ES2890814T3 - Procedimiento de preparación del ácido (3E,7E)-homofarnésico o del éster del ácido (3E,7E)-homofarnésico - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aislar el isómero 3-(E) de un compuesto de ácido carboxílico insaturado de la fórmula general (I) **(Ver fórmula)** en el que R1 es H o un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado, R3 es H o un residuo de hidrocarbilo C1-C4; R2 es un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado; con la condición de que, si R3 es un residuo de hidrocarbilo C1-C4, R2 representa un residuo de hidrocarbilo que contiene al menos un átomo de carbono adicional; a partir de una mezcla de isómeros que comprende el isómero 3-(E) y el isómero 3-(Z) de dicho compuesto de ácido carboxílico, por lo que dicha mezcla de isómeros se somete a una reacción de conversión enzimática catalizada por una lipasa (E.C 3.1.1.3), la cual convierte preferentemente dicho isómero 3-(E), y el producto de conversión de dicho isómero 3-(E) se aísla de dicha mezcla de reacción.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de preparación del ácido (3E,7E)-homofamésico o del éster del ácido (3E,7E)-homofamésico

La invención proporciona un procedimiento mejorado para aislar el isómero 3-(E) de un ácido carboxílico insaturado a partir de una mezcla de isómeros (E/Z) correspondientes. Más particularmente, la presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para la preparación biocatalítica del ácido (3E,7E)-homofarnesílico; así como a un procedimiento biocatalítico novedoso para la preparación mejorada del homofarnesol, en particular del (3E,7E)-homofarnesol y de las preparaciones de homofarnesol que tienen un contenido aumentado de (3E,7E)-homofarnesol (también designado como "todo E-homofarnesol"). La presente invención también se refiere a procedimientos de preparación de (-)-ambrox aplicando el ácido (3E,7E)-homofarnesílico o el (3E,7E)-homofarnesol obtenido según la invención como material de partida.

Antecedentes de la invención:

Ambrox® es el nombre comercial del compuesto enantioméricamente puro (-)-Ambrox (3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9atetrametildodecahidronafto [2,1 -b] furano) que se utiliza como valiosa fragancia. El (-)-Ambrox natural es un constituyente de la ambra, un producto digestivo de los cachalotes.

El (-)-Ambrox puede sintetizarse mediante la aplicación de pasos de reacción química y/o enzimática (véase el esquema 1)

Reducción química de acuerdo

a procedimientos conocidos

Acido 3E. 7E- homofarnesi ico _{3E. 7E-homofarnesol}

Esclareolida (-)-Ambrox

Esquema 1

El ácido (3E,7E)-homofarnesílico o el (3E,7E)-homofarnesol en forma estereoquímicamente pura son los materiales de partida más preferidos de las rutas sintéticas de base enzimática, ya que permiten la biosíntesis de (-)-ambrox con la estereoquímica correcta.

Existen mezclas de los isómeros del ácido (3E,7E)-homofarnesílico y (3Z,7E)-homofarnesílico. Sin embargo, es muy difícil separar dicha mezcla de isómeros en vista de la gran similitud entre dichos dos isómeros. La separación mediante procedimientos clásicos como la destilación y la cromatografía es, por tanto, bastante laboriosa.

Es, por lo tanto, un objeto de la presente invención proporcionar procedimientos que permitan un acceso más simple al ácido (3E,7E)-homofarnesílico y/o al (3E,7E)-homofarnesol estereoisoméricamente puros, o al menos a preparaciones con un contenido aumentado de ácido (3E,7E)-homofarnesílico o de (3E,7E)-homofarnesol.

Sumario de la invención:

Los problemas mencionados anteriormente podrían, sorprendentemente, resolverse proporcionando procedimientos catalizados enzimáticamente para preparar selectivamente isómeros 3E de ácidos carboxílicos insaturados, como se ejemplifica en el isómero 3E,7E del ácido homofarnesílico, aplicando ciertas enzimas lipasa (E.C. 3.1.1.3).

Sorprendentemente, se ha encontrado en un primer aspecto particular de la invención que, al aplicar la actividad enzimática de una lipasa, como por ejemplo una lipasa de Candida antárctica, el isómero (3e ,7E) del ácido homofarnesílico libre se esterifica mucho más rápidamente en presencia de un alcohol que el isómero (3Z,7E) correspondiente. Según este primer aspecto de la invención, se obtienen mezclas de éster de ácido (3e ,7E)-homofamesílico y de ácido 3Z,7E-homofarnesílico libre. En vista de las importantes diferencias químicas entre el ácido y el éster, ahora es posible una separación muy eficaz y sencilla mediante extracción o destilación. La saponificación química del éster del ácido (3E,7E)-homofarnesílico así aislado produce el ácido 3E,7E)-homofarnesílico libre deseado Sorprendentemente, también se ha encontrado en un segundo aspecto particular de la invención que, al aplicar la actividad enzimática de una lipasa, como por ejemplo una lipasa de Candida antárctica, el isómero (3E,7E) del éster de ácido homofarnesílico se saponifica mucho más rápidamente en presencia de agua que el isómero (3Z,7E) correspondiente. Según este segundo aspecto de la invención, se obtienen mezclas de ácido (3E,7E)-homofarnesílico y de éster de ácido 3Z,7E-homofarnesílico. En vista de las importantes diferencias químicas entre el ácido y el éster, ahora es posible una separación muy eficaz y sencilla mediante extracción o destilación.

El siguiente esquema 2 ilustra dichos dos aspectos de la presente invención

Descripción detallada de la invención:

1. Definiciones generales:

Salvo información en contrario, se aplicarán las siguientes definiciones generales: "Ácido homofarnesílico" o "ácido homofarnesoico" son sinónimos de "ácido (3E,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trieno" o "ácido (3Z,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trieno" o mezclas de dichos isómeros E/Z.

"Esclareolid" se utiliza como sinónimo de "(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-tetrametil-1,4,5,5a,7,8,9boctahidrobenzo[e]benzofuran-2-ona".

La esclareolida izquierda presenta la siguiente fórmula estructural:

"Ambrox", "Ambroxan" y "Ambroxid" se utilizan como sinónimos. Incluyen todas las formas estereoisoméricas, como por ejemplo (+) Ambrox, 3a-epi-(-)Ambrox, 9b-epi-(-) Ambrox y en particular (-) Ambrox.

Según la invención, el término "lipasa" designa las enzimas de la clase E.C. 3.1.1.3 según la nomenclatura enzimática de la IUBMB (http://www.iubmb.unibe.ch; http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/).

Según una realización especial del procedimiento según la invención, la lipasa es la lipasa B, el producto génico de CALB de Candida antárctica. El gen CALB fue descrito previamente (Uppenberg J., Hansen, M.T., Patkar, S., Jones, A., Estructura 2: 293-308 (1994)) y su secuencia de nucleótidos o proteínas se depositó con los números de acceso Z30645 y CAA83122.1 en GenBank. A menos que se designe con más precisión, aquí CALB significa una secuencia de nucleótidos con este número de acceso. Otro ejemplo de lipasa de triacilglicerol es la lipasa B de Pseudozyma tsukubaensis (Suen, W.C., Zhang, N., Xiao, L, Madison, V., Zaks, A. Protein Eng. Des. Sel. 17(2): 133-40 (2004)).

Para los fines de la presente invención, las "ciclasas" son generalmente enzimas o mutantes de enzimas, que en particular exhiben la actividad de una ciclasa de ácido homofarnesílico y/o de una homofarnesol ciclasa. Como enzimas con la actividad de una homofarnesil ciclasa o homofarnesol ciclasa son transferasas intramoleculares de la subclase de las isomerasas; es decir, son adecuadas las proteínas con el número EC 5.4. (Código de la enzima según Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650). En particular, son miembros de la clase EC 5.4.99.17. Las enzimas adecuadas que tienen la actividad de una homofarnesílica o homofarnesol ciclasa son, en particular, aquellas ciclasas que también llevan a cabo la ciclización del ácido homofarnesílico a esclareolida y/o del escualeno a hopeno (por lo que también se denominan a veces "SHC" o escualeno-hopeno ciclasa) y que se describen ampliamente en la solicitud de patente internacional WO2010/139719. Sus mutantes se describen, por ejemplo, en WO 2012/066059.

El término "actividad ciclásica" describe una actividad enzimática determinada con un "sustrato de referencia en condiciones estándar", y que describe la formación de un producto cíclico a partir de un sustrato no cíclico. Las condiciones estándar son, por ejemplo, concentraciones de sustrato de 10 mM a 0,2 M, especialmente de 15 a 100 mM, por ejemplo, de unos 20 a 25 mM; a un pH de 4 a 8, y a temperaturas de, por ejemplo, 15 a 30 o 20 a 25 °C. La determinación puede llevarse a cabo con células recombinantes que expresan la ciclasa, células digeridas que expresan la ciclasa, fracciones de las mismas o enzima ciclasa enriquecida o purificada. En particular, un sustrato de referencia es un ácido (3E,7E)-homofarnesílico.

El "rendimiento" y/o la "tasa de conversión" de una reacción según la invención se determina a lo largo de un periodo definido de, por ejemplo, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 o 48 horas, en el que tiene lugar la reacción. En particular, la reacción se lleva a cabo en condiciones definidas con precisión, por ejemplo, a 25, 30, 40, 50 o 60 ° C.

Un procedimiento "catalizado enzimáticamente" o "biocatalítico" significa que dicho procedimiento se lleva a cabo bajo la acción catalítica de una enzima, incluidos los mutantes enzimáticos, tal como se define en el presente documento. Por lo tanto, el procedimiento puede realizarse en presencia de dicha enzima en forma aislada (purificada, enriquecida) o cruda, o en presencia de un sistema celular, en particular, células microbianas naturales o recombinantes que contengan dicha enzima en forma activa, y que tengan la capacidad de catalizar la reacción de conversión como se divulga en el presente documento.

Los términos "convertir selectivamente" o "aumentar la selectividad" en general significan que una forma estereoisomérica particular, es decir, la forma 3E, de un ácido carboxílico insaturado tal como se define en el presente documento, se convierte en una proporción o cantidad mayor (comparada sobre una base molar) que la forma 3Z correspondiente, ya sea durante todo el curso de dicha reacción (es decir, entre el inicio y la terminación de la reacción), en un momento determinado de dicha reacción, o durante un "intervalo" de dicha reacción. En particular, dicha selectividad puede observarse durante un "intervalo" correspondiente a una conversión del 1 al 99 %, del 2 al 95 %, del 3 al 90 %, del 5 al 85 %, del 10 al 80 %, del 15 al 75 %, del 20 al 70 %, del 25 al 65 %, del 30 al 60, o del 40 al 50 % de la cantidad inicial del sustrato. Dicha proporción o cantidad mayor puede, por ejemplo, expresarse en términos de:

- un mayor rendimiento máximo del isómero 3E observado durante todo el curso de la reacción o dicho intervalo de la misma;

- una mayor cantidad relativa del isómero 3E a un valor definido de grado de % de conversión del sustrato; y/o

- una cantidad relativa idéntica del isómero 3E con un valor de grado de % de conversión superior;

cada uno de los cuales se observa preferentemente en relación con un procedimiento de referencia, realizándose dicho procedimiento de referencia en condiciones por lo demás idénticas con medios químicos, como por ejemplo la esterificación o la escisión químicas del éster.

El término "aproximadamente" indica una variación potencial de ± 25% del valor declarado, en particular ± 15%, ±10%, preferentemente ± 5%, ± 2% o ± 1%.

El término "sustancialmente" describe un rango de valores de aproximadamente 80 a 100%, como, por ejemplo, 85-99,9%, en particular 90 a 99,9%, preferentemente 95 a 99,9%, o 98 a 99,9% Especialmente 99 a 99,9%.

"Predominantemente" se refiere a una proporción en el rango de más del 50%, como por ejemplo en el rango del 51 al 100%, preferiblemente en el rango del 75 al 99,9%; más particularmente del 85 al 98,5%, como del 95 al 99%.

Debido a la reversibilidad de las reacciones enzimáticas, la presente invención se refiere a las reacciones enzimáticas aquí descritas en ambas direcciones de reacción.

Los "mutantes funcionales" de las enzimas aquí descritas incluyen los "equivalentes funcionales" de dichas enzimas, tal como se definen a continuación.

El término "estereoisómeros" incluye en particular los isómeros conformacionales.

