TW201930358A - 針對ｔｉｇｉｔ之單域抗體及其變異體 - Google Patents

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Abstract

本申請案提供了包含特異性識別TIGIT之單域抗體(sdAb)部分之構建體。亦提供了製備及使用此等構建體之方法。

Description

針對TIGIT之單域抗體及其變異體
本發明係關於包含特異性識別TIGIT之單域抗體(sdAb)部分的構建體，及其製備及使用方法。
具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT，亦稱為Vstm3或WUCAM)係屬於CD28家族之免疫受體。此26KDa蛋白含有細胞外IgV域，I型跨膜區，細胞內免疫球蛋白尾酪胺酸(ITT)樣基序，以及細胞質中基於C末端免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)基序。在原生T細胞及NK細胞中，TIGIT在細胞表面幾乎檢測不到，但在T細胞及NK細胞活化時上調。在腫瘤微環境中，TIGIT在調節性T細胞(Treg)、耗竭的T細胞及NK細胞上被高度檢測到。TIGIT具有多種配體，包括CD155(necl-5或脊髓灰質炎病毒受體(PVR))，CD112(連接蛋白-2或脊髓灰質炎病毒受體相關2(PVRL2))及CD113(連接蛋白-3或PVRL3)。TIGIT可以高親和力結合至CD155(PVR)，而以較低的親和力結合至CD112及CD113。最近的報道亦表明TIGIT順式地與CD226(PTA1或DNAM-1)相互作用。
TIGIT藉由幾種機制發揮其抑制性免疫檢查點功能。首先，在與其主要配體CD155(PVR)結合後，隨後TIGIT在其ITIM域中之磷酸化轉導抑制信號，從而藉由NF-κB途徑來下調T細胞及NK細胞中之IFN-γ表現。其次，由於TIGIT以比CD226更高的親和力與PVR相互作用，因此它與CD226競爭並減弱由CD226轉導之刺激信號。第三，PVR與樹突細胞上之TIGIT結合可導致IL-10表現之上調及IL-12表現之下調，因此損害樹突細胞之抗腫瘤免疫應答。 最後，最近的研究表明，TIGIT可以直接順式地與CD226結合，以便抑制CD226二聚化，該二聚化為T細胞活化所必需的。因此，TIGIT在感染及癌症之免疫應答中起著重要的負調節作用，並且已經提出阻斷TIGIT信號傳導作為增強用於癌症治療之T細胞及NK細胞免疫的方法。
程序性細胞死亡受體1(PD-1)係另一種抑制性免疫檢查點分子，對T細胞功能具有重要的負調節作用。當PD-1與調節T細胞受體(TCR)信號傳導的程序性細胞死亡配體1(PD-L1)及/或程序性細胞死亡配體2(PD-L2)結合時，PD-1可以減弱T細胞應答。使用靶向PD-1或PD-L1之抗體來阻斷PD-1/PD-L1軸已經證明可促進腫瘤特異性T細胞免疫，對癌症患者具有顯著的臨床益處。然而，由於PD-1/PD-L1阻斷後之抗性或復發，仍然存在巨大的未滿足之臨床需求。
本文所提及的所有公佈、專利、專利申請及公佈的專利申請的揭示內容特此以引用的方式整體併入本文。
本發明涉及抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分(下文稱為「抗TIGIT sdAb」)，例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，其包含與人免疫球蛋白G(IgG)之結晶片段(Fc)片段融合的抗TIGIT sdAb，以及多特異性(例如雙特異性)抗原結合蛋白，其包含例如與其他sdAb融合或融合至全長四鏈抗體的抗TIGIT sdAb；及其製備及使用方法。
本申請案之一態樣提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中該sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一 者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中，其中CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。
在根據上述任一種分離的抗TIGIT構建體之一些實施例中，特異性 識別TIGIT之sdAb部分包括以下任何一種：(1)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：176之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：177之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：178之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：179之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：180之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區 域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體； (15)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(16)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；(17)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體(18)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。
在根據上述任一種分離的抗TIGIT構建體之一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分包含VHH域，其包含以下任一者之胺基酸序列：a-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T及P(諸如F、Y、L、I或V，諸如F或Y，或諸如F)；a-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M及I(諸如A、G、E、D、Q、R、S或L，或諸如G、E或Q)；a-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D及V(諸如L、C或R，或諸如L或R)；a-4)103位之胺基酸 殘基選自由以下各者組成之群：W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E及C(諸如W、G或R，或諸如W)；及a-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A及H(諸如Q)；或b-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、L、I及V(諸如F或Y，或諸如F)；b-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：E及Q；b-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：R及L(諸如R)；b-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：W、R、G及S(諸如W)；及b-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q及L(諸如Q)；或c-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、L、I及V(諸如F或Y，或諸如F)；c-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：A、G、E、D、Q、R、S及L(諸如G、E或Q)；c-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：L、R及C(諸如L或R)；c-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：P、R及S(諸如R或S)；及c-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q及L(諸如Q)；其中胺基酸位置根據Kabat編號。在一些實施例中，當108位為Q時，108位可以視情況地人源化為L。
在根據如上所述之分離的抗TIGIT構建體中之任一者之一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中之任一者)序列同一性的變體。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列，或其在VHH域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取 代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR，諸如CDR1，及/或CDR2，及/或CDR3中。在一些實施例中，胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之FR，諸如FR1，及/或FR2，及/或FR3，及/或FR4中。在一些實施例中，胺基酸取代在CDR及FR中。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。
在根據上述任一種分離的抗TIGIT構建體之一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分與TIGIT之間結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-5M至約10-12M，約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。
在根據如上所述之分離的抗TIGIT構建體中之任一者之一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在根據上述任一種分離的抗TIGIT構建體之一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體係sdAb-Fc融合蛋白。在一些實施例中，sdAb-Fc融合蛋白為單體的。在一些實施例中，sdAb-Fc融合蛋白為二聚體的。在一些實施例中，Fc片段為人IgG1(hIgG1)Fc、無效應子(effectorless)(惰性)hIgG1 Fc或hIgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分及Fc片段視情況藉由肽接頭來連接，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭。在一些實施例中，sdAb-Fc融合蛋白質包含SEQ ID NO：288-294、306、308-311、315、317-319、321-322及365-367中之任一者之胺基酸序列。
在根據上述分離的抗TIGIT構建體中之任一者之一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體亦包含特異性識別第二抗原決定基之第二抗體部分。在一 些實施例中，第二抗體部分為全長抗體、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體(diabody)、或sdAb。在一些實施例中，抗TIGIT構建體為單特異性的。在一些實施例中，抗TIGIT構建體為多特異性的(例如雙特異性的)。在一些實施例中，第二抗原決定基不來自TIGIT。在一些實施例中，第二抗原決定基來自TIGIT但不同於抗TIGIT sdAb部分特異性識別者。在一些實施例中，第二抗原決定基與抗TIGIT sdAb部分特異性識別者相同。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分及第二抗體部分視情況藉由肽接頭來連接，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭。在一些實施例中，第二抗體部分為sdAb。在一些實施例中，第二抗體部分為Fab。在一些實施例中，第二抗體部分為scFv。在一些實施例中，第二抗體部分為由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。在一些實施例中，重鏈之Fc片段為IgG1 Fc、無效應子之IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分之N末端融合至全長抗體之重鏈中之至少一者之C末端。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分之C末端融合至全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分之N末端融合至全長抗體之輕鏈中之至少一者之C末端。在一些實施例中，特異性識別TIGIT之sdAb部分之C末端融合至全長抗體之輕鏈中之至少一者之N末端。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體包含四個相同的如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，每個抗TIGIT sdAb部分之C末端經由可選之肽接頭來與全長抗體之每個鏈之N末端融合。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體包含四個相同的如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，兩個抗TIGIT sdAb部分經由可選之肽接頭彼此融合，另外兩個抗TIGIT sdAb部分經由可選之肽接頭彼此融合，並且每個抗TIGIT sdAb部分融合多肽之C末端經由可選之肽接頭與全長抗體之每條重鏈之N末端融合。在一些實施例中，分離的抗TIGIT 構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)抗TIGIT sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；(3)抗TIGIT sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-抗TIGIT sdAb；(3)VH-CH1-CH2-CH3-抗TIGIT sdAb；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)抗TIGIT sdAb-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)抗TIGIT sdAb-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL-抗TIGIT sdAb；(2)VH-CH1-CH2-CH3：(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-抗TIGIT sdAb，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗 TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)抗TIGIT sdAb-VL-CL；(2)抗TIGIT sdAb-VH-CH1-CH2-CH3：(3)抗TIGIT sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)抗TIGIT sdAb-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)抗TIGIT sdAb-抗TIGIT sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；(3)抗TIGIT sdAb-抗TIGIT sdAb-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-抗TIGIT sdAb-CH2-CH3；(3)VH-CH1-抗TIGIT sdAb-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由兩條多肽鏈組成，每條鏈具有如下從N末端至C末端之結構：VL-VH-抗TIGIT sdAb-CH2-CH3，其中每個多肽鏈之VH及VL形成scFv域，其特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之複本，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建 體由四條多肽鏈組成，該等多肽鏈具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL-抗TIGIT sdAb-CL；(2)VH-CH1-抗TIGIT sdAb-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-抗TIGIT sdAb-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-抗TIGIT sdAb-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二複本之抗原結合位點，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)抗TIGIT sdAb-CL；(2)VL-VH-抗TIGIT sdAb-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-抗TIGIT sdAb-CH1-CH2-CH3；及(4)抗TIGIT sdAb-CL，其中多肽鏈(2)及(3)之VH及VL各自形成特異性結合第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之複本之scFv，並且每個抗TIGIT sdAb特異性結合TIGIT之複本。在一些實施例中，全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)特異性識別PD-1。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：385之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：386之VL。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：325之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：326之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：387之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：388之VL。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：406之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：407之VL。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391之輕鏈，其中全長抗體之重鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中重鏈融合多肽 包含胺基酸序列SEQ ID NO：394或396。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391之輕鏈，其中全長抗體之輕鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：399或401。在一些實施例中，全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)特異性識別PD-L1。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：379之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：380之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：383之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：384之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或包含VH及VL之抗原結合部分)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：381之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：382之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：333之重鏈及包含胺基酸序 列SEQ ID NO：334之輕鏈。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈，其中全長抗體之重鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：343。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈，其中全長抗體之重鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：357或359。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈，其中全長抗體之重鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：341或402。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈，其中全長抗體之輕鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：362或364。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈，其中全長抗體之輕鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：405。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332之輕鏈，其中全長抗體之重鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：347。在一些實施例中，全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：333之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：334之輕鏈，其中全長抗體之重鏈中之至少一者融合至如上所述的特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：345。
在根據上述任一種分離的抗TIGIT構建體之一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體亦包含生物活性蛋白質或其片段。
進一步提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者的CDR1、CDR2及CDR3。
進一步提供了分離的抗TIGIT構建體(例如，抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合體，PD-1×TIGIT BABP或PD-L1×TIGIT BABP)，其競爭性地與上述分離的抗TIGIT構建體特異性地結合至TIGIT。
亦提供了醫藥組合物，其包含任何一種上述分離的抗TIGIT構建體及可選之醫藥學上可接受之載劑。
本申請案之另一態樣提供了治療患有TIGIT相關疾病(諸如癌症或免疫相關疾病)之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之任何一種上述醫藥組合物。在一些實施例中，TIGIT相關疾病為癌症。在一些實施例中，癌症係實體腫瘤，諸如結腸癌症。在一些實施例中，TIGIT相關疾病為免疫相關疾病。在一些實施例中，免疫相關疾病與T細胞功能障礙病症相關。在一些實施例中，T細胞功能障礙病症之特徵在於T細胞衰竭。在一些實施例中，免疫相關疾病選自由以下各者組成之群：未解決之急性感染、慢性感染及腫瘤免疫。在一些實施例中，TIGIT相關疾病為病原性感染。在一些實施例中，該方法亦包括向該個體投與另外的療法(例如，癌症療法)，諸如手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。在一些實施例中，另外的療法為免疫療法。在一些實施例中，免疫療法包括向該個體投與有效量之第二醫藥組合物，其包含免疫調節劑，諸如免疫檢查點抑制劑(例如，特異性識別PD-1或PD-L1之抗體)。在一些實施例中，醫藥組合物係全身投與，諸如靜脈內(i.v.)或腹膜內(i.p.)。在一些實施例中，醫藥組合物係局部投與，諸如腫瘤內。在一些實施例中，個體係人類。
亦提供了分離的核酸，其編碼上述任何一種分離的抗TIGIT構建體。在一些實施例中，分離的核酸包含SEQ ID NO：246-252中之任一者之核酸序列。
亦提供了包含上述任何一種分離的核酸之載體。
亦提供了分離的宿主細胞，其包含上述分離的核酸或載體中之任一者。
亦提供了套組，其包含上述分離的抗TIGIT構建體、分離的核酸、載體或分離的宿主細胞中之任一者。
本申請案之另一態樣提供了產生上述任一種分離的抗TIGIT構建體之方法，其包括在有效表現所編碼之抗TIGIT構建體之條件下，培養包含上述分離的核酸或載體中之任一者之宿主細胞，或培養任何一種上述之分離的宿主細胞；以及從該宿主細胞中獲得所表現之抗TIGIT構建體。在一些實施例中，該方法亦包括產生包含上述分離的核酸或載體中之任一者的宿主細胞。
圖1描繪了最後一次加強後免疫前血清及免疫後血清之免疫應答評估。
圖2描繪了最後一次加強後常規抗體(IgG1)及重鏈抗體(IgG2及IgG3)之免疫應答評估。從免疫前血清中分離的相應免疫球蛋白片段用作陰性對照。
圖3描繪了非人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在Promega TIGIT/CD155阻斷報道基因測定中之功能。22G2用作陽性抗TIGIT對照。
圖4A-4C描繪了單獨或與小鼠PD-1阻斷抗體RMP1-14組合之非人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584-Fc)在CT26同系腫瘤模型中之活體內功效。10A7用作抗TIGIT抗體之陽性對照。圖4A顯示了每個治療組中之平均 腫瘤體積。圖4B顯示了每種治療下腫瘤浸潤之CD8+或CD4+ T淋巴細胞之百分比。圖4C顯示了每只動物之蜘蛛圖。
圖5A-5B描繪了單獨或與抗PD-1抗體RMP1-14組合之非人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584-Fc)在CT26同系腫瘤模型中之活體內功效。圖5A顯示每個治療組中之平均腫瘤體積。圖5B顯示了在不同治療下每只動物之在對數標度下之腫瘤體積之蜘蛛圖。
圖6A-6B描繪了單獨或與抗PD-1抗體RMP1-14組合之非人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584-Fc)在MC38同系腫瘤模型中之活體內功效。圖6A顯示每個治療組中之平均腫瘤體積。圖6B顯示了在不同治療下每只動物之在對數標度下之腫瘤體積之蜘蛛圖。
圖7描繪了使用Promega TIGIT/CD155阻斷報道基因測定，與其未人源化之親本抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584-Fc，AS19886-Fc)相比較，人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584VH28-Fc，AS19886VH5-Fc，AS19886VH8-Fc)之活體外功能活性。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。
圖8描繪了使用IL-2釋放測定，與其未人源化之親本抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584-Fc，AS19886-Fc)相比較，人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(AS19584VH28-Fc，AS19886VH5-Fc，AS19886VH8-Fc)之活體外功能活性。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。
圖9描繪了人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白AS19584VH28-Fc之活體內藥代動力學曲線。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。
圖10A-10B描繪了人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在攜帶MC38腫瘤模型之TIGIT人源化小鼠中之活體內功效。圖10A顯示了每個治療組中之平均腫瘤體積。圖10B顯示了每只動物之腫瘤體積之蜘蛛圖。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。hIgG1用作陰性對照。
圖11描繪了使用基於細胞之PD-L1功能測定，概念驗證(POC)PD-L1×TIGIT雙特異性抗原結合蛋白(BABP)及其親本抗PD-L1抗體元件之活體外功能。Tecentriq生物仿製藥(具有IgG1 Fc或惰性IgG1 Fc)用作陽性抗PD-L1抗體對照。h53C1(具有IgG1 Fc或惰性IgG1 Fc)為內部開發之抗PD-L1抗體。
圖12描繪了使用混合淋巴細胞反應(MLR)，POC PD-L1×TIGIT BABP及相應親本元件(抗PD-L1抗體及抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白)之活體外功能。Tecentriq生物仿製藥(具有IgG1 Fc或惰性IgG1 Fc)用作陽性抗PD-L1抗體對照。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。hIgG1用作陰性對照。
圖13描繪了使用Promega TIGIT/CD155阻斷報道基因測定，POC PD-L1×TIGIT BABP及相應親本元件(抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白)之活體外功能。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。
圖14描繪了使用針對TIGIT靶向之IL-2釋放測定，POC PD-L1×TIGIT BABP及相應親本元件(抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白)之活體外功能。22G2用作陽性抗TIGIT抗體對照。
圖15描繪了使用PD-L1/TIGIT雙功能報道分子測定，POC PD-L1×TIGIT BABP BTP-5、其相應親本元件(h53C1及AS19584-Fc融合蛋白)及其組合之活體外功能。
圖16A-16B描繪了與其親本元件(h53C1及AS19584-Fc)及其組合療法相比，POC PD-L1×TIGIT BABP BTP-5在攜帶MC38-hPD-L1腫瘤之C57BL/6人PD-1 KI小鼠中之活體內功效。圖16A顯示每個治療組中之平均腫瘤體積。圖16B顯示了每只動物之腫瘤體積之蜘蛛圖。IgG1用作陰性對照。
圖17描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體，及兩個相同抗TIGIT sdAb，其中每個抗TIGIT sdAb之C末端經由可選之肽接頭融合至一條重鏈之N末端。兩個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。全長抗體具有兩個特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3：及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。單特異性全長抗體可以用雙特異性全長抗體替換，以進一步擴展結合特異性。
圖18描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體，及兩個相同抗TIGIT sdAb，其中每個抗TIGIT sdAb之N末端經由可選之肽接頭融合至一條重鏈之C末端。兩個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。全長抗體具有兩個特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；(3)VH-CH1-CH2-CH3-VHH；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。單特異性全長抗體可以用雙特異性全長抗體替換，以進一步擴展結合特異性。
圖19描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體，及兩個相同抗TIGIT sdAb，其中每個抗TIGIT sdAb之C末端經由可選之肽接頭融合至一條輕鏈之N末端。兩個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。全長抗體具有兩個特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VHH-VL-CL；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VHH-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。單特異性全長抗體可以用雙特異性全長抗體替換，以進一步擴展結合特異性。
圖20描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體，及兩個相同抗TIGIT sdAb，其中每個抗TIGIT sdAb之N末端經由可選之肽接頭融合至一條輕鏈之C末端。兩個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基。全長抗體具有兩個特異性結合第二抗原決定基之抗原結合位點。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL-VHH；(2)VH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-VHH，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。單特異性全長抗體可以用雙特異性全長抗體替換，以進一步擴展結合特異性。
圖21描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體，及四個相同抗TIGIT sdAb，其中每個抗TIGIT sdAb之C末端經由可選之肽接頭融合至單特異性全長抗體之重鏈或輕鏈 之N末端。每個抗TIGIT sdAb特異性結合至第一抗原決定基(TIGIT)。全長抗體具有兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點特異性結合第二抗原決定基。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VHH-VL-CL；(2)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VHH-VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。單特異性全長抗體可以用雙特異性全長抗體替換，以進一步擴展結合特異性。
圖22描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含具有兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈之單特異性全長抗體，及四個相同抗TIGIT sdAb，其中與每條重鏈之N末端融合的係兩個相同抗TIGIT sdAb，兩個抗TIGIT sdAb經由可選之肽接頭彼此融合，並且兩個抗TIGIT sdAb經由可選之肽接頭與每條重鏈之N末端融合。每個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。全長抗體具有兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點特異性結合第二抗原決定基。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；(3)VHH-VHH-VH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。單特異性全長抗體可以用雙特異性全長抗體替換，以進一步擴展結合特異性。
圖23描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含兩個相同抗原結合(Fab)片段，兩個相同抗TIGIT sdAb及Fc區，其中每個抗TIGIT sdAb之N末端經由可選之肽接頭與Fab片段之CH1區之C末端融合，並且每個抗TIGIT sdAb之C末端融合到Fc區之CH2區之N末端。每個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。每個Fab片段特異性結合第二抗原決定基。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH2-CH3；及(4)VL-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。在替代形式中，為了擴展特異性，兩個Fab片段可以特異性結合不同的抗原決定基，及/或VHH片段可以特異性結合不同的抗原決定基。
圖24描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含兩個相同單鏈可變片段(scFv)，兩個相同抗TIGIT sdAb及Fc區，其中每個抗TIGIT sdAb之N末端經由可選之肽接頭與scFv之C末端融合，並且每個抗TIGIT sdAb之C末端與Fc區之N末端融合。每個抗TIGIT sdAb特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。每個scFv特異性結合第二抗原決定基。例如，BABP可以由兩條多肽鏈組成，每條鏈具有如下從N末端至C末端之結構：VL-VH-VHH-CH2-CH3，其中每條多肽鏈之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之複本的scFv域，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，scFv域可以從N末端至C末端包含：VH-VL。在替代形式中，可以省略每個抗TIGIT sdAb，或者用彼此融合之兩個相同或不同的抗TIGIT sdAb替換。另外，為了擴展特異性，兩個scFv可以特異性結合不同的抗原決定基，及/或VHH片段可以特異性結合 不同的抗原決定基。
圖25描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含：兩個相同Fab片段；兩個相同Fab樣片段，每個片段包含兩個VHH片段；及Fc區。在每個Fab樣片段中，VH及VL區各自被抗TIGIT sdAb取代。每個Fab樣片段特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。每個Fab片段特異性結合第二抗原決定基。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VL-CL-VHH-CL；(2)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VH-CH1-VHH-CH1-CH2-CH3；及(4)VL-CL-VHH-CL，其中多肽鏈(1)及(2)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第一複本之抗原結合位點，多肽鏈(3)及(4)之VH及VL形成特異性結合第二抗原決定基之第二複本之抗原結合位點，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，為了擴展特異性，兩個Fab片段可以特異性結合不同的抗原決定基，及/或Fab樣片段可以特異性結合不同的抗原決定基(例如，來自TIGIT之不同抗原決定基)。
圖26描繪了示例性BABP之示意性結構，其包含：兩個相同scFv；兩個相同Fab樣片段，每個片段包含兩個VHH片段；及Fc區。在每個Fab樣片段中，VH及VL區各自被抗TIGIT sdAb取代。每個Fab樣片段特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)。每個scFv特異性結合第二抗原決定基。例如，BABP可以由四條多肽鏈組成，其具有如下從N末端至C末端之結構：(1)VHH-CL；(2)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；(3)VL-VH-VHH-CH1-CH2-CH3；及(4)VHH-CL，其中多肽鏈(2)及(3)之VH及VL各自形成特異性結合第二抗原決定基之複本之scFv，並且每個VHH特異性結合第一抗原決定基(TIGIT)之複本。在替代形式中，scFv之C末端可以與包含VHH-CL之Fab樣片段中之鏈之N末端融合；及/或scFv域可以從N末端至C末端包含：VH-VL。另外，為了擴展特異性，兩個scFv可以特異性結合不同的抗原決定基，及/或VHH片段可以特異性結合不同的抗原決定 基(例如，來自TIGIT之不同抗原決定基)。
圖27A-27C描繪了PD-1/TIGIT及PD-L1/TIGIT雙功能報道分子測定，以藉由同時靶向PD-L1/PD-1途徑及CD155/TIGIT途徑來評估BABP之活體外協同作用。測試BTP-11及BTP-13並與阻斷PD-1或TIGIT之單一療法進行比較(圖27A)。測試BTP-15、BTP-17、BTP-21及BTP-22，並與阻斷PD-L1或TIGIT之單一療法進行比較(圖27B及27C)。
圖28A及28B分別描繪了藉由FACS檢測之BTP-21、替拉戈單抗(Tiragolumab)、阿特珠單抗(Atezolizumab)、度伐單抗(Durvalumab)、h53C1及AS19584VH28與原代CD8及CD4 T細胞之結合。
圖29描繪了BTP-21、阿特珠單抗、度伐單抗及h53C1在誘導由3個健康個體之原代人PBMC體外釋放IFN-γ之能力。
圖30描繪了與其親本元件(PD1-BM-min及AS19584VH28)及其組合相比，PD-1×TIGIT BABP BTP-11在攜帶CT26腫瘤之Balb/c人PD-1 K1小鼠中之活體內功效。資料顯示在蜘蛛圖中。TF指示無腫瘤小鼠。
圖31描繪了與阿特珠單抗、其親本元件(h53C1及AS19584VH28)及其組合相比，PD-L1×TIGIT BABP BTP-21在攜帶過量表現人PD-L1之MC38腫瘤(MC38-hPDL1)之C57BL/6人PD-1/PD-L1雙KI小鼠中之活體內功效。資料顯示在蜘蛛圖中。TF指示無腫瘤小鼠。
相關申請之交叉引用
本申請案主張於2017年12月28日申請之國際專利申請第PCT/CN2017/119506號及2018年7月26日申請之PCT/CN2018/097159之優先權，該等專利之內容以引用方式整體併入本文。
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本發明提供了特異性識別TIGIT之新型sdAb(以下亦稱為「抗TIGIT sdAb」)及其抗體變體(例如，包含抗TIGIT sdAb之較大蛋白質或多肽，諸如抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，與全長抗體、Fab或scFv融合之抗TIGIT sdAb，或包含抗TIGIT sdAb之多特異性抗原結合蛋白(MABP，例如雙特異性抗原結合蛋白(BABP)))，其用於治療TIGIT相關疾病(諸如癌症)之用途及其製備方法。
sdAb與常規4鏈抗體之不同在於具有單個單體抗體可變域，諸如重鏈可變域(VHH)，其可以在沒有輕鏈幫助之情況下對抗原表現出高親和力。已知駱駝科動物VHH係分子量約為15kDa之最小功能性抗原結合片段。
因此，本申請案之一個態樣提供了分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分。分離的抗TIGIT構建體可以為例如抗TIGIT sdAb(例如天然或人源化)，包含融合在一起之本文所述之多個抗TIGIT sdAb之多肽，包含與Fc片段(例如，人IgG1 Fc、無效應子(惰性)IgG1 Fc、hIgG2 Fc或IgG4 Fc)融合之本文所述之抗TIGIT sdAb之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，或包含融合至全長抗體(諸如抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體)或包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)之抗原結合片段之本文所述之抗TIGIT sdAb的MABP。抗TIGIT構建體可以為單特異性或多特異性(諸如雙特異性)，單價或多價(諸如二價)。
亦提供了包含本文所述之抗TIGIT構建體之組合物(諸如醫藥組合物)、套組及製品，其製備方法，以及使用本文所述之抗TIGIT構建體治療TIGIT相關疾病(諸如癌症)之方法。
I. 定義
如本文所用，「治療(treatment)」或「治療(treating)」係用於獲得有 利或所需結果(包括臨床結果)之方法。出於本發明之目的，有益或期望之臨床結果包括但不限於以下一種或多種：緩解由疾病引起之一種或多種症狀，減輕疾病之程度，穩定疾病(例如，預防或延遲疾病之惡化)，預防或延遲疾病之傳播(例如，轉移)，預防或延遲疾病之復發，延遲或減緩疾病之進展，改善疾病狀態，提供疾病之緩解(部分或全部)，減少治療疾病所需之一種或多種其他藥物之劑量，延遲疾病之進展，提高生活品質及/或延長生存期。「治療」亦涵蓋減少癌症之病理後果。本發明之方法考慮此等治療方面中之任何一種或多種。
本文所用之術語「有效量」係指足以治療特定病症、病狀或疾病諸如改善、緩和、減輕及/或延遲其一種或多種症狀之藥劑或藥劑組合的量。關於癌症，有效量包括足以引起腫瘤縮小及/或降低腫瘤生長速率(諸如抑制腫瘤生長)或預防或延遲其他不需要之細胞增殖之量。在一些實施例中，有效量係足以延遲發育之量。在一些實施例中，有效量係足以預防或延遲復發之量。有效量可以在一次或多次投與中投與。有效量之藥物或組合物可以：(i)減少癌細胞之數量；(ii)減小腫瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延緩、減緩並較佳阻止癌細胞浸潤到外周器官中；(iv)抑制(即，在某種程度上減緩並且較佳地阻止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤之發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上緩解與癌症相關之一種或多種症狀。
如本文所用，「個體」或「受試者」係指哺乳動物，包括但不限於人類、牛科動物、馬科動物、貓科動物、犬科動物、齧齒動物或靈長類動物。在一些實施例中，個體係人類。
術語「抗體」、「抗原結合部分」或「抗體部分」係以其最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、全長抗體及其抗原結合片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
術語「僅有重鏈之抗體」或「HCAb」係指功能性抗體，其包含重鏈，但缺少通常在4鏈抗體中發現之輕鏈。已知駱駝科動物(諸如駱駝、美洲駝或羊駝)產生HCAb。
術語「單域抗體」或「sdAb」係指具有三個互補決定區(CDR)之單一抗原結合多肽。單獨sdAb能夠在不與相應含CDR多肽配對之情況下結合至抗原。在一些情況下，單域抗體由駱駝科HCAb改造而來，並且其重鏈可變域在本文中稱為「VHH」(重鏈抗體重鏈之可變域)。駱駝科動物sdAb係已知最小之抗原結合抗體片段之一(參見例如Hamers-Casterman等，Nature 363：446-8(1993)；Greenberg等，Nature 374：168-73(1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh等，Nanomedicine(Lond),8：1013-26(2013))。基本VHH具有從N末端至C末端之以下結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分別指框架區1至4，並且其中CDR1至CDR3係指互補決定區1至3。
「分離」抗體(或構建體)係已經從其生產環境之組分中鑒定、分離及/或回收之抗體(例如天然或重組)。較佳地，分離的多肽不與來自其產生環境之所有其他組分締合。來自其產生環境之污染物組分(諸如由重組轉染細胞導致的污染物組分)係通常將干擾抗體之研究、診斷性或治療性用途的物質，並且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，多肽將被純化至：(1)如例如藉由勞立法(Lowry method)所測定大於95重量%之抗體，並且在一些實施例中大於99重量%；(2)足以藉由使用旋杯式測序儀獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或者(3)藉由使用考馬斯藍(Coomassie Blue)或較佳地銀染色法在非還原或還原條件下進行SDS-PAGE被純化至均質。分離的抗體(或構建體)包括重組細胞內之原位抗體，因為抗體之天然環境之至少一種組分將不存在。然而，分離的多肽、抗體或構建體通常將藉由至少一個純化步驟來製備。
抗體之「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈之胺基末端域。重鏈及輕鏈之可變域可分別稱為「VH」及「VL」。此等結構域通常係抗體之最易變部分(相對於相同類別之其他抗體)並且包含抗原結合位點。來自駱駝科物種之僅有重鏈之抗體具有單條重鏈可變區，其被稱為「VHH」。因此VHH係一種特殊類型之VH。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「完全抗體」可互換使用，係指呈大致上完整形式之抗體，與抗體片段相反。具體地說，全長4鏈抗體包括具有重鏈及輕鏈(包括Fc區)之抗體。全長僅重鏈抗體包括重鏈可變域(諸如VHH)及Fc區。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如人天然序列恆定結構域)或其胺基酸序列變體。在一些情況下，完整抗體可具有一種或多種效應子功能。
