ES2892873T3 - Métodos para transfectar plantas y para reducir eventos de integración aleatoria - Google Patents

Abstract

Un método para reducir la integración aleatoria de moléculas de ácido nucleico transfectadas en una célula vegetal, dicho método comprende transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, en la que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal cuando se compara con una célula vegetal tipo silvestre.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para transfectar plantas y para reducir eventos de integración aleatoria

Campo de la invención

La presente divulgación proporciona métodos para transfectar plantas y para expresar moléculas de ARN o polipeptídicas en plantas. En particular, las plantas que tienen expresión y/o actividad de POLQ reducida se transfectan para reducir los eventos de integración aleatorios. La divulgación proporciona adicionalmente plantas transfectadas y progenie de plantas producidas mediante los métodos divulgados en el presente documento.

Antecedentes de la invención

La modificación genética de plantas mediante transfección permite alteraciones en rasgos tales como aumento de rendimiento, resistencia a enfermedades y plagas, aumento de biomasa vegetativa, tolerancia a herbicidas, calidad nutricional, tolerancia a sequía y estrés, así como cualidades hortícolas tales como pigmentación y crecimiento y otras características agronómicas para el mejoramiento de cultivos. Además, la modificación genética de plantas se ha utilizado como un sistema para la expresión de proteínas recombinantes.

La transfección de plantas con ácido nucleico es ahora una práctica común que puede llevarse a cabo mediante varios métodos diferentes conocidos en la técnica. Sin embargo, una desventaja de los presentes métodos de transfección es la producción de un número relativamente grande de eventos de integración de ADN aleatorios en el genoma del anfitrión. La integración aleatoria puede tener efectos impredecibles y/o perjudiciales sobre el organismo anfitrión. Adicionalmente, la integración del ADN en el genoma de la planta no siempre es deseable, particularmente cuando las plantas genéticamente modificadas (GMO) suscitan problemas ambientales y políticos. Por tanto, sigue subsistiendo la necesidad de desarrollar sistemas mejorados para expresar transgenes en plantas.

Inagaki et al 2006 divulgan que loa Arabidopsis TEBICHI, con dominios de helicasa y ADN polimerasa, es necesaria para la división y diferenciación celular regulada en meristemos (Ignaki S et al, Plant Cell. 2006 Apr; 18(4): 879-892.) Inagaki et al 2009 divulgan un vínculo entre la replicación del ADN, la recombinación y la expresión génica revelada por el análisis genético y genómico del gen TEBICHI de Arabidopsis thaliana (Inagaki S et al, PLoS Genet. 2009 Aug; 5(8): e1000613).

Resumen de la invención

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Todos los aspectos o realizaciones descritos en el presente documento que no estén abarcados en las reivindicaciones se incluyen solo como aspectos o realizaciones de la divulgación.

La divulgación proporciona un método para reducir la integración aleatoria de moléculas de ácido nucleico transfectadas en una célula vegetal, dicho método comprende proporcionar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, en el que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal.

La divulgación proporciona un método para transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, el método comprende proporcionar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, en el que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal.

En realizaciones preferidas, los métodos se utilizan para el direccionamiento de genes. Específicamente, los métodos son para producir una célula vegetal que lleva una secuencia de ADN en un sitio específico en su genoma a través de recombinación genética.

La divulgación proporciona un método para expresar una molécula de ARN o un polipéptido en una célula vegetal, el método comprende proporcionar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de ARN o polipéptido, en el que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula anfitriona.

La divulgación proporciona un método para producir una planta que expresa una molécula de ARN o un polipéptido, el método comprende proporcionar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de ARN o polipéptido, en el que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal, y generar la planta a partir de dicha célula vegetal.

La molécula de ácido nucleico se transfecta en la célula vegetal que tiene expresión y o actividad de POLQ reducida. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se transfecta transitoriamente en la célula vegetal. Preferiblemente, el ácido nucleico comprende un casete de expresión vegetal. Preferiblemente, el casete de expresión vegetal comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o una molécula de ARN y secuencias reguladoras para impulsar la expresión. Preferiblemente, el ácido nucleico es una nucleasa. Preferiblemente, el ácido nucleico es un componente de un sistema Crispr/Cas.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico se integra en un sitio específico a través de recombinación genética en el cromosoma de la célula vegetal (o más bien a través de recombinación genética específica de sitio o recombinación homóloga). Preferiblemente, dicha integración estable da como resultado la expresión de un polipéptido o molécula de ARN heterólogo. En algunas realizaciones, la integración es el resultado de la recombinación homóloga. En algunas realizaciones dicha integración estable interrumpe o modifica un gen endógeno. En algunas realizaciones, la integración es el resultado de recombinación específica de sitio.

En algunas realizaciones, dicha célula vegetal comprende un oligonucleótido antisentido específico para un pre-ARNm codificado por el gen POLQ o una molécula de ARNi de doble cadena específica para un ARNm codificado por el gen POLQ. En algunas realizaciones, la célula vegetal tiene un gen POLQ mutado. En algunas realizaciones, la célula vegetal tiene una inactivación del gen POLQ.

La divulgación proporciona una planta producida por los métodos divulgados en el presente documento y la progenie de la misma (que incluye semillas). Preferiblemente, dichas plantas y progenie comprenden la molécula de ácido nucleico integrada establemente en el genoma a través de recombinación genética (es decir, integración específica de sitio y no integración aleatoria).

En algunas realizaciones de lo anterior, dicha célula vegetal no es Arabidopsis thaliana.

La divulgación proporciona una planta o célula vegetal en la que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha planta o célula vegetal y en la que dicha planta o célula vegetal no es Arabidopsis thaliana. La divulgación proporciona adicionalmente el uso de dichas plantas y células para transfectar una molécula de ácido nucleico.

La divulgación proporciona el uso de una planta o células vegetales que tienen expresión y o actividad de POLQ reducida para producir una planta que expresa una molécula de ARN o un polipéptido, en la que a) la molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de ARN o polipéptido no se integra en el cromosoma de la célula vegetal o b) la molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de ARN o polipéptido se integra a través de recombinación genética específica de sitio o recombinación homóloga en el cromosoma de la célula vegetal.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Las plantas deficientes en Pol 0 son refractarias a la integración de T-ADN mediante transformación por inmersión floral. a, Estrategia de transformación por inmersión floral: (1) Se sumergen plantas florecientes de A. thaliana en una suspensión que contiene células de Agrobacterium, después de lo cual (2) se permite que las plantas produzcan semillas. (3) Las semillas, de las cuales un pequeño porcentaje se puede haber vuelto transgénico (representadas en amarillo), se siembran (4) sobre medio solidificado que contiene el herbicida apropiado como marcador de selección. b, Imágenes representativas de placas que contienen el herbicida fosfinotricina (PPT) sobre las que se siembran semillas de tipo silvestre (izquierda) y teb-5 (derecha) recolectadas después de la transformación por inmersión floral. Las plántulas transformadas, que tienen T-ADN integrado de forma estable que contiene el marcador de selección, son resistentes a PPT. c, Se realizaron experimentos de inmersión floral utilizando dos cepas de Agrobacterium desarmadas diferentes: LBA1100 suplementada con el vector binario pCAMBIA1301, y AGL1, suplementada con el vector binario pSDM3900. d, Imágenes representativas de embriones en desarrollo que expresan transitoriamente un gen indicador de GUS que contiene un intrón (gusA) bajo el control del promotor A C T lI (azul) en la silicona en desarrollo.

Figura 2: Se requiere Pol 0 para la transgénesis de Arabidopsis mediada por transformación de raíces. a, Estrategia de transformación de raíces. Las semillas se germinan en cultivo líquido (1) y las raíces se recolectan de plántulas de A. thaliana de 10 días de edad, se precultivan durante dos o tres días en medio solidificado y se cocultivan con células de Agrobacterium (2). Se deja que se formen callos/brotes sobre un medio solidificado que contiene el herbicida PPT y después de tres semanas se transfieren a placas frescas, sobre las que los brotes que han integrado de manera estable el T-ADN y, por lo tanto, han adquirido el marcador de resistencia, pueden continuar creciendo (3) b, Imágenes representativas de placas que contienen el herbicida fosfinotricina (PPT) sobre las que se cultivaron raíces de tipo silvestre (izquierda) y teb-5 (derecha) para permitir la formación de brotes. Los brotes de tipo silvestre (panel izquierdo) han adquirido resistencia a PPT que apunta hacia una integración estable del T-ADN, mientras que los brotes teb-5 (panel derecho) se deterioran. c, TAIL-PCR para recuperar las uniones del genoma de la planta de T-ADN produce productos para la mayoría de los callos tipo silvestre (panel superior), mientras que los callos teb-5 no producen ningún producto en TAIL-PCR (panel inferior). d, Un explante de raíz tipo silvestre en el que una flecha apunta a una mancha positiva para GUS, donde el Agrobacterium ha suministrado uno o más T-ADN que contienen el gen informador GUS que contiene el intrón. e, se contaron las manchas positivas para GUS por explante para Col-0, teb-2 y teb-5 de tipo silvestre. Se contaron al menos 100 explantes de raíces por experimento. f, Se contó la formación de brotes verdes, que indica una integración estable de T-ADN, para Col-0, teb-2 y teb-5 de tipo silvestre.

Figura 3: El ADN de relleno refleja la extensión dependiente de Pol 0 de moléculas del genoma de T-ADN-Arabidopsis emparejadas mínimamente. a, Acción propuesta de Pol 0 en la integración de T-ADN: la síntesis de ADN mediante Pol 0 estabiliza los extremos de ADN de las sobresalientes 3'm mínimamente emparejados, un extremo proporcionado por el T-ADN y el otro por el genoma de Arabidopsis. Las uniones de T-ADN-genoma son de dos tipos: ~57 % de las uniones secuenciadas contienen ADN de relleno, mientras que ~43 % de alelos secuenciados no tienen relleno. b, Representación esquemática del análisis de subcadena común más larga (LCS). Para cada relleno (azul), se determina el tramo más largo posible de identidad de secuencia entre el relleno y una secuencia diana. c, Representaciones de mapas de calor de LCS para T-ADN con rellenos de tamaño de 6 a 40 nt. En el panel de la izquierda, se grafica la probabilidad pseudoaleatoria (consulte la sección Métodos para conocer el enfoque), mientras que el panel central refleja el conjunto de datos completo en el que el espacio de búsqueda comprende la secuencia genómica de Arabidopsis en ambos lados del inserto de T-ADN (-120 pb a 160 pb con respecto a la unión), 160 pb de la secuencia de T-ADN dentro del inserto (comenzando desde la unión) y 120 pb del flanco original del T-ADN, que es ADN plasmídico. El panel derecho muestra el diferencial de sobreprobabilidad de datos, que por lo tanto visualiza la representación excesiva (amarillo a rojo) y la representación insuficiente (azul claro a oscuro). A partir de este mapa de calor diferencial, se determina que el porcentaje de integraciones de T-ADN, de las cuales sus rellenos afines están sobrerrepresentados > 10 veces con respecto a la probabilidad, es del 48.2 %. d, La subcategoría (n = 1.653) según se determina en c se utiliza para trazar la ubicación con respecto al sitio de integración (tamaño de contenedor de 5 pb). e, Representación de mapa de calor del relleno que contiene uniones de T-ADN en el que el que contiene uniones se representa gráficamente en sus secuencias afines de coincidencia de relleno en las proximidades de las uniones para visualizar el grado de identidad de secuencia. f, Representación de mapa de calor de uniones de integración de T-ADN que están sin rellenos, en el que se determina el grado de identidad de secuencia entre el T-ADN y el genoma de Arabidopsis.

