ES2877852T3 - Conjugados poliméricos de factor VIII - Google Patents

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Abstract

Composición que comprende una molécula proteica, que comprende: (a) una molécula de factor VIII; y (b) al menos uno de PEG, PSA o dextrano unido a dicha molécula de factor VIII, en la que dicho PSA, PEG o dextrano se une al factor VIII a través de uno o más restos de hidrato de carbono ubicados en el dominio B del factor VIII, en la que dicha molécula conserva al menos el 50% de actividad biológica de FVIII nativo.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados poliméricos de factor VIII
La presente invención se refiere a una composición que comprende un constructo proteico que comprende el factor VIII de la coagulación (FVIII) que se une a al menos un polímero soluble en agua, tal como polietilenglicol, tal como se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención se refiere a métodos para prolongar la semivida in vivo de FVIII en la sangre de un mamífero que tiene un trastorno hemorrágico asociado con defectos funcionales o deficiencias de FVIII.
Antecedentes de la invención
El factor VIII de la coagulación (FVIII) circula en el plasma a una concentración muy baja y está unido de manera no covalente al factor de von Willebrand (VWF). Durante la hemostasia, el FVIII se separa del VWF y actúa como cofactor para la activación del factor X (FX) mediada por el factor IX activado (FIXa) potenciando la tasa de activación en presencia de calcio y fosfolípidos o membranas celulares.
El FVIII se sintetiza como un precursor de cadena sencilla de aproximadamente 270-330 kD con la estructura de dominios A1-A2-B-A3-C1-C2. Cuando se purifica a partir del plasma (por ejemplo, “derivado del plasma” o “plasmático”), el FVIII se compone de una cadena pesada (A1-A2-B) y una cadena ligera (A3-C1-C2). La masa molecular de la cadena ligera es de 80 kD mientras que, debido a la proteólisis dentro del dominio B, la cadena pesada está en el intervalo de 90-220 kD.
El FVIII también se sintetiza como proteína recombinante para su uso terapéutico en trastornos hemorrágicos. Se han diseñado diversos ensayos in vitro para determinar la eficacia potencial del FVIII recombinante (rFVIII) como medicamento terapéutico. Estos ensayos imitan los efectos in vivo del FVIII endógeno. El tratamiento con trombina in vitro de FVIII da como resultado un rápido aumento y una posterior disminución en su actividad procoagulante, tal como se mide mediante ensayo in vitro. Esta activación e inactivación coincide con la proteólisis limitada específica en las cadenas tanto pesada como ligera, que alteran la disponibilidad de diferentes epítopos de unión en FVIII, por ejemplo permitiendo que el FVIII se disocie de VWF y se una a una superficie fosfolipídica o alterando la capacidad de unión a determinados anticuerpos monoclonales.
La falta o disfunción de FVIII está asociada con el trastorno hemorrágico más frecuente, la hemofilia A. El tratamiento de elección para la gestión de la hemofilia A es la terapia de sustitución con concentrados de rFVIII o derivados de plasma. Los pacientes con hemofilia A grave con niveles de FVIII inferiores al 1% generalmente reciben terapia profiláctica con el objetivo de mantener el FVIII por encima del 1% entre dosis. Teniendo en cuenta las semividas promedio de los diversos productos de FVIII en la circulación, esto puede conseguirse habitualmente administrando FVIII de dos a tres veces a la semana.
Existen muchos concentrados en el mercado para el tratamiento de la hemofilia A. Uno de estos concentrados es el producto recombinante Advate®, que se produce en células CHO y lo fabrica Baxter Healthcare Corporation. No se añaden ni albúmina ni proteínas plasmáticas humanas o animales en el proceso de cultivo celular, la purificación o la formulación final de este producto.
El objetivo de muchos fabricantes de concentrados de FVIII y fármacos polipeptídicos terapéuticos es desarrollar un producto de nueva generación con propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas potenciadas, a la vez que se mantienen todas las demás características del producto.
Los fármacos polipeptídicos terapéuticos se degradan rápidamente por las enzimas proteolíticas y se neutralizan por los anticuerpos. Esto reduce su semivida y el tiempo de circulación, limitando de ese modo su eficacia terapéutica. Se ha demostrado que la adición de un hidrato de carbono o polímero soluble a un polipéptido evita la degradación y aumenta la semivida de los polipéptidos. Por ejemplo, la pegilación de fármacos polipeptídicos los protege y mejora sus perfiles farmacodinámicos y farmacocinéticos (Harris J M y Chess R B, Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21). El proceso de pegilación une unidades de repetición de polietilenglicol (PEG) a un fármaco polipeptídico. La pegilación de moléculas puede conducir a resistencia aumentada de los fármacos a la degradación enzimática, semivida in vivo aumentada, frecuencia de administración de dosis reducida, inmunogenicidad disminuida, estabilidad física y térmica aumentadas, solubilidad aumentada, estabilidad de líquido aumentada y agregación reducida.
Por tanto, la adición de un polímero soluble, tal como a través de pegilación, es un enfoque para mejorar las propiedades de un producto de FVIII. El estado de la técnica está documentado por diferentes patentes y solicitudes de patente:
La patente estadounidense n.° 6.037.452 describe un conjugado poli(óxido de alquileno)-FVIII o FIX, en el que la proteína está unida covalentemente a un poli(óxido de alquileno) a través de los grupos carbonilo de dicho FVIII.
El documento WO 2008/025856 divulga una conjugación de aminooxi-PEG a restos de hidrato de carbono oxidados de un FVIII con el dominio B delecionado. Las condiciones que se usan en este ejemplo proporcionan un número reducido de sitios para la pegilación y una concentración por debajo de la óptima de peryodato de sodio como agente oxidante.
El documento US 2007/244301 divulga conjugados de FVIII con PEG.
El documento EP1258497B1 describe un método para preparar conjugados de FVIII y un polímero biocompatible. Esta patente se complementó mediante una publicación de Rostin et al. (Bioconj Chem 2000;11:387-96). Los conjugados comprenden un FVIII recombinante con el dominio p delecionado modificado con monometoxipolietilenglicol. El conjugado tenía función de FVIII reducida y la actividad coagulante disminuía rápidamente con el grado de modificación.
El documento WO04075923A3 describe un conjugado molecular de polímero-FVIII que comprende una pluralidad de conjugados, en el que cada conjugado tiene de uno a tres polímeros solubles en agua unidos covalentemente a una molécula de FVIII. La molécula de FVIII tiene el dominio B delecionado.
La patente estadounidense n.° 4.970.300 describe un FVIII modificado, en el que un conjugado infusible que comprende una proteína que tiene actividad de FVIII se unió covalentemente a un ligando no antigénico.
La patente estadounidense n.° 6.048.720 describe conjugados de un polipéptido y un polímero biocompatible.
El documento WO94/15625 describe FVIII unido a polietilenglicol que tiene un peso molecular preferido no mayor de 5.000 Daltons.
Sigue existiendo la necesidad de un FVIII que tenga un polímero soluble unido para prolongar la semivida del FVIII in vivo, por ejemplo, un FVIII pegilado, tal como un FVIII de longitud completa que tenga un PEG de más de 10.000 Daltons conjugado con el mismo, que conserve la actividad funcional a la vez que proporcione una semivida prolongada in vivo, en comparación con FVIII no pegilado.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a una composición que comprende un constructo proteico que comprende una molécula de factor VIII que se conjuga con un polímero soluble en agua a través de restos de hidrato de carbono de factor VIII, y a métodos para preparar la misma, tal como se define adicionalmente en las reivindicaciones.