「抗體片段」或「抗原結合片段」包括完整抗體之一部分，較佳地該完整抗體之抗原結合區及/或可變區。抗體片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段；雙抗體；線性抗體(參見美國專利5,641,870，實施例2；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；單鏈抗體(scFv)分子；單域抗體(諸如VHH)及由抗體片段形成之多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，及殘留「Fc」片段，該名稱反映了容易結晶之能力。Fab片段由整條L鏈連同H鏈之可變域(VH)及一條重鏈之第一恆定結構域(CH1)組成。每個Fab片段關於抗原結合係單價的，即，它具有單一抗原結合位點。抗體經木瓜蛋白酶處理產生單個大F(ab')2片段，該片段大致對應於具有不同抗原結合活性的兩個二硫化物連接之Fab片段並且仍然能夠交聯抗原。Fab'片段因在CH1結構域之羧基末端處具有少量額外殘基(包括來自抗體鉸鏈區之一個或多個半胱胺酸)而不同於Fab片段。Fab'-SH係恆定域之半胱胺酸殘基帶有自由硫醇基的Fab'在本文中的名稱。F(ab')2抗體片段最初以之間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對形式產生。抗體片段之其他化學偶聯亦係已知的。
術語「恆定域」係指免疫球蛋白分子中相對於免疫球蛋白之其他部分，即含有抗原結合位點之可變域，具有更保守之胺基酸序列的部分。恆定域含有重鏈之CH1、CH2及CH3域(統稱為CH)及輕鏈之CHL(或CL)域。
來自任何哺乳動物物種之抗體(免疫球蛋白)之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列指定為兩種明顯不同類型(稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ))中之一者。
「Fv」係含有完全抗原識別及結合位點之最小抗體片段。此片段由處於緊密、非共價締合的一條重鏈可變域及一條輕鏈可變域之二聚體組成。由該兩個結構域之摺疊產生六個高變環(由H鏈及L鏈各自產生3個環)，該等高變環促成用於抗原結合之胺基酸殘基並且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即便單個可變域(或僅包含三個對抗原具有特異性之CDR之半個Fv)具有識別及結合抗原之能力，但與整個結合位點相比，處於較低的親和力下。
「單鏈Fv」(亦縮寫為「sFv」或「scFv」)係包含連接到單一多肽鏈中之VH及VL抗體結構域的抗體片段。較佳地，scFv多肽亦包含VH與VL結構域之間的多肽接頭，多肽接頭能夠使scFv形成用於抗原結合之所需結構。關於sFv之綜述參見Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
如本文所用的術語「高變區」、「HVR」或「HV」係指抗體可變域中序列高度可變及/或形成結構確定環的區。通常，單域抗體包含三個HVR(或CDR)：HVR1(或CDR1)、HVR2(或CDR2)及HVR3(或CDR3)。在該三種HVR中，HVR3(或CDR3)顯示最大多樣性，並且被認為在賦予抗體之優良特異性方面發揮獨特作用。參見例如Hamers-Casterman等，Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
術語「互補決定區」或「CDR」用於指由Kabat系統定義之高變區。參見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家 衛生研究院公共衛生署(Public Health Service,National Institutes of Health),Bethesda,Md.(1991)。
多個HVR描述在使用中並且涵蓋在本文中。Kabat互補決定區(CDR)基於序列可變性並且係最常用的(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國國家衛生研究院公共衛生署，Bethesda,Md.(1991))。Chothia替代地提及結構化環之位置(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR表示Kabat HVR與Chothia結構化環之間的折衷，並且藉由Oxford Molecular之AbM抗體建模軟件來使用。「接觸」HVR基於可用複合物晶體結構之分析。來自此等HVR中之每個之殘基在以下表1中指出。
HVR可包括如下的「延長HVR」：在VL中，24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)、以及89-97或89-96(L3)，並且在VH中，26-35(H1)、50-65或49-65(H2)、以及93-102、94-102、或95-102(H3)。對於此等定義中之每個，可變域殘基皆係根據Kabat等(出處同上)來編號。
單域抗體(諸如VHH)之胺基酸殘基根據Kabat等給出之VH域之一般編號進行編號(「Sequence of proteins of immunological interest」，美國公共衛生署，NIH Bethesda,Md.，出版號91)，在Riechmann及Muyldermans,J.Immunol. Methods 2000 6月23日；240(1-2)：185-195之文章中應用於來自駱駝科動物之VHH域。根據該編號，VHH之FR1包含1-30位之胺基酸殘基，VHH之CDR1包含31-35位之胺基酸殘基，VHH之FR2包含36-49位之胺基酸，VHH之CDR2包含50-65位之胺基酸殘基，VHH之FR3包含66-94位之胺基酸殘基，VHH之CDR3包含95-102位之胺基酸殘基，且VHH之FR4包含103-113位之胺基酸殘基。在此方面，應該注意(如VH域及VHH域之技術眾所周知)，每個CDR中胺基酸殘基之總數可以變化，並且可以不對應於由Kabat編號指示之胺基酸殘基之總數(即，根據Kabat編號之一個或多個位置可能不在實際序列中被佔據，或者實際序列可能包含比Kabat編號允許之數量更多之胺基酸殘基)。
表述「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變型係指用於Kabat等(出處同上)中之抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可能含有較少或額外的對應於可變域之FR或HVR的縮短或對其進行的插入之胺基酸，。例如，重鏈可變域可包括H2之殘基52之後的單個胺基酸插入(根據Kabat之殘基52a)及重鏈FR殘基82之後的插入殘基(例如，根據Kabat之殘基82a、82b及82c等)。可藉由在抗體序列之同源區處與「標準」Kabat編號序列比對來確定給定抗體之殘基的Kabat編號。
除非本文另有說明，否則免疫球蛋白重鏈中殘基之編號係如上文Kabat等之EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人IgG1 EU抗體之殘基編號。
「框架」或「FR」殘基係除了如本文所定義之HVR殘基以外的彼等可變域殘基。
如本文所用，術語「特異性結合」、「特異性識別」或「特異性針對」係指可測量的及可再現的相互作用，諸如靶標與抗原結合蛋白(諸如sdAb) 之結合，該結合在存在包括生物分子在內之分子之異質群體的情況下確定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為抗原決定基)之抗原結合蛋白(諸如sdAb)係與結合其他靶標相比，更容易地以更大親和力、親合力且/或以更長持續時間結合該靶標之抗原結合蛋白(例如sdAb)。在一些實施例中，抗原結合蛋白(諸如sdAb)與不相關靶標之結合程度係抗原結合蛋白(諸如sdAb)與靶標之結合的約10%以下，例如藉由放射免疫測定(RIA)量測。在一些實施例中，特異性結合靶標之抗原結合蛋白(諸如sdAb)具有10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M之解離常數(Kd)。在一些實施例中，抗原結合蛋白特異性地結合在來自不同物種之蛋白質中保守的蛋白質上之表位。在一些實施例中，特異性結合可包括但不需要專一性結合。抗體或抗原結合域之結合特異性可以藉由此項技術已知之方法經實驗測定。此類方法包括但不限於Western印跡、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試、EIA測試、BIAcore測試及肽掃描。
術語「特異性」係指抗原結合蛋白(諸如sdAb)針對抗原之特定抗原決定基的選擇性識別。例如，天然抗體為單特異性的。如本文所用之術語「多特異性」表示抗原結合蛋白具有多抗原決定基特異性(即，能夠特異性結合一個生物分子上之兩個、三個或更多個不同的抗原決定基或能夠特異性結合兩個、三個或更多個不同的生物分子上之抗原決定基)。如本文所用之「雙特異性」表示抗原結合蛋白具有兩種不同的抗原結合特異性。除非另有說明，否則所列出之雙特異性抗體結合之抗原之順序係任意的。即，例如，術語「抗TIGIT/PD-L1」、「抗PD-L1/TIGIT」、「TIGIT×PD-L1」、「PD-L1×TIGIT」、「PD-L1/TIGIT」「TIGIT/PD-L1」、「PD-L1-TIGIT」及「TIGIT-PD-L1」可互換使用，指特異性結合TIGIT及PD-L1之雙特異性抗體。如本文所用之術語「單特異性」表示具有一個或多個結合位點之抗原結合蛋白(諸如sdAb)，每個結合位點結合相同 抗原之相同抗原決定基。
如本文所用的術語「價」表示抗原結合蛋白中存在特定數目的結合位點。例如天然抗體或全長抗體具有兩個結合位點並且係二價的。因此，術語「三價」、「四價」、「五價」及「六價」分別表示抗原結合蛋白中存在兩個結合位點、三個結合位點、四個結合位點、五個結合位點及六個結合位點。
本文中之術語「Fc區」或「片段可結晶區域」用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區，其包括天然序列Fc區及變體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可能不同，但人類IgG重鏈Fc區通常限定為從在位置Cys226處之胺基酸殘基或從Pro230至其羧基末端的延伸段。Fc區之C末端離胺酸(根據EU編號系統之殘基447)可例如在抗體產生或純化期間或藉由對編碼抗體之重鏈之核酸進行重組工程化來去除。因此，完整抗體之組合物可包括所有的K447殘基去除之抗體群體、K447殘基未去除之抗體群體、以及具有擁有或沒有K447殘基之抗體之混合物之抗體群體。適用於本文描述之抗體之天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。
「結合親和力」總體上係指一個分子(例如，抗體)之單一結合位點與它的結合配偶體(例如，抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。除非另外指示，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對之成員之間的1：1相互作用的內在結合親和力。結合親和力可以由Kd、Koff、Kon或Ka表示。如本文所用，術語「Koff」欲指抗體(或抗原結合域)從抗體/抗原複合物中解離之解離速率常數，如從動力學選擇設置確定，以s-1為單位表示。如本文所用，術語「Kon」欲指抗體(或抗原結合域)與抗原結合形成抗體/抗原複合物之締合速率常數，以M-1s-1為單位表示。如本文所用，術語平衡解離常數「KD」或「Kd」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數，並且描述佔據存在於平衡之抗體分子溶液中之所有抗體結合域之一半所需之抗原濃度，並且等於Koff/Kon，以M為單位表示。Kd之量 測預先假定所有結合劑都在溶液中。在抗體與細胞壁繫連之情況下，例如在酵母表現系統中，相應平衡速率常數表示為EC50，此給出了Kd之良好近似值。親和常數Ka係解離常數Kd之倒數，以M-1為單位表示。解離常數(KD或Kd)用作顯示抗體對抗原之親和力之指標。例如，藉由使用標記有多種標記物之抗體的Scatchard方法，以及藉由使用BiacoreX(Amersham Biosciences製造)(其係櫃枱買賣量測套組)或類似套組，根據用戶手冊及套組附帶之實驗操作方法，可以易於進行分析。可以使用此等方法導出之KD值以M(莫耳)為單位表示。特異性結合靶標之抗體或其抗原結合片段可具有例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M之解離常數(Kd)。
半數最大抑制濃度(IC50)係物質(諸如抗體)抑制特定生物或生物化學功能之有效性之量度。它表明需要多少特定藥物或其他物質(抑制劑，諸如抗體)來抑制特定之生物過程(例如，TIGIT與CD155，或過程之組分即酶、細胞、細胞受體或微生物之間之結合)達一半。該等值通常表示為莫耳濃度。對於促效劑藥物或其他物質(諸如抗體)，IC50與「EC50」相當。EC50亦表示在體內獲得最大作用之50%所需的血漿濃度。如本文所用，「IC50」用於指示在活體外中和50%之抗原生物活性(諸如TIGIT生物活性)所需之抗體(諸如抗TIGIT sdAb)之有效濃度。IC50或EC50可以藉由生物測定來量測，諸如藉由FACS分析(競爭結合測定)配體結合之抑制、基於細胞之細胞因子釋放測定或擴增之發光鄰近均相測定(AlphaLISA)。
相對於肽、多肽或抗體序列的「胺基酸序列同一性百分比(%)」及「同源性」定義為，在比對序列並且引入缺口(如果需要的話)以獲得最大序列同一性百分比之後，候選序列中與特定肽或多肽序列中胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比，而不考慮任何保守取代作為序列同一性之一部分。出於確定胺基酸序列同一性百分比的目的所進行之比對可以本領域技術範圍內之各種方式達 成，例如使用公眾可獲得之計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可確定測量比對之適當參數，包括對所比較序列之全長獲得最大比對所需的任何算法。
編碼構建體、抗體或其抗原結合片段的「分離的」核酸分子係識別的並且與至少一種污染物核酸分子分開之核酸分子，核酸分子在其產生的環境中通常與污染物核酸分子締合。較佳地，分離的核酸分子不與產生環境相關聯的所有組分締合。編碼本文所述多肽及抗體之分離的核酸分子呈其在自然界中存在的形式或狀態以外的形式。因此分離的核酸分子區別於天然存在於細胞中的編碼本文中之多肽及抗體之核酸。分離的核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含有之核酸分子，但核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置處。
應理解，本文中描述之本發明之實施例包括由實施例組成及/或主要由實施例組成。
本文中對「約」某一個值或參數的提及包括(以及描述)針對該值或參數本身的變量。例如，關於「約X」之描述包括「X」之描述。
如本文所使用，提及「並非」某個值或參數通常表示並描述「不同於」某個值或參數。例如，該方法不用於治療X型癌症，意味著該方法用於治療不同於X之類型之癌症。
本文使用之術語「約X-Y」具有與「約X至約Y」相同含義。
除非上下文另有明確規定，否則在本文及隨附申請專利範圍中使用的單數形式「一個」、「或」及「該」包括複數個指示物。
II. 抗TIGIT構建體 (I)抗TIGIT單域抗體部分
本文所述之分離的抗TIGIT構建體包含特異性識別TIGIT之單域抗 體(sdAb)部分(或「抗TIGIT sdAb」)。在一些實施例中，分離的抗TIGIT構建體係抗TIGIT sdAb。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包括包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列的CDR3，並且胺基酸取代在CDR1及/或CDR2中。因此，在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb 部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。
本文提到之CDR序列在表22中提供。CDR可以以各種成對組合組合以產生許多抗TIGIT sdAb部分。
例如，在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：176之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：176之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：36之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：176之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：177之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：177之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：37之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：177之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：38之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：108之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：178之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2 個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：38之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：108之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：178之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：38之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：108之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：178之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：109之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：179之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：109之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：179之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：39之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：109之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：179之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：40之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：110之CDR2，或其包 含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：180之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：40之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：110之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：180之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：40之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：110之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：180之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：41之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：111之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：181之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：41之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：111之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：181之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：41之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：111之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：181之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列 SEQ ID NO：42之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：112之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：182之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：42之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：112之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：182之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：42之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：112之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：182之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：124之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：194之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：124之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：194之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：54之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：124之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：194之 CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：196之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：196之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：56之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：126之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：196之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：197之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：197之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中， 提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：57之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：127之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：197之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：198之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：198之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：58之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：128之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：198之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：129之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：199之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：129之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：199之CDR3；或其在CDR 區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：59之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：129之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：199之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：63之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：133之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：203之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：63之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：133之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：203之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：63之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：133之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：203之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：135之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：205之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb 部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：135之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：205之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：65之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：135之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：205之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：136之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：206之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：136之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：206之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：66之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：136之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：206之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：137之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包 含胺基酸序列SEQ ID NO：207之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：137之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：207之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：67之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：137之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：207之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：139之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：209之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：139之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：209之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：69之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：139之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：209之CDR3。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：70之CDR1，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之 任一者)胺基酸取代之變體；包含胺基酸序列SEQ ID NO：140之CDR2，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：210之CDR3，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：70之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：140之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：210之CDR3；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：70之CDR1；包含胺基酸序列SEQ ID NO：140之CDR2；及包含胺基酸序列SEQ ID NO：210之CDR3。
抗TIGIT sdAb部分可以在一個或多個FR序列中包含一個或多個「標誌殘基」。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含以下任一個之胺基酸序列：a-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T及P(例如F、Y、L、I或V，例如F或Y，或者諸如F)；a-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M及I(例如A、G、E、D、Q、R、S或L，或諸如G、E或Q)；a-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D及V(如L、C或R，或諸如L或R)；a-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E及C(如W、G或R，或如W)；及a-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A及H(如Q)；或b-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、L、I及V(如F或Y，或如F)；b-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：E 及Q；b-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：R及L(如R)；b-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：W、R、G及S(如W)；及b-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q及L(如Q)；或c-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、L、I及V(如F或Y，或如F)；c-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：A、G、E、D、Q、R、S及L(如G、E或Q)；c-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：L、R及C(如L或R)；c-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：P、R及S(如R或S)；及c-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q及L(如Q)；其中胺基酸位置根據Kabat編號。應注意，根據Kabat編號之胺基酸位置37、44、45、103及108處之此等「標記殘基」適用於天然VHH序列之抗TIGIT sdAb部分，並且可在人源化期間被取代。例如，根據Kabat編號在胺基酸108位處之Q可以視情況地人源化為L。其他人源化取代對於熟習此項技術者來說係清楚的。例如，可以藉由比較天然存在之VHH之FR序列與一個或多個密切相關之人VH之相應FR序列，然後使用此項技術已知(亦如本文所述)之方法將一個或多個此等潛在有用之人源化取代引入該VHH中來確定潛在有用之人源化取代。可以測試所得之人源化VHH序列之TIGIT結合親和力、穩定性、易於表現水準及/或其他所需性質。可能之殘基取代亦可以來自抗體VH域，其中VH/VL界面包含一個或多個高度帶電之胺基酸殘基。本文所述之抗TIGIT sdAb部分可以為部分或完全人源化的。較佳地，所得之人源化抗TIGIT sdAb以如本文所述之Kd、Kon及Koff結合TIGIT。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，或其與SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中之任一者)序列同一性的變體。在一些 實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分，其包含VHH域，該域包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列，或其在VHH域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之VHH域的抗TIGIT sdAb部分，或其變體在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR，諸如CDR1，及/或CDR2，及/或CDR3中包含胺基酸取代。在一些實施例中，包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之VHH域的抗TIGIT sdAb部分，或其變體包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3，並且胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之FR，諸如FR1，及/或FR2，及/或FR3，及/或FR4中。在一些實施例中，包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之VHH域的抗TIGIT sdAb部分，或其變體在CDR及FR中包含胺基酸取代。在一些實施例中，提供包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之VHH域的抗TIGIT sdAb部分。在一些實施例中，提供包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3的抗TIGIT sdAb部分。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供了抗TIGIT sdAb部分(下文稱為「競爭性抗TIGIT sdAb部分」或「競爭性抗TIGIT sdAb」)或包含抗TIGIT sdAb部分之抗 TIGIT構建體(下文稱為「競爭性抗TIGIT構建體」，其與本文所述之任何一種抗TIGIT sdAb部分競爭性地特異性結合TIGIT。在一些實施例中，可以使用ELISA測定來確定競爭性結合。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分(或包含抗TIGIT sdAb部分之抗TIGIT構建體)，其競爭性地與包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之抗TIGIT sdAb部分特異性地結合至TIGIT。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb部分(或包含抗TIGIT sdAb部分之抗TIGIT構建體)，其競爭性地與抗TIGIT sdAb部分特異性地結合至TIGIT，該抗TIGIT sdAb部分包括包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，競爭性抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，競爭性抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
單域抗體
示例性sdAb包括但不限於來自僅重鏈抗體之重鏈可變域(例如，駱駝科之VHH(重鏈抗體重鏈之可變域)或軟骨魚中之VNAR(鯊魚新抗原受體之可變域))，天然缺乏輕鏈之結合分子，源自常規4鏈抗體之單域(如VH或VL)，人源化僅重鏈抗體，表現人重鏈節段之轉基因小鼠或大鼠產生之人單域抗體，不同於源自抗體之彼等的工程化域及單域支架。sdAb可以源自任何物種，包括但不限於小鼠、大鼠、人、駱駝、美洲駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。本文涵蓋之sdAb亦包括來自駱駝科及鯊魚以外之物種之天然存在之sdAb分子。
在一些實施例中，sdAb源自天然存在之單域抗原結合分子，其被稱 為缺乏輕鏈之重鏈抗體(在本文中亦稱為「僅重鏈抗體」或「HCAb」)。此等單域分子揭示於例如WO 94/04678及Hamers-Casterman,C.等(1993)Nature 363：446-448中。出於清楚之原因，源自天然缺乏輕鏈之重鏈分子之可變域在本文中稱為VHH，以將其與四鏈免疫球蛋白之常規VH區分開。此VHH分子可以源自駱駝科物種中產生之抗體，例如駱駝、美洲駝、駱馬、單峰駱駝、羊駝及原駝。除了駱駝科之外之其他物種可以產生天然缺乏輕鏈之重鏈分子，並且此等VHH在本申請案之範圍內。
在一些實施例中，sdAb源自在軟骨魚中發現之免疫球蛋白之可變區。例如，sdAb可以源自在鯊魚血清中發現之稱為新型抗原受體(NAR)之免疫球蛋白同種型。產生源自NAR可變區(「IgNAR」)之單域分子之方法描述於WO 03/014161及Streltsov(2005)Protein Sci.14：2901-2909中。
在一些實施例中，sdAb係重組、CDR-移植、人源化、駱駝化、去免疫及/或活體外產生(例如，藉由噬菌體展示來選擇)。在一些實施例中，框架區之胺基酸序列可以藉由框架區中特定胺基酸殘基之「駱駝化」來改變。駱駝化係指將來自常規4鏈抗體之(天然存在之)VH域之胺基酸序列中之一個或多個胺基酸殘基用在重鏈抗體之VHH域中之相應位置出現之一個或多個胺基酸殘基來替換或取代。此可以以對於熟習此項技術者來說係顯而易見之本身已知之方式進行，例如基於本文之進一步描述。此等「駱駝化」取代較佳插入形成及/或存在於VH-VL界面之胺基酸位置，及/或如本文所定義之所謂之駱駝科標誌殘基(參見例如WO 94/04678，Davies及Riechmann FEBS Letters 339：285-290,1994；Davies及Riechmann Protein Engineering 9(6)：531-537,1996；Riechmann J.Mol.Biol.259：957-969,1996；及Riechmann及Muyldermans J.Immunol.Meth.231：25-38,1999)。
在一些實施例中，sdAb係由表現人重鏈區段之轉基因小鼠或大鼠產 生之人sdAb。參見例如US20090307787A1、美國專利第8,754,287號，US20150289489A1，US20100122358A1及WO2004049794。在一些實施例中，sdAb係親和力成熟的。
在一些實施例中，針對特定抗原或靶標之天然存在之VHH域可以從駱駝科動物VHH序列之(原生或免疫)文庫獲得。此等方法可以包括或不包括使用該抗原或靶標，或其至少一部分、片段、抗原決定簇或抗原決定基使用本身已知之一種或多種篩選技術來篩選此等文庫。此類文庫及技術例如描述於WO 99/37681，WO 01/90190，WO 03/025020及WO 03/035694中。或者，可以使用源自(原生或免疫)VHH文庫之改進之合成或半合成文庫，例如藉由諸如隨機誘變及/或CDR改組之技術從(原生或免疫)VHH文庫獲得之VHH文庫，例如在WO 00/43507中描述。
在一些實施例中，sdAb由常規之4鏈抗體產生。參見例如EP 0 368 684，Ward等(Nature 1989年10月12日；341(6242)：544-6)，Holt等，Trends Biotechnol.,2003,21(11)：484-490；WO 06/030220；及WO 06/003388。
由於sdAb之獨特性質，使用VHH域作為單一抗原結合蛋白或作為抗原結合域(即作為較大蛋白質或多肽之一部分)提供了許多優於常規VH及VL、scFv及常規抗體片段(例如Fab或(Fab')2)之顯著優勢：1)僅需要單個域以高親和力結合抗原，因此不需要具有第二域，亦不需要確保存在此等兩個域在正確空間構形及組態中(例如，在摺疊期間不需要配對重鏈及輕鏈，不需要使用專門設計之接頭，例如用於scFv)；2)VHH域及其他sdAb可以從單個基因表現，不需要轉譯後摺疊或修飾；3)VHH域及其他sdAb可以容易地設計成多價及/或多特異性形式(例如本申請案中描述之彼等)；4)VHH域及其他sdAb係高度可溶的並且不具有聚集之傾向(如Ward等，Nature.1989年10月12日；341(6242)：544-6描述之小鼠衍生之「dAb」)；5)VHH域及其他sdAb對於熱、pH、蛋白酶及其他變 性劑或條件具有高度穩定性；6)VHH域及其他sdAb易於且相對便宜地製備(即使在大規模生產中)，例如使用微生物發酵，不需要使用哺乳動物表現系統(例如，為生產例如常規抗體片段所需要)；7)與常規之4鏈抗體及其抗原結合片段相比，VHH域及其他sdAb相對較小(約15kDa，或比常規IgG小10倍)，因此具有(較)高組織穿透能力，例如用於實體瘤及其他緻密組織；8)VHH域及其他sdAb可以表現出所謂之「空腔結合特性」(由於它們與常規VH域相比延伸之CDR3環)，因此可以接近常規4鏈抗體及其抗原結合片段無法接近之靶標及抗原決定基，例如，已顯示VHH域及其他sdAb可以抑制酶(參見例如WO1997049805；Transue等，Proteins.1998年9月1日；32(4)：515-22；Lauwereys等，EMBO J.1998年7月1日；17(13)：3512-20)。
TIGIT
TIGIT屬於CD28家族。具有26kDa之蛋白質由細胞外IgV域，I型跨膜區域，細胞內免疫球蛋白尾酪胺酸(ITT)樣基序及細胞質中基於C末端免疫受體酪胺酸之抑制基序(ITIM)基序組成。在原生T細胞及NK細胞中，TIGIT在細胞表面幾乎檢測不到，但在T細胞及NK細胞活化時上調。
術語「具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體」，「TIGIT」，「TIGIT抗原」，「TIGIT抗原決定基」，「Vstm3」及「WUCAM」可互換使用，包括人TIGIT之變體、同種型、物種同源物，及具有至少一個與TIGIT共有之抗原決定基之類似物。
人TIGIT之胺基酸序列在Genbank登錄號NP_776160中揭示。胺基酸區1-21係信號肽；22-141係細胞外結構域；142-162係跨膜結構域；並且163-244係細胞質結構域。已經報道了藉由mRNA之可變剪接具有170個胺基酸之胺基酸序列之變體。人TIGIT mRNA之核苷酸序列揭示於NM_173799。已經報道了在173位具有A至G轉換之核苷酸序列之變體。
特定之人TIGIT序列在胺基酸序列中通常與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT至少90%相同，並且含有與其他物種(例如，小鼠)之TIGIT胺基酸序列相比，將胺基酸序列鑒定為人之胺基酸殘基。在一些實施例中，人TIGIT之胺基酸序列可以與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT至少約95%、96%、97%、98%或99%相同。在一些實施例中，人TIGIT序列將顯示與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT不超過10個胺基酸差異。在一些實施例中，人TIGIT可以顯示與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT不超過5、4、3、2或1個胺基酸差異。可以如本文所述確定同一性百分比。在一些實施例中，人TIGIT序列可以與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT不同，例如，藉由具有保守突變或在非保守區中之突變，並且TIGIT具有與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT基本相同生物學功能。例如，人TIGIT之生物學功能係在TIGIT之細胞外域中具有抗原決定基，其特異性地由本發明之抗TIGIT構建體來結合或人TIGIT之生物學功能係T細胞活性之調節。在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT sdAb部分特異性識別與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT具有100%胺基酸序列同一性之TIGIT多肽。在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT sdAb部分特異性地識別包含SEQ ID NO：368之胺基酸序列之TIGIT多肽。
在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分可以與來自除人之外之物種之TIGIT或在結構上與人TIGIT相關之其他蛋白質(例如，人TIGIT同源物)交叉反應。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分對人TIGIT係完全特異的，並且不表現出物種或其他類型之交叉反應性。
在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT sdAb部分特異性識別TIGIT之細胞外域(ECD)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分特異性識別TIGIT ECD之N末端部分。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分特異性識別TIGIT ECD之C末端部分。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分特異性識別TIGIT ECD之 中間部分。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分特異性識別之TIGIT之ECD在胺基酸序列中與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT之ECD具有至少約95%、96%、97%、98%或99%之同一性。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分特異性識別之TIGIT之ECD在胺基酸序列上與Genbank登錄號NP_776160之人TIGIT之ECD 100%相同。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分特異性地識別包含SEQ ID NO：369之胺基酸序列之TIGIT多肽。
抗體親和力
抗體或抗原結合域之結合特異性可以藉由此項技術已知之方法藉由實驗確定。此類方法包括但不限於Western印跡、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore-測試及肽掃描。
在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-6M，約10-6M至約10-7M，約10-7M至約10-8M，約10-8M至約10-9M，約10-9M至約10-10M，約10-10M至約10-11M，約10-11M至約10-12M，約10-5M至約10-12M，約10-6M至約10-12M，約10-7M至約10-12M，約10-8M至約10-12M，約10-9M至約10-12M，約10-10M至約10-12M，約10-5M至約10-11M，約10-7M至約10-11M，約10-8M至約10-11M，約10-9M至約10-11M，約10-5M至約10-10M，約10-7M至約10-10M，約10-8M至約10-10M，約10-5M至約10-9M，約10-7M至約10-9M，約10-5M至約10-8M，或約10-6M至約10-8M。
