ES2887942T3 - Procedimiento y material para el secuestro diferenciado de sustancias de distintos grupos de sustancias con hidrogeles que contienen componentes sulfatados o sulfonados - Google Patents

Procedimiento y material para el secuestro diferenciado de sustancias de distintos grupos de sustancias con hidrogeles que contienen componentes sulfatados o sulfonados Download PDF

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Abstract

Procedimiento para el secuestro diferenciado de sustancias de diferentes grupos de sustancias A y B en un hidrogel sulfatado y/o sulfonado y para el empobrecimiento de sustancias del grupo de sustancias A en un biofluido con liberación diferenciada simultánea de sustancias del grupo de sustancias A o B del hidrogel sulfatado y/o sulfonado en el biofluido o la unión reducida de sustancias del grupo de sustancias B en el hidrogel sulfatado y/o sulfonado, en el que el hidrogel sulfatado y/o sulfonado se selecciona de un grupo de hidrogeles de tipo 1, tipo 2, tipo 3 o de tipo 4 y los hidrogeles están constituidos por elementos constituyentes no cargados y elementos constituyentes cargados caracterizados por que los elementos constituyentes cargados se caracterizan por un parámetro calculado a partir del número de grupos sulfato y/o sulfonato por unidad de repetición dividido por la masa molar de la unidad de repetición de 0,0040-0,0060 mol/g para el tipo 1, de 0,0025-0,0040 mol/g para el tipo 2, de 0,0005-0,0025 mol/g para el tipo 3 y de 0,0040-0,0100 mol/g para el tipo 4 y los hidrogeles hinchados presentan un módulo de almacenamiento inferior a 20 kPa y las propiedades de los hidrogeles hinchados presentan una concentración de grupos sulfato o sulfonato en mmol/ml de 0,09 a 0,20 en el tipo 1, de 0,05 a 0,18 en el tipo 2, de 0,01 a 0,12 en el tipo 3 y de 0,16 a 0,8 en el tipo 4, y por que se influye en la concentración de sustancias del grupo de sustancias A y de sustancias del grupo de sustancias B en el biofluido mediante la elección del tipo de hidrogel.

Description

DESCRIPCIÓN
P ro ce d im ie n to y m a te ria l p a ra e l se cu e s tro d ife re n c ia d o de su s ta n c ia s de d is tin to s g ru p o s de s u s ta n c ia s con h id ro g e le s q ue co n tie n e n c o m p o n e n te s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s
La inve nc ión se re fie re a un p ro ce d im ie n to p a ra el se cu e s tro d ife re n c ia d o de su s ta n c ia s de d ife re n te s g ru p o s de su s ta n c ia s A y B con h id ro g e le s q ue co n tie n e n c o m p o n e n te s su lfa ta d o s y /o s u lfo n a d o s y el e m p o b re c im ie n to de su s ta n c ia s d e l g ru p o de su s ta n c ia s A en un b io flu id o con libe ra c ión d ife re n c ia d a s im u ltá n e a de s u s ta n c ia s de l g rup o de s u s ta n c ia s A o B de l h id ro ge l q ue c o n tie n e c o m p o n e n te s s u lfa ta d o s y /o s u lfo n a d o s en el b io flu id o y /o la un ión re d u c id a de las su s ta n c ia s de l g ru p o de su s ta n c ia s B en el h id ro g e l q u e c o n tie n e co m p o n e n te s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s . La inve n c ió n se re fie re a d e m á s a h id ro g e le s q u e p ue de n o b te n e rse s in té tica m e n te b a sa d o s en p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) co m o c o m p o n e n te de red y m o lé cu la s de re ticu la c ió n q u e co n tie n e n a m in a o tio l co m o c o m p o n e n te s de red a d ic io n a le s q ue p ue de n ca ra c te r iza rs e y u tiliza rse p a ra e l p ro ce d im ie n to m e n c io n a d o a n te r io rm e n te co m o m a te ria l p a ra e l se cu e s tro d ife re n c ia d o de su s ta n c ia s de d ife re n te s g ru p o s de su s ta n c ia s . Los g ru p o s de su s ta n c ia s A y B no son g ru p o s de s u s ta n c ia s d e fin id o s q u ím ica m e n te , s ino q u e p ueden c o n te n e r d ife re n te s su s ta n c ia s seg ún el tip o de h id ro ge l, q ue en la co rre sp o n d ie n te c o n s te la c ió n y c o m p o s ic ió n dan lu g a r al se cu e s tro d ife re n c ia d o seg ún la inve nc ión d e n tro de l s is te m a g e n e ra l. P o r lo tan to , los g ru p o s de su s ta n c ia s A y B se d e fin e n p o r su co m p o rta m ie n to en el s is te m a g en e ra l.
El s e c to r de a p lica c ió n de la inve n c ió n se e n c u e n tra en el s e c to r de la b io te cn o lo g ía y la m e d ic in a , en el q ue a n ive l m o le c u la r d e te rm in a d a s s u s ta n c ia s se e lim in a n s e le c tiva m e n te de un b io flu id o y se se cu e s tra n en un h id ro ge l y, p o r o tra parte , o tras s u s ta n c ia s no se se cu e s tra n e sp e c ífica m e n te , s ino q u e se libe ran s e le c tiva m e n te d e sd e el h id ro ge l en e l b io flu id o . P o r lo tan to , en un se n tid o m ás am p lio , se tra ta de un p ro ce d im ie n to de se p a ra c ió n a n ive l m o lecu la r. En un se n tid o m ás a m p lio , e l s e c to r de a p lica c ió n de la inve n c ió n se e n c u e n tra en el s e c to r de u tiliza c ió n de h id ro g e le s c a rg a d o s n e g a tiva m e n te de fo rm a g ra d u a l p a ra a p lica c io n e s té cn ica s , b io m é d ica s y b io ló g ica s , p o r e je m p lo , p a ra e l c u ltivo de c é lu la s de m a m ífe ro o un tra ta m ie n to a n tib a c te ria n o de sup e rfic ie s .
En e l e s ta d o de la té cn ica , se co n o ce n h id ro g e le s con c o m p o n e n te s su lfa ta d o s , p o r e je m p lo , h id ro g e le s de PEG en e s tre lla -g lic o sa m in o g lic a n o , p o r e l d o cu m e n to W O 2010 /060485 A 1, y se e s tá n in ve s tig a n d o p a ra su uso en a p lic a c io n e s b io te cn o ló g ica s o co m o m a te ria le s de re e m p la zo de im p la n te s o te jid o s p a ra su uso en tra ta m ie n to s re ge n e ra tivo s .
U n a p ro p ie d a d c lave de e s to s m a te ria le s co n s is te en las in te ra cc io n e s re su lta n te s e n tre g ru p o s su lfa to p re se n te s en las c a d e n a s p o lim é rica s de un c o m p o n e n te de los h id ro g e le s con p ro te ín a s so lu b le s , ta le s com o , p o r e je m p lo , p ro te ín a s q u e co n tro la n e l m e ta b o lism o , el tra n s p o rte y las fu n c io n e s de se ñ a liza c ió n ta le s co m o e n z im a s y m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s , c o m p re n d ie n d o las p rim e ra s , p o r e je m p lo , p ro te a sa s , lip o la sa s , a m ila sa s y las seg un da s , p o r e je m p lo , h o rm on as , n e u ro tra n sm iso re s , c ito c in a s , fa c to re s de c re c im ie n to y q u im io c in a s .
Las in te ra cc io n e s q u e son d e c is iva s p a ra la a fin id a d p o r e s ta s p ro te ín a s se b asan p rin c ip a lm e n te en fu e rza s e le c tro s tá tic a s e n tre los g ru p o s su lfa to o de á c ido su lfó n ico ca rg a d o s n e g a tiva m e n te de los h id ro g e le s en las c o n d ic io n e s de a p lica c ió n y las c a d e n a s la te ra le s de a m in o á c id o s ca rg a d o s p o s itiva m e n te de las p ro te ína s.
Este p rin c ip io ya se u tiliza a m p lia m e n te en e l e s ta d o de la té c n ica p a ra e l d e sa rro llo de h id ro g e le s q u e co n tie n e n a zú ca re s su lfa ta d o s (g lic o s a m in o g lic a n o s = G A G ) p a ra la lib e ra c ió n m a n te n id a de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s , p o r e je m p lo , p a ra los fa c to re s de c re c im ie n to V E G F (fa c to r de c re c im ie n to e n d o te lia l va s c u la r) y FG F-2 (fa c to r de c re c im ie n to de f ib ro b la s to s 2). A d e m á s, la lib e ra c ió n de FG F-2 y V E G F p o d ría a u m e n ta rse g ra d u a lm e n te re d u c ie n d o el g ra d o de su lfa ta c ió n en los h id ro g e le s de PEG en e s tre lla -G A G su b ya ce n te s . Se han u tiliza d o p o lím e ro s s in té tico s q ue co n tie n e n g ru p o s de á c id o su lfó n ico , p o r e je m p lo , con á c id o p o lie s tire n o s u lfó n ic o (A P S ), J. Phys. C he m . B, 2007 , 111 (13), p á g in a s 3391 -3397 , D O I: 10.1021 /jp 067707 d 9., o á c id o 2 -a c r ila m id o -2 -m e tilp ro p a n o s u lfó n ic o (p a te n te s de E s ta d os U n id os N° 5.451.617 y 5.011.275 y so lic itu d de p a te n te de E s ta d os U n id os N° 2008 /011412 ) co m o c o m p o n e n te s s u lfo n a d o s p a ra p ro d u c ir h id ro g e le s , p o r e je m p lo , p a ra su uso en len tes de co n ta c to . S in e m b a rg o , en la a c tu a lid a d no se co n o ce n re de s p o lim é ric a s h id ra ta d a s co va le n te m e n te re ticu la d a s q ue p orte n g ru p o s de á c id o su lfó n ico , es d ec ir, h id ro g e le s en los q ue los g ru p o s c a rb o x ilo de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) se hayan u tiliza d o co m o g ru p o s fu n c io n a le s p a ra la re ticu la c ió n con re ticu la n te s co rto s q u e co n tie n e n g ru p o s a m in a o p o lím e ro s q u e co n tie n e n g ru p o s am ina .
O tra d e s v e n ta ja es q ue las in te ra cc io n e s e n tre h id ro g e le s q ue co n tie n e n c o m p o n e n te s (o e le m e n to s c o n s titu ye n te s ) su lfa ta d o s o s u lfo n a d o s y p ro te ín a s h asta la fe ch a so lo se han in ve s tig a d o p rin c ip a lm e n te a p a rt ir de s o lu c io n e s con u na o d o s m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s y, a m e nu do , no en co n d ic io n e s f is io ló g ic a m e n te re le va n te s . En el con te x to b io ló g ico re leva n te , no o b s ta n te , e x is te n b io flu id o s con u na p lu ra lid a d de p ro te ín a s d ife re n te s a d ife re n te s c o n ce n tra c io n e s , e s ta n d o p re se n te s las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s en los b io flu id o s so lo en n ive les b a jos en el in te rva lo de 100 p g /m l - 2000 ng /m l, m ie n tra s q ue o tra s p ro te ín a s ta le s com o , p o r e je m p lo , a lb ú m in a e s tán p re se n te s en a lta s co n ce n tra c io n e s de a p ro x im a d a m e n te 60 m g /m l.
A e s te re spe cto , las fu e rz a s de a tra cc ió n p rin c ip a lm e n te e le c tro s tá tic a s e n tre los d o m in io s c a rg a d o s p o s itiva m e n te de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s y los g ru p o s su lfa to o su lfo n a to ca rg a d o s n e g a tiva m e n te en e l h id ro ge l d e se m p e ñ a n un p a p e l im p orta n te , p a ra c u y a e s tim a c ió n se p ue de u tiliz a r a m e n u d o e l pun to iso e lé c trico (IE P ) de u na p ro te ína . A d e m á s de la ca rg a n e ta en co n d ic io n e s f is io ló g ica s , q ue se p u e d e e s tim a r u tiliza n d o el IEP, la d is trib u c ió n de la ca rga , p o r e je m p lo , la p re se n c ia de a g ru p a c io n e s de ca rg a c a rg a d a s p o s itiva m e n te , a s í co m o las in te ra cc io n e s s e cu n d a ria s c a u sa d a s p o r e l ta m a ñ o y la e s tru c tu ra de la p ro te ín a , a s í co m o la fo rm a c ió n de fu e rza s in te rm o le cu la re s no ión icas m ás d é b ile s , ta le s com o , p o r e je m p lo , in te ra cc io n e s h id ró fob as , e n la ce s de p u e n te de h id ró g e n o o in te ra cc io n e s b ip o la re s , d e se m p e ñ a n un p ape l, p o r lo q u e no ha s ido h as ta fe c h a p o s ib le p re d e c ir la u n ión a b so lu ta o re la tiva de las p ro te ín a s a los h id ro g e le s . A d e m á s, se p rod u ce n p ro ce so s co m p e tit iv o s q ue h as ta la fe c h a no se han te n id o en c u e n ta y se d e b e n , p o r e je m p lo , a las in te ra cc io n e s de las p ro te ín a s d ia n a co n la a lb ú m in a , q ue es re sp o n sa b le de c o n tro la r la p re s ió n o sm ó tica y la re g u la c ió n de los p ro ce so s de tra n sp o rte , a sí co m o a in te ra cc io n e s e n tre la a lb ú m in a y e l h id ro ge l. A d e m á s, las c o n s ta n te s de u n ión q ue se u tilizan a m e n u d o en la lite ra tu ra p a ra p re d e c ir las in te ra cc io n e s m o le cu la re s e n tre los p o lím e ro s ca rg a d o s y las p ro te ín a s so lo son a d e cu a d a s p a ra d e s c r ib ir la in te ra cc ió n de los co m p le jo s m o lé c u la -p ro te ín a in d iv id u a le s en so lu c ió n , m ie n tra s q ue en los h id ro g e le s e x is te u n a fu e rte in flu e n c ia de las c a d e n a s p o lim é rica s a d ya ce n te s y la d is trib u c ió n tr id im e n s io n a l de los ce n tro s de c a rg a o de a fin id a d en la red p o lim é rica sob re las in te ra cc io n e s re su lta n te s y, p o r lo tan to , sob re la u n ión de las p ro te ín a s en e l h id ro ge l.
En co n se cu e n c ia , la se le c tiv id a d de la u n ión e n tre h id ro g e le s q u e co n tie n e n c o m p o n e n te s (e lem en to s co n s titu ye n te s ) su lfa ta d o s y /o s u lfo n a d o s y co m p o n e n te s m o le cu la re s de b io flu id o s c o m p le jo s aún no se ha a c la ra d o . C on los m é to d o s y p ro c e d im ie n to s e s ta b le c id o s , un co n tro l s e le c tivo de l n ive l de m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s m e d ia n te h id ro g e le s q ue co n tie n e n c o m p o n e n te s (e le m e n to s co n s titu ye n te s ) su lfa ta d o s o su lfo n a d o s en los b io flu id o s re le va n te s p a ra la a p lica c ió n so lo es p os ib le , p o r lo tan to , de fo rm a lim itada .
El o b je to de la inve nc ión c o n s is te en p ro p o n e r un p ro ce d im ie n to q u e p e rm ita in flu ir s e le c tiva m e n te en la co n c e n tra c ió n de d e te rm in a d a s su s ta n c ia s en b io flu id os .
El o b je to se lo g ra m e d ia n te un p ro ce d im ie n to y un m a te ria l q u e tie n e las ca ra c te rís tic a s seg ún las re iv in d ica c io n e s in d e p e n d ie n te s . C om o m a te ria l a d e cu a d o p a ra lle va r a ca b o el p ro ce d im ie n to p udo u tiliza rse un s is te m a de h id ro ge l to ta lm e n te s in té tico a b ase de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) co m o c o m p o n e n te s in té tico , c a rg a d o n e g a tiva m e n te en co n d ic io n e s fis io ló g ic a s y p o r lo ta n to co n a fin ida d p o r b io m o lé cu la s p a rc ia lm e n te ca rg a d a s p o s itiva m e n te p a ra el se cu e s tro d ife re n c ia d o de s u s ta n c ia s de d ife re n te s g ru p o s de su s ta n c ia s . En las re iv in d ica c io n e s d e p e n d ie n te s se ind ican d e sa rro llo s d e l p ro ce d im ie n to y de l m a te ria l. T o ta lm e n te s in té tico s ig n ifica q ue no se re q u ie re n co m p o n e n te s de o rig e n b io ló g ico p a ra la fo rm a c ió n de h id ro ge l. P o r lo ta n to , se p u e d e e x c lu ir el rie sgo de re a cc io n e s in m u n o g é n ica s a dve rsa s .
P o r se cu e s tro de s u s ta n c ia s de los g ru p o s de s u s ta n c ia s A y B en e l co n te x to de la in ve n c ió n se d e b e e n te n d e r la u n ión de e s ta s su s ta n c ia s , ta le s com o , p o r e je m p lo , m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s , fa c to re s o e n z im a s , a los ce n tro s de a fin id a d p re se n te s en un m a te ria l de h id ro g e l y, p o r lo tan to , la re du cc ió n de la c o n ce n tra c ió n o la e lim in a c ió n to ta l de e s ta s su s ta n c ia s de un b io flu id o q u e se e n c u e n tra en co n ta c to d ire c to con e l h id ro ge l. El h id ro ge l e s tá co n s titu id o p o r e le m e n to s co n s titu ye n te s q u e e s tá n c a rg a d o s o no ca rga do s .
C om o h id ro g e le s q u e co n tie n e n g ru p o s su lfa to y /o s u lfo n a to la inve nc ión co m p re n d e h id ro g e le s con las p ro p ie d a d e s s ig u ie n te s y la co m p o s ic ió n s ig u ie n te : re de s p o lim é rica s fo rm a d a s m e d ia n te re ticu la c ió n co v a le n te (q u ím ica ) o re ticu la c ió n fís ica , p o r e je m p lo , seg ún el d o cu m e n to W O 2014040591 A2, e n tre d os co m p o n e n te s de h id ro ge l o e le m e n to s co n s titu ye n te s de h id ro ge l. El p rim e r e le m e n to co n s titu ye n te o co m p o n e n te de l h id ro ge l es u na m o lé cu la q ue no e s tá c a rg a d a en co n d ic io n e s f is io ló g ica s , q ue ta m b ié n se d e n o m in a e le m e n to co n s titu ye n te no ca rg a d o (E N C ) y p re fe re n te m e n te p re se n ta un peso m o le c u la r de 20 g /m o l a 100.000 g /m o l. Las m o lé cu la s no ca rg a d a s se se le cc io n a n o se d e riva n ve n ta jo sa m e n te , a e s te re specto , de la c la se de p o lie tile n g lico le s , p o li(2-o xazo lin as ), p o liv in ilp irro lid o n a s (P V P ), p o li(a lco h o le s v in ílico s ) (P A V ) y /o p o lia c r ila m id a s (P A M ) o u n a m o lé cu la re ticu lan te b ifu n c io n a l co rta . A d e m á s, e l EN C p re s e n ta al m e no s d o s g ru p o s fu n c io n a le s , p re fe re n te m e n te de 4 a 8 g ru p o s fu n c io n a le s , q ue , de fo rm a v e n ta jo sa , son e sp e c ia lm e n te a d e cu a d o s p a ra la re ticu la c ió n . F u n c io n a lid a d e s a d e cu a d o s p a ra la re ticu la c ió n (en EC o E N C ) p u e d e n s e r g ru p o s a m ina , tio l, ca rb o x ilo , a nh íd rid o , m a le im id a , v in ilsu lfo n a , acrila to , h id ro x ilo , isoc ian a to , e po x i y a ld e h íd o o g ru p o s q u e p ue de n fo rm a r u n io n e s no cova le n te s b a sá n d o se en fu e rz a s e le c tro s tá tica s , in te ra cc io n e s h id ró fob as , e n la ce s de p u e n te de h id ró g e n o , in te ra cc io n e s d ip o la re s . El se g u n d o e le m e n to co n s titu ye n te (co m p o n e n te ) e s tá c o n s titu id o p o r un p o lím e ro q u e p o rta g ru p o s su lfa to o su lfo n a to (que c o n tie n e a zu fre ) y, p o r lo tan to , e s tá c a rg a d o n e g a tiva m e n te en co n d ic io n e s f is io ló g ica s (e le m e n to co n s titu ye n te c a rg a d o , EC) (o p c io n a lm e n te con un p eso m o le c u la r de 2.000 a 250.000 g /m o l) q ue p ue de u n irse p rin c ip a lm e n te p o r m e d io de in te ra cc io n e s e le c tro s tá tic a s (ió n ica s) y en m e n o r m e d id a p o r m e d io de e n la ce s m enos fu e rte s , ta le s co m o fu e rz a s de va n d e r W a a ls , p u e n te s de h id ró g e n o o in te ra cc io n e s h id ró fo b a s a p ro te ína s en la red d e l h id ro ge l. Los ce n tro s de a fin ida d q ue d e te rm in a n d e c is iva m e n te la u n ión de las p ro te ín a s son , a e ste re spe cto , seg ún la inve nc ión , los g ru p o s su lfa to o de á c id o su lfó n ico q ue e s tá n c a rg a d o s en g ran p arte n e g a tiva m e n te en co n d ic io n e s fis io ló g ica s . C om o p o lím e ro s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s se u tilizan , a e s te respecto , g lic o sa m in o g lica n o s su lfa ta d o s o b te n id o s de fu e n te s n a tu ra le s ta le s co m o h e p a rin a y h e p a rin a s d e su lfa ta d a s se le c tiva s , su lfa to de co n d ro itin a , su lfa to de hep a rán , su lfa to de q u e ra tá n , á c ido h ia lu ró n ico su lfa ta d o , a s í com o g lic o p o lím e ro s s u lfa ta d o s a b ase de m a no sa , lac tosa , d e x tra n o y co m p u e s to s p o lisu lfo n a d o s q u e p o rta n á c ido e s tire n o s u lfó n ic o (A E S ), á c ido v in ils u lfó n ic o (A V S ), á c id o 2 -a c r ila m id o -2 -m e tilp ro p a n o s u lfó n ic o (A A M P S ), á c id o a m in o p ro p a n o s u lfó n ic o (A A P S ) o á c id o a n e to lsu lfó n ico (A A S ) co m o m o n ó m e ro s q ue co n tie n e n a zu fre (ta m b ié n en c o p o lím e ro s con u n id a d e s q u e co n tie n e n los g ru p o s de re ticu la c ió n an tes m e n c io n a d o s).