En una realización de la invención, se proporciona un método para conjugar un polímero soluble en agua con un resto de hidrato de carbono oxidado de FVIII que comprende poner en contacto el resto de hidrato de carbono oxidado ubicado en el dominio B de FVIII con un polímero soluble en agua activado, concretamente un miembro seleccionado del grupo que consiste en PEG, PSA y dextrano, en condiciones que permitan la conjugación. El polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG, PSA y dextrano. En aún otro aspecto, el polímero soluble en agua activado se selecciona del grupo que consiste en PEG-hidrazida, PSA-hidrazina y aldehído-dextrano activado. En otro aspecto de la invención, el resto de hidrato de carbono se oxida mediante incubación en un tampón que comprende NaIO4. En aún otro aspecto de la invención, el resto de hidrato de carbono oxidado de FVIII está ubicado en el dominio B de FVIII.
En otra realización de la invención, se proporciona un FVIII modificado producido mediante el método según cualquiera de los métodos anteriormente mencionados. En aún otra realización, se proporciona un constructo proteico que comprende (a) una molécula de factor VIII; y (b) al menos un polímero soluble en agua unido a dicha molécula de factor VIII, en el que el polímero soluble en agua se une al factor VIII a través de uno o más restos de hidrato de carbono ubicados en el dominio B del factor VIII. El polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en PEG, PSA y dextrano.
Figuras
La figura 1 muestra la ampliación y el aumento de masa de rFVIII tras la conjugación con PEG medidos mediante SDS-PAGE con inmunotransferencia posterior.
La figura 2 muestra la farmacocinética del conjugado PEG-rFVIII en comparación con FVIII no conjugado en ratones hemofílicos. Cuadrados blancos: PEG-rFVIII, dosis de 200 UI de FVIII/kg. Rombos negros: rFVIII nativo, dosis de 200 UI de FVIII/kg.
La figura 3 muestra el análisis detallado de los sitios de pegilación mediante SDS-PAGE usando diversos anticuerpos anti-FVIII.
La figura 4 muestra la activación e inactivación inducidas por trombina de rFVIII nativo y pegilado.
La figura 5 muestra las bandas que demuestran los dominios de rFVIII nativo y pegilado.
La figura 6 muestra el grado de pegilación de diversos dominios de rFVIII nativo y pegilado.
La figura 7 muestra la tasa de inactivación por trombina de rFVIII nativo y pegilado.
Descripción detallada de la invención
La invención es una composición que comprende un constructo proteico que comprende una molécula de FVIII que tiene al menos una porción del dominio B intacta, unida a un polímero soluble en agua que incluye, por ejemplo, poli(ácido siálico) (PSA) o dextrano. En una realización de la invención, el polímero soluble en agua es una molécula de polietilenglicol que tiene un peso molecular de más de 10.000 Daltons. En otra realización, el polímero soluble en agua tiene un peso molecular de más de 10.000 Da a aproximadamente 125.000 Da, de aproximadamente 15.000 Da a 20.000 Da, o de aproximadamente 18.000 Da a aproximadamente 25.000 Da. En una realización, el constructo conserva la actividad funcional completa de productos de FVIII terapéuticos convencionales, y proporciona una semivida prolongada in vivo, en comparación con los productos de FVIII terapéuticos convencionales. En otra realización, el constructo conserva al menos el 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 por ciento (%) de actividad biológica en relación con el factor VIII nativo. En un aspecto relacionado, las actividades biológicas del constructo y el factor VIII nativo se determinan mediante las razones de actividad cromógena con respecto al valor del antígeno de FVIII (FVIII:Chr:FVIII:Ag). En aún otra realización de la invención, la semivida del constructo disminuye o aumenta en 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 veces en relación con la semivida in vivo del factor VIII nativo.
El material de partida de la presente invención es FVIII, que puede derivarse de plasma humano, o producirse mediante técnicas de modificación por ingeniería recombinantes, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4.757.006; la patente estadounidense n.° 5.733.873; la patente estadounidense n.° 5.198.349; la patente estadounidense n.° 5.250.421; la patente estadounidense n.° 5.919.766; el documento EP 306968.
En el presente documento, el término “factor VIII” o “FVIII” se refiere a cualquier molécula de FVIII que tiene al menos una porción del dominio B intacta, y que muestra actividad biológica que está asociada con FVIII nativo. En una realización de la invención, la molécula de FVIII es factor VIII de longitud completa. La molécula de FVIII es una proteína que está codificada por secuencias de ADN capaces de hibridarse con a Dn que codifica para el factor VIII:C. Una proteína de este tipo puede contener deleciones de aminoácidos en diversos sitios entre o dentro de los dominios A1-A2-B-A3-C1-C2 (patente estadounidense n.° 4.868.112). La molécula de FVIII también puede ser un análogo de FVIII nativo en el que se han reemplazado uno o más residuos de aminoácido mediante mutagénesis dirigida al sitio.
Las moléculas de FVIII útiles para la presente invención incluyen la proteína de longitud completa, precursores de la proteína, subunidades o fragmentos biológicamente activos o funcionales de la proteína y derivados funcionales de los mismos, así como variantes de los mismos tal como se describe a continuación en el presente documento. La referencia a FVIII pretende incluirtodas las formas posibles de tales proteínas y en las que cada una de las formas de FVIII tiene al menos una porción o la totalidad de la secuencia nativa del dominio B intacta.
Según la presente invención, el término “factor VIII recombinante” (rFVIII) puede incluir cualquier rFVIII, heterólogo o que se produce de manera natural, obtenido a través de tecnología de ADN recombinante, o un derivado biológicamente activo del mismo. En determinadas realizaciones, el término engloba proteínas, tal como se describieron anteriormente, y ácidos nucleicos, que codifican para el rFVIII de la invención. Tales ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo y sin limitación, genes, pre-mARN, ARNm, variantes polimórficas, alelos, mutantes sintéticos y que se producen de manera natural. Las proteínas abarcadas por el término rFVIII incluyen, por ejemplo y sin limitación, las proteínas y los polipéptidos descritos anteriormente en el presente documento, proteínas codificadas por un ácido nucleico descrito anteriormente, homólogos de interespecies y otros polipéptidos que: (1) tienen una secuencia de aminoácidos que tiene más de aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% o más de identidad de secuencia de aminoácidos, a lo largo de una región de al menos aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400 o más aminoácidos (hasta la secuencia de longitud completa de 406 aminoácidos para la proteína nativa madura), con respecto a un polipéptido codificado por un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos de referencia descritos en el presente documento; y/o (2) se unen específicamente a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales, generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos de referencia tal como se describe en el presente documento, un fragmento inmunógeno de la misma y/o una variante modificada de manera conservadora de la misma.
Los polinucleótidos que codifican para un rFVIII de la invención incluyen, sin limitación, aquellos que (1) se hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con un ácido nucleico que codificada para una secuencia de aminoácidos de referencia tal como se describe en el presente documento, y variantes modificadas de manera conservadora de la misma; (2) tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene más de aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de identidad de secuencia de nucleótidos, a lo largo de una región de al menos aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 o más nucleótidos (hasta la secuencia de longitud completa de 1218 nucleótidos de la proteína madura), con respecto a una secuencia de ácido nucleico de referencia tal como se describe en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, “FVIII endógeno” incluye FVIII que se origina a partir del mamífero destinado a recibir el tratamiento. El término también incluye FVIII transcrito a partir de un transgén o de cualquier otro ADN foráneo presente en dicho mamífero. Tal como se usa en el presente documento, “FVIII exógeno” incluye FVIII que no se origina a partir de dicho mamífero.
