ES2889906T3 - Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos - Google Patents

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Luke Evnin
Jeanmarie Guenot
Vanitha Ramakrishnan
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Abstract

Una proteína de unión a antígeno triespecífica, en donde dicha proteína de unión a antígeno triespecífica comprende (a) un primer dominio (A) que comprende un fragmento variable monocatenario (scFv) específico de CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que comprende un anticuerpo de dominio único (sdAb; del inglés, single domain antibody) que se une a albúmina sérica humana; y (c) un tercer dominio (C) que comprende un anticuerpo de dominio único (sdAb) que se une específicamente a un antígeno tumoral diana, en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(C)-L2-(B)-L1-(A)-COOH y en donde L1 y L2 son, cada uno independientemente, un enlazador que consiste en de 0 a 50 restos de aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia en ASCII, creada el 17 de mayo de 2016, se denomina 47517_701_601_SL.txt. y tiene un tamaño 128.516 bytes.
Antecedentes de la técnica
La destrucción selectiva de una célula individual o de un tipo de células específico con frecuencia es deseable en diversas situaciones clínicas. Por ejemplo, el objetivo principal de la terapia del cáncer es destruir específicamente las células tumorales, al tiempo que se dejan las células y los tejidos sanos intactos y sin dañar. Uno de tales métodos es mediante la inducción de una respuesta inmunitaria contra el tumor, para hacer que las células efectoras inmunitarias, tales como las células citolíticas naturales (NK; del inglés, natural killer) o los linfocitos T citotóxicos (CTL; del inglés, cytotoxic T lymphocytes), ataquen y destruyan a las células tumorales.
El documento EP 1736484 A1 desvela anticuerpos triespecíficos que comprenden un fragmento monocatenario (scFv; del inglés, single chain fragment), un antígeno anti-carcinoembrionario (CEA; del inglés, anti-carcinoembryonic antigen), un scFv anti-CD3 y una cadena variable de cadena pesada (VH; del inglés, heavy chain variable chain) anti-CD28 y un péptido de unión a HSA.
Sumario de la divulgación
En un aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a antígeno triespecífica, en donde dicha proteína de unión a antígeno triespecífica comprende
(a) un primer dominio (A) que comprende un fragmento variable monocatenario (scFv) específico de CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que comprende un anticuerpo de dominio único (sdAb; del inglés, single domain antibody) que se une a albúmina sérica humana; y
(c) un tercer dominio (C) que comprende un anticuerpo de dominio único (sdAb) que se une específicamente a un antígeno tumoral diana,
en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(C)-L2-(B)-L1-(A)-COOH y en donde L1 y L2 son, cada uno independientemente, un enlazador que consiste en 0 a 50 restos de aminoácidos.
En algunas realizaciones, el primer dominio comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR; del inglés, complementary determining regions) seleccionadas del grupo que consiste en muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab, SP34, X35, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4,2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIM-141, XMI-46, XIM-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 y WT-31. En algunas realizaciones, el primer dominio es humanizado o humano. En algunas realizaciones, el primer dominio es específico para CD3e (épsilon). En algunas realizaciones, el primer dominio tiene reactividad cruzada con el CD3 de cinomolgo.
En algunas realizaciones, el tercer dominio es específico de una molécula de superficie celular. En algunas realizaciones, el tercer dominio es específico de un antígeno tumoral seleccionado del grupo que consiste en EGFR, PSMA, HER2 y MSLN.
En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son enlazadores peptídicos. En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 consisten independientemente en aproximadamente 20 o menos restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son cada uno independientemente (GS)n (SEQ ID NO: 49), (GGS)n (SEQ ID NO: 50), (GGGS)n (SEQ ID NO: 51), (GGSG)n (SEQ ID NO: 52), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 53) o (GGGGS)n (SEQ ID NO: 54), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son cada uno independientemente (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 55) o (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 56).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno triespecífica es de aproximadamente 50 a aproximadamente 75 kDa.
En otro aspecto, la invención proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de unión a antígeno triespecífica de la invención. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) un proteína de unión a antígeno triespecífica de la invención y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención proporciona una proteína de unión a antígeno triespecífica de la invención o una composición farmacéutica de la invención, para usar en un método para el tratamiento o mejora de una enfermedad proliferativa.
A continuación, se analizan realizaciones adicionales de la divulgación, junto con otros aspectos de la divulgación.
En el presente documento se proporcionan una proteína de unión a antígeno, composiciones farmacéuticas de la misma, como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras para hacer tales proteínas de unión a antígeno triespecíficas y usos médicos para el tratamiento de enfermedades, trastornos o afecciones. En un aspecto, en el presente documento se describen proteínas de unión a antígeno en donde dichas proteínas comprenden (a) un primer dominio (A) que se une específicamente al CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que es un domino de ampliación de semivida; y (c) un tercer dominio (C) que se une específicamente a un antígeno diana, en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(A)-(B)-(C)-COOH, H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C) -COOH, H2N-(B)-(C)-(A)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH o H2N-(C)-(A)-(B)-COOH mediante los enlazadores L1 y L2.
En el presente documento también se proporcionan proteínas de unión a antígeno triespecíficas, en donde dichas proteínas comprenden (a) un primer dominio (A) que se une específicamente al CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que es un domino de ampliación de semivida; y (c) un tercer dominio (C) que se une específicamente a un antígeno diana, en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(a )-(C)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A) -COOH o mediante los enlazadores L1 y L2.
En el presente documento también se proporcionan proteínas de unión a antígeno triespecíficas, en donde dichas proteínas comprenden (a) un primer dominio (A) que se une específicamente al CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que es un domino de ampliación de semivida; y (c) un tercer dominio (C) que se une específicamente a un antígeno diana, en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(A)-(B)-(C)-COOH, H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C) -COOH, H2N-(B)-(C)-(A)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH o H2N-(C)-(A)-(B)-COOH mediante los enlazadores L1 y L2 y en donde el primer dominio se une al CD3 humano con una KD de más de 100 nM.
En el presente documento también se proporcionan proteínas de unión a antígeno triespecíficas, en donde dichas proteínas comprenden (a) un primer dominio (A) que se une específicamente al CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que es un domino de ampliación de semivida; y (c) un tercer dominio (C) que se une específicamente a un antígeno diana, en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(A)-(B)-(C)-COOH, H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C) -COOH, H2N-(B)-(C)-(A)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH o H2N-(C)-(A)-(B)-COOH mediante los enlazadores L1 y L2 y en donde la proteína tiene un peso molecular de menos de 55 kDa.
En el presente documento también se proporcionan proteínas de unión a antígeno triespecíficas, en donde dichas proteínas comprenden (a) un primer dominio (A) que se une específicamente al CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que es un domino de ampliación de semivida; y (c) un tercer dominio (C) que se une específicamente a un antígeno diana, en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(A)-(B)-(C)-COOH, H2N-(A)-(C)-(B)-COOH, H2N-(B)-(A)-(C) -COOH, H2N-(B)-(C)-(A)-COOH, H2N-(C)-(B)-(A)-COOH o H2N-(C)-(A)-(B)-COOH mediante los enlazadores L1 y L2 y en donde B comprende un anticuerpo de dominio único que se une a albúmina sérica.
En el presente documento también se proporcionan diversas realizaciones de proteínas de unión a antígeno triespecíficas, contempladas para cualquier aspecto en el presente documento, en solitario o en combinación. En algunas realizaciones, un primer dominio comprende una cadena ligera variable y una cadena pesada variable, cada una de las cuales es capaz de unirse específicamente al CD3 humano. En algunas realizaciones, la cadena ligera variable es una cadena ligera A (lambda). En algunas realizaciones, la cadena ligera variable es una cadena ligera k (kappa). En algunas realizaciones, el primer dominio comprende un fragmento variable monocatenario (scFv) específico del CD3 humano. En algunas realizaciones, el primer dominio es específico para CD3e (épsilon). En algunas realizaciones, el primer dominio es específico para CD38 (delta). En algunas realizaciones, el primer dominio es específico para CD3y (gamma). En algunas realizaciones, el primer dominio comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab (NUVION®), SP34, X35, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4,2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 y WT-31. En algunas realizaciones, el primer dominio es humanizado o humano. En algunas realizaciones, el primer dominio tiene una unión de KD de 1000 nM o menos al CD3 en las células que expresan CD3. En algunas realizaciones, el primer dominio tiene una unión de KD de 100 nM o menos al CD3 en las células que expresan CD3. En algunas realizaciones, el primer dominio tiene una unión de KD de 10 nM o menos al CD3 en las células que expresan CD3. En algunas realizaciones, el primer dominio tiene reactividad cruzada con el CD3 de cinomolgo. En algunas realizaciones, el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento.
En algunas realizaciones, el segundo dominio se une a albúmina sérica humana. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un scFv, un dominio pesado variable (VH; del inglés, variable heavy), un dominio ligero variable (VL; del inglés, variable light), un anticuerpo de dominio único, un péptido, un ligando o una molécula pequeña. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un scFv. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un dominio VH. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un dominio VL. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un anticuerpo de dominio único. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un péptido. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende un ligando. En algunas realizaciones, el segundo dominio comprende una entidad de molécula pequeña.
En algunas realizaciones, el tercer dominio comprende un scFv, un dominio VH, un dominio VL, un dominio no de Ig, un ligando, una knotina o una entidad de molécula pequeña que se une específicamente a un antígeno diana. En algunas realizaciones, el tercer dominio es específico de una molécula de superficie celular. En algunas realizaciones, el tercer dominio es específico de un antígeno tumoral.
En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son enlazadores peptídicos. En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 consisten independientemente en aproximadamente 20 o menos restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 se seleccionan cada uno independientemente de (GS)n (SEQ ID NO: 49), (GGS)n (SEQ ID NO: 50), (GGGS)n (SEQ ID NO: 51), (GGSG)n (SEQ ID NO: 52), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 53) o (GGGGS)n (SEQ ID NO: 54), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son cada uno independientemente (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 55) o (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 56). En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son enlazadores químicos.
En algunas realizaciones, el primer dominio está en el extremo N de la proteína. En algunas realizaciones, el segundo dominio está en el extremo N de la proteína. En algunas realizaciones, el tercer dominio está en el extremo N de la proteína. En algunas realizaciones, el primer dominio está en el extremo C de la proteína. En algunas realizaciones, el segundo dominio está en el extremo C de la proteína. En algunas realizaciones, el tercer dominio está en el extremo C de la proteína.
En algunas realizaciones, la proteína es inferior de aproximadamente 80 kDa. En algunas realizaciones, la proteína es de aproximadamente 50 a aproximadamente 75 kDa. En algunas realizaciones, la proteína es inferior de aproximadamente 50 kDa. En algunas realizaciones, la proteína es inferior de aproximadamente 40 kDa. En algunas realizaciones, la proteína es de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa. En algunas realizaciones, la proteína tiene una semivida de eliminación de al menos aproximadamente 50 horas. En algunas realizaciones, la proteína tiene una semivida de eliminación de al menos aproximadamente 100 horas. En algunas realizaciones, la proteína tiene una penetración tisular aumentada en comparación con una IgG para el mismo antígeno diana.
En el presente documento también se proporcionan, en otro aspecto polinucleótidos que codifican proteínas de unión a antígeno triespecíficas de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores. En otro aspecto se proporcionan en el presente documento vectores que comprenden los polinucleótidos descritos. En otro aspecto, se proporcionan en el presente documento células hospedadoras transformadas con los vectores descritos.