Figura 4. Un modelo para la integración de T-ADN. a, el T-ADN se captura preferentemente en el extremo 3', donde pol © se puede extender desde el cebado mediante un emparejamiento mínimo de bases. La captura posterior del extremo 5' por parte del genoma da como resultado un único inserto de T-ADN en el genoma (imagen de la izquierda). Sin embargo, en la mayoría de los casos (63%), se observan integraciones dobles donde ambos T-ADN están en una orientación invertida, lo que apunta hacia la captura preferencial de un T-ADN en el extremo 3' por el genoma de la planta. b, después de la captura del extremo 3' de un T-ADN, los ciclos iterativos de cebado, extensión y cambio de cebador-molde darán como resultado inserciones de T-ADN con rellenos de trabajo parcheados que llevan múltiples inserciones de plantilla.

Descripción detallada de las realizaciones divulgadas

En general, la recombinación génica en plantas es mayoritariamente no homóloga, o más bien, el ADN introducido se inserta aleatoriamente en cualquier posición del cromosoma. La integración aleatoria puede tener efectos perjudiciales si el ADN introducido interrumpe, por ejemplo, la expresión de un gen endógeno. Además, la expresión de ARN o proteína codificada por ADN integrado aleatoriamente es menos predecible que por integración de sitio específico, ya que tanto el sitio de integración como el número de eventos de integración pueden afectar la expresión. Uno de los objetos de los métodos divulgados en este documento es reducir (incluso eliminar o evitar) o eliminar la integración aleatoria del ADN transfectado. Un objeto adicional de los métodos es proporcionar un método eficaz para el direccionamiento de genes.

En algunos casos, solo se desea la transfección transitoria de ADN en una planta. Puede haber, por ejemplo, razones ambientales o políticas para evitar o limitar el uso de plantas modificadas genéticamente (de manera estable). Además, en algunas situaciones, es posible que la expresión deseada solo sea necesaria durante un breve período de tiempo. Uno de los objetos de los métodos divulgados en este documento es proporcionar métodos y plantas en los que la molécula de ácido nucleico de interés sólo se transfecte transitoriamente, o más bien, la molécula de ácido nucleico de interés no se inserte en los cromosomas de la planta. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico transfectado es una nucleasa o un componente del sistema Crispr/Cas.

Un aspecto de la divulgación proporciona métodos para transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico de interés. Las células vegetales transfectadas se pueden utilizar para expresar un ARN o un polipéptido de interés. Se pueden generar plantas a partir de dichas células vegetales transfectadas. Se proporcionan métodos para reducir la integración aleatoria de moléculas de ácido nucleico transfectadas.

Los métodos divulgados en el presente documento comprenden proporcionar una molécula de ácido nucleico s una célula vegetal, en la que se reduce la expresión de POLq la célula vegetal. Como se demostró en los ejemplos, la transfección de plantas que tienen expresión de POLQ reducida da como resultado la eliminación de la integración aleatoria de la molécula de ácido nucleico transfectada.

En algunas realizaciones, se prefieren los métodos para expresión transitoria de un ARN o polipéptido de interés. En otras realizaciones, se prefieren los métodos para la integración específica de sitio estable de la molécula de ácido nucleico a través de recombinación genética. Expresión transitoria se refiere a la expresión de una molécula de ácido nucleico que no se integra en el cromosoma anfitrión, pero funciona independientemente. Integración estable se refiere a la integración de un ácido nucleico en el ADN del anfitrión mediante enlaces covalentes. La “recombinación genética” permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición específica del sitio definida e incluye tanto la recombinación homóloga como la recombinación específica de sitio.

Preferiblemente, el ácido nucleico de interés no se inserta a través de recombinación no homóloga. Los métodos divulgados en el presente documento se describen como se describen como células y plantas productoras en las que el ácido nucleico de interés no se integra en el cromosoma de la célula vegetal (es decir, transfección transitoria) o se integra a través de recombinación genética específica de sitio o recombinación homóloga en el cromosoma de la célula vegetal. El experto debe entender que al realizar los métodos divulgados en el presente documento se puede producir un pequeño porcentaje de células vegetales en las que se ha insertado el ácido nucleico de interés a través de una combinación homóloga. Sin embargo, un experto puede identificar y descartar fácilmente dichas células vegetales.

Se puede utilizar cualquier molécula de ácido nucleico adecuada para transfectar la célula vegetal. Aunque el ADN es la molécula de ácido nucleico preferida, la transfección de ARN también se abarca en la invención. Por ejemplo, An et al. describen un método de transfección de ARN en Arabidopsis (An et al. Biosci Biotechnol Biochem. 2003 Dec; 67(12):2674-7).

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o una molécula de ARN (por ejemplo, un polipéptido que codifica ARN o un ARN no codificante, por ejemplo, ARN largo no codificante, ARNmicro, ARNt, ARN ribosómico, ARNpn, etc.). Las moléculas de ácido nucleico de interés incluyen aquellas que impactan en la resistencia a insecticidas de plantas, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicidas, contenido nutricional y de celulosa, resistencia al estrés abiótico, genes de mejora del rendimiento, genes de tolerancia a la sequía, genes de tolerancia al frío, resistencia a antibióticos y genes marcadores. Por ejemplo, el documento US20140130207 describe moléculas de ARNi que se pueden expresar en plantas para proporcionar resistencia a plagas y patógenos.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico transfectada es heteróloga. Como se utiliza en el presente documento, ácido nucleico heterólogo (o un gen heterólogo) incluye ácido nucleico que normalmente no se encuentra en la planta, por ejemplo, ácido nucleico de otra especie. El ácido nucleico heterólogo también incluye un polinucleótido nativo de un organismo que ha sido alterado de alguna manera (por ejemplo, mutado, agregado en múltiples copias, conectado a una secuencia promotora o potenciadora no nativa, etc.). Los genes de plantas heterólogos se distinguen de los genes de plantas endógenos en que las secuencias de genes heterólogos se unen normalmente a secuencias de nucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran asociados de forma natural con el gen de la proteína codificada por el gen heterólogo o con secuencias de genes de plantas en el cromosoma, o están asociados con porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en loci donde el gen no se expresa normalmente).

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico transfectada es una nucleasa. Las nucleasas preferidas incluyen nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasas de repetición palindrómica corta agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), meganucleasas y endonucleasas de corte. Dichas nucleasas pueden ser útiles en métodos de edición de genes o genomas.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico transfectada es parte del sistema Crispr/Cas, tal como una nucleasa Cas y/o un ácido nucleico guía. Como es conocido por un experto, el sistema Crispr/Cas se puede utilizar para la edición de genes. Los genes se pueden editar, mutar, reemplazar o inactivar utilizando este sistema. Crispr/Cas también se puede utilizar para modular la expresión génica al utilizar proteínas Cas “muertas” modificadas fusionadas con dominios de activación transcripcional (véase, por ejemplo, Khatodia et al. Frontiers in Plant Science 2016 7: artículo 506 y Ma et al. FEBS Journal 2014 5186-5193 para revisiones recientes de la tecnología Crispr).

En los métodos preferidos de la invención, se transfecta una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína Cas. La proteína Cas puede ser una proteína Cas de tipo I, tipo II, tipo III, tipo IV, tipo V o tipo VI. La proteína Cas puede comprender uno o más dominios. Ejemplos no limitantes de dominios incluyen, un dominio de reconocimiento y/o unión del ácido nucleico guía, dominios de nucleasa (por ejemplo, dominios de ADNasa o ARNasa, RuvC, HNH), dominio de unión de ADN, dominio de unión de ARN, dominios de helicasa, dominios de interacción proteína-proteína y dominios de dimerización. El dominio de unión y/o reconocimiento de ácido nucleico guía puede interactuar con un ácido nucleico guía. En algunas realizaciones, el dominio de nucleasa puede comprender una o más mutaciones que dan como resultado una nickasa o una enzima “muerta” (es decir, el dominio nucleasa carece de actividad catalítica).

Las proteínas Cas preferidas incluyen c2c1, C2c2, c2c3, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cash, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 o Csx12), Cas10, Cas10d, Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, y Cu1966, y homólogos o versiones modificadas de las mismas.

En los métodos preferidos de la invención, se transfecta una secuencia de dirección Crispr. Dichas secuencias son conocidas por el experto e incluyen ARNg (ARN guía), ARNcr, ARNtracr y ARNgu. La secuencia de dirección Crispr se une a una secuencia complementaria en el genoma de la planta anfitriona y dirige una proteína Cas al sitio respectivo.

La transfección del sistema Crispr/Cas en una célula vegetal que tiene una expresión y/o actividad de POLQ reducida reduce la inserción aleatoria de componentes Crispr/Cas en el genoma de la planta. Si bien no se desea limitarse a la teoría, la transfección transitoria de componentes Crispr puede reducir los efectos fuera de diana y/o aumentar la especificidad del sistema Crispr/Cas. En otras realizaciones, la divulgación proporciona métodos para la generación de plantas en las que los componentes Crispr (tales como una enzima Cas) se transfectan de forma estable mediante recombinación genética específica de sitio o recombinación homóloga.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionan una transfección transitoria de la molécula de ácido nucleico. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico para la transfección transitoria comprende un casete de expresión vegetal. Un casete de expresión vegetal adecuado comprende secuencias reguladoras 5' y 3' conectadas operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una transcripción. El término “conectado operativamente” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una está regulada por la otra. Por ejemplo, un promotor está conectado operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de regular la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor).

