ES2883182T3 - Ensayo para la detección de alfa-sinucleína total y fosforilada en S129 - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro de detección simultánea de alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína fosforilada en S129 (pS129), que comprende: a) poner en contacto una muestra con: (i) un complejo donante que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la alfa-sinucleína unida a un soporte y a un marcador de donante, que se excita por la luz para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete; (ii) un primer complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína pS129 que comprende un anticuerpo que se une a alfa-sinucleína pS129, en donde el anticuerpo tiene una constante de asociación al menos cinco veces mayor para la alfa-sinucleína pS129 que para la alfa-sinucleína no fosforilada, unido a un soporte y a un primer marcador de aceptor; en donde si la alfa-sinucleína pS129 está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el primer complejo aceptor se unen a la alfa-sinucleína pS129 mediante la formación de un primer sándwich en donde el marcador de donante se excita por la luz para producir oxígeno singlete para activar el primer marcador de aceptor para producir una primera señal; (iii) un segundo complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína total que comprende un anticuerpo que se une a la alfa-sinucleína independientemente de la fosforilación de S129, el anticuerpo está unido a un soporte y a un segundo marcador de aceptor; en donde si la alfa-sinucleína total está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el segundo complejo aceptor se unen a la alfa-sinucleína total mediante la formación de un segundo sándwich en donde el marcador de donante se excita por la luz para producir oxígeno singlete para activar el segundo marcador de aceptor para producir una segunda señal; (b) excitar el marcador de donante con una luz para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete, de esta manera se produce la primera señal si está presente la alfa-sinucleína pS129 y la segunda señal si está presente la alfa-sinucleína total; y (c) detectar la primera y segunda señales, si hay alguna, para indicar la presencia de alfa-sinucleína pS129 y alfa sinucleína total, respectivamente.
Description
DESCRIPCIÓN
Ensayo para la detección de alfa-sinucleína total y fosforilada en S129
Antecedentes
La patología cerebral por alfa-sinucleína es una característica notable de varias enfermedades neurodegenerativas denominadas sinucleinopatías. La alfa-sinucleína es el componente principal de los cuerpos de Lewy (LB) y las neuritas de Lewy, que son inclusiones intraneuronales.
Las sinucleinopatías incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), la variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBVAD), la enfermedad de cuerpos de Lewy difusa (DLBD), la atrofia de múltiples sistemas (MSA) y la neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro tipo 1 (NBIA-1). Las sinucleinopatías son una causa común de trastornos del movimiento y deterioro cognitivo en la población envejecida (Galasko y otros, Arch. Neurol. (1994) 51:888-95). Hasta la fecha estos trastornos no son curables ni prevenibles y la comprensión de las causas y la patogénesis de la EP es fundamental para el desarrollo de nuevos tratamientos (Tanner y otros, Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30). La causa de la enfermedad de Parkinson es controvertida y se ha propuesto que intervienen múltiples factores, incluidas varias neurotoxinas y factores de susceptibilidad genética.
Varios estudios han demostrado que la alfa-sinucleína juega un papel central en la patogénesis de la EP porque: (1) esta proteína se acumula en los Lb (Spillantini y otros, Nature (1997) 388:839-40; Takeda y otros, J. Pathol. (1998) 152:367-72; Wakabayashi y otros, Neurosci. Lett. (1997) 239:45-8), (2) mutaciones en el gen de la alfa-sinucleína cosegregan con formas familiares raras de parkinsonismo (Kruger y otros, Nature Gen. (1998) 18:106-8; Polymeropoulos y otros, Science (1997) 276:2045-7) y, (3) su sobreexpresión en ratones transgénicos (Masliah y otros, Science (2000) 287:1265-9) y Drosophila (Feany y otros, Nature (2000) 404:394-8) imita varios aspectos patológicos de la EP. Por tanto, el hecho de que la acumulación de la alfa-sinucleína en el cerebro esté asociada con alteraciones morfológicas y neurológicas similares en especies tan diversas como seres humanos, ratones y moscas sugiere que esta molécula contribuye al desarrollo de la enfermedad de PD.
Se encontró sistemáticamente que los LB contienen una gran cantidad de alfa-sinucleína acumulada (Spillantini y otros National Acad Sciences 95:6469-6473 (1998)). El análisis de la asina anormalmente procesada y agregada de pacientes reveló diferentes modificaciones postraduccionales, que incluyen fosforilación, nitración, ubiquitinación y truncamiento C-terminal de la proteína (Giasson y otros Science 290:985-989 (2000); Baba y otros Am J Pathol.
152:879-884 (1998); Fujiwara y otros Nat Cell Biol. 4:160-164 (2002)). La mayoría de la alfa-sinucleína acumulada en el cerebro de los pacientes está de hecho fosforilada especialmente en la serina 129 (pS129 h-asina) (Fujiwara y otros Nat Cell Biol. 4:160-164 (2002); Anderson y otros J Biol Chem. 281:29739-29752 (2006)). Estos hallazgos conducen al desarrollo de ensayos independientes que monitorean los niveles totales de alfa-sinucleína, así como sus estados oligoméricos y fosforilados, no solo en el tejido cerebral sino también en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y muestras de sangre (El-Agnaf y otros FASEB J. 20:419-425(2006); Hong y otros Brain 133:713-726(2010); Emmanouilidou y otros PLoS ONE. (2001); Bidinosti y otros J Biol Chem. 287(40):33691-705(2012); Kruse y otros Neurobiology of Aging. 36: 2587-2596 (2015)); Mollenhauer y otros Experimental Neurology. 213: 315-325(2008)). WO-A-2005/047860 describe métodos para la detección de alfa-sinucleína, identifica epítopos preferidos de la alfasinucleína para su uso en tal detección y proporciona anticuerpos que se unen específicamente a tales epítopos. Aunque se han desarrollado ensayos para la alfa-sinucleína como biomarcador húmedo, particularmente para cuantificar los niveles de alfa-sinucleína total para su correlación con el inicio y la progresión de la enfermedad, solo se han desarrollado cuatro ensayos para la cuantificación de la alfa-sinucleína fosforilada en S129 (Anderson y otros J Biol Chem. 281: 29739-29752 (2006); Swirski y otros Alzheimer Res Ther.6: 77 (2014); Foulds y otros Fa Se B J.
25: 4127-4137 (2011); Wang y otros Science Translational Medicine. 4: 121(2012)). En particular, ninguno de los métodos anteriores implementó una plataforma de ensayo dúplex para medir la alfa-sinucleína total y la alfasinucleína fosforilada en S129 en un solo pocillo.
La invención proporciona un ensayo novedoso que permite el análisis simultáneo, sensible y específico de alfasinucleína total asina humana (h-asina) en la misma molécula por tanto mejora la precisión así como ahorra tiempo, consumibles y muestras.
Resumen
La invención proporciona un método in vitro para la detección simultánea de alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína fosforilada en S129 (pS129), que comprende: el contacto de una muestra con: (i) un complejo donante que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la alfa-sinucleína unida a un soporte y un marcador de donante, que se excita por la luz para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete; (ii) un primer complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína pS129 que comprende un anticuerpo que se une a la alfa-sinucleína pS129 con una constante de asociación al menos cinco veces mayor para la alfa-sinucleína pS129 que para la alfasinucleína no fosforilada, unida a un soporte y a un primer marcador de aceptor; en donde si la alfa-sinucleína pS129
está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el primer complejo aceptor se unen a la alfasinucleína pS129 mediante la formación de un primer sándwich en el que el marcador de donante se excita por la luz para producir oxígeno singlete para activar el primer marcador de aceptor para producir una primera señal; (iii) un segundo complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína total que comprende un anticuerpo que se une a la alfa-sinucleína independientemente de la fosforilación de S129, el anticuerpo está unido a un soporte y un segundo marcador de aceptor; en el que si la alfa-sinucleína total está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el segundo complejo aceptor se unen a la alfa-sinucleína total mediante la formación de un segundo sándwich en el que el marcador de donante se excita por la luz para producir oxígeno singlete para activar el segundo marcador de aceptor para producir una segunda señal; (b) la excitación del marcador de donante con una luz para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete, produce de esta manera la primera señal si está presente la alfa-sinucleína pS129 y la segunda señal si está presente la alfa-sinucleína total; y (c) la detección de la primera y segunda señales, si hay alguna, para indicar la presencia de alfa-sinucleína pS129 y alfa sinucleína total, respectivamente. Opcionalmente, la segunda señal se detecta antes que la primera señal. Opcionalmente, el contacto de la muestra con el complejo donante comprende poner en contacto la muestra con el soporte unido al marcador de donante del complejo donante, en donde el soporte está unido además a estreptavidina y el anticuerpo del complejo donante, en donde el anticuerpo está unido a la biotina, en donde la estreptavidina se une a la biotina mediante la formación del complejo donante en la muestra para de esta manera ponerse en contacto con la muestra. Opcionalmente la muestra se pone en contacto con el primer y segundo complejos aceptores y el anticuerpo del complejo donante se une a la biotina, se incuba la muestra, y a continuación se pone en contacto la muestra con el soporte unido además a estreptavidina.
