ES2883347T3

ES2883347T3 - Composiciones y procedimientos para atenuar y prevenir la inflamación intestinal debida a la presencia de antígenos alimentarios peptídicos en un intestino

Info

Publication number: ES2883347T3
Application number: ES15809878T
Authority: ES
Inventors: David Schriemer; Martial Rey
Original assignee: Codexis Inc
Current assignee: Codexis Inc
Priority date: 2014-06-16
Filing date: 2015-06-16
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2035-06-16
Also published as: JP6829077B2; CN106794228A; JP2021073236A; US10960059B2; US11723960B2; EP3943104A1; CN106794228B; WO2015192211A9; SI3220946T1; EP3220946A4; US20210220451A1; EP3220946B1; EP3220946A1; US20160022785A1; DK3220946T3; WO2015192211A1; JP2017519763A; CN113827708A; US20190022194A1; JP7369893B2

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende neprosina o una variante de la misma con al menos 85 % de homología de secuencia con la misma, y opcionalmente una enzima seleccionada del grupo que consiste en nepentesina I, nepentesina II, variantes de las mismas con al menos 85 % de homología de secuencia con las mismas y mezclas de las mismas, para uso en la atenuación o prevención de la inflamación intestinal debida a la presencia de antígenos alimentarios peptídicos en un intestino de un paciente.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para atenuar y prevenir la inflamación intestinal debida a la presencia de antígenos alimentarios peptídicos en un intestino

CAMPO DE LA INVENCIÓN

En esta memoria se proporcionan composiciones para uso en el tratamiento de la intolerancia al gluten y afecciones relacionadas, tales como enfermedad celíaca o sensibilidad al gluten. Se proporcionan además en esta memoria composiciones y procedimientos para atenuar o impedir la infiltración de linfocitos intraepiteliales (IEL) inducida por la presencia de antígenos alimentarios proteicos en el intestino. Tales antígenos alimentarios proteicos incluyen alimentos ricos en prolina difíciles de digerir, tales como las proteínas encontradas en el trigo, la cebada, el centeno, etc., que contienen gluten. El gluten, en particular, se hidroliza parcialmente en el tracto gastrointestinal y puede conducir a infiltración de IEL y producción de anticuerpos que incluyen IgA endomisial y transglutaminasa antitisular. Las composiciones de esta invención proporcionan cantidades reducidas de tales antígenos alimentarios proteicos en el intestino, lo que a su vez reduce la cantidad de infiltración de IEL del intestino.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Varias enfermedades están mediadas por reacciones a proteínas alimentarias antigénicas en individuos susceptibles. Por ejemplo, la ingestión de trigo, cebada y centeno, que contienen proteínas alimentarias antigénicas (p. ej., gluten), puede provocar respuestas autoinmunitarias anómalas, tales como enfermedad celíaca, alergia al trigo y dermatitis herpetiforme, en individuos intolerantes al gluten. El gluten es una mezcla de moléculas proteicas de prolamina y glutenina ricas en glutamina y prolina.

La enfermedad celíaca es un trastorno autoinmunitario que afecta al intestino delgado. La mayoría de los individuos que tienen las respuestas autoinmunitarias anómalas características de la enfermedad celíaca expresan las moléculas de antígeno leucocitario humano (HLA) DQ2 o DQ8. Los síntomas de la enfermedad son provocados por una reacción a las proteínas del gluten, y también pueden incluir otras proteínas de almacenamiento en los productos de grano consumidos (p. ej., serpinas, purininas). Clínicamente, la enfermedad es detectable en parte mediante la cuantificación de anticuerpos específicos para el gluten y la transglutaminasa tisular (tTG). Las respuestas autoinmunitarias dan como resultado el desarrollo de atrofia de las vellosidades de la mucosa del intestino delgado con hiperplasia de las criptas e inflamación de la mucosa. Los síntomas de la enfermedad celíaca pueden variar de un individuo a otro y pueden incluir uno o más de fatiga, diarrea crónica, estreñimiento, mala absorción de nutrientes, pérdida de peso, distensión abdominal, anemia, así como un riesgo sustancialmente mayor de desarrollar osteoporosis y neoplasias malignas intestinales (linfoma y carcinoma).

La diabetes de tipo I es un factor de riesgo para la enfermedad celíaca. El autismo también está asociado a la enfermedad celíaca, y una dieta exenta de gluten puede ayudar a aliviar algunos síntomas del autismo. Similarmente, se cree que algunas personas con trastorno por déficit de atención e hiperactividad presentan menos síntomas cuando se elimina el gluten de sus dietas. Otras afecciones que pueden beneficiarse de la eliminación del gluten en la dieta incluyen la artritis reumatoide y la fibromialgia. El documento WO 2012/006384 describe las enzimas degradadoras de gluten encontradas en bacterias de la especie Rothia que son capaces de romper los enlaces peptídicos en péptidos que contienen -XPQ-, -QQP-, -PPF-, -LYP- y/o -PFP-. Stepniak y col. (2006) American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology, American Physiological Society, US 291 (4), G621-G629 describen la degradación del gluten muy eficiente con una prolil endoproteasa recientemente identificada y también describen las implicaciones para la enfermedad celíaca. La patente US 2005/249719 describe la administración de una dosis efectiva de glutenasa a un paciente celíaco o con dermatitis herpetiforme con el fin de reducir los niveles de oligopéptidos tóxicos del gluten atenuando o eliminando los efectos perjudiciales del gluten. Kadek y col. (2013) describen la expresión y caracterización de la proteasa aspártica vegetal nepentesina-1 de Nepenthes gracilis.La patente US 2014/140980 describe composiciones, alimentos que comprenden nepentesina o un derivado de la misma y procedimientos para usar nepentesina o un derivado de la misma para modular la intolerancia al gluten y afecciones relacionadas, tales como enfermedad celíaca.Freeman (2008) Canadian Journal of Gastroenterology (2008) describe las ventajas y dificultades del diagnóstico de la enfermedad celíaca del adulto.

El tratamiento para la intolerancia al gluten, especialmente la enfermedad celíaca, implica habitualmente una dieta estricta exenta de gluten de por vida. Sin embargo, una dieta exenta de gluten es inapropiada, restrictiva y el gluten es difícil de evitar. Por lo tanto, se necesitan tratamientos alternativos efectivos para la intolerancia al gluten y la enfermedad celíaca.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al descubrimiento de que la administración de una composición farmacéutica que comprende una o más enzimas de Nepenthes como se describen en esta memoria, en combinación con una proteína alimentaria potencialmente antigénica, da como resultado una disminución en la respuesta inmunitaria a la proteína alimentaria antigénica después de su ingestión, que incluye una disminución en la infiltración y/o producción de linfocitos intraepiteliales en el intestino. Los linfocitos intraepiteliales son linfocitos T que están intercalados entre las células epiteliales del intestino grueso y delgado. Un recuento de linfocitos T aumentado es un indicador precoz de inflamación y está potencialmente asociado a intolerancia al gluten, lo que incluye la enfermedad celíaca.

Se cree que las propiedades tóxicas de las proteínas del gluten (p. ej., gliadinas y gluteninas) se deben en gran medida a los péptidos ricos en prolina y glutamina que se producen durante la degradación incompleta de las proteínas por las enzimas digestivas humanas (entre otras, la pepsina). Las endoproteasas gástricas y pancreáticas son incapaces de escindir estos subproductos peptídicos tóxicos o inmunogénicos de la degradación incompleta, al menos en parte debido al hecho de que tales enzimas carecen de especificidad por la prolina y/o la glutamina. Se cree que los péptidos provocan numerosos síntomas intestinales en individuos sensibles, que incluyen linfocitosis intraepitelial, atrofia de las vellosidades y/o inflamación. Otras proteínas presentes en el trigo también pueden estar implicadas en la respuesta autoinmunitaria, entre otras, las serpinas, las purininas, los inhibidores de alfa-amilasas/proteasas, las globulinas y las farininas.

Los linfocitos T son unos de los primeros en responder al ataque antigénico (es decir, la presencia de péptidos alimentarios tóxicos) en un individuo sensible. Los linfocitos T reaccionan rápidamente al ataque del antígeno y provocan inflamación y, en algunos casos, degradación del intestino. Por tanto, una reducción de los linfocitos T en el intestino indica una respuesta inmunitaria disminuida y es un indicador potencial de síntomas reducidos o eliminados asociados al consumo de alimentos inmunogénicos (p. ej., gluten) en individuos sensibles.

Sin ceñirnos a la teoría, se cree que al poner en contacto el gluten (u otra proteína antigénica) con una composición farmacéutica como se describe en esta memoria, la proteína se descompone en fragmentos polipeptídicos pequeños que reducen o eliminan una respuesta inmunitaria (es decir, no son tóxicos o son menos tóxicos).

Se contempla que una composición farmacéutica como se describe en esta memoria puede usarse para degradar proteínas de la dieta, particularmente proteínas ricas en prolina y/o glutamina, que no son degradadas con efectividad por las enzimas del tracto digestivo. Se contempla además que tal degradación aumentaría la absorción de las proteínas y/o disminuiría la inmunogenicidad. Tal resultado puede tener efectos beneficiosos sobre los síntomas de las enfermedades y los trastornos intestinales (p. ej., enfermedad celíaca, intolerancia al gluten, síndrome del intestino irritable, colitis, enfermedad de Crohn, alergias alimentarias y similares). En una realización, la administración de la composición farmacéutica mejora la absorción de nutrientes.

Las secreciones de la jarra de Nepenthes, una planta carnívora conocida habitualmente como copas de mono en las regiones tropicales, incluyen varias proteasas. El fluido de la jarra de Nepenthes concentrado tiene especificidad alta por los péptidos del gluten ricos en prolina y glutamina. Las solicitudes de patente de los Estados Unidos de n.° de publicación 2014/0186330 y 2014/0140980 describen la actividad y especificidad del fluido de la jarra de Nepenthes concentrado y las enzimas de Nepenthes recombinantes. El fluido de la jarra es ácido y las enzimas contenidas en el mismo generalmente son más activas a pH ácido.

La nepentesina (EC 3.4.23.12) es una proteasa aspártica que se puede aislar o concentrar a partir de las secreciones de la jarra de Nepenthes, así como de un abanico de otras fuentes vegetales. Tokés y col., Digestive Enzymes Secreted by the Carnivorous Plant Nepenthes macferlanei L., Planta (Berl.) 119, 39-46 (1974). Se ha encontrado que la actividad de la nepentesina es superior a la de la pepsina (EC 3.4.23.1), una enzima presente en el estómago de los seres humanos que es parcialmente responsable de la degradación de las proteínas alimentarias en péptidos. La nepentesina tiene dos isotipos conocidos: nepentesina I (que se sabe que tiene dos variantes: nepentesina la y nepentesina Ib) y nepentesina II.

En un aspecto de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende neprosina o una variante de la misma con al menos 85 % de homología de secuencia con la misma, y opcionalmente una enzima seleccionada del grupo que consiste en nepentesina I, nepentesina II, variantes de las mismas con al menos 85 % de homología de secuencia con las mismas y mezclas de las mismas para uso en la atenuación o prevención de la inflamación intestinal debida a la presencia de antígenos alimentarios peptídicos en un intestino de un paciente. En un aspecto adicional de la invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende neprosina y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde la neprosina es una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos 90 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1.

La prolil endopeptidasa, neprosina, posee una actividad proteolítica alta para escindir proteínas y oligopéptidos ricos en prolina (tales como proteínas del gluten). La neprosina se puede aislar o concentrar a partir de las secreciones de la jarra de Nepenthes, es activa en un amplio intervalo de pH y es especialmente activa a pH bajo (p. ej., de aproximadamente 3 a 5). La secuencia proteica de la neprosina no es homóloga a ninguna otra proteína conocida en las bases de datos genómicas. La neprosina puede escindir con efectividad los péptidos sobre el extremo carboxílico (C) de la prolina. Esta escisión parece ser muy específica.

La neprosina, la nepentesina I y la nepentesina II, solas o en combinación, pueden escindir los péptidos alimentarios tóxicos en péptidos no tóxicos más pequeños. Debido a que las enzimas son activas en un amplio intervalo de pH ácidos, la digestión por las enzimas se puede iniciar en el entorno ácido del estómago.

Esta invención se basa además en el descubrimiento de que tales composiciones enzimáticas son capaces de degradar antígenos alimentarios proteicos hasta un nivel en el que la respuesta inmunitaria en el intestino, como se mide mediante la infiltración de IEL, se atenúa o elimina cuando se usan en combinación con alimentos La infiltración de IEL debida a la presencia de uno o más antígenos alimentarios peptídicos es un indicador biológico precoz de sensibilidad a antígenos alimentarios (p. ej., gluten). Por consiguiente, en un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir una respuesta inmunitaria a antígenos alimentarios proteicos en el intestino de un mamífero, este procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas. En una realización, la cantidad de la composición farmacéutica es efectiva para atenuar o impedir la infiltración de IEL en el intestino debida a la presencia del uno o más antígenos alimentarios peptídicos. En una realización, la infiltración de IEL es debida a la digestión incompleta de una proteína alimentaria potencialmente antigénica por las enzimas gástricas y/o intestinales endógenas. En una realización, la composición se administra al mamífero antes de la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero con la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero después de la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero independientemente del consumo de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es gluten. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es una o más proteínas del trigo.

