ES2898701T3 - Proteína VP4 de rotavirus truncada y aplicación de la misma - Google Patents

Proteína VP4 de rotavirus truncada y aplicación de la misma Download PDF

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Abstract

Una proteína VP4 de rotavirus truncada, en la que, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25-64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a cualquier posición entre las posiciones de aminoácidos 276-497 de SEQ ID NO: 40.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteína VP4 de rotavirus truncada y aplicación de la misma
Campo técnico
La invención se refiere a los campos de la bioquímica, la biología molecular, la virología molecular, y la inmunología. En particular, la invención se refiere a una proteína VP4 de rotavirus truncada, a una secuencia que la codifica, a un método para prepararla, y a una composición farmacéutica y a una vacuna que comprende la proteína, en la que la proteína, la composición farmacéutica y la vacuna son útiles para prevenir, aliviar o tratar la infección por rotavirus y una enfermedad causada por la infección por rotavirus, tal como gastroenteritis y diarrea por rotavirus. La descripción se refiere además al uso de la proteína en la fabricación de una composición farmacéutica o una vacuna para prevenir, aliviar o tratar la infección por rotavirus y una enfermedad causada por la infección por rotavirus, tal como gastroenteritis y diarrea por rotavirus.
Antecedentes de la técnica
El rotavirus (RV) pertenece al género rotavirus perteneciente a la familia Reoviridae, que es el principal patógeno responsable de la diarrea infantil y que se encontró en el duodeno de pacientes con gastroenteritis por Bishop en 1973 (Bishop, Davidson, Holmes, et al. Lancet, 2 (7841), 1281-1283, 1973). Los estudios mostraron que más del 95% de los niños se infectaron con rotavirus al menos una vez antes de los 5 años. Según las estadísticas de la OMS, hasta 600.000 personas mueren anualmente a causa de la infección por rotavirus, y los casos de diarrea alcanzan los 200 millones; y solo en EE.UU., las pérdidas económicas causadas por la infección por rotavirus alcanzaron los mil millones de dólares anuales (Hsu, Staat, Roberts, et al. Pediatrics, 115 (1), 78-82, 2005; Tate, Burton, Boschi-Pinto, et al. The Lancet Infectious Diseases, 12 (2), 136-141,2011), lo que genera una carga económica y social grave.
El rotavirus es un virus de ARN sin envoltura, y su genoma consiste en 11 moléculas de ARN bicatenario que codifican 6 proteínas estructurales (VP1-VP4, VP6 y VP7) y 6 proteínas no estructurales (NSP1-NSP6) (Estes y Cohen. Microbiol Rev, 53 (4), 410-449, 1989). El rotavirus es icosaédrico, y su cápside consiste en tres capas concéntricas, es decir, la capa central consiste en VP1, VP2 y VP3, la cápside interior consiste en VP6, y la cápside exterior consiste en VP4 y VP7.
La proteína VP6 es una proteína de la cápside que se encuentra en el mayor contenido de rotavirus. Dependiendo de la antigenicidad de VP6, el rotavirus se puede dividir en 7 grupos, es decir, rotavirus A-G, entre los cuales el rotavirus A es el principal patógeno responsable de la diarrea en lactantes y niños pequeños. VP4 y VP7 son los principales antígenos neutralizantes, y el rotavirus A se puede dividir en serotipo P y serotipo G, dependiendo de su antigenicidad. El serotipo G y el serotipo P son independientes entre sí, pero también interactúan entre sí; las combinaciones comunes incluyen G1P[8], G2P[4], G3P[8] y G4P[8]; en los últimos años, la prevalencia de G9P[8] y G9P[6] ha aumentado significativamente (Li, Liu, Yu, et al. Vaccine, 27 F40-F45, 2009).