En otro aspecto más, se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno triespecífica de cualquiera de las realizaciones anteriores, un polinucleótido que codifica una proteína de unión a antígeno triespecífica de cualquiera de las realizaciones anteriores, un vector que comprende los polinucleótidos descritos o una célula hospedadora transformada con un vector de cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento también se proporcionan, procedimientos para la producción de proteínas de unión a antígeno triespecíficas de acuerdo con cualquiera de los aspectos y realizaciones del presente documento, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un hospedador transformado o transfectado con un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica cualquier proteína de unión a antígeno triespecífica en el presente documento en condiciones que permiten la expresión de la proteína y recuperar y purificar la proteína producida a partir del cultivo.
El presente documento también se proporcionan usos médicos para el tratamiento de la mejora de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa, enfermedad vírica, reacciones alérgicas, reacciones parasitarias, enfermedades de injerto contra hospedador o enfermedades de hospedador contra injerto, que comprenden la administración de una proteína de unión a antígeno triespecífica de cualquiera de las realizaciones anteriores a un sujeto que necesita tal tratamiento o mejora. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el uso médico comprende la administración además de un agente junto con la proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
Las nuevas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se usan los principios de la invención y a los dibujos adjuntos de los cuales:
La Figura 1 es una representación esquemática de una proteína de unión a antígeno ilustrativa donde la proteína tiene un elemento de núcleo constante que comprende un fragmento variable monocatenario anti-CD3£ y una región de cadena pesada variable anti-HSA; y un dominio de unión a la diana variable que puede ser un VH, scFv, un ligando no de Ig o un ligando.
La Figura 2 es una representación esquemática de proteínas de unión a antígeno triespecíficas adicionales construidas para la penetración tisular óptima. Figura 2 izquierda, una proteína de unión a antígeno triespecífica ilustrativa que comprende fragmentos de anticuerpo de dominio único para todos sus dominios. Figura 2 centro, una proteína de unión a antígeno triespecífica ilustrativa que comprende una knotina que se une a un antígeno diana. Figura 2 derecha, una proteína de unión a antígeno triespecífica ilustrativa que comprende un ligando natural que se une a un antígeno diana.
La Figura 3 es una representación esquemática de la unión de un aglutinante de entidad de molécula pequeña a una proteína de unión a antígeno triespecífica. La proteína de unión a antígeno triespecífica comprende una secuencia de reconocimiento de sortasa como su dominio de unión a antígeno diana. Tras la incubación de la proteína con una sortasa y un aglutinante de molécula pequeña unido a glicina, la sortasa liga o conjuga el aglutinante de molécula pequeña en el sitio de reconocimiento. La figura desvela "LPETGG" como la SEQ ID NO: 60 y "LPETG" como la SEQ ID NO: 57.
La Figura 4 es una representación esquemática de las seis maneras diferentes en las que los tres dominios de estas moléculas de unión a antígeno triespecíficas pueden organizarse.
La Figura 5 compara la capacidad de las moléculas de BiTE (BiTE de direccionamiento a EGFR, Lutterbuese et al. 2007. PNAS 107: 12605-12610 y BiTE de direccionamiento a PSMA pasotuxizumab) con la capacidad del dominio de VH que contiene moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR y PSMA para inducir linfocitos T humanos primarios a destruir células tumorales.
La Figura 6 muestra que las seis configuraciones posibles de una molécula triespecífica que contiene un dominio VH de direccionamiento a EGFR pueden inducir linfocitos T a destruir la línea celular tumoral humana NCI-1563. El experimento se realizó en ausencia (izquierda) y en presencia (derecha) de albúmina sérica humana con un BiTE de direccionamiento a EGFR como control positivo.
La Figura 7 calcula la capacidad de las seis configuraciones posibles de una molécula triespecífica que contiene un dominio VH de direccionamiento a PSMA para inducir linfocitos T a destruir la línea celular tumoral humana 22Rv1. El experimento se realizó en ausencia (izquierda) y en presencia (derecha) de albúmina sérica humana con un BiTE de direccionamiento a PSMA como control positivo. También se muestra la actividad de una molécula triespecífica de direccionamiento a PSMA con un scFv de direccionamiento a PSMA.
La Figura 8 muestra que las moléculas triespecíficas pueden consistir en un elemento de núcleo constante que comprende un fragmento variable monocatenario (scFv) anti-CD3£ y una región de cadena pesada variable anti-HSA; y un dominio de unión a la diana variable que puede ser un scFv.
La Figura 9 demuestra que las moléculas triespecíficas que utilizan un finómero en lugar de un dominio derivado de anticuerpo para el direccionamiento tumoral pueden inducir linfocitos T a destruir células tumorales.
La Figura 10 muestra que cuando las moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR redirigen linfocitos T para destruir células tumorales CaPan2 humanas (panel A), los linfocitos T se activan y producen las citocinas TNF-a (panel B) y IFNy (panel C) de una forma dependiente de la dosis de las moléculas triespecíficas.
La Figura 11 muestra que cuando las moléculas triespecíficas de direccionamiento a PSMA redirigen linfocitos T para destruir células tumorales 22Rv1 humanas (panel A), los linfocitos T se activan y producen las citocinas TNF-a (panel B) y IFNy (panel C) de una forma dependiente de la dosis de las moléculas triespecíficas.
La Figura 12 muestra que las moléculas triespecíficas de direccionamiento a MSLN pueden migrar a través de Matrigel más rápido que los anticuerpos convencionales.
La Figura 13 muestra la titulación de fagos en biotina-CD3£ y biotina-HSA.
Descripción detallada
En el presente documento se describen proteínas de unión a antígeno triespecíficas, composiciones farmacéuticas de la misma, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras para hacer tales proteínas de unión a antígeno triespecíficas. Se proporcionan también usos médicos de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos. Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas son capaces de unirse específicamente a un antígeno diana, así como a CD3 y a un domino de ampliación de semivida, tal como un dominio de unión a albúmina sérica dominio humana (HSA). La Figura 1 representa un ejemplo no limitativo de una proteína de unión a antígeno triespecífica.
En un aspecto, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas comprenden un dominio (A) que se une específicamente a CD3, un dominio (B) que se une específicamente a albúmina sérica humana (HSA) y un dominio (C) que se une específicamente a un antígeno diana. Los tres dominios en proteínas de unión a antígeno triespecíficas se disponen en cualquier orden. Por tanto, se contempla que el orden de dominios de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas es:
H2N-(A)-(B)-(C)-COOH,
H2N-(A)-(C)-(B)-COOH,
H2N-(B)-(A)-(C)-COOH,
H2N-(B)-(C)-(A)-COOH,
H2N-(C)-(B)-(A)-COOH o
H2N-(C)-(A)-(B)-COOH.
En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas tienen un orden de dominios de H2N-(A) (B)-(C)-COOH. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas tienen un orden de dominios de H2N-(A)-(C)-(B)-COOH. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas tienen un orden de dominios de H2N-(B)-(A)-(C)-COOH. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas tienen un orden de dominios de H2N-(B)-(C)-(A)-COOH. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas tienen un orden de dominios de H2N-(C)-(B)-(A)-COOH. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas tienen un orden de dominios de H2N-(C)-(A)-(B)-COOH.
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento opcionalmente comprenden un polipéptido que tiene una secuencia descrita en la Tabla 6 o la Tabla 7 (SEQ ID NO: 1-48) y en las posteriores. En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno triespecífica comprende un polipéptido que tiene al menos un 70 %-95 % o más de homología con una secuencia descrita en la Tabla 6 o la Tabla 7 (SEQ ID NO: 1-48). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno triespecífica comprende un polipéptido que tiene al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más de homología con una secuencia descrita en la Tabla 6 o la Tabla 7 (SEQ ID NO: 1-48). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno triespecífica tiene una secuencia que comprende al menos una porción de una secuencia descrita en la Tabla 6 o la Tabla 7 (SEQ ID NO: 1-48). En algunas realizaciones, la proteína de unión a antígeno triespecífica comprende un polipéptido que comprende una o más de las secuencias descritas en la Tabla 6 o la Tabla 7 (SEQ ID NO: 1-48).
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento se diseñan para permitir el direccionamiento específico de células que expresan un antígeno diana mediante el reclutamiento de linfocitos T citotóxicos. Esto mejora la eficacia en comparación con ADCC (del inglés, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos), que utiliza anticuerpos de longitud completa dirigidos a un solo anticuerpo y no es capaz de reclutar directamente linfocitos T citotóxicos. En cambio, mediante el acoplamiento de moléculas de CD3 expresadas específicamente en estas células, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas pueden entrecruzar linfocitos T citotóxicos con células que expresan un antígeno diana de una forma altamente específica, dirigiendo de este modo el potencial citotóxico del linfocito T hacia la célula diana. Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento acoplan linfocitos T citotóxicos a través de la unión a proteínas CD3 expresadas en superficie, que forman parte del TCR. La unión simultánea de varias proteínas de unión a antígeno triespecíficas a CD3 y a un antígeno diana expresado en la superficie de células particulares, provoca la activación de linfocitos T y media en la lisis posterior de la célula que expresa el antígeno diana particular. Por tanto, se contempla que las proteínas de unión a antígeno triespecíficas muestren una destrucción de células diana eficaz. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento estimulan la destrucción de células diana mediante linfocitos T citotóxicos para eliminar células patógenas (por ejemplo, células tumorales, células infectadas por virus o bacterias, linfocitos T autorreactivos, etc.). En algunas de tales realizaciones, las células se eliminan selectivamente, reduciendo así el potencial de efectos secundarios tóxicos. En otras realizaciones, los mismos polipéptidos podrían usarse para mejorar la eliminación de células endógenas para un efecto terapéutico, tal como linfocitos B o T en una enfermedad autoinmunitaria o células madre hematopoyéticas (CMH; del inglés, hematopoietic stem cells) para el trasplante de células madre.
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento confieren ventajas terapéuticas adicionales sobre los anticuerpos monoclonales y otras moléculas biespecíficas más pequeñas. Generalmente, la eficacia de agentes farmacéuticos de proteínas recombinantes depende grandemente de la farmacocinética intrínseca de la proteína en sí. Uno de tales beneficios en el presente documento es que las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento tienen un semitiempo de eliminación farmacocinético ampliado, debido a que tienen un dominio de ampliación de semivida, tal como un dominio específico para HSA. En este sentido, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento tienen un semitiempo de eliminación sérico ampliado de aproximadamente dos, tres, aproximadamente cinco, aproximadamente siete, aproximadamente 10, aproximadamente 12 o aproximadamente 14 días en algunas realizaciones. Esto contrasta con otras proteínas de unión, tales como moléculas de BiTE o DART, que tienen semitiempos de eliminación relativamente mucho más cortos. Por ejemplo, la molécula de fusión scFvscFv biespecífica BiTE CD19*CD3 requiere el suministro de infusión intravenosa (i.v.) continuo debido a su semitiempo de eliminación corto. Las semividas intrínsecas más largas de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas solucionan este problema, de modo que permiten un potencial terapéutico aumentado, tal como formulaciones farmacéuticas de dosificación baja, administración periódica disminuida y/o composiciones farmacéuticas novedosas.