在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間結合之Kon為約102M-1s-1至約104M-1s-1，約104M-1s-1至約106M-1s-1，約106M-1s-1至約107M-1s-1，約102M-1s-1至約107M-1s-1，約103M-1s-1至約107M-1s-1，約104M-1s-1至約107M-1s-1，約105M-1s-1至約107M-1s-1，約103M-1s-1至約106M-1s-1，或約104M-1s-1至約106M-1s-1。
在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Koff為約1s-1至約10-2s-1，約10-2s-1至約10-4s-1，約10-4s-1至約10-5s-1，約10-5s-1至約10-6s-1，約1s-1至約10-6s-1，約10-2s-1至約10-6s-1，約10-3s-1至約10-6s-1，約10-4s-1至約10-6s-1，約10-2s-1至約10-5s-1，或約10-3s-1至約10-5s-1。
在一些實施例中，在擴增之發光鄰近均相測定(AlphaLISA)中，抗TIGIT sdAb部分之EC50小於10nM。在一些實施例中，藉由FACS分析(競爭結合測定)或基於細胞之細胞因子釋放測定，在配體結合之抑制中，抗TIGIT sdAb部分之EC50小於500nM。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之EC50小於1nM(例如約0.001nM至約0.01nM，約0.01nM至約0.1nM，約0.1nM至約1nM等)，約1nM至約10nM，約10nM至約50nM，約50nM至約100nM，約100nM至約200nM，約200nM至約300nM，約300nM至約400nM，或約400nM至約500nM。
嵌合或人源化抗體
在一些實施例中，本文提供之抗TIGIT sdAb部分係嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。在一個實例中，嵌合抗體包含非人可變區(例如，源自駱駝科物種，例如美洲駝之可變區)及人恆定區。在又一個實施例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或亞類與親本抗體的類別或亞類相比已經改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人抗體被人源化以降低對人的免疫原性，同時保留親本非人抗體的特異性及親和力。一般說來，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中例如CDR的HVR(或其部分)來源於非人抗體，並且FR(或其部分)來源於人抗體序列。人源化抗體視情況亦將包含至少一部分人恆定區。在一些實施例中，人源化抗體中的一些FR殘基被來自 非人抗體(例如HVR殘基所來源的抗體)的相應殘基取代，例如以恢復或改善抗體特異性或親和力。
人源化抗體及其製備方法在例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中進行了綜述。可用於人源化之人框架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區域；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人抗體之共有序列的框架區；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區；及篩選FR文庫得到之框架區域。
在一些實施例中，修飾抗TIGIT sdAb，例如人源化，而不降低域對抗原之天然親和力，同時降低其對異源物種之免疫原性。例如，可以確定美洲駝抗體之抗體可變域(VHH)之胺基酸殘基，並且例如在框架區中之一個或多個駱駝科胺基酸被其如在人類共有序列中發現之人類對應物替換，該多肽不失去其典型特徵，即人源化不會顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝科動物單域抗體之人源化需要在單一多肽鏈中引入及誘變有限量之胺基酸。此與scFv，Fab'，(Fab')2及IgG之人源化形成對比，其需要在兩條鏈，即輕鏈及重鏈中引入胺基酸變化以及兩條鏈之組裝之保存。
包含VHH域之sdAb可以人源化以具有人樣序列。在一些實施例中，本文使用之VHH域之FR區包含與人VH框架區至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多中之任一者之胺基酸序列同源性。一類示例性之人源化VHH域之特徵在於VHH在位置45處攜帶選自由以下各者組成之群之胺基酸：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺或麩醯胺酸，例如L45及位置103處之色胺酸，根據Kabat編號。因此，屬於該類之多肽顯示出與人VH框架區之高胺基酸序列同源性，並且該等多肽可以直接投與於人而不期望由此產生不需要之免疫應答，並且沒有進一步人源化之負擔。
另一種示例性之人源化駱駝科動物單域抗體已在WO 03/035694中描述，並且含有通常在人源或其他物種之常規抗體中發現之疏水性FR2殘基，但藉由103位上之帶電精胺酸殘基補償此親水性損失，此殘基代替雙鏈抗體之VH中存在之保守色胺酸殘基。因此，屬於此等兩類之肽顯示出與人VH框架區之高胺基酸序列同源性，並且該等肽可以直接投與於人而不期望由此產生不需要之免疫應答，並且沒有進一步人源化之負擔。
人域抗體
在一些實施例中，本文提供之抗TIGIT sdAb部分係人抗體(稱為人域抗體，或人DAb)。可以使用此項技術已知之各種技術產生人抗體。人抗體一般描述於Chen,Mol.Immunol.47(4)：912-21(2010)中。能夠產生完全人單域抗體(或DAb)之轉基因小鼠或大鼠係此項技術已知的。參見例如US20090307787A1，美國專利第8,754,287號，US20150289489A1，US20100122358A1及WO2004049794。
可以藉由向轉基因動物投與免疫原製備人抗體(例如人DAb)，轉基因動物已經被修飾以響應抗原性攻擊產生完整的人抗體或具有人可變區的完整抗體。此類動物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座，其替換內源免疫球蛋白基因座，或者存在於染色體外或隨機整合到動物的染色體中。在此類轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已經失活。關於從轉基因動物獲得人抗體的方法的綜述，參見Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。可以進一步修飾來自由此類動物產生的完整抗體的人可變區，例如藉由與不同的人恆定區組合進行。
亦可以藉由基於雜交瘤的方法製備人抗體(例如人DAb)。用於產生人單株抗體的人骨髓瘤及小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系在本領域中為已知的。
亦可以藉由分離選自人衍生的噬菌體展示文庫的Fv純系可變域序列來產生人抗體(例如人DAb)。然後，可將此類可變域序列與期望的人恆定結構域組合。下文描述了從抗體文庫中選擇人抗體的技術。
獲得針對特定抗原或靶標之VHH序列之一種技術涉及適當地免疫能夠表現重鏈抗體之轉基因哺乳動物(即，以便產生針對該抗原或靶標之免疫應答及/或重鏈抗體)，從該轉基因哺乳動物中獲得合適之生物樣品，該樣品含有VHH序列(編碼該等VHH序列之核酸序列)(例如血液樣品，血清樣品或B細胞樣品)，然後，從該樣品開始，使用本身已知之任何合適之技術(例如本文所述之任何方法或雜交瘤技術)，產生針對該抗原或靶標之VHH序列。例如，為此目的，表現重鏈抗體之小鼠及其他方法及技術在WO 02/085945，WO 04/049794及WO 06/008548以及Janssens等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2006年10月10日；103(41)：15130-5中描述。例如，表現此重鏈抗體之小鼠可以表現具有任何合適(單個)可變域之重鏈抗體，例如來自天然來源之(單個)可變域(例如人(單個)可變域，駱駝科(單個)可變域或鯊魚(單個)可變域)，以及例如合成或半合成(單個)可變域。
文庫衍生的抗體
可以藉由對組合文庫篩選具有期望的一種或多種活性之抗體來分離本發明之抗體。例如，本領域中已知用於產生噬菌體展示文庫並對此類文庫篩選具有期望的結合特性之抗體之多種方法。已經描述了構建單域抗體文庫之方法，例如，參見美國專利第7371849號。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈式反應(PCR)分別選植VH及VL基因的組庫，並隨機重組在噬菌體文庫中，然後可以對其篩選抗原結合噬菌體，如Winter等，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中描述。可以藉由PCR類似地選殖VHH基因之所有譜系，在噬菌體文庫中隨機重組，並篩選抗原結合 噬菌體。噬菌體通常展示作為scFv片段或作為Fab片段之抗體片段。來自經免疫之來源之文庫提供對免疫原之高親和力抗體，而不需要構建雜交瘤。或者，可以在沒有任何免疫的情況下(例如，從人)選植天然組庫以提供針對廣泛範圍之非自身抗原及還有自身抗原之抗體的單一來源，如由Griffiths等，EMBO J,12：725-734(1993)描述。最後，亦可以藉由從幹細胞選植未重排的V基因區段，並使用含有隨機序列之PCR引物來合成製備天然文庫，以編碼高度可變的CDR3區並在體外達成重排，如由Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)描述。
認為從人抗體文庫分離的抗體或抗體片段係本文中之人抗體或人抗體片段。
生物活性
本文所述之抗TIGIT sdAb部分之生物活性可以藉由量測其半數最大有效濃度(EC50)來確定，其係抗體結合其靶標或抑制特定生物或生物化學功能(例如抑制TIGIT與其主要配體CD155之間之結合)之有效性之量度。例如，此處EC50可用於指示在細胞表面結合50% TIGIT或在活體外中和50% TIGIT生物活性所需之抗TIGIT sdAb之有效濃度。EC50亦係指在體內獲得最大作用的50%所需的血漿濃度。EC50可以藉由此項技術已知之測定來量測，例如，生物測定例如FACS結合分析，藉由FACS分析配體結合之抑制(競爭結合測定)，基於細胞之細胞因子釋放測定，或擴增之發光鄰近同源測定(AlphaLISA)。
例如，可以使用流式細胞術研究配體結合之阻斷(亦參見實例2)。表現人TIGIT之CHO細胞可以從貼壁培養瓶中解離，並與用於測試的不同濃度之抗TIGIT sdAb，及恆定濃度之經標記之CD155蛋白(例如生物素標記之人CD155-Fc蛋白)混合。可使用抗TIGIT抗體陽性對照，諸如22G2(參見US 2016/0176963中之SEQ ID NO：7及9)。將混合物在室溫下平衡30分鐘，用FACS 緩衝液(含有1% BSA之PBS)洗滌三次。然後，加入特異性識別恆定濃度之經標記CD155蛋白之抗體(如PE/Cy5鏈黴抗生物素蛋白二級抗體)，並在室溫下溫育15分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞並藉由流式細胞術分析。可以使用Prism(GraphPad Software，San Diego，CA)使用非線性迴歸分析資料以計算EC50。競爭測定之結果可以證明抗TIGIT sdAb抑制經標記之CD155與TIGIT之間相互作用之能力。
亦可以藉由TIGIT/CD155阻斷報道基因測定或IL-2釋放測定來測試抗TIGIT sdAb部分之生物活性(亦參見實例2)。在與其主要配體CD155結合後，隨後TIGIT在其ITIM域中之磷酸化轉導抑制信號以下調T細胞中之IL-2表現。例如，可將TIGIT效應細胞接種過夜，然後與包含抗TIGIT sdAb之連續稀釋之抗TIGIT構建體一起溫育，然後以合適之E：T比率加入CD155 aAPC/CHO-K1細胞。在37℃，5%CO2下誘導6小時後，可以加入Bio-GloTM螢光素酶測定試劑並測定發光。結果可以證明抗TIGIT sdAb抑制CD155與TIGIT之間相互作用之能力。
在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分阻斷或拮抗由TIGIT受體轉導之信號。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分可以結合TIGIT上之抗原決定基，從而抑制TIGIT與CD155相互作用。在一些實施例中，在抗體結合位點與TIGIT配體結合位點之比例大於1：1且抗體濃度大於10-8M之條件下，抗TIGIT sdAb部分可以將TIGIT與CD155之結合降低至少約5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或99.9%中之任一者。
(II)包含抗TIGIT sdAb部分之構建體
包含抗TIGIT sdAb部分之抗TIGIT構建體可以為任何可能之形式。
在一些實施例中，包含抗TIGIT sdAb部分之抗TIGIT構建體可以進一步包含另外之多肽序列，例如一個或多個抗體部分(或抗原結合部分)，或免疫 球蛋白之Fc片段。此類另外之多肽序列可以或可以不改變或以其他方式影響抗TIGIT sdAb之(生物學)性質，並且可以或可以不向本文所述之抗TIGIT sdAb添加其他功能。在一些實施例中，另外之多肽序列賦予本發明之抗TIGIT sdAb一種或多種所需之性質或功能。
在一些實施例中，另外之多肽序列可包含特異性識別第二抗原決定基之第二抗體部分或第二抗原結合部分(例如sdAb、scFv、Fab、全長抗體)。在一些實施例中，第二抗原決定基來自TIGIT。在一些實施例中，第二抗原決定基不係來自TIGIT。在一些實施例中，第二抗體部分(或第二抗原結合部分)特異性識別TIGIT上與本文所述之抗TIGIT sdAb相同之抗原決定基。在一些實施例中，第二抗體部分(或第二抗原結合部分)特異性識別TIGIT上之與本文所述之抗TIGIT sdAb不同之抗原決定基。在一些實施例中，抗TIGIT構建體包含藉由可選之接頭(例如肽接頭)連接在一起之兩個或更多個本文所述之抗TIGIT-sdAb部分。連接在一起之兩個或更多個抗TIGIT-sdAb部分可以相同或不同。
在一些實施例中，額外之多肽序列可以增加抗體構建體之半衰期、溶解度或吸收，降低免疫原性或毒性，消除或減弱不期望之副作用，及/或與本文所述之抗TIGIT sdAb本身相比，賦予本發明之抗TIGIT構建體其他有利性質及/或減少其不希望之性質。此類另外之多肽序列之一些非限制性實例係血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA；參見例如WO 00/27435)或半抗原分子(例如被循環抗體識別之半抗原，參見例如WO 98/22141)。顯示將免疫球蛋白(例如VH域)之片段與血清白蛋白或其片段連接可以增加抗體半衰期(參見例如WO 00/27435及WO 01/077137)。因此，在一些實施例中，本發明之抗TIGIT構建體可包含視情況地經由合適之接頭(例如肽接頭)與血清白蛋白(或與其合適片段)連接之本文所述之抗TIGIT sdAb部分。在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT sdAb部分可以與至少包含血清白蛋白域III之血清白蛋白片段連接(參見 PCT/EP2007/002817)。抗TIGIT sdAb-HSA融合蛋白可以為任何形式，例如(sdAb)n-HSA(n係至少1之整數)、sdAb-HSA-sdAb等。
抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白
在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT sdAb部分可以視情況地經由接頭序列與一個或多個(較佳人)CH2及/或CH3域(例如Fc片段)連接，以增加其活體內半衰期。
因此，在一些實施例中，抗TIGIT構建體係抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，其包含與免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG及IgM之Fc片段融合之本文所述之抗TIGIT sdAb部分。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白包含IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之任一種)之Fc片段。在一些實施例中，Fc片段係人Fc，例如人IgG1(hIgG1)Fc、hIgG2Fc或hIgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段係無效應子的、具有減少的、最小化的或消除的抗體效應子功能，例如ADCC、CDC及/或ADCP(抗體依賴性細胞吞噬作用)。例如，在一些實施例中，無效應子Fc包含CH2區中之N297A或DANA突變(D265A+N297A)。在一些實施例中，無效應子之Fc包含K322A及L234A/L235A(LALA)突變。在一些實施例中，Fc片段係無效應子之(惰性)IgG1 Fc，例如無效應子之hIgG1 Fc。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白係單體的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白係二聚體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分及Fc片段視情況地藉由肽接頭連接。在一些實施例中，肽接頭為人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：370)。在一些實施例中，肽接頭為突變人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：371)。在一些實施例中，肽接頭為人類IgG4鉸鏈(SEQ ID NO：324)。在一些實施例中，肽接頭係hIgG2鉸鏈。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：372-378中之任一者，諸如SEQ ID NO：372或373之胺 基酸序列。
因此，例如，在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO： 176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，Fc片段係人IgG1 Fc、人無效應子IgG1 Fc、hIgG2 Fc或人IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白係單體的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白係二聚體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分及Fc片段視情況地藉由肽接頭連接。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，或其與SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中之任一者)序列同一性的變體，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，或其在VHH域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，VHH域中之胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中 之任一者之CDR，諸如CDR1，及/或CDR2，及/或CDR3中。在一些實施例中，VHH域中之胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之FR，諸如FR1，及/或FR2，及/或FR3，及/或FR4中。在一些實施例中，胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR及FR中。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3，並且其中抗TIGIT sdAb部分經由可選之接頭來融合至免疫球蛋白之Fc片段。在一些實施例中，Fc片段係人IgG1 Fc、無效應子之人IgG1 Fc、hIgG2 Fc或人IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白係單體的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白係二聚體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分及Fc片段視情況地藉由肽接頭連接。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其包含SEQ ID NO：288-294、306、308-311、315、317-319、321-322及365-367中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，亦提供了抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白(下文稱為「競爭性抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白」)，其與抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白、抗TIGIT sdAb或包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之抗TIGIT構建體中之任何一者競爭性地特異性結合TIGIT。可以使用ELISA測定來確定競爭性結合。例如，在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其競爭性地與包含SEQ ID NO：288-294、306、308-311、315、317-319、321-322及365-367中之任一者之胺基酸序列的抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質特異性地結合至TIGIT。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其競爭性地與包含抗TIGIT sdAb之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質特異性地結合至TIGIT，該抗TIGIT sdAb包括包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，提供抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質，其競爭性地與抗TIGIT sdAb(或包含抗TIGIT sdAb之抗TIGIT構建體)特異性地結合至TIGIT，該抗TIGIT sdAb包括包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列之CDR3。在一些實施例中，競爭性抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白質之Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，競爭性抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，競爭性抗TIGIT sdAb-Fc部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
多價及/或多特異性抗體
在一些實施例中，抗TIGIT構建體包含與一種或多種其他抗體部分或抗原結合部分(例如特異性識別另一抗原決定基之抗體部分)融合之本文所述之抗TIGIT sdAb部分。一種或多種其他抗體部分可以為任何抗體或抗體片段形式，例如全長抗體、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、scFv-scFv、微抗體，雙抗體或sdAb。在一些實施例中，一種或多種抗體部分(或抗原結合部分)包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。抗體片段可藉由各種技術製備，包括但不限於蛋白水解消化完整抗體以及如本文所述，藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生。
製備多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現，以及「孔中旋鈕(knob-into-hole)」工程；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體；例如，如Tutt等J.Immunol.147：60(1991)所述，製備三特異性抗體；以及產生包含串聯單域抗體之多肽。本文亦包括具有三個或更多個功能性抗原結合位點的改造抗體，包括「章魚抗體(Octopus antibody)」(參見例如US 2006/0025576A1)。
肽接頭
在一些實施例中，抗TIGIT構建體內之抗TIGIT sdAb及其他一個或多個抗體部分(例如全長抗體，sdAb或包含VH及VL之抗原結合部分)可以視情況地藉由肽接頭連接。抗TIGIT構建體中使用之肽接頭之長度、可撓性及/或其他性質可能對性質具有一些影響，該等性質包括但不限於對於一種或多種特定抗原或抗原決定基之親和力、特異性或親合力。例如，可以選擇較長之肽接頭以確保兩個相鄰之域不在空間上相互干擾。在一些實施例中，肽接頭包含撓性殘基(例如甘胺酸及絲胺酸)，使得相鄰之域相對於彼此自由移動。例如，甘胺酸 -絲胺酸雙聯體可以為合適之肽接頭。
肽接頭可具有任何合適之長度。在一些實施例中，肽接頭為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或更多個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中，肽接頭為不超過約100、75、50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更少個胺基酸長度中之任一者。在一些實施例中，肽接頭之長度為約1個胺基酸至約10個胺基酸，約1個胺基酸至約20個胺基酸，約1個胺基酸至約30個胺基酸，約5個胺基酸至約15個胺基酸，約10個胺基酸至約25個胺基酸，約5個胺基酸至約30個胺基酸，約10個胺基酸至約30個胺基酸長，約30個胺基酸至約50個胺基酸，約50個胺基酸至約100個胺基酸，或約1個胺基酸至約100個胺基酸中之任一者。
肽接頭可具有天然存在之序列或非天然存在之序列。例如，源自僅重鏈抗體之鉸鏈區之序列可用作接頭。參見例如WO1996/34103。在一些實施例中，肽接頭為人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：370)。在一些實施例中，肽接頭為突變人類IgG1鉸鏈(SEQ ID NO：371)。在一些實施例中，肽接頭為人類IgG4鉸鏈(SEQ ID NO：324)。在一些實施例中，肽接頭係人IgG2鉸鏈。在一些實施例中，肽接頭係柔性接頭。示例性柔性接頭包括甘胺酸聚合物(G)n(SEQ ID NO：374)，甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括，例如，(GS)n(SEQ ID NO：375)，(GSGGS)n(SEQ ID NO：376)，(GGGS)n(SEQ ID NO：377)，及(GGGGS)n(SEQ ID NO：378)，其中n為至少1之整數)，甘胺酸-丙胺酸聚合物，丙胺酸-絲胺酸聚合物，及在此項技術中已知之其他柔性接頭。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：372(GGGGSGGGS)或373(GGGGSGGGGSGGGGS)之胺基酸序列。
在一些實施例中，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分及一種或多種其他抗體部分(例如全長抗體，sdAb或包含VH及VL之抗原結合部分)之抗TIGIT 構建體係單特異性的。在一些實施例中，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分及一種或多種其他抗體部分(例如全長抗體，sdAb或包含VH及VL之抗原結合部分)之抗TIGIT構建體係多特異性的(如雙特異性)。多特異性分子係對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性之分子(例如，對兩個抗原決定基具有結合特異性的雙特異性抗體)。亦涵蓋了具有多於兩種價及/或特異性之多特異性分子。例如，可製備三特異性抗體。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。應理解，熟習此項技術者可選擇本文所述之各個多特異性分子之適當特徵以彼此組合以形成本發明之多特異性抗TIGIT分子。
在一些實施例中，抗TIGIT構建體係多價的但係單特異性的，即抗TIGIT構建體包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分及至少第二抗體部分(例如全長抗體，sdAb或包含VH及VL之抗原結合部分)，其特異性識別與本文所述之抗TIGIT sdAb部分相同TIGIT抗原決定基。在一些實施例中，特異性識別與本文所述之抗TIGIT sdAb部分相同TIGIT抗原決定基之一個或多個抗體部分可包含與抗TIGIT sdAb部分相同CDR及/或相同VHH胺基酸序列。例如，抗TIGIT構建體可包含兩個或更多個本文所述之抗TIGIT sdAb部分，其中兩個或更多個抗TIGIT sdAb部分相同，並且視情況地藉由肽接頭連接。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗TIGIT構建體係多價及多特異性的，即，抗TIGIT構建體包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分及至少第二抗體部分(例如全長抗體，sdAb或包含VH及VL之抗原結合部分)，其特異性識別除TIGIT外之第二抗原，或由本文所述之抗TIGIT sdAb部分識別之不同TIGIT抗原決定基。在一些實施例中，第二抗體部分係sdAb。在一些實施例中，第二抗體部分特異性識別人血清白蛋白(HSA)。在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT sdAb部分與第二抗體部分之N末端及/或C末端融合。在一些實施例中，抗TIGIT構建體係三價 及雙特異性的。在一些實施例中，抗TIGIT構建體包含本文所述之兩個抗TIGIT sdAb部分及第二抗體部分(例如抗HSA sdAb)，其中第二抗體部分位於兩個抗TIGIT sdAb部分之間。在一些實施例中，抗體部分視情況藉由肽接頭連接。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。
與本文所述之單個抗TIGIT sdAb部分相比，包含兩個或更多個抗TIGIT sdAb部分之單特異性或多特異性抗TIGIT構建體可具有增加之親合力。
包含與全長抗體融合之抗TIGIT sdAb部分之雙特異性抗體
在一些實施例中，抗TIGIT構建體包含與第二抗體部分融合之本文所述之抗TIGIT sdAb部分，其中第二抗體部分係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(例如抗PD-1或抗PD-L1全長抗體)。全長抗體之Fc片段可以為例如IgG1 Fc、無效應子IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，全長抗體係刺激性免疫檢查點分子之活化劑。在一些實施例中，全長抗體係免疫檢查點抑制劑，例如PD-1或PD-L1之抑制劑。
包含針對TIGIT及PD-1之雙特異性之構建體在下文中稱為「抗TIGIT/PD-1抗體」，「抗TIGIT/PD-1構建體」，「PD-1×TIGIT抗體」或「PD-1×TIGIT BABP」。包含針對TIGIT及PD-L1之雙特異性之構建體在下文中稱為「抗TIGIT/PD-L1抗體」，「抗TIGIT/PD-L1構建體」，「PD-L1×TIGIT抗體」或「PD-L1×TIGIT BABP」。
與TIGIT類似，PD-1及PD-L1係抑制性免疫檢查點分子。
PD-1係調節T細胞活化及耐受之B7/CD28家族共刺激分子之一部分，因此拮抗性抗PD-1抗體可用於克服耐受性。PD-1已被定義為B7-4之受體。B7-4在與免疫細胞上之抑制性受體結合後可以抑制免疫細胞之活化。 PD-1/PD-L1途徑之參與導致T細胞效應子功能、細胞因子分泌及增殖之抑制。(Turnis等，OncoImmunology 1(7)：1172-1174,2012)。高水準之PD-1與耗盡或慢性刺激之T細胞相關。此外，增加之PD-1表現與癌症患者之存活率降低相關。用於下調PD-1，B7-4以及免疫細胞中B7-4及PD-1抑制信號之間之相互作用之試劑可以導致免疫應答之增強。可應用於本申請案之示例性抗PD-1抗體包括但不限於派姆單抗(pembrolizumab)(例如Keytruda®)，PD1-BM-min及納武單抗(nivolumab)(例如Opdivo®)。
PD-L1(程序性細胞死亡-配體1)亦稱為分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。在特定事件(例如妊娠，組織異體移植，自體免疫疾病及其他疾病狀態，例如肝炎及癌症)期間，PD-L1充當PD-1在抑制免疫系統中起主要作用之配體。PD-1受體/PD-L1配體複合物之形成傳遞抑制信號，其降低淋巴結處CD8+ T細胞之增殖。可應用於本申請案之示例性抗PD-L1抗體包括但不限於阿特珠單抗(例如，Tecentriq®)，度伐單抗(例如，MEDI4736，IMFINZITM)，阿維單抗(avelumab)(例如，Bavencio®)及h53C1(人源化53C1)。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈。
在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列；或其在CDR區域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代係在CDR1及/或CDR2中。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其 中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，或其與SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中之任一者)序列同一性的變體。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，或其在VHH域中包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR，諸如CDR1，及/或CDR2，及/或CDR3中。在一些實施例中，胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之FR，諸如FR1，及/或FR2，及/或FR3，及/或FR4中。在一些實施例中，胺基酸取代在SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR及FR中。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：385之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：386之VL。在一些實施例中，抗PD-1 抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：325之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：326之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：387之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：388之VL。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：406之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：407之VL。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段係hIgG1 Fc、無效應子之hIgG1 Fc、hIgG2 Fc或hIgG4 Fc。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至全長抗體之重鏈中之至少一者之C末端。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至全長抗體之輕鏈中之至少一者之C末端。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至全長抗體之輕鏈中之至少一者之N末端。在一些實施例中，抗TIGIT構建體包含本文所述之四個抗TIGIT sdAb部分，並且抗TIGIT sdAb部分之C末端與全長抗體之重鏈及輕鏈之N末端融合(如圖21所示)。在一些實施例中，抗TIGIT構建體包含本文所述之四個抗TIGIT sdAb部分，其中兩個抗TIGIT sdAb部分經由第一可選之接頭融合在一起，並且另外兩個抗TIGIT sdAb部分經由第二可選之接頭融合在一起，其中每組兩個抗TIGIT sdAb融合體之C末端經由第三及第四可選之接頭與全長抗體之每條重鏈之N末端融合(如圖22所示)。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分及全長 抗體視情況地藉由肽接頭連接。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391或395之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：394(在下文指示為「BTP-11」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-1全長抗體之兩條重鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-1全長抗體之重鏈中之至少一者之C末端，其中抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391或397之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：396(在下文指示為「BTP-12」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-1全長抗體之兩條重鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-1全長抗體之輕鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390或398之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391之輕鏈，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：399(在下文指示為「BTP-13」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-1全長抗體之兩條輕鏈之N末端。在 一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-1全長抗體之輕鏈中之至少一者之C末端，其中抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：390或400之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：391之輕鏈，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：401(在下文指示為「BTP-14」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-1全長抗體之兩條輕鏈之C末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包括包含SEQ ID NO：394及396中之任一者之胺基酸序列的重鏈融合多肽之兩個相同複本，及包含SEQ ID NO：391、395或397中之任一者之胺基酸序列的輕鏈之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT構建體具有如圖17及18所示之結構。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包括包含SEQ ID NO：390、398或400中之任一者之胺基酸序列的重鏈之兩個相同複本，及包含SEQ ID NO：399或401之胺基酸序列的輕鏈融合多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT構建體具有如圖19及20所示之結構。
因此，在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：381之胺基酸 序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列的VHH域，或其與SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者具有至少約80%(諸如至少約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%中之任一者)序列同一性的變體；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之VHH域；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、 LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，全長抗體之Fc片段包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：333之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：334之輕鏈。
在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332或348之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：347(在下文指示為「BTP-7」)。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：333之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：334或346之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：345(在下文指示為「BTP-6」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條重鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包括包含SEQ ID NO：345或347之胺基酸序列的重鏈融合 多肽之兩個相同複本，及包含SEQ ID NO：332、334、346及348中之任一者之胺基酸序列的輕鏈之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT構建體具有如圖17所示之結構。
在根據本文所述之抗TIGIT/抗PD-L1構建體中之任一者的一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。
在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330或342之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：341(在下文指示為「BTP-4」)。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：327之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328或344之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：343(在下文指示為「BTP-5」)。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328或358之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：357(在下文指示為「BTP-15」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條重鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之C末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328或360之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：359(在下文指示為「BTP-16」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條重鏈之C末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之輕鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或361之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：362(在下文指示為「BTP-17」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條輕鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-L1全長抗體之輕鏈中之至少一者之C末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或363之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：364(在下文指示為「BTP-18」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之N末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條輕鏈之C末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之重鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO： 329之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330或403之輕鏈，並且其中重鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：402(在下文指示為「BTP-21」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條重鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之輕鏈中之至少一者之N末端，其中抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329或404之重鏈，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈，並且其中輕鏈融合多肽包含胺基酸序列SEQ ID NO：405(在下文指示為「BTP-22」)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分之C末端融合至抗PD-L1全長抗體之兩條輕鏈之N末端。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包括包含SEQ ID NO：341、343、357、359及402中之任一者之胺基酸序列的重鏈融合多肽之兩個相同複本，及包含SEQ ID NO：328、330、342、344、358、360及403中之任一者之胺基酸序列的輕鏈之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT構建體具有如圖17及18所示之結構。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包括包含SEQ ID NO：323、329、361、363及404中之任一者之胺基酸序列的重鏈之兩個相同複本，及包含SEQ ID NO：362、364及405中之任一者之胺基酸序列的輕鏈融合多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT構建體具有如圖19及20所示之結構。
在根據本文所述之抗TIGIT/抗PD-L1構建體中之任一者的一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287 中之任一者之胺基酸序列之VHH域；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
在根據本文所述之抗TIGIT/抗PD-L1構建體中之任一者的一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之VHH域；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，提供分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分及抗PD-L1全長抗體，其中sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3；並且其中抗PD-L1全長抗體包含VH，該VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。
在一些實施例中，亦提供了抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分(下文中稱為「競爭性抗TIGIT構建體」)，其與本文所述之任何一種抗TIGIT構建體競爭性地特異性結合TIGIT(諸如抗TIGIT sdAb部分，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之多特異性或單特異性抗TIGIT構建體，例如本文描述之PD-1×TIGIT BABP或PD-L1×TIGIT BABP)。
抗TIGIT多特異性抗原結合蛋白(MABP)
