ES2878037T3 - Anticuerpos anti-IL-33 y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo que se une a IL-33 humana, que comprende dos LCDR1, cada una de la SEQ ID NO: 16, dos LCDR2, cada una de la SEQ ID NO: 17, dos LCDR3, cada una de la SEQ ID NO: 18, dos HCDR1, cada una de la SEQ ID NO: 13, dos HCDR2, cada una de la SEQ ID NO: 14, y dos HCDR3, cada una de la SEQ ID NO: 15, en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 12, y cada HCVR es la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 11.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-IL-33 y usos de los mismos
La presente invención pertenece al campo de la medicina. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra la interleucina 33 (IL-33) y a composiciones farmacéuticas de los mismos. Se espera que los anticuerpos de la presente invención sean útiles en el tratamiento de la dermatitis atópica.
La dermatitis atópica (también conocida como eccema atópico) es una enfermedad alérgica inflamatoria crónica de la piel que se caracteriza por lesiones recurrentes rojas y pruriginosas. En los pacientes con dermatitis atópica se observan dos anomalías fisiopatológicas importantes; inflamación cutánea debida a respuestas inmunitarias inapropiadas en la piel y una estructura y función epidérmicas alteradas. El infiltrado inflamatorio está compuesto por una mezcla de células, en particular células inmunitarias que expresan IL-4, IL-5 e IL-13. Estas citocinas a menudo se encuentran elevadas en otras enfermedades alérgicas tales como el asma y la rinitis alérgica.
La dermatitis atópica se ha descrito como la principal carga sanitaria no mortal atribuible a las enfermedades de la piel. Aunque con mayor frecuencia comienza en la infancia y afecta a dos de cada diez niños, también es muy prevalente en adultos. La mayoría de los adultos que padecen dermatitis atópica crónica han tenido una enfermedad casi de por vida. El prurito, la falta de sueño y la vergüenza social debida a lesiones visibles tienen efectos considerables sobre el bienestar psicosocial de los pacientes y sus familiares. En los niños, el efecto de la dermatitis atópica sobre la calidad de vida relacionada con la salud es similar al de otros trastornos importantes de la infancia, tales como asma y la diabetes. La mayoría de las personas que tiene dermatitis atópica tienen antecedentes personales o familiares de alergias.
En la actualidad, la dermatitis atópica no se puede curar y el objetivo del tratamiento de la enfermedad es controlar o mejorar los síntomas y lograr el control de la enfermedad a largo plazo con un enfoque de varias etapas. Los principios fundamentales son la reparación continua de la barrera epidérmica con emolientes, la evitación de factores desencadenantes individuales y la terapia antinflamatoria con corticoesteroides tópicos o inhibidores de la calcineurina. En casos gravemente afectados, están indicados la fototerapia o los inmunodepresores sistémicos. De esta manera, existe la necesidad de terapias eficaces adicionales para pacientes con dermatitis atópica.
La IL-33 es un miembro de la superfamilia de citocinas IL-1 y se expresa principalmente en queratinocitos, células epiteliales y células endoteliales. La IL-33 activa varios tipos de células de la inmunidad innata y adquirida, provocando la producción de otros mediadores proinflamatorios, y se caracteriza con mayor frecuencia como una citoquina epitelial que estimula respuestas inmunitarias de tipo 2 o de T auxiliares 2 (Th2). Existen varios anticuerpos que se unen y neutralizan a la IL-33 conocidos en la técnica. Por ejemplo, la Publicación de Estados Unidos N.° 20160168242A1 y las Publicaciones Internacionales N.° WO2015/106080A2 y WO2016/077381 divulgan determinados anticuerpos que se unen a la IL-33 humana. Sin embargo, existe una necesidad de anticuerpos alternativos que se unan a la IL-33 humana con alta afinidad y sean terapéuticamente eficaces en el tratamiento de enfermedades alérgicas tales como la dermatitis atópica. Una afinidad mejorada y una CI50 superior pueden permitir beneficios de dosificación.
La presente invención aborda la necesidad de una terapia de anticuerpos alternativa para pacientes que tienen enfermedades alérgicas tales como dermatitis atópica, alergia alimentaria, rinitis alérgica y asma. En algunas realizaciones, la enfermedad alérgica es dermatitis atópica. La presente invención también aborda la necesidad de una terapia de anticuerpos alternativa para pacientes que tienen enfermedades inflamatorias persistentes, incluida la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La presente invención también aborda la necesidad de una terapia de anticuerpos alternativa para pacientes que tiene enfermedad de Crohn.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo que se une a la IL-33 humana, que comprende dos LCDR1, cada una de la SEQ ID NO: 16, dos LCDR2, cada una de la SEQ ID NO: 17, dos LCDR3, cada una de la SEQ ID NO: 18, dos HCDR1, cada una de la SEQ ID NO: 13, dos HCDR2, cada una de la SEQ ID NO: 14, y dos HCDR3, cada una de la SEQ ID NO: 15, en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 12, y cada HCVR es la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 11.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la presente invención en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 4 y cada HCVR es la SEQ ID NO: 3.
De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la presente invención en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 8 y cada HCVR es la SEQ ID NO: 7.
De acuerdo con aún otra realización preferida de la presente invención, se proporciona un anticuerpo de acuerdo con la presente invención en donde, cada LCVR es la SEQ ID NO: 12 y cada HCVR es la SEQ ID NO: 11.
Preferentemente, cada LC es la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 10, y cada HC es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 9.
Preferentemente, cada LC es la SEQ
Figure imgf000003_0001
NO: 2 y cada HC es la SEQ ID NO: 1.
Preferentemente, cada LC es la SEQ
Figure imgf000003_0002
NO: 6 y cada HC es la SEQ ID NO: 5.
Preferentemente, cada LC es la SEQ
Figure imgf000003_0003
O: 10 y cada HC es la SEQ ID NO: 9.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el anticuerpo de la presente invención para su uso en terapia.