Preferiblemente, un casete de expresión vegetal comprende un promotor que dirige la expresión en plantas y una señal de poliadenilación. Promotores de ejemplo para la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos incluyen promotores de plantas tales como el promotor CaMV 35S (Odell et al., 1985), CaMV 19S (Lawton et al., 1987), nos (Ebert et al., 1987), Adh (Walker et al., 1987), sacarosa sintasa (Yang and Russell, 1990), a-tubulina, actina (Wang et al., 1992), cab (Sullivan et al., 1989), PEPCasa (Hudspeth and Grula, 1989) o aquellos asociados con el complejo del gen R (Chandler et al., 1989). También se pueden utilizar promotores específicos de tejido tales como promotores de células de la raíz (Conkling et al., 1990) y potenciadores específicos de tejido (Fromm et al., 1986). Ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen los detallados en: Becker, D. et al., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; y Bevan, M. W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; y Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15­ 38.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionan una integración específica de sitio estable de la molécula de ácido nucleico a través de recombinación genética. La integración de sitio específico se refiere a la integración en una región definida del genoma que depende de la secuencia de ácidos nucleicos en el genoma. Esto difiere de la integración aleatoria. En una realización, el ácido nucleico se integra en el genoma de la planta a través de recombinación homóloga. Se conocen métodos y vectores adecuados para inducir la recombinación homóloga. Por ejemplo, se puede preparar un vector de recombinación homóloga que comprende la molécula de ácido nucleico de interés flanqueada en sus extremos 5' y 3' por secuencias de ácido nucleico que son homólogas a secuencias de plantas endógenas. Se puede utilizar recombinación homóloga, por ejemplo, para reemplazar un gen de tipo silvestre sobre un cromosoma por un nuevo gen no relacionado, un gen inactivado o una versión modificada del gen de tipo silvestre (nuevo alelo). La recombinación homóloga también se puede inducir por nucleasas tales como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasas agrupadas de repetición palindrómica corta regularmente interespaciadas (CRISPR), meganucleasas y endonucleasas de corte.

Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una forma mutada de un polipéptido endógeno o molécula de ARN. Las mutaciones pueden ser una ganancia de función o una pérdida de función (por ejemplo, mutación inactivante). En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender, por ejemplo, una primera región, una segunda región y una tercera región. La primera y tercera regiones son sustancialmente homólogas a un gen de interés. La segunda región puede comprender una forma mutada de un gen endógeno o, por ejemplo, codificar un marcador. Preferiblemente, el marcador es un marcador de selección positiva, como un gen de resistencia a fármacos, un gen que codifica un marcador de superficie, un gen que codifica un marcador de fluorescencia o un gen que codifica pgalactosidasa. Los métodos y vectores de recombinación homóloga adecuados para plantas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO2003027261.

En una realización, el ácido nucleico se integra en el genoma de la planta mediante recombinación específica de sitio. Se han probado varios sistemas de recombinación específicos de sitio en plantas, que incluyen el sistema Cre/lox, el sistema Flp/FRT y el sistema R/RS. Las recombinasas ejercen sus efectos al promover la recombinación entre dos de sus sitios de recombinación. En el caso de cre, el sitio de recombinación es un sitio Lox, y en el caso de Flp, el sitio de recombinación es un sitio Frt. Estos sitios de recombinación incluyen palíndromos invertidos separados por una secuencia asimétrica. La recombinación entre sitios diana dispuestos en paralelo (las llamadas “repeticiones directas”) sobre la misma molécula de ADN lineal da como resultado la escisión de la secuencia de ADN interviniente como una molécula circular. Las plantas y células vegetales que llevan secuencias de reconocimiento estables (por ejemplo, sitio FRT, lox o RS) en su genoma se pueden utilizar para transfectar una molécula de ácido nucleico de interés flanqueada por la secuencia de reconocimiento respectiva junto con la recombinasa apropiada (por ejemplo, recombinasa Flp, Cre, o R) en los métodos descritos en el presente documento. La transfección da como resultado la integración estable de la molécula de ácido nucleico.

Para la transfección transitoria o estable, se pueden incluir marcadores seleccionables o cribables en la molécula de ácido nucleico a transfectar. Los “genes marcadores” son genes que imparten un fenotipo distinto a las células que expresan la proteína marcadora y, por tanto, permiten que las células transfectadas se distingan de las células que no tienen el marcador. Dichos genes pueden codificar un marcador seleccionable o cribable, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que se puede “seleccionar” por medios químicos, es decir, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un herbicida, antibiótico o similares), o si se trata simplemente de un rasgo que se puede identificar mediante observación o prueba, es decir, al “cribar” (por ejemplo, la proteína verde fluorescente). Los genes marcadores seleccionables incluyen genes que codifican la resistencia a antibióticos, tales como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas. Los genes de resistencia a herbicidas generalmente codifican una proteína diana modificada insensible al herbicida o una enzima que degrada o desintoxica el herbicida en la planta antes de que pueda actuar. (Véase, DeBlock, et al., (1987) EMBO J. 6: 2513-2518; DeBlock, et al., (1989) Plant Physiol. 91: 691­ 704; Fromm, et al., (1990) 8: 833-839; Gordon-Kamm, et al., (1990) 2: 603-618). Por ejemplo, la resistencia a herbicidas glifosato o sulfonilurea se ha obtenido mediante al utilizar genes que codifican las enzimas diana mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y acetolactato sintasa (ALS). Se conocen en la técnica muchos ejemplos de proteínas marcadoras adecuadas y se pueden emplear en la práctica de la invención. En realizaciones preferidas de los métodos, las células vegetales transfectadas o las plantas regeneradas de las mismas se criban para detectar la presencia de un marcador seleccionable o cribable.

La “transfección” se define en el presente documento como un proceso para introducir un ácido nucleico en una célula vegetal e incluye el término “transformación”. Las células vegetales y las partes de las plantas incluyen células individuales y tejidos de polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, ápices de raíces, anteras, flores, frutos, tallos, brotes y semillas; así como polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, ápices de raíces, anteras, flores, frutos, tallos, brotes, vástagos, polen, semillas, protoplastos, callos y similares. La transfección puede ocurrir en condiciones naturales o artificiales utilizando varios métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos adecuados incluyen infección viral, electroporación, lipofección y bombardeo de partículas. Ejemplos de estas técnicas se describen en Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984), Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), y Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987). La transfección incluye la introducción de ácido nucleico en una célula vegetal mediante métodos físicos o químicos o mediante una infección viral. Sin embargo, está claro para un experto que este proceso no incluye la introducción de un ácido nucleico mediante entrecruzamiento o cruzamiento.

Las células transfectadas se pueden regenerar en plantas completas utilizando técnicas estándar conocidas en la materia. Además de transfectar células, tejidos u órganos vegetales cultivados in vitro; también se pueden transfectar plantas vivas completas. La transferencia mediada por agrobacterias es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales porque el ADN puede introducirse en tejidos vegetales completos. Los procesos adecuados incluyen la inmersión de plántulas, hojas, raíces, cotiledones, etc. en una suspensión de Agrobacterium que puede mejorarse mediante infiltración al vacío, así como para algunas plantas, la inmersión de una planta con flores en una solución de Agrobacteria (inmersión floral), seguida de reproducción de los gametos transformados.

A continuación, se permitirá que las células transfectadas con éxito, que se identifican preferiblemente mediante selección o cribado y se cultiven en un medio apropiado que soporte la regeneración, se regeneren en plantas. “Regeneración” se refiere al proceso de hacer crecer una planta a partir de una célula vegetal (por ejemplo, un protoplasto o explante vegetal) y dichos métodos son bien conocidos en la técnica.

En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico de interés se transfecta mediante el sistema T-ADN de Agrobacterium. Las cepas de Agrobacterium adecuadas incluyen LBA4404, EHA101, C58, EHA105, AGL1 o GV3101. El T-ADN puede ser un plásmido Ti modificado o un vector artificial derivado del plásmido Ti (plásmido inductor de tumores), denominado colectivamente en el presente documento como “vector T-ADN”. El plásmido Ti es una molécula de ADN circular que comprende una región de T-ADN y una región vir (virulencia). La región de T-ADN endógena comprende los genes para la biosíntesis de auxina (aux), citoquinina (cyt) y opina (ocs) flanqueados por un borde derecho e izquierdo. Los bordes son repeticiones directas imperfectas que tienen 24 pares de bases. Los genes de la región de virulencia son responsables de transferir el T-ADN a las células vegetales. Por ejemplo, la endonucleasa VirD2 con ayuda de VirD1 corta en los bordes del T-ADN, liberando una copia de cadena sencilla del T-ADN, la cadena T, que es transportada a las células vegetales por el sistema de transporte codificado por virB. La proteína VirE2 se une a la cadena T en la célula anfitriona y el complejo ingresa al núcleo de la célula vegetal.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de interés se inserta en la región de T-ADN de un plásmido Ti. Preferiblemente, los genes aux, cyt y ocs del plásmido Ti se eliminan (es decir, el plásmido se “desarma”).

En algunas realizaciones, se utiliza un vector artificial derivado del plásmido Ti. El uso de vectores de integración de plantas mediados por Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es bien conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, los métodos descritos por Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987) y la patente de Estados Unidos no.

5,563,055.

En algunas realizaciones, uno o más genes del plásmido Ti se mutan para aumentar la eficiencia de transformación, por ejemplo, como cepas de Agrobacterium en las que la expresión del gen vir y/o la inducción del mismo se altera debido a la presencia de genes virA o virG mutantes o quiméricos (por ejemplo, Chen and Winans, 1991, J. Bacteriol.

173: 1139-1144; y Scheeren-Groot et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6418-6246). En otra realización, la cepa de Agrobacterium puede comprender una copia del gen virG adicional, tal como el gen supervirG derivado de pTiBo542.

En una realización preferida, se utiliza un sistema binario de T-ADN. En un sistema binario, los genes vir necesarios para la transferencia de T-ADN a las células vegetales y el T-ADN están sobre plásmidos separados. El “plásmido binario” comprende el ácido nucleico de interés y, preferiblemente un marcador de planta, flanqueado a la izquierda y a la derecha por secuencias de borde de T-ADN. El plásmido binario normalmente también comprende uno o más orígenes de replicación para permitir la replicación tanto en E. coli como en Agrobacterium y un marcador seleccionable de bacterias. El “plásmido auxiliar” comprende los genes vir del plásmido Ti. Los vectores del sistema binario de T-ADN están disponibles comercialmente. También se ha descrito un sistema de vector binario en el que la región T está ubicada sobre el cromosoma de la cepa de Agrobacterium (véase, por ejemplo, EP-B 176 112).

En realizaciones preferidas de los métodos divulgados en este documento, los métodos comprenden proporcionar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, dicha molécula comprende una secuencia de ácidos nucleicos de interés flanqueada por una secuencia del borde derecho (RB) derivada de la secuencia de T-ADN de Agrobacterium y una secuencia del borde izquierdo (LB) derivada de la secuencia de T-ADN de Agrobacterium. Como se discute en el presente documento, la molécula de ácido nucleico puede comprender además secuencias reguladoras para impulsar la expresión en plantas y/o genes marcadores. Preferiblemente, también se proporciona en los métodos un dominio vir derivado del plásmido Ti. El dominio vir puede estar presente sobre n la misma molécula de ácido nucleico descrita anteriormente o puede ser proporcionado por un vector separado, por ejemplo, un plásmido auxiliar. Para un experto, está claro que no es necesario el dominio vir completo del plásmido Ti.