Opcionalmente, el contacto de la muestra con el complejo donante comprende poner en contacto la muestra con el soporte unido al marcador de donante y un marcador de biotina y el anticuerpo unido a la estreptavidina, en donde la estreptavidina se une a la biotina mediante la formación del complejo donante que de esta manera contacta con la muestra.
Opcionalmente, el método se realiza cualitativamente. Opcionalmente, el método se realiza cuantitativamente en el que la primera señal indica una cantidad de la alfa-sinucleína pS129 y la segunda señal indica una cantidad de la alfa-sinucleína total. Opcionalmente, el complejo donante, el primer complejo aceptor y el segundo complejo aceptor se ponen en contacto con la muestra simultáneamente. Opcionalmente, el primer y segundo complejos aceptores se ponen en contacto con la muestra antes que el complejo donante.
Opcionalmente, el anticuerpo del primer complejo aceptor se une específicamente a un epítopo de la sinucleína fosforilada dentro de los residuos 123-134. Opcionalmente, el anticuerpo del primer complejo aceptor es 11A5 (número de acceso ATCC PTA-8222).
Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 103 108 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 4B12 (disponible para su compra en BioLegend®, 9727 Pacific Heights Blvd., San Diego, CA 92121, www.biolegend.com, números de catálogo 807801, 807802 o 807803, anteriormente número de catálogo de Covance SIG-39730). Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711). Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 91 97 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220). Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 109-120 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 5C12 (número de acceso ATCC PTA-9197). Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 115-122 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es LB509 (disponible para su compra en BioLegend®, 9727 Pacific Heights Blvd., San Diego, CA 92121, www.biolegend.com, números de catálogo 807701, 807702, 807703 o 80774, anteriormente números de catálogo de Covance SIG-39725 o SIG-39726). Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 4B12, LB509, 1H7, 5C12 o 23E8.
El anticuerpo del segundo complejo aceptor puede ser cualquiera de varios anticuerpos que se unen a la alfasinucleína. En algunos métodos de la invención, el epítopo del anticuerpo complejo donante es diferente del epítopo del anticuerpo del segundo complejo aceptor. Algunos de tales epítopos son distintos (es decir, no se superponen ni se bloquean entre sí). Por ejemplo, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de 40-55, 91-99, 103-108, 109-122 o 115-122 de la alfa-sinucleína y el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de 40-55, 91-99, 103-108, 109-122 o 115-122, siempre y cuando el epítopo unido específicamente por el anticuerpo del complejo donante sea distinto del epítopo unido específicamente por el anticuerpo del segundo complejo aceptor. Por ejemplo, el anticuerpo del complejo donante puede ser 23E8, 1H7, 4B12, 5C12 o LB509 y el del segundo complejo aceptor puede ser 23E8, 1H7, 4B12, 5C12 o LB509, siempre y cuando el anticuerpo del complejo donante y el anticuerpo del segundo complejo aceptor sean anticuerpos diferentes. En algunos métodos, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 115-122 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 91-97 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 1H7
Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 109-122 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 5C12. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de la alfa-sinucleína. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 23E8.
Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 4B12, LB509, 1H7, 5C12 o 23E8. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 4B12 y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509, 1H7, 5C12 o 23E8. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 4B12 y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 23E8 y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509, 1H7, 5C12 o 23E8. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 23E8 y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 1H7. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante es 5C12 y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 23E8 o 1H7.
Opcionalmente, los soportes del complejo donante, el primer complejo aceptor, y el segundo complejo aceptor son perlas. Opcionalmente, el primer marcador de aceptor comprende europio, terbio, samario o gadolinio. Opcionalmente, el segundo marcador de aceptor comprende europio, terbio, samario o gadolinio. Opcionalmente, el primer marcador de aceptor comprende europio y el segundo marcador de aceptor comprende terbio.
Opcionalmente, la muestra es un tejido de un ser humano. Opcionalmente, la muestra es de un ratón transgénico con un transgén que expresa la alfa-sinucleína humana. Opcionalmente, la muestra es un fluido corporal. Opcionalmente, la muestra es líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ser humano. Opcionalmente, la muestra es un homogeneizado de cerebro, piel u otro órgano de un ser humano, un animal de tipo silvestre o transgénico. Opcionalmente, la muestra es un medio usado para el cultivo de células. Opcionalmente, las células expresan alfasinucleína humana recombinante.
Breve descripción de los dibujos
Figuras 1A-D: muestran la caracterización del ensayo de alfa-sinucleína humana total.
Figuras 2A-D: muestran la caracterización del ensayo específico de alfa-sinucleína humana fosforilada en S129. Figura 3: muestra la cantidad de h-asina fosforilada mediante el uso de geles de enfoque isoeléctrico.
Figuras 4A-F: muestran el rendimiento del ensayo dúplex.
Figura 5: muestra la comparación de la intensidad de la señal de las condiciones uniplex y dúplex.
Figuras 6A-F: muestran la caracterización del ensayo dúplex de alfa-sinucleína humana total y fosforilada en S129. Figura 7: muestra la fosforilación específica de S129 de la alfa-sinucleína humana mediante el uso de PLK2 in vitro. Definiciones
La frase que un anticuerpo "se une específicamente" a una diana se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia del anticuerpo en la presencia de una población heterogénea de otros productos biológicos. Por tanto, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, una molécula específica se une preferentemente a una diana particular y no se une en una cantidad significativa a otros productos biológicos presentes en la muestra. La unión específica de un anticuerpo a una diana bajo tales condiciones requiere que se seleccione el anticuerpo por su especificidad para la diana. La unión específica entre dos entidades significa una afinidad de al menos 106, 107, 108, 109 o 1010 M-1. Se prefieren las afinidades mayores que 108 M-1. La falta de unión específica significa la unión a una diana indistinguible de un anticuerpo de control irrelevante y/o una afinidad menor de 106 M-1.
El término "anticuerpo" incluye anticuerpos intactos y fragmentos de unión de los mismos. Típicamente, los fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del que se derivaron por la unión específica a un fragmento de antígeno, que incluye las cadenas pesadas separadas, las cadenas ligeras Fab, Fab', F(ab')2, Fabc y Fv. Los fragmentos se producen mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye una o más cadenas de inmunoglobulina que se conjugan químicamente a, o se expresan como, proteínas de fusión con otras proteínas. El término "anticuerpo" también incluye anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante una variedad de métodos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'. Ver, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny y otros, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Los anticuerpos de la invención son típicamente sustancialmente puros de contaminantes no deseados. Esto significa que un agente es típicamente al menos aproximadamente un 50 % p/p (peso/peso) de pureza, así como sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfieren. Algunas veces los anticuerpos son al menos aproximadamente un 80 % p/p y, con mayor preferencia al menos 90 o aproximadamente 95 % p/p de pureza. Sin embargo, mediante el uso de técnicas convencionales de purificación de proteínas, pueden obtenerse anticuerpos homogéneos de al menos 99 % p/p.
El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que responden las células B y/o T. Los epítopos de células B puede formarse ambos de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados de aminoácidos contiguos o aminoácidos modificados postraduccionalmente se retienen típicamente en la exposición a solventes desnaturalizantes mientras que los epítopos formados mediante el plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, pero generalmente hablando de 5 a 10 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos de determinación de la conformación espacial de epítopos incluyen, por ejemplo, la cristalografía de rayos X y la resonancia magnética nuclear bidimensional. Ver, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Edición (1996). Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden identificarse en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.
El término "fluido corporal" se refiere a aquellos fluidos de un mamífero huésped que se sospecha que contienen cantidades medibles de alfa-sinucleína o fragmentos de la misma, que incluyen específicamente sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), cerebro o cualquier otro líquido intersticial de órganos (ISF), orina, saliva, humor acuoso, y líquido peritoneal. El término "sangre" se refiere a la sangre completa, así como a al plasma sanguíneo y suero. Una enfermedad sinucleinopática significa una enfermedad caracterizada por cuerpos de Lewy, neuritas de Lewy u otros depósitos de alfa-sinucleína.