Preferentemente, el anticuerpo de la presente invención es para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades alérgicas.
Más preferentemente, el anticuerpo de la presente invención es para su uso una enfermedad alérgica en donde la enfermedad alérgica es dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica o alergia alimentaria. Incluso más preferentemente, el anticuerpo de la presente invención es para dermatitis atópica.
En una realización preferida, el anticuerpo de la presente invención es para su uso en el tratamiento de la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
De acuerdo con una realización preferida adicional, el anticuerpo de la presente invención es para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
La presente invención proporciona también una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención, y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de una enfermedad alérgica, por lo que dicho tratamiento comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la presente invención. En algunas realizaciones particulares, la enfermedad alérgica es dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica o alergia alimentaria. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
La presente invención también proporciona un método de tratamiento de una enfermedad alérgica, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. En algunas de tales realizaciones, la enfermedad alérgica es dermatitis atópica. En otras de tales realizaciones, la enfermedad alérgica es asma. En otras de tales realizaciones, la enfermedad alérgica es alergia alimentaria. En otras de tales realizaciones, la enfermedad alérgica es rinitis alérgica. La presente invención también proporciona un método de tratamiento de la dermatitis atópica, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona un método de tratamiento de al menos una de esofagitis eosinofílica, esclerodermia/esclerosis generalizada, colitis ulcerosa y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención. En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona un método de tratamiento de la enfermedad de Crohn.
La presente invención también proporciona un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo para su uso en terapia. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades alérgicas, en donde la enfermedad alérgica es dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica o alergia alimentaria. En una realización particular, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento de la dermatitis atópica. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento de la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
En una realización, la presente invención también proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad alérgica. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad alérgica, en donde la enfermedad alérgica es dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica o alergia alimentaria. En una realización particular, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la dermatitis atópica. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo de la presente invención o una composición farmacéutica del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
La presente invención también se refiere a las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la presente invención. En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una HC, en donde la secuencia de aminoácidos de la HC es la SEQ ID NO: 9. De acuerdo con algunas de tales realizaciones, la molécula de ADN tiene una secuencia polinucleotídica proporcionada por la SEQ ID NO: 20.
En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una LC, en donde la secuencia de aminoácidos de la LC es la SEQ ID NO: 10. De acuerdo con algunas de tales realizaciones, la molécula de ADN tiene una secuencia polinucleotídica proporcionada por la SEQ ID NO: 21.
En una realización adicional, la presente invención proporciona una molécula de ADN que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una HC que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una LC que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10. En una realización particular, la secuencia polinucleotídica que codifica la HC que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 está proporcionada por la SEQ ID NO: 20, y la secuencia polinucleotídica que codifica la LC que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 está proporcionada por la SEQ ID NO: 21.
La presente invención también proporciona una célula de mamífero transformada con una molécula (o moléculas) de ADN, célula que es capaz de expresar un compuesto que comprende una HC y una LC de la presente invención, en donde la HC está proporcionada por la SEQ ID NO: 9, y la LC está proporcionada por la SEQ ID NO: 10. Además, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de un compuesto que comprende la HC y la LC, que comprende cultivar la célula de mamífero en condiciones tales que se exprese el anticuerpo de la presente invención. La presente invención también proporciona un anticuerpo producido mediante dicho proceso.
En otra realización, la presente invención proporciona un anticuerpo que contacta con la IL-33 humana en un nuevo epítopo, en donde el epítopo tiene los siguientes restos de la SEQ ID NO: 19: Ser en la posición 23; Pro en la posición 24; Ile en la posición 25; Thr en la posición 26; Glu en la posición 27; Tyr en la posición 28; Leu en la posición 29; Tyr en la posición 69; Glu en la posición 71; Val en la posición 83; Asp en la posición 84; Lys en la posición 86; Leu en la posición 88; Leu en la posición 126; Asn en la posición 128; Met en la posición 129; Asn en la posición 132; Cys en la posición 133; Val en la posición 134; Glu en la posición 175; y Thr en la posición 176. En tal realización, el epítopo se determina mediante cristalografía de rayos X, en que cualquier resto de IL-33 dentro de los 4,5 A de otro resto del Fab unido se considera un sitio de contacto. El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere por tanto a sitios de un antígeno que están en contacto con la región variable de un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 HC y 2 LC interconectadas mediante enlaces disulfuro. La porción amino terminal de cada LC y Hc incluye una región variable de aproximadamente 100-120 aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos a través de las CDR contenidas en las mismas. Las c Dr están intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas ("FR"). Cada LCVR y HCVR se compone de 3 CDR y 4 FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDR de la LC se denominan "LCDR1, LCDR2 y LCDR3", y las 3 CDR de la HC se denominan "HCDR1, HCDR2 y HCDR3". Las CDR contienen la mayoría de los restos que forman interacciones específicas con el antígeno. Es decir, las CDR contienen la mayoría de los restos que están en contacto con (dentro de los 4,5 A) los restos del antígeno. La capacidad funcional de un anticuerpo para unirse a un antígeno particular está, por tanto, influida en gran medida por los restos de aminoácidos dentro de las seis CDR. La asignación de aminoácidos a dominios CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR de los anticuerpos de la presente invención se basa en la muy conocida convención de numeración de Kabat (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publication del NIH n.° 91-3242(1991)), la convención de numeración de North (North et al., A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations, Journal of Molecular Biology, 406:228-256 (2011)) y la de Chothia (Chothia C, Lesk AM. Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 1987; 196:901-17. Chothia C, Lesk AM, Tramontano A, Levitt M, Smith-Gill SJ, Air G, Sheriff S, Padlan EA, Davies D, Tulip WR, et al. Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature. 1989; 342:877-83). Las CDR de los anticuerpos de la presente invención se definen de acuerdo con la Tabla 1.