Los ce n tro s de a fin ida d , g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to ca rg a d o s n e g a tiva m e n te , e s tá n d is trib u id o s , de fo rm a p rev is ta , so lo a lo la rgo d e l EC, m ie n tra s q ue , p o r el c o n tra rio , e l EN C se u tiliza co m o co m p o n e n te q u e m in im iza la a dso rc ió n de p ro te ína s. Los g ru p o s c a rb o x ilo s e ve n tu a lm e n te p re se n te s en e l EC y q ue no se u tilizan p a ra la re acc ión de re ticu la c ió n se co n s id e ra n irre le va n te s p a ra la u n ión de las p ro te ín a s en el h id ro ge l d e b id o a los g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to s ig n ifica tiva m e n te m ás á c id os en co m p a ra c ió n con los m ism o s y, p o r lo tan to , p re fe re n te m e n te d e s p ro to n a d o s d e l EC.
C o n d ic io n e s f is io ló g ic a s son so lu c io n e s a cu o sa s cu yo s p H y fu e rz a ió n ica co rre sp o n d e n a te jid o s h um a n o s con un co n te n id o fis io ló g ic o de sa l y, p o r lo ta n to , e s tá n a ju s ta d o s a a p ro x im a d a m e n te el 0 ,9 % de N aC l con ta m p ó n fo s fa to a un pH de 7,4.
Un b io flu id o seg ún la inve n c ió n es u na so lu c ió n a cu o sa con un co n te n id o de sa l va r ia b le , p re fe re n te m e n te un co n te n id o de sa l f is io ló g ico , y u n a m e zc la de p ro te ína s.
El co n te n id o de p ro te ín a s p u e d e v a r ia r y c o n s is te p rin c ip a lm e n te en p ro te ín a s g lo b u la re s so lu b le s en agua, p o r e je m p lo , m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s , e n z im a s o fa c to re s , en n ive les b a jo s en el in te rva lo de 100 p g /m l - 2000 ng /m l y a lb ú m in a s , q ue re gu lan la p res ió n o s m ó tic a y p ro ce so s de tra n s p o rte en e l cu e rp o y p a ra e s te p rop ó s ito , p o r e je m p lo , e s tá n p re se n te s en u na a lta c o n ce n tra c ió n de a p ro x im a d a m e n te 60 m g/m l.
La c o n ce p c ió n de la inve nc ión c o n s is te en q u e las d ife re n c ia s en la u n ión de las p ro te ín a s q ue co n tro la n el m e ta b o lism o , e l tra n s p o rte y las fu n c io n e s de se ñ a liza c ió n (p o r e je m p lo , m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s y e n z im a s ) a h id ro g e le s q u e co n tie n e n co m p o n e n te s su lfa ta d o s o s u lfo n a d o s (EC ) se d e te rm in a n , p o r u na parte , m e d ia n te in te ra cc io n e s e le c tro s tá tic a s e n tre EC y p ro te ín a s , a s í co m o m e d ia n te e l ta m a ñ o y la e s tru c tu ra de las p ro te ín a s (p o r e je m p lo la p re se n c ia de d o m in io s de p ro te ín a s ca ra c te rís tic o s ) y, p o r o tra p arte , en g ran m e d id a m e d ia n te los p a rá m e tro s de red de los h id ro g e le s . C om o p a rá m e tro s de red d e te rm in a n te s , a e s te re spe cto , se d e te rm in a ro n (1) la co n ce n tra c ió n de su lfa to o s u lfo n a to en el h id ro ge l h in ch a d o (m m o l de su lfa to o de s u lfo n a to p o r m l) en el h id ro ge l h in ch a d o en co n d ic io n e s fis io ló g ic a s y (2) e l n ú m e ro de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r u n id ad de re pe tic ió n de l EC d iv id id o p o r la m a sa m o la r de las u n id a d e s de re pe tic ió n d e l EC (n úm ero de g ru p o s /(g /m o l)) co m o u na m a gn itu d ca ra c te rís tic a p a ra la c a rg a d e l EC. El p a rá m e tro (1) se c o rre la c io n a con e l n ú m e ro de ce n tro s de in te ra cc ió n (co rre sp o n d ie n te s a g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to ca rg a d o s n e g a tiva m e n te ) en la red de h id ro ge l h in cha do tr id im e n s io n a lm e n te y, p o r lo ta n to , d e te rm in a rá la u n ión de p ro te ín a s (m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s , e n z im a s ) en el h id ro ge l. Este p a rá m e tro inc lu ye in te ra cc io n e s in te rm o le cu la re s (es d ec ir, in te ra cc io n e s e n tre c a d e n a s p o lim é rica s a d ya ce n te s ) de l EC con p ro te ín a s (m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s , e n z im a s ). El p a rá m e tro (2), p o r o tra p arte , d e sc rib e la d e n s id a d y la d is trib u c ió n de los ce n tro s de in te ra cc ió n (c o rre sp o n d ie n te m e n te g ru p o s su lfa to o su lfo n a to ca rg a d o s n e g a tiva m e n te ) a lo la rgo de los d ive rso s EC y, p o r lo tan to , d e te rm in a rá en g ra n m e d id a las in te ra cc io n e s de las p ro te ín a s con los re sp e c tivo s EC in d iv id u a le s y, p o r lo tan to , a tra vé s de la m o du lac ión e sp a c ia l de los ce n tro s de c a rg a a lo la rgo de la ca d e n a p o lim é ric a ta m b ié n inc lu ye in te ra cc io n e s e sp e c ífica s q ue son co n o c id a s , p o r e je m p lo , p a ra las in te ra cc io n e s p ro te ín a -g lic o sa m in o g lica n o (véase C ap ila , I.; L in h ard t, R .J. A n g e w C he m Int Ed Engl 2002, 41 (3), 391 -412 ). El co m p o rta m ie n to de u n ión y lib e ra c ió n de los h id ro g e le s p a ra p ro te ín a s (m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s ) se d e te rm in a seg ún la inve nc ión m e d ia n te u n a su p e rp o s ic ió n de las p ro p ie d a d e s de la red de h id ro g e l re su lta n te s q u e re su ltan de a m b o s p a rá m e tro s (1) y (2) y, p o r lo tan to , se p ue de d e s c r ib ir a m p lia m e n te m e d ia n te la e sp e c ifica c ió n de e s to s p a rá m e tro s (vé ase ta m b ié n e l re su lta d o de los e je m p lo s de re a liza c ió n E N C 1-EC1 01 a E N C 1 -E C 4 04).
A d e m á s, se d eb en te n e r en c u e n ta los e fe c to s e s té ric o s en e l se n tid o de q u e se d e b e g a ra n tiz a r la a cce s ib ilid a d e s té ric a de la red de h id ro ge l p a ra la u n ión y e l se cu e s tro de p ro te ín a s , es d ec ir, e l ta m a ñ o de las p ro te ín a s no d eb e su p e ra r la a n ch u ra de m a lla de los h id ro ge le s , q ue p u e d e ca lcu la rse , p o r e je m p lo , a p a rtir d e l m ó d u lo de a lm a ce n a m ie n to de los h id ro g e le s p o r m e d io de la te o ría de la e la s tic id a d d e l ca u ch o según el m a te ria l y los p ro ce d im ie n to s .
M e d ia n te la p u e s ta en co n ta c to de b io flu id o s con h id ro g e le s se le c tiv a m e n te g ra d u a b le s en su e s tru c tu ra de red y su g ra d o de su lfa ta c ió n o s u lfo n a c ió n , la c o n ce n tra c ió n de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s re le va n te s en el b io flu id o se p uede a ju s ta r p o r m e d io de u n a se le c tiv id a d c a ra c te r ís tic a de la u n ión de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s al h id ro g e l y en c o n se cu e n c ia , p u e d e co n tro la rs e en u n a a p licac ión b io ló g ic a o b io te cn o ló g ica . La a p licac ión b io ló g ic a se p uede re a liza r, a e s te re spe cto , en e l co n te x to m é d ico en la m o du lac ión de m o lécu la s s e ñ a liza d o ra s so lu b le s p a ra el co n tro l de la a ng io g é n e s is , e l b ro te de v a so s sa n g u ín e o s , la re sp u e s ta in m u n o ló g ica , e n tre o tra s co sa s p a ra la c u ra c ió n de e n fe rm e d a d e s n e u ro d e g e n e ra tiva s y a u to in m u n ita r ia s y ca n ce ro sa s , d ia b e te s , en la c ica tr iza c ió n de h e rid as cu tá n e a s y la re g e n e ra c ió n ó se a , p a ra la inh ib ic ió n de la p ro life ra c ió n de tu m o re s , a s í co m o p a ra el tra ta m ie n to a n tisé p tico y a n tim ic ro b ia n o en o sob re e l cu e rp o . E x is ten a p lica c io n e s b io te c n o ló g ic a s en e l c u ltivo in vitro de c é lu la s y ó rg a n o s de cé lu la s m a dre e m b rio n a ria s (E S -), c é lu la s m a dre p lu rip o te n te s ind u c id a s (iP S -), a s í co m o o tras c é lu la s m a dre y p re cu rso ra s q u e no p u e d e n a s ig n a rse a ES e iPS , c é lu la s p rim a ria s o b te n id a s de p a c ie n te s , líne as ce lu la re s in m o rta liza d a s , a s í co m o te jid o ca rd ia co , m u scu la r, rena l, h ep á tico y n e rv io so , a s í com o en c re c im ie n to co m o c u a rta fu n c ió n . Las p ro p ie d a d e s fís ica s , ta le s co m o la rig ide z y la h id ra ta c ió n d e l m a te ria l, se p u e d e n a ju s ta r en un a m p lio in te rva lo . P ara e s te p ro p ó s ito , seg ún u n a fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de la inve nc ión , se p re p a ra ro n h id ro g e le s co v a le n te m e n te re ticu la d o s m e d ia n te re acc ión de g ru p o s c a rb o x ilo a c tiva d o s con 1 -e til-3 -(3 -d im e tila m in o p ro p il)-ca rb o d iim id a (E D C )/N -h id ro x is u lfo s u c c in im id a (su lfo -N H S ) d e l p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -c o -á c id o m a le ico ) y g ru p o s a m in a te rm in a le s d e un p o lie tile n g lico l linea l o ra m ifica d o en fo rm a d e e s tre lla com o co m p o n e n te no c a rg a d o a tra vé s de g ru p o s a m id a e s ta b le s . En u n a fo rm a de re a liza c ió n a lte rn a tiva , q u e se p re fie re p a ra e l e m b e b id o de c é lu la s v iva s , en u n a p rim e ra e tapa , se g ra d u a ro n los g ru p o s ca rb o x ilo a c tiva d o s con 1 -e til-3 -(3 -d im e tila m in o p ro p il)-ca rb o d iim id a (E D C )/N -h id ro x is u lfo s u c c in im id a (su lfo -N H S ) d e l p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -c o -á c id o m a le ico ) p o r m e d io de la m o lé cu la re ticu la n te b ifu n c io n a l co rta N -(2 -a m in o e til)m a le im id a , es d ec ir, con 6 a 10 m o lé cu la s de N -(2 -a m in o e til)m a le im id a p o r m o lé cu la de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o -m a le ic o ), se fu n c io n a liz a ro n y a co n tin u a c ió n se p u rifica ro n y se a is la ro n . E s tos d e riva d o s de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) con N -(2 -a m in o e til)m a le im id a p e rm ite n la re acc ión b io o rto g o n a l e sp o n tá n e a cu a n d o se m e zc la n en so lu c io n e s a cu o sa s o en b io flu id o s co m p le jo s con c é lu la s v iva s y b io m o lé cu la s s in su ca m b io fu n c io n a l a tra vé s de u n a a d ic ión de tip o M icha e l e n tre los g ru p o s m a le im id a de los d e riva d o s de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) fu n c io n a liz a d o s y los g ru p o s tio l de las m o lé cu la s de re ticu la c ió n b ifu n c io n a le s q ue co n tie n e n g ru p o s tio l o p o lím e ro s q u e co n tie n e n g ru p o s tio l co m o e le m e n to s c o n s titu ye n te s no c a rg a d o s en el se n tid o de la e s tru c tu ra de h id ro ge l d e sc rita a n te rio rm e n te . E s tos e le m e n to s co n s titu ye n te s p u e d e n ser, p o r e je m p lo , p é p tid o s e sc in d ib le s e n z im á tic a m e n te q ue p rese n ta n el a m in o á c id o c is te ín a (que p o rta un g ru p o tio l en la ca d e n a la te ra l) en la se cu e n c ia y q ue se han c o n ju g a d o p re v ia m e n te a uno o m ás b razo s de un p o lie tile n g lico l (P E G ) de cu a tro b razo s, ta l co m o se d e sc rib e p o r T su rka n e t al. 2013 (Adv. M a te r. 2013 , 25, 2606 -2610 ). La v e n ta ja de e s te tip o de re ticu lac ió n co n s is te en que , d e b id o a la rá p id a re acc ión de las m a le im id a s con los g ru p o s tio l lib res , se e fe c tú a u n a re acc ión d ir ig id a sin re a cc io n e s s e cu n d a ria s no d e se a d a s con o tra s b io m o lé cu la s o co n p ro te ín a s d e la su p e rfic ie ce lu la r, p o r lo q u e la a d ic ión de tip o M icha e l se p ue de u tiliz a r co m o u n a re acc ión de re ticu lac ió n b io o rto g o n a l p a ra la p o lim e riza c ió n de c é lu la s v iva s . Los h id ro g e le s ta m b ié n se p u e d e n fu n c io n a liz a r a tra vé s de los g ru p o s m a le im id a de los d e riva d o s de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) p o r m e d io de p é p tid o s in s tru c tivo s de cé lu la s , p o r e je m p lo la se cu e n c ia de a m in o á c id o s C W G R G D S P . A d e m á s, los m a te ria le s de h id ro ge l se p ue de n fu n c io n a liz a r con su s ta n c ia s con a c tiv id a d a n tim ic ro b ia n a , p o r e je m p lo , co n a n tib ió tico s ca rg a d o s p o s itiva m e n te .
C om o a lte rn a tiva al m a te ria l de h id ro ge l re ticu lad o co va le n te m e n te , es p o s ib le u tiliz a r un m a te ria l de h id ro ge l re ticu la d o fís ic a m e n te p a ra lle va r a ca b o el p ro ce d im ie n to m e n c io n a d o a n te rio rm e n te . Este m a te ria l ta m b ié n c o m p le ta m e n te s in té tico e s tá b a sa d o en in te ra cc io n e s fís ica s e n tre e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s en fo rm a de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) y e le m e n to s co n s titu ye n te s no c a rg a d o s en fo rm a de po lím eros , e s ta n d o c o n ju g a d o s al p o lím e ro s e cu e n c ia s p e p tíd ica s fu e rte m e n te c a rg a d a s de fo rm a p os itiva . Las se cu e n c ia s p e p tíd ica s fu e rte m e n te ca rg a d a s de fo rm a p o s itiva c o m p re n d e n p re fe re n te m e n te al m e no s d ie z re p e tic io n e s de lis in a o a rg in in a o al m e no s c in co re p e tic io n e s de m o tivo s d ip e p tíd ic o s con lis ina y a la n in a o a rg in in a y a lan ina .
M ás d e ta lle s , ca ra c te rís tic a s y v e n ta ja s d e las fo rm a s d e re a liza c ió n d e la in ve n c ió n se d e d u ce n d e la s ig u ie n te d e sc rip c ió n de e je m p lo s de re a liza c ió n , q u e ta m b ié n se d e sc rib e n y se co n c re ta n en las ta b la s y fig u ra s e sp e c ifica d a s . La fig u ra 1 m u e s tra im á g e n e s d e m ic ro sco p ía ó p tica re p re se n ta tiva s d e los cu ltiv o s ce lu la re s con c é lu la s e n d o te lia le s h um a na s , c u ltiva d a s en h id ro ge le s , d e sp u é s de 24 horas.
M e d ia n te la v a r ia c ió n se le c tiva de las p ro p ie d a d e s de la red, ta m b ié n se p ue de n a ju s ta r o tra s re la c io n e s de co n ce n tra c ió n ve n ta jo sa s y, con u n a a m p lia c ió n de l a n á lis is p a ra o tra s m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s , ta m b ié n es p os ib le con e l p ro ce d im ie n to p ro p u e s to e l co n tro l de la c o n ce n tra c ió n de e s ta s e sp e c ie s en c u a lq u ie r b io flu id o .
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
la 2: P ro p ie d a d e s q u ím ic o -fís ic a s de los e le m e n to s co n s titu ye n te s (co m p o n e n te s ) de h id ro g e l p o lim é rico ; M W P : M a sa m o la r d e l p o lím e ro , M W U R : M a sa m o la r de la u n id ad de re p e tic ió n :
Figure imgf000009_0001
T a b la 3: P ro p ie d a d e s q u ím ic o -fís ic a s de las m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s , u n ión o se cu e s tro de las p ro te ín a s en el h id ro ge l de los tip o s E N C 1-E C 1 01, E N C 1 -E C 2 02, E N C 1 -E C 5 23, E N C 1 -E C 3 03, E N C 1 -E C 4 04, E N C 2 -E C 4 20 y d e l h id ro ge l no ca rg a d o E N C 2 -E N C 3 26 (com o co n tro l n e g a tivo )
Figure imgf000010_0001
: T ie m p o de a c tiva c ió n de los g ru p o s ca rb o x ilo de EC1 a 5 en m in u tos , v o lu m e n de g e l u tiliza d o p a ra los e s tu d io s de un ión
Figure imgf000011_0001
T a b la 5.1 T ip os de ge l con in te rva lo s de p a rá m e tro s
Figure imgf000011_0002
T a b la 5.2 T ip o s de g e l de e je m p lo s de re a liza c ió n p re fe rid o s
Figure imgf000011_0003
T a b la 6.1
Figure imgf000011_0004
T a b la 6.2.