Todavía no existen fármacos específicos para el rotavirus, y las vacunas seguras y eficaces son los medios importantes para el control de la infección por rotavirus. Después de años de investigación, el desarrollo de la vacuna ha pasado por tres fases, es decir, vacunas atenuadas monovalentes, vacunas recombinantes de genes polivalentes, y vacunas de ingeniería genética. En la actualidad, hay cinco vacunas contra rotavirus aparecidas en el mercado una por una, incluyendo la vacuna tetravalente recombinante del gen humano-mono de Wyeth, la vacuna monovalente atenuada del Instituto Lanzhou, la vacuna pentavalente recombinante del gen humano-bovino de Merck, la vacuna monovalente atenuada de GSK, y la vacuna monovalente atenuada de Bharat Vaccines, India. Sin embargo, estas vacunas son vacunas vivas atenuadas que tienen un gran peligro potencial para la seguridad, y entre ellas, las vacunas de Wyeth fueron retiradas del mercado por invaginación intestinal medio año después de su comercialización (Murphy, Gargiullo, Massoudi, et al. 344 (8), 564-572, 2001). Aunque se demostró que las vacunas de MERCK y GSK eran seguras y eficaces mediante una gran cantidad de pruebas clínicas (Bernstein, Sack, Rothstein, et al. Lancet (British edition), 354 (9175), 287-290, 1999; Vesikari, Matson, Dennehy, et al. New England Journal of Medicine, 354 (1), 23­ 33, 2006; Linhares, Velázquez, Perez-Schael, et al. Lancet, 371 (9619), 1181-1189, 2008; Vesikari, Itzler, Karvonen, et al. Vaccine, 28 (2), 345-351,2009; Snelling, Andrews, Kirkwood, et al. Clinical Infectious Diseases, 52 (2), 191-200, 2011), en países y regiones con una alta mortalidad por rotavirus, tales como Asia y África, la eficiencia de protección fue mucho menor que en países desarrollados tales como Europa y América (Armah, Sow, Breiman, et al. Lancet, 376 606-614, 2010; Zaman, Anh, Victor, et al. Lancet, 376568-570, 2010; Madhi, Cunliffe, Steele, et al. N Engl J Med, 362 (4), 289-298, 2011). Cada vez más pruebas mostraron que tras la vacunación con las dos vacunas, se producía la excreción del virus, lo que podía causar la transmisión horizontal del virus (Anderson. Lancet Infect Dis, 8 (10), 642-9, 2008; Rivera, Pena, Stainier, et al. Vaccine, 29 (51), 9508-9513, 2011; Yen, Jakob, Esona, et al. Vaccine, 29 (24), 4151-5, 2011). También se demostró en algunos estudios que podía desarrollarse gastroenteritis grave en niños inmunodeficientes después de la vacunación con las vacunas (Steele, Cunliffe, Tumbo, et al. J Infect Dis, 200 Suppl 1 S57-62, 2009; Patel, Hertel, Estes, et al. N Engl J Med, 362 (4), 314-9, 2010). Las vacunas del Lanzhou Institute han estado disponibles comercialmente durante más de 10 años, y todavía no se ha detectado ningún problema grave; sin embargo, solo pueden prevenir la diarrea grave, pero no pueden prevenir la infección por rotavirus (Fu, Wang, Liang, et al. Vaccine, 25 (52), 8756-61,2007). Por lo tanto, aunque se obtienen excelentes resultados en los estudios sobre vacunas atenuadas contra el rotavirus, todavía existen algunos problemas, y la seguridad y la eficacia deben mejorarse aún más. Es imperativo desarrollar vacunas más seguras y eficaces.
Las vacunas que no se replican son la dirección principal de los estudios sobre las vacunas contra el rotavirus en la actualidad, y las vacunas de ingeniería genética atraen mucha atención debido a características tales como el bajo coste, la seguridad y la eficacia.
