ES2898337T3 - ADN dúplex lineal de extremos cerrados para la transferencia de genes no víricos - Google Patents

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Abstract

Un ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec) que comprende un inserto de ácido nucleico que comprende un transgén, estando el inserto flanqueado por al menos dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de virus adenoasociado (AAV), en el que las, al menos dos, secuencias de ITR son asimétricas y están unidas covalentemente entre sí, en el que cada secuencia tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante (RBE), en el que una primera secuencia de ITR está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos formados por secuencias palindrómicas interrumpidas B-B' y C-C', en el que cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo en el intervalo de 5 a 15 pares de bases de longitud y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados, en el que una segunda secuencia de ITR está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada que tiene una o más deleciones de entre 11 y 20 nucleótidos en una región de secuencia palindrómica B-B' y/o una región de secuencia palindrómica C-C'.

Description

DESCRIPCIÓN
ADN dúplex lineal de extremos cerrados para la transferencia de genes no víricos
Antecedentes
Los vectores de suministro de genes actuales presentan varios inconvenientes. Los vectores de suministro de genes tanto víricos como bacterianos pueden inducir las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas de un paciente. Por ejemplo, los vectores de ADN plasmídico (ADNp) y de ADN de minicírculo (ADNmc) poseen típicamente patrones procarióticos de metilación de ADN que no están presentes en el ADN eucariótico. Además, los lipopolisacáridos (LPS) y otras moléculas derivadas de bacterias son reconocidos en las células de vertebrados por el receptor de reconocimiento de patrones (PRR) de respuesta inmunitaria innata como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), lo que da lugar a la activación de genes celulares en respuesta al patógeno microbiano invasivo. El ADN plasmídico, conformacionalmente, es exclusivamente bacteriano; la estructura de mamífero más cercana es el genoma mitocondrial, o ADN circular dúplex, que, compartimentado en el orgánulo, no está expuesto a los PRR citosólicos. En otro ejemplo, los virus adenoasociados recombinantes (rAAV) pueden inducir una respuesta de células T a los antígenos de la cápside procesados, o pueden ser neutralizados por inmunoglobulinas y glicoproteínas que no son Ig circulantes. Los vectores víricos también tienen una capacidad de transporte de transgenes limitada y su producción es laboriosa, cara y requiere mucho tiempo. En consecuencia, se necesitan composiciones y procedimientos mejorados para el suministro de genes.
Li L et al., PLOS ONE, vol. 8, N° 8, 2013, describen genomas de forma replicativa de rAAV que tienen moléculas dúplex lineales con extremos cerrados covalentemente. Samulski RJ et al., Cell, vol. 33, N° 1, 1983, páginas 135-143, describen la corrección de genes dentro de las repeticiones terminales de vectores de AAV. Bohenzky RA et al., Virology, vol. 166, N° 2, 1988, páginas 316-327, informan sobre los requisitos de secuencia y simetría dentro de las secuencias palindrómicas internas de la repetición terminal de AAV. McCarty DM, Molecular Therapy, vol. 16, N° 10, 2008, páginas 1648-1656, revisan vectores de AAV autocomplementarios, explorando las características estructurales y funcionales. Chiorini JA et al., Journal of Virology, vol. 68, N° 11, 1994, páginas 7448-7457, informan de los requisitos de secuencia para la unión estable y la función de la proteína Rep68 en repeticiones terminales invertidas de AAV2. Virag T et al., Human Gene Therapy, vol. 20, 2009, páginas 807-817, describen la producción de AAV usando una estrategia de expresión de baculovirus en células de insecto.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La divulgación se refiere, en algunos aspectos, al descubrimiento de que la replicación de ácidos nucleicos que codifican un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por determinados tipos de extremos asimétricos (por ejemplo, secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas) da como resultado un enlace covalente de los extremos asimétricos (por ejemplo, secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas) y conduce a la producción de una nueva conformación de ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec). En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas se pueden producir fácilmente (por ejemplo, en grandes cantidades) mientras se evitan los problemas de aumento de escala asociados con otros vectores de terapia génica (por ejemplo, vectores basados en virus). Este resultado es sorprendente a la vista de los informes de que se requiere simetría en la región palindrómica interna para la propagación de ácidos nucleicos similares.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas, tal como se divulgan en el presente documento, pueden tener una estabilidad genética mejorada en comparación con otros vectores de terapia génica (por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas simétricas). En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas, tal como se divulgan en el presente documento, pueden tener perfiles de seguridad mejorados en comparación con otros vectores (por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas simétricas). Por ejemplo, en algunas formas de realización, es menos probable que la administración de ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas dé como resultado mutagénesis de inserción en comparación con otros vectores (por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas simétricas) debido a la naturaleza asimétrica del constructo.
En determinadas formas de realización, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas que se han modificado genéticamente para que expresen un transcrito (por ejemplo, un transcrito que codifica una proteína o un ácido nucleico funcional) pueden tener una expresión mejorada en comparación con otros vectores (por ejemplo, ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas simétricas) porque la naturaleza asimétrica de los constructos hace que sea menos probable que interactúen en las células con determinadas enzimas (por ejemplo, helicasas, tales como helicasas RecQ) que pueden reducir la capacidad de transcripción de dichos vectores.
En algunas formas de realización, es menos probable que la administración de un ácido nucleico que tenga secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas, tal como se describe en el presente documento, induzca una respuesta inmunitaria en un sujeto en comparación con la administración de otros vectores de terapia génica (por ejemplo, vectores de ADN plasmídico y vectores víricos). Por lo tanto, en algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en el presente documento se puede administrar a un sujeto en múltiples ocasiones (por ejemplo, en el contexto de una terapia génica a largo plazo) sin inducir una respuesta inmunitaria sustancial que impida o inhiba la expresión y/o la actividad de un producto génico codificado por el ácido nucleico.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por al menos una secuencia autocomplementaria interrumpida, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que la secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forman dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que cada uno de los tallosbucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 5 a 15 pares de bases y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados.
En algunas formas de realización, las secuencias autocomplementarias interrumpidas se derivan de uno o más organismos o serotipos víricos, incluidos parvovirus, dependovirus, etc. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un ácido nucleico comprende una primera secuencia autocomplementaria interrumpida derivada de un serotipo AAV2 y una segunda secuencia autocomplementaria interrumpida derivada de un serotipo AAV9. En otro ejemplo no limitante, un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación puede comprender una primera secuencia autocomplementaria interrumpida de un serotipo AAV2 y una segunda secuencia autocomplementaria interrumpida de un parvovirus (por ejemplo, parvovirus B19). En algunas formas de realización, las secuencias autocomplementarias interrumpidas se derivan del mismo organismo o serotipo vírico pero tienen diferentes longitudes, o combinaciones de los anteriores. En algunas formas de realización, el ácido nucleico comprende una segunda secuencia autocomplementaria interrumpida que está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un ácido nucleico comprende una primera secuencia autocomplementaria autointerrumpida derivada de un serotipo AAV2 que tiene una longitud de 145 pares de bases, y una segunda secuencia autocomplementaria interrumpida derivada de un serotipo AAV2 con una longitud inferior a 145 pares de bases (por ejemplo, una secuencia de brazo transversal truncada).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forman dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que cada uno de los tallosbucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 5 a 15 pares de bases y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados, en los que la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada.
En algunas formas de realización, la(s) secuencia(s) autocomplementaria(s) interrumpida(s) tiene(n) una longitud en el intervalo de 40 a 1000 nucleótidos. En algunas formas de realización, la(s) secuencia(s) autocomplementaria(s) interrumpida(s) tiene(n) una longitud en el intervalo de 100 a 160 nucleótidos.
En algunas formas de realización, la secuencia de brazo transversal tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de -12 kcal/mol a -30 kcal/mol. En algunas formas de realización, la secuencia de brazo transversal tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de -20 kcal/mol a -25 kcal/mol.
En algunas formas de realización, cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 3 a 15 pares de bases. En algunas formas de realización, cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 8 a 10 pares de bases.
En algunas formas de realización, cada porción de bucle tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados. En algunas formas de realización, cada porción de bucle tiene tres desoxirribonucleótidos.
En algunas formas de realización, una porción de bucle tiene tres desoxitimidinas y la otra porción de bucle tiene tres desoxiadenosinas.
En algunas formas de realización, el elemento de unión a la proteína de replicación por círculo rodante es un elemento de unión a Rep (RBE). En algunas formas de realización, el RBE comprende la secuencia 5'-GCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 1).
En algunas formas de realización, el sitio de resolución terminal operativo comprende una secuencia 5'-TT-3’. En algunas formas de realización, el extremo 3’ del sitio de resolución terminal operativo se encuentra a 15 a 25 nucleótidos del extremo 5' del elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante.
En algunas formas de realización, la secuencia de brazo transversal truncada forma dos tallos-bucles longitudinalmente asimétricos opuestos. En algunas formas de realización, uno de los tallos-bucles longitudinalmente asimétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 8 a 10 pares de bases y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados. En algunas formas de realización, el bucle-tallo longitudinalmente asimétrico tiene una porción de tallo con una longitud de menos de 8 pares de bases y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos. En algunas formas de realización, el tallo-bucle longitudinalmente asimétrico tiene una porción de tallo con una longitud de menos de 3 pares de bases. En algunas formas de realización, el tallo-bucle longitudinalmente asimétrico tiene una porción de bucle que tiene 3 o menos desoxirribonucleótidos. En algunas formas de realización, la secuencia de brazo transversal truncada tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de 0 kcal/mol a -22 kcal/mol.
En algunas formas de realización, el inserto de ácido nucleico heterólogo se ha modificado genéticamente para que exprese una proteína o ARN funcional. En algunas formas de realización, el inserto de ácido nucleico heterólogo es un construto sin promotor como sustrato para la edición de genes. En algunas formas de realización, la construcción sin promotor proporciona un sustrato para TALENS, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), meganucleasas, Cas9 y otras proteínas de edición de genes. En algunas formas de realización, el constructo sin promotor está flanqueado por ácido nucleico con homología con el ADN celular para promover la recombinación homóloga en el genoma celular. En algunas formas de realización, el constructo está flanqueado por ácido nucleico con homología con el ADN celular para promover la recombinación homóloga en el genoma celular.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico tiene una longitud de 500 a 50.000 nucleótidos. En algunas formas de realización, el ácido nucleico tiene una longitud de entre 500 y 10.000 nucleótidos. En algunas formas de realización, el ácido nucleico tiene una longitud de entre 1000 y 10.000 nucleótidos. En algunas formas de realización, el ácido nucleico tiene una longitud de entre 500 y 5.000 nucleótidos.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición que comprende una pluralidad de ácidos nucleicos tal como se describen en la divulgación. En algunas formas de realización, la pluralidad de ácidos nucleicos están enlazados extremo a extremo. En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición que comprende un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición que comprende: un ácido nucleico monomérico que comprende una única subunidad; y, al menos un ácido nucleico multimérico que comprende dos o más subunidades, en el que cada subunidad del ácido nucleico monomérico y del, al menos un, ácido nucleico multimérico comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos y la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada. En algunas formas de realización, cada multímero tiene al menos un palíndromo terminal autocomplementario, y en algunos casos solo uno.
En algunas formas de realización, el, al menos un, ácido nucleico multimérico comprende dos subunidades. En algunas formas de realización, el ácido nucleico multimérico no tiene más de dos subunidades. En algunas formas de realización, las dos subunidades están enlazadas en una configuración de cola a cola, o una configuración de cabeza a cabeza, o una configuración de cabeza a cola.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una célula huésped que comprende el ácido nucleico tal como se describe en la divulgación. En algunas formas de realización, la célula huésped comprende además una proteína de replicación por círculo rodante que se une selectivamente al elemento de unión a la proteína de replicación por círculo rodante del ácido nucleico.
En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un procedimiento para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula, comprendiendo el procedimiento suministrar a la célula un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para suministrar un ácido nucleico heterólogo a un sujeto, comprendiendo el procedimiento suministrar al sujeto un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación, en el que el suministro del ácido nucleico no tiene como consecuencia la aparición de una respuesta inmunitaria adquirida contra el ácido nucleico en el sujeto. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta humoral. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta celular.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico heterólogo se suministra en múltiples ocasiones al sujeto. En algunas formas de realización, el número de ocasiones en las que se suministra (por ejemplo, se administra) ácido nucleico heterólogo al sujeto se encuentra en el intervalo de 2 a 10 veces. En algunas formas de realización, el número de ocasiones en las que se suministra ácido nucleico heterólogo al sujeto es cada hora, diariamente, semanalmente, quincenalmente, mensualmente, trimestralmente, semestralmente o anualmente. En algunas formas de realización, el número de ocasiones en las que se suministra ácido nucleico heterólogo al sujeto es el número de ocasiones necesarias para mantener un benefició clínico (por ejemplo terapéutico).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para suministrar un ácido nucleico heterólogo a un sujeto, comprendiendo el procedimiento suministrar una célula huésped tal como se describe en la divulgación al sujeto. En algunas formas de realización, la célula huésped es una célula sanguínea. En algunas formas de realización, la célula huésped es una célula progenitora (por ejemplo, una célula madre hematopoyética, HSC), mieloide o linfoide. En algunas formas de realización, la célula huésped se suministra en múltiples ocasiones. En algunas formas de realización, la frecuencia a la que se suministra la célula huésped en múltiples ocasiones está determinada por la semivida de la célula huésped. En algunas formas de realización, la célula huésped se suministra en múltiples ocasiones para lograr fpor ejemplo, lograr y mantener) un beneficio terapéutico.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento de preparación de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento: (i) introducir en una célula permisiva un ácido nucleico que codifica un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por al menos una secuencia autocomplementaria interrumpida, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que la secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tienen una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 5 a 15 pares de bases y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados; y (ii) mantener la célula permisiva en condiciones en las que una proteína de replicación por círculo rodante en la célula permisiva inicia la producción de múltiples copias del ácido nucleico.
En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además la etapa de purificar las múltiples copias del ácido nucleico. En algunas formas de realización, la purificación comprende poner en contacto el ácido nucleico con una resina de gel de sílice.
En algunas formas de realización, la proteína de replicación por círculo rodante se selecciona del grupo que consiste en Rep78 de AAV, Rep52 de AAV, Rep68 de AAV y Rep40 de AAV de tipo silvestre. En algunas formas de realización, el conjunto de proteínas de replicación por círculo rodante incluye al menos una de Rep78 de AAV y Rep68 de AAV, y una de Rep52 de AAV y Rep40 de AAV. En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante son derivados funcionalmente equivalentes de proteínas Rep de AAV de tipo silvestre que incluyen proteínas truncadas o proteínas de fusión.
En algunas formas de realización, la célula permisiva no es una célula de mamífero. En algunas formas de realización, la célula permisiva es una línea celular de insecto u otra especie de invertebrado, línea celular de levadura o línea celular bacteriana. En algunas formas de realización, la célula permisiva se usa para la producción, por ejemplo larvas de Spodoptera frugiperda. En algunas formas de realización, se ha usado el virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autograph californica (AcMNPV) recombinante ocluido para infectar larvas de S. frugiperda para la producción de proteínas recombinantes, por ejemplo, mediante un proceso de buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP) para la producción de proteínas en larvas.
En algunas formas de realización, la proteína de replicación por círculo rodante está codificada por un vector de virus auxiliar, opcionalmente en el que el vector de virus auxiliar es virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autograph californica (AcMNPV) o vectores de expresión de baculovirus (BEV).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento de preparación de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento: introducir en una célula permisiva un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada, en el que la célula permisiva expresa una proteína de replicación por círculo rodante, pero no expresa proteínas de la cápside vírica capaces de envasar copias de replicación del ácido nucleico en una partícula vírica; y mantener la célula permisiva en condiciones en las que la proteína de replicación por círculo rodante en la célula permisiva replica el ácido nucleico.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento de preparación de ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento: introducir en una célula permisiva un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que se ha determinado que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que se ha determinado que la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada, en el que la célula permisiva expresa una proteína de replicación por círculo rodante, pero no expresa proteínas de la cápside vírica capaces de envasar copias de replicación del ácido nucleico en una partícula vírica; y mantener la célula permisiva en condiciones en las que la proteína de replicación por círculo rodante en la célula permisiva replica el ácido nucleico.
En algunas formas de realización, el procedimiento comprende además aislar el ácido nucleico replicado a partir de la célula permisiva.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para analizar un ácido nucleico, comprendiendo el procedimiento: obtener una preparación de ácido nucleico que comprende productos de replicación de ácido nucleico aislados de una célula permisiva, en el que la célula permisiva comprende un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada, en el que la célula permisiva expresa una proteína de replicación por círculo rodante, pero no expresa proteínas de la cápside vírica capaces de envasar copias de replicación del ácido nucleico en una partícula vírica, y en el que la proteína de replicación por círculo rodante se une al elemento de unión de la proteína de replicación por círculo rodante del ácido nucleico y replica el ácido nucleico para producir productos de replicación del ácido nucleico; y determinar una propiedad fisicoquímica de uno o más productos de replicación.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la secuencia de nucleótidos de una, o de cada, secuencia autocomplementaria.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es el grado de multimerización de uno o más productos de replicación. En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la estequiometría de formas monoméricas y/o multiméricas del producto de replicación en la preparación de ácido nucleico.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la susceptibilidad de uno o más productos de replicación a la digestión con una endonucleasa de restricción.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la polaridad de los monómeros en una forma dimérica del producto de replicación, en la que la polaridad es de cabeza a cabeza, de cabeza a cola o de cola a cola.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es el peso molecular de uno o más productos de replicación o de un fragmento de un producto de replicación. En algunas formas de realización, el peso molecular es de un fragmento de uno o más productos de replicación que comprende una, o cada, secuencia autocomplementaria. En algunas formas de realización, el peso molecular se determina basándose en la movilidad electroforética. En algunas formas de realización, el peso molecular se determina basándose en espectroscopía de masas.
En algunas formas de realización, el peso molecular es de un fragmento de uno o más productos de replicación, y en el que antes de determinar el peso molecular, el fragmento se amplifica mediante una reacción que comprende la extensión del cebador por una polimerasa. En algunas formas de realización, la reacción que comprende la extensión del cebador es una reacción en cadena de la polimerasa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra la estructura secundaria teórica de ITR de AAV2 basada en maximizar la estabilidad y disminuir la energía libre de Gibb (AG, los valores negativos indican formación espontánea). La figura 1B muestra varios ejemplos no limitantes de truncamientos en la región de tallo de la ITR de AAV2 que dan como resultado una molécula de ácido nucleico que tiene extremos asimétricos.
Las figuras 2A-2B muestran representaciones de moléculas de ADN dúplex simétricas y asimétricas abiertas y de extremos cerrados (ADNec). La figura 2A muestra varios ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos que tienen extremos simétricos (cuadro izquierdo) y varios ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos que tienen extremos asimétricos (por ejemplo, ADNec) (cuadro derecho). La figura 2B muestra que las regiones terminales asimétricas inducen la alteración de corte de ácido nucleico y la separación de cadenas inducida durante la replicación vírica, lo que da como resultado la formación de moléculas de ADN dúplex de extremos cerrados (derecha).
La figura 3 muestra una representación gráfica de un par de ITR asimétricas. En la parte superior se muestra una ITR de AAV2 de longitud completa, y en la parte inferior se muestra una ITR de AAV2 con un truncamiento en el tallo C. Tanto la ITR completa como la truncada comprenden un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo.
La figura 4 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad ocular.
La figura 5 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad hematológica.
La figura 6 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad hepática.
La figura 7 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad pulmonar.
Las figuras 8A-8D muestran el suministro de ADNec al ojo. Se anestesiaron ratones adultos con ketamina/xilazina (100/10 mg/kg) y se suministró el agente de transfección por vía intravítrea mediante una inyección transescleral de un volumen de 1-2 gl. Se aplicó un ungüento antibiótico en la córnea para evitar que el ojo se secara mientras el ratón se recuperaba. Se dejó que el ratón se recuperara a 37 grados y después se volvió a dejar en el espacio de alojamiento del ratón durante 2 semanas y se sacrificó mediante asfixia con CO2. La retina se diseccionó y se procesó para montaje plano o sección plana. No fue necesaria tinción de anticuerpos GFP para detectar células transfectadas. La figura 8A muestra un montaje plano de fluorescencia de GFP en la retina de un ratón. La figura 8B muestra la fluorescencia de GFP en una sección transversal de la retina. La figura 8C muestra la fluorescencia de GFP y tinción de células gliales en una sección transversal de la retina. La figura 8D muestra la fluorescencia de GFP en la retina de ratón después del suministro de ADNec (por ejemplo, ADNec que tiene secuencias autocomplementarias asimétricas interrumpidas) por electroporación subretiniana (parte superior) e inyección intravítrea (parte inferior).
Las figuras 9A-9C muestran una inyección intracraneal de ADNec-GFP (por ejemplo, ADNec que tiene secuencias autocomplementarias asimétricas interrumpidas y que codifica GFP) formulado con jetPEI in vivo en el cuerpo estriado de una rata. La figura 9A muestra la tinción para la expresión de GFP a las 3 semanas y a las 20 semanas después de la inyección; se observó una expresión similar de GFP a las 3 semanas y a las 20 semanas. Las figuras 9B y 9C muestran inmunohistoquímica (IHC) con anticuerpos (Ab) contra Iba1 (figura 9B) y MHCII (figura 9C); a las 3 semanas, no se detectó ningún antígeno de MHCII o Iba1 en las secciones del cerebro.