Los polipéptidos variantes (o análogos) incluyen variantes de inserción, en las que se añaden uno o más residuos de aminoácido a una secuencia de aminoácidos de FVIII de la invención. Las inserciones pueden estar ubicadas o bien en cualquiera de los extremos terminales, o bien en ambos, de la proteína y/o pueden estar posicionados dentro de las regiones internas de la secuencia de aminoácidos de FVIII. Las variantes de inserción, con residuos adicionales o bien en cualquiera de los extremos terminales, o bien en ambos, incluyen, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas de aminoácidos u otros marcadores de aminoácidos. En un aspecto, la molécula de FVIII puede contener opcionalmente una Met N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa de manera recombinante en una célula bacteriana, tal como E. coli.
En las variantes de deleción, se retiran uno o más residuos de aminoácido en un polipéptido de FVIII tal como se describe en el presente documento. Las deleciones pueden efectuarse en uno o ambos extremos terminales del polipéptido de FVIII y/o con la retirada de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos de FVIII. Por tanto, las variantes de deleción incluyen todos los fragmentos de una secuencia de polipéptido de FVIII.
En las variantes de sustitución, se retiran uno o más residuos de aminoácido de un polipéptido de FVIII y se reemplazan por residuos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son conservadoras en la naturaleza, y las sustituciones conservadoras de este tipo se conocen bien en la técnica. Alternativamente, la invención abarca sustituciones que también son no conservadoras. Las sustituciones conservadoras a modo de ejemplo se describen en Lehninger, [Biochemistry, 2a edición; Worth Publishers, Inc., Nueva York (1975), págs. 71-77] y se exponen inmediatamente a continuación.
SUSTITUCIONES CONSERVADORAS
CARACTERISTICA DE LA
CADENA LATERAL AMINOÁCIDO
No polar (hidrófoba):
A. Alifática A L I V P
B. Aromática F W
C. Que contiene azufre M
D. Ambigua G
Polar sin carga:
A. Hidroxilo S T Y
B. Amidas N Q
C. Sulfhidrilo C
D. Ambigua G
Con carga positiva (básica) K R H
Con carga negativa (ácida) D E
Alternativamente, las sustituciones conservadoras a modo de ejemplo se exponen inmediatamente a continuación.
SUSTITUCIONES CONSERVADORAS II
SUSTITUCION A MODO DE RESIDUO ORIGINAL EJEMPLO
Ala (A) Val, Leu, Ile
Arg (R) Lys, Gln, Asn
Asn(N) Gln, His, Lys, Arg
Asp(D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe;
Leu (L) Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K) Arg, Gln, Asn
Met (M) Leu, Phe, Ile
Phe (F) Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P) Gly
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala
Una secuencia de polipéptido o polinucleótido “que se produce de manera natural” es normalmente de un mamífero que incluye, pero no se limita a, primate, por ejemplo, humano; roedor, por ejemplo, rata, ratón, hámster; vaca, cerdo, caballo, oveja o cualquier mamífero. Los ácidos nucleicos y las proteínas de la invención pueden ser moléculas recombinantes (por ejemplo, heterólogas y que codifican para la secuencia de tipo natural o una variante de la misma, o que no se producen de manera natural). Las secuencias de polipéptido o polinucleótido de referencia incluyen, por ejemplo, UniProtKB/Swiss-Prot P00451 (FA8_HUMAN); Gitschier J et al., Characterization ofthe human Factor VIII gene, Nature, 312(5992): 326-30 (1984); Vehar GH et al., Structure de human factor VIII, Nature, 312(5992):337-42 (1984); y Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein, Semin Thromb Hemost, 2003:29:11-29 (2002)
Tal como se usa en el presente documento, “derivado biológicamente activo” o “variante biológicamente activa” incluye cualquier derivado o variante de una molécula que tiene sustancialmente las mismas propiedades funcionales y/o biológicas de dicha molécula, tal como las propiedades de unión, y/o la misma base estructural, tal como un estructura principal peptídica o una unidad polimérica básica.
Tal como se usa en el presente documento, “FVIII derivado de plasma” o “plasmático” incluye todas las formas de la proteína halladas en la sangre obtenida de un mamífero que tiene la propiedad de activar la ruta de coagulación.
En diversos aspectos, la producción de rFVIII incluye cualquier método conocido en la técnica para (i) la producción de ADN recombinante mediante modificación por ingeniería genética, (ii) la introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas mediante, por ejemplo y sin limitación, transfección, electroporación o microinyección, (iii) el cultivo de dichas células transformadas, (iv) la expresión de rFVIII, por ejemplo, de manera constitutiva o tras la inducción y (v) el aislamiento de dicho rFVIII, por ejemplo, a partir del medio de cultivo o recogiendo las células transformadas, con el fin de (vi) obtener rFVIII purificado.
En otros aspectos, el rFVIII se produce mediante la expresión en un sistema huésped procariota o eucariota adecuado caracterizado por producir una molécula de rFVIII farmacológicamente aceptable. Ejemplos de células eucariotas son células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2.
En aún otros aspectos, se usan una amplia variedad de vectores para la preparación del rFVIII y se seleccionan de vectores de expresión eucariota y procariota. Los ejemplos de vectores para la expresión procariota incluyen plásmidos tales como, y sin limitación, pRSET, pET y pBAD, en los que los promotores usados en vectores de expresión procariota incluyen uno o más de, y sin limitación, lac, trc, trp, recA o araBAD. Los ejemplos de vectores para la expresión eucariota incluyen: (i) para la expresión en levadura, vectores tales como, y sin limitación, pAO, pPIC, pYES o pMET, usando promotores tales como, y sin limitación, AOX1, GAP, GAL1 o AUG1; (ii) para la expresión en células de insecto, vectores tales como, y sin limitación, pMT, pAc5, pIB, pMIB o pBAC, usando promotores tales como, y sin limitación, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 o polh, y (iii) para la expresión en células de mamífero, vectores tales como, y sin limitación, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 o pBPV, y vectores derivados de, en un aspecto, sistemas virales tales como, y sin limitación, virus de la vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o retrovirus, usando promotores tales como, y sin limitación, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y p-actina.
Las moléculas de FVIII pueden conjugarse con un polímero soluble en agua mediante cualquiera de una variedad de métodos químicos (Roberts JM et al., Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76). Por ejemplo, el FVIII puede pegilarse mediante la conjugación de PEG con grupos amino libres de la proteína usando ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS). El polímero soluble en agua, por ejemplo PEG, puede acoplarse a grupos SH libres usando la química de la maleimida o el acoplamiento de PEG-hidrazidas o PEG-aminas a restos de hidrato de carbono del FVIII después de la oxidación previa.
En otras realizaciones, el FVIII se conjuga con otros polímeros solubles en agua, en el que los polímeros solubles en agua son el poli(ácido siálico) (PSA) o el dextrano. El acoplamiento del polímero soluble en agua puede llevarse a cabo mediante acoplamiento directo a la proteína o a través de moléculas ligadoras. Un ejemplo de un ligador químico es MBPH (hidrazida del ácido 4-[4-N-maleimidofenil]butírico) que contiene una hidrazida selectiva de hidrato de carbono y un grupo maleimida reactivo con sulfhidrilo (Chamow et al., J Biol Chem 1992;267:15916-22).
La conjugación puede realizarse mediante acoplamiento directo (o acoplamiento a través de sistemas ligadores) del polímero soluble en agua al factor VIII a través de la formación de enlaces estables. Además, en la presente invención pueden usarse sistemas ligadores degradables, liberables o hidrolizables (Tsubery et al. J Biol Chem 2004;279:38118-24 / Greenwald et al., J Med Chem 1999;42:3657-67 / Zhao et al., Bioconj Chem 2006;17:341-51 / documento WO2006/138572A2 / documento US7259224B2 / documento US7060259B2).