Figure imgf000011_0005
En las ta b la s 5.1, 5.2 , 6.1 y 6.2 , en la c o lu m n a A se m u e s tra co m o p ro p ie d a d de los e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s el n úm e ro de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r u n idad de re pe tic ió n (U R ) d iv id id o p o r la m a sa m o la r (M W ) de UR en [m o l/g ]. C om o p ro p ie d a d e s de los h id ro g e le s h in ch a d o s se ind ican en la c o lu m n a B la c o n ce n tra c ió n de los g ru p o s su lfa to o su lfo n a to en m m o l/m l y en la c o lu m n a C e l m ó du lo de a lm a ce n a m ie n to en kPa. La c o lu m n a D p ro p o rc io n a las p ro p ie d a d e s de los e le m e n to s co n s titu ye n te s no ca rga do s .
La c o lu m n a E p ro p o rc io n a la c o n ce n tra c ió n m o la r de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r m ol de p o lím e ro (en m o l/m o l) del e le m e n to c o n s titu ye n te c a rg a d o . Las p ro p ie d a d e s de los h id ro g e le s se m u es tra n en la co lu m n a F co m o la co n ce n tra c ió n de E c en m m o l/m l, la c o lu m n a G co m o la c o n ce n tra c ió n de los g ru p o s su lfa to o su lfo n a to en m m o l/m l y la c o lu m n a C co m o e l m ó du lo de a lm a ce n a m ie n to .
S eg ú n las su p o s ic io n e s re a liza d a s en los p ro ce d im ie n to s , e l m ó du lo de a lm a ce n a m ie n to de 20 kP a co rre sp o n d e a p ro x im a d a m e n te a un ta m a ñ o de m a lla de 6 nm y, p o r lo ta n to , d e b e ría p e rm itir e l a cce so e s té rico a to d a s las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s e n u m e ra d a s en el p re se n te d o c u m e n to en los h id ro ge le s .
T a b la 7
Figure imgf000012_0001
La ta b la 7 e n u m e ra las s u s ta n c ia s de los g ru p o s de su s ta n c ia s A y B en c o n c e n tra c io n e s re le va n te s en los b io flu id os .
La inve nc ión se e xp lica a co n tin u a c ió n con re fe re n c ia a los e je m p lo s de re a liza c ió n (ER ) de las ta b la s m o stra d a s a n te rio rm e n te .
P or e je m p lo , los h id ro g e le s de E N C 1-E C 1 01 de a cu e rd o con la ta b la 1 (E R 1) d e m u e s tra n s e r p a rticu la rm e n te v e n ta jo so s p a ra a ju s ta r las co n ce n tra c io n e s de d ive rsa s m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s (vé ase la ta b la 3). La c la se de q u im io c in a s p re s e n ta u n a e le va d a s im ilitu d e s tru c tu ra l de la e s tru c tu ra te rc ia ria , q u e se e s ta b iliza m e d ia n te la in te ra cc ió n de cu a tro c is te ín a s a tra vé s de p u e n te s d isu lfu ro (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: PS00471 y P S 00472). A d e m á s, las q u im io c in a s se ca ra c te r iza n p o r u na c a rg a n e ta fu e rte m e n te p o s itiva IEP > 9 o d o m in io s ca rg a d o s p o s itiva m e n te ta le s co m o en MIP1 -a lfa y M IP 1 -b e ta y un p eso m o le cu la r in fe rio r a 10 kD a (vé ase la ta b la 3) y se u nen fu e rte m e n te en el h id ro ge l de este tipo de hidrogel y, p o r lo ta n to , se e m p o b re ce n en los b io flu id o s a d ya ce n te s (u n ión de M ip l-a lfa y M ip 1 -b e ta de a p ro x im a d a m e n te el 60% , las o tra s q u im io c in a s e o ta x in a , G R O -a lfa , IL -8, IP -10, M C P -1, R a n te s y SDF-1 a lfa se u nen > 95 % (ta b la 3), m ie n tra s q ue so rp re n d e n te m e n te las s ig u ie n te s m o lécu la s s e ñ a liza d o ra s fu e rte m e n te ca rg a d a s p o s itiva m e n te q ue se a so c ia n a la c la se de los fa c to re s de c re c im ie n to FG F-2 (IE P 9 ,58 ) y T G F b l (IE P 8 ,59), a s í co m o p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s de la fa m ilia FG F (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00247 ) y la fa m ilia TG Fb1 (co rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00250 ) con el 31 % y e l 18% so lo se u nen de fo rm a re du c ida , P LG F (IE P 8 ,37) con u n a un ión < 10% se une de fo rm a aún m ás re d u c id a (ta b la 3), y las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s a so c ia d a s a la c la se de las c ito q u in a s con un IEP lig e ra m e n te b ás ico ta l co m o IL-10 (IEP 7 ,65), a s í co m o m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s con un IEP en e l in te rva lo neu tro (pH 5 ,5 -7 ) ta le s co m o IL1 -b e ta , IL6 y T N F -a lfa y p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s de la fa m ilia de p ro te ín a s IL -1 -b e ta (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00253 ), la fa m ilia de p ro te ín a s IL -10 (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00520 ), la fa m ilia de in te rle u c in a -6/G M -C S F /M G F (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00254 ) y la fa m ilia de p ro te ín a s T N F -a lfa (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00251 ) de l b io flu id o co m p le jo se u nen so lo lig e ra m e n te < 30 % (ta b la 3), (u n ión de T N F -a lfa : a p ro x im a d a m e n te e l 38% ) y p o r lo ta n to e s tá n p re se n te s en e l b io flu id o con co n ce n tra c io n e s ca s i sin ca m b io s . A d e m á s, e l fa c to r de c re c im ie n to con u na ca rg a n e ta lig e ra m e n te n e g a tiva E G F (IE P 4 ,8 ) ca s i no se une con una u n ió n in fe rio r al 10% . Esto s ig n ifica q u e los fa c to re s de se ñ a liza c ió n q u e son e se n c ia le s p a ra la s u p e rv ive n c ia de las cé lu la s , ta le s co m o EG F, FG F-2 , TG FB o P LG F, no se ven a fe c ta d o s p o r e l se cu e s tro re a liza d o p o r m e d io de los h id ro g e le s m e n c io n a d o s a n te rio rm e n te .
Las c ito c in a s fu e rte m e n te b á s ica s IF N -g a m m a (IE P 9 ,52), IL-4 (IE P 9 ,25), los a n ta g o n is ta s de W N T y B M P e sc le ro s tin a (9 ,57 ) y DKK1 (8 ,72 ), a s í co m o p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s de la fa m ilia IL -4 /IL -13 (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00838 ) y la fa m ilia s im ila r a e sc le ro s tin a (c o rre sp o n d ie n te a In te rP ro ID: IP R 008835 ) y los fa c to re s de c re c im ie n to fu e rte m e n te b á s ico s b N G F (IE P 9 ,00), P D G F (IE P 9 ,4 ), y V E G F (IE P 9 ,2), a s í co m o p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s de la fa m ilia N G F (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00248 ), y la fa m ilia P D G F (co rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00250 ) e IL -12 p40 , ta l co m o se e sp e ra b a , se unen fu e rte m e n te > 59 ,9 % (ta b la 3) y, p o r ta n to , se e m p o b re ce n en el b io flu id o .
P on ie nd o en co n ta c to un b io flu id o con un h id ro ge l con las ca ra c te rís tic a s de ca rg a y de red e sp e c ifica d a s d e l tip o 1 seg ún la ta b la 5.1, u n a se le cc ió n se le c tiv a de fa c to re s de c re c im ie n to con p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s a D KK1, b N G F , P d G f -BB, V E G F , a s í co m o q u im io c in a s (p o r e je m p lo , e o ta x in a , G ro -a lfa , IL -8, IP -10, M CP-1 MIP-1 a lfa , MIP1 b e ta , R an tes, SDF1 a lfa ) y c ito c in a s con p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s a IF N -ga m m a , IL4 y e sc le ro s tin a co rre sp o n d ie n te s a los m o tivo s de se cu e n c ia y fa m ilia s de p ro te ín a s se ñ a la d o s p u e d e n , p o r lo tan to , e m p o b re c e rs e en el b io flu id o o a u m e n ta rse m e d ia n te la p re ca rg a de l h id ro ge l en su c o n ce n tra c ió n en el b io flu id o , m ie n tra s q u e las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s EG F, FG F-2 , T G F b l, P LG F, IL-10, IL1 beta , IL6 y T N F a lfa m e n c io n a d a s a n te r io rm e n te cas i no va ría n , ve n ta jo sa m e n te , en su co n ce n tra c ió n . A d e m á s, en el caso de e s te h id ro ge l e x is te una in te ra cc ió n de EC1 con las e n z im a s tro m b in a y a n titro m b in a , q u e son im p o rta n te s p a ra la co a g u la c ió n san gu íne a , seg ún U w e F re u d e n b e rg e t al., "Jo u rn a l o f C o n tro lle d R e le ase", J o u rn a l o f C o n tro lle d R e le ase : O ffic ia l J o u rn a l o f th e C o n tro lle d R e le ase S o c ie ty 220 , N° P arte A (28 de d ic ie m b re de 2015 ): 79 -88 , d o i: 10.1016 /j. jc o n re l.2015.10.028.
O tro e je m p lo de re a liza c ió n p a rtic u la rm e n te v e n ta jo so (E R 2) c o n s is te en el t ip o de h id ro ge l E N C 1 -E C 2 02 (vé ase la ta b la 2) q u e e xce p to la u n ión m ás re d u c id a de las d os q u im io c in a s M IP-1 a lfa y M IP-1 b e ta y e sc le ro s tin a (ca da u na a p ro x im a d a m e n te el 40% , ta b la 3) y de la m ás v e n ta jo sa aún m ás re d u c id a u n ión de IL -10 (15% ), IL -6 (8% ), T N F a lfa (25% ), v é a se la ta b la 3, y de la aún m ás v e n ta jo sa cas i ca re n te u n ión de F G F -2 (5% ) y T G F b l (0% ) y la fa lta de in te ra cc ió n de EC 2 con las e n z im a s de co a g u la c ió n s a n g u ín e a tro m b in a y a n titro m b in a (vé ase U w e F re u d e n b e rg et a l., "Jo u rn a l o f C o n tro lle d R e le ase", J o u rn a l o f C o n tro lle d R e le ase : O ffic ia l Jo u rn a l o f th e C o n tro lle d R e le ase S o c ie ty 220 , N° P arte A (28 de d ic ie m b re de 2015 ): 79 -88 , d o i: 10.1016 /j. jc o n re l.2015.10.028 ) p re se n ta un pa tró n de u n ión o de se cu e s tro q ue es cas i id é n tico al tip o de h id ro ge l ENC1 :EC1 01 (vé ase la ta b la 3). O tro e je m p lo de re a liza c ió n v e n ta jo so lo re p re se n ta E N C 2 -E C 5 23 (E R 23, v é a se la ta b la 1), q ue tie n e u n a ca ra c te rís tic a de c a rg a q ue se p ue de a s ig n a r al tip o 2 seg ún la ta b la 5.1, co m o el ER2, p ero con un co n te n id o de s u lfo n a to lig e ra m e n te d ife re n te de 0,14 m m o l/m l (ta b la 1 o ta b la 5.2 c o lu m n a B) y un n ú m e ro lig e ra m e n te d ife re n te de g ru p o s su lfo n a to p o r u n id ad de re p e tic ió n (U R ) d iv id id o p o r la m a sa m o la r (M W ) de la UR en [m o l/g ] de 0 ,0038 , e n co n trá n d o se , no o b s ta n te , am bo s p a rá m e tro s de la ta b la 5.1 en e l in te rva lo p re e s ta b le c id o p a ra un h id ro ge l d e l tip o 2. S in e m b a rg o , e l h id ro ge l se fo rm ó a p a rtir de o tro e le m e n to c o n s titu ye n te de g e l s in té tico ca rg a d o (E C 5 ) con o tra re acc ión de re ticu la c ió n (tipo de re ticu la c ió n 2, ta b la 1) y, e xce p to la u n ión a lgo m á s fu e rte de las d os q u im io c in a s M IP-1 a lfa y MIP-1 b e ta , p re se n ta un p a tró n de u n ión o de se cu e s tro cas i idé n tico q ue e l ER 2 (vé ase la ta b la 3). E s to c o n firm a la c la s if ica c ió n de los h id ro g e le s con los p a tro n e s de ca rg a ca ra c te rís tic o s seg ún la ta b la 5.1 y ta m b ié n re p re se n ta un pa tró n de secu e s tro p a rticu la rm e n te ve n ta jo so .
O tro e je m p lo de re a liza c ió n v e n ta jo so (E R 3 ) co n s is te en el tip o de h id ro ge l E N C 1 -E C 3 03 (véase la ta b la 2), que d e b id o a la c o n ce n tra c ió n s ig n ifica tiva m e n te in fe rio r de g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to en e l h id ro ge l (ta b la 5.2, c o lu m n a B, 0 ,06 en c o m p a ra c ió n con 0 ,12 m m o l/m l p a ra ER1 o E R 2) y ta m b ié n e l m e n o r n ú m e ro de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r UR d iv id id o p o r la m a sa m o la r de la UR de 0 ,0019 en c o m p a ra c ió n con 0 ,005 o 0 ,0035 p a ra ER1 o ER 2 (v é a s e la ta b la 5.2, co lu m n a A ) p re se n ta u na u n ión s ig n ific a tiv a m e n te m ás re d u c id a a m u ch as p ro te ína s (m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s ) en c o m p a ra c ió n con ER1 y ER 2. En e s te tip o de h id ro ge l, bN G F, P D G F -B B y V E G F A, e o ta x in a , G R O -a lfa , IP -10, R an tes , SDF-1 a lfa , IF N -g a m m a e IL-4 se u nen en m ás d e l 50 % p o r e l h id ro ge l y, p o r lo ta n to , se e m p o b re ce n en un b io flu id o , p e ro IL -8, M CP-1 e IL -12 p 40 se unen so lo a p ro x im a d a m e n te el 45 % (véase la ta b la 3), H G F, MIP-1 a lfa , M IP-1 beta , IL-1 be ta , IL -10, IL -6, T N F a lfa y DKK1 so lo lig e ra m e n te con e l 16 -36 % (véase la ta b la 3) y FG F-2 , T G F b l, EG F, P l G f , G M -c S f y e sc le ro s tin a ca s i no se unen (< 12% ) (vé ase la ta b la 3) y p o r lo ta n to la m a yo r p a rte de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s se unen de fo rm a s ig n ific a tiv a m e n te in fe rio r q u e p a ra ER1 y ER 2 en e l h id ro ge l. C on e s te tip o de ge l, p o r e je m p lo , u na se p a ra c ió n a m p lia m e n te s e le c tiva de b N G F , P D G F -B B y V E G F A, e o ta x in a , G R O -a lfa , IP -10, R an tes , s D F -1 a lfa , IF N -g a m m a e IL-4 de c u a lq u ie r b io flu id o es pos ib le .
O tro e je m p lo de re a liza c ió n v e n ta jo so c o n s is te en el h id ro ge l E N C 1 -E C 4 04 (vé ase la ta b la 1), q u e d e b id o a la a lta co n ce n tra c ió n de g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to de 0 ,28 m m o l/m l en el h id ro g e l (ta b la 5.2, c o lu m n a B) y un n úm ero ig u a lm e n te a lto de g ru p o s s u lfo n a to p o r U R d iv id id o p o r la m a sa m o la r de la UR de 0 ,0045 m o l/g , e xce p to HG F, PLG F, G M -G S F y EG F, to d o s los fa c to re s in ve s tig a d o s se u nen al h id ro ge l con u n a e le v a d a e fic a c ia (de e n tre e l 72-100% , vé a se la ta b la 3) y p o r lo ta n to se e m p o b re ce n en e l b io flu id o (véase la ta b la 3).
En p a rticu la r, con e s te h id ro ge l t ie n e lu g a r u n a re du cc ió n de to d o s los fa c to re s in ve s tig a d o s y e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s (IEP y la p re se n c ia de s im ilitu d e s e s tru c tu ra le s ), en p a rtic u la r de la c la se de las q u im io c in a s , q u e p rese n ta n u n a a lta s im ilitu d e s tru c tu ra l de la e s tru c tu ra te rc ia ria , q u e e s tá n ca ra c te r iza d a s p o r la in te ra cc ió n de cu a tro c is te ín a s a tra vé s de p u e n te s d isu lfu ro (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: PS00471 y P S 00472 ), p o r u n a ca rg a neta fu e rte m e n te p o s itiva IEP > 9 o d o m in io s ca rg a d o s p o s itiva m e n te ta le s co m o MIP1 a lfa y MIP1 b e ta y un peso m o le c u la r in fe rio r a 10 kD a (vé a n se las p ro p ie d a d e s de p ro te ín a s de la tab la ), F G F -2 (IE P 9 ,58), T G F b l (IE P 8 ,59) y p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s de la fa m ilia FG F (co rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00247 ), la fa m ilia T G F (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00250 ), a s í co m o m o lé cu la s se ñ a liz a d o ra s a so c ia d a s a la c lase de las c ito c in a s con IEP lig e ra m e n te b á s ico ta le s co m o IL -10 (IE P 7 ,65), a s í co m o m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s con un IEP en el in te rva lo neu tro (pH 5 ,5 -7 ) ta le s co m o IL1p, IL6 y T N F y p ro te ín a s e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s de la fa m ilia de p ro te ín a s IL-1 p (c o rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00253 ) y la fa m ilia de p ro te ín a s IL-10 (co rre sp o n d ie n te a P R O S IT E ID: P S 00520 ) de b io flu id o s a d ya ce n te s . O tro e je m p lo de re a liza c ió n ve n ta jo so , E N C 2 -E C 4 20 (vé ase la ta b la 1), q u e tie n e u na c a ra c te r ís tic a de c a rg a q ue se p ue de a s ig n a r al tip o 4 según la ta b la 5.1, a s í co m o el ER4, q ue p re se n ta e l m ism o EC 5, v é a se la ta b la 5.1, c o lu m n a A : 0 ,0045 , p e ro u na c o n ce n tra c ió n de su lfo n a to in fe rio r de 0 ,16 m m o l/m l (vé ase la ta b la 1 y la ta b la 5.1 ), q ue to d a v ía se a s ig n a al m arco de l tip o 4, p e ro q ue se fo rm ó , a e ste re spe cto , con u na re acc ión de re ticu la c ió n d ife re n te (R R : 2 en la ta b la 1), p re se n ta un p a trón de un ión o de se cu e s tro cas i idé n tico al E N C 1 -E C 4 04 (vé ase la ta b la 3). P o r lo ta n to , e s te h a lla zg o ta m b ié n co n firm a el p o d e r p re d ic tivo e fica z de las ca ra c te rís tic a s de ca rg a de los tip o s 1-5 seg ún la ta b la 5.1 p a ra e l se cu e s tro d ife re n c ia d o de su s ta n c ia s o g ru p o s d e su s ta n c ia s .