En una realización, la inflamación intestinal está caracterizada por infiltración y/o proliferación de IEL en el intestino Por consiguiente, en un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la inflamación intestinal debida a la presencia de uno o más antígenos alimentarios peptídicos en el intestino de un mamífero, este procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas. En una realización, la cantidad de la composición farmacéutica es efectiva para atenuar o impedir la inflamación intestinal debida a la presencia del uno o más antígenos alimentarios peptídicos. En una realización, la inflamación intestinal es debida a la digestión incompleta de una proteína alimentaria potencialmente antigénica por las enzimas gástricas y/o intestinales endógenas. En una realización, la composición se administra al mamífero antes de la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero con la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero después de la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero independientemente del consumo de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es gluten. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es una o más proteínas del trigo.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la linfocitosis intraepitelial debida a la presencia de uno o más antígenos alimentarios peptídicos en un intestino de un mamífero, este procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas. En una realización, la cantidad de la composición farmacéutica es efectiva para inhibir la linfocitosis intraepitelial en el intestino. En una realización, la composición se administra al mamífero antes de la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero con la ingestión de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la composición se administra al mamífero después de la ingestión de un alimento potencialmente antigénico. En una realización, la composición se administra al mamífero independientemente del consumo de un alimento o una proteína potencialmente antigénicos. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es gluten. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es una o más proteínas del trigo.

En una realización, la cantidad efectiva de la composición farmacéutica es de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 1 g. En una realización, la cantidad efectiva de la composición farmacéutica depende de la cantidad de proteína potencialmente antigénica consumida.

En una realización, esta descripción se refiere a tratar y/o mejorar al menos un síntoma asociado a una respuesta inmunitaria a la presencia de gluten u otra proteína antigénica en el intestino de un paciente. Los síntomas incluyen, sin limitación, “mente confusa”, depresión, ansiedad, comportamiento similar al TDAH, dolor abdominal, hinchazón, diarrea, estreñimiento, cefaleas, migrañas, dolor de huesos o articulaciones, fatiga crónica, lesión del intestino delgado, desarrollo de anticuerpos contra la transglutaminasa tisular (tTG), acné extenso, vómitos, pérdida de peso, irritabilidad, anemia ferropénica, artritis, hormigueo, entumecimiento en las extremidades, infertilidad y úlceras aftosas en la boca.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la atrofia de las vellosidades debida a la presencia de uno o más antígenos alimentarios peptídicos en un intestino de un mamífero, este procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es degradada por la composición farmacéutica para inhibir la atrofia de las vellosidades en el intestino. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es gluten. En una realización, la proteína potencialmente antigénica es una o más proteínas del trigo.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para reducir la respuesta de linfocitos T a un antígeno alimentario peptídico, comprendiendo el procedimiento poner en contacto el antígeno alimentario peptídico con una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas, en condiciones donde dicho antígeno es degradado para reducir la respuesta de linfocitos T al antígeno. En una realización, se reduce la respuesta de linfocitos T en un intestino de un mamífero. En una realización, el antígeno se pone en contacto con la composición farmacéutica en el estómago de un mamífero. En una realización, el antígeno se pone en contacto con la composición farmacéutica ex vivo. En una realización, el antígeno es gluten. En una realización, el antígeno es una proteína inmunotóxica del gluten.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir una manifestación de la enfermedad celíaca que se produce por la presencia de proteína de trigo parcialmente hidrolizada en un intestino de un paciente que tiene enfermedad celíaca, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas para atenuar o impedir una manifestación de la enfermedad celíaca.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para mejorar la digestibilidad de una proteína de un alimento en un mamífero con un trastorno intestinal, este procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas, en condiciones donde la proteína del alimento es degradada por la composición farmacéutica. En una realización, la degradación de la proteína mejora la absorción de la proteína en el intestino. En una realización, se atenúa o impide al menos un síntoma del trastorno. En una realización, el trastorno intestinal es enfermedad de Crohn, síndrome del intestino irritable o colitis. En una realización, se aumenta la absorción de proteínas de los alimentos.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para tratar la insuficiencia de enzimas pancreáticas en un paciente que lo necesita, que comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende al menos una enzima de Nepenthes. En una realización, la al menos una enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas y una mezcla de las mismas. En una realización, se administran una o más enzimas pancreáticas. La una o más enzimas pancreáticas se pueden administrar simultáneamente a la composición farmacéutica o en un momento diferente. En una realización, la enzima pancreática es una lipasa, una amilasa, una proteasa o una mezcla de las mismas. En una realización, la insuficiencia de enzimas pancreáticas se debe a pancreatitis, fibrosis quística, síndrome de Shwachman-Bodian-Diamond, cálculos biliares, lupus, esprúe celíaco, cáncer pancreático o cirugía pancreática. En una realización, la pancreatitis es pancreatitis crónica.

En una realización, la enzima de Nepenthes se concentra, aísla o extrae a partir del fluido de la jarra de una planta de Nepenthes. En una realización, la enzima de Nepenthes comprende nepentesina I recombinante, nepentesina II recombinante, neprosina recombinante, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas.

En una realización, la variante de las mismas comprende una proteína, cuya secuencia aminoacídica tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21. En una realización, la variante de las mismas comprende una proteína, cuya secuencia aminoacídica tiene al menos 85 % de homología de secuencia con el aminoácido codificado por el ADNc seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 14.

En una realización, el alimento es un líquido. En un aspecto de la descripción, el alimento es un sólido. En una realización preferida, la composición farmacéutica se administra por vía oral.

Incluso cuando un paciente cumple con una dieta exenta de gluten estricta, el gluten es difícil de evitar. Numerosos alimentos, particularmente los alimentos procesados, están contaminados con cantidades pequeñas de gluten. El consumo de cantidades incluso mínimas de gluten puede conducir a la reaparición de los síntomas en un paciente con enfermedad celíaca. Esto también ocurre con otros alimentos potencialmente inmunogénicos.

En una realización, la composición farmacéutica se administra independientemente de si el paciente ha ingerido (p. ej., ha ingerido conscientemente) un alimento que contiene una proteína potencialmente inmunogénica. En una realización, la composición farmacéutica se administra según sea necesario, p. ej., antes, durante, y/o después de una comida que podría estar contaminada con una proteína potencialmente inmunogénica, o en la que se desconoce el contenido de proteína potencialmente inmunogénica. En una realización, la composición farmacéutica se administra regularmente. En una realización, la composición farmacéutica se administra al menos una vez al día. En una realización, la composición farmacéutica se administra dos, tres, cuatro o más veces al día. En una realización, la composición farmacéutica se administra junto con (p. ej., antes de, durante o después de) cada comida y/o aperitivo. En una realización, la composición farmacéutica se incluye como parte de una formulación de liberación prolongada en la que hay una liberación continua de una o más enzimas para permitir la ingestión intermitente de aperitivos, etc., sin tener en cuenta el contenido de proteína antigénica del alimento.

En una realización, la composición farmacéutica se mantiene en un sistema acuoso, a aproximadamente pH 2, donde se cargan los grupos amino libres de dicha enzima. En una realización, la composición se mantiene a pH neutro antes de entrar en contacto con los ácidos del estómago. En una realización, la composición farmacéutica comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, de tal manera que el pH de la composición permanece pH 5 o 6 tras entrar en contacto con los ácidos del estómago.

En una realización, la cantidad efectiva de composición farmacéutica es de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 1 g. En una realización, la cantidad efectiva de composición farmacéutica es de entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 1 g por 1 g de sustrato (p. ej., gluten u otra proteína potencialmente inmunogénica). En una realización, la composición farmacéutica comprende más de una de nepentesina I, nepentesina II, neprosina o una variante de las mismas.

En una realización, el mamífero es un ser humano. En un aspecto, el ser humano padece sensibilidad al gluten o enfermedad celíaca. En un aspecto, se contempla que la sensibilidad intestinal a la proteína intestinal antigénica se correlaciona, directa o indirectamente, con trastorno por déficit de atención e hiperactividad, autismo, artritis reumatoide, fibromialgia y/o dermatitis herpetiforme. Se contempla además que la eliminación de tales proteínas intestinales antigénicas del intestino usando composiciones de esta invención tendrá un efecto positivo sobre el trastorno por déficit de atención e hiperactividad, el autismo, la artritis reumatoide, la fibromialgia y/o la dermatitis herpetiforme. En una realización preferida, el ser humano padece enfermedad celíaca.

En un aspecto, esta descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende neprosina o una variante y/o sal de las mismas. En una realización preferida adicional, la composición farmacéutica comprende además al menos una enzima de Nepenthes adicional. En una realización, la enzima de Nepenthes adicional comprende nepentesina I, nepentesina II, una variante de las mismas y/o una sal de las mismas.

Sin ceñirnos a la teoría, se cree que la nepentesina I, la nepentesina II y la neprosina son menos activas o sustancialmente inactivas a pH de neutro o básico. Esto puede ser importante cuando hay posibilidad de una digestión no deseable por la una o más enzimas. Por ejemplo, cuando la composición farmacéutica se administra por vía oral, el tamponamiento de la composición a pH 6,5 o superior puede dar como resultado una forma menos activa de la una o más enzimas, de tal manera que la mucosa oral, la mucosa esofágica y otras células que pueden entrar en contacto con la composición no serán digeridas por la una o más enzimas contenidas en la misma. Asimismo, cuando la composición se añade a un alimento, la una o más enzimas tamponadas no serán capaces (o serán menos capaces) de digerir el alimento antes de consumirlo. En tales situaciones, la introducción de la composición en el entorno ácido del estómago dará como resultado una disminución del pH y la activación de la una o más enzimas.

En una realización, la composición farmacéutica se tampona a aproximadamente pH 6,5 o superior. En una realización preferida, la composición se tampona de aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 8,5. En una realización, la composición está en forma líquida. En una realización, la composición está en forma sólida. En una realización, el pH de la composición se ajusta en forma líquida y la composición se seca para formar un sólido.

En una realización, la composición farmacéutica comprende una o más proteasas adicionales. En una realización, la una o más proteasas adicionales son una proteasa aspártica, una serina proteasa, una treonina proteasa, una cisteína proteasa, una ácido glutámico proteasa o una metaloproteasa. En una realización, la composición farmacéutica comprende una o más exoproteasas adicionales, tales como leucina aminopeptidasas y carboxipeptidasas. En una realización, la una o más proteasas adicionales son tripsina. En una realización preferida, la una o más proteasas adicionales son activas a pH ácido (p. ej., pH 2-6).

En un aspecto, la invención se refiere a una formulación que comprende la composición farmacéutica de la invención, donde la una o más enzimas están presentes en un vehículo de liberación retardada de tal manera que la una o más enzimas se liberan continuamente mientras la formulación está presente en el estómago. En una realización, la formulación tiene un pH superior a aproximadamente 5 antes de entrar en contacto con los ácidos del estómago. En una realización, la formulación comprende un tampón biológicamente aceptable, de tal manera que el pH de la composición permanece a aproximadamente pH 5 o 6 durante al menos un período de tiempo tras entrar en contacto con los ácidos del estómago.

En una realización, la descripción se refiere a una formulación de dosis unitaria de la composición farmacéutica. Por ejemplo, y sin limitación, la dosis unitaria puede estar presente en un comprimido, una cápsula y similares. La dosis unitaria puede estar en forma sólida, líquida, en polvo o en cualquier otra forma. Sin ceñirnos a la teoría, se prevé que una formulación de dosis unitaria de la composición farmacéutica permitirá la administración correcta (p. ej., en base a la cantidad de proteína inmunogénica ingerida) evitando al mismo tiempo los posibles efectos secundarios negativos de administrar una cantidad excesiva de la composición.

En una realización, la descripción se refiere a una forma proenzimática de la nepentesina I, nepentesina II, neprosina y/o a una variante de las mismas. En una realización, está presente un propéptido en la enzima. En una realización preferida, el propéptido se elimina mediante pH ácido, activando de ese modo la enzima. En una realización, el propéptido comprende la secuencia aminoacídica del propéptido de origen natural para la enzima. En una realización, el propéptido es un propéptido artificial o un propéptido meterólogo (es decir, un propéptido lábil en ácidos de una proteína y/o especie diferentes).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias proteicas para nepentesina I de Nepenthes mirabilis (SEQ ID NO: 5), Nepenthes alata (SEQ ID NO: 6), Nepenthes gracilis (s Eq ID NO: 7), Zea mays (SEQ ID NO: 10) y Oryza sativa (Se Q ID NO: 11), y nepentesina II de Nepenthes mirabilis (SEQ ID NO: 8), Nepenthes gracilis (SEQ ID NO: 9), Oryza sativa (SEQ ID NO: 12) y Zea mays (Se Q ID NO: 13).

La Figura 2 indica los tamaños de las proteínas de nepentesina recombinantes. A: Gel de nepentesina I teñido con Coomassie. B: Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF de nepentesina I activada con ácido. C: Gel de nepentesina II teñido con Coomassie. D: Análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF de nepentesina II activada con ácido.

La Figura 3 indica los tamaños de la nepentesina I y nepentesina II naturales (agrupadas a partir de 2-3 especies) mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

La Figura 4 es una fotografía de un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie que indica los pesos moleculares de los fragmentos de gluten después de la digestión con nepentesina II recombinante, extracto de Nepenthes o pepsina.

La Figura 5A es una fotografía de viales que contienen una suspensión de proteína del gluten digerida con pepsina (40 |jg) o con la cantidad indicada de nepentesina I recombinante o nepentesina II recombinante. La Figura 5b es una fotografía de viales que contienen una suspensión de proteína del gluten digerida con pepsina (40 jg ) o con la cantidad indicada de extracto de Nepenthes. Los viales incubados con nepentesina o extracto de Nepenthes son menos turbios que el vial de pepsina, lo que demuestra la digestión más enérgica del gluten.