Las proteínas VP4 y VP7, como antígenos neutralizantes de rotavirus, pueden estimular la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo, inhibiendo así la infección por rotavirus. Por lo tanto, tanto VP4 como VP7 son los principales antígenos candidatos para las vacunas de subunidades de rotavirus. La proteína VP7, que es una proteína glicosilada, comprende 4 enlaces de disulfuro intracatenarios, y forma un trímero dependiente de Ca2+, pero el nivel de anticuerpos neutralizantes, generados por estimulación con una proteína VP7 expresada de forma recombinante, es bajo. La proteína VP4 no está glicosilada, y una proteína VP4 expresada de manera recombinante puede estimular la generación de una alta respuesta inmune en un organismo, y reducir el grado de diarrea en ratones lactantes (Mackow, Vo, Broome, et al. J Virol, 64 (4), 1698-703, 1990). En otro aspecto, solo hay dos serotipos P comunes, pero hay cinco serotipos G. Por lo tanto, en comparación con la proteína VP7, la proteína VP4 es un antígeno candidato más adecuado para vacunas de ingeniería genética contra rotavirus.
La proteína VP4 consta de 776 aminoácidos, y se puede escindir mediante tripsina para formar dos restos, es decir, VP8* (aa1 -231) y VP5* (aa248-776). La proteína VP4 consta de un dominio de cabeza, un dominio de cuerpo y tallo, y un dominio de pie, y como proteína de la espícula del rotavirus, VP4 desempeña un papel importante en la infección por rotavirus. El dominio de cabeza de una espícula consiste en dos moléculas de proteína VP8, y la proteína VP8 puede unirse al receptor de ácido siálico en la superficie de una célula, y de ese modo mediar la adsorción de rotavirus. El dominio de cuerpo y tallo consiste en tres moléculas del dominio del antígeno VP5, en el que dos moléculas del dominio del antígeno VP5 forman un dímero, y otro dominio del antígeno VP5 está presente en forma de monómero. Durante la infección por rotavirus, la estructura de VP4 se reordena para exponer el sitio de fusión de la membrana en VP5 y mediar la entrada de rotavirus en una célula, durante la cual los dominios del antígeno VP5 cambian de un dímero a un trímero. El dominio de pie consiste en tres moléculas del dominio C-terminal de la proteína VP5, y se inserta en la cápside externa y la cápside interna en virtud del dominio. Los primeros 25 aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína VP8 forman una hélice a, tres hélices a forman un haz helicoidal que se inserta en el dominio de pie de VP5 y está vinculado a un dominio de cabeza de VP8 a través de una región de unión flexible, en el que la estructura de la región de unión aún no está completamente determinada (Settembre, Chen, Dormitzer, et al. EMBO J, 30 (2), 408-16, 2011).
Hay estudios que muestran que los epítopos neutralizantes de la proteína VP4 están presentes principalmente en el dominio de cabeza de VP8 y el dominio del antígeno VP5, los anticuerpos neutralizantes contra VP8 pueden inhibir la absorción de rotavirus, y los anticuerpos neutralizantes contra VP5 tienen actividad neutralizante cruzada y pueden inhibir la entrada de rotavirus en una célula (Dormitzer, Nason, Venkataram Prasad, et al. Nature, 430 (7003), 1053­ 1058, 2004; Abdelhakim, Salgado, Fu, et al. PLoS Pathog, 10 (9), e1004355, 2014). Además, los resultados del escaneo de péptidos sintéticos muestran que también hay epítopos neutralizantes en la región helicoidal a en el extremo N-terminal y la región de unión de la proteína VP8 (Kovacs-Nolan, Yoo y Mine. Biochem J, 376 (Pt 1), 269­ 75, 2003).