Aunque no se desea estar limitado por la teoría, consideramos que el extremo 3' del T-ADN de cadena sencilla no protegido (borde izquierdo) es normalmente un sustrato para la reacción de reparación mediada por POLQ, que conduce a una integración aleatoria. La reducción de POLQ en la célula vegetal reduce o elimina la integración aleatoria de T-ADN, sin afectar la recombinación genética y la expresión transitoria. De acuerdo con lo anterior, se espera que la reducción de POLQ reduzca o elimine la integración aleatoria cuando una célula vegetal se transfecta con cualquier fuente de ácido nucleico, lo que da como resultado la presencia en el núcleo de un ADN de cadena sencilla con un extremo 3' desprotegido.

En principio, todas las plantas se pueden utilizar para la transfección. Las plantas transgénicas preferidas se seleccionan, por ejemplo, de las familias Aceraceae, Anacardiaceae, Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cactaceae, Cucurbitaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Malvaceae, Nymphaeaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Salicaceae, Solanaceae, Arecaceae, Bromeliaceae, Cyperaceae, Iridaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Gentianaceae, Labiaceae, Magnoliaceae, Ranunculaceae, Carifolaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Caryophyllaceae, Ericaceae, Polygonaceae, Violaceae, Juncaceae o Poaceae y preferiblemente de una planta seleccionada del grupo de las familias Apiaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Papaveraceae, Rosaceae, Solanaceae, Liliaceae o Poaceae. Se prefieren plantas de cultivo tales como plantas seleccionadas ventajosamente del grupo del género algodón, melón, achicoria, papaya, ciruela, maní, colza, canola, girasol, cártamo, olivo, sésamo, avellana, almendra, aguacate, laurel, calabaza/calabaza blanca, linaza, soja, pistacho, borraja, maíz, trigo, centeno, avena, sorgo y mijo, triticale, arroz, cebada, cassaya, papa, remolacha azucarera, berenjena, alfalfa y hierbas perennes y plantas forrajeras, palma de aceite, hortalizas (brassicas, tubérculos, tubérculos, hortalizas de vaina, hortalizas de fruto, hortalizas de cebolla, hortalizas de hoja y hortalizas de tallo), trigo sarraceno, alcachofa de Jerusalén, habas, vezas, lentejas, judías enanas, altramuces, trébol y alfalfa, por mencionar solo algunas de ellas. Preferiblemente, la planta es maíz, colza, canola, algodón, patata, soja, remolacha azucarera, calabaza, melón, arroz, lino, radicchio, papaya, alfalfa o trigo. Las plantas más preferidas son maíz, algodón, soja, canola y arroz. En una realización preferida, la célula vegetal no es Arabidopsis thaliana.

Las plantas, como todos los eucariotas multicelulares, expresan polimerasa theta, codificada por el gen POLQ (Pol 0). En la presente divulgación, POLQ y polimerasa theta se utilizan indistintamente. POLQ comprende un dominio central que tiene aproximadamente 800 residuos en plantas y un dominio de polimerasa que pertenece a la familia “A” de ADN polimerasas (véase, por ejemplo, Yousefzadeh and Wood ADN Repair 2013 12: 1-9). El dominio de polimerasa comprende 5 “motivos” (véase Figura 2A de Yousefzadeh and Wood). La homología de secuencia entre plantas se conserva especialmente en estas regiones, en particular en los motivos 2, 5 y 6.

Una secuencia POLQ de ejemplo de plantas es la “proteína que contiene helicasa y polimerasa TEBICHI” de Arabidopsis thaliana. La secuencia de proteínas de 2154 aminoácidos se puede encontrar en la base de datos NCBI bajo el número de acceso BAD93700.1. La secuencia de TEBICHI también se publicó en Inagaki et al. (Plant Cell 18 (4), 879-892 (2006)). Los genes POLQ en otras plantas se pueden identificar, por ejemplo, al realizar una búsqueda de alineación BLAST con la secuencia POLQ de Arabidopsis thaliana. Por ejemplo, los genes POLQ de las siguientes plantas de ejemplo se enumeran en la base de datos del NCBI con los siguientes números de acceso:

arroz Oryza saliva: XP_015619406

papa Solanum tuberosum: XP_006356662

soja Glycine max: XP_003545584

remolacha azucarera Beta vulgaris: XP_010667709

tomate Solanum lycopersum: XP_010325163

banana Musa acuminata ID de Secuencia: ref. |XM_009385225.1|

manzana Malus x domestica: ID de Secuencia: ref. |XM_008380001.1|

uva Vitis vinifera ID de Secuencia: ref. |XM_010650232.1|

colza Brassica napus ID de Secuencia: ref. |XM_013882859.1|

naranja Citrus x sinensis ID de Secuencia: ref. |XM_006476088.2|

maíz Zea mays ID de Secuencia: AQK40086

La familia de programas BLAST que se puede utilizar para búsquedas de similitud de bases de datos incluye: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; b La STX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de proteínas; BLASTP para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de proteínas; TBLASTN para secuencias de consulta de proteínas frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos frente a secuencias de bases de datos de nucleótidos.

Alternativamente, se pueden utilizar técnicas moleculares estándar para identificar el gen POLQ de una especie vegetal particular. Por ejemplo, se pueden utilizar sondas de oligonucleótidos basadas en la secuencia TEBICHI para identificar el polinucleótido deseado en una biblioteca de ADNc o ADN genómico de una especie de planta deseada. Pueden utilizarse sondas para hibridar con ADN genómico o secuencias de ADNc para aislar genes homólogos en las especies vegetales de interés.

Alternativamente, el gen POLQ se puede amplificar convenientemente a partir de muestras de ácido nucleico utilizando técnicas de amplificación de rutina. Por ejemplo, la PCR se puede utilizar para amplificar las secuencias de los genes directamente de ARNm, de ADNc, de bibliotecas genómicas o bibliotecas de ADNc. La PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas a expresar, para producir ácidos nucleicos para utilizar como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciación de ácidos nucleicos, o para otros fines. Se pueden generar cebadores y sondas apropiados para identificar el gen POLQ en la planta en base a la secuencia TEBICHI. Para obtener una descripción general de la PCR, véase PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, M, Gelfand, D., Sninsky, J. and White, T., eds.), Academic Press, San Diego (1990).

En las células vegetales utilizadas en los métodos descritos en el presente documento, se reduce la expresión y/o actividad de POLQ. La reducción en la expresión de POLQ puede ocurrir a nivel de ácido nucleico o proteína. Preferiblemente, la cantidad de expresión de POLQ funcional se reduce en al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente. Preferiblemente, la expresión y/o actividad se reduce en al menos un 50 % en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente, más preferiblemente, la expresión y/o actividad se reduce en al menos un 70 %.

En algunas realizaciones, la expresión de POLQ se determina al medir la expresión del ácido nucleico de POLQ. Los métodos adecuados incluyen RT-PCR, PCR cuantitativa, transferencia Northern, secuenciación de genes, en particular secuenciación de ARN, y técnicas de perfil de expresión génica, por ejemplo, micromatrices. En realizaciones preferidas, la expresión se determina al medir el nivel de proteína POLQ. Los métodos adecuados incluyen ELISA, inmunocitoquímica, citometría de flujo, transferencia Western, espectrometría proteómica y de masas. Preferiblemente, la expresión de POLQ se determina en un inmunoensayo. Los inmunoensayos adecuados incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayo “ intercalado”, ensayo inmunorradiométrico, reacción de precipitación por difusión en gel, ensayo de inmunodifusión, reacción de precipitación, ensayo de aglutinación (por ejemplo, ensayo de aglutinación en gel, ensayo de hemaglutinación, etc.), ensayo de fijación del complemento, ensayo de inmunofluorescencia, ensayo de proteína A y ensayo de inmunoelectroforesis.

En algunas realizaciones, la actividad POLQ se refiere a la capacidad de POLQ para unirse al ADN, en particular a la cromatina. Dicha actividad se puede medir mediante cualquier método conocido por un experto, tal como inmunotransferencia de fracciones de cromatina con un anticuerpo POLQ como se describe en Fernandez-Vidal et al., 2014 Nature Communications 5.

En algunas realizaciones, la actividad de POLQ se refiere a su capacidad para actuar como una polimerasa. Dicha actividad se puede medir, por ejemplo, en el ensayo de extensión del cebador descrito en Hogg et al. Nucleic Acids Res. 2012 Mar; 40(6): 2611-2622, un ensayo Mm Ej como se describe en Kent et al. Nat Struct Mol Biol. 2015 Mar; 22(3): 230-237. Zhan et al. (Nat Struct Mol Biol. 2015 Apr; 22(4): 304-311) describe ensayos adicionales para medir la actividad POLQ. Como es evidente para un experto, una reducción en la actividad de POLQ se refiere a la reducción de la actividad en comparación con la actividad de POLQ de tipo silvestre del mismo organismo. La regulación a la baja de POLQ se puede lograr al introducir una mutación que interrumpe el gen al disminuir la expresión de POLQ, al abrogar la expresión por completo o al hacer que el producto génico no sea funcional. Por ejemplo, la mutación puede ser una mutación puntual, una inserción o una supresión, y la mutación puede estar ubicada en una porción codificante (por ejemplo, en un exón POLQ) o no codificante del gen POLQ (por ejemplo, en la región promotora de POLQ). Yousefzadeh and Wood (DNA Repair, Volumen 12, Número 10, 2013, página 871) proporcionan comparaciones estructurales de los miembros de la familia POLQ y discuten la ubicación de los dominios catalíticos. Las mutaciones preferidas interrumpen el dominio de polimerasa POLQ como se muestra en la Figura 2 de Yousefzadeh and Wood. Preferiblemente, el mutante POLQ reduce la expresión y/o la actividad en al menos un 50 % en comparación con el gen de tipo silvestre.

Las mutaciones en el gen POLQ se pueden lograr mediante cualquiera de los métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, que incluyen los métodos de mutagénesis aleatoria tales como irradiación, integración aleatoria de ADN (por ejemplo, mediante un transposón o T-ADN), o mediante el uso de un mutágeno químico. Más aún, en ciertos aspectos, un gen POLQ puede mutarse utilizando un enfoque de mutagénesis dirigida al sitio. En algunas realizaciones, el gen POLQ se muta o se interrumpe utilizando un vector de recombinación homólogo o una nucleasa dirigida tal como nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasas de repetición palindrómica corta agrupadas regularmente (CRISPR) o meganucleasas. Preferiblemente. Se utiliza el sistema CRISPR/Cas. Estos métodos son conocidos en la técnica, y un experto en la materia podrá identificar dichos métodos según sea apropiado a la luz de la presente divulgación. Se conocen varias técnicas para cribar alelos mutantes específicos, por ejemplo, Deleteagene (Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242) utiliza ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cribar mutantes de supresión generados mediante mutagénesis de neutrones rápidos, TILLING (lesiones locales inducidas dirigidas en genomas; McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18: 455-457) identifica mutaciones puntuales inducidas por EMS, etc.

En una realización preferida, la célula vegetal tiene el gen POLQ mutado, preferiblemente ambos alelos están mutados. En realizaciones preferidas, la mutación es un alelo “inactivado”, es decir, no se produce proteína funcional.