La Figura 6 muestra la longitud promedio de todos los péptidos identificados a partir de la digestión de gliadina de trigo con fluido de Nepenthes enriquecido, usando CL-EM/EM, después de 1,5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos a 37 °C. Se usó un límite de corte de confianza de 95 % (p < 0,05) en las puntuaciones para REDUCIR la identificación de falsos positivos. La desviación estándar relativa de la longitud de los péptidos se muestra en la figura insertada.

La Figura 7 muestra el número de péptidos identificados mediante CL-EM/EM después de 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos de digestión a 37 °C, agrupados por longitud. Datos como en la Figura 6.

La Figura 8 muestra los mismos datos que la Figura 6, como una probabilidad acumulada de obtener una cierta longitud después de 10, 60, 120, 360 u 810 minutos de digestión a 37 °C.

La Figura 9 muestra las preferencias de escisión en (A) el lado PI o aminoterminal del sitio de escisión y en (B) el lado P1' o carboxiterminal del sitio de escisión para las enzimas indicadas. Las barras de la izquierda para cada residuo indican digestión con extracto de Nepenthes, las barras del medio indican digestión con extracto de Nepenthes purificado y las barras de la derecha con nepentesina I recombinante. El % de escisión representa el número de escisiones observadas en el residuo dado, con respecto el número total de péptidos presentes. Los datos se obtuvieron a partir de productos de la digestión de gliadina.

La Figura 10 muestra el perfil de purificación por intercambio iónico para fluido de Nepenthes. Los picos correspondientes a la neprosina y la nepentesina se indican mediante flechas. La región enmarcada indica las fracciones recogidas.

La Figura 11 muestra los pesos corporales de los ratones durante el ciclo del tratamiento. Los animales de control negativo (•) no se expusieron a gliadina. Los animales de control positivo (■) se expusieron a gliadina digerida por pepsina. Los animales del tratamiento 1 (▲) se expusieron a gliadina digerida con extracto de Nepenthes. Los animales del tratamiento 2 (▼) se expusieron a gliadina digerida con nepentesina II recombinante.

La Figura 12 es una fotografía de la inmunohistoquímica para los IEL positivos para CD3 en el intestino de los ratones tratados.

La Figura 13 muestra el número medio de linfocitos intraepiteliales (IEL) positivos para CD3 por 100 enterocitos en el intestino para cada grupo de tratamiento. *p < 0,05; ***p < 0,001

La Figura 14 muestra las proporciones promedio de vellosidades a criptas para cada grupo de tratamiento.

La Figura 15A presenta un muestreo de las porciones de gliadina que son digeridas por la neprosina, como se detectan mediante CL-EM/EM dependiente de los datos.

La Figura 15B muestra el perfil de digestión de la gliadina después de la digestión con neprosina. Los puntos indican sitios de escisión.

La Figura 16 muestra la ubicación de los polimorfismos en la secuencia aminoacídica de la neprosina de diferentes especies de Nepenthes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La descripción detallada de la invención se divide en varias secciones sólo por conveniencia del lector y la descripción encontrada en cualquier sección se puede combinar con la de otra sección.

I. Definiciones

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en esta memoria tienen los mismos significados que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. A continuación, se describen los procedimientos, dispositivos y materiales preferidos. Nada de lo contenido en esta memoria se debe interpretar como una admisión de que esta invención no está legitimada para preceder a tal descripción en virtud de la invención anterior.

Como se emplean en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias en plural, a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo.

Como se emplea en esta memoria, el término “que comprende” está destinado a significar que las composiciones y los procedimientos incluyen los elementos mencionados, pero no excluyen otros. “Que consiste esencialmente en”, cuando se usa para definir composiciones y procedimientos, significará excluir otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación. Por ejemplo, una composición que consiste esencialmente en los elementos como se definen en esta memoria no excluiría otros elementos que no afecten materialmente a la una o más características básicas y novedosas de la invención reivindicada. “Que consiste en” significará excluir más de una traza de otros ingredientes y las etapas importantes del procedimiento mencionadas. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención.

Como se emplea en esta memoria, un “alimento o proteína potencialmente antigénicos” es cualquier alimento o proteína que puede provocar una respuesta inmunitaria y/o inflamatoria en el intestino de un individuo sensible. En una realización preferida, el individuo es un ser humano y el alimento es un alimento destinado al consumo humano. Los alimentos potencialmente antigénicos incluyen, sin limitación, trigo, centeno, cebada, cacahuetes, nueces y semillas. En una realización, las proteínas potencialmente antigénicas de estos alimentos incluyen proteínas de prolamina, albúminas 2S, proteínas de transferencia de lípidos no específicas, inhibidores bifuncionales de aamilasas/proteasas, proteína hidrófoba de soja, indolinas, gluten, serpinas, purininas, inhibidores de alfaamilasas/proteasas, globulinas y farininas. En una realización preferida, la proteína (o el péptido) potencialmente antigénica es rica en residuos de prolina y/o glutamina. En una realización especialmente preferida, la proteína potencialmente antigénica es gluten. En otra realización preferida, la proteína potencialmente antigénica es una proteína del trigo.

Como se emplea en esta memoria, el término “gluten” se refiere en general a las proteínas presentes en el trigo o especies de granos relacionadas, que incluyen cebada y centeno, que tienen un efecto potencialmente perjudicial para ciertos individuos. Las proteínas del gluten incluyen gliadinas, tales como a-gliadinas, p-gliadinas, Y-gliadinas y u>-gliadinas, que son proteínas monoméricas, y gluteninas, que son mezclas muy heterogéneas de agregados de subunidades peso molecular alto y peso molecular bajo unidas mediante enlaces disulfuro. Se han caracterizado muchas proteínas del gluten de trigo. Véase, por ejemplo, Woychik y col., Amino Acid Composition of Proteins in Wheat Gluten, J. Agric. Food Chem., 9 (4), 307-310 (1961). El término gluten, como se emplea en esta memoria, también incluye oligopéptidos que se pueden obtener de la digestión humana normal de proteínas del gluten de alimentos que contienen gluten y provocan la respuesta inmunitaria anómala. Algunos de estos oligopéptidos son resistentes a las enzimas digestivas normales. Se cree que el gluten, lo que incluye las proteínas y los oligopéptidos antes mencionados, actúa como un antígeno para los linfocitos T (p. ej., IEL) en pacientes con intolerancia al gluten (p. ej., esprúe celíaco). El término gluten también se refiere a gluten desnaturalizado, tal como se encontraría en los productos horneados.

Como se emplea en esta memoria, la expresión “sensibilidad al gluten y afecciones relacionadas” se refiere a cualquier afección derivada de la intolerancia o sensibilidad a proteínas o péptidos del gluten. Estas incluyen, sin limitación, esprúe celíaco (enfermedad celíaca), alergia al trigo, sensibilidad al gluten, enteropatía sensible al gluten, sensibilidad idiopática al gluten y dermatitis herpetiforme. Las afecciones relacionadas también incluyen, sin limitación, autismo, trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH), artritis reumatoide, fibromialgia, enfermedad de Crohn, mala absorción de nutrientes y síndrome del intestino irritable (SII).

El término “neprosina” se refiere a una prolil endoproteasa con un peso molecular de aproximadamente 29 kilodalton (kDa). La neprosina se puede aislar a partir de las secreciones de la jarra de la especie Nepenthes. La neprosina escinde proteínas carboxiterminales a la prolina, con especificidad alta. La enzima es activa de aproximadamente pH 2 a aproximadamente pH 6. En una realización, la neprosina tiene la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1. La secuencia aminoacídica de la neprosina no es homóloga a ninguna otra proteína conocida. En una realización, la neprosina está codificada por la secuencia de ADNc de SEQ ID NO: 2. En una realización, la neprosina comprende una secuencia señal. En una realización, la secuencia señal comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 3. En una realización, la neprosina no comprende una secuencia señal.

Neprosina incluye todas las isoformas, isotipos y variantes de la neprosina, la neprosina recombinante y sales de las mismas. Sales se refiere a aquellas sales formadas por la neprosina con una o más bases o uno o más ácidos que conservan la efectividad biológica y las propiedades de la neprosina libre, y que no son biológicamente, o de otro modo, no deseables. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero no se limitan a, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, que incluyen aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico básicas, tales como resinas de isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, poliamina y similares. Los ácidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares.

Los ejemplos de proteasas incluyen, sin limitación, proteasas aspárticas, serina proteasas, treonina proteasas, cisteína proteasas, ácido glutámico proteasas y metaloproteasas. Las proteasas que pueden ser útiles en la presente invención incluyen, sin limitación, bAc E, catepsina D, catepsina E, quimosina (o “renina”), napsina, pepsina, plasmepsina, presenilina, renina, tripsina, quimiotripsina, elastasa y cisteína endoproteasa (EP) B2 (también conocida como EPB2). Las proteasas incluyen las descritas, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos n.° 7320788; 7303871; 7 320 788; 7628 985; 7910 541 y 7943 312; y las patentes PCT de n.° de publicación 2005/107786; 2008/115428; 2008/115411; 2010/021752; 2010/042203; 2011/097266. En una realización preferida, la al menos una proteasa adicional es activa a pH ácido, tal como el encontrado en el estómago (p. ej., pH 1,5 a 3,5).

El término “nepentesina” se refiere a la proteasa aspártica que tiene el número de la Comisión de Enzimas EC 3.4.23.12, e incluye todas las isoformas, isotipos y variantes de la nepentesina tales como nepentesina I y nepentesina II, isoformas de la nepentesina y nepentesina recombinante, y sales de las mismas. La nepentesina (EC 3.4.23.12) es una proteasa aspártica de origen vegetal que se puede aislar o concentrar a partir de un abanico de fuentes vegetales, tales como las secreciones de la jarra de Nepenthes, una planta de jarra carnívora, conocida como habitualmente como copas de mono en las regiones tropicales. La nepentesina se describe pormenorizadamente en la solicitud de patente de los Estados Unidos de n.° de serie 13/843 369, depositada el 15 de marzo de 2013. La alineación de secuencias de las secuencias proteicas de nepentesina conocidas (y las secuencias proteicas putativas de nepentesina) se muestra en la Figura 1.

En una realización, “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de una composición que da como resultado la inhibición o mejora de los síntomas en un sujeto o un resultado biológico deseado, p. ej., signos clínicos mejorados, aparición retardada de la enfermedad, etc. La cantidad efectiva puede ser determinada por un experto en la materia. El nivel de dosis seleccionado puede depender de la gravedad de la afección que se está tratando y de la afección y los antecedentes médicos del mamífero que se está tratando. Por ejemplo, un experto en la materia iniciará las dosis de la composición a niveles inferiores a los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentará gradualmente la dosis hasta conseguir el efecto deseado.

El término “manifestaciones de la enfermedad celíaca” se refiere a cualquiera de los síntomas o presentaciones clínicas de la enfermedad celíaca. Tales manifestaciones incluyen, sin limitación, inflamación intestinal, “mente confusa”, depresión, ansiedad, comportamiento similar al TDAH, dolor abdominal, hinchazón, diarrea, estreñimiento, cefaleas, migrañas, dolor de huesos o articulaciones, fatiga crónica, lesión del intestino delgado, desarrollo de anticuerpos contra la transglutaminasa tisular (tTG), acné extenso, vómitos, pérdida de peso, irritabilidad, anemia ferropénica, artritis, hormigueo, entumecimiento en las extremidades, infertilidad y úlceras aftosas en la boca. Las manifestaciones incluyen además atrofia de las vellosidades de la mucosa del intestino delgado con hiperplasia de las criptas, inflamación de la mucosa del intestino, mala absorción de nutrientes, distensión abdominal, así como un riesgo sustancialmente mayor de desarrollo de osteoporosis y neoplasias intestinales malignas (linfoma y carcinoma).

“Administración simultánea” o “cotratamiento”, como se emplean en esta memoria, incluye la administración de los agentes juntos, o antes o después uno de otro.

Los términos “modular”, “atenuar” o “mejorar” significan cualquier tratamiento de una enfermedad o un trastorno en un sujeto, tal como un mamífero, lo que incluye:

□ impedir o proteger contra la enfermedad o el trastorno, es decir, hacer que la reacción biológica anómala o los síntomas no se desarrollen;

□ inhibir la enfermedad o el trastorno, es decir, detener o impedir el desarrollo de reacciones biológicas anómalas y/o síntomas clínicos; y/o

□ aliviar la enfermedad o el trastorno, es decir, provocar la regresión de las reacciones biológicas anómalas y/o los síntomas.

Como se emplean en esta memoria, los términos “ impedir” o “inhibir” se refieren al tratamiento profiláctico de un sujeto que lo necesita. El tratamiento profiláctico se puede lograr proporcionando una dosis apropiada de un agente terapéutico a un sujeto con riesgo de padecer una dolencia, evitando sustancialmente de ese modo la aparición de la dolencia.

Como se emplea en esta memoria, el término “afección” se refiere a una enfermedad para la que se usan los compuestos, las composiciones y los procedimientos proporcionados en esta memoria.

Como se emplean en esta memoria, los términos “paciente” o “sujeto” se refieren a mamíferos e incluyen seres humanos y mamíferos no humanos. En realizaciones particulares de esta memoria, el paciente o sujeto es un ser humano.

El término “aproximadamente”, cuando se usa antes de un valor numérico, indica que el valor puede variar dentro de un intervalo razonable: ±5 %, ±1 % o ±0,2 %.