Se incluyen en general, según la invención, todas las formas estereoisoméricas de los compuestos descritos en el presente documento, como los isómeros constitucionales y, en particular, los estereoisómeros y sus mezclas, por ejemplo, los isómeros ópticos, o los isómeros geométricos, como los isómeros E y Z, y sus combinaciones. Si hay varios centros asimétricos en una molécula, la invención abarca todas las combinaciones de diferentes conformaciones de estos centros de asimetría, por ejemplo, los pares enantioméricos

La "estereoselectividad" describe la capacidad de producir un estereoisómero particular de un compuesto en una forma estereoisoméricamente pura o de convertir específicamente un estereoisómero particular en un procedimiento catalizado enzimáticamente como se describe en el presente documento a partir de una pluralidad de estereoisómeros. Más concretamente, esto significa que un producto de la invención está enriquecido con respecto a un estereoisómero específico. Esto puede cuantificarse a través del parámetro de pureza %ee calculado según la fórmula:

%ee = [XA-XB]/[ XA+XB]*100,

donde Xa y Xb representan la relación molar (Molenbruch) de los estereoisómeros A y B.

La "estereoselectividad E" o "selectividad E" describe la capacidad de producir un isómero E de un insaturado de al menos una vez en un doble enlace C=C particular en una forma pura o esencialmente pura o enriquecida o de convertir específicamente o esencialmente un isómero E en un procedimiento catalizado enzimáticamente como se describe en el presente documento a partir de una pluralidad de otros isómeros o una mezcla de isómeros E y Z en dicha posición particular del doble enlace dentro de s

La definición anterior de estereoselectividad y su cálculo se aplica por analogía también al término "enantioselecitividad"

Pueden obtenerse purezas estereoisoméricas o enantioméricas de al menos el 90 %ee, como al menos el 95 %ee, o al menos el 98 %ee, o al este el 99 %ee o más según la invención.

A menos que se indique lo contrario, se aplican las siguientes definiciones químicas generales: El término "ácido carboxílico" abarca tanto el ácido libre como la forma de sal del mismo, por ejemplo, sus sales de metales alcalinos o alcalinotérreos. Esto se aplica en consecuencia a todos los ácidos carboxílicos mencionados aquí, en particular al ácido homofarnesílico.

Un residuo de "hidrocarbilo" lineal o ramificado, saturado o no saturado, según la presente invención, se refiere particularmente a residuos de alquilo o alquenilo, lineales o ramificados.

Un residuo "alquilo" comprende radicales C ¹ -C ²⁰ -alquilo que son radicales lineales o ramificados que tienen de 1 a 20 átomos de carbono o radicales C ¹ -C ⁴ -alquilo o radicales C ⁴ -C ²⁰ -alquilo. Ejemplos de ello son:

- Radicales C1-C4-alquilo seleccionados entre el metilo, el etilo, el n-propilo, el isopropilo, el n-butilo, el 2-butilo, el isobutilo o el tere-butilo,

- Radicales C1-C6-alquilo seleccionados entre los radicales C1-C4-alquilo definidos anteriormente, pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, hexilo, 1,1 -metilpropilo, 1,2-metilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutílico, 1,2-dimetilbutílico, 1,3-dimetilbutílico, 2,2-dimetilbutílico, 2,3-dimetilbutílico, 3,3-dimetilbutílico, 1 -etilbutílico, 2-etilbutílico, 1,1,2-trimetilpropílico, 1,2,2-trimetilpropílico, 1-etil-1-metilpropílico, 1-etil-2-metilpropílico;

- Radicales alquílicos C ⁷ -C ²⁰ que son radicales lineales o ramificados que tienen de 7 a 20 átomos de carbono;

ejemplos de los mismos se seleccionan entre heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, tetradecilo, pentadecilo, hexadecilo, heptadecilo, octadecilo, nonadecilo, eicosilo, y sus isómeros constitucionales, como por ejemplo 4,8-dimetiónilo.

Un residuo de "alquenilo" comprende radicales de alquenilo C2-C20 mono o poliinsaturados, en particular radicales de hidrocarburos lineales o ramificados de 1,2, 3 o 4 veces, preferentemente de 1 a 20 átomos de carbono.

Ejemplos de residuos monosaturados de C2-C20-alquenilo, con una posición del doble enlace en cualquier posición dentro de la cadena hidrocarbonada son vinilo, 2-propeno-1-ilo, 1-metilprop-2-eno-1-ilo, 2-buteno-1-ilo, 3-buteno-1-ilo, n-pentenilo, n-hexenilo, n-heptenilo, n-octenilo, n-nonenilo, n-decenilo, n-undecenilo, n-dodecenilo, n-tridecenilo, ntetradecenilo, n-pentadecenilo, n-hexadecenilo, n-heptadecenilo, n-octadecenilo, oleilo, n-nonadecenilo, n-eicosenilo; Ejemplos de residuos di- o tri-insaturados de C ⁴ -C ²⁰ -alquenilo con dos o tres dobles, preferiblemente no acumulados y preferiblemente no conjugados en cualquier posición de la cadena hidrocarbonada son el n-butadienilo, npentadienilo, n-hexadienilo, n-heptadienilo, n-octadienilo, n-octatrienilo n-nonadienilo, n-nonatrienilo, n-decadienilo, ndecatrienilo, n-undecadienilo, n-undecatrienilo, n-dodecadienilo, n-dodecatrienilo, n-tridecadienilo, n-tridecatrienilo, ntetradecadienilo, n-tetradecatrienilo, n-pentadecadienilo, n-pentadecatrienilo, n-hexadecadienilo, n-hexadecatrienilo, n-heptadecadienilo, n-heptadecatrienilo, n-octadecadienilo, n-octadecatrienilo, n-noadecadienilo, n-noadecatrienilo, neicosadienilo, n-eicosatrienilo, y los isómeros constitucionales de los mismos, como por ejemplo 4,8-dimeticona-3,7-dienilo.

Cada doble enlace dentro del residuo de C ² -C ²⁰ -alquenilo anterior puede, a menos que se indique lo contrario, adoptar la configuración E o Z, e independientemente del otro doble enlace en el caso de la poliinsaturación.

Ejemplos no limitantes de residuos "opcionalmente sustituidos" como se definen en el presente documento comprenden 1, 2, 3, 4, 5 o 6, preferentemente 1 o 2 sustituyentes idénticos o diferentes como, HO, SH, NH2, NO2, halógeno, como F, Cl, Br, J; alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio inferior, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior o hidroxilo inferior, como se define anteriormente.

El término "alquilo inferior" se refiere a los radicales Ci-C4-alquilo definidos anteriormente.

El término "alcoxi inferior" se refiere preferentemente a los análogos C ¹ -C ⁴ -alcoxi de los radicales alquilo inferiores mencionados anteriormente.

El término "alquiltio inferior" se refiere preferentemente a los análogos C1-C4-alquilo de los radicales alquilo inferiores mencionados anteriormente. Los ejemplos son metiltio, etiltio, propiltio, iso-propiltio, butiltio, sec-butiltio, isobutiltio y terc-butiltio.

El "alquenilo inferior" comprende los radicales C2-C4-alquenilo definidos anteriormente.

Los "alquinilos inferiores" comprenden los homólogos alquinilos de los radicales "alquenios inferiores" anteriores. El término "hidroxialquilo inferior" se refiere a C1-C4-hidroxialquilo, que es un radical alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, en el que al menos un átomo de hidrógeno, por ejemplo 1 o 2 de los átomos de hidrógeno, está sustituido por un grupo hidroxilo. Ejemplos de ello son el hidroximetilo, el 2-hidroxi-1 -etilo, el 2 y el 3-hidroxi-1-propilo, el 2, el 3 y el 4-hidroxi-1-butilo, y sus isómeros constitucionales.

En el presente documento se dan a conocer rangos de parámetros de diferente grado de preferencia para un parámetro en particular. Dentro del alcance de la presente divulgación se encuentra también cualquier combinación de rangos de parámetros de diferente grado de preferencia para cualquier combinación de dos o más parámetros referidos en el presente documento.

2. Realizaciones particulares de la invención:

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones particulares:

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para aislar el isómero 3-(E) de un compuesto de ácido carboxílico insaturado de la fórmula general (I)

donde

R1 es H o un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado, opcionalmente sustituido, preferentemente un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta, saturado y no sustituido;

R3 es H o un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ⁴ , preferentemente H o metilo;

R2 es un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado, opcionalmente sustituido, preferentemente un residuo de hidrocarbilo C2-C16 de cadena ramificada no saturado;

con la condición de que, si R3 es un residuo de hidrocarbilo C1-C4, R2 representa un residuo de hidrocarbilo que contiene al menos un átomo de carbono adicional;

a partir de una mezcla de isómeros que comprende el isómero 3-(E)- y el isómero 3-(Z)- de dicho compuesto de ácido carboxílico, por lo que dicha mezcla de isómeros se somete a una reacción de conversión enzimática catalizada por una lipasa (E.C 3.1.1.3), la cual convierte preferentemente, y en particular estereoselectivamente, dicho isómero 3-(E), y el producto de conversión de dicho isómero 3-(E) se aísla de dicha mezcla de reacción.

Una realización particular de la misma se refiere a un procedimiento, en el que dicha lipasa cataliza una reacción de conversión 3-(E)-estereoselectiva.

Más particularmente, dicha lipasa se aplica en forma libre o inmovilizada.

Más particularmente, dicha lipasa es una enzima natural o producida recombinantemente, opcionalmente modificada genéticamente (mutada).

Más particularmente, dicha lipasa se origina de Candida sp., en particular Candida antárctica , y aún más particularmente dicha lipasa es la lipasa B de Candida antarctica. (CALB) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:330 o un mutante de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos el 60 % con SEQ ID NO:330 y que retiene dicha 3-(E)-selectividad.

Según otra realización particular de dicho procedimiento, dicha reacción de conversión comprende una reacción de esterificación enzimática de un ácido de la fórmula (Ia);

donde

R2 y R3 son los definidos anteriormente;

y en el que se forma predominantemente el 3-(E)-éster; y en el que un alcano alifático R1OH, en el que R1 es como se ha definido anteriormente, preferentemente un residuo de alquilo C1-C20 saturado de cadena recta o ramificada, preferentemente C ¹ -C ⁴ , opcionalmente en presencia de un disolvente orgánico que no perturbe o incluso inhiba la actividad de la lipasa.

Según otra realización particular de dicho procedimiento, dicha reacción de conversión comprende una reacción de escisión enzimática de un éster de la fórmula (Ib);

donde

R1 es un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado, en particular C4-C ²⁰ -;

Y R 2 y R3 son los definidos anteriormente;

y en el que se forma predominantemente el 3-(E)-ácido; y en el que la reacción se realiza en presencia de agua, y opcionalmente en presencia de un disolvente orgánico, que no perturba o incluso inhibe la actividad de la lipasa.

Más particularmente, dicha reacción de conversión se realiza en un disolvente orgánico o en un disolvente acuosoorgánico.

Dicho disolvente orgánico se selecciona particularmente entre los hidrocarburos alifáticos o cicloalifáticos, como los hidrocarburos que tienen al menos 5 átomos de carbono, en particular el hexano, el ciclohexano, el heptano, el octano; los hidrocarburos aromáticos, en particular los compuestos aromáticos mononucleares, como el benceno, el xileno y el tolueno; y los éteres alifáticos, como el MTBE, el éter di-iso-propílico. Preferiblemente, los disolventes orgánicos adecuados deben ser capaces de formar un sistema de 2 fases con el agua.

Según otra realización de dicho procedimiento, en la que dicho compuesto de ácido carboxílico es un compuesto de ácido 3-(E)/7-(E)- homofarnesoico de fórmula (II)

en el que R1 es como se ha definido anteriormente.

Según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un ácido 3-(E)-carboxílico insaturado de la fórmula general (Ia):

donde

R2 y R3 son como se definen anteriormente;

donde

a) una mezcla de isómeros, que comprende el isómero 3-(E)- y el isómero 3-(Z)- de dicho ácido carboxílico de fórmula (Ia) se somete a una reacción de esterificación enzimática en presencia de un alcanol de fórmula R1OH, en la que R1 es un residuo de hidrocarbilo C1-C20 de cadena recta o ramificado, saturado o insaturado, preferiblemente un residuo de alquilo C1-C20 de cadena recta o ramificado, saturado, preferiblemente C1-C4; y en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las realizaciones 1 a 6;

b) dicho éster 3-(E)-carboxílico formado en la etapa a) se aísla, por ejemplo, transfiriendo el isómero ácido no reaccionado en una fase acuosa (como sal ácida) y recuperando el éster mediante un disolvente orgánico que estaba presente durante la conversión o que se añadió posteriormente; y

c) dicho éster aislado de la etapa b) se saponifica hasta obtener el correspondiente ácido 3-(E)-carboxílico de fórmula (Ia).

Según un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de un ácido 3-(E)-carboxílico insaturado de la fórmula general (Ia):

donde

R2 y R3 son como se definen anteriormente;

donde

a) una mezcla de isómeros, que comprende el isómero 3-(E)- y el isómero 3-(Z)- de un éster de ácido carboxílico de fórmula (Ib)

donde

R1 es un residuo de hidrocarbilo Ci-C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado, preferiblemente un residuo de alquilo C1-C20 de cadena recta o ramificada, saturado, preferiblemente C1-C ⁴ ; y

R2 y R3 son los definidos anteriormente;

se somete a una reacción enzimática de escisión de ésteres en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las realizaciones 1 a 6, y preferentemente en presencia de agua y opcionalmente de un disolvente orgánico;

b) se aísla dicho ácido 3-(E)-carboxílico tal como se ha formado en la etapa a), preferentemente como ácido libre de la fase acuosa de la mezcla de reacción.