Las figuras 10A-10B muestran los resultados de un análisis de secuencia de las secuencias autocomplementarias interrumpidas de ADN plasmídico. La figura 10C muestra la separación electroforética en gel de agarosa de ADNec-GFP. El lado izquierdo de la figura muestra electroforesis en gel nativo de ADNec-GFP y ADNec-GFP sin cortar digeridos con XhoI. Se observan productos conformadores monoméricos (~2,1 kb) y diméricos (~4,1 kb) en el gel nativo; el fragmento de extremo de 0,4 está oscurecido por la fluorescencia de las impurezas en la parte inferior del gel. El lado derecho de la figura muestra la electroforesis en gel desnaturalizante de ADNec-GFP sin cortar y ADNec-GFP digerido con XhoI. El producto de confórmero dimérico (~4,1 kb) se observa en el gel desnaturalizante; también se observaron productos terminales desnaturalizados de 0,4 kb que discurren como un ADN monocatenario a 0,8 kb.
Descripción detallada
La divulgación se refiere en algunos aspectos a composiciones y procedimientos para el suministro de un transgén a un sujeto (por ejemplo, una célula de un sujeto o un tejido de un sujeto). La divulgación se refiere, en parte, al descubrimiento de que la replicación de ácidos nucleicos que codifican un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por determinados tipos de secuencias terminales asimétricas (por ejemplo, secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas) da como resultado un enlace covalente de las secuencias terminales asimétricas y conduce a la producción de una nueva conformación de ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec). En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas pueden tener una mejor expresión, replicación (por ejemplo, rendimiento de producción) en un sujeto en comparación con los vectores de terapia génica utilizados actualmente. En algunas formas de realización, la mejora de la expresión de ácidos nucleicos que comprenden secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas está relacionada con una preferencia de las helicasas RecQ (por ejemplo, RecQ1) para interactuar con ácidos nucleicos que comprenden secuencias autocomplementarias interrumpidas simétricas en comparación con ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, que se derivan de un organismo o serotipo vírico diferente, o que se derivan del mismo organismo o serotipo vírico pero tienen longitudes diferentes, o una combinación de los anteriores) pueden tener una menor probabilidad de mutagénesis de inserción en un sujeto en comparación con los vectores de terapia génica usados actualmente. En algunas formas de realización, la administración de ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas induce una respuesta inmunitaria reducida, o no induce una respuesta inmunitaria detectable, en un sujeto con respecto a los vectores de ADN plasmídico.
Una secuencia de "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ADN o ARN. En algunas formas de realización, se aíslan proteínas y ácidos nucleicos de la divulgación. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aislado" significa producido artificialmente. En algunas formas de realización, con respecto a los ácidos nucleicos, el término "aislado" se refiere a un ácido nucleico que: (i) se ha amplificado in vitro mediante, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) se ha producido de forma recombinante mediante clonación molecular; (iii) se ha purificado, tal como por escisión mediante endonucleasa de restricción y fraccionamiento electroforético en gel, o cromatografía en columna; o (iv) se ha sintetizado mediante, por ejemplo, síntesis química. Un ácido nucleico aislado es uno que se puede manipular fácilmente mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en el que se conocen los sitios de restricción 5’ y 3' o para el que se han divulgado secuencias de cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera aislada, pero una secuencia de ácido nucleico que existe en su estado nativo en su huésped natural no lo está. Un ácido nucleico aislado puede purificarse sustancialmente, pero no necesariamente. Por ejemplo, un ácido nucleico que está aislado dentro de un vector de clonación o expresión no es puro porque puede comprender solo un porcentaje minúsculo del material de la célula en la que reside. Sin embargo, dicho ácido nucleico está aislado, tal como se utiliza el término en el presente documento, porque es fácilmente manipulable mediante técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. Tal como se utiliza en el presente documento con respecto a proteínas o péptidos, el término "aislado" se refiere a una proteína o un péptido que se ha aislado de su entorno natural o se ha producido artificialmente (por ejemplo, por síntesis química, por tecnología de ADN recombinante, etc.).
El experto en la técnica también reconocerá que se pueden realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos para proporcionar variantes u homólogos funcionalmente equivalentes de las proteínas de la cápside. En algunos aspectos, la divulgación abarca alteraciones de secuencia que dan como resultado sustituciones conservadoras de aminoácidos. Tal como se utiliza en el presente documento, una sustitución conservadora de aminoácidos se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera las características de carga relativa ni el tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoácidos. Las variantes se pueden preparar de acuerdo con procedimientos para alterar la secuencia de polipéptidos conocidos por un experto en la técnica, tales como los que se encuentran en las referencias que recopilan dichos procedimientos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., Eds., segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los grupos siguientes: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D. Por lo tanto, se pueden realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de proteínas y polipéptidos descritos en el presente documento.
Secuencias autocomplementarias interrumpidas
La divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que los ácidos nucleicos que tienen secuencias terminales asimétricas (por ejemplo, secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas) forman estructuras de ADN dúplex lineales de extremos cerrados (por ejemplo, ADNec) que, en algunas formas de realización, muestran una inmunogenicidad reducida en comparación con los vectores de suministro de genes actualmente disponibles. En algunas formas de realización, el ADNec se comporta como ADN dúplex lineal en condiciones nativas y se transforma en ADN circular monocatenario en condiciones desnaturalizantes. Sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, los ácidos nucleicos descritos en la divulgación (por ejemplo, ADNec) son útiles, en algunas formas de realización, para el suministro de insertos de ácidos nucleicos heterólogos (por ejemplo, transgenes) a un sujeto.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos, en el que cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo y una porción de bucle, en el que la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "flanqueado" se refiere al posicionamiento de una primera secuencia autocomplementaria interrumpida cadena arriba (por ejemplo, 5') con respecto a un inserto de ácido nucleico heterólogo y una segunda secuencia autocomplementaria interrumpida cadena abajo (por ejemplo, 3') con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo. Por ejemplo, un genoma de virus adenoasociado comprende marcos de lectura abiertos de genes rep y cap "flanqueados" por repeticiones terminales invertidas (ITR).
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "secuencia autocomplementaria interrumpida" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que codifica un ácido nucleico que tiene secuencias terminales palindrómicas (por ejemplo, un tramo contiguo de polinucleótidos que es idéntico a su cadena complementaria, si ambos se "leen" en la misma dirección 5’ a 3') que están interrumpidas por uno o más tramos de polinucleótidos no palindrómicos. Generalmente, un polinucleótido que codifica una o más secuencias palindrómicas interrumpidas se plegará hacia atrás sobre sí mismo, formando una estructura de tallo-bucle (por ejemplo, un bucle de horquilla, un bucle en forma de "T" o un bucle en forma de "Y"), por ejemplo, tal como se muestra en la estructura de ITR de AAV2 representada en la figura 1A y las estructuras de ejemplo representadas en la figura 2A.
En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida forma una estructura en forma de "T" que tiene una secuencia de tallo y una secuencia de brazo transversal. En algunas formas de realización, la "secuencia de brazo transversal" forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos (por ejemplo, con respecto a la secuencia del tallo), en la que cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo y una porción de bucle. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la secuencia del tallo se forma mediante la hibridación de los extremos 5’ y 3' complementarios (por ejemplo, palindrómicos) de una secuencia polinucleotídica (denominada "A-A"'), en la que el palíndromo A-A' está interrumpido por la secuencia polinucleotídica de brazo transversal formada por un par de secuencias palindrómicas interrumpidas formadoras de bucle denominadas "B-B"' y "C-C"', respectivamente, tal como se muestra en la figura 1 A. En algunas formas de realización, la porción de bucle de cada brazo transversal (por ejemplo, los bucles formados por las secuencias palindrómicas interrumpidas B-B' y C-C') se forma a partir de nucleótidos no apareados (por ejemplo, desoxirribonucleótidos no apareados). Debe apreciarse que una secuencia autocomplementaria interrumpida descrita en la divulgación puede comprender más de dos (por ejemplo, 3, 4 o más) secuencias de brazo transversal.
Una secuencia autocomplementaria interrumpida puede tener cualquier tamaño, siempre que la secuencia forme un bucle en horquilla y funcione como un cebador para la replicación del ácido nucleico (por ejemplo, replicación del ADN). Por ejemplo, una secuencia autocomplementaria interrumpida puede variar de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida varía de aproximadamente 40 a 1000 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida tiene al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900 o hasta 1000 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida tiene más de 1000 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida varía de aproximadamente 100 a 160 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un nucleótido autocomplementario interrumpido varía de aproximadamente 115 a aproximadamente 150 nucleótidos de longitud.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia autocomplementaria interrumpida que forma tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos. En algunas formas de realización, cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 3 a 15 pares de bases. En algunas formas de realización, cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 8 a 10 pares de bases. En algunas formas de realización, cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 nucleótidos.
Generalmente, una porción de bucle de una estructura de tallo-bucle comprende al menos 2 nucleótidos no apareados. En algunas formas de realización, cada porción de bucle tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 desoxirribonucleótidos no apareados). En algunas formas de realización, cada porción de bucle de una secuencia de brazo transversal descrita en la divulgación tiene tres desoxirribonucleótidos. En algunas formas de realización, una porción de bucle de una secuencia de brazo transversal descrita en la divulgación tiene tres desoxitimidinas y la otra porción de bucle tiene tres desoxiadenosinas.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a secuencias autocomplementarias interrumpidas que flanquean un inserto de ácido nucleico, en el que las secuencias autocomplementarias interrumpidas son asimétricas entre sí (por ejemplo, se derivan de un organismo o serotipo vírico diferente, o se derivan del mismo organismo o serotipo vírico pero tienen longitudes diferentes, o una combinación de los anteriores). En algunas formas de realización, una secuencia de un par de secuencias autocomplementarias asimétricas comprende una secuencia de brazo transversal truncada. Tal como se utiliza en el presente documento, "secuencia de brazo transversal truncada" se refiere a una secuencia de brazo transversal que tiene una longitud más corta con respecto a la correspondiente secuencia autocomplementaria que flanquea una secuencia de ácido nucleico heterólogo. Una secuencia de brazo transversal truncada puede tener entre 1 y 50 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50) deleciones de nucleótidos con respecto a una secuencia de brazo transversal de longitud completa. En algunas formas de realización, una secuencia de brazo transversal truncada tiene entre 1 y 30 deleciones de nucleótidos con respecto a una secuencia de brazo transversal de longitud completa. En algunas formas de realización, una secuencia de brazo transversal truncada contiene entre 2 y 20 deleciones de nucleótidos con respecto a una secuencia de brazo transversal de longitud completa.
En algunas formas de realización, una secuencia de brazo transversal truncada forma dos tallos-bucles longitudinalmente asimétricos opuestos. En algunas formas de realización, uno de los tallos-bucles longitudinalmente asimétricos opuestos de la secuencia de brazo transversal truncada tiene una porción de tallo en el intervalo de 8 a 10 pares de bases de longitud y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados. En algunas formas de realización, un tallo-bucle longitudinalmente asimétrico de una secuencia de brazo transversal truncado tiene una porción de tallo de menos de 8 pares de bases de longitud y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos. En algunas formas de realización, el tallo-bucle longitudinalmente asimétrico tiene una porción de tallo con una longitud de menos de 3 pares de bases. En algunas formas de realización, el tallo-bucle longitudinalmente asimétrico tiene una porción de bucle que tiene 3 o menos desoxirribonucleótidos.
Generalmente, una secuencia de brazo transversal truncada no contiene ninguna deleción de nucleótidos (por ejemplo, con respecto a una secuencia de brazo transversal no truncada) en las regiones A o A’, para no interferir con la replicación del ADN (por ejemplo, unión a un RBE por la proteína Rep, o corte en un sitio de resolución terminal). En algunas formas de realización, una secuencia de brazo transversal truncada tiene una o más deleciones en la región B, B’, C y/o C'. A continuación se muestran varios ejemplos no limitantes de secuencias de brazo transversal truncadas:
La región C de ITR de AAV2 A está indicada entre paréntesis; se pueden utilizar deleciones totales o parciales dentro de los corchetes para crear secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas; abajo, "RBE"' se refiere a "elemento de unión a Rep".
Región C Región B
A RBE’
5’cggg(cgaccaaaggtc)gcccg-a-cgcccgggctttgcccgggc (SEQ ID NO: 2)
5’cggg(cgaccaaaggtcg)cccg-a-cgcccgggctttgcccgggc (SEQ ID NO: 2)
5’gccc(gggcaaagccc)gggcg-t-cgggcgacctttggtcgcccg (SEQ ID NO: 3)
5’gccc(gggcaaagccc)gggcg-t-cgggcgacctttggtcgcccg (SEQ ID NO: 3)
5’[cgggcgaccaaaggtcgcccg]-a-cgcccgggctttgcccgggc (SEQ ID NO: 2)
5’[cgggcgaccaaaggtcgcccg]-a-cgcccgggctttgcccgggc (SEQ ID NO: 2)
5’ [gcccgggcaaagcccgggcg]-t-cgggcgacctttggtcgcccg (SEQ ID NO: 3)
5’ [gcccgggcaaagcccgggcg]-t-cgggcgacctttggtcgcccg (SEQ ID NO: 3)
Generalmente, las propiedades termodinámicas de un ácido nucleico (por ejemplo, la energía libre de Gibbs (AG), la composición G C, la composición A T, la temperatura de fusión, la composición de bases de cada cadena, la longitud de la secuencia complementaria, las bases no apareadas dentro de la región dúplex y las bases no apareadas que constituyen el bucle) necesarias para la formación de horquilla son conocidas en la técnica, por ejemplo, tal como se divulga por Bosco et al., Nucl. Acids Res. (2013) doi: 10.1093/nar/gkt1089; publicado por primera vez en línea: 12 de noviembre de 2013.
En algunas formas de realización, la secuencia de brazo transversal tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de -12 kcal/mol a -30 kcal/mol. En algunas formas de realización, la secuencia de brazo transversal tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de -20 kcal/mol a -25 kcal/mol. En algunas formas de realización, las propiedades termodinámicas de una secuencia de brazo transversal truncada pueden ser las mismas (por ejemplo, idénticas) con respecto a una secuencia de brazo transversal de longitud completa, incluso aunque tengan diferencias de secuencia que las hagan asimétricas. En algunas formas de realización, las propiedades termodinámicas de una secuencia de brazo transversal truncada pueden ser diferentes a las de una secuencia de brazo transversal de longitud completa. Por ejemplo, en algunas formas de realización, una secuencia de brazo transversal truncada tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de 0 kcal/mol a más de -22 kcal/mol.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "operativo" se refiere a la capacidad de una secuencia de ácido nucleico para realizar su función prevista. Por ejemplo, una "región de unión operativa" es una secuencia de ácido nucleico que conserva la función de unión para su objetivo previsto (por ejemplo, una proteína o ácido nucleico). En otro ejemplo, un "sitio de escisión operativo" es una secuencia de ácido nucleico que conserva su capacidad para ser escindida específicamente por una o más enzimas particulares.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren al descubrimiento de que se requieren secuencias de ácido nucleico autocomplementarias que comprenden un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante operativo para la formación de ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec). Tal como se utiliza en el presente documento, "elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante" se refiere a una secuencia de ácido nucleico conservada (por ejemplo, un motivo) que se reconoce por una proteína de replicación por círculo rodante, que es una proteína no estructural (proteína NS) vírica que inicia la replicación por círculo rodante (por ejemplo, horquilla rodante) y se une a la misma. La replicación por círculo rodante (por ejemplo, horquilla rodante) se describe por Tattersall et al. Nature 2009, 263, páginas 106-109. Los ejemplos de proteínas NS incluyen, pero sin limitación, proteínas Rep de AAV (por ejemplo, Rep78, Rep68, Rep52, Rep40), proteínas no estructurales de parvovirus (por ejemplo, NS2), proteínas no estructurales de rotavirus (por ejemplo, NSP1) y proteínas no estructurales de densovirus (por ejemplo, PfDNV NS1). En algunas formas de realización, el elemento de unión a la proteína de replicación por círculo rodante es un elemento de unión a Rep (RBE). En algunas formas de realización, el RBE comprende la secuencia 5'-GCTCGCTCGCTC-3'.
En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante son del género dependoparvovirus de la familia de virus con genomas de ADN monocatenario lineal Parvoviridae. En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante son de los géneros de Parvovirinae autónomos que incluyen el virus diminuto de ratón, el virus de la enfermedad del visón de las Aleutianas, el parvovirus bovino, el parvovirus canino, el parvovirus del pollo, el virus de la panleucopenia felina, el parvovirus felino, el parvovirus de ganso, el parvovirus HB, el parvovirus H-1, el virus de la rata Kilham, el parvovivirus lapino, el virus LUIII, el virus de la enteritis de visón, el parvovirus de ratón, el parvovirus porcino, el parvovivurs de mapache, el parvovirus RT, el virus tumoral X, el parvovirus de rata 1a, el parvovirus de pato Barbarie, el parvovirus equino, el parvovirus de hámster y el virus de la artritis reumatoide 1. En algunas formas de realización, el género es parvovirus. En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante son de los géneros de Densovirinae, que incluyen brevidensovirus, densovirus e iteravirus.
En algunas formas de realización, una proteína de replicación por círculo rodante es de los géneros de la subfamilia Parvovirinae. Los ejemplos de los géneros de Parvovirinae incluyen, pero sin limitación, Amdoparvovirus, Aveparvovirus, Bocaparvovirus, Copiparvovirus, Dependoparvovirus, Erythroparvovirus, Protoparvovirus, Tetraparvovirus. En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante son de los géneros de la subfamilia Densovirinae. Los ejemplos de los géneros de Densovirinae incluyen, pero sin limitación, Amdoparvovirus, Aveparvovirus, Bocaparvovirus, Copiparvovirus, Dependoparvovirus, Erythroparvovirus, Protoparvovirus, y Tetraparvovirus. En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante son de un Dependovirus, tales como virus adenoasociado 2 (AAV2), virus adenoasociado 3 (AAV3), virus adenoasociado 4 (AAV4) o virus adenoasociado 5 (AAV5), o cualquier combinación de los mismos.
En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante se derivan de las familias de bacteriófagos de ADN monocatenario. En algunas formas de realización, las familias de virus son Microviridae e Inoviridae.
En algunas formas de realización, las proteínas de replicación por círculo rodante se derivan de bacterias Gram positivas.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren al descubrimiento de que las secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas que comprenden un sitio de resolución terminal (trs) operativo son necesarias para la formación de ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec). Normalmente, la replicación de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas (por ejemplo, ITR de AAV) se inicia desde el extremo 3' del brazo transversal (por ejemplo, estructura de horquilla) y genera una molécula dúplex en la que uno de los extremos está cerrado covalentemente; los extremos cerrados covalentemente de la molécula dúplex se escinden después mediante un proceso llamado resolución terminal para formar dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias separadas. Sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, el proceso de resolución terminal está mediado por una escisión de endonucleasa específica de sitio y de cadena en un sitio de resolución terminal (trs) (por ejemplo, una proteína de replicación por círculo rodante, tal como la proteína Rep de AAV). Los ejemplos de secuencias trs incluyen 3'-CCGGTTG-5 y 5'-AGTTGG-3' (reconocidas por la proteína AAV2 p5). Se ha planteado la hipótesis de que el corte de cadena mediado por Rep tiene lugar entre la porción central de di-timidina ("TT") de la secuencia trs. Por lo tanto, en algunas formas de realización, el sitio de resolución terminal operativo comprende una secuencia 5'-TT-3'.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren al posicionamiento de un sitio de resolución terminal (trs) con respecto a un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante. Generalmente, un trs se ubica cadena arriba (por ejemplo, 5') con respecto a un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante. Sin embargo, en algunas formas de realización, un trs está ubicado cadena abajo (por ejemplo, 3') con respecto a un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante. En algunas formas de realización, el extremo 3' del sitio de resolución terminal operativo tiene de 15 a 25 nucleótidos (por ejemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos) desde el extremo 5' del elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante.
En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida es una secuencia de repetición terminal invertida de AAV. La secuencia de ITR de AAV puede ser de cualquier serotipo de AAV, que incluye, pero sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, serotipos de AAV de primates no humanos (por ejemplo, AAVrh.10) y variantes de los mismos. En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida es una ITR de AAV2 o una variante de la misma (por ejemplo, ITR de AAV2, o una ITR de AAV2 truncada que tiene una deleción en el "brazo B" o "brazo C"). En algunas formas de realización, una secuencia autocomplementaria interrumpida es una ITR de AAV5 o una variante de la misma (por ejemplo, ITR de AAV5, o una ITR de AAV5 truncada que tiene una deleción en el "brazo B" o "brazo C"). Tal como se utiliza en el presente documento, una "variante" de una ITR de AAV es un polinucleótido que tiene entre aproximadamente el 70% y aproximadamente el 99,9% de similitud con una secuencia de ITR de AAV de tipo silvestre. En algunas formas de realización, una variante de ITR de AAV es aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o aproximadamente el 99% idéntica a una ITR de AAV de tipo silvestre.