O tro pa tró n de re a liza c ió n es el h id ro ge l no ca rg a d o fo rm a d o a p a rtir de ENC1 y E N C 3 (E N C 2 -E N C 3 26), q ue , tal co m o se e sp e ra b a co m o co n tro l n eg a tivo , no se u ne a cas i n in g u n a de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s d e l b io flu id o . C on la e xce p c ió n d e l m e n o r se cu e s tro , q u e no p ue de c la s if ica rse co m o s ig n ifica tivo , de P D G F -B B de l 19,7 ± 23 ,1% e IP 10 al n ive l de 16,1 ± 16,4% , d e b id o a las g ra n d e s d e s v ia c io n e s e s tá n d a r, no tie n e lu g a r n ingún se cu e s tro (< 1,3% p a ra to d a s las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s a n a liza d a s , v é a se la ta b la 3) p o r m e d io de e s te h id ro ge l. Este h a lla zg o se p ue de a tr ib u ir c la ra m e n te a la a u s e n c ia de ce n tro s de a fin id a d ca rg a d o s y, p o r lo ta n to , a la a u se n c ia de las in te ra cc io n e s de c a rg a d is cu tid a s en e l p re se n te d o cu m e n to . El m ó du lo de a lm a ce n a m ie n to y, p o r lo tan to , ta m b ié n la a n ch u ra de la m a lla de la red es, p o r e l c o n tra rio , con 4 ,4 kP a (ta b la 1), ca s i id é n tico a los m ó d u lo s de a lm a ce n a m ie n to de l E N C 1-E C 2 02, E N C 2 -E C 4 20 y E N C 2 -E C 5 23, es d ec ir, e x is te n in te ra cc io n e s e s té rica s co m p a ra b le s a los e je m p lo s de re a liza c ió n ca rg a d o s con las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s . E s tos re su ltad o s, en p a rticu la r la fa lta de in te ra cc io n e s (es d ec ir, la a u s e n c ia de e fe c to s de u n ión y se cu e s tro ) d e l h id ro g e l no ca rg a d o (E N C 2-E N C 3 26) con las m o lécu la s se ñ a liza d o ra s , a p o ya n las re iv in d ica c io n e s c o rre sp o n d ie n te s a la ta b la 5.1 p a ra el se cu e s tro d ife re n c ia d o .
S in e m b a rg o , al m ism o tie m p o , p ue de n lib e ra rse fa c to re s in d iv id u a le s se le c tiv a m e n te en e l b io flu id o m e d ia n te la p re ca rg a s e le c tiva de los h id ro g e le s de los tip o s 1 a 3 de la ta b la 5, p a ra le la m e n te e in d e p e n d ie n te m e n te de l se cu e s tro y, p o r lo tan to , de l e m p o b re c im ie n to de los o tro s fa c to re s . C on los d ife re n te s tip o s de h id ro ge l, cas i c u a lq u ie r n ive l de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s in d iv id u a le s se p ue de a ju s ta r en b io flu id o s c o m p le jo s m e d ia n te la p re ca rg a s e le c tiva de los h id ro g e le s o si no e l se cu e s tro (re d u cc ió n ) cas i cu a n tita tiv o de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s (p o r e je m p lo , la a p lica c ió n p a ra se p a ra r m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s de c u a lq u ie r so lu c ió n q u e co n te n g a p ro te ína s).
S ob re la b ase a los e je m p lo s de re a liza c ió n en E N C 1-E C 1 01 a E N C 2 -E N C 3 26, se p ue de n o b s e rv a r las s ig u ie n te s re lac io ne s e n tre las p ro p ie d a d e s d e las p ro te ín a s , las p ro p ie d a d e s d e l h id ro ge l y la un ión d e las p ro te ín a s en la red de h id ro ge l, q ue son im p o rta n te s p a ra la d e sc rip c ió n de la inve nc ión : U na fu e rte u n ió n de las m o lécu la s s e ñ a liza d o ra s c o rre sp o n d ie n te m e n te a la ta b la 3 se co rre la c io n a en el lado de las p ro te ína s con u na ca rg a neta p o s itiva (y, a e s te re spe cto , con un IEP b á s ico e le va d o co m o p a rá m e tro co rre sp o n d ie n te ) e in ve rsa m e n te con el p e so m o le c u la r (un IEP e le va d o y un p eso m o le c u la r re du c ido fo rta le ce n la u n ión , v é a se la ta b la 3, las q u im io c in a s fu e rte m e n te c a rg a d a s p o s itiva m e n te y, al m ism o tie m p o , re la tiva m e n te p e q u e ñ a s (< 9 kD a ) son las q ue m ás fu e rte m e n te se unen y en el lad o de las re de s de h id ro ge l a c tú a u na (1) a lta c o n ce n tra c ió n de g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to en e l h id ro ge l (ta b la 1 y 5.2 , c o lu m n a B) y (2) un e le va d o n úm e ro de g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to p o r UR d iv id id o p o r la m a sa m o la r de la UR fo rta le c ie n d o la u n ión de las m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s . De fo rm a co rre sp o n d ie n te al p a rá m e tro se o b tie n e p a ra los h id ro g e le s e l s ig u ie n te o rde n de la u n ión m ás fu e rte E N C 1 -E C 4 04 = E N C 2 -E C 4 20 < E N C 1-E C 1 01 < E N C 1 -E C 2 02 = E N C 2 -E C 5 23 < E N C 1 -E C 3 03 << E N C 2 -E N C 3 26 a la u n ión m ás d éb il, e ste h a lla zg o se su s te n ta p o r los va lo re s de u n ión e n co n tra d o s e xp e rim e n ta lm e n te (véase la ta b la 3). A d e m á s, m e d ia n te d ife re n te s co m b in a c io n e s de a m b o s p a rá m e tro s de la red de h id ro ge l ( 1) y (2) m e n c io n a d o s a n te r io rm e n te , p ueden a ju s ta rse las fu e rte s in te ra cc io n e s e n tre p ro te ín a s y p o lie le c tro lito s ca rg a d o s n e g a tiva m e n te (p o r e je m p lo , g lic o sa m in o g lica n o s ) c o n o c id a s en la lite ra tu ra co m o " in te ra c c io n e s e sp e c ífica s ", es d ec ir, u n a co in c id e n c ia e sp a c ia l de d ife re n te s ce n tro s de in te ra cc ió n y, p o r lo tan to , o tra s p ro p ie d a d e s e s tru c tu ra le s a d ic io n a lm e n te al p eso m o le c u la r y la c a rg a n e ta se p ue de n u tiliz a r ta m b ié n en el lado de la p ro te ín a con el fin de m o d u la r la u n ión a los h id ro ge le s . E s ta s re la c io n e s ta m b ié n e xp lica n la re d u c id a u n ión de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s fu e rte m e n te b á s ica s y re la tiva m e n te p e q u e ñ a s FG F-2 , TG Fb1 y P LG F a los tip o s de h id ro ge l E N C 1-E C 1 01, E N C 1 -E C 2 02, E N C 1 -E C 3 03 y E N C 1 -E C 4 04.
O tra s p o s ib ilid a d e s de co n tro l de los n ive les de m o lé cu la s se ñ a liz a d o ra s so lu b le s co n s is te n en la a p licac ión se cu e n c ia l o co m b in a d a de los d ife re n te s tip o s de h id ro ge l p a ra p o d e r a ju s ta r con p re c is ió n u n a a m p lia d ive rs id a d de p ro p ie d a d e s e sp e c ífica s de se cu e s tro y libe ra c ión . P o r m e d io de la v a r ia c ió n se le c tiv a de las p ro p ie d a d e s de la red (en p a rtic u la r los p a rá m e tro s (1) y (2) d e sc rito s a n te r io rm e n te ) y ta m b ié n la co m b in a c ió n de m ic ro p a rtícu la s de h id ro g e l co m p u e s ta s de m a n e ra d ife re n te (p o r e je m p lo , ca rg a con m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s in d iv id u a le s ) en los d e n o m in a d o s m a te ria le s de h id ro ge l de v a r ia s fa se s (es d ec ir, m e d ia n te e l m e zc la d o de tip o s de h id ro ge l de d ife re n te s tip o s o p re ca rg a con m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s o p ro te ín a s ) p ue de n a ju s ta rse ta m b ié n o tra s re la c io n e s de c o n ce n tra c ió n ve n ta jo sa s en b io flu id o s a d ya ce n te s .
A l a m p lia r el a n á lis is a o tra s m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s , ta m b ié n es p o s ib le con e l p ro ce d im ie n to p ro p u e s to e l con tro l de la c o n ce n tra c ió n de e s ta s s u s ta n c ia s en c u a lq u ie r b io flu id o .
P ara p o d e r c o n tro la r e fic a zm e n te las co m p le ja s fu n c io n e s b io ló g ica s de las m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s , p o r e je m p lo , p a ra co n ce p to s te ra p é u tico s , a d e m á s de la lib e ra c ió n m a n te n id a de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s in d iv id u a le s a p a rtir de h id ro g e le s p re ca rg a d o s con las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s , es n e ce sa ria u na g e s tió n a c tiva de d ife re n te s m o lécu la s s e ñ a liza d o ra s de l e n to rn o b io ló g ico in m e d ia to de las c é lu la s o de la a p lica c ió n b io ló g ica . P o r lo ta n to , las in te ra cc io n e s con u na p lu ra lid a d de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s re le va n te s d eb en co n s id e ra rs e de m a n e ra in te gra l. Si los h id ro g e le s con c o m p o n e n te s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s se ca rg a n , p o r e je m p lo , con u n a m o lé cu la s e ñ a liza d o ra p a ra la lib e ra c ió n m a n ten id a , p ue de n s e cu e s tra rse y, p o r lo tan to , ina c tiva rse , s im u ltá n e a m e n te con la libe ra c ión te ra p é u tica m e n te d e s e a d a de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s o tra s m o lé cu la s ta m b ié n te ra p é u tica m e n te im p orta n te s d e l e n to rn o b io ló g ico , es d ec ir, p u e d e o b te n e rse un e fe c to s e cu n d a rio in d e se a b le . S in e m b a rg o , p o r o tra parte , ta m b ié n se p u e d e n s e c u e s tra r s e le c tiva m e n te m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s no d e se a d a s te ra p é u tica m e n te y, p o r tan to , in a c tiva rla s en el h id ro ge l q ue p o rta g ru p o s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s . En g e n e ra l, son p o s ib le s e sce n a rio s de lib e ra c ió n y se cu e s tro m u y co m p le jo s , q u e en su to ta lid a d d e c id e n so b re e l e fe c to b io ló g ico , en p a rt ic u la r las p ro p ie d a d e s de se p a ra c ió n m o le cu la r, de los m a te ria les .
O tras fo rm a s de re a liza c io n e s v e n ta jo sa s de la in ve n c ió n co n s is te n en el uso de h id ro g e le s co rre sp o n d ie n te s a los tip o s 1 -4 de la ta b la 5 p a ra m o d u la r la c o n ce n tra c ió n o e l n ive l de p ro te ín a s b io ló g ica m e n te a c tiva s en n ive les to ta le s ba jos.
U na g ran v e n ta ja d e l p ro ce so es la u n ive rsa lid a d de sus p o s ib ilid a d e s de uso. El p ro ce d im ie n to se p ue de u tiliz a r v e n ta jo sa m e n te ta n to p a ra la p u rifica c ió n b io te c n o ló g ic a co m o p a ra la se p a ra c ió n de m e zc la s de p ro te ín a s de b io flu id o s o en los m ism o s u tiliza n d o h id ro g e le s con c o m p o n e n te s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s .
En un se n tid o m ás e s tric to e je m p la r, e l p ro ce d im ie n to se p u e d e u tiliz a r p a ra la g e s tió n de fa c to re s in vivo para c o n tro la r la a n g io g é n e s is , e n fe rm e d a d e s in m u n o ló g ica s , d ia b e te s , e n fe rm e d a d e s n e u ro d e g e n e ra tiva s y la c ica tr iza c ió n de heridas .
D uran te la c ica triza c ió n de h erid as , las q u im io c in a s en su m a yo r p a rte con a c tiv id a d p ro in fla m a to r ia (p o r e je m p lo , e o ta x in a , G R O -a , IL -8, IP -10, M c P -1, M C P -3 , M C D , R A N T E S y S D F -1 ) son s e cu e s tra d a s en el in te rio r de los h id ro g e le s , m ie n tra s q ue los fa c to re s p ro rre g e n e ra tivo s (p o r e je m p lo , EG F, FG F-2 , T G F b l, IL-10, H G F y P LG F) p e rm a n e ce n en g ran p a rte ina lte rad os .
Un s e c to r de a p lica c ió n p a rtic u la rm e n te im p o rta n te de la in ve n c ió n c o n s is te en el co n tro l de las co n ce n tra c io n e s de s u s ta n c ia s en b io flu id o s q u e son re sp o n sa b le s de las d e c is io n e s sob re el d e s tin o c e lu la r in vitro e in vivo. La d e s re g u la c ió n de las q u im io c in a s p ro in fla m a to r ia s y la in fla m a c ió n c ró n ic a a so c ia d a es la c a u s a de l d e sa rro llo de d ive rsa s e n fe rm e d a d e s ta le s co m o la e n fe rm e d a d de C ro hn , co litis u lce ro sa , e sc le ro s is m ú ltip le , a sm a o a rtritis re u m a to id e . La m o d u la c ió n s e le c tiva de la c o n ce n tra c ió n de e s to s fa c to re s in fla m a to rio s a p a rt ir de b io flu id o s m e d ia n te la a p lica c ió n según la inve n c ió n de d ife re n te s h id ro g e le s con c o m p o n e n te s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s re p re se n ta un p o s ib le e sce n a rio de a p lica c ió n .
En un se n tid o m ás a m p lio , e l uso según la inve n c ió n de los h id ro g e le s con c o m p o n e n te s s u lfa ta d o s o su lfo n a d o s p e rm ite la p u rifica c ió n s e le c tiva de las m o lé cu la s se ñ a liz a d o ra s in ve s tig a d a s en el p re se n te d o c u m e n to o e s tru c tu ra lm e n te s im ila re s a p a rt ir de m e zc la s de p ro te ín a s co m p le ja s . P o r lo ta n to , los s is te m a s de g e l d e sc rito s p u e d e n u tiliza rse b io te c n o ló g ic a m e n te p a ra la p u rifica c ió n s e le c tiva de p ro te ín a s a p a rtir de lisad os ce lu la re s de o rig e n m ic ro b ia n o o e u ca rio ta . D ich os lisad os ce lu la re s se hacen p asar, a e s te re spe cto , a tra vé s de h id ro g e le s seg ún la inve nc ión p a ra u n ir las m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s . En u n a s e g u n d a e tapa , las s u s ta n c ia s u n id as se p ueden e lim in a r de n uevo de los h id ro ge le s , y p o r lo ta n to se p a ra rse de los m ism os , p a ra su u so p o s te rio r e n ju a g a n d o con s o lu c io n e s con a lto co n te n id o de sa l o p o lie le c tro lito s ca rg a d o s p o s itiva m e n te (p o r e je m p lo , q u ito sa n o ). A d e m á s, una se le cc ió n n e g a tiva p a ra la se p a ra c ió n de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s q u e se unen lig e ra m e n te a los h id ro g e le s de los tip o s 1-3 en d ich a s co n d ic io n e s , p o r e je m p lo , EG F, FG F-2 , T G F -p , IL-10, H G F y P LG F, es p o s ib le m e d ia n te el u so de s o b re n a d a n te s d e sp u é s de 24 hora s de un ión .
U n a v e n ta ja p rá c tica re le va n te de la inve nc ión es q u e inc lu so con a lta s co n ce n tra c io n e s de a lb ú m in a de 1 m g /m l a 45 m g /m l con n ive les s im u ltá n e a m e n te b a jo s de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s de 100 p g /m l a 2000 n g /m l en e le c tro lito fis io ló g ic o co m o b io flu id o , se re a liza la u n ión de u n a p lu ra lid a d de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s b io ló g ica m e n te re le va n te s a h id ro g e le s su lfa ta d o s o s u lfo n a d o s con ca ra c te rís tic a s de ca rg a s e le c tiva m e n te g ra d u a le s y e s tru c tu ra de red y en b ase a esto , p ue de n u tiliza rse las d ife re n c ia s de s e le c tiv id a d en la un ión de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s in d iv id u a le s a los d ife re n te s tip o s de h id roge l.
Los e je m p lo s de re a liza c ió n de E N C 1-E C 1 01 a E N C 1 -E C 4 011 e n u m e ra d o s en la ta b la 1 son h id ro g e le s re ticu la d o s co v a le n te m e n te según la re acc ión de re ticu la c ió n 1, en los q u e de 6 a 24 g ru p o s ca rb o x ilo (d e p e n d ie n d o de la re lac ió n m o la r de 1,5 a 6 en el ca so de PEG en e s tre lla de cu a tro b razo s) de u n a m o lé cu la de EC 4 (p o li(á c id o 4-e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ), re lac ió n m o la r de á c id o e s tire n o s u lfó n ic o :á c id o m a le ico 3:1, ta b la 1) se a c tiva ro n p o r m e d io de E D C /su lfo -N H S y se co n v ir t ie ro n d ire c ta m e n te en un h id ro g e l p o r m e d io de l ENC1 de cu a tro b ra zo s te rm in a d o en a m in a (véase la ta b la 1). A s í se o b tie n e n h id ro g e le s con u n a c o n ce n tra c ió n de su lfo n a to v a r ia b le de 0 ,28 a 0 ,06 m m o l/m l y m ó d u lo s de a lm a ce n a m ie n to va r ia b le s de 4 ,8 a 19,6 kP a (vé ase la ta b la 1).
Los e je m p lo s de re a liza c ió n E N C 1 -E C 5 12 a E N C 1 -E C 5 19 e n u m e ra d o s en la ta b la 1 son h id ro g e le s re ticu lad os co v a le n te m e n te según e l p rin c ip io de re ticu la c ió n 1, en los q u e de 6 a 24 g ru p o s ca rb o x ilo (d e p e n d ie n d o de la re lac ió n m o la r de 1,5 a 6 en el caso de PEG en e s tre lla te tra fu n c io n a le s ) de u na m o lé cu la de p o li(á c id o 4-e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) con u n a re lac ió n m o la r de á c id o e s tire n o s u lfó n ic o con re sp e c to a á c id o m a le ico de 1:1 (E C 5), se a c tiva ro n p o r m e d io de E D C /S N S y se c o n v ir t ie ro n d ire c ta m e n te en un h id ro ge l p o r m e d io del ENC1 de cu a tro b razo s te rm in a d o en a m in a (vé ase la ta b la 1). A s í se o b tu v ie ro n h id ro g e le s con co n ce n tra c io n e s va r ia b le s de s u lfo n a to de 0 ,13 a 0 ,05 m m o l/m l y m ó d u lo s de a lm a ce n a m ie n to va r ia b le s de 3 a 21 ,8 kP A (vé ase la ta b la 1).
Los e je m p lo s de re a liza c ió n E N C 2 -E C 4 20 a E N C 2 -E C 4 22 son h id ro g e le s re ticu la d o s c o v a le n te m e n te seg ún el p rin c ip io de re ticu la c ió n 2, en los q u e o ch o de los g ru p o s ca rb o x ilo de EC 4 a c tiva d o s m e d ia n te E D C /su lfo -N H S (p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) con la re lac ió n m o la r de á c id o e s tire n o s u lfó n ic o :á c id o m a le ico de 3 :1 ) se fu n c io n a liz a ro n en u n a p rim e ra e ta p a p o r m e d io de la m o lé cu la re ticu la n te b ifu n c io n a l c o rta N -(2 -a m in o e til)m a le im id a y d e sp u é s se p u rifica ro n y se a is la ro n . E s tos d e riva d o s de EC 4 se co n v ir t ie ro n d e sp u é s en un h id ro ge l m e d ia n te m e zc la d o en so lu c ió n sa lin a f is io ló g ic a (o sue ro ) con E N C -2 (P E G de cu a tro b ra zo s te rm in a d o en tio l). Se o b tie n e n h id ro g e le s con u na g ra d a c ió n en la c o n ce n tra c ió n de los g ru p o s s u lfo n a to de 0 ,16 a 0 ,05 m m o l/m l y m ó d u lo s de a lm a ce n a m ie n to de 3 ,7 a 0 ,2 kPa.