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento también tienen un tamaño óptimo para la penetración tisular y la distribución tisular mejoradas. Tamaños mayores limitan o evitan la penetración o distribución de la proteína en tejidos diana. Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento evitan esto al tener un tamaño pequeño que permite una penetración tisular y una distribución mejoradas. Por consiguiente, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento, en algunas realizaciones tienen un tamaño de aproximadamente 50 kD a aproximadamente 80 kD, aproximadamente 50 kD a aproximadamente 75 kD, aproximadamente 50 kD aproximadamente 70 kD o aproximadamente 50 kD a aproximadamente 65 kD. Por tanto, el tamaño de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas es ventajoso sobre otros anticuerpos IgG que son aproximadamente 150 kD y las moléculas de BiTE y de DART, que son aproximadamente 55 kD pero que no son de semivida ampliada y por tanto, se eliminan rápidamente a través del riñón.
En realizaciones adicionales, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento tienen un tamaño óptimo para la penetración y la distribución tisular mejoradas. En estas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas se construyen para ser tan pequeñas como sea posible, al tiempo que retienen la especificidad hacia sus dianas. Por consiguiente, en estas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento tienen un tamaño de aproximadamente 20 kD a aproximadamente 40 kD o aproximadamente 25 kD a aproximadamente 35 kD a aproximadamente 40 kD, a aproximadamente 45 kD, a aproximadamente 50 kD, a aproximadamente 55 kD, a aproximadamente 60 kD, a aproximadamente 65 kD. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento tienen un tamaño de aproximadamente 50 kD, 49 kD, 48 kD, 47 kD, 46 kD, 45 kD, 44 kD, 43 kD, 42 kD, 41 kD, 40 kD, aproximadamente 39 kD, aproximadamente 38 kD, aproximadamente 37 kD, aproximadamente 36 kD, aproximadamente 35 kD, aproximadamente 34 kD, aproximadamente 33 kD, aproximadamente 32 kD, aproximadamente 31 kD, aproximadamente 30 kD, aproximadamente 29 kD, aproximadamente 28 kD, aproximadamente 27 kD, aproximadamente 26 kD, aproximadamente 25 kD, aproximadamente 24 kD, aproximadamente 23 kD, aproximadamente 22 kD, aproximadamente 21 kD o aproximadamente 20 kD. Un enfoque ilustrativo del tamaño pequeño es a través del uso de fragmentos de anticuerpos dominio único (sdAb) para cada uno de los dominios. Por ejemplo, una proteína de unión a antígeno triespecífica particular tiene un sdAb anti-CD3, un sdAb anti-HSA y un sdAb para un antígeno diana. Esto reduce el tamaño de la proteína de unión a antígeno triespecífica ilustrativa a menos de 40 kD. Por tanto, en algunas realizaciones, los dominios de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas son todos fragmentos de anticuerpos de dominio único (sdAb). En otras realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden aglutinantes de entidades de molécula pequeña (SME; del inglés, small molecule entity) para HSA y/o el antígeno diana. Los aglutinantes de SME son moléculas pequeñas de promedio aproximadamente 500 a 2000 Da en tamaño y se unen a proteínas de unión a antígeno triespecíficas por métodos conocidos, tal como el ligamiento o conjugación de sortasa. En estos casos, uno de los dominios de una proteína de unión a antígeno triespecífica es una secuencia de reconocimiento de sortasa, por ejemplo, LPETG (SEQ ID NO: 57). Para unir un aglutinante de SME a una proteína de unión a antígeno triespecífica con una secuencia de reconocimiento de sortasa, se incuba la proteína con una sortasa y un aglutinante de SME, de modo que la sortasa une el aglutinante de SME a la secuencia de reconocimiento. Los aglutinantes de SME conocidos incluyen MIP-1072 y MIP-1095 que se unen al antígeno de membrana específico de próstata (PSMA; del inglés, prostate-specific membrane antigen). En otras realizaciones más, el dominio que se une a un antígeno diana de unas proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprende un péptido knotina para unirse a un antígeno diana. Las knotinas son péptidos estabilizados por disulfuros con un armazón de nudo de cisteína y tienen tamaños promedio de aproximadamente 3,5 kD. Se han contemplado las knotinas para la unión a ciertas moléculas tumorales, tales como fibronectina y receptor de VEGF. En realizaciones adicionales, el dominio que se une a un antígeno diana de unas proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprende un ligando de receptor natural, tal como un factor de activación de linfocitos (BAFF/BLyS).
Otra característica de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento es que son de un diseño de polipéptido individual con enlace flexible de sus dominios. Esto permite la fácil producción y la fabricación de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas, dado que pueden codificarse mediante una molécula de ADNc individual para que se incorporen fácilmente en un vector. Además, debido a que las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento son de cadena polipeptídica individual monomérica, no hay problemas de emparejamiento de cadena o un requisito para la dimerización. Se contempla que las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento tengan una tendencia reducida para agregarse, a diferencia de otras moléculas notificadas tales como proteínas biespecíficas con dominios de inmunoglobulinas Fcgamma.
En las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento, los dominios se unen mediante los enlazadores internos L1 y L2, donde L1 enlaza el primer y el segundo dominio de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas y L2 enlaza el segundo y el tercer dominio de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas. Los enlazadores L1 y L2 tienen una longitud y/o una composición de aminoácidos optimizada(s). En algunas realizaciones, los enlazadores L1 y L2 son de la misma longitud y composición de aminoácidos. En otras realizaciones, L1 y L2 son diferentes. En determinadas realizaciones, los enlazadores internos L1 y/o L2 son "cortos", es decir, consisten en 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 restos de aminoácidos. Por tanto, en determinados casos, los enlazadores internos consisten en aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos. En el caso de 0 restos de aminoácidos, el enlazador interno es un enlace peptídico. En determinadas realizaciones, los enlazadores internos L1 y/o L2 son "largos", es decir, consisten en 15, 20 o 25 restos de aminoácidos. En algunas realizaciones, estos enlazadores internos consisten en aproximadamente de 3 a aproximadamente 15, por ejemplo 8, 9 o 10 restos de aminoácidos contiguos. Respecto a la composición de aminoácidos de los enlazadores internos L1 y L2, los péptidos se seleccionan con propiedades que confieren flexibilidad a las proteínas de unión a antígeno triespecíficas, que no interfieren con los dominios de unión, así como que resisten la escisión de proteasas. Por ejemplo, los restos de glicina y serina generalmente proporcionan resistencia a proteasas. Los ejemplos de enlazadores internos adecuados para unir los dominios en las proteínas de unión a antígeno triespecíficas incluyen, pero sin limitación, (GS)n (SEQ ID NO: 49), (GGS)n (SEQ ID NO: 50), (GGGS)n (SEQ ID NO: 51), (GGSG)n (SEQ ID NO: 52), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 53) o (GGGGS)n (SEQ ID NO: 54), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, el enlazador L1 y/o L2 es (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 55) o (GGGGS)a (SEQ ID NO: 56).
Dominio de unión a CD3
La especificidad de la respuesta de los linfocitos T está mediada por el reconocimiento de antígeno (presentado en el contexto de un complejo principal de histocompatibilidad, MHC (del inglés, major histocompatibility complex) por el TCR. Como parte del TCR, CD3 es un complejo proteico que incluye una cadena de CD3y (gamma), una cadena de CD38 (delta) y dos cadenas de CD3£ (épsilon) que están presentes en la superficie celular. CD3 se asocia con las cadenas a (alfa) y p (beta) del TCR, así como CD3 Z (zeta) en conjunto para comprender el TCR completo. El agrupamiento de CD3 en linfocitos T, tal como mediante anticuerpos anti-CD3 inmovilizados, conduce a la activación de linfocitos T similar al acoplamiento del receptor de linfocitos T pero independiente de su especificidad típica de clon.
En un aspecto, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3. En un aspecto, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3 humano. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3y. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD38. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a CD3£.
En realizaciones adicionales, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente al TCR. En determinados casos, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a la cadena a del TCR. En determinados casos, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio que se une específicamente a la cadena p del TCR.
En determinadas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento presenta no solo afinidades de unión a CD3 potentes con CD3 humano, sino que también muestran una reactividad cruzada excelente con las proteínas CD3 de mono cinomolgo respectivas. En algunos casos, el dominio de unión a CD3 de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas es de reactividad cruzada con CD3 de mono cinomolgo. En determinados casos, las proporciones de Kd humano:cinomolgo para CD3 están entre 5 y 0,2.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de la proteína de unión a antígeno triespecífica puede ser cualquier dominio que se una a CD3, incluyendo, pero sin limitación, dominios de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado. En algunos casos, es beneficioso para el dominio de unión a CD3 que se derive de la misma especie en la que la proteína de unión a antígeno triespecífica se utilizará finalmente. Por ejemplo, para usar en seres humanos, sería beneficioso para el dominio de unión a CD3 de la proteína de unión a antígeno triespecífica que comprendiera restos humanizados o humanos del dominio de unión a antígeno de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Por tanto, en un aspecto, el dominio de unión a antígeno comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humanizado o humano o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo murino. En una realización, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una o más (por ejemplo, las tres) región(ones) determinante(s) de complementariedad de cadena ligera 1 (LC CDR1), región(ones) determinante(s) de complementariedad de cadena ligera 2 (LC CDR2) y región(ones) determinante(s) de complementariedad de cadena ligera 3 (LC CDR3) de un dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano descrito en el presente documento y/o uno o más (por ejemplo, las tres) región(ones) determinante(s) de complementariedad de cadena pesada 1 (HC CDR1), región(ones) determinante(s) de complementariedad de cadena pesada 2 (HC CDR2) y región(ones) determinante(s) de complementariedad de cadena pesada 3 (HC CDR3) de un dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano descrito en el presente documento, por ejemplo, un dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una o más, por ejemplo, las tres, LC c Dr y una o más, por ejemplo, las tres, HC CDR.
En algunas realizaciones, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una región variable de cadena ligera humanizada o humana específica para CD3, donde la región variable de cadena ligera específica para CD3 comprende CDR de cadena ligera humana o no humana en una región marco conservada de cadena ligera humana. En determinados casos, la región marco conservada de cadena ligera es una región marco conservada de cadenas ligera A (lambda). En otros casos, la región marco conservada de cadena ligera es una región marco conservada de cadena ligera k (kappa).
En algunas realizaciones, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano comprende una región variable de cadena pesada humanizada o humana específica para CD3, donde la región variable de cadena pesada específica para CD3 comprende CDR de cadena pesada humana o no humana en una región marco conservada de cadena pesada humana.
En determinados casos, las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada y/o ligera se derivan de anticuerpos anti-CD3 conocidos, tales como, por ejemplo, muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab (NUVION®), SP34, TR-66 o X35-3, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4,2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIM-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 y WT-31.
En una realización, el dominio de unión anti-CD3 es un fragmento variable monocatenario (scFv) que comprende una cadena ligera y una cadena pesada de una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, "fragmento variable monocatenario" o "scFv" se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en donde las regiones variables de cadena ligera y pesada están unidas de forma contigua a través de un enlazador polipeptídico flexible corto y son capaces de expresarse como una cadena polipeptídica individual y en donde el scFv retiene la especificidad del anticuerpo del cual se deriva intacta. En una realización, el dominio de unión anti-CD3 comprende: una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera proporcionada en el presente documento o una secuencia con un 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento; y/o una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una, dos o tres modificaciones (por ejemplo, sustituciones), pero no más de 30, 20 o 10 modificaciones (por ejemplo, sustituciones) de una secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada proporcionada en el presente documento o una secuencia con un 95-99 % de identidad con una secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. En una realización, el dominio de unión anti-CD3 humanizado o humano es un scFv y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, se une a una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento, a través de un enlazador de scFv. La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de un scFv puede estar, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes orientaciones: región variable de cadena ligeraenlazador de scFv-región variable de cadena pesada o región variable de cadena pesada-enlazador de scFv-región variable de cadena ligera.