Tal como se comenta en el presente documento, una realización de la invención es el acoplamiento del polímero soluble activado al resto de hidrato de carbono oxidado de FVIII. El término “polímero soluble en agua activado” se usa en el presente documento para referirse a polímeros solubles en agua, usados para acoplarse a FVIII, que tienen un grupo funcional activo, lo que permite la conjugación química del polímero soluble en agua a un ligador o directamente a FVIII (que contiene un grupo aldehído activo). El término “resto de hidrato de carbono oxidado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a FVIII que contiene grupos aldehído libres, que se generan mediante un agente oxidante tal como NaIO4. En un aspecto de la invención, se acopla dextrano activado con aldehído (que contiene un grupo aldehído activo) a los grupos aldehído de FVIII a través de un ligador de dihidrazida.
Según el patrón de glicosilación de FVIII (Lenting et al; Blood, 92:3983-96(1998)), la conjugación de FVIII a través de restos de hidrato de carbono debería tener lugar, probablemente, en el dominio B de FVIII. Se desea la selección como diana del dominio B para tales reacciones de conjugación puesto que el dominio B no desempeña ningún papel en la actividad de FVIII. La glicoconjugación enzimática se describe en el documento US 2008/00700275.
También se divulga en el presente documento la modificación de FVIII a través de residuos de lisina mediante el uso de derivados de polietilenglicol que contienen un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) activo, tal como succinato de succinimidilo, glutarato de succinimidilo o propionato de succinimidilo. Estos derivados reaccionan con los residuos de lisina de FVIII en condiciones suaves formando un enlace amida estable. En una realización de la invención, la longitud de cadena del derivado de PEG puede ser de 5.000 Da. En diversas realizaciones se usan otros derivados de PEG con longitudes de cadena de 500 a 2.000 Da, de 2.000 a 5.000 Da, de más de 5.000 hasta 10.000 Da o de más de 10.000 hasta 20.000 Da, o de más de 20.000 hasta 150.000 Da, incluyendo estructuras lineales y ramificadas.
Métodos alternativos para la pegilación de grupos amino son la conjugación química con carbonatos de PEG formando enlaces uretano, o la reacción con aldehídos o cetonas mediante la aminación reductora formando enlaces amina secundaria.
En la presente invención, una molécula de FVIII se modifica químicamente usando derivados de PEG que están disponibles comercialmente. Estos derivados de PEG pueden tener estructuras lineales o ramificadas. Los ejemplos de derivados de PEG que contienen grupos NHS se enumeran a continuación.
Los siguientes derivados de PEG son ejemplos de aquellos disponibles comercialmente de Nektar Therapeutics (Huntsville, Ala.; véase www.nektar.com/PEG reagent catalog; Nektar Advanced PEGylation, lista de precios de 2005­ 2006):
mPEG-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA)
Figure imgf000007_0001
mPEG -a-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB)
Figure imgf000008_0001
mPEG-CM-HBA-NHS (CM=carboximetilo; HBA=ácido hidroxibutírico)
Figure imgf000008_0002
Estructura de un derivado de PEG ramificado (Nektar Therapeutics):
PEG-N-hidroxisuccinimida ramificado (mPEG2-NHS)
Figure imgf000008_0003
Este reactivo con estructura ramificada se describe con más detalle por Kozlowski et al. (BioDrugs 2001;5:419-29). Otros ejemplos de derivados de PEG están disponibles comercialmente de NOF Corporation (Tokio, Japón; véase www.nof.co.jp/english: catálogo del 2005)
Estructura general de derivados de PEG lineales (NOF Corp.):
Figure imgf000008_0004
X=carboximetilo
Figure imgf000008_0005
X=carboxipentilo
x=succinato
Figure imgf000009_0001
mPEG-succinato de succinimidilo
x=glutarato
Figure imgf000009_0002
mPEG-glutarato de succinimidilo
Estructuras de derivados de PEG ramificados (NOF Corp.):
2,3-Bis(metilpolioxietilen-oxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidiloxipentiloxi)propano
Figure imgf000009_0003
2,3-Bis(metilpolioxietilen-oxi)-1-(succinimidilcarboxipentiloxi)propano
Figure imgf000009_0004
Estos derivados de propano muestran una estructura principal de glicerol con un patrón de sustitución 1,2. En la presente invención, también pueden usarse los derivados de PEG ramificados basados en estructuras de glicerol con sustitución 1,3 u otras estructuras ramificadas descritas en el documento US2003/0143596A1.
En la presente invención, también pueden usarse los derivados de PEG con ligadores degradables (por ejemplo, hidrolizables) tal como se describe por Tsubery et al. (J Biol Chem 2004;279:38118-24) y Shechter et al. (documento WO04089280A3).
Sorprendentemente, el FVIII pegilado de esta invención muestra actividad funcional completa, combinada con una semivida de FVIII prolongada in vivo. Además, el rFVIII pegilado parece ser más resistente frente a la inactivación por trombina. Esto se demostró mediante una variedad de métodos in vitro e in vivo, y se ilustra mediante los siguientes ejemplos.
Tal como se usa en el presente documento, “restos de ácido siálico” incluye monómeros o polímeros (“polisacáridos”) del ácido siálico que son solubles en una disolución o suspensión acuosa y que tienen poco o ningún impacto, tal como efectos secundarios, sobre los mamíferos tras la administración del conjugado PSA-FVIII en una cantidad farmacéuticamente eficaz. No hay limitación particular con respecto a la unidad de ácido siálico usada según la presente invención. Los polímeros se caracterizan, en un aspecto, por tener desde 1 hasta 4 unidades. En determinados aspectos, se combinan diferentes unidades de ácido siálico en una cadena.
Los restos de ácido siálico pueden unirse a FVIII, por ejemplo, mediante el método descrito en la patente estadounidense n.° 4.356.170. En diversas realizaciones de la invención, el compuesto de polisacárido es un polisacárido que se produce de manera natural, un derivado de un polisacárido que se produce de manera natural o un derivado de polisacárido que se produce de manera natural. Generalmente, todos los residuos de sacárido en el compuesto son residuos de ácido siálico.
También se conocen otras técnicas para acoplar PSA a polipéptidos. Por ejemplo, la publicación estadounidense n.° 2007/0282096 describe la conjugación de un derivado de amina o hidrazida de, por ejemplo, PSA, a proteínas. Además, la publicación estadounidense n.° 2007/0191597 describe derivados de PSA que contienen un grupo aldehido para la reacción con sustratos (por ejemplo, proteínas) en el extremo terminal reductor.
En una realización de la invención, la porción de poli(ácido siálico) del compuesto de polisacárido es altamente hidrófila y, en otra realización, todo el compuesto es altamente hidrófilo. La hidrofilia se confiere principalmente por los grupos carboxilo colgantes de las unidades de ácido siálico, así como por los grupos hidroxilo. La unidad de sacárido puede contener otros grupos funcionales, tales como grupos amina, hidroxilo o sulfato, o combinaciones de los mismos. Estos grupos pueden estar presentes en compuestos de sacárido que se producen de manera natural, o introducirse en compuestos de polisacárido derivados.
Los compuestos de polisacárido de uso particular para la invención son, en un aspecto, aquellos producidos por bacterias. Algunos de estos polisacáridos que se producen de manera natural se conocen como glicolípidos. En una realización, los compuestos de polisacárido están sustancialmente libres de unidades de galactosa terminales.
En una realización de la presente invención, se prolonga la semivida in vivo del constructo proteico. En una realización relacionada, se prolonga la semivida in vivo del constructo proteico en al menos un factor de dos, mientras que en otra realización, se prolonga la semivida in vivo en al menos un factor de tres, en comparación con FVIII que no está unido a ningún polímero soluble en agua.
En una realización, el constructo proteico de la presente invención puede administrarse mediante inyección, tal como inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal.