Según una realización particular de los procedimientos del segundo y tercer aspecto anteriores, dicho procedimiento aplica un disolvente orgánico como el definido anteriormente.

Según otra realización de los procedimientos anteriores, dicho isómero 3-(E) de un ácido carboxílico insaturado es el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico.

Según otra realización de los procedimientos anteriores, dicha mezcla de isómeros comprende una mezcla de ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico o una mezcla de éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y éster del ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico de un alcanol de la fórmula R1OH, en la que R1 es un residuo de hidrocarbilo C1-C20de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado.

Más particularmente, este procedimiento puede aplicarse para preparar el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico en el que

a) una mezcla de isómeros, que comprende el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y el ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico se somete a una reacción de esterificación enzimática en presencia de un alcanol de la fórmula R1OH, en la que R1 es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificado, saturado o insaturado, preferiblemente un residuo de alquilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificado, saturado, preferiblemente C ¹ -C ⁴ ; y en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las realizaciones 1 a 6 en un disolvente como se define en una de las realizaciones 9 y 10;

b) dicho éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico, tal como se ha formado en la etapa a), se separa del ácido sin reaccionar (i.p. 3-(Z)/7-(E)-ácido homofarnesoico), en particular por destilación o, preferentemente, por extracción; y

c) dicho éster aislado del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico se saponifica a ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico; o puede aplicarse para preparar el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico,

en el que

a) una mezcla de isómeros, que comprende el éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y el éster del ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico se somete a una reacción de escisión enzimática del éster en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las realizaciones 1 a 6 en un disolvente como se define en una de las realizaciones 9 y 10, y preferentemente en presencia de agua; y

b) dicho ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico formado en la etapa a) se separa del éster no reaccionado (i.p. ester del ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesoico), en particular por destilación o, preferentemente, por extracción.

Según un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de (-)-ambrox de la fórmula (III)

que comprende las etapas de

a) obtener dicho ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico aplicando un procedimiento como el definido anteriormente en el contexto del primer, segundo o tercer aspecto de la invención;

b) reducir químicamente el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico a 3-(E)/7-(E)-homofarnesol y

c) ciclación enzimática de 3-(E)/7-(E)-homofarnesol a (-)-ambrox.

Según un quinto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de (-)-ambrox de la fórmula (III)

que comprende las etapas de

a) obtener dicho ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico aplicando un procedimiento como el definido anteriormente en el contexto del primer, segundo y tercer aspecto de la invención;

b) ciclación enzimática del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico a esclareolida de la fórmula (IV)

y

c) convertir químicamente dicha esclareolida en (-)-ambrox.

Según una realización particular del procedimiento del cuarto y quinto aspecto de la invención, la cidización enzimática se realiza en presencia de una transferasa intramolecular (E.C. 5.4), en particular una ciclasa del ácido homofarnesoico (E.C. 5.4.99.17), en particular una escualeno-hopeno ciclasa (E.C. 5.4.99.17), mostrando la actividad de la ciclasa del ácido homofarnesoico.

Más particularmente, dicha ciclasa es una escualeno-hopeno ciclasa (SHC) natural o producida recombinantemente, opcionalmente modificada genéticamente (mutada), como por ejemplo una escualeno-hopeno ciclasa originaria de Methylococcus capsalatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec, Streptomyces coelicolor o, preferiblemente, Zymomonas mobilis, como una ciclasa de Zymomonas mobilis, que comprenda una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 60 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2.

Según un último aspecto, la presente invención proporciona ésteres alquílicos del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico, en los que dicho grupo alquilo se selecciona entre n-propilo, isopropilo, n-butilo, 2-butilo, isobutilo; así como el pentilo, el hexilo, el heptilo, el octilo y sus isómeros constitucionales; preferentemente en forma de la forma 3-(E)/7-(E) sustancialmente pura, y en particular preparada según un procedimiento como el definido anteriormente.

En general, las ciclasas aplicables en dicho aspecto de la invención son SHCs que se enumeran a continuación haciendo referencia a su secuencia de tipo salvaje (se indican los SEQ ID NO's y los números de Genbank) y su fuente microbiana.

SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de una ciclasa que también se conoce como Zm-SHC-1.

3. Enzimas y mutantes enzimáticos según la invención

La presente invención no se limita al uso de las lipasas y ciclasas específicamente divulgadas, sino que también se extiende a sus equivalentes funcionales.

Los "equivalentes funcionales" o análogos de las enzimas concretamente divulgadas son, dentro del ámbito de la presente invención, diversos polipéptidos de las mismas, que además poseen la función o actividad biológica deseada, por ejemplo, actividad enzimática.

Por ejemplo, se entiende por "equivalentes funcionales" las enzimas que, en una prueba utilizada para la actividad enzimática, muestran al menos una actividad del 1 al 10%, o al menos el 20%, o al menos el 50%, o al menos el 75%, o al menos el 90% superior o inferior de una enzima, tal como se define en el presente documento.

Por "equivalentes funcionales", según la invención, se entiende también, en particular, los mutantes que, en al menos una posición de secuencia de las secuencias de aminoácidos indicadas anteriormente, tienen un aminoácido diferente del indicado concretamente, pero que, sin embargo, poseen una de las actividades biológicas mencionadas. Los "equivalentes funcionales" comprenden, por tanto, los mutantes obtenibles por una o más, como por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15, adiciones de aminoácidos, sustituciones, inserciones, deleciones y/o inversiones, donde los cambios indicados pueden ocurrir en cualquier posición de la secuencia, siempre que conduzcan a un mutante con el perfil de propiedades según la invención. La equivalencia funcional también se da, en particular, si los patrones de reactividad coinciden cualitativamente entre el polipéptido mutante y el no modificado, es decir, si, por ejemplo, los mismos sustratos se convierten a una velocidad diferente. En la siguiente tabla se muestran ejemplos de sustituciones de aminoácidos adecuadas:

Residuo original Ejemplos de sustitución

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln; His

Asp Glu

Cys Ser

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

Su Asn ; Gln

Ile Leu; Val

Leu Ile; Val

Lys Arg ; Gln ; Glu

Met Leu ; Ile

Phe Met ; Leu ; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp ; Phe

Val Ile; Leu

Los "equivalentes funcionales" en el sentido anterior son también "precursores" de los polipéptidos descritos, así como "derivados funcionales" y "sales" de los polipéptidos.

Los "precursores" son en este caso precursores naturales o sintéticos de los polipéptidos con o sin la actividad biológica deseada.

La expresión "sales" significa sales de grupos carboxilo, así como sales de adición de ácido de grupos amino de las moléculas de proteínas según la invención. Las sales de los grupos carboxilo pueden producirse de forma conocida y comprenden sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, hierro y zinc, y sales con bases orgánicas, por ejemplo, aminas, como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina y similares. Las sales de adición de ácidos, por ejemplo, las sales con ácidos inorgánicos, como el ácido clorhídrico o el ácido sulfúrico, y las sales con ácidos orgánicos, como el ácido acético y el ácido oxálico, también están cubiertas por la invención.

Los "derivados funcionales" de los polipéptidos según la invención también pueden producirse en grupos laterales de aminoácidos funcionales o en su extremo N-terminal o C-terminal utilizando técnicas conocidas. Dichos derivados comprenden, por ejemplo, ésteres alifáticos de grupos de ácido carboxílico, amidas de grupos de ácido carboxílico, obtenibles por reacción con amoníaco o con una amina primaria o secundaria; derivados N-acílicos de grupos aminos libres, producidos por reacción con grupos acilo; o derivados O-acílicos de grupos hidroxi libres, producidos por reacción con grupos acilo.

Los "equivalentes funcionales" comprenden naturalmente también los polipéptidos que pueden obtenerse de otros organismos, así como las variantes naturales. Por ejemplo, pueden establecerse áreas de regiones de secuencias homólogas mediante la comparación de secuencias, y pueden determinarse enzimas equivalentes sobre la base de los parámetros concretos de la invención.

Los "equivalentes funcionales" también comprenden fragmentos, preferentemente dominios individuales o motivos de secuencia, de los polipéptidos según la invención, que por ejemplo muestran la función biológica deseada.

Los "equivalentes funcionales" son, además, proteínas de fusión que tienen una de las secuencias polipeptídicas mencionadas anteriormente o equivalentes funcionales derivados de ellas y al menos una secuencia heteróloga adicional, funcionalmente diferente, en asociación funcional N-terminal o C-terminal (es decir, sin deterioro funcional mutuo sustancial de las partes de la proteína de fusión). Ejemplos no limitantes de estas secuencias heterólogas son, por ejemplo, péptidos señal, anclajes de histidina o enzimas.

Los "equivalentes funcionales" que también se incluyen según la invención son homólogos de las proteínas concretamente divulgadas. Estos poseen valores porcentuales de identidad como los indicados anteriormente. Dichos valores se refieren a la identidad con las secuencias de aminoácidos concretamente divulgadas, y pueden calcularse según el algoritmo de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.

Los valores de % de identidad también pueden ser calculados a partir de alineamientos BLAST, algoritmo blastp (proteina-proteina BLAST) o aplicando el ajuste Clustal como se indica a continuación.

Un porcentaje de identidad de un polipéptido homólogo según la invención significa en particular el porcentaje de identidad de los residuos de aminoácidos en relación con la longitud total de una de las secuencias de aminoácidos descritas concretamente en el presente documento.

En el caso de una posible glicosilación de proteínas, los "equivalentes funcionales" según la invención comprenden proteínas del tipo designado anteriormente en forma deglicosilada o glicosilada, así como formas modificadas que pueden obtenerse alterando el patrón de glicosilación.

Dichos equivalentes u homólogos funcionales de las proteínas o polipéptidos según la invención pueden producirse por mutagénesis, por ejemplo, por mutación puntual, alargamiento o acortamiento de la proteína.

Dichos equivalentes u homólogos funcionales de las proteínas según la invención pueden identificarse mediante el cribado de bases de datos combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de acortamiento. Por ejemplo, se puede producir una base de datos variada de variantes de proteínas mediante mutagénesis combinatoria a nivel de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la ligadura enzimática de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos. Hay muchos procedimientos que pueden utilizarse para la producción de bases de datos de homólogos potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia genética degenerada puede llevarse a cabo en un sintetizador automático de ADN, y el gen sintético puede entonces ligarse en un vector de expresión adecuado. El uso de un genoma degenerado permite suministrar todas las secuencias de una mezcla, que codifican el conjunto deseado de posibles secuencias de proteínas. Los procedimientos de síntesis de oligonucleótidos degenerados son conocidos por un experto en la materia (por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3 Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323 Itakura et al., (1984) Science 198:1056 Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res.

11:477).

En la técnica anterior, se conocen varias técnicas para el cribado de productos génicos de bases de datos combinatorias, que fueron producidos por mutaciones puntuales o acortamientos, y para el cribado de bibliotecas de ADNc en busca de productos génicos con una propiedad seleccionada. Estas técnicas pueden adaptarse para el cribado rápido de los bancos de genes producidos por mutagénesis combinatoria de homólogos según la invención. Las técnicas más utilizadas para el cribado de grandes bancos de genes, que se basan en un análisis de alto rendimiento, comprenden la clonación del banco de genes en vectores de expresión que puedan replicarse, la transformación de las células adecuadas con el banco de vectores resultante y la expresión de los genes combinados en condiciones en las que la detección de la actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se ha detectado. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bases de datos, puede utilizarse en combinación con las pruebas de cribado, con el fin de identificar homólogos (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815 Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

4. Secuencias de ácidos nucleicos codificantes

La invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican enzimas y mutantes como se define en el presente documento.

La presente invención también se refiere a ácidos nucleicos con un cierto grado de "identidad" con las secuencias específicamente divulgadas en el presente documento. Por "identidad" entre dos ácidos nucleicos se entiende la identidad de los nucleótidos, en cada caso a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico.