Un polinucleótido o una región polinucleotídica (o un polipéptido o una región polipeptídica) que tiene un cierto porcentaje (por ejemplo, 80 %, 85 %, 90 %, o 95 %) de “ identidad de secuencia” con otra secuencia significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son iguales al comparar las dos secuencias. La alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., Eds.

1987) Suplemento 30, apartado 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferiblemente, se usan los parámetros predeterminados para la alineación. Un programa de alineación es BLAST, que usa parámetros predeterminados. Los ejemplos de los programas incluyen BLASTN y BLASTP que usan los parámetros predeterminados siguientes: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; matriz = BLOSUM62; descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACIÓN ALTA; bases de datos = no redundantes, GenBank EMBL DDBJ PDB traducciones de CDS de GenBank Swiss-Prot Spupdate PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la dirección de Internet siguiente: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

“Homología” o “identidad” o “similitud” se refiere a la similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear con fines comparativos. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre secuencias es función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia “no relacionada” o “no homóloga” comparte menos de 40 % de identidad, o alternativamente menos de 25 % de identidad, con una de las secuencias de la presente descripción.

II. Procedimientos

En un aspecto, esta descripción se refiere a procedimientos para modular una afección mediada por la intolerancia al gluten en un paciente, que comprenden administrar al paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una enzima de Nepenthes. En una realización preferida, la afección es enfermedad celíaca o una alergia al trigo.

En otro aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la producción y/o el reclutamiento de IEL en el intestino debido a la presencia de un antígeno alimentario peptídico en un intestino de un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una enzima de Nepenthes. En una realización, la proteína del gluten es degradada por la composición farmacéutica para atenuar o impedir la producción y/o el reclutamiento de IEL en el intestino.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la inflamación intestinal debida a la presencia de un antígeno alimentario peptídico en el intestino de un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una enzima de Nepenthes. En una realización, el antígeno alimentario peptídico es degradado por la una o más enzimas para atenuar o impedir la inflamación intestinal.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la linfocitosis intraepitelial debida a la presencia de un antígeno alimentario peptídico en un intestino de un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una enzima de Nepenthes. En una realización, el antígeno alimentario peptídico es degradado por la composición farmacéutica para atenuar o impedir la linfocitosis intraepitelial en el intestino.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un procedimiento para atenuar o impedir la atrofia de las vellosidades debida a la presencia de un antígeno alimentario peptídico en un intestino de un mamífero. En una realización, el procedimiento comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende una enzima de Nepenthes. En una realización, el antígeno alimentario peptídico es degradado por la composición farmacéutica para atenuar o impedir la atrofia de las vellosidades en el intestino. En una realización, la atrofia de las vellosidades es un resultado de la inflamación del intestino.

En una realización, la enzima de Nepenthes es nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas. En una realización preferida, la formulación farmacéutica es una formulación de liberación prolongada.

En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 20 o SEQ ID NO: 21. En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1. En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 5. En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 6. En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 7. En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica. que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 8. En una realización, la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 9. En una realización, la variante es una proteína que tiene una amina o secuencia de ácido que tiene al menos 85 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 20. En una realización, la variante es una proteína que tiene que tiene una secuencia aminoacídica que tiene al menos 85 % de homología con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 21.

En una realización, la composición farmacéutica comprende un extracto de fluido de jarra de Nepenthes. En una realización, la composición farmacéutica comprende nepentesina I, nepentesina II y/o neprosina purificadas a partir de un extracto de fluido de jarra de Nepenthes. En una realización, al menos una de nepentesina I, nepentesina II, neprosina o una variante de las mismas es una proteína recombinante. En una realización, la composición farmacéutica está entre aproximadamente pH 5 y aproximadamente pH 8 antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas para uso en los procedimientos descritos en esta memoria se analizan más pormenorizadamente a continuación.

En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. En una realización, el ser humano padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en intolerancia al gluten, enfermedad celíaca, trastorno por déficit de atención e hiperactividad, autismo, artritis reumatoide, fibromialgia y dermatitis herpetiforme. En una realización, el ser humano padece una alergia alimentaria.

En una realización, la composición farmacéutica se administra por vía oral antes, durante o inmediatamente después del consumo de un alimento que contiene gluten.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto antes de la ingestión por el sujeto del alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra dentro de un período en el que la enzima es al menos parcialmente efectiva (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 50 %, 70 %, 90 % de la actividad original) para degradar el gluten en el alimento que ingerirá el sujeto. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra como máximo aproximadamente 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o 30 minutos antes de la ingestión del alimento por el sujeto.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto simultáneamente a la ingestión por el sujeto del alimento potencialmente inmunogénico. En algunas realizaciones, la composición enzimática se administra con el alimento. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra independientemente del alimento.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto poco después de la ingestión por el sujeto del alimento potencialmente inmunogénico. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra dentro de un período en el que al menos parte (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 50 %, 70 %, 90 %) del uno o más antígenos del alimento están todavía en el estómago del sujeto. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra como máximo 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora o 30 minutos después de la ingestión del alimento por el sujeto.

Habitualmente, la composición farmacéutica se administra en una cantidad que es segura y suficiente para producir el efecto deseado de desintoxicación del uno o más antígenos alimentarios peptídicos. La dosis de la composición farmacéutica puede variar en función de muchos factores, tales como la enzima particular administrada, la sensibilidad del sujeto al alimento, la cantidad y los tipos de alimentos que contienen antígeno ingeridos, las propiedades farmacodinámicas de la enzima, el modo de administración, la edad, salud y peso del receptor, la naturaleza y magnitud de los síntomas, la frecuencia del tratamiento y el tipo de tratamiento simultáneo, si lo hay, y la tasa de depuración de la enzima. Un experto en la materia puede determinar la dosis apropiada en base a los factores anteriores. La composición se puede administrar inicialmente en una dosis adecuada que se puede ajustar según proceda, en función de la respuesta clínica. Se pueden emplear opcionalmente ensayos in vitro para ayudar a identificar los intervalos de dosis óptimos. La dosis exacta que se debe emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y/o la gravedad de la enfermedad o el trastorno, y se debe decidir según el juicio del facultativo y las circunstancias de cada sujeto.

La dosis o pauta posológica de un sujeto adulto puede ajustarse proporcionalmente para niños y lactantes, y también ajustarse para otra administración u otros formatos, en proporción, por ejemplo, al peso molecular o la respuesta inmunitaria. La administración o los tratamientos se pueden repetir a intervalos apropiados, a discreción del facultativo.

Generalmente, la composición farmacéutica se administra cuando se necesita, tal como cuando el sujeto consumirá, está consumiendo o ha consumido un alimento que comprende una proteína antigénica o se sospecha que comprende una proteína antigénica. En cualquier caso, se puede administrar en dosis de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1000 mg de enzima por kg de peso corporal al día, o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 g por dosis para una persona promedio. En algunas realizaciones, la enzima se puede administrar a 0,001; 0,01; 0,1; 1, 5, 10, 50, 100, 500 o 1000 mg/kg peso corporal al día, y a intervalos entre cualesquiera dos de estos valores (incluidos los extremos). En algunas realizaciones, la enzima se puede administrar a 1 mg, 10 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 700 mg, 1 g, 10 g, 20 g, 50 g, 70 g, 100 g por dosis, y a intervalos entre cualesquiera dos de estos valores (incluidos los extremos). En algunas realizaciones, se puede administrar una, dos, tres veces, etc., al día, en función del número de veces que el sujeto ingiere un alimento que comprende una proteína antigénica y/o de la cantidad de tal alimento que consume. La cantidad de enzima mencionada en esta memoria se puede referir a la enzima total o a cada enzima de la composición.

En algunas realizaciones, la cantidad de composición farmacéutica administrada es dependiente de la cantidad (o cantidad aproximada) de sustrato (p. ej., gluten y/u otra proteína o proteína potencialmente antigénica) consumido/que se va a consumir. En una realización, se administra de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1 g de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1 g de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1 g de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 250 mg de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg de enzima por 1 g de sustrato. En una realización, se administra de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg de enzima por 1 g de sustrato. Esto incluye cualquier valor en estos intervalos (incluidos los extremos), y subintervalos entre cualesquiera dos de estos valores.

En una realización, la proporción de sustrato a enzima administrada es de aproximadamente1:1 a aproximadamente 10 000:1. En una realización preferida, la proporción de sustrato a enzima es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1000:1. En una realización, la proporción de sustrato a enzima es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 100:1.

La composición farmacéutica de esta invención se puede administrar como único agente activo o se puede administrar en combinación con otros agentes (simultánea, secuencial o independientemente, o mediante coformulación), que incluyen otros compuestos que presentan una actividad terapéutica igual o similar y que se ha determinado que son seguros y eficaces para tal administración combinada.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra con una enzima adicional, tal como una proteasa gástrica, una proteasa aspártica (tal como pepsina, pepsinógeno o las descritas por Chen y col., Aspartic proteases gene family in rice: Gene structure and expression, predicted protein features and phylogenetic relation, Gene 442:108-118 (2009)) y enzimas tales como otra prolil endopeptidasa (PEP), dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) y dipeptidil carboxipeptidasa (DCP) o cisteína proteinasa B (descritas en la patente de los Estados Unidos n.° 7910541). En una realización, la otra enzima se administra en forma de bacterias que producen y/o secretan la enzima adicional. En una realización, las bacterias están diseñadas para producir y/o secretar nepentesina I, nepentesina II, neprosina y/o una variante de las mismas.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se administra al sujeto con otro agente. Los ejemplos no limitantes de agentes que se pueden administrar con la composición farmacéutica incluyen inhibidores de la transglutaminasa tisular, agentes antiinflamatorios tales como amilasas, glucoamilasas, endopeptidasas, inhibidores de la HMG-CoA reductasa (p. ej., compactina, lovastatina, simvastatina, pravastatina y atorvastatina), antagonistas del receptor de leucotrienos (p. ej., montelukast y zafirlukast), inhibidores de la COX-2 (p. ej., celecoxib y rofecoxib), inhibidores de la MAP cinasa p38 (p. ej., BIRB-796); agentes estabilizadores de los mastocitos tales como cromoglicato de sodio (cromolín), pemirolast, proxicromil, repirinast, doxantrazol, amlexanox nedocromil y probicromil, agentes antiulcerosos, agentes antialérgicos tales como agentes antihistamínicos (p. ej., acrivastina, cetirizina, desloratadina, ebastina, fexofenadina, levocetirizina, loratadina y mizolastina), inhibidores de la transglutaminasa 2 (TG2), agentes anti-TNFa y antibióticos. En otra realización, el agente adicional es un probiótico. Los probióticos incluyen, sin limitación, especies y cepas de lactobacilos, levaduras, bacilos o bifidobacterias. En una realización, el otro agente es elafina. En una realización, el otro agente se administra en forma de bacterias que producen y/o secretan el agente adicional.

En algunas realizaciones, el otro agente comprende una enzima (p. ej., proteasa) que es activa en el intestino. Sin ceñirnos a la teoría, se cree que tales enzimas pueden actuar sinérgicamente con la una o más enzimas de la composición farmacéutica para degradar adicionalmente las proteínas inmunogénicas.

También se proporciona en esta memoria el uso de una composición enzimática que comprende nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas y/o una sal de las mismas en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una de las afecciones y enfermedades antes mencionadas.

III. Composiciones Farmacéuticas

La composición farmacéutica se puede administrar en un abanico de composiciones sola o con vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados.

Por consiguiente, en otro aspecto de la descripción, se proporciona en esta memoria una composición que comprende nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas y/o una sal de las mismas. En algunas realizaciones, la composición es una composición farmacéutica. Las composiciones se pueden formular en formas sólidas, semisólidas o líquidas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, inyecciones, geles y microesferas. La administración de la composición se puede conseguir de diversas maneras, por ejemplo, mediante administración oral.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas o una mezcla de las mismas y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. El término “vehículo” hace referencia a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el que se administra el agente terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, que incluyen los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos.

Los excipientes farmacéuticos aceptables incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, carbonato de calcio, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades pequeñas de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva de la una o más enzimas, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para la administración correcta al paciente. La formulación se debe adecuar al modo de administración.

Para administración oral, la composición farmacéutica se puede usar sola o en combinación con aditivos apropiados para fabricar comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, jarabes, líquidos, suspensiones, etc. Por ejemplo, las formas orales sólidas de la composición se pueden preparar con aditivos convencionales, desintegrantes, lubricantes, diluyentes, agentes tamponadores, agentes humectantes, conservantes y aromatizantes. Los ejemplos no limitantes de excipientes incluyen lactosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz, carboximetilcelulosa de sodio, talco, estearato de magnesio, aromas y colorantes. En algunas realizaciones, la formulación libera la una o más enzimas en el estómago del sujeto de manera que el uno o más antígenos alimentarios peptídicos puedan ser degradados por la una o más enzimas.

La composición se puede liofilizar a partir de una solución acuosa, opcionalmente en presencia de tampones (p. ej., tampones de fosfato, citrato, histidina, imidazol) y excipientes (p. ej., crioprotectores tales como sacarosa, lactosa, trehalosa) apropiados. Las tortas liofilizadas pueden mezclarse opcionalmente con excipientes y prepararse en diferentes formas.