Una ITR de AAV puede existir en dos conformaciones: "flip" y "flop", que son el resultado del mecanismo de horquilla rodante de la replicación del AAV. A continuación se muestra un ejemplo no limitante de una secuencia autocomplementaria interrumpida (por ejemplo, ITR de AAV2) en conformaciones tanto "flip" como "flop":
GenBank (>gi| 110645916|ref|NC_001401.2| Virus adenoasociado - 2, genoma completo)
Conformación flop
(SEQ ID NO: 4)
t t a a c c a c t c c c t c t c t a c a c a c t c a c t c a c t c a c t a a a a c c a a a c a a c c a a a a a tc a c c c a a c a c c c a a a c t t t a
a a c c q q t q a a q q a q a q a c q c q c q a q c q a a c q a q t q a c t c c q a c c c a c t a a t t t c c a a c a a a c t a c a a a c c c a a a a c
(SEQ ID NO: 5)
c c c g g g c _ g g c c t c a g t g a g c g a g c g a g c g c g c a g a g a g g g a g t g g c c a a c t c c a t c a c t a g g g g t t c c t
£ 22 c c c g _ c c g g a g t c a c t c g c t c g c t c g c g c g t c t c t c c c t c a c c g g t t g a g g t a g t g a t c c c c a a g g a
Conformación flip
(SEQ ID NO: 6)
a g g a a c c c c t a g t g a t g g a g t t g g c c a c t c c c t c t c t g c g c g c t c g c t c g c t c a c t g a g g c c _ g g g cg a cca a a g g t
t c c t t g g g g a t c a c t a c c t c a a c c g g t g a g g g a g a g a c g c g c g a g c g a g c g a g t g a c t c c g g _ c c c g c t g g t t t c c a
(SEQ ID NO: 7)
c g c c c g a c g c c c g g g c t t t g c c c g g g c g _ g c c t c a g t g a g c g a g c g a g c g c g c a g a g a g g g a g t g g c c a a
g c g g g c t g c g g g c c c g a a a c g g g c c c g c _ c g g a g t c a c t c g c t c g c t c g c g c g t c t c t c c c t c a c c g g t t
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación (por ejemplo, ADNec) comprende una secuencia autocomplementaria interrumpida en la conformación flip. En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación (por ejemplo, ADNec) comprende una secuencia autocomplementaria interrumpida en la conformación flop.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren a composiciones que comprenden una población de ácidos nucleicos descritos en la divulgación. Generalmente, las poblaciones pueden ser homogéneas (por ejemplo, que comprenden múltiples copias del mismo ácido nucleico) o heterogéneas (por ejemplo, que comprende múltiples ácidos nucleicos diferentes). Por ejemplo, en algunas formas de realización, una composición comprende un ácido nucleico monomérico (por ejemplo, una población de una única especie de ácido nucleico monomérico) que comprende una única subunidad. En algunas formas de realización, la subunidad comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en la que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a la proteína de replicación en círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos y la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada.
En algunas formas de realización, una composición comprende un ácido nucleico multimérico que comprende dos o más subunidades (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más subunidades). En algunas formas de realización, cada subunidad del ácido nucleico multimérico comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas, en la que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que una secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos y la otra de las secuencias autocomplementarias está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada. En algunas formas de realización, el ácido nucleico multimérico comprende dos subunidades (por ejemplo, es un dímero). En algunas formas de realización, cada multímero tiene al menos un palíndromo terminal autocomplementario, y en algunos casos solo uno.
En algunas formas de realización, las subunidades de un ácido nucleico multimérico forman concatámeros. Tal como se utiliza en el presente documento, "concatámero" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende múltiples copias de las mismas, o sustancialmente las mismas, secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, subunidades) que normalmente están enlazadas formando una serie. En algunas formas de realización, los concatámeros descritos en la divulgación pueden estar orientados en una polaridad de cabeza a cabeza o de cola a cola. En formas de realización en las que las subunidades contienen una secuencia de ácido nucleico heterólogo configurada para expresar un transcrito de ARN, la polaridad de "cabeza a cabeza" se refiere a un concatámero en el que las secuencias autocomplementarias interrumpidas más cercanas a la secuencia promotora de cada subunidad están unidas covalentemente (por ejemplo, las subunidades están enlazadas del extremo 5’ al extremo 5'). En dichas formas de realización, la polaridad de "cola a cola" se refiere a un concatámero en el que las secuencias autocomplementarias interrumpidas distales a la secuencia promotora de cada subunidad están unidas covalentemente (por ejemplo, las subunidades están enlazadas del extremo 5’ al extremo 5'). En algunas formas de realización, las dos subunidades están enlazadas en una configuración (por ejemplo, polaridad) de cola a cola.
En algunas formas de realización, una composición comprende ácidos nucleicos tanto monoméricos como multiméricos (por ejemplo, comprende una población heterogénea de ácidos nucleicos).
Insertos de ácido nucleico heterólogo
La composición de la secuencia de transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) del ácido nucleico dependerá del uso que se le dé al ácido nucleico resultante. Por ejemplo, un tipo de secuencia de transgén incluye una secuencia reportera, que tras la expresión produce una señal detectable. En otro ejemplo, el transgén codifica una proteína terapéutica o ARN funcional terapéutico. En otro ejemplo, el transgén codifica una proteína o ARN funcional que se pretende utilizar con fines de investigación, por ejemplo, para crear un modelo animal transgénico somático que alberga el transgén, por ejemplo, para estudiar la función del producto transgénico. En otro ejemplo, el transgén codifica una proteína o ARN funcional que se pretende utilizar para crear un modelo animal de enfermedad. Las secuencias codificantes de transgén apropiadas resultarán evidentes para el experto en la técnica.
La divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que, a diferencia de los vectores AAV, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) no están limitados con respecto al tamaño de un inserto de ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, una secuencia de transgén). En algunas formas de realización, un transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 5.000 pares de bases, de aproximadamente 10 a aproximadamente 10.000 pares de bases, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50.000 pares de bases de longitud. En algunas formas de realización, un transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 pares de bases de longitud. En algunas formas de realización, un transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas varía de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 pares de bases de longitud. En algunas formas de realización, un transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 pares de bases de longitud. En algunas formas de realización, un transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 5000 pares de bases de longitud. En algunas formas de realización, el tamaño de un transgén (por ejemplo, inserto de ácido nucleico heterólogo) supera la capacidad de un vector AAV tradicional (por ejemplo, la supera en aproximadamente 4,8 kb).
Las secuencias reporteras que pueden proporcionarse en un transgén incluyen, sin limitación, secuencias de ADN que codifican p-lactamasa, p-galactosidasa (LacZ), fosfatasa alcalina, timidina quinasa, proteína verde fluorescente (GFP), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), luciferasa y otras bien conocidas en la técnica. Cuando se asocian con elementos reguladores que impulsan su expresión, las secuencias reporteras proporcionan señales detectables por medios convencionales, incluidos ensayos enzimáticos, radiográficos, colorimétricos, de fluorescencia u otros ensayos espectrográficos, ensayos de clasificación celular activada por fluorescencia y ensayos inmunológicos, incluido el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) e inmunohistoquímica. Por ejemplo, cuando la secuencia marcadora es el gen LacZ, la presencia del vector que porta la señal se detecta mediante ensayos de actividad de p-galactosidasa. Cuando el transgén es una proteína verde fluorescente o luciferasa, el vector que porta la señal puede medirse visualmente mediante la producción de luz o color en un luminómetro. Dichos reporteros pueden ser útiles, por ejemplo, para verificar las capacidades de direccionamiento específicas de tejido y la actividad reguladora del promotor específico de tejido de un ácido nucleico.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona ácidos nucleicos para su uso en procedimientos de prevención o tratamiento de una o más deficiencias o disfunciones genéticas en un mamífero, tales como por ejemplo, una deficiencia de polipéptido o exceso de polipéptido en un mamífero, y particularmente para tratar o reducir la gravedad o el grado de la deficiencia en un ser humano que manifiesta uno o más de los trastornos relacionados con una deficiencia de tales polipéptidos en células y tejidos. El procedimiento implica la administración de ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación) que codifica uno o más péptidos, polipéptidos, ARNip, microARN, nucleótidos antisentido terapéuticos, etc., en un vehículo farmacéuticamente aceptable al sujeto en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficiente para tratar la deficiencia o trastorno en el sujeto que padece dicho trastorno.
Por lo tanto, la divulgación abarca el suministro de ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos tal como se describen en la divulgación) que codifican uno o más péptidos, polipéptidos o proteínas, que son útiles para el tratamiento o la prevención de estados patológicos en un sujeto mamífero. Los ejemplos de proteínas terapéuticas incluyen uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en factores de crecimiento, interleucinas, interferones, factores antiapoptosis, citocinas, factores antidiabéticos, agentes antiapoptosis, factores de coagulación, factores antitumorales. Otros ejemplos no limitantes de proteínas terapéuticas incluyen BDNF, CNTF, CSF, EGF, FGF, G-SCF, GM-CSF, gonadotropina, IFN, IFG-1, M-CSF, NGF, PDGF, PEDF, TGF, VEGF, TGF-B2, TNF, prolactina, somatotropina, XIAP1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-10(187A), IL-10 vírica, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 e IL-18.
Los ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos tal como se describen en la divulgación) pueden comprender un gen que se va a transferir a (por ejemplo, expresar en) un sujeto para tratar una enfermedad asociada con expresión reducida, falta de expresión o disfunción del gen. Los ejemplos de genes y los estados patológicos asociados incluyen, pero sin limitación: glucosa-6-fosfatasa, asociada con deficiencia de almacenamiento de glucógeno tipo 1A; fosfoenolpiruvato-carboxiquinasa, asociada con la deficiencia de Pepck; galactosa-1 fosfato uridil transferasa, asociada con galactosemia; fenilalanina hidroxilasa, asociada con fenilcetonuria; alfa-cetoácido de cadena ramificada deshidrogenasa, asociada con la enfermedad de la orina de jarabe de arce; fumarilacetoacetato hidrolasa, asociada con tirosinemia de tipo 1; metilmalonil-CoA mutasa, asociada con acidemia metilmalónica; acil CoA de cadena media deshidrogenasa, asociada con deficiencia de acetil CoA de cadena media; omitina transcarbamilasa, asociada con deficiencia de omitina transcarbamilasa; ácido argininosuccínico sintetasa, asociada con citrulinemia; proteína receptora de lipoproteínas de baja densidad, asociada con hipercolesterolemia familiar; UDP-glucouronosiltransferasa, asociada con la enfermedad de Crigler-Najjar; adenosina desaminasa, asociada con una enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave; hipoxantina guanina fosforribosil transferasa, asociada con gota y síndrome de Lesch-Nyan; biotinidasa, asociada con deficiencia de biotinidasa; beta-glucocerebrosidasa, asociada con la enfermedad de Gaucher; beta-glucuronidasa, asociada con el síndrome de Sly; proteína de membrana de peroxisoma de 70 kDa, asociada con el síndrome de Zellweger; porfobilinógeno desaminasa, asociada con porfiria aguda intermitente; alfa-1 antitripsina para el tratamiento de la deficiencia de alfa-1 antitripsina (enfisema); eritropoyetina para el tratamiento de la anemia debida a talasemia o insuficiencia renal; factor de crecimiento del endotelio vascular, angiopoyetina-1 y factor de crecimiento de fibroblastos para el tratamiento de enfermedades isquémicas; trombomodulina e inhibidor de la ruta del factor tisular para el tratamiento de vasos sanguíneos obstruidos tal como se observa, por ejemplo, en aterosclerosis, trombosis o embolias; aminoácido aromático descarboxilasa (AADC) y tirosina hidroxilasa (TH) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson; el receptor beta adrenérgico, antisentido con respecto a, o una forma mutante de, fosfolambán, adenosina trifosfatasa-2 del retículo sarco(endo)plásmico (SERCA2) y la adenilil ciclasa cardiaca para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva; un gen supresor de tumores tal como p53 para el tratamiento de varios cánceres; una citocina tal como una de las diversas interleucinas para el tratamiento de cánceres y trastornos inflamatorios e inmunitarios; distrofina o minidistrofina y utrofina o miniutrofina para el tratamiento de distrofias musculares; e insulina para el tratamiento de la diabetes.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el sistema nervioso central (SNC). La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedad del SNC: DRD2, GRIA1, GRIA2,GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER, asociados con la enfermedad de Alzheimer; UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB, gstm1, S106p, asociados con la enfermedad de Parkinson; IT15, PRNP, JPH3, Tb P, a Tx N1, ATXN2, ATXN3, atrofina 1, FTL, TITF-1, asociados con la enfermedad de Huntington; FXN, asociado con ataxia de Freidrich; ASPA, asociado a la enfermedad de Canavan; DMD, asociado con distrofia muscular; y SMN1, UBE1, DYNC1H1 asociados con atrofia muscular espinal. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de acido nucleico heterologo que expresa uno o mas de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de acido nucleico heterologo que expresa uno o mas ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o mas de los genes anteriores.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el sistema cardiovascular. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedades cardiovasculares: VEGF, FGF, SDF-1, conexina 40, conexina 43, SCN4a, HIF1a, SERCa2a, ADCY1 y ADCY6. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o más de los genes anteriores.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el sistema pulmonar. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedad pulmonar: CFTR, AAT, TNFa, TGFp1, SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC, HPS1, HPS3, HPS4, ADTB3A, ILIA, IL1B, LTA, IL6, CXCR1 y CXCR2. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o más de los genes anteriores. En la figura 10 se representan ejemplos no limitantes de insertos de ácido nucleico heterólogo que codifican una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el sistema pulmonar.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el hígado. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedad hepática: a1-AT, HFE, ATP7B, fumarilacetoacetato hidrolasa (FAH), glucosa-6-fosfatasa, NCAN, GCKR, LYPLAL1, PNPLA3, lecitina colesterol acetiltransferasa, fenilalanina hidroxilasa y G6PC. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o más de los genes anteriores. En la figura 9 se representan ejemplos no limitantes de insertos de ácido nucleico heterólogo que codifican una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el hígado.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el riñón. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedad renal: PKD1, PKD2, PKHD1, NPHS1, NPHS2, PLCE1, CD2AP, LAMB2, TRPC6, WT1, LMX1B, SMARCAL1, COQ2, PDSS2, SCARB3, FN1, COL4A5, COL4A6, COL4A3, COL4A4, FOX1C, RET, UPK3A, BMP4, SIX2, CDC5L, USF2, ROBO2, SLIT2, EYA1, MYOG, SIX1, SIX5, FRAS1, FREM2, GATA3, KAL1, Pa X2, t Cf2 y SALL1. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o más de los genes anteriores.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el ojo. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedad ocular: ABCA4, VEGF, CEP290, CFH, C3, MT-ND2, ARMS2, TIMP3, CAMK4, FMN1, RHO, USH2A, RPGR, RP2, TMCO, SIX1, SIX6, LRP12, ZFPM2, TBK1, GALC, miocilina, CYP1B1, CAV1, CAV2, optineurina y CDKN2B. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o más de los genes anteriores. En la figura 7 se representan ejemplos no limitantes de insertos de ácido nucleico heterólogo que codifican una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con el ojo.
En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con la sangre (por ejemplo, glóbulos rojos). La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con enfermedades y trastornos de la sangre: factor VIII (FVIII), factor IX (FIX), factor de von Willebrand (VWF). En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más de los genes anteriores o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que expresa uno o más ARN funcionales que inhiben la expresión de uno o más de los genes anteriores. En la figura 8 se representan ejemplos no limitantes de insertos de ácido nucleico heterólogo que codifican una proteína o ARN funcional útil para el tratamiento de una afección, enfermedad o trastorno asociado con la sangre.
Los ácidos nucleicos de la divulgación (por ejemplo, ácido nucleico que tiene un inserto de ácido nucleico heterólogo) se pueden utilizar para restaurar la expresión de genes cuya expresión está reducida, están silenciados o son de otra forma disfuncional en un sujeto (por ejemplo, un supresor de tumores que se ha silenciado en un sujeto que tiene cáncer). Los ácidos nucleicos de la divulgación también se pueden utilizar para reducir la expresión de genes que se expresan de forma aberrante en un sujeto (por ejemplo, un oncogén que se expresa en un sujeto que tiene cáncer). En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico asociado con el cáncer (por ejemplo, supresores de tumores) puede utilizarse para tratar el cáncer, administrando el ácido nucleico que comprende el inserto de ácido nucleico heterólogo a un sujeto que tiene cáncer. En algunas formas de realización, un ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un ácido nucleico pequeño de interferencia (por ejemplo, ARNip, miARN) que inhibe la expresión de un producto génico asociado con el cáncer (por ejemplo, oncogenes) se puede usar para tratar el cáncer, administrando el ácido nucleico que comprende el inserto de ácido nucleico heterólogo a un sujeto que tiene cáncer. En algunas formas de realización, el ácido nucleico que comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico asociado con el cáncer (o un ARN funcional que inhibe la expresión de un gen asociado con el cáncer) puede utilizarse con fines de investigación, por ejemplo para estudiar el cáncer o identificar tratamientos terapéuticos que tratan el cáncer. La siguiente es una lista no limitante de ejemplos de genes que se sabe que están asociados con el desarrollo del cáncer (por ejemplo, oncogenes y supresores tumorales): AARS, ABCB1, a Bc C4, ABI2, ABL1, ABL2, ACK1, ACP2, ACY1, ADSL, AK1, AKR1C2, AKT1, ALB, ANPEP, ANXA5, ANXA7, AP2M1, APC, ARHGAP5, ARHGEF5, ARID4A, ASNS, ATF4, ATM, ATP5B, ATP5O, AXL, BARD1, BAX, BCL2, BHLHB2, BLMH, BRAF, BRCA1, BRCA2, BTK, CANX, CAP1, CAPN1, CAPNS1, CAV1, CBFB, CBLB, CCL2, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CCT5, CCYR61, CD24, CD44, CD59, CDC20, CDC25, CDC25A, CDC25B, CDC2L5, CDK10, CDK4, CDK5, CDK9, CDKL1, CDKN1A, CDKN1B, CDKN1C, CDKN2A, CDKN2B, CDKN2D, CEBPG, CENPC1, CGRRF1, CHAF1A, CIB1, CKMT1, CLK1, CLK2, CLK3, CLNS1A, CLTC, COL1A1, COL6A3, COX6C, COX7A2, CRAT, CRHR1, CSF1R, CSK, CSNK1G2, CTNNA1, CTNNB1, CTPS, CTSC, CTSD, CUL1, CYR61, DCC, DCN, DDX10, DEK, DHCR7, DHRS2, DHX8, DLG3, DVL1, DVL3, E2F1, E2F3, E2F5, EGFR, EGR1, EIF5, EPHA2, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC3, ETV1, ETV3, ETV6, F2R, FASTK, FBN1, FBN2, FES, FGFR1, FGR, FKBP8, FN1, FOS, FOSL1, FOSL2, FOXG1A, FOXO1A, FRAP1, FRZB, FTL, FZD2, FZD5, FZD9, G22P1, GAS6, GCN5L2, GDF15, GNA13, GNAS, GNB2, GNB2L1, GPR39, GRB2, GSK3A, GSPT1, GTF2I, HDAC1, HDGF, HMMR, HPRT1, HRB, HSPA4, HSPA5, HSPA8, HSPB1, HSPH1, HYAL1, HYOU1, ICAM1, ID1, ID2, IDUA, IER3, IFITM1, IGF1R, IGF2R, IGFBP3, IGFBP4, IGFBP5, IL1B, ILK, ING1, IRF3, ITGA3, ITGA6, ITGB4, JAK1, JARID1A, JUN, JUNB, JUND, K-ALPHA-1, KIT, KITLG, KLK10, KPNA2, KRAS2, KRT18, KRT2A, KRT9, LAMB1, LAMP2, LCK, LCN2, LEP, LITAF, LRPAP1, LTF, LYN, LZTR1, MADH1, MAP2K2, MAP3K8, MAPK12, MAPK13, MAPKAPK3, MAPRE1, MARS, MAS1, MCC, MCM2, MCM4, MDM2, MDM4, MET, MGST1, MICB, MLLT3, MME, MMP1, MMP14, MMP17, MMP2, MNDA, MSH2, MSH6, MT3, MYB, MYBL1, MYBL2, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYL9, MYLK, NEO1, NF1, NF2, NFKB1, NFKB2, NFSF7, NID, NINJ1, NMBR, NME1, NME2, NME3, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH4, NPM1, NQO1, NR1D1, NR2F1, NR2F6, NRAS, NRG1, NSEP1, OSM, PA2G4, PABPC1, PCNA, PCTK1, PCTK2, PCTK3, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDPK1, PEA15, PFDN4, PFDN5, PGAM1, PHB, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIM1, PKM2, PKMYT1, PLK2, PPARD, PPARG, PPIH, PPP1CA, PPP2R5A, PRDX2, PRDX4, PRKAR1A, PRKCBP1, PRNP, PRSS15, PSMA1, PTCH, PTEN, PTGS1, PTMA, PTN, PTPRN, RAB5A, RAC1, RAD50, RAF1, RALBP1, RAP1A, RARA, RARB, RASGRF1, RB1, RBBP4, RBL2, REA, REL, RELA, RELB, RET, RFC2, RGS19, RHOA, RHOB, RHOC, RHOD, RIPK1, RPN2, RPS6KB1, RRM1, SARS, SELENBP1, SEMA3C, SEMA4D, SEPP1, SERPINH1, SFN, SFPQ, SFRS7, SHB, SHH, SIAH2, SIVA, SIVA TP53, SKI, SKIL, SLC16A1, SLC1A4, SLC20A1, SMO, SMPD1, SNAI2, SND1, SNRPB2, SOCS1, SOCS3, SOD1, SORT1, SPINT2, SPRY2, SRC, SRPX, STAT1, STAT2, STAT3, STAT5B, STC1, TAF1, TBL3, TBRG4, TCF1, TCF7L2, TFAP2C, TFDP1, TFDP2, TGFA, TGFB1, TGFBI, TGFBR2, TGFBR3, THBS1, TIE, TIMP1, TIMP3, TJP1, TK1, TLE1, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6, TNFSF7, TNK1, TOB1, TP53, TP53BP2, TP53I3, TP73, TPBG, TPT1, TRADD, TRAM1, TRRAP, TSG101, TUFM, TXNRD1, TYRO3, UBC, UBE2L6, UCHL1, USP7, VDAC1, VEGF, VHL, VIL2, WEE1, WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WT1, XRCC1, YES1, YWHAB, YWHAZ, ZAP70 y ZNF9.