Tabla 1. Convenciones de numeración de CDR utilizadas para definir las CDR de los anticuerpos de la presente invención.
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Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse y purificarse utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, las secuencias de ADNc que codifican una HC (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos proporcionada por la SEQ ID NO: 9) y una LC (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos proporcionada por la SEQ ID NO: 10) pueden clonarse y diseñarse técnicamente en un vector de expresión de GS (glutamina sintasa). El vector de expresión de inmunoglobulinas técnicamente diseñado puede, después, transfectarse de forma estable en células CHO. Como apreciará un experto en la materia, la expresión de anticuerpos en mamíferos dará como resultado la glucosilación, normalmente en sitios de N-glucosilación altamente conservados en la región Fc. En los clones estables puede verificarse la expresión de un anticuerpo que se une específicamente a IL-33. Los clones positivos se pueden expandir en un medio de cultivo sin suero para la producción de anticuerpos en biorreactores. El medio en el que se ha secretado un anticuerpo puede purificarse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, el medio se puede aplicar convenientemente a una columna de Sepharose FF Proteína A o G que se haya equilibrado con un tampón compatible, tal como solución salina tamponada con fosfato. La columna se lava para eliminar los componentes de unión inespecífica. El anticuerpo unido se eluye, por ejemplo, mediante un gradiente de pH, y se detectan las fracciones de anticuerpos, tal como por SDS-PAGE, y luego se agrupan. El anticuerpo puede concentrarse y/o esterilizarse por filtración utilizando técnicas comunes. Los agregados solubles y los multímeros pueden eliminarse de forma eficaz mediante técnicas comunes, incluida la exclusión por tamaño, la interacción hidrófoba, el intercambio iónico o la cromatografía de hidroxiapatita. El producto puede congelarse inmediatamente, por ejemplo, a -70 °C, o puede liofilizarse.
Se puede incorporar un anticuerpo de la presente invención en una composición farmacéutica que se puede preparar mediante métodos bien conocidos en la técnica y que comprenda un anticuerpo de la presente invención y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo de la presente invención puede administrarse a un paciente en riesgo de presentar, o que presente, enfermedades o trastornos como se describe en el presente documento, mediante vías parentales (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o transdérmica). Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad necesaria (en las dosificaciones y durante los períodos de tiempo y para los medios de administración) para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la patología, la edad, el sexo y el peso del individuo, y de la capacidad del anticuerpo para suscitar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo de la presente invención se ve superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse en el tratamiento de pacientes. Más particularmente, se espera que los anticuerpos de la presente invención traten enfermedades alérgicas tales como dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica y alergia alimentaria. Las enfermedades alérgicas son un conjunto de afecciones crónicas que implican respuestas inmunitarias anómalas frente a sustancias que normalmente son inofensivas para la mayoría de las personas. Además, se espera que los anticuerpos de la presente invención traten la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Además, se espera que los anticuerpos de la presente invención traten la enfermedad de Crohn.
Como se usa indistintamente en el presente documento, "tratamiento" y/o "que tratar" y/o "tratar" se pretende que se refieran a todos los procesos en donde puede haber un enlentecimiento, interrupción, detención, control, terminación o inversión de la progresión de los trastornos descritos en el presente documento, pero no indican necesariamente una eliminación total de todos los síntomas del trastorno. El tratamiento incluye la administración de un anticuerpo de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o afección en un ser humano que se beneficiaría de una reducción en la actividad de IL-33, e incluye: (a) la inhibición de la progresión adicional de la enfermedad; y (b) el alivio de la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o trastorno o aliviar los síntomas o complicaciones del mismo.
Anticuerpo técnicamente diseñado
Se optimizó un anticuerpo anti-IL-33 humana parental para unirse a IL-33 humana. Para conseguir esto, las CDR de VH y VL aisladas se aleatorizaron mediante mutagénesis y los anticuerpos resultantes se cribaron en cuanto a la unión a IL-33 humana utilizando un ELISA. Las mutaciones potenciadoras de la afinidad se combinaron luego para producir el Anticuerpo 23, que luego se optimizó utilizando un enfoque de biblioteca de armazones. Para la biblioteca de armazones, se sintetizaron doce genes (1-24, 1-46, 1-69, 2-5, 3-15, 3-23, 3-53, 3-72, 4-04, 4-39, 5-51 y 6-01) de la línea germinal de la región marco conservada de VH humana y ocho genes (A-19, A-26, A-27, B-2, B-3, L-2, L-12 y O-2) de la región marco conservada de VL humana que contienen las CDR del Anticuerpo 23 y se clonaron en vectores de expresión de IgG4 humana de cadena pesada y ligera. Después de la transfección transitoria de 293 HEK de las 96 combinaciones de cadenas pesadas y ligeras, los sobrenadantes se sometieron a ensayo mediante ELISA en cuanto a la unión a IL-33 humana directamente recubierta en una placa y a IL-33 biotinilada en solución después de la captura de IgG humana de los sobrenadantes con un anticuerpo anti-kappa humana. Un anticuerpo humano con CDR procedentes del anticuerpo Anticuerpo 23, utilizando el armazón humano de la cadena pesada 3-53 y el armazón de cadena ligera humana A27, fue elegido para un mayor desarrollo (Anticuerpo 75). La expresión del Anticuerpo 75 en CHO transitorias dio como resultado títulos de expresión más altos en comparación con el Anticuerpo 23. Adicionalmente, la purificación del Anticuerpo 75 dio como resultado rendimientos de purificación más altas que el Anticuerpo 23. Además, con el Anticuerpo 75 se observó una unión inespecífica reducida a la heparina en comparación con el Anticuerpo 23. En conjunto, el Anticuerpo 75 tenía propiedades preferidas en comparación con el Anticuerpo 23. El Anticuerpo 75 se unió a IL-33 humana con una afinidad de 14,5 pM y se unió a IL-33 de cinomolgo con una afinidad de 12.400 pM, lo que representa una diferencia de ~850 veces en la reactividad cruzada entre especies.