Para administrar las composiciones que comprenden un constructo proteico de la presente invención a un humano o a animales de experimentación, en un aspecto, las composiciones comprenden uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los términos “farmacéuticamente” o “farmacológicamente aceptable” se refieren a entidades moleculares y composiciones que son estables, inhiben la degradación de las proteínas, tal como los productos de agregación y escisión, y además no producen reacciones alérgicas u otras adversas cuando se administran usando vías bien conocidas en la técnica, tal como se describe a continuación. Los “portadores farmacéuticamente aceptables” incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción clínicamente útiles, y similares, incluyendo aquellos agentes divulgados anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, “cantidad eficaz” incluye una dosis adecuada para tratar a un mamífero que tiene un trastorno hemorrágico tal como se indicó anteriormente.
Las composiciones pueden administrarse por vía oral, tópica, transdérmica, parenteral, mediante aerosol para inhalación, vaginal, rectal o mediante inyección intracraneal. El término parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intracisternal o técnicas de infusión. También se contempla la administración mediante inyección intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamaria, intraperitoneal, intratecal, retrobulbar, intrapulmonar y/o implantación quirúrgica en un sitio particular. Generalmente, las composiciones están esencialmente libres de pirógenos, así como de otras impurezas que podrían ser perjudiciales para el receptor.
Pueden llevarse a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones con los niveles de dosis y el patrón seleccionado por el médico tratante. Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, tal como se describió anteriormente, la gravedad y la evolución de la enfermedad, si el fármaco se administra con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, el historial clínico del paciente y la respuesta al fármaco y el juicio del médico especialista.
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un constructo proteico tal como se definió anteriormente. La composición farmacéutica puede comprender además un portador, un diluyente, una sal, una tampón o un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede usarse para tratar los trastornos hemorrágicos anteriormente definidos. La composición farmacéutica de la invención puede ser una disolución o un producto liofilizado. Las disoluciones de la composición farmacéutica pueden someterse a cualquier procedimiento de liofilización adecuado.
Como aspecto adicional, la invención incluye kits, tal como se describen adicionalmente en las reivindicaciones, que comprenden una composición de la invención envasada de una manera que facilita su uso para la administración a sujetos. En una realización, un kit de este tipo incluye un compuesto o una composición descritos en el presente documento (por ejemplo, una composición que comprende un constructo proteico), envasados en un recipiente, tal como un frasco o una botella sellados, con una etiqueta adherida al recipiente o incluida en el envase que describe el uso del compuesto o de la composición en la práctica del método. En una realización, el kit contiene un primer recipiente que tiene una composición que comprende un constructo proteico y un segundo recipiente que tiene una disolución de reconstitución fisiológicamente aceptable para la composición del primer recipiente. En un aspecto, el compuesto o la composición están envasados en una forma de dosificación unitaria. El kit puede incluir además un dispositivo adecuado para administrar la composición según una vía de administración específica. Preferiblemente, el kit contiene un etiqueta que describe el uso de la composición proteica o peptídica terapéutica.
Ejemplos
Ejemplo de referencia 1
Pegilación de residuos de lisina en rFVIII con mPEG-succinato de succinimidilo
Se filtró en gel una disolución de una masa de rFVIII derivado del procedimiento de fabricación de Advate (3.400 U/ml) mediante el uso de columnas Econo-Pac 10DG (Bio-Rad) usando tampón Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contenía sacarosa al 0,5% y polisorbato 80 al 0,1%. A continuación se añadió mPEG-succinato de succinimidilo (Abuchowski et al. Cancer Biochim Biophys 1984;7:175-86) con una longitud de cadena de 5.000 Da (PEG-SS 5000) a esta disolución con agitación suave (5 mg de PEG-SS/mg de proteína) y se ajustó el valor de pH a 7,4 mediante la adición gota a gota NaOH de 0,5 M. A continuación se llevó a cabo la pegilación con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, se aplicó la mezcla de reacción sobre una resina de cromatografía de intercambio iónico equilibrada (Fractogel EMD TMAE 650M/columna Pharmacia XK-10, altura de lecho: 15,0 cm) en tampón Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contenía sacarosa al 0,5% y polisorbato 80 al 0,1%. A continuación se lavó la columna con 20 VC de tampón de equilibrado para retirar el exceso de reactivo y se eluyó el rFVIII pegilado con tampón de elución (Hepes 20 mM, NaCl 1,0 M, sacarosa al 0,5%, polisorbato 80 al 0,1%, pH 7,4). Se concentró el eluido mediante ultrafiltración/diafiltración con una membrana que consistía en celulosa regenerada y con un valor de corte de peso molecular de 30 kD usando un sistema de tampón que consistía en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 0,5%, pH 7,4.
Ejemplo 2
Caracterización bioquímica de rFVIII pegilado in vitro
Se pegiló rFVIII derivado del procedimiento de fabricación de Advate según el ejemplo de referencia 1 y se caracterizó bioquímicamente el producto de FVIII pegilado. Se determinó la actividad funcional del PEG-rFVIII mediante el uso del ensayo cromógeno de FVIII (Rosen S, Scand J Haematol 1984;33 (supl. 40): 139-45). El método se basa en la 5a edición de la Farm. Eur. (5.05) 2.7.4 Ensayo del factor VIII de la coagulación sanguínea.
Se mezcla una muestra, que contiene factor VIII (FVIII:C) con trombina, factor IX activado (FIXa), fosfolípidos y factor X (FX) en un tampón que contiene calcio. Se activa el FVIII mediante la trombina y posteriormente forma un complejo con los fosfolípidos, el FIXa y los iones de calcio. Este complejo activa el factor X para dar factor Xa, que a su vez escinde el sustrato cromógeno FXa-1 (AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA). Se mide el transcurso temporal de la para-nitroanilina (pNA) liberada con un lector de microplacas a 405 nm. La pendiente de la reacción es proporcional a la concentración de factor VIII en la muestra. Se midió el valor de antígeno de FVIII mediante el uso de un sistema ELISA disponible comercialmente (Cedarlane, Hornby, Ontario, Canadá) con ligeras modificaciones. A partir de estos valores, se calcularon las razones de cromógeno de FVIII/antígeno de FVIII. Se determinó el contenido de proteína en las preparaciones midiendo la densidad óptica a 280 nm. A partir de estos datos, se calculó el contenido de proteína (Hoyer LW en: Human Protein Data. Installments 1-6; Heberli Ed.; Wiley V C H, Weinheim, Alemania, 1998) y se expresó en mg/ml.
TABLA 1
PEG-rFVIII
rFVIII nativo PEG-SS 5K
(5 mg por mg de proteína) Actividad de FVIII:Chr [U/ml] 3.430 64
FVIII:Ag [U/ml] 4.067 81
Razón de FVIII:Chr/FVIII:Ag 0,84 0,79
Recuperación de actividad biológica (%) 100 94
Los datos de la tabla 1 muestran que, en la preparación de rFVIII pegilado, la actividad biológica (expresada por la razón de actividad cromógena de FVIII con respecto a antígeno de FVIII) se recupera en más del 90% en comparación con la actividad biológica del rFVIII nativo (100%).