本申請案通常提供抗TIGIT構建體，其包含與全長抗體或包含VH及VL之抗原結合片段融合之本文所述之抗TIGIT sdAb部分，其中抗TIGIT構建體係多特異性的(下文稱為「多特異性抗TIGIT構建體」或「抗TIGIT多特異性抗原結合蛋白(MABP)」)。在一些實施例中，抗TIGIT MABP係雙特異性的(下文中稱為「雙特異性抗TIGIT構建體」或「抗TIGIT雙特異性抗原結合蛋白(BABP)」)。抗TIGIT sdAb部分特異性結合TIGIT，其不同於由全長抗體或包含VH及VL之抗原結合片段識別之靶標，從而賦予擴展之靶向能力。由於sdAb之小尺寸，在一些實施例中，與全長抗體或抗原結合片段組分相比，本文所述之抗TIGIT MABP(或BABP)可具有相似之分子量及藥代動力學性質。例如，可以藉由以下方式來設計抗TIGIT MABP：將一種或多種抗TIGIT sdAb部分與單株抗體融合，單株抗體具有經證實之臨床功效及安全性，以提供增加之臨床益處及期望之藥代動力學性質，而不妨礙多特異性構建體之可表現性。在一些實施例中，藉由可選之肽接頭將本文所述之一種或多種抗TIGIT sdAb部分與全長抗體或抗原結合片段融合。可採用本文所述之抗TIGIT MABP(或BABP)來靶向除TIGIT之外之多種疾病相關抗原決定基或抗原組合，諸如TIGIT與免疫檢查點分子、細胞表面抗原(諸如腫瘤抗原)或促炎分子之組合，從而提供可用於治療多種疾病及病症，諸如癌症、炎症及自體免疫疾病之藥劑。抗TIGIT MABP可以為 任何形式，諸如PCT/CN2017/093644中揭示之彼等，該專利以引用方式整體併入本文。
因此，例如，在一些實施例中，提供抗TIGIT構建體(例如，MABP或BABP)，該構建體包含：(a)第一抗原結合部分，其包含抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)包含VH及VL之第二抗原結合部分，其中VH及VL一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1、PD-L1)之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分與第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供抗TIGIT構建體(例如，MABP或BABP)，該構建體包含：(a)第一抗原結合部分，其包含抗TIGIT sdAb部分，該部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3，及(b)包含VH及VL之第二抗原結合部分，其中VH及VL一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1、PD-L1)之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分與第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，第二抗原決定基係免疫檢查點分子(例如，PD-1，PD-L1)。在一些實施例中，第二抗原決定基係促炎分子。在一些實 施例中，第二抗原決定基係細胞表面抗原(諸如腫瘤抗原，或免疫效應細胞上之細胞表面抗原)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH之重鏈及含有VL之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分在重鏈之N末端、輕鏈之N末端、Fc區之N末端、重鏈之C末端或輕鏈之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fab或scFv。在一些實施例中，第一抗原結合部分在Fab或scFv之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含全長4鏈抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含抗PD-1全長抗體。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或Fab、scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：385之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：386之VL。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：325之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：326之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或Fab、scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：387之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：388之VL。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或Fab、scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：406之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：407之VL。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含抗PD-L1全長抗體(或Fab，scFv)。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或 Fab、scFv)包含VH，該VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：381之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：382之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：333之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：334之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包含VH，該VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：379之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：380之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包含VH，該VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：383之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：384之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO： 323或327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分化學融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分經由肽接頭與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，肽接頭長度不超過約30個(諸如不超過約25、20或15個中之任一者)胺基酸。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合片段包含Fc區，諸如IgG1 Fc、無效應子之IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，第二抗原結合片段包括包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列之Fc區域。
在一些實施例中，抗TIGIT構建體(例如，MABP或BABP)包含可以特異性結合至少兩個不同抗原決定基之至少兩個抗原結合部分。至少兩個抗原結合部分中之一些可以為相同的，只要MABP具有兩個不同抗原決定基之結合位點即可。抗TIGIT MABP(或BABP)可以為對稱的或不對稱的。例如，抗TIGIT MABP(或BABP)可包含含有本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之一至八個複本，及包含VH及VL之第二抗原結合部分之一個或兩個複本。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個不同的抗原結合部分，每個抗原結合部分包含VH域及VL域，它們一起形成不同的抗原結合位點。例如，第二抗原結合部分可以為雙特異性抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分係單特異性全長抗體或其抗原結合片段，諸如Fab或scFv。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含1、2、3、4、5、6、7、8或更多種不同的抗原結合部分中之任一者，每種抗原結合部分包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分。在一些實施例中，兩個相同抗TIGIT sdAb部分彼此融合，其進一步與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，兩個不同的抗TIGIT sdAb部分彼此融合，其進一步與第二抗原結合部分融合。
抗TIGIT構建體(例如MABP)可具有針對TIGIT及/或第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之任何合適數量之價數，以及任何合適數量之特異性。在一些實施例中，MABP(或BABP)係針對TIGIT之二價、三價、四價、五價、六價或更高價。在一些實施例中，MABP(或BABP)係針對第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之二價、三價、四價、五價、六價或更高價。在一些實施例中，MABP係雙特異性的(例如，PD-1×TIGIT BABP，PD-L1×TIGIT BABP)。示例性BABP描繪於圖17-26中。在一些實施例中，MABP係三特異性的。在一些實施例中，MABP係四特異性的。在一些實施例中，MABP具有超過四種特異性。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一抗原結合部分之一或多個複本(諸如2個)，其包含抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)包含VH及VL之第二抗原結合部分之單一複本，其中VH及VL一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1、PD-L1)之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分之每個複本融合至第二抗原結合部分。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP，其包含：(a)複數個(諸如2、3、4、5、6、7、8、或更多個)相同或不同抗TIGIT sdAb部分，其包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之 胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)複數個(諸如2、3、4、5、6、或更多個)包含VH及VL之第二抗原結合部分，其中VH及VL一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1、PD-L1)之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分彼此融合，及/或融合至第二抗原結合部分。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，一個或多個抗TIGIT sdAb部分各自進一步與另一個相同或不同的抗TIGIT sdAb部分融合。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含抗PD-1全長抗體(或Fab，scFv)。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體(或Fab、scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1全長抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分經由肽接頭彼此融合。在一些實施例中，第一抗 原結合部分經由肽接頭與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合片段包含Fc區，諸如IgG1 Fc、無效應子之IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，第二抗原結合片段包括包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列之Fc區域。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(諸如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分之單一複本，其包含抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)各自包含VH及VL之第二抗原結合部分之兩個複本，其中VH及VL一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1、PD-L1)之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分融合至第二抗原結合部分之兩個複本中之一者。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分之兩個複本，其各自包含抗TIGIT sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者) 胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)各自包含VH及VL之第二抗原結合部分之兩個複本，其中VH及VL一起形成特異性結合第二抗原決定基(例如，PD-1、PD-L1)之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分之一個複本融合至第二抗原結合部分之每個複本(如圖17-20、23及24例示)。在一些實施例中，一個或多個抗TIGIT sdAb各自進一步與另一種相同或不同的抗TIGIT sdAb部分融合。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。
a)融合多肽
抗TIGIT MABP(或BABP)之包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分與包含VH及VL之第二抗原結合部分彼此融合(即，共價連接)。因此，本申請案之抗TIGIT MABP(或BABP)包含一個或多個融合多肽。每個融合多肽可包括包含本文所述之抗TIGIT sdAb之第一抗原結合部分及來自第二抗原結合部分之多肽。
包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分及包含VH 及VL之第二抗原結合部分可以藉由單個化學鍵(諸如肽鍵)或經由肽接頭直接連接。包含抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分可以在第二抗原結合部分之任何一個(包括每個)多肽之N末端或C末端融合，或者可以在第二抗原結合部分之任何一個(包括每個)多肽之內部位置融合，諸如在第二抗原結合部分之重鏈Fc區之N末端。融合多肽可以重組或化學方式獲得。在一些實施例中，包含抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之C末端經由化學鍵(諸如肽鍵)或肽接頭與第二抗原結合部分之任何(包括每個)多肽之N末端融合。在一些實施例中，包含抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之N末端經由化學鍵(諸如肽鍵)或肽接頭與第二抗原結合部分之任何(包括每個)多肽之C末端融合。在一些實施例中，包含抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分經由化學鍵與第二抗原結合部分融合，該化學鍵不係涉及胺基酸主鏈化學基團之肽鍵。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH及VL之單鏈抗體片段。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含scFv。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含在N末端至C末端方向包含以下各者之融合多肽：包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分，可選之肽接頭，VH域及VL域。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含在N末端至C末端方向包含以下各者之融合多肽：包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分，可選之肽接頭，VL域及VH域。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含在N末端至C末端方向包含以下各者之融合多肽：VH域，VL域，可選之肽接頭，及包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含在N末端至C末端方向包含以下各者之融合多肽：VL域，VH域，可選之肽接頭，及包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含含有VH域之重鏈及含有 VL域之輕鏈。在一些實施例中，重鏈亦包含一個或多條重鏈恆定域，例如CH1、CH2、CH3及CH4，及/或抗體鉸鏈區(HR)。在一些實施例中，輕鏈亦包含輕鏈恆定域(CL)，諸如λCL域或κCL域。在一些實施例中，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之N末端與重鏈之C末端融合。在一些實施例中，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之C末端與重鏈之N末端融合。在一些實施例中，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之N末端與輕鏈之C末端融合。在一些實施例中，包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分之C末端與輕鏈之N末端融合。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含從N末端至C末端包含以下各者之第一多肽：重鏈，可選之肽接頭，及包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分；及包含輕鏈之第二多肽。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含從N末端至C末端包含以下各者之第一多肽：包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分，可選之肽接頭，及重鏈；及包含輕鏈之第二多肽。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含從N末端至C末端包含以下各者之第一多肽：輕鏈，可選之肽接頭，及包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分；及包含重鏈之第二多肽。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含從N末端至C末端包含以下各者之第一多肽：包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分，可選之肽接頭，及輕鏈；及包含重鏈之第二多肽。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽及兩個相同本文所述之第二多肽。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(例如，抗PD-1或抗PD-L1全長抗體)。在一些實施例中，全長抗體係由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈組成之全長單株抗體。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個多肽從N末端至C末端 包含以下各者：重鏈，可選之肽接頭，及包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分；及兩個相同第二多肽，每個包含輕鏈(參見例如圖18)。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，各自從N末端至C末端包含以下各者：包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分，可選之肽接頭，及重鏈；及兩個相同第二多肽，每個包含輕鏈(參見例如圖17)。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：輕鏈，可選之肽接頭，及包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分；及兩個相同第二多肽，每個包含重鏈(參見例如圖20)。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，各自從N末端至C末端包含：包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之第一抗原結合部分，可選之肽接頭，及輕鏈；及兩個相同包含重鏈之第二多肽(參見例如圖19)。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含：(a)由第一及第二重鏈以及第一及第二輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)；(b)本文所述之第一抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第二抗原決定基；(c)本文所述之第二抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第三抗原決定基；(d)本文所述之第三抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第四抗原決定基；(e)本文所述之第四抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第五抗原決定基；其中第一抗TIGIT sdAb部分之C末端與第一輕鏈之N末端融合，其中第二抗TIGIT sdAb部分之C末端與第二輕鏈之N末端融合，其中第三抗TIGIT sdAb部分之C末端與第一重鏈之N末端融合，並且其中第四抗TIGIT sdAb部分之C末端與第二重鏈之N末端融合。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係不同的。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個從N末端至C末端包含 以下各者：第三或第四抗TIGIT sdAb部分，可選之肽接頭，及重鏈；及兩個相同第二多肽，每個包含第一或第二抗TIGIT sdAb部分，可選之肽接頭及輕鏈。參見例如圖21。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含：(a)由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)；(b)本文所述之第一抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第二抗原決定基；(c)本文所述之第二抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第三抗原決定基；(d)本文所述之第三抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第四抗原決定基；(e)本文所述之第四抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第五抗原決定基；其中第一抗TIGIT sdAb部分之C末端與第二抗TIGIT sdAb部分之N末端融合，並且第二抗TIGIT sdAb部分之C末端與一條重鏈之N末端融合，且其中第三抗TIGIT sdAb部分之C末端與第四抗TIGIT sdAb部分之N末端融合，並且第四抗TIGIT sdAb部分之C末端與另一條重鏈之N末端融合。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係不同的。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：第一或第三抗TIGIT sdAb部分，可選之肽接頭，第二或第四抗TIGIT sdAb部分，可選之肽接頭及重鏈；及兩個相同第二多肽，每個包含輕鏈。參見例如圖22。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含：(a)由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)；(b)本文所述之第一抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第二抗原決定基；(c)本文所述之第二抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第三抗原決定基，其中第一或第二抗TIGIT sdAb部分之N末端與重鏈之CH1區之C末端融合，並且第一或第二抗TIGIT sdAb部分之C末端與重鏈之CH2區之N末端融合。在一 些實施例中，兩個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，兩個抗TIGIT sdAb部分係不同的。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：VH-CH1-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3；及兩個相同第二多肽，每個包含輕鏈。參見例如圖23。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含：(a)特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一scFv；(b)特異性識別第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二scFv；(c)Fc區；(d)本文所述之第一抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第三抗原決定基；(d)本文所述之第二抗TIGIT sdAb部分，其特異性識別第四抗原決定基，其中每個抗TIGIT sdAb部分之N末端與scFv之C末端並且抗TIGIT sdAb部分之C末端與Fc區之N末端融合。在一些實施例中，兩個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，兩個抗TIGIT sdAb部分係不同的。在一些實施例中，兩個scFv係相同的。在一些實施例中，兩個scFv係不同的。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：scFv-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3，諸如VH-VL-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3，或VL-VH-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3。參見例如圖24。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含：(a)特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一Fab；(b)特異性識別第二抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第二Fab；(c)Fc區；(d)第一Fab樣域，其包含本文所述之特異性識別第三抗原決定基之第一抗TIGIT sdAb部分，及本文所述之特異性識別第四抗原決定基之及第二抗TIGIT sdAb部分；(c)第二Fab樣域，其包含本文所述之特異性識別第五抗原決定基之第三抗TIGIT sdAb部分，及本文所述之特異性識別第六抗原決定基之第四抗TIGIT sdAb部分，其中每個Fab樣域之N末端與Fab之C末端融合，並且Fab樣域之兩個C末端之一與Fc區之N末端融合。 在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係不同的。在一些實施例中，兩個Fab係相同的。在一些實施例中，兩個Fab係不同的。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：VH-CH1-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CH1-CH2-CH3；及兩個相同第二多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：VL-CL-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CL。參見例如圖25。
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含：(a)特異性識別第一抗原決定基(例如，PD-1，PD-L1)之第一scFv；(b)特異性識別第二抗原決定基(例如PD-1，PD-L1)之第二scFv；(c)Fc區；(d)第一Fab樣域，其包含本文所述之特異性識別第三抗原決定基之第一抗TIGIT sdAb部分，及本文所述之特異性識別第四抗原決定基之第二抗TIGIT sdAb部分；(e)第二Fab樣域，其包含本文所述之特異性識別第五抗原決定基之第三抗TIGIT sdAb部分，及本文所述之特異性識別第六抗原決定基之第四抗TIGIT sdAb部分，其中每個Fab樣域之兩個N末端中之一個與scFv之C末端融合，並且Fab樣域之兩個C末端之一與Fc區之N末端融合。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係相同的。在一些實施例中，四個抗TIGIT sdAb部分係不同的。在一些實施例中，兩個scFv係相同的。在一些實施例中，兩個scFv係不同的。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(或BABP)包含兩個相同第一多肽，每個多肽從N末端至C末端包含以下各者：scFv-可選之肽接頭-抗TIGIT sdAb部分-CH1-CH2-CH3；及兩個相同第二多肽，每個從N末端至C末端包含以下各者：抗TIGIT sdAb部分-CL。在一些實施例中，scFv從N末端至C末端包含以下各者：VH-VL或VL-VH。參見例如圖26。
本文所述之抗TIGIT MABP(或BABP)可包含位於第一抗原結合部分及第二抗原結合部分之間之一個或多個肽接頭。在一些實施例中，第二抗原結 合部分之重鏈多肽及第一抗原結合部分之間之肽接頭與第二抗原結合部分之輕鏈多肽及第一抗原結合部分之間之肽接頭相同。在一些實施例中，第二抗原結合部分之重鏈多肽與第一抗原結合部分之間之肽接頭不同於第二抗原結合部分之輕鏈多肽與第一抗原結合部分之間之肽接頭。在一些實施例中，第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此直接融合，其間沒有設置肽接頭。兩個或更多個抗TIGIT sdAb部分之間之肽接頭可以與抗TIGIT sdAb部分及第二抗原結合部分之間之肽接頭相同或不同。上文「肽接頭」部分中描述之任何肽接頭可用於本文所述之任何抗TIGIT MABP(或BABP)中。
b)包合V H 及V L 之第二抗原結合部分
抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含至少一個包含VH及VL之第二抗原結合部分。此抗原結合部分可以為由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長常規抗體，或由其衍生之抗原結合片段。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係抗原結合片段，其包含含有VH域之重鏈及含有VL域之輕鏈。本文涵蓋的示例性抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(諸如scFv)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含Fc區，諸如人Fc區。在一些實施例中，Fc區源自IgG分子，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類中之任一種。在一些實施例中，Fc區能夠介導抗體效應子功能，諸如ADCC及/或CDC。例如，具有野生型Fc序列之亞類IgG1、IgG2及IgG3之抗體通常顯示包括CIq及C3結合之補體活化，而IgG4不活化補體系統並且不結合CIq及/或C3。在一些實施例中，Fc區包含降低Fc區與Fc受體之結合親和力之修飾。在一些實施例中，Fc區係IgG1 Fc。在一些實施例中，IgG1 Fc包含233-236位之一個或多個突變，諸如L234A及/或L235A。在一些實施例中，Fc區係無效應子之 IgG1 Fc。在一些實施例中，Fc區係IgG4 Fc。在一些實施例中，IgG4 Fc包含位置327、330及/或331之突變。參見例如Armour KL等，Eur J.Immunol.1999；29：2613；及Shields RL等，J.Biol.Chem.2001；276：6591。在一些實施例中，Fc區包含P329G突變。在一些實施例中，Fc區域包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc區包含促進兩條不相同重鏈之異二聚化之修飾。此等修飾之Fc區對於具有不對稱設計之本文所述之抗TIGIT MABP(例如，BABP)可能係特別受關注的。在一些實施例中，該修飾係孔中旋鈕修飾，其包含重鏈或重鏈融合多肽之一中之旋鈕修飾及兩條重鏈或重鏈融合多肽中之另一條中之孔修飾。在一個實施例中，Fc區包含CH3域中兩條重鏈之間界面內之修飾，其中i)在一條重鏈之CH3域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積之胺基酸殘基取代，從而在一條重鏈之CH3域之界面內產生突起(「旋鈕」)，其可定位在另一條重鏈之CH3域中之界面內之空腔(「孔」)中，並且ii)在另一條重鏈之CH3域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積之胺基酸殘基取代，從而在第二CH3域之界面內產生空腔(「孔」)，其中第一個CH3域中之界面內之突起(「旋鈕」)係可定位的。例如，在US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431及Zhu等，1997,Protein Science 6：781-788中描述了孔中旋鈕修改之實例。本文亦涵蓋了促進異二聚化之對Fc區之其他修飾。例如，可以將靜電轉向效應設計到Fc區中以提供Fc-異二聚體分子(參見例如US4676980及Brennan等，Science,229：81(1985))。
在一些實施例中，Fc區包含抑制Fab臂交換之修飾。例如，IgG4 Fc中之S228P突變阻止Fab臂交換。
在一些實施例中，第二抗原結合部分包含κ輕鏈恆定區。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含λ輕鏈恆定區。在一些實施例中，第二抗原結 合部分包含重鏈恆定區。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之單株抗體(在本文中亦稱為「4鏈抗體」)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之多特異性(諸如雙特異性)全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人IgG1亞類、無效應子之hIgG1亞類或具有突變L234A及L235A之人IgG1亞類之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人IgG2亞類之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人IgG3亞類之全長抗體。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人IgG4亞類之全長抗體或具有額外突變S228P之人IgG4亞類之全長抗體。在一些實施例中，全長抗體之Fc區域包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。
此項技術已知之任何全長4鏈抗體或由其衍生之抗原結合片段可用作抗TIGIT MABP(例如BABP)之第二抗原結合部分。具有經證實之臨床功效、安全性及藥代動力學特徵之抗體或抗體片段係特別令人關注的。在一些實施例中，對此項技術已知之抗體或抗體片段進一步改造，諸如人源化或誘變以選擇具有合適親和力之變體，然後與第一抗原結合部分融合以提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含此項技術已知之單株抗體或抗體片段之VH及VL域，及修飾之重鏈恆定區及/或輕鏈恆定區。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含此項技術已知之單株抗體及修飾之Fc區，諸如具有S228P突變之IgG4 Fc，或無效應子之IgG1 Fc。在一些實施例中，第二抗原結合部分包含人、人源化或嵌合全長抗體或抗體片段。
在一些實施例中，第二抗原結合部分係抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)。在一些實施例中，抗PD-1抗體係派姆單抗(例如， Keytruda®)，PD1-BM-min或納武單抗(例如，Opdivo®)。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：385之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：386之VL。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：325之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：326之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：387之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：388之VL。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含VH，其包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：406之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：407之VL。在一些實施例中，第二抗原結合部分係抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)。在一些實施例中，抗PD-L1抗體係阿特珠單抗(例如，Tecentriq®)，度伐單抗(例如，MEDI4736，IMFINZITM)，阿維單抗(例如，Bavencio®)或人源化53C1(h53C1)。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含VH，該VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1抗體 或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：381之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：382之VL。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：333之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：334之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含VH，該VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：379之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：380之VL。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含VH，該VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，該VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：383之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：384之VL。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如，Fab或scFv)包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段(例如Fab或scFv)包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸 序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈。
c)示例性抗TIGIT MABP及BABP
在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別TIGIT之sdAb部分，及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合(下文中稱為「PD-1×TIGIT BABP」或「TIGIT×PD-1 BABP」)。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含(a)第一抗原結合部分，其包含本文所述之特異性識別TIGIT之sdAb部分，及(b)第二抗原結合部分，其包含VH及VL，其中VH及VL一起形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合(下文中稱為「PD-L1×TIGIT BABP」或「TIGIT×PD-L1 BABP」)。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(諸如派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗)，其中全長抗體特異性結合PD-1：並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供抗 TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-1；其中全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：385之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：386之VL。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：325之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：326之輕鏈。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或 其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-1；其中全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2、及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2、及LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：387之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：388之VL。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-1；其中全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：406之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：407之VL。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含 SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，第一抗原結合部分在兩條重鏈中之一條或每條之N末端，兩條輕鏈中之一條或每條之N末端，Fc區之N末端，兩條重鏈中之一條或每條之C末端，或兩條輕鏈中之一條或每條之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分化學融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分經由肽鍵或肽接頭與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，肽接頭長度不超過約30個(例如不超過約25、20或15個中之任一者)胺基酸。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，全長抗體之Fc區可以為例如IgG1 Fc、無效應子之IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc區域包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、 135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體(諸如阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1)，其中全長抗體特異性結合PD-L1；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-L1；其中全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：381之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：382之VL。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：331之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：332之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序 列SEQ ID NO：333之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：334之輕鏈。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-L1；其中全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：379之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：380之VL。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3 個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-L1；其中全長抗體包含VH，其包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列之HC-CDR1、HC-CDR2及HC-CDR3，及VL，其包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列之LC-CDR1、LC-CDR2及LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：383之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：384之VL。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一抗原結合部分，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，該部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體，及(b)第二抗原結合部分，其包含由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體，其中全長抗體特異性結合PD-L1；其中全長抗體包含1)VH，其包括包含SEQ ID NO：349之胺基酸序列之HC-CDR1、包含SEQ ID NO：350之胺基酸序列之HC-CDR2及包含SEQ ID NO：351之胺基酸序列之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含SEQ ID NO：352之胺基酸序列之LC-CDR1、包含SEQ ID NO：353之胺基酸序列之LC-CDR2及包含SEQ ID NO：354之胺基酸序列之LC-CDR3；並且其中第一抗原結合部分及第二抗原結合部分彼此融合。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施 例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：323或327之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：328之輕鏈。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：329之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：330之輕鏈。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，第一抗原結合部分在兩條重鏈中之一條或每條之N末端，兩條輕鏈中之一條或每條之N末端，Fc區之N末端，兩條重鏈中之一條或每條之C末端，或兩條輕鏈中之一條或每條之C末端與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分與第二抗原結合部分化學融合。在一些實施例中，第一抗原結合部分經由肽鍵或肽接頭與第二抗原結合部分融合。