ES2895623T3 - Conjugación de sitio específico de fármacos enlazadores con anticuerpos y ADC resultantes - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco en donde un fármaco enlazador se conjuga en sitios específicos con un anticuerpo IgG1 a través de una cisteína modificada por ingeniería genética en dicho anticuerpo en la posición 41 de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat, en donde dicho fármaco enlazador comprende un derivado de duocarmicina.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugación de sitio específico de fármacos enlazadores con anticuerpos y ADC resultantes
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) en donde un fármaco enlazador se conjuga en sitios específicos a un anticuerpo mediante una cisteína modificada por ingeniería genética y su uso en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos humanos, en particular cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer urotelial, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y leucemia.
Antecedentes de la presente invención
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) son una clase emergente de agentes terapéuticos dirigidos que tienen un índice terapéutico mejorado con respecto a la quimioterapia tradicional. Los fármacos y enlazadores han sido el eje de la producción de ADC, además del anticuerpo (monoclonal) (mAb, por sus siglas en inglés) y la selección de la diana. Recientemente, sin embargo, se comprendió la importancia de la homogeneidad conjugada. Los métodos convencionales para la fijación de un fármaco a un anticuerpo dan lugar a una mezcla heterogénea, y algunos constituyentes individuales de esa mezcla pueden tener mal rendimiento in vivo. Los métodos más novedosos para la fijación de fármacos de sitio específico dan lugar a conjugados más homogéneos y permiten el control del sitio de fijación del fármaco. Estas sutiles mejoras pueden tener efectos profundos sobre la eficacia in vivo y/o sobre la seguridad in vivo y por lo tanto en el índice terapéutico. Métodos para la conjugación de fármacos de sitio específico con anticuerpos se revisan de manera exhaustiva por C.R. Behrens and B. Liu in mAbs, Vol. 6, Fascículo 1, 2014, páginas 1-8.
Los ADC convencionales se producen normalmente conjugando el fármaco enlazador con el anticuerpo a través de las cadenas laterales de las lisinas expuestas a la superficie o de las cisteínas libres generadas mediante la reducción de los enlaces disulfuro entre cadenas. Debido a que los anticuerpos contienen muchos restos de lisina y enlaces disulfuro de cisteína, la conjugación convencional produce normalmente mezclas heterogéneas que presentan dificultades con respecto a la caracterización analítica y la fabricación. Asimismo, los constituyentes individuales de estas mezclas muestran diferentes propiedades fisicoquímicas y farmacológicas con respecto a sus perfiles farmacocinéticos, de eficacia y de seguridad, dificultando un enfoque racional para optimizar esta modalidad.
Estas dos técnicas convencionales para la modificación química de anticuerpos se utilizaron para construir los dos ADC con las aprobaciones de comercialización actuales de la FDA. Brentuximab vedotina (Adcetris™, Seattle Genetics) consiste en un anticuerpo monoclonal anti-CD30 conjugado con el fármaco altamente citotóxico monometil auristatina E (MMAE) a través de la modificación de tioles de cadena lateral de cisteínas naturales. La fabricación implica la reducción parcial de los disulfuros intercatenarios expuestos al disolvente seguida de la modificación de los tioles resultantes con fármacos enlazadores que contienen maleimida. Para brentuximab vedotina, los tioles se modificaron con mc-vc-PAB-MMAE, que incorpora un sitio de escisión de la proteasa catepsina B (vc, valina-citrulina) y un enlazador de autoinmolación (PAB, paraaminobenciloxicarbonilo) entre el grupo maleimida (mc, maleimidocaproílo) y el fármaco citotóxico (MMAE). La estrategia de fijación de cisteína da como resultado un máximo de dos fármacos por disulfuro reducido. La mayoría de las moléculas de IgG humanas tienen cuatro enlaces disulfuro expuestos al disolvente, por lo que es posible un intervalo de cero a ocho fármacos por anticuerpo. El número exacto de fármacos por anticuerpo se determina por el grado de reducción de disulfuro y el número de equivalentes molares de fármaco enlazador utilizados en la reacción de conjugación consiguiente. La reducción completa de los cuatro enlaces disulfuro proporciona una construcción homogénea con ocho fármacos por anticuerpo, mientras que una reducción parcial normalmente da como resultado una mezcla heterogénea con cero, dos, cuatro, seis u ocho fármacos por anticuerpo. Brentuximab vedotina tiene un promedio de aproximadamente 4 fármacos por anticuerpo.
El otro ADC con la aprobación actual de la FDA es ado-trastuzumab emtansina (T-DM1, Kadcyla™, Roche / Genentech), que se construyó acoplando el anticuerpo monoclonal anti-HER2 trastuzumab al fármaco citotóxico maitansina mediante la modificación de las aminas de la cadena lateral de lisina. Esta versión de maitansina (DM1) se modificó para incluir un tiol que podría fijarse a un enlazador de maleimida. Un enlazador bifuncional (SMCC, succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato) con una maleimida en un extremo y un N-hidroxisuccinimidil (NHS) éster en el otro extremo se hizo reaccionar con cadenas laterales de aminas primarias de lisinas para formar una enlace amida estable. La maitansina modificada (DM1) se fijó después al anticuerpo mediante conjugación al extremo maleimida del enlazador bifuncional. A diferencia del enlazador utilizado en brentuximab vedotina, este enlazador no tiene sitio de escisión (de proteasas) y, por tanto, requiere la degradación lisosómica de la parte del anticuerpo del ADC para liberar el metabolito activo DM1-enlazador-lisina. El método de fijación dio como resultado una mezcla heterogénea de conjugados con un promedio de 3,5 fármacos por anticuerpo. En comparación con el método de cisteína descrito anteriormente, esta estrategia proporcionó una mezcla más heterogénea porque se observó que se modificaron de 20 a 40 restos de lisina, mientras que solo se modifican como máximo 8 restos de cisteína diferentes utilizando el método de modificación de cisteína natural.
Recientemente, se informó que el perfil farmacológico de los ADC se puede mejorar mediante la aplicación de tecnologías de conjugación específicas de sitio que utilizan restos de cisteína expuestos a la superficie modificados por ingeniería genética en anticuerpos que después se conjugan con un fármaco enlazador, dando como resultado ADC conjugados en sitios específicos con relaciones definidas de fármaco a anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés). En relación con las mezclas heterogéneas creadas utilizando metodologías convencionales de conjugación con lisina y cisteína, los ADC conjugados en sitios específicos generalmente han demostrado al menos una potencia equivalente in vivo, una PK mejorada y una ventana terapéutica ampliada.
El primer enfoque de conjugación de sitio específico se creó en Genentech mediante la introducción de un resto de cisteína usando mutagénesis dirigida en posiciones que mostraban una alta reactividad de tiol como se elabora en el documento WO2006/034488. Esta práctica común en la modificación de proteínas era más complicada en un anticuerpo debido a los diversos restos de cisteína natural ya presentes. La introducción del resto de cisteína adicional en una posición inadecuada podría dar como resultado la formación incorrecta de enlaces disulfuro entre cadenas y, por lo tanto, un plegamiento incorrecto del anticuerpo. Los restos de cisteína modificados por ingeniería genética en posiciones adecuadas en el anticuerpo mutado con frecuencia están protegidos terminalmente por otros tioles, tales como cisteína o glutatión, para formar disulfuros.
La fijación del fármaco a los restos mutantes se logró reduciendo tanto los disulfuros intercadena naturales como los mutantes, volviendo a oxidar después las cisteínas intercatenarias naturales usando un oxidante suave tal como CuSO4 o ácido deshidroascórbico, seguida de la conjugación convencional de la cisteína mutante liberada con un fármaco enlazador. En condiciones optimizadas, se fijarán dos fármacos por anticuerpo (si una cisteína se modifica por ingeniería genética en la cadena pesada o en la cadena ligera del mAb). El método de la cisteína modificada por ingeniería genética demostró ser adecuado para crear el ADC SGN-CD33A de sitio específico (Seattle Genetics), que se introdujo recientemente en un estudio clínico de aumento de dosis de fase I como tratamiento para la leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), así como en un ensayo clínico de fase Ib en combinación con tratamiento de referencia con quimioterapia, incluyendo citarabina y daunorrubicina. Este ADC comprende un enlazador dipeptídico escindible (es decir, valina-alanina) y un dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD) de reticulación de ADN como fármaco unido a la posición de la cadena pesada S239C en la parte Fc del mAb de IgG1 h2H12 (DAR 1.9; Sutherland et al. Blood 2013; 122(8): 1455-1463).
Mientras que en el documento WO2006/034488 se sustituyeron restos de valina, alanina y serina específicamente accesibles en la superficie, no implicados en las interacciones de unión al antígeno y distantes de los enlaces disulfuro existentes entre cadenas, para obtener restos de cisteína modificados por ingeniería genética con alta reactividad de tiol, el documento WO2014/124316 de Novartis se centra específicamente en la identificación de sitios accesibles en la superficie en las regiones constantes de las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo, sitios en los que la sustitución de un resto de cisteína permite la conjugación eficaz de cargas y proporciona conjugados con alta estabilidad.
Además de la estrategia de conjugación de cisteínas modificadas por ingeniería genética, se han creado otros métodos para la fijación de sitio específico de fármacos. Pfizer demostró una nueva técnica de conjugación que utiliza transglutaminasa microbiana para acoplar un fármaco que contiene amina a una glutamina modificada por ingeniería genética en el anticuerpo. La transglutaminasa es una enzima que cataliza la formación de enlaces amida entre el grupo acilo de una cadena lateral de glutamina y la amina primaria de una cadena lateral de lisina.
Además de la conjugación enzimática, también se ha utilizado conjugación química ortogonal para modificar en sitios específicos una amplia variedad de proteínas utilizando aminoácidos no naturales (en concreto, tecnologías de Ambrx y Sutro Biopharma). En particular, se eligieron p-acetilfenil-alanina y p-azidometil-L-fenilalanina como aminoácidos no naturales, porque ellos, respectivamente, contienen un grupo funcional cetona y uno azida que no se encuentra en ninguna de las 20 cadenas laterales de aminoácidos naturales. Esto permite la modificación específica de los grupos cetona y azida sin interferencia de otros aminoácidos. Este método proporcionó una vía adicional para construir ADC con un máximo de dos fármacos por anticuerpo (por uno de dichos aminoácidos no naturales).
En todos los métodos de la técnica anterior divulgados hasta ahora, se hizo hincapié en la conjugación de sitio específico de fármacos enlazadores en las posiciones expuestas en superficie/a disolvente, en posiciones que muestran alta reactividad de tiol y en posiciones específicamente en las regiones constantes de anticuerpos monoclonales, con el objetivo de mejorar la homogeneidad y las propiedades farmacocinéticas. Aunque los métodos convencionales de conjugación de lisina y cisteína descritos anteriormente han dado lugar a conjugados anticuerpofármaco aprobados por la FDA y se están utilizando para construir la mayoría de un gran número de ADC actualmente en ensayos preclínicos y clínicos, todavía hay una necesidad de nuevas estrategias de conjugación con el objetivo de mejorar (adicionalmente) las propiedades fisicoquímicas, farmacocinéticas, farmacológicas y/o toxicológicas de los ADC para obtener ADC que tengan propiedades aceptables de unión a antígeno, eficacia in vivo, índice terapéutico y/o estabilidad.