En algunos casos, los scFv que se unen a CD3 se preparan de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, las moléculas scFv pueden producirse uniendo las regiones VH y VL juntas utilizando enlazadores polipeptídicos flexibles. Las moléculas scFv comprenden un enlazador de scFv (por ejemplo, un enlazador de Ser-Gly) con una longitud y/o composición de aminoácidos optimizada. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la longitud del enlazador de scFv es de modo que el dominio VH o VL puede asociarse de forma intermolecular con el otro dominio variable para formar el sitio de unión de CD3. En determinadas realizaciones, tales enlazadores de scFv son "cortos", es decir, consisten en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 restos de aminoácidos. Portanto, en determinados casos, los enlazadores de scFv consisten en aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos. En el caso de 0 restos de aminoácidos, el enlazador de scFv es un enlace peptídico. En algunas realizaciones, estos enlazadores de scFv consisten en aproximadamente 3 a aproximadamente 15, por ejemplo 8, 9 o 10 restos de aminoácidos contiguos. Respecto a la composición de aminoácidos de los enlazadores de scFv, los péptidos se seleccionan de modo que confieren flexibilidad, no interfieren con los dominios variables así como que permiten el plegamiento intracatenario para reunir los dos dominios variables para formar un sitio de unión a CD3 funcional. Por ejemplo, los enlazadores de scFv que comprenden restos de glicina y serina generalmente proporcionan resistencia a proteasas. En algunas realizaciones, los enlazadores en un scFv comprenden restos de glicina y serina. La secuencia de aminoácidos de los enlazadores de scFv puede optimizarse, por ejemplo, mediante métodos de presentación en fagos para mejorar la unión de CD3 y el rendimiento de producción del scFv. Entre los ejemplos de enlazadores de scFv de péptidos adecuados para unirse a un dominio variable de cadena ligera y a un dominio variable de cadena pesada en un scFv se incluyen, pero sin limitación, (GS)n (SEQ ID NO: 49), (GGS)n (SEQ ID NO: 50), (GGGS)n (SEQ ID NO: 51), (GGSG)n (SEQ ID NO: 52), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 53) o (GGGGS)n (SEQ ID NO: 54), en donde n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización, el enlazador de scFv puede ser (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 55) o (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 56). La variación en la longitud del enlazador puede retener o mejorar la actividad, dando lugar a una eficacia superior en estudios de actividad.
En algunas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de una proteína de unión a antígeno triespecífica tiene una afinidad para CD3 en células que expresan CD3 con una Kd de 1000 nM o menos, 500 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 80 nM o menos, 50 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos o 0,5 nM o menos. En algunas realizaciones, el dominio de unión a CD3 de una proteína de unión a antígeno triespecífica tiene una afinidad para CD3e, y o 8 con una Kd de 1000 nM o menos, 500 nM o menos, 200 nM o menos, 100 nM o menos, 80 nM o menos, 50 nM o menos, 20 nM o menos, 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos o 0,5 nM o menos. En realizaciones adicionales, el dominio de unión a CD3 de una proteína de unión a antígeno triespecífica tiene una afinidad baja para CD3, es decir, aproximadamente 100 nM o mayor.
La afinidad de unión a CD3 puede determinarse, por ejemplo, por la capacidad de la proteína de unión a antígeno triespecífica en sí o de su dominio de unión a CD3 para unirse a CD3 revestido en una placa de ensayo; presentado en la superficie de una célula microbiana; en solución; etc. La actividad de unión de la proteína de unión a antígeno triespecífica en sí o de su dominio de unión a CD3 de la presente divulgación a CD3 puede ensayarse mediante la inmovilización del ligando (por ejemplo, CD3) o de la proteína de unión a antígeno triespecífica en sí o de su dominio de unión a CD3, en una perla, sustrato, célula, etc. Los agentes se pueden añadir en un tampón adecuado y las parejas de unión pueden incubarse durante un período de tiempo a una temperatura dada. Después de los lavados para eliminar el material no unido, la proteína unida se puede liberar con, por ejemplo, SDS, tampones con un pH alto y similares y analizarse, por ejemplo, mediante resonancia de plasmón superficial (SPR; del inglés, surface plasmon resonance).
Dominio de ampliación de semivida
En el presente documento se contemplan dominios que extienden la semivida de un dominio de unión a antígeno. Se contempla que tales dominios incluyan, aunque no de forma limitativa, dominios de unión a HSA, dominios Fc, moléculas pequeñas y otros dominios de ampliación de semivida conocidos en la técnica.
La albúmina sérica humana (HSA) (masa molecular ~67 kDa) es la proteína más abundante en el plasma, presente en aproximadamente 50 mg/ml (600 j M) y tiene una semivida de aproximadamente 20 días en seres humanos. La HSA sirve para mantener el pH del plasma, contribuye a la presión sanguínea coloidal, funciona como transportadora de muchos metabolitos y ácidos grasos y sirve como una proteína transportadora farmacológica principal en el plasma.
La asociación no covalente con albúmina amplía el semitiempo de eliminación de las proteínas de vida corta. Por ejemplo, una fusión recombinante de un dominio de unión a albúmina a un fragmento Fab dio como resultado un aclaramiento in vivo de 25 y 58 veces y una ampliación de semivida de 26 y 37 veces cuando se administró por vía intravenosa a ratones y conejos respectivamente, en comparación con la administración del fragmento Fab solo. En otro ejemplo, cuando la insulina está acilada con ácidos grasos para promover la asociación con albúmina, se observó un efecto prolongado cuando se inyectaron subcutáneamente en conejos o cerdos. En conjunto, estos estudios demuestran un enlace entre la unión de albúmina y la acción prolongada.
En un aspecto, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento comprenden un dominio de ampliación de semivida, por ejemplo, un dominio que se une específicamente a HSA. En algunas realizaciones, el dominio de unión HSA de una proteína de unión a antígeno triespecífica puede ser cualquier dominio que se una a HSA, incluyendo, pero sin limitación, dominios de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el dominio de unión a HSA es un fragmento variable monocatenario (scFv), un anticuerpo de dominio único, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de anticuerpo de dominio único derivado de camélido, péptido, ligando o entidad de molécula pequeña específica para HSA. En determinadas realizaciones, el dominio de unión a HSA es un anticuerpo de dominio único. En otras realizaciones, el dominio de unión a HSA es un péptido. En realizaciones adicionales, el dominio de unión a HSA es una molécula pequeña. Se contempla que el dominio de unión a HSA de una proteína de unión a antígeno triespecífica es bastante pequeño y no más de 25 kD, no más de 20 kD, no más de 15 kD o no más de 10 kD en algunas realizaciones. En determinados casos, la unión de HSA es 5 kD o menos si es un péptido o entidad de molécula pequeña.
El dominio de ampliación de semivida de una proteína de unión a antígeno triespecífica proporciona una farmacodinámica y una farmacocinética alteradas de la proteína de unión a antígeno triespecífica en sí. Como anteriormente, el dominio de ampliación de semivida prolonga el semitiempo de eliminación. El dominio de ampliación de semivida altera las propiedades farmacodinámicas, incluyendo la alteración de la distribución tisular, penetración y difusión de la proteína de unión a antígeno triespecífica. En algunas realizaciones, el dominio de ampliación de semivida proporciona un direccionamiento tisular (incluyendo tumor) mejorado, distribución tisular, penetración tisular, distribución dentro del tejido y eficacia mejorada en comparación con una proteína sin un dominio de ampliación de semivida. En una realización, los métodos terapéuticos utilizan eficaz y eficientemente una cantidad reducida de la proteína de unión a antígeno triespecífica, dando como resultado efectos secundarios reducidos, tales como citotoxicidad de células no tumorales reducida.
Además, la afinidad de unión del domino de ampliación de semivida puede seleccionarse de modo que se dirija a un semitiempo de eliminación específico en una proteína de unión a antígeno triespecífica. Por tanto, en algunas realizaciones, el dominio de ampliación de semivida tiene una afinidad de unión elevada. En otras realizaciones, el dominio de ampliación de semivida tiene una afinidad de unión media. En otras realizaciones más, el dominio de ampliación de semivida tiene una afinidad de unión baja o marginal. Las afinidades de unión ilustrativas incluyen concentraciones de Kd a 10 nM o menos (elevada), entre 10 nM y 100 nM (media) y mayores de 100 nM (baja). Como anteriormente, las afinidades de unión a HSA se determinan por métodos conocidos, tales como la resonancia de plasmón superficial (SPR; del inglés, surface plasmon resonance).
Dominio de unión al antígeno diana
Además de los dominios de CD3 y de ampliación de semivida descritos, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento también comprenden un dominio que se une a un antígeno diana. Un antígeno diana está implicado y/o asociado con una enfermedad, trastorno o afección. En particular, un antígeno diana asociado con una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa, una enfermedad vírica, una reacción alérgica, una reacción parasitaria, una enfermedad de injerto contra hospedador o una enfermedad de hospedador frente a injerto. En algunas realizaciones, un antígeno diana es un antígeno tumoral expresado en una célula tumoral. Como alternativa en algunas realizaciones, un antígeno diana se asocia con un patógeno, tal como un virus o una bacteria.
En algunas realizaciones, un antígeno diana es una molécula de superficie celular tal como una proteína, lípido o polisacárido. En algunas realizaciones, un antígeno diana está en una célula tumoral, célula infectada por virus, célula infectada por bacteria, glóbulo rojo dañado, célula de placa arterial o célula de tejido fibrótico.
El diseño de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento permite al dominio de unión a un antígeno diana ser flexible en cuanto a que el dominio de unión a un antígeno diana puede ser cualquier tipo de dominio de unión, incluyendo, aunque no de forma limitativa, dominios de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones, el dominio de unión a un antígeno diana es un fragmento variable monocatenario (scFv), un anticuerpo de dominio único, tal como un dominio variable de cadena pesada (VH), un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable (VHH) de anticuerpo de dominio único derivado de camélido. En otras realizaciones, el dominio de unión a un antígeno diana es un dominio de unión no de Ig, es decir, mimético de anticuerpos, tal como anticalinas, afilinas, moléculas affibody, afímeros, afitinas, alfacuerpos, avímeros, DARPin, finómeros, péptidos de dominio Kunitz y monocuerpos. En realizaciones adicionales, el dominio de unión a un antígeno diana es un ligando o péptido que se une o se asocia con un antígeno diana. En otras realizaciones adicionales más, el dominio de unión a un antígeno diana es una knotina. En otras realizaciones adicionales más, el dominio de unión a un antígeno diana es una entidad de molécula pequeña.
Modificaciones de proteínas triespecíficas
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento abarcan derivados o análogos en los que (i) un aminoácido está sustituido con un resto de aminoácido que no es uno codificado por el código genético, (ii) el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como polietilenglicol o (iii) se fusionan aminoácidos adicionales con la proteína, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia para la purificación de la proteína.
Las modificaciones típicas incluyen, pero sin limitación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje a GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como arginilación y ubiquitinación.
Las modificaciones se hacen en cualquier sitio en las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Determinadas modificaciones peptídicas comunes que son útiles para la modificación de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas incluyen glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, gammacarboxilación de restos de ácido glutámico, hidroxilación, bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido o de ambos, por una modificación covalente y ADP-ribosilación.