El ensayo cualitativo detecta la presencia o ausencia de un analito. Un ensayo cuantitativo detecta no solo la presencia o ausencia del analito sino que si está presente proporciona una cantidad absoluta o relativa del analito. Las composiciones o métodos que "comprenden" uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos no enumerados específicamente. Por ejemplo, una composición que comprende un péptido de alfa-sinucleína abarca tanto un péptido de alfa-sinucleína aislado y un péptido de alfa-sinucleína como un componente de una secuencia polipeptídica mayor.
El término "alfa-sinucleína total" se refiere a la alfa-sinucleína independientemente de si está fosforilada en S129. Si la alfa-sinucleína es de un ser humano, se denomina como "h-asina". Si la alfa-sinucleína es de un ratón, se denomina como "m-asina". Por tanto, la determinación de la presencia o cantidad de alfa-sinucleína total en una muestra puede reflejar la presencia o cantidad de alfa-sinucleína fosforilada en S129, alfa-sinucleína no fosforilada en S129 o ambas.
Una muestra se refiere a una alícuota de prueba que puede contener alfa-sinucleína total o pS129 o ambas. Tales muestras pueden obtenerse de pacientes, cultivos celulares o animales transgénicos, entre otras fuentes como se describe a continuación. Una muestra puede someterse a un procesamiento adicional antes del análisis, tal como la eliminación de componentes irrelevantes, o la adición de solventes, tampones, y así sucesivamente.
Descripción detallada
La invención proporciona métodos para la detección de la alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína pS129 en una muestra mediante un único ensayo, de esta manera permite un cálculo preciso de la proporción de moléculas de alfa-sinucleína fosforiladas en S129. El ensayo no requiere lavado y puede completarse con un tiempo corto de incubación. Por tanto el ensayo puede incorporarse en cribados de alto rendimiento, lo que permite ejecuciones rentables y mediante el uso de cantidades menores de material de la muestra que la ejecución de ensayos uniplex separados.
I. Anticuerpos usados en la detección
Los presentes métodos detectan alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína fosforilada en S129 (pS129) mediante el uso de un complejo donante, un primer complejo aceptor, y un segundo complejo aceptor. El complejo donante comprende un anticuerpo que se une específicamente a la alfa-sinucleína unida a un soporte y un marcador de donante. El anticuerpo se une a un epítopo diferente a partir y preferentemente no superpuesto con los epítopos unidos mediante los anticuerpos del primer y segundo complejos aceptores que son descritos a continuación. El anticuerpo se une independientemente de si la alfa-sinucleína está fosforilada en S129. Una unión de anticuerpo independientemente de la fosforilación en S129 significa un anticuerpo con constantes de asociación para la alfasinucleína con o sin fosforilación en S129 que difieren por no más de un factor de 1,5 y preferentemente
indistinguible (que no sea un error experimental insignificante). El marcador de donante se excita por la luz para activar el oxígeno y producir oxígeno singlete. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 103-108 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 4B12 es un ejemplo de tal anticuerpo en el complejo donante. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 23E8 es un ejemplo de tal anticuerpo en el complejo donante. El anticuerpo 23E8 se ha depositado como número de acceso ATCC pTA-122711. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 91-97 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 1H7 es un ejemplo de tal anticuerpo en el complejo donante. El anticuerpo 1H7 se ha depositado como número de acceso ATCC PTA-8220. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 109-120 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 5C12 es un ejemplo de tal anticuerpo en el complejo donante. El anticuerpo 5C12 se ha depositado como número de acceso ATCC pTA-9197. Opcionalmente, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 23E8 es un ejemplo de tal anticuerpo en el complejo donante. El anticuerpo 23E8 se ha depositado como número de acceso ATCC PTA-122711.
El primer complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína pS129 comprende un anticuerpo que se une preferentemente a la alfa-sinucleína pS129 unida a un soporte y un primer marcador de aceptor. Unión preferencial significa una constante de asociación al menos cinco veces mayor para la alfa-sinucleína pS129 que para la alfasinucleína no fosforilada. Opcionalmente, la constante de asociación es al menos diez veces mayor para la alfasinucleína pS129 que para la alfa-sinucleína no fosforilada. Opcionalmente, el anticuerpo carece de unión específica a la alfa-sinucleína no fosforilada. El anticuerpo 11A5 es un ejemplo de un anticuerpo adecuado en el primer complejo aceptor. El anticuerpo 11A5 se ha depositado como número de acceso ATCC PTA-8222.
El segundo complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína total comprende un anticuerpo que se une a la alfa-sinucleína independientemente de la fosforilación en S129. El anticuerpo del segundo complejo aceptor está unido a un soporte y a un segundo marcador de aceptor. El anticuerpo del segundo complejo aceptor puede ser cualquiera de varios anticuerpos que se unen a la alfa-sinucleína. El anticuerpo del segundo complejo aceptor se une a un epítopo diferente de los epítopos unidos mediante los anticuerpos del complejo donante y del primer complejo aceptor, y se une a la alfa-sinucleína independientemente de si S129 está fosforilada. Algunos de tales epítopos son distintos (es decir, no se superponen y/o se bloquean entre sí). Por ejemplo, el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de 40-55, 91-99, 103-108, 109-122 o 115-122 de la alfasinucleína y el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de 40-55, 91 99, 103-108, 109-122 o 115-122, siempre y cuando el epítopo unido específicamente por el anticuerpo del complejo donante sea distinto del epítopo unido específicamente por el anticuerpo del segundo complejo aceptor. Por ejemplo, el anticuerpo del complejo donante puede ser 23E8, 1H7, 4B12, 5C12 o LB509 y el del segundo complejo aceptor puede ser 23E8, 1H7, 4B12, 5C12 o LB509, siempre y cuando el anticuerpo del complejo donante y el anticuerpo del segundo complejo aceptor sean anticuerpos diferentes. En algunos métodos, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 115-122 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo LB509 es un ejemplo de tal anticuerpo en el segundo complejo aceptor. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 91-97 de la alfasinucleína. El anticuerpo 1H7 es un ejemplo de tal anticuerpo en el segundo complejo aceptor. El anticuerpo 1H7 se ha depositado como número de acceso ATCC PTA-8220. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 109-122 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 5C12 es un ejemplo de tal anticuerpo en el segundo complejo aceptor. Opcionalmente, el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de la alfa-sinucleína. El anticuerpo 23E8 es un ejemplo de tal anticuerpo en el segundo complejo aceptor.
Cuando se dice que un anticuerpo se une a un epítopo dentro de residuos específicos, tal como la alfa-sinucleína 40-55, por ejemplo, lo que significa es que el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que consiste de los residuos especificados (es decir, la alfa-sinucleína 40-55 en este ejemplo). Tal anticuerpo no se pone en contacto necesariamente con todos los residuos de la alfa-sinucleína 40-55. Tampoco cada sustitución o deleción de un aminoácido dentro de la alfa-sinucleína 40-55 afecta necesariamente de manera significativa la afinidad de unión. La especificidad del epítopo de un anticuerpo puede determinarse, por ejemplo, mediante la evaluación de una colección de péptidos superpuestos de aproximadamente 15 aminoácidos que abarcan la secuencia de la alfasinucleína y difieren en incrementos de un pequeño número de aminoácidos (por ejemplo, 3 aminoácidos). Los péptidos se inmovilizan dentro de los pocillos de una placa de microtitulación. La inmovilización puede efectuarse mediante la biotinilación de un extremo de los péptidos. Opcionalmente, diferentes muestras del mismo péptido pueden biotinilarse en los extremos N y C e inmovilizarse en pocillos separados con fines de comparación. Lo cual es particularmente útil para identificar los anticuerpos específicos de extremos. Un anticuerpo se criba para la unión específica a cada uno de los diversos péptidos. El epítopo se define como el que ocurre dentro de un segmento de aminoácidos que es común a todos los péptidos a los que el anticuerpo muestra unión específica. Epítopos superpuestos significan epítopos que comparten algunos pero no todos los residuos. Por ejemplo, un epítopo de los residuos 140-155 se superpone con un epítopo de los residuos 154-160.
i. Características generales de las inmunoglobulinas
Se conoce que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente de 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente de 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. (Ver en general, Fundamental Immunology, Paul, W., ed., 2a Edición Raven Press, N.Y., 1989, Cap. 7.
Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por tanto, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son lo mismo. Todas las cadenas exhiben la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas mediante tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas mediante las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N-terminal al C-terminal, tanto la cadena ligera como la pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos para cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 y 1991); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987); o Chothia y otros, Nature 342:878-883 (1989).
ii. Producción de anticuerpos no humanos
Pueden producirse anticuerpos de ratón u otros anticuerpos no humanos mediante la tecnología de hibridoma convencional. La especificidad de unión deseada puede impartirse mediante la selección del inmunógeno y/o el método de cribado. Para generar anticuerpos con una especificidad de epítopo entre los residuos 40 y 55, puede usarse un fragmento de la alfa-sinucleína que consiste de estos residuos (es decir, 40-55) un inmunógeno o un fragmento más largo que incluya estos residuos hasta la longitud completa de la alfa-sinucleína. Los anticuerpos pueden cribarse mediante la unión a péptidos superpuestos como se describió anteriormente. Para la producción de un anticuerpo que se une preferentemente a la alfa-sinucleína fosforilada en S129 (alfa-sinucleína pS129), puede usarse como inmunógeno la alfa-sinucleína pS129 de longitud completa o un fragmento de la misma que incluye el residuo 129 y residuos suficientes a ambos lados para constituir un epítopo (por ejemplo, de 3-15 residuos seguidos que incluyen el residuo 129). Los anticuerpos se criban para la unión preferencial a la alfa-sinucleína pS129 frente a la alfa-sinucleína no fosforilada.
Los anticuerpos quiméricos y humanizados tienen la misma o similar especificidad y afinidad de unión que un anticuerpo de ratón u otro no humano que proporciona el material de partida para la construcción de un anticuerpo quimérico o humanizado. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada se han construido, típicamente mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de genes de inmunoglobulinas que pertenecen a diferentes especies. Por ejemplo, puede secuenciarse el ADN que codifica los dominios variables de un anticuerpo de ratón, y pueden construirse las construcciones de ADN que codifican los dominios variables unidos a segmentos humanos constantes (C), tales como IgG1 e IgG4. Se prefiere que las construcciones se expresen entonces para producir el anticuerpo humano isotipo IgG1. En algunos métodos, el isotipo del anticuerpo es IgG1 humana. Los anticuerpos IgM también pueden usarse en algunos métodos. Por tanto un anticuerpo quimérico típico es una proteína híbrida que consiste del dominio V o de unión al antígeno de un anticuerpo de ratón y el dominio C o efector de un anticuerpo humano.
Los anticuerpos humanizados tienen residuos del marco de la región variable sustancialmente de un anticuerpo humano o consenso de anticuerpos humanos (denominado anticuerpo aceptor) y algunas y normalmente las seis regiones determinantes de complementariedad sustancial o totalmente de un anticuerpo de ratón, (denominado como la inmunoglobulina donante). Ver, Queen y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), WO 90/07861, la patente de EE.UU. núm. 5,693,762, la patente de EE.UU. núm. 5,693,761, la patente de EE.UU. núm.
5,585,089, la patente de EE.UU. núm. 5,530,101, y Winter, patente de EE.UU. núm. 5,225,539. La región o regiones constantes, si están presentes, también son sustancial o totalmente de una inmunoglobulina humana. Los dominios variables humanos se eligen normalmente a partir de anticuerpos humanos cuyas secuencias marco exhiben un alto grado de identidad de secuencia con los dominios de la región variable murina de los que se derivan las CDR. Los residuos del marco de la región variable de las cadenas pesada y ligera pueden derivarse de la misma o de diferentes secuencias de anticuerpos humanos. Las secuencias de anticuerpos humanos pueden ser las secuencias de anticuerpos humanos naturales o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos humanos. Ver Carter y otros, WO 92/22653. Se seleccionan ciertos aminoácidos de los residuos del marco de la región variable humana para la sustitución en base a su posible influencia en la conformación de la CDR y/o unión al antígeno. La investigación de tales posibles influencias es mediante el modelado, el examen de las características de los
aminoácidos en ubicaciones particulares, o la observación empírica de los efectos de la sustitución o mutagénesis de aminoácidos particulares.
Por ejemplo, cuando un aminoácido difiere entre un residuo del marco de la región variable murina y un residuo del marco de la región variable humana seleccionada, el aminoácido del marco humano debería sustituirse normalmente por el aminoácido del marco equivalente del anticuerpo de ratón cuando se espera razonablemente que el aminoácido: (1) se une directamente de forma no covalente al antígeno, (2) es adyacente a una región CDR, (3) de cualquier otra manera interactúa con una región CDR (por ejemplo, está dentro de aproximadamente 6 A de una región CDR), o (4) participa en la interfaz VL-VH.
Otros candidatos para la sustitución son los aminoácidos aceptores del marco humanos que son inusuales para una inmunoglobulina humana en esa posición. Estos aminoácidos pueden sustituirse con aminoácidos de la posición equivalente del anticuerpo donante de ratón o de las posiciones equivalentes de inmunoglobulinas humanas más típicas. Los marcos de la región variable de las inmunoglobulinas humanizadas normalmente muestran al menos un 85 % de identidad de secuencia con una secuencia del marco de la región variable humana o consenso de tales secuencias.
iii. Anticuerpos humanos
Los anticuerpos humanos contra la alfa-sinucleína se proporcionan mediante una variedad de técnicas descritas a continuación. Los anticuerpos humanos también pueden cribarse para la especificidad hacia un epítopo particular mediante el uso de solo un fragmento de alfa-sinucleína como el inmunógeno, y/o mediante el cribado de anticuerpos frente a una colección de mutantes por deleción de la alfa-sinucleína. Los anticuerpos humanos tienen preferentemente IgG1 humana de especificidad de isotipo. Varios métodos están disponibles para la producción de anticuerpos humanos, incluido el método del trioma, Oestberg y otros, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patente de EE.UU. núm. 4,634,664; y Engleman y otros, patente de EE.UU. núm. 4,634,666; mamíferos no humanos transgénicos descritos en detalle mediante, por ejemplo, Lonberg y otros, WO93/1222, la patente de EE.UU. núm.
5,877,397, la patente de EE.UU. núm.5,874,299, la patente de EE.UU. núm. 5,814,318, la patente de EE.UU. núm.
5,789,650, la patente de EE.UU. núm.5,770,429, la patente de EE.UU. núm. 5,661,016, la patente de EE.UU. núm.
5,633,425, la patente de EE.UU. núm.5,625,126, la patente de EE.UU. núm. 5,569,825, la patente de EE.UU. núm.
5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994)), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741; y métodos de presentación de fagos Ver, por ejemplo, Dower y otros, WO 91/17271 y McCafferty y otros, WO 92/01047, la patente de EE.UU. núm. 5,877,218, la patente de EE.UU. núm. 5,871,907, la patente de EE.UU. núm.
5,858,657, la patente de EE.UU. núm. 5,837,242, la patente de EE.UU. núm. 5,733,743 y la patente de EE.UU. núm.
5,565,332.
iv. Selección de la región constante
Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos pueden unirse a al menos una porción de una región constante humana. La elección de la región constante depende, en parte, de si se desea el complemento dependiente de anticuerpos y/o una toxicidad mediada por células. Por ejemplo, los isotipos IgG1 e IgG3 tienen actividad complementaria y los isotipos IgG2 e IgG4 no. La elección del isotipo también puede afectar el paso del anticuerpo al cerebro. Se prefiere el isotipo IgG1 humano. Las regiones constantes de la cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2, y Fv, o como anticuerpos de cadena simple en los que los dominios variables de las cadenas pesada y ligera están unidos a través de un espaciador.
v. Expresión de anticuerpos recombinantes
Los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos se producen típicamente mediante expresión recombinante. Las construcciones de polinucleótidos recombinantes incluyen típicamente una secuencia de control de la expresión operativamente unida a las secuencias codificantes de las cadenas de anticuerpos, que incluyen las regiones promotoras asociadas naturalmente o heterólogas. Preferentemente, las secuencias de control de la expresión son sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas. Una vez que el vector se ha incorporado en el huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones adecuadas para la expresión a alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos de reactividad cruzada.
Estos vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a ampicilina o resistencia a higromicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
E. coli es un huésped procariota particularmente útil para el clonaje de las secuencias de ADN de la presente invención. Los microbios, tales como la levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces es un
huésped de levadura preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, un origen de replicación, secuencias de terminación y similar según se desee. Los promotores típicos incluyen la 3-fosfoglicerato quinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores de levadura inducibles incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.
Las células de mamífero son un huésped preferido para expresar segmentos de nucleótidos que codifican inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas. Ver Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). Se han desarrollado en la técnica varias líneas celulares huésped capaces de secretar proteínas heterólogas intactas, e incluyen líneas celulares CHO, varias líneas celulares COS, células HeLa, células L, células de riñón de embrión humano, y líneas celulares de mieloma. Preferentemente, las células no son humanas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen y otros, Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y los sitios necesarios de procesamiento de la información, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes endógenos, citomegalovirus, SV40, adenovirus, papilomavirus bovino y similares. Ver Co y otros, J. Immunol. 148:1149 (1992).