Breve descripción de la presente invención
El alcance de la invención se define por medio de las reivindicaciones. La presente invención se refiere a conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) en donde un fármaco enlazador derivado de duocarmicina se conjuga en sitios específicos con un anticuerpo IgG1 a través de una cisteína modificada por ingeniería genética en la posición 41 de la cadena pesada de dicho anticuerpo, y su uso en el tratamiento de tumores sólidos y neoplasias hematológicas humanos, en particular cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer urotelial, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y leucemia.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A. Identificación de posiciones de conjugación de fármaco enlazador adecuadas en la parte Fab de un anticuerpo
Figura 1b . Acoplamiento del fármaco enlazador de duocarmicina vc-seco-DUBA en la cavidad Fab de un anticuerpo (superposición de múltiples acoplamientos de vc-seco-DUBA)
Figura 1C. Identificación de posiciones de conjugación de fármaco enlazador adecuadas en la parte Fc de un anticuerpo
Figura 1D. Acoplamiento del fármaco enlazador de duocarmicina vc-seco-DUBA en la cavidad Fc de un anticuerpo (superposición de múltiples acoplamientos de vc-seco-DUBA)
Figura 2A. Eficacia in vivo del ADC (SYD1091) anti-PSMA (VH S41C) con cisteínas modificadas por ingeniería genética frente a control de vehículo, comparador de ADC (SYD1035) anti-PSMA (CH T120C) y ADC (SYD998) anti-PSMA wt (tipo silvestre, wt por sus siglas en inglés) sin modificación por ingeniería genética a 2 mg/kg cada uno
Figura 2B. Eficacia in vivo del ADC (SYD1091) anti-PSMA (VH S41C) con cisteínas modificadas por ingeniería genética frente a control de vehículo, comparador de ADC (SYD1035) anti-PSMA (CH T120C) y ADC (SYD998) anti-PSMA wt sin modificación por ingeniería genética a 10 mg/kg cada uno
Figura 3. Efecto sobre el peso corporal del ADC (SYD1091) anti-PSMA (VH S41C) con cisteínas modificadas por ingeniería genética frente a control de vehículo, comparador de ADC (SYD1035) anti-PSMA (CH T120C) y ADC (SYD998) anti-PSMA wt sin modificación por ingeniería genética a 10 mg/kg cada uno
Figura 4A. Eficacia in vivo del ADC (H8-41 C-vc-seco-DUBA) anti-5T4 (VH P41C) H8 con cisteínas modificadas por ingeniería genética frente a control del vehículo, y ADC (H8-vc-seco-DUBA) anti-5T4 wt H8 sin modificar por ingeniería genética a 3 mg/kg cada uno
Figura 4B. Eficacia in vivo del ADC (H8-41 C-vc-seco-DUBA) anti-5T4 (VH P41C) H8 con cisteínas modificadas por ingeniería genética frente a control del vehículo, y ADC (H8-vc-seco-DUBA) anti-5T4 wt H8 sin modificar por ingeniería genética a 10 mg/kg cada uno
Descripción detallada de la presente invención
Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) están surgiendo como una nueva clase de agentes terapéuticos contra el cáncer que combinan la eficacia de agentes terapéuticos de molécula pequeña con la capacidad de direccionamiento de los anticuerpos. Al combinar estos dos componentes en una única entidad molecular nueva, se pueden administrar fármacos de molécula pequeña altamente citotóxicos a los tejidos cancerosos diana, potenciando, de este modo, la eficacia a la vez que se reducen los posibles efectos secundarios tóxicos sistémicos de la molécula pequeña.
Los anticuerpos se han conjugado con una variedad de fármacos citotóxicos, incluidas moléculas pequeñas que se unen al ADN (por ejemplo, antraciclinas), ADN alquilato o reticulado (por ejemplo, dímeros de duocarmicinas o pirrolobenzodiazepina, respectivamente), causan roturas de la cadena de ADN (por ejemplo, caliqueamicinas) o alteran los microtúbulos (por ejemplo, maitansinoides y auristatinas).
La presente solicitud se refiere a un compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en donde un fármaco enlazador se conjuga en sitios específicos a un anticuerpo a través de una cisteína modificada por ingeniería genética en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionadas de la 40, 41,89 de cadena pesada (numeración de Kabat), 152, 153, 155, 171, 247, 297, 339, 375 y 376 (numeración Eu) y 40, 41 de cadena ligera (numeración Kabat), 165 y 168 (numeración Eu).
Debido a que el objetivo en un trabajo anterior sobre ADC específicos de sitio fue encontrar posiciones de conjugación que mostraran una buena reactividad con el fármaco enlazador y, al mismo tiempo, tuvieran un bajo riesgo de formar enlaces disulfuro entre los anticuerpos (lo que da lugar a la agregación) o alterar la estructura del anticuerpo. (el denominado reordenamiento de puentes disulfuro), no se han evaluado los efectos sobre la hidrofobia de los conjugados en relación con el sitio de conjugación. Además, el objetivo se ha centrado principalmente en encontrar sitios adecuados en las regiones constantes del anticuerpo, ya que generalmente se cree que la modificación de las regiones variables de un anticuerpo está asociada con un alto riesgo de pérdida parcial o completa de la unión al antígeno.
Los inventores actuales, sin embargo, se han centrado en la influencia en las características de hidrofobia de los ADC de sitio específico.
Un método in silico, empleando el paquete de programa informático YASARA (www.yasara.org, véase: Krieger et al. Proteins 2009; 77 Suppl 9: 114-122), se utilizó para identificar sitios de fuerte interacción del fármaco enlazador con el anticuerpo. Las ubicaciones adecuadas muestran un aumento mínimo en la superficie hidrófoba. En las proximidades de los sitios de interacción identificados de esta manera se identificaron restos adecuados (es decir, con suficiente accesibilidad) para convertir en cisteínas. En este enfoque no se hizo limitación a las regiones constantes del anticuerpo, también se consideraron los aminoácidos de la región variable si no estaban en las proximidades de los sitios de unión a antígeno. Las ubicaciones en el dominio variable de la parte Fab resultaron ser preferidas.
El acoplamiento de fármacos enlazadores en los modelos Fab y Fc de varios anticuerpos se simuló con el algoritmo VINA de uso común (Trott O y Olson AJ. J. Comput. Chem. 2010; 31: 455-461) como se implementa en YASARA. Los modelos de anticuerpos Fab y Fc utilizados se obtuvieron a partir de estructuras de rayos X o mediante modelado de homología utilizando YASARA.
Los fármacos enlazadores de tipo duocarmicina, por ejemplo, vc-seco-DUBA (es decir, SYD980; un compuesto de ADC del mismo se representa en la fórmula II), demostraron tener una fuerte preferencia por la unión en cavidades que están presentes en todas las estructuras de anticuerpos (véanse las figuras 1B y 1D para la parte Fab y Fc de un anticuerpo, respectivamente). Se identificaron múltiples posiciones de conjugación adecuadas para la fijación del fármaco enlazador en estas cavidades y en sus proximidades, es decir, con buena accesibilidad de cisteínas modificadas por ingeniería genética en estas ubicaciones (véanse las figuras 1A y 1C para la parte Fab y Fc de un anticuerpo, respectivamente).
En el contexto de la presente invención, la numeración de Kabat se usa para indicar las posiciones de los aminoácidos de las cisteínas modificadas por ingeniería genética en las regiones variables de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) y la numeración Eu se usa para indicar las posiciones en las regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo. En vista de la variabilidad de secuencia en las regiones variables de los anticuerpos, el aminoácido exacto que se sustituirá por cisteína puede ser diferente para diferentes anticuerpos. Para la mayoría de los anticuerpos, en particular anticuerpos IgG, en la cadena pesada de la región variable (VH), generalmente hay una A o S en la posición 40, una P en la posición 41 y una V en la posición 89 y en la cadena ligera de la región variable (VL), generalmente hay una P en la posición 40 y una G en la posición 41. En la cadena pesada de las regiones constantes (CH1, CH2 y CH3), normalmente hay una E en la posición 152, una P en la posición 153, una T en la posición 155, una P en la posición 171, una P en la posición 247, una N en la posición 297, una A en la posición 339, una S en la posición 375 y una D en la posición 376 y en la cadena ligera de la región constante k (CL), normalmente hay una E en la posición 165 y una S en la posición 168. En las cinco regiones constantes de isotipo de cadena ligera A (CL), normalmente hay una S en la posición 165 y una S en la posición 168.
La expresión "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración utilizado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en, una región marco (FR) o una región determinante de la complementariedad (CDR) del dominio variable. La numeración de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".
La expresión "numeración Eu" se refiere al índice Eu como en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., publicación NIH n.° 91 -3242, págs. 662, 680, 689 (1991). El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de restos del anticuerpo EU de lgG1 humana (Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63, 78-85 (1969)).
Las posiciones 40, 41 y 89 de cadena pesada están ubicadas en la región variable y las posiciones 152, 153, 155, 171,247, 297, 339, 375 y 376 están ubicadas en la región constante del anticuerpo. Las posiciones 40 y 41 de cadena ligera están ubicadas en la región variable y las posiciones 165 y 168 están ubicadas en la región constante del anticuerpo.
Las posiciones 40, 41,89, 152, 153, 155 y 171 de cadena pesada y las posiciones 40, 41, 165 y 168 de cadena ligera están ubicadas en la parte Fab y las posiciones 247, 297, 339, 375 y 376 de cadena pesada están ubicadas en la parte Fc del anticuerpo.
De acuerdo con la presente invención, la expresión "cisteína modificada por ingeniería genética" significa reemplazar un aminoácido que no es cisteína en la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo por una cisteína. Tal como es conocido por el experto en la materia, esto se puede realizar a nivel de aminoácidos o a nivel de ADN, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los compuestos de ADC conjugados en sitios específicos de la presente invención muestran propiedades fisicoquímicas, farmacológicas y/o farmacocinéticas mejoradas, en comparación con los ADC en donde el fármaco enlazador se conjuga a través de enlaces disulfuro intercatenarios naturales del anticuerpo y, asimismo, en comparación con los ADC con cisteínas modificadas por ingeniería genética en donde el fármaco enlazador se conjuga en las posiciones divulgadas en la técnica anterior de las divulgadas o reivindicadas específicamente en la presente solicitud de patente. Los compuestos de ADC de acuerdo con la presente invención tienen propiedades de unión similares a las de los anticuerpos desnudos, buena eficacia in vivo, un índice terapéutico aumentado y/o una estabilidad mejorada. De manera destacable, se observó que los compuestos de ADC son generalmente menos hidrófobos y menos susceptibles a la escisión de catepsina B y, por lo tanto, es probable que también a otras enzimas/proteasas intra o extracelulares en la masa tumoral (microambiente tumoral) que los ADC que se conjugan en sitios específicos en diferentes posiciones, pero muestran una citotoxicidad in vitro similar. De manera inesperada, los ADC de acuerdo con la presente invención muestran eficacia in vivo mejorada en un modelo animal de xenoinjerto de tumor en comparación con los ADC que se conjugan en sitios específicos en otras posiciones.
Sin pretender quedar ligados a teoría alguna, los presentes inventores han observado que cuando los fármacos enlazadores se conjugan en las posiciones específicas del anticuerpo como se divulga en el presente documento, dicho fármaco enlazador encaja en la cavidad Fab que está formada por los dominios CH1, VH, VL y CL del anticuerpo o en la cavidad Fc que está formada por los dos dominios CH2 y dos CH3 del anticuerpo. En un anticuerpo IgG1, la parte superior de la cavidad Fc está formada por el glucósido/carbohidrato que está fijado a la posición N297 de la cadena pesada. Como resultado, el fármaco enlazador (que normalmente es más hidrófobo que el anticuerpo) está protegido del entorno acuoso hidrófilo que rodea al anticuerpo y el ADC como tal es menos hidrófobo en comparación con los ADC en donde el fármaco enlazador se conjuga a través de enlaces disulfuro naturales del anticuerpo y es mucho menos hidrófobo en comparación con los ADC en donde el fármaco enlazador se conjuga en sitios específicos en diferentes posiciones que no se divulgan o reivindican en el presente documento y donde el fármaco enlazador se fuerza al exterior del anticuerpo, es decir, apunta en una dirección alejada del anticuerpo.