En algunas realizaciones, el sistema CRISPR/Cas se utiliza para reducir la expresión o actividad de POLQ. El sistema CRISPR/Cas se basa en la nucleasa Cas9 guiada por ARN del sistema inmunitario adaptativo CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) procarióticas de tipo II (véase, por ejemplo, Belahj et al., Plant Methods 9:39, 2013). Este sistema consta de tres componentes: proteína Cas9, ARNcr y ARNtracr. El ARncr y el ARNtracr se proporcionan normalmente como una sola molécula de ARN denominada ARNg (ARN guía). El ARN guía se puede expresar utilizando pequeños promotores de ARN nucleares como U6 o U3. También se han descrito versiones de Cas9 optimizadas para codones vegetales y se pueden expresar en plantas mediante promotores constitutivos (por ejemplo, promotor 35S) o mediante un promotor inducible o específico de tejido.

Este sistema implica dirigir Cas9 al locus genómico específico a través de un ARNg. Sin embargo, la longitud canónica del ARNg es de 20 pb, para dirigirse a loci de plantas, se pueden utilizar 19-22 pb. El ARNg está diseñado para unirse a la secuencia diana, en este caso el gen POLQ. El sitio de unión se elige de manera que el ADN diana sea seguido por una secuencia PAM (motivo adyacente al protoseparador). La proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes, SpCas9, se utiliza a menudo en este sistema ya que tiene una secuencia de reconocimiento PAM corta de NGG. Por lo tanto, si se utiliza SpCas9, se pueden diseñar ARNg adecuados al cribar el locus genómico POLQ para la secuencia (N)-^{ig -22}NGG. También está disponible una herramienta de diseño CRISPR en línea para identificar los sitios de destino adecuados (http://tools.genome-engineering.org, Ren et al).

Se puede encontrar información adicional sobre el uso del sistema CRISPR/Cas9 para inducir mutaciones en plantas en Lowder et al. Plant Physiology 2015 169:971-985 y Belhaj et al. 2013 Plant Methods 9:39.

La reducción en la expresión de POLQ también se puede lograr utilizando una “molécula de ácido nucleico inhibidora” cuya presencia en una célula provoca la degradación o inhibe la función, transcripción o traducción de su gen diana de una manera específica de secuencia. Las moléculas de ácido nucleico ejemplares incluyen aptámeros, ARNip, ARNmicro artificial, ARN o ARN de interferencia, ARNcd, ribozimas, oligonucleótidos antisentido y casetes de expresión de ADN que codifican dichas moléculas de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido. Los oligonucleótidos antisentido (AON) generalmente inhiben su diana al unir el ARNm diana y bloquear estéricamente la expresión al obstruir el ribosoma. Los AON también pueden inhibir su diana al unir el ARNm diana formando de esta manera un híbrido de ADN-ARN que puede ser una sustancia para la ARNasa H. Los AON también se pueden producir como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos, miméticos de oligonucleótidos o regiones o porciones de los mismos. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gápmeros. Los métodos para diseñar y modificar dichos gápmeros se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos Nos. 20110092572 y 20100234451. Los Ao N comprenden normalmente entre 12 a 80, preferiblemente entre 15 a 40, nucleobases. Preferiblemente, los AON comprenden un tramo de al menos 8 nucleobases que tienen un 100 % de complementariedad con el ARNm diana.

En otro método, un ácido nucleico se puede transcribir en una ribozima o ARN catalítico, lo que afecta la expresión de un ARNm. Véase la Patente de Estados Unidos No. 6,423,885. Las ribozimas se pueden diseñar para emparejarse específicamente con un ARN diana y escindir la estructura principal del fosfodiéster en una ubicación específica, inactivando de esta manera funcionalmente el ARN diana. Los ácidos nucleicos heterólogos pueden codificar ribozimas diseñadas para escindir transcripciones de ARNm particulares, evitando de esta manera la expresión de un polipéptido. Las ribozimas de cabeza de martillo escinden los ARNm en ubicaciones dictadas por las regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm diana.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARNi de doble cadena específica para el ARNm codificado por el gen POLQ. Preferiblemente, la molécula comprende un fragmento del gen POLQ que se va a silenciar en una estructura repetida invertida. Las repeticiones invertidas están separadas por un separador, a menudo un intrón. La construcción de ARNi es impulsada por un promotor adecuado y se transfecta en una planta. La transcripción del transgén conduce a una molécula de ARN que se pliega sobre sí misma para formar un ARN en horquilla de doble cadena. Esta estructura de ARNdc es reconocida por la planta y cortada en ARN pequeños (de aproximadamente 21 nucleótidos de largo) llamados ARN interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip se asocian con un complejo proteico (RISC) que pasa a la degradación directa del ARNm del gen diana. Se puede transformar en una construcción que incluye una secuencia que está conectada operativamente a una región reguladora y una secuencia de terminación de la transcripción y que se transcribe en un ARN que puede formar un ARN de doble cadena. Aquellos expertos en la técnica conocen métodos para utilizar ARNi para inhibir la expresión de un gen. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,034,323; 6,326,527; 6,452,067; 6,573,099; 6,753,139; y 6,777,588. Véase también los documentos WO 97/01952; WO 98/53083; WO 99/32619; WO 98/36083; y las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos 20030175965, 20030175783, 20040214330 y 20030180945. Se han descrito ARNip dirigidos a POLQ humano Ceccaldi et al. Nature. 2015 Feb 12; 518(7538): 258-262.

Las técnicas de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) son una variación de las técnicas de ARNi que explota las defensas antivirales endógenas de las plantas. La infección de plantas con virus VIGS recombinantes que contienen fragmentos de ADN del anfitrión conduce al silenciamiento del gen postranscripcional para el gen diana. En una realización, se puede utilizar un sistema VIGS basado en el virus del sonajero del tabaco (TRV). Los sistemas VIGS basados en el virus del sonajero del tabaco se describen, por ejemplo, en Baulcombe, Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113 (1999); Lu, et al, Methods 30: 296-303 (2003); Ratcliff, et al, The Plant Journal 25: 237-245 (2001); y la Patente de Estados Unidos No. 7,229,829.

En algunas realizaciones, la actividad POLQ se reduce al proporcionar a la célula vegetal una molécula de unión a POLQ. Preferiblemente, la actividad de POLQ se reduce en al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % en comparación con una célula vegetal de tipo silvestre correspondiente. Preferiblemente, la molécula de unión de POLQ se une a POLQ e inhibe su actividad enzimática y/o su capacidad para unirse al ADN.

Preferiblemente, la molécula de unión a POLQ es una molécula pequeña. Los agentes de unión adicionales incluyen anticuerpos, así como agentes de unión que no son de inmunoglobulina, tales como aglutinantes de péptidos derivados de la presentación de fagos y los imitadores de anticuerpos, por ejemplo, afficuerpos, tetranectinas (CTLD), adnectinas (monocuerpos), anticalinas, DARPins (anquirinas), avímeros, iMabs, microcuerpos, aptámeros de péptidos, dominios de Kunitz, aptámeros y afilinas. El término “anticuerpo” incluye, por ejemplo, anticuerpos tanto de origen natural como no de origen no natural, anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos totalmente sintéticos y fragmentos de los mismos, tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab', F(ab')2, Fv o Fab, u otros fragmentos de inmunoglobulina que reconocen antígenos.

Preferiblemente, la molécula de unión a POLQ es un anticuerpo POLQ o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos que reconocen POLQ están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, X3-Q588V7 [ABX] de Abmart que se generó utilizando la proteína TEBICHI).

Los anticuerpos que se unen a un epítopo particular se pueden generar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos policlonales mediante el método convencional de inmunización de un mamífero (por ejemplo, conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras). A continuación, los anticuerpos policlonales están contenidos en los sueros de los animales inmunizados y se pueden aislar utilizando procedimientos estándar (por ejemplo, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico). Los anticuerpos monoclonales se pueden elaborar mediante el método convencional de inmunización de un mamífero, seguido del aislamiento de células B plasmáticas que producen los anticuerpos monoclonales de interés y la fusión con una célula de mieloma (véase, por ejemplo, Mishell, et al., 1980). El cribado para el reconocimiento del epítopo se puede realizar utilizando métodos de inmunoensayo estándar que incluyen técnicas de ELISA, radioinmunoensayos, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y transferencia de Western (Ausubel, et al., 1992). También se pueden utilizar métodos in vitro de selección de anticuerpos, tal como la presentación de anticuerpos en fagos, para generar anticuerpos (véase, por ejemplo, Schirrmann et al. 2011). Preferiblemente, se agrega una señal de localización nuclear al anticuerpo para aumentar la localización en el núcleo.

La presente divulgación también abarca una planta o célula vegetal de origen no natural en la que la expresión y/o actividad de POLQ en dicha planta o célula vegetal se reduce como se divulga en el presente documento, en la que dicha planta o célula vegetal no es Arabidopsis thaliana. En una realización preferida, la planta o célula vegetal expresa una “molécula de ácido nucleico inhibidora” de POLQ como se describe en el presente documento. En una realización preferida, la planta o célula vegetal tiene un POLQ mutado, como se describe en el presente documento. Dichas plantas y células vegetales son útiles para llevar a cabo los métodos divulgados en este documento. De acuerdo con lo anterior, la presente divulgación también abarca el uso de la planta o célula vegetal para transfectar una molécula de ácido nucleico de interés.

La presente divulgación también abarca células vegetales y plantas producidas mediante los métodos divulgados en el presente documento. Dichas plantas y células vegetales son ventajosas ya que comprenden la molécula de ácido nucleico, pero su genoma tiene eventos de recombinación aleatoria limitados o nulos del ácido nucleico. En realizaciones preferidas, dichas células vegetales y plantas tienen expresión y/o actividad reducida de POLQ como se describe en el presente documento.

La presente divulgación también abarca la progenie de plantas producidas por los métodos divulgados en este documento. Como se utiliza en este documento, el término “progenie” denota la descendencia (que incluye las semillas) de cualquier generación de una planta original preparada de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, donde la progenie comprende la molécula de ácido nucleico de interés.

Definiciones

Como se utiliza en el presente documento, “comprender” y sus conjugaciones se utiliza en su sentido no limitativo para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no están excluidos. Además, el verbo “consistir” puede ser reemplazado por “consistir esencialmente en”, lo que significa que un compuesto o compuesto adjunto como se define aquí puede comprender componente(s) adicional(es) a los específicamente identificados, dichos componentes adicionales no alteran la característica única de la invención.

Los artículos “un” y “una” se utilizan en este documento para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Como se utiliza en el presente documento, la recombinación homóloga (HR) se refiere a la reparación de roturas sin errores utilizando una plantilla no dañada (normalmente la cromátida hermana).

Como se utiliza en el presente documento, HDR (reparación impulsada por homología) se refiere más ampliamente al uso de secuencias homólogas para la reparación directa utilizando una plantilla. Una rotura también se puede reparar si está flanqueada por secuencias homólogas, en cuyo caso el modo de reparación se denomina SSA, para la hibridación de una cadena sencilla; este resultado es propenso a errores.