Hay muchos resultados de investigación que muestran que la proteína VP4 puede estimular la respuesta inmune protectora en un organismo (Dunn, Fiore, Werner, et al. Arch Virol, 140 (11), 1969-78, 1995; Gil, De Souza, Asensi, et al. Viral Immunology, 13 (2), 187-200, 2000). Sin embargo, la expresión de la proteína VP4 por el sistema eucariota tiene las desventajas de un ciclo largo, un alto coste, y un bajo nivel de expresión; además, una proteína VP4 de longitud completa está presente principalmente en forma de cuerpo de inclusión en el sistema procariótico, es difícil de purificar, y no puede conservar su conformación natural. Wen Xiaobo et al. resolvieron el problema relativo a la expresión de la proteína VP8 en forma de cuerpo de inclusión en el sistema procariótico mediante la expresión de una forma truncada de la misma, y obtuvo la proteína VP8 truncada (DVP8*, aa65-223) que podía expresarse eficazmente en E. coIí en forma soluble (Wen, Cao, Jones, et al. Vaccine, 30 (43), 6121-6, 2012); sin embargo, la inmunogenicidad de la proteína VP8 truncada es significativamente menor que la de la proteína VP8 de longitud completa. Para solucionar el problema de la baja inmunogenicidad de la proteína VP8 truncada, tras estudios profundos, el laboratorio del inventor obtuvo nuevas proteínas VP8 truncadas con mayor inmunogenicidad, que pueden estimular la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título en ratones tras la inmunización con las mismas en presencia de adyuvante de Freund, y pueden reducir el grado de diarrea en ratones lactantes; y la proteína VP8 truncada puede someterse a expresión de fusión con un adyuvante intramolecular, para producir una proteína de fusión con mayor inmunogenicidad y protección inmunitaria (documento CN201510165746.2). Aunque las nuevas proteínas VP8 truncadas y la proteína de fusión de las mismas han logrado efectos técnicos significativamente ventajosos, todavía existen deficiencias. Por ejemplo, los anticuerpos contra la proteína VP8 son principalmente anticuerpos específicos de serotipo, y por lo tanto, las nuevas proteínas VP8 truncadas como vacunas tienen una actividad neutralizante significativamente menor contra cepas de virus de un serotipo diferente que la actividad neutralizante contra cepas de virus de los mismos serotipos (Wen, Cao, Jones, et al. Vaccine, 30 (43), 6121-6, 2012). Además, también se ha descubierto en los estudios posteriores que la inmunoprotección de las nuevas proteínas VP8 truncadas no es suficientemente satisfactoria en presencia de adyuvante de aluminio, y debe mejorarse aún más.
Otra técnica anterior es MIAOGE XUE ET AL: “Characterization and protective efficacy in an animal model of a novel truncated rotavirus VP8 subunit parenteral vaccine candidate”, VACCINE, vol. 33, no. 22, 14 de abril 2015 (14-04­ 2015), páginas 2606-2613; MACKOW E R ET AL: “DNA AMPLIFICATION-RESTRICTED TRANSCRIPTION-TRANSLATION: RAPID ANALYSIS OF RHESUS ROTAVIRUS NEUTRALIZATION SITES”, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 87, no. 2, 1 de enero de 1990 (01-01-1990), páginas 518-522; XIAOBO WEN ET AL: “Construction and characterization of human rotavirus recombinant VP8* subunit parenteral vaccine candidates”, VACCINE, vol. 30, no. 43, 1 de septiembre 2012 (01-09­ 2012), páginas 6121-6126; S. KOMOTO ET AL: “Generation of Recombinant Rotavirus with an Antigenic Mosaic of Cross-Reactive Neutralization Epitopes on VP4”, JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 82, no. 13, 23 de abril de 2008 (23­ 04-2008), páginas 6753-6757; SHI Ch ANGXIN ET AL: “Expression of Human Group A Rotavirus Outer Capsid Protein VP4 in Escherichia Coli”, ZHONGHUA SHIYAN HE LINCHUANG BINGDUXUE ZAZHI - CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL AND CLINICAL VIROLOGY, vol. 10, no. 2, 30 de junio de 1996 (30-06-1996), páginas 114-117.
Por lo tanto, todavía existe demanda en la técnica para desarrollar nuevas vacunas contra el rotavirus, que se pueden producir de manera más conveniente en un nivel de expresión alto (por ejemplo, mediante expresión soluble y purificación), pueden tener una inmunogenicidad más fuerte que las vacunas existentes (por ejemplo, la proteína VP8 truncada mencionada anteriormente), pueden inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título contra el rotavirus (particularmente en presencia de adyuvante de aluminio) en un organismo, y por lo tanto pueden usarse en la producción industrial a gran escala de vacunas altamente eficaces contra el rotavirus.