Generalmente se evita la modificación de la parte variable de un anticuerpo, ya que puede dar lugar a una pérdida parcial o completa de las propiedades de unión al antígeno. Sin embargo, al contrario de las expectativas generales, se observó que los restos específicos en las regiones marco de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo son tanto adecuados para la conjugación como no dan lugar a una reducción (significativa) de la unión del antígeno después de la conjugación del fármaco enlazador. Por lo tanto, la presente solicitud se refiere a un compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) en donde dicha cisteína modificada por ingeniería genética está en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionadas entre la 40, 41 y 89 de cadena pesada y 40 y 41 de cadena ligera en la parte Fab de dicho anticuerpo. Preferentemente, dicha cisteína modificada por ingeniería genética está en la posición 40 o 41 de la cadena pesada y/o en la posición 40 o 41 de la cadena ligera, más preferentemente en la posición 41 de la cadena pesada y/o en la posición 40 o 41 de la cadena ligera. De acuerdo con la presente invención, dicha cisteína modificadas por ingeniería genética está en la posición 41 de la cadena pesada. Como se sabe por la bibliografía que las proteasas asociadas a tumores en el microambiente tumoral pueden escindir parcialmente los dominios constantes Fc, debajo de la región bisagra, se prefiere la conjugación en la parte Fab a la conjugación en la parte Fc. La escisión de los dominios constantes Fc daría como resultado la pérdida de fármacos enlazadores conjugados con Fc, que a su vez podría dar lugar a una disminución de la actividad del ADC in vivo. (Fan et al. Breast Cancer Res. 2012; 14: R116 y Brezsky et al. PNAS 2009; 106: 17864-17869). Asimismo, la conjugación a estas posiciones en la parte Fab también permite el uso de fragmentos de unión a antígeno.
En una realización específica, el compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) puede comprender además una cisteína modificada por ingeniería genética adicional en una o más posiciones del anticuerpo seleccionadas de 152, 153, 155, 171,339 de cadena pesada y 375 y 165 y 168 de cadena ligera. Preferentemente, dicha cisteína modificada por ingeniería genética adicional está en la posición 375 de cadena pesada en la parte Fc de dicho anticuerpo.
De acuerdo con la presente invención, el uno o más restos de cisteína se pueden modificadas por ingeniería genética en el anticuerpo mediante el uso de técnicas de clonación molecular convencionales o los dominios de cadena pesada o de cadena ligera del anticuerpo que lleva la o las mutaciones de cisteína se pueden sintetizar como tales utilizando equipos y procedimientos de síntesis (péptido o ADN ) conocidos.
Cualquier fármaco enlazador conocido en la técnica de los ADC se puede utilizar para la conjugación de sitio específico con un anticuerpo, siempre que tenga un grupo químico que pueda reaccionar con el grupo tiol de una cisteína modificada por ingeniería genética, normalmente un grupo maleimida o haloacetilo. Los fármacos enlazadores adecuados pueden comprender un dímero de duocarmicina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepina (PBD), derivado de maitansinoide o auristatina como fármaco citotóxico. Puede utilizarse un enlazador escindible o no escindible. Ejemplos adecuados de fármacos maitansanoides incluyen DM1 y DM4. Ejemplos adecuados de fármacos de auristatina incluyen MMAE y MMAF.
Estas abreviaturas son bien conocidas por los expertos en la materia. Ejemplos de fármacos enlazadores adecuados conocidos por los expertos en la materia incluyen mc-vc-PAB-MMAE (también abreviado como mc-vc-MMAE y vc-MMAE), mc-MMAF y mc-vc-MMAF. Preferentemente, el enlazador utilizado es un enlazador escindible, tal como valina-citrulina (vc) o valina-alanina (va).
Las estructuras moleculares genéricas de un ADC de vc-MMAE y un ADC de mc-MMAF se muestran a continuación.
Figure imgf000007_0001
Estructura molecular de vc-MMAE unido a un mAb
Figure imgf000007_0002
Estructura molecular de mc-MMAF unido a un mAb
De acuerdo con la presente invención, el fármaco enlazador en el compuesto de ADC de la invención comprende un derivado de duocarmicina.
Las duocarmicinas, aisladas primero a partir de un caldo de cultivo de especies de Streptomyces, son miembros de una familia de antibióticos antitumorales que incluyen duocarmicina A, duocarmicina SA y CC-1065. Estos agentes extremadamente potentes supuestamente obtienen su actividad biológica de la capacidad de alquilar ADN de forma selectiva de secuencia en la posición N3 de adenina en el surco menor, lo que inicia una cascada de eventos que acaba en un mecanismo de muerte celular apoptótica.
El documento WO2011/133039 divulga una serie de fármacos enlazadores que comprenden un derivado de duocarmicina de CC-1065. Derivados de enlazador-duocarmicina adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención se divulgan en las páginas 182-197. La síntesis química de varios de estos fármacos enlazadores se describe en los ejemplos 1-12 del documento WO2011/133039.
En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000007_0003
en donde
n es 0-3, preferentemente 0-1,
m representa una DAR promedio de 1 a 6, preferentemente de 1 a 4,
R1 se selecciona de
Figure imgf000008_0001
y es 1-16, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000008_0002
En las fórmulas estructurales de la presente memoria descriptiva, n representa un número entero de 0 a 3, mientras que m representa una relación de fármaco a anticuerpo (DAR, por sus siglas en inglés) promedio de 1 a 6. Tal como se conoce bien en la técnica, se puede determinar la DAR y la distribución de carga de fármaco, por ejemplo, mediante el uso de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés) o cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC). HIC es particularmente adecuado para determinar la DAR promedio.
Los compuestos de fórmula (I) de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse de acuerdo con métodos y procedimientos que son bien conocidos por un experto en la materia. Los métodos adecuados para conjugar fármacos enlazadores en sitios específicos se pueden encontrar, por ejemplo, en los ejemplos 7 y 8 del documento WO2005/084390, que describen estrategias de reducción completas para la carga (parcial) de anticuerpos con el fármaco enlazador vc-MMAE, en los ejemplos 11 y 12 del documento WO2006/034488, que describen la conjugación de sitio específico de un fármaco enlazador que comprende maitansina (DM1), y en Doronina et al. Bioconjugate Chem. 17 (2006): 114-124, que describe la conjugación con mc-MMAF.
La conjugación con dos o más de los sitios con cisteínas modificadas por ingeniería genética de la presente invención permite la preparación de ADC que comprenden clases de fármacos hidrófobos con una DAR superior, en concreto DAR 4, sin obtener demasiado agregado.
De acuerdo con la solicitud, se pueden incorporar una o dos cisteínas modificadas por ingeniería genética en la cadena pesada y/o cadena ligera del anticuerpo, en condiciones de reacción óptimas que dan como resultado un compuesto de ADC que tiene una DAR de 2 o 4, respectivamente. Cuando se introduce una cisteína modificada por ingeniería genética, puede ubicarse bien en la parte Fab o Fc del anticuerpo. Se prefiere introducir dicha cisteína en la parte Fab del anticuerpo en la posición HC 40, 41, 89, 152 o 153 o LC 40, 41 o 165, preferentemente en HC 40, 41 u 89 o LC 40, 41 o 165, más preferentemente y en HC 40 o 41 o LC 40 o 41, incluso más preferentemente en HC 41 o LC 40 o 41, lo más preferentemente en HC 41. Cuando se introducen dos cisteínas modificadas por ingeniería genética, estas dos cisteínas pueden estar ubicadas en la parte Fab o Fc del anticuerpo o, preferentemente, una puede estar en la parte Fab, preferentemente en HC 40, 41, 152 o 153 o LC 40, 41 o 165, más preferentemente y en HC 40 o 41 o LC 40 o 41, incluso más preferentemente en HC 41 o LC 40 o 41, lo más preferentemente en HC 41 y la otra puede estar en la parte Fc del anticuerpo, preferentemente en HC 247, 297, 339 o 375, más preferentemente en HC 339 o 375, lo más preferentemente en HC 375. Cuando se introducen dos cisteínas modificadas por ingeniería genética en la parte Fab del anticuerpo, se puede introducir un resto de cisteína en la cadena pesada y la otra cisteína se introduce en la cadena ligera del anticuerpo, por ejemplo, en HC 40 o 41 y en LC 40 o 41. Además, cuando se introducen dos cisteínas modificadas por ingeniería genética en la parte Fab del anticuerpo, se puede introducir un resto de cisteína en una de las posiciones específicas identificadas en la presente invención, por ejemplo, HC 40 o 41 o LC 40 o 41 y la otra puede estar ubicada en una posición de cisteína modificada por ingeniería genética expuesta a la superficie (es decir, no reivindicada en el presente documento) que da lugar a una DAR más alta y una hidrofobia todavía aceptable.
En una realización particular, la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula (I) como se divulga anteriormente en el presente documento, en donde n es 0-1, m representa una DAR promedio de 1 a 6, preferentemente de 1 a 4, más preferentemente de 1 a 2, lo más preferentemente de 1,5 a 2,
R1 se selecciona de
Figure imgf000009_0001
y es 1-16, preferentemente 1-4, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000009_0002
En una realización específica, la presente invención se refiere a un compuesto de la fórmula estructural (I) como se divulga anteriormente en el presente documento, en donde n es 0-1, m representa una DAR promedio de 1,5 a 2, R1 es
Figure imgf000009_0003
y es 1-4 y R2 se selecciona de
Figure imgf000009_0004
En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (II)
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Cualquier anticuerpo, particularmente cualquier anticuerpo que se sepa que tiene actividad terapéutica o cualquier anticuerpo conocido en la técnica de los ADC, o cualquier fragmento de unión a antígeno del mismo puede utilizarse para la conjugación de sitio específico de un fármaco enlazador en las posiciones de anticuerpos específicas reivindicadas en el presente documento. Dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. Dicho anticuerpo puede tener cadenas ligeras k (kappa) o cadenas ligeras A (lambda). Dicho anticuerpo IgG puede ser un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. Preferentemente, el anticuerpo se une a una diana antigénica que se expresa en o sobre la membrana celular (p. ej., en la superficie celular) de una célula tumoral, más preferentemente, el anticuerpo es internalizado por la célula después de unirse a la diana (antígeno), después de lo cual la toxina se libera intracelularmente. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, lo más preferentemente un anticuerpo IgG1 que tiene cadenas ligeras k. Preferentemente, el anticuerpo IgG1 lleva un resto glucósido/carbohidrato natural unido a N297 de la cadena pesada del anticuerpo.