A continuación, se optimizó el Anticuerpo 75 en cuanto a la unión a IL-33 de cinomolgo. Para conseguir esto, las CDR de las VH y VL aisladas del Anticuerpo 75 se aleatorizaron mediante mutagénesis y los anticuerpos resultantes se cribaron en cuanto a la unión a IL-33 humana e IL-33 de cinomolgo mediante ELISA. A continuación, se combinaron mutaciones potenciadoras de la afinidad por cinomolgo que no afectaban significativamente la afinidad por la IL-33 humana para producir el Anticuerpo 54. El Anticuerpo 54 se unió a IL-33 humana con una afinidad de 46 pM y se unió a IL-33 de cinomolgo con una afinidad de 217 pM, lo que representa una diferencia de 5 veces en la reactividad cruzada entre especies. A continuación, el Anticuerpo 54 se diseñó técnicamente adicionalmente para reducir una eventual inmunogenicidad, lo que dio como resultado el Anticuerpo 43. Se proporcionan a continuación los números de identificación de la secuencia de aminoácidos para los Anticuerpos 43, 54 y 75.
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Ejemplos
Ejemplo 1: Expresión y purificación de los anticuerpos ejemplificados
Los anticuerpos de la invención se pueden biosintetizar, purificar y formular para su administración mediante métodos muy conocidos. Se transfecta una célula hospedadora adecuada, tal como HEK 293 o CHO, de forma transitoria o estable con un sistema de expresión para la secreción de anticuerpos, utilizando una relación de vectores de HC:LC predeterminada si se utilizan dos vectores, o un único sistema de vectores que codifica tanto la cadena pesada como la cadena ligera. Los vectores adecuados para la expresión y secreción de anticuerpos a partir de estas células hospedadoras de uso común son muy conocidos.
Después de la expresión y secreción del anticuerpo, el medio se clarifica para eliminar las células y el medio clarificado se purifica utilizando cualquiera de las muchas técnicas comúnmente utilizadas. Por ejemplo, el medio se puede aplicar a una columna de Proteína A o G que se haya equilibrado con un tampón, tal como solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se lava para eliminar los componentes de unión inespecífica. El anticuerpo unido se eluye, por ejemplo, mediante un gradiente de pH (tal como tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8 a tampón de citrato de sodio 0,1 M pH 2,5). Se detectan las fracciones de anticuerpos, tal como mediante SDS-PAGE, y luego se agrupan. La purificación adicional es optativa, dependiendo del uso previsto. El anticuerpo puede concentrarse y/o esterilizarse por filtración utilizando técnicas comunes. Otros materiales que no sean el anticuerpo, tal como la célula hospedadora y los componentes del medio de crecimiento, y los agregados solubles y multímeros del anticuerpo, pueden reducirse o eliminarse de forma eficaz mediante técnicas comunes, incluida la exclusión por tamaño, la interacción hidrófoba, el intercambio catiónico, el intercambio aniónico, la cromatografía de afinidad o hidroxiapatita. La pureza del anticuerpo después de estas etapas de cromatografía es normalmente mayor del 95 %. El producto puede congelarse a -70 °C o puede liofilizarse.
El Anticuerpo 43 ejemplificado se expresó transitoriamente en células CHO después de la cotransfección de vectores de ADN de expresión de cadena pesada y cadena ligera separados que incorporaban las secuencias de ADN de la SEQ ID NO: 20 y la SEQ ID NO: 21, respectivamente, o se expresó de forma estable en células CHO después de la transfección de un único vector de ADN que incorporaba las secuencias de ADN de la SEQ ID NO: 20 y de la SEQ ID NO: 21, que codificaban respectivamente la cadena pesada y la cadena ligera. Se clarificó el medio recogido de un cultivo transitorio de CHO de 7 días o de un cultivo en masa de CHO de 14 días y el sobrenadante en bruto resultante se purificó mediante cromatografía de Proteína A. El Anticuerpo 43 se unió a la resina de Proteína A y se eluyó utilizando tampón de pH bajo. El anticuerpo eluido se purificó adicionalmente utilizando cromatografía de exclusión por tamaño preparativa (SEC), para material producido a partir de CHO transitorias, o utilizando cromatografía de intercambio catiónico como etapa de depuración para material producido a partir de CHO estables. La pureza final del Anticuerpo 43 se evaluó mediante SDS-PAGE, SEC-HPLC analítica y análisis por LC/MS. Utilizando el análisis Endosafe-PTS se demostró que los niveles de endotoxinas eran de <1 UE/mg. El Anticuerpo 43 purificado se almacenó en PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,2 a 4 °C.
Afinidad de unión y cinética in vitro.
La cinética de unión y la afinidad del Anticuerpo 43 por la IL-33 humana, de mono cinomolgo, de ratón, de rata y de conejo se determina utilizando un ensayo de resonancia de plasmón superficial en un instrumento Biacore T100 o T200 preparado con tampón de ejecución HBS-EP+ (GE Healthcare, Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %) y temperatura de análisis ajustada a 37 °C. Se utiliza un chip CM4 que contiene Proteína A inmovilizada (generada utilizando acoplamiento de aminas de NHS-EDC convencional) en las cuatro celdas de flujo (Cf) para emplear un método de captura. Las muestras de anticuerpo se preparan a 10 pg/ml en tampón de ejecución. Se preparan muestras de IL-33 de ratón, rata y conejo a concentraciones finales de 1000, 500, 250, 125, 63, 31, 16 y 0 nM en tampón de ejecución. Se preparan muestras de IL-33 humana y de cinomolgo a concentraciones finales de 250, 125, 63, 31, 16, 8, 4, 2, 1 y 0 nM en tampón de ejecución. Cada ciclo de análisis implica las etapas de (1) capturar muestras de anticuerpo en celdas de flujo distintas (Fc2, Fc3 o Fc4); (2) inyectar 200 pl de IL-33 en todas las celdas de flujo a 100 pl/min; (3) volver al flujo de tampón durante un mínimo de 10 min a 100 pl/min para controlar la disociación del complejo; (4) regenerar la superficie del chip con dos inyecciones secuenciales de 7,5 microlitros de glicina, pH 1,5; y (5) equilibrar la superficie del chip durante 5 minutos antes de repetir el ciclo. Cada concentración de IL-33 se inyecta por duplicado. Los datos se procesan utilizando doble referenciación convencional y se ajustan a un modelo de unión 1:1 utilizando el programa informático Biacore T100 Evaluation, versión 2.0.1, para determinar la constante de asociación (constante de asociación, kon, unidades de M 'V 1) y la constante de disociación (constante de disociación, koff, unidades de s-1). La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula a partir de la relación Kd = koff/kon, y está en unidades molares. Se realizan tres repeticiones (n) experimentales para la unión del Anticuerpo 43 a IL-33 humana y de mono cinomolgo.
Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, el anticuerpo 43 tenía una respuesta de unión dependiente de la concentración a IL-33 humana y a IL-33 del mono cinomolgo. A la concentración más alta de IL-33 de ratón, rata y conejo inyectada (1000 nM), la señal de respuesta de unión no alcanzó la señal de respuesta semimáxima teórica. Como resultado, se estimó que la Kd del Anticuerpo 43 para IL-33 de ratón, rata y conejo era > 1000 nM. Se utilizaron métodos similares a los descritos anteriormente para determinar la cinética y la afinidad de unión del Anticuerpo 75 y el Anticuerpo 54. Además, se utilizaron métodos similares para determinar la cinética y la afinidad de unión de un anticuerpo IgG4 anti-IL-33 (no de la presente invención) que tiene las secuencias de HCVR y LCVR de APE4909 (divulgado en el documento WO15106080; denominado en el presente documento "Anticuerpo 6"). Los resultados se muestran en la Tabla 2.
T l 2: in i fini ni n IL- ni r l r n inv n i n l An i r
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continuación
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Caracterización in vitro de la unión a IL-33 humana y otros miembros de la familia de IL-1.
El biosensor 2000 BIAcore se utiliza para demostrar la especificidad de unión del Anticuerpo 43 a la IL-33 humana y para mostrar que el anticuerpo ejemplificado no se une a otros miembros de la familia de proteínas IL-1 humanas.
La Oroteína A (Calbiochem) se acopla a través de grupos amina libres a grupos carboxilo en las celdas de flujo 1 y 2 de un chip biosensor CM5 (GE Healthcare) utilizando una mezcla de N-etil-N-(dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N- hidroxisuccinimida (NHS). Para capturar anticuerpos de control positivo, se acopla IgG anti-cabra de conejo (específica de Fc) a la celda de flujo 3, y se acopla IgG anti-rata de conejo (específica de Fc) a la celda de flujo 4 (ambos de Jackson ImmunoResearch). Las celdas de flujo se verifican con un caudal de 30 pl/minuto utilizando un tampón que contiene HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 150 mM, tensioactivo P20 al 0,005 %. El Anticuerpo 43 se captura en la celda de flujo 2 para producir un total de 300 a 800 unidades de respuesta (UR; los resultados reflejan la celda de flujo 2 menos la celda de flujo 1). Las pruebas de unión van seguidas de una etapa de regeneración utilizando glicina-HCl (pH 1,5) entre cada ciclo. La celda de flujo 1 se utiliza como control para verificar la unión no específica de los analitos analizados. El anticuerpo ejemplificado se analiza con todos los analitos de la familia de proteínas IL-1 humanas enumerados a una concentración de 500 nM.
Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, los resultados de la Tabla 3 muestran que el Anticuerpo 43 solo se une a IL-33 humana y no a los otros miembros de la familia IL-1.
Tabla 3: El anticuer o 43 se une es ecíficamente a IL-33.
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Neutralización de IL-33 en el ensayo indicador de GEC NFKB-Luciferasa in vitro.
Se utilizan células endoteliales glomerulares (GEC) humanas transfectadas de forma estable con una construcción de NFkB - luciferasa para determinar la capacidad del Anticuerpo 43 para inhibir la actividad de NFkB inducida por IL-33. La línea GEC expresa de forma natural el receptor ST2 y su correceptor IL1RAP. En respuesta a IL-33 humana, la ruta de NFkB se activa en las GEC.
Se cultivan células GEC-NFkB-Iuc en medio de ensayo (medio EGM BulletKit (LONZA) más puromicina). El día anterior al ensayo, se siembran en placas células GEC-NFkB-Iuc a 5.000 células en 50 pl/pocillo en placas de paredes blancas tratadas con colágeno I (BD Biocoat) y las placas se incuban durante una noche.
Al día siguiente, las células se tratan con Anticuerpo 43 en presencia de IL-33. Para cada prueba, se añaden 25 pl del anticuerpo ejemplificado por pocilio en un intervalo de dosis de 0 a 133,3 nM por pocilio. A continuación, se añaden 25 pl de IL-33 humana a cada pocilio a una concentración final de 126 pM (basado en un PM =20 kDa). El ST2 monomérico humano (IL1RL1) se utiliza como control positivo en el ensayo en un intervalo de dosis de 0 a 142,9 nM (concentración final basada en un PM= 35 kDa), y se utiliza un anticuerpo de control de isotipo como control negativo en el ensayo en un intervalo de dosis de 0 a 133,3 nM (concentración final basada en un PM= 75 kDa). Todas las muestras se procesan por triplicado. Las placas de 96 pocillos se incuban a 37 °C, humedad relativa del 95 %, CO2 al 5 % durante 4 horas, después de lo cual se añaden 100 pl/pocillo de solución de luciferasa One-Glo para medir la actividad de luciferasa y las placas se leen en un luminómetro (Perkin Elmer Victor3). Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4: CI50 (pM, prom. ± DT) del anticuerpo ejemplificado en el ensayo de actividad de NFKB-GEC-luciferasa in vitro.