En algunas formas de realización, la presente divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico asociado con un trastorno relacionado con el SNC. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con un trastorno relacionado con el SNC: DRD2, GRIA1, GRIA2, GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER, asociados con la enfermedad de Alzheimer; UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB, gstm1, S106p, asociados con la enfermedad de Parkinson; IT15, PRNP, JPH3, TBP, ATXN1, a Tx N2, At XN3, atrofina 1, FTL, TITF-1, asociados con la enfermedad de Huntington; FXN, asociado con ataxia de Freidrich; ASPA, asociado con la enfermedad de Canavan; DMD, asociado con distrofia muscular; y SMN1, UBE1, DYNC1H1 asociados con atrofia muscular espinal.
Un inserto de ácido nucleico heterólogo puede comprender un transgén, un ácido nucleico que codifica una proteína o ARN funcional que modula la apoptosis. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con la apoptosis y ácidos nucleicos que codifican los productos de estos genes y sus homólogos y que codifican ácidos nucleicos pequeños de interferencia (por ejemplo, ARNip, miARN) que inhiben la expresión de estos genes y sus homólogos y son útiles como transgenes en determinadas formas de realización de la divulgación: RPS27A, ABL1, AKT1, APAF1, BAD, BAG1, BAG3, BAG4, BAK1, BAX, BCL10, BCL2, BCL2A1, BCL2L1, BCL2L10, BCL2L11, BCL2L12, BCL2L13, BCL2L2, BCLAF1, BFAR, BID, BIK, NAIP, BIRC2, BIRC3, XIAP, BIRC5, BIRC6, BIRC7, BIRC8, BNIP1, BNIP2, BNIP3, BNIP3L, BOK, BRAF, CARD10, CARD11, NLRC4, CARD14, NOD2, NOD1, CARD6, CARD8, CARD9, CASP1, CASP10, CASP14, CASP2, CASP3, CASP4, CASP5, CASP6, CASP7, CASP8, CASP9, CFLAR, CIDEA, CIDEB, CRADD, DAPK1, DAPK2, DFFA, DFFB, FADD, GADD45A, GDNF, HRK, IGF1 R, LTA, LTBR, MCL1, NOL3, PYCARD, RIPK1, RIPK2, TNF, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF14, TNFRSF19, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSF25, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, TNFRSF9, TNFSF10, TNFSF14, TNFSF18, CD40LG, FASLG, CD70, TNFSF8, TNFSF9, TP53, TP53BP2, TP73, TP63, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5 DRD2, GRIA1, GRIA2,GRIN1, SLC1A1, SYP, SYT1, CHRNA7, 3Rtau/4rTUS, APP, BAX, BCL-2, GRIK1, GFAP, IL-1, AGER, UCH-L1, SKP1, EGLN1, Nurr-1, BDNF, TrkB,gstm1, S106P, IT15, PRNP, JPH3, TBP, ATXN1, ATXN2, ATXN3, atrofina 1, FTL, TITF-1, FXN, ASPA, DMD y SMN1, UBE1, DYNC1H1.
El experto en la técnica también reconocerá de que en el caso de transgenes que codifican proteínas o polipéptidos, las mutaciones que dan como resultado sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden realizarse en un transgén para proporcionar variantes funcionalmente equivalentes u homólogos de una proteína o polipéptido. En algunos aspectos, la divulgación abarca alteraciones de secuencia que dan como resultado la sustitución conservadora de aminoácidos de un transgén. En algunas formas de realización, el transgén comprende un gen que tiene una mutación negativa dominante. Por ejemplo, un transgén puede expresar una proteína mutante que interactúa con los mismos elementos que una proteína de tipo silvestre y, por tanto, bloquea algún aspecto de la función de la proteína de tipo silvestre.
Los productos transgénicos útiles también incluyen miARN. Los miARN y otros ácidos nucleicos pequeños de interferencia regulan la expresión génica mediante la escisión/degradación del transcrito de ARN diana o la represión de la traducción del ARN mensajero (ARNm) diana. Los miARN se expresan de forma nativa, típicamente como productos finales de ARN 19-25 no traducidos. Los miARN muestran su actividad a través de interacciones específicas de secuencia con las regiones 3’ no traducidas (UTR) de los ARNm diana. Estos miARN expresados de forma endógena forman precursores en horquilla que se procesan posteriormente para dar un dúplex de miARN, y después una molécula de miARN monocatenaria "madura". Este miARN maduro guía un complejo multiproteico, miRISC, que identifica el sitio diana, por ejemplo, en las regiones UTR 3’, de los ARNm diana basándose en su complementariedad con el miARN maduro.
La siguiente lista no limitante de genes de miARN y sus homólogos son útiles como transgenes o como dianas para ácidos nucleicos pequeños de interferencia codificados por transgenes (por ejemplo, esponjas de miARN, oligonucleótidos antisentido, ARN TuD) en determinadas formas de realización de los procedimientos: hsa-let-7a, hsalet-7a*, hsa-let-7b, hsa-let-7b*, hsa-let-7c, hsa-let-7c*, hsa-let-7d, hsa-let-7d*, hsa-let-7e, hsa-let-7e*, hsa-let-7f, hsalet-7f-1 *, hsa-let-7f-2*, hsa-let-7g, hsa-let-7g*, hsa-let-7i, hsa-let-7i*, hsa-miR-1, hsa-miR-100, hsa-miR-100*, hsa-miR-101, hsa-miR-101*, hsa-miR-103, hsa-miR-105, hsa-miR-105*, hsa-miR-106a, hsa-miR-106a*, hsa-miR-106b, hsamiR-106b*, hsa-miR-107, hsa-miR-10a, hsa-miR-10a*, hsa-miR-10b, hsa-miR-10b*, hsa-miR-1178, hsa-miR-1179, hsa-miR-1180, hsa-miR-1181, hsa-miR-1182, hsa-miR-1183, hsa-miR-1184, hsa-miR-1185, hsa-miR-1197, hsa-miR-1200, hsa-miR-1201, hsa-miR-1202, hsa-miR-1203, hsa-miR-1204, hsa-miR-1205, hsa-miR-1206, hsa-miR-1207-3p, hsa-miR-1207-5p, hsa-miR-1208, hsa-miR-122, hsa-miR-122*, hsa-miR-1224-3p, hsa-miR-1224-5p, hsa-miR-1225-3p, hsa-miR-1225-5p, hsa-miR-1226, hsa-miR-1226*, hsa-miR-1227, hsa-miR-1228, hsa-miR-1228*, hsa-miR-1229, hsa-miR-1231, hsa-miR-1233, hsa-miR-1234, hsa-miR-1236, hsa-miR-1237, hsa-miR-1238, hsa-miR-124, hsa-miR-124*, hsa-miR-1243, hsa-miR-1244, hsa-miR-1245, hsa-miR-1246, hsa-miR-1247, hsa-miR-1248, hsa-miR-1249, hsamiR-1250, hsa-miR-1251, hsa-miR-1252, hsa-miR-1253, hsa-miR-1254, hsa-miR-1255a, hsa-miR-1255b, hsa-miR-1256, hsa-miR-1257, hsa-miR-1258, hsa-miR-1259, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-125b-1 *, hsa-miR-125b-2*, hsa-miR-126, hsa-miR-126*, hsa-miR-1260, hsa-miR-1261, hsa-miR-1262, hsa-miR-1263, hsa-miR-1264, hsa-miR-1265, hsa-miR-1266, hsa-miR-1267, hsa-miR-1268, hsa-miR-1269, hsa-miR-1270, hsa-miR-1271, hsa-miR-1272, hsa-miR-1273, hsa-miR-127-3p, hsa-miR-1274a, hsa-miR-1274b, hsa-miR-1275, hsa-miR-127-5p, hsa-miR-1276, hsa-miR-1277, hsa-miR-1278, hsa-miR-1279, hsa-miR-128, hsa-miR-1280, hsa-miR-1281, hsamiR-1282, hsa-miR-1283, hsa-miR-1284, hsa-miR-1285, hsa-miR-1286, hsa-miR-1287, hsa-miR-1288, hsa-miR-1289, hsa-miR-129*, hsa-miR-1290, hsa-miR-1291, hsa-miR-1292, hsa-miR-1293, hsa-miR-129-3p, hsa-miR-1294, hsa-miR-1295, hsa-miR-129-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR-1297, hsa-miR-1298, hsa-miR-1299, hsa-miR-1300, hsamiR-1301, hsa-miR-1302, hsa-miR-1303, hsa-miR-1304, hsa-miR-1305, hsa-miR-1306, hsa-miR-1307, hsa-miR-1308, hsa-miR-130a, hsa-miR-130a*, hsa-miR-130b, hsa-miR-130b*, hsa-miR-132, hsa-miR-132*, hsa-miR-1321, hsa-miR-1322, hsa-miR-1323, hsa-miR-1324, hsa-miR-133a, hsa-miR-133b, hsa-miR-134, hsa-miR-135a, hsa-miR-135a*, hsa-miR-135b, hsa-miR-135b*, hsa-miR-136, hsa-miR-136*, hsa-miR-137, hsa-miR-138, hsa-miR-138-1*, hsamiR-138-2*, hsa-miR-139-3p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-141, hsa-miR-141*, hsamiR-142-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-143, hsa-miR-143*, hsa-miR-144, hsa-miR-144*, hsa-miR-145, 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hsa-miR-663b, hsa-miR-664, hsa-miR-664*, hsamiR-665, hsa-miR-668, hsa-miR-671-3p, hsa-miR-671-5p, hsa-miR-675, hsa-miR-7, hsa-miR-708, hsa-miR-708*, hsamiR-7-1*, hsa-miR-7-2*, hsa-miR-720, hsa-miR-744, hsa-miR-744*, hsa-miR-758, hsa-miR-760, hsa-miR-765, hsamiR-766, hsa-miR-767-3p, hsa-miR-767-5p, hsa-miR-768-3p, hsa-miR-768-5p, hsa-miR-769-3p, hsa-miR-769-5p, hsa-miR-770-5p, hsa-miR-802, hsa-miR-873, hsa-miR-874, hsa-miR-875-3p, hsa-miR-875-5p, hsa-miR-876-3p, hsamiR-876-5p, hsa-miR-877, hsa-miR-877*, hsa-miR-885-3p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-886-3p, hsa-miR-886-5p, hsamiR-887, hsa-miR-888, hsa-miR-888*, hsa-miR-889, hsa-miR-890, hsa-miR-891a, hsa-miR-891b, hsa-miR-892a, hsamiR-892b, hsa-miR-9, hsa-miR-9*, hsa-miR-920, hsa-miR-921, hsa-miR-922, hsa-miR-923, hsa-miR-924, hsa-miR-92a, hsa-miR-92a-1*, hsa-miR-92a-2*, hsa-miR-92b, hsa-miR-92b*, hsa-miR-93, hsa-miR-93*, hsa-miR-933, hsa-miR-934, hsa-miR-935, hsa-miR-936, hsa-miR-937, hsa-miR-938, hsa-miR-939, hsa-miR-940, hsa-miR-941, hsa-miR-942, hsa-miR-943, hsa-miR-944, hsa-miR-95, hsa-miR-96, hsa-miR-96*, hsa-miR-98, hsa-miR-99a, hsa-miR-99a*, hsamiR-99b y hsa-miR-99b*.
Un miARN inhibe la función de los ARNm a los que se dirige y, como resultado, inhibe la expresión de los polipéptidos codificados por los ARNm. Así, el bloqueo (parcial o total) de la actividad del miARN (por ejemplo, el silenciamiento del miARN) puede inducir o restaurar eficazmente la expresión de un polipéptido cuya expresión está inhibida (desrepresión del polipéptido). En una forma de realización, la desrepresión de polipéptidos codificados por dianas de ARNm de un miARN se logra inhibiendo la actividad de miARN en las células por medio de una diversidad de procedimientos. Por ejemplo, el bloqueo de la actividad de un miARN se puede lograr mediante la hibridación con un ácido nucleico pequeño de interferencia (por ejemplo, oligonucleótido antisentido, esponja de miARN, ARN TuD) que es complementario o sustancialmente complementario al miARN, bloqueando así la interacción del miARN con su ARNm diana. Tal como se utiliza en el presente documento, un ácido nucleico pequeño de interferencia que es sustancialmente complementario a un miARN es uno que es capaz de hibridarse con un miARN y bloquear la actividad del miARN. En algunas formas de realización, un ácido nucleico pequeño de interferencia que es sustancialmente complementario a un miARN es un ácido nucleico pequeño de interferencia que es complementario con el miARN en todas menos en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 bases. En algunas formas de realización, una secuencia de ácido nucleico pequeño de interferencia que es sustancialmente complementaria a un miARN, es una secuencia de ácido nucleico pequeño de interferencia que es complementaria con el miARN en, al menos, una base.
Un "inhibidor de miARN" es un agente que bloquea la función, la expresión y/o el procesamiento de miARN. Por ejemplo, estas moléculas incluyen, pero sin limitación, microARN antisentido específico, esponjas de microARN, ARN señuelo resistente (ARN TuD) y oligonucleótidos de microARN (oligonucleótidos cortos, de horquilla, bicatenarios) que inhiben la interacción de miARN con un complejo de Drosha. Los inhibidores de microARN se pueden expresar en células a partir de transgenes de un ácido nucleico, tal como se ha expuesto anteriormente. Las esponjas de microARN inhiben específicamente los miARN a través de una secuencia semilla heptamérica complementaria (Ebert, M.S. Nature Methods, Epub, 12 de agosto de 2007). En algunas formas de realización, se puede silenciar una familia completa de miARN utilizando una sola secuencia de esponja. Los ARN TuD logran una supresión eficaz y a largo plazo de miARN específicos en células de mamífero (véase, por ejemplo, Takeshi Haraguchi, et al., Nucleic Acids Research, 2009, vol. 37, N° 6 e43). Otros procedimientos para silenciar la función de miARN (desrepresión de dianas de miARN) en células serán evidentes para un experto en la técnica.
En algunos aspectos, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos relacionados con el SNC. Tal como se utiliza en el presente documento, un "trastorno relacionado con el SNC" es una enfermedad o afección del sistema nervioso central. Un trastorno relacionado con el sistema nervioso central puede afectar a la médula espinal (por ejemplo, una mielopatía), al cerebro (por ejemplo, encefalopatía) o a los tejidos que rodean el cerebro y la médula espinal. Un trastorno relacionado con el SNC puede ser de origen genético, ya sea heredado o adquirido por medio de una mutación somática. Un trastorno relacionado con el SNC puede ser una afección o un trastorno psicológico, por ejemplo, trastorno por déficit de atención con hiperactividad, trastorno del espectro autista, trastorno del estado de ánimo, esquizofrenia, depresión, síndrome de Rhett, etc. Un trastorno relacionado con el SNC puede ser un trastorno autoinmunitario. Un trastorno relacionado con el SNC también puede ser un cáncer del SNC, por ejemplo, cáncer de cerebro. Un trastorno relacionado con el SNC que es un cáncer puede ser un cáncer primario del SNC, por ejemplo, un astrocitoma, glioblastomas, etc., o puede ser un cáncer que se ha metastatizado en el tejido del SNC, por ejemplo, un cáncer de pulmón que se ha metastatizado en el cerebro. Otros ejemplos no limitantes de trastornos relacionados con el SNC incluyen enfermedad de Parkinson, enfermedad de almacenamiento lisosómico, isquemia, dolor neuropático, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM) y enfermedad de Canavan (EC).