Los anticuerpos adecuados incluyen un anticuerpo antianexinaA1, un anticuerpo anti-CD 19, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo anti-CD30, un anticuerpo anti-CD33, un anticuerpo anti-CD37, un anticuerpo anti-CD38, un anticuerpo anti-CD44, un anticuerpo anti-CD47, un anticuerpo anti-CD56, un anticuerpo anti-CD70, un anticuerpo anti-CD74, un anticuerpo anti-CD79, un anticuerpo anti-CD115, un anticuerpo anti-CD 123, un anticuerpo anti-CD 138, un anticuerpo anti-CD203c, un anticuerpo anti-CD303, un anticuerpo anti-CEACAM, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-c-MET (o anti-HGFR), un anticuerpo anti-Cripto, un anticuerpo anti-DLL3, un anticuerpo anti-EGFR, un anticuerpo anti-EPCAM, un anticuerpo anti-EphA2, un anticuerpo anti-EphB3, un anticuerpo anti-ETBR, un anticuerpo anti-FcRL5, un anticuerpo anti-FOLRI, un anticuerpo anti-GCC, un anticuerpo anti-GPNMB, un anticuerpo anti-Her2, un anticuerpo anti-HMW-MAA, un anticuerpo contra integrina, un anticuerpo anti-Lewis A de tipo carbohidrato, un anticuerpo anti-Lewis Y, un anticuerpo anti-LIV 1, un anticuerpo contra mesotelina, un anticuerpo anti-MN, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-MUC16, un anticuerpo anti-NaPi2b, un anticuerpo anti-nectina-4, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-SIRPa, un anticuerpo anti-SLC44A4, un anticuerpo anti-STEAP-1, un anticuerpo anti-5T4 (o anti-TPBG, glucoproteína trofoblasto), un anticuerpo anti-Tag72, un anticuerpo anti-TF (o antifactor tisular), anticuerpo anti-TROP2, y un anticuerpo anti-VLA.
Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo antianexinaA1, un anticuerpo anti-CD 115, un anticuerpo anti-CD123, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-MET, un anticuerpo anti-MUCl, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-5T4 o un anticuerpo anti-TF. Más preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-PSMA o un anticuerpo anti-5T4.
El anticuerpo que se utilizará de acuerdo con la presente invención es preferentemente un anticuerpo monoclonal (mAb) y puede ser un mAb quimérico, humanizado o humano. Más preferentemente, de acuerdo con la presente invención se utiliza un mAb humanizado o humano. Preferentemente, dicho anticuerpo tiene cadenas ligeras k (kappa), es decir, un anticuerpo IgG1-K humanizado o humano.
En anticuerpos humanizados, las CDR de unión a antígeno en las regiones variables derivan de anticuerpos de una especie no humana, comúnmente ratón, rata o conejo. Estas CDR no humanas se colocan dentro de un marco humano (FR1, FR2, FR3 y FR4) de la región variable y se combinan con regiones constantes humanas. Como los anticuerpos humanos, estos anticuerpos humanizados pueden numerarse de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. La presente solicitud se refiere particularmente a un compuesto de ADC en donde dicha cisteína modificada por ingeniería genética está en una posición seleccionada de VH 40, VH 41, VH 89, VL 40 o VL 41 en el marco humano (es decir, VH 40, VH 41, VL 40 y VL 41 están en el medio de FR2, VH 89 está en FR3) de un anticuerpo humanizado, más particularmente en VH 40, VH 41, VL 40 o VL 41, incluso más particularmente en VH 41, VL 40 o VL 41, especialmente en VH 41.
De acuerdo con la solicitud, estos restos específicos en las regiones marco son tanto adecuados para la conjugación de un fármaco enlazador como no dan lugar a una reducción significativa de las propiedades de unión al antígeno del anticuerpo después de la conjugación del fármaco enlazador. Asimismo, estos sitios no solo son adecuados en anticuerpos, sino también en cualquier fragmento de unión a antígeno de los mismos.
En una realización particular, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo antianexina A1, un anticuerpo anti-CD 115, un anticuerpo anti-CD 123, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-MET, un anticuerpo anti-MUC1, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-5T4 o un anticuerpo anti-TF y dicho fármaco enlazador comprende un derivado de duocarmicina, preferentemente un compuesto de ADC de acuerdo con la fórmula (I) o (II).
En una realización particular adicional, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo (monoclonal) anti-PSMA o un anticuerpo (monoclonal) anti-5T4 y dicho fármaco enlazador comprende un derivado de duocarmicina, preferentemente un compuesto de ADC de acuerdo con la fórmula (I) o (II).
Los anticuerpos anti-PSMA adecuados se describen en los documentos WO98/03873 (p. ej., ejemplo 12), WO02/098897 (p. ej., Figuras 1-2), WO2007/002222 (por ejemplo, TABLA 1) y WO2011/069019 (por ejemplo, figura 2). Los anticuerpos anti-5T4 adecuados incluyen h 8, que se describe en el documento WO2006/031653, y los anticuerpos A1 y A3 que se describen en el documento WO2007/106744, así como cualquier anticuerpo que se una al mismo epítopo que estos anticuerpos conocidos.
En una realización preferida, la cadena pesada del anticuerpo anti-PSMA comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera del anticuerpo anti-PSMA comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Más preferentemente, la cadena pesada del anticuerpo anti-PSMA comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y la cadena ligera del anticuerpo anti-PSMA comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6.
En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC de fórmula (II), en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-PSMA, comprendiendo la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-PSMA la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y comprendiendo la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-PSMA la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. Más preferentemente, la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-PSMA comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 y la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-PSMA comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6.
En otra realización preferida, la cadena pesada del anticuerpo anti-5T4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y la cadena ligera del anticuerpo anti-5T4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. Más preferentemente, la cadena pesada del anticuerpo anti-5T4 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 y la cadena ligera del anticuerpo anti-5T4 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 6.
En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC de fórmula (II), en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-5T4, comprendiendo la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-5T4 la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y comprendiendo la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-5T4 la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11. Más preferentemente, la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-5T4 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9 y la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-5T4 comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO:6.
La presente invención además se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento para su uso como medicamento.
En una realización, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento para su uso en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos humanos.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento para su uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos seleccionados del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer urotelial (por ejemplo, cáncer de vejiga), cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón no microcítico y cáncer de pulmón microcítico), mesotelioma (especialmente mesotelioma pleural maligno), cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento, particularmente un compuesto que comprende un anticuerpo anti-PSMA (monoclonal) y un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, para su uso en el tratamiento de cáncer de próstata.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento, particularmente un compuesto que comprende un anticuerpo anti-5T4 (monoclonal) y un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, para su uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos seleccionados del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por sus siglas en inglés) y cáncer de pulmón microcítico (SCLC, por sus siglas en inglés)) y mesotelioma pleural maligno.
En una realización adicional más, la presente invención se refiere a un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento para su uso en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas humanas, particularmente leucemia, seleccionada del grupo que consiste en leucemia linfoblástica y mieloide agudas (ALL y AML, por sus siglas en inglés, respectivamente).
La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de ADC como se describe anteriormente en el presente documento y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones farmacéuticas típicas de proteínas terapéuticas, tal como los anticuerpos monoclonales y los conjugados anticuerpo (monoclonal)-fármaco, adoptan la forma de tortas liofilizadas (polvos liofilizados), que requieren disolución (acuosa) (es decir, reconstitución) antes de la infusión intravenosa, o soluciones congeladas (acuosas), que requieren descongelación antes de su uso.
Normalmente, la composición farmacéutica se presenta en forma de torta liofilizada. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para su inclusión en la composición farmacéutica (antes de la liofilización) de acuerdo con la presente invención incluyen soluciones tampón (por ejemplo, sales que contienen citrato, histidina o succinato en agua), lioprotectores (por ejemplo, sacarosa, trehalosa), modificadores de tonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio), tensioactivos (por ejemplo, polisorbato) y agentes de carga (por ejemplo, manitol, glicina). Los excipientes utilizados para las formulaciones de proteínas liofilizadas se seleccionan por su capacidad para prevenir la desnaturalización de las proteínas durante el proceso de liofilización, así como durante el almacenamiento. Como ejemplo, la formulación en polvo liofilizado estéril de un solo uso de Kadcyla™ (Roche) contiene, tras la reconstitución con agua bacteriostática o estéril para inyección (BWFI o SWFI, por sus siglas en inglés), 20 mg/ml de ado-trastuzumab emtansina, polisorbato 20 al 0,02 % p/v, succinato de sodio 10 mM y sacarosa al 6 % p/v con un pH de 5,0.
La presente invención también se refiere al uso de un compuesto o una composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento para el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos humanos como se describe anteriormente en el presente documento.
La presente invención se refiere además al uso de una combinación administrada secuencial o simultáneamente de un compuesto o una composición farmacéutica como se describe anteriormente en el presente documento con un anticuerpo terapéutico y/o un agente quimioterapéutico, para el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos humanos como se describe anteriormente en el presente documento.
En una realización de la presente invención, el anticuerpo terapéutico es adecatumumab, alemtuzumab, amatuximab, bevacizumab, cetuximab, denosumab, etaracizumab, farletuzumab, gemtuzumab, labetuzumab, mapatumumab, minretumomab, nimotuzumab, nivolumab, oregovomab, panitumumab, pemtumomab, pertuzumab, ramucirumab, sibrotuzumab, trastuzumab o volociximab y el agente quimioterapéutico es i) un agente alquilante, particularmente mostazas nitrogenadas, tal como mecloretamina, clorambucilo, ciclofosfamida, ifosfamida y melfalán, nitrosoureas, tal como estreptozocina, carmustina y lomustina, alquilsulfonatos, tal como busulfán, triazinas, tal como dacarbazina y temozolomida, etileniminas, tal como tiotepa y altretamina, o fármacos de platino, tal como cisplatino, carboplatino y oxaliplatino, ii) un antimetabolito, particularmente 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, capecitabina, citarabina, floxuridina, fludarabina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato o pemetrexed, iii) un antibiótico antitumoral, particularmente daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, actinomicina D, bleomicina, mitomicina-C o mitoxantrona, iv) un inhibidor de topoisomerasas, en particular inhibidores de la topoisomerasa I, tales como topotecán e irinotecán, o inhibidores de la topoisomerasa II, tales como etopósido, tenipósido y mitoxantrona, v) un inhibidor mitótico, particularmente taxanos, tales como paclitaxel, cabazitaxel y docetaxel, epotilonas, tal como ixabepilona, alcaloides de la vinca, tales como vinblastina, vincristina y vinorelbina, o estramustina, vi) un inhibidor de la cascada de señalización, particularmente inhibidores de mTOR (diana de rapamicina en mamíferos), tal como temsirolimus y everolimus, o inhibidores de tirosina cinasas, tal como gefitinib, erlotinib, imatinib, pazopanib, ceritinib, crizotinib, lapatinib y afatinib, vii) un corticosteroide, particularmente prednisona, metilprednisolona o dexametasona, viii) un agente terapéutico hormonal, particularmente agentes moduladores de receptores de andrógenos, tales como bicalutamida, enzalutamida y acetato de abiraterona, antiestrogénicos, tales como tamoxifeno o agentes inhibidores de la aromatasa o modificadores de esteroides, tales como anastrozol, letrozol, fulvestrant y exemestano, ix) un inhibidor de PARP, particularmente olaparib o x) otro fármaco de quimioterapia, particularmente L-asparaginasa o bortezomib. El experto en la materia no tendrá dificultad en seleccionar terapias de combinación adecuadas para su uso en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos humanos como se describe anteriormente en el presente documento.
En otra realización de la presente invención, particularmente en el caso de un compuesto de ADC anti-PSMA que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es bevacizumab, denosumab, pertuzumab o trastuzumab y el agente quimioterapéutico es un inhibidor de la topoisomerasa II, particularmente mitoxantrona, un inhibidor mitótico, particularmente un taxano, más particularmente cabazitaxel o docetaxel, un corticoesteroide, particularmente prednisona o un agente terapéutico hormonal, particularmente un agente modulador de receptores de andrógenos, más particularmente enzalutamida o acetato de abiraterona.