En otro aspecto de la descripción, se proporcionan procedimientos para tratar la intolerancia al gluten o una afección asociada, tal como enfermedad celíaca, alergia al trigo, sensibilidad al gluten y dermatitis herpetiforme, en un paciente que lo necesita, que comprenden tratar un alimento que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten con una cantidad efectiva de la composición antes del consumo por el paciente. En algunas realizaciones, el alimento se combina con una cantidad efectiva de la composición durante su preparación. En una realización, la composición se añade después de cualquier etapa de calentamiento en la preparación del alimento. En una realización, la composición se añade antes de una o más etapas de calentamiento en la preparación del alimento.

La nepentesina I, la nepentesina II y la neprosina se presentan como proenzimas en Nepenthes antes de la activación. Es decir, la proteína incluye un propéptido que se escinde para activar la enzima en el fluido de la jarra. En una realización, la composición comprende nepentesina I, nepentesina II, neprosina, una variante de las mismas y/o una sal de las mismas que comprende un propéptido. En una realización, el propéptido es adyacente al extremo amino de la enzima. En una realización, el propéptido es el propéptido de origen natural de la enzima. En una realización, el propéptido es un propéptido heterólogo (p. ej., de una proteína o especie diferentes, o sintético). En una realización, el propéptido se escinde mediante condiciones ácidas. En una realización, el propéptido se escinde mediante una enzima. En una realización, la presencia del propéptido da como resultado actividad retardada de la enzima en el estómago (p. ej., debido al tiempo necesario para eliminar el propéptido y producir la enzima madura). En una realización, el propéptido está diseñado para ser eliminado más lentamente con el fin de retardar la actividad de la enzima en el estómago. En una realización, el propéptido está diseñado para ser eliminado más rápidamente con el fin de acelerar la actividad de la enzima en el estómago.

En una realización preferida, la formulación es una formulación de liberación controlada. El término “formulación de liberación controlada” incluye formulaciones de liberación prolongada y de liberación a lo largo del tiempo. Las formulaciones de liberación controlada son muy conocidas en la técnica. Estas incluyen excipientes que permiten la liberación prolongada, periódica, pulsada o retardada del fármaco. Las formulaciones de liberación controlada incluyen, sin limitación, incorporación del fármaco en una matriz; revestimientos entéricos; microencapsulación; geles e hidrogeles; y cualquier otra formulación que permita la liberación controlada de un fármaco.

En algunas realizaciones, la composición se administra como un aditivo alimentario junto con un alimento que comprende o se sospecha que comprende una proteína alimentaria potencialmente antigénica. En una realización, el alimento comprende o se sospecha que comprende gluten, por ejemplo, pan, pasta, cereales y similares, preparados a partir de trigo, centeno y cebada, etc. En algunas realizaciones, la composición se añade como un ingrediente en tal alimento. En algunas realizaciones, la composición se dispersa en un alimento antes del consumo, opcionalmente a un pH al que es inactiva, tal como un pH de aproximadamente 5 o superior. En algunas realizaciones, la composición se puede preparar o incorporar en un polvo, una crema para untar, un espray, una salsa, una salsa para mojar, una nata montada, etc., que se puede aplicar al alimento cuando el alimento está siendo consumido por el paciente. En algunas realizaciones, la composición se puede preparar en formas que despiertan el apetito, tales como caramelos, chicles, complementos nutricionales masticables, jarabe, etc. para una administración fácil. En algunas realizaciones, la composición se puede mezclar con alimentos habituales, tales como azúcar, sal, aderezos para ensaladas, especias, queso, mantequilla, margarinas, cremas para untar, mantequilla, grasas comestibles para freír, mayonesas, productos lácteos, mantequillas de nueces, mantequillas de semillas, mantequillas de almendra, mantequilla de cacahuete, etc. Preferiblemente, los alimentos o aditivos que comprenden la composición no necesitan calentamiento antes de ser ingeridos por un paciente, de manera que se puede minimizar la posible pérdida de actividad de la una o más enzimas debido a la temperatura elevada.

En una realización, la una o más enzimas de la composición se activan tras entrar en contacto con el ácido (es decir, en el estómago).

En otro aspecto de la descripción, se proporciona un producto alimentario que comprende neprosina, nepentesina I, nepentesina II, una variante de las mismas o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el producto alimentario comprende gluten o se sospecha que comprende gluten, tal como productos para horneado (p. ej., tartas, magdalenas, dónuts, pasteles, panecillos y pan), pasta, galletas saladas, nachos, cereales, etc. hechos de trigo, centeno y cebada. En algunas realizaciones, el producto alimentario se puede consumir con otro producto alimentario que comprende gluten o se sospecha que comprende gluten. Los ejemplos no limitantes de tal alimento incluyen un polvo, una crema para untar, un espray, una salsa, una salsa para mojar, una nata montada, caramelos, chicles, jarabe, azúcar, sal, aderezos para ensaladas, especias, queso, mantequilla, margarinas, cremas para untar, mantequilla, grasas comestibles para freír, mayonesas, productos lácteos, mantequillas de nueces, mantequillas de semillas, mantequillas de almendras, mantequilla de cacahuete, etc.

En algunas realizaciones, la composición que comprende neprosina, nepentesina I, nepentesina II, una variante de las mismas o una combinación de las mismas se mezcla con alimentos o se usa para pretratar alimentos que contienen gluten. La composición presente en los alimentos puede ser enzimáticamente activa para reducir el nivel de gluten en el alimento antes de, o durante, la ingestión.

En un aspecto de la descripción, se añade una composición que comprende neprosina, nepentesina I, nepentesina II, una variante de las mismas o una combinación de las mismas se añade al alimento antes de consumir el alimento. En una realización, la descripción se refiere a un dispensador que comprende un excipiente interno y una cantidad efectiva de la composición farmacéutica para digerir el gluten. En una forma de realización, la composición farmacéutica y/o el excipiente interno se añaden al alimento antes de consumir el alimento. En una realización, el alimento comprende gluten o se sospecha que comprende gluten. En una realización, el excipiente interno comprende cloruro de sodio o yoduro de sodio, o una mezcla de los mismos. En una realización, la composición farmacéutica y/o el excipiente interno están en forma granular, dimensionados para dispensar eficientemente desde dicho dispensador.

En algunas realizaciones, la composición (tal como la composición farmacéutica o la composición comestible) o el producto alimentario comprende de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 99 %, de aproximadamente 0,5 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 95 %, de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 % de la una o más enzimas. En algunas realizaciones, la cantidad de enzima en la composición (tal como la composición farmacéutica o la composición comestible) o el producto alimentario es aproximadamente 0,01 %, aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 % de la composición total o el producto alimenticio, o un intervalo entre cualesquiera dos de los valores (incluidos los extremos).

En algunas realizaciones, la composición comprende neprosina y nepentesina, o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la nepentesina es nepentesina I y/o nepentesina II, o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la nepentesina es nepentesina I recombinante y/o nepentesina II recombinante, o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la nepentesina es nepentesina I recombinante y nepentesina II recombinante, o una variante de cada una de las mismas. En algunas realizaciones, la neprosina es neprosina recombinante o una variante de la misma. En una realización preferida, la composición comprende nepentesina I, nepentesina II y/o neprosina que comprenden la una o más secuencias aminoacídicas de la nepentesina I, nepentesina II, y/o neprosina de una especie de Nepenthes, o una o más variantes de las mismas.

Se han descrito las secuencias de ARNm/ADNc de nepentesina I de varias especies de Nepenthes, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (n.° de entrada de GenBank JX494401), Nepenthes gracilis (n.° de entrada de GenBank AB114914) y Nepenthes alata (n.° de entrada de GenBank AB266803). Se han descrito las secuencias de ARNm/ADNc de nepentesina II de varias especies de Nepenthes, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (número de acceso de GenBank JX494402) y Nepenthes gracilis (número de acceso de GenBank AB114915).

Se han descrito las secuencias proteicas de nepentesina I de varias especies de Nepenthes, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (n.° de acceso de GenBank AFV26024; SEC ID NO: 5), Nepenthes gracilis (n.° de acceso de GenBank BAD07474; SEC ID NO: 7) y Nepenthes alata (n.° de acceso de GenBank BAF98915; SEC ID NO: 6). Se han descrito las secuencias proteicas de nepentesina II de varias especies de Nepenthes, por ejemplo, Nepenthes mirabilis (n.° de acceso de GenBank AFV26025; SEQ ID NO: 8) y Nepenthes gracilis (n.° de acceso de GenBank BAD07475; SEQ ID NO: 9). Las secuencias también se encuentran en la solicitud de patente de los estados Unidos de n.° de publicación 2014/0186330.

En algunas realizaciones, la nepentesina es una variante de nepentesina que tiene al menos aproximadamente 85 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I (p. ej., SEQ ID NO: 5; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 7 o SEQ ID NO: 21). En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 90 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 95 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 96 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 97 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos 98 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos 99 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina I. En una realización, la nepentesina comprende la secuencia aminoacídica de SEC ID NO: 5; SEC ID NO: 6; SEC ID NO: 7 o SEQ ID NO: 21.

En algunas realizaciones, la nepentesina es una variante de nepentesina que tiene al menos aproximadamente 85 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II (p. ej., SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 22). En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 90 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 95 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 96 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 97 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 98 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II. En algunas realizaciones, la variante tiene al menos aproximadamente 99 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica de nepentesina II. En una realización, la nepentesina comprende la secuencia aminoacídica de nepentesina I de SEQ ID No : 8; SEC ID NO: 9 o SEQ ID NO: 22 que conserva actividad de glutenasa. En una realización particularmente preferida, la secuencia codifica una variante de nepentesina I que degrada al menos un péptido tóxico del gluten.

En un aspecto de la descripción, la proporción de neprosina a nepentesina I y/o II en la composición es tal que el antígeno alimentario peptídico se escinde en fragmentos suficientemente pequeños y/o inocuos para impedir la intolerancia al gluten, enfermedad celíaca, alergia al trigo o dermatitis herpetiforme, la inflamación, la proliferación o el reclutamiento de IEL, la linfocitosis intraepitelial y/o la atrofia de las vellosidades, o cualquier síntoma de las mismas, en un intestino del sujeto. En algunas realizaciones, la proporción de neprosina:nepentesina es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1.

En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina (nepentesina I y/o II) de al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 90:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 70:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 60:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 50:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 40:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 30:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:2. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:3. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:4. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:30. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:40. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:50. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:60. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:70. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:80. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:90. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:100.

En un aspecto de la descripción, la proporción de nepentesina I a nepentesina II en la composición es tal que el antígeno alimentario peptídico se escinde en fragmentos suficientemente pequeños y/o inocuos para impedir la inflamación, la proliferación o el reclutamiento de IEL, la linfocitosis intraepitelial y/o la atrofia de las vellosidades en un intestino del sujeto. En algunas realizaciones, la proporción de nepentesina I:nepentesina II es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 100:1.

En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 90:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 70:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 60:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 50:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 40:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 30:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:2. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:3. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:4. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:30. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:40. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:50. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:60. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:70. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:80. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:90. En algunas realizaciones, la composición comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:100.

IV. Procedimientos de preparación

Se contempla que la nepentesina y/o la neprosina se pueden concentrar (o extraer) o purificar mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo (pero no limitados a) filtración o purificación por afinidad basada en pepstatina inmovilizada, de una fuente natural, lo que incluye secreciones de las jarras de plantas tales como Nepenthes. También se puede usar cromatografía de proteínas clásica, tal como cromatografía de exclusión por tamaños (también conocida como cromatografía de permeación en gel) y/o cromatografía de cromatoenfoque, para concentrar (o extraer) o purificar nepentesina y/o neprosina. El cromatoenfoque se puede usar antes o después de la exclusión por tamaños. La nepentesina I, la nepentesina II y la neprosina se encuentran en cantidades relativamente pequeñas en las secreciones vegetales naturales. La producción de nepentesina I, nepentesina II y/o neprosina se puede aumentar, por ejemplo, usando tecnologías de bioingeniería para crear plantas transgénicas que expresen y/o secretan cantidades aumentadas de la una o más enzimas deseadas, o una variante de las mismas.

Además de aislarla de una fuente vegetal, la enzima de Nepenthes o variante de la misma se puede preparar mediante síntesis química. La síntesis química se puede conseguir acoplando los aminoácidos según la secuencia de la enzima o variante deseada. Se dispone de diversos procedimientos de acoplamiento peptídico y aparatos de síntesis peptídica comerciales para sintetizar péptidos o proteínas, por ejemplo, los sintetizadores automáticos de Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, Beckman y otros fabricantes.

En otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para preparar una enzima de Nepenthes o variante de la misma usando sistemas de producción recombinante transformando o transfectando una célula con el ADN (p. ej., ADNc) y/o ARN mensajero de la una o más enzimas de manera que la célula sea capaz de producir la una o más enzimas. Por ejemplo, se puede producir nepentesina creando sistemas de vector hospedador en organismos tales como Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Lactobacillus, Bacilli, Aspergilli y cultivos de células vegetales, tales como células de tabaco, etc.

También se proporcionan vectores y células hospedadoras, tales como E. coli, que comprenden polinucleótidos y composiciones que contienen cualquiera de los polinucleótidos o polipéptidos como se describen en esta memoria.

En otro aspecto de la descripción, se proporciona un procedimiento para producir enzima de Nepenthes recombinante (nepentesina I, nepentesina I y/o neprosina, o una variante de las mismas) que comprende expresar en un organismo hospedador elegido una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha enzima e insertar la secuencia de ácido nucleico en un vector diseñado apropiadamente. En un aspecto de la descripción, la enzima recombinante es nepentesina I o una variante de la misma. En un aspecto de la descripción, la enzima recombinante es nepentesina II o una variante de la misma. En un aspecto de la descripción, la enzima recombinante es neprosina o una variante de la misma. En un aspecto de la descripción, la enzima recombinante es una mezcla de nepentesina I, nepentesina II y/o neprosina, o una variante de las mismas.