Los e je m p lo s de re a liza c ió n E N C 2 -E C 5 23 a E N C 2 -E C 5 25 son h id ro g e le s re ticu la d o s c o v a le n te m e n te seg ún el p rin c ip io de re ticu la c ió n 2 (R R 2, ta b la 1), en los q u e o ch o de los g ru p o s c a rb o x ilo de EC 5 (p o li(á c id o 4-e s tire n e s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) con u n a re lac ió n m o la r á c id o e s tire n o s u lfó n ic o :á c id o m a le ico de 1:1) a c tiva d o s m e d ia n te E D C /su lfo -N H S se fu n c io n a liz a ro n en u n a p rim e ra e ta p a p o r m e d io de la m o lé cu la re ticu la n te b ifu n c io n a l c o rta N -(2 -a m in o e til)m a le im id a y d e sp u é s se p u rifica ro n y se a is la ro n . E s tos d e riva d o s de EC 5 se c o n v irtie ro n d e sp u é s en un h id ro g e l m e d ia n te m e zc la d o en so lu c ió n sa lin a f is io ló g ic a (o sue ro ) con E N C -2 (P E G de cua tro b ra zo s te rm in a d o en tio l). S e o b tie n e n h id ro g e le s con u n a g ra d a c ió n en la c o n ce n tra c ió n de los g ru p o s su lfo n a to de 0 ,14 a 0 ,04 m m o l/m l y m ó d u lo s de a lm a ce n a m ie n to de 4 ,6 -0 ,3 kPa.
El e je m p lo de re a liza c ió n E N C 2 -E N C 3 26 es un h id ro ge l de PEG no ca rg a d o en el que , seg ún el p rin c ip io de re ticu la c ió n 2, se h izo re a c c io n a r PEG de cu a tro b ra zo s te rm in a d o en tio l (E N C -2 ) con un PEG de cu a tro b razos te rm in a d o en m a le im id a (E N C -3 ). E s te h id ro ge l s irv ió co m o co n tro l n eg a tivo no ca rg a d o en los e n sa yo s de secu e s tro .
S ob re la b ase de los e je m p lo s de re a liza c ió n 04-5 , es p os ib le , so rp re n d e n te m e n te , p ro d u c ir h id ro ge le s co m p le ta m e n te s in té tico s con u n a a m p lia d ive rs id a d de p ro p ie d a d e s y co m b in a c io n e s de p ro p ie d a d e s ve n ta jo sa s sin re a cc io n e s in m u n o g é n ica s d e sve n ta jo sa s . Se p ue de a ju s ta r en g ran m e d id a in d e p e n d ie n te m e n te e n tre s í una a m p lia c o n ce n tra c ió n de g ru p o s s u lfo n a to en el h id ro ge l h in ch a d o de 0 ,04 a 0 ,28 m m o l/m l y con u na v a ria c ió n ig u a lm e n te g ra n d e d e l m ó du lo de a lm a c e n a m ie n to de 0 ,2 a 21 ,8 kP a. P o r e je m p lo , los h id ro g e le s E N C 2 -E C 4 21, E N C 1 -E C 5 14, E N C 1 -E C 5 15 y E N C 1 -E C 4 08 p re se n ta n u n a co n ce n tra c ió n co n s ta n te de g ru p o s s u lfo n a to en el h id ro ge l h in ch a d o de 0 ,08 m m o l/m l p e ro al m ism o tie m p o m ó d u lo s de a lm a ce n a m ie n to c re c ie n te s de 1 ,1 ,5 ,5 , 12,5 y 19,6 kP a, es d ec ir, la c o n ce n tra c ió n de su lfo n a to y la rig ide z de los h id ro g e le s p ue de m o d u la rse in d e p e n d ie n te m e n te e n tre s í en un a m p lio in te rva lo . Del m ism o m odo, con la se le cc ió n de l E N C 1 -E C 5 19 con u na c o n ce n tra c ió n de s u lfo n a to de 0 ,05, de l E N C 1 -E C 4 11 con u n a co n ce n tra c ió n de s u lfo n a to de 0 ,06 y d e l E N C 1 -E C 4 10 con una c o n ce n tra c ió n de s u lfo n a to de 0 ,09 con un m ó du lo de a lm a ce n a m ie n to cas i co n s ta n te de 8 ,0 -8 ,5 kP a, la c o n ce n tra c ió n de su lfo n a to se p u e d e v a r ia r in d e p e n d ie n te m e n te de la rig ide z de los h id ro g e le s (vé ase la ta b la 1). A d e m á s, d e b id o a u n a va r ia c ió n a d ic io n a l de las re la c io n e s m o la re s E N C :E C en los in te rva lo s de e n tre 1,5 y 3 y de e n tre 3 y 6 p a ra RR1 y de e n tre 0 ,5 y 0 ,75 , a s í co m o 1 y 1,5, a s í co m o 1,5 y 2 p a ra R R2 y o tra va r ia c ió n en la co n ce n tra c ió n de EC y EN C, se p u e d e o b te n e r u na p lu ra lida d de o tra s co m b in a c io n e s de p ro p ie d a d e s .
S o rp re n d e n te m e n te , a e s te re spe cto , m e d ia n te la re ticu lac ió n de l p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ), c o m e n z a n d o con la a c tiva c ió n de E D C /su lfo N H S de uno de los g ru p o s á c id o s e s tre c h a m e n te a d ya ce n te s de l á c ido m a le ico , q u e en su re ac tiv ida d no so lo se ven in flu e n c ia d o s p o r e l g ru p o ca rb o x ilo a d ya ce n te s ino en p a rtic u la r p o r los g ru p o s s u lfo n a to y las u n id a d e s de e s tire n o h id ró fo b a s de u na fo rm a im p re d e c ib le , p u d ie ro n s in te tiza rse m a te ria le s de h id ro ge l d e fin id o s con e le m e n to s c o n s titu ye n te s no ca rg a d o s con las p ro p ie d a d e s a m p lia m e n te g ra d u a b le s m e n c io n a d a s a n te rio rm e n te . A e s te re sp e c to , se log ró u n a fo rm a c ió n de red p re c isa (p a ra R R 1) o d e riva tiza c ió n (p ara R R 2) m e d ia n te e l uso de un tie m p o de a c tiva c ió n s o rp re n d e n te m e n te m u y co rto de 1 m in, es d ec ir, e l t ie m p o en el q ue se p ro p o rc io n a E D C /su lfo N H S al p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ), v é a se la ta b la 4, a n tes de h a c e r re a c c io n a r a co n tin u a c ió n u na m o lé cu la q u e p o rta g ru p o s a m in a m e d ia n te m e zc la d o con el p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) e n to n ce s a c tiva d o y un m e zc la d o a fo n d o in te n s ivo de los a so c ia d os de re acc ión .
En un e je m p lo de re a liza c ió n a d ic io n a l se fu n c io n a liz a ro n h id ro g e le s de los t ip o s EN C 1-E C 1 01, E N C 1 -E C 4 20, E N C 1 -E C 5 23 y E N C 1 -E C 3 26 con el p é p tid o de a d h e s ió n C W R G D S P y se p re ca rg a ro n con V E g F-A y FG F-2 y se u tiliza ro n p a ra el c u ltivo de c é lu la s e n d o te lia le s h um a n a s en la s u p e rfic ie d e l g e l en un m e d io de cu ltivo ce lu la r d e s p ro v is to de sue ro . L a m o rfo lo g ía de las c é lu la s a d h e rid a s se a n a lizó d e sp u é s de un p e rio d o de c u ltivo de 24 h, ta l co m o se m u e s tra en la fig u ra 1 p a ra E N C 1-E C 1 01, E N C 2 -E C 4 20, E N C 2 -E C 5 23, E N C 2 -E N C 3 26. Las cé lu las e n d o te lia le s a d q u irie ro n , a e s te re spe cto , u n a m o rfo lo g ía d ife re n te en los d ife re n te s h id ro g e le s , q ue p ue de d e s c rib irse m e d ia n te los d os p a rá m e tro s , re lac ió n de a sp e c to y c ircu la rid a d . U n a re lac ió n de a sp e c to g ra n d e y u na c ircu la rid a d b a ja co rre sp o n d e n a la m o rfo lo g ía de c é lu la s e n d o te lia le s a la rg a d a s d e se a d a , a la p rim e ra e ta p a en la fo rm a c ió n de las e s tru c tu ra s tu b u la re s b io ló g ica m e n te d e se a d a s . La re lac ió n de a sp e c to de las c é lu la s e n d o te lia le s c u ltiva d a s en E N C 1-E C 1 01, E N C 2 -E C 4 20 y E N C 2 -E C 5 23 fu e ro n 3 ,4 ± 1,0, 4,1 ± 1,1 y 4 ,9 ± 1,6, m ie n tra s q u e los g e le s de re fe re n c ia no ca rg a d o s E N C 2 -E N C 3 26 p re se n ta b a n u na re lac ió n de a sp e c to s ig n ifica tiva m e n te in fe rio r de 2,1 ± 1,2. La c ircu la rid a d se co m p o rtó de fo rm a c o rre sp o n d ie n te m e n te in ve rsa con 0 ,5 ± 0,1, 0 ,4 ± 0,1, 0 ,3 ± 0,1 y 0 ,7 ± 0 ,3 p a ra las c é lu la s e n d o te lia le s en los h id ro g e le s E N C 1-E C 1 01, E N C 1 -E C 4 20 y E N C 1 -E C 5 23 y EN C1-Ec 3 26. E stas d ife re n c ia s fu e ro n e s ta d ís tic a m e n te m uy s ig n ifica tiva s . Las c é lu la s e n d o te lia le s se co m p o rta n en c o n s e c u e n c ia en los h id ro g e le s con las d ife re n te s p ro p ie d a d e s de c a rg a y se cu e s tro de tip o 1 (E N C 1-E C 1 01), tip o 4 (E N C 2 -E C 4 20), tip o 2 (E N C 2 -E C 5 23) y de tip o 5 no ca rg a d o (E N C 1 -E C 3 26) co rre sp o n d ie n te s a la ta b la 5.1 de fo rm a c la ra m e n te d ife re n te . En e l h id ro ge l no ca rg a d o , las c é lu la s m u es tra n p ro p o rc io n e s de a sp e c to co rta s no d e se a d a s y u n a a lta c ircu la rid a d , m ie n tra s q ue la m o rfo lo g ía d e s e a d a a u m e n ta en el o rde n E N C 1-E C 1 01 < E N C 1-EC 4 20 < E N C 2 -E C 5 23. El h id ro ge l E N C 2 -E C 5 23 de tip o 2 m u e s tra los m e jo re s re su lta d o s en e s te e n sa yo . Esta g ra d a c ió n c o n firm a u n a in flu e n c ia d ire c ta de las p ro p ie d a d e s de la c a rg a y los p a tro n e s de se cu e s tro sob re e l cu ltivo de c é lu la s e n d o te lia le s hum a na s .
En un e je m p lo de re a liza c ió n a d ic io n a l, se u tiliza ro n h id ro g e le s de tip o 1 (E N C 1-E C 1 01), tip o 4 (E N C 1 -E C 4 20), tipo 2 (E N C 1 -E C 5 23) y tip o 5 no ca rg a d o s (E N C 1 -E N C 3 26) p a ra la p o lim e riza c ió n de c é lu la s m e se n q u im a le s del e s tro m a h um a na s . Los h id ro g e le s re sp o n d ía n a las cé lu la s , es d ec ir, a d e m á s de la fu n c io n a liz a c ió n de los h id ro g e le s con e l p é p tid o p ro m o to r de la a d h e s ió n C W G R G D S P , la s e c u e n c ia p e p tíd ica G C G G P Q G IW G Q G G C G , q ue p u e d e e sc in d irse e n z im á tic a m e n te p o r m e d io de m e ta lo p ro te a sa s de m a triz s e c re ta d a s p o r e s ta s cé lu la s , se co n ju g ó p re v ia m e n te con e l e le m e n to c o n s titu ye n te no ca rg a d o re sp e c tivo y se u tilizó p a ra la re ticu lac ió n seg ún R R2. D e sp u é s de 24 horas, la a c tiv id a d m e ta b ó lica de las c é lu la s e m b e b id a s se ca ra c te r izó co m o p ru e b a de v ia b ilid a d m e d ia n te un e n sa yo P re s to B lue ® . A e s te re spe cto , la a c tiv id a d m e ta bó lica , m e d id a co m o u n id a d e s de f lu o re sc e n c ia re la tiva , de las c é lu la s m e se n q u im a le s de l e s tro m a h um a n a s p o lim e riza d a s d e n tro de l h id ro ge l e ra del tip o 1 7112 ± 3924, d e l tip o 2 3704 ± 2945 , de l tip o 4 3160 ± 6023 y d e l tip o no ca rg a d o 5 2316 ± 446. De fo rm a c o rre sp o n d ie n te , las c é lu la s m e se n q u im a le s de l e s tro m a h u m a n a s e m b e b id a s en g e le s de tip o 2 m o stra ro n la a c tiv id a d m e ta b ó lica m ás a lta y las e m b e b id a s en g e le s d e l ge l de re fe re n c ia no c a rg a d o s la m ás ba ja . P o r lo tan to , los h id ro ge le s , en p a rtic u la r de l tip o 2, re su lta ron se r e sp e c ia lm e n te v e n ta jo so s p a ra e l cu ltivo de cé lu la s m e se n q u im a le s d e l e s tro m a h um a n a s v iva s en 3D.
En o tro e je m p lo de re a liza c ió n v e n ta jo so , se fu n c io n a liz a ro n E N C 1-E C 1 01, E N C 2 -E C 4 20, E N C 2 -E C 5 23, E N C 2-E N C 3 26 con e l a n tib ió tico g e n ta m ic in a , q ue p o rta g ru p o s ca rg a d o s p o s itiva m e n te , m e d ia n te se cu e s tro d ife re n c ia d o . La inh ib ic ió n se m id ió a c o n tin u a c ió n lib e ra n d o la g e n ta m ic in a de los d ife re n te s h id ro ge le s u tiliz a n d o las d o s cep as b a c te ria n a s re le va n te s q ue ca u sa n e n fe rm e d a d e s E sch e rich ia co li (E. coli) y S ta p h y lo co ccu s e p id e rm id is (Staph. epidermidis). El e fe c to a n tim ic ro b ia n o se m id ió sob re la b ase de l ta m a ñ o de la zo n a de inh ib ic ió n (e lim in a c ió n del h id ro ge l de la p la ca de cu ltivo , v é a se M a te ria l y p ro ce d im ie n to s ). No h ubo zo n a s de inh ib ic ió n d e te c ta b le s p a ra los h id ro g e le s de los tip o s EN C 1-E C 1 01, E N C 2 -E C 4 20, E N C 2 -E C 5 23, E N C 2 -E N C 3 26 sin se cu e s tro p rev io de g e n ta m ic in a , es d ec ir, los h id ro g e le s no te n ía n e fe c to a n tim ic ro b ia n o . En e l ca so d e l se cu e s tro d ife re n c ia d o p rev io de g e n ta m ic in a p o r los h id ro g e le s , se m id ie ron las s ig u ie n te s zo n a s de inh ib ic ió n g ra d u a le s : EN C 1-E C 1 01: 3 ,08 ± 0 ,33 m m , E N C 2 -E C 4 20 E. coli: 3 ,08 ± 0 ,33 m m , S. epidermidis: 2 ,94 ± 0 ,35 m m , E N C 2 -E C 4 20: E. coli: 1,78 ± 0 ,27 m m , S. epidermidis: 1,76 ± 0 ,45 m m ; E N C 2 -E C 5 23 E. coli: 2 ,18 ± 0 ,38 m m , S. epidermidis: 1,81 ± 0,51 m m y p ara los g e le s de re fe re n c ia no ca rg a d o s E N C 2 -E N C 3 26 E. coli: 0 ,48 ± 0 ,36 m m , S. epidermidis: 0 ,90 ± 0 ,28 m m . En c o n se cu e n c ia , p a ra los g e le s de re fe re n c ia no ca rg a d o s E N C 2 -E N C 3 26, ta l co m o se e sp e ra b a , so lo las ca n tid a d e s m ás p e q u e ñ a s de g e n ta m ic in a se se cu e s tra n de fo rm a in e sp e c ífica y p o s te rio rm e n te se libe ran de nuevo . Se e n co n tró un e fe c to a n tim ic ro b ia n o g ra d u a l en el o rde n E N C 2 -E C 4 20 < E N C 2 -E C 5 23 < E N C 1-E C 101 p a ra los o tros h id ro g e le s . Este h a lla zg o re sp a ld a las a firm a c io n e s so b re el se cu e s tro d ife re n c ia d o de m o lé cu la s de p rin c ip io a c tivo c a rg a d a s p o s itiva m e n te . A d e m á s, se p u e d e n a ju s ta r d ife re n te s e fe c to s a n tim ic ro b ia n o s m e d ia n te la v a r ia c ió n de la co n ce n tra c ió n de se cu e s tro de g e n ta m ic in a .
M a te ria l y p ro ce d im ie n to s :
D esu lfa ta c ió n re g io se le c tiva de h e p a rin a (p ro d u cc ió n de EC 2 y EC 3 a p a rtir de EC 1)
P ara la s ín te s is de h e p a rin a d e s u lfa ta d a re g io se le c tiva m e n te (E C 2 y E C 3), se d is o lv ió en p r im e r lu g a r h e p a rin a (M W 14.000 , M e rck -M illip o re , N° de l fa b rica n te : 375095 , A le m a n ia , E C 1) en a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a y se d e sa lin izó u tiliz a n d o u na c o lu m n a de in te rca m b io ión ico A m b e rlite IR -120 H+ (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ). M e d ia n te la a d ic ión de p ir id in a (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) a la so lu c ió n de h e p a rin a h as ta a lc a n z a r un pH de 6, se fo rm ó u na sa l de h e p a rin a -p ir id in a , q u e se e n riq u e c ió p o r e va p o ra c ió n de l d iso lve n te en un e va p o ra d o r ro ta to rio B -490 (Büchi, A le m a n ia ), d e sp u é s se lio filizó a -80 °C (G E A L yo vac G T 2, A le m a n ia ) y se a lm a ce n ó a -20 °C h as ta su p o s te rio r p ro ce sa m ie n to .
P ara la p ro d u cc ió n de h e p a rin a N -d e su lfa ta d a (N -D S H , E C 2) se d is o lv ió 1 g /l de h e p a rin a -p ir id in a en u n a m e zc la de D M S O y a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a (95 :5 ) y se incu bó a 50 °C d u ra n te 1,5 horas. La so lu c ió n re su lta n te se d ilu yó 1 :1 con a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a y se a ju s tó a pH 9 con u n a so lu c ió n de h id ró x id o de sod io 1 M (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ). D espu és de la d iá lis is de la so lu c ió n (S p ec tru m Labs, A le m a n ia , M W C O = 8 kD a) fre n te a a gu a u ltra p u ra d e s io n iza d a d u ra n te tre s d ía s , se re a lizó la N -a ce tila c ió n de la h e p a rin a d e su lfa ta d a . P ara e llo se a ñ a d ie ro n a la so lu c ió n m e ta no l al 10% v /v (S ig m a -A ld r ich , A le m a n ia ) y c a rb o n a to de sod io 50 m M (S ig m a -A ld r ich , A le m a n ia ). La re acc ión de a ce tila c ió n tu vo lu g a r d u ra n te tre s hora s con e n fr ia m ie n to a 4 °C y a g ita c ió n co n s ta n te a 400 rpm m e d ia n te la a d ic ión de 400 gl de a nh íd rid o a cé tico (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) p o r 1 mg de h e p a rin a c a d a m e d ia hora y e l a ju s te p o s te rio r de l pH a 7 ,5 m e d ia n te la a d ic ión de u na so lu c ió n de c a rb o n a to de sod io 2 M.
P ara la p ro d u cc ió n de h e p a rin a 6O -N -d e s u lfa ta d a (6O N -D S H , EC 3) se d iso lv ió 1 g /l de h e p a rin a -p ir id in a en una m e zc la de D M S O y a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a (95 : 5) y se incu bó a 90 °C d u ra n te 24 horas . La so lu c ió n re su ltan te se d ilu yó 1 :1 con a gu a u ltra p u ra d e s io n iza d a y se a ju s tó a pH 9 con u na so lu c ió n de h id ró x id o de sod io 1 M (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ). D e spu és de la d iá lis is en un tu b o de d iá lis is (la b o ra to r io s S p e c tru m , A le m a n ia , M W C O = 8 kD a) fre n te a a gu a u ltra p u ra d e s io n iza d a d u ra n te tre s d ía s , la h e p a rin a d e s u lfa ta d a -6O -N se e n riq u e c ió p o r e va p o ra c ió n d e l d iso lve n te B -490 (B ü ch i, A le m a n ia ) y d e sp u é s se lio filizó (G E A L yo vac G T 2, A le m a n ia ).