En otra realización más de la presente invención, particularmente en el caso de un compuesto de ADC anti-5T4 que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es bevacizumab, cetuximab, nivolumab o ramucirumab y el agente quimioterapéutico es un agente alquilante, particularmente un fármaco de platino, más particularmente cisplatino o carboplatino, un antimetabolito, particularmente gemcitabina o pemetrexed, un inhibidor de la topoisomerasa II, particularmente etopósido, un inhibidor mitótico, particularmente un taxano o un alcaloide de la vinca, más particularmente paclitaxel o docetaxel, o vinblastina o vinorelbina, o un inhibidor de la cascada de señalización, particularmente un inhibidor de tirosina cinasas, más particularmente erlotinib, ceritinib, crizotinib o afatinib.
En una realización adicional de la presente invención, particularmente en el caso de un compuesto de ADC anti-5T4 que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es bevacizumab y el agente quimioterapéutico es un agente alquilante, particularmente una mostaza nitrogenada, un fármaco de platino o una triazina, más particularmente ciclofosfamida, ifosfamida, cisplatino o temozolomida, un antibiótico antitumoral, particularmente doxorrubicina, un antimetabolito, particularmente gemcitabina, un inhibidor de la topoisomerasa I o II, particularmente topotecán, irinotecán o etopósido, o un inhibidor mitótico, particularmente un taxano o un alcaloide de la vinca, más particularmente paclitaxel o docetaxel o vincristina o vinorelbina.
En una realización adicional más de la presente invención, particularmente en el caso de un compuesto de ADC anti-5T4 que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es amatuximab y el agente quimioterapéutico es un agente alquilante, particularmente un fármaco de platino, más particularmente cisplatino o carboplatino, un antimetabolito, particularmente gemcitabina o pemetrexed, o un inhibidor mitótico, particularmente un alcaloide de la vinca, más particularmente vinorelbina.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos de acuerdo con la presente invención se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, particularmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, más particularmente en el intervalo de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Este último intervalo corresponde aproximadamente a una dosis fija en el intervalo de 20 a 800 mg del compuesto de ADC. El compuesto de la presente invención puede administrarse semanal, quincenal, trimestral o mensualmente, por ejemplo, semanalmente durante las primeras 12 semanas y después cada tres semanas hasta la progresión de la enfermedad. Se pueden usar regímenes de tratamiento alternativos dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad del paciente, el compuesto que se va a administrar y otros factores que considere el médico responsable.
Ejemplos
Expresión transitoria de anticuerpos con cisteínas modificadas por ingeniería genética (mutantes)
la ) Preparación de ADNc
La secuencia de ADNc para la cadena pesada se obtuvo a partir de las secuencias de aminoácidos de una secuencia líder (SEQ ID NO: 1), la región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-PSMA (SEQ ID NO: 2, numeración de Kabat, que tiene un resto de cisteína en la posición 41) y la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 3, numeración secuencial, numeración Eu que comienza en alanina 118) mediante la retrotraducción de las secuencias de aminoácidos combinadas en una secuencia de ADNc optimizada para la expresión en células humanas. (Homo sapiens) (SEQ ID NO: 4).
De forma análoga, la secuencia de ADNc para la cadena ligera se obtuvo a partir de las secuencias de aminoácidos de una señal de secreción (SEQ ID NO: 1), la región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-PSMA (SEQ ID NO: 5, numeración de Kabat), y la región constante de la cadena ligera de Ig k humana (SEQ ID NO: 6, numeración secuencial) mediante la retrotraducción de las secuencias de aminoácidos combinadas en una secuencia de ADNc optimizada para la expresión en células humanas (Homo sapiens) (SEQ ID NO: 7).
De forma análoga, la secuencia de ADNc para la cadena pesada del anticuerpo anti-5T4 H8-HC41 (SEQ ID NO: 10) se obtuvo a partir de las secuencias de aminoácidos de una secuencia líder (SEQ ID NO: 1), la región variable de cadena pesada del anticuerpo H8 (SEQ ID NO: 8, numeración secuencial, que tiene un resto de cisteína en la posición 41) y la región constante de cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 9, numeración secuencial, numeración Eu que comienza en Alanina 118).
La secuencia de ADNc para la cadena ligera del anticuerpo H8 (SEQ ID NO: 12) se obtuvo a partir de las secuencias de aminoácidos de una secuencia líder (SEQ ID NO: 1), la región variable de cadena ligera del anticuerpo H8 (SEQ ID NO: 11, Numeración de Kabat) y la región constante de cadena ligera de Ig k humana (SEQ ID NO: 6, numeración secuencial).
La secuencia de ADNc para la cadena pesada de natalizumab (SEQ ID NO: 16) se obtuvo a partir de las secuencias de aminoácidos de una secuencia líder (SEQ ID NO: 13), la región variable de cadena pesada de natalizumab (SEQ ID NO: 14, numeración de Kabat) y la región constante de cadena pesada de IgG4 humana (SEQ ID NO: 15, numeración secuencial, numeración Eu que comienza en alanina 118; que tiene un resto de prolina en la posición 225 y un resto de cisteína en la posición 375).
La secuencia de ADNc para la cadena ligera del natalizumab (SEQ ID NO: 19) se obtuvo a partir de las secuencias de aminoácidos de una secuencia líder (SEQ ID NO: 17), la región variable de cadena ligera natalizumab (SEQ ID NO: 18, Numeración de Kabat) y la región constante de cadena ligera de Ig k humana (SEQ ID NO: 6, numeración secuencial).
Las construcciones de ADNc de cadena pesada y cadena ligera se sintetizaron de forma química y se obtuvieron de una fuente comercial (Life Technologies). La escisión de la secuencia líder correspondió al sitio de escisión predicho usando el programa SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).
lb ) Estrategia de construcción y clonación de vectores
Para la expresión de las cadenas de anticuerpos, el vector de expresión de mamíferos 0098 se construyó de la siguiente manera. El casete de expresión CMV:BGHpA se escindió del plásmido pADNc3.1 (-) (Life Technologies) y se volvió a insertar en el mismo vector original (que aún contenía un casete de expresión CMV:BGHpA intacto), duplicando, de este modo, el casete de expresión CMV:BGHpA, para permitir la expresión de ADNc tanto de HC como de LC a partir de un único vector plasmídico. Posteriormente, se aisló un fragmento de IRES-DHFR del vector pOptiVEC-TOPO (Life Technologies) y se insertó entre el promotor de CMV y la secuencia de poliadenilación de BGHpA en uno de los casetes de expresión CMV:BGHpA.
Los ADNc para la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) se unieron en los vectores plásmidos pMA-RQ y pMA T (Life Technologies), respectivamente, utilizando sitios de restricción de Sfil. Después de la transferencia a E. coli K12 y la expansión, el ADNc de LC se transfirió al vector de expresión de mamífero 0098 usando sitios de restricción de AscI y HpaI. El vector resultante se digirió con las enzimas de restricción BamHI y NheI y se unió con el fragmento de ADNc de HC, digerido con las mismas enzimas de restricción. El vector final, que contenía tanto los casetes de expresión de HC como de LC (CMV:HC:BGHpA y CMV:LC-BGHpA, respectivamente) se transfirió y expandió en células E. coli NEB 5-alfa (New England Biolabs).
La producción a gran escala del vector de expresión mutante de anticuerpo final para la transfección se realizó utilizando los kits Maxi o Megaprep (Qiagen).
2) Expresión transitoria en células de mamíferos
Se transfectaron células Expi293F disponibles comercialmente (Life Technologies) con el vector de expresión mutante de anticuerpo preparado en 1) anterior utilizando el agente de transfección ExpiFectamine (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la siguiente manera: se sembraron 75 x 107 células en 300 ml de medio de expresión Expi293; se combinaron 300 gg del vector de expresión mutante de anticuerpo con 800 gl de agente de transfección ExpiFectamine y se añadieron a las células. Un día después de la transfección, se añadieron al cultivo 1,5 ml de potenciador 1 y 15 ml de potenciador 2. Seis días después de la transfección, el sobrenadante del cultivo celular se recogió mediante centrifugación a 4.000 g durante 15 minutos y se filtró la fracción recogida aclarada sobre filtros MF 75 (Nalgene).
3) Purificación de proteínas expresadas
Las fracciones recogidas aclaradas se verificaron primero en el nivel de expresión usando electroforesis SDS-PAGE. Como la producción se consideró adecuada, los anticuerpos se purificaron utilizando resina de proteína A disponible comercialmente (MabSelect SuRe, GE Healthcare), utilizando equipo cromatográfico Ákta (GE Healthcare). Se utilizó una columna de lecho de 20 cm de altura con una carga máxima de resina empaquetada de 25 mg/ml. El proceso se realizó a TA.
Después del equilibrio (PBS pH 7,4) y la carga, la etapa de purificación empleó dos etapas de lavado (PBS pH 7,4 y NaAc pH 5, respectivamente) y una etapa de elución (NaAc 25 mM, pH 3) seguida de una etapa de regeneración, aclarado y limpieza, respectivamente, antes de que se iniciara un nuevo ciclo. Durante la etapa de elución, la proteína diana se recogió en un pico comenzando y parando a una absorbancia de 0,05-0,1 AU (0,2 cm de longitud celular). Después de la purificación, la proteína se almacenó entre -20 0C y -80 0C.
4) Concentración e intercambio de tampón al tampón de conjugación de ADC
Los eluatos de proteína A se concentraron, si era necesario, a 20-25 mg/ml utilizando dispositivos de centrifugación Vivaspin (corte de 5 o 30 kDa, Vivaproducts). Después de obtener las concentraciones deseadas, las soluciones concentradas (normalmente 25 mg/ml) se dializaron dos veces usando columnas PD10 (GE Healthcare) y tampón de L-Histidina 4,2 mM tampón de trehalosa 50 mM, pH 6,0. Como alternativa, cuando las concentraciones de eluato de proteína A eran de aproximadamente 10 mg/ml, no se empleó ninguna etapa de concentración y el eluato se dializó inmediatamente tres veces usando un tubo de diálisis snakeskin (corte de 10 kDa, Thermo Scientific) frente a tampón de L-histidina 4,2 mM tampón de trehalosa 50 mM, pH 6,0. Cualquier precipitado que apareció se eliminó por filtración después de que se completara la diálisis. Las concentraciones se midieron mediante espectroscopía UV usando Nanodrop o un espectrofotómetro UV de cubeta (ambos de Thermo Scientific). El análisis de calidad mostró que la proteína tenía una pureza de> 95 % y contenía cantidades insignificantes de dímeros o fragmentos según lo determinado por HPSEC. El punto isoeléctrico del mutante con cisteína modificada por ingeniería genética fue idéntico al del tipo silvestre.
Utilizando el mismo procedimiento o similar al descrito anteriormente en el presente documento para la preparación y purificación del anticuerpo anti-PSMA con cisteínas modificadas por ingeniería genética (VH 41C, numeración de Kabat), se prepararon y purificaron los anticuerpos H8-HC41 modificado por ingeniería genética (VH 41C, numeración de Kabat) y el natalizumab con cisteínas modificadas por ingeniería genética (CH 225P, 375C, numeración de Kabat), además de los otros anticuerpos de los ejemplos.