Todas las demás reparaciones que no sean HR, HDR o SSA se denominan normalmente unión final (EJ). Debido a que EJ no utiliza homología para la reparación directa, originalmente se denominó unión de extremos no homólogos (NHEJ). La ruta EJ más conocida, que se descubrió por primera vez, requería las proteínas KU70 y KU80 y LIG4 y se denomina NHEJ o NHEJ clásico (cNHEJ). EJ que no es cNHEJ (que se manifiesta en células que eran deficientes para cNHEJ) se denomina EJ “alternativo” o alt-EJ. Debido a que este tipo de EJ con frecuencia muestra segmentos de bases idénticas en las uniones del producto de reparación, también se le ha llamado: EJ o MMEJ mediado por micro-homología.

Como se utiliza en el presente documento, TMEJ (pol Theta-Mediated EJ) se refiere a la reparación mediada por POLQ aceptada en el campo. Si bien no deseamos limitarnos a la teoría, proponemos que la mayoría de las reparaciones de alt-EJ en realidad están mediadas por TMEJ.

La invención se explica con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 Transfección de T-ADN

Antecedentes

Agrobacterium tumefaciens es el agente causal de la enfermedad de la agalla de la corona en plantas dicotiledóneas. Una parte del ADN del patógeno, el T-ADN, se transfiere a las células vegetales donde se integra en el genoma, lo que lo convierte en un ejemplo de transferencia genética trans-reino. Los genes ubicados en el T-ADN transforman las células vegetales en células tumorales que sintetizan nutrientes, que la bacteria puede utilizar como fuente de carbono y nitrógeno, creando de esta manera un nicho ecológico para sí misma2. Las capacidades de transmisión de ADN de este patógeno se han explorado ampliamente en biotecnología como un medio para insertar genes extraños en plantas. Aunque ahora se sabe mucho sobre la interacción entre Agrobacterium y las células vegetales, y los procesos que conducen a la integración del T-ADN en el genoma del anfitrión, el mecanismo real de integración sigue siendo desconocido1. Hace ya dos décadas se planteó la hipótesis de que Agrobacterium utiliza enzimas de reparación de rotura de doble cadena (DSB) del anfitrión para catalizar la integración del T-ADN, lo que lleva a la investigación genética de proteínas clave de diferentes rutas de reparación de DSB3. Se han investigado factores canónicos de unión de extremos no homólogos y de recombinación homóloga para determinar su participación en la integración del T-ADN, pero con resultados limitados y variables4'7. Incluso cuando se desactivaron diferentes rutas en combinación, la integración del T-ADN siguió siendo posible89, lo que sugiere la participación de una ruta desconocida aún por identificar.

Una característica potencialmente informativa de la integración del T-ADN que apunta hacia el mecanismo de integración es un tipo de cicatriz del genoma, el llamado “ADN de relleno”, que se encuentra con frecuencia en los sitios de integración del T-ADN. Los ADN de relleno son inserciones de secuencias de ADN que a veces contienen tramos idénticos a las secuencias presentes en el flanco inmediato del sitio de integración1011. Notamos un parecido sorprendente entre la composición del ADN de relleno en los eventos de integración del T-ADN y los productos de la reparación de DSB propensa a errores en el nematodo C. elegans y la mosca D. melanogaster. En estas especies, los DSB asociados a la replicación, así como los inducidos por nucleasas, se pueden repara mediante una ruta alternativa de unión de extremos que depende críticamente de la polimerasa Theta de la familia A (Pol 0), en algunos casos con inserciones de relleno como consecuencia12' 14 Esta característica distintiva de la unión de extremos mediada por Pol 0 se conserva evolutivamente, ya que también en las células de mamíferos se pueden encontrar inserciones de ADN en los sitios de reparación1516. Los genes que codifican Pol 0 se pueden encontrar en los genomas de todos los eucariotas multicelulares, que i9ncluyen la planta modelo Arabidopsis thaliana, en la que el gen se denomina Tebichi1718.

Para abordar la cuestión de si Pol 0 es responsable de la síntesis de ADN de relleno en plantas e ipso facto de catalizar la integración de T-ADN, transformamos plantas de tipo silvestre (Col-0) y dos alelos inactivados de Pol 0 (teb-5 y teb-217) mediante transformación de inmersión floral. Encontramos que la transformación de las plantas Col-0 de tipo silvestre se producía normalmente, mientras que de las plantas teb-2 y teb-5 no se podía recuperar ni un solo transformante (Fig. 1a-c).

Para excluir la posibilidad de que estos resultados sean el resultado de un defecto floral morfológico no obvio que evitaría que el Agrobacterium penetre y alcance los gametofitos femeninos (las células diana para la transformación), ensayamos la expresión transitoria de T-ADN en estas células. Para ello, utilizamos T-ADN que expresa el marcador GUS::intrón bajo el control del promotor ACT11, que se expresa en óvulos/semillas en desarrollo1920. Tras la infección con Agrobacterium, encontramos que la expresión transitoria mediada por T-ADN en plantas mutantes de tipo silvestre y Pol 0 es indistinguible (Fig. 1). Por tanto, el T-ADN puede alcanzar los núcleos del tejido diana, pero depende completamente de Pol 0 funcional para su integración.

Se ha sugerido previamente que la integración del T-ADN en las células de la raíz puede ser diferente de la integración del T-ADN en las flores21. Mientras que miles de uniones del genoma de la planta de T-ADN están disponibles para los transformantes de flores de Arabidopsis, solo se ha determinado un número limitado para los transformantes obtenidos a través de la transformación de la raíz, lo que hace imposible una predicción a priori. Por lo tanto, infectamos raíces deficientes en Col-0 y pol 0 con una cepa de Agrobacterium que suministra un T-ADN que proporciona resistencia al herbicida fosfinotricina (PPT) y utilizamos la formación de brotes verdes sobre placas de selección que contienen PPT como marcador para la integración estable. Como se esperaba, encontramos ~80 % de transformación exitosa en Col-0, pero la frecuencia de transformación de raíces deficientes en pol 0 se redujo considerablemente (Fig. 2a-b, f); de hecho, ninguno de los 853 callos desarrolló brotes verdes. La regeneración de brotes de callos bajo condiciones no selectivas no se vio afectada en raíces deficientes en pol 0. Observamos que las raíces infectadas deficientes en pol 0 formaron callos, pero estos no crecieron y se deterioraron después de unas pocas semanas, lo que sugiere que la formación de callos puede resultar de la expresión transitoria de T-ADN no integrado. De hecho, los ensayos de TAIL-PCR dirigidos a clonar y validar la integración de T-ADN solo produjeron productos en el ADN extraído de callos Col-0 infectados y no de callos teb-5 infectados (Fig. 2c). Para confirmar la competencia del suministro de T-ADN y la expresión transitoria en raíces deficientes en pol 0, mostramos la expresión exitosa de un gen GUS::intrón codificado por T-ADN en raíces infectadas de teb-2 y teb-5 (Fig. 2d-e). A partir de estos datos, llegamos a la conclusión de que para la transformación de las células de la raíz, como es el caso de los gametos florales, la integración exitosa del T-ADN depende de la pol 0 funcional.

El T-ADN se transmite a las células vegetales como una molécula de ADN de cadena sencilla (ADNcs), con la proteína bacteriana VirD2 unida covalentemente a su extremo 5'1. Este extremo se denomina borde derecho del T-ADN (RB). El extremo 3' del T-ADN, el borde izquierdo (LB), está desprotegido, lo que lo convierte en un excelente sustrato para una reacción de reparación mediada por pol 0: in vitro, la síntesis de a Dn por pol 0 estabiliza dos extremos de ADN que sobresalen 3' mínimamente emparejados22. Esta propiedad bioquímica de pol 0, junto con su función demostrada en la reparación de roturas genómicas fisiológicas, proyecta un mecanismo notablemente simple para las integraciones de T-ADN en el genoma de la planta: captura inadvertida de T-ADN durante la reparación de DSB genómicos espontáneos (Fig. 3a). La extrema sensibilidad de las plantas mutantes pol 0 hacia los agentes inductores de DSB17 aboga por una función prominente de pol 0 en la reparación de roturas genómicas. En apoyo de los DSB endógenos que actúan como sitios de captura de T-ADN, se ha encontrado que infligir daño adicional al ADN al genoma, ya sea por radiación ionizante o por expresión ectópica de endonucleasas, estimula y dirige la integración de T-ADN2324.

Para investigar las características de la acción de pol 0 in vivo, analizamos sistemáticamente > 10.000 productos de su acción: uniones de T-ADN/genoma vegetal resultantes de la integración mediante inmersión floral en células vegetales de tipo silvestre11. En casi el 70 % de todos los eventos de integración, una o ambas uniones contienen ADN de relleno, que en gran parte son de origen desconocido. Una encuesta reciente, utilizando criterios estrictos, mapeó el origen del 16 % de los rellenos a secuencias ubicadas dentro de los 10 kb de la inserción del T-ADN, ya sea en el flanco genómico o en el propio T-ADN11. Sin embargo, informes anteriores han proporcionado pistas de que los rellenos podrían reflejar un mosaico molecular al ser composiciones de múltiples segmentos más pequeños que son de diferente origen10. Analizamos sistemáticamente una colección de ~5000 rellenos utilizando una estrategia de subcadena común más larga (LCS) que determina el tramo de identidad más largo posible entre un relleno y una secuencia de sujeto (Fig. 3b). Encontramos que ~60 % de los rellenos tienen al menos una coincidencia con el ADN dentro de los 100 pb de la unión. En ~20 % de estos, identificamos tramos adicionales que se mapean a otras posiciones de flanqueo. Las plantillas que se utilizan para la síntesis de relleno están predominantemente cerca de la unión (Fig. 3b-d), y se utilizan tanto el T-ADN como el genoma de la planta (Fig. 3d). Muchos rellenos tienen composiciones complejas con múltiples tramos que se pueden rastrear de manera confiable, pero a veces se intercalan con nucleótidos de origen desconocido. Estos arreglos de secuencia segmentaria proporcionan validación in vivo para la proposición de que pol 0 puede facilitar la reparación al permitir uno o más ciclos de cambio de cebador-plantilla, una característica que puede ayudar a generar extremos complementarios que estimulan la resolución. Para examinar si los rellenos son realmente estimulados por la interacción cebador-plantilla, generamos mapas de calor en los que trazamos uniones que contienen relleno en sus secuencias de emparejamiento de relleno afines en las proximidades de las uniones. Este enfoque visualiza el grado de identidad de secuencia entre el extremo 3' predicho que generó una unión, es decir, el cebador, y la secuencia inmediatamente en dirección ascendente de la plantilla que se utiliza para la síntesis de relleno. Para evitar una posible ambigüedad en la interpretación, restringimos nuestro análisis a solo aquellos casos (n = 589) para los cuales el relleno tiene solo un emparejamiento contiguo en el flanco. De hecho, encontramos una profunda sobrerrepresentación de bases coincidentes (Fig.3e): el 66 % de los rellenos tienen al menos un cebador de 1 nucleótido, el 57 % contiene al menos 2 emparejamientos entre el cebador y la plantilla, y el 47 % tiene 3 nucleótidos de cebado en el terminal 3'. Juntos, estos resultados sugieren i) que el ADN de relleno es el producto de pol 0 que extiende el extremo 3' de una ruptura genómica que está mínimamente emparejada con un extremo 3' del T-ADN, o viceversa, y ii) que la capacidad de cambio de cebador-plantilla de esta polimerasa es responsable de la compleja composición de los rellenos.