Por ejemplo, la identidad puede calcularse mediante el programa Vector NTI Suite 7.1 de la empresa Informax (USA) empleando el método Clustal Method (Higgins DG, Sharp PM. Alineaciones múltiples de secuencias rápidas y sensibles en un microordenador. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr; 5(2):151-1) con los siguientes ajustes:

Parámetro de alineación múltiple:

Penalización por apertura de huecos 10

Penalización por extensión de huecos 10

Rango de penalización por separación de huecos 8

Penalización por separación de huecos off

% de identidad para el retraso de la alineación 40

Huecos específicos de los residuos off

Hueco de residuos hidrofílicos off

Pesaje de transición 0

Parámetro de alineación por pares:

Algoritmo FAST on

Tamaño de K-tuple 1

Penalización por huecos 3

Tamaño de la ventana 5

Número de mejores diagonales 5

Alternativamente la identidad puede determinarse según Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, López, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, página web: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# y la siguiente configuración

Penalización de apertura de hueco de ADN 15.0

Penalización de extensión de hueco de ADN 6.66

Matriz de ADN Identity

Penalización de apertura de hueco de proteina 10.0

Penalización de extensión de hueco de proteina 0.2

Matriz de proteínas Gonnet

Proteína/ADN ENDGAP -1

Proteína/ADN GAPDIST 4

Todas las secuencias de ácido nucleico mencionadas en el presente documento (secuencias de ADN y ARN monocatenario y bicatenario, por ejemplo, ADNc y ARNm) pueden producirse de forma conocida mediante síntesis química a partir de los bloques de construcción de nucleótidos, por ejemplo, mediante la condensación de fragmentos de bloques de construcción de ácido nucleico individuales y complementarios de la doble hélice. La síntesis química de oligonucleótidos puede realizarse, por ejemplo, de forma conocida, por el método de la fosfoamida (Voet, Voet, 2a edición, Wiley Press, Nueva York, páginas 896-897). La acumulación de oligonucleótidos sintéticos y el relleno de huecos mediante el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa y las reacciones de ligación, así como las técnicas generales de clonación, se describen en Sambrook et al. (1989), véase más adelante.

La invención también se relaciona con secuencias de ácido nucleico (secuencias de ADN y ARN monocatenario y bicatenario, por ejemplo, ADNc y ARNm), que codifican uno de los polipéptidos anteriores y sus equivalentes funcionales, que pueden obtenerse, por ejemplo, utilizando análogos nucleotídicos artificiales.

La invención se refiere tanto a moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican polipéptidos o proteínas según la invención o segmentos biológicamente activos de los mismos, como a fragmentos de ácido nucleico, que pueden utilizarse, por ejemplo, como sondas de hibridación o cebadores para identificar o amplificar ácidos nucleicos codificantes según la invención.

Las moléculas de ácido nucleico según la invención pueden contener además secuencias no traducidas del extremo 3' y/o 5' de la región genética codificante.

La invención se refiere además a las moléculas de ácido nucleico que son complementarias a las secuencias de nucleótidos concretamente descritas o a un segmento de las mismas.

Las secuencias de nucleótidos según la invención hacen posible la producción de sondas y cebadores que pueden utilizarse para la identificación y/o clonación de secuencias homólogas en otros tipos celulares y organismos. Dichas sondas o cebadores comprenden generalmente una región de secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones "estrictas" (véase más adelante) en al menos unos 12, preferiblemente al menos unos 25, por ejemplo, unos 40, 50 o 75 nucleótidos sucesivos de una cadena sentido de una secuencia de ácido nucleico según la invención o de una cadena antisentido correspondiente.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico y además puede estar sustancialmente libre de otro material celular o medio de cultivo, si se está produciendo por técnicas recombinantes, o puede estar libre de precursores químicos u otros productos químicos, si se está sintetizando químicamente.

Una molécula de ácido nucleico según la invención puede aislarse mediante técnicas estándar de biología molecular y la información de la secuencia suministrada según la invención. Por ejemplo, el ADNc puede aislarse de una biblioteca de ADNc adecuada, utilizando una de las secuencias completas concretamente divulgadas o un segmento de la misma como sonda de hibridación y técnicas de hibridación estándar (como se describe, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Además, una molécula de ácido nucleico que comprende una de las secuencias divulgadas o un segmento de la misma, puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa, utilizando los cebadores oligonucleótidos que se construyeron sobre la base de esta secuencia. El ácido nucleico amplificado de esta manera puede ser clonado en un vector adecuado y puede ser caracterizado por secuenciación de ADN. Los oligonucleótidos según la invención también pueden producirse mediante métodos de síntesis estándar, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automático.

Las secuencias de ácido nucleico según la invención o sus derivados, homólogos o partes de estas secuencias, pueden por ejemplo aislarse mediante las técnicas habituales de hibridación o la técnica de PCR de otras bacterias, por ejemplo, mediante bibliotecas genómicas o de ADNc. Estas secuencias de ADN hibridan en condiciones estándar con las secuencias según la invención.

Por "hibridar" se entiende la capacidad de un polinucleótido u oligonucleótido de unirse a una secuencia casi complementaria en condiciones estándar, mientras que la unión inespecífica no se produce entre socios no complementarios en estas condiciones. Para ello, las secuencias pueden ser complementarias en un 90-100%. La propiedad de las secuencias complementarias de poder unirse específicamente entre sí se utiliza, por ejemplo, en el Northern Blotting o el Southern Blotting o en la unión de cebadores en la PCR o la RT-PCR.

Los oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas se utilizan ventajosamente para la hibridación. Sin embargo, también es posible utilizar fragmentos más largos de los ácidos nucleicos según la invención o las secuencias completas para la hibridación. Estas condiciones estándar varían en función del ácido nucleico utilizado (oligonucleótido, fragmento más largo o secuencia completa) o en función del tipo de ácido nucleico -ADN o ARN- que se utilice para la hibridación. Por ejemplo, las temperaturas de fusión de los híbridos ADN:ADN son aproximadamente 10°C más bajas que las de los híbridos ADN:ARN de la misma longitud.

Por ejemplo, dependiendo del ácido nucleico en particular, las condiciones estándar significan temperaturas entre 42 y 58°C en una solución tampón acuosa con una concentración entre 0,1 y 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM de citrato de sodio, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de 50% de formamida, por ejemplo 42°C en 5 x SSC, 50% de formamida. Ventajosamente, las condiciones de hibridación para los híbridos de ADN:ADN son 0,1 x SSC y temperaturas entre unos 20°C a 45°C, preferentemente entre unos 30°C a 45°C. Para los híbridos de ADN:ARN, las condiciones de hibridación son ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre aproximadamente 30°C a 55°C, preferentemente entre aproximadamente 45°C a 55°C. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son ejemplos de valores de temperatura de fusión calculados para un ácido nucleico con una longitud de aproximadamente 100 nucleótidos y un contenido de G C del 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación del ADN se describen en los libros de texto de genética pertinentes, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, y pueden calcularse mediante fórmulas conocidas por un experto en la materia, por ejemplo, en función de la longitud de los ácidos nucleicos, el tipo de híbridos o el contenido de G C. Un experto en la materia puede obtener más información sobre la hibridación en los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York Hames y Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

La "hibridación" puede llevarse a cabo, en particular, en condiciones estrictas. Estas condiciones de hibridación se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., en Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, páginas 9.31-9.57 o en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

Por condiciones de hibridación "estrictas" se entiende, en particular: Incubación a 42°C durante la noche en una solución compuesta por formamida al 50%, 5 x SSC (750 mM NaCl, 75 mM citrato trisódico), 50 mM fosfato sódico (pH 7,6), 5x solución Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y esquilado, seguido de un lavado de los filtros con 0,1x SSC a 65°C.

La invención también se refiere a derivados de las secuencias de ácido nucleico concretamente divulgadas o derivables.

Así, otras secuencias de ácido nucleico según la invención pueden derivarse de las secuencias específicamente divulgadas en el presente documento y pueden diferir de ella por adición, sustitución, inserción o supresión de uno o varios nucleótidos, y además codificar polipéptidos con el perfil de propiedades deseado.

La invención también abarca las secuencias de ácido nucleico que comprenden las llamadas mutaciones silenciosas o que han sido alteradas, en comparación con una secuencia concreta, de acuerdo con el uso de codones de un organismo original o anfitrión especial, así como las variantes que se producen naturalmente, por ejemplo, variantes de empalme o variantes alélicas, de las mismas.

También se refiere a las secuencias que pueden obtenerse mediante sustituciones conservadoras de nucleótidos (es decir, el aminoácido en cuestión se sustituye por un aminoácido de la misma carga, tamaño, polaridad y/o solubilidad).

La invención también se refiere a las moléculas derivadas de los ácidos nucleicos concretamente divulgados por polimorfismos de secuencia. Estos polimorfismos genéticos pueden existir entre los individuos de una población debido a la variación natural. Estas variaciones naturales suelen producir una variación del 1 al 5% en la secuencia de nucleótidos de un gen.

Los derivados de las secuencias de ácidos nucleicos según la invención son, por ejemplo, variantes alélicas que tienen al menos un 60% de homología a nivel del aminoácido derivado, preferiblemente al menos un 80% de homología, y muy especialmente al menos un 90% de homología en todo el rango de la secuencia (en lo que respecta a la homología a nivel de aminoácidos, hay que remitirse a los detalles dados anteriormente para los polipéptidos). Ventajosamente, las homologías pueden ser mayores sobre regiones parciales de las secuencias.

Además, los derivados también deben entenderse como homólogos de las secuencias de ácido nucleico según la invención, por ejemplo, homólogos animales, vegetales, fúngicos o bacterianos, secuencias acortadas, ADN de cadena simple o ARN de la secuencia de ADN codificante y no codificante. Por ejemplo, los homólogos tienen, a nivel de ADN, una homología de al menos el 40%, preferiblemente de al menos el 60%, especialmente preferiblemente de al menos el 70%, muy especialmente preferiblemente de al menos el 80% en toda la región de ADN dada en una secuencia específicamente divulgada en el presente documento.

Además, debe entenderse que los derivados son, por ejemplo, fusiones con promotores. Los promotores que se añaden a las secuencias de nucleótidos indicadas pueden modificarse mediante al menos un intercambio de nucleótidos, al menos una inserción, inversión y/o supresión, aunque sin perjudicar la funcionalidad o eficacia de los promotores. Además, la eficacia de los promotores puede aumentarse alterando su secuencia o puede cambiarse completamente por promotores más eficaces incluso de organismos de un género diferente.

5. Constructos según la invención

La invención también se refiere a constructos de expresión que contienen, bajo el control genético de secuencias nucleotídicas reguladoras, una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido o una proteína de fusión según la invención; así como vectores que comprenden al menos uno de estos constructos de expresión.

Por "unidad de expresión" se entiende, según la invención, un ácido nucleico con actividad de expresión, que comprende un promotor tal como se define en el presente documento y que, tras la asociación funcional con un ácido nucleico que debe expresarse o un gen, regula la expresión, es decir, la transcripción y la traducción de este ácido nucleico o de este gen. Por lo tanto, en este contexto, también se denomina "secuencia de ácido nucleico reguladora". Además del promotor, puede haber otros elementos reguladores, por ejemplo, potenciadores.

Por "casete de expresión" o "constructo de expresión" se entiende, según la invención, una unidad de expresión, que está funcionalmente asociada al ácido nucleico que se va a expresar o al gen que se va a expresar. A diferencia de una unidad de expresión, un casete de expresión comprende, por tanto, no sólo las secuencias de ácido nucleico que regulan la transcripción y la traducción, sino también las secuencias de ácido nucleico que deben expresarse como proteína como resultado de la transcripción y la traducción.

Los términos "expresión" o "sobreexpresión" describen, en el contexto de la invención, la producción o el aumento de la actividad intracelular de una o más enzimas en un microorganismo, que están codificadas por el ADN correspondiente. Para ello, es posible, por ejemplo, insertar un gen en un organismo, sustituir un gen existente por otro, aumentar el número de copias del gen o de los genes, utilizar un promotor fuerte o utilizar un gen que codifique para una enzima correspondiente con una actividad elevada, y opcionalmente se pueden combinar estas medidas.

Preferiblemente, dichos constructos según la invención comprenden un promotor 5'-aguas arriba de la respectiva secuencia codificante, y una secuencia terminadora 3'-aguas abajo, y opcionalmente otros elementos reguladores habituales, en cada caso asociados funcionalmente con la secuencia codificante.

Un "promotor", un "ácido nucleico con actividad promotora" o una "secuencia promotora" significan, según la invención, un ácido nucleico que, funcionalmente asociado a un ácido nucleico que va a ser transcrito, regula la transcripción de este ácido nucleico.

Por asociación "funcional" u "operativa" se entiende, en este contexto, por ejemplo, la disposición secuencial de uno de los ácidos nucleicos con actividad promotora y de una secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir y, opcionalmente, de otros elementos reguladores, por ejemplo secuencias de ácido nucleico que permiten la transcripción de los ácidos nucleicos, y por ejemplo un terminador, de tal manera que cada uno de los elementos reguladores pueda cumplir su función en la transcripción de la secuencia de ácido nucleico. Esto no requiere necesariamente una asociación directa en el sentido químico. Las secuencias de control genético, como las secuencias potenciadoras, también pueden ejercer su función sobre la secuencia objetivo desde posiciones más remotas o incluso desde otras moléculas de ADN. Se prefieren las disposiciones en las que la secuencia de ácido nucleico que se va a transcribir se sitúa detrás (es decir, en el extremo 3') de la secuencia promotora, de modo que las dos secuencias se unen covalentemente entre sí. La distancia entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar transgénicamente puede ser inferior a 200 pb (pares de bases), o inferior a 100 pb o inferior a 50 pb.

