la L-selectina soluble (sCD62L) y la interleucina-1p liberada de los leucocitos activados con LPS (analizados mediante perlas citométricas, CBA®), se redujeron significativamente en los pocillos recubiertos con P8RI. *p<0,05 frente al Control. Barra de escala=100 pm

Las Figuras 4-6 muestran que el P8RI inmovilizado previene la activación plaquetaria. La generación de trombina se midió a 37 °C mediante un trombograma automatizado calibrado en plasma rico en plaquetas en presencia de Factor Tisular (0,5 pM) en pocillos de poliestireno aminado. El P8RI se unió covalentemente a los pocillos. Se usó un péptido codificado como control negativo. Figura 4:, Trombogramas representativos; Figura 5: El índice de velocidad de la actividad de la trombina, calculado como Pico/Tiempo hasta el pico - Tiempo de retardo, se redujo significativamente en los pocillos P8RI frente a los pocillos Vacíos y de Control. La Figura 6: La concentración de P-selectina soluble (sCD62P), liberada por las plaquetas, se redujo significativamente en el sobrenadante de los pocillos recubiertos con P8RI. Los datos son de 8 experimentos independientes, *p<0,01

La Figura 7 muestra el efecto de los péptidos solubles sobre la expresión de VCAM-1 en células endoteliales D3. El efecto de P8RI sobre la expresión de VCAM-1 se evaluó mediante análisis FACS cuantitativo en la línea de células endoteliales de cerebro humano inmortalizada HCMEC/D3 sometida a estimulación durante la noche con TNFa (50 ng/ml) e IFNg (100 ng/ml).

La Figura 8 demuestra un efecto terapéutico del péptido P8RI en encefalitis autoinmunitaria experimental, un modelo de ratón de esclerosis múltiple. Se realizó un ensayo curativo en el modelo de ratón EAE iniciando la administración de P8RI a 2 mg/kg/día por vía subcutánea después del inicio de la parálisis ascendente (puntuación >1), mediante el uso de prednisona como control farmacéutico. La figura muestra parálisis ascendente (puntuación clínica) relacionada con encefalitis activa en ratones tratados con vehículo (cuadrados), prednisona a 2 mg/kg/día (círculos) o P8RI a 2 mg/kg/día (triángulos).

La Figura 9 demuestra un efecto terapéutico del péptido P8F en un modelo de ratón de trombosis aguda. Se trataron ratones ateroscleróticos con P8F a 2,5, 5 o 10 mg/kg/día, con aspirina como control positivo y vehículo como control negativo. El número de secciones que muestran un trombo oclusivo, de 1000 secciones/muestra, fue significativamente menor en los ratones tratados con P8F en comparación con el vehículo. No se pudo encontrar ningún trombo oclusivo ni en el grupo de aspirina ni en el grupo de 5 mg/ml

La Figura 10 muestra un análisis de prueba de Cochran-Mantel-Haenszel (Chi cuadrado) de los datos presentados en la Figura 9. El ancho de las columnas es proporcional al número de ratones incluidos en cada grupo (Aspirina=5, "2,5"=7, "5"=11, "10"=7, Vehículo=8). P<0,05 para todos los grupos frente al vehículo (Veh).

Breve descripción de la lista de secuencias

SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de CD31 humano.

SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de CD31 murino.

SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia de CD31 bovino.

SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de CD31 de cerdo.

SEQ ID NO: 5 corresponde al péptido P8F. H-RVFLAPWK-OH

SEQ ID NO: 6 corresponde al péptido P8RI. H-kwpalfvr-OH

SEQ ID NO: 7 corresponde al equivalente humano del péptido P8F. H-RVILAPWK-OH

SEQ ID NO: 8 corresponde al equivalente humano del péptido P8RI H-kwpalivr-OH

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Efecto sobre la activación de las células T:

Células T Jurkat (10x106/ml) se preincubaron con la sonda de calcio fluo 3-AM y se estimularon reticulando el TCR con anticuerpos anti-CD3 y fragmentos F(ab')2 de anticuerpos secundarios. La Figura 2 muestra la adquisición de citometría de flujo continuo antes y después de la adición del estímulo ± los péptidos. Como se muestra en la figura, la presencia de 60 |jg/ml de P8RI (H-kwpalfvr-OH) y P8F (H-RVFLAPWK-OH) conduce a una movilización de calcio intracelular retardada y reducida (según lo determinado por la intensidad de fluorescencia media (FMI) de la sonda fluo-3AM, después de la estimulación con TCR de las células Jurkat.