在一些實施例中，肽接頭長度不超過約30個(例如不超過約25、20或15個中之任一者)胺基酸。在一些實施例中，肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，全長抗體之Fc區可以為例如IgG1 Fc、無效應子之IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。在一些實施例中，Fc區域包含SEQ ID NO：355、356及389中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3-抗TIGIT sdAb部分；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，CH3及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例 中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：396之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：397之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-1×TIGIT BABP具有如圖18所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3-抗TIGIT sdAb部分；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210 中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，CH3及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：359之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：360之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中， PD-L1×TIGIT BABP具有如圖18所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324 及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：394之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：395之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-1×TIGIT BABP具有如圖17所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210 中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：345之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：346之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中， 抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：347之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：348之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：341之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：342之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：343之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：344之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：357之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：358之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：402之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：403之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT BABP具有如圖17所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL-抗TIGIT sdAb部分，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、 63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，CL及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：400之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：401之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-1×TIGIT BABP具有如圖20所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL-抗TIGIT sdAb部分，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO： 36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384 之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，CL及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：363之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：364之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT BABP具有如圖20所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb部分-VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、 63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，VL及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：398之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：399之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-1×TIGIT BABP具有如圖19所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb部分-VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO： 36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384 之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，VL及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：361之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：362之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含(a)包含SEQ ID NO：404之胺基酸序列的第一多肽之兩個相同複本，及(b)包含SEQ ID NO：405之胺基酸序列的第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT BABP具有如圖19所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb1部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb2部分-VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、 209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，VL及抗TIGIT sdAb2部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，VH及抗TIGIT sdAb1部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、 部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖21所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb1部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb2部分-VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體 包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，VL及抗TIGIT sdAb2部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，VH及抗TIGIT sdAb1部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖21所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb1部分-抗TIGIT sdAb2部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中 VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分與抗TIGIT sdAb2部分，及/或VH與抗TIGIT sdAb2部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及 370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgGI Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖22所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb1部分-抗TIGIT sdAb2部分-VH-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、 209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分與抗TIGIT sdAb2部分，及/或VH與抗TIGIT sdAb2部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱 駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖22所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些 實施例中，CH1及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-1×TIGIT BABP具有如圖23所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域， 其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，CH1及抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT BABP具有如圖23所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含多肽，該多肽從N末端至C末端包含：VL-VH-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3，其中VL及VH一起形 成特異性結合PD-1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含多肽，該多肽從N末端至C末端包含：VH-VL-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3，其中VL及VH一起形成特異性結合PD-1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一 者之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，形成scFv之VH與VL，及/或scFv與抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含兩個相同多肽複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-1×TIGIT BABP具有如圖24所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含多肽，該多肽從N末端至C末端包含：VL-VH-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3，其中VL及VH一起形成特異性結合PD-L1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT BABP，其包含多肽，該多肽從N末端至C末 端包含：VH-VL-抗TIGIT sdAb部分-CH2-CH3，其中VL及VH一起形成特異性結合PD-L1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，scFv(或形成scFv之VL及VH)源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。 在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，形成scFv之VH與VL，及/或scFv與抗TIGIT sdAb部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT BABP包含兩個相同多肽複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT BABP具有如圖24所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-抗TIGIT sdAb1部分-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL-抗TIGIT sdAb2部分-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中， 抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，CH1與抗TIGIT sdAb1部分，及/或CL與抗TIGIT sdAb2部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖25所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a) 第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-CH1-抗TIGIT sdAb1部分-CH1-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：VL-CL-抗TIGIT sdAb2部分-CL，其中VH及VL形成特異性結合PD-L1之抗原結合位點，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352 之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，CH1與抗TIGIT sdAb1部分，及/或CL與抗TIGIT sdAb2部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖25所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VL-VH-抗TIGIT sdAb1部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb2部分-CL，其中VL及VH形成特異性結合PD-1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO： 106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-VL-抗TIGIT sdAb1部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb2部分-CL，其中VL及VH形成特異性結合PD-1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域(或scFv)源自派姆單抗、PD1-BM-min或納武單抗。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列。在一些實施例中，形成scFv之VH與VL，及/或scFv與抗TIGIT sdAb1部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖26所示之結構。
在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VL-VH-抗TIGIT sdAb1部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb2部分-CL，其中VL及VH形成特異性結合PD-L1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、 209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，提供抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含：(a)第一多肽，其從N末端至C末端包含：VH-VL-抗TIGIT sdAb1部分-CH2-CH3；及(b)第二多肽，其從N末端至C末端包含：抗TIGIT sdAb2部分-CL，其中VL及VH形成特異性結合PD-L1之scFv，並且其中抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含：CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分各自包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係相同的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb1部分及抗TIGIT sdAb2部分係不同的。在一些實施例中，VH及VL域(或scFv)源自阿特珠單抗、度伐單抗、阿維單抗或h53C1。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包含1)VH，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：349之HC-CDR1， 包含胺基酸序列SEQ ID NO：350之HC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：351之HC-CDR3，及2)VL，其包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：352之LC-CDR1，包含胺基酸序列SEQ ID NO：353之LC-CDR2，及包含胺基酸序列SEQ ID NO：354之LC-CDR3。在一些實施例中，h53C1抗PD-L1抗體包括包含胺基酸序列SEQ ID NO：339之VH及包含胺基酸序列SEQ ID NO：340之VL。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列且VL包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。在一些實施例中，形成scFv之VH與VL，及/或scFv與抗TIGIT sdAb1部分視情況經由肽接頭，諸如包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列的肽接頭來彼此融合。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG4 Fc，諸如SEQ ID NO：389。在一些實施例中，CH2及CH3域來自IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：356。在一些實施例中，CH2及CH3域來自無效應子IgG1 Fc，諸如SEQ ID NO：355。在一些實施例中，抗TIGIT MABP(例如，BABP)包含第一多肽之兩個相同複本及第二多肽之兩個相同複本。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，PD-L1×TIGIT MABP(例如，BABP)具有如圖26所示之結構。
在一些實施例中，亦提供了抗TIGIT MABP(例如，BABP)，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分(下文稱為「競爭性抗TIGIT構建體」，「競爭性抗TIGIT MABP」或「競爭性抗TIGIT BABP」)，其與本文所述之任何一種抗TIGIT構建體競爭性地特異性結合TIGIT(諸如抗TIGIT sdAb部分，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，多特異性(例如雙特異性)或單特異性抗TIGIT構建體，其包 含本文描述之抗TIGIT sdAb部分，例如本文所述之抗TIGIT/PD-1構建體(例如，MABP或BABP)或抗TIGIT/PD-L1構建體(例如，MABP或BABP)。
(III)抗TIGIT構建體抗體變體
在一些實施例中，涵蓋了本文提供之抗TIGIT構建體(例如，抗TIGIT sdAb部分，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT MABP/BABP)之胺基酸序列變體。例如，可能需要改善抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體之胺基酸序列內之殘基的缺失及/或插入及/或取代。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構建體，其限制條件為最終構建體具有所需特性，例如抗原結合性。
a)取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一個或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之目標位點包括HVR(或CDR)及FR。保守性取代展示於表2中之標題「較佳取代」下。更實質性變化提供於表2中之標題「示例性取代」下，且如以下關於胺基酸側鏈類別進一步所述。胺基酸取代可引入目標抗體及經篩選所需活性(例如，保留的/改善的抗原結合性、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)之產物中。
可基於共同側鏈性質將胺基酸分成以下類別：1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)鹼性：His、Lys、Arg；5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將需要將此等類別中一個類別之成員更換成另一類別。
一種類型之取代變體涉及取代親本抗體(例如，人源化抗體或人抗體)之一個或多個高變區殘基。一般說來，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有改變(例如改善)(例如親和力增加、免疫原性降低)及/或將基本上保留親本抗體之某些生物特性。一個示例性取代變體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(諸如本文描述述之彼等技術)便利地產生。簡而言之，使一個或多個HVR殘基突變，並且使變體抗體展示在噬菌體上並篩選特定生物活性(例如結合親和力)。
可在HVR中進行改變(例如取代)以例如改善抗體親和力。可在HVR「熱點」(即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經受突變之密碼子編碼之殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行此類改變，且測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由 構建及從二級文庫中重新選擇之親和力成熟已經例如在Hoogenboom等之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中描述。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變)中之任一種將多樣性引入選用於成熟的可變基因中。然後產生二級文庫。然後篩選文庫以鑒別具有所需親和力的任何抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR定向方法，其中使若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機化。可例如使用丙胺酸掃描誘變或模型化來特異性地鑒別抗原結合中涉及的HVR殘基。特別地，經常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一個或多個HVR內，只要此類改變基本上不降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中進行基本上不降低結合親和力之保守性改變(例如如本文所提供的保守性取代)。此類改變可處於HVR「熱點」或CDR以外。在以上提供之變體VHH序列之某些實施例中，各HVR未被改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種可用於鑒定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域之方法稱作「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所描述。在此方法中，鑒別某一殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且取代為中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置上引入其他取代。可替代地或另外，抗原-抗體複合物的晶體結構用來鑒別抗體與抗原之間之接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為取代之候選物而被靶向或消除。可篩選變體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基的多肽之範圍內之胺基末端及/或羧基末端融合，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入的實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分 子之其他插入變體包括抗體的N端或C端與增加抗體之血清半衰期的酶(例如用於ADEPT)或多肽之融合。
b)糖基化變體
在某些實施例中，改變本文提供之抗TIGIT構建體以提高或降低抗體醣基化的程度。對抗體添加醣基化位點或使抗體缺失醣基化位點可藉由改變胺基酸序列以使得產生或除去一個或多個醣基化位點來便利地達成。
當抗TIGIT構建體包含Fc區(例如，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，PD-1×TIGIT MABP或PD-L1×TIGIT MABP)時，可以改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含一般藉由N-鍵連接到Fc區之CH2域之Asn297的分支二天線寡醣。參見例如Wright等TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接到二天線寡醣結構之「主幹」中的GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對本發明的抗TIGIT構建體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改善特性之抗體變體。
在一些實施例中，提供具有缺乏(直接或間接)連接到Fc區上的岩藻糖之碳水化合物結構之抗TIGIT構建體抗體變體。例如，此類抗體中之岩藻糖量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。如藉由MALDI-TOF質譜法所測量，藉由相對於連接到Asn297的所有醣結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)的總和計算Asn297上之糖鏈內岩藻糖之平均量來測定岩藻糖的量，如例如WO 2008/077546中所述。Asn297係指位於Fc區中大致位置297(Fc區殘基的EU編號)上之天冬醯胺殘基；然而，Asn297亦可由於抗體中之微小序列變化而位於位置297之上游或下游約±3個胺基酸處，即在位置294與300之間。此類岩藻醣基化變體可具有改善的ADCC功能。參見例如美國專利申請案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.， Ltd)。涉及「脫岩藻醣基化的」或「岩藻糖缺乏的」抗體變體的出版物的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87：614(2004)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗TIGIT構建體變體，例如其中連接到抗體的Fc區的二天線寡醣係由GlcNAc二等分。此類抗體變體可具有降低的岩藻醣基化及/或改善的ADCC功能。此類抗體變體的實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美國專利第6,602,684號(Umana等)；及US2005/0123546(Umana等)。亦提供了在連接到Fc區的寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。此類抗體變體可具有改善的CDC功能。此類抗體變體描述於例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc區變體
在一些實施例中，可以將一個或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗TIGIT構建體(例如，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，PD-1×TIGIT MABP或PD-L1×TIGIT MABP)之Fc區，從而產生Fc區變體。Fc區變體可以包含在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如，取代)之人Fc區序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一些實施例中，本申請案涵蓋具有一些但不係所有效應子功能之抗TIGIT構建體(例如，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，PD-1×TIGIT MABP或PD-L1×TIGIT MABP)變體，此情況使得它成為抗TIGIT構建體在活體內之半衰 期很重要，但某些效應功能(如補體及ADCC)係不必要或有害之應用之理想候選物。可進行體外及/或體內細胞毒性測定以確認CDC及/或ADCC活性的降低/減少。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體缺乏FcγR結合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。在Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)的第464頁上的表2中匯總了造血細胞上的FcR表現。用於評估目標分子之ADCC活性之活體外測定之非限制性實例描述於美國專利第5,500,362號中(參見例如Hellstrom,L.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom，I等Proc.Nat’l Acad. Sci. USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。可替代地，可採用非放射性測定方法(參見例如用於流式細胞術的ACTITM非放射性細胞毒性測定(CellTechnology公司Mountain View,CA)；以及CytoTox 96®非放射性細胞毒性測定(Promega,Madison,WI)。用於此類測定的有用效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可以在體內評估目標分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如揭示於Clynes等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中之動物模型中。亦可進行C1q結合測定以確認抗體不能結合C1q並且因此缺乏CDC活性。參見，例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中的C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可以進行CDC測定。亦可以使用本領域中已知的方法來實施FcRn結合及體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova,S.B.等，Int’lImmunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低的效應功能的抗體包括具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一個或多個之取代的彼等(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中的兩處或更多處具有 取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代成丙胺酸的所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
與FcR之結合改善或削弱的某些抗體變體已有描述。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312及Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
在某些實施例中，抗TIGIT構建體變體包含具有一個或多個改善的ADCC之胺基酸取代(例如在Fc區的位置298、333及/或334(EU殘基編號)處的取代)之Fc區。
在一些實施例中，對Fc區做出改變，其導致改變的(即，改善的或降低的)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如描述於美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000)中。
在一些實施例中，提供了抗TIGIT構建體(例如，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，PD-1×TIGIT MABP或PD-L1×TIGIT MABP)變體，其包含含有一個或多個胺基酸取代之變體Fc區，該等取代增加半衰期及/或改善與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。具有延長的半衰期及改善的與新生兒Fc受體(FcRn)的結合的抗體描述於US2005/0014934A1(Hinton等)中，新生兒Fc受體(FcRn)負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。彼等抗體包含其中具有改善Fc區與FcRn的結合的一個或多個取代的Fc區。此類Fc變體包括在Fc區殘基之一個或多個處具有取代之Fc變體，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
關於Fc區變異體的其他實例，亦可見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
涵蓋包含本文所述之任何Fc變體之抗TIGIT構建體(例如sdAb-Fc 融合蛋白，與全長抗體融合之抗TIGIT sdAb，或本文所述之抗TIGIT MABP/BABP)或其組合。
d)半胱胺酸工程化抗體變體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸改造抗TIGIT構建體，例如「巰基單抗(thioMAb)」，其中抗體的一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，取代的殘基存在於抗體的可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基由此定位在抗體的可及位點處且可用於使抗體結合至其他部分(諸如藥物部分或接頭-藥物部分)以產生如本文進一步所述的免疫結合物。在一些實施例中，以下殘基中之任一者或多個可以被半胱胺酸取代：重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。可如例如美國專利第7,521,541號中所述來生成半胱胺酸改造抗TIGIT抗體。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，可以進一步修飾本文中提供的抗TIGIT構建體以含有本領域已知的且易於獲得的額外非蛋白質部分。適於使抗體衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三氧雜環己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及右旋糖酐或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性可具有製造優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可為分支或未分支的。連接到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如果連接了超過一個聚合物，那麼它們可為相同或不同的分子。通常，用於衍生化的聚合物的數量及/或類型可基於包括但不限於有待改善的抗體的具體特性或功能、抗體衍生物是否在限定條件下用於療法中等考慮 因素來確定。
在一些實施例中，提供抗TIGIT構建體與可藉由暴露於輻射而選擇性加熱的非蛋白質部分的結合物。在一些實施例中，非蛋白質部分係碳奈米管(Kam等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞但會將非蛋白質部分加熱至殺死鄰近於抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度的波長。
在一些實施例中，本文提供之抗TIGIT構建體(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體，抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體或抗TIGIT MABP(例如，BABP))可以進一步修飾以包含一種或多種生物活性蛋白、多肽或其片段。如本文中可互換使用之「生物活性(bioactive)」或「生物活性(biologically active)」係指在體內顯示生物活性以達成特定功能。例如，它可以指與特定生物分子(例如蛋白質，DNA等)之組合，然後促進或抑制此生物分子之活性。在一些實施例中，生物活性蛋白質或其片段包括作為用於預防或治療疾病或病症之活性藥物物質投與患者之蛋白質及多肽，以及用於診斷目的之蛋白質及多肽，例如用於診斷測試或活體外測定之酶，以及投與於患者以預防疾病之蛋白質及多肽諸如疫苗。在一些實施例中，生物活性蛋白質或其片段具有免疫刺激/免疫調節、膜轉運或酶活性。在一些實施例中，生物活性蛋白質、多肽或其片段係酶、激素、生長因子、細胞因子或其混合物。在一些實施例中，生物活性蛋白質、多肽或片段可以特異性識別目標肽(例如抗原或其他蛋白質)。
在一些實施例中，可包含在本文所述之抗TIGIT構建體內之生物活性蛋白質或其片段係蛋白質結合蛋白質。在一些實施例中，可以包含在本文所述之抗TIGIT構建體內之生物活性蛋白質或其片段係抗體模擬物，其係包含令人聯想到抗體之抗原結合域之小工程化蛋白質(Geering及Fussenegger，Trends Biotechnol.,33(2)：65-79,2015)。此等分子源自現有人支架蛋白並包含單一多肽。可包含在本文所述之抗TIGIT構建體內之示例性抗體模擬物可以為，但不限於，設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin；包含3-5個完全合成之錨蛋白重複序列，其側翼為N-及C末端Cap域)、親和力多聚體(avimer；一種高親和力蛋白質，其包含多個A域，每個域對靶標具有低親和力)，或Anticalin(基於脂質運載蛋白之支架，具有四個可接近之環，每個環之序列可以為隨機的)。在一些實施例中，可包含在本文所述之抗TIGIT構建體內之生物活性蛋白或其片段係犰狳重複蛋白(例如，β-連環蛋白、α-內輸蛋白、斑珠蛋白、腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC))，其包含犰狳重複單元(長度約40個殘基之特徵性重複胺基酸序列)。每個犰狳重複序列由一對形成髮夾結構之α螺旋組成。重複序列之多個副本形成所謂之α螺線管結構。犰狳重複蛋白能夠結合不同類型之肽，依賴於肽骨架之恆定結合方式，而不需要特定之保守側鏈或與肽之游離N-或C末端之相互作用。藉由殘基識別肽殘基之可能性，結合重複蛋白之內在模塊性，使得犰狳重複蛋白有希望用於設計用於肽結合之通用支架。
在一些實施例中，可包含在本文所述之抗TIGIT構建體內之生物活性蛋白質或其片段係配體，例如與特定細胞受體相互作用之淋巴因子及細胞因子。淋巴因子係低分子量蛋白質，當抗原或凝集素刺激T細胞生長時，T細胞分泌此等蛋白質。
III. 醫藥組合物
本申請案進一步提供了包含任何一種抗TIGIT構建體之醫藥組合物，該等抗TIGIT構建體包含如本文所述之特異性識別TIGIT之sdAb(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)，或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))，及可選之醫藥學上可接受之載劑。藉由混合具有期望純度的本文所述 抗TIGIT構建體與可選之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))以凍乾調配物或水性溶液形式製備醫藥組合物。
醫藥組合物較佳係穩定的，其中包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分之抗TIGIT構建體在儲存時基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。可在選定溫度下持續選定時期測量穩定性。為了快速篩選，可以將調配物在40℃下保持2週至1個月，此時量測穩定性。當調配物在2-8℃下儲存時，通常調配物應在30℃或40℃下穩定至少1個月，及/或在2-8℃下穩定至少2年。當調配物在30℃下儲存時，調配物通常應在30℃下穩定至少2年，及/或在40℃下穩定至少6個月。例如，儲存期間之聚集程度可用作蛋白質穩定性之指標。在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT構建體之穩定調配物可包含少於約10%(較佳少於約5%)之作為調配物中聚集體存在之抗TIGIT構建體。
可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，包括緩衝劑，抗氧化劑，包括抗壞血酸，甲硫胺酸，維生素E，偏亞硫酸氫鈉；防腐劑，等滲劑(例如氯化鈉)，穩定劑，金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；螯合劑諸如EDTA及/或非離子表面活性劑。
生理上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨、氯化六烴季銨、氯化苯二甲羥銨、氯化苄甲乙氧銨、苯酚、丁醇或苄醇、對羥苯甲酸烷酯(如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯)、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇以及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二醣以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖、 甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，如鈉離子；金屬絡合物(例如Zn-蛋白質絡合物)；及/或非離子界面活性劑，如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)，及PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
緩衝劑用於將pH控制在優化治療效果之範圍內，特別係在穩定性取決於pH的情況下。緩衝劑較佳以約50mM至約250mM之濃度存在。適用於本申請案之緩衝劑包括有機酸及無機酸及其鹽。例如，檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、乙酸鹽。另外，緩衝劑可包含組胺酸及三甲胺鹽，例如Tris。
添加防腐劑以阻止微生物生長，並且通常以0.2%-1.0%(w/v)之範圍存在。添加防腐劑可以例如促進多用途(多劑量)調配物之生產。適用於本申請案之防腐劑包括十八烷基二甲基苄基氯化銨；六甲基氯化銨；苯紮氯銨(例如氯化物、溴化物、碘化物)，苄索氯銨；硫柳汞，苯酚，丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇，3-戊醇及間甲酚。
存在有時稱為「穩定劑」之張力劑以調節或維持組合物中液體之張力。當與大的帶電生物分子如蛋白質及抗體一起使用時，它們通常被稱為「穩定劑」，因為它們可以與胺基酸側鏈之帶電基團相互作用，從而減少分子間及分子內相互作用之可能性。考慮到其他成分之相對量，張力劑可以以0.1重量%至25重量%，較佳1重量%至5重量%之任何量存在。較佳之張力劑包括多元糖醇，較佳三元或更高級糖醇，例如甘油、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。
另外之賦形劑包括可以作為以下一者或多者之試劑：(1)填充劑，(2)溶解度增強劑，(3)穩定劑及(4)防止變性或黏附到容器壁上之試劑。此等賦形劑包括：多元糖醇(上面列舉的)；胺基酸如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、 組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、蘇胺酸等；有機糖或糖醇，例如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌胺酸、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環醇(例如肌醇)、聚乙二醇；含硫還原劑，如尿素，麩胱甘肽，硫辛酸，硫代乙醇酸鈉，硫代甘油，α-硫代甘油及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白質，如人血清白蛋白，牛血清白蛋白，明膠或其他免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；單醣(例如，木糖，甘露糖，果糖，葡萄糖；二醣(例如乳糖，麥芽糖，蔗糖)；三醣如棉子糖；及多醣例如糊精或葡聚糖。
存在非離子表面活性劑或清潔劑(亦稱為「潤濕劑」)以幫助溶解治療劑以及保護治療性蛋白免於攪動誘導之聚集，從而亦允許調配物暴露於剪切表面應力而不會引起活性治療蛋白質或抗體之變性。非離子表面活性劑之存在量為約0.05mg/ml至約1.0mg/ml，較佳約0.07mg/ml至約0.2mg/ml。
合適之非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、40、60、65、80等)，聚氧乙烯醚(184、188等)，PLURONIC®多元醇，TRITON®，聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20，TWEEN®-80等)，月桂醯甘油400，聚乙二醇40硬脂酸酯，聚氧乙烯氫化菌麻油10、50及60，甘油單硬脂酸酯，蔗糖脂肪酸酯，甲基纖維素及羧甲基纖維素。可以使用之陰離子清潔劑包括十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉及二辛基磺酸鈉。陽離子清潔劑包括苯紮氯銨或苄索氯銨。
為了使醫藥組合物用於活體內投與，它們必須係無菌的。可藉由無菌過濾膜過濾使醫藥組合物無菌。通常將本文中的醫藥組合物放到具有無菌進入端口的容器中，例如具有藉由皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
投與途徑根據已知及可接受之方法，例如藉由單次或多次推注或以合適之方式長時間輸注，例如藉由皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、 病灶內或關節內途徑來注射或輸注，局部投與，吸入或藉由持續釋放或延長釋放方式。在一些實施例中，醫藥組合物局部投與，例如腫瘤內投與。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物之半透性基質，半透性基質呈成形製品之形式，例如膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯，水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國專利第3,773,919號)，L-麩胺酸與L-麩胺酸乙酯之共聚物，不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯，可降解之乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林組成之可注射微球)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