Polinucleótidos que codifican proteínas de unión a antígeno triespecíficas
También se proporciona, en algunas realizaciones, moléculas de polinucleótidos que codifican una proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, las moléculas de polinucleótidos se proporcionan como una construcción de ADN. En otras realizaciones, las moléculas de polinucleótidos se proporcionan como un transcrito de ARN mensajero.
Las moléculas de polinucleótidos se construyen mediante métodos conocidos, tales como mediante la combinación de los genes que codifican los tres dominios de unión separados por enlazadores peptídicos o en otras realizaciones, directamente enlazados mediante un enlace peptídico, en una construcción genética individual unida operativamente a un promotor adecuado y opcionalmente a un terminador de transcripción adecuado y expresarla en una bacteria u otro sistema de expresión adecuado, tal como, por ejemplo, células CHO. En las realizaciones donde el dominio de unión al antígeno diana es una molécula pequeña, los polinucleótidos contienen genes que codifican el dominio de unión a CD3 y el dominio de ampliación de semivida. En las realizaciones donde el dominio de ampliación de semivida es una molécula pequeña, los polinucleótidos contienen genes que codifican los dominios que se unen a CD3 y al antígeno diana. Dependiendo del sistema de vector y el hospedador utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y de traducción adecuados, incluidos los promotores constitutivos e inducibles. El promotor se selecciona de modo que dirige la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora respectiva.
En algunas realizaciones, el polinucleótido se inserta en un vector, preferentemente un vector de expresión, que representa una realización adicional. Este vector recombinante puede construirse de acuerdo con métodos conocidos. Entre los vectores de interés particular se incluyen plásmidos, fagémidos, derivados de fagos, virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, lentivirus y similares) y cósmidos.
Puede utilizarse varios sistemas de expresión vector/hospedador para contener y expresar el polinucleótido que codifica el polipéptido de la proteína de unión a antígeno triespecífica descrita. Son ejemplos de vectores de expresión en E. coli pSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27) o pcDNA5 (Invitrogen) para la expresión en células de mamífero.
Por tanto, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas como se describe en el presente documento, en algunas realizaciones, se producen introduciendo un vector que codifica la proteína como se ha descrito anteriormente en una célula hospedadora y cultivando dicha célula hospedadora en condiciones de modo que se expresen los dominios de proteína, puedan aislarse y opcionalmente, además purificarse.
Composiciones farmacéuticas
También se proporciona, en algunas realizaciones, composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento, un vector que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas o una célula hospedadora transformada por este vector y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye, aunque no de forma limitativa, cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos y que no sea tóxico para el paciente a la que se administra. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Tales vehículos pueden formularse mediante métodos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. Preferentemente, las composiciones son estériles. Las composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede asegurarse por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos.
En algunas realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento se encapsula en nanopartículas. En algunas realizaciones, las nanopartículas son fulerenos, cristales líquidos, liposoma, puntos cuánticos, nanopartículas supermagnéticas, dendrímeros o nanorods. En otras realizaciones de las composiciones farmacéuticas, la proteína de unión a antígeno triespecífica se une a liposomas. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno triespecífica se conjuga con la superficie de liposomas. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno triespecífica se encapsula dentro de la cubierta de un liposoma. En algunos casos, el liposoma es un liposoma catiónico.
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas descritas en el presente documento se contemplan para usar como un medicamento. La administración se efectúa por diferentes vías, por ejemplo, administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En algunas realizaciones, la vía de administración depende del tipo de terapia y del tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. El régimen de dosificación se determinará por el médico responsable y otros factores clínicos. Las dosificaciones para un paciente cualquiera dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el sexo, la composición a administrar en particular, el tiempo y la vía de administración, el tipo de terapia, salud general y otros fármacos que se hayan administrado al mismo tiempo. Una dosis eficaz se refiere a las cantidades del principio activo que son suficientes para afectar al recorrido y la gravedad de la enfermedad, conduciendo a la reducción o la remisión de tal patología y puede determinarse usando métodos conocidos.
Usos médicos
En el presente documento también se proporcionan, en algunas realizaciones, usos médicos para estimular el sistema inmunitario de un individuo que lo necesita que comprende la administración de una proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento. En algunos casos, la administración de una proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento incluye y/o sostiene la citotoxicidad hacia una célula que expresa un antígeno diana. En algunos casos, la célula que expresa un antígeno diana es un cáncer o célula tumoral, una célula infectada por virus, una célula infectada por bacterias, un linfocito T o B autorreactivo, glóbulos rojos dañados, placas arteriales o tejido fibrótico.
También se proporcionan en el presente documento usos médicos para el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección asociados con un antígeno diana que comprenden la administración a un individuo que lo necesita una proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento. Las enfermedades, trastornos o afecciones asociados con un antígeno diana incluyen, pero sin limitación, infección vírica, infección bacteriana, enfermedad autoinmunitaria, rechazo de trasplante, aterosclerosis o fibrosis. En otras realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección asociados con un antígeno diana es una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumoral, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad infecciosa, una enfermedad vírica, una reacción alérgica, una reacción parasitaria, una enfermedad de injerto contra hospedador o una enfermedad de hospedador frente a injerto. En una realización, la enfermedad, trastorno o afección asociados con un antígeno diana es cáncer. En un caso, el cáncer es un cáncer hematológico. En otro caso, el cáncer un cáncer de tumor sólido.
Como se utiliza en el presente documento, en algunas realizaciones, "tratamiento" o "tratar" o "tratado" se refiere a un tratamiento terapéutico en el que el objetivo es ralentizar (disminuir) una condición fisiológica no deseada, trastorno o enfermedad o para obtener resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para los objetivos descritos en el presente documento, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, el alivio de los síntomas; la disminución de la extensión de la afección, trastorno o enfermedad; la estabilización (es decir, no empeoramiento) del estado de la afección, trastorno o enfermedad; retraso en la aparición o ralentización de la progresión de la afección, trastorno o enfermedad; mejora de la afección, trastorno o estado de enfermedad; y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable o mejoría o mejora de la afección, trastorno o enfermedad. El tratamiento incluye provocar una respuesta clínicamente significativa sin niveles excesivos de efectos secundarios. Tratamiento también incluye prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. En otras realizaciones, "tratamiento" o "tratar" o "tratado" se refiere a medidas profilácticas, en las que el objeto es retrasar la aparición o reducir la gravedad de una condición fisiológica no deseada, trastorno o enfermedad, tales como, por ejemplo, es una persona que está predispuesta a una enfermedad (por ejemplo, un individuo que porta un marcador genético de una enfermedad como el cáncer de mama).
En algunas realizaciones de los usos médicos descritos en el presente documento, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas se administran junto con un agente para el tratamiento de la enfermedad, trastorno o afección concretos. Los agentes incluyen, pero sin limitación, terapias que implican anticuerpos, moléculas pequeñas (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos), hormonas (esteroidea, péptido y similares), radioterapias (rayos y, rayos X y/o el suministro dirigido de radioisótopos, microondas, radiación UV y similares), terapias génicas (por ejemplo, antisentido, terapia retrovírica y similares) y otras inmunoterapias. En algunas realizaciones, los proteínas de unión a antígeno triespecíficas se administran junto con agentes antidiarreicos, agentes antieméticos, analgésicos, opioides y/o agentes antiinflamatorios no esteroideos. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a antígeno triespecíficas se administran antes, durante o después de la cirugía.
Algunas definiciones
Como se utiliza en el presente documento, "semitiempo de eliminación" se utiliza en su sentido ordinario, como se describe en The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, de Goodman y Gilman, 21-25 (Alfred Goodman Gilman, Louis S. Goodman y Alfred Gilman, eds., 6a ed. 1980). En resumen, la expresión quiere decir que abarca una medida cuantitativa del transcurso de tiempo de la eliminación del fármaco. La eliminación de la mayoría de fármacos es exponencial (es decir, sigue una cinética de primer orden), dado que las concentraciones de fármaco no se aproximan a las requeridas para la saturación del proceso de eliminación. La tasa de un proceso exponencial puede expresarse por su constante de velocidad, k, que expresa el cambio fraccional por unidad de tiempo o por su semitiempo, ti/2 el tiempo requerido para completar un 50 % del proceso. Las unidades de estas dos constantes son tiempo-1 y tiempo, respectivamente. Una constante de velocidad de primer orden y el semitiempo de la reacción se relacionan de forma simple (kxti/2=0,693) y por consiguiente, pueden intercambiarse. Dado que la cinética de eliminación de primer orden establece que se pierde una fracción constante de fármaco por unidad de tiempo, un gráfico del log de la concentración de fármaco frente al tiempo es lineal siempre, tras la fase de distribución inicial (es decir, después de la absorción del fármaco y la distribución se completa). El semitiempo para la eliminación del fármaco puede determinarse con exactitud a partir de tal gráfico.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de una proteína de unión a antígeno triespecífica ilustrativa para CD20 Generación de un dominio de unión a CD3 de scFv
La secuencia canónica de la cadena de CD3e humano tiene el n.° de acceso P07766 de UniProt. La secuencia canónica de la cadena de CD3y humano tiene el n.° de acceso P09693 de UniProt. La secuencia canónica de la cadena de CD36 humano tiene el n.° de acceso P043234 de UniProt. Los anticuerpos contra CD3e, CD3y o CD36 se generan a través de tecnologías conocidas tales como la maduración por afinidad. Cuando los anticuerpos anti-CD3 murinos se utilizan como un material de partida, es deseable la humanización de los anticuerpos anti-CD3 murinos para el ámbito clínico, donde los restos específicos de ratón pueden inducir una respuesta de antígeno humano antirratón (HAMA; del inglés, human-anti-mouse antigen) en sujetos que reciben un tratamiento de una proteína de unión a antígeno triespecífica descrita en el presente documento. La humanización se consigue mediante el injerto de regiones CDR de anticuerpo anti-CD3 murino en regiones marco conservadas aceptoras de línea germinal humana, incluyendo opcionalmente otras modificaciones para las CDR y/o regiones marco conservadas. Tal como se proporciona en el presente documento, la numeración de restos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos sigue a Kabat (Kabat E. A. et al, 1991; Chothia et al, 1987).
Por tanto, los anticuerpos humanos o humanizados anti-CD3 se utilizan para generar secuencias de scFv para los dominios de unión a CD3 de una proteína de unión a antígeno triespecífica. Se obtienen las secuencias de ADN que codifican dominios VL y VH humanos o humanizados y los codones para las construcciones se optimizan, opcionalmente, para la expresión en células de Homo sapiens. El orden en el que los dominios VL y VH aparecen en el scFv varía (es decir, orientación VL-VH o VH-VL) y tres copias de la subunidad "G4S" (SEQ ID NO: 58) o "G4S" (SEQ ID NO: 58) (G4S)3 (SEQ ID NO: 56) conectan los dominios variables para crear el dominio de scFv. Las construcciones plasmídicas de scFv anti-CD3 pueden tener de forma opcional Flag, His u otros marcadores de afinidad y se electroporan en HEK293 u otras líneas celulares humanas o de mamíferos adecuadas y se purifican. Los ensayos de validación incluyen los análisis de unión mediante FACS, análisis cinético utilizando Proteon y tinción de células que expresan CD3.