Ejemplo 2: Efecto del péptido soluble sobre la agregación plaquetaria:

Los microcapilares del biochip Vena8 Fluoro ™ (400 jm de ancho x 100 jm de profundidad x 20 mm de largo, Cellix) se recubrieron con 2,5 mg/ml de colágeno tipo I de caballo insoluble durante la noche a 4 °C y luego se bloquearon con HSA al 0,1 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Se marcó sangre entera periférica humana, anticoagulada con P-PACK (un inhibidor directo de la trombina, agente no quelante) con DiOC65 jM durante 10 minutos antes de la perfusión con la bomba Cellix a los 1500 segundos-1 a través de los capilares recubiertos. La interacción de las plaquetas con la matriz se observó en tiempo real bajo un microscopio de fluorescencia y se guardó para el análisis posterior. La superficie cubierta por plaquetas agregadas se analizó fotograma a fotograma (24 fotogramas/s) durante los primeros 5 minutos y se expresó como % de cobertura. Se mostró que P8RI (H-kwpalfvr-OH) y P8F (H-RVFLAPWK-OH) solubles inhiben la agregación plaquetaria humana de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 3: Efecto del péptido inmovilizado sobre la activación plaquetaria y la generación de trombina.

La generación de trombina se midió a 37 °C mediante un trombograma automatizado calibrado (Hemker y otros, Thromb Haemost. 2000; 83(4): 589-91) en plasma rico en plaquetas (1,5 x 108 plaquetas/ml) en presencia de Factor Tisular (0,5 pM) en pocillos de poliestireno aminado (Covalink, Immunon® 2HB, Stago). La SEQ ID NO 8 (P8RI, H-kwpalfvr-OH, MW 1016,26, sal de TFA reemplazada por sal de HCl, pureza del 100 %, disuelta en agua a 50 jM , pH 4-4,5) se pretrató con EDC/S-NHS (Relación molar 10:1) y se unió covalentemente a los pocillos Immulon®. Se usó un péptido codificado como péptido de control, las Figuras 4-6 muestran que la actividad de la trombina, calculada como Pico/Tiempo hasta el pico -Tiempo de retardo, se redujo significativamente en los pocillos P8RI frente a los pocillos Vacío y Control, y que la concentración de P-selectina soluble (sCD62P), liberado por las plaquetas, se redujo significativamente en el sobrenadante de los pocillos recubiertos con P8RI.

Ejemplo 4: Efecto del péptido soluble sobre las células endoteliales:

Los inventores evaluaron el efecto de P8RI sobre la expresión de VCAM-1 por inmunofluorescencia en la línea de células endoteliales de cerebro humano inmortalizadas HCMEC/D3 sometidas a estimulación durante la noche con TNFa (50 ng/ml) e IFNg (100 ng/ml). Aunque el aumento en la expresión de VCAM-1 no fue impresionante, la presencia del péptido lo impidió (datos no mostrados). El análisis cuantitativo por FACS de las mismas condiciones experimentales (Figura 7) mostró que la reducción de la expresión de VCAM-1 observada en los pocillos del "péptido" fue estadísticamente significativa (n=3 pozos/condición). El efecto ya se observó a 6,25 jg/m l y no cambió con dosis más altas del péptido (las dosis fueron de hasta 50 jg/ml).

P8RI (H-kwpalfvr-OH (SEQ ID NO 6) MW 1016,26, sal de TFA reemplazada por sal de HCl, pureza del 100 %, disuelta en agua a 50 jM , pH 4-4,5) se pretrató con EDC/S-NHS (Relación molar 10:1) y se unió covalentemente a pocillos de poliestireno aminado (Covalink, Immunon® 2HB, Stago). Los pocillos de control se recubrieron con ácido acético (con EDC/S-NHS) como fuente irrelevante de grupos COOH. Los pocillos se bloquearon con medio de cultivo de células endoteliales suplementado con FCS al 3% antes de sembrar las células endoteliales umbilicales humanas primarias (HUVEC, 5x105 células/ml). Tres días después, los pocillos recubiertos con P8RI contenían células adherentes y vivas (grises/translúcidas), mientras que en los pocillos de control (masas oscuras) solo se podían encontrar células muertas/restos. Esto demostró claramente que el P8RI inmovilizado favorece la unión y el crecimiento de las células endoteliales sobre soportes sólidos.

Ejemplo 5: Protocolo curativo en un modelo de esclerosis múltiple

Para demostrar la efectividad de los péptidos en un protocolo terapéutico in vivo, se realizó un ensayo curativo en el modelo de ratón EAE (encefalitis autoinmunitaria experimental, un modelo de ratón de esclerosis múltiple), con prednisona usada como fármaco de referencia. Se administró P8RI a 2 mg/kg/día, s.c. En el protocolo usado, el tratamiento se inició solo una vez que la puntuación clínica fue >1 (parálisis de la cola) y se realizó un seguimiento diario de los ratones inscritos durante 12 días. El fármaco de referencia (prednisona) se usó con el mismo esquema de dosificación. Como se muestra en la Figura 8, el péptido CD31 fue incluso más rápido y efectivo que la prednisona para reducir la extensión de la parálisis ascendente (puntuación clínica) relacionada con la encefalitis activa en los ratones tratados.