En otro aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende nepentesina recombinante, tal como nepentesina I y/o nepentesina II o una variante de las mismas. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina I o una variante de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es nepentesina II o una variante de la misma. En un aspecto de la descripción, la nepentesina recombinante es una mezcla de nepentesina I y nepentesina II o variantes de las mismas.

En un aspecto, esta descripción se refiere a un ADNc como se describe en esta memoria. En una realización, esta descripción se refiere a un vector que comprende un ADNc como se describe en esta memoria. En una realización, el vector es un vector de expresión. En una realización, esta descripción se refiere a una célula que expresa nepentesina I recombinante, nepentesina II recombinante, neprosina recombinante, una variante o una mezcla de las mismas.

En algunas realizaciones, la biosíntesis de una o más enzimas de Nepenthes se puede conseguir transformando una célula con un vector que comprende un ADNc que codifica nepentesina I, por ejemplo, la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, n.° de acceso de GenBank JX494401, n.° de acceso de GenBank AB114914 o n.° de acceso de GenBank AB266803. En algunas realizaciones, la biosíntesis de nepentesina se puede conseguir transformando una célula con un vector que comprende una secuencia homóloga a un ADNc que codifica nepentesina I, esta secuencia codifica una proteína con actividad de proteasa. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 60 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 70 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 80 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 85 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 90 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 95 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 96 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 97 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 98 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina La secuencia puede tener al menos aproximadamente 99 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina I. En una realización preferida, la secuencia codifica una variante de nepentesina I que conserva actividad de glutenasa. En una realización particularmente preferida, la secuencia codifica una variante de nepentesina I que degrada al menos un péptido tóxico del gluten.

En algunas realizaciones, la biosíntesis de una o más enzimas de Nepenthes se puede conseguir transformando una célula con un vector que comprende un ADNc que codifica nepentesina II, por ejemplo, la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, n.° de acceso de GenBank JX494402 o n.° de acceso de GenBank AB114915. En algunas realizaciones, la biosíntesis de nepentesina se puede conseguir transformando una célula con un vector que comprende una secuencia homóloga a un ADNc que codifica nepentesina II, esta secuencia codifica una proteína con actividad de proteasa. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 60 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 70 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 80 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 85 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 90 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 95 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 96 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 97 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 98 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 99 % de homología con un ADNc que codifica nepentesina II. En una realización preferida, la secuencia codifica una variante de nepentesina II que conserva actividad de glutenasa. En una realización particularmente preferida, la secuencia codifica una variante de nepentesina II que degrada al menos un péptido tóxico del gluten.

En algunas realizaciones, la biosíntesis de una o más enzimas de Nepenthes se puede conseguir transformando una célula con un vector que comprende un ADNc que codifica neprosina, por ejemplo, la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la biosíntesis de neprosina se puede conseguir transformando una célula con un vector que comprende una secuencia homóloga a un ADNc que codifica neprosina, esta secuencia codifica una proteína con actividad de proteasa. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 60 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 70 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 80 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 85 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 90 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 95 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 96 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 97 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 98 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. La secuencia puede tener al menos aproximadamente 99 % de homología con un ADNc que codifica neprosina. En una realización preferida , la secuencia codifica una variante de neprosina que conserva actividad de prolil endoproteasa. En una realización especialmente preferida, la secuencia codifica una variante de nepentesina II que conserva actividad de glutenasa. En una realización particularmente preferida, la secuencia codifica una variante de neprosina que degrada al menos un péptido tóxico del gluten.

Sin ceñirnos a la teoría, se cree que la respuesta inflamatoria al gluten en los intestinos de individuos afectados es debida a la hidrólisis incompleta de las proteínas del gluten, lo que conduce a la formación de péptidos tóxicos (inmunotóxicos) del gluten. Se conocen varios péptidos inmunotóxicos y/o potencialmente inmunotóxicos del gluten. Estos incluyen, pero no se limitan a, el 33-mer (SEQ ID NO: 15, LQLQPF(PQPQLPY)3PQPQPF) y p31-49 (SEQ ID NO: 16, LGQQQPFPPQQPYPQPQPF) de a-gliadina; Gly-156 (SEQ ID NO: 17, QQQQPPFSQQQQSPFSQQQQ) de glutenina de bajo peso molecular; y la repetición de nonapéptidos (SEQ ID NO: 18, GYYPTSPQQ) y la repetición de hexapéptidos (SEQ ID NO: 19, PGQGq Q) de glutenina de alto peso molecular.

En algunas realizaciones, se sintetiza nepentesina I, nepentesina II, neprosina y/o una variante de las mismas transfectando, infectando o transformando una célula con uno o más vectores que comprenden una secuencia de ADNc de cada enzima deseada. Es decir, se puede diseñar una única célula, línea celular u organismo para producir dos o más enzimas. En algunas realizaciones, las enzimas deseadas se sintetizan mediante células independientes y se combinan en la composición farmacéutica. En una realización preferida, la nepentesina I, nepentesina II, neprosina y/o una variante de las mismas recombinantes no están glucosiladas. En una realización, la nepentesina I, nepentesina II, neprosina recombinantes y/o una variante de las mismas tienen un patrón de glucosilación diferente a la enzima natural (es decir, nepentesina I, nepentesina II o neprosina aisladas de una planta de Nepenthes).

La una o más enzimas de Nepenthes sintéticas (p. ej., recombinantes) se pueden concentrar o purificar según procedimientos conocidos, tales como aquellos para aislar una o más enzimas de Nepenthes del líquido de la jarra de la planta.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética (p. ej., recombinante) comprende al menos 20 % en peso de al menos una enzima de Nepenthes o una variante de la misma. En algunas realizaciones, el producto proteico aislado comprende al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % en peso de la enzima de Nepenthes o variante de la misma. En algunas realizaciones, el producto proteico aislado comprende al menos 99 % en peso de la enzima de Nepenthes o variante de la misma.

En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende sustancialmente solo nepentesina recombinante o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante o variante de la misma comprende sustancialmente solo nepentesina I recombinante o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante o variante de la misma comprende sustancialmente solo nepentesina II o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante o variante de la misma comprende nepentesina I y nepentesina II, o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante o una variante de la misma comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II (o una variante de cada una de las mismas) de al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 90:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 70:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 60:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 50:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 40:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 30:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:2. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:3. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:4. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:30. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:40. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:50. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:60. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:70. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:80. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:90. En algunas realizaciones, la nepentesina recombinante comprende una proporción de nepentesina I a nepentesina II de al menos aproximadamente 1:100.

En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende sustancialmente solo neprosina recombinante o una variante de la misma. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende neprosina y nepentesina recombinante o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende neprosina y nepentesina I o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende neprosina y nepentesina II o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende neprosina, nepentesina I y nepentesina II o una variante de las mismas. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante o variante de la misma comprende una proporción de neprosina a nepentesina (o una variante de cada una de las mismas) de al menos aproximadamente 100:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 90:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 70:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 60:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 50:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 40:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 30:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 20:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 10:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 5:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 4:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 3:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:1. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:2. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:3. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:4. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:30. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:40. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:50. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:60. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:70. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:80. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:90. En algunas realizaciones, la enzima de Nepenthes recombinante comprende una proporción de neprosina a nepentesina de al menos aproximadamente 1:100.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende una secuencia aminoacídica que es al menos aproximadamente 70 % homóloga a la secuencia aminoacídica de nepentesina I de Nepenthes (p. ej., SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 21). En una realización, el producto proteico conserva actividad de proteasa. La proteína puede ser al menos aproximadamente 80 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 85 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 90 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 95 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 96 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 97 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 98 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 99 % homóloga a la nepentesina I de Nepenthes.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende una proteína que es al menos aproximadamente 70 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes (p. ej., SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 20). En una realización, el producto proteico conserva actividad de proteasa. La proteína puede ser al menos aproximadamente 80 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 85 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 90 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 95 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 96 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 97 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 98 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 99 % homóloga a la nepentesina II de Nepenthes.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende una proteína que es al menos aproximadamente 70 % homóloga a la neprosina de Nepenthes (p. ej., SEQ ID NO: 1). En una realización, el producto proteico conserva actividad de proteasa. La proteína puede ser al menos aproximadamente 80 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 85 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 90 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 95 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 96 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 97 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 98 % homóloga a la neprosina de Nepenthes. La proteína puede ser al menos aproximadamente 99 % homóloga a la neprosina de Nepenthes.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 10 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I de Nepenthes. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 20 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 30 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 40 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 50 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 60 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 70 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 80 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 90 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con más de aproximadamente 100 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina I.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 10 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II de Nepenthes. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 20 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 30 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 40 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 50 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 60 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 70 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 80 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 90 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende nepentesina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 100 % de la actividad de proteasa original de la nepentesina II.

En algunas realizaciones, el producto proteico aislado de una fuente natural o una fuente sintética comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 10 % de la actividad de proteasa original de la neprosina de Nepenthes. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 20 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 30 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 40 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 50 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 60 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 70 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 80 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con al menos aproximadamente 90 % de la actividad de proteasa original de la neprosina. En algunas realizaciones, el producto proteico comprende neprosina o una variante de la misma con más de aproximadamente 100 % de la actividad de proteasa original de la neprosina.

A menos que se indique de otro modo, las abreviaturas usadas a lo largo de esta memoria descriptiva tienen los significados siguientes:

g = gramo

kDa = kilodalton

kg = kilogramo

L = litro

CL = cromatografía líquida

mg =miligramo

min = minuto

mL = mililitro

mm = milimolar

EM = espectrometría de masas

nM = nanomolar

pM = picomolar

d.e. = desviación estándar

|jC¡ = microcurio

|jg = microgramo

jL = microlitro

jM = micromolar

jm = micrómetro

°C = grado Celsius

Estos símbolos de una letra tienen el significado siguiente cuando representan aminoácidos:

A = alanina

R = arginina

N = asparagina

D = ácido aspártico

C = cisteína

E = ácido glutámico

Q = glutamina

G = glicina

H = histidina

I = isoleucina

L = leucina

K = lisina

M = metionina

F = fenilalanina

P = prolina

S = serina

T = treonina

W = triptófano

Y = tirosina

V = valina

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Preparación del extracto de nepentesina

Productos químicos

Se compró agua y acetonitrilo, de grado HPLC Burdick & Jackson, de VWR. Se compró ácido fórmico, Tris y glicina de Sigma Aldrich.

Cultivo vegetal

Se compraron trasplantes de Nepenthes rafflesiana, Nepenthes ampularia, Nepenthes mirabilis, y Nepenthes globosa se compraron de Keehns Carnivores (www.keehnscarnivores.ca). Estos se colocaron en macetas con corteza de madera, perlita, turba en polvo y humus (40, 35, 10, 5 %, respectivamente). Las condiciones de crecimiento implicaron 14 horas de luz al día, 80 % humedad y temperatura en el intervalo de 23 °C a 28 °C con 2 a 3 riegos a la semana. Tras la madurez de la jarra, las plantas se alimentaron con una o dos Drosophila por jarra y el fluido de la jarra se recogió una semana después. Se dejó que las jarras y sus secreciones se recuperaran durante una semana antes de una segunda ronda de alimentación y extracción.

Preparación de extracto

Se recogió fluido de la jarra de las cuatro especies de plantas y se combinó. El fluido de la jarra bruto se aclaró primero a través de un filtro de 0,22 pm, a continuación se concentró de 80 a 100 veces usando un filtro de corte de peso molecular de 10 kDa de ultracentrífuga Amicon (ambos de Millipore). Antes de usarlo en las digestiones, el concentrado se activó con ácido con glicinaHCl 100 mM (pH 2,5) durante 3 horas, a continuación se lavó 3X con glicina-HCl 100 mM (pH 2,5) en el dispositivo de filtración, usando un volumen de fluido de 10X para cada lavado. Las bacterias aisladas finales se rediluyeron a continuación a una concentración de 11X en base al muestreo original de fluido de la jarra.

Caracterización del extracto de fluido de jarra

Las secreciones de fluido de la planta de jarra se concentraron y las enzimas de digestión se activaron mediante reducción del pH (pH 2,5). El impacto del procedimiento de enriquecimiento y la activación sobre el proteoma del fluido se determinó usando procedimientos proteómicos. Primero, para confirmar la presencia de enzima nepentesina, el concentrado inactivo se separó mediante SDS-PAGE. Siete zonas de gel contiguas con tinción de Coomassie muy tenue se digirieron con tripsina y se analizaron mediante nanoCL-EM/EM usando procedimientos convencionales. No cabe esperar que este sea un catálogo completo del proteoma del fluido activado, pero el análisis confirmó la presencia de la proteasa aspártica nepentesina I/II, así como de una glucanasa, quitinasa, carboxipeptidasa y peroxidasa de origen vegetal, además de niveles moderados de Drosophila y contaminación bacteriana. La baja complejidad del proteoma del fluido es compatible con los análisis recientes, Hatano N, Hamada T (2012) Proteomic analysis of secreted protein induced by a component of prey in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata. Journal of Proteomics 3;75(15):4844-52 (publicación electrónica de 15 de junio de 2012), pero se encontró nepentesina-I distribuida a lo largo de un intervalo de masas mucho más amplio en este análisis (40-70 kDa).