Ejemplo 3
Caracterización de rFVIII pegilado mediante SDS-PAGE y técnicas de inmunotransferencia
Se caracterizó el rFVIII nativo mediante SDS PAGE en condiciones reductoras usando un gel de gradiente de poliacrilamida del 4-12% obtenido de Invitrogen (Carlsbad, Calif., EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Como marcadores de peso molecular (PM), se usaron marcadores Precision Plus (10 kD-250 kD) obtenidos de Bio-Rad (Hercules, Calif., EE.UU.). A continuación se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF obtenida de Bio-Rad (Hercules, Calif., EE.UU.) mediante electrotransferencia y posteriormente se incubaron con un anticuerpo policlonal de oveja anti-FVIII:C humano obtenido de Cedarlane (Hornby, Ontario, Canadá). Las últimas etapas del procedimiento de inmunotinción fueron la incubación con una fosfatasa alcalina (ALP) conjugada con anticuerpo anti-IgG de oveja obtenido de Accurate (Westbury, N.Y., EE.UU.) seguido de la visualización final mediante el uso de un kit de sustrato de ALP (Bio-Rad, Hercules, Calif., EE.UU.). Los resultados se resumen en la figura 1. La transferencia demuestra la estructura de dominios de rFVIII nativo y pegilado. Se muestra que el rFVIII pegilado tiene bandas más anchas y masas moleculares más altas que la proteína recombinante nativa.
Ejemplo 4
Farmacocinética de rFVIII pegilado en un modelo de ratón con genes inactivados deficiente en FVIII
Se usaron los ratones deficientes en FVIII descritos con detalle por Bi et al. (Nat Genet 1995;10:119-21) como modelo de hemofilia A humana grave. Grupos de 5 ratones recibieron una inyección en bolo (10 ml/kg) a través de la vena de la cola o bien con PEG-rFVIII (PEG-SS, 5K) preparado según el ejemplo de referencia 1 o bien con rFVIII nativo en una dosis de 200 UI de FVIII/kg de peso corporal. Se preparó plasma de citrato mediante punción cardiaca tras anestesia a partir de los grupos respectivos, 5 minutos, 3, 6, 9 y 24 horas tras la inyección. Se midieron los niveles de actividad de FVIII en muestras de plasma. Los resultados de este experimento se resumen en la figura 2. La semivida media aumentó desde 1,9 horas (para rFVIII nativo) hasta 4,9 horas (para rFVIII pegilado), el área bajo la curva (AUC) aumentó desde 13,0 hasta 25,2 horas*UI/ml. El cálculo de la semivida se realizó con MicroMath Scientist, modelo 1 de la biblioteca farmacocinética (MicroMath, Saint Louis, Mo., EE.UU.).
Ejemplo 5
Análisis detallado de la pegilación de rFVIII mediante SDS-PAGE y técnicas de inmunotransferencia
Se digirió rFVIII nativo y pegilado con trombina 1 nM durante 60 minutos a 60°C, lo que dio como resultado la escisión específica de la molécula de FVIII con productos de degradación bien definidos. Se separaron estos fragmentos de cadena pesada y ligera mediante SDS-PAGE seguido de electrotransferencia, tal como se describió en el ejemplo 3. Para visualizar los fragmentos escindidos, se aplicaron un anticuerpo policlonal y anticuerpos monoclonales contra los dominios A1 y A2 de cadena pesada, el dominio B y el dominio A3 N-terminal de cadena ligera.
Tal como se observa en la figura 3, todos los dominios estaban pegilados, aunque en un grado diferente. El dominio B estaba fuertemente pegilado. Ambos de los dominios A1 y A2 de la cadena pesada estaban parcialmente pegilados. Pudieron observarse diversos grados de pegilación (mono-, di-, tri-pegilación...) en el dominio A3 de cadena ligera. De acuerdo con el ejemplo 6, el FVIII pegilado parecía ser más resistente a la trombina.
Ejemplo 6
Resistencia a la trombina de rFVIII pegilado
El tratamiento con trombina in vitro de FVIII da como resultado un rápido aumento y la posterior disminución de su actividad procoagulante. Se monitorizó la tasa de activación e inactivación, que depende de la concentración de trombina y de la integridad de FVIII, mediante un ensayo de cofactor de FIXa, tal como sigue:
Se incubó FVIII a 37°C con trombina 0,5 ó 1 nM. Se extrajeron submuestras a intervalos de tiempo de entre 0,5 y 40 minutos y se añadieron a una mezcla de FIXa, FX, vesículas fosfolipídicas (PL) y CaCh, que también contenía un inhibidor de trombina específico para detener las reacciones mediadas por trombina adicionales, y se incubaron durante 3 minutos. Se añadió una submuestra a un sustrato cromógeno, que se escinde selectivamente por FXa y que contiene EDTA para detener la activación de Xa adicional. Después de una incubación de 15 min, se terminó la reacción mediante ácido acético. Se midieron los valores de absorbancia (A405), que son proporcionales a las concentraciones de FXa, en un lector de ELISA y se convirtieron en concentraciones de FXa usando una curva de calibración de FXa purificado. Se representaron gráficamente las concentraciones de FXa generadas frente al tiempo de incubación con trombina.
Se determinó la tasa de inactivación de pseudoprimer orden de FVIII ajustando la parte decreciente de las curvas con un ajuste exponencial único.
TABLA 2
k' de la tasa de inactivación de primer orden (1/min)
Trombina FVIII nativo PEG-FVIII k' relativa
PEG/nativo
0,5 nM 0,14 0,08 0,57
1 nM 0,24 0,14 0,58
Tal como se muestra en la figura 4 y la tabla 2, el rFVIII pegilado mostró una tasa de inactivación más lenta a ambas concentraciones de trombina aplicadas.
Ejemplo de referencia 7
Pegilación de residuos de lisina en rFVIII con 2,3-bis(metilpolioxietilen-oxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidiloxipentiloxi)propano ramificado
Se preparó una disolución de rFVIII en tampón Hepes 20 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 150 mM, sacarosa al 0,5% y polisorbato 80 al 0,1% a partir de un material a granel derivado del procedimiento de fabricación de Advate que contenía 489 UI de FVIII/ml. Se añadió un reactivo de PEG-glutarato de succinimidilo (PEG-SG) ramificado, (2,3-bis(metilpolioxietilen-oxi)-1-(1,5-dioxo-5-succinimidiloxipentiloxi)propano), obtenido de NOF Corporation (Tokio, Japón) con un peso molecular de 20 kD a 153 ml de esta disolución con agitación suave (5 mg de reactivo/mg de proteína) y se ajustó el valor de pH a 7,4 mediante la adición gota a gota de NaOH 0,5 M después de 10 minutos. A continuación se realizó la pegilación de rFVIII con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente.
Posteriormente, se aplicó la mezcla de reacción sobre una resina de cromatografía de intercambio iónico equilibrada (Fractogel EMD TMAE 650M/columna Pharmacia XK-50, altura de lecho: 14,5 cm) en tampón Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, que contenía sacarosa al 0,5% y polisorbato 80 al 0,1%, usando una velocidad de flujo lineal de 1 cm/min. Se lavó la columna con 25 VC de tampón de equilibrado para retirar el exceso de reactivo (velocidad de flujo lineal: 2 cm/min) y se eluyó el rFVIII pegilado con tampón de elución (Hepes 20 mM, NaCl 1,0 M, sacarosa al 0,5%, polisorbato 80 al 0,1%, pH 7,4) a una velocidad de flujo lineal de 0,5 cm/min. A continuación se concentró el eluido mediante ultrafiltración/diafiltración con una membrana que consistía en celulosa regenerada y con un valor de corte de peso molecular de 30 kD usando un sistema de tampón que consistía en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, sacarosa al 0,5%, pH 7,4.
Ejemplo 8
Caracterización in vitro de rFVIII pegilado con PEG-SG ramificado de 20 kD
Se pegiló rFVIII derivado del procedimiento de fabricación de Advate a través de los residuos de lisina usando un reactivo de PEG-SG ramificado según el ejemplo de referencia 7 y se caracterizó bioquímicamente el producto de rFVIII pegilado tal como se describió en el ejemplo 2.