Protocolo general de conjugación de sitio específico
A una solución de anticuerpo modificado por ingeniería genética con cisteína (5-10 mg/ml en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6) se añadió EDTA (25 mM en agua, 4 % v/v). El pH se ajustó a ~ 7,4 usando TRIS (1 M en agua, pH 8), después de lo cual se añadió TCEP (10 mM en agua, 20 equivalentes) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1 -3 horas. El exceso de TCEP se eliminó mediante bien una columna de desalación PD-10 o un concentrador por centrifugación Vivaspin (corte de 30 kDa, PES) usando histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6. El pH de la solución de anticuerpo resultante se elevó a ~ 7,4 usando TRIS (1 M en agua, pH 8), después de lo cual se añadió ácido deshidroascórbico (10 mM en agua, 20 equivalentes) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Se añadió DMA seguido de una solución de fármaco enlazador (10 mM en DMA). La concentración final de DMA fue de 5-10 %. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente en ausencia de luz durante 1-16 h. Para eliminar el exceso de fármaco enlazador, se añadió carbón activado y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. El carbón se eliminó usando un filtro de PES de 0,2 pm y el ADC resultante se formuló en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6 usando un concentrador por centrifugación Vivaspin (corte de 30 kDa, PES). Finalmente, la solución de ADC se filtró de forma estéril usando un filtro de PES de 0,22 pm.
Protocolo de conjugación general para la conjugación mediante disulfuros endógenos parcialmente reducidos (conjugación de ts)
A una solución de anticuerpo (5-10 mg/ml en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6) se añadió EDTA (25 mM en agua, 4 % v/v). El pH se ajustó a ~ 7,4 usando TRIS (1 M en agua, pH 8), después de lo cual se añadió TCEP (10 mM en agua, 1-3 equivalentes dependiendo del anticuerpo y la DAR deseada) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Se añadió DMA seguido de una solución de fármaco enlazador (10 mM en DMA). La concentración final de DMA fue de 5-10 %. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente en ausencia de luz durante 1-16 h. Para eliminar el exceso de fármaco enlazador, se añadió carbón activado y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. El carbón se eliminó usando un filtro de PES de 0,2 pm y el ADC resultante se formuló en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6 usando un concentrador por centrifugación Vivaspin (corte de 30 kDa, PES). Finalmente, la solución de ADC se filtró de forma estéril usando un filtro de PES de 0,22 pm.
Utilizando los procedimientos generales anteriores, se sintetizaron ADC modificados con cisteína y de tipo silvestre basados en los fármacos enlazadores vc-seco-DUBA (SYD980; es decir, el compuesto 18b, n = 1 en el ejemplo 10 en la página 209 del documento WO2011/133039), lc-MMAE y mc-MMAF y se caracterizaron usando cromatografía de interacción hidrófoba analítica (HIC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés), cromatografía de fase hidrófoba protegida (SHPC, por sus siglas en inglés), RP-HPLC y prueba de endotoxinas LAL.
Para HIC analítico, se inyectaron 5-10 pl de muestra (1 mg/ml) en una columna TSKgel Butyl-NPR (4,6 mm DI x 3,5 cm L, Tosoh Bioscience, número de catálogo 14947). El método de elución consistió en un gradiente lineal de tampón A al 100 % (fosfato de sodio 25 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 6,95) a tampón B al 100 % (fosfato de sodio 25 mM, pH 6,95, isopropanol al 20 %) a 0,4 ml/min durante 20 minutos. Se utilizó un sistema de UPLC Waters Acquity H-Class equipado con detector de PDA y el programa informático Empower. Se midió la absorbancia a 214 nm y se determinó el tiempo de retención de los ADC.
Como lo demuestra el análisis de HIC, hubo diferencias en los tiempos de retención (RT, por sus siglas en inglés) para las especies DAR2 de los diferentes ADC modificados con cisteína. frente a los conjugados de ts (Tablas 1,2 y 3). Lo más interesante es que, la conjugación del fármaco enlazador en sitios específicos dentro de la cavidad Fab o la cavidad Fc (como lo predijo el algoritmo de modelado molecular) dio lugar a una disminución (drástica) en el tiempo de retención en comparación con los ADC que se conjugaron mediante disulfuros endógenos parcialmente reducidos, lo que da lugar a los presentes inventores a concluir que, basándose en los datos de HIC, los ADC modificados por ingeniería genética en los que el fármaco enlazador se conjuga en sitios específicos en la cavidad Fab o Fc son menos hidrófobos que los conjugados de ts. Para cuantificar adicionalmente este efecto, se introduce el término hidrofobia relativa, que se define como:
(RTDAR2 - RTdARü)/(RTdAR2, wt-ADC RTdARü, wt-ADC).
Esencialmente, la hidrofobia relativa es una medida que permite una comparación fácil entre la hidrofobia de los ADC modificados por ingeniería genética frente a los homólogos conjugados de ts basándose en datos de HIC. Los datos se resumen en las tablas 1, 2 y 3.
Tabla 1. La hidrofobia relativa de ADC con vc-seco-DUBA en la columna analítica HIC es ecificada anteriormente:
Figure imgf000015_0001
continuación
Figure imgf000016_0001
Tabla 2. La hidrofobia relativa de los ADC de vc-MMAE en la columna de HIC analítica es ecificada anteriormente:
Figure imgf000016_0002
Tabla 3. La hidrofobia relativa de los ADC de mc-MMAF en la columna de HIC analíticâ es ecificada anteriormente:
Figure imgf000016_0003
Unión celular
Tres ADC anti-PSMA SYD998 (ts), SYD1091 (HC41) y el comparador SYD1035 (HC120) tenían afinidades de unión iguales en células LNCaP-C4.2 que expresan PSMA (CE50 en el intervalo de ü,1-ü,2 pg/ml) similar al anticuerpo de tipo silvestre, y los tres ADC no pudieron unirse a células DU-145 PSMA-negativas (CE50 > 10 pg/ml).
Dos ADC anti-5T4 H8-wt y H8-HC40 tenían afinidades de unión iguales en células MDA-MB-468 que expresan 5T4 (CE50 en el intervalo de 0,1-1,2 pg/ml) similar al anticuerpo H8 de tipo silvestre, y ninguno de los ADC pudieron unirse a células SK-MEL-305T4 negativas (CE50 > 10 pg/ml).
Por tanto, las propiedades de unión a antígeno de los ADC no se vieron afectadas por el fármaco enlazador derivado de duocarmicina fijado.
Citotoxicidad in vitro
Las potencias de los ADC anti-PSMA conjugados en sitios específicos fueron similares a los ADC de tipo silvestre enlazados convencionalmente (SYD998) en células LNCaP-C4.2 que expresan PSMA (CI50 en el intervalo de 0,1-0,5 nM, basándose en equivalentes de fármacos, véase la tabla 4 a continuación). Todos los ADC fueron inactivos en células DU-145 PSMA negativas (CI50 > 70 nM) indicando la muerte selectiva de células tumorales a través de PSMA. Los dos ADC de control sin unión fueron al menos 50 veces menos potentes que los ADC anti-PSMA en cada una de las líneas celulares evaluadas.
Tabla 4. Citotoxicidad in vitro de los ADC anti-PSMA-vc-seco-DUBA en células tumorales humanas que expresan
PSMA
Figure imgf000017_0001
La conjugación de vc-MMAE a las posiciones HC41, LC40 y LC41 en anticuerpos anti-PSMA dio como resultado potencias citotóxicas en células LNCaP-C4.2 PSMA positivas similares a anti-PSMA-vc-seco-DUBA unido en estos sitios de cisteína (tablas 4 y 5). Los ADC anti-PSMA-vc-MMAE carecieron de actividad en las células DU-145 PSMA negativas (CI50 > 70 nM).
Tabla 5. Citotoxicidad in vitro de los ADC anti-PSMA-vc-MMAE en células tumorales humanas ue ex resan PSMA
Figure imgf000017_0002
Las potencias de los ADC anti-5T4 modificados por ingeniería genética fueron iguales a las del ADC H8-wt unido convencionalmente en células MDA-MB-468 que expresan 5T4 (CI50 entre 0,07 y 0,09 nM, tabla 6). Los ADC anti-5T4 fueron inactivos en células SK-MEL-30 5T4 negativas (CI50 > 90 nm).
Tabla 6. Citotoxicidad in vitro de los ADC anti-5T4-vc-seco-DUBA en células tumorales humanas ue ex resan 5T4
Figure imgf000018_0001
En conjunto, estos datos muestran que las posiciones de cisteína probadas para la conjugación de sitio específico no tuvieron un impacto en la potencia de destrucción de células tumorales de los ADC que comprenden dos fármacos enlazadores diferentes. Asimismo, el enlace de sitio específico de fármacos enlazadores en la región variable de la parte Fab de diferentes anticuerpos es generalmente aplicable.
Escisión enzimática por catepsina B
El resto valina-citrulina presente en el enlazador de los ADC con vc-seco-DUBA (SYD980) y vc-MMAE pueden escindirse mediante cisteína proteasas, tal como la catepsina B, que da como resultado la posterior liberación intracelular del fármaco(seco-)DUBA o MMAE dentro de los lisosomas tumorales o extracelular en el microambiente tumoral. Para evaluar la sensibilidad hacia la catepsina B, los ADC se trataron durante 2 minutos y 4 horas con catepsina B activada (Calbiochem). La actividad citotóxica del fármaco liberado de los ADC anti-PSMA se midió en células DU-145 PSMA negativas. La actividad citotóxica del fármaco liberado de los ADC anti-5T4 se midió en células SK-MEL-30 5T4 negativas. Durante la etapa de incubación previa a 37 0C, se mezcló 1 mg/ml de cada ADC con 5 pg/ml de catepsina B (0,04 unidades/pocillo) en acetato de sodio 0,1 M pH 5 que contenía DTT 4 mM. Como control, se diluyó directamente 1 mg/ml de cada ADC en medio de cultivo (RPMI 1640, FBS calificado al 10 %). Se realizaron diluciones en serie a partir de estas soluciones de ADC en medio de cultivo. Para medir la liberación de las correspondientes toxinas libres DUBA o MMAE, se cultivaron células DU-145 PSMA negativas (1000 células/pocillo) y células SKMEL-30 5T4 negativas (2000 células/pocillo) con los ADC durante 6 días, y se midió la viabilidad celular después de 6 días utilizando el kit de ensayo CellTiter-Glo™ (CTG).
Las diferencias en la potencia del fármaco liberado en las células DU-145 PSMA negativas y las células SK-MEL-30 5T4 negativas reflejan la cantidad de fármaco que se escinde del ADC y, por lo tanto, la accesibilidad del sitio de escisión valina-citrulina para la catepsina B. Como se muestra en la tabla 7, la sensibilidad para la escisión proteolítica difirió entre los ADC después de cuatro horas de exposición a catepsina B activada (véanse los valores de la CI50), mientras que ninguno de los ADC se escindió después de un corto período de exposición de 2 minutos con catepsina B (CI50 >10 nM, datos no mostrados en la tabla).
Juntos, estos datos muestran que el sitio de conjugación influye en la accesibilidad del fármaco enlazador para la escisión enzimática, y que el fármaco enlazador vc-seco-DUBA (SYD980) en los ADC anti-PSMA ADC-HC41, ADC-HC152, ADC-HC339, ADC-HC375, ADC-LC41 y ADC-LC165 está más protegido de la escisión por dicha enzima. La conjugación de vc-MMAE en las posiciones HC41 y LC41 de los anticuerpos anti-PSMA dio como resultado una protección similar del sitio de escisión valina-citrulina (tabla 7). También se observó una tendencia similar para el anticuerpo anti-5T4 H8-HC41 conjugado con vc-seco-DUBA (SYD980) a través de la misma posición HC41.
Estos datos juntos muestran que particularmente la posición 41C es una posición adecuada para la conjugación de sitio específico de fármacos enlazadores con varios anticuerpos.