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Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, El anticuerpo 43 inhibe la actividad de NFkB inducida por IL-33 humana e IL-33 de cinom., pero no por IL-33 de ratón, rata o conejo de una manera dependiente de la dosis. La CI50 promedio de tres experimentos independientes para neutralización de la humana y la de cinom. se resume en la Tabla 4. El anticuerpo de control negativo no inhibió la actividad de NFkB en células g EC-NFkB-Iuc a ninguna concentración analizada.
Neutralización de la secreción de GM-CSF inducida por IL-33 a partir de mastocitos humanos in vitro.
Se determina la inhibición de la liberación de GM-CSF inducida por IL-33 en mastocitos humanos mediante el tratamiento con el Anticuerpo 43. Se diferencian en cultivo mastocitos humanos que expresan de forma natural el receptor ST2 (IL1RL1) y su correceptor IL1RAP, a partir de células madre de sangre de cordón umbilical humanas utilizando medio StemSpan (StemCell) y SCF/IL-6. El día del ensayo, los mastocitos se siembran en placas a 50.000 células en 50 pl/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos en medio de cultivo. Las células se tratan con IL-33 en presencia o ausencia de anticuerpos. Para cada prueba, se añaden 25 pl del anticuerpo ejemplificado 4X por pocilio en un intervalo de dosis de 0 a 30 nM. Se añaden 25 pl de IL-33 humana 4X a cada pocilio hasta una concentración final de 0,5 nM. Se utiliza medio de ensayo solo como control sin tratamiento y se utiliza un ST2 monomérico humano como control positivo en un intervalo de dosis de 0 a 30 nM. El anticuerpo de control de isotipo analizado a 30 nM se utiliza como control negativo. Las pruebas se realizan por triplicado. Las placas de 96 pocillos se colocan en una incubadora de cultivo de tejidos (37 °C, humedad relativa del 95 %, CO2 al 5 %) durante 16 horas. Se recogen 100 pl/pocillo de sobrenadante para medir los niveles de GM-CSF mediante un ELISA comercial (R&D Systems).
Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, el anticuerpo 43 inhibió completamente la secreción de GM-CSF inducida por IL33 humana a partir de mastocitos humanos de una manera dependiente de la dosis, con una CI50 de 0,3 nM, lo que fue mayor que la CI50 de 7,6 nM para el receptor soluble de control positivo. En otro experimento similar, el anticuerpo 54 inhibió la secreción de g M-CSF inducida por IL33 humana a partir de mastocitos humanos con una CI50 de 0,265 nM, y el Anticuerpo 6 inhibió la secreción de GM-CSF inducida por IL33 humana a partir de mastocitos humanos con una CI50 de 0,811 nM. El anticuerpo de control de isotipo no inhibió la secreción de GM-CSF inducida por IL- 33. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
Inhibición de la producción de IL-5 inducida por IL-33 in vivo.
Para confirmar la neutralización de IL-33 in vivo, para determinar si el Anticuerpo 43 es capaz de neutralizar la función de IL-33 humana e inhibir la producción de IL-5 de ratón in vivo, se les inyecta a ratones C57BL/6 (n=5) por vía intraperitoneal 0,94 mg/kg, 0,282 mg/kg o 0,094 mg/kg de anticuerpo, o un anticuerpo de control de isotipo a 0,94 mg/kg. Un día posinyección, los ratones se exponen a 0,025 mg/kg de IL-33 humana mediante inyección intraperitoneal. Seis horas posexposición a IL-33 humana, se sacrifican los ratones y se recolecta suero. El suero se analiza en cuanto a la producción de IL-5 de ratón utilizando un ELISA comercial (R&D Systems) según las instrucciones del fabricante.
Los resultados indicaron que el Anticuerpo 43 es capaz de inhibir completamente la producción de IL-5 de ratón de una manera dependiente de la dosis. Los niveles de IL-5 en el suero de ratones inyectados con 0,94 mg/kg, 0,282 mg/kg o 0,094 mg/kg del anticuerpo ejemplificado fueron respectivamente de 0,03±0,004 ng/ml, 0,166±0,036 ng/ml y 0,430±0,095 ng/ml. El anticuerpo de control negativo no inhibe la producción de IL-5 de ratón inducida por IL-33 humana. Estos datos demuestran que el Anticuerpo 43 inhibe la producción de IL-5 de ratón a través de la neutralización de IL-33 humana in vivo.
Eficacia in vivo de un anticuerpo para IL-33 de ratón sustituto en un modelo de inflamación de las vías respiratorias
Se desarrolla un anticuerpo sustituto para neutralizar la IL-33 de ratón (IL-33r) para su uso en modelos preclínicos de enfermedad. El sustituto es un anticuerpo monoclonal IgG1 murino que neutraliza a IL-33r en ensayos in vitro. Se determina in vivo la capacidad de la administración sistémica del anticuerpo anti-IL-33r de afectar la respuesta inflamatoria de las vías respiratorias a la exposición a Alternaría. En el día 0 se les inyectan por vía subcutánea a ratones BALB/c hembra (n=5 por grupo) 25 mg/kg de anticuerpo anti-IL-33r o de control de isotipo. ST2-Fc de ratón, una forma soluble de uno de los correceptores para IL-33 que puede neutralizar a IL-33r en ensayos in vitro (control positivo), se inyecta a 12,5 mg/kg por vía intraperitoneal en los días 1 y 2, 30 minutos antes de la administración de Alternaria. Se administra a cada ratón extracto de Alternaría (50 |jg en 2o j l de PBS) por vía intranasal los días 1 y 2. Los ratones se sacrifican el día 3 con inhalación de CO2 y se recolecta inmediatamente sangre mediante punción cardíaca para la preparación de suero.