Alternativamente, las secuencias codificantes de anticuerpos pueden incorporarse en transgenes para su introducción en el genoma de un animal transgénico y su posterior expresión en la leche del animal transgénico (ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. núm. 5,741,957, la patente de EE. UU. núm. 5,304,489, la patente de EE. UU. núm. 5,849,992). Los transgenes adecuados incluyen secuencias codificantes para cadenas ligeras y/o pesadas en unión operable con un promotor y potenciador de un gen específico de la glándula mamaria, tal como caseína o beta lactoglobulina.
Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés pueden transferirse a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, en dependencia del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio, electroporación, lipofección, biolística o transfección basada en virus pueden usarse para otros huéspedes celulares. Otros métodos usados para transformar células de mamíferos incluyen el uso de polibreno, fusión de protoplastos, liposomas, electroporación, y microinyección (ver en general, Sambrook y otros, supra). Para la producción de animales transgénicos, los transgenes pueden microinyectarse en ovocitos fertilizados, o pueden incorporarse al genoma de células madre embrionarias, y los núcleos de tales células transferirse a ovocitos enucleados.
Una vez expresados, los anticuerpos pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica, que incluyen la purificación por Hp l C, la cromatografía en columna, y la electroforesis en gel y similares (ver en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982).
II. Alfa-sinucleína
La alfa-sinucleína se identificó originalmente en cerebros humanos como la proteína precursora del componente no p-amiloide de (NAC) de las placas de la EA. (Ueda y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (23): 11282-11286 (1993)). La alfa-sinucleína, también denominada el precursor del componente n-Ap de la EA amiloide (NACP), es un péptido de 140 aminoácidos. La alfa-sinucleína de longitud completa tiene la secuencia de aminoácidos:
(SEQ ID NO: 1) MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVH GVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYE MPSEEGYQDYEPEA (Ueda y otros, Ibid.; número de acceso GenBank P37840).
A menos que se indique de cualquier otra manera, la referencia a la alfa-sinucleína significa la secuencia de aminoácidos humana natural indicada anteriormente así como las variantes alélicas y de especies naturales de la misma, que incluyen las formas completas y los fragmentos de las mismas que se encuentran en las muestras que se están analizando, así como las formas que se han sometido a una modificación postraduccional, tal como la fosforilación. Los fragmentos o variantes de alfa-sinucleína se numeran como en las secuencias ejemplificadas tal que a los residuos alineados se les asigna el mismo número.
III. Ensayos para alfa sinucleína
La alfa-sinucleína puede detectarse mediante un inmunoensayo en el que un anticuerpo de un complejo donante se une a un soporte y un marcador de donante, un anticuerpo de un primer complejo aceptor se une a un soporte y un primer marcador de aceptor, y un anticuerpo de un segundo complejo aceptor se une a un soporte y un segundo marcador de aceptor. El anticuerpo del primer complejo aceptor se une específicamente a la alfa-sinucleína pS129. Entonces si la alfa-sinucleína pS129 está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el primer complejo aceptor pueden unirse a la alfa-sinucleína pS129 al mismo tiempo mediante la formación de un primer sándwich, en el que los respectivos anticuerpos se mantienen en la proximidad suficiente para que el marcador de donante se excite por la luz para producir oxígeno singlete para activar el primer marcador de aceptor para producir
una primera señal. Los anticuerpos del complejo donante y del segundo complejo aceptor tienen diferentes especificidades entre sí (y el anticuerpo del primer complejo aceptor), por lo que ambos pueden unirse a la alfasinucleína al mismo tiempo mediante la formación de un segundo sándwich, en el que los marcadores donante y segundo aceptor se mantienen en la proximidad suficiente para que el marcador de donante se excite por la luz para producir oxígeno singlete para activar el segundo marcador de aceptor para producir una segunda señal.
Las muestras pueden ponerse en contacto con complejos en estado preformado o pueden ponerse en contacto con componentes de un complejo que se ensamblan en la muestra. Lo último puede lograrse mediante marcaje de un anticuerpo y un soporte con un par de unión, tal como biotina estreptavidina, tal que la unión de la biotina a la estreptavidina una el anticuerpo a un soporte en la muestra. En algunos métodos, los complejos aceptores se suministran preformados y el complejo donante se suministra con el anticuerpo marcado con biotina y el soporte marcado con estreptavidina tal que el complejo donante se forma en la muestra, de esta manera se pone en contacto con la muestra.
Los complejos pueden ponerse en contacto con la muestra simultánea o secuencialmente. Un orden de contacto preferido es que el primer y segundo complejos aceptores se pongan en contacto con la muestra junto con el anticuerpo del complejo donante. Después de la incubación para permitir que los respectivos anticuerpos se unan a sus dianas (si están presentes), se suministran el soporte y el marcador de donante unido del complejo donante y se realiza una incubación adicional para permitir que el anticuerpo del complejo donante se asocie con su soporte por medio del apareamiento de restos de unión, tales como estreptavidina y biotina.
Las muestras se incuban para permitir que los anticuerpos se unan a sus dianas, si están presentes. El tiempo de incubación puede variar de por ejemplo, 10 minutos a 5 horas, o 30-120 minutos. Un tiempo de incubación preferido es 1 hora. Tal incubación se realiza preferentemente en la oscuridad.
Si los complejos donantes se suministran inicialmente como componentes con el anticuerpo que se suministra primero seguido del soporte, se realiza una incubación adicional después de suministrar el soporte para que el anticuerpo se una al soporte por medio de la asociación de un par de unión tal como estreptavidina-biotina. El tiempo para esta incubación adicional puede variar de, por ejemplo, 10 minutos a 2 horas. La incubación también se conduce preferentemente en la oscuridad.
Después de la incubación, la luz se dirige a la muestra para excitar el marcador de donante para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete. Si está presente la alfa-sinucleína pS129 se genera una primera señal, y si está presente la alfa-sinucleína total, está presente una segunda señal. Las señales pueden detectarse de simultánea o secuencialmente. Preferentemente, la segunda señal se detecta antes que la primera señal. La primera señal detectada indica la presencia y/o una cantidad de la alfa-sinucleína pS129 en la muestra. Igualmente, detectó que una segunda señal indica la presencia y/o una cantidad de alfa-sinucleína total en la muestra. Tales cantidades pueden ser relativas o absolutas. Para un grupo dado de un complejo donante, un primer complejo aceptor, y un segundo complejo aceptor, se pueden adquirir curvas estándar de alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína pS129 mediante dilución en serie de muestras que contienen concentraciones conocidas de alfa-sinucleína no fosforilada y alfa-sinucleína fosforilada en S129. Las curvas estándar se ajustan en la señal medida y los valores de concentración correspondientes de alfa-sinucleína se transforman logarítmicamente mediante un programa de software.
Los marcadores de donante adecuados para el uso en los métodos anteriores son moléculas que se excitan que activan el oxígeno para producir oxígeno singlete. Los marcadores de donante ilustrativos incluyen, sin limitación, acetona, benzofenona, clorofilas, 9,10-dibromoantraceno, eosina, fulerenos, azul de metileno, las metaloporfirinas, tales como la hematoporfirina, ftalocianinas, tales como Al3+ftalocianinas, Cu2+ ftalocianinas y Zn2+ ftalocianinas, rosa Bengala y 9-tioxantona. Estos y otros marcadores de donante se describen en las patentes de EE.UU. números 5,340,716; 5,516,636; 5,536,834; 5709994; 5,763,602; 6,251,581; 6,406,667; 6,797,481; 7,033,775; 7,101,682; N. J. Turro, "Molecular Photochemistry", página 132, W. A. Benjamin Inc., Nueva York 1965; Ullman, y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 5426-5430 (1994); Strong y otros, Ann. New York Acad. Sci., 745: 297 - 320 (1994)); Martin y otros, Methods Enzymol., 186: 635-645 (1990); Yarmush y otros, Grit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Syst., 10: 197 252 (1993)); Wohrle, Chimia, 45: 307-310 (1991)); Thetford, publicación europea de patentes 0484027; Sessler y otros, SP iE, 1426: 318-329 (1991); Madison y otros, Brain Research, 522: 90-98 (1990); Polo y otros, Inorganica Chimica Acta, 192: 1-3 (1992); y Demas y otros, J. Macromol. Sci., A25: 1189-1214 (1988)).
Los marcadores de aceptor adecuados para el uso en los métodos anteriores son materiales excitables mediante el oxígeno singlete para liberar energía. Los marcadores de aceptor pueden ser reactivos de quimioluminiscencia capaces de reaccionar con oxígeno singlete tal que la energía se transfiera a un complejo aceptor en la proximidad del reactivo de quimioluminiscencia. Los marcadores de aceptor ilustrativos incluyen europio y terbio. Estos marcadores de aceptor son tintes de fluorescencia que emiten fluorescencia en un intervalo de longitud de onda de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 1000 nm.