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNec) descritos en el presente documento puede ser útiles para suministrar una terapia génica a células cardiacas (por ejemplo al tejido cardiaco). En consecuencia, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNec) descritos en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos cardiovasculares. Tal como se utiliza en el presente documento, un "trastorno cardiovascular" es una enfermedad o afección del sistema cardiovascular. Una enfermedad cardiovascular puede afectar al corazón, sistema circulatorio, arterias, venas, vasos sanguíneos y/o capilares. Un trastorno cardiovascular puede ser de origen genético, ya sea heredado o adquirido por medio de una mutación somática. Los ejemplos no limitantes de trastornos cardiovasculares incluyen enfermedad cardiaca reumática, enfermedad cardiaca valvular, enfermedad cardiaca hipertensiva, aneurisma, aterosclerosis, hipertensión (por ejemplo, tensión arterial alta), enfermedad arterial periférica (EAP), cardiopatía isquémica, angina, enfermedad coronaria, enfermedad de las arterias coronarias, infarto de miocardio, enfermedad vascular cerebral, ataque isquémico transitorio, enfermedad cardiaca inflamatoria, miocardiopatía, enfermedad pericárdica, enfermedad cardiaca congénita, insuficiencia cardiaca, apoplejía y miocarditis debida a la enfermedad de Chagas.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) puede dirigirse al pulmón y/o al tejido del sistema pulmonar. En consecuencia, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNec) descritos en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad pulmonar. Tal como se utiliza en el presente documento, una "enfermedad pulmonar" es una enfermedad o afección del sistema pulmonar. Una enfermedad pulmonar puede afectar a los pulmones o a los músculos involucrados en la respiración. Una enfermedad pulmonar puede ser de origen genético, ya sea heredada o adquirida por medio de una mutación somática. Una enfermedad pulmonar puede ser un cáncer de pulmón, que incluye, pero sin limitación, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas y tumor carcinoide de pulmón. Otros ejemplos no limitantes de enfermedades pulmonares incluyen bronquitis aguda, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), asbestosis, asma, bronquiectasia, bronquiolitis, bronquiolitis obliterante con neumonía organizada (BONO), displasia broncopulmonar, bisinosis, bronquitis crónica, coccidioidomicosis (Cocci), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía criptogénica organizada (COP), fibrosis quística, enfisema, síndrome pulmonar por hantavirus, histoplasmosis, metaneumovirus humano, neumonitis por hipersensibilidad, gripe, linfangiomatosis, mesotelioma, síndrome respiratorio del Medio Oriente, micobacterias no tuberculosas, tosferina, neumoconiosis (enfermedad del pulmón negro), neumonía, discinesia ciliar primaria, hipertensión pulmonar primaria, hipertensión arterial pulmonar, fibrosis pulmonar, enfermedad vascular pulmonar, virus respiratorio sincitial (VSR), sarcoidosis, síndrome respiratorio agudo severo (SARS), silicosis, apnea del sueño, síndrome de muerte infantil súbita (SMSL) y tuberculosis.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) puede dirigirse al tejido hepático. En consecuencia, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedad hepática. Tal como se utiliza en el presente documento, una "enfermedad hepática" es una enfermedad o afección del hígado. Una enfermedad hepática puede ser de origen genético, heredada o adquirida por medio de una mutación somática. Una enfermedad hepática puede ser un cáncer de hígado, que incluye, pero sin limitación, carcinoma hepatocelular (HCC), carcinoma fibrolamelar, colangiocarcinoma, angiosarcoma y hepatoblastoma. Otros ejemplos no limitantes de enfermedades pulmonares incluyen síndrome de Alagille, deficiencia de alfa 1 anti-tripsina, hepatitis autoinmunitaria, atresia biliar, cirrosis, enfermedad quística del hígado, enfermedad del hígado graso, galactosemia, cálculos biliares, síndrome de Gilbert, hemocromatosis, enfermedad hepática durante el embarazo, hepatitis neonatal, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, porfiria, síndrome de Reye, sarcoidosis, hepatitis tóxica, enfermedad por almacenamiento de glucógeno de tipo 1, tirosinemia, hepatitis vírica A, B, C, enfermedad de Wilson y esquistosomiasis.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) puede dirigirse al tejido renal. En consecuencia, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para el tratamiento de la enfermedad renal. Tal como se utiliza en el presente documento, una "enfermedad renal" es una enfermedad o afección del hígado. Una enfermedad hepática puede ser de origen genético, heredada o adquirida por medio de una mutación somática. Una enfermedad hepática puede ser un cáncer de riñón, que incluye, pero sin limitación, cáncer de células renales, cáncer de células claras, cáncer papilar de tipo 1, cáncer papilar de tipo 2, cáncer cromófobo, cáncer de células oncocíticas, cáncer del conducto colector, cáncer de células de transición de la pelvis renal y tumor de Wilm. Otros ejemplos no limitantes de enfermedad renal incluyen síndrome de Abderhalden-Kaufmann-Lignac (cistinosis nefropática), insuficiencia renal aguda/lesión renal aguda, nefronia lobar aguda, nefropatía aguda por fosfato, necrosis tubular aguda, deficiencia de adenina fosforribosiltransferasa, nefritis por adenovirus, síndrome de Alport, amiloidosis, angiomiolipoma, nefropatía por analgésicos, anticuerpos de angiotensina y glomeruloesclerosis segmentaria focal, síndrome antifosfolípido, glomerulonefritis relacionada con la terapia anti-TNF-a, mutaciones APOL1, síndrome de exceso aparente de mineralocorticoide, nefropatia por ácido aristolóquico, nefropatia endémica de los Balcanes, síndrome de Bartter, beeturia, enfermedad renal por p-talasemia, nefropatía por cilindros biliares, polioma BK, nefropatía C1q, síndrome cardiorrenal, nefropatía CFHR5, embolia por colesterol, síndrome de Churg-Strauss, quiluria, glomerulopatía colapsante, glomerulopatía colapsante relacionada con CMV, síndrome nefrótico congénito, síndrome conorrenal (síndrome de Mainzer-Saldino o enfermedad de Saldino-Mainzer), nefropatía por contraste, intoxicación por sulfato de cobre, necrosis cortical, crioglobuinemia, lesión renal aguda inducida por cristales, enfermedad renal quística, cistinuria adquirida, enfermedad de depósitos densos (MPGN tipo 2), enfermedad de Dent (nefrolitiasis recesiva ligada al cromosoma X), síndrome de desequilibrio de diálisis, enfermedad renal diabética, diabetes insípida, síndrome de EAST, uréter ectópico, edema, enfermedad de Erdheim-Chester, enfermedad de Fabry, hipercalcemia hipocalciúrica familiar, síndrome de Fanconi, síndrome de Fraser, glomerulopatía por fibronectina, glomerulonefritis fibrilar y glomerulopatía inmunotactoide, síndrome de Fraley, glomeruloesclerosis segmentaria focal, esclerosis focal, glomeruloesclerosis focal, síndrome de Galloway Mowat, síndrome de Gitelman, enfermedades glomerulares, reflujo tubular glomerular, glucosuria, síndrome de Goodpasture, síndrome urémico hemolítico (HUS), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), síndrome hemofagótico, cistitis hemorrágica, hemosiderosis relacionada con hemoglobinuria paroxística nocturna y anemia hemolítica, enfermedad veno-oclusiva hepática, síndrome de obstrucción sinusoidal, enfermedad renal asociada a hepatitis C, síndrome hepatorrenal, nefropatía asociada con VIH (HIVAN), riñón en herradura (fusión renal), úlcera de Hunner, hiperaldosteronismo, hipercalcemia, hiperpotasemia, hipermagnesemia, hipernatremia, hiperoxaluria, hiperfosfatemia, hipocalcemia, hipopotasemia, disfunción renal inducida por hipopotasemia, hipomagnesemia, hiponatremia, hipofosfatemia, nefropatía de IgA, nefropatía de IgG4, cistitis intersticial, síndrome de vejiga dolorosa, nefritis intersticial, síndrome de Ivemark, piedras en el riñón, nefrolitiasis,enfermedad renal por leptospirosis, enfermedad de deposición de cadena ligera, enfermedad de deposición de inmunoglobulina monoclonal, síndrome de Liddle, síndrome de Lightwood-Albright, glomerulopatía por lipoproteínas, nefrotoxicidad por litio, mutaciones de LMX1B que causan FSGS hereditaria, dolor lumbar-hematuria, lupus, lupus eritematoso sistémico, enfermedad renal por lupus, nefritis por lupus, glomerulonefritis asociada a enfermedad de Lyme, nefropatía palúdica, hipertensión maligna, malacoplaquia, estenosis del meato, enfermedad renal quística medular, riñón esponjoso medular, megauréter, toxicidad por melamina en el riñón, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía membranosa, nefropatía mesoamericana, acidosis metabólica, alcalosis metabólica, poliangitis microscópica, síndrome de leche y alcalinos, enfermedad de cambio mínimo, riñón displásico multiquístico, mieloma múltiple, neoplasias mieloproliferativas y glomerulopatía, síndrome de uña-rótula, nefrocalcinosis, fibrosis sistémica nefrogénica, nefroptosis (riñón flotante, ptosis renal), síndrome nefrótico, vejiga neurogénica, glomeruloesclerosis nodular, no gonocócida, síndrome del cascanueces, síndrome orofaciodigital, hipotensión ortostática, proteinuria ortostática, diuresis osmótica, riñón de Page, necrosis papilar, síndrome del papilorrenal (síndrome de coloboma renal, hipoplasia renal aislada), síndrome peritoneal-renal, válvula uretral posterior, glomerulonefritis posinfecciosa, glomerulonefritis posestreptocócica, poliarteritis nudosa, enfermedad renal poliquística, válvulas uretrales posteriores, preeclampsia, glomerulonefritis proliferativa con depósitos de IgG monoclonal (enfermedad de Nasr), proteinuria (proteína en la orina), pseudohiperaldosteronismo, pseudohipoparatiroidismo, síndrome renal pulmonar, pielonefritis (infección de riñón, pionefrosis, nefropatía por radiación, síndrome de realimentación, nefropatía por reflujo, glomerulonefritis rápidamente progresiva, absceso renal, absceso periférico, agenesia renal, aneurisma de la arteria renal, estenosis de la arteria renal, cáncer de células renales, quiste renal, hipouricemia renal con insuficiencia renal aguda inducida por ejercicio, infarto renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, alteración del osmorreceptor, uréter retrocavo, fibrosis retroperitoneal, rabdomiólisis, rabdomiólisis relacionada con cirugía bariátrica, enfermedad renal asociada a artritis reumatoide, sarcoidosis renal, enfermedad de pérdida de sal renal y cerebral, displasia inmunoósea de Schimke, crisis renal por esclerodermia, síndrome de peroné en serpentina-riñón poliquístico, síndrome de Exner, nefropatía de células falciformes, exposición a sílice y enfermedad renal crónica, enfermedad renal después de un trasplante de células hematopoyéticas, enfermedad renal relacionada con el trasplante de células madre, enfermedad de la membrana basal delgada, hematuria familiar benigna, trigonitis, esclerosis tuberosa, disgenesia tubular, síndrome de lisis tumoral, uremia, neuropatía óptica urémica, ureterocele, caráncula uretral, estenosis uretral, incontinencia urinaria, infección del aparato urinario, obstrucción del aparato urinario, fístula vesicointestinal, reflujo vesicouretral, enfermedad de Von Hippel-Lindau, nefropatía relacionada con warfarina, granulomatosis de Wegener, granulomatosis con poliangeítis y síndrome de Wunderlich.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para suministrar una terapia génica al tejido ocular. En consecuencia, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos oculares. Tal como se utiliza en el presente documento, un "trastorno ocular" es una enfermedad o afección del ojo. Una enfermedad cardiovascular puede afectar el ojo, la esclerótica, la córnea, la cámara anterior, la cámara posterior, el iris, la pupila, el cristalino, el humor vítreo, la retina o el nervio óptico. Un trastorno ocular puede ser de origen genético, ya sea heredado o adquirido por medio de una mutación somática. Los ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos oculares incluyen, pero sin limitación: degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía, retinopatía diabética, edema macular, glaucoma, retinitis pigmentosa, enfermedad de Stargardt, enfermedad de Usher y amaurosis congénita de Leber y cáncer de ojo.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para suministrar una terapia génica al tejido sanguíneo (por ejemplo, células sanguíneas). En consecuencia, en algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para el tratamiento de trastornos sanguíneos. Tal como se utiliza en el presente documento, un "trastorno sanguíneo" es una enfermedad o afección de la sangre. Un trastorno sanguíneo puede tener un origen genético, ya sea heredado o adquirido por medio de una mutación somática. Los ejemplos no limitantes de enfermedades y trastornos de la sangre incluyen, pero sin limitación, anemia (por ejemplo, anemia en enfermedad renal crónica, anemia aplásica, anemia mielodisplásica, anemia de células falciformes), trombosis venosa profunda, hemofilia (por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B, hemofilia C), púrpura de Henoch-Schonlein, embolia pulmonar, talasemia y enfermedad de Von Willebrand.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento (por ejemplo, ADNec) pueden ser útiles para suministrar moléculas de edición de genes (por ejemplo, nucleasas) a un sujeto. En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una nucleasa. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "endonucleasa" y "nucleasa" se refieren a una enzima que escinde un enlace o enlaces fosfodiéster dentro de una cadena polinucleotídica. Las nucleasas pueden ser de origen natural o estar modificadas genéticamente. Las nucleasas modificadas genéticamente son particularmente útiles para la edición del genoma y generalmente se clasifican en cuatro familias: nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), meganucleasas modificadas genéticamente y proteínas asociadas a CRISPR (nucleasas Cas). En algunas formas de realización, la nucleasa es una ZFN. En algunas formas de realización, la ZFN comprende un dominio de escisión de FokI. En algunas formas de realización, la ZFN comprende el grupo de pliegue de Cys2His2. En algunas formas de realización, la nucleasa es una TALEN. En algunas formas de realización, la TALEN comprende un dominio de escisión de FokI. En algunas formas de realización, la nucleasa es una meganucleasa modificada genéticamente.
El término "CRISPR" se refiere a "repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas regularmente", que son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Los loci CRISPR forman una parte de un sistema inmunológico adaptativo procariota que confiere resistencia al material genético extraño. Cada uno de los loci CRISPR está flanqueado por segmentos cortos de "ADN espaciador", que se derivan de material genómico vírico. En el sistema CRISPR de tipo II, el ADN espaciador se hibrida con ARN de transactivación (ARNcrtra) y se procesa para dar CRISPR-ARN (ARNcr) y, posteriormente, se asocia con nucleasas asociadas a CRISPR (nucleasas Cas) para formar complejos que reconocen y degradan el ADN extraño. En determinadas formas de realización, la nucleasa es una nucleasa asociada a CRISPR (nucleasa Cas). Los ejemplos de nucleasas CRISPR incluyen, pero sin limitación, Cas9, Cas6 y dCas9. La dCas9 es una proteína Cas modificada genéticamente que se une a un locus diana pero no escinde dicho locus. En algunas formas de realización, la nucleasa es Cas9. En algunas formas de realización, el Cas9 se deriva de la bacteria S. pyogenes (SpCas9).
Con el fin de editar el genoma, el sistema CRISPR se puede modificar para combinar el ARNcrtra y el ARNcr en un ARN guía simple (ARNgs) o solo (ARNg). Tal como se utiliza en el presente documento, el término "ARN guía" o "ARNg" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que es complementaria a una secuencia diana en una célula y se asocia con una nucleasa Cas, dirigiendo así la nucleasa Cas a la secuencia diana. En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un ARN guía (ARNg). En algunas formas de realización, un ARNg varía entre 1 y 30 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un ARNg varía entre 5 y 25 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un ARNg varía entre 10 y 20 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un ARNg varía entre 14 y 18 nucleótidos de longitud. En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un ARNg y una nucleasa CRISPR.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un inserto de ácido nucleico heterólogo que no codifica una proteína funcional. Por ejemplo, en el contexto de una terapia génica, la integración del promotor transgénico puede provocar la activación del oncogén. En consecuencia, en algunas formas de realización, la divulgación se refiere a un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un constructo sin promotor. Sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, un constructo de expresión sin promotor es útil, en algunas formas de realización, como sustrato para la edición de genes.
Tal como se utiliza en el presente documento, "edición del genoma" se refiere a la adición, la interrupción o el cambio de secuencias genómicas (por ejemplo, una secuencia de genes). En algunas formas de realización, la edición del genoma se realiza utilizando proteínas modificadas genéticamente y moléculas relacionadas. En algunos aspectos, la edición del genoma comprende el uso de nucleasas modificadas genéticamente para que escindan un locus genómico diana. En algunas formas de realización, la edición del genoma comprende además insertar, eliminar, mutar o sustituir residuos de ácido nucleico en un locus escindido. En algunas formas de realización, la inserción, deleción, mutación o sustitución de residuos de ácido nucleico en un locus escindido se realiza mediante mecanismos celulares endógenos tales como recombinación homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ). Los ejemplos de tecnologías de edición del genoma incluyen, pero sin limitación, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasas con dedos de zinc (ZFN), endonucleasas homing remodificadas genéticamente con meganucleasas modificadas genéticamente, el sistema CRISPR/Cas. En algunas formas de realización, las tecnologías de edición de genes son proteínas o moléculas relacionadas con TALEN, que incluyen, pero sin limitación, efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) y endonucleasas de restricción (por ejemplo, FokI). En algunas formas de realización, las tecnologías de edición de genes son proteínas o moléculas relacionadas con ZFN, que incluyen, pero sin limitación, proteínas que comprenden el grupo de pliegue Cys2His2 (por ejemplo, Zif268 (EGR1)) y endonucleasas de restricción (por ejemplo, FokI). En algunas formas de realización, las tecnologías de edición de genes son proteínas o moléculas relacionadas con el sistema CRISPR/Cas, que incluyen, pero sin limitación, Cas9, Cas6, dCas9, ARN CRISPR (ARNcr) y ARNcr de transactivación (ARNcrtra). En algunas formas de realización, el constructo sin promotor proporciona un sustrato para TALENS, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), meganucleasas, Cas9 y otras proteínas de edición de genes.
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un ácido nucleico que codifica un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica una vacuna de ADN. Tal como se utiliza en el presente documento, "vacuna de ADN" se refiere a un ácido nucleico que codifica un antígeno que estimula una respuesta inmunitaria (por ejemplo, una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria humoral) contra ese antígeno en un huésped. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta protectora que protege contra una infección o afección futura. No obstante, en algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria trata (por ejemplo, erradica o atenúa) una infección o afección existente. Ejemplos de vacunas de ADN incluyen Ig de cadena HL, scFv, Ig de dominio único derivada de camélidos (VhH) o peces cartilaginosos (Vnar), nanocuerpos y otros péptidos de reconocimiento de parátopos y péptidos de fusión denominados colectivamente moléculas de Ig (o de tipo Ig).
En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo codifica una molécula Ig o de tipo Ig. En algunas formas de realización, las moléculas de Ig (o de tipo Ig) son secuencias de proteínas no modificadas derivadas de secuencias de anticuerpos monoclonales. En algunas formas de realización, las moléculas de Ig (o de tipo Ig) son secuencias de proteínas no modificadas derivadas de secuencias de anticuerpos monoclonales murinos o de otros mamíferos.
En algunas formas de realización, las moléculas de Ig (o de tipo Ig) son secuencias de proteínas no modificadas derivadas de bibliotecas de péptidos sintéticos generadas aleatoriamente. En algunas formas de realización, las bibliotecas se derivaron de ADN complementario obtenido de especies de vertebrados sin tratamiento previo. Las especies incluyen, pero sin limitación, mamíferos, tales como primates (por ejemplo, seres humanos y primates no humanos), roedores (por ejemplo, ratón, ratas), ungulados, camélidos, equinos, caninos, felinos, marsupiales y animales de interés agrícola; Especies de aves, incluidos pollos, patos y gansos; especies de peces que incluyen peces cartilaginosos, anguilas lamprea y especies de peces de mandíbula.
En algunas formas de realización, el ácido nucleico heterólogo codifica las cadenas pesada y ligera de una inmunoglobulina (Ig), de modo que cuando se administra a una célula permisiva, una Ig ensamblada se secreta en el sistema circulatorio. En algunas formas de realización, la molécula de Ig no se secreta y actúa internamente como un denominado "intracuerpo".
En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo codifica una molécula de Ig que es un anticuerpo monocatenario modificado genéticamente que consta de las regiones variables de cadena pesada y ligera en un polipéptido (scFv). El scFv conserva la avidez y la especificidad por el antígeno diana.
En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo codifica una molécula de Ig que se une a agentes microbianos y afecta a la infectividad del microbio. En algunas formas de realización, los agentes microbianos son organismos procariotas. En algunas formas de realización, los agentes microbianos son rickettsia, micoplasma u otras formas de vida intracelulares.
En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo codifica una molécula de Ig que se une a proteínas estructurales víricas de virus patógenos humanos, que incluyen, pero sin limitación, una proteína vírica del virus del Ébola, una proteína vírica de inmunodeficiencia humana, una proteína vírica del papiloma, un proteína vírica del herpes simple 1, una proteína vírica del herpes simple 2, una proteína vírica de VHC A, una proteína vírica de VHC B, una proteína vírica de VHC C, una proteína vírica de VHC no A, una proteína vírica de VHC no B o una proteína vírica de la fiebre hemorrágica de dengue. En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo codifica una molécula de Ig que se une a la(s) proteína(s) estructural(es) vírica(s) de un patógeno zoonótico, incluidos, pero sin limitación, el virus de la fiebre aftosa y el virus de la rabia.
En algunos aspectos, los ácidos nucleicos descritos en la divulgación son útiles para la producción de células modificadas, tales como células modificadas ex vivo. Tal como se utiliza en el presente documento, "célula modificada ex vivo" se refiere a una célula (por ejemplo, una célula de mamífero) que se extrae de un sujeto, se modifica genéticamente (por ejemplo, se transfecta o se transduce con ácidos nucleicos exógenos, o se reprograma genéticamente), se cultiva o se expande y, opcionalmente, se devuelve a un sujeto (por ejemplo, al mismo sujeto o a un sujeto diferente). Generalmente, las células modificadas ex vivo son útiles para terapia con células autólogas o terapia con células alogénicas. Por ejemplo, se pueden extraer células de un sujeto que padece una enfermedad asociada con un defecto genético particular (por ejemplo, sobreexpresión de una proteína en particular), transfectarlas con un ácido nucleico que corrige el defecto genético (por ejemplo reduce la expresión de la proteína) y reintroducirlas en el sujeto. En otro ejemplo no limitante, las células se extraen de un sujeto, se reprograman genéticamente (por ejemplo, se desdiferencian o se transdiferencian en células madre), se expanden y se reintroducen en el sujeto. En algunas formas de realización, las células modificadas ex vivo producidas por transfección con un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación tienen un perfil de seguridad mejorado en comparación con células producidas ex vivo por vectores de terapia génica actualmente disponibles.
En algunos aspectos, los ácidos nucleicos descritos en la divulgación son útiles para la producción de células T de antígeno quimérico (CART). Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) son receptores de células T modificados genéticamente que muestran especificidad contra antígenos diana basándose en un resto de anticuerpo FV de cadena sencilla (scFv). Generalmente, los CART se producen por transducción de células T con vectores lentivirales que comprenden ADN que codifica CAR. La transducción lentiviral, en algunas formas de realización, aumenta el riesgo de mutagénesis de inserción que conduce al cáncer. Tal como se describe en la divulgación, los ácidos nucleicos que tienen secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas muestran una probabilidad reducida de mutagénesis de inserción en comparación con otras modalidades de terapia génica. En consecuencia, en algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación comprende un inserto de ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, un transgén) que codifica un CAR. En algunas formas de realización, un CART producido por transducción con un ácido nucleico descrito en la divulgación muestra un perfil de seguridad mejorado en comparación con un CART producido por transducción lentiviral.
Componentes adicionales
Además de los elementos principales identificados anteriormente para el ácido nucleico, el ácido nucleico también incluye elementos de control convencionales necesarios que están unidos operativamente al inserto de ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, transgén) de una forma que permita su transcripción, su traducción y/o su expresión en una célula transfectada con un ácido nucleico descrito en la divulgación. Tal como se utiliza en el presente documento, las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.
Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias apropiadas de iniciación, de terminación, promotoras y potenciadoras de la transcripción; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que mejoran la eficacia de la traducción (es decir, secuencia de consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Se conocen en la técnica y pueden utilizarse un gran número de secuencias de control de la expresión, incluidos promotores que son nativos, constitutivos, inducibles y/o específicos de tejido.
En algunas formas de realización, un inserto de ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, transgén) comprende una secuencia codificante de proteína que está unida operativamente a una o más secuencias reguladoras. Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que una secuencia codificante de ácido nucleico y secuencias reguladoras están unidas "operativamente" cuando están unidas covalentemente de tal forma que colocan la expresión o la transcripción de la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, transgén) bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, transgén) se traduzca en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5’ da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN (1) no da lugar a la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) no interfiere en la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes o (3) no interfiere en la capacidad de transcripción de ARN correspondiente para su traducción en una proteína. Por lo tanto, una región promotora estaría unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de forma que el transcrito resultante pudiera traducirse en la proteína o polipéptido deseado. De manera similar, dos o más regiones codificantes están unidas operativamente cuando están unidas de tal manera que su transcripción a partir de un promotor común da como resultado la expresión de dos o más proteínas que se han traducido en marco. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes unidas operativamente producen una proteína de fusión. En algunas formas de realización, las secuencias codificantes unidas operativamente producen un ARN funcional (por ejemplo, ARNg).
Para ácidos nucleicos (por ejemplo, transgenes) que codifican proteínas, generalmente se inserta una secuencia de poliadenilación después de las secuencias transgénicas y antes de la secuencia 3’ ITR de AAV. Un inserto de ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, transgén) útil en la presente divulgación también puede contener un intrón, ubicado de forma conveniente entre la secuencia promotora/potenciadora y el transgén. Una posible secuencia de intrón se deriva de SV-40 y se denomina secuencia de intrón SV-40 T. Otro elemento de vector que puede utilizarse es un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Se usa una secuencia IRES para producir más de un polipéptido a partir de un transcrito de un solo gen. Se usaría una secuencia IRES para producir una proteína que contenga más de una cadena polipeptídica. La selección de estos y otros elementos vectoriales comunes es convencional y muchas de estas secuencias están disponibles [véase, por ejemplo, Sambrook et al, y referencias citadas en el mismo, por ejemplo, páginas 3.183.26 y 16.17 16.27 y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989]. En algunas formas de realización, se incluye una secuencia 2A del virus de la fiebre aftosa en la poliproteína; este es un péptido pequeño (de aproximadamente 18 aminoácidos de longitud) que se ha demostrado que media en la escisión de poliproteínas (Ryan, MD et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N. M et al., J Virology, noviembre de 1996; páginas 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; y Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). La actividad de escisión de la secuencia 2A se ha demostrado previamente en sistemas artificiales que incluyen plásmidos y vectores de terapia génica (AAV y retrovirus) (Ryan, MD et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N. M et al., J Virology, noviembre de 1996; páginas 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; y Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198­ 208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; y Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811­ 817).
La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica en las células huésped puede variar entre especies, tejidos o tipos de células, pero en general incluirá, según sea necesario, secuencias 5’ no transcritas y 5' no traducidas implicadas en el inicio de transcripción y traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, secuencia de encapsulación de extremos, secuencia CAAT, elementos potenciadores y similares. Especialmente, dichas secuencias reguladoras 5’ no transcritas incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido operativamente. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba, según se desee. Los vectores de la divulgación pueden incluir opcionalmente secuencias 5’ líder o señal. La elección y el diseño de un vector apropiado están dentro de la capacidad y el criterio de un experto en la técnica.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous (RSV) retroviral (opcionalmente con el potenciador RSV), el promotor del citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)], el promotor SV40, el promotor dihidrofolato reductasa, el promotor p-actina, el promotor fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor EF1a [Invitrogen].
Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y pueden ser regulados por compuestos suministrados exógenamente, factores ambientales tales como la temperatura o la presencia de un estado fisiológico específico, por ejemplo, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solo en células replicantes. Los promotores inducibles y los sistemas inducibles están disponibles en una diversidad de fuentes comerciales, que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Se han descrito muchos otros sistemas y un experto en la técnica puede seleccionarlos fácilmente. Los ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina de oveja (MT) inducible por zinc, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema promotor de la polimerasa T7 (documento WO 98/10088); el promotor de insectos de ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 3346-3351 (1996)), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551 (1992)), el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268: 1766-1769 (1995), véase también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2: 512-518 (1998)), el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15: 239-243 (1997)) y Wang et al., Gene Ther., 4: 432-441 (1997)) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100: 2865-2872 (1997)). Otros tipos de promotores inducibles que también pueden ser útiles en este contexto son aquellos que están regulados por un estado fisiológico específico, por ejemplo, temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solo en células replicantes.
En otra forma de realización, se utilizará el promotor nativo del transgén. Puede preferirse el promotor nativo cuando se desee que la expresión del transgén imite la expresión nativa. El promotor nativo puede usarse cuando la expresión del transgén debe regularse temporalmente o en términos de desarrollo, o de una forma específica de tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una forma de realización adicional, también pueden utilizarse otros elementos de control de la expresión nativos, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak para imitar la expresión nativa.
En algunas formas de realización, las secuencias reguladoras imparten capacidades de expresión génica específicas de tejido. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas de tejido se unen a factores de transcripción específicos de tejido que inducen la transcripción de una forma específica de tejido. Tales secuencias reguladoras específicas de tejido (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) son bien conocidas en la técnica. Los ejemplos de secuencias reguladoras específicas de tejido incluyen, pero sin limitación, los siguientes promotores específicos de tejido: un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG) específico de hígado, un promotor de insulina, un promotor de glucagón, un promotor de somatostatina, un promotor de polipéptido pancreático (PPY), un promotor de sinapsina-1 (Syn), un promotor de creatina quinasa (MCK), un promotor de desmina de mamífero (DES), un promotor de cadena pesada de a-miosina (a-MHC) o un promotor de troponina T cardiaca (cTnT). Otros ejemplos de promotores incluyen el promotor de beta-actina, el promotor del núcleo del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 1002-9 (1996); promotor de alfa-fetoproteína (AFP), Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7: 1503-14 (1996)), promotor de osteocalcina ósea (Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24: 185 - 96 (1997)); promotor de sialoproteína ósea (Chen et al., J. Bone Miner. Res. 11: 654-64 (1996)), Promotor CD2 (Hansal et al., J. Immunol., 161: 1063-8 (1998); promotor de la cadena pesada de inmunoglobulina; promotor de la cadena a del receptor de células T, promotor neuronal tal como enolasa específica de neurona (NSE) (Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13: 503-15 (1993)), promotor del gen de la cadena ligera del neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 5611 -5 (1991)), y el promotor del gen vgf específico de neurona (Piccioli et al., Neuron, 15: 373-84 (1995)), entre otros que serán evidentes para el experto en la técnica.
Producción de ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec)
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para producir un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación (por ejemplo, ADNec), que comprende: (i) introducir en una célula permisiva un ácido nucleico que codifica un inserto de ácido nucleico heterólogo flanqueado por al menos una secuencia autocomplementaria interrumpida, en el que cada secuencia autocomplementaria tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante, en el que la secuencia autocomplementaria está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles opuestos, longitudinalmente simétricos, en el que cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo con una longitud en el intervalo de 5 a 15 pares de bases y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados; y (ii) mantener la célula permisiva en condiciones en las que una proteína de replicación por círculo rodante en la célula permisiva inicia la producción de múltiples copias del ácido nucleico.
El número de copias resultantes de la producción de un ácido nucleico se puede expresar como un múltiplo del número original de copias del ácido nucleico (por ejemplo, 1, 2, 10, 100 o más copias originales) introducidas en la célula permisiva. En algunas formas de realización, la producción de múltiples copias del ácido nucleico da como resultado un aumento de entre 2 y 10.000 veces en el número de copias del ácido nucleico en la célula permisiva. En algunas formas de realización, la producción de múltiples copias del ácido nucleico da como resultado un aumento de más de 10.000 veces en el número de copias del ácido nucleico en la célula permisiva.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona células transfectadas (por ejemplo, células permisivas transfectadas). El término "transfección" se utiliza para referirse a la captación de ADN extraño por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana celular. En general, se conocen en la técnica varias técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al. (1981) Gene 13:197. Dichas técnicas se pueden usar para introducir uno o más ácidos nucleicos exógenos, tales como un vector de integración de nucleótidos y otras moléculas de ácido nucleico, en células adecuadas (por ejemplo, células permisivas).
Una "célula permisiva" se refiere a cualquier célula en la que un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación se replica, o es capaz de promover la replicación de un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación. En algunas formas de realización, la célula permisiva no expresa proteínas de la cápside vírica capaces de envasar copias de replicación del ácido nucleico en una partícula vírica. Los aspectos de la divulgación se refieren, en parte, al sorprendente descubrimiento de que, en algunas formas de realización, las células de mamífero no son permisivas para la replicación de ácidos nucleicos descritos en la divulgación. En consecuencia, en algunas formas de realización, una célula permisiva es una célula que no es de mamífero (por ejemplo, la célula permisiva no es una célula de mamífero). En algunas formas de realización, la célula permisiva es una línea celular de insecto, una línea celular de levadura o una línea celular bacteriana.
Los ejemplos de células de insectos permisivas incluyen, pero sin limitación, Spodoptera frugiperda (por ejemplo, Sf9, Sf21), Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Heliothis subflexa, Anticarsia gemmatalis, Trichopulsia ni (por ejemplo, células High-Five), Drosophila melanogaster (por ejemplo, S2, S3), Antheraea eucalypti, Bombyx mori, Aedes alpopictus, Aedes aegyptii, y otras.
Los ejemplos de células bacterianas permisivas incluyen, pero sin limitación, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum y Pseudomonas fluorescens.
Los ejemplos de células de levadura permisivas incluyen, pero sin limitación, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris, Bacillus sp, Aspergillus sp, Trichoderma sp. y Myceliophthora thermophila C1.
Los ejemplos de células vegetales permisivas incluyen, pero sin limitación, Nicotiana sp., Arabidopsis thaliana, Mays zea, Solanum sp. o Lemna sp.
En algunas formas de realización, una célula permisiva es una célula de mamífero. Los ejemplos de células de mamífero permisivas incluyen células tumorales Henrietta Lacks (HeLa) y células de riñón de cría de hámster (BHK-21).
En algunas formas de realización, un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación está contenido dentro de un vector y se suministra a una célula permisiva. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "vector" incluye cualquier elemento genético, tal como un plásmido, fago, transposón, cósmido, cromosoma, cromosoma artificial, virus, virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos de control adecuados y que puede transferir secuencias de genes entre células. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores víricos. En algunas formas de realización, se contempla que los vectores útiles sean aquellos vectores en los que el segmento de ácido nucleico que se va a transcribir está ubicado bajo el control transcripcional de un promotor.
En algunas formas de realización, el procedimiento comprende expresar una proteína de replicación por círculo rodante (por ejemplo, una proteína vírica no estructural, tal como una proteína Rep de AAV) en la célula permisiva. En algunas formas de realización, se expresa más de una (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) proteína de replicación por círculo rodante en una célula permisiva. Sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, la o las proteínas no estructurales víricas expresadas en la célula permisiva median la replicación de un ácido nucleico descrito en la divulgación. Por ejemplo, en algunas formas de realización, Rep78 y Rep52 de AAV se expresan en una célula permisiva que comprende un ácido nucleico que tiene secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas basadas en ITR de AAV2. En algunas formas de realización, la proteína vírica no estructural se selecciona del grupo que consiste en AAV78, AAV52, Rep68 de AAV y Rep40 de AAV.
En algunas formas de realización, una proteína de replicación por círculo rodante (por ejemplo, una proteína vírica no estructural, tal como una proteína Rep de AAV) expresada en una célula permisiva está codificada por un vector de virus auxiliar. Tal como se utiliza en el presente documento, "vector de virus auxiliar" se refiere a un vector vírico que expresa una o varias moléculas (por ejemplo, una o más proteínas) requeridas para la replicación de un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un vector de virus auxiliar expresa una o más proteínas de replicación por círculo rodante que se unen al RBE de una secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida e inician la replicación del ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida. Los vectores de virus auxiliares son generalmente conocidos e incluyen, por ejemplo, vectores de baculovirus, adenovirus, herpesvirus, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y virus vacuna. En algunas formas de realización, un vector de virus auxiliar es un vector de expresión de baculovirus (BEV). Los vectores de expresión de baculovirus son generalmente conocidos en la técnica, por ejemplo, tal como se divulga por Passer et al. Methods Mol Biol. 2007; 388: 55-76. Los ejemplos de vectores de baculovirus incluyen, pero sin limitación, vector del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autograph californica (AcMNPV), BmNPV y nucleopoliedrovirus múltiple de Spodoptera exigua. En algunas formas de realización, el vector de virus auxiliar es el vector del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autograph californica (AcMNPV).
En algunas formas de realización, los procedimientos para producir ácidos nucleicos descritos en la divulgación comprenden además una etapa de purificar las múltiples copias del ácido nucleico de una célula (por ejemplo, una célula permisiva). Generalmente, se puede utilizar cualquier procedimiento de purificación de ácido nucleico adecuado. Por ejemplo, en algunas formas de realización, las múltiples copias del ácido nucleico descritas en la divulgación se purifican mediante kits de purificación de plásmidos, tales como el kit Qiagen MiniPrep, precipitación con etanol, purificación con fenol-cloroformo, etc. Sin embargo, la divulgación se refiere, en parte, al descubrimiento de que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias autocomplementarias interrumpidas muestran una escasa eficacia de unión a medios de cromatografía de intercambio catiónico débiles (por ejemplo, medio dietilaminoetílico, DEAE) y que la purificación utilizando medios de gel de sílice produce especies moleculares bien resueltas al tiempo que reduce la formación de complejos de alto peso molecular. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la purificación comprende poner en contacto el ácido nucleico con una resina de gel de sílice.
En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos proporcionados en el presente documento pueden usarse para suministrar un inserto heterólogo a una célula, por ejemplo, con fines terapéuticos. Además, en algunos aspectos, la divulgación se refiere al suministro de ácidos nucleicos que contienen insertos heterólogos que codifican productos terapéuticos (por ejemplo, proteínas terapéuticas, ARN terapéuticos) a un sujeto. Para evitar la administración de ácidos nucleicos impuros o contaminados o para caracterizar de otro modo el grado o la pureza, la calidad o la composición de una preparación de ácido nucleico, dichas preparaciones pueden estar sujetas a un control de calidad (QC) u otro procedimiento de análisis antes de su uso, por ejemplo, antes de la administración a una célula o a un sujeto. Por ejemplo, los procedimientos para analizar un ácido nucleico, en algunas formas de realización, comprenden obtener una preparación de ácido nucleico descrita en la divulgación y determinar una propiedad fisicoquímica de uno o más componentes de ácido nucleico en la preparación, por ejemplo, productos de replicación de ácido nucleico.
Los ejemplos de propiedades fisicoquímicas que pueden determinarse incluyen, pero sin limitación, solubilidad, estabilidad, estructura (por ejemplo, estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria, estructura cuaternaria, etc.), hidrofobicidad, contenido de GC, peso molecular (por ejemplo, peso molecular de uno o más fragmentos o porciones de un ácido nucleico, por ejemplo después de la digestión de restricción), etc. En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la secuencia de nucleótidos de una o de cada secuencia autocomplementaria (por ejemplo, determinar si un ácido nucleico descrito en la divulgación comprende una secuencia de brazo transversal truncada).
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es el grado de multimerización (por ejemplo, monómero, dímero, trímero, 4-mero u otro multímero o concatámero) de un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación. En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la estequiometría de formas monoméricas y/o multiméricas del producto de replicación en la preparación de ácido nucleico.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la susceptibilidad de uno o más productos de replicación (por ejemplo, obtenidos a partir de una preparación de ácido nucleico) a la digestión con una endonucleasa de restricción. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación se digiere con una o más enzimas de restricción y los fragmentos del ácido nucleico se analizan para determinar el tamaño de cada fragmento. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es el peso molecular de uno o más productos de replicación o de un fragmento de un producto de replicación. En algunas formas de realización, el peso molecular es de un fragmento de uno o más productos de replicación que comprende una o más secuencias autocomplementarias. En algunas formas de realización, el peso molecular se determina basándose en la movilidad electroforética. En algunas formas de realización, el peso molecular se determina basándose en espectroscopía de masas.
En algunas formas de realización, el peso molecular es de un fragmento de uno o más productos de replicación. En algunas formas de realización, el peso molecular es de un fragmento de un producto de replicación que se amplifica mediante una reacción que comprende la extensión del cebador mediante una polimerasa. Ejemplos de procedimientos de extensión basados en polimerasa incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de la polimerasa recombinasa, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), etc.
En algunas formas de realización, la propiedad fisicoquímica es la polaridad de los monómeros en una forma dimérica del producto de replicación, siendo la polaridad de cabeza a cabeza, de cabeza a cola o de cola a cola.
Generalmente, pueden utilizarse ensayos adecuados para determinar propiedades fisicoquímicas. Los ensayos adecuados pueden incluir análisis de digestión de restricción, electroforesis en gel (por ejemplo, electroforesis en gel nativo, electroforesis en gel desnaturalizante, electroforesis en gel de alta resolución), espectrometría (por ejemplo, espectrometría de masas, tal como CL/EM, HPLC/EM, ESI-EM, MALDI-TOF, etc.), y secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, secuenciación de Maxam-Gilbert, pirosecuenciación, secuenciación de terminación de cadena, secuenciación masiva de firmas paralelas, secuenciación de una sola molécula, secuenciación de nanoporos, secuenciación de Illumina, etc.).
Composiciones
En algunos aspectos, la divulgación se refiere a composiciones que comprenden un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación. En algunas formas de realización, las composiciones que comprenden ácidos nucleicos tal como se describen en el presente documento se suministran a un sujeto con necesidad de ello. Los ácidos nucleicos pueden suministrarse a un sujeto en composiciones según cualquier procedimiento apropiado conocido en la técnica. Debe apreciarse que las composiciones pueden comprender uno o más (por ejemplo, una pluralidad) de ácidos nucleicos tal como se describen en la divulgación. En algunas formas de realización, una pluralidad de ácidos nucleicos son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más ácidos nucleicos. En algunas formas de realización, cada uno de los uno o más ácidos nucleicos de una pluralidad está unido covalentemente (por ejemplo, unido extremo a extremo). En algunas formas de realización, la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El ácido nucleico, preferentemente suspendido en un vehículo fisiológicamente compatible (es decir, en una composición), se puede administrar a un sujeto, es decir, un animal huésped, tal como un ser humano, ratón, rata, gato, perro, oveja, conejo, caballo, vaca, cabra, cerdo, cobaya, hámster, pollo, pavo o un primate no humano (por ejemplo, un macaco). En algunas formas de realización, un animal huésped no incluye a un ser humano.
El suministro de los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNec) a un sujeto mamífero puede ser, por ejemplo, por inyección intramuscular o por administración en el torrente sanguíneo del sujeto mamífero. La administración en el torrente sanguíneo puede ser mediante inyección en una vena, una arteria o cualquier otro conducto vascular. En algunas formas de realización, los ácidos nucleicos se administran en el torrente sanguíneo por medio de perfusión de extremidades aisladas, una técnica bien conocida en la técnica quirúrgica, permitiendo el procedimiento esencialmente al técnico aislar una extremidad de la circulación sistémica antes de la administración del ácido nucleico. Una variante de la técnica de perfusión de extremidades aisladas, descrita en la patente de Estados Unidos N° 6.177.403, también puede emplearse por un experto en la técnica para administrar el ácido o ácidos nucleicos en la vasculatura de una extremidad aislada para potenciar potencialmente la transfección de células o tejidos musculares. Además, en determinados casos, puede ser deseable suministrar el o los ácidos nucleicos al SNC de un sujeto. Por "SNC" se entiende todas las células y tejidos del cerebro y la médula espinal de un vertebrado. Por lo tanto, el término incluye, pero sin limitación, células neuronales, células gliales, astrocitos, líquido cefalorraquídeo (LCR), espacios intersticiales, hueso, cartílago y similares. Los AAV recombinantes pueden suministrarse directamente al SNC o al cerebro mediante inyección en, por ejemplo, la región ventricular, así como en el cuerpo estriado (por ejemplo, el núcleo caudado o putamen del cuerpo estriado), la médula espinal y la unión neuromuscular, o el lóbulo cerebeloso, con una aguja, catéter o dispositivo relacionado, utilizando técnicas neuroquirúrgicas conocidas en la técnica, tales como por inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Stein et al., J Virol 73: 3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97: 3428­ 3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3: 219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11: 2315-2329, 2000).
Los vehículos adecuados pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la técnica en vista de la indicación a la que se dirige el o los ácidos nucleicos. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye solución salina, que puede formularse con una diversidad de soluciones tampón (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato). Otros ejemplos de vehículos incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del vehículo no es una limitación de la presente divulgación.
Opcionalmente, las composiciones de la divulgación pueden contener, además del o de los ácidos nucleicos y del o de los vehículos, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizantes químicos. Los ejemplos de conservantes adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, parabenos, etilvainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
El o los ácidos nucleicos se administran en cantidades suficientes para transfectar las células de un tejido deseado y para proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica sin efectos adversos indebidos. Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, el suministro directo al órgano seleccionado (por ejemplo, suministro por vía intraportal al hígado), la vía oral, por inhalación (incluyendo el suministro por vía intranasal e intratraqueal), las vías intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, intratumoral y otras vías de administración parentales. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea.
La dosis de ácido(s) nucleico(s) requerida para lograr un "efecto terapéutico" particular variará en función de varios factores que incluyen, pero sin limitación: la vía de administración del ácido nucleico, el nivel de expresión del gen o ARN requerido para lograr un efecto terapéutico, la enfermedad o trastorno específico que se está tratando y la estabilidad del gen o producto de ARN. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente un intervalo de dosis de ácido nucleico para tratar a un paciente que tiene una enfermedad o trastorno particular basándose en los factores antes mencionados, así como en otros factores que son bien conocidos en la técnica.
El régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, el oligonucleótido se puede administrar repetidamente, por ejemplo, se pueden administrar varias dosis al día o se puede reducir proporcionalmente la dosis según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Un experto en la técnica podrá determinar fácilmente las dosis y los programas de administración apropiados de los oligonucleótidos objeto, tanto si los oligonucleótidos se administran a células como a sujetos.
Los expertos en la técnica conocen bien la formulación de excipientes y soluciones de vehículo farmacéuticamente aceptables, así como el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento.
Normalmente, estas formulaciones pueden contener al menos aproximadamente el 0,1% del compuesto activo o más, aunque el porcentaje del o de los ingredientes activos, por supuesto, puede variarse y puede encontrarse convenientemente entre aproximadamente el 1 o el 2% y aproximadamente el 70% o el 80% o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuesto activo en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtenga una dosis adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas serán contempladas por un experto en la técnica de preparación de dichas formulaciones farmacéuticas y, como tal, pueden ser deseables una diversidad de dosis y regímenes de tratamiento.
En determinadas circunstancias, será deseable suministrar los constructos terapéuticos basados en ácido nucleico en composiciones farmacéuticas adecuadamente formuladas descritas en el presente documento ya sea por vía subcutánea, intraopancreática, intranasal, parenteral, intravenosa, intramuscular, intratecal u oral, intraperitoneal o por inhalación. En algunas formas de realización, las modalidades de administración descritas en las patentes de Estados Unidos N° 5.543.158, 5.641.515 y 5.399.363 pueden usarse para suministrar ácidos nucleicos. En algunas formas de realización, un modo de administración preferido es mediante inyección en la vena porta.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos. En muchos casos, la forma es estéril y fluida en la medida en que se puede inyectar fácilmente con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para la administración de una solución acuosa inyectable, por ejemplo, la solución puede tamponarse de forma adecuada, si es necesario, y el diluyente líquido en primer lugar puede volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la técnica conocerán un medio acuoso estéril que pueda emplearse. Por ejemplo, una dosis puede disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el lugar de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Necesariamente ocurrirá alguna variación en la dosis dependiendo de la afección del huésped. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el huésped individual.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el ácido nucleico en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, operación seguida de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y liofilización que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada de forma estéril de los mismos.
Las composiciones de ácido nucleico divulgadas en el presente documento también se pueden formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.
Tal como se utiliza en el presente documento, "vehículo" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, revestimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, soluciones de vehículos, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos suplementarios. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa alérgica o similar cuando se administran a un huésped.
Se pueden utilizar vehículos de suministro tales como liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente divulgación en células huésped adecuadas. En particular, los ácidos nucleicos pueden formularse para su suministro encapsulados en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similares.
Dichas formulaciones pueden preferirse para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen generalmente la formación y el uso de liposomas. Recientemente, se han desarrollado liposomas con mejores estabilidad en suero y semividas en circulación (patente de Estados Unidos N° 5.741.516). Además, se han descrito varios procedimientos de liposomas y preparaciones similares a liposomas como posibles vehiculos de fármacos (patentes de Estados Unidos N° 5.567.434, 5.552.157, 5.565.213, 5.738.868 y 5.795.587).