Se prepara líquido de lavado broncoalveolar (LBA) lavando los pulmones con 10 lavados (500 j l cada lavado) de inyección de PBS y extracción a través de una cánula en la tráquea expuesta de cada ratón. El líquido del LBA se centrifuga a 200 g durante 10 minutos y el sobrenadante se retira y se congela. Las células se resuspenden en 1 ml de tampón ACK (Sigma) para lisar los glóbulos rojos, se lavan y se resuspenden en 0,5 ml de PBS para el recuento. Se recuentan los eosinófilos utilizando líquido de dilución de eosinófilos y tinción (ENG Scientific, Cat. ES-3101) y las células totales se recuentan con azul tripano. El líquido del LBA se somete a ensayo utilizando ELISA de IL-5 de ratón comercial y de quitinasa 3 de tipo 3/YM1 (Chi3L3/YM1) (R&D Systems) y en cuanto a la exposición a anticuerpos. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5.
Tabla 5: Niveles de IL-5 y^ Chi3L3/YM1, y número de eosinófilos y número total de células^ en el líquido de LBA.
élulas/Citocina Sin exposición Control de Isotipo Anti-IL-33r Control positivo osinófilos (n.° d
células) 32000± 13565 340000± 70711 120000± 51769 112000± 57480
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IL-5 (pg/ml) 2 ± 0 69,6 ± 27,31 2 ± 0 9,2 ± 6,248
Chi3L3/YM1 (ng/ 17,4 ± 2,064 108,6 ± 28,7
Figure imgf000010_0004
27,4 ± 4,986 37,4 ± 6,313 Células totales (n.°
células)
Figure imgf000010_0002
104000± 20396
Figure imgf000010_0003
408000 ± 95833 144000± 31241
Figure imgf000010_0005
152000± 44989
Siguiendo los procedimientos esencialmente como se describe anteriormente, La exposición a Alternaría aumentó el número de células, principalmente de eosinófilos, presente en el líquido del LBA. Además, indujo la producción de citocinas tales como IL-5 y Chi3L3/YM1. La administración sistémica del anticuerpo anti-IL-33r redujo significativamente la infiltración celular total y de eosinófilos, medida por los recuentos de células del LBA, y disminuyó los niveles de IL-5 y Chi3L3/YM1 en el líquido del LBA. Estos resultados demuestran que la inhibición de IL-33r redujo múltiples marcadores inflamatorios en este modelo de inflamación de las vías respiratorias.
Mapeo epitópico por cristalografía de rayos X
Cristalografía de rayos X
Una solución de 10,6 mg/ml de complejo IL33h:FAB se criba en cuanto a cristales utilizando placas de cristalización hechas a medida y disponibles en el mercado. Los experimentos de difusión de vapor se configuran a 22 °C como gotas de cristalización de 400 nl 400 nl (proteína solución de pocillo) con 50 j l de solución de pocillo (sulfato de amonio 0,2 M y polietilenglicol 8.000 al 30 % p/v) en una placa de gota sentada MRC2 (SWISSCI). Se añade acetato de magnesio 20 mM a la proteína para ayudar a la cristalización. Los cristales resultantes se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido después de una inmersión rápida en una solución de pocillo que contiene etilenglicol al 20 % añadido como agente criogénico. Los datos de difracción de rayos X se recopilan utilizando radiación de sincrotrón en LRL-CAT 31-ID (Advanced Photon Source, Argonne, IL). Se recopilan 180 fotogramas con una oscilación de 1° a una longitud de onda de 0,97931 A y se procesan con paquetes CCP41.
Los cristales son del grupo espacial P21212 con dimensiones de celda unitaria a=70,1 A b=194,9 A c=46,5 A a=p=Y=90°. Se obtiene una solución de reemplazo molecular del complejo IL33h:FAB con Phaser2 utilizando modelos de entrada de la estructura del PDB 4KC3 y un modelo del FAB generado con la herramienta de modelado de anticuerpos MOE3 (v2014.9). La solución de sustitución molecular contiene 1 complejo en la unidad asimétrica. Posteriormente, esta solución se somete a múltiples rondas de refinamiento y de construcción de modelos con Buster4 y Coot5, produciendo una estructura final con Rwork del 17,8 % y Rfree del 20,3 % a 1,40 A.
El epítopo de IL33h se mapea para la estructura cristalina de alta resolución del complejo IL33h:FAB utilizando la herramienta Protein Contacts en MOE3 (v2015.10). La herramienta se utiliza para evaluar las interacciones "distancia", "covalente", "areno", "iónica" y "enlace de hidrógeno". El resultado para las interacciones intercatenarias se depura hasta el nivel de resto en Microsoft Excel para identificar los restos del epítopo de IL33h. El listado final contiene restos de IL33h que se encuentran dentro de los 4,5 A de cualquier resto del FAB.
Siguiendo un procedimiento esencialmente como se describe anteriormente, un anticuerpo que tiene las mismas CDR que el Anticuerpo 75 se pone en contacto con la IL-33 humana en un epítopo proporcionado por los siguientes restos de la SEQ ID NO: 19: Ser en la posición 23; Pro en la posición 24; Ile en la posición 25; Thr en la posición 26; Glu en la posición 27; Tyr en la posición 28; Leu en la posición 29; Tyr en la posición 69; Glu en la posición 71; Val en la posición 83; Asp en la posición 84; Lys en la posición 86; Leu en la posición 88; Leu en la posición 126; Asn en la posición 128; Met en la posición 129; Asn en la posición 132; Cys en la posición 133; Val en la posición 134; Glu en la posición 175; y Thr en la posición 176. El Anticuerpo 54 y el Anticuerpo 43 también se ponen en contacto con un epítopo sustancialmente similar en la IL-33 humana.