Los soportes adecuados para el uso en los métodos anteriores incluyen, por ejemplo, perlas, membranas de nitrocelulosa, membranas de nailon y membranas de nailon derivatizado, y también partículas, tales como agarosa,
un gel a base de dextrano, varillas, partículas, microesferas, partículas magnéticas, tubos de prueba, pocilios de microtitulación, SEPHADEX™ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ, y similares. La inmovilización puede ser mediante absorción o por unión covalente. Opcionalmente, los anticuerpos pueden unirse a una molécula enlazadora, tal como biotina para unirse a una superficie.
Los solventes usados para extraer la alfa-sinucleína de muestras de tejido pueden disminuir la sensibilidad del ensayo (por ejemplo, guanidina 5 M, urea/tiourea/CHAPS, urea/tiourea, SDS al 1 %, SDS al 1 %/8 M, tampón de lisis celular). Se recomienda que tales solventes se eliminen o diluyan tal que representen menos del 1 % y preferentemente menos del 0,1 % del tampón usado para el ensayo.
Los pares preferidos de anticuerpos monoclonales para su uso en un inmunoensayo basado en perlas son un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de los residuos 103-108 de la alfa-sinucleína como el anticuerpo de un complejo donante, un anticuerpo específico para la alfa-sinucleína pS129 como el anticuerpo de un primer complejo aceptor, y un anticuerpo que se une a un epítopo dentro de los residuos 115-122 de la alfa-sinucleína como el anticuerpo del segundo complejo aceptor. El anticuerpo del segundo complejo aceptor detecta la alfa-sinucleína fosforilada en la serina 129. Tales anticuerpos también detectan fragmentos de alfa-sinucleína que incluyen los residuos 103-108 y 115-122 o 129 y cualquier residuo adicional que complete el epítopo del anticuerpo específico para pS129.
Una implementación preferida del método tiene el complejo donante que comprende, preferentemente 4B12, unido a una perla del donante por medio de estreptavidina-biotina y un marcador de donante, el primer complejo aceptor que comprende, preferentemente 11A5, unido a una perla como un soporte y europio como primer marcador de aceptor, y el segundo complejo aceptor que comprende, preferentemente LB509, unido a una perla como un soporte y terbio como segundo marcador de aceptor. La muestra se pone en contacto primero con el primer y segundo complejos seguido por la adición del complejo donante. El marcador de donante se excita a 680 nm, lo que activa el primer marcador de aceptor, europio, para producir la primera señal, si la alfa-sinucleína pS129 está presente en la muestra, y que también activa el segundo marcador de aceptor, terbio, para producir la segunda señal si la alfasinucleína total está presente en la muestra. La señal de terbio es detectada preferentemente primero mediante el filtro Resorufine/Amplex Red FP535 y luego se detecta la señal de europio por los filtros Europium 615.
IV. Aplicaciones
A. Fluidos corporales
La detección de h-asina pS129 en muestras de pacientes puede usarse para el diagnóstico y control de enfermedades caracterizadas por cuerpos de Lewy u otros depósitos de alfa-sinucleína. Las enfermedades sinucleinopáticas incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), la demencia con cuerpos de Lewy (DLB), la variante de la enfermedad de Alzheimer con cuerpos de Lewy (LBVAD), la atrofia multisistémica (MSA), la neurodegeneración con acumulación cerebral de hierro tipo 1 (NBIA-1), enfermedad de cuerpos de Lewy difusa (DLBD), y EP y enfermedad de Alzheimer (EA) combinada. Las muestras adecuadas de pacientes incluyen los fluidos corporales, tales como sangre, LCR, ISF, humor vítreo, saliva, orina y fluido peritoneal. La presencia de una enfermedad sinucleinopática se asocia generalmente con niveles significativamente alterados de alfa-sinucleína pS129 en el fluido (típicamente aumentados) cuando se comparan con los valores medios en individuos normales, es decir, individuos que no padecen una enfermedad sinucleinopática. Un nivel se altera significativamente si se aparta en al menos una y preferentemente al menos dos desviaciones estándar del nivel medio en una población de individuos normales. En algunos métodos, también se determina un nivel de alfa-sinucleína total o alfa-sinucleína no fosforilada y opcionalmente se calcula una relación entre el nivel de alfa-sinucleína fosforilada y alfa-sinucleína total o alfasinucleína no fosforilada. Tal relación generalmente cambia en la misma dirección que la alfa-sinucleína pS129 (es decir, una proporción aumentada indica la presencia o una mayor gravedad de la enfermedad).
B. Cultivo celular
El monitoreo in vitro de la alfa-sinucleína pS129 en medio de cultivo acondicionado de un cultivo celular adecuado puede usarse para analizar el procesamiento, fosforilación y secreción de la alfa-sinucleína pS129 y el efecto de agentes potenciales sobre la misma. El monitoreo de la fosforilación de la alfa-sinucleína proporciona un medio para identificar las fosforilasas responsables de la misma. Los agentes que inhiben el procesamiento y/o la secreción de la alfa-sinucleína pS129 tienen actividad farmacológica potencialmente útil para la profilaxis de la enfermedad sinucleinopática. Típicamente, la actividad inhibidora se determina mediante la comparación de los niveles de alfasinucleína pS129 en el medio a partir de una célula tratada con un agente de prueba frente a una célula de control comparable no tratada con el agente.
Las células adecuadas incluyen células transfectadas con ácidos nucleicos que codifican alfa-sinucleína, preferentemente, alfa-sinucleína humana y células que expresan naturalmente alfa-sinucleína, también preferentemente humana. La alfa-sinucleína en las células transfectadas puede llevar una mutación, tal como S129A, S129D, A53T y A20P. Las células incluyen las células PeakS, células SY5Y, células corticales humanas, líneas celulares de neuroglioma humano, líneas celulares de neuroblastoma, células HeLa humanas, células
endoteliales humanas primarias (por ejemplo, células HUVEC), fibroblastos o linfoblastos humanos primarios, células cerebrales mixtas primarias (incluidas neuronas, astrocitos y neuroglia), células de ovario de hámster chino (CHO), y similares. Las células SY5Y son células neuronales que pueden inducirse a diferenciarse mediante el tratamiento con ácido retinoico/BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro). Se prefieren las células transfectadas que expresan la alfa-sinucleína pS129 a niveles mayores que las células humanas normales.
También pueden cribarse bibliotecas aleatorias de péptidos u otros compuestos por idoneidad. Pueden producirse bibliotecas combinatorias para muchos tipos de compuestos que pueden sintetizarse de manera paso a paso. Tales compuestos incluyen polipéptidos, miméticos de giro beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas y oligocarbamatos. Pueden construirse grandes bibliotecas combinatorias de los compuestos mediante el método de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Farmacopea, WO 95/35503 y Scripps, WO 95/30642. Las bibliotecas de péptidos pueden generarse también mediante métodos de presentación de fagos. Ver, por ejemplo, Devlin, WO 91/18980. Los compuestos de prueba se administran típicamente al medio de cultivo en una concentración en el intervalo de aproximadamente 1 nM a 1 mM, normalmente de aproximadamente 10 pM a 1 mM. Los compuestos de prueba que pueden inhibir la formación, el procesamiento o la secreción de alfa-sinucleína son candidatos para determinaciones adicionales en animales transgénicos y eventualmente para ensayos clínicos en humanos.
C. Animales transgénicos
Los anticuerpos de la invención y los ensayos para detectarlos también pueden usarse para monitorear la producción, fosforilación y procesamiento de alfa-sinucleína pS129 en modelos animales transgénicos de enfermedad. Los modelos animales transgénicos de la enfermedad con cuerpos de Lewy son descritos por Masliah y otros Science 287:1265-1269 (2000); Masliah y otros, PNAS USA 98:12245-12250 (2001). La alfa sinucleína puede analizarse en fluidos corporales como se describe anteriormente para muestras humanas, o en muestras de tejido tomadas directamente del animal (ver copendiente 60/423,012, presentada el 1 de noviembre de 2002,. Las muestras de tejido pueden clasificarse como cuerpos de Lewy, la fracción particulada y fracciones solubles. Pueden realizarse ensayos sencillos como para el cultivo celular para cribar agentes con la capacidad para inhibir la formación de la alfa-sinucleína pS129. Típicamente, la actividad inhibitoria se determina mediante la comparación del nivel de alfa-sinucleína pS129 del mismo en un fluido corporal particular o fracción a partir de una muestra de tejido de un animal transgénico tratado con el agente en comparación con el nivel de alfa-sinucleína pS129 en el mismo fluido corporal o fracción en un animal transgénico de control no tratado con el agente. La actividad inhibitoria se muestra mediante niveles reducidos de alfa-sinucleína pS129 del mismo en el animal tratado con respecto al control.