Los liposomas se han utilizado con éxito con varios tipos de células que normalmente son resistentes a la transfección mediante otros procedimientos. Además, los liposomas carecen de las limitaciones de longitud del ADN que son típicas de los sistemas de suministro basados en virus. Los liposomas se han utilizado de forma eficaz para introducir genes, fármacos, agentes radioterapéuticos, virus, factores de transcripción y efectores alostéricos en una diversidad de líneas de células cultivadas y animales. Además, se han completado varios ensayos clínicos exitosos que examinan la eficacia del suministro de fármacos mediado por liposomas.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de dos capas concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 ANG, que contienen una solución acuosa en el núcleo.
En algunas formas de realización, un liposoma comprende lípidos catiónicos. El término "lípido catiónico" incluye lípidos y lípidos sintéticos que tienen dominios polares y no polares y que son capaces de cargarse positivamente a pH fisiológico o cerca del mismo y que se unen a polianiones, tales como ácidos nucleicos, y facilitan el suministro de ácidos nucleicos a células. En algunas formas de realización, los lípidos catiónicos incluyen éteres y ésteres de alquilo y alicíclicos saturados e insaturados de aminas, amidas o derivados de los mismos. En algunas formas de realización, los lípidos catiónicos comprenden grupos alquilo, alquenilo ramificados, de cadena lineal o cualquier combinación de los anteriores. En algunas formas de realización, los lípidos catiónicos contienen de 1 a aproximadamente 25 átomos de carbono (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 átomos de carbono). En algunas formas de realización, los lípidos catiónicos contienen más de 25 átomos de carbono. En algunas formas de realización, los grupos alquilo o alqueno de cadena lineal o ramificada tienen seis o más átomos de carbono. Un lípido catiónico también puede comprender, en algunas formas de realización, uno o más grupos alicíclicos. Los ejemplos no limitantes de grupos alicíclicos incluyen colesterol y otros grupos esteroides. En algunas formas de realización, los lípidos catiónicos se preparan con uno o más contraiones. Ejemplos de contraiones (aniones) incluyen, pero sin limitación, Cl-, Br, I-, F-, acetato, trifluoroacetato, sulfato, nitrito y nitrato.
Los ejemplos no limitantes de lípidos catiónicos incluyen polietilenimina, poliamidoamina (PAMAM) dendrímeros en forma de estrella, lipofectina (una combinación de DOTMA y DOPE), lipofectasa, LlPoFECTAMINE™ (por ejemplo, LIPOFECt A m INE™ 2000), DOPE, Cytofectin (Gilead Sciences, Foster City, CA) y Eufectins (JBL, San Luis Obispo, CA). Se pueden preparar liposomas catiónicos de ejemplo a partir de cloruro de N-[1 -(2,3-dioleoloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoloxi)-propilo]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), 3p-[N-(N’,N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), trifluoroacetato de 2,3,-dioleiloxi-N-[2(esperminacarboxamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetilhidroxietilamonio; y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB). Los ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNec) también se puede complejar con, por ejemplo, poli(L-lisina) o avidina y los lípidos pueden, o no, estar incluidos en esta mezcla, por ejemplo, esteril-poli(L-lisina).
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se suministra utilizando un lípido catiónico descrito en la patente de Estados Unidos N° 8.158.601, o un compuesto de poliamina o lípido tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 8.034.376.
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación está conjugado (por ejemplo, unido covalentemente a un agente que aumenta la captación celular). Un "agente que aumenta la captación celular" es una molécula que facilita el transporte de un ácido nucleico a través de una membrana lipídica. Por ejemplo, un ácido nucleico puede conjugarse con un compuesto lipófilo (por ejemplo, colesterol, tocoferol, etc.), un péptido penetrante de células (CPP) (por ejemplo, penetratina, TAT, Syn1 B, etc.), y poliaminas (por ejemplo, espermina). Otros ejemplos de agentes que aumentan la captación celular se divulgan, por ejemplo, por Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4 (7); 791-809.
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se conjuga con un polímero (por ejemplo, una molécula polimérica) o una molécula de folato (por ejemplo, molécula de ácido fólico). Generalmente, el suministro de ácidos nucleicos conjugados a polímeros es conocido en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en los documentos WO2000/34343 y WO2008/022309. En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se conjuga con un polímero de poli (amida), por ejemplo, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 8.987.377. En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se conjuga con una molécula de ácido fólico tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 8.507.455.
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se conjuga con un carbohidrato, por ejemplo, tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 8.450.467.
Alternativamente, pueden utilizarse formulaciones de nanocápsulas del ácido nucleico. Las nanocápsulas generalmente pueden atrapar sustancias de forma estable y reproducible. Para evitar los efectos secundarios debidos a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0,1 gm) deberán diseñarse utilizando polímeros capaces de degradarse in vivo. Se contempla el uso de nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos.
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se suministra mediante una nanopartícula lipídica. Generalmente, las nanopartículas lipídicas comprenden un amino-lípido ionizable (por ejemplo, 4-(dimetilamino)butanoato de heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo, DLin-MC3-DMA, una fosfatidilcolina (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DSPC), colesterol y un lípido de cubierta (polietilenglicol-dimiristolglicerol, PEG-DMG), por ejemplo, tal como se divulga por Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5 (3): 498-507. En algunas formas de realización, una nanopartícula lipídica tiene un diámetro medio de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1000 nm. En algunas formas de realización, una nanopartícula lipídica tiene un diámetro inferior a 300 nm. En algunas formas de realización, una nanopartícula lipídica tiene un diámetro de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 300 nm. En algunas formas de realización, una nanopartícula lipídica tiene un diámetro inferior a 200 nm. En algunas formas de realización, una nanopartícula lipídica tiene un diámetro de entre aproximadamente 25 y aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, una preparación de nanopartículas lipídicas (por ejemplo, composición que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas) tiene una distribución de tamaño en la que el tamaño medio (por ejemplo, diámetro) es de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 200 nm y, más típicamente, el tamaño medio es de aproximadamente 100 nm o inferior.
En algunas formas de realización, un ácido nucleico descrito en la divulgación se suministra mediante una nanopartícula de oro. Generalmente, un ácido nucleico puede unirse covalentemente a una nanopartícula de oro o unirse de forma no covalente a una nanopartícula de oro (por ejemplo, unirse mediante una interacción carga-carga), por ejemplo, tal como se describe por Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22 (6); 1075-1083. En algunas formas de realización, los conjugados de nanopartículas de oro y ácido nucleico se producen utilizando procedimientos descritos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N° 6.812.334.
Además de los procedimientos de suministro descritos anteriormente, las siguientes técnicas también se contemplan como procedimientos alternativos para suministrar las composiciones de ácido nucleico a un huésped. La sonoforesis (por ejemplo, ultrasonidos) se ha utilizado y se ha descrito en la patente de Estados Unidos N° 5.656.016 como un dispositivo para mejorar la velocidad y la eficacia de la penetración del fármaco en y a través del sistema circulatorio. Otras alternativas de suministro de fármacos contempladas son la inyección intraósea (patente de Estados Unidos N° 5.779.708), dispositivos de microchip (patente de Estados Unidos N° 5.797.898), formulaciones oftálmicas (Bourlais et al., 1998), matrices transdérmicas (patentes de Estados Unidos N° 5.770.219 y 5.783.208) y suministro controlado por retroalimentación (patente de Estados Unidos N° 5.697.899).
Suministro/ administración
En algunas formas de realización, la divulgación proporciona un procedimiento para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula (por ejemplo, una célula huésped), comprendiendo el procedimiento suministrar a la célula un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona células huésped transfectadas. Una "célula huésped" se refiere a cualquier célula que alberga, o es capaz de albergar, una sustancia de interés. Puede usarse una célula huésped como receptora de un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por lo tanto, una "célula huésped", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógeno (por ejemplo, un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación). Se entiende que la progenie de una única célula progenitora puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento genómico o de ADN total que el progenitor original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.
En algunas formas de realización, una célula huésped es una célula permisiva. En algunas formas de realización, una célula huésped no es una célula permisiva. A menudo, una célula huésped es una célula de mamífero. En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para suministrar un ácido nucleico heterólogo a un sujeto que comprende administrar una célula huésped que tiene un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación al sujeto. Por ejemplo, en algunas formas de realización, una célula huésped es una célula sanguínea, tal como una célula sanguínea humana, que comprende un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación (por ejemplo, un ácido nucleico que tiene un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica un transgén asociado a una enfermedad de la sangre). Sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, el suministro de dicha célula huésped es útil, en algunas formas de realización, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno de la sangre.
Algunos aspectos de la divulgación se refieren al descubrimiento de que los ácidos nucleicos tal como se describen en el presente documento provocan una respuesta inmunitaria reducida (por ejemplo, no provocan una respuesta inmunitaria) en un huésped con respecto a vectores de terapia génica derivados de bacterias y virus que se utilizan actualmente. En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para suministrar un ácido nucleico heterólogo a un sujeto, comprendiendo el procedimiento suministrar al sujeto un ácido nucleico tal como se describe en la divulgación, en el que el suministro del ácido nucleico no da como resultado una respuesta inmunitaria contra el ácido nucleico en el sujeto. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta humoral. La respuesta inmunitaria humoral se refiere a la producción de anticuerpos específicos de antígeno por los linfocitos B. En algunas formas de realización, la respuesta inmunitaria es una respuesta celular. Una respuesta inmunitaria celular se refiere a una respuesta inmunitaria que no involucra anticuerpos, sino más bien la activación de células inmunitarias (por ejemplo, fagocitos, células T específicas de antígeno, macrófagos, células asesinas naturales, etc.) por un antígeno (por ejemplo, un ácido nucleico exógeno).
Sin desear vincularse a ninguna teoría en particular, la falta de respuesta inmunitaria provocada por la administración de ácidos nucleicos tal como se describe en la divulgación permite que los ácidos nucleicos se administren a un huésped en múltiples ocasiones. En algunas formas de realización, el número de ocasiones en las que se suministra un ácido nucleico heterólogo a un sujeto se encuentra en el intervalo de 2 a 10 veces (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces). En algunas formas de realización, se suministra un ácido nucleico heterólogo a un sujeto más de 10 veces.
En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de una vez por día natural (por ejemplo, un periodo de 24 horas). En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de una vez cada 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días naturales. En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de una vez por semana natural (por ejemplo, 7 días naturales). En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de dos veces por semana (por ejemplo, una vez en un periodo de dos semanas naturales). En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de una vez por mes natural (por ejemplo, una vez cada 30 días naturales). En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de una vez cada seis meses naturales. En algunas formas de realización, una dosis de ácido nucleico (por ejemplo, ADNec) se administra a un sujeto no más de una vez por año natural (por ejemplo, 365 días o 366 días en un año bisiesto).
Tal como se divulga en el presente documento, los ácidos nucleicos (incluidos los constructos de expresión de ADN que pueden usarse para expresarlos) pueden administrarse por cualquier vía adecuada. Para su uso en terapia, una cantidad eficaz de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) y/u otro agente terapéutico se puede administrar a un sujeto mediante cualquier modo que suministre el agente al tejido deseado, por ejemplo el tejido muscular. En algunas formas de realización, los agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos) se administran por vía intramuscular. Otras vías de administración adecuadas incluyen, pero sin limitación, las vías oral, parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intranasal, sublingual, intratraqueal, por inhalación, subcutánea, ocular, vaginal y rectal. Las vías sistémicas incluyen las vías oral y parenteral. Se utilizan regularmente varios tipos de dispositivos para la administración por inhalación. Estos tipos de dispositivos incluyen inhaladores de dosis medidas (MDI), MDI accionado por respiración, inhalador de polvo seco (DPI), cámaras espaciadoras/de retención en combinación con MDI y nebulizadores.
Para la administración oral, los agentes se pueden formular fácilmente combinando el o los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular los agentes de la divulgación en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para su ingestión oral por parte de un sujeto que se va a tratar. Pueden obtenerse preparaciones farmacéuticas para uso oral como excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones de uso oral también se pueden formular en solución salina o tampones para neutralizar las condiciones ácidas internas o se pueden administrar sin ningún vehículo.
Las preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas duras fabricadas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas fabricadas de gelatina y un plastificante, tales como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los agentes activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. También se pueden utilizar microesferas formuladas para administración oral. Dichas microesferas se han definido bien en la técnica. Las formulaciones para administración oral se encuentran típicamente en dosis adecuadas para dicha administración.
Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o grageas formuladas de forma convencional.
Para la administración por inhalación, pueden suministrarse convenientemente agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos) para su uso según la presente divulgación en forma de una presentación en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, utilizando un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de por ejemplo, gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Los agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos), cuando es deseable suministrarlos sistémicamente, pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en embolada o infusión continua. Las formulaciones inyectables pueden presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos antisentido) en forma soluble en agua. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de agentes como suspensiones oleosas apropiadas para inyección. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los agentes para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, los agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos) pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso. También se pueden formular los agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos) en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Otros sistemas de suministro pueden incluir sistemas de suministro de liberación prolongada, liberación retardada o liberación mantenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los agentes (por ejemplo, ácidos nucleicos antisentido), aumentando la comodidad para el sujeto y el médico. Se encuentran disponibles muchos tipos de sistemas de suministro de liberación. Estos incluyen sistemas de base polimérica tales como poli(lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutírico y polianhídridos. Los sistemas de suministro también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; revestimientos de cera; comprimidos prensados que utilizan aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y otros divulgados en el presente documento.
Ejemplos
Ejemplo 1: Secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas
La figura 1A muestra un ejemplo no limitante de una secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida (que es una ITR de AAV2). Tal como se muestra en la figura 1A, el ácido nucleico forma una estructura de horquilla en forma de T que tiene una porción de tallo (D-A-A’) y una secuencia de brazo transversal que tiene tallos-bucles longitudinalmente opuestos (B-B' y C-C’). También se representan trs y RBE de la secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida. La figura 1B muestra varios ejemplos no limitantes de truncamientos en el "brazo C" de una secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida. En la figura 3 se muestra una representación gráfica de un ejemplo de ITR de AAV2 asimétricas.
Replicación de ADNec a partir de ITR de AAV asimétricas
Los genomas del virus adenoasociado (AAV) son ADN monocatenarios lineales flanqueados por palíndromos terminales que se denominan típicamente repeticiones terminales invertidas (ITR) (figura 2A, lado izquierdo). Excepto por 7 bases no apareadas, la secuencia de ITR de 145 nt es autocomplementaria y forma una horquilla en forma de "T" energéticamente estable (AG = -72,4 kcal por mol, Tm > 80 °C) (figura 1A). Durante la replicación del ADN vírico, el complejo de ADN polimerasa celular inicia la síntesis en el extremo 3’ de la cadena de plantilla, en la que el dúplex parcial formado por la ITR sirve como cebador para la extensión del cebador. El intermedio de replicación formado es un dúplex intramolecular con las cadenas de plantilla y nacientes conectadas covalentemente por la ITR. Durante una infección productiva, un proceso denominado resolución terminal resuelve la ITR intracatenaria dando como resultado dos genomas de virus complementarios de longitud completa (figura 2B, lado izquierdo).
En ausencia de expresión del gen AAV cap, un genoma de vector de AAV que tiene ITR asimétricas experimenta una replicación ineficaz, y los productos de replicación se acumulan en una nueva conformación de ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec). Debido a una replicación ineficaz (por ejemplo, resolución terminal incompleta), las cadenas complementarias del intermedio intramolecular están ahora unidas covalentemente a través de las ITR en ambos extremos del genoma (figura 2B, lado derecho). Por lo tanto, en condiciones nativas, el ADNec se comporta como ADN dúplex lineal, sin embargo, en condiciones de desnaturalización, las cadenas de ADNec se funden, pero permanecen unidas, transformando, por lo tanto, la molécula dúplex lineal en ADN circular monocatenario.
En algunas formas de realización, la producción de ADNec a partir de ITR de AAV asimétricas depende de una ITR truncada en un extremo y de una ITR de tipo silvestre (wt) o similar a wt operativa (por ejemplo, funcional) en el extremo opuesto del casete del transgén. En algunas formas de realización, la ITR truncada se procesa de forma ineficaz durante los ciclos de replicación del ADNec en las células Sf9, lo que conduce a una acumulación de intermedios de replicación, monómero dúplex, dímeros dúplex, etc. En ausencia de expresión de la proteína estructural (cápside), Rep78 (o Rep68) se ensambla en las ITR intactas y cataliza el corte específico de sitio en el sitio de resolución terminal. La reacción da como resultado la formación de un fosfodiéster de tirosina transitorio (Y156 para Rep78 de AAV2 unida covalentemente a la timidina 5’ del sitio de resolución terminal 5'AGTTGG). El complejo de nucleoproteínas transitorio transfiere después la cadena donante al extremo 3’ libre de la cadena complementaria. Por lo tanto, la conformación del ADNec es resultado de la ITR defectuosa en un extremo del genoma del vector, una ITR intacta u operativa en el extremo opuesto, y la coexpresión de las proteínas Rep p5 y p19, expresándose al menos una Rep p5 y p19. Otras proteínas Rep o NS "pequeñas" de parvovirus pueden sustituir a la proteína Rep p19 de AAV (Rep 52 y Rep 40). Dado que estas proteínas Rep pequeñas son helicasas monoméricas no procesadoras, es factible que las helicasas de la superfamilia 2 (SF2) que no son parvoviridae puedan sustituir a las proteínas Rep de AAV.
Los dependovirinae han existido relativamente sin cambios durante decenas de millones (y probablemente, cientos de millones) de años. Se plantea la hipótesis de que han desarrollado una relación homeostática o simbiótica con sus huéspedes en la que el provirus de las células infectadas de forma latente a menudo se localiza en el locus AAVS1 del cromosoma humano 19q, que parece no tener ningún efecto adverso sobre la célula huésped. Mientras se encuentra en latencia, la expresión del gen AAV es reprimida por factores celulares, por ejemplo, YY1, y por las proteínas Rep p5 que, actuando servomecánicamente, regulan negativamente la expresión de los promotores p5 y p40. Por lo tanto, las células infectadas de forma latente tienen poca o ninguna proteína AAV detectable y limitan la respuesta inmunitaria adquirida a las células que sintetizan proteínas víricas.
Ejemplo 2: Purificación de ADNec
Los protocolos de purificación de plásmidos suelen utilizar geles de sílice para preparaciones de pequeñas cantidades de plásmidos o cromatografía de intercambio aniónico con dietilaminoetil sefarosa (DEAE-sefarosa, por ejemplo) para cantidades mayores. Para la purificación de ADNp a gran escala, las bacterias Escherichia coli se lisan con dodecilsulfato de sodio (SDS) y las proteínas celulares y el ADN genómico se precipitan mediante un ciclo de desnaturalización/neutralización que retiene el plásmido en solución. El ADNp bicatenario renaturalizado se une al grupo DEAE cargado positivamente y, tras las etapas de lavado, el ADNp se desplaza y se eluye con una solución tampón con alto contenido de sal. Alternativamente, pueden utilizarse membranas de gel de sílice para la adsorción selectiva de ADNp del lisado bacteriano clarificado en condiciones de alta salinidad y eluirse en tampón de baja o nula iconicidad.
Se ha observado que el ADNec se puede purificar fácilmente con el proceso basado en gel de sílice a pequeña escala. Usando el protocolo de intercambio aniónico a gran escala, la recuperación de ADNec fue muy ineficaz y dio como resultado bajos rendimientos.
Se describe un procedimiento para la purificación de ADNec a gran escala a partir de células Sf9 de invertebrados utilizando membranas de gel de sílice. El aumento del área superficial de la membrana de gel de sílice modificada (o medio de cromatografía) es un enfoque para mejorar la velocidad de flujo, la adsorción y la recuperación de ADNec. Hay disponibilidad de cápsulas de filtro estándar en una amplia gama de configuraciones que varían en tamaño desde 0,5 cm de diámetro hasta 20 cm de diámetro o más. La cápsula puede contener una sola capa de membrana de gel de sílice sobre un soporte químicamente inerte, o pilas de membranas separadas por soportes inertes, o membranas plisadas que utilizan un diseño de flujo horizontal. La filtración de flujo tangencial (TFF) y la filtración en fibra hueca (HFF) son alternativas para la filtración en cápsula de flujo coaxial.