TABLA 3
PEG-rFVIII
rFVIII nativo PEG-SG 20K
(5 mg por mg de proteína) Actividad de FVIII:Chr [U/ml] 9.950 1.040
FVIII:Ag [U/ml] 20.807 1.763
Razón de FVIII:Chr/FVIII:Ag 0,48 0,59
Recuperación de actividad biológica (%) 100 120
Los datos de la tabla 3 muestran que, en la preparación de rFVIII pegilado, la actividad biológica (expresada por la razón de actividad cromógena de FVIII con respecto a antígeno de FVIII) se recuperó por completo en comparación con la actividad biológica del rFVIII nativo (100%).
Se caracterizó el rFVIII pegilado mediante SDS-PAGE y técnicas de inmunotransferencia en condiciones reductoras usando un gel de gradiente de poliacrilamida del 4-12% tal como se describió en el ejemplo 3. Los resultados se resumen en la figura 5. La transferencia demuestra la estructura de dominios de rFVIII nativo y pegilado. Se muestra que el rFVIII pegilado tiene bandas más anchas y masas moleculares más altas que la proteína recombinante nativa.
Para un análisis con más detalle de la pegilación de la preparación rFVlII de mediante SDS-PAGE y técnicas de inmunotransferencia, se digirió rFVIII nativo y pegilado con trombina 1 nM durante 60 minutos a 60°C, lo que dio como resultado la escisión específica de la molécula de FVIII con productos de degradación bien definidos, tal como se describió en el ejemplo 5. Se separaron los fragmentos mediante SDS-PAGE seguido de electrotransferencia y se visualizaron mediante diferentes anticuerpos anti-FVIII. Tal como se observa en la figura 6, todos los dominios estaban pegilado, aunque en un grado diferente. El dominio B estaba fuertemente pegilado. Pudieron observarse diversos grados de pegilación (mono-, di-, tri-pegilación...) en el dominio A3 de cadena ligera. Los resultados indican que el rFVIII pegilado parecía ser más resistente a la trombina.
Se monitorizó la tasa de activación e inactivación por trombina mediante un ensayo de cofactor de FIXa, tal como se describió en el ejemplo 6. Se determinó la tasa de inactivación de pseudoprimer orden de FVIII ajustando la parte descendente de las curvas con un ajuste exponencial único.
TABLA 4
k' de la tasa de inactivación de primer orden (1/min)
Trombina FVIII nativo PEG-FVIII k' relativa
PEG/nativo
0,5 nM 0,13 0,09 0,67
1 nM 0,21 0,15 0,71
Tal como se muestra en la figura 7 y la tabla 4, el rFVIII pegilado mostró una tasa de inactivación más lenta a ambas concentraciones de trombina aplicadas.
Ejemplo 9
Pegilación de rFVIII a través de restos de hidrato de carbono
Para la preparación de un conjugado PEG-rFVIII a través de residuos de hidrato de carbono, se prepara una disolución de rFVIII (concentración final: 1,2 mg/ml) en tampón fosfato 25 mM, pH 6,7. Se añade NaIO4 (concentración final de 0,3 mM) para la oxidación de residuos de hidrato de carbono (Roberts et al.; Advanced Drug Del Rev.; 54:459-76 (2002); Meir y Wilchek; Met Enzymol; 138: 429-42(1987)). Se extinguió la reacción mediante la adición de glicerol en una concentración final del 10% y se separaron los reactivos en exceso mediante centrifugación repetida usando dispositivos Amicon Micron-10 (Amicon, Billerica, MA). Se añadió PEG-hidrazida (PM de 3300 Da / Nektar, Huntsville, Alabama) para dar una concentración final de 1,5 mM de reactivo. A continuación se realizó la pegilación durante 2 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se separó el conjugado obtenido y el reactivo en exceso mediante centrifugación repetida en dispositivos Amicon Micron-10 usando tampón fosfato 25 mM, pH 6,7.
Ejemplo 10
Polisialilación de rFVIII con PSA-hidrazina
Para la preparación de un conjugado PSA-rFVIII a través de residuos de hidrato de carbono, se prepara una disolución de rFVIII (concentración final: 1 mg/ml) en tampón acetato de sodio 20 mM, pH 6,0. Se añade NaIO4 (concentración final de 0,25 mM) para la oxidación de residuos de hidrato de carbono. La oxidación se lleva a cabo durante 60 min a 4°C en la oscuridad. Se añade bisulfito de sodio (concentración final de 25 mM) para detener la reacción. Se separa el peryodato de sodio en exceso mediante filtración en gel en columnas DG-10 (Bio-Rad). Posteriormente, se añade PSA-hidrazina con una longitud de cadena de 20 kD (preparado según el documento WO2006/016168) (concentración final de 10 mM). El procedimiento de polisialilación se lleva a cabo durante 2 ha temperatura ambiente. Se purifica el rFVIII polisialilado mediante CIH en Butyl-Sepharose (GE-Healthcare). Se añade una disolución de NaCl 5 M a la mezcla para dar una concentración final de 3M de NaCl. Se aplica esta mezcla a la columna rellena de Butyl-Sepharose (GE-Healthcare) y se lleva a cabo la elución del conjugado rFVIII-PSA con tampón Hepes 50 mM, pH 7,4, que contiene CaCl26,7 mM. Tras la elución del conjugado, se ajusta el pH a pH 6,9.
Ejemplo 11
Purificación y derivatización de poli(ácido siálico)
Se purificó poli(ácido siálico) mediante cromatografía de intercambio aniónico en Q-Sepharose FF tal como se describe en el documento WO06016161A1. Se disolvieron cinco gramos de PSA en 50 ml de tampón trietanolamina 10 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 25 mM (= tampón de partida). Se aplicó esta disolución en una columna Pharmacia XK50 rellena de Q-Sepharose FF (GE Healthcare, Múnich, Alemania), que se equilibró con tampón de partida. A continuación se lavó la columna con 8 volúmenes de columna (VC) de tampón de partida y se eluyó por etapas el PSA unido con 3 VC de NaCl 200 mM, NaCl 350 mM y NaCl 500 mM en tampón de partida. La fracción eluida con NaCl 350 mM mostró un peso molecular de 20 kDa, tal como se indica mediante electroforesis en gel de SDS. Se concentró esta fracción mediante ultrafiltración usando una membrana de 5 kD fabricada de celulosa regenerada (Millipore, Billerica, MA) y posteriormente se diafiltró contra tampón fosfato 50 mM, pH 7,2. Se oxidó el PSA con NaIO4 y se introdujo un grupo amino primario terminal mediante aminación reductora, tal como se describe en el documento WO05016973A1. Para la aminación reductora, se añadieron 11 ml de una disolución de NH4Cl 2 M a 20 ml de una disolución que contenía 58 mg de PSA oxidado/ml en tampón fosfato 50 mM, pH 7,2. A continuación se añadió una disolución de NaCNBH35M en NaOH 1 M para dar una concentración final de 75 mM. La reacción se realizó durante 5 d a temperatura ambiente a pH 8,0.
A continuación se dializó la mezcla contra una disolución de (NH4)2CO3 (50 mg/l) que contenía NaCl 10 mM y posteriormente contra tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 5 mM. A continuación se introdujo un grupo sulfhidrilo mediante la reacción del grupo amino primario terminal con 2-iminotiolano (reactivo de Traut/Pierce, Rockford, IL). Se llevó a cabo la reacción en tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, que contenía EDTA 5 mM con un exceso molar de reactivo de 20 veces durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente se sometió la disolución de PSA que contenía un grupo SH libre terminal a ultrafiltración/diafiltración usando una membrana con un valor de corte de 5 kD y fabricada de celulosa regenerada (Millipore, Billerica, MA).