Las muestras de tejido del cerebro de pacientes humanos pueden someterse a análisis similares. Sin embargo, como la obtención de muestras del cerebro de un paciente es un procedimiento indeseablemente invasivo, tales análisis normalmente se limitan a los cadáveres.
V. Kits
La invención proporciona además kits que incluyen pares de captura y reporteros de uno o más anticuerpos de la invención. En algunos kits el anticuerpo de captura se preinmoviliza a una fase sólida, tal como una placa de microtitulación. Opcionalmente, también se incluyen en los kits reactivos de marcaje, tales como un anticuerpo antiidiotípico. El marcaje también puede incluir un gráfico u otro régimen de correspondencia que correlacione los niveles del marcador medido con los niveles de anticuerpos para la alfa-sinucleína. El término marcaje se refiere a cualquier material escrito o grabado que se adjunte a, o de cualquier otra manera acompañe un kit en cualquier momento durante su fabricación, transporte, venta o uso. Por ejemplo, el término marcaje abarca folletos y folletos publicitarios, materiales de empaque, instrucciones, casetes de audio o video, discos de computadora, así como escritura impresa directamente en los kits. Los kits pueden venderse, por ejemplo, como reactivos de investigación o diagnóstico.
Aunque la invención se ha descrito en detalle con fines de claro entendimiento, será obvio que ciertas modificaciones pueden practicarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. A menos que sea evidente de cualquier otra manera por el contexto, cualquier modalidad, aspecto, característica o etapa puede usarse en combinación con cualquier otro. Si el contenido asociado con una cita o un número de acceso similar cambia con el tiempo, se pretende que la versión existente en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud, la fecha de presentación efectiva sea la fecha de presentación real o la fecha de presentación anterior de una solicitud de prioridad que revele el número de acceso o citación.
EJEMPLOS
I. Selección de pares de anticuerpos para los ensayos específicos de alfa-sinucleína humana total y pS129
Se evaluó la relación de la señal de fondo (S/B) para pares de anticuerpos hacia la detección de tanto la proteína hasina total como la h-asina pS129 (Tabla 2; sección a la izquierda). Se incluyeron cuatro anticuerpos específicos humanos evaluados en el experimento WB incluidos en la etapa de desarrollo del ensayo de h-asina total. Los resultados sugirieron que el anticuerpo 4B12 funcionó mejor cuando se conjugó con biotina y se evaluó contra los anticuerpos syn211 y LB509 acoplados a las perlas aceptoras de europio (cifras en negrita en la Tabla 2). En particular, el apareamiento de los mismos anticuerpos en la orientación opuesta no dio la misma lectura robusta pero fue de 2-5 veces menor en la relación de señal de fondo. Además, como los epítopos usados para generar los anticuerpos 4B12 y syn 204 tienen residuos de aminoácidos superpuestos (especialmente en la posición 103 y 108; ver Tabla 1), cuando estos dos anticuerpos se aparean, no hubo señal detectable.
Los tres anticuerpos específicos para la asina pS 129 se evaluaron después de conjugarlos con las perlas aceptoras de europio y aparearlos con 4B12 biotinilado y syn204 (Tabla 2; sección a la derecha). Esta prueba reveló que la combinación de anticuerpos 4B12 - 11A5 que representa los epítopos 103-108 y 124-134 respectivamente fue muy superior (relación de la señal de fondo más de 6 veces mayor) a otros pares y por tanto se seleccionó para un desarrollo posterior.
Tabla 1. Anticuerpos utilizados para establecer los ensayos dúplex
Tabla 2. Relaciones de la señal de fondo para el ensayo de h-asina total y pS129
II. Optimización de las condiciones del ensayo para la detección uniplex de alfa-sinucleína humana total o alfasinucleína humana pS129
En el caso del ensayo de h-asina total, el análisis para ambos anticuerpos LB509 y syn211 conjugados con las perlas aceptoras se realizó mediante el uso del anticuerpo 4B12 biotinilado a concentraciones entre 10 pM y 10 nM (Figura 1A). A una concentración de 1,0 nM de 4B12 biotinilado ambos pares de anticuerpos alcanzaron su señal máxima. Como la señal del par 4B12 y LB509 biotinilado acoplado a las perlas aceptoras de europio fue tres veces mayor en todas las concentraciones evaluadas, este par se seleccionó como la mejor condición para la detección de h-asina total.
Para evaluar las características del ensayo de dosis-respuesta para la alfa-sinucleína humana total (h-asina), se estableció una curva estándar mediante el uso de la proteína h-asina recombinante marcada con GST o la proteína asina recombinante de ratón (m-asina) añadida en el lisado de cerebro de rata tipo silvestre (Figura 1B). Las curvas estándar para la h-asina presentaron una típica curva sigmoidea, mientras que la señal para la m-asina no excedió el límite de detección inferior (LDL). El rango dinámico lineal del ensayo específico de la h-asina se encuentra entre 0,1 y 10 ng/ml de concentración en el pocillo, mientras que el límite de detección estimado es de aproximadamente 2,0 pg/ml e indica una sensibilidad 3 veces mayor que lo que han informado ensayos de asina anteriores (Hong y otros Brain 133: 713-726(2010); Emmanouilidou y otros PLoS ONE. (2001); Bidinosti y otros J Biol Chem.
287(40):33691-705(2012)). Las variaciones intra e interensayos se calcularon entre cuatro curvas estándar individuales mediante el uso de seis concentraciones en esas curvas para validar la precisión y la variación entre las ejecuciones de los ensayos (Figuras 1C,D) y 22 de las 24 mediciones estaban por debajo del 8,7 %, con dos mediciones (0,1 ng/ml) al 14,5 % y al 19,5 % (Figuras 1C,D).
El análisis de punto de gancho para el ensayo de h-asina pS129 mostró que 1,0 nM de anticuerpo biotinilado proporciona la señal más alta para el par de anticuerpos 4B12 - 11A5 (Figura 2A). Las características del ensayo dosis-respuesta de h-asina pS129 se analizaron estableciendo curvas estándar mediante el uso de h-asina pS129 y la proteína h-asina S129A recombinante añadida en el lisado de cerebro de un ratón con desactivación génica para la asina (Figura 2B). La curva estándar para la h-asina pS129 presentó una forma sigmoidea típica mientras que la señal para la h-asina S129A entre concentraciones de 1 pg/ml y 100 ng/ml permaneció por debajo del LDL. Para asegurar cálculos precisos para la sensibilidad y el rango dinámico lineal del ensayo de h-asina pS129, se midió la cantidad de h-asina fosforilada mediante el uso de geles de enfoque isoeléctrico y se determinó que el 28 % de la proteína recombinante estándar sería fosforilada (Figura 3). Todos los valores informados para la h-asina pS129 se han ajustado mediante el uso de este factor. El rango dinámico lineal del ensayo de h-asina pS129 para la proteína h-asina pS129 está entre 8 pg/ml y 3 ng/ml de concentración en el pocillo con un LDL de 0,3 pg/ml, que es aproximadamente 30 veces menor que el ensayo de la asina pS129 anteriormente descrito (Wang y otros Science Translation Medicine 4:121(2012)). Las variaciones intra e interensayos se calcularon de nuevo mediante el uso de seis concentraciones diferentes en cuatro curvas estándar ejecutadas individualmente y fueron menores del 8,7 % para todas las mediciones (Figura 2C, D).
III. Evaluación de la viabilidad y el rendimiento del ensayo dúplex para la cuantificación de alfa-sinucleína humana total y pS129 en un solo pocillo
El desafío de diseñar un método de detección dúplex en un ensayo cuantitativo basado en anticuerpo para una única proteína diana en dos confirmaciones, como opuesto de uno donde se miden dos proteínas diana separadas en el mismo pocillo, es doble: Primero, espera que una fracción de la proteína diana se marque con dos anticuerpos unidos a perlas aceptoras y un tercer complejo anticuerpo-biotina para anclar la perla del donante a la misma diana. Por tanto, las etapas de validación del ensayo tienen que incluir la evaluación del impedimento estérico en el sitio de unión del anticuerpo acoplado a la perla del aceptor mediante el otro. Segundo, como las dos perlas aceptoras (reportero) se basan en la misma perla del donante (activador) pero solo se lee una de ellas a la vez, es necesario considerar la secuencia de adquisición de la señal.