Aparte de los promotores y los terminadores, ejemplos de otros elementos reguladores que pueden mencionarse son las secuencias de orientación, los potenciadores, las señales de poliadenilación, los marcadores seleccionables, las señales de amplificación, los orígenes de replicación y similares. Las secuencias reguladoras adecuadas se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Los constructos de ácido nucleico según la invención comprenden en particular secuencias seleccionadas entre las mencionadas específicamente en el presente documento o derivados y homólogos de las mismas, así como las secuencias de ácido nucleico que pueden derivarse de las secuencias de aminoácidos mencionadas específicamente en el presente documento que se asocian ventajosamente de forma operativa o funcional con una o más señales reguladoras para controlar, por ejemplo, el aumento de la expresión génica.

Además de estas secuencias reguladoras, la regulación natural de estas secuencias puede seguir estando presente frente a los genes estructurales reales y, opcionalmente, puede haber sido alterada genéticamente, de modo que la regulación natural se apague y la expresión de los genes se haya incrementado. El constructo de ácido nucleico también puede tener un diseño más sencillo, es decir, sin insertar ninguna señal reguladora adicional delante de la secuencia codificante y sin eliminar el promotor natural con su regulación. En su lugar, se silencia la secuencia reguladora natural para que la regulación deje de tener lugar y se incremente la expresión del gen.

Un constructo de ácido nucleico preferido contiene ventajosamente también una o más de las secuencias potenciadoras antes mencionadas, asociadas funcionalmente con el promotor, que permiten aumentar la expresión de la secuencia de ácido nucleico. También se pueden insertar secuencias adicionales ventajosas, como otros elementos reguladores o terminadores, en el extremo 3' de las secuencias de ADN. El constructo puede contener una o más copias de los ácidos nucleicos según la invención. El constructo también puede contener otros marcadores, como las resistencias a los antibióticos o los genes que complementan la auxotrofia, opcionalmente para la selección del constructo.

Ejemplos de secuencias reguladoras adecuadas están contenidas en promotores como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, lpp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPBAü)SP6-, lambda-PR- o en el promotor lambda-PL, que encuentran aplicación ventajosamente en bacterias Gram-negativas. Otras secuencias reguladoras ventajosas están contenidas, por ejemplo, en los promotores Gram-positivos ace, amy y SPO2, en los promotores de levadura o de hongos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, Ad H. También se pueden utilizar promotores artificiales para la regulación.

Para la expresión, el constructo de ácido nucleico se inserta en un organismo huésped ventajosamente en un vector, por ejemplo, un plásmido o un fago, que permite la expresión óptima de los genes en el huésped. Además de los plásmidos y los fagos, los vectores también deben entenderse como todos los demás vectores conocidos por un experto en la materia, por ejemplo, virus, como SV40, CMV, baculovirus y adenovirus, transposones, elementos IS, fásmidos, cósmidos y ADN lineal o circular. Estos vectores pueden replicarse de forma autónoma en el organismo anfitrión o pueden replicarse cromosómicamente. Estos vectores representan otra realización de la invención.

Los plásmidos adecuados son, por ejemplo en E. coli, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, Agt11 o pBdCl; en actinomicetos nocardioformes pJAM2; en Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361; en bacilos pUB110, pC194 o pBD214; en Corynebacterium pSA77 o pAj667; en hongos pALSI, pIL2 o pBB116; en levaduras 2alphaM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. Los plásmidos mencionados representan una pequeña selección de los posibles plásmidos. Otros plásmidos son bien conocidos por un experto en la materia y se encuentran, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-Nueva York-Oxford, 1985, ISBN 0444904018).

En otra realización del vector, el vector que contiene el constructo de ácido nucleico según la invención o el ácido nucleico según la invención puede insertarse ventajosamente en forma de ADN lineal en los microorganismos e integrarse en el genoma del organismo huésped mediante recombinación heteróloga u homóloga. Este ADN lineal puede comprender un vector linealizado como el plásmido o simplemente el constructo de ácido nucleico o el ácido nucleico según la invención.

Para una expresión óptima de los genes heterólogos en los organismos, es ventajoso alterar las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con el uso específico de codones empleado en el organismo. El uso de codones puede determinarse fácilmente a partir de evaluaciones informáticas de otros genes conocidos del organismo en cuestión.

La producción de un casete de expresión según la invención se basa en la fusión de un promotor adecuado con una secuencia de nucleótidos codificante adecuada y una señal de terminación o de poliadenilación. Para ello se utilizan técnicas comunes de recombinación y clonación, como se describe, por ejemplo, en T. Maniatis, E.F. Fritsch y J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), así como en T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, n Y (1984) y en Ausubel, F.M. y otros, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience (1987).

El constructo de ácido nucleico recombinante o el constructo genético se inserta ventajosamente en un vector específico del huésped para su expresión en un organismo huésped adecuado, para permitir la expresión óptima de los genes en el huésped. Los vectores son bien conocidos por un experto en la materia y se encuentran, por ejemplo, en "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Publ. Elsevier, Amsterdam-Nueva York-Oxford, 1985).

⁶ . Huéspedes que pueden ser utilizados según la invención

Dependiendo del contexto, el término "microorganismo" significa el microorganismo de partida (de tipo salvaje) o un microorganismo modificado genéticamente según la invención, o ambos.

El término "de tipo salvaje" significa, según la invención, el correspondiente microorganismo de partida, y no tiene que corresponder necesariamente a un organismo natural.

Mediante los vectores según la invención, se pueden producir microorganismos recombinantes, que han sido transformados, por ejemplo, con al menos un vector según la invención y que pueden utilizarse para la producción de los polipéptidos según la invención. Ventajosamente, los constructos recombinantes según la invención, descritos anteriormente, se insertan en un sistema huésped adecuado y se expresan. Preferentemente, se utilizan procedimientos comunes de clonación y transfección que son conocidos por un experto en la materia, por ejemplo, la coprecipitación, la fusión de protoplastos, la electroporación, la transfección retroviral y otros similares, con el fin de asegurar la expresión de los ácidos nucleicos indicados en el sistema de expresión respectivo. Los sistemas adecuados se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Publ. Wiley Interscience, Nueva York 1997o Sambrook et al. Clonación molecular: A Laboratory Manual. 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En principio, todos los organismos procariotas pueden considerarse organismos huéspedes recombinantes para el ácido nucleico según la invención o el constructo de ácido nucleico. Las bacterias se utilizan ventajosamente como organismos huéspedes. Preferentemente se seleccionan entre las bacterias nativas o recombinantes que tienen la capacidad de producir cuerpos de inclusión del tipo PHA, TAG o WE, como en particular los actinomicetos nocardioformes productores de TAG, en particular del género Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia, Gordonia, Skermania y Tsukamurella; así como los estreptomicetos productores de TAG; los géneros Acinetobacter y Alcanivorax productores de W E ; así como las cepas recombinantes del género Escherichia, especialmente E. coli, Corynebacterium, especialmente C. glutamicum y Bacillus, especialmente B. subtilis.

El organismo anfitrión o los organismos anfitriones según la invención contienen entonces preferentemente al menos una de las secuencias de ácido nucleico, constructos de ácido nucleico o vectores descritos en esta invención, que codifican una actividad enzimática según la definición anterior.

Los organismos utilizados en el procedimiento según la invención se cultivan o se crían de una manera conocida por un experto en la materia, dependiendo del organismo huésped. Por regla general, los microorganismos se cultivan en un medio líquido que contiene una fuente de carbono, generalmente en forma de azúcares, una fuente de nitrógeno, generalmente en forma de fuentes orgánicas de nitrógeno como el extracto de levadura o sales como el sulfato de amonio, oligoelementos como sales de hierro, manganeso y magnesio y, opcionalmente, vitaminas, a temperaturas entre 0°C y 100°C, preferentemente entre 10°C y 60°C con aireación de oxígeno. El pH del medio nutritivo líquido puede mantenerse en un valor fijo, es decir, regulado o no regulado durante el cultivo. El cultivo puede realizarse por lotes, por semilotes o de forma continua. Los nutrientes pueden suministrarse al inicio de la fermentación o pueden suministrarse posteriormente, de forma semicontinua o continua.

7. Producción recombinante de enzimas de la invención

La invención también se refiere a procedimientos para la producción de enzimas utilizadas en los procedimientos según la invención, cultivando un microorganismo que expresa dicha enzima, y aislando el producto deseado del cultivo.

Los microorganismos utilizados según la invención pueden cultivarse de forma continua o discontinua en el proceso por lotes o en el proceso por lotes alimentados o alimentados repetidamente. En el libro de texto de Chmiel (Bioprocesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).

El medio de cultivo que se va a utilizar debe satisfacer los requisitos de las cepas particulares de manera adecuada. Las descripciones de los medios de cultivo para diversos microorganismos figuran en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981).

Estos medios que pueden utilizarse según la invención comprenden generalmente una o varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas, vitaminas y/o oligoelementos.

Las fuentes de carbono preferidas son los azúcares, como los mono-, di- o polisacáridos. Muy buenas fuentes de carbono son, por ejemplo, la glucosa, la fructosa, la manosa, la galactosa, la ribosa, la sorbosa, la ribulosa, la lactosa, la maltosa, la sacarosa, la rafinosa, el almidón o la celulosa. Los azúcares también pueden añadirse al medio a través de compuestos complejos, como la melaza, u otros subproductos del refinado del azúcar. También puede ser ventajoso añadir mezclas de varias fuentes de carbono. Otras posibles fuentes de carbono son aceites y grasas como el aceite de soja, el aceite de girasol, el aceite de cacahuete y el aceite de coco, ácidos grasos como el ácido palmítico, el ácido esteárico o el ácido linoleico, alcoholes como el glicerol, el metanol o el etanol y ácidos orgánicos como el ácido acético o el ácido láctico.

Las fuentes de nitrógeno suelen ser compuestos orgánicos o inorgánicos de nitrógeno o materiales que contienen estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrógeno son el gas amoníaco o las sales de amonio, como el sulfato de amonio, el cloruro de amonio, el fosfato de amonio, el carbonato de amonio o el nitrato de amonio, los nitratos, la urea, los aminoácidos o las fuentes complejas de nitrógeno, como el licor de maíz, la harina de soja, la proteína de soja, el extracto de levadura, el extracto de carne y otros. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse por separado o como una mezcla.

Los compuestos de sales inorgánicas que pueden estar presentes en el medio comprenden las sales de cloruro, fosfato o sulfato de calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre y hierro.

Los compuestos inorgánicos que contienen azufre, por ejemplo, los sulfatos, los sulfitos, los ditionitos, los tetrationatos, los tiosulfatos, los sulfuros, pero también los compuestos orgánicos de azufre, como los mercaptanos y los tioles, pueden utilizarse como fuentes de azufre.

El ácido fosfórico, el dihidrogenofosfato de potasio o el hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio pueden utilizarse como fuentes de fósforo.

Se pueden añadir agentes quelantes al medio para mantener los iones metálicos en solución. Los agentes quelantes especialmente adecuados son los dihidroxifenoles, como el catecol o el protocatecolato, o los ácidos orgánicos, como el ácido cítrico.

Los medios de fermentación utilizados según la invención también pueden contener otros factores de crecimiento, como vitaminas o promotores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato y piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales suelen proceder de componentes complejos del medio, como el extracto de levadura, la melaza, el licor de maíz y otros similares. Además, pueden añadirse precursores adecuados al medio de cultivo. La composición exacta de los compuestos en el medio depende en gran medida del experimento concreto y debe decidirse individualmente para cada caso concreto. Se puede encontrar información sobre la optimización de los medios en el libro de texto "Microbiología Aplicada. Fisiología, un enfoque práctico" (Publ. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) p. 53-73, ISBN 0199635773). Los medios de cultivo también pueden obtenerse de proveedores comerciales, como Standard 1 (Merck) o BHI (Brain heart infusion, DIFCO), etc.

Todos los componentes del medio se esterilizan, ya sea por calentamiento (20 min a 1,5 bar y 121°C) o por filtración estéril. Los componentes se pueden esterilizar juntos o, si es necesario, por separado. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al inicio del cultivo, u opcionalmente pueden añadirse de forma continua o por alimentación discontinua.