T l 7 i xi i l f rm li r in i r in B
Figure imgf000018_0002
continuación
Figure imgf000019_0001
Modelo animal de xenoinjerto de tumor
La eficacia in vivo de tres ADC anti-PSMA se evaluó en el modelo de xenoinjerto de cáncer de próstata LNCaP C4-2. La línea celular LnCaP-C4.2 es una línea celular epitelial de carcinoma de próstata humano derivada de un xenoinjerto que se propagó en serie en ratones después de la regresión inducida por castración y la recaída de la línea celular de xenoinjerto LnCaP-FGC dependiente de andrógenos precursora.
Los tumores se indujeron por vía subcutánea inyectando 1x107 células LnCap C4.2 en 200 |ul de RPMI 1640 que contiene matrigel (50:50, v:v) en el flanco derecho de ratones CB17-SCID macho. La implantación de células tumorales LnCaP-C4.2 se realizó de 24 a 72 horas después de una irradiación de todo el cuerpo con una fuente y (1,44 Gy, 60Co, BioMep, Bretenieres, Francia). Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 100-200 mm.3. Los ratones se asignaron al azar de acuerdo con su volumen de tumor individual en grupos y recibieron una única inyección intravenosa de ADC anti-PSMA (2 o 10 mg/kg) o vehículo en la vena de la cola. Se controlaron los cambios en los volúmenes tumorales (figura 2) y el peso corporal (figura 3). Los tres ADC tienen una DAR promedio de aproximadamente 1,8.
La figura 2A demuestra que a 2 mg/kg el comparador ADC SYD1035 anti-PSMA con cisteínas modificadas por ingeniería genética es menos activo en comparación con el SYD998 con cisteínas no modificadas por ingeniería genética. Sin embargo, la eficacia de SYD1091, un ADC con cisteínas modificadas por ingeniería genética de acuerdo con la presente invención, es significativamente mejor que el comparador SYD1035 y es mejor que el SYD998 natural sin modificar por ingeniería genética. La diferencia entre el comparador SYD1035 y SYD1091 es aún más pronunciada a 10 mg/kg como se muestra en la figura 2B. Los ratones que portan tumores LnCap C4.2 contraen caquexia como se ilustra en la figura 3. Esta pérdida de peso corporal con frecuencia se recupera después de la administración de tratamientos eficaces y se considera un biomarcador de eficacia sensible. El tratamiento con SYD1091 dio como resultado una restauración del peso corporal mucho más rápida que con el comparador SYD1035 o SYD998 natural sin modificar por ingeniería genética (figura 3).
La eficacia in vivo de dos ADC anti-5T4, es decir, el H8-vc-seco-DUBA natural (DAR promedio 2.0 ) y el ADC con cisteínas modificadas por ingeniería genética (VH P41C) ADC H8-41 C-vc-seco-DUBA (DAR promedio 1,7), se evaluó en el modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario PA-1. La línea celular PA-1 se estableció a partir de células extraídas de líquido ascítico recogidas de una mujer con carcinoma de ovario (Zeuthen J. et al. Int. J. Cancer 1980; 25(1): 19­ 32).
Los tumores PA-1 se indujeron por vía subcutánea inyectando 1x107 células en 100 |ul de medio RPMI 1640 que contiene matrigel (50/50, v/v) en el flanco derecho de ratones atímicos Balb/c hembra. La inyección de células tumorales PA-1 se realizó de 24 a 72 horas después de una irradiación de todo el cuerpo con una fuente y (2 Gy, 60Co, BioMep, Bretenieres, Francia). Los tratamientos se iniciaron cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 200-300 mm.3. Los ratones se aleatorizaron de acuerdo con su volumen tumoral individual en grupos y recibieron una única inyección intravenosa de ADC anti-5T4 (3 o 10 mg/kg) o vehículo en la vena de la cola y se controlaron los cambios en los volúmenes tumorales (figuras 4A y 4B). Aunque ambas variantes tienen una eficacia similar a la dosis más alta de 10 mg/kg (figura 4B), a 3 mg/kg el a Dc anti-5T4 ADC H8-41 C-vc-seco-DUBA con cisteínas modificadas por ingeniería genética fue claramente más activa en comparación con el ADC anti-5T4 sin modificar por ingeniería genética natural, H8-vc-con eso-DUBA (figura 4A).
Juntos, estos hallazgos demuestran que, in vivo, los ADC con cisteínas modificadas por ingeniería genética de sitio específico de acuerdo con la presente invención muestran propiedades favorables con respecto a la eficacia en modelos de tumores de ratón.
SEQ ID NO: 1 (secuencia líder de HAVT20)
1 MACPGFLWAL VISTCLEFSM A
SEQ ID NO:2 (HC S41C de anticuerpo anti-PSMA)
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKI SCKTSGYTFT EYT1HWVKQA CGKGLEWIGN
51 INPNNGGTTY NQKFEDRATL TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAAGW
101 NFDYWGQGTT VTVSS
SEQ ID NO: 3 (región constante de HC del anticuerpo IgG1 humano)
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 4 (ADNc de HC S41C de anticuerpo anti-PSMA)
1 ATGGCCTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCGAGGTGC AGCTGGTGCA GTCTGGCGCC GAAGTGAAGA AACCAGGCGC CAGCGTGAAG
121 ATCAGCTGCA AGACCAGCGG CTACACCTTC ACCGAGTACA CCATCCACTG GGTCAAGCAG
181 GCCTGTGGCA AGGGCCTGGA ATGGATCGGC AACATCAACC CCAACAACGG CGGCACCACC
241 TACAACCAGA AGTTCGAGGA CCGGGCCACC CTGACCGTGG ACAAGAGCAC AAGCACCGCC
301 TACATGGAAC TGAGCAGCCT GCGGAGCGAG GACACCGCCG TGTACTATTG TGCCGCCGGA
361 TGGAACTTCG ACTACTGGGG CCAGGGCACC ACCGTGACAG TGTCTAGCGC CAGCACAAAG
421 GGCCCCAGCG TGTTCCCTCT GGCCCCTAGC AGCAAGTCTA CCTCTGGCGG AACAGCCGCC
481 CTGGGCTGCC TCGTGAAGGA CTACTTTCCC GAGCCCGTGA CCGTGTCCTG GAACTCTGGC
541 GCTCTGACAA GCGGCGTGCA CACCTTTCCA GCCGTGCTGC AGAGCAGCGG CCTGTACTCT
601 CTGAGCAGCG TCGTGACTGT GCCCAGCAGC AGCCTGGGCA CCCAGACCTA CATCTGCAAC
661 GTGAACCACA AGCCCAGCAA CACCAAGGTG GACAAAAAGG TGGAACCCAA GAGCTGCGAC
721 AAGACCCACA CCTGTCCCCC TTGTCCTGCC CCTGAACTGC TGGGCGGACC TTCCGTGTTC
781 CTGTTCCCCC CAAAGCCCAA GGACACCCTG ATGATCAGCC GGACCCCCGA AGTGACCTGC
841 GTGGTGGTGG ATGTGTCCCA CGAGGACCCT GAAGTGAAGT TCAATTGGTA CGTGGACGGC
901 GTGGAAGTGC ACAACGCCAA GACCAAGCCC AGAGAGGAAC AGTACAACAG CACCTACCGG
961 GTGGTGTCCG TGCTGACAGT GCTGCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAAGA GTACAAGTGC
1021 AAGGTGTCCA ACAAGGCCCT GCCTGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCAGCAA GGCCAAGGGC
1081 CAGCCCCGCG AACCCCAGGT GTACACACTG CCTCCCAGCA GGGACGAGCT GACCAAGAAC
1141 CAGGTGTCCC TGACATGCCT CGTGAAAGGC TTCTACCCCT CCGATATCGC CGTGGAATGG
1201 GAGAGCAACG GCCAGCCCGA GAACAACTAC AAGACCACCC CCCCTGTGCT GGACAGCGAC
1261 GGCTCATTCT TCCTGTACAG CAAGCTGACT GTGGATAAGT CCCGGTGGCA GCAGGGCAAC
1321 GTGTTCAGCT GCAGCGTGAT GCACGAGGCC CTGCACAACC ACTACACCCA GAAAAGCCTG
1381 TCCCTGAGCC CCGGCAAG
SEQ ID NO: 5 (LC de anticuerpo anti-PSMA)
1 DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVDWYQQKP GKAPKLLIYW
51 ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSLQP EDFADYFCQQ YNSYPLTFGG
101 GTKLEIK
SEQ ID NO: 6 (región constante k de LC del anticuerpo IgG humano)
1 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
51 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
101 SFNRGEC
SEQ ID NO: 7 (ADNc de LC de anticuerpo anti-PSMA)
1 ATGGCTTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCGACATCG TGATGACCCA GAGCCCCAGC TCTCTGAGCG CCAGCGTGGG CGACAGAGTG 121 ACCATCACAT GCAAGGCCAG CCAGGACGTG GGCACCGCCG TGGATTGGTA TCAGCAGAAG 181 CCTGGCAAGG CCCCCAAGCT GCTGATCTAC TGGGCCAGCA CCAGACACAC CGGCGTGCCC 241 GATAGATTCA CAGGCAGCGG CTCCGGCACC GACTTCACCC TGACAATCAG CAGCCTGCAG 301 CCCGAGGACT TCGCCGACTA CTTCTGCCAG CAGTACAACA GCTACCCCCT GACCTTCGGC 361 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGACA GTGGCCGCTC CCAGCGTGTT CATCTTCCCA 421 CCTAGCGACG AGCAGCTGAA GTCTGGCACC GCCTCTGTCG TGTGCCTGCT GAACAACTTC 481 TACCCCCGCG AGGCCAAGGT GCAGTGGAAG GTGGACAATG CCCTGCAGAG CGGCAACAGC 541 CAGGAAAGCG TGACCGAGCA GGACAGCAAG GACTCCACCT ACAGCCTGAG CAGCACCCTG 601 ACCCTGAGCA AGGCCGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTACG CCTGCGAAGT GACCCACCAG 661 GGCCTGTCTA GCCCCGTGAC CAAGAGCTTC AACCGGGGCG AGTGC
SEQ ID NO:8 (HC P41C de H8)
1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYYMHWVKQS CGQGLEWIGR
51 INPNNGVTLY NQKFKDRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARST
101 MITNYVMDYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 9 (región constante de HC del anticuerpo IgG1 humano)
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 10 (ADNc de HC P41C de H8)
1 ATGGCCTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCCAGGTGC AGCTGGTGCA GTCTGGCGCC GAAGTGAAGA AACCAGGCGC CAGCGTGAAG
121 GTGTCCTGCA AGGCCAGCGG CTACAGCTTC ACCGGCTACT ACATGCACTG GGTCAAGCAG
181 AGCTGCGGCC AGGGCCTGGA ATGGATCGGC AGAATCAACC CCAACAACGG CGTGACCCTG
241 TACAACCAGA AATTCAAGGA CCGCGTGACC ATGACCCGGG ACACCAGCAT CAGCACCGCC
301 TACATGGAAC TGAGCCGGCT GAGAAGCGAC GACACCGCCG TGTACTACTG CGCCCGGTCC
361 ACCATGATCA CCAACTACGT GATGGACTAC TGGGGCCAGG GCACCCTCGT GACAGTGTCT
421 AGCGCCAGCA CAAAGGGCCC CAGCGTGTTC CCTCTGGCCC CTAGCAGCAA GAGCACATCT
481 GGCGGAACAG CCGCCCTGGG CTGCCTCGTG AAGGATTACT TCCCCGAGCC CGTGACCGTG
541 TCCTGGAATA GCGGAGCCCT GACAAGCGGC GTGCACACCT TTCCAGCCGT GCTGCAGAGC