El fluido activado con ácido se procesó y analizó de una manera similar. El procedimiento de activación redujo el rendimiento total de proteínas y también pareció simplificar la composición. Aparte de nepentesina-I, solo se observó una contaminación pequeña de queratina y actina. Estos análisis indican la baja complejidad del fluido enriquecido, en el que la nepentesina es el componente principal. La concentración total de proteínas del fluido activado y enriquecido 80X se midió mediante un ensayo de BCA y se determinó que era 22 ng/pL. Este valor es compatible con un estudio anterior que describe el enriquecimiento del fluido. Tokes ZA, y col., Digestive Enzymes Secreted by Carnivorous Plant Nepenthes-Macferlanei-L. Planta 119(1):39-46 (1974).

Ejemplo 2: Purificación de extracto de nepentesina

Purificación de extracto

Se equilibró pepstatina inmovilizada en sefarosa en una columna de 50 x 2 cm de DI en glicina-HCl 20 mM, pH 2,5-3. El fluido de la jarra filtrado (preparado como se describe en el Ejemplo 1) se sometió a dos ciclos a través de la columna y la columna se lavó con 100 mL de tampón de equilibrio (glicina-HCl 20 mM, pH 2,5). La columna se eluyó con bicarbonato de amonio 100 mM a pH 8,7 y se recogieron las fracciones. Con el fin de conservar al máximo la actividad enzimática, el pH se disminuyó a 4 inmediatamente después de la recogida de las fracciones con glicina-HCl 2 M, pH 2,5. La actividad se verificó usando un ensayo de digestión y las fracciones más activas se combinaron y concentraron hasta aproximadamente 80x, en base al volumen original de fluido.

Las únicas endoproteasas encontradas a niveles detectables en el fluido y/o extracto de Nepenthes son proteasas aspárticas y prolil endoproteasa.

Ejemplo 3: Nepentesina I recombinante

El gen para la nepentesina I (SEQ ID NO: 4; que codifica los residuos aminoacídicos 20-413, de N. gracilis,, sin la secuencia señal de la planta) se preparó a partir de ADNc de nepentesina I y se colocó entre los sitios de restricción Ndel y HindIII. Esta secuencia se clonó en pET21a, usando T4 ADN ligasa (1 U) (New England Bio, NEB), tampón de T4 a Dn ligasa (NEB), ATP (0,5 mM) (NEB), 0,5 pg de vector pET21a y 2 pg de a Dnc de nepentesina I. Esta se incubó a 18 °C durante 4 horas. La mezcla de ligación (5 pL) se añadió a 200 pL de células competentes NovaBlue y se incubó en hielo durante 15 minutos. Las células se transformaron mediante choque térmico (45 segundos a 42 °C, a continuación inmediatamente en hielo, con 1 ml de medio LB), se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se sembraron en placas con antibióticos (tetraciclina y ampicilina). Después de confirmar la presencia de genes en varias colonias blancas, se eligió una colonia representativa para Maxiprep. El plásmido recombinante resultante pET21a/R.NepI se transformó en C41 de E. coli mediante choque térmico como anteriormente, para expresión con inducción por IpTG. Aquí, las células se hicieron crecer a una DO⁶⁶⁰de 0,6 y se indujeron con IPTG 0,1 mM durante cuatro horas a 37 °C. La proteína expresada fue a cuerpos de inclusión.

Los cuerpos de inclusión se aislaron como se indica a continuación. Las células se centrifugaron, se añadió tampón de lisis de sacarosa (25 % de sacarosa, TrisCl 50 mM pH 7,4, EDTA 1 mM, NaN31 mM e inhibidores de proteasas) y las células se sometieron a cuatro rondas de congelación/descongelación y sonicación. Esto fue seguido de adición de ADNasa y ARNasa durante una incubación de 30 min a temperatura ambiente. El preparado se centrifugó (~15 min a 5000 x g) para sedimentar los cuerpos de inclusión y los fragmentos de membrana. Este sedimento se resuspendió en tampón Triton (TrisCl 50 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, p-mercaptoetanol 1 mM, NaN3 1 mM, 0,5 % de Triton X100 inhibidores de proteasas) y se realizó la sonicación en hielo. Se centrifugó de nuevo, para sedimentar los cuerpos de inclusión, y el sedimento se lavó dos veces en hielo (con mezcla y sonicación) en un tampón exento de Triton (TrisCl 50 mM pH 7,4, NaCl 10 mM, p-mercaptoetanol 1 mM, NaN31 mM, inhibidores de proteasas).

El sedimento proteico se sometió a continuación a replegamiento. Se suspendió un g de cuerpos de inclusión en 1 L de CAPS 50 mM pH 10,5, urea 8 M, EDTA 1 mM, glicina 1 mM, NaCl 500 mM, p-mercaptoetanol 300 mM y se agitó durante 1 h. La suspensión se dializó contra Tris 50 mM, pH 11, dos veces durante 1 hora cada vez, seguido de un día de diálisis contra Tris 50 mM, pH 7,5 y, por último, diálisis contra tampón de fosfato con NaCl 300 mM, pH 7,0.

La solución se centrifugó a alta velocidad (10000 x g durante 15 min) para eliminar toda la proteína no replegada y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,22 pm. La nepentesina I se activó a pH 2,5 (glicina-HCl) durante la noche a 4 °C. Los rendimientos varían de 10 a 100 mg de proteína activada plegada, partiendo de 1 L de cultivo celular.

Ejemplo 4: Nepentesina II recombinante

El ADNc de nepentesina II (véase la SEQ ID NO: 14) de N. gracilis,, sin la secuencia señal de la planta) se usó para preparar ADNc de nepentesina II. Esta secuencia se clonó en pET21a entre los sitios de restricción Ndel y HindIII, usando T4 AND ligasa (1 U) (New England Bio, NEB), tampón de T4 ADN ligasa (NEB), ATP (0,5 mM) (NEB), 0,5 pg de vector pET21a y 2 |jg del ADNc de nepentesina II. Esta se incubó a 18 °C durante 4 horas. La mezcla de ligación (5 jL ) se añadió a 200 jL de células competentes NovaBlue y se incubó en hielo durante 15 minutos. Las células se transformaron mediante choque térmico (45 segundos a 42 °C, a continuación inmediatamente en hielo, con 1 ml de medio LB), se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se sembraron en placas con antibióticos (tetraciclina y ampicilina). Después de confirmar la presencia de genes en varias colonias blancas, se eligió una colonia representativa para Maxiprep. El plásmido recombinante resultante pET21a/R.NepI se transformó en C41 de E. coli mediante choque térmico como anteriormente, para expresión con inducción por IPTG. Aquí, las células se hicieron crecer a una DO⁶⁶⁰de 0,6 y se indujeron con IPTG 0,1 mM durante cuatro horas a 37 °C. La proteína expresada fue a cuerpos de inclusión.

La solución se centrifugó a alta velocidad (10000 x g durante 15 min) para eliminar toda la proteína no replegada y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,22 jm . La nepentesina II se activó a pH 2,5 (glicina-HCl) durante la noche a 4 °C. Los rendimientos varían de 10 a 100 mg de proteína activada plegada, partiendo de 1 L de cultivo celular.

Ejemplo 5. Glucosilación de enzimas de Nepenthes

La producción recombinante de nepentesina I (A) y II (C) a partir del replegamiento de cuerpos de inclusión de E. coli purificados se muestra en la Figura 2. Se monitorizó cada etapa del procedimiento de replegamiento y se muestran como: proteína total solubilizada de cuerpos de inclusión de E. coli purificados (carril 1), nepentesina replegada después de la diálisis final (carril 2), activación con ácido durante 24 horas (glicina-HCl 100 mM, pH 2,5) del producto replegado (carril 3). Se realizó el análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF en las enzimas nepentesina I (B) y II (D) activadas con ácido durante 24 horas. Los análisis de CL/EM-EM de los productos de la digestión en gel de las bandas activadas con ácido (A y C, carriles 3) confirmaron la presencia de nepentesina I y II puras, respectivamente.

Se realizaron análisis mediante MALDI-TOF de las nepentesinas naturales (agrupadas a partir de 2-3 especies). Los resultados se muestran en la Figura 3. Se cree que la masa a 37 200 es nepentesina II y la masas a 38 951 es nepentesina I. En cualquier caso, son diferentes a las masas de las enzimas recombinantes, como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Masa de las nepentesinas recombinantes frente a las naturales

Sin ceñirnos a la teoría, creemos que esto confirma que la nepentesina I es de naturaleza glucosilada. La enzima madura activa de nepentesina II recombinante es más grande que la que existe en la naturaleza. Sigue siendo posible que la nepentesina II natural sea incluso más pequeña en cuanto a la secuencia proteica, pero tenga algo de glucosilación. Las masas de las enzimas naturales descritas en esta memoria difieren de las de Athauda y col., probablemente porque la espectrometría de masas es una técnica más exacta que la SDS-PAGE para determinar la masa de una molécula.

Ejemplo 6. Comparación de las enzimas de Nepenthes con la pepsina

Se realizó SDS-PAGE en gliadina digerida por la enzima indicada. La SDS-PAGE realiza un perfil aproximado de las proteínas según el peso molecular. La digestión de gliadina con pepsina, extracto de Nepenthes purificado o nepentesina II recombinante se realizó en una proporción de sustrato a enzima de aproximadamente 100:1. Se incubó gliadina (5 mg) con el preparado indicado a 37 °C durante 2 h. La Figura 4 muestra un gel de SDS-PAGE de la digestión de gliadina por nepentesina II recombinante, extracto de Nepenthes o pepsina. El gel muestra que la digestión de la gliadina por la nepentesina II recombinante da como resultado un patrón de digestión diferente y la digestión en péptidos más pequeños que la pepsina. Esto es particularmente evidente en las áreas enmarcadas del gel. El extracto de Nepenthes es tan efectivo para degradar la gliadina que no se observa proteína gliadina residual en esta región.

La Tabla 2 muestra los residuos preferidos, de baja probabilidad y prohibidos para la escisión carboxiterminal mediante pepsina, nepentesina I y II recombinantes y extracto de Nepenthes. La especificidad de la escisión carboxiterminal, la manera clásica en que se clasifican las enzimas, se resume en base a una gran colección de sustratos proteicos. Las nepentesinas son bastante diferentes de la pepsina en cuanto a especificidad de escisión, lo que indica que la nepentesina y la pepsina son enzimas muy diferentes. Los datos de la pepsina proporcionados en la Tabla 2 se resumen de la bibliografía (p. ej., “Determining the Specificity of Pepsin for Proteolytic Digestion”, una tesis de Melissa Palashoff disponible en: books.google.ca/books?id=7O1nU4-6T-wC&printsec=frontcover#v=onepage&q&f=false). Los datos de las enzimas de Nepenthes se resumen a partir de estudios de digestiones tales como el descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos de n.° de publicación 2014/0186330.

TABLA 2: Escisión carboxiterminal

Se realizó un ensayo de CL-EM para determinar la capacidad de cada enzima para escindir el péptido tóxico del gluten de 33-mer. Se incubó 33-mer con la enzima indicada durante 0,5 h en una proporción (sustrato:enzima) de 100:1 y se determinó la cantidad de 33-mer no digerido con respecto a un patrón, siguiendo la práctica habitual. Los datos se proporcionan como porcentaje del control (33-mer sin enzima añadida).

La Tabla 3 proporciona la digestión del fragmento resistente a la pepsina de la proteína del gluten que se denomina “33-mer” (LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF) SEQ ID NO: 15. Esta secuencia está fuertemente ligada a la enfermedad celíaca y a menudo se denomina péptido tóxico del gluten. Como todas las proteínas de gluten, el 33-mer es rico en los aminoácidos Q, P y L. Los tiempos de digestión prolongados usando solo pepsina no tuvieron mucho efecto sobre este péptido, fue muy resistente a la digestión con pepsina. En cambio, la nepentesina I, la nepentesina II y la fracción de alto peso molecular (>aprox. 10 kDa) de extracto de Nepenthes (fluido) presentaron la capacidad de digerir este péptido. Los datos se proporcionan como % de control (33-mer sin enzima).

TABLA 3: Di estión de 33 mer

Se incubó suspensión de proteína gliadina (5 mg de gluten) con 40 o 200 |jg de nepentesina I recombinante o nepentesina II recombinante o con 40 jg de pepsina y se examinó para determinar el grado de digestión (como se determina mediante el grado de turbidez de las soluciones correspondientes). Las cantidades crecientes de pepsina no tienen ningún efecto sobre la turbidez de la suspensión (datos no mostrados). La Figura 5A es una imagen de viales que contienen suspensión de gliadina y la cantidad indicada de nepentesina I recombinante, nepentesina II recombinante o pepsina. La Figura 5B es similar, pero se usaron 5, 20 o 100 jg de extracto de Nepenthes. Los viales incubados con nepentesina o extracto de Nepenthes fueron menos turbios que el vial de pepsina, lo que demuestra la digestión más enérgica de la gliadina.

Estos datos demuestran que los productos de la digestión de la proteína gliadina son diferentes entre las enzimas de Nepenthes y la pepsina a nivel de gel (que presenta los productos de digestión “más grandes”), a nivel de péptido (procesamiento del 33-mer) y a nivel de suspensión (aclarando la solución). La pepsina, la neprosina y la nepentesina son proteínas muy diferentes, con especificidades de escisión distintas, particularmente en lo que respecta a las proteínas del gluten. En pocas palabras, la pepsina no digiere adecuadamente el gluten de una manera que evite la toxicidad del gluten, mientras que las enzimas de Nepenthes sí lo hacen.