Generación de un dominio de unión a CD20 de scFv
CD20 es una de las proteínas de superficie celular presente en linfocitos B. El antígeno CD20 se encuentra en linfocitos B normales y malignos preB y maduros, incluyendo aquellos en más de un 90 % de los linfomas no Hodgkin (NHL; del inglés, non-Hodgkin's lymphomas). El antígeno está ausente en células madre hematopoyéticas, linfocitos B activados (células plasmáticas) y tejido normal. Como tales, se han descrito varios anticuerpos, principalmente de origen murino: 1F5, 2B8/C2B8, 2H7 y 1H4.
Un dominio de unión de scFv a CD20 se genera de forma similar al método anterior para la generación de un dominio de unión de scFv a CD3.
Clonación de construcciones de expresión de ADN que codifican la proteína de unión a antígeno triespecífica
Los dominios de scFv anti-CD3 se utilizan para construir una proteína de unión a antígeno triespecífica junto con un dominio de scFv anti-CD20 y un dominio de unión a HSA (por ejemplo, un péptido o un dominio VH), con los dominios organizados como en la Figura 1. Para la expresión de una proteína de unión a antígeno triespecífica en células CHO, las secuencias codificantes de todos los dominios de proteínas se clonan en un sistema de vectores de expresión en mamíferos. En resumen, las secuencias génicas que codifican el dominio de unión a CD3, el dominio de unión a HSA y el dominio de unión a CD20, junto con los enlazadores peptídicos L1 y L2, se sintetizan y subclonan por separado. A continuación, las construcciones resultantes se ligan juntas en el orden de "dominio de unión a CD20 - L1 - dominio de unión a CD3 - L2 - dominio de unión a HSA" para producir una construcción final. Todas las construcciones de expresión se diseñan para contener secuencias de codificación para un péptido señal del extremo N y un marcador de hexahistidina (6xHis) del extremo C (SEQ ID NO: 59) para facilitar la secreción y purificación de proteínas, respectivamente.
Expresión de proteínas de unión a antígeno triespecíficas en células CHO transfectadas de forma estable
Se utilizó un sistema de expresión de células CHO (Flp-In®, Life Technologies), un derivado de las célula de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC, CCL-61) (Kao y Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4): 1275-81). Las células adherentes se subcultivaron de acuerdo con los protocolos de cultivos celulares convencionales proporcionados por Life Technologies.
Para la adaptación al crecimiento en suspensión, las células se separaron de los matraces de cultivo de tejidos y se colocaron en medio sin suero. Las células adaptadas a la suspensión se crioconservaron en medio con DMSO al 10 %.
Las líneas celulares de CHO recombinantes que expresan de forma estable proteínas de unión a antígeno triespecíficas secretadas se generaron mediante transfección de las células adaptadas a la suspensión. Durante la selección con el antibiótico higromicina B, se midieron las densidades de células viables dos veces a la semana y las células se centrifugaron y resuspendieron en medio de selección nuevo en una densidad máxima de 0,1x106 células viables/ml. Las agrupaciones de células que expresaron de forma estable proteínas de unión a antígeno triespecíficas se recuperaron después de 2-3 semanas de selección, momento en que las células se transfirieron a un medio de cultivo convencional en matraces agitados. La expresión de proteínas secretadas recombinantes se confirmó realizando electroforesis en gel de proteínas o citometría de flujo. Las agrupaciones de células estables se crioconservaron en medio que contenía DMSO.
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas se producen en cultivos semicontinuos de 10 días de las líneas celulares de CHO transfectadas de forma estable mediante la secreción en el sobrenadante del cultivo celular. Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron después de 10 días en viabilidades de cultivo de normalmente >75 %. Las muestras se recogieron de los cultivos de producción en días alternos y se calcularon la densidad celular y la viabilidad. El día de la recogida, los sobrenadantes de cultivo celular se aclararon mediante centrifugación y filtración al vacío antes de su uso posterior.
Los títulos de expresión de proteínas y la integridad del producto en los sobrenadantes de cultivo celular se analizaron mediante SDS-PAGE.
Purificación de proteínas de unión a antígeno triespecíficas
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas se purificaron a partir de los sobrenadantes de cultivo celular de CHO en un procedimiento de dos etapas. Las construcciones se sometieron a cromatografía de afinidad en una primera etapa, seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC; del inglés, preparative size exclusion chromatography) preparativa en Superdex 200, en una segunda etapa. Las muestras se intercambiaron con tampón y se concentraron mediante ultrafiltración a una concentración típica de >1 mg/ml. Se evaluaron la pureza y la homogeneidad (normalmente >90 %) de las muestras finales mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, seguido de inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-HSA o anti-idiotipo, así como SEC analítica, respectivamente. Las proteínas purificadas se almacenaron en alícuotas a -80 °C hasta su uso.
Ejemplo 2: Determinación de la afinidad antigénica mediante citometría de flujo
Las proteínas de unión a antígeno triespecíficas del Ejemplo 1 se ensayaron en cuanto a sus afinidades de unión a células CD3+ y CD20+ humanas y a células CD3+ y CD20+ de cinomolgo.
Se incubaron células CD3+ y CD20+ con 100 pl de diluciones seriadas de las proteínas de unión a antígeno triespecíficas del Ejemplo 1. Después de lavar tres veces con tampón de FACS, las células se incubaron con 0,1 ml de anticuerpo anti-idiotipo monoclonal de ratón 10 pg/ml en el mismo tampón, durante 45 min en hielo. Después de un segundo ciclo de lavado, las células se incubaron con 0,1 ml de anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra conjugados con FITC 15 pg/ml, en las mismas condiciones que las anteriores. Como control, las células se incubaron con las IgG anti-His, seguido de los anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra conjugados con FITC sin las proteínas de unión a antígeno triespecíficas. A continuación, las células se lavaron de nuevo y se resuspendieron en 0,2 ml del tampón de FACS que contenía yoduro de propidio (PI) 2 pg/ml con el fin de excluir las células muertas. La fluorescencia de 1x104 células vivas se midió utilizando un citómetro de flujo FC500 MPL de Beckman-Coulter, utilizando el software MXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemania) o un citómetro de flujo Guava EasyCyte de Millipore, utilizando el software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemania). Las intensidades de fluorescencia medias de las muestras celulares se calcularon utilizando el software CXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemania) o el software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemania). Después de restar los valores de intensidad de fluorescencia de las células teñidas con los reactivos secundarios o terciarios solos, a continuación, se utilizaron los valores para el cálculo de los valores de Kd con la ecuación para el enlace de un sitio (hipérbola) del Prism de GraphPad (versión 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla, California, Estados Unidos).
La afinidad de unión a CD3 y la reactividad cruzada se evaluaron en experimentos de titulación y citométricos en células Jurkat CD3+ y la línea celular HSC-F CD3+ de cinomolgo (JCRB, cat n.° JCRB1164). La unión y la reactividad cruzada a CD20 se evaluaron en las líneas celulares tumorales CD20+ humanas. La proporción de Kd de reactividad cruzada se calculó utilizando los valores de Kd determinados en las líneas celulares CHO que expresan antígenos humanos recombinantes o de cinomorfo recombinantes.
Ejemplo 3: Ensayo de citotoxicidad
La proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 se evalúa in vitro en su mediación de la citotoxicidad dependiente de linfocitos T para células diana CD20+.
Se incubaron células CD20+ REC-1 marcadas con fluorescencia (una línea celular de linfoma de células del manto, ATCC CRL-3004) con PBMC aisladas de donantes aleatorios o linfocitos T CB15 (línea de linfocitos T estandarizada) como células efectoras en presencia de la proteína de unión a antígeno del Ejemplo 1. Tras la incubación durante 4 h a 37 °C en una incubadora humidificada, la liberación del tinte fluorescente de las células diana al sobrenadante se determina en un espectrofluorómetro. Las células diana incubadas sin la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 y las células diana totalmente lisadas mediante la adición de saponina al final de la incubación, sirven como controles negativos y positivos, respectivamente.
Basándose en las células diana vivas restantes medidas, el porcentaje de lisis celular específica se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: [1-(número de dianas vivas(muestra)/número de dianas vivas(espontánea))] x 100 %. Las curvas de respuesta a la dosis sigmoidea y los valores de CE50 se calculan mediante regresión no lineal/ajuste logístico de 4 parámetros utilizando el software de GraphPad. Los valores de lisis obtenidos para una concentración de anticuerpos dada se utilizan para calcular las curvas de respuesta a la dosis sigmoideas mediante un análisis de ajuste logístico de 4 parámetros utilizando el software Prism.
Ejemplo 4: Farmacocinética de proteínas de unión a antígeno triespecíficas
La proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 se evalúa para el semitiempo de eliminación en estudios en animales.
La proteína de unión al antígeno triespecífica se administra a monos cinomolgos como una inyección de bolo de 0,5 mg/kg por vía intramuscular. Otro grupo de mono cinomolgo recibe una proteína comparable en tamaño con dominios de unión a CD3 y CD20, pero que carece de la unión a HSA. Un tercer y un cuarto grupo reciben una proteína con dominios de unión a CD3 y HSA y una proteína con dominios de unión a CD20 y HSA respectivamente y ambas comparables en tamaño a la proteína de unión a antígeno triespecífica. Cada grupo de prueba consiste en 5 monos. Las muestras de suero se tomaron en los puntos temporales indicados, se diluyeron en serie y la concentración de las proteínas se determinó usando un ELISA de unión a CD3 y/o CD20.
El análisis farmacocinético se realiza utilizando las concentraciones plasmáticas del artículo de prueba. Los datos de plasma de la media de grupo para cada artículo de prueba conforman un perfil multiexponencial cuando se representan gráficamente frente al tiempo tras la dosificación. Los datos se ajustan mediante un modelo de dos compartimentos convencional con aporte de bolo y constantes de velocidad de primer orden para las fases de distribución y eliminación. La ecuación general para el mejor ajuste de los datos para la administración i.v. es: c(t)=Ae-crt+Be-|3t, donde c(t) es la concentración plasmática en el tiempo t, A y B son intersecciones en el eje Y y a y p son las constantes de velocidad de primer orden aparentes para las fases de distribución y eliminación, respectivamente. La fase a es la fase inicial del aclaramiento y refleja la distribución de la proteína en todo el líquido extracelular del animal, si bien la segunda porción o fase p de la curva de desintegración representa el aclaramiento plasmático real. Los métodos para ajustar tales ecuaciones son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, A=D/V(a-k2l)/(a-p), B=D/V(p-k21)/(a-p) y a y p (para a>p) son raíces de la ecuación cuadrática: r2+(k12+k21+k10)r+k21k10=0 utilizando parámetros estimados de V=distribución de volumen, k10=tasa de eliminación, k12=tasa de transferencia del compartimento 1 al compartimento 2 y k21=tasa de transferencia del compartimento 2 al compartimento 1 y D=la dosis administrada.
Análisis de datos: Los gráficos de concentración frente a los perfiles temporales se hicieron utilizando KaleidaGraph (KaleidaGraph™ V. 3.09 Copyright 1986-1997. Synergy Software. Reading, Pensilvania). Los valores notificados como inferiores a los notificables (LTR; del inglés, less than reportable) no se incluyen en el análisis de FC y no se representan gráficamente. Los parámetros farmacocinéticos se determinan mediante análisis compartimental, utilizando el software WinNonlin (WinNonlin® Professional V. 3.1 WinNonlin™ Copyright 1998-1999. Pharsight Corporation. Mountain View, California). Los parámetros farmacocinéticos se calcularon como se describe en Ritschel W A y Kearns G L, 1999, En: Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications, 5a edición, American Pharmaceutical Assoc., Washington, D.C.