Ejemplo 3: Constructos de ADNec para el tratamiento de enfermedades
La figura 4 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad ocular. El primer constructo de ácido nucleico de la figura 4 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la enfermedad de Stargardt. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica la proteína del casete de unión a ATP, subfamilia A (ABC1), miembro 4 (ABCA4). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un intrón 2 de hBglobina ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de hGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El segundo constructo de ácido nucleico de la figura 4 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la enfermedad de Usher. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica la variante 1 de la proteína usherina (USH2A). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El tercer constructo de ácido nucleico de la figura 4 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la degeneración/neovascularización macular. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El cuarto constructo de ácido nucleico de la figura 4 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la amaurosis congénita de Leber. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica la proteína centrosómica 290 (CEP290). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
La figura 5 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedades de la sangre. El primer constructo de ácido nucleico de la figura 5 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la hemofilia A. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica la proteína del factor VIII con deleción del dominio B (BDD-FVIII). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El segundo constructo de ácido nucleico de la figura 5 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la hemofilia A. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica la proteína de factor VIII de longitud completa (FVIII), que supera la capacidad de clonación de los vectores de AAV tradicionales. Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El tercer constructo de ácido nucleico de la figura 5 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la enfermedad del factor de von Willebrand. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica el factor de von Willebrand (vWF). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
La figura 6 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad hepática. El primer constructo de ácido nucleico de la figura 6 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la hipercolesterolemia. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica lecitina colesterol acetil transferasa. Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El segundo constructo de ácido nucleico de la figura 6 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la fenilcetonuria (PKU). El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica fenilalanina hidroxilasa (PAH). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El tercer constructo de ácido nucleico de la figura 6 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno 1 (GSD1). El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica la subunidad catalítica de glucosa 6-fosfatasa (G6PC). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
La figura 7 muestra ejemplos no limitantes de constructos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico autocomplementarias asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2) y un transgén asociado con enfermedad pulmonar. El primer constructo de ácido nucleico de la figura 7 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la fibrosis quística. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística (CFTR). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
El segundo constructo de ácido nucleico de la figura 7 representa un ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico para el tratamiento de la deficiencia de alfa-1 antitripsina. El ácido nucleico comprende un par de secuencias de ácido nucleico autocomplementarias interrumpidas asimétricas (por ejemplo, ITR de AAV2 asimétricas) que flanquean un inserto de ácido nucleico heterólogo que codifica alfa-1 antitripsina (AAT). Las ITR de AAV2 son asimétricas porque una de las ITR de AAV2 (lado derecho) contiene una deleción en la región del tallo C. Cada secuencia de ácido nucleico autocomplementaria interrumpida incluye un elemento de unión a Rep (RBE) operativo y un sitio de resolución terminal (trs) operativo. El ácido nucleico también codifica un promotor/potenciador CMV y un promotor T7 ubicado en 5’ con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo, y una señal de poli(A) de bGH ubicada en 3' con respecto al inserto de ácido nucleico heterólogo.
Ejemplo 4: Estudios in vivo: suministro hidrodinámico de ADN desnudo a ratones ICR machos normales
Después de infundir ADNp en la vena de la cola de ratones, la expresión de lacZ disminuyó continuamente entre las 24 horas y 5 semanas, lo que corresponde a la cantidad de ADNp por genoma diploide. El hígado de los ratones tratados con ADNec que tiene secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas no mostraron cambios en la actividad de lacZ entre las 24 horas y 1 semana, sin embargo, la expresión se redujo sustancialmente a las 5 semanas. Sin embargo, el ADNec presente en los hepatocitos permaneció esencialmente sin cambios en el punto de 5 semanas. Se obtuvieron resultados similares con casetes de GFP del promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG): poca o ninguna expresión de GFP y ADNp fueron detectables después de 10 semanas, mientras que la expresión de TBG-GFP de ADNec y los niveles de ADN permanecieron sin cambios entre 1 y 10 semanas.
Ejemplo 5: Suministro ocular de ADNec
Se observó fluorescencia directa de GFP de manera uniforme en las células que abarcaban el ancho de la retina. Las figuras 8A-8D muestran el suministro de ADNec que tiene secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas al ojo. Se anestesiaron ratones adultos con ketamina/xilazina (100/10 mg/kg) y se suministró el agente de transfección por vía intravítrea mediante una inyección transescleral a un volumen de 1-2 gl. Se aplicó un ungüento antibiótico en la córnea para evitar que los ojos se secaran mientras el ratón se recuperaba. Se dejó que el ratón se recuperara a 37 grados y después se volvió a disponer en el espacio de alojamiento del ratón durante 2 semanas y se sacrificó mediante asfixia con CO2. La retina se diseccionó y se procesó para preparar un montaje plano o una sección plana. No fue necesaria tinción con anticuerpos GFP para detectar células transfectadas. La figura 8A muestra un montaje plano de fluorescencia de GFP en la retina de un ratón. La figura 8B muestra fluorescencia de GFP en una sección transversal de la retina. La figura 8C muestra fluorescencia de GFP y tinción de células gliales en una sección transversal de la retina. La figura 8D muestra fluorescencia de GFP en la retina de ratón después del suministro de ADNec por electroporación subretiniana (parte superior) e inyección intravítrea (parte inferior).
Ejemplo 6: Estudios in vivo: suministro intraestriatal en ratas
Se formuló ADNec-GFP (ADNec que tiene secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas) con un reactivo de transfección disponible comercialmente, jetPEI in vivo, a una concentración apropiada (Polyplus Corp.) y se inyectó por vía intracraneal en el cuerpo estriado de ratas (figura 9A). Las ratas se sacrificaron 3 semanas y 20 semanas después de la inyección y, después del procesamiento, las secciones de cerebro se examinaron utilizando inmunohistoquímica (IHC) con anticuerpos (Ab) contra GFP, MHCII e Iba1. Se observó una expresión de GFP similar a las 3 semanas y a las 20 semanas. A las 3 semanas, no se detectó ningún antígeno MHCII o Iba1 en las secciones de cerebro, tal como se muestra en las figuras 9B-9C.
Ejemplo 7: Infección por Sf9 para producir ADNec
Transposición en bácmido
Se descongelaron células competentes DH10Bac (Invitrogen) en hielo. Se dispensaron 50 gl de células en tubos de 14 ml, se añadieron 50 ng de ADN plasmídico (por ejemplo, un plásmido que comprende un transgén que codifica una proteína flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas) y se mezcló suavemente. La secuencia de ADN del plásmido descrito en este ejemplo está representada por SEQ ID NO: 25. La secuencia de ADN de la región del plásmido que comprende un transgén que codifica una proteína flanqueada por secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas está representada por SEQ ID NO: 26
El análisis de secuencia de las secuencias autocomplementarias interrumpidas por ADN plasmídico se muestra en las figuras 10A-10B. La secuencia autocomplementaria 5’ (denominada la porción de cabeza, que se encuentra cadena arriba de la secuencia codificante del transgén) se muestra en la figura 10 A. Esta se secuenció utilizando un cebador complementario con el promotor CMV del constructo del plásmido. La figura 10A muestra un mapa de restricción del plásmido en la región de la secuencia autocomplementaria 5’. Dos ejecuciones de los resultados de la secuencia del plásmido se alinean con una secuencia de referencia, que es una secuencia de ITR de AAV2 de tipo silvestre.
La secuencia autocomplementaria 3’ (denominada la porción de cola, que se encuentra cadena abajo de la secuencia codificante del transgén) se muestra en la figura 10B. Esta se secuenció utilizando un cebador complementario con el promotor SV40 del constructo del plásmido. La figura 10B muestra un mapa de restricción del plásmido en la región de la secuencia autocomplementaria 3’. Dos ejecuciones de los resultados de la secuencia del plásmido se alinean con una secuencia de referencia, que es una secuencia de ITR de AAV2 de tipo silvestre. Los resultados muestran un truncamiento dentro de la secuencia autocomplementaria que corresponde a un brazo de la estructura de brazo transversal.
Estos resultados confirman que el constructo de ADN plasmídico codifica un transgén flanqueado por secuencias autocomplementarias interrumpidas asimétricas. La asimetría surge porque la secuencia autocomplementaria 5’ codifica un brazo transversal completo; mientras que la secuencia autocomplementaria 3’ codifica un brazo transversal truncado.
A continuación, los tubos se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y después se sometieron a choque térmico en un baño de agua a 42 °C durante 45 segundos. A continuación, los tubos se enfriaron sobre hielo durante 2 min. Se añadieron 450 pl de medio SOC a los tubos y se agitaron en una incubadora a 37 °C durante 4 horas. Se diluyeron 1:10 partes alícuotas y se sembraron 50 pl en placas de agar que contenían 50 pg/ml de kanamicina, 7 pg/ml de gentamicina, 10 pg/ml de tetraciclina, 100 pg/ml de Bluo-gal y 40 pg/ml de IPTG. Las placas se incubaron 48 horas a 37 °C o 72 horas a 30 °C. Se recogió una sola colonia blanca y se sembró en estrías en una placa nueva para asegurarse de que no estaba contaminada con una colonia azul, después se incubó durante la noche. Se crearon soluciones madre en glicerol.
Preparación de ADN a partir de bácmido
El bácmido se incubó en 10 ml de medio LB con 50 pg/ml de kanamicina, 7 pg/ml de gentamicina, 10 pg/ml de tetraciclina y se cultivó en una incubadora con agitación a 37 °C durante la noche. El cultivo se centrifugó a 8000 rpm durante 10 min. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1,5 ml de tampón P1 de un kit de extracción Qiagen. Se añadieron 1,5 ml de tampón 2 y el tubo se invirtió 4-6 veces. Se añadieron 2,1 ml de tampón P3 y el tubo se invirtió 4-6 veces. Los precipitantes se pasaron a través de un filtro de jeringa Qiagen y se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min. La solución de lisis limpia se transfirió a un tubo que contenía 5 ml de isopropanol y se mezcló bien y se centrifugó a 4 °C durante 30 min a velocidad máxima. Se retiró el sobrenadante y se añadieron 3 ml de etanol al 70% para lavar el sedimento. A continuación, se centrifugó el sedimento a 8000 rpm durante 10 min. A continuación, el sedimento se lavó y se secó al aire. A continuación, el ADN se resuspendió en 200 pl de tampón TE. Se extrajo una parte alícuota y se leyó la densidad óptica (DO) a 260 nm para cuantificar la concentración de ADN.
Producción de vectores de expresión de baculovirus P1 (BEV)
Se sembraron un total de 4 x 106 células Sf9 en 5 ml de medio en un matraz T25 TC. El matraz se dispuso sobre una superficie horizontal durante la unión de las células para que las células se distribuyeran uniformemente. Generalmente, las células se adhieren dentro de un periodo de 15 min. Se diluyó 1 pg de ADN de bácmido en 75 pl de agua. Se diluyeron 6 pl de Promega Fugene HD en 69 pl de agua en un tubo separado. El Fugene HD diluido se mezcló con ADN diluido pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de 15 min, se añadieron los complejos de ADN/lípido a las células Sf9. El vector de expresión de baculovirus P1 (BEV) se recolectó después de 4 días. En resumen, todos los medios se retiraron del matraz utilizando una pipeta de 5 ml y se transfirieron a un tubo de poliestireno de 15 ml. El recipiente se centrifugó a 1200 g durante 10 min para sedimentar cualquier célula o residuo que pudiera haber sido recogido. Los BEV se decantaron en un tubo nuevo de 15 ml y el virus se almacenó a 4 °C.
Producción de células de insectos infectadas por baculovirus (Biics)
Se infectaron 50 ml de células Sf9 a una concentración de 2,5 x 106 células/ml con 1 ml de BEV (1:50). Se contaron las células y se midió su diámetro el día 1 (por ejemplo, se analizaron para determinar si el recuento de células alcanzaba 2 x 106/ml y las células medían -15-16 pm de diámetro) y el día 2 (por ejemplo, se analizaron para determinar si el recuento de células alcanzaba entre 4-5 x 106 células/ml y su diámetro medía -18-19 pm). Las células se centrifugaron cuando parecieron infectadas a 300 x g durante 5 min. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en un medio de congelación para obtener una concentración final de 20 x 107 células/ml. Las células se pueden congelar a -80 °C en una rejilla con isopropanol para su almacenamiento.
Ensayo de eficacia de infectividad para una solución madre infectada de baculovirus no titulada (TIPS)
Se prepararon cuatro matraces de 20 ml a 2,5 x 106 células/ml. Las células se infectaron con 4 diluciones diferentes de solución madre infectadas de baculovirus no tituladas (TIPS), por ejemplo 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000. Las células se cultivaron y se evaluaron el diámetro, la viabilidad y los recuentos de células durante 3 días. Para determinar la eficancia de la solución madre de TIPS, se evalúa qué dilución alcanzó los siguientes criterios después de 3 días: células viables 4 a 5 x 105 células/ml, viabilidad del 85 al 95%, diámetro de 18 a 20 pm.
Producción de ADNec:
Se coinfectaron 2,5 x 106 células/ml de células Sf9 con TIPS para la proteína Rep y el transgén de interés (por ejemplo, GFP). Después de 4-5 días, se observó el diámetro y la viabilidad de las células. Las células del sedimento se recogieron centrifugando en una centrifugadora a 4150 rpm durante 30 min. A continuación, las células se congelaron o se extrajo ADNec, por ejemplo, mediante el protocolo de purificación Qiagen Midi Plus.
Análisis de ADNec
Los ADNec se analizaron mediante electroforesis en gel nativo y/o electroforesis en gel desnaturalizante, con digestión de restricción. Por ejemplo, se seleccionó una enzima de restricción de corte único a aproximadamente 2/3 en la secuencia de ADNc entre las ITR, y los productos de digestión de restricción resultantes se procesaron en un gel de agarosa.
La figura 10C muestra las -4,5 kb de un ADNec que comprende un transgén de GFP (ADNec-GFP) que se separaron electroforéticamente en diferentes confórmeros (por ejemplo, monómero, dímero, trímero, etc.) en condiciones nativas (izquierda) y desnaturalizantes (derecha), después de la digestión con el cortador sencillo, XhoI.
En un gel nativo (figura 10C, izquierda), los monómeros se resolvieron en dos productos: 2,1 kb y 0,4 kb. Los dímeros se resolvieron en productos de 4,1 kb/0,4 kb o productos de 4,1 kb/0,8 kb, según la orientación (por ejemplo, cola a cola, o cabeza a cabeza) de las subunidades de dímero. Los productos que resultan de la organización de cola a cola del dímero se indicaron mediante flechas que apuntan hacia abajo. El fragmento terminal de 0,4 kb se oscureció por la fluorescencia de las impurezas en la parte inferior del gel. Las flechas orientadas hacia arriba indican los productos que resultan del dímero de cabeza a cabeza. Las líneas marcadas indican la posición de la ITR truncada. En el monómero, la ITR eliminada se encontraba en el lado derecho de la molécula de ADNc y en el dímero de cola a cola, la ITR truncada era interno (en el plano especular). En la conformación cabeza a cabeza, la ITR truncada se encontraría en los extremos de la molécula.
En un gel desnaturalizante (figura 10C, derecha), el ADNec-GFP dimérico produjo una banda a 4,1 kb y 0,8 kb (que se correlaciona con los productos terminales desnaturalizados de 0,4 kb que discurren sobre el gel como un ADN monocatenario de 0,8 kb). Tal como se ha descrito anteriormente, los productos predichos para los dímeros de ADNec-GFP de cabeza a cabeza fueron 0,8 kb y 4,1 kb en geles nativos, y 0,8 kb y 8,2 kb en geles desnaturalizantes. El gel desnaturalizante no muestra banda a 8,2 kb y por lo tanto indica que la forma predominante del dímero de ADNec-GFP era cola a cola.
Debe entenderse que los artículos indefinidos "un" y "una", tal como se utilizan en el presente documento en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, significan "al menos uno".
Debe entenderse que la expresión "y/o", tal como se utiliza en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, significa "uno o ambos" de los elementos unidos con la misma, es decir, elementos que están presentes de forma conjuntiva en algunos casos y presentes de forma disyuntiva en otros casos. Opcionalmente, pueden estar presentes otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la expresión "y/o", ya estén relacionados o no con los elementos identificados específicamente, a menos que se indique claramente lo contrario. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, una referencia a "A y/o B", cuando se utiliza junto con un lenguaje de interpretación abierta tal como "que comprende" puede referirse, en una forma de realización, a A sin B (incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra forma de realización, a B sin A (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en otra forma de realización más, tanto a A como a B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc. Los términos tales como "solo uno de" o "exactamente uno de" o, cuando se utilizan en las reivindicaciones, "que consiste en" se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos". “Que consiste esencialmente en", cuando se utilice en las reivindicaciones, tendrá su significado ordinario utilizado en el campo de la legislación de patentes.
Tal como se utiliza en el presente documento en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que la expresión "al menos uno", en referencia a una lista de uno o más elementos, significa al menos un elemento seleccionado de uno o más de los elementos de la lista de elementos, pero sin incluir necesariamente al menos uno de todos y cada uno de los elementos enumerados específicamente en la lista de elementos y sin excluir ninguna combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que puedan estar presentes opcionalmente elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a los que se refiere la expresión "al menos uno", ya estén relacionados o no con los elementos identificados específicamente. Por lo tanto, como ejemplo no limitante, "al menos uno de A y B" (o, de forma equivalente, "al menos uno de A o B", o, de forma equivalente, "al menos uno de A y/o B") puede referirse, en una forma de realización, a al menos una A, incluyendo opcionalmente más de una A, sin la presencia de B (e incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra forma de realización, a al menos una B, incluyendo opcionalmente más de una B, sin la presencia de A (e incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en otra forma de realización más, a al menos

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ADN dúplex lineal de extremos cerrados (ADNec) que comprende un inserto de ácido nucleico que comprende un transgén, estando el inserto flanqueado por al menos dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de virus adenoasociado (AAV), en el que las, al menos dos, secuencias de ITR son asimétricas y están unidas covalentemente entre sí, en el que cada secuencia tiene un sitio de resolución terminal operativo y un elemento de unión a proteína de replicación por círculo rodante (RBE), en el que una primera secuencia de ITR está interrumpida por una secuencia de brazo transversal que forma dos tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos formados por secuencias palindrómicas interrumpidas B-B' y C-C', en el que cada uno de los tallos-bucles longitudinalmente simétricos opuestos tiene una porción de tallo en el intervalo de 5 a 15 pares de bases de longitud y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados, en el que una segunda secuencia de iTr está interrumpida por una secuencia de brazo transversal truncada que tiene una o más deleciones de entre 11 y 20 nucleótidos en una región de secuencia palindrómica B-B' y/o una región de secuencia palindrómica C-C'.
2. El ADNec de la reivindicación 1, en el que
(i) las ITR tienen una longitud en el intervalo de 40 a 1000 nucleótido, opcionalmente una longitud de 100 a 160 nucleótidos;
(ii) la secuencia de brazo transversal tiene una energía libre de Gibbs (AG) de despliegue en condiciones fisiológicas en el intervalo de -12 kcal/mol a -30 kcal/mol, opcionalmente de -20 kcal/mol a -25 kcal/mol;
(iii) el RBE comprende la secuencia 5'-GCTCGCTCGCTC-3' y/o
(iv) el sitio de resolución terminal operativo comprende una secuencia 5'-TT-3' y/o el extremo 3' del sitio de resolución terminal operativo se encuentra a entre 15 y 25 nucleótidos del extremo 5' del elemento de unión a la proteína de replicación por círculo rodante.
3. El ADNec de la reivindicación 1 o 2, en el que la secuencia de brazo transversal truncada forma tallos-bucles longitudinalmente asimétricos opuestos, opcionalmente en el que uno de los tallos-bucles longitudinalmente asimétricos opuestos tiene una porción de tallo en el intervalo de 8 a 10 pares de bases de longitud y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos no apareados o el tallo-bucle longitudinalmente asimétrico tiene una porción de tallo inferior a 8 pares de bases de longitud y una porción de bucle que tiene de 2 a 5 desoxirribonucleótidos.
4. El ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inserto de ácido nucleico se ha modificado genéticamente para que exprese una proteína o ARN funcional.
5. El ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el inserto de ácido nucleico es un constructo sin promotor como sustrato para la edición de genes seleccionado de entre un sustrato para TALENS, un sustrato para nucleasas con dedos de zinc (ZFN), un sustrato para meganucleasas, un sustrato para Cas9 y un sustrato para otra proteína de edición de genes.
6. El ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, contenido dentro de un vector.
7. Una composición que comprende una pluralidad de ADNec tal como se describen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que opcionalmente la pluralidad de ADNec están enlazados extremo a extremo, y opcionalmente comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Una célula huésped que comprende el ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que opcionalmente la célula huésped comprende además una proteína de replicación por círculo rodante que se une selectivamente al RBE del ácido nucleico.
9. Un procedimiento in vitro para suministrar un ácido nucleico heterólogo a una célula, comprendiendo el procedimiento suministrar a la célula el ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
10. Un ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un procedimiento de suministro de un ácido nucleico heterólogo a un sujeto, en el que el suministro no da como resultado una respuesta inmunitaria contra el ácido nucleico en el sujeto, opcionalmente en el que la respuesta inmunitaria es una respuesta humoral o una respuesta celular.
11. Un ADNec para su uso según la reivindicación 10, en el que el suministro tiene lugar una o múltiples veces.
12. La célula huésped de la reivindicación 8 para su uso en un procedimiento de suministro de un ácido nucleico heterólogo a un sujeto, en el que el suministro de la célula huésped tiene lugar una o múltiples veces.
13. Un procedimiento para preparar ácidos nucleicos, comprendiendo el procedimiento:
(i) introducir en una célula permisiva in vitro un ácido nucleico de ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que opcionalmente la célula permisiva es una línea celular de insecto, una línea celular de levadura o una línea celular bacteriana; y
(ii) mantener la célula permisiva en condiciones en las que una proteína de replicación por círculo rodante en la célula permisiva inicia la producción de múltiples copias del ácido nucleico, en el que la célula permisiva no expresa proteínas de la cápside vírica capaces de envasar copias de replicación del ácido nucleico en una partícula vírica, en la que la proteína de replicación por círculo rodante se selecciona del grupo que consiste en AAV78, AAV52, Rep68 de AAV y Rep40 de AAV; y opcionalmente,
(iii) purificar las múltiples copias del ácido nucleico, en el que la purificación comprende opcionalmente poner en contacto el ácido nucleico con una resina de gel de sílice.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la proteína de replicación por círculo rodante está codificada por un vector de virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autograph californica (AcMNPV) o un vector de expresión de baculovirus (BEV).
15. El ADNec de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ADNec comprende un ácido nucleico monomérico que comprende una única subunidad o al menos un ácido nucleico multimérico que comprende dos o más subunidades, en el que cada subunidad comprende el inserto de ácido nucleico flanqueado por las secuencias de ITR.
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