601 AGCGGCCTGT ACTCTCTGAG CAGCGTCGTG ACTGTGCCCA GCAGCAGCCT GGGCACCCAG
661 ACCTACATCT GCAACGTGAA CCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA GAAGGTGGAA
721 CCCAAGAGCT GCGACAAGAC CCACACCTGT CCCCCTTGTC CTGCCCCTGA ACTGCTGGGC
781 GGACCTTCCG TGTTCCTGTT CCCCCCAAAG CCCAAGGACA CCCTGATGAT CAGCCGGACC
841 CCCGAAGTGA CCTGCGTGGT GGTGGATGTG TCCCACGAGG ACCCTGAAGT GAAGTTCAAT
901 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA AGTGCACAAC GCCAAGACCA AGCCCAGAGA GGAACAGTAC
961 AACAGCACCT ACCGGGTGGT GTCCGTGCTG ACAGTGCTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC
1021 AAAGAGTACA AGTGCAAGGT GTCCAACAAA GCCCTGCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC 1081 AGCAAGGCCA AGGGCCAGCC CCGCGAACCC CAGGTGTACA CACTGCCTCC CAGCCGGGAA 1141 GAGATGACCA AGAACCAGGT GTCCCTGACA TGCCTCGTGA AAGGCTTCTA CCCCTCCGAT 1201 ATCGCCGTGG AATGGGAGAG CAACGGCCAG CCCGAGAACA ACTACAAGAC CACCCCCCCT 1261 GTGCTGGACA GCGACGGCTC ATTCTTCCTG TACAGCAAGC TGACCGTGGA CAAGTCCCGG 1321 TGGCAGCAGG GCAACGTGTT CAGCTGCAGC GTGATGCACG AGGCCCTGCA CAACCACTAC 1381 ACCCAGAAGT CCCTGAGCCT GAGCCCCGGC AAA
SEQ ID NO:11 (LC de H8)
1 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVS NDVAWYQQKP GQSPKLLISY
51 TSSRYAGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQA EDVAVYFCQQ DYNSPPTFGG
101 GTKLEIK
SEQ ID NO: 12 (ADNc de LC de H8)
1 ATGGCCTGTC CTGGATTTCT GTGGGCCCTC GTGATCAGCA CCTGTCTGGA ATTCAGCATG
61 GCCGACATCG TGATGACCCA GAGCCCCGAT AGCCTGGCCG TGTCTCTGGG AGAGAGAGCC
121 ACCATCAACT GCAAGGCCAG CCAGAGCGTG TCCAACGACG TGGCCTGGTA TCAGCAGAAG
181 CCCGGCCAGA GCCCTAAGCT GCTGATCTCC TACACCAGCA GCAGATATGC CGGCGTGCCC
241 GACAGATTTT CCGGCAGCGG CTCTGGCACC GACTTCACCC TGACAATCAG CTCCCTGCAG
301 GCCGAGGACG TGGCCGTGTA CTTCTGTCAG CAAGACTACA ACAGCCCCCC CACCTTCGGC
361 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGACA GTGGCCGCTC CCAGCGTGTT CATCTTCCCA
421 CCTAGCGACG AGCAGCTGAA GTCCGGCACA GCCTCTGTCG TGTGCCTGCT GAACAACTTC
481 TACCCCCGCG AGGCCAAGGT GCAGTGGAAG GTGGACAATG CCCTGCAGAG CGGCAACAGC
541 CAGGAAAGCG TGACCGAGCA GGACAGCAAG GACTCCACCT ACAGCCTGAG CAGCACCCTG
601 ACCCTGAGCA AGGCCGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTACG CCTGCGAAGT GACCCACCAG
661 GGACTGAGCA GCCCTGTGAC CAAGAGCTTC AACCGGGGCG AGTGC
SEQ ID NO: 13 (secuencia líder de la línea germinal)
1 MDWTWRILFL VAAATGAHS
SEQ ID NO: 14 (HC de natalizumab)
1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DTY1HWVRQA PGQRLEWMGR
51 IDPANGYTKY DPKFQGRVTI TADTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAREG
101 YYGNYGVYAM DYWGQGTLVT VSS
SEQ ID NO: 15 (HC S225P, S375C de natalizumab)
1 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSWT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES
101 KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSQED
151 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK
201 CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK
251 GFYPCDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
301 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
SEQ ID NO: 16 (ADNc de HC S225P, S375C de natalizumab)
1 ATGGACTGGA CCTGGCGCAT CCTGTTTCTG GTGGCCGCTG CTACCGGCGC TCACTCCCAG
61 GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG CGCCGAAGTG AAGAAACCTG GCGCCTCCGT GAAGGTGTCC
121 TGCAAGGCCT CCGGCTTCAA CATCAAGGAC ACCTACATCC ACTGGGTCCG ACAGGCCCCT
181 GGACAGCGGC TGGAATGGAT GGGCAGAATC GACCCCGCCA ACGGCTACAC TAAGTACGAC
241 CCCAAGTTCC AGGGCAGAGT GACCATCACC GCCGACACCT CCGCCTCCAC AGCCTACATG
301 GAACTGTCCT CCCTGCGGAG CGAGGACACC GCCGTGTACT ACTGCGCCAG AGAGGGCTAC
361 TACGGCAACT ACGGCGTGTA CGCCATGGAC TACTGGGGCC AGGGCACCCT GGTCACCGTG
421 TCCTCCGCTT CCACCAAGGG CCCCTCCGTG TTCCCTCTGG CCCCTTGCTC CCGGTCCACC
481 TCCGAGTCTA CCGCCGCTCT GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA GCCCGTGACC
541 GTGTCCTGGA ACTCTGGCGC CCTGACCTCT GGCGTGCACA CCTTCCCTGC TGTGCTGCAG
601 TCCTCCGGCC TGTACTCCCT GTCCTCCGTC GTGACCGTGC CCTCCAGCTC CCTGGGCACC
661 AAGACCTACA CCTGTAACGT GGACCACAAG CCCTCCAACA CCAAGGTGGA CAAGCGGGTG
721 GAATCTAAGT ACGGCCCTCC CTGCCCCCCC TGCCCTGCCC CTGAATTTCT GGGCGGACCT
781 TCCGTGTTCC TGTTCCCCCC AAAGCCCAAG GACACCCTGA TGATCTCCCG GACCCCCGAA
841 GTGACCTGCG TGGTGGTGGA CGTGTCCCAG GAAGATCCCG AGGTCCAGTT CAATTGGTAC
901 GTGGACGGCG TGGAAGTGCA CAACGCCAAG ACCAAGCCCA GAGAGGAACA GTTCAACTCC
961 ACCTACCGGG TGGTGTCCGT GCTGACCGTG CTGCACCAGG ACTGGCTGAA CGGCAAAGAG
1021 TACAAGTGCA AGGTGTCCAA CAAGGGCCTG CCCAGCTCCA TCGAAAAGAC CATCTCCAAG 1081 GCCAAGGGAC AGCCTCGCGA GCCCCAGGTG TACACCCTGC CTCCAAGCCA GGAAGAGATG 1141 ACCAAGAACC AGGTGTCCCT GACCTGTCTG GTCAAGGGCT TCTACCCCTG CGATATCGCC 1201 GTGGAATGGG AGTCCAACGG CCAGCCCGAG AACAACTACA AGACCACCCC CCCTGTGCTG 1261 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTGTACTCT CGGCTGACCG TGGACAAGTC CCGGTGGCAG 1321 GAAGGCAACG TCTTCTCCTG CTCCGTGATG CACGAGGCCC TGCACAACCA CTACACCCAG 1381 AAGTCCCTGT CCCTGAGCCT GGGCAAG
SEQ ID NO: 17 (secuencia líder de la línea germinal)
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC
SEQ ID NO: 18 (LC de natalizumab)
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKTSQDIN KYMAWYQQTP GKAPRLL1HY
51 TSALQPGIPS RFSGSGSGRD YTFTISSLQP EDIATYYCLQ YDNLWTFGQG
101 TKVEIK
SEQ ID NO: 19 (ADNc de LC de natalizumab)
1 ATGGACATGA GAGTGCCCGC CCAGCTGCTG GGACTGCTGC TGCTGTGGCT GAGAGGCGCC
61 AGATGCGACA TCCAGATGAC CCAGTCCCCC TCCAGCCTGT CCGCCTCCGT GGGCGACAGA
121 GTGACCATCA CATGCAAGAC CTCCCAGGAC ATCAACAAGT ACATGGCCTG GTATCAGCAG 181 ACCCCCGGCA AGGCCCCTCG GCTGCTGATC CACTACACCT CCGCTCTGCA GCCTGGCATC 241 CCCTCCAGAT TCTCCGGCTC CGGCTCTGGC CGGGACTATA CCTTCACCAT CTCCAGTCTG 301 CAGCCCGAGG ATATCGCCAC CTACTACTGC CTGCAGTACG ACAACCTGTG GACCTTCGGC 361 CAGGGCACCA AGGTGGAAAT CAAGCGGACC GTGGCCGCTC CCTCCGTGTT CATCTTCCCA 421 CCCTCCGACG AGCAGCTGAA GTCCGGCACC GCCTCCGTCG TGTGCCTGCT GAACAACTTC 481 TACCCCCGCG AGGCCAAGGT GCAGTGGAAG GTGGACAACG CCCTGCAGTC CGGCAACTCC 541 CAGGAATCCG TCACCGAGCA GGACTCCAAG GACAGCACCT ACTCCCTGTC TCCACCCTG 601 ACCCTGTCCA AGGCCGACTA CGAGAAGCAC AAGGTGTACG CCTGCGAAGT GACCCACCAG 661 GGCCTGTCCA GCCCCGTGAC CAAGTCCTTC AACCGGGGCG AGTGC

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de conjugado anticuerpo-fármaco en donde un fármaco enlazador se conjuga en sitios específicos con un anticuerpo IgG1 a través de una cisteína modificada por ingeniería genética en dicho anticuerpo en la posición 41 de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat, en donde dicho fármaco enlazador comprende un derivado de duocarmicina.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una cisteína modificada por ingeniería genética en la posición 375 en la parte Fc de dicho anticuerpo de acuerdo con la numeración Eu.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 de la fórmula (I)
Figure imgf000037_0001
en donde
n es 0-3,
m representa una DAR promedio de 1 a 6,
R1 se selecciona de
Figure imgf000037_0002
y es 1-16, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000037_0003
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en donde
n es 0-1,
m representa una DAR promedio de 1,5 a 2,
Figure imgf000038_0001
y es 1-4, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000038_0002
5. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 de la fórmula (II)
Figure imgf000038_0003
6. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde dicho anticuerpo se une a una diana antigénica que se expresa en o sobre la membrana celular de una célula tumoral y en donde dicho anticuerpo es internalizado por la célula después de unirse a dicha diana.
7. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo antianexina A1, un anticuerpo anti-CD115, un anticuerpo anti-CD123, un anticuerpo anti-CLL-1, un anticuerpo anti-MET, un anticuerpo anti-MUC1, un anticuerpo anti-PSMA, un anticuerpo anti-5T4 o un anticuerpo anti-TF.
8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-PSMA o un anticuerpo monoclonal anti-5T4.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-PSMA comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-PSMA comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la cadena pesada de dicho anticuerpo anti-5T4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y la cadena ligera de dicho anticuerpo anti-5T4 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.
11. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, preferentemente en forma de polvo liofilizado.
12. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso como un medicamento.
13. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 para uso en el tratamiento de neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos humanos.
14. El compuesto o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde los tumores sólidos humanos se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer urotelial, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de pulmón, mesotelioma, cáncer de hígado, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.
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