C a ra c te riza c ió n de EC y EN C (vé ase la ta b la 2):
El peso m o le c u la r de E C 1-E C 3 se d e te rm in ó m e d ia n te d isp e rs ió n de luz de m ú ltip le s á n g u lo s a 690 nm en un a p a ra to D aw n H E L E O S II (W ya tt T e ch n o lo g y E urope , A le m a n ia ). Los va lo re s d n /d c n e ce sa rio s p a ra la d e te rm in a c ió n de l p eso m o le c u la r se d e te rm in a ro n con un d e te c to r RI (O p tila b T -rE X , W ya tt, A le m a n ia ) a una lon g itu d de o n d a de l = 690 nm . Los in c re m e n to s de RI, d n /d c de 0,1351 ml g -1 p a ra EC1, EC 2 y EC 3 fue ro n n e ce sa rio s p a ra la e va lu a c ió n de los e xp e rim e n to s de d isp e rs ió n de luz. La e va lu a c ió n de los re su lta d o s de d isp e rs ió n de luz p a ra d e te rm in a r la m a sa m o la r se re a lizó con e l p ro g ra m a in fo rm á tico A s tra , ve rs ió n 6.1 (W yatt T e ch n o lo g y , E s ta d os U n id os).
El g ra d o de su lfa ta c ió n de los d e riva d o s de h e p a rin a (E C 1 -E C 3 ) se d e te rm in ó m e d ia n te a n á lis is e le m e n ta l (E le m e n ta r, V a rio M IC R O cub e , A le m a n ia ) b a sá n d o se en la re lac ió n m o la r S :N . D eb ido a q ue c a d a u n id ad de d isa cá rid o c o n tie n e e xa c ta m e n te un á to m o de N, e l g ra d o de su lfa ta c ió n de EC1, EC2 y EC 3 (n úm ero de g ru p o s su lfa to /u n id a d de re p e tic ió n ) se d e te rm in ó m e d ia n te la re lac ió n m o la r S :N . A p a rtir de e llo ta m b ié n se d e te rm in ó el p e so m o le cu la r de la u n id ad de re p e tic ió n . B a sá n d o se en e llo , se c a lcu ló e l n úm e ro de g ru p o s su lfa to p o r u n id ad de re p e tic ió n o p o r m ol de po lím ero .
El p eso m o le c u la r y e l n ú m e ro de g ru p o s s u lfo n a to p o r u n id ad de re p e tic ió n o p o r m o l de p o lím e ro de EC 4 y EC5 (p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico )) se b asan en la in fo rm a c ió n d e l fa b rica n te (S ig m a -A ld rich , N° del fa b ric a n te : 434566 , A le m a n ia ).
El p eso m o le c u la r y la e s tru c tu ra de E N C 1, E N C 2, EN C3, PEG de cu a tro b razo s te rm in a d o en a m ina , t io l o m a le im id a se b asan en la in fo rm a c ión d e l fa b ric a n te (Je nkem te ch n o lo g y , E s ta d os U n id os). El peso m o le c u la r y la e s tru c tu ra de E N C 4 (P E G de cu a tro b ra zo s te rm in a d o en p é p tid o e sc in d ib le e n z im á tica m e n te ) e s tá de a cu e rd o con el p ro ce d im ie n to , ta l co m o se ha d e sc rito , p ro d u c id o y u tiliz a d o p o r T su rka n et a l. 2013 (Adv. M a te r. 2013, 25, 2606 ­ 2610).
P ro du cc ió n de h id ro g e le s a b ase de h e p a rin a o d e riva d o s de h e p a rin a (vé ase ta m b ié n la ta b la 1): P ara p ro d u c ir los h id ro g e le s , se d iso lv ie ro n seg ún e l tip o de h id ro g e l (vé ase la ta b la 2), co m o e le m e n to co n s titu ye n te c a rg a d o (EC) h e p a rin a (E C 1) (M e rck -M illip o re , N° de l fa b ric a n te : 375095 , A le m a n ia ), d e riva d o s de h e p a rin a d e s u lfa ta d o s a base de EC1 m e d ia n te e l p ro ce d im ie n to d e sc rito a n te r io rm e n te , v é a s e D esu lfa ta c ió n re g io se le c tiva , p a ra EC2 y E C 3) en a g u a d e s io n iza d a u ltra p u ra a 4 °C d u ra n te 30 se g u n d o s a 500 rpm con un m e zc la d o r de v ó rtice (IKA , A lem an ia ). A d ic io n a lm e n te se d iso lv ie ro n p a ra to d o s los tip o s de h id ro ge l co m o ENC1 PEG te rm in a d o en a m in a de cua tro b ra zo s (M W 10.000 , Je n ke m te ch n o lo g y , E s ta d os U n id os), 1 -e til-3 -(3 -d im e tila m in o p ro p il)ca rb o d iim id a (E D C ; S igm a-A ld rich , A le m a n ia ) y N -h id ro x isu lfo s u c c in im id a (su lfo -N H S ; S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) de la m ism a fo rm a . Para a se g u ra r la d iso lu c ió n c o m p le ta de los e le m e n to s co n s titu ye n te s de h id ro ge l, e s ta s s o lu c io n e s se tra ta ro n a d ic io n a lm e n te d u ra n te 5 m in a 4 °C con un b añ o de u ltra so n id o s (R K 100H , B an de lin , A le m a n ia ).
P ara a c tiv a r de EC1 a EC 3, se a ñ a d ie ro n ED C y su lfo -N H S (re la c ió n 2:1 de E D C :su lfo -N H S ) al EC d isu e lto (4 m ol de su lfo -N H S , 8 m ol de ED C con re sp e c to a c a d a m ol de ENC1 de la m e zc la de re acc ión te rm in a d a ) y se incu ba ro n de fo rm a co rre sp o n d ie n te a los tie m p o s de la ta b la 4 a 4 °C. D e spu és d e l p e rio d o de a c tiva c ió n de EC 1, EC 2, EC3, e l PEG de 4 b ra zo s te rm in a d o en a m in a d isu e lto (E N C 1) se a ñ a d ió ta m b ié n y se m e zc ló d u ra n te 30 se g u n d o s a 500 rpm con un m e zc la d o r de v ó rtic e (IK A , A le m a n ia ).
P ro du cc ió n de h id ro g e le s a b ase de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) seg ún la re acc ión de re ticu la c ió n 1 (R R 1, v é a s e ta m b ié n la ta b la 1):
Se u tiliza ro n p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) con la re lac ió n m o la r á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o :á c id o m a le ico 3:1 (S ig m a -A ld rich , N° de l fa b rica n te : 434566 , A le m a n ia , EC4, v é a s e la ta b la 2) y con la re lac ión m o la r ácido 4 -e s tire n o s u lfó n ic o :á c id o m a le ico 1 :1, S ig m a -A ld rich , N° de l fa b ric a n te : 434558 , A le m a n ia , EC5, v é a se la ta b la 2) y ENC1 (P E G de cu a tro b ra zo s te rm in a d o en a m ina , (M W 10.000 , Je n ke m te ch n o lo g y , E s ta d os U n id os ) p a ra p ro d u c ir h id ro g e le s re ticu la d o s co v a le n te m e n te de la fo rm a s ig u ie n te : se d iso lv ie ro n EC 4 o EC 5 y ENC1 re sp e c tiva m e n te en un te rc io d e l v o lu m e n to ta l de la m e zc la de h id ro g e l en a gu a d e s io n iza d a u ltra p u ra con 3 v e ce s la c o n ce n tra c ió n que se ind ica en la ta b la 1 y se tra ta ro n a d ic io n a lm e n te d u ra n te 5 m in a 4 °C con un b añ o de u ltra so n id o s (R K 100H, B an d e lin , A le m a n ia ). A c o n tin u a c ió n , to d a s las so lu c io n e s se te m p la ro n a 4 °C p a ra las e ta p a s a d ic io n a le s . Se d iso lv ie ro n 1 -e til-3 -(3 -d im e tila m in o p ro p il)ca rb o d iim id a (E D C ; S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) y N -h id ro x isu lfo su cc in im id a (su lfo -N H S ; S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) ta m b ié n en ca d a ca so en u n a se x ta p a rte de to d a la m e zc la de re acc ión y se c a le n ta ro n a 4 °C. La re lac ió n m o la r de ENC1 :E D C :su lfo N H S es de 1 :8:4 (1 :2:1 p a ra ca d a g ru p o a m in a de E N C 1). C o m o e ta p a s ig u ie n te , se a ñ a d ie ro n el ED C y e l s u lfo N H S al EC 4 o EC 5 y se m e zc la ro n p ip e te a n d o y se e sp e ra ron 30 se g u n d o s , a co n tin u a c ió n la m e zc la de re acc ión se m e zc ló d u ra n te 10 se g u n d o s en el a g ita d o r de v ó rtic e (V W R , A le m a n ia ) y d e sp u é s se e sp e ra ro n n u e va m e n te 20 se g u n d o s . D espu és de e s te p ro ce d im ie n to con un tie m p o de a c tiva c ió n to ta l de 1 m in, se a ñ a d ió el ENC1 al EC 4 o EC 5 a c tiva d o p ip e te a n d o en e l a g ita d o r de v ó rtice y a c o n tin u a c ió n se m e zc ló con e l a g ita d o r de v ó rtice d u ra n te 10 se g u n d o s a d ic io n a le s . La m e zc la de reacc ión te rm in a d a (las co n ce n tra c io n e s de ENC1 y EC 4 o EC 5 co rre sp o n d e n a h o ra a las co n ce n tra c io n e s ind ica d a s en la ta b la 1) se p ue de n v e r te r a h o ra en c u a lq u ie r fo rm a m e d ia n te p ip e te o y la fo rm a c ió n de g e l tu vo lu g a r p o r p o lim e riza c ió n a lo la rgo de un p e rio d o de 12 horas . A co n tin u a c ió n , los h id ro g e le s se h in cha ro n co m p le ta m e n te en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to m e d ia n te m ú ltip le s in te rca m b io s de so lu c ió n d u ra n te va r ia s hora s a n tes del u so o la ca ra c te r iza c ió n p o s te rio r de los h id ro ge le s .
P ro du cc ió n de h id ro g e le s p a ra c u ltivo c e lu la r con c é lu la s e n d o te lia le s h um a na s :
P ara e l c u ltivo de c é lu la s e n d o te lia le s h um a na s , se fo rm a ro n g e le s u n id os a s u p e rfic ie con un e sp e s o r fin a l de a p ro x im a d a m e n te 100 gm p ip e te a n d o 11 gl de la m e zc la de re acc ión fin a l/cm 2 sob re c u b re o b je to s de v id rio . P ara e llo , los cu b re o b je to s de v id r io se re cu b rie ro n p re v ia m e n te con u na f in a p e líc u la de p o li(e tile n o -a lt-a n h íd r id o de á c ido m a le ico ) según e l p ro ce d im ie n to de P om pe et. al. B io m a c ro m o le cu le s 2003, 4, 1072 -1079 p a ra g a ra n tiz a r u n a unión co va le n te d e l h id ro ge l. P ara la m o d ifica c ió n con p é p tid o s R G D , los h id ro g e le s fo rm a d o s h in ch a d o s en so lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a con fo s fa to con E D C /su lfo -N H S con u na c o n ce n tra c ió n de ED C 50 m M y su lfo -N H S 25 m M se d iso lv ie ro n en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to 1/15 M a 4 °C y los g ru p o s c a rb o x ilo re m a n e n te s d e l EC 4 o EC 5 se a c tiva ro n d u ra n te 20 m in y d e sp u é s se e n ju a g a ro n con ta m p ó n de b o ra to (100 m M , pH 8,0, 4 °C). Los h id ro g e le s a c tiva d o s se h ic ie ro n re a c c io n a r d e sp u é s con u na so lu c ió n con u n a c o n ce n tra c ió n de 50 m g /m l de la se cu e n c ia p e p tíd ica H 2 N -G W G G R G D S P -C O N H 2 (P e p tid e s In te rn a tio n a l, Lou isv ille , KY, E s ta d os U n id os ) d isu e lta en ta m p ó n b o ra to (100 m M , pH 8 ,0 ) a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te 2 hora s y d e sp u é s se lavó en e xce so con so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to .
C u ltivo de cé lu la s :
Se p a sa ro n c é lu la s e n d o te lia le s de la v e n a u m b ilica l h u m a n a (H U V E C , L onza , A le m a n ia ) en fra sc o s de cu ltivo c e lu la r re cu b ie rto s con fib ro n e c tin a en P ro m o ce ll C -22010 con u na m e zc la su p le m e n ta ria (P ro m o C e ll G m bH , A le m a n ia ) a 37 °C y e l 5% de C O 2 h as ta q u e a lca n za ro n e l 80% de c o n flu e n c ia . Las c é lu la s de l p ase 2 al 6 se u tiliza ro n en los e xp e rim e n to s s ig u ie n te s .
Los h id ro g e le s u n id o s a la s u p e rfic ie fu n c io n a liz a d o s con R G D se incu ba ro n con V E G F -A y FG F-2 a u na c o n ce n tra c ió n de 0 ,565 gg p o r c m 2 de su p e rfic ie de h id ro ge l d u ra n te 18 hora s a te m p e ra tu ra a m b ie n te y d e sp u é s se la va ro n d o s v e ce s con so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fos fa to .
Se cu ltiva ro n 50.000 c é lu la s /cm 2 en los h id ro g e le s fu n c io n a liz a d o s con R G D , V E G F -165 y FG F-2 en m edio P ro m o ce ll sin la m e zc la s u p le m e n ta ria . D espu és de 24 hora s de cu ltivo , las c é lu la s se lava ro n , se fija ro n y se ca ra c te r iza ro n m e d ia n te m ic ro sco p ía ó p tica (m ic ro sco p io in ve rtid o O lym p u s IX73, H am b urgo , A le m a n ia ). La re lac ión de a sp e c to se d e te rm in ó d e sp u é s de m e d ir c é lu la s in d iv id u a le s u tiliz a n d o e l p ro g ra m a in fo rm á tico de p ro ce sa m ie n to de im á g e n e s Fiji d iv id ie n d o la lon g itu d de la cé lu la e n tre la a n ch u ra de la cé lu la . La c ircu la rid a d se d e te rm in ó u tiliza n d o el p ro g ra m a in fo rm á tico de p ro ce sa m ie n to de im á g e n e s Fiji según la fó rm u la s ig u ie n te : c ircu la rid a d = 4 * n * (á re a de c é lu la /p e rím e tro )A2. En ca d a caso , se d e te rm in a ro n 20 c é lu la s p o r im agen en n = 10 m u es tra s in d e p e n d ie n te s . El a n á lis is e s ta d ís tic o con el p ro g ra m a in fo rm á tico G ra p h P a d P rism y un e n sa yo A n o va u n id ire cc io n a l m o stró d ife re n c ia s s ig n ifica tiva s p a ra to d a s las c o n d ic io n e s e xa m in a d a s .
P ro du cc ió n de h id ro g e le s a b ase de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) seg ún la re acc ión de re ticu la c ió n 2 (R R 2, v é a s e ta m b ié n la ta b la 1):
D e riva tiza c ió n de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) con g ru p o s m a le im id a :
P ara la fo rm a c ió n de h id ro g e le s seg ún la re acc ión de re ticu lac ió n 2, e l EC 4 o EC 5 d eb e fu n c io n a liz a rse en p rim e r lu g a r con tr if lu o ro a c e ta to de N -(2 -a m in o e til)m a le im id a (S igm a , A le m a n ia ). P ara e llo , se d iso lv ie ro n 500 m g (25 gm o l) d e l EC 4 o EC 5 re spe ctivo en 2 ,7 ml de a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a y se a g ita ro n en h ie lo d u ra n te 10 m in . Un va so de 25 m l con ta p ó n a p res ió n s irve co m o re c ip ie n te de m u es tra . A c o n tin u a c ió n , se a ña de n 65 ,14 mg de N H S (0 ,30 m m o l) d isu e lto s en 400 gl y 115 ,02 mg (0 ,60 m m o l) de ED C d is u e lto s en 200 gl de a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a h e la d a a la so lu c ió n de EC 4 o EC 5 y se e sp e ra n 5 m in . En la e ta p a s ig u ie n te , se a ñ a d ie ro n g o ta a g o ta 76 ,25 mg (0 ,30 m m o l) de tr if lu o ro a c e ta to de N -(-2 -a m in o e til)m a le im id a d isu e lto s en 200 gl de a gu a M illiQ al EC 4 o EC5 a c tiva d o a lo la rgo de un p e rio d o de 40 s d e sp u é s de q u e fin a liza ra e l t ie m p o de a c tivac ión . La m e zc la de re acc ión se a g ita en h ie lo d u ra n te 10 m in a d ic io n a le s . F in a lm e n te , se re tira e l b año de h ie lo y se a g ita la p re p a ra c ió n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te la noche . El p ro d u c to se d isp o n e en un tu b o de d iá lis is con un ta m a ñ o d e e xc lu s ió n de M W C O = 5 kD a. La d iá lis is se lleva a ca b o d u ra n te d o s d ías , d ia liz á n d o s e fre n te a u n a so lu c ió n de c lo ru ro de sod io m o n o m o la r de 2 ,5 l d u ra n te 6 ho ra s el p rim e r d ía . A e s te re spe cto , la so lu c ió n se ca m b ia , en ca d a caso , ca d a 2 horas . D espu és de 6 h, se lleva a ca b o la d iá lis is fre n te a a g u a u ltra p u ra d e s io n iza d a d u ra n te la noche . El se g u n d o d ía se re a liza la d iá lis is d u ra n te 8 ho ra s con a gu a u ltra p u ra d e s io n iza d a , ca m b iá n d o s e e l agua, en c a d a caso , c a d a 2 horas . En la ú ltim a e ta pa , la so lu c ió n se lio filiza .
C ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o p a ra la c a ra c te r iza c ió n de d e riva d o s de m a le im id a E C 4/E C 5 :
La c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o (S E C ) se u tiliza p a ra d e te rm in a r el n úm e ro de g ru p o s m a le im id a p o r m o lé cu la EC 4 o EC 5. P ara e llo , e l p é p tid o R G D -S P (M = 990 g /m o l) se a co p la al d e riva d o de m a le im id a E C 4 /E C 5 en d ife re n te s e xce so s . Los e xce so s m o la re s de R G D -S P in ve s tig a d o s son 6,8, 10 o 12 con re sp e c to a EC4 o EC5. En p r im e r lugar, se re g is tra u n a ca lib ra c ió n m e zc la n d o 35 gl de la c o n ce n tra c ió n de R G D -S P re sp e c tiva con 35 gl de so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to en un re c ip ie n te de m u es tra .
P ara e s ta in ve s tig a c ió n se u tiliza u n a c o lu m n a B io S E P -S E C S 2000 de P h e n o m n e x (A le m a n ia ), q u e se in se rta en el s is te m a H P LC A g ile n t 1100 (A le m a n ia ). La so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to con un ca u d a l de 0 ,5 m l/m in s irve co m o e lu ye n te . El v o lu m e n de inye cc ió n es de 50 gl.
La d e te rm in a c ió n de los g ru p o s m a le im id a ta m b ié n se re a liza en las m ism as co n d ic io n e s de e lu c ió n . En ca d a caso , se m e zc la n 35 gl de u n a c o n ce n tra c ió n de R G D con 35 gl de la so lu c ió n de d e riva d o de m a le im id a E C 4 /E C 5 en el re c ip ie n te de m u es tra . El p ro ce d im ie n to p e rm ite la d e te rm in a c ió n e xa c ta de las c o n v e rs io n e s de m a le im id a con EC4 o EC5.