Curiosamente, un mapa de calor que muestra el grado de microhomología de las uniones de T-ADN sin rellenos (que también requieren pol 0 para su formación) es muy similar al mapa de calor de la plantilla de cebador de las uniones que contienen relleno (Fig. 3e, f). Esta noción apoya la idea de que la microhomología en la reparación de DSB no refleja una estabilidad marginalmente aumentada en el emparejamiento de cadenas de ADNcs no complementarias, sino que refleja la propiedad bioquímica de una polimerasa para extender preferentemente un extremo 3' emparejado a un pequeño número de bases complementarias.

En conjunto, nuestros resultados conducen a un mecanismo conceptualmente simple para la integración del T-ADN en los genomas de las plantas: la ruta de reparación mediada por pol 0 de la planta, en lugar de unir los extremos de una ruptura genómica, une los extremos a moléculas de T-ADN proporcionadas exógenamente. El resultado es similar en las células germinales y en las células somáticas. La mayoría de las integraciones de T-ADN (63 %) tienen una configuración de repetición invertida, donde a cada lado el genoma de la planta está unido al LB 3' de un T-ADN, argumentando que el extremo 3' del T-ADN es el sustrato preferencial. La capacidad de pol 0 para extender los extremos 3' mínimamente emparejados proporciona una explicación mecanicista de la unión del borde izquierdo del T-ADN al genoma de la planta, mientras que su tolerancia al cambio de la plantilla principal puede explicar la existencia de rellenos de mosaico (véase Figura 4). La cuestión de cómo el borde derecho 5 'del T-ADN está conectado al genoma de la planta (para la integración de una sola copia) o a otro borde 5' del T-ADN (para la orientación de repetición invertida) es menos clara. Sin embargo, un análisis detallado de las uniones RB-T-ADN/genoma vegetal sugiere un mecanismo de unión muy similar: también en el presente documento se encuentran rellenos, indicativos de la acción de pol 0. Puede ser que una conversión del T-ADN de cadena sencilla en una configuración de cadena doble preceda a esta reacción, ya sea iniciada por la captura genómica del extremo 3' del T-ADN o mediante un mecanismo aún desconocido^{2 5 2 6}. Una noción intrigante es que un DSB que captura el extremo 3' de un T-ADN en cada lado está protegido de la actividad de resección 5' por la proteína VirD2 bacteriana unida covalentemente. Para su resolución, este extremo 5' puede requerir un procesamiento enzimático adicional, lo que puede explicar las eficiencias de integración reducidas en plantas que portan mutaciones en varias enzimas de procesamiento de ADN^{4 '} 9

Además de proporcionar una comprensión mecanicista de la integración del T-ADN en las plantas, nuestros datos tienen un impacto profundo sobre las estrategias biotecnológicas para desarrollar cultivos transgénicos: dirigirse a pol 0 abolirá por completo la integración aleatoria no deseada en los enfoques dirigidos a genes sin afectar HR, no se requiere pol 0 para HR en todas las especies examinadas hasta ahora. La dependencia absoluta de pol 0 para la integración del T-ADN en los gametofitos de Arabidopsis así como en las raíces, junto con la amplia aparición de firmas pol 0 en la integración del T-ADN en todas las plantas superiores estudiadas, incluidas especies de cultivos como arroz, tomate, fresa o tabaco, proyecta una amplia utilidad^{2 7 -3 0}.

Métodos

Líneas de plantas y condiciones de crecimiento

La información del mutante de inserción se obtuvo del sitio web de SIGnAL en http://signal.salk.edu. teb-5 (SALK_018851) y teb-2 (SALK_035610) se obtuvieron de la colección SALK T-ADN^{3 1}. Los alelos teb-5 y teb-2 se han descrito previamente^{1 7}. Las plantas se cultivaron en suelo a 20 ° C en un ciclo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad.

Transformación por inmersión floral

Se transformaron plantas de tipo silvestre (ecotipo Col-0) y Arabidopsis mutantes utilizando la cepa de Agrobacterium desarmada LBA1100^{3 2} que alberga el vector binario pCAMBIA1301 mediante el método de inmersión floral como se describió previamente^{3 3}. Las semillas transgénicas se seleccionaron sobre medio sólido MA que carecía de sacarosa, suplementado con 100 pg/ml de nistatina, 100 pg/ml de timentin (para destruir cualquier Agrobacterium restante y prevenir infecciones) y 15 |jg/ml de higromicina para seleccionar los eventos de integración. Alternativamente, las plantas se transformaron utilizando la cepa AgII34 de A. tumefaciens que alberga el vector binario pSDM390035. Las semillas transgénicas se seleccionaron sobre medio sólido MA sin sacarosa suplementado con 100 jg/m l de nistatina, 100 jg/m l de timentin (para destruir cualquier Agrobacterium restante y prevenir infecciones) y 15 jg/m l de fosfinotricina para seleccionar los eventos de integración. Para detectar eventos transitorios, las plantas con flores se sometieron a inmersión floral con la cepa AgII de Agrobacterium que alberga pCAMBIA1301_ACT11, que se elabora mediante la clonación de un fragmento de 850 pb del genoma Col-0 que contiene el promotor ACT11 en el vector binario pCAMBIA1301, a partir del cual el marcador de integración estable y su promotor ha sido eliminado (secuencia disponible a pedido). Después de 6 días, las flores se recolectaron y se tiñeron durante la noche en tampón fosfato (pH = 7.3) que contenía K³Fe(CN⁾⁶ 1 mM y K⁴Fe(CN⁾⁶ 1 mM, Na²EDTA 10 mM, SDS al 0.1 %, Triton X-100 al 0.1 % y X-gluc 2 mM. Posteriormente, las flores se aclararon con etanol al 70 %.

Transformación de la raíz

Se realizaron transformaciones de la raíz sobre plantas de A. thaliana de tipo silvestre (Col-0) y mutantes como se describió previamente36, utilizando la cepa LBA110032 de A. tumefaciens desarmada que alberga el vector binario pCAMBIA3301. Después de dos días de cocultivo, parte de los explantes de raíz se tiñeron inmediatamente en tampón fosfato (pH = 7.3) que contenía K³Fe(CN)⁶1 mM y K⁴Fe(CN)⁶ 1 mM, Na²EDTA 10 mM, SDS al 0.1 %, Tritón X-100 al 0.1 % y X-gluc 2 mM, mientras que el resto de los explantes de raíces se transfirieron a un medio sólido que contenía 10 jg/m l de PPT para la selección de transformantes y 500 jg/m l de carbenicilina y 100 jg/m l de vancomicina para destruir el Agrobacterium restante.

Amplificación de las uniones de inserción

El material vegetal se rompió en un polvo en un TissueLyser (Retch, Haan Alemania) bajo N² líquido. El ADN se aisló como se describió previamente37. Se utilizó 1 jL de ADN aislado para PCR en un volumen total de 20 jL . La polimerasa Taq y los tampones se fabricaron internamente. Las uniones del genoma de T-ADN se aislaron mediante TAlL-PCR38, utilizando el cebador degenerado AD2 (NGTCGASWGANAWGAA)38 y cebadores anidados específicos:

Determinación de inserciones genómicas de T-ADN

Todas las secuencias de confirmación de integración de T-ADN se descargaron de ENA/GenBank (números de acceso LN484267 a LN515397)11. Para determinar las uniones de inserción de T-ADN, se realizaron búsquedas MegaBLAST entre cada secuencia y el genoma de referencia de Arabidopsis (TAIR10) y el plásmido binario relevante. Para las secuencias en las que el T-ADN estaba presente en la región 3', se analizó adicionalmente el complemento inverso de la secuencia. Para centrarnos en uniones secuenciadas de alta calidad, solo incluimos secuencias en las que el extremo 3' del T-ADN, así como la región genómica 5', mostraban un emparejamiento perfecto (> 20 pb, emparejamiento erróneo, sin espacio) con su correspondiente mejor éxito de BLAST. Las secuencias en las que los aciertos de T-ADN y BLAST genómicos no se superponían se designaron como integración de relleno, mientras que las secuencias que tenían un acierto de BLAST superpuesto o de unión se designaron como integración sin relleno. Se eliminaron los rellenos que contenían bases no informativas. Después de aplicar estos filtros, quedaron 10.616 eventos de inserción de T-ADN para análisis adicionales.

Origen de los rellenos

Para determinar el origen de los rellenos empleamos un algoritmo de subcadena común más larga (LCS). El algoritmo determina la secuencia común más larga entre el relleno (consulta) y otra secuencia (tema). Para cada relleno (>6 pb y < 40 pb) determinamos el LCS tanto en el genoma de referencia de T-ADN como en el de Arabidopsis, en ambas orientaciones de cadena, en relación con la posición de unión del genoma de T-ADN que se determinó mediante su mejor BLAST respectivo golpes. Buscamos la secuencia del plásmido de T-ADN y el genoma de referencia a 25-6,400 bases de distancia de la unión en ambas direcciones. Para calcular la sobrerrepresentación de longitudes de LCS encontradas, determinamos la probabilidad pseudoaleatoria de encontrar una LCS de cierta longitud para un relleno dado en una secuencia de ADN. Con este fin, mezclamos el ADN del sujeto para cada relleno y buscamos el LCS (10­ 100 veces para cada relleno). A continuación, se creó una distribución de probabilidad de longitudes de LCS pseudoaleatorias para cada tamaño de relleno (>6 pb y < 40 pb). La sobrerrepresentación entre la distribución de probabilidad y el tamaño de LCS real encontrado se calcula como la fracción de rellenos que tienen una longitud de LCS en la cola derecha de la distribución de probabilidad menos la fracción de rellenos esperados. Marcamos los rellenos individuales como sobrerrepresentados cuando la distribución real de su longitud LCS era al menos diez veces mayor que la probabilidad.