La temperatura del cultivo se sitúa normalmente entre 15°C y 45°C, preferentemente entre 25°C y 40°C y puede mantenerse constante o variarse durante el experimento. El valor del pH del medio debe estar en el rango de 5 a 8,5, preferiblemente alrededor de 7,0. El valor del pH para el cultivo puede controlarse durante el mismo añadiendo compuestos básicos, como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua amoniacal, o compuestos ácidos, como ácido fosfórico o ácido sulfúrico. Pueden utilizarse agentes antiespumantes, por ejemplo, ésteres de poliglicol de ácidos grasos, para controlar la espuma. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, se pueden añadir al medio sustancias adecuadas con acción selectiva, por ejemplo, antibióticos. El oxígeno o las mezclas de gases que contienen oxígeno, por ejemplo, el aire ambiente, se introducen en el cultivo para mantener las condiciones aeróbicas. La temperatura del cultivo suele ser de 20°C a 45°C. El cultivo se continúa hasta que se haya formado un máximo del producto deseado. Esto se consigue normalmente en un plazo de 10 a 160 horas.

Las células pueden ser perturbadas opcionalmente por ultrasonidos de alta frecuencia, por alta presión, por ejemplo, en una célula de presión francesa, por osmólisis, por la acción de detergentes, enzimas líticas o disolventes orgánicos, por medio de homogeneizadores o por una combinación de varios de los procedimientos enumerados.

⁸ . Condiciones de reacción para los procedimientos biocatalíticos de la invención

La al menos una enzima que está presente durante un procedimiento de la invención o un paso individual de un procedimiento de varios pasos como se define aquí arriba, puede estar presente en células vivas que producen naturalmente o recombinantemente la enzima o enzimas, en células cosechadas, en células muertas, en células permeabilizadas, en extractos celulares crudos, en extractos purificados, o en forma esencialmente pura o completamente pura. La al menos una enzima puede estar presente en solución o como una enzima inmovilizada en un soporte. Una o varias enzimas pueden estar presentes simultáneamente en forma soluble e inmovilizada.

Los procedimientos según la invención pueden realizarse en reactores comunes, que son conocidos por los expertos en la materia, y en diferentes rangos de escala, por ejemplo, desde una escala de laboratorio (unos pocos mililitros a docenas de litros de volumen de reacción) hasta una escala industrial (varios litros a miles de metros cúbicos de volumen de reacción). Si la lipasa se utiliza en forma encapsulada por células no vivas, opcionalmente permeabilizadas, en forma de extracto celular más o menos purificado o en forma purificada, se puede utilizar un reactor químico. El reactor químico suele permitir controlar la cantidad de al menos una enzima, la cantidad de al menos un sustrato, el pH, la temperatura y la circulación del medio de reacción. Cuando la al menos una enzima está presente en las células vivas, el proceso será una fermentación. En este caso, la producción biocatalítica tendrá lugar en un biorreactor (fermentador), en el que se pueden controlar los parámetros necesarios para que las células vivas tengan unas condiciones de vida adecuadas (por ejemplo, el medio de cultivo con nutrientes, la temperatura, la aireación, la presencia o ausencia de oxígeno u otros gases, los antibióticos, etc.). Los expertos en la materia están familiarizados con los reactores químicos o los biorreactores, por ejemplo, con los procedimientos para aumentar la escala de los procedimientos químicos o biotecnológicos de la escala de laboratorio a la escala industrial, o para optimizar los parámetros del proceso, que también están ampliamente descritos en la literatura (para los procedimientos biotecnológicos, véase, por ejemplo Crueger und Crueger, Biotechnologie - Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie, 2. Ed., R. Oldenbourg Verlag, München, Wien, 1984).

Las células que contienen la al menos una enzima pueden permeabilizarse por medios físicos o mecánicos, como pulsos de ultrasonido o radiofrecuencia, prensas Francesas, o medios químicos, como medios hipotónicos, enzimas líticas y detergentes presentes en el medio, o una combinación de tales procedimientos. Ejemplos de detergentes son la digitonina, el n-dodecilmaltosido, el octilglicósido, el Triton® X-100, el Tween ® 20, el desoxicolato, el CHAPS (3-[(3-Colamidopropil)dimetil amonio]-1-propano sulfonato), el Nonidet ® P40 (Etil fenol polietilenglicol eter), y similares.

Si la al menos una enzima está inmovilizada, se une a un soporte inerte. Los materiales portadores adecuados son conocidos en la técnica y se divulgan, por ejemplo, en EP-A-1149849, EP-A-1 069 183 y DE-OS 100193773 así como las referencias bibliográficas citadas en ellas (todas las cuales se adjuntan específicamente en relación con los materiales de soporte). Ejemplos de materiales portadores adecuados son las arcillas, los minerales arcillosos como la caolinita, la tierra diatomácea, la perlita, la sílice, la alúmina, el carbonato de sodio, el carbonato de calcio, la celulosa en polvo, los materiales intercambiadores de aniones, los polímeros sintéticos, como el poliestireno, las resinas acrílicas, las resinas de fenol formaldehído, los poliuretanos y las poliolefinas, como el polietileno y el polipropileno. Para la preparación de enzimas unidas a portadores, los materiales portadores suelen utilizarse en forma de polvos finos, siendo preferibles las formas porosas. El tamaño de las partículas del material portador no suele superar los 5 mm, en particular los 2 mm. En caso de que al menos una enzima esté presente en un preparado de células enteras, dicho preparado de células enteras puede estar presente en forma libre o inmovilizada. Los materiales portadores adecuados son, por ejemplo, el ca-alginato o la carragenina. Tanto las enzimas como las células pueden estar directamente unidas por el glutaraldehído. Se conoce una amplia gama de métodos de inmovilización en la técnica (por ejemplo J. Lalonde y A. Margolin "Immobilization of Enzymes" en K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim).

La reacción de conversión puede llevarse a cabo por lotes, por semilotes o de forma continua. Los reactivos (y opcionalmente los nutrientes) pueden ser suministrados al inicio de la reacción o pueden ser suministrados posteriormente, de forma semicontinua o continua.

La reacción de la invención, dependiendo del tipo de reacción particular, puede realizarse en un medio de reacción acuoso o no acuoso. La reacción de escisión de ésteres se realiza preferentemente en presencia de agua, en particular en presencia de un sistema de disolvente acuoso-orgánico, preferentemente un sistema de 2 fases. Las reacciones de esterificación se llevan a cabo preferentemente en ausencia de agua, más concretamente en presencia de un disolvente orgánico libre o sustancialmente libre de agua.

Un medio acuoso puede contener un tampón adecuado para ajustar el pH a un valor en el rango de 5 a 9, como ⁶ a 8.

El medio no acuoso puede contener es sustancialmente libre de agua, es decir, contendrá menos de aproximadamente 1 % en peso o 0,5 % en peso de agua.

En particular, los procedimientos biocatalíticos se realizan en un medio orgánico no acuoso. Como disolventes orgánicos adecuados pueden mencionarse los hidrocarburos alifáticos que tienen, por ejemplo, de 5 a ⁸ átomos de carbono, como el pentano, el ciclopentano, el hexano, el ciclohexano, el heptano, el octano o el ciclooctano; los hidrocarburos aromáticos, como el benceno, el tolueno, los xilenos, el clorobenceno o el diclorobenceno, los acíclicos alifáticos y los éteres, como el dietiléter, el metil-tertbutiléter, etil-tert. -butiléter, dipropiléter, diisopropiléter, dibutiléter; o mezclas de los mismos. Preferiblemente se aplica un disolvente orgánico que tiene la capacidad de formar un sistema de disolvente bifásico con el agua

La concentración de los reactivos/substratos puede adaptarse a las condiciones óptimas de reacción, que pueden depender de la enzima específica aplicada. Por ejemplo, la concentración inicial del sustrato puede estar entre 0,1 y 0,5 M, como por ejemplo entre 10 y 100 mM.

La temperatura de reacción puede adaptarse a las condiciones óptimas de reacción, que pueden depender de la enzima específica aplicada. Por ejemplo, la reacción puede realizarse a una temperatura en un rango de ⁰ a 70 °C, como por ejemplo de 20 a 50 o de 25 a 40 °C. Algunos ejemplos de temperaturas de reacción son aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C y aproximadamente 60 °C.

El proceso puede proceder hasta que se alcance el equilibrio entre el sustrato y el/los producto/s, pero puede detenerse antes. Los tiempos de proceso habituales están en el rango de 1 minuto a 25 horas, en particular de 10 min a ⁶ horas, como por ejemplo en el rango de 1 hora a 4 horas, en particular de 1,5 horas a 3,5 horas.

8.1 Esterificación enzimática selectiva de un ácido 3-carboxílico insaturado, como el ácido homofarnesílico

En una realización preferida, una mezcla de isómeros (3E/Z) del ácido 3-carboxílico insaturado, como en particular del ácido (3E,7E)- y (3Z,7E)-homofarnesílico, un alcohol alifático y opcionalmente un disolvente orgánico se trata con la enzima lipasa para realizar una reacción de esterificación.

Ejemplos no limitantes de lipasas adecuadas son la lipasa de Candida antárctica (CALB), y su análogo inmovilizado, como Novozym 435 ®.

Ejemplos no limitantes de alcoholes adecuados son los alifáticos C-i-C ²⁰ -alcoholes, como por ejemplo metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, sec.-butanol, n-pentanol, n-hexanol, n-heptanol y n-octanol.

Ejemplos no limitantes de disolventes adecuados son, en particular, los hidrocarburos alifáticos, como por ejemplo el hexano, el ciclohexano, el heptano, el octano; los hidrocarburos aromáticos, como por ejemplo el tolueno, el xileno; los éteres dialquílicos, como por ejemplo el MTBE y el éter diisopropílico.

En una realización preferida, se utiliza un alcohol equivalente por un equivalente de ácido (3E)-carboxílico, en particular el (3E,7E)-isómero del ácido homofarnesílico, para obtener una conversión esencialmente completa. La aplicación de bajas cantidades de alcohol limita el rendimiento de los ésteres.

La reacción se realiza convenientemente en un rango de temperatura de aproximadamente 0°C y 80°C. El progreso de la reacción puede controlarse mediante análisis de GC o HPLC.

Se obtiene una mezcla separable ácido/éster de los isómeros del ácido carboxílico.

8.2 Saponificación enzimática selectiva de ésteres de ácidos 3-carboxílicos insaturados, como los ésteres de ácidos homofarnesílicos

En otra realización, se obtiene una mezcla separable de isómeros aplicando una escisión de ésteres catalizada por enzimas de una mezcla de isómeros 3E/Z del ácido 3-carboxílico insaturado, en particular de una mezcla de isómeros (3E,7E)- y (3Z,7E)- de ésteres alquílicos del ácido homofarnesílico. En una reacción se obtiene el ácido 3E libre, en particular el isómero del ácido (3E,7E)-homofarnesílico y el éster 3Z no reaccionado, en particular el éster del ácido (3Z,7E)-homofarnesílico no reaccionado.

En una realización preferida, una mezcla de isómeros de los ésteres alquílicos de ácidos carboxílicos, opcionalmente disueltos en un disolvente orgánico, se convierte aplicando una enzima lipasa en presencia de agua.

Ejemplos no limitantes de lipasas adecuadas son la lipasa de Candida antárctica (CALB), y su análogo inmovilizado, como Novozym 435 ®.

Ejemplos no limitantes de residuos alquílicos adecuados del éster son: metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo y sec-butilo

Ejemplos no limitantes de disolventes adecuados son los hidrocarburos alifáticos como, por ejemplo, el hexano, el ciclohexano, el heptano; los hidrocarburos aromáticos, como el tolueno y el xileno; los éteres como, por ejemplo, el MTBE y el éter diisopropílico, el THF.

8.3 Preparación de (-)-Ambrox

La preparación puede realizarse partiendo del ácido homofarnesílico (3E/7E) estereoisoméricamente puro obtenido según la presente invención, aplicando procedimientos conocidos como los representados en el esquema ¹ anterior.

La divulgación de EP16156410 y WO2010/139719 como se indica en el Esquema 1, así como de WO2012/066059 en el que se describe la conversión biocatalítica de sustratos insaturados mediante la aplicación de enzimas ciclasas de distinto origen.

El esclareólido, como por ejemplo el obtenido por la conversión catalizada por la ciclasa del ácido (3E/7E)-homofarnesílico de la invención que luego se reduce químicamente (por ejemplo, mediante LiAlH ⁴ o NaBH ⁴ ) para formar ambrox-1,4-diol [Mookherjee et al.; Perfumer and Flavourist (1990), 15: 27]. El ambrox-1,4-diol puede entonces convertirse químicamente mediante diferentes procesos en (-)-ambrox. (véase por ejemplo US 5.274.134).

La síntesis biocatalítica del compuesto (-)-ambrox también se describe en la literatura [Neumann et al.; Biol Chem Hoppe Seyler (1986), 367: 723]. La molécula se obtiene a partir del homofarnesol ((3Z, 7E)-4,8,12-trimetiltreca-3,7,11-trien-1-ol y se utilizó la escualeno-hopenociclasa (SHC) de Alicyclobacillus acidocaldarius (antes Bacillus acidocaldarius) como catalizador.