Con el fin de diseñar el ensayo dúplex para la h-asina y sus especies pS129 modificadas postraduccionalmente, se evaluaron las características de las perlas aceptoras de terbio en comparación con las perlas aceptoras de europio para los anticuerpos LB509 y 11A5. Las características de señal de ambas perlas aceptoras se evaluaron mediante la combinación del anticuerpo 4B12 biotinilado con el anticuerpo LB509 acoplado a perlas aceptoras de europio o terbio por separado y mediante el uso de la proteína purificada en una curva de dosis-respuesta. La señal global de terbio fue aproximadamente 100 veces menor en todas las mediciones incluidos los blancos en comparación con la señal de europio bajo condiciones idénticas. Como la señal de fondo en este ensayo también fue significativamente menor, la relación S/B de las curvas estándar obtenidas mediante el uso de perlas de terbio se afectó solo marginalmente en comparación con las perlas aceptores de europio (Figura 4A). Se usó la misma configuración para el par de anticuerpo 4B12 y 11A5 (Figura 4B). En el último caso la diferencia en S/B entre las perlas aceptores de europio y terbio fue más pronunciada. Debido a este fenómeno y al hecho de que siempre habrá una mayor cantidad de la h-asina total en comparación con la h-asina pS129, se eligieron las perlas aceptoras de terbio acopladas a LB509 y conjugadas el anticuerpo 11A5 a las perlas aceptoras de europio. Por tanto, fue más preferible la lectura de la señal de Terbio primero seguida de la señal de Europio.
Los epítopos de los dos anticuerpos acoplados a perlas aceptoras en el ensayo anterior fueron muy parecidos (ver la Tabla 1 para los detalles). Por lo tanto, se evaluó si el impedimento estérico afectó los resultados mediante la comparación de la intensidad de la señal de la condición uniplex y dúplex para cada anticuerpo acoplado a la perla del aceptor. Cuando la señal es la misma para ambas condiciones, no se produce impedimento cuando ambos anticuerpos se unen al analito (Figura 5). Cuando la señal en la condición dúplex es menor que en la condición uniplex, el otro complejo de anticuerpo acoplado a la perla del aceptor impide estéricamente la unión (Figura 5). La señal obtenida a partir del LB509 (LB509-Tb) acoplado a la perla del aceptor de terbio [Figura 4C; donde la señal detectada desde el filtro de terbio (Resorufine/Amplex Red FP535) para ambas condiciones se presenta en la izquierda, mientras que la señal detectada por medio del filtro de europio (Europio 615 nm) de los mismos pocillos se muestra en la derecha] no se afectó debido a presencia de la perla del aceptor de europio acoplado a 11A5 (11A5
Claims (16)
- REIVINDICACIONESi. Un método in vitro de detección simultánea de alfa-sinucleína total y alfa-sinucleína fosforilada en S129 (pS129), que comprende:a) poner en contacto una muestra con:(i) un complejo donante que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la alfa-sinucleína unida a un soporte y a un marcador de donante, que se excita por la luz para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete;(ii) un primer complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína pS129 que comprende un anticuerpo que se une a alfa-sinucleína pS129, en donde el anticuerpo tiene una constante de asociación al menos cinco veces mayor para la alfa-sinucleína pS129 que para la alfa-sinucleína no fosforilada, unido a un soporte y a un primer marcador de aceptor; en donde si la alfa-sinucleína pS129 está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el primer complejo aceptor se unen a la alfa-sinucleína pS129 mediante la formación de un primer sándwich en donde el marcador de donante se excita por la luz para producir oxígeno singlete para activar el primer marcador de aceptor para producir una primera señal;(iii) un segundo complejo aceptor para la detección de alfa-sinucleína total que comprende un anticuerpo que se une a la alfa-sinucleína independientemente de la fosforilación de S129, el anticuerpo está unido a un soporte y a un segundo marcador de aceptor; en donde si la alfa-sinucleína total está presente en la muestra, los anticuerpos del complejo donante y el segundo complejo aceptor se unen a la alfa-sinucleína total mediante la formación de un segundo sándwich en donde el marcador de donante se excita por la luz para producir oxígeno singlete para activar el segundo marcador de aceptor para producir una segunda señal; (b) excitar el marcador de donante con una luz para activar el oxígeno para producir oxígeno singlete, de esta manera se produce la primera señal si está presente la alfa-sinucleína pS129 y la segunda señal si está presente la alfa-sinucleína total; y(c) detectar la primera y segunda señales, si hay alguna, para indicar la presencia de alfa-sinucleína pS129 y alfa sinucleína total, respectivamente.
- 2. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda señal se detecta antes que la primera señal.
- 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el contacto de la muestra con el complejo donante comprende el contacto de la muestra con el soporte unido al marcador de donante del complejo donante, en donde el soporte se une además a estreptavidina y al anticuerpo del complejo donante, en donde el anticuerpo se une a la biotina, en donde la estreptavidina se une a la biotina mediante la formación del complejo donante en la muestra para de esta manera ponerse en contacto con la muestra.
- 4. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra se pone en contacto con el primer y segundo complejos aceptores y el anticuerpo del complejo donante unido a biotina, se incuba la muestra y luego se pone en contacto la muestra con el soporte unido además a estreptavidina, en donde la biotina se une a la biotina mediante la formación del complejo donante en la muestra para de esta manera ponerse en contacto con la muestra.
- 5. El método de cualquier reivindicación anterior, realizado cualitativamente; o realizado cuantitativamente en el que la primera señal indica una cantidad de alfa-sinucleína pS129 y la segunda señal indica una cantidad de alfa-sinucleína total.
- 6. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el complejo donante, el primer complejo aceptor y el segundo complejo aceptor se ponen en contacto con la muestra simultáneamente; o en donde el primer y segundo complejos aceptores se ponen en contacto con la muestra antes que el complejo donante.
- 7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo del primer complejo aceptor se une específicamente a un epítopo de sinucleína fosforilada dentro de los residuos 123-134, en donde opcionalmente el anticuerpo del primer complejo aceptor es 11A5 (número de acceso ATCC PTA-8222).
- 8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde:el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 103-108 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo del complejo donante es 4B12; oen donde el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40 55 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo del complejo donante es 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711); oen donde el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 91 97 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo es 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220); oen donde el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 109-120 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo es 5C12 (número de acceso ATCC PTA-9197); oen donde el anticuerpo del complejo donante se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 115-122 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo es LB509; oen donde el anticuerpo del complejo donante es 4B12, LB509, 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220), 5C12 (número de acceso ATCC Pt A-9197) o 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711).
- 9. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde:el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 115 122 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509; o en donde el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 91-97 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220); oen donde el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 109-122 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 5C12 (número de acceso ATCC PTA-9197); oen donde el anticuerpo del segundo complejo aceptor se une específicamente a un epítopo dentro de los residuos 40-55 de la alfa-sinucleína, en donde opcionalmente el anticuerpo es 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711); oen donde el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 4B12, LB509, 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220), 5C12 (número de acceso ATCC p Ta -9197) o 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711).
- 10. El método de la reivindicación 9, en donde el anticuerpo del complejo donante es 4B12 y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509, 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220), 5C12 (número de acceso ATCC PTA-9197) o 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711); oen donde el anticuerpo del complejo donante es 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711) y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509, 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220), 5C12 (número de acceso ATCC PTA-9197) o 4B12; oen donde el anticuerpo del complejo donante es 5C12 (número de acceso ATCC PTA-9197) y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es 23E8 (número de acceso ATCC PTA-122711) o 1H7 (número de acceso ATCC PTA-8220).
- 11. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el anticuerpo del complejo donante es 4B12, el anticuerpo del primer complejo aceptor es 11A5 (número de acceso ATCC PTA-8222) y el anticuerpo del segundo complejo aceptor es LB509.
- 12. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde los soportes del complejo donante, el primer complejo aceptor y el segundo complejo aceptor son perlas.
- 13. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el primer marcador de aceptor comprende europio, terbio, samario o gadolinio; y/o en donde el segundo marcador de aceptor comprende europio, terbio, samario o gadolinio;en donde opcionalmente el primer marcador de aceptor comprende europio y el segundo marcador de aceptor comprende terbio.
- 14. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde(i) la muestra es un tejido de un ser humano; o(ii) la muestra es de un ratón transgénico con un transgén que expresa la alfa-sinucleína humana.
- 15. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra es un fluido corporal, opcionalmente líquido cefalorraquídeo (LCR) de un ser humano.
- 16. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la muestra es un homogeneizado de cerebro, piel u otro órgano de un ser humano, un animal de tipo silvestre o transgénico; oen donde la muestra es un medio que se usa para cultivar células, en donde opcionalmente las células expresan la alfa-sinucleína humana recombinante.
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