P ro du cc ió n de h id ro g e le s b a sa d o s en d e riva d o s de p o li(á c id o 4 -e s tire n o s u lfó n ic o -co -á c id o m a le ico ) seg ún la re a cc ió n de re ticu la c ió n 2 (R R 2, v é a se ta m b ié n la ta b la 1):
Se d isu e lve n d e riva d o s de m a le im id a E C 4 /E C 5 y PEG de cu a tro b razo s te rm in a d o en tio l (E N C 2, M w = 10.000 Da, Je n ch e m , E s ta d os U n id os , ta b la 2) en u n a so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to con e l d o b le de la co n ce n tra c ió n e sp e c ifica d a en la ta b la 1. A co n tin u a c ió n se p ip e te a n vo lú m e n e s igu a les de a m bo s c o m p o n e n te s en un re c ip ie n te de m ic ro rre a cc ió n y se a g itan en e l a g ita d o r de v ó rtic e d u ra n te 10 se g u n d o s . A co n tin u a c ió n , se re tira un vo lu m e n d e fin id o de la m e zc la de re acc ión y se d isp o n e sob re un cu b re o b je to s de v id r io re ve s tid o con S ig m a C o te ® con un d iá m e tro de 9 m m . O tro cu b re o b je to s de v id rio re cu b ie rto con S ig m a C o te ® se d isp o n e sob re la g o ta . D espu és de 30 m in u tos , se re tiran los cu b re o b je to s de v id r io y e l d is co de g e l se h in cha en u na so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to a lo la rgo de 12 horas. En el ca so de c o n c e n tra c io n e s a lta s de E N C 2, e l v a lo r de pH d e l E N C 2 se p uede a ju s ta r a un v a lo r de pH de e n tre 5 -7 con H C l 1 M p a ra lo g ra r u na fo rm a c ió n de ge l ó p tim a .
P ro du cc ió n de h id ro g e le s p a ra c u ltivo c e lu la r con c é lu la s e s tro m a le s m e se n q u im a le s h um a n a s en 3D :
Los h id ro g e le s e sc in d ib le s p o r m e ta lo p ro te a sa d e m a triz (M M P ) se p re p a ra ro n u tiliza n d o el E N C 4 (tab la 4, s in te tiza d o seg ún el p ro ce d im ie n to d e sc rito p o r T su rka n et a l., A dv. M ate r. 2013 , 25 (18), 2606 -2610 ) en lu g a r de E N C 2 seg ún el p ro ce d im ie n to m e n c io n a d o a n te rio rm e n te .
P ara e llo , las c é lu la s se s u sp e n d ie ro n en el d e riva d o de E C 4 o E C 5 y d e s p u é s se fo rm a ro n los h id ro g e le s m e zc la n d o seg ún el p ro ce d im ie n to m e n c io n a d o a n te r io rm e n te y se h in cha ro n en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to y m e d io d e cu ltivo ce lu la r in m e d ia ta m e n te d e sp u é s de un tie m p o d e g e lifica c ió n de 5 m in.
C u ltivo d e cé lu la s :
S e c u ltiva ro n cé lu la s e s tro m a le s m e se n q u im a le s (M SC , A T C C , a is la d a s d e te jid o a d ip oso , A le m a n ia ) en D M E M con su e ro d e te rn e ro fe ta l al 10% y p e n ic ilin a /e s tre p to m ic in a al 1% en c o n d ic io n e s d e cu ltivo e s tá n d a r (5% de C O 2 y 37 °C). En los e xp e rim e n to s se u tiliza ro n M S C d e los pases 2 a 4.
S e m e zc la ro n d e riv a d o s d e EC -4 o E C -5 y E N C con 1 m ol d e C G W G G R G D S P p o r m ol d e EC y se d iso lv ie ro n en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to (la co n ce n tra c ió n d e los d e riva d o s d e E C 4 o E C 5 co rre sp o n d ió a 3 v e ce s la c o n ce n tra c ió n seg ún la ta b la 1). D espu és d e m e zc la r, la so lu c ió n se incu bó d u ra n te 10 -15 m in a 37 °C y d e sp u é s se m e zc ló u na su sp e n s ió n c e lu la r co n c e n tra d a en un te rc io de l vo lu m e n d e gel fina l con 6 x 106 cé lu la s /m l e x tra p o la d a s a la m e zc la d e re acc ión fina l. El E N C 4 (3 v e c e s la c o n ce n tra c ió n d e la ta b la 1) se d iso lv ió en un te rc io a d ic io n a l del vo lu m e n to ta l d e ge l en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to y se a ñ a d ió a la m e zc la d e d e riva d o s d e E C 4 /5 con cé lu la s y se m e zc ló p ip e te a n d o . D espu és d e la fo rm a c ió n de l ge l d u ra n te 5 m in u tos , se a ñ a d ió el m ed io d e cu ltivo ce lu la r d e sc rito a n te r io rm e n te y los h id ro g e le s se incu b a ro n a 37 °C d u ra n te 24 horas tal com o se ha d esc rito a n te r io rm e n te . E nsa yo P re s to B lu e ® : el e n sa yo P re s to B lu e ® se re a liza d e sp u é s d e un p e rio d o d e in cu b a c ió n d e 24 ho ra s d e s p u é s d e re a liza r el cu ltivo de las c é lu la s en los h id ro g e le s . P ara e llo , se a ñ a d e a ca d a m u e s tra d e h id roge l una so lu c ió n al 10% de l co lo ra n te P re s to B lu e ® d isu e lto en m e d io d e cu ltivo ce lu la r y se in cu b a en p la cas de m ic ro va lo ra c ió n d u ra n te 1 h a 37 °C. A co n tin u a c ió n , se m ide la flu o re sc e n c ia en el fo tó m e tro d e m ic ro p la ca s (T ecan S p a rk® , A le m a n ia ). La lon g itu d de o n d a de e xc ita c ió n es de 560 nm y la flu o re sc e n c ia se m id ió a u na lon g itu d de o n d a d e 590 nm. La a c tiv id a d m e ta b ó lica de las c é lu la s se ind icó so b re la base d e los v a lo re s d e f lu o re sce n c ia re la tiva (R FU ). Se e va lu a ro n 10 e n sa yo s in d e p e n d ie n te s con 4 d e te rm in a c io n e s té cn ica s (n = 40) y se e n co n tra ro n d ife re n c ia s s ig n ifica tiva s (A n ova de una d ire cc ió n ) pa ra to d a s las co n d ic io n e s .
E n sa yo de zo n a d e inh ib ic ió n a n tib a c te ria n a :
S e in cu b a ro n d isco s d e h id roge l (60 p l) en 1 ml d e g e n ta m iic in a a 50 p g /m l (S ig m a A ld rich , A le m a n ia ) d u ra n te 18 ho ra s y d e sp u é s se lava ro n d o s v e ce s con so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fos fa to . La a c tiv id a d a n tim ic ro b ia n a d e los h id ro g e le s ca rg a d o s con g e n ta m ic in a se d e te rm in ó u tiliza n d o un e n sa yo d e zo n a de inh ib ic ió n . P ara e llo , se p re p a ra ro n p la cas d e a g a r de ca ld o L u ria (LB ) (S ig m a A ld rich , M ú n ich , A le m a n ia ) seg ún las in s tru cc io n e s del fa b rica n te . Los cu ltivo s d e E sch e rich ia co li K 12 D H 5 (D S M Z , A le m a n ia ) y S ta p h y lo co c cu s e p id e rm id is PCI 1200 (A T C C , E s ta d o s U n id os) d e s p u é s d e 12 h d e c re c im ie n to se d ilu ye ro n h as ta una d e n s id a d ó p tica (D O ) m e d id a a 600 nm d e 0,1 y se a p lica ro n 250 pl de e s ta su sp e n s ió n b a c te ria n a a las re sp e c tiva s p lacas. Se u tilizó un paño de a lg o d ó n es té ril p a ra d is tr ib u ir las b a c te ria s de m a n e ra un ifo rm e . Los h id ro g e le s EN C 1-E C 1 01, E N C 2 -E C 4 20 y E N C 2 -E C 5 23 y E N C 2 -E N C 3 26, ca d a uno ca rg a d o o no ca rg a d o con g e n ta m ic in a , se d isp u s ie ro n en las cua tro e sq u in a s d e la p la ca d e A G A R y las p la ca s se incu ba ro n a 37 °C d u ra n te la noche . A co n tin u a c ió n , se m id ió la zon a d e inh ib ic ió n u tiliza n d o un c a lib re d ig ita l. S e e va lu a ro n 10 e n sa yo s in d e p e n d ie n te s con 3 d e te rm in a c io n e s e sp e c ia liz a d a s (n = 30) y se e n co n tra ro n d ife re n c ia s s ig n ifica tiva s (A n ova d e una d ire cc ió n ) p a ra to d a s las co n d ic io n e s .
D e te rm in a c ió n d e las p ro p ie d a d e s fís ic o -q u ím ic a s d e los h id ro g e le s :
P ara d e te rm in a r las p ro p ie d a d e s fís ica s de los d ife re n te s tip o s de h id ro ge l, se p o lim e riza ro n en cad a caso 67 pl de so lu c ió n de h id ro ge l no p o lim e riza d o e n tre d o s p o rta o b je to s d e v id r io d e 9 m m (M enze l G lá se r, A le m a n ia ) tra ta d o s con S ig m a co te (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) d u ra n te 16 h a te m p e ra tu ra a m b ie n te y d e s p u é s los d is co s d e gel re su lta n te s se re tira ron de los p o rta o b je to s de v id rio . El d iá m e tro de los d is c o s d e gel se d e te rm in ó ó p tica m e n te u tiliz a n d o un e sc á n e r de l tipo F L A -3100 (F u jitsu , Ja p ó n ) (d iá m e tro en e s ta d o no h in cha do ). Los d is co s d e ge l se h in ch a ro n d e s p u é s en so lu c ió n sa lin a ta m p o n a d a con fo s fa to (P B S ), 0 ,9 % d e N aC l ta m p o n a d o a pH d e 7 ,4 (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) d u ra n te 24 h (co n d ic io n e s fis io ló g ica s ) y se d e te rm in a ro n d e n uevo u tiliza n d o el e s c á n e r FLA-3100 (F u jitsu , Ja p ó n ) (d iám e tro en e s ta do h in cha do ). El h in ch a m ie n to d e los h id ro g e le s se d e te rm in ó a p a rtir de los d iá m e tro s d e te rm in a d o s u tiliza n d o la e cu ac ió n s ig u ie n te :
Hinchamiento = Diámetro de hidrogel hinchadoA3 / Diámetro del hidrogel no hinchadoA3
Hinchamiento = Diámetro de ? l h !' idrogel no hinchado3 ,
vé a s e la ta b la 1.
L os d a to s n o tifica d o s se o b tie n e n p ro m e d ia n d o (M W ) de al m e no s cu a tro m u e s tra s in d e p e n d ie n te s . T a m b ié n se p ro p o rc io n ó la d e sv ia c ió n e s tá n d a r (SD).
A d e m á s , el m ó d u lo de a lm a c e n a m ie n to y el m ó d u lo de p é rd id a de los h id ro g e le s se d e te rm in a ro n m e d ia n te re o m e tría o sc ila to ria (en k ilo p a sca le s ) u tiliza n d o un re óm etro de c iza lla m ie n to de tip o A re s de la e m p re sa T A In s tru m e n ts U n ited K ing d om . P ara e llo , se p e rfo ra ro n d isco s de 8 m m de h id ro g e le s h in ch a d o s en c o n d ic io n e s f is io ló g ic a s (so luc ión s a lin a ta m p o n a d a con fo s fa to (P B S , N aC l al 0 ,9 % ta m p o n a d o a pH de 7 ,4 (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia )) d u ra n te 24 horas y se m id ie ron con una d isp o s ic ió n de m e d ic ión de p la ca -p la ca de 9 m m con a um e n to d e la fre cu e n c ia de 1-100 rad /s a te m p e ra tu ra a m b ie n te con una d e fo rm a c ió n re d u c id a (2% ) y se d e te rm in ó el v a lo r p ro m e d io a lo la rgo d e l in te rva lo co m p le to de fre cu e n c ia (1 v a lo r de m e d ic ión en una m u es tra ). Los va lo re s n o tif ica d o s son los v a lo re s m e d io s de cu a tro d is co s de h id ro g e l p ro d u c id o s de fo rm a in d e p e n d ie n te y se ind ican co m o /- la d e sv ia c ió n e s tá n d a r (S D ). El m ó d u lo de a lm a ce n a m ie n to de los cu a tro tip o s d e h id ro ge l se ind icó en la ta b la 1, el m ó du lo de p é rd id a fu e en ca d a caso de v a r io s ó rd e n e s de m a g n itu d in fe rio r (d a to s no m o strad os).
La ta b la 1 m u e s tra las p ro p ie d a d e s fis ic o q u ím ica s de los h id ro ge le s .
La a n c h u ra de m a lla de los h id ro g e le s se p u e d e d e riv a r sob re la b ase de la te o ría de la e la s tic id a d d e l ca u ch o a p a rt ir de l m ó d u lo de a lm a c e n a m ie n to d e te rm in a d o e xp e rim e n ta lm e n te u tiliza n d o la fó rm u la s ig u ie n te (P o lym e r P hys ics, M ich a e l R ub ins te in y R alph H. C o lby, 2006 , O x fo rd U n ive rs ity P ress, O x fo rd ):
Figure imgf000022_0001
En la q ue G ' es el m ó du lo de a lm a c e n a m ie n to m e d id o , Na es la c o n s ta n te de A vo g a d ro , R es la co n s ta n te u n ive rsa l d e los g a se s y T es la te m p e ra tu ra (en K e lv in ).
P ara d e te rm in a r las p ro p ie d a d e s de un ión de los d ife re n te s tip o s de h id ro ge le s , se p o lim e riza ro n s o lu c io n e s de h id ro g e l s in p o lim e riz a r e n tre d o s p o rta o b je to s de v id r io de 5 m m (v id rio s M e nze l) tra ta d o s con S ig m a co te (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) d u ra n te 16 h a te m p e ra tu ra a m b ie n te y d e s p u é s se h in cha ro n en so lu c ió n s a lin a ta m p o n a d a con fo s fa to (P B S ), 0 ,9 % de N aC l ta m p o n a d o a pH 7 ,4 (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) d u ra n te 24 h. A este re spe cto , el vo lu m e n to ta l se a ju s tó en c o n s e c u e n c ia p a ra a s e g u ra r las m ism a s c a n tid a d e s m o la re s de EC1, EC 2, EC 3 y EC 4 en los cu a tro tip o s de h id ro g e l (vé ase la ta b la 4). P ara los e s tu d io s de un ión (se cu e s tro ), los re sp e c tivo s d is co s de h id ro g e l se in cu ba ro n d u ra n te 24 h en re c ip ie n te s de re acc ión P ro te in L oB in d de 0 ,5 ml (E p p e n d o rf T u bes, A le m a n ia ) con la m e zc la de p ro te ín a s co rre sp o n d ie n te (ta b la 3) d is u e lta en 400 pl de PBS con el 1% (m /v) de a lb ú m in a de su e ro b o v in o (B S A ; S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) y el 0 ,05 % (m /v) de P roc lin 300 (S ig m a -A ld rich , A le m a n ia ) (co rre sp o n d e n a la so lu c ió n d e s p u é s de la in cu b a c ió n 2). P ara p ro d u c ir la m e zc la de p ro te ín a s , se d iso lv ió e l p a tró n P ro ca rta P le x A, B y C (e b io sc ie n ce , A le m a n ia ) seg ún las in s tru cc io n e s d e l fa b ric a n te y se s u p le m e n tó con las p ro te ín a s DKK1 (N° d e l fa b ric a n te : 120-30, P ep ro tech , A le m a n ia ), e sc le ro s tin a (N° d e l fa b rica n te : 1406-S T , P ep ro te ch , A le m a n ia ) y T G F b l (N° d e l fa b ric a n te : 100-21, P ep ro tech , A le m a n ia ). L as co n c e n tra c io n e s in d iv id u a le s se m u e s tra n en la ta b la 7 (co rre sp o n d e n a la so lu c ió n a n tes de la in cu b a c ió n 1).
L as so lu c io n e s 1 y 2 se a lm a ce n a ro n a -80 °C h as ta q ue se m id ió la c o n ce n tra c ió n de p ro te ína s. P ara d e te rm in a r las c o n c e n tra c io n e s de p ro te ín a s en las so lu c io n e s 1 y 2, las m u e s tra s se m id ie ron según las in s tru cc io n e s de l fa b ric a n te u tiliza n d o el P ro ca rta P le x H um an C h e m o k in e P ane l 1 (e b io sc ie n ce , A le m a n ia ) en c o m b in a c ió n con los co rre sp o n d ie n te s k its P ro ca rte a P le x S im p le x en un d isp o s itivo d e l t ip o B io p le x 200 (B io rad , A le m a n ia ).
La un ión (se cu e s tro ) de las m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s se d e te rm in ó a p a rtir de las co n c e n tra c io n e s d e te rm in a d a s de la so lu c ió n 1 y 2 según la e cu ac ió n s ig u ie n te : U n ión en % = (1 - co n c e n tra c ió n en la so lu c ió n 2 (d e sp u é s de la in c u b a c ió n )/co n ce n tra c ió n en la so lu c ió n 1 (a n te s de la in cu b a c ió n )) x 100.
La ta b la 4 m u e s tra el tie m p o de a c tiva c ió n de los g ru p o s ca rb o x ilo de EC 1 a 4 en m in u to s y el v o lu m e n de gel u tiliza d o p a ra los e s tu d io s de un ión.
L os h id ro g e le s su lfa ta d o s o su lfo n a d o s se ca ra c te r iza n m e d ia n te su d is trib u c ió n de c a rg a en el e le m e n to c o n s titu ye n te ca rg a d o (EC ) en m ol d e g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r m o l de p o lím e ro y la c o n ce n tra c ió n de g rup o s su lfa to o su lfo n a to en el vo lu m e n de h id ro ge l h in cha do en c o n d ic io n e s fis io ló g ic a s en m m o l de su lfa to o su lfo n a to /m l d e h id ro g e l y el n ú m e ro de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r UR d iv id id o p o r el peso m o le c u la r de la UR en los in te rva lo s e sp e c ifica d o s . El cá lc u lo se re a lizó a p a rtir de las c o n c e n tra c io n e s m o la re s de los e le m e n to s co n s titu ye n te s de h id ro ge l d u ra n te la fo rm a c ió n d e l h id ro g e l (vé ase la ta b la 1) y el h in ch a m ie n to vo lu m é tr ico , ta b la 1) a su m ie n d o q ue los e le m e n to s co n s titu ye n te s de h id ro g e l se inco rp o ra n cu a n tita tiv a m e n te en la red.
La c o n ce n tra c ió n de los g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to en el h id ro ge l no h in ch a d o se c a lcu ló a p a rtir de la c o n ce n tra c ió n de EC en e l h id ro ge l no h in ch a d o x n ú m e ro de u n id a d e s de re pe tic ió n x n ú m e ro de g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to p o r u n id ad de re pe tic ió n . La c o n ce n tra c ió n de l su lfa to o s u lfo n a to en e l g e l h in ch a d o (ta b la 1) se c a lcu ló a p a rtir de la co n ce n tra c ió n de los g ru p o s su lfa to o su lfo n a to en el h id ro ge l no h in ch a d o d iv id id a p o r e l h in ch a m ie n to (vé ase la ta b la 1).
Los e n sa yo s de e x tra cc ió n no p ro p o rc io n a ro n co m o re su lta d o n in g u n a e lu c ió n m e d ib le de los e le m e n to s co n s titu ye n te s de l g e l, p o r lo q u e se c o n s id e ra ju s tif ica d a la su p o s ic ió n de q u e los e le m e n to s co n s titu ye n te s de l gel se han in co rp o ra d o p o r com p le to .