9. A islam iento del producto

La metodología de la presente invención puede incluir además una etapa de recuperación de un producto final o intermedio, opcionalmente en forma estereoisomérica o enantioméricamente pura. El término "recuperar" incluye extraer, cosechar, aislar o purificar el compuesto de los medios de cultivo o de reacción. La recuperación del compuesto puede realizarse según cualquier metodología convencional de aislamiento o purificación conocida en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ello, el tratamiento con una resina convencional (por ejemplo, resina de intercambio aniónico o catiónico, resina de adsorción no iónica, etc.), el tratamiento con un adsorbente convencional (por ejemplo, carbón activado, ácido silícico, gel de sílice, celulosa, alúmina, etc.), alteración del pH, extracción con disolventes (por ejemplo, con un disolvente convencional como un alcohol, acetato de etilo, hexano y similares), destilación, diálisis, filtración, concentración, cristalización, recristalización, ajuste del pH, liofilización y similares.

La identidad y la pureza del producto aislado pueden determinarse mediante técnicas conocidas, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), la cromatografía de gases (GC), la Spektroskopy (como IR, UV, NMR), los métodos de coloración, TLC, NIRS, los ensayos enzimáticos o microbianos (véase, por ejemplo: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140 Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 1127-32y Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S.

89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 y S. 581-587 Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.)

Los siguientes ejemplos sólo sirven para ilustrar la invención.

Parte experimental:

A. Materiales

(1) Enzimas

Lipasa: Novozym 435; producto comercial de Novozymes;

lipasa B inmovilizada de Candida antárctica

Secuencia de aminoácidos

1 MKLLSLTGVAGVLATCVAAT PLVKRLPSGS DPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPIL

61 LVPGTGTTGPQSFDSNWIPL STQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSG

121NNKLPVLTWS QGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDY KGTVLAGPLDALAVSAPSW

181QQTTGSALTTALRNAGGLTQ IVPTTNLYSATDEIVQPQVS NSPLDSSYLFNGKNVQAQAV

241 CGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTT GQARSADYGI TDCNPLPANDLTPEQKVAAA

301ALLAPAAAAI VAGPKQNCEP DLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP

Ciclasa: Zm-SHC-1 ver abajo

A menos que se especifique lo contrario, las proteínas recombinantes se clonan y expresan mediante procedimientos estándar, como, por ejemplo, los descritos porSambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

(2) Productos químicos

Las mezclas de isómeros del ácido homofarnesílico se obtienen, por ejemplo, mediante un procedimiento como el descrito en Solicitud de patente europea, solicitud número EP 17157950.1 presentada el 24 de febrero de 2017. Se han preparado mezclas de isómeros de ésteres de ácidos homofarnesílicos (por ejemplo, de acuerdo con la generalmente conocida esterificación catalizada por ácido de ácidos carboxílicos con alcoholes (la llamada esterificación de Fischer - Chemische Berichte ^{2 8} , 1895, 3252-3258) a partir de mezclas isoméricas de ácido homofarnesílico.

Todos los demás productos químicos aplicados eran de grado de laboratorio.

B. Procedimientos:

1. Parámetros de HPLC para el análisis de compuestos de ácido homofarnesílico

Aparato: Agilent Serie 1100

Columna: Chiralpak AD-RH 5^m 150*4,6mm de Daicel®

Eluyente: -A: Agua con 0,1% en volumen H ³ PO ⁴

-B: Acetonitrilo con 0,1% en volumen H ³ PO ⁴

Detector: Detector UV A=205 nm, BW=5 nm

Caudal: ^{1 ,2} ml/min

Inyección: 5 |jL

Temp.: 40°C

Duración: 35 minutos

Presión : aproximadamente 70 bar

2. Parámetros GC para el análisis de esclareolida

La conversión del ácido homofarnesílico en esclareolida puede determinarse con el siguiente sistema de GC:

Columna: 10 m Óptima 1

Perfil de temperatura:

0 min: 100°C

5°C/min hasta 200°C

Después de 5 minutos

30°C/min a 320°C

a partir de entonces constante

Duración del procedimiento: 30 minutos Temperatura del inyector: 280°C

Tiempos de retención (RT):

Ácido homofarnesílico: pico 1 a 11,7 min, pico 2 a 12,1 min ;

Esclareolida: aprox. 13,5 min

Una serie de calibración, con la ayuda de la cual se determinó la concentración de muestras desconocidas, se establece utilizando material auténtico (Sigma, catálogo No: 358002).

2. Medición de la actividad de la lipasa

Ensayo de Tributyrin según Beisson, F. et al. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2000, 133-153.

B. Ejemplos:

Ejemplo de referencia 1: Clonación del Zm-SHC-1 y expresión en E. coli

El gen de la ciclasa puede ser amplificado a partir de Zymomonas mobilis con la ayuda de los oligonucleótidos Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev.

En cada caso se mezclaron 100 ng de cebadores Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev en una proporción equimolar. La PCR con ADN genómico de Z. mobilis (ATCC31821) se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando la Pwo-polimerasa (Roche Applied Science) y el siguiente programa de gradiente de temperatura: 95°C durante 3 min; 30 ciclos a 95°C durante 30 seg, 50°C durante 30 seg y 72°C durante 3 min; 72°C durante 10 min; 4°C hasta su utilización. El producto de la PCR (~2,2 kb) se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa (gel de electroforesis al 1,2%, Invitrogen) y cromatografía en columna (GFX Kit, Amersham Pharmacia) y posteriormente se secuenció (cebador de secuenciación: Zm-SHC_fw y Zm-SHC_rev). La secuencia obtenida coincide con la publicada.

El producto de la PCR se digirió con las endonucleasas de restricción Ndely BamHIy se ligó en el vector pDHE19.2 convenientemente digerido [9]. La secuenciación de los plásmidos resultantes dio la secuencia de ácido nucleico mostrada en la SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en el siguiente texto /(SEQ ID NO:2)

Met Gly lie Asp Arg Met Asn Ser Leu Ser Arg Leu Leu Met Lys Lys 1 5 10 15

lie Phe Gly Ala Glu Lys Thr Ser Tyr Lys Pro Ala Ser Asp Thr lie

20 25 30

lie Gly Thr Asp Thr Leu Lys Arg Pro Asn Arg Arg Pro Glu Pro Thr

35 40 45

Ala Lys Val Asp Lys Thr lie Phe Lys Thr Met Gly Asn Ser Leu Asn

50 55 60

Asn Thr Leu Val Ser Ala Cys Asp Trp Leu lie Gly Gln Gln Lys Pro 65 70 75 80 Asp Gly His Trp Val Gly Ala Val Glu Ser Asn Ala Ser Met Glu Ala 85 90 95

Glu Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Leu Gly Leu Glu Asp His Pro Leu

100 105 110

Arg Pro Arg Leu Gly Asn Ala Leu Leu Glu Met Gln Arg Glu Asp Gly

115 120 125

Ser Trp Gly Val Tyr Phe Gly Ala Gly Asn Gly Asp lie Asn Ala Thr

130 135 140

Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Asn 145 150 155 160 Pro Val Leu Lys Lys Ala Ala Ala Trp lie Ala Glu Lys Gly Gly Leu 165 170 175

Lys Asn lie Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu Ala Leu lie Gly Glu

180 185 190

Trp Pro Trp Glu Lys Thr Pro Asn Leu Pro Pro Glu lie lie Trp Phe

195 200 205

Pro Asp Asn Phe Val Phe Ser lie Tyr Asn Phe Ala Gln Trp Ala Arg

210 215 220

Ala Thr Met Val Pro lie Ala lie Leu Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg 225 230 235 240 Pro Leu Arg Pro Gln Asp Arg Leu Asp Glu Leu Phe Pro Glu Gly Arg 245 250 255

Ala Arg Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Lys Lys Glu Gly lie Asp Leu Trp

260 265 270

Ser Gln Phe Phe Arg Thr Thr Asp Arg Gly Leu His Trp Val Gln Ser

275 280 285

Asn Leu Leu Lys Arg Asn Ser Leu Arg Glu Ala Ala lie Arg His Val

290 295 300

Leu Glu Trp lie lie Arg His Gln Asp Ala Asp Gly Gly Trp Gly Gly 305 310 315 320 lie Gln Pro Pro Trp Val Tyr Gly Leu Met Ala Leu His Gly Glu Gly 325 330 335

Tyr Gln Leu Tyr His Pro Val Met Ala Lys Ala Leu Ser Ala Leu Asp

340 345 350

Asp Pro Gly Trp Arg His Asp Arg Gly Glu Ser Ser Trp lie Gln Ala

355 360 365

Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Leu Lys

370 375 380

Asp Ala Lys Ala Glu Asp Arg Phe Thr Pro Glu Met Asp Lys Ala Ala

385 390 395 400

Asp Trp Leu Leu Ala Arg Gln Val Lys Val Lys Gly Asp Trp Ser lie

405 410 415

Lys Leu Pro Asp Val Glu Pro Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn

420 425 430

Asp Arg Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val Ala Leu lie Ala Leu

435 440 445

Ser Ser Tyr Arg Asp Lys Glu Glu Trp Gln Lys Lys Gly Val Glu Asp

450 455 460

Ala lie Thr Arg Gly Val Asn Trp Leu lie Ala Met Gln Ser Glu Cys

465 470 475 480

Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Arg Ser lie Leu Ser

485 490 495

Lys lie Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Ser lie Asp Pro Pro Ser Val

500 505 510

Asp Val Thr Ala His Val Leu Glu Ala Phe Gly Thr Leu Gly Leu Ser

515 520 525

Arg Asp Met Pro Val lie Gln Lys Ala lie Asp Tyr Val Arg Ser Glu

530 535 540

Gln Glu Ala Glu Gly Ala Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr lie

545 550 555 560

Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala lie Gly Glu Asp

565 570 575

Met Thr Gln Pro Tyr lie Thr Lys Ala Cys Asp Trp Leu Val Ala His

580 585 590

Gln Gln Glu Asp Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys Ser Ser Tyr Met Glu

595 600 605

lie Asp Ser lie Gly Lys Gly Pro Thr Thr Pro Ser Gln Thr Ala Trp

610 615 620

Ala Leu Met Gly Leu lie Ala Ala Asn Arg Pro Glu Asp Tyr Glu Ala

625 630 635 640

lie Ala Lys Gly Cys His Tyr Leu lie Asp Arg Gln Glu Gln Asp Gly

645 650 655

Ser Trp Lys Glu Glu Glu Phe Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Tyr Gly

660 665 670

Val Gly Gln Thr lie Lys Leu Asp Asp Pro Ala Leu Ser Lys Arg Leu

675 680 685

Leu Gln Gly Ala Glu Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu Arg Tyr Asp Phe

690 695 700

Tyr Arg Gln Phe Phe Pro lie Met Ala Leu Ser Arg Ala Glu Arg Leu

705 710 715 720

lie Asp Leu Asn Asn

725

El plásmido pDHE-Zm-SHC-1 se transformó en la cepa E. coli TG10 pAgro4 pHSG575 [Takeshita et al., Gene 1987, 61:63-74 Tomoyasu et al., Mol Microbiol2001, 40:397-413]. Las E. coli recombinantes se denominaron E. coli LU15568.

Ejemplo de referencia 2: Sum inistro de homofarnesol ciclasa recombinante de Z. mobilis

Inoculado a partir de un precultivo adecuado de 2 ml, E. coli LU15568 se cultivó durante 16 h a 37°C en 20 ml de LB-Amp/Spec/Cm (100 jg /l de ampicilina; 100|jg/l de espectinomicina; 20 jg /l de cloranfenicol), 0,1 mM de IPTG, 0,5 g/l de ramnosa en matraces Erlenmeyer de 100 ml (con deflectores), se centrifugó a 5000*g/10 min y se almacenó a 4°C. El extracto de proteínas se preparó suspendiendo el sedimento celular en 15 ml de tampón de disrupción (Tris/HCl 0,2 M, EDTA 0,5 M, pH 8,0), 375 U de benzonasa (por ejemplo, Novagen, 25 U/jL), 40 jL de PMSF (100 mM, disuelto en i-PropOH), 0,8 g de sacarosa y aproximadamente 0,5 mg de lisozima. La mezcla de reacción se mezcló y se incubó en hielo durante 30 minutos. A continuación, la mezcla se congeló a -20°C.

Una vez descongelada la mezcla de reacción, se completó hasta aproximadamente 40 ml con agua destilada y se incubó de nuevo en hielo durante 30 minutos.

A continuación, las células se interrumpieron 3 veces durante 3 minutos con ultrasonidos (HTU-Soni 130, de G. Heinemann, Schwabisch-Hall, amplitud 80%, pulso 15" / pausa). Tras la disrupción, los restos celulares se eliminaron por centrifugación durante 60 minutos a 4°C y 26900 *g. Se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 100 ml de tampón de solubilización (50 mM Tris/HCl, 10 mM MgCl2x6H2O, 1% Triton X-100, pH 8,0) y se trituró en un Potter durante aproximadamente 5 min. A continuación, la suspensión se mantuvo en hielo durante 30 minutos.