Contenidos de la invención
Los inventores de la presente solicitud descubrieron sorprendentemente después de extensas investigaciones que la proteína VP4 que tiene de 1-64 aminoácidos (por ejemplo, 5-64 aminoácidos) truncada en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en una posición entre las posiciones de aminoácidos 276-497, se puede expresar en E. coIí en forma soluble, y se puede purificar fácilmente mediante cromatografía; además, la proteína truncada de alta pureza así obtenida (con una pureza que puede alcanzar al menos el 50% o más, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) tiene buena homogeneidad e inmunogenicidad, puede inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título contra rotavirus en presencia de adyuvante de aluminio en un organismo, y por lo tanto resuelve eficazmente el problema técnico mencionado anteriormente.
La invención se refiere a las realizaciones definidas en las reivindicaciones. Por lo tanto, la invención se refiere a una proteína VP4 de rotavirus truncada, en la que, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25-64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a cualquier posición entre las posiciones de aminoácidos 276-497 de SEQ ID NO: 40. En un aspecto, la descripción se refiere a una proteína VP4 de rotavirus truncada o una variante de la misma que tiene 1-64 aminoácidos (por ejemplo, 5-64 aminoácidos) truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en una posición entre las posiciones de los aminoácidos 276-497.
En un aspecto, la descripción se refiere a una proteína VP4 de rotavirus truncada o una variante de la misma, que en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, tiene 1-64 aminoácidos (por ejemplo, 5-64 aminoácidos) truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a cualquier posición entre las posiciones de aminoácidos 276-497 de SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones preferidas, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 1 -64 aminoácidos, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63 o 64 aminoácidos (por ejemplo, 1 -5, 5-25, 5-21,21 -25, 21 -64, o 25-64 aminoácidos, por ejemplo 1,5, 21,25 o 64 aminoácidos) truncados en el extremo N-terminal; y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a cualquier posición entre las posiciones de aminoácidos 276-497 (por ejemplo, posiciones de aminoácidos 281 -497, 291 -497, 301 -497, 311 -497, 321 -497, 331 -497, 341 -497, 351 -497, 361 -497, 371 -497, 381 -497, 391-497, 401-497, 411-497, 421-497, 431-497, 441-497, 451-497, 461-497, 471-497, 476-497, 482-497, 487-497, o 492-497) de SEQ ID NO: 40, por ejemplo tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición: una posición correspondiente a la posición de aminoácido 276, 281, 291, 301, 311, 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, 391,401, 411, 421, 431, 441, 451, 461, 471, 476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40 (por ejemplo, una posición correspondiente a la posición de aminoácido 331,351,381,411,441,461,471,476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40).
En algunas realizaciones preferidas, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 1,5, 21,25 o 64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a la posición de aminoácido 276, 281, 291, 301, 311, 321, 331, 341, 351, 361, 371, 381, 391,401, 411, 421, 431, 441, 451, 461, 471, 476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40 (por ejemplo, una posición correspondiente a la posición de aminoácido 331,351,381,411,441,461,471,476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40).
En algunas realizaciones preferidas, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene una característica seleccionada de:
(1) tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición: una posición correspondiente a la posición de aminoácido 276, 281, 291, 301, 311, 321, 331, 341,351,361,371,381,391,401,411,421,431,441,451,461,471,476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40 (preferiblemente, una posición correspondiente a la posición de aminoácido 331, 351, 381, 411, 441, 461, 471, 476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40);
(2) tiene 1 aminoácido truncado en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 476 de SEQ ID NO: 40;
(3) tiene 5 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 476 de SEQ ID NO: 40;
(4) tiene 21 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 476 de la SEQ ID NO: 40; y
(5) tiene 64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en una posición correspondiente a la posición de aminoácido 476 de SEQ ID NO: 40.