Se espera que la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 tenga parámetros farmacocinéticos mejorados, tales como un aumento en el semitiempo de eliminación en comparación con las proteínas que carecen de un dominio de unión a HSA.
Ejemplo 5: Modelo de tumor de xenoinjerto
La proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 se evalúa en un modelo de xenoinjerto.
Se irradiaron de forma subletal ratones NOD/scid inmunodeficientes hembra (2 Gy) y se inocularon subcutáneamente con 4x106 células Ramos RA1 en su flanco dorsal derecho. Cuando los tumores alcanzaron 100 a 200 mm3, los animales se asignaron en 3 grupos de tratamiento. Los grupos 2 y 3 (8 animales cada uno) se inyectaron intraperitonealmente con 1,5x107 linfocitos T humanos activados. Tres días más tarde, los animales del Grupo 3 se trataron posteriormente con un total de 9 dosis intravenosas de 50 |jg de proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 (qdx9d). Los grupos 1 y 2 solo se tratan con vehículo. El peso corporal y el volumen tumoral se determinaron durante 30 días.
Se espera que los animales tratados con la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 tengan un tiempo de demora estadísticamente significativo en el crecimiento del tumor en comparación con el grupo de control tratado con vehículo respectivo.
Ejemplo 6: Protocolo de ensayo clínico de viabilidad para la administración de la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 a pacientes de linfoma de linfocitos B
Este es un ensayo clínico de fase I/II para estudiar la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 como un tratamiento para el linfoma de linfocitos B.
Resultados del estudio:
Primarios: Dosis tolerada máxima de proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1
Secundarios: Determinar si la respuesta in vitro de la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 se asocia con la respuesta clínica
Fase I
La dosis máxima tolerada (MTD; del inglés, maximum tolerated dose) se determinará en la sección de fase I del ensayo.
1.1 La dosis máxima tolerada (MTD) se determinará en la sección de fase I del ensayo.
1.2 Los pacientes que cumplan los criterios de elegibilidad entrarán en el ensayo para la proteína de unión a antígenos triespecífica del Ejemplo 1.
1.3 El objetivo es identificar la dosis más alta de proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 que puede administrarse de forma segura sin efectos secundarios graves o incontrolables en los participantes. La dosis administrada dependerá del número de participantes que se hayan inscrito en el estudio antes y de cómo de bien se tolere la dosis. No todos los participantes recibirán la misma dosis.
Fase II
2.1 Una sección de la fase II posterior se tratará en la MTD con un objetivo de determinar si la terapia con la terapia de la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 da como resultado una tasa de respuesta de al menos un 20%.
Resultado primario para la Fase II: determinar si la terapia de la proteína de unión a antígeno triespecífica del Ejemplo 1 da como resultado que al menos un 20% de los pacientes alcance una respuesta clínica (respuesta blástica, respuesta menor, respuesta parcial o respuesta completa).
Elegibilidad:
Confirmado histológicamente un linfoma de linfocitos B agresivo diagnosticado recientemente de acuerdo con clasificación actual de la Organización Mundial de la Salud, de 2001 a 2007
En cualquier estadio de enfermedad.
Tratamiento con regímenes similares a R-CHOP o R-CHOP (trasplante /-).
Edad > 18 años.
Estado funcional de Karnofsky > 50 % o estado funcional ECOG 0-2
Esperanza de vida > 6 semanas.
Ejemplo 7: Métodos para evaluar las actividades de unión y citotóxicas de moléculas de unión a antígeno triespecíficas
Producción de proteínas
Se clonaron secuencias de moléculas triespecíficas en el vector de expresión de mamíferos pCDNA 3.4 (Invitrogen), precedido por una secuencia líder y seguido por un marcador de 6x histidina (SEQ ID NO: 59). Se mantuvieron las células Expi293F (Life Technologies A14527) en suspensión en matraces Optimum Growth (Thomson) entre 0,2 a 8 x 1e6 células/ml en medios de Expi293. El ADN plasmídico purificado se transfectó en células Expi293 de acuerdo con los protocolos del kit del sistema de expresión Expi293 (Life Technologies, A14635) y se mantuvo durante 4-6 días tras la transfección. Los medios condicionados se purificaron parcialmente por cromatografía de afinidad y desalación. Las proteínas triespecíficas se pulieron posteriormente mediante intercambio iónico o como alternativa, se concentraron con unidades de filtración centrífuga Amicon Ultra (EMD Millipore), se aplicaron a medios de exclusión por tamaño Superdex 200 (GE Healthcare) y se resolvieron en un tampón neutro que contiene excipientes. La combinación de fracciones y la pureza final se evaluaron mediante SDS-PAGE y SEC analítica.
Mediciones de afinidad
Las afinidades de todas las moléculas de dominios de unión se midieron mediante inferometría de biocapa usando un instrumento Octet.
Las afinidades de PSMA se midieron cargando proteína PSMA-Fc humana (100 nM) en biosensores de Fc anti-IgG humana durante 120 segundos, seguido de una centrifugación basal de 60 segundos, después de la que se midieron las asociaciones mediante la incubación de la punta del sensor en una serie de diluciones de moléculas durante 180 segundos, seguido de disociación durante 50 segundos. Las afinidades de EGFR y CD3 se midieron cargando proteína EGFR-Fc humana o proteína CD3-Etiqueta-Fc humana, respectivamente, (100 nM) en biosensores Fc anti-IgG humana durante 120 segundos, seguido de una centrifugación basal de 60 segundos, después de la que se midieron las asociaciones mediante la incubación de la punta del sensor en una serie de diluciones de moléculas durante 180 segundos, seguido de disociación durante 300 segundos. Las afinidades por la albúmina de suero humano (HSA) se midieron cargando albúmina biotinilada en biosensores de estreptavidina, siguiendo a continuación los mismos parámetros cinéticos que para las mediciones de afinidad de CD3. Todas las etapas se realizaron a 30 °C en caseína al 0,25% en solución salina tamponada con fosfato.
Ensayos de citotoxicidad
Se utiliza un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de linfocitos T (TDCC; del inglés, T-cell dependent cellular cytotoxicity) humanos para medir la capacidad de los captadores de linfocitos T, incluyendo las moléculas triespecíficas, para dirigir linfocitos T a destruir células tumorales (Nazarian et al. 2015. J Biomol Screen. 20:519-27).
En este ensayo, los linfocitos T y las células de líneas celulares cancerosas diana se mezclan juntos en una proporción de 10:1 en una placa de 384 pocillos y se añaden diversas cantidades de captador de linfocitos T. Después de 48 horas, los linfocitos T se lavan aparte dejando unidas a la placa las células diana que no destruyeron los linfocitos T. Para cuantificar las células viables restantes, se utilizó un ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega).
Ensayos de atocinas
Los ensayos de AlphaLISA (Perkin Elmer) para TNFalfa e interferón gamma se utilizan para obtener pruebas de que los linfocitos T se activan por moléculas triespecíficas en presencia de células diana. Para este ensayo, los linfocitos T humanos primarios y las células tumorales humanas se incuban en presencia de moléculas de prueba como se describe en los ensayos de citotoxicidad. Después de 48 h de incubación, se analizan alícuotas de 2 microlitros de los sobrenadantes del ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayos de difusión
Se añadió una capa de Matrigel (75 j l ) a inserciones Transwell de 24 pocillos (0,4 |jm), después de lo que se añadió PBS a las cámaras superior e inferior (100 y 1025 jl, respectivamente) y se equilibró durante la noche a 4 °C. Se añadieron 100 pmol de IgG o Fab (Fc anti-humana de cabra, Jackson ImmunoResearch) o de moléculas triespecíficas a la cámara superior y la difusión de cada molécula a la cámara inferior se cuantificó a lo largo del tiempo mediante un ELISA específico para cada molécula. Se capturaron IgG y Fab mediante anti-IgG de cabra de burro (Jackson ImmunoResearch) que se habían inmovilizado en placas de ELISA y se detectaron con una anti-IgG de cabra de burro conjugada con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) y desarrollo de TMB. Las moléculas triespecíficas se capturaron mediante albúmina sérica humana (Athens Research & Technology) que se había inmovilizado en placas ELISA y se detectaron con un anticuerpo anti-His conjugado con peroxidasa de rábano picante (Genscript) y desarrollo de TMB.
La difusión relativa en cada punto temporal se calculó como: (concentración en la cámara inferior en el momento = t)/(concentración en la cámara superior en el momento = t).
Las diferencias estadísticamente significativas en la difusión entre la molécula de IgG y el Fab o las moléculas triespecíficas se identificaron utilizando una prueba t desapareada.
Ejemplo 8: Medidas de afinidad para moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR
Las afinidades de los tres dominios de unión en la molécula de direccionamiento a EGFR se midieron mediante inferometría de biocapa utilizando un instrumento Octet y se resumen en la Tabla 1.
Las moléculas triespecíficas en las que el dominio de unión a EGFR se sitúa en el extremo N de la molécula mostraron afinidades significativamente mayores por EGFR, en comparación con las moléculas triespecíficas que contenían el dominio de unión a EGFR en el centro o en la posición C-terminal. Asimismo, las moléculas triespecíficas que contienen el dominio de unión a la albúmina en el extremo N también presentaron afinidades mayores por HSA que las que contienen albúmina en las posiciones media o C-terminal. En cambio, todas las moléculas triespecíficas mostraron afinidades muy similares para CD3 humano, independientemente de la posición del dominio de unión dentro de la molécula triespecífica.
Ejemplo 9: Medidas de afinidad para moléculas triespecíficas de direccionamiento a PSMA
Las afinidades de los tres dominios de unión en las moléculas de direccionamiento a PSMA se midieron mediante inferometría de biocapa utilizando un instrumento Octet y se resumen en la Tabla 2.
Las moléculas triespecíficas que contienen el dominio de unión a la albúmina en el extremo N tuvieron afinidades mayores por HSA que las que contienen el dominio de unión a albúmina en las posiciones media o C-terminal. En cambio, la posición del dominio de unión a CD3 no afectó a la afinidad por su diana. De manera análoga, la posición del dominio de unión de PSMA tuvo poco impacto en la afinidad, con todas las moléculas triespecíficas que tienen afinidades por el PSMA humano dentro de 3 veces entre sí.
Ejemplo 10: Ensayos de citotoxicidad con moléculas triespecíficas
Las moléculas triespecíficas se probaron en ensayos de citotoxicidad celular dependiente de linfocitos T (TDCC) en cuanto a su capacidad para inducir linfocitos T humanos primarios a destruir células tumorales humanas en una manera dependiente de la diana tumoral.
Las moléculas triespecíficas que contienen dominios de direccionamiento a tumores derivados de anticuerpos de dominio único contra EGFR o PSMA pueden inducir una destrucción celular potente de una manera comparable a los captadores biespecíficos de linfocitos T (BiTE), véase la Figura 5.