El extracto homogeneizado se recentrifugó durante 1 h a 4°C y 26900 *g, y el pellet se desechó. El extracto se empleó para los ensayos enzimáticos y puede almacenarse durante varias semanas a -20°C sin sufrir pérdidas de actividad. El contenido de proteínas era del orden de 1 mg/ml.

Ejemplo de referencia 3: Determinación de la actividad de la ciclasa recombinante de E. coli LU15568

El ácido homofarnesílico ((3E,7E)-4,8,12-trimetiltrideca-3,7,11-trienoico) se incubó con la preparación de proteínas descrita en el Ejemplo de Referencia 2. En concreto, se pesaron 0,0412 g de ácido homofarnesílico (20 mM en la mezcla de reacción; pureza del 85,1% compuesta por Z,Z 0,44%, E,Z 10,13%, E,E 74,93%), 2,913 ml de agua; 0,350 ml de tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 1M, pH 5,4), 0,560 ml de MgCl2 (solución 0,5M) y la mezcla se calentó durante 30 minutos a 37°C, con agitación. La reacción se inició con la adición del homogeneizado de E. coli LU15568 (contenido de proteínas 35 mg/ml), calentado a 37°C. La mezcla de reacción se agitó en un agitador magnético en un baño de aceite durante 24 h a pH 5,0 a 37°C a la máxima velocidad de agitación. El pH se ajustó durante la reacción utilizando HCl 0,5M. Tras la incubación durante 24 horas, se extrajeron 0,500 ml de la mezcla de reacción mediante vórtex durante 30 segundos con 1000 ml de n-heptano/n-propanol 3:2. El sobrenadante orgánico después de la separación de fases se empleó en el análisis GC (véase la figura 1).

Utilizando los análisis que se describen a continuación con mayor detalle, se determinó una tasa de conversión del 74,5% en total del 82,7% del isómero E,E.

Ejemplo 1: Preparación del éster butílico del ácido (3E,7E)-homofarnesílico

71 g (283 mmol) de una mezcla de ácido (3E,7E)-homofarnesílico y de ácido (3Z,7E)-homofarnesílico en una proporción molar de 56 : 44 se disolvieron en 360 ml de n-heptano. Se añadieron 21 g (283 mmol) de n-butanol y 470 mg de Novozym 435. La mezcla se agitó durante 48 h a 23°C. La enzima se separó por filtración. A una temperatura de 0°C, se añadieron 115 ml de metanol y 5 ml de agua. El pH de la mezcla se ajustó a pH = 12 añadiendo hidróxido de sodio acuoso (25%) a una temperatura de < 10°C y bajo agitación.

Se detuvo el agitador y se separó la fase inferior. Tras eliminar el disolvente, se obtuvieron 43,5 g (119 mmol) del éster butílico del ácido homofarnesílico con un contenido de (3E,7E) de > 97%.

Ejemplo 2: Influencia de diferentes alcoholes en la selectividad de la esterificación enzimática del ácido homofarnesílico en ausencia de disolvente:

Se disolvieron 2 g ^{( 8} mmol) de una mezcla 57:43 de ácido (3E,7E)- homofarnesílico y de ácido (3Z,7E)-homofarnesílico en 15 ml de diferentes alcoholes y se agitaron a 23°C en presencia de 20 mg de Novozym 435. A determinados intervalos de tiempo se analizó la composición de la mezcla de reacción mediante HPLC. Los resultados se resumen en la siguiente tabla ¹ .

Tabla 1:

Ejemplo 3: La influencia de una combinación de diferentes alcoholes y del disolvente heptano en la selectividad de la esterificación enzimática del ácido homofarnesílico

Se disolvieron 2 g ^{( 8} mmol) de una mezcla 57:43 de ácido (3E,7E)- homofarnesílico y ácido (3Z,7E)-homofamesílico en 15 ml de heptano. Se añadieron ⁸ mmol de diferentes alcoholes y 20 mg de Novozym 435 y la mezcla se agitó a 23°C. A intervalos de tiempo predeterminados se analizó la composición de la mezcla de reacción mediante HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2:

Ejemplo 4: La influencia de una combinación de butanol y diferentes disolventes en la selectividad de la esterificación enzimática del ácido homofarnesílico

Se disolvieron 2 g ^{( 8} mmol) de una mezcla 57:43 de ácido (3E,7E)-homofamesílico y ácido (3Z,7E)-homofamesílico en 15 ml de diferentes disolventes. Se añadieron ⁸ mmol de butanol y 20 mg de Novozym 435 y la mezcla se agitó a 23°C. A intervalos de tiempo predeterminados se analizó la composición de la mezcla de reacción mediante HPLC. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3:

Ejemplo 5: Preparación del ácido (3E,7E)-homofamesíNco libre mediante escisión enzimática del éster Se disolvieron 2 g (7,56 mmol) de ésteres metílicos de ácido (3E,7E)- y (3Z,7E)-homofamesílico (proporción de (3E,7E):(3Z,7E) = 51:49) en 50 ml de tolueno. Se añadieron 10 ml de agua y 50 mg de Novozym 435. La mezcla se agitó a 23°C. Después de ⁶ horas se analizó la composición de la mezcla de reacción, que fue la siguiente:

36% de éster metílico del ácido (3E,7E)-homofarnesílico,

49% de éster metílico del ácido (3Z,7E)-homofarnesílico,

15% de ácido (3E,7E)-homofarnesílico y

< 0,1% de ácido (3Z,7E)-homofarnesílico .

La enzima se eliminó por filtración y la mezcla de reacción se ajusta a un pH > 9 por medio de carbonato de sodio. Se separó la fase inferior acuosa. El pH de la fase acuosa se ajustó a un valor < 4 mediante un ácido (ácido clorhídrico al 10 %). Después se extrae la fase con tolueno. La fase tolueno obtenida contiene más del 95% de ácido (3E,7E)-homofarnesílico puro.

Secuencias:

SEQ ID NO: 1- 326 Secuencias de ácidos nucleicos/aminoácidos de varios genes SHC

SEQ ID NO: 327-328 Cartilla PCR

SEQ ID NO: 329, 330 Secuencias de ácidos nucleicos/aminoácidos de la lipasa CALB Se remite explícitamente a las referencias aquí citadas.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para aislar el isómero 3-(E) de un compuesto de ácido carboxílico insaturado de la fórmula general (I)

   

   en el que

   R ¹ es H o un residuo de hidrocarbilo Ci-C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado,

   R ³ es H o un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C4;

   R ² es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado;

   con la condición de que, si R ³ es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C4, R ² representa un residuo de hidrocarbilo que contiene al menos un átomo de carbono adicional;

   a partir de una mezcla de isómeros que comprende el isómero 3-(E) y el isómero 3-(Z) de dicho compuesto de ácido carboxílico, por lo que dicha mezcla de isómeros se somete a una reacción de conversión enzimática catalizada por una lipasa (E.C 3.1.1.3), la cual convierte preferentemente dicho isómero 3-(E), y el producto de conversión de dicho isómero 3-(E) se aísla de dicha mezcla de reacción.

   2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha lipasa se origina a partir de Candida sp., en particular Candida antarctica- 3. El procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha lipasa es la lipasa B de Candida antarctica (CALB) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 330, o un mutante del mismo que tenga una identidad de secuencia de al menos el 60 % con la SEQ ID NO: 330 y conservando dicha 3-(E)-selectividad.

   4. El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha reacción de conversión comprende una reacción de esterificación enzimática de un ácido de la fórmula (Ia);

   

   en el que

   R ² y R ³ son como se definen anteriormente;

   y en el que se forma predominantemente el 3-(E)-éster.

   5. El procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha reacción de conversión comprende una reacción de escisión enzimática de un éster de la fórmula (Ib);

   

   en el que

   R ¹ es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado, en particular C ⁴ -C ²⁰ ;

   y Ra y R ³ son los definidos anteriormente;

   y en el que se forma predominantemente el ácido 3-(E).

   ⁶ . El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha reacción de conversión se realiza en un disolvente orgánico o acuoso-orgánico.

   7. El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho compuesto de ácido carboxílico es un compuesto de ácido 3-(E)/7-(E)- homofarnesoico de fórmula (II)

   

   en el que R ¹ es como se ha definido anteriormente.

   ⁸ . Un procedimiento de preparación de un ácido 3-(E)-carboxílico insaturado de la fórmula general (Ia):

   

   en el que

   R ² y R ³ son como se definen anteriormente;

   en el que

   a) una mezcla de isómeros, que comprende el isómero 3-(E) y el isómero 3-(Z) de dicho ácido carboxílico de fórmula (Ia) se somete a una reacción de esterificación enzimática en presencia de un alcanol de fórmula R ¹ OH, en la que R ¹ es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado; y en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las reivindicaciones ¹ y ² ;

   b) se aísla dicho éster 3-(E)-carboxílico formado en la etapa a); y

   c) dicho éster aislado de la etapa b) se saponifica hasta obtener el correspondiente ácido 3-(E)-carboxílico de fórmula (Ia).

   9. Un procedimiento de preparación de un ácido 3-(E)-carboxílico insaturado de la fórmula general (la):

   

   en el que

   R ² y R ³ son como se definen anteriormente;

   en el que

   a) una mezcla de isómeros, que comprende el isómero 3-(E) y el isómero 3-(Z) de un éster de ácido carboxílico de fórmula (lb)

   

   en el que

   R ¹ es un residuo de hidrocarbilo Ci-C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado; y

   R ² y R ³ son los definidos anteriormente;

   se somete a una reacción de escisión enzimática del éster en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las reivindicaciones ¹ y ² ;

   b) se aísla dicho ácido 3-(E)-carboxílico formado en la etapa a).

   10. El procedimiento según la reivindicación ⁸ o 9, en el que se aplica un disolvente orgánico como el definido en la reivindicación ⁶ .

   11. El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho isómero 3-(E) de un ácido carboxílico insaturado es el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico.

   12. El procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de isómeros comprende una mezcla de ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico; o una mezcla de éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y éster del ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico de un alcanol de la fórmula R ¹ OH, en la que R ¹ es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado.

   13. El procedimiento según la reivindicación 12 para preparar ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico,

   en el que

   a) una mezcla de isómeros, que comprende el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y el ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico se somete a una reacción de esterificación enzimática en presencia de un alcano de la fórmula R ¹ OH, en la que R ¹ es un residuo de hidrocarbilo C ¹ -C ²⁰ de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado y en presencia de una enzima lipasa como se define en una de las reivindicaciones ¹ y ² en un disolvente como se define en la reivindicación ⁶ ;

   b) dicho éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico, tal como se ha formado en la etapa a), se separa del ácido que no ha reaccionado, en particular mediante destilación o, preferentemente, extracción; y c) dicho éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofamesóico aislado se saponifica a ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico.

   14. El procedimiento según la reivindicación 12 para preparar ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico,

   en el que

   a) una mezcla de isómeros, que comprende el éster del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesóico y el éster del ácido 3-(Z)/7-(E)-homofarnesóico se somete a una reacción de escisión enzimática del éster en presencia de una enzima lipasa como la definida en una de las reivindicaciones ¹ y ² en un disolvente como el definido en la reivindicación ⁶ , y en particular en presencia de agua; y

   b) dicho ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico, tal como se ha formado en la etapa a), se separa del éster que no ha reaccionado, en particular por destilación o, preferentemente, por extracción.

   15. Un procedimiento de preparación de (-)-ambrox de la fórmula (III)

   

   que comprende las etapas de

   a) obtener dicho ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico aplicando un procedimiento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14;

   b) reducir químicamente el ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico a 3-(E)/7-(E)-homofarnesol y

   c) ciclación enzimática de 3-(E)/7-(E)-homofarnesol a (-)-ambrox.

   16. Un procedimiento de preparación de (-)-ambrox de la fórmula (III)

   

   que comprende las etapas de

   a) obtener dicho ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico aplicando un procedimiento como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,

   b) ciclación enzimática del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico a esclareolida de la fórmula (IV)

   

   y

   c) convertir químicamente dicha esclareolida en (-)-ambrox.

   17. El procedimiento según la reivindicación 15 o 16, en el que la cidización enzimática se realiza en presencia de una transferasa intramolecular (E.C. 5.4), en particular una escualeno-hopeno ciclasa (E.C. 5.4.99.17) que muestra la actividad de la ciclasa del ácido homofarnesoico

   18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha ciclasa es de Zymomonas mobilis, que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:2.

   19. Ester alquílico del ácido 3-(E)/7-(E)-homofarnesoico, en el que dicho grupo alquilo se selecciona entre n-propilo, isopropilo, n-butilo, ² -butilo o isobutilo, así como pentilo, hexilo, heptilo, octilo y sus isómeros constitucionales.