Para determinar si un relleno se originó a partir del plásmido originario de T-ADN, hicimos uso del LCS con la adición de que la ubicación solo se usó si el LCS tenía una longitud > 13 pb. Para identificar los posibles orígenes del relleno en el genoma de Arabidopsis, utilizamos BLAST con un valor E de corte de 10-4

Ejemplo 2: recombinación homóloga

El ejemplo 1 demuestra que se requiere Pol 0 funcional para la integración aleatoria estable de T-ADN. El presente ejemplo demuestra que no se requiere Pol 0 funcional para la integración estable a través de recombinación homóloga. Se prepara una construcción de T-ADN, que contiene alrededor de 6 kb de homología con la protoforfirinógeno oxidasa (PPO) del locus de Arabidopsis endógena. La región homóloga contiene dos mutaciones puntuales, que confieren resistencia al herbicida butafenicil tras la integración a través de recombinación homóloga en el locus PPO (véase ver Hanin et al, Plant J 2001 para una descripción de las mutaciones). Además, el T-ADN codifica una enzima Cas9 (Cas9-AteCas9 con codón optimizado de Arabidopsis (Fauser et al. Plant J 79: 348-359 2014)) y el ARN guía, que dirige la enzima Cas9 al locus PPO. La expresión de Cas9 está dirigida por el promotor de ubiquitina y el ARN guía está bajo el control del promotor U6 (Atil6).

Las plantas de tipo silvestre (Col-0) y dos alelos inactivos de Pol 0 (teb-5 y teb-217) se transforman a través de la transformación por inmersión floral. La integración estable del T-ADN mediante recombinación homóloga se mide mediante la resistencia frente al butafenicil. El nivel de integración estable en el locus específico del sitio entre plantas mutantes de tipo silvestre y Pol 0 será similar.

Ejemplo 3: Transfección con un plásmido linealizado

Se prepara un plásmido que contiene alrededor de 6 Kb de homología con la protoforfirinógeno oxidasa (PPO) del locus de Arabidopsis endógena. La región homóloga contiene dos mutaciones puntuales, que confieren resistencia al herbicida butafenicil tras la integración a través de la recombinación homóloga en el locus PPO (véase Hanin et al, Plant J 2001 para una descripción de las mutaciones). Además, el plásmido codifica una enzima Cas9 (Cas9-AteCas9 con codón optimizado de Arabidopsis (Fauser et al. Plant J 79: 348-359 2014)) y el ARN guía, que dirige la enzima Cas9 al locus PPO. La expresión de Cas9 está bajo el control del promotor de ubiquitina y el ARN guía está bajo el control del promotor U6 (Atil6). El plásmido también contiene un sitio de restricción único. El plásmido se linealiza por digestión con el sitio de restricción apropiado.

Los protoplastos se preparan a partir de plantas tipo silvestre y deficientes en Pol © (teb-5 y teb-2) y el plásmido linealizado se transforma en los protoplastos mediante un protocolo de transformación de PEG estándar. Las colonias se mantienen en medio que contiene butafenicil para seleccionarlas para eventos de integración estable a través de la recombinación homóloga. El nivel de integración estable en el locus específico del sitio entre plantas mutantes de tipo silvestre y Pol 0 será similar.

Ejemplo 4: Transfección de una planta de tomate

El presente ejemplo demostrará la reducción de la integración aleatoria en una planta de cultivo, concretamente tomate (Solanum lycopersum). El gen POLQ de tomate se identificó en la base de datos NCBI como el número de acceso. XP_010325163 en base a una búsqueda BLAST utilizando la secuencia Tebichi.

Los mutantes de tomate deficientes en Pol © se crean al dirigirse al locus Pol © utilizando CRISPR y autopolinizarse para crear mutantes homocigotos en la próxima generación. Brevemente, se prepara una construcción de T-ADN que codifica un marcador seleccionable por kanamicina, una enzima Cas9 (Cas9-pcoCas9 con codón de planta optimizado (Li et al. 2013 Nat Biotechnol 31: 688-691)) y el ARN guía, que dirige la enzima Cas9. al locus POLQ. La expresión de Cas9 está bajo el control del promotor 35S y el ARN guía está bajo el control del promotor U3 (Atil3). Los explantes de cotiledones de tomate se transforman por inmersión en una suspensión de Agrobacterium, se seleccionan por su resistencia a la kanamicina y se criban para mutaciones de POLQ. Las plántulas se seleccionan para detectar mutaciones de POLQ utilizando el ensayo Surveyor (Voytas 2013 Annu Rev Plant Biol 64: 327-350) y las plántulas que contienen una mutación inactivante en POLQ se cultivan y autopolinizan para crear mutantes homocigotos en la próxima generación. El efecto de POLQ sobre la integración aleatoria se demuestra utilizando un ensayo tumoral realizado sobre plantas de tomate de tipo silvestre y en mutantes de tomate deficientes sobre Pol ©. Brevemente, se inserta Agrobacterium en un orificio en el tallo de las plantas de tomate de tipo silvestre y de las plantas de tomate deficientes en pol ©. La integración aleatoria se mide al medir la formación de tumores. Las plantas de tomate tipo silvestre desarrollarán tumores, lo que indica eventos de integración aleatoria, mientras que las plantas de tomate deficientes en pol © no desarrollarán tumores.

Ejemplo 5: Generación de plantas de cultivo deficientes en polQ

Se identifica una planta de cultivo, por ejemplo, trigo, soja, arroz, algodón, maíz o Brassica que tiene una mutación en uno o más genes polQ (por ejemplo, en uno o más genes homólogos) o generada mediante mutagénesis (aleatoria) o dirigida inactiva (por ejemplo, utilizando una nucleasa específica de secuencia tal como una meganucleasa, una nucleasa de dedos de zinc, un TALEN, Crispr/Cas9, Crispr/Cpf1, etc.). La reducción de la expresión y/o actividad de PolQ se confirma mediante Q-PCR, transferencia de Western o similar.

Una planta de cultivo, por ejemplo, trigo, soja, arroz, algodón o planta de brassica, se transforma con una construcción que codifica una molécula de ácido nucleico inhibidora de polQ o una molécula de unión a polQ (por ejemplo, que codifica un ARN en horquilla de polQ, anticuerpo, etc., bajo el control de un promotor constitutivo o inducible). La reducción de la expresión y/o actividad de PolQ se confirma mediante Q-PCR, transferencia de Western o similar.

Ejemplo 6: Transfección de plantas de cultivo deficientes en polQ con un gen marcador seleccionable Una planta del Ejemplo 5 que tiene una expresión de PolQ reducida, así como una planta correspondiente que tiene expresión de polQ de tipo silvestre, se transforman con un gen marcador seleccionable (por ejemplo, bar, gus) utilizando Agrobacterium, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.

Los transformantes se criban para determinar la expresión del gen marcador seleccionable. Los transformantes con expresión de polQ reducida muestran una expresión transitoria del gen marcador seleccionable, mientras que los transformantes con expresión de polQ de tipo silvestre muestran una expresión estable del gen marcador seleccionable.

La integración genómica del gen marcador seleccionable se evalúa a través de, por ejemplo, transferencia Southern de ADN genómico aislado de plantas transformadas con expresión de polQ de tipo silvestre o reducida. La presencia del gen marcador seleccionable se puede detectar en el ADN genómico de plantas de tipo silvestre polQ, mientras que las plantas con expresión de polQ reducida muestran una integración genómica menor o incluso nula del gen marcador seleccionable.

Ejemplo 7: Inserción dirigida a través de la recombinación homóloga en plantas de cultivo deficientes en polQ

Las plantas deficientes en PolQ del Ejemplo 5 y las plantas correspondientes que tienen expresión de polQ de tipo silvestre se transforman con un ácido nucleico de interés para la integración dirigida a través de la recombinación homóloga. El ácido nucleico de interés comprende secuencias homólogas al ADN genómico en el sitio diana genómico. Opcionalmente, la planta se cotransforma con una construcción de expresión para una nucleasa específica de secuencia capaz de inducir una ruptura del ADN en el sitio diana para potenciar la recombinación homóloga. Las plantas se criban para la integración del ácido nucleico de interés, por ejemplo, mediante transferencia Southern o PCR. Las plantas que tienen expresión de polQ de tipo silvestre muestran una inserción aleatoria de ácido nucleico de interés así como una inserción dirigida mediante recombinación homóloga en el sitio diana. Las plantas con expresión de polQ reducida muestran menos o incluso ninguna inserción aleatoria del ácido nucleico de interés, pero muestran una inserción dirigida a través de la recombinación homóloga del ácido nucleico de interés en el sitio diana.

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para reducir la integración aleatoria de moléculas de ácido nucleico transfectadas en una célula vegetal, dicho método comprende transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, en la que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal cuando se compara con una célula vegetal tipo silvestre.

2. Un método para transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico en el que el método reduce la integración aleatoria de la molécula de ácido nucleico transfectada en la célula vegetal, el método comprende transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico, en la que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal cuando se compara con una célula vegetal tipo silvestre.

3. Un método para expresar una molécula de ARN o un polipéptido en una célula vegetal en el que el método reduce la integración aleatoria de una molécula de ácido nucleico transfectada en la célula vegetal, el método comprende transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de ARN o polipéptido, en el que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal cuando se compara con una célula vegetal tipo silvestre.

4. Un método para producir una planta que expresa una molécula de ARN o un polipéptido en el que el método reduce la integración aleatoria de una molécula de ácido nucleico transfectada en la célula vegetal, el método comprende transfectar una célula vegetal con una molécula de ácido nucleico que codifica dicha molécula de ARN o polipéptido, en el que se reduce la expresión y o actividad de POLQ en dicha célula vegetal cuando se compara con una célula vegetal tipo silvestre, y generar la planta a partir de dicha célula vegetal.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha molécula de ácido nucleico se integra a través de recombinación genética específica de sitio o recombinación homóloga en el cromosoma de la célula vegetal.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha célula vegetal comprende un oligonucleótido antisentido específico para un pre-ARNm codificado por el gen POLQ o una molécula de ARNi de doble cadena específica para un ARNm codificado por el gen POLQ.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la célula vegetal tiene uno o más alelos POLQ mutados de tal manera que la expresión y o actividad de POLQ se reduce en al menos 70 % cuando se compara con el gen tipo silvestre.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha célula vegetal no es Arabidopsis thaliana.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6-8, en el que dicha molécula de ácido nucleico se transfecta transitoriamente en la célula vegetal.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha molécula de ácido nucleico transfectada transitoriamente codifica una nucleasa.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha molécula de ácido nucleico transfectada transitoriamente codifica un componente de un sistema CRISPR/Cas.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicha molécula de ácido nucleico transfectada transitoriamente comprende un casete de expresión vegetal.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la expresión de POLQ en dicha célula vegetal se reduce al mutar uno o más alelos de POLQ utilizando irradiación, un mutágeno químico, integración aleatoria utilizando un transposón, mutagénesis dirigida a sitio, un vector de recombinación homóloga, o una nucleasa dirigida.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la expresión de POLQ en dicha célula vegetal se reduce al proporcionar la célula vegetal con una molécula de ácido nucleico inhibidora de POLQ, en la que la molécula de ácido nucleico inhibidora de POLQ se dirige directamente a POLQ.

15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la actividad de POLQ en dicha célula vegetal se reduce al proporcionar la célula vegetal con una molécula de unión a POLQ, en el que la molécula de unión a POLQ se une a Po Lq e inhibe su actividad enzimática y/o su capacidad para unirse al ADN.