本文中的醫藥組合物亦可含有所治療之特定適應症所需要之一種以上活性化合物，較佳為具有互補活性並且不會對彼此有不利影響之化合物。或者/另外，組合物可包含細胞毒劑，化學治療劑，細胞因子，免疫抑制劑或生長抑制劑。此類分子適合於以對於預定目的有效之量組合存在。
活性成分亦可截留在例如藉由凝聚技術或界面聚合作用製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙酸甲酯)微膠囊)中、膠狀藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或粗乳液中。此類技術揭示在Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版中。
在一些實施例中，醫藥組合物包含在一次性小瓶中，例如一次性密封小瓶。在一些實施例中，醫藥組合物包含在多用途小瓶中。在一些實施例中，醫藥組合物散裝容納在容器中。在一些實施例中，醫藥組合物為冷凍保存的。
IV. 治療TIGIT相關疾病之方法
包含如本文所述之特異性識別TIGIT之sdAb部分(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))之抗TIGIT構建體，及其組合物(例如醫藥組合物)可用於多種應用，例如診斷、分子測定及治療。
本發明之一個態樣提供了治療有需要之個體中之TIGIT相關疾病或病症之方法，其包括向個體投與有效量之包含本文所述之抗TIGIT構建體之醫藥組合物。在一些實施例中，TIGIT相關疾病係癌症。在一些實施例中，TIGIT相關疾病係病原性感染，例如病毒感染。在一些實施例中，TIGIT相關疾病係免疫相關疾病。在一些實施例中，免疫相關疾病與T細胞功能障礙病症相關。在一些實施例中，T細胞功能障礙病症之特徵在於T細胞衰竭。在一些實施例中，免疫相關疾病選自由以下各者組成之群：未解決之急性感染、慢性感染及腫瘤免疫。在一些實施例中，本文所述之抗TIGIT構建體可用於增加、增強或刺激有此需要之受試者中之免疫應答或功能。在一些實施例中，TIGIT相關疾病(例如，癌症，免疫相關疾病)對PD-1或PD-L1阻斷具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療具有部分抗性)。
本發明部分涵蓋了抗TIGIT蛋白質構建體(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如PD-1×TIGIT BABP)，或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))，編碼其之核酸分子或載體，包含編碼其之核酸分子或載體之宿主細胞，其可以單獨或以任何方式與另一種療法組合投與，並且在至少一些態樣中，與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑一起。在一些實施例中，在投與抗TIGIT構建體之前，它們可以與此項技術熟知之合適之藥物載劑及賦形劑組合。根據本揭示內容製備之組合物可用於治療或延遲癌症之惡化，或增加、增強或刺激有此需要之受試者之免疫應答或功能。
在一些實施例中，提供了治療TIGIT相關疾病(例如，癌症、免疫相關疾病，例如與T細胞功能障礙相關之疾病)的方法，其包括向個體投與有效量 的醫藥組合物，其包含分離的抗TIGIT構建體，該構建體包含特異性識別TIGIT之sdAb部分(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)，或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))，其中抗TIGIT sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及視情況醫醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，TIGIT相關疾病係癌症。在一些實施例中，癌症係實體腫瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中，TIGIT相關疾病係免疫相關疾病。在一些實施例中，免疫相關疾病與T細胞功能障礙病症相關。在一些實施例中，T細胞功能障礙病症之特徵在於T細胞衰竭。在一些實施例中，免疫相關疾病選自由以下各者組成之群：未解決之急性感染、慢性感染及腫瘤免疫。在一些實施例中，TIGIT相關疾病(例如，癌症，免疫相關疾病)對PD-1或PD-L1阻斷具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療具有部分抗性)。在一些實施例中，該方法亦包括向個體投與另外之療法(例如，癌症療法，例如 手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)。在一些實施例中，另外之療法係免疫療法，例如藉由向個體投與有效量之包含免疫調節劑之第二醫藥組合物。在一些實施例中，免疫調節劑係免疫檢查點抑制劑，例如抗PD-1或抗PD-L1抗體。在一些實施例中，醫藥組合物係全身投與(例如靜脈內或腹膜內)。在一些實施例中，醫藥組合物係局部投與(例如腫瘤內)。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，治療癌症之方法具有以下一種或多種生物活性：(1)殺死癌細胞(包括旁觀者殺死)；(2)抑制癌細胞之增殖；(3)在腫瘤中誘導免疫應答；(4)減小腫瘤大小；(5)緩解患有癌症之個體之一種或多種症狀；(6)抑制腫瘤轉移；(7)延長生存期；(8)延長癌症進展時間；(9)預防、抑制或降低癌症復發之可能性。在一些實施例中，由本文所述之醫藥組合物介導之殺死癌細胞之方法可以達成至少約40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或者更多中之任一者之腫瘤細胞死亡率。在一些實施例中，由本文所述之醫藥組合物介導之殺死癌細胞之方法可以達成至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多中之任何一者之旁觀者腫瘤細胞(例如，未被編碼抗TIGIT構建體之溶瘤VV感染)死亡率。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物介導之減小腫瘤大小之方法可以減少至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中之任一者)之腫瘤大小。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物介導之抑制腫瘤轉移之方法可以抑制至少約10%(包括例如至少約20%、30%、40%、60%、70%、80%、90%或100%中之任何一者)之轉移。在一些實施例中，由本文所述醫藥組合物介導之延長個體(例如人)之存活之方法可以使個體之存活延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24個月中之任一者。在一些實施例中，由本文所述醫藥組合物介導之延長癌症進展時間之方法可以使癌症進展之時間延長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12週中之任一者。在一些實施例中，治療免疫相關疾病之方法可以增 加、增強或刺激受試者中之免疫應答或功能。在一些實施例中，藉由活化效應細胞(例如，T細胞，例如CD8+及/或CD4+ T細胞)，擴增(增加)效應細胞群，及/或殺死靶細胞(例如，靶腫瘤細胞)來增加、增強及/或刺激受試者中之免疫應答或功能。在一些實施例中，相對於投與包含本文所述之抗TIGIT構建體之醫藥組合物之前，個體中之CD4及/或CD8 T細胞增加或增強引發、活化、增殖、細胞因子釋放及/或細胞溶解活性。在一些實施例中，相對於投與包含本文所述之抗TIGIT構建體之醫藥組合物之前，CD4及/或CD8 T細胞之數量升高。在一些實施例中，相對於投與包含本文所述之抗TIGIT構建體之醫藥組合物之前，活化之CD4及/或CD8 T細胞之數量升高。在一些實施例中，活化之CD4及/或CD8T細胞之特徵在於相對於在投與包含本文所述抗TIGIT構建體之醫藥組合物之前，產生γ-IFN+之CD4及/或CD8 T細胞及/或增強之細胞溶解活性。在一些實施例中，CD4及/或CD8 T細胞表現出選自由IFN-γ、TNF-α及白介素組成的組的細胞因子的釋放增加。在本發明方法之一些實施例中，CD4及/或CD8 T細胞係效應記憶T細胞。在一些實施例中，CD4及/或CD8效應記憶T細胞之特徵在於產生γ-IFN+之CD4及/或CD8 T細胞及/或增強之細胞溶解活性。在一些實施例中，CD4及/或CD8效應記憶T細胞之特徵在於具有CD44高CD62L低之表現。在一些實施例中，癌症具有升高之T細胞浸潤水準。
本文描述之方法適用於治療多種癌症，包括實體癌症及液體癌症。該等方法適用於所有階段之癌症，包括早期癌症、非轉移性癌症、原發性癌症、晚期癌症、局部晚期癌症、轉移性癌症或緩解期癌症。本文描述之方法可以用作第一療法、第二療法、第三療法或與此項技術已知之其他類型之癌症療法之組合療法，例如化學療法、手術、激素療法、放射、基因療法、免疫療法(例如T細胞療法或投與免疫調節劑)、骨髓移植、幹細胞移植、靶向療法、冷凍療法、超聲療法、光動力療法、射頻消融等，在輔助環境或新輔助環境中(即，該方法 可以在初步/確定性治療之前進行)。在一些實施例中，該方法用於治療先前已經治療之個體。在一些實施例中，癌症對於先前療法係難以治癒的。在一些實施例中，該方法用於治療先前未接受過治療之個體。在一些實施例中，癌症對PD-1或PD-L1阻斷具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療具有部分抗性)。
在一些實施例中，該方法適用於治療具有異常TIGIT表現、活性及/或信號傳導之癌症，作為非限制性實例，該等癌症包括非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巢癌、乳癌、胰臟癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、間皮瘤、黑色素瘤、頭頸癌、甲狀腺癌、肉瘤、前列腺癌、膠質母細胞瘤、宮頸癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤(例如，多發性骨髓瘤(MM))、蕈樣真菌病、梅克爾細胞癌(merkel cell cancer)及惡性血液病。
因此，在一些實施例中，提供了治療免疫療法應答性實體瘤(例如癌瘤或腺癌，例如具有異常TIGIT表現、活性及/或信號傳導之癌症)的方法，其包括向個體投與有效量的醫藥組合物，該醫藥組合物包含分離的抗TIGIT構建體，該構建體包含特異性識別TIGIT之sdAb部分(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)，或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))，其中該sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個(諸如約1個、2個、或3個中之任一者)胺 基酸取代之變體；及視情況醫醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分與TIGIT之間之結合之Kd為約10-5M至約10-12M(例如約10-7M至約10-12M，或約10-8M至約10-12M)。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。在一些實施例中，抗TIGIT sdAb部分包含VHH域，其包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，癌症係實體腫瘤(諸如結腸癌)。在一些實施例中，醫藥組合物係全身投與(例如靜脈內或腹膜內)。在一些實施例中，醫藥組合物係局部投與(例如腫瘤內)。在一些實施例中，該方法進一步包括向個體投與另外之癌症療法(例如手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合)。在一些實施例中，另外之療法包括向個體投與有效量之第二醫藥組合物，其包含免疫調節劑，例如抗PD-1或抗PD-L1抗體。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，免疫療法應答性實體瘤對PD-1或PD-L1阻斷具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療具有部分抗性)。
在一些實施例中，該方法適用於治療具有異常PD-1或PD-L1/PD-L2表現、活性及/或信號傳導之癌症，作為非限制性實例，該等癌症包括血液癌症及/或實體瘤。可以使用本發明之抗體抑制其生長之一些癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症。用於治療之其他癌症之非限制性實例包括黑素瘤(例如，轉移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如透明細胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、乳癌、結腸癌及肺癌(例如非小細胞肺癌)。另外，本發明包括其生長可以使用本發明之抗體抑制的難治性或復發性惡性腫瘤。可以使用本發明之抗體治療之其他癌症之實例包括骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金病(Hodgkin's Disease)、 非霍奇氏金淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病包括急性髓性白血病、慢性粒細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、兒童實體瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T-細胞淋巴瘤，環境誘發之癌症(包括由石棉誘導之癌症)以及該等癌症之組合。本發明亦可用於治療轉移性癌症，尤其係表現PD-L1之轉移性癌症(Iwai等(2005)Int.Immunol.17：133-144)。在一些實施例中，具有異常PD-1或PD-L1/PD-L2表現、活性及/或信號傳導之癌症對PD-1或PD-L1阻斷具有部分抗性(例如，對抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體治療具有部分抗性)。
在一些實施例中，本文所述之方法適用於治療結腸直腸癌，例如腺癌，胃腸道類癌瘤，胃腸道間質瘤，平滑肌肉瘤，黑素瘤或鱗狀細胞癌。
本申請案之醫藥組合物之劑量及所需藥物濃度可根據設想的特定用途而變化。確定投與的適當劑量或途徑完全在本領域普通技術人員之範圍內。動物實驗為人類療法之有效劑量之確定提供可靠的指導。有效劑量之物種間類推可以遵循Mordenti,J.及Chappell,W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics,」In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobi等人編，Pergamon Press,New York 1989，第42-46頁來進行。
當活體內投與包含本文所述之抗TIGIT sdAb部分(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如PD-1×TIGIT BABP)或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))之抗TIGIT構建體時，正常劑量可以從每天約10ng/kg至約100mg/kg哺乳動物體重或更多變化，較佳約1mg/kg/天至10mg/kg/天，例如約1-3mg/kg/ 天，約2-4mg/kg/天，約3-5mg/kg/天，約4-6mg/kg/天，約5-7mg/kg/天，約6-8mg/kg/天，約6-6.5mg/kg/天，約6.5-7mg/kg/天，約7-9mg/kg/天，或約8-10mg/kg/天，此取決於投與途徑。在本申請案之範圍內的係，不同的調配物對於不同的治療及不同的病症係有效的，並且意圖治療特定器官或組織的投與可需要不同於對另一種器官或組織的遞送方式的遞送。此外，劑量可藉由一個或多個單獨的投與來投與，或藉由連續輸注來投與。對於若干天或更長時間內的重複投與，根據病狀，持續進行治療，直至達成所需的疾病症狀抑制為止。然而，其他劑量方案可為有用的。此療法的進展容易地藉由常規技術及測定來監測。
在一些實施例中，醫藥組合物係單次投與(例如推注)。在一些實施例中，醫藥組合物被投與多次(例如2、3、4、5、6或更多次中之任何一者)。如果係多次投與，則可以藉由相同或不同的途徑進行，並且可以在同一部位或替代部位進行。醫藥組合物可以每週投與兩次，每週投與3次，每週投與4次，每週投與5次，每日投與，不中斷地每日投與，每週投與一次，不中斷地每週投與，每2週投與一次，每3週投與一次，每月投與一次，每2個月一次，每3個月一次，每4個月一次，每5個月一次，每6個月一次，每7個月一次，每8個月一次，每9個月一次，每10個月一次，每11個月一次，或每年一次。投與間隔可以為24h至48h，2天至3天，3天至5天，5天至1週，1週至2週，2週至1個月，1個月至2個月，2個月至3個月，3個月至6個月，或6個月至一年中之任一者。間隔亦可以為不規則的(例如在腫瘤進展後)。在一些實施例中，投與方案沒有中斷。在一些實施例中，每4天投與組合物達4次。藉由監測患者之疾病跡象並相應地調整治療，熟習醫學技術者可以容易地確定特定患者之最佳劑量及治療方案。
將本申請案之醫藥組合物(包括但不限於復溶及液體調配物)投與需要用本文所述之抗TIGIT構建體(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋 白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)，或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))治療之個體，較佳人，根據已知方法，例如靜脈內推注投與，或在一段時間內連續輸注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、靜脈內(i.v.)、關節內、滑膜內、鞘內、口服、局部或吸入途徑。藉由將本文所述之凍乾之抗TIGIT構建體溶解在稀釋劑中以使蛋白質分散在各處，可以製備復溶之調配物。適用於本申請案之示例性醫藥學上可接受之(對人投與係安全且無毒之)稀釋劑包括但不限於無菌水，抑菌性注射用水(BWFI)，pH緩衝溶液(例如磷酸鹽-緩衝鹽水)，無菌鹽水溶液，林格氏溶液或右旋糖溶液，或鹽及/或緩衝劑之水溶液。
在一些實施例中，醫藥組合物藉由皮下(即在皮膚下)投與來投與個體。出於該目的，可以使用注射器來注射醫藥組合物。然而，可以使用其他用於投與醫藥組合物之裝置，例如注射裝置；注射筆；自動注射器裝置，無針裝置；及皮下貼片遞送系統。在一些實施例中，將醫藥組合物靜脈內投與於個體。在一些實施例中，藉由輸注(例如靜脈內輸注)將醫藥組合物投與於個體。
V. 製備方法
本文所述之抗TIGIT構建體(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，抗TIGIT/PD-1雙特異性抗體(例如，PD-1×TIGIT BABP)或抗TIGIT/PD-L1雙特異性抗體(例如，PD-L1×TIGIT BABP))可以使用此項技術已知或如本文所述之任何方法製備。亦參見實例1、2、4及6。在一些實施例中，提供了產生抗TIGIT構建體之方法，其包括：(a)在有效表現所編碼之抗TIGIT構建體之條件下培養包含編碼本文所述之抗TIGIT構建體之分離的核酸之或載體之宿主細胞；(b)從該宿主細胞中獲得所表現之抗TIGIT構建體。在一些實施例中，步驟(a)之方法亦包括產生包含編碼本文所述之抗TIGIT構建體之分離的核酸或載體之宿主細胞。
已經描述了製備sdAb之方法。參見例如Els Pardon等，Nature Protocol,2014；9(3)：674。sdAb(例如VHH)可以使用此項技術已知之方法獲得，例如藉由對駱駝科物種(例如駱駝或美洲駝)進行免疫並從中獲得雜交瘤，或藉由使用此項技術中已知之分子生物學技術選殖單域抗體文庫，並且隨後使用未選擇之文庫之單個純系藉由ELISA來選擇或藉由使用噬菌體展示。
為了重組產生sdAb，將編碼單域抗體之核酸分離並插入可複製之載體中以進一步選殖(擴增DNA)或用於表現。編碼單域抗體的DNA容易分離並且使用常規程序(例如，使用能夠特異性結合至編碼抗體的重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)來測序。有很多載體可供使用。載體之選擇部分取決於要使用之宿主細胞。通常，較佳之宿主細胞來源於原核或真核(通常係哺乳動物)。在一些實施例中，編碼本文所述抗TIGIT構建體之分離核酸包含SEQ ID NO：246-252中之任一者之核酸序列。
1. 在原核細胞中重組生產 a)載體構建
編碼本申請案之抗體之多核酸序列可使用標準重組技術獲得。可以從產生抗體之細胞諸如雜交瘤細胞中分離及測序所需之多核酸序列。或者，可以使用核苷酸合成儀或PCR技術合成多核苷酸。獲得後，將編碼多肽之序列插入能夠在原核宿主中複製及表現異源多核苷酸之重組載體中。此項技術可獲得及已知之許多載體可用於本發明之目的。合適載體之選擇主要取決於待插入載體之核酸之大小及待用載體轉化之特定宿主細胞。每個載體含有不同組分，此取決於其功能(異源多核苷酸之擴增或表現，或兩者)及其與其所在之特定宿主細胞之相容性。載體組分通常包括但不限於：複製起點、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合位點(RBS)、信號序列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。
通常，含有複製子及控制序列之質體載體與此等宿主一起使用，該 複製子及控制序列源自與宿主細胞相容之物種。載體通常攜帶複製位點以及能夠提供在轉化之細胞中進行表型選擇之標誌序列。
另外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列之噬菌體載體作為轉化載體可與此等宿主一起使用。例如，噬菌體諸如GEMTM-11可用於製備重組載體，該載體可用於轉化感受態宿主細胞，諸如大腸桿菌LE392。
本申請案之表現載體可包含兩個或更多個啟動子-順反子對，其編碼每種多肽組分。啟動子係位於調節其表現之順反子上游(5')之非轉譯調節序列。原核啟動子通常分為兩類，誘導型及組成型。誘導型啟動子係一種這樣的啟動子，其響應於培養條件之變化，例如營養素之存在與否或溫度之變化，啟動在其控制下之順反子之轉錄水準之增加。
許多由多種潛在宿主細胞識別的啟動子係熟知的。藉由限經由制酶消化從源DNA中除去啟動子並將分離的啟動子序列插入本申請案之載體中，可以將選擇之啟動子與編碼輕鏈或重鏈之順反子DNA可操作地連接。天然啟動子序列及許多異源啟動子都可用於指導目標基因之擴增及/或表現。在一些實施例中，使用異源啟動子，因為與天然目標多肽啟動子相比，它們通常允許所表現之目標基因之更多轉錄及更高產量。
適用於原核宿主之啟動子包括PhoA啟動子，β-半乳糖酶及乳糖啟動子系統，色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子諸如tac或trc啟動子。然而，在細菌中起作用之其他啟動子(例如其他已知之細菌或噬菌體啟動子)亦係合適的。其核酸序列已經公佈，從而使熟習此項技術者可操作地使用接頭或銜接子將它們連接到編碼靶輕鏈及重鏈之順反子(Siebenlist等(1980)Cell 20：269)以提供任何所需之限制性位點。
在一個態樣，重組載體內之每個順反子包含分泌信號序列組分，其指導所表現之多肽跨膜轉運。一般來說，信號序列可為載體之組分，或其可為 插入載體中之目標多肽DNA之一部分。出於本發明目的選擇之信號序列應該係宿主細胞識別及處理(即被信號肽酶切割)之信號序列。對於不能識別及處理異源多肽原生之信號序列之原核宿主細胞，信號序列被原核信號序列取代，該原核信號序列選自例如由以下各者組成之群：鹼性磷酸酶、青黴素酶、Ipp或熱穩定腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA及MBP。在本申請案之一些實施例中，在表現系統之兩個順反子中使用之信號序列係STII信號序列或其變體。
在一些實施例中，根據本申請案之抗TIGIT構建體之產生可以發生在宿主細胞之細胞質中，因此不需要在每個順反子內存在分泌信號序列。在一些實施例中，多肽組分，諸如編碼視情況與第一抗原結合部分融合之第二抗原結合部分之VH域之多肽，及編碼視情況與第一抗原結合部分融合之第二抗原結合部分之VL域之多肽在細胞質內表現、摺疊及組裝以形成功能性抗體。某些宿主菌株(例如，大腸桿菌trxB-菌株)提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，從而允許所表現之蛋白質亞基之正確摺疊及組裝。Proba及Pluckthun Gene,159：203(1995)。
本發明提供了一種表現系統，在該表現系統中可以調節所表現之多肽組分之定量比，以使本申請案之抗體之分泌及適當組裝之產量最大化。此調節至少部分地藉由同時調節多肽組分之轉譯強度來完成。在Simmons等之美國專利第5,840,523號中揭示了一種調節轉譯強度之技術。它利用順反子內之轉譯起始區(TIR)之變體。對於給定之TIR，可以產生具有一系列轉譯強度之一系列胺基酸或核酸序列變體，從而提供方便之手段，藉以調整該因子以獲得特定鏈之所需表現水準。TIR變體可以藉由常規誘變技術產生，其導致密碼子改變，從而可以改變胺基酸序列，但核酸序列中之沈默改變係較佳的。TIR之改變可包括例如Shine-Dalgarno序列之數量或間隔之改變，以及信號序列之改變。產生突變 信號序列之一種方法係在編碼序列開始時產生「密碼子庫」，其不改變信號序列之胺基酸序列(即，改變係沈默的)。此可以藉由改變每個密碼子之第三個核苷酸位置來達成；另外，一些胺基酸(諸如白胺酸、絲胺酸及精胺酸)具有多個第一及第二位置，從而可能增加製造庫之複雜性。
較佳地，產生具有針對其中每個順反子之TIR強度範圍之載體集合。該有限集合提供了在各種TIR強度組合下各鏈表現水準以及所需蛋白質產物之產率之比較。TIR強度可以藉由定量報道基因之表現水準來確定，如Simmons等美國專利第5,840,523號中詳細描述的。基於轉譯強度比較，選擇期望之個別TIR以在本申請案之表現載體構建體中組合。
b)原核宿主細胞
適用於表現本申請案之抗體之原核宿主細胞包括古細菌類(Archaebacteria)及真細菌類(Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性(Gram-negative)或革蘭氏陽性(Gram-positive)生物。有用細菌之實例包括埃希氏菌屬(Escherichia)(例如，大腸桿菌)、芽孢桿菌(Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis))、腸桿菌(Enterobacteria)、假單胞菌屬(Pseudomonas)物種(例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)、志賀氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明顫菌(Vitreoscilla)或副球菌(Paracoccus)。在一些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一些實施例中，大腸桿菌細胞用作本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括菌株W3110及其衍生物，包括具有基因型W3110AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc-fepE)degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號)。其他菌株及其衍生物，諸如大腸桿菌294(ATCC 31,446)、大腸桿菌B、大腸桿菌1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌RV308(ATCC 31,608)亦係合適的。此等實例係說明性的而非限制性的。考慮到複製子在細菌 細胞中之可複製性，通常需要選擇合適之細菌。例如，當眾所周知之質體諸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410用於提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌屬物種可適合用作宿主。
通常，宿主細胞應分泌最少量之蛋白水解酶，並且可以理想地將另外之蛋白酶抑制劑摻入細胞培養物中。
c)蛋白質生產
宿主細胞用上述表現載體轉化，並在被調節為適合誘導啟動子、篩選轉化子或擴增編碼所需序列之基因的常規營養培養基中培養。轉化意味著將DNA引入原核宿主中，使得DNA可以作為染色體外元件或藉由染色體整合體來複製。取決於所用之宿主細胞，使用適合於此類細胞之標準技術進行轉化。使用氯化鈣之鈣處理通常用於含有大量細胞壁屏障之細菌細胞。另一種轉化方法使用聚乙二醇/DMSO。使用之另一種技術係電穿孔。
宿主細胞用上述表現載體轉化，並在被調節為適合誘導啟動子、篩選轉化子或擴增編碼所需序列之基因的常規營養培養基中培養。轉化意味著將DNA引入原核宿主中，使得DNA可以作為染色體外元件或藉由染色體整合體來複製。取決於所用之宿主細胞，使用適合於此類細胞之標準技術進行轉化。使用氯化鈣之鈣處理通常用於含有大量細胞壁屏障之細菌細胞。另一種轉化方法使用聚乙二醇/DMSO。使用之另一種技術係電穿孔。
使用於產生本申請案之抗體之原核細胞在此項技術已知並適於培養所選擇之宿主細胞之培養基中生長。合適之培養基之實例包括luria肉湯(LB)加必需之營養補充劑。在一些實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構建來選擇之選擇劑，以選擇性地允許含有表現載體之原核細胞之生長。例如，將胺苄青黴素添加到培養基中以供表現胺苄青黴素抗性基因之細胞生長。
除了碳、氮及無機磷酸鹽源之外之任何必要之補充物亦可以以適當 濃度包括在內，該等補充物單獨或作為與另一種補充物或介質之混合物(諸如複合氮源)引入。視情況地，培養基可含有一種或多種選自由麩胱甘肽、半胱胺酸、胱胺、巰基乙酸鹽、二硫赤蘚糖醇及二硫蘇糖醇組成之群之還原劑。原核宿主細胞在合適之溫度下培養。例如，對於大腸桿菌生長，較佳之溫度範圍為約20℃至約39℃，更佳約25℃至約37℃，甚至更佳在約30℃。培養基之pH可以為約5至約9之任何pH，主要取決於宿主生物。對於大腸桿菌，pH較佳為約6.8至約7.4，且更佳為約7.0。
如果在本申請案之經表現載體中使用誘導型啟動子，則在適於活化啟動子之條件下誘導蛋白質表現。在本申請案之一個態樣中，PhoA啟動子用於控制多肽之轉錄。因此，轉化之宿主細胞在用於誘導之磷酸鹽限制培養基中培養。較佳地，磷酸鹽限制培養基係C.R.A.P培養基。根據所用之載體構建體，可以使用多種其他誘導物，如此項技術已知的。
本申請案之表現之抗TIGIT構建體被分泌到宿主細胞之周質中並從宿主細胞之周質中回收。蛋白質回收通常涉及破壞微生物，通常藉由諸如滲透壓休克、超聲處理或裂解之方式破壞微生物。一旦細胞被破壞，可藉由離心或過濾除去細胞碎片或全細胞。蛋白質可以進一步純化，例如，藉由親和樹脂層析法。或者，可將蛋白質轉運到培養基中並在其中分離。可以從培養物中除去細胞，過濾培養上清液並濃縮，以進一步純化所產生之蛋白質。經表現之多肽可以使用通常已知之方法進一步分離及鑒定，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)及Western印跡測定。
或者，藉由發酵過程大量進行蛋白質生產。各種大規模補料分批發酵程序可用於生產重組蛋白。大規模發酵具有至少1000升容量，較佳約1,000至100,000升容量。此等發酵罐使用攪拌器葉輪來分配氧氣及營養物質，尤其係葡萄糖(較佳之碳/能源)。小規模發酵通常係指發酵罐中之發酵，其體積容量不 超過約100升，並且可以在約1升至約100升之範圍內。
在發酵過程中，蛋白質表現之誘導通常在細胞已經在合適條件下生長至所需密度(例如OD550為約180-220)後開始，在該階段細胞處於早期穩定期。根據所用之載體構建體，可以使用多種誘導物，如此項技術已知及如上所述。細胞可以在誘導前生長更短之時間。細胞通常誘導約12-50小時，但可以使用更長或更短之誘導時間。
為了提高本申請案之抗體之產量及品質，可以改變各種發酵條件。例如，為了改善所分泌多肽之正確組裝及摺疊，過量表現分子伴侶蛋白，如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴侶蛋白活性之肽基脯胺醯順式，反式異構酶)之其他載體可用於共轉化宿主原核細胞。已證明伴侶蛋白促進細菌宿主細胞中產生之異源蛋白質之正確摺疊及溶解性。
為了使表現之異源蛋白質(特別係蛋白水解敏感之蛋白質)之蛋白水解最小化，某些缺乏蛋白水解酶之宿主菌株可用於本發明。例如，可以修飾宿主細胞株以在編碼已知細菌蛋白酶之基因中達成基因突變，例如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合。
缺乏蛋白水解酶並用過量表現一種或多種伴侶蛋白之質體轉化之大腸桿菌菌株可用作編碼本申請案抗體之表現系統中之宿主細胞。
d)蛋白質純化
進一步純化本文產生之抗TIGIT構建體以獲得基本上同質之製劑用於進一步之測定及用途。可以使用此項技術已知之標準蛋白質純化方法。以下程序係合適之純化程序之示例：在免疫親和或離子交換柱上分級，乙醇沈澱，反相HPLC，在二氧化矽上或在陽離子交換樹脂如DEAE上之層析，層析聚焦，SDS-PAGE，硫酸銨沈澱，及使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾。
在一些實施例中，固定在固相上之蛋白A用於包含本申請案Fc區之 抗體之免疫親和純化。蛋白A係來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)之411D細胞壁蛋白，其與抗體之Fc區以高親和力結合。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.62：1-13。固定有蛋白A之固相較佳為包含玻璃或二氧化矽表面之柱，更佳為可控孔徑玻璃柱或矽酸柱。在一些應用中，柱已經塗覆有試劑，例如甘油，以試圖防止污染物之非特異性黏附。然後洗滌固相以除去非特異性結合至固相之污染物。最後，藉由溶析從固相中回收目標抗體。
2. 在真核細胞中重組生產
對於真核表現，載體組分通常包括但不限於以下一或多者：信號序列、複製起點、一種或多種標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。
a)信號序列組分
用於真核宿主之載體亦可以為插入物，其編碼信號序列或在成熟蛋白質或多肽之N末端具有特異性切割位點之其他多肽。選擇之異源信號序列較佳係被宿主細胞識別及處理(即被信號肽酶切割)之信號序列。在哺乳動物細胞表現中，可獲得哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導序列，例如單純皰疹gD信號。
將此前體區之DNA以讀碼框連接到編碼本申請案抗體之DNA上。
b)複製起點
通常，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(通常使用SV40起點僅因為它含有早期啟動子)。
c)選擇基因組分
表現及選殖載體可含有選擇基因，亦稱為選擇標記。典型之選擇基因編碼之蛋白質(a)賦予對抗生素或其他毒素，例如胺苄青黴素、新黴素、胺甲蝶呤或四環素之抗性，(b)補充營養缺陷型缺陷，或(c)提供複雜培養基無法獲得之關鍵營養素，例如：編碼用於芽孢桿菌D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇方案之一個實例利用藥物來阻止宿主細胞之生長。用異源基因 成功轉化之彼等細胞產生賦予抗藥性之蛋白質，從而在選擇方案中存活。此顯性選擇之實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。
用於哺乳動物細胞之合適選擇標記之另一個實例係能夠鑒定能夠攝取編碼本申請案抗體之核酸之細胞之彼等選擇標記，例如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II、較佳靈長類動物金屬硫蛋白基因、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。
例如，首先藉由在含有胺甲蝶呤(Mtx)(DHFR之競爭性拮抗劑)之培養基中培養所有轉化體來鑒定用DHFR選擇基因轉化之細胞。當採用野生型DHFR時，合適之宿主細胞係DHFR活性缺失之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如ATCC CRL-9096)。
或者，用編碼多肽之DNA序列、野生型DHFR蛋白及另一種選擇標記如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH)轉化或共轉化之宿主細胞(特別係含有內源DHFR之野生型宿主)可以藉由在含有針對選擇標記之選擇劑之培養基中進行細胞生長來選擇，該選擇劑例如胺基糖苷類抗生素，例如卡那黴素、新黴素或G418。
d)啟動子組分
表現及選植載體通常含有由宿主生物識別，並且可操作地連接至編碼所需多肽序列之核酸之啟動子。事實上所有的真核基因均具有富含AT的區，區位於轉錄起始位點之上游大約25至30個鹼基處。在許多基因之轉錄開始的上游70至80個鹼基處發現之另一個序列係CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。在大多數真核基因的3'末端的係AATAAA序列，其可為用於將poly A尾添加到編碼序列之3'末端的信號。所有此等序列可插入真核表現載體中。
適用於原核宿主之其他啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶啟動子、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子如tac啟動子。然而，其他已知之細菌啟動子亦係合適的。用於細菌系統中之啟動子亦 可含有可操作地連接於編碼抗體之DNA之Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
來自哺乳動物宿主細胞中之載體之多肽轉錄例如藉由以下各者來控制：從諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒且最佳猿猴病毒40(SV40)之病毒之基因組獲得之啟動子，異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)，熱休克啟動子，條件係此等啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子可方便地作為SV40限制性片段獲得，該片段亦含有SV40病毒複製起點。人巨細胞病毒之立即早期啟動子可方便地作為HindIII E限制性片段獲得。使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表現DNA之系統在美國專利第4,419,446號中揭示。該系統之改進在美國專利第4,601,978號中描述。關於在來自單純皰疹病毒之胸苷激酶啟動子控制下之小鼠細胞中人干擾素cDNA之表現，亦參見Reyes等，Nature 297：598-601(1982)。或者，勞斯肉瘤病毒長末端重複序列可用作啟動子。
e)增強子元件組分
藉由將增強子序列插入載體中，通常可以提高高等真核生物對編碼本申請案抗體之DNA之轉錄。現在已知許多來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白及胰島素)之增強子序列。然而，通常，人們將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括複製起點(100-270bp)之後側上之SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、複製起點之後側上之多瘤增強子及腺病毒增強子。增強子可在多肽編碼序列之5'或3'位剪接到載體中，但較佳位於啟動子之5'部位。
f)轉錄終止組分
用於真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其他多細胞生物之有核細胞)中之表現載體亦將含有終止轉錄及穩定mRNA所必需 之序列。此類序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA之5’及偶爾3'非轉譯區中獲得。此等區域含有轉錄為多肽編碼mRNA之非轉譯部分中之腺苷酸化片段之核苷酸區段。一種可用的轉錄終止組分係牛生長激素聚腺苷酸化區。參見WO94/11026及在其中揭示之表現載體。
g)宿主細胞之選擇及轉化
用於在本文載體中選殖或表現DNA之合適宿主細胞包括本文所述之高等真核細胞，包括脊椎動物宿主細胞。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中之繁殖已成為常規程序。有用之哺乳動物宿主細胞系之實例係由SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(次選殖以便在懸浮培養中生長之293或293細胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；小倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞特利氏細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1細胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞系(Hep G2)。
宿主細胞被用於產生抗體之上述表現或選植載體轉化並且在經適當改良以誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所需序列之基因的慣用培養基中培養。
h)培養宿主細胞
用於產生本發明之抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。如Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基(Minimal Essential Medium)((MEM),(Sigma)、 RPMI-1640(Sigma)及杜氏改良依格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(Sigma)等可商購獲得的培養基適用於培養宿主細胞。必要時培養基都可補充有激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂、及磷酸鹽)、緩衝劑(如HEPES)、核苷酸(如腺苷及胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以在微莫耳濃度範圍內的最終濃度存在的無機化合物)以及葡萄糖或等效能量來源。亦可以以熟習此項技術者已知之適當濃度包括任何其他必需之補充劑。培養條件，例如溫度、pH等，係先前與選擇用於表現之宿主細胞一起使用之彼等，並且對於普通熟習此項技術者係顯而易見的。
i)蛋白質純化
當使用重組技術時，抗體可在細胞內在周質空間中產生，或直接分泌到培養基中。如果抗體在細胞內產生，那麼作為第一個步驟，例如藉由離心或超濾去除微粒狀碎片(宿主細胞或裂解的片段)。Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述了分離分泌到大腸桿菌周質空間之抗體之程序。簡而言之，在約30分鐘內在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下解凍細胞糊狀體。可以藉由離心除去細胞碎片。當抗體被分泌至培養基中時，通常首先使用可商購獲得的抗體濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮來自此類表現系統之上清液。可在任何前述步驟中納入蛋白酶抑制劑(如PMSF)以抑制蛋白水解並且可納入抗生素以防止外來污染物之生長。
由細胞製備之蛋白質組合物可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析來純化，親和層析係較佳之純化技術。蛋白A作為親和配體之適合性取決於抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc域之種類及同種型。蛋白A可用於純化基於含有1、2或4條重鏈之人免疫球蛋白之抗體。蛋白質G被推薦用於所有小鼠同種型及人3個同種型。親和配體所附接的基質最通常為瓊脂糖， 但亦可用其他基質。機械穩定的基質，如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯，允許比使用瓊脂糖可達成的流動速率快的流動速率及使用瓊脂糖可達成的處理時間短的處理時間。在抗體包含CH3結構域的情況下，Bakerbond ABXTM樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)適用於純化。根據待回收之抗體，其他蛋白質純化技術，如離子交換柱上之分級，乙醇沈澱，反相HPLC，二氧化矽層析，肝素SEPHAROSETM層析，陰離子或陽離子交換樹脂(如聚天冬胺酸柱)層析，層析聚焦，SDS-PAGE及硫酸銨沈澱亦為可利用的。
在任何初步純化步驟之後，可以使包含目標抗體及污染物之混合物經受使用pH在約2.5-4.5之間之溶析緩衝液的低pH疏水相互作用層析，該層析較佳在低鹽濃度(例如，約0-0.25M鹽)下進行。
3. 多株抗體
通常藉由多次皮下(s.c.)或腹膜內(i.p.)注射相關抗原及佐劑在動物中產生多株抗體。使用雙功能性或衍生化藥劑將相關抗原偶聯到在待免疫的物種中係免疫原性之蛋白質(例如，鑰孔蟲感血藍蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑)可能係有用的，雙功能性或衍生化藥劑例如馬來醯亞胺苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(藉由半胱胺酸殘基偶聯)、N-經基琥珀醯亞胺(藉由離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N=C=NR，其中R及R1獨立地係低級烷基。可採用之佐劑之實例包括弗氏完全佐劑及MPL-TDM佐劑(單磷醯脂質A、合成的海藻糖二黴菌酸酯(trehalose dicorynomycolate))。免疫方案可由本領域技術人員選擇而無需過多的實驗。
藉由將例如100μg(針對兔)或5μg(針對小鼠)的蛋白質或偶聯物與3個體積的弗氏完全佐劑組合並且在多個部位處皮內注射溶液來針對抗原、免疫原性偶聯物、或衍生物對動物進行免疫。一個月後，藉由在多個部位皮下注射，用1/5至1/10的初始量的於弗氏完全佐劑中的肽或偶聯物對動物加強免疫。七 至十四天後，對動物進行放血，測定血清的抗體滴度。對動物加強免疫，直至滴度達到穩定為止。偶聯物亦可在重組細胞培養物中製備為蛋白質融合體。另外，聚集劑(諸如明礬)適於增強免疫應答。亦參見實例1之駱駝中之免疫接種。
4. 單株抗體
單株抗體從基本上均質的抗體的群體獲得，即構成該群體之個體抗體係相同的，除了可能以微量存在的可能天然存在的突變及/或轉譯後修飾(例如，異構化，醯胺化)之外。因此，修飾語「單株」指示如不為分散抗體之混合物之抗體的特徵。例如，單株抗體可使用最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)描述的雜交瘤方法製備，或者可藉由重組DNA方法(美國專利第4,816,567號)製備。在雜交瘤方法中，使小鼠或其他適當的宿主動物(諸如倉鼠或美洲駝)如本文所述那樣免疫以得到產生或能夠產生將特異性結合用於免疫的蛋白質之抗體之淋巴細胞。可替代地，可體外免疫淋巴細胞。然後使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第59-103頁(Academic Press，1986))。亦參見實例1之駱駝中之免疫接種。
免疫劑通常包括抗原蛋白或其融合變體。一般說來，如果需要人類來源之細胞，則使用外周血淋巴細胞(「PBL」)；而如果需要非人類哺乳動物來源之細胞，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然後使用合適的融合劑(諸如聚乙二醇)使淋巴細胞與永生化細胞系融合以形成雜交瘤細胞。Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press(1986)，第59-103頁。
永生化細胞系通常係經過轉化的哺乳動物細胞，尤其係齧齒動物、牛及人類來源的骨髓瘤細胞。通常，採用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。接種由此製備的雜交瘤細胞，並且使其在較佳地含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質的合適的培養基中生長。例如，如果親本骨髓瘤細胞 缺少酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，則用於雜交瘤的培養基通常包括次黃嘌呤、胺基蝶呤及胸苷(HAT培養基)，它們係防止HGPRT缺陷細胞的生長的物質。
較佳永生化骨髓瘤細胞係有效地融合、支持藉由產生所選抗體之細胞穩定高水平地產生抗體、並且對培養基(諸如HAT培養基)敏感的彼等骨髓瘤細胞。在此等中，較佳者係鼠骨髓瘤系，諸如源自MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤(可從Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA獲得)的彼等細胞系以及SP-2細胞(及其衍生物，例如，X63-Ag8-653)(可從American Type Culture Collection，Manassas，Va.USA獲得)。
測定雜交瘤細胞生長所處之培養基中針對抗原之單株抗體之產生。較佳地，藉由免疫沈澱法或藉由體外結合測定(諸如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來確定雜交瘤細胞產生之單株抗體之結合特異性。
可以測定培養雜交瘤細胞之培養基中是否存在針對所需抗原之單株抗體。較佳地，藉由免疫沈澱法或藉由體外結合測定(諸如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定(ELISA))來確定單株抗體之結合親和力及特異性。此等技術及測定係此項技術中已知的。例如，結合親和力可以藉由Munson等，Anal.Biochem.,107：220(1980)之Scatchard分析來測定。
在識別出產生具有所需特異性、親和力及/或活性之抗體之雜交瘤細胞之後，可藉由有限稀釋程序對純系進行亞選植並且藉由標準方法使其生長(Goding，出處同上)。用於此目的之合適的培養基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可作為腫瘤在哺乳動物中體內生長。
由亞純系分泌之單株抗體藉由常規免疫球蛋白純化程序(例如像多肽A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法)從培養基、腹水或血清適當地分離。
單株抗體亦可以藉由重組DNA方法製備。編碼單株抗體之DNA容易分離並且使用常規程序(例如，使用能夠特異性結合至編碼鼠科抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)來測序。雜交瘤細胞充當此DNA之較佳來源。分離後，可將DNA置於表現載體中，然後將其轉染到宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞)中，該等細胞不另外產生免疫球蛋白，以便在此等重組宿主細胞中合成單株抗體。