Secuencias
HC del anticuerpo 75 (SEQ ID NO: 1)
EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG GSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTLHGIRAAYDA FIIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPYTVSWN S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL YSL S S V VT VP S S SLGTKT YT CN VDHKP SNTKVDKR VESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEV QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SN KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSLG
LC del anticuerpo 75 (SEQ ID NO: 2)
EIVLT Q SPGTL SL SPGERATL SCRASQ S VGINL S W Y QQKPGQ APRLLIY GASHRAT
GIPDRF S GS GS GTDF TLTISRLEPEDF A V Y Y CHQ Y S Q SPPF TF GGGTK YEIKRT V A A
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKD S T Y SL S STL TL SK AD YEKHK V Y ACE VTHQGL S SP VTK SFNRGEC
HCVR del anticuerpo 75 (SEQ ID NO: 3)
EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG
GS T Y Y AD S VKGRF TISRDN SKNTL YLQMN SLRAED T A V Y Y C ARTLHGIRA A YD A
FIIWGQGTLVTVSS
LCVR del anticuerpo 75 (SEQ ID NO: 4)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSYGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRAT
GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSQSPPFTFGGGTKVEIK
HC del anticuerpo 54 (SEQ ID NO: 5)
EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSFYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG
GSTYYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CARTLHGIRAAYD A
FIIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTKT YT CNVDHKP SNTK VDKR
VESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSYFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYVDYSQEDPEY
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SN
KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW QEGNVF SC S VMHEALHNHYTQKSLSLSLG LC del anticuerpo 54 (SEQ ID NO: 6 )
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRLT
GIPDRF SGSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYY CHQ YSQPPPFTF GGGTKVEIKRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKD ST Y SL S STLTL SK AD YEKHK VY ACEVTHQGL S SP VTKSFNRGEC
HCVR del anticuerpo 54 (SEQ ID NO: 7)
EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSFYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG GSTYYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CARTLHGIRAAYD A FIIW GQGTL VT V S S LCVR del anticuerpo 54 (SEQ ID NO: 8 )
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRLT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSQPPPFTFGGGTKVEIK HC del anticuerpo 43 (SEQ ID NO: 9)
EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSFYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG
GSTYYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CARTIHGIRAAYD A
FIIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
S GALT S GVHTFP A VLQ S S GL Y SL S S V VT VP S S SLGTKT YT CNVDHKP SNTK VDKR
VESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYYVDVSQEDPEY
QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVV S VLTVLHQDWLNGKEYKCKV SN
KGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNH
YTQKSLSLSLG
LC del anticuerpo 43 (SEQ ID NO: 10)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRLT
GIPDRF S GSGSGTDFTLTISRLEPEDF AVYY CHQ Y S QPPPFTF GGGTK VEIKRT VA A
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
SKD ST Y SL S STLTL SKAD YEKHK VY ACEVTHQGL S SP VTKSFNRGEC
HCVR del anticuerpo 43 (SEQ ID NO: 11)
EVQLVETGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSFYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSG GSTYY AD S VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CARTIHGIRAAYD A FIIWGQGTLVTVSS LCVR del anticuerpo 43 (SEQ ID NO: 12)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGINLSWYQQKPGQAPRLLIYGASHRLT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYSQPPPFTFGGGTKVEIK
HCDR1 (SEQ ID NO: 13)
GFTFSXYAMS
En donde X en la posición 6 es S o F.
HCDR2 (SEQ ID NO: 14)
AISGSGGSTYYADSVKG HCDR3 (SEQ ID NO: 15)
TXHGIRAAYDAFII
En donde X en la posición 2 es L o I.
LCDR1 (SEQ ID NO: 16)
RASQSVGINLS LCDR2 (SEQ ID NO: 17)
GASHRXT
En donde X en la posición 6 es A o L.
LCDR3 (SEQ ID NO: 18)
HQYSQXPPFT
En donde X en la posición 6 es S o P.
Aminoácidos de IL-33 humana 95-270 (SEQ ID NO: 19)
AFGISGVQKYTRALHDSSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKK
DEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVEL
HKCEKPLPDQAFF VLHNMHSNCV SFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDS SENLCT
ENILFKLSET
ADN que codifica la HC de la SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 20)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGACTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCC
TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCTTTTATGCTATGAGCT
GGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGG
TAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGATTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCT
CCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGC
CGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAACGATCCACGGTATACGCGCA
GCCTATGATGCTTTTATTATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTC
AGCTTCTACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCA
CCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA
ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACC
TTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGAC
CGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCAC
AAGCCC AGC AAC ACC AAGGT GGAC AAGAGAGTT GAGTCC AAAT AT GGTCCCC
CATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTG
TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une a IL-33 humana, que comprende dos LCDR1, cada una de la SEQ ID NO: 16, dos LCDR2, cada una de la s Eq ID NO: 17, dos LCDR3, cada una de la SEQ ID NO: 18, dos HCDR1, cada una de la SEQ ID NO: 13, dos HCDR2, cada una de la SEQ ID NO: 14, y dos HCDR3, cada una de la SEQ ID NO: 15, en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 12, y cada HCVR es la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 11.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 4 y cada HCVR es la SEQ ID NO: 3.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 8 y cada HCVR es la SEQ ID NO: 7.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde cada LCVR es la SEQ ID NO: 12 y cada HCVR es la SEQ ID NO: 11.
5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde cada LC es la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 10, y cada HC es la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 9.
6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde cada LC es la SEQ ID NO: 2 y cada HC es la SEQ ID NO: 1.
7. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde cada LC es la SEQ ID NO: 6 y cada HC es la SEQ ID NO: 5.
8. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde cada LC es la SEQ ID NO: 10 y cada HC es la SEQ ID NO: 9.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
10. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.
11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de una o más enfermedades alérgicas.
12. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la enfermedad alérgica es dermatitis atópica, asma, rinitis alérgica o alergia alimentaria.
13. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la enfermedad alérgica es dermatitis atópica.
14. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de la esofagitis eosinofílica, la esclerodermia/esclerosis generalizada, la colitis ulcerosa o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
15. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Crohn.
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