Ejemplo 7. Digestión de gliadina por extracto de Nepenthes

Se realizaron digestiones de gliadina por nepentesina en solución usando un inyector de muestras automático LEAP HTX-PAL y un sistema de dosificación diseñado para aplicaciones de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX). Los datos se recogieron usando un espectrómetro de masas QqTOF Triple-TOF 5600 de AB Sciex. Los péptidos se identificaron usando Mascot (v2.3) a partir de datos de EM/EM. Brevemente, se mezclaron 12 pmol de gliadina cruda (comprados en Sigma Aldrich) con 2 pL de extracto concentrado 100x, producido como se describe en el Ejemplo 1. Después de la digestión, se inyectó todo el volumen en un sistema de CL de fase inversa conectado al espectrómetro de masas. Los péptidos se atraparon en una columna Magic C18 de 7 cm, 150 pm de d.i. y se eluyeron con un gradiente de acetonitrilo de 10 % a 40 % en 10 o 30 minutos. Los péptidos detectados en estos análisis se seleccionaron para fragmentación CID en múltiples adquisiciones de espectros EM/EM dependientes de la información. Se buscaron espectros en una base de datos en miniatura que contenía las secuencias de todas las proteínas gliadina de trigo identificadas (a, p, y, w) más la glutenina de alto y bajo peso molecular.

La Figura 6 muestra la longitud promedio de todos los péptidos identificados a partir de la digestión de gliadina de trigo con extracto de Nepenthes, usando CL-EM/EM, después de 1, 5, 10, 15, 30, 60, 130, 360 u 810 minutos a 37 °C. Se usó un límite de corte de confianza de 95 % (p < 0,05) en las puntuaciones para reducir la identificación de falsos positivos. La desviación estándar relativa de la longitud de los péptidos se muestra en la figura insertada.

La Figura 8 muestra los mismos datos que la Figura 6, como una probabilidad acumulada de obtener una cierta longitud después de 10, 60, 120, 360 u 810 minutos de digestión a 37 °C.

Para la cartografía de la digestión, se realizó la digestión de gliadina como se describió anteriormente, excepto que la proporción de sustrato a enzima fue aproximadamente1000:1. La gliadina se digirió a 37 °C durante 2 h con extracto de nepentesina, extracto de nepentesina purificado o nepentesina I recombinante.

La preferencia de escisión de PI de la nepentesina I recombinante es muy similar a la del extracto de fluido concentrado, así como a la fracción purificada del extracto (Figura 9A). Sorprendentemente, el extracto presentó una preferencia superior por la glutamina que el extracto purificado o la nepentesina I recombinante.

La preferencia de escisión de P1' de la nepentesina I recombinante es muy similar a la del extracto de fluido concentrado, así como a la fracción purificada del extracto (Figura 9B). Sorprendentemente, el extracto presentó una preferencia superior por la prolina que el extracto purificado o la nepentesina I recombinante.

El extracto contiene nepentesina I, nepentesina II y neprosina, pero la estrategia de purificación recupera más nepentesina I que las otras dos enzimas. Sin desear ceñirnos a la teoría, se cree que la escisión intensificada en la posición de la glutamina PI y la posición de la prolina P1' por el extracto se debe a la neprosina, la nepentesina II y/o a la sinergia entre dos o más de las enzimas.

Ejemplo 8. Preparación de extracto de neprosina

Se extrajo neprosina del fluido de digestión de la especie Nepenthes. El fluido se recogió de la jarra de la planta 5 días después de alimentarla con moscas de la fruta congeladas. El líquido recogido se filtró para eliminar los insectos muertos y se lavó repetidamente con acetato de amonio 20 mM pH 5,0 mediante múltiples ciclos de concentración/filtración a través de una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa.

La neprosina se purificó parcialmente de la nepentesina en una columna Mono P 5/50 GL. Se inyectaron 5 mL de fluido concentrado 1,5X en la columna Mono P equilibrada a fuerza iónica baja (acetato de amonio 20 mM pH 6). Las proteínas se eluyeron con un gradiente de NaCl de 40 min (0 a 1 M) a 0,5 ml/min. Las fracciones se recogieron cada 0,5 ml. La actividad de la neprosina se evaluó en cada fracción digiriendo una proteína rica en prolina intrínsecamente desordenada, APLF. Los péptidos generados se separaron en una columna C8 y se analizaron mediante CL-EM/EM en un tripleToF 5600 (AB Sciex). Las fracciones 19-22 se enriquecieron en neprosina (Figura 10) y se denominan extracto de neprosina bruto; la neprosina es distinta de la nepentesina, que se enriqueció en fracciones posteriores.

Ejemplo 9. Eficacia de las enzimas de Nepenthes para inhibir la inflamación en los intestinos de ratones intolerantes al gluten

Objetivo: analizar la eficacia de la digestión in vitro de gliadina usando extracto de Nepenthes o nepentesina II recombinante para impedir el daño inducido por la gliadina in vivo usando ratones NOD-DQ8 sensibilizados con gliadina.

Diseño experimental: se sensibilizaron ratones NOD DQ8 con toxina del cólera (CT) y gliadina para romper la tolerancia oral a la gliadina. Los controles negativos se trataron con CT y gliadina, pero se dejaron exentos de exposiciones posteriores a gliadina oral. Las exposiciones a gliadina se realizaron con productos de la digestión de gliadina con una proteasa porcina (pepsina) que contenía un abanico de péptidos derivados tóxicos e inmunogénicos. Los grupos de tratamiento se expusieron a gliadina predigerida con extracto de Nepenthes o nepentesina II recombinante (durante 90 minutos a 37 grados Celsius). Se ha planteado la hipótesis de que los productos de la digestión de gliadina con extracto de Nepenthes o nepentesina II recombinante serán menos inmunogénicos in vivo que los productos de la digestión de gliadina con pepsina.

Grupos:

Control positivo (n=8) sensibilizado y expuesto a gliadina. Los ratones se sensibilizaron con toxina del cólera (CT) y pepsina-gliadina (P-G) (1 vez a la semana durante 3 semanas). Durante el período experimental, los ratones se alimentaron por sonda con P-gliadina (3 veces a la semana durante 3 semanas).

Control negativo (n=8) sensibilizado (a continuación, exento de gliadina). Los ratones se sensibilizaron con toxina del cólera (CT) y pepsina-gliadina (P-G) (1 vez a la semana durante 3 semanas). Durante el período experimental, los ratones se alimentaron por sonda con vehículo (3 veces a la semana durante 3 semanas).

Tratamiento 1 (n = 8): extracto de Nepenthes. Los ratones se sensibilizaron con toxina del cólera (CT) y pepsinagliadina (P-G) (1 vez a la semana durante 3 semanas). Durante el período experimental, los ratones se alimentaron con gliadina digerida con extracto de Nepenthes (3 veces a la semana durante 3 semanas).

Tratamiento 2 (n = 8): los ratones se sensibilizaron con toxina del cólera (CT) y pepsina-gliadina (P-G) (1 vez a la semana durante 3 semanas). Durante el período experimental, los ratones se alimentaron por sonda con gliadina digerida por nepentesina II (3 veces a la semana durante 3 semanas).

Resultados:

Los 4 grupos de ratones se sensibilizaron con productos de la digestión de gliadina con pepsina más toxina del cólera. Los controles negativos se dejaron exentos de exposición a gliadina después de la sensibilización. Los controles positivos y los grupos de tratamiento se expusieron por vía oral a gliadina después de la sensibilización. La diferencia en los grupos tratados fue que la gliadina se predigirió con extracto de Nepenthes o nepentesina II. De esta manera, los “controles negativos” no estuvieron totalmente libres de la exposición a gliadina (ya que fueron expuestos durante la fase de sensibilización), y así simulaban la situación clínica de un paciente celíaco que entraba en remisión mientras seguía una dieta exenta de gluten.

Efectos clínicos/tóxicos: se evaluó el aspecto general de los ratones (movimiento, apertura de ojos, aseo). No se observaron efectos nocivos en ninguno de los grupos de tratamiento o control. Se registraron los pesos corporales a lo largo de los experimentos y no se observó pérdida de peso en ninguno de los grupos (Figura 11).

Cambios inmunitarios intrínsecos a la exposición a gliadina: se realizó inmunohistoquímica para analizar los linfocitos intraepiteliales CD3+ en los intestinos de los ratones de cada grupo de tratamiento (Figura 12). Este es un marcador inmunitario intrínseco rápido y precoz de la exposición intestinal a gliadina en el modelo. La exposición a gliadina dio como resultado recuentos de IEL aumentados en comparación con los ratones de control negativo y con los ratones expuestos a gliadina que fue predigerida con extracto de Nepenthes o nepentesina II (Figura 13). No se observaron diferencias en los recuentos de IEL entre los grupos tratados con extracto de Nepenthes y nepentesina II.

Proporciones de vellosidades a criptas: se observaron tendencias no significativas a proporciones de vellosidades a criptas (V/C) inferiores en el grupo de control positivo (Figura 14). Los grupos tratados con extracto de Nepenthes y nepentesina II tuvieron una tendencia a proporciones superiores en comparación con los controles positivos y negativos.

Interpretación/análisis de los resultados:

Una exposición de tres semanas a gliadina predigerida con extracto de Nepenthes o nepentesina II fue segura y no indujo disminuciones a corto plazo en el peso corporal ni ningún acontecimiento clínico adverso en los ratones.

Las exposiciones orales a gliadina condujeron a aumentos significativos en los recuentos de IEL en el intestino delgado en ratones previamente sensibilizados. El aumento de IEL no se observó en ratones que fueron expuestos a gliadina que se había predigerido con extracto de Nepenthes o nepentesina II. Esto sugiere una antigenicidad luminal inferior de la gliadina tratada con extracto de Nepenthes o nepentesina II.

La reducción en las proporciones V/C fue muy moderada en el grupo de control positivo. Sin embargo, hubo tendencias no significativas a proporciones V/C superiores en los ratones que fueron expuestos a gliadina que fue predigerida con extracto de Nepenthes o nepentesina II. La reducción en las proporciones V/C en este modelo animal es moderada y varía con la duración y la dosis de exposición a gliadina. Las diferencias son más evidentes entre los controles positivos y negativos cuando estos últimos no han sido expuestos en absoluto a gliadina/gluten (no sensibilizados). Se cree que las diferencias en las proporciones V/C usando extracto de Nepenthes nepentesina II predigeridos en un entorno más crónico y/o en comparación con los ratones que no han sido expuestos en absoluto a gliadina (no sensibilizados) serían más pronunciadas.

Conclusión general: los resultados demuestran un efecto de la predigestión de gliadina con extracto de Nepenthes o nepentesina II para reducir la antigenicidad de los péptidos de gliadina en el intestino delgado de los ratones NOD/DQ8 sensibilizados.

Ejemplo 10. Digestión de gliadina por la neprosina

Se incubó extracto bruto de neprosina con gliadina a pH 2,5 y los fragmentos peptídicos resultantes se analizaron mediante EM. Los resultados se muestran en las Figuras 15A y 15B (un punto [.] indica un sitio de escisión). La cobertura de la secuencia proteica por el extracto fue 61 %. Aproximadamente 57 % de los sitios potenciales de escisión de prolina (P) (carboxiterminales) en la gliadina fueron procesados por el extracto de neprosina bruto. Sin ceñirnos a la teoría, se cree que al menos una porción de los sitios de escisión de la glutamina fueron debidos a una pequeña cantidad de contaminación del extracto con proteínas de nepentesina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende neprosina o una variante de la misma con al menos 85 % de homología de secuencia con la misma, y opcionalmente una enzima seleccionada del grupo que consiste en nepentesina I, nepentesina II, variantes de las mismas con al menos 85 % de homología de secuencia con las mismas y mezclas de las mismas, para uso en la atenuación o prevención de la inflamación intestinal debida a la presencia de antígenos alimentarios peptídicos en un intestino de un paciente.

2. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el paciente padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en sensibilidad al gluten y enfermedad celíaca.

3. La composición para uso de la reivindicación 1, donde la nepentesina I, la nepentesina II, la neprosina, variantes de las mismas con al menos 85 % de homología de secuencia con las mismas o una mezcla de las mismas es una proteína recombinante.

4. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde una dosis unitaria de la composición farmacéutica comprende entre 1 mg y 25 g de la enzima.

5. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la composición farmacéutica está entre pH 5 y pH 8.

6. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la variante es una proteína que tiene una secuencia aminoacídica con al menos 85 % de homología de secuencia con una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21.

7. Una composición farmacéutica que comprende neprosina y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde la neprosina es una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos 90 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, donde la secuencia aminoacídica de la neprosina comprende una secuencia aminoacídica que tiene al menos 90 % de homología de secuencia con la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 1 sin una secuencia señal.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, que comprende además al menos una enzima de Nepenthes adicional o una variante de la misma con al menos 85 % de homología de secuencia con la misma.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, donde la al menos una enzima de Nepenthes adicional o variante de la misma es nepentesina I, nepentesina II y/o una variante de las mismas con al menos 85 % de homología de secuencia con las mismas.

11. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, que es una formulación de liberación prolongada.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, donde la neprosina y/o una o más enzimas de Nepenthes comprenden un propéptido.

13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, donde la composición se mantiene a pH neutro.

14. Una formulación farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 13, donde la neprosina está presente en múltiples capas de tal manera que la neprosina se libera continuamente mientras la formulación está presente en el estómago.

15. Una formulación farmacéutica que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 14, que comprende además un tampón farmacéuticamente aceptable, de tal manera que el pH de la neprosina permanece a pH 5 o 6 tras entrar en contacto con los ácidos en el estómago.