在另一個實施例中，抗體可從使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)中所描述之技術生成之抗體噬菌體文庫分離。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫之鼠抗體及人類抗體的分離。隨後的出版物描述藉由鏈改組(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及組合感染及體內重組作為構建非常大的噬菌體文庫之策略(Waterhouse等，Nucl.Acids.Res.21：2265-2266(1993))生成高親和性(nM範圍)的人抗體。因此，此等技術為用於分離單株抗體之傳統單株抗體雜交瘤技術的可行備選方案。
DNA亦可以被修飾，例如，藉由用人重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列代替同源鼠序列(美國專利第4,816,567號；Morrison等，Proc.Natl Acad.Sci.USA,81：6851(1984))，或藉由將非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列。通常，此類非免疫球蛋白多肽取代抗體之恆定結構域，或者它們取代抗體之一個抗原組合位點之可變域以產生嵌合二價抗體，該嵌合二價抗體包括具有針對抗原之特異性的一個抗原組合位點及具有針對不同抗原之特異性的另一個抗原組合位點。
本文所述之單株抗體可以為單價的，其製備係此項技術熟知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈及修飾之重鏈之重組表現。重鏈通常在Fc區中的任何點處截短，以便防止重鏈交聯。可替代地，相關的半胱胺酸殘基可使 用另一種胺基酸殘基取代或缺失以便防止交聯。體外方法亦適於製備單價抗體。消化抗體以產生其片段(具體地係Fab片段)可使用本領域已知的常規技術來達成。
嵌合或雜合抗體亦可使用合成蛋白質化學中已知的方法(包括涉及交聯劑之彼等方法)在體外製備。例如，免疫毒素可使用二硫鍵交換反應或藉由形成硫醚鍵來構建。用於此目的之合適的試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及4-巰基丁醯亞胺酸甲基酯。
另外，參見實例1之單株sdAb生產。
5. 人源化抗體
非人類(例如，鼠)抗體的人源化形式係包含源自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合亞序列)。人源化抗體包括其中來自受者的CDR的殘基被來自諸如小鼠、大鼠、兔、駱駝科或美洲駝的非人類物種(供體抗體)的CDR的具有所需特異性、親和力及能力的殘基替換的人類免疫球蛋白(受者抗體)。在一些情況下，人類免疫球蛋白的FR框架殘基被對應的非人類殘基替換。人源化抗體亦可包含既不存在於受者抗體中亦不存在於輸入CDR或框架序列中的殘基。通常，人源化抗體包含至少一個並且通常兩個可變域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR區對應於非人類免疫球蛋白的彼等CDR區並且全部或基本上全部的Fv區係人類免疫球蛋白共有序列的彼等FR區。在一些實施例中，人源化抗體包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常人免疫球蛋白的恆定區)的至少一部分。參見例如Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
用於人源化非人抗體之方法係此項技術熟知的。通常，人源化抗體具有從非人來源引入其中之一個或多個胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基經 常被稱為「輸入」殘基，輸入殘基通常取自「輸入」可變域。人源化可基本上按照Winter及合作者的方法(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，藉由用齧齒動物CDR或CDR序列取代人抗體的對應序列來進行。因此，此類「人源化」抗體係嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中基本上小於完整的人類可變域被來自非人類物種的對應序列取代。實際上，人源化抗體通常係人類抗體，其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基被來自齧齒動物抗體中的類似位點的殘基取代。
用於製備人源化抗體的人可變域輕鏈及重鏈兩者的選擇對降低抗原性係非常重要的。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知的人類可變域序列的整個文庫篩選齧齒動物抗體的可變域的序列。然後接受最接近於齧齒動物的序列的人類序列作為人源化抗體的人類框架(FR)。Sims等，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.,196：901(1987)。另一種方法使用源自特定亞組的輕鏈或重鏈的全部人類抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可用於若干不同的人源化抗體。
亦重要的是，抗體被人源化成保留對抗原的高親和力及其他有利的生物特性。為達成這一目標，根據較佳方法，利用親本序列及人源化序列的三維模型藉由親本序列及各種概念上人源化之產物之分析方法製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常係可獲得的並且係熟習此項技術者熟悉的。可獲得電腦程序，其說明及顯示所選候選免疫球蛋白序列之可能之三維構形結構。檢查此等顯示允許對殘基在候選免疫球蛋白序列的功能方面的可能的作用進行分析，即，對影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基進行分析。以這種方式，可從接受者及輸入序列中選擇並併入FR殘基，從而達成所需的抗體特徵，諸如增加的對靶抗原的親和力。通常，CDR殘基直接並且最基本地參與影響抗 原結合。
在一些實施例中，sdAb被修飾，例如人源化，而不降低該域對抗原之天然親和力，同時降低其對異源物種之免疫原性。例如，可以確定美洲駝抗體之抗體可變域(VHH)之胺基酸殘基，並且例如在框架區中之一個或多個駱駝科胺基酸被其在人類共有序列中發現之人類對應物替換，該多肽不失去其典型特徵，即人源化不會顯著影響所得多肽之抗原結合能力。駱駝科sdAb之人源化需要在單一多肽鏈中引入及誘變有限量之胺基酸。此與scFv、Fab'、(Fab')2及IgG之人源化形成對比，其需要在兩條鏈，輕鏈及重鏈中引入胺基酸變化以及兩條鏈之組裝之保存。
6. 人抗體
作為人源化的替代方案，可產生人抗體。例如，現在可能在內源性免疫球蛋白產生不存在下在免疫之後能夠產生人類抗體的全譜的轉基因動物(例如，小鼠)。例如，已經描述了在嵌合及種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(JH)基因的純合子缺失導致完全抑制內源性抗體產生。在此類種系突變體小鼠中轉移人類種系免疫球蛋白基因陣列將在抗原攻擊之後引起人類抗體的產生。
可替代地，噬菌體展示技術可用於從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結構域基因譜在體外產生人類抗體及抗體片段。McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)；Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)。根據此技術，將抗體V結構域基因同框選植到絲狀噬菌體(諸如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，並且在噬菌體顆粒的表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基於抗體的功能特性進行選擇亦引起選擇編碼表現出此等特性的抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種形式進行。V基因片段的幾個來源可用於噬菌體展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)從源自免疫小鼠的脾的V 基因的小隨機組合文庫分離多種不同陣列的抗唑酮抗體。可構建來自未免疫人類供體的V基因譜，並且可主要遵循由以下所述的技術分離針對多種不同陣列的抗原(包括自體抗原)的抗體：Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)。亦參見美國專利第5,565,332號及第5,573,905號。
Cole等及Boerner等之技術亦可用於製備人單株抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)及Boerner等，J.Immunol.,147(1)：86-95(1991))。相似地，人類抗體可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入到轉基因動物(例如，其中內源性免疫球蛋白基因部分地或完全地失活的小鼠)中來製備。在攻擊之後，觀察到人類抗體產生，這在各個方面(包括基因重排、裝配及抗體譜)與在人類中看到的非常相似。此方法描述在例如美國專利第5,545,807號；第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號及Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)，Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-851(1996)，Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)以及Lonberg及Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。例如，在一些實施例中，可藉由對人HCAb小鼠進行免疫接種來產生人抗體(例如人DAb)。例如，HCAb(例如，sdAb-Fc融合蛋白)可以藉由對轉基因小鼠進行免疫接種來產生，其中已經消除了內源性鼠抗體表現並且已經引入了人轉基因。HCAb小鼠在US8,883,150，US8,921,524，US8,921,522，US8,507,748，US8,502,014，US2014/0356908，US2014/0033335，US2014/0037616，US2014/0356908，US2013/0344057，US2013/0323235，US2011/0118444及US2009/0307787中揭示，所有此等文獻關於僅重鏈抗體及其在轉基因小鼠中之產生之揭示內容以引用方式併入本文。對HCAb小鼠免疫接種並將得到之預敏化之脾細胞與鼠骨髓 瘤細胞融合以形成雜交瘤。然後藉由用人序列取代鼠CH2及CH3區，可以使得到之HCAb完全係人的。
最後，人抗體亦可以藉由活體外活化之B細胞(參見美國專利5,567,610及5,229,275)或藉由使用此項技術已知之各種技術產生，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.,222：581(1991)。
VI. 製品及套組
亦提供了套組及製品，其包含任何分離的抗TIGIT構建體(例如抗TIGIT sdAb，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白，PD-1×TIGIT雙特異性構建體(例如BABP)，PD-L1×TIGIT雙特異性構建體(例如，BABP))，編碼其之分離的核酸或載體，或分離的宿主細胞，其包含編碼本文所述之抗TIGIT構建體之分離的核酸或載體。在一些實施例中，提供了套組，其包含本文所述之任何一種醫藥組合物，並且較佳提供其使用說明。
本申請案之套組處於合適的包裝中。合適的包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、柔性包裝(例如，密封的聚酯薄膜或塑膠袋)等。套組可視情況提供額外的組分，諸如緩衝液及解釋性資訊。因此，本申請案亦提供了製品，其包括小瓶(例如密封小瓶)、瓶子、罐子、軟包裝等。
製品可包含容器及容器上或與容器相關的標籤或包裝說明書。適合的容器包括瓶、小瓶、注射器等。容器可由多種材料(如玻璃或塑膠)形成。通常，容器保存對治療本文所述疾病或病況(諸如癌症)有效的組合物並且可具有無菌入口(例如，容器可為具有可經皮下注射用注射針刺破的塞子的靜脈輸液袋或小瓶)。標記或包裝插入物指示組合物用於治療個體的具體病狀。標記或包裝插入物將亦包括用於向個體投與組合物的說明書。標籤可以指示復溶及/或使用之指示。容納醫藥組合物之容器可以為多次使用之小瓶，其允許復溶調配物之重複 投與(例如2-6次投與)。包裝插入物係指習慣上包括於治療產品的商業包裝中的說明書，說明書含有關於指征、用法、劑量、投與、禁忌症及/或涉及治療產品使用的警告的資訊。另外，製品可以進一步包括第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。它可以進一步包括從商業及用戶觀點看期望的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
套組或製品可包括多個單位劑量之醫藥組合物及使用說明書，其包裝量足以在藥房，例如醫院藥房及配藥藥房中存儲及使用。
實例
以下實例僅意圖例示本發明，並且因此不應視為以任何方式限制本發明。提供以下實例及詳述係用以說明而非用以限制。
實例1：抗TIGIT sdAb之產生 免疫接種
在所有當前動物福利法規下，用重組TIGIT-Fc(Acrobiosystems)蛋白對駱駝進行免疫接種。為了免疫接種，將抗原調配成具有CFA(完全弗氏佐劑；初次免疫)或IFA(不完全弗氏佐劑；加強免疫)之乳液。在頸部皮下投與抗原。每只動物接受5次注射乳液(含有100μg之CFA乳液中之TIGIT-Fc)，並且隨後以2週之間隔，注射4次在IFA乳液中之TIGIT-Fc。在免疫接種期間之不同時間點，從動物收集10ml血液樣品並製備血清。在使用固定化TIGIT-His蛋白之基於ELISA之實驗中使用血清樣品驗證抗原特異性體液免疫應答之誘導(圖1及圖2)，顯示足夠之應答引發，包括重鏈免疫球蛋白(HCAb)。最後一次免疫接種後5天，收集300ml血樣。使用Ficoll-Paque梯度(Amersham Biosciences)從300ml血液樣品中分離作為駱駝HCAb遺傳來源之外周血淋巴細胞(PBL)，產生1×109個PBL。
文庫構建
從PBL提取之RNA用作RT-PCR之起始材料以擴增sdAb編碼基因片段。將此等片段選殖到內部噬菌粒載體中。在與sdAb編碼序列一致之情況下，該載體編碼C末端His-Tag。文庫大小約為6×108。根據標準方案製備文庫噬菌體，並在4℃過濾滅菌後儲存以供進一步使用。
選擇及高通量篩選
使用固體淘選以及基於細胞之淘選，用上述文庫進行選擇。對此等兩種情況僅進行了單輪選擇。針對富集因子(相對於對照之在析出液中存在之噬菌體之數量)、多樣性及TIGIT陽性純系之百分比(ELISA)來分析每個選擇輸出物。基於此等參數，選取最佳選擇用於進一步分析。為此，將每個選擇之輸出物作為彙集物來重新選殖到可溶性表現載體中以進行高通量篩選。在與sdAb編碼序列一致之情況下，該載體編碼C末端His-Tag。挑取菌落並在96孔深孔板(1mL體積)中生長，並藉由加入IPTG及0.1% Triton誘導上清液中之sdAb表現。
分析上清液結合TIGIT蛋白(藉由ELISA)及表現TIGIT之CHO-K1穩定細胞系(藉由FACS)之能力。對陽性結合物進行測序且選擇獨特之純系用於進一步表徵。
獨特之純系在2XYT培養基中生長，並藉由IPTG誘導上清液中之sdAb表現。分析獨特結合物之上清液抑制CD155與TIGIT之間相互作用之能力。為此，首先將表現TIGIT之穩定CHO細胞與含sdAb之上清液一起溫育，然後與CD155-Fc(Acrobiosystems)一起溫育，然後與螢光團標記之抗人Fc之二級抗體一起溫育。與沒有抗TIGIT sdAb阻斷之樣品相比，平均螢光強度(MFI)之變化代表CD155/TIGIT結合之阻斷。
選擇所有潛在之抑制劑用於在BIAcore T200儀器上藉由表面電漿子共振(SPR)來進行KD分析。解離相用於計算每個個別sdAb之koff值。
實例2：抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之製備及活體外評估 產生sdAb-Fc融合蛋白
藉由將抗TIGIT sdAb與人IgG1 Fc區融合來產生抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白構建體。製備構建體之maxiprep用於CHO-K1細胞瞬時表現及純化。表現之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白藉由層析法經由含有蛋白A瓊脂糖樹脂之柱來純化。藉由SEC-HPLC測定蛋白質純度。藉由Bristol-Myers Squibb產生之抗TIGIT抗體22G2，根據公佈專利中之序列(參見US2016/0176963，SEQ ID NO：7及9)在人類IgG1主鏈中產生。阻斷鼠科TIGIT之倉鼠抗體，10A7，根據在公佈專利中報告之序列(參見US2015/0216970，SEQ ID NO：13及15)在人類IgG1主鏈中產生。
藉由表面電漿子共振(SPR)進行靶蛋白結合及跨物種反應測試
利用BIAcore T200儀器藉由SPR測定每種抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之親和常數(K D )。簡而言之，人、食蟹猴或小鼠TIGIT-His蛋白(Acrobiosystems)以不高於100RU之密度與CM5感測器晶片胺偶聯。以不少於5種不同濃度注射抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白。幾種示例性抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之動力學資料總結於表3中。
藉由FACS分析CHO-TIGIT細胞結合及配體結合之抑制
為了確定細胞結合EC50，收穫表現人、食蟹猴或鼠TIGIT之CHO-K1細胞，並用梯度濃度之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白溫育，然後用螢光團標記之抗人Fc之二級抗體溫育。對於阻斷測定，將固定濃度之生物素化之CD155-Fc蛋白(Acrobiosystems)加入到溫育中，並用螢光團標記之鏈黴抗生物素蛋白檢測CD155-Fc與CHO/人TIGIT細胞之結合。用流式細胞術分析樣品。表4總結了抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之結合及阻斷能力之EC50。抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白對CHO細胞上表現之人TIGIT具有與陽性對照22G2相似或更好之結合能力，而AS19584-Fc、AS19886-Fc及AS20160-Fc對22G2表現出優異之配體阻斷能力。另外，發現AS19584-Fc以與在CHO細胞上表現之人TIGIT結合之相似EC50來結合在CHO細胞上表現之小鼠TIGIT。檢測到小鼠TIGIT交叉結合對照10A7，具有0.709nM之CHO/小鼠TIGIT結合EC50，與AS19584-Fc相似。
CT26係一種鼠結腸癌細胞系，具有高表現之鼠CD155(資料未顯示)。因為AS19584-Fc與鼠TIGIT交叉反應，為了評估其阻斷TIGIT與其主要配體CD155相互作用之能力，CT26細胞在梯度濃度之AS19584-Fc融合蛋白存在下與鼠TIGIT-Fc一起溫育。藉由用針對人Fc之螢光染料偶聯之二級抗體染色並藉由FACS檢測來評估鼠TIGIT-Fc與CT26細胞之結合。阻斷之EC50對於 AS19584-Fc為77.90nM，對於小鼠TIGIT阻斷劑10A7為71.33nM。因此，AS19584-Fc及10A7具有相當之阻斷TIGIT配體CD155之能力。
TIGIT/CD155阻斷報道基因測定
根據測定套組(Promega，Cat編號CS198811)之手冊，使用Promega TIGIT/CD155阻斷報道基因測定套組(Promega，Cat編號CS198811)進行TIGIT/CD155阻斷報道基因測定。簡言之，將解凍及使用之TIGIT效應細胞接種過夜，然後與連續稀釋之抗TIGIT抗體或抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白一起溫育，然後在合適之E：T比率下加入CD155 aAPC/CHO-K1細胞。在37℃，5%CO2下誘導6小時後，加入Bio-GloTM螢光素酶測定試劑並測定發光。使用GraphPad Prism 6軟件進行四參數邏輯曲線分析。資料曲線顯示在圖3中並總結在表5中。AS19584-Fc、AS19886-Fc及AS20160-Fc具有與22G2相當或更優異之阻斷功能。
實例3：抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在同系腫瘤模型中之活體內功效 在CT26同系腫瘤模型中比較10A7及AS19584-Fc之功效研究
由於AS19584-Fc融合蛋白及10A7具有非常接近之細胞結合並且小鼠TIGIT阻斷EC50(參見表4)，進行了在相同莫耳劑量下比較不同分子形式之兩種抗體的研究。培養表現鼠CD155之CT26腫瘤細胞，懸浮於不含鎂及鈣之HBSS-/-中，並在6-8週齡時之雌性Balb/c小鼠之側腹皮下注射5×105個細胞。使用卡尺量測腫瘤體積並用公式(長×寬×寬)/2計算。當平均腫瘤體積達到90-100mm3時，將小鼠隨機化以開始治療。測試物品每4天藉由腹膜內投與一次。在整個研究中量測體重。在投與後第18天處死動物並收穫腫瘤組織，用膠原酶 IV/DNA酶I消化以製備單細胞懸浮液用於表面標誌物CD3/CD4/CD8之染色及流式細胞術分析。
CT26腫瘤模型對於PD-1阻斷係部分抵抗的。如圖4A及4C所示，大鼠抗鼠科PD-1抗體RMP1-14(Bioxcell)在5mg/kg下對於CT26腫瘤生長具有有限之抑制。AS19584-Fc及10A7在單獨或與RMP1-14組合的情況下，均以相同莫耳劑量(分別為10mg/kg及18.8mg/kg)顯著延遲腫瘤進展。值得注意地，AS19584-Fc在投與後一週內表現出更快之反應，並且在測試之莫耳劑量下最終比10A7更均勻之反應。在關於腫瘤學不同靶點之其他研究中亦觀察到此現象(資料未顯示)。這可能與相比於全長單株抗體，sdAb-Fc融合蛋白之較小分子量相關(分別為~80kDa對150kDa)。在小鼠PK研究中，與抗TIGIT全長抗體相比，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白具有約1.5~2倍更大之在穩態下之表觀分佈容積(Vss)，及更低血漿峰濃度(Cmax)(圖9；未顯示附加資料)。差異與抗體係否與小鼠TIGIT交叉反應無關。該觀察結果表明，sdAb-Fc融合蛋白由於其小之尺寸可能比全長抗體具有更快及更強之組織(包括腫瘤)穿透，並且更快之藥效亦可能與此獨特之性質相關。如用流式細胞術評估，用AS19584-Fc治療增強了CD8+及CD4+ T細胞瘤內浸潤，而其與RMP1-14之組合進一步增強了此過濾(圖4B)。
在CT26同系腫瘤模型中測試PD-1/TIGIT雙重阻斷之功效研究
培養CT26腫瘤細胞，懸浮於不含鎂及鈣之HBSS-/-中，並在6-8週齡之雌性Balb/c小鼠之側腹皮下注射5×105個細胞。使用卡尺量測腫瘤體積並用公式(長×寬×寬)/2計算。當平均腫瘤體積達到90-100mm3時，將小鼠隨機化以開始治療。測試物品每4天藉由腹膜內投與一次。在整個研究中量測體重。
CT26腫瘤模型對於PD-1阻斷係部分抵抗的。如圖5A及5B所示，大鼠抗鼠科PD-1抗體RMP1-14(Bioxcell)在5mg/kg下適度但顯著地抑制CT26腫瘤生長。AS19584-Fc融合蛋白在與RMP1-14相同莫耳劑量下顯示出顯著之腫 瘤抑制。相同莫耳劑量(分別為5mg/kg及2.67mg/kg)之RMP1-14及AS19584-Fc之組合顯示出顯著改善之功效，在8只小鼠中之6只中觀察到腫瘤完全消退。
在MC38同系腫瘤模型中測試PD-1/TIGIT雙重阻斷之功效研究
培養MC38腫瘤細胞，懸浮於不含鎂及鈣之HBSS-/-中，並在6-8週齡之雌性C57BL/6小鼠之側腹皮下注射1×106個細胞。使用卡尺量測腫瘤體積並用公式(長×寬×寬)/2計算。當平均腫瘤體積達到90-100mm3時，將小鼠隨機化以開始治療。測試物品每4天藉由腹膜內投與一次。在整個研究中量測體重。
MC38腫瘤模型對PD-1阻斷敏感。如圖6A及6B所示，RMP1-14在3mg/kg下顯著延遲MC38腫瘤生長。AS19584-Fc融合蛋白以劑量依賴性方式抑制腫瘤生長。相同莫耳劑量(分別為3mg/kg及1.6mg/kg)之RMP1-14及AS19584-Fc之組合顯示同時靶向PD-1及TIGIT之協同作用，導致功效顯著提高並且在7只小鼠中之5只中完全消退。RMP1-14及高劑量AS19584-Fc(分別為3mg/kg及10mg/kg)之組合完全消除了所有動物中之腫瘤植入(7只中之7只)。
實例4：抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之人源化、產生及表徵 抗TIGIT sdAb之人源化
將sdAb AS19584及AS19886之蛋白質序列與具有最高同源性之5個最接近之人種系序列比對。選擇最佳人種系序列作為人受體。製作了同源性模型。根據模型分析資料，將對於抗原結合或抗體支架形成而言係潛在關鍵之殘基予以保留，而選擇其餘殘基以轉化為人對應物。最初生成4-6個序列優化變體之組(階段1)。分析此等變體之許多參數，並將獲得之結果用於設計第二組sdAb(階段2)。人源化sdAb在其名稱中用「VH」表示。
產生人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白
在人源化變體中，根據親和力及小規模生產水準選擇AS19584VH28、AS19886VH5及AS19886VH8用於生產及表徵。藉由將人源化 抗TIGIT sdAb與人IgG1 Fc區融合產生人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白構建體。製備構建體之maxiprep用於HEK293細胞瞬時表現及純化。表現之人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白藉由層析法經由含有蛋白A瓊脂糖樹脂之柱純化。藉由SEC-HPLC測定蛋白質純度。表現結果匯總於表6中。
穩定性分析
使用動態光散射(DLS)檢測到在加熱期間較大蛋白質聚集體之形成。使用DYNAPRO®NANOSTAR®讀板儀(Wyatt，Santa Barbara，California)，對1.5mg/ml之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白樣品，進行從25℃至75℃之溫度勻升，溫度間隔約為0.75℃。將20μl每種樣品加入到WYATT®一次性比色皿中，然後用10μl礦物油(Sigma 8410)覆蓋樣品以防止蒸發。對每個抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白樣品平均三次量測(5次採集/每次量測)。在具有所選溫度間隔之實驗期間，熱掃描速率計算為1.5℃/min。量測每個樣品，同時連續升高溫度直至目標溫度達到75℃(約40分鐘)。在DYNAMICSTM 7.6.0.48軟件(Wyatt，Santa Barbara，California)中用起始分析方法分析聚集溫度(T agg )。各種樣品之量測之聚集起始溫度(T agg )顯示在表7中。
酸性穩定性評估如下。每種抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白樣品以10mg/ml在具有不同pH：3.6、3.3、3.0及2.7的50mM檸檬酸鈉緩衝液中製備，在pH 7.2之磷酸鈉緩衝液中製備一個對照。在R.T.下之酸性條件下暴露1小時後，藉由磷酸鈉緩衝液將樣品中和至pH 7.2。然後用SDS-PAGE檢測每個樣品之純度分析及SPR活性。各種酸性條件下之活性濃度百分比總結在表7中。
如下測試凍融穩定性。在含有4%蔗糖、50mM組胺酸及50mM精胺酸之緩衝液(pH 6.0)中，將濃度>50mg/ml之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白樣品完全凍融5個循環。藉由SEC-HPLC評估所有樣品之完整全單體分子之級分，並使用製造商提供之CHROMELEONTM軟件來記錄及分析資料。凍融循環後每種抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之回收率如表7所示。
表7中之資料證明，所有測試之人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在熱、酸性及凍融穩定性測試中係穩定的。
疏水性分析
藉由疏水相互作用層析(HIC)測試人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之疏水性。在TSKgel® Butyl-NPR HPLC柱上分析每個樣品，該柱具有遞增量之含有(NH4)2SO4之Tris緩衝液(pH 7.0)作為流動相，流速為1ml/min。保留時間用於比較每個樣品之疏水性。如表8中所示，所有人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在疏水性方面係合格的。
溶解度分析
為了評估溶解度，使用交叉相互作用層析(CIC)柱量測純化之人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白。從合併之小鼠血清中純化之鼠多株抗體購自Sigma-Aldrich(I5381)。將鼠多株抗體以約30mg/ml與樹脂基質偶聯。將PBS緩 衝液中純化之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白分別注射到鼠IgG偶聯柱及對照柱，濃度範圍為0.05-0.20mg/ml。保留時間用於計算表9中報告之保留因子k'值：k'=(Vr-Vo)/Vo=(Tr-Tm)/Tm。Vr表示蛋白質偶聯柱上樣品之溶析體積，Vo表示來自對照柱之溶析體積，Tr表示蛋白質偶聯柱上之保留時間，且Tm表示對照柱上之保留時間。許多樣品在同一柱上運行兩次。k'值>0.6之蛋白質通常明顯不易溶解。根據表9，所有人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白樣品表現出優異之溶解性。
藉由表面電漿子共振(SPR)進行靶蛋白結合及跨物種反應測試
利用BIAcore T200儀器藉由SPR測定每種抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之親和常數(KD)。簡而言之，人、食蟹猴或小鼠TIGIT-His(Acrobiosystems)以不高於100RU之密度與CM5感測器晶片胺偶聯。以不少於5種不同濃度注射抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白。動力學資料總結於表10中。
藉由FACS分析CHO-TIGIT細胞結合及配體結合之抑制
使用與實例2中所述相同方法測定抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白與CHO-K1細胞上表現之TIGIT結合並阻斷CD155配體結合之能力。表11總結了抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之結合及阻斷能力之EC50。所有人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白與其親本抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白具有相當之結合及阻斷能力。
TIGIT/CD155阻斷報道基因測定及IL-2釋放測定
TIGIT/CD155阻斷報道基因測定：該研究根據實例2中描述之方法進行。22G2充當陽性對照。資料曲線顯示在圖7中並總結在表12中。結果表明人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在配體阻斷方面具有與其親本純系相當之功能。
IL-2釋放測定：將由GenScript開發之表現CD155之靶細胞在96-w板中接種過夜，然後與連續稀釋之抗TIGIT抗體或抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白一起溫育，然後以適當之E：T比率加入內部開發之TIGIT效應細胞。在37℃，5%CO2下誘導24小時後，藉由人IL-2 HTRF測定套組量測細胞培養上清液中白細胞介素2(IL-2)之濃度。使用GraphPad Prism 6軟件進行四參數邏輯曲線分析。資料曲線顯示在圖8中並總結在表12中。22G2充當陽性對照。結果表明人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在效應T細胞中誘導IL-2釋放方面具有與其親本純 系相當之功能。
實例5：人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之活體內研究 人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之藥代動力學研究
8週齡之C57BL/6小鼠接受單次靜脈內推注22G2或AS19584VH28-Fc融合蛋白，劑量為3mg/kg。在不同時間點，收穫外周血樣品以製備血漿，並使用夾心ELISA測定測試抗體之濃度。WinNonlin用於藉由非區室分析來模擬每種測試抗體之藥代動力學特徵(模型201)。資料總結在表13中且藥代動力學曲線顯示在圖9中。該研究及其他幾個研究(現在顯示之資料)之結果表明，與單株抗體相比，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白具有更短之半衰期、更高之清除率但在穩態下分佈之表觀體積更大。
人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白在攜帶MC38腫瘤之TIGIT人源化小鼠中之功效
培養MC38腫瘤細胞，懸浮於無鎂及鈣之HBSS-/-中，且在6-8週齡 之具有人TIGIT敲入(KI)之雌性C57BL/6小鼠(Biocytogen)之側腹皮下注射1×106個細胞。使用卡尺量測腫瘤體積並用公式(長×寬×寬)/2計算。當平均腫瘤體積達到90-100mm3時，將小鼠隨機化以開始治療。測試物品每4天藉由腹膜內投與一次。在整個研究中量測體重。
如圖10A及10B所示，包括3種人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白及陽性對照22G2之所有測試抗體顯著抑制MC38腫瘤之生長，證明了人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之活體內功效。本研究中22G2對人源化抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之優越功效，與活體外研究結果不一致，很可能係由於與常規全長抗體相比，抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白之半衰期較短(亦參見圖9及表13)，以及由於在此情況下採用之低測試劑量。
實例6：靶向PD-1/PD-L1及TIGIT之概念驗證(POC)雙特異性分子之產生及活體外表徵 PD-1×TIGIT及PD-L1×TIGIT POC雙特異性抗原結合蛋白(BABP)之構建及表現
可以用與以下各者融合之抗TIGIT sdAb構建BABP：全長抗體，或者從在C末端處具有Fc區之全長抗體衍生之scFv或Fab區，例如抗PD-1抗體，例如，Keytruda®(派姆單抗)，PD1-BM-min、Opdivo®(納武單抗)或抗PD-L1抗體，例如Tecentriq®(阿特珠單抗)，IMFINZITM(度伐單抗)，Bavencio®(阿維單抗)或人源化53C1(h53C1)。抗TIGIT sdAb可以經由接頭(例如9-胺基酸Gly/Ser接頭(9GS接頭)、人IgG1(hIgG1)鉸鏈，或突變之hIgG1鉸鏈)，或在沒有接頭的情況下與全長抗體(或來自在C末端處具有Fc區之全長抗體之scFv或Fab區域)連接。BABP可以為圖17-26中舉例說明之任何組態。例如，抗TIGIT sdAb可以藉由N-或C末端與至少一條重鏈、至少一條輕鏈，或重鏈及輕鏈融合(見圖17-20)。
該示例描述了用於概念驗證(POC)之PD-L1×TIGIT BABP之構建及表現。藉由突變之人IgG1(hIgG1)鉸鏈將抗TIGIT sdAb AS19584與抗PD-L1抗 體h53C1(BTP-4及BTP-5)或Tecentriq生物仿製藥(BTP-6及BTP-7)之重鏈之N末端融合。野生型人IgG1 Fc用於BTP-5及BTP-7，而無效應子之人IgG1(惰性hIgG1)Fc用於BTP-4及BTP-6。所有POC PD-L1×TIGIT BABP構建體具有圖17所示之結構。POC BABP構建體在Expi293F細胞中瞬時表現，蛋白質用蛋白A親和柱純化。用SEC-HPLC測定蛋白質純度。結果匯總於表14中。
BABP之親和力測定
為了比較POC PD-L1×TIGIT BABP與其親本元件(抗PD-L1 Ab及抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白)，將Tecentriq®之Fc區域改變為野生型人IgG1(hIgG1)Fc作為對照，並且產生具有野生型hIgG1 Fc或無效應子之人IgG1(惰性hIgG1)Fc之h53C1及AS19584-Fc融合蛋白作為對照。人及小鼠TIGIT-His及人PD-L1購自Acrobiosystems。如實例2中所述測試POC PD-L1×TIGIT BABP之親和力，資料顯示在表15中。與其親本元件單株抗體及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，PD-L1×TIGIT BABP與靶蛋白具有相當或略微降低之親和力。
藉由FACS分析CHO-TIGIT或CHO-PD-L1細胞結合及配體結合之抑制
如實例2中所述評估POC PD-L1×TIGIT BABP結合至在CHO細胞上表現之TIGIT及阻斷CD155與CHO-TIGIT細胞結合之能力。如實例2中所述，類似地評估結合至在CHO細胞上表現之PD-L1及阻斷PD-1與CHO-PD-L1細胞結合之能力。22G2用作陽性抗TIGIT Ab對照。結果匯總於表16中。與其親本元件單株抗體(抗PD-L1 Ab)及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，PD-L1×TIGIT BABP具有相當或略微降低之靶細胞結合及配體阻斷能力。
POC PD-L1×TIGIT BABP之活體外功能測定
基於PD-L1細胞之測定：將PD-L1靶細胞(GS-C2/PD-L1，GenScript，Cat編號M00613)接種過夜，然後與連續稀釋之測試樣品一起溫育，然後以合適之E：T比率加入PD-1效應細胞(GS-J2/PD-1，GenScript，Cat編號M00612)。在37℃，5%CO2誘導6小時後，加入One-GloTM螢光素酶測定試劑並測定發光。使用GraphPad Prism 6軟件進行四參數邏輯曲線分析。結果示於圖11中。
混合淋巴細胞反應(MLR)：從人外周血單核細胞(PBMC)分離樹突細胞(DC)及CD4+ T細胞。在FACS測定中分析DC之共刺激分子及MHC II類之 表現(其表面標誌物CD1a、CD83、CD86及HLA-DR之表現資料被驗證，資料未顯示)。將合適比例之CD4+ T細胞及DC接種到96孔板之孔中，並用測試抗體處理。將測定板在37℃/5%CO2培養箱中溫育72小時，並使用人IL2 HTRF套組(Cisbio，cat編號64IL2PEB)量測由細胞釋放之IL-2。結果示於圖12中。
根據實例2及實例4中描述之方法分別進行TIGIT/CD155阻斷報道基因分析及IL-2釋放分析。結果分別示於圖13及圖14中。
所有上述基於活體外細胞之功能測定之結果總結於表17中。與其親本元件單株抗體(抗PD-L1 Ab)及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，POC PD-L1×TIGIT BABP顯示出相當或略微降低之活體外功能。
基於PD-L1/TIGIT細胞之雙功能報道基因測定：將PD-L1/CD155靶細胞(表現PD-L1及CD155之細胞)接種過夜，然後用連續稀釋之測試抗體溫育，然後以合適之E：T比率加入PD-1/TIGIT效應細胞(表現PD-1及TIGIT之細胞)。在37℃，5%CO2誘導6小時後，加入One-GloTM螢光素酶測定試劑並確定發光代表效應細胞活化。
如圖15所示，藉由阻斷PD-L1，h53C1能夠在T細胞中誘導IL-2表 現。低劑量與高劑量之間之效果差異極小。單獨之TIGIT阻斷劑AS19584-Fc(IgG1或惰性IgG1)在測定條件下不能活化T細胞。相比之下，與其親本元件單株抗體(抗PD-L1 Ab)及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，POC PD-L1×TIGIT BABP(BTP-4及BTP-5)表現出藉由在效應細胞中誘導IL-2表現而增強T細胞功能之優異能力。POC PD-L1×TIGIT BABP之效果與相應組合(h53C1+AS19584-Fc，具有IgG1或惰性IgG1 Fc片段)之效果相當。
實例7：靶向PD-L1及TIGIT之POC PD-L1×TIGIT BABP之活體內功效 攜帶MC38-hPD-L1腫瘤模型之C57BL/6人PD-1敲入(KI)小鼠之功效研究
敲除MC38腫瘤細胞中之小鼠PD-L1基因，並藉由慢病毒轉導來穩定表現人PD-L1。對所產生之MC38-hPD-L1細胞進行培養，懸浮在無鎂及鈣之HBSS-/-中，並在6-8週齡雌性C57BL/6人PD-1 KI小鼠(Biocytogen)之側翼腹皮下注射1×106個細胞，其中鼠PD-1基因之細胞外域已被人類對應物取代。使用卡尺量測腫瘤體積並用公式(長×寬×寬)/2計算。當平均腫瘤體積達到90-100mm3時，將小鼠隨機化以開始治療。測試物品每週藉由腹膜內投與三次。在整個研究中量測體重。
如圖16A及16B所示，分別藉由分別阻斷PD-L1及TIGIT，h53C1及AS19584-Fc(具有野生型IgG1)均適度延遲MC38-hPD-L1腫瘤生長，沒有統計學意義。h53C1及AS19584-Fc之組合療法沒有改善單一療法之功效，部分動物無反應。然而，接受BTP-5之動物之腫瘤生長持續延遲，表明POC PD-L1×TIGIT BABP具有比任何單一療法及活體內組合療法更好之治療效果。
實例8：PD-1×TIGIT及PD-L1×TIGIT BABP之產生 PD-1×TIGIT及PD-L1×TIGIT BABP之構建
該示例描述了PD-L1×TIGIT及PD-1×TIGIT BABP之構建。
經由突變之人IgG1(hIgG1)鉸鏈作為接頭，將人源化抗TIGIT sdAb AS19584VH28與抗PD-L1單株Ab h53C1之重鏈N末端、重鏈C末端、輕鏈N末端或輕鏈C末端融合，以分別產生PD-L1×TIGIT BABP BTP-15、BTP-16、BTP-17及BTP-18。h53C1之重鏈包含野生型人IgG1 Fc區。BTP-15、BTP-16、BTP-17及BTP-18分別具有圖17、圖18、圖19及圖20中所示之示例性結構。
經由突變之人IgG1(hIgG1)鉸鏈作為接頭，人源化抗TIGIT sdAb AS19584VH28與抗PD-1抗體之重鏈N末端、重鏈C末端、輕鏈N末端或輕鏈C末端融合，以產生PD-1×TIGIT BABP。抗PD-1抗體之重鏈包含人IgG4 Fc區。PD-1×TIGIT BABP具有圖17-20所示之示例性結構。
實例9：PD-1×TIGIT及PD-L1×TIGIT BABP之產生及表徵 PD-1×TIGIT及PD-L1×TIGIT BABP之構建
該示例描述了PD-L1×TIGIT及PD-1×TIGIT BABP之構建。
經由突變之人IgG1(hIgG1)鉸鏈作為接頭，將人源化抗TIGIT sdAb AS19584VH28與抗PD-1單株抗體Ab PD1-BM-min之重鏈N末端、重鏈C末端、輕鏈N末端或輕鏈C末端融合，以分別產生PD-1×TIGIT BABP BTP-11、BTP-12、BTP-13及BTP-14。PD1-BM-min之重鏈包含人IgG4 Fc區。BTP-11、BTP-12、BTP-13及BTP-14分別具有圖17、圖18、圖19及圖20中所示之示例性結構。
經由突變之人IgG1(hIgG1)鉸鏈作為接頭，將人源化抗TIGIT sdAb AS19584VH28與抗PD-L1單株Ab h53C1之重鏈N末端、重鏈C末端、輕鏈N末端或輕鏈C末端融合，以產生分別PD-L1×TIGIT BABP BTP-15、BTP-16、BTP-17及BTP-18。h53C1之重鏈包含野生型人IgG1 Fc區。BTP-15、BTP-16、BTP-17及BTP-18分別具有圖17、圖18、圖19及圖20中所示之示例性結構。
經由突變之人IgG1(hIgG1)鉸鏈作為接頭，將人源化抗TIGIT sdAb AS19584VH28與抗PD-L1單株Ab h53C1之重鏈N末端或輕鏈N末端融合，分 別產生PD-L1×TIGIT BABP BTP-21及BTP-22。h53C1之重鏈包含惰性人IgG1 Fc區。BTP-21及BTP-22分別具有圖17及圖19中所示之示例性結構。
BABP之親和力測定
如前所述評估BABP對人PD-1、PD-L1、人TIGIT及小鼠TIGIT之親和力。結果匯總於表18中。簡言之，為了比較PD-1×TIGIT BABP與其親本元件(抗PD-1 Ab及抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白)，產生具有野生型人IgG4 Fc之PD1-BM-min及AS19584VH28-Fc融合蛋白作為對照。為了比較PD-L1×TIGIT BABP與其親本元件(抗PD-L1 Ab及抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白)，產生具有無效應子之人IgG1(惰性hIgG1)Fc之h53C1及AS19584VH28-Fc融合蛋白作為對照。人及小鼠TIGIT-His及人PD-1及PD-L1購自Acrobiosystems。如實例2中所述測試PD-1xTIGIT BABP及PD-L1×TIGIT BABP之親和力，資料顯示在表18中。與它們各自之親本元件單株抗體及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，PD-1×TIGIT BABP及PD-L1×TIGIT BABP都具有與靶蛋白相當或僅略微降低之親和力。
藉由FACS分析CHO-TIGIT、CHO-PD-1或CHO-PD-L1細胞結合及配體結合之抑制
PD-1×TIGIT BABP及PD-L1×TIGIT BABP與CHO細胞上表現之PD-1、PD-L1或TIGIT結合之能力及其阻斷PD-1與CHO-PD-L1結合、PD-L1與CHO-PD-1細胞之結合或CD155與CHO-TIGIT細胞之結合之能力如實例2中所述評估。22G2(IgG1)係抗TIGIT單株抗體，並根據公佈之序列來表現。替拉戈單抗(臨床試驗中之抗TIGIT單株抗體)、度伐單抗及阿特珠單抗(均作為市售之抗PD-L1抗體)根據其公佈之序列來表現並用作另外之對照。結果匯總於表19中。與其親本元件單株抗體(抗PD-1 Ab，PD-1-BM min)及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，PD-1×TIGIT BABP具有相當或僅略微降低之靶細胞結合及配體阻斷能力。與其親本元件單株抗體(抗PD-L1 Ab，h53C1)及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，PD-L1×TIGIT BABP具有相當或僅略微降低之靶細胞結合及配體阻斷能力。
活體外功能測定
PD-1×TIGIT BABP及PD-L1×TIGIT BABP之活體外功能藉由基於PD-1細胞之測定，基於PD-L1細胞之測定，基於TIGIT細胞之報道基因測定及用於TIGIT之IL-2釋放測定進行分析，如實例2、4及6中所述。22G2(IgG1)係抗TIGIT單株抗體，並根據公佈之序列來表現。替拉戈單抗(臨床試驗中之抗TIGIT單株抗體)、度伐單抗及阿特珠單抗(均作為市售之抗PD-L1抗體)根據其公佈之序列來表現並用作另外之對照。結果匯總於表20中。與其親本元件單株抗體(分別為PD1-BM-min及h53C1)及具有相應同種型之抗TIGIT sdAb-Fc融合蛋白相比，PD-1×TIGIT BABP及PD-L1×TIGIT BABP顯示出相當或僅略微降低之活體外功能。與商業抗TIGIT抗體替拉戈單抗相比，PD-L1×TIGIT BABP BTP-21及BTP-22甚至表現出更好之TIGIT阻斷功能。
PD-L1/TIGIT雙功能報道基因檢測：為了評估PD-1×TIGIT BABP或PD-L1×TIGIT BABP藉由同時靶向PD-L1/PD-1路徑及CD155/TIGIT路徑，來以協同方式活化T細胞之能力，如實例6所述，進行PD-L1/TIGIT雙功能報道基因測定。簡而言之，將PD-L1/CD155靶細胞(表現PD-L1及CD155之細胞)接種過夜，然後與連續稀釋之測試抗體一起溫育，然後在合適之E：T比率下加入PD-1/TIGIT效應細胞(表現PD-1及TIGIT之細胞)。在37℃，5%CO2誘導6小時後，加入One-GloTM螢光素酶測定試劑並確定發光代表效應細胞活化。22G2(IgG1)係抗TIGIT單株抗體，並根據公佈之序列來表現。替拉戈單抗(臨床試驗中之抗TIGIT單株抗體)，派姆單抗(市售之抗PD-1單株抗體；縮寫為Pembro)，度伐單抗及阿特珠單抗/Tecentriq®(均為市售之抗PD-L1抗體)，根據其公佈之序列來表現並用作另外之對照。從圖27A-27C可以看出，使用抗PD-1、抗PD-L1或抗TIGIT Ab之單一療法不能同時有效地阻斷PD-L1/PD-1及CD155/TIGIT途徑以觸發效應細胞活化。BTP-11、BTP-13(如圖27A所示)、BTP-15、BTP-17(如圖27B所示)、BTP-21及BTP-22(如圖27C及表21所示)藉由阻斷PD-L1/PD-1及/或CD155/TIGIT途徑而在報道細胞中協同觸發信號，與任何測試之單一療法相比，顯示出顯著增加之最大信號。與派姆單抗(抗PD-1)及22G2(抗TIGIT)組合療法相比，BTP-11及BTP-13甚至表現出優異之效應細胞活化功能(圖27A)。與替拉戈單抗+阿特珠單抗或替拉戈單抗+度伐單抗組合療法相比，BTP-21及BTP-22 BABP顯示出相當或甚至更好(BTP-22)同時PD-L1/PD-1及CD155/TIGIT阻斷活性(圖27C)。
原代T細胞結合：為了評估PD-L1×TIGIT BABP與原代細胞結合之能力，用CD8+ T細胞分離套組(Miltenyi，Cat編號130-096-495)或CD4+ T細胞分離套組(Miltenyi，Cat編號130-096-533)從PBMC(HemaCare)分離人原代T細胞。用T細胞活化/擴增套組(Miltenyi，Cat編號130-092-919)活化並擴增分離的T細胞。如實例2中所述進行FACS分析，以分別測定PD-L1×TIGIT BABP與活化之CD8+及CD4+ T細胞之結合。如圖28A及28B所示，BTP-21已顯示出對原代CD8及CD4 T細胞之有效結合能力，其與基準抗體或親本抗體相當。
PBMC IFN-γ釋放測定：在存在梯度濃度之測試物品之情況下，在37℃下，在具有5%CO2之培養箱中，在補充有10%FBS之RPMI 1640培養基中，將來自健康供體之新鮮解凍之人PBMC(HemaCare)與PD-L1靶細胞(GS-C2/PD-L1，GenScript，Cat編號M00613)以3：1之比例共培養72小時。然後將細胞離心，收集上清液，用人IFN-γ HTRF套組(Cisbio，Cat編號62HIFNGPEH)及PHERAstarPlus試劑(BMG Labtech)測定IFN-γ濃度。該研究由3名不同的供體進行。結果表明BTP-21具有與基準抗體及親本抗體相當之EC50，而其在BTP-21中之細胞因子釋放誘導之最大潛力始終高於其他PD-L1抗體(圖29)。
PD-1×TIGIT BABP之活體內功效研究