La ta b la 3 ind ica las ca n tid a d e s p o rce n tu a le s u n id a s de m o lé cu la s s e ñ a liza d o ra s en los h id ro g e le s n o rm a liza d a s a la co n ce n tra c ió n de los fa c to re s so lu b le s a n tes de la in cu b a c ió n , ta l co m o se ha e xp lica d o a n te rio rm e n te . Los p o rce n ta je s se re fie ren al p o rce n ta je en m asa .
El ta m a ñ o m o le cu la r de las su s ta n c ia s , q u e ta m b ié n se d e n o m in a n su s ta n c ia s s e ñ a liza d o ra s o fa c to re s , se e xp re sa en k ilo d a lto n s (kD a).
Las p ro te ín a s (m o lé cu la s se ñ a liza d o ra s ) e s tá n c la ra m e n te a s ig n a d a s en a b re v ia tu ra s (ta b la 3 y los n ú m e ro s de id e n tifica c ió n U n iP ro t (U n ip ro t ID) d e l b an co de d a to s de p ro te ín a s U n ive rsa l P ro te in R eso u rce (U n iP ro t; h ttp ://w w w .u n ip ro t.o rg /).
El p u n to iso e lé c trico (IE P ) y la m a sa m o la r se ca lcu la ro n b a sá n d o se en la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s c o m p le ta m e n te p ro c e sa d a b io ló g ica m e n te u tiliza n d o e l p ro g ra m a E xP A S y P ro tP a rm (h ttp ://w e b .e x p a sy .o rg /p ro tp a ra m /; R e fe ren c ia : G a s te ig e r, E. e t al. en T he P ro teo m ics P ro toco ls H a n d b o o k 571 -607 (2005 )).
Los p a rá m e tro s e s tru c tu ra le s de las p ro te ín a s se d e te rm in a ro n u tiliza n d o e l b an co de d a to s E xP A S y P R O S IT E b a sá n d o se en los n úm e ro s de id e n tifica c ió n U n iP ro t (h ttp ://p ro s ite .e x p a s y .o rg /; S ig ris t, C .J .A . e t al. N e w and co n tin u in g d e v e lo p m e n ts at E xP A S y P R O S IT E ; R e fe re n c ia s : (1) N uc le ic A c id s Res. 41, (2013 ); (2) S ig ris t, C .J .a . e t al. P R O S IT E : u n a b ase de d a to s d o c u m e n ta d a q ue u tiliza p a tro n e s y p e rfile s co m o d e sc rip to re s de m o tivo s . Brie f. B io in fo rm . 3, 265 -274 (2002 )).

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. P ro ce d im ie n to p a ra e l se cu e s tro d ife re n c ia d o de su s ta n c ia s de d ife re n te s g ru p o s de su s ta n c ia s A y B en un h id ro g e l s u lfa ta d o y /o su lfo n a d o y p a ra el e m p o b re c im ie n to de su s ta n c ia s d e l g ru p o de s u s ta n c ia s A en un b io flu id o con lib e ra c ió n d ife re n c ia d a s im u ltá n e a de s u s ta n c ia s d e l g ru p o de s u s ta n c ia s A o B de l h id ro ge l s u lfa ta d o y /o su lfo n a d o en e l b io flu id o o la u n ió n re d u c id a de s u s ta n c ia s de l g ru p o de su s ta n c ia s B en el h id ro ge l su lfa ta d o y/o s u lfo n a d o , en e l q u e e l h id ro ge l s u lfa ta d o y /o su lfo n a d o se se le cc io n a de un g ru p o de h id ro g e le s de tip o 1, tip o 2, tip o 3 o de tip o 4 y los h id ro g e le s e s tá n co n s titu id o s p o r e le m e n to s co n s titu ye n te s no ca rg a d o s y e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s c a ra c te r iza d o s p o r q u e los e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s se ca ra c te r iza n p o r un p a rá m e tro ca lc u la d o a p a rtir d e l n ú m e ro de g ru p o s su lfa to y /o su lfo n a to p o r u n id ad de re pe tic ió n d iv id id o p o r la m a sa m o la r de la u n idad de re p e tic ió n de 0 ,0040 -0 ,0060 m o l/g p a ra e l tip o 1, de 0 ,0025 -0 ,0040 m o l/g p a ra e l t ip o 2, de 0 ,0005 -0 ,0025 m o l/g p a ra el tip o 3 y de 0 ,0040 -0 ,0100 m o l/g p a ra e l tip o 4 y los h id ro g e le s h in ch a d o s p re se n ta n un m ó d u lo de a lm a c e n a m ie n to in fe rio r a 20 kP a y las p ro p ie d a d e s de los h id ro g e le s h in ch a d o s p re se n ta n una c o n ce n tra c ió n de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to en m m o l/m l de 0 ,09 a 0 ,20 en e l tip o 1, de 0 ,05 a 0 ,18 en e l tip o 2, de 0,01 a 0 ,12 en el tip o 3 y de 0 ,16 a 0 ,8 en el tip o 4, y p o r q ue se in flu ye en la c o n ce n tra c ió n de s u s ta n c ia s de l g rup o de su s ta n c ia s A y de su s ta n c ia s de l g ru p o de s u s ta n c ia s B en e l b io flu id o m e d ia n te la e le cc ió n de l tip o de h id ro ge l.
2. P ro ce d im ie n to seg ún la re iv in d ica c ió n 1, c a ra c te r iza d o p o r q ue los e le m e n to s co n s titu ye n te s ca rg a d o s de los h id ro g e le s p re se n ta n un n úm e ro de g ru p o s su lfa to y /o s u lfo n a to p o r u n id ad de re p e tic ió n d iv id id o p o r la m a sa m o la r de la u n id ad de re p e tic ió n de 0 ,0050 m o l/g p a ra el tip o 1, de 0 ,0035 m o l/g o 0 ,0038 m ol/g p a ra el tip o 2, de 0 ,0019 m o l/g p a ra e l tip o 3 y de 0 ,0045 m o l/g p a ra e l tip o 4, y p o r q u e las p ro p ie d a d e s de los h id ro g e le s h in cha do s p re se n ta n u n a c o n ce n tra c ió n de su lfa to o su lfo n a to en m m o l/m l de 0 ,12 en el tip o 1 y de 0 ,12 o 0 ,14 en el tip o 2 y de 0 ,06 en el tip o 3 y de 0 ,28 o 0 ,16 en e l tip o 4.
3. P ro ce d im ie n to p a ra e l se cu e s tro d ife re n c ia d o de su s ta n c ia s de d ife re n te s g ru p o s de su s ta n c ia s A y B en un h id ro g e l s u lfa ta d o y /o su lfo n a d o y p a ra el e m p o b re c im ie n to de su s ta n c ia s d e l g ru p o de s u s ta n c ia s A en un b io flu id o con lib e ra c ió n d ife re n c ia d a s im u ltá n e a de su s ta n c ia s d e l g ru p o de su s ta n c ia s B de l h id ro ge l su lfa ta d o y /o su lfo n a d o en e l b io flu id o o la u n ión re d u c id a de s u s ta n c ia s de l g ru p o de s u s ta n c ia s B en e l h id ro ge l s u lfa ta d o y /o su lfo n a d o , en el q ue el h id ro ge l su lfa ta d o y /o su lfo n a d o se s e le cc io n a de un g ru p o de h id ro g e le s de tip o 1, tip o 2, tip o 3 o de tip o 4 y los h id ro g e le s e s tá n co n s titu id o s p o r e le m e n to s co n s titu ye n te s no ca rg a d o s y e le m e n to s co n s titu ye n te s ca rg a d o s c a ra c te r iza d o s p o r q ue los e le m e n to s co n s titu ye n te s ca rg a d o s p re se n ta n u na c o n ce n tra c ió n en m o les de g rup o s su lfa to o su lfo n a to p o r m ol de p o lím e ro de 60 a 80 en el tip o 1, de 30 a 75 en e l tip o 2, de 10 a 30 en e l tip o 3 y de 80 a 120 en e l tip o 4, y p o r q u e los e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s en e l h id ro ge l p re se n ta n u n a co n ce n tra c ió n de EC en m m o l/m l de 0 ,0015 a 0 ,0025 en el tip o 1, de 0 ,0015 a 0 ,0030 en el tip o 2, de 0 ,0010 a 0 ,0040 en el tip o 3 y de 0 ,0018 a 0 ,0050 en el tip o 4, y p o r q ue los h id ro g e le s h in ch a d o s p re se n ta n un m ó du lo de a lm a c e n a m ie n to in fe rio r 20 kP a, en el q u e los g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p re se n ta n u na c o n ce n tra c ió n en m m o l/m l en e l h id ro ge l de 0 ,09 a 0 ,20 en e l tip o 1, de 0 ,05 a 0 ,18 en e l t ip o 2, de 0,01 a 0 ,12 en el tip o 3 y de 0 ,16 a 0 ,80 en e l tip o 4, y p o r q ue se in fluye en la c o n ce n tra c ió n de su s ta n c ia s de l g ru p o de su s ta n c ia s A y de s u s ta n c ia s de l g ru p o de su s ta n c ia s B en el b io flu id o m e d ia n te la e le cc ió n de l tip o de h id roge l.
4. P ro ce d im ie n to seg ún la re iv in d ica c ió n 3, ca ra c te r iza d o p o r q ue los e le m e n to s co n s titu ye n te s ca rg a d o s tie n e n una c o n ce n tra c ió n en m o les de g ru p o s su lfa to o su lfo n a to p o r m ol de p o lím e ro de 70 ,2 en el tip o 1 y de 48 ,4 o 75 ,0 en el tip o 2 y de 23 ,4 en el tip o 3 y de 90 ,0 en el tip o 4, y p o r q ue los e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s en el h id ro ge l p re se n ta n u na c o n ce n tra c ió n de EC en m m o l/m l de 0 ,0018 en el tip o 1, de 0 ,0025 o 0 ,0018 en el tip o 2, de 0 ,0027 en el tip o 3 y de 0,0031 o 0 ,0018 en e l tip o 4, y p o r q u e los h id ro g e le s h in ch a d o s p re se n ta n un m ó d u lo de a lm a c e n a m ie n to in fe rio r a 20 kP a, en el q ue la c o n ce n tra c ió n de g ru p o s su lfa to o s u lfo n a to en m m o l p o r ml en el h id ro g e l es de 0 ,12 en e l tip o 1, de 0 ,12 o 0 ,14 en e l tip o 2, de 0 ,06 en e l tip o 3 y de 0 ,28 o 0 ,16 en el tip o 4.
5. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, c a ra c te r iza d o p o r q u e la re ticu la c ió n de los e le m e n to s co n s titu ye n te s p a ra d a r e l h id ro ge l se re a liza m e d ia n te re acc ión de g ru p o s fu n c io n a le s a d e cu a d o s en e l EC y /o el EN C de la c la se de a m ina s, tio le s , ca rb o x ilo s , a n h íd rid o s , m a le im id a s , v in ilsu lfo n a s , acrila tos , h id ro x ilos , isoc ian a to s , e p ó x id o s y a ld e h íd o s , o g ru p o s q u e p ue de n fo rm a r e n la ce s no c o v a le n te s b a sa d o s en fu e rz a s e le c tro s tá tic a s o in te ra cc io n e s h id ró fob as , e n la ce s de p u e n te de h id ró g e n o o in te ra cc io n e s d ip o la re s .
6. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 5, c a ra c te r iza d o p o r q u e la re ticu la c ió n de los e le m e n to s co n s titu ye n te s ca rg a d o s p a ra d a r e l h id ro ge l se re a liza m e d ia n te re ticu la c ió n d ire c ta p o r m e d io de u na m o lé cu la de re ticu la c ió n b ifu n c io n a l p e q u e ñ a con u na m a sa m o la r de EN C < 500 g /m o l.
7. P ro ce d im ie n to seg ún u n a de las re iv in d ica c io n e s 1 a 6, c a ra c te r iza d o p o r q u e co m o e le m e n to s co n s titu ye n te s c a rg a d o s se se le cc io n a n g lic o sa m in o g lica n o s s u lfa ta d o s o b te n id o s de fu e n te s na tu ra le s , ta le s co m o h e p a rin a y h e p a rin a s d e su lfa ta d a s se le c tiva s , su lfa to de c o n d ro itin a , su lfa to de h ep a rán , su lfa to de q u e ra tá n , á c ido h ia lu rón ico su lfa ta d o , a s í co m o g lic o p o lím e ro s su lfa ta d o s a b ase de m a no sa , lac tosa , d e x tra n o y co m p u e s to s p o lisu lfo n a d o s q u e p o rta n á c id o e s tire n o s u lfó n ic o (A E S ), á c id o v in ils u lfó n ic o (A V S ), á c ido 2 -a c r ila m id o -2 -m e tilp ro p a n o s u lfó n ic o (A A M P S ), á c id o a m in o p ro p a n o s u lfó n ic o (A A P S ) o á c id o a n e to ls u lfó n ic o (A A S ) co m o m o n ó m e ro s q ue co n tie n e n a zu fre y ta m b ié n en c o p o lím e ro s con u n id a d e s q u e co n tie n e n los g ru p o s de re ticu la c ió n m e n c io n a d o s , y p o r q ue co m o e le m e n to s co n s titu ye n te s no ca rg a d o s se se le cc io n a n p o lie tile n g lico le s , p o li(2-o xa zo lin a s ), p o liv in ilp irro lid o n a (P V P ), p o li(a lco h o le s v in ílic o s ) (P A V ) y /o p o lia c r ila m id a s (P A M ) o u n a m o lé cu la re ticu la n te b ifu n c io n a l co rta .
8. P ro ce d im ie n to seg ún u n a de las re iv in d ica c io n e s 1 a 7, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 1 com o su s ta n c ia de l g ru p o de su s ta n c ia s A se se le cc io n a al m e no s u na de las s u s ta n c ia s bN G F, P D G F -B B , V E G F -A , e o ta x in a , G R O -a lfa , IL -8, IP -10, M C P -1, M IP-1 a lfa , M IP-1 b e ta , R an tes , S D F 1 -a lfa , IF N -ga m m a , IL -12 p40 , IL-4, e sc le ro s tin a y /o D K K 1, en e l q ue las s u s ta n c ia s se e m p o b re ce n en el b io flu id o en m ás d e l 50 % de la co n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n y se se cu e s tra n en el h id roge l.
9. P ro ce d im ie n to seg ún u n a de las re iv in d ica c io n e s 1 a 8, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 1 com o su s ta n c ia de l g ru p o de s u s ta n c ia s B se s e le cc io n a al m e no s u na de las su s ta n c ia s FG F-2 , T G F b 1, EG F, H G F, PLG F, G M -C S F , IL-1 beta , IL-10, IL-6 y /o T N F -a lfa , en el q u e las su s ta n c ia s se unen so lo h as ta e l 50 % de la co n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n en el h id ro ge l o se libe ran de l m ism o.
10. P ro ce d im ie n to según u n a de las re iv in d ica c io n e s 1 a 9, c a ra c te r iza d o p o r q ue en h id ro g e le s de tip o 2 com o su s ta n c ia de l g ru p o de su s ta n c ia s A se se le cc io n a al m e no s u na de las s u s ta n c ia s bN G F, P D G F -B B , V E G F -A , e o ta x in a , G R O -a lfa , IL -8, IP -10, M C P -1, R an tes , S D F 1 -a lfa , IF N -ga m m a , IL -12 p40 , IL-4 y /o D K K 1, en e l q u e las s u s ta n c ia s se e m p o b re ce n en el b io flu id o en m ás del 50% de la c o n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n y se secu e s tra n en e l h id ro ge l.
11. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 10, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 2 co m o s u s ta n c ia d e l g ru p o de su s ta n c ia s B se s e le cc io n a al m e no s u n a de las s u s ta n c ia s FG F-2 , T G F b 1, EG F, H G F, P LG F, G M -C S F , IL-1 beta , IL-10, IL -6, T N F -a lfa y /o e sc le ro s tin a , en el q ue las s u s ta n c ia s se u nen so lo h as ta e l 50% de la c o n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n en el h id ro ge l o se libe ran d e l m ism o.
12. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 11, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 3 co m o s u s ta n c ia d e l g ru p o de s u s ta n c ia s A se s e le cc io n a al m e no s u n a de las su s ta n c ia s b N G F , P D G F -B B , V E G F -A , e o ta x in a , G R O -a lfa , IP -10, R an tes , S D F 1 -a lfa , IF N -g a m m a y /o IL-4, en e l q ue las su s ta n c ia s se e m p o b re ce n en el b io flu id o en m ás d e l 50% de la c o n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n y se se cu e s tra n en el h id ro ge l.
13. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 12, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 3 co m o s u s ta n c ia d e l g ru p o de su s ta n c ia s B se s e le cc io n a al m e no s u n a de las s u s ta n c ia s FG F-2 , T G F b 1, EG F, H G F, P LG F, IL -8, M C P -1, M IP-1 a lfa , M IP-1 beta , G M -C S F , IL-1 beta , IL-10, IL -12 p40 , IL -6, T N F -a lfa , e sc le ro s tin a y /o D K K 1, en el q ue las su s ta n c ia s se unen so lo h as ta el 50% de la c o n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n en e l h id ro ge l o se libe ran de l m ism o.
14. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 13, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 4 co m o s u s ta n c ia d e l g ru p o de s u s ta n c ia s A se s e le cc io n a al m e no s u n a de las su s ta n c ia s b N G F , P D G F -B B , V E G F -A , e o ta x in a , G R O -a lfa , IL -8, IP -10, M C P -1, M IP-1 a lfa , M IP-1 b e ta , R an tes , S D F 1 -a lfa , IF N -ga m m a , IL-1 beta , IL-10, IL-12p40 , IL-4, IL-6 y /o T N F -a lfa , en e l las su s ta n c ia s se e m p o b re ce n en el b io flu id o en m ás d e l 60 % de la c o n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n y se se cu e s tra n en el h id ro ge l.
15. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 14, c a ra c te r iza d o p o r q u e en h id ro g e le s de tip o 4 co m o s u s ta n c ia de l g ru p o de su s ta n c ia s B se s e le cc io n a al m e no s u n a de las su s ta n c ia s EG F, P LG F y /o G M -C S F , en el q u e las su s ta n c ia s se u nen so lo h as ta e l 40 % de la co n ce n tra c ió n in ic ia l de la so lu c ió n en e l h id ro ge l o se libe ran de l m ism o.
16. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 15, c a ra c te r iza d o p o r q u e los h id ro g e le s de tip o 1, tip o 2, tip o 3 o tip o 4 e s tán p re ca rg a d o s con al m e no s u n a s u s ta n c ia d e l g ru p o de s u s ta n c ia s A y /o B en a lta co n ce n tra c ió n y d e s p u é s e s ta s s u s ta n c ia s se libe ran de l h id ro ge l p a ra le la m e n te e in d e p e n d ie n te m e n te en el b io flu id o p a ra c a m b ia r la co n ce n tra c ió n .
17. P ro ce d im ie n to seg ún u na de las re iv in d ica c io n e s 1 a 16, c a ra c te r iza d o p o r q ue los h id ro g e le s se fo rm a n a p a rtir de m a te ria le s m u ltifá s ico s , es d ec ir, a p a rtir de m e zc la s de los d ife re n te s tip o s 1-4 de m a te ria le s de h id ro ge l o d ife re n te s fo rm a s de p ro ce sa m ie n to (m ic ro p a rtícu la s e h id ro g e le s en m a sa ) o e s tá n p re ca rg a d o s con d ife re n te s s u s ta n c ia s o ca n tid a d e s de su s ta n c ia s .
18. P ro ce d im ie n to seg ún u n a de las re iv in d ica c io n e s 1 a 17, ca ra c te r iza d o p o r q u e la lib e ra c ió n d ife re n c ia d a de s u s ta n c ia s d e l g ru p o de su s ta n c ia s A o B d e l h id ro ge l su lfa ta d o y /o su lfo n a d o en el b io flu id o y la u n ión re d u c id a de las su s ta n c ia s de l g ru p o de s u s ta n c ia s B en el h id ro ge l su lfa ta d o y /o su lfo n a d o se re a liza n s im u ltá n e a m e n te .
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