Ejemplo 6: Protocolo curativo en un modelo de trombosis aguda

La secuencia P8F también se usó in vivo (administración subcutánea de diferentes dosis: 2,5, 5 y 10 mg/kg/d) en ratones ateroscleróticos (apoE KO, 35 semanas de edad, machos, dieta chow) sometidos a la ligadura de la arteria carótida común izquierda (un modelo de trombosis aguda). Debido a la edad avanzada, la mayoría de los ratones ya habían desarrollado una lesión aterosclerótica cerca del sitio donde se realizó la ligadura. La fotomicrografía de fluorescencia en secciones transversales teñidos con azul de Evan (fluorescente en el canal rojo) mostró la aparición de un trombo oclusivo sobre lesiones ateroscleróticas en ratones no tratados. El péptido fue efectivo para prevenir la aparición de un trombo oclusivo, en todas las dosis probadas. La dosis de 5 mg/kg d mostró la misma extensión del efecto antitrombótico que el fármaco de referencia (aspirina, administrada por vía subcutánea a 150 mg/kg/d). El número de secciones que muestran un trombo oclusivo, de 1000 secciones/muestra, se redujo significativamente en los ratones tratados con P8F en comparación con el vehículo (Figuras 9 y 10). No se pudo encontrar ningún trombo oclusivo ni en el grupo de aspirina ni en el de 5 mg/ml.

Ejemplo: 7 Comparación de P8F y P8RI con péptidos existentes

La solubilidad, actividad y estabilidad (resistencia a la congelación/descongelación) de los péptidos P8F y P8RI se compararon con péptidos usados previamente que comprenden las secuencias proximales a la membrana de CD31.

Los péptidos usados para la comparación fueron:

P8F

P8RI

P23 Hum - aminoácidos 579-601 de la secuencia de CD31 humano de SEQ ID NO: 1

P22 ratón - aminoácidos 569-590 de la secuencia CD31 de ratón de SEQ ID NO: 2

PepReg - aminoácidos 581-590 de la secuencia de CD31 de ratón de SEQ ID NO: 2.

La actividad se determinó mediante el uso de la prueba de movilización de calcio usando células T Jurkat, como se describió anteriormente. Los resultados se muestran en la Tabla 1 más abajo y se expresan como DE50 (la dosis mínima que produce el 50 por ciento de la inhibición máxima obtenible de la movilización de calcio intracelular en células Jurkat estimuladas con anticuerpos Fab antiCD3+).

La estabilidad se determinó sometiendo los péptidos a ciclos repetidos de congelación-descongelación y se determina el número de ciclos después de los cuales se aumentó la DE50 y/o se anuló la actividad biológica. La actividad de los péptidos disminuyó o se anuló después del número de ciclos de congelación-descongelación indicados en la Tabla 1.

Como se puede ver en la tabla 1 más abajo, P8F y P8RI fueron superiores a los péptidos usados previamente en todos los aspectos probados. Ellos mostraron una mayor solubilidad, una DE50 más baja y una estabilidad igual o mejorada. Además, mientras que los péptidos usados anteriormente requieren un solvente orgánico, P8F y P8RI son solubles en agua, lo que los hace más adecuados para aplicaciones médicas.

Tabla I

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que consiste de:

a) la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 582 a 589 de SEQ ID NO: 2;

b) un fragmento de al menos 6 aminoácidos consecutivos de (a);

c) la secuencia de aminoácidos correspondiente a (a) o (b) en otro CD31 de mamífero; o

d) una secuencia de aminoácidos correspondiente a (a), (b) o (c) en donde la secuencia completa de aminoácidos del péptido está invertida, en donde el término invertido significa una inversión de la cadena de aminoácidos del extremo C-terminal al extremo N-terminal,

en donde dicho péptido es soluble en agua y en donde dicho péptido tiene la actividad biológica de ejercer una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación de células T in vitro.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1(c), en donde dicho otro CD31 de mamífero es un CD31 humano, porcino o bovino.

3. El péptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde uno o más aminoácidos están en forma de enantiómero D.

4. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho péptido tiene la secuencia:

(i) H-RVFLAPWK-OH (SEQ ID NO: 5);

(ii) H-kwpalfvr-OH (SEQ ID NO: 6);

(iii) H-RVILAPWK-OH (SEQ ID NO: 7); o

(iv) H-kwpalivr-OH (SEQ ID NO: 8).

5. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho péptido está unido a un soporte sólido.

6. El péptido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicho soporte sólido es una prótesis intravascular.

7. El péptido de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha prótesis intravascular es una endoprótesis.

8. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Un péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de un trastorno trombótico o inflamatorio.

10. El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho trastorno es:

- un trastorno trombótico seleccionado del grupo que consiste en aterotrombosis, aterosclerosis, síndrome coronario agudo, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad arterial periférica y aneurisma aórtico abdominal; o

- un trastorno inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Graves, diabetes mellitus, psoriasis, dermatitis atópica, angiopatía amiloide cerebral y vasculitis.

11. El péptido para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, en donde dicho trastorno se caracteriza por aumento del número de linfocitos T CD31 - en sangre periférica y/o niveles plasmáticos elevados de CD31 soluble desprendido.

12. El péptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde dicho péptido está unido a un soporte sólido, como una prótesis intravascular.

13. El péptido para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el péptido se administra por vía subcutánea.