Ejemplo 12
Polisialilación de rFVIII mediante el uso de un reticulante heterobifuncional
Para el acoplamiento de PSA-SH a rFVIII, se usó el reticulante heterobifuncional MBPH (clorhidrato de hidrazida del ácido 4-[4-N-maleimidofenil]butírico / Pierce, Rockford, IL) que contiene una hidrazida selectiva de hidrato de carbono y un grupo maleimida reactivo con sulfhidrilo (Chamow et al., J Biol Chem; 267:15916-22(1992)). Se preparó PSA-SH que contenía un grupo sulfhidrilo activo según el ejemplo 11.
Se transfirieron dos ml de rFVIII (638 mg, concentración de proteína de 3,856 mg/ml) al tampón de oxidación (acetato de sodio 50 mM, pH 6) usando columnas desaladoras (Bio-Rad Econopac 10 DG) según las instrucciones del fabricante. A continuación se oxidó la proteína con NaIO40,25 mM (Merck) (1 h a 4°C en la oscuridad). Se extinguió la reacción de oxidación con glicerol en una concentración final del 10%. Se retiraron el glicerol y el NaIO4 y se transfirió la proteína al tampón de reacción (fosfato de sodio 50 mM, pH 6,5) usando columnas desaladoras (Bio-Rad Econopac 10 DG) según las instrucciones del fabricante. A continuación se incubaron una mezcla que contenía 1 mg de MBPH/mg de proteína y PSA-SH (exceso molar de 200 veces con respecto a la proteína) durante 2 h a TA a pH 6,5. Se retiró el exceso de ligador usando columnas desaladoras (Bio-Rad Econopac 10 DG) según las instrucciones del fabricante y se transfirió el conjugado ligador-PSA al tampón de reacción.
Se añadió el conjugado MPBH-PSA al rFVIII oxidado (0,105 mg/ml de proteína) y se incubó la mezcla de reacción durante 2 h a TA con agitación suave. Se purificó el conjugado rFVIII-PSA mediante CIH usando una columna Butyl-Sepharose preempaquetada (GE Healthcare, Butyl HiTrap FF 5 ml). Para permitir las interacciones hidrófobas del conjugado con Butyl-Sepharose, se enfrió la muestra hasta 2-8°C y se aumentó la fuerza iónica de la mezcla de reacción hasta una conductividad de aproximadamente 185 mS/cm mediante la adición de una disolución tampón que contenía NaCl 5 M (Hepes 50 mM, NaCl 5 M, CaCh 6,7 mM, Tween al 0,01%, pH 6,9). Se cargó la mezcla de reacción en la columna que se equilibró con tampón de equilibrado, pH 6,9 (que contenía Hepes 50 mM, NaCl 3 M, CaCh 6,7 mM, Tween 80 al 0,01%) con una velocidad de flujo de 1,2 cm/min. Se eliminó por lavado la muestra no unida con 10 volúmenes de columna (VC) de tampón de equilibrado. Se eluyó el conjugado con un tampón de baja fuerza iónica, pH 7,4 (Hepes 50 mM, CaCh 6,7 mM) con una velocidad de flujo de 1,2 cm/min. Durante el procedimiento cromatográfico, se enfriaron las muestras y los tampones usando un baño de hielo. Finalmente, se ajustó el pH del eluido a 6,9.
Ejemplo 13
Conjugación de rFVIII con dextrano
Para la conjugación de rFVIII con dextrano, se transfirieron 2 ml de rFVIII (638 mg, 3,4 mg/ml de proteína) al tampón de oxidación (acetato de sodio 50 mM, pH 6) usando columnas desaladoras (Bio-Rad Econopac 10 DG) según las instrucciones del fabricante. A continuación se oxidó la proteína con NaIO40,25 mM (1 h a 4°C en la oscuridad). En primer lugar se concentró la proteína oxidada usando columnas de centrifugación por ultrafiltración Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech GmbH) con un MWCO de 30 kDa según las instrucciones del fabricante. A continuación se dializó la muestra contra tampón de reacción (fosfato de sodio 50 mM, pH 7) durante la noche a 4°C.
Tras la diálisis, se añadieron 26,58 mg de dihidrazida del ácido adípico (ADH) (Sigma) (exceso molar de 500 veces) y se incubó la mezcla de reacción durante 2 h a TA a pH 7 con agitación suave. Se retiró la ADH usando columnas desaladoras (Bio-Rad Econopac 10 DG) según las instrucciones del fabricante. Se añadieron diez mg de dextrano activado con aldehído (Pierce) (exceso molar de 17 veces con respecto a la proteína) y se incubó la mezcla durante 2 h a TA, pH 7.
Se purificó el conjugado mediante cromatografía IEX en Q-Sepharose HP (GE-Healthcare). Se cargó la muestra en una columna (6,4 mm x 3 cm, V = 1 ml) que se equilibró con tampón A (fosfato de sodio 50 mM, pH 6,8) con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Se eliminó por lavado la muestra no unida con 5 VC de tampón A. Finalmente, se eluyó el conjugado con un gradiente lineal de sal (el 0-100% de tampón B [fosfato de sodio 50 mM, pH 6,8 NaCl 1 M] en 10 VC) con una velocidad de flujo de 0,5 ml/min.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Composición que comprende una molécula proteica, que comprende:
    (a) una molécula de factor VIII; y
    (b) al menos uno de PEG, PSA o dextrano unido a dicha molécula de factor VIII, en la que dicho PSA, PEG o dextrano se une al factor VIII a través de uno o más restos de hidrato de carbono ubicados en el dominio B del factor VIII,
    en la que dicha molécula conserva al menos el 50% de actividad biológica de FVIII nativo.
  2. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que dicha molécula conserva al menos el 60% de actividad biológica de FVIII nativo.
  3. 3. Composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha molécula conserva al menos el 70% de actividad biológica de FVIII nativo.
  4. 4. Composición según cualquier reivindicación anterior, en la que dicha molécula conserva al menos el 80% de actividad biológica de FVIII nativo.
  5. 5. Composición según cualquier reivindicación anterior, en la que el PEG, PSA o dextrano tiene un peso molecular de más de 10.000 Da a aproximadamente 125.000 Da.
  6. 6. Composición según cualquier reivindicación anterior, en la que el PEG, PSA o dextrano tiene un peso molecular de aproximadamente 18.000 Da a aproximadamente 25.000 Da.
  7. 7. Composición según cualquier reivindicación anterior, en la que el PEG, PSA o dextrano se une al resto de hidrato de carbono a través de un ligador, preferiblemente en la que el ligador es liberable o hidrolizable, y más preferiblemente en la que el ligador es hidrazida del ácido 4-[4-N-maleimidofenil]butírico (MBPH).
  8. 8. Composición según cualquier reivindicación anterior, en la que el factor VIII es un factor VIII recombinante o es un factor VIII plasmático.
  9. 9. Composición para su uso en el tratamiento de un trastorno hemorrágico, en la que la composición comprende:
    (i) una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y
    (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
  10. 10. Composición para su uso según la reivindicación 9, en la que dicha composición está en una forma adecuada para inyección.
  11. 11. Composición para su uso según la reivindicación 9 ó 10, en la que dicha composición se reconstituye con una disolución de reconstitución fisiológicamente aceptable.
  12. 12. Kit de partes que comprende una composición farmacéutica, que comprende:
    (i) una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; y
    (ii) una disolución de reconstitución fisiológicamente aceptable,
    envasada en un recipiente con instrucciones que describen el uso de la composición farmacéutica.
  13. 13. Método para preparar una molécula proteica según la reivindicación 1, en el que el método comprende conjugar al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en PEG, PSA y dextrano con una molécula de factor VIII a través de uno o más restos de hidrato de carbono ubicados en el dominio B del factor VIII en condiciones que permitan la conjugación.
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