Se ensayaron seis moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR con un anticuerpo anti-EGFR de dominio único (véase la Figura 4) y una molécula triespecífica que contiene un scFv anti-EGFR en ensayos de TDCC, utilizando la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano NCI-1563. Con fines de comparación, se incluyó un BiTE de EGFR en cada ensayo (Lutterbuese et al. 2007. PNAS 107: 12605-12610). Se demostró que las 7 configuraciones de moléculas triespecíficas de direccionamiento a EFGR destruyen células diana eficazmente (véanse los datos representativos en las Tablas 3 y 4 y las Figuras 6 y 8) con una potencia similar a la de BiTE de EFGR. El ensayo TDCc también se realizó con la adición de 15 mg/ml de albúmina sérica humana para evaluar el impacto de la unión de albúmina en la actividad de TDCC de las moléculas triespecíficas. Como se esperaba, la potencia del BiTE de EGFR, que carece de un dominio de unión a albúmina, fue similar en ausencia o presencia de albúmina. Las potencias de las moléculas triespecíficas disminuyeron en presencia de albúmina, pero la cantidad de la disminución fue dependiente de la configuración de la molécula. Las configuraciones cuyas potencias disminuyeron menos en presencia de albúmina fueron la EGFR-scFv:C:A y la E:A:C (anti-EGFR-scFv:anti-CD3E-scFv:anti-ALB-sdAb y anti-EGFR-sdAb:anti-ALB-sdAb:anti-CD3E-scFv).
Para demostrar que los resultados de las moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR pueden aplicarse a todas las moléculas triespecíficas, se ensayaron cinco moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR con un anticuerpo anti-PSMA de dominio único y una molécula triespecífica que contiene un scFv anti-PSMA en un ensayo de TDCC, utilizando la línea celular epitelial de carcinoma de próstata humano 22Rv1. Con fines de comparación, se incluyó en el ensayo un BiTE de PSMA (pasotuxizumab). Los resultados representativos se encuentran en la Tabla 5 y en la Figura 7. La mayoría de las moléculas específicas dirigidas a PSMA tuvieron una actividad similar a la del BiTE de PSMA en el ensayo de TDCC, excepto por una molécula triespecífica con una configuración de A:C:P (anti-PSMA-sdAb:anti-CD3E-scFv:anti-ALB-sdAb). Estas moléculas triespecíficas se ensayaron también en un ensayo de TDCC que contenía 15 mg/ml de albúmina sérica humana para evaluar el impacto de la unión de albúmina en la actividad de TDCC de las moléculas triespecíficas. Como se esperaba, la potencia del BiTE de PSMA, que carece de un dominio de unión a albúmina, fue similar en ausencia o presencia de albúmina. Las potencias de las moléculas triespecíficas disminuyeron en presencia de albúmina, pero la cantidad de la disminución fue dependiente de la configuración de la molécula. Las configuraciones cuya potencia disminuyó menos en presencia de albúmina fue la P:A:C (anti-PSMA-sdAb:anti-ALB-sdAb:anti-CD3E-scFv).
Las moléculas triespecíficas descritas en el presente documento pueden utilizar diversas modalidades para dirigirse a células tumorales. Las Figuras 5, 6 y 7 muestran moléculas triespecíficas con dominios de direccionamiento a tumores derivados de sdAb y las Figuras 7 y 8 muestran que las moléculas triespecíficas con un dominio de unión a tumores derivado de scFv pueden funcionar igualmente bien. La Figura 9 demuestra que el dominio de direccionamiento del tumor no se limita a construcciones derivadas de anticuerpos como sdAb y scFv, sino que los dominios no de inmunoglobulina pueden funcionar también. En este ejemplo, se usa un finómero de 7 kDa específico para Her2 para redirigir los linfocitos T humanos restantes para destruir las células cancerosas ováricas humanas.
Ejemplo 11: Ensayos de producción de citocinas con moléculas triespecíficas
Con el fin de mostrar que las moléculas triespecíficas ensayadas en el presente documento activaron linfocitos T y redirigieron estos linfocitos T para destruir células tumorales, se determinó la producción de las citocinas TNFa e IFNy en paralelo a la actividad de destrucción celular de los linfocitos T, dado que los linfocitos T producen estas citocinas a medida que se activan.
Como se muestra en las Figuras 10 y 11, las cuatro moléculas triespecíficas de direccionamiento a EGFR y PSMA ensayadas estimularon la producción de TNFa e Interferón y con una potencia similar a su actividad destructora de células. Estos datos son coherentes con la afirmación de que las moléculas triespecíficas activan los linfocitos T cuando se acoplan con las células diana.
Ejemplo 12: Ensayos de difusión
Las moléculas triespecíficas analizadas en el presente documento son más pequeñas que las moléculas de IgG convencionales y por tanto, se espera que se difundan más rápido y que penetren los tejidos mejor que los anticuerpos monoclonales. Se desarrolló un ensayo de difusión/migración a través de Matrigel para evaluar esta propiedad. Para este fin, se revistieron placas de ensayo Transwell con Matrigel, una mezcla de proteínas gelatinosas que se parece al entorno extracelular complejo encontrado en muchos tejidos. Las moléculas triespecíficas, las IgG de longitud completa o los fragmentos Fab se añadieron a la cámara superior. Después de ocho y 12 horas, se evaluó la cámara inferior en cuanto a la cantidad de macromolécula capaz de migrar a través de la matriz. Como se muestra en la Figura 12, las moléculas triespecíficas migraron en ambos puntos temporales en una tasa mucho más rápida que las moléculas de IgG de longitud completa.
Ejemplo 13: Identificación de variantes de anti-CD3 con afinidades variables por los CD3 humanos Caracterización del fago anti-CD3e parental
Los anti-CD3 parentales mostraron una unión buena a biotina-CD3s y baja unión a biotina-HSA (Figura 13).
Bibliotecas de fagos de scFv anti-CD3
Se proporcionó una biblioteca de sustitución única para los dominios de CDR1 de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, CDR3 de cadena pesada, CDR1 de cadena ligera, CDR2de cadena ligera y CDR3 de cadena ligera. Los restos variaron uno cada vez a través de mutagénesis.
Selección de clones y determinación de la afinidad de unión
Las bibliotecas de sustitución individuales se unieron a hu-CD3 biotiniladas, se lavaron, se eluyeron y se contaron. Se utilizó cinoCD3 biotinilado como el objetivo de selección de la ronda 1 y se lavó durante 4 horas después de la unión de fago combinatoria a partir de las dos bibliotecas independientes (~2x selección). Se utilizó hu-CD3 biotinilado como el objetivo de selección de la ronda 2 y se lavó durante 3 horas después de la unión de ambas bibliotecas (<2x selección). Los insertos sometidos a PCR de la segunda ronda de selección se subclonaron en el vector de expresión de His6 pcDNA3.4. Se seleccionaron 180 clones y el ADN se purificó, se secuenció y se transfectó en Expi293. Se seleccionó un panel de dieciséis clones con una gama de afinidades por CD3 humanos para una determinación de Kd más precisa (Tabla 6).
La Tabla 1 resume las afinidades de moléculas triespecíficas que contienen un anticuerpo de dominio único de direccionamiento a EGFR para los tres antígenos diana. Clave para las abreviaturas de la tabla: E = anticuerpo de dominio único anti-EGFR C = scFv anti-CD3E A = anticuer o de dominio único anti-albúmina.
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La Tabla 2 resume las afinidades de moléculas triespecíficas que contienen un anticuerpo de dominio único de direccionamiento a PSMA para los tres antígenos diana. Clave para las abreviaturas de la tabla: P = anticuerpo de dominio único anti-PSMA C = scFv anti-CD3E A = anticuer o de dominio único anti-albúmina. Afinidad
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La Tabla 3 resume las potencias de moléculas triespecíficas que contienen un anticuerpo de dominio único de direccionamiento a EGFR en ensayos de destrucción celular. Los valores de EC50 se presentan como concentraciones molares. Clave para las abreviaturas de la tabla: E = anticuerpo de dominio único anti-EGFR, C = scFv anti-CD3E A = anticuer o^ de dominio único ant -albúmina.
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La Tabla 4 resume las potencias de moléculas triespecíficas que contienen un anticuerpo scFv de direccionamiento a EGFR y una molécula BiTE en ensayos de destrucción celular. Los valores de EC50 se presentan como concentraciones molares. Clave para las abreviaturas de la tabla: E = anticuerpo de dominio único anti-EGFR, C = scFv anti-CD3E A = anticuer o^ de dominio único anti-albúmina.
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La Tabla 5 resume las potencias de moléculas triespecíficas que contienen un anticuerpo de dominio único de direccionamiento a PSMA en ensayos de destrucción celular. Los valores de EC50 se presentan como concentraciones molares. Clave para las abreviaturas de la tabla: P = anticuerpo de dominio único anti-PSMA, C = anti-CD3E scFv A = anticuer o^ de dominio único ant -albúmina.
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La Tabla 6 resume las afinidades de unión de las bibliotecas de fa os de scFv CD3e.
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Tabla 7: Secuencias
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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continuación
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína de unión a antígeno triespecífica, en donde dicha proteína de unión a antígeno triespecífica comprende (a) un primer dominio (A) que comprende un fragmento variable monocatenario (scFv) específico de CD3 humano; (b) un segundo dominio (B) que comprende un anticuerpo de dominio único (sdAb; del inglés, single domain antibody) que se une a albúmina sérica humana; y
(c) un tercer dominio (C) que comprende un anticuerpo de dominio único (sdAb) que se une específicamente a un antígeno tumoral diana,
en donde los dominios están unidos en el orden H2N-(C)-L2-(B)-L1-(A)-COOH y
en donde L1 y L2 son, cada uno independientemente, un enlazador que consiste en de 0 a 50 restos de aminoácidos.
2. La proteína de unión a antígeno triespecífica de la reivindicación 1, en donde el primer dominio comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) seleccionadas del grupo que consiste en muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab, SP34, X35, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4,2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIM-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1 y WT-31.
3. La proteína de unión a antígeno triespecífica de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el primer dominio es humanizado o humano.
4. La proteína de unión a antígeno triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el primer dominio es específico para CD3e (épsilon).
5. La proteína de unión a antígeno triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el primer dominio tiene reactividad cruzada con el CD3 de cinomolgo.
6. La proteína de unión a antígeno triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el tercer dominio es específico para una molécula de superficie celular.
7. La proteína de unión a antígeno triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el tercer dominio es específico para un antígeno tumoral seleccionado del grupo que consiste en EGFR, PSMA, HER2 y MSLN.
8. La proteína de unión a antígeno triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los enlazadores L1 y L2 son enlazadores peptídicos.
9. La proteína de unión a antígeno triespecífica de la reivindicación 8, en donde los enlazadores L1 y L2 consisten independientemente en aproximadamente 20 o menos restos de aminoácidos.
10. La proteína de unión a antígeno triespecífica de la reivindicación 8, en donde los enlazadores L1 y L2 son cada uno independientemente (GS)n (SEQ ID NO: 49), (GGS)n (SEQ ID NO: 50), (GGGS)n (SEQ ID NO: 51), (GGSG)n (SEQ ID NO: 52), (GGSGG)n (SEQ ID NO: 53) o (GGGGS)n (SEQ ID NO: 54), en donde n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
11. La proteína de unión a antígeno triespecífica de la reivindicación 8, en donde los enlazadores L1 y L2 son cada uno independientemente (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 55) o (GGGGS)a (SEQ ID NO: 56).
12. La proteína de unión a antígeno triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la proteína de unión a antígeno triespecífica es de aproximadamente 50 a aproximadamente 75 kDa.
13. Un polinucleótido que codifica una proteína de unión a antígeno triespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Una composición farmacéutica que comprende (i) la proteína de unión a antígeno triespecífica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. La proteína de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12 o la composición farmacéutica de la reivindicación 14, para usar en un método para el tratamiento o la mejora de una enfermedad proliferativa.
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