在具有人PD-1 KI之Balb/c小鼠中建立之同系CT26結腸癌模型(表現鼠CD155)中評估BTP-11之活體內抗腫瘤活性。如實例3中那樣構建該CT26腫瘤模型。當腫瘤大小達到約100mm3時，動物開始接受治療。測試物品每4 天藉由腹膜內投與一次。在整個研究中量測體重。腫瘤體積小於10mm3之動物被認為係無腫瘤的(TF)。
如圖30所示，CT26腫瘤模型對抗TIGIT單阻斷(參見AS19584VH28 IgG4)具有部分抗性，僅導致8只小鼠中之1只無腫瘤。單獨之抗PD-1抗體(PD1-BM-min)以10mg/kg適度抑制PD-1 KI小鼠中之CT26腫瘤生長，導致8只小鼠中之3只無腫瘤。BTP-11在相同莫耳劑量(12.33mg/kg)下顯示出導致腫瘤消退之優異效果，導致8只小鼠中之5只無腫瘤。此效果甚至優於使用相同莫耳劑量(分別為10mg/kg及5.33mg/kg)之PD1-BM-min及AS19584VH28 IgG4之組合治療，其僅導致8只小鼠中之1只無腫瘤。
PD-L1×TIGIT BABP之活體內功效研究
為了評估BTP-21之活體內抗腫瘤活性，將過量表現人PD-L1之鼠MC38結腸癌細胞(MC38-hPDL1)植入C57BL/6人PD-1/PD-L1雙KI小鼠中，類似地如在實例3中所述。根據公佈之序列來表現阿特珠單抗(市售之抗PD-L1抗體)並用作另外之對照。當腫瘤大小達到100mm3時，將動物隨機化進行治療。測試物品在第0天、第4天、第6天及第8天藉由腹膜內投與。在整個研究中量測體重。
從圖31中可以看出，阿特珠單抗及h53C1(惰性IgG1)單阻斷均能夠以5mg/kg抑制MC38-hPD-L1腫瘤生長，分別在治療後第30天導致8只小鼠中之4只及8只小鼠中之3只無腫瘤。使用2.67mg/kg之AS19584VH28惰性IgG1之單阻斷導致8只小鼠中之4只無腫瘤。BTP-21及組合療法(h53C1(惰性IgG1)及AS19584VH28惰性IgG1)顯示出較高之無腫瘤小鼠率(分別為8只中之6只及7只中之6只)。值得注意地，BTP-21及組合療法比所測試之任何單一療法都更早發生無腫瘤狀態。BTP-21或組合療法組中最早之應答者在治療後第10至15天達到無腫瘤狀態，而單一療法組在任何小鼠達到無腫瘤狀態之前需要20至25 天。此外，與較高劑量(6.17mg/kg)投與BTP-21或相同莫耳劑量(5mg/kg h53C1+2.67mg/kg AS19584VH28惰性IgG1)之組合療法相比，BTP-21即使在較低劑量(2.06mg/kg)下亦表現出類似之優異治療效果(圖31)。
上述研究表明，與在攜帶人源化靶標之小鼠腫瘤模型中靶向兩種途徑中之任一種之單一療法相比，本文所述之BABP藉由同時阻斷PD-L1/PD-1及CD155/TIGIT途徑而顯示出優異之抗腫瘤活性。
序列表
SEQ ID NO：246(AS19584 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：247(AS19852 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：248(AS19858 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：249(AS19886 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：250(AS19887 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：251(AS19888 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：252(AS20160 sdAb核酸序列)
SEQ ID NO：253(AS19584 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：254(AS19852 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：255(AS19858 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：256(AS19886 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：257(AS19887 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：258(AS19888 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：259(AS20160 sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：271(AS19584VH26人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：273(AS19584VH28人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：274(AS19584VH29人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：275(AS19584VH30人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：276(AS19584VH31人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：280(AS19886VH5人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：282(AS19886VH8人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：283(AS19886VH9人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：284(AS19886VH10人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：286(AS19886VH19人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：287(AS19886VH20人源化sdAb胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：288(AS19584 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：289(AS19852 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：290(AS19858 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：291(AS19886 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：292(AS19887 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：293(AS19888 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：294(AS20160 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：306(AS19584VH26 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：308(AS19584VH28 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：309(AS19584VH29 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：310(AS19584VH30 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：311(AS19584VH31 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：315(AS19886VH5 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：317(AS19886VH8 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：318(AS19886VH9 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：319(AS19886VH10 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：321(AS19886VH19 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：322(AS19886VH20 sdAb-Fc(IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：323(h53C1(IgG1)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：324(人類IgG4(hIgG4)鉸鏈胺基酸序列)ESKYGPPCPPCP
SEQ ID NO：325(Keytruda生物仿製藥(IgG4)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：326(Keytruda生物仿製藥(IgG4)mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：327(h53C1(IgG1)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：328(h53C1(IgG1)mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：329(h53C1(惰性IgG1)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：330(h53C1(惰性IgG1)mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：331(Tecentriq生物仿製藥(IgG1)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：332(Tecentriq生物仿製藥(IgG1)mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：333(Tecentriq生物仿製藥(惰性IgG1)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：334(Tecentriq生物仿製藥(惰性IgG1)mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：335(22G2(IgG1)mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：336(22G2(IgG1)mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：337(10A7 mAb_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：338(10A7 mAb_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：339(h53C1 VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：340(h53C1 VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：349(h53C1 HC-CDR1胺基酸序列)GYIFTGYGIT
SEQ ID NO：350(h53C1 HC-CDR2胺基酸序列)EIFPRRVQTYYSEKFKG
SEQ ID NO：351(h53C1 HC-CDR3胺基酸序列)DYDPYFALDY
SEQ ID NO：352(h53C1 LC-CDR1胺基酸序列)RASQDVSTAVD
SEQ ID NO：353(h53C1 LC-CDR2胺基酸序列)SASYRYT
SEQ ID NO：354(h53C1 LC-CDR3胺基酸序列)QQHYSIPFTF
SEQ ID NO：355(人類惰性IgG1 Fc區域胺基酸序列)
SEQ ID NO：356(人類IgG1 Fc區域胺基酸序列)
SEQ ID NO：365(AS19584 sdAb-Fc(惰性IgG1)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線，接頭加粗體)
SEQ ID NO：366(AS19584 sdAb-Fc(IgG4)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：367(AS19584VH28 sdAb-Fc(IgG4)融合蛋白質二聚體形式胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：368(全長人類TIGIT胺基酸序列，沒有信號肽)
SEQ ID NO：369(人類TIGIT胺基酸序列之細胞外域) LESSVAEHGARFQIP
SEQ ID NO：370(人類IgG1(hIgG1)鉸鏈胺基酸序列)EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO：371(突變人類IgG1(hIgG1)鉸鏈胺基酸序列)EPKSSDKTHTSPPSP
SEQ ID NO：372(接頭肽(9GS)胺基酸序列)GGGGSGGGS
SEQ ID NO：373(接頭肽胺基酸序列)GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：374(接頭肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(G)n
SEQ ID NO：375(接頭肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GS)n
SEQ ID NO：376(接頭肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GSGGS)n
SEQ ID NO：377(接頭肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GGGS)n
SEQ ID NO：378(接頭肽胺基酸序列，n為至少1之整數)(GGGGS)n
SEQ ID NO：379(度伐單抗VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：380(度伐單抗VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：381(Tecentriq VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：382(Tecentriq VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：383(阿維單抗VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：384(阿維單抗VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：385(Keytruda VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：386(Keytruda VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：387(Opdivo VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：388(Opdivo VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：389(人類IgG4 Fc區域胺基酸序列)
SEQ ID NO：390(PD1-BM-min_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：391(PD1-BM-min_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：392(替拉戈單抗_HC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：393(替拉戈單抗_LC胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：406(PD1-BM-min_VH胺基酸序列；CDR加下劃線)
SEQ ID NO：407(PD1-BM-min_VL胺基酸序列；CDR加下劃線)
<110> 大陸商南京傳奇生物科技有限公司
<120> 針對TIGIT之單域抗體及其變異體
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<223> 合成構建體
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<223> 合成構建體
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<220>
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 342
<210> 343
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<223> 合成構建體
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 358
<210> 359
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<211> 214
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<223> 合成構建體
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<223> 合成構建體
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<220>
<223> 合成構建體
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<400> 374
<210> 375
<211> 2
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
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<400> 375
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<400> 376
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<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
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<400> 377
<210> 378
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<220>
<221> VARIANT
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<400> 378
<210> 379
<211> 121
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
<400> 379
<210> 380
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構建體
<400> 387
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 388
<210> 389
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 389
<210> 390
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 390
<210> 391
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 391
<210> 392
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 392
<210> 393
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 393
<210> 394
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 394
<210> 395
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 395
<210> 396
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 396
<210> 397
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 397
<210> 398
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 398
<210> 399
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 399
<210> 400
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 400
<210> 401
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 401
<210> 402
<211> 589
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 402
<210> 403
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 403
<210> 404
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 404
<210> 405
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 405
<210> 406
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 406
<210> 407
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 407

Claims (70)

  1. 一種分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之單域抗體(sdAb)部分，其中該sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體。
  2. 如申請專利範圍第1項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分包含CDR1，該CDR1包含SEQ ID NO：36-42、54、56-59、63、65-67、69-70中之任一者之胺基酸序列；CDR2，該CDR2包含SEQ ID NO：106-112、124、126-129、133、135-137、139-140中之任一者之胺基酸序列；及CDR3，該CDR3包含SEQ ID NO：176-182、194、196-199、203、205-207、209-210中之任一者之胺基酸序列；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分包括以下任一者：(1)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：176之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多 約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：177之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：178之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：179之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：180之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多 約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：127之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2，或其包含至 多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(16)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；(17)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；或(18)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO：140之胺基酸序列之CDR2，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3，或其包含至多約3個胺基酸取代之變體。
  4. 如申請專利範圍第1-3項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分包含以下任一者：(1)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：176之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(2)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：107之 胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：177之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(3)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：178之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(4)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：179之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(5)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：180之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(6)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(7)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：182之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(8)包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：124之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(9)包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：126之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(10)包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：127之 胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(11)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(12)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(13)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(14)包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：135之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(15)包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：136之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(16)包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：137之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；(17)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：139之胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體；或(18)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列之CDR1；包含SEQ ID NO：140之 胺基酸序列之CDR2；及包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列之CDR3；或其在該等CDR區域中包含至多約3個胺基酸取代之變體。
  5. 如申請專利範圍第1-4項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分包含V HH域，該V HH域包含以下任一者之胺基酸序列：a-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、V、L、A、H、S、I、W、C、N、G、D、T及P；a-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：E、Q、G、D、A、K、R、L、P、S、V、H、T、N、W、M及I；a-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：L、R、P、H、F、G、Q、S、E、T、Y、C、I、D及V；a-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：W、R、G、S、K、A、M、Y、I、F、T、N、V、Q、P、E及C；及a-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q、L、R、P、E、K、S、T、M、A及H；或b-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、L、I及V；b-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：E及Q；b-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：R及L；b-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：W、R、G及S；及b-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q及L；或c-1)37位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：F、Y、L、I及V；c-2)44位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：A、G、E、D、Q、R、S及L；c-3)45位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：L、R及C；c-4)103位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：P、R及S；及 c-5)108位之胺基酸殘基選自由以下各者組成之群：Q及L；其中胺基酸位置係根據Kabat編號，並且其中當108位係Q時，108位可以視情況地人源化為L。
  6. 如申請專利範圍第1-5項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb包含V HH域，該V HH域包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列，或其與SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者具有至少約80%序列同一性的變體。
  7. 如申請專利範圍第6項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分包括包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之胺基酸序列之V HH域，或其在該V HH域中包含至多約3個胺基酸取代之變體。
  8. 如申請專利範圍第1-7項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分與TIGIT之間之結合之K d為約10 -5M至約10 -12M。
  9. 如申請專利範圍第8項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb部分與TIGIT之間之結合之K d為約10 -7M至約10 -12M。
  10. 如申請專利範圍第1-9項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該特異性識別TIGIT之sdAb部分係駱駝科的、嵌合的、人類的、部分人源化的或完全人源化的。
  11. 如申請專利範圍第1-10項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該分離的抗TIGIT構建體係sdAb-Fc融合蛋白。
  12. 如申請專利範圍第11項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb-Fc融合蛋白係單體或二聚體的。
  13. 如申請專利範圍第11或12項之分離的抗TIGIT構建體，其中該 Fc片段係人IgG1(hIgG1)Fc、無效應子(惰性)hIgG1 Fc或hIgG4 Fc。
  14. 如申請專利範圍第11-13項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該sdAb-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：288-294、306、308-311、315、317-319、321-322及365-367中之任一者之胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第1-10項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該分離的抗TIGIT構建體進一步包含特異性識別第二抗原決定基之第二抗體部分。
  16. 如申請專利範圍第15項之分離的抗TIGIT構建體，其中該第二抗體部分係全長抗體、Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、單鏈Fv(scFv)、scFv-scFv、微抗體、雙抗體或sdAb。
  17. 如申請專利範圍第15或16項之分離的抗TIGIT構建體，其中該抗TIGIT構建體係多特異性的。
  18. 如申請專利範圍第15-17項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該特異性識別TIGIT之sdAb部分及該第二抗體部分視情況藉由肽接頭來連接。
  19. 如申請專利範圍第18項之分離的抗TIGIT構建體，其中該肽接頭包含SEQ ID NO：324及370-378中之任一者之胺基酸序列。
  20. 如申請專利範圍第15-19項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該第二抗體部分係由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之全長抗體。
  21. 如申請專利範圍第20項之分離的抗TIGIT構建體，其中該重鏈之Fc片段可以為IgG1 Fc、無效應子之IgG1 Fc、IgG2 Fc或IgG4 Fc。
  22. 如申請專利範圍第20或21項之分離的抗TIGIT構建體，其中該特異性識別TIGIT之sdAb部分之N末端與該全長抗體之至少一條重鏈之C末端融合。
  23. 如申請專利範圍第20或21項之分離的抗TIGIT構建體，其中該特異性識別TIGIT之sdAb部分之C末端與該全長抗體之至少一條重鏈之N末端融合。
  24. 如申請專利範圍第20或21項之分離的抗TIGIT構建體，其中該特異性識別TIGIT之sdAb部分之N末端與該全長抗體之至少一條輕鏈之C末端融合。
  25. 如申請專利範圍第20或21項之分離的抗TIGIT構建體，其中該特異性識別TIGIT之sdAb部分之C末端與該全長抗體之至少一條輕鏈之N末端融合。
  26. 如申請專利範圍第20-25項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體特異性識別PD-1。
  27. 如申請專利範圍第26項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：385之胺基酸序列的重鏈可變域(V H)，及包含SEQ ID NO：386之胺基酸序列的輕鏈可變域(V L)。
  28. 如申請專利範圍第26項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：387之胺基酸序列的重鏈可變域(V H)，及包含SEQ ID NO：388之胺基酸序列的輕鏈可變域(V L)。
  29. 如申請專利範圍第26項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：406之胺基酸序列的重鏈可變域(V H)，及包含SEQ ID NO：407之胺基酸序列的輕鏈可變域(V L)。
  30. 如申請專利範圍第26或29項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：390之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：391之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等重鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該重鏈融合多肽包含SEQ ID NO：394或396之胺基酸序列。
  31. 如申請專利範圍第26或29項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：390之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：391之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等輕鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該輕鏈融合多肽包含SEQ ID NO：399或401之胺基酸序列。
  32. 如申請專利範圍第20-25項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體特異性識別PD-L1。
  33. 如申請專利範圍第32項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包含1)V H，其包含：包含SEQ ID NO：349之胺基酸序列的重鏈互補決定區(HC-CDR)1、包含SEQ ID NO：350之胺基酸序列的HC-CDR2及包含SEQ ID NO：351之胺基酸序列的HC-CDR3，及2)V L，其包含：包含SEQ ID NO：352之胺基酸序列的輕鏈互補決定區(LC-CDR)1、包含SEQ ID NO：353之胺基酸序列的LC-CDR2及包含SEQ ID NO：354之胺基酸序列的LC-CDR3。
  34. 如申請專利範圍第33項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包含：V H，其包含SEQ ID NO：339之胺基酸序列；及V L，其包含SEQ ID NO：340之胺基酸序列。
  35. 如申請專利範圍第33或34項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：323或327之胺基酸序列的重鏈，及包含SEQ ID NO：328之胺基酸序列的輕鏈。
  36. 如申請專利範圍第33或34項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：329之胺基酸序列的重鏈，及包含SEQ ID NO：330之胺基酸序列的輕鏈。
  37. 如申請專利範圍第32項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包含：V H，其包含SEQ ID NO：379之胺基酸序列；及V L，其包含SEQ ID NO：380之胺基酸序列。
  38. 如申請專利範圍第32項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包含：V H，其包含SEQ ID NO：383之胺基酸序列；及V L，其包含SEQ ID NO：384之胺基酸序列。
  39. 如申請專利範圍第32項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包含：V H，其包含SEQ ID NO：381之胺基酸序列；及V L，其包含SEQ ID NO：382之胺基酸序列。
  40. 如申請專利範圍第39項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：331之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：332之胺基酸序列的輕鏈。
  41. 如申請專利範圍第39項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：333之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：334之胺基酸序列的輕鏈。
  42. 如申請專利範圍第32-36項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：327之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：328之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等重鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該重鏈融合多肽包含SEQ ID NO：343之胺基酸序列。
  43. 如申請專利範圍第32-36項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：323之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：328之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等重鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該重鏈融合多肽包含SEQ ID NO：357或359之胺基酸序列。
  44. 如申請專利範圍第32-36項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：329之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：330之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等重鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該重鏈融合多肽包含SEQ ID NO：341或402之胺基酸序列。
  45. 如申請專利範圍第32-36項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：323之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：328之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等輕鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該輕鏈融合多肽包含SEQ ID NO：362或364之胺基酸序列。
  46. 如申請專利範圍第32-36項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：329之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：330之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等輕鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該輕鏈融合多肽包含SEQ ID NO：405之胺基酸序列。
  47. 如申請專利範圍第32項及第39-41項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：331之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：332之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等重鏈中之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該重鏈融合多肽包含SEQ ID NO：347之胺基酸序列。
  48. 如申請專利範圍第32項及第39-41項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，其中該全長抗體包括包含SEQ ID NO：333之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：334之胺基酸序列的輕鏈，其中該全長抗體之該等重鏈中 之至少一者融合至該特異性識別TIGIT之sdAb部分，並且其中該重鏈融合多肽包含SEQ ID NO：345之胺基酸序列。
  49. 一種分離的抗TIGIT構建體，其包含特異性識別TIGIT之sdAb部分，其中該sdAb部分包含SEQ ID NO：253-259、271、273-276、280、282-284、286-287中之任一者之CDR1、CDR2及CDR3。
  50. 一種分離的抗TIGIT構建體，其與如申請專利範圍第1-49項中任一項之分離的抗TIGIT構建體競爭性地特異性結合至TIGIT。
  51. 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1-50項中任一項之分離的抗TIGIT構建體，及視情況醫藥學上可接受之載劑。
  52. 一種治療患有TIGIT相關疾病之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如申請專利範圍第51項之醫藥組合物。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該TIGIT相關疾病為癌症。
  54. 如申請專利範圍第53項之方法，其中該癌症為實體腫瘤。
  55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中該癌症為結腸癌。
  56. 如申請專利範圍第52-55項中任一項之方法，其進一步包括向該個體投與另外之療法。
  57. 如申請專利範圍第56項之方法，其中該另外之療法係手術、放射、化學療法、免疫療法、激素療法或其組合。
  58. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該另外之療法係免疫療法。
  59. 如申請專利範圍第58項之方法，其中該免疫療法包括向該個體投與有效量之包含免疫調節劑之第二醫藥組合物。
  60. 如申請專利範圍第59項之方法，其中該免疫調節劑係免疫檢查點抑制劑。
  61. 如申請專利範圍第60項之方法，其中該免疫檢查點抑制劑係特 異性識別PD-1或PD-L1之抗體。
  62. 如申請專利範圍第52-61項中任一項之方法，其中該醫藥組合物係全身投與。
  63. 如申請專利範圍第52-61項中任一項之方法，其中該醫藥組合物係局部投與。
  64. 如申請專利範圍第52-63項中任一項之方法，其中該個體為人類。
  65. 一種分離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1-50項中任一項之分離的抗TIGIT構建體。
  66. 一種載體，其包含如申請專利範圍第65項之分離的核酸。
  67. 一種分離的宿主細胞，其包含如申請專利範圍第65項之分離的核酸或如申請專利範圍第66項之載體。
  68. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1-50項中任一項之分離的抗TIGIT構建體、如申請專利範圍第65項之分離的核酸、如申請專利範圍第66項之載體或如申請專利範圍第67項之分離的宿主細胞。
  69. 一種產生抗TIGIT構建體之方法，其包括：(a)在有效表現所編碼之抗TIGIT構建體之條件下培養包含如申請專利範圍第65項之分離的核酸或如申請專利範圍第66項之載體之宿主細胞，或如申請專利範圍第67項之分離的宿主細胞；及(b)從該宿主細胞中獲得所表現之抗TIGIT構建體。
  70. 如申請專利範圍第69項之方法，其中步驟(a)進一步包括產生宿主細胞，該宿主細胞包含如申請專利範圍第65項之分離的核酸或如申請專利範圍第66項之載體。
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