En algunas realizaciones preferidas, la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje es una proteína VP4 derivada de la cepa LLR, la cepa SA11, o la cepa EDIM de rotavirus, o una proteína VP4 derivada de un rotavirus de genotipo P[4], P[6], o P[8].
En algunas realizaciones preferidas, la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 40 y 87-91.
En algunas realizaciones preferidas, la proteína VP4 de rotavirus truncada (para abreviar, también denominada la proteína truncada) tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 2-5 y 10-39.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica la proteína truncada y a un vector que comprende el polinucleótido.
Los vectores para insertar un polinucleótido de interés son bien conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, un vector de clonación y un vector de expresión. En una realización, el vector es, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, etc.
En otro aspecto, la invención se refiere además a una célula hospedante que comprende el polinucleótido o vector. Tal célula hospedante incluye, pero no se limita a, una célula procariota tal como célula de E. coIí, y una célula eucariota tal como una célula de levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, y una célula animal (tal como una célula de mamífero, por ejemplo una célula de ratón, una célula humana, etc.). La célula hospedante según la invención puede ser una línea celular, tal como una célula 293T. Sin embargo, se prefiere particularmente que la célula hospedante según la invención sea una célula procariota tal como una célula de E. coIí .
En otro aspecto, la invención se refiere además a un polímero que comprende o consiste en la proteína VP4 de rotavirus truncada. En algunas realizaciones preferidas, el polímero es un trímero. En algunas realizaciones preferidas, el polímero es un polímero con un peso molecular de al menos 600 kDa. En algunas realizaciones preferidas, el polímero comprende una proteína VP4 de rotavirus truncada, que, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en una posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje que corresponde a la posición de aminoácido 476 de SEQ ID NO: 40. En algunas realizaciones preferidas, el polímero comprende una proteína VP4 de rotavirus truncada, cuya secuencia de aminoácidos se expone en SEQ ID NO: 30. En algunas realizaciones preferidas, el polímero es un trímero o un polímero con un peso molecular de al menos 600 kDa, que comprende una proteína VP4 de rotavirus truncada expuesta en SEQ ID NO: 30.
En otro aspecto, la invención se refiere además a una composición que comprende la proteína truncada, o el polinucleótido, o el vector, o la célula hospedante, o el polímero. En algunas realizaciones preferidas, la composición comprende la proteína truncada según la invención. En algunas realizaciones preferidas, la composición comprende el polímero según la invención.
En otro aspecto, la invención se refiere además a una composición farmacéutica (por ejemplo, una vacuna), que comprende la proteína truncada según la invención o el polímero según la invención, y opcionalmente, un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica (por ejemplo, vacuna) según la invención es útil para prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por la infección por rotavirus, tal como gastroenteritis o diarrea por rotavirus.
En algunas realizaciones preferidas, la proteína truncada según la invención o el polímero según la invención está presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por la infección por rotavirus. En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica (por ejemplo, la vacuna) según la invención comprende además un ingrediente activo adicional. Preferiblemente, el ingrediente activo adicional es capaz de prevenir o tratar una infección por rotavirus o una enfermedad causada por una infección por rotavirus. En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica (por ejemplo, una vacuna) según la invención comprende además un adyuvante, tal como un adyuvante de aluminio.
En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica comprende además un vehículo, excipiente, estabilizador, o agente adicional farmacéuticamente aceptable capaz de proporcionar propiedades ventajosas para la administración de la composición farmacéutica (por ejemplo, administración a un sujeto humano). Los vehículos farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, agua estéril, disolución salina, glucosa, producto de condensación de aceite de ricino y óxido de etileno, ácido líquido, alcohol inferior (por ejemplo, alcohol de C1-4), aceite (por ejemplo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de sésamo; opcionalmente, que comprende además un emulsionante tal como monoglicérido o diglicérido de ácido graso, o fosfolípido tal como lecitina), etilenglicol, polialquilenglicol, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, y similares. Opcionalmente, los vehículos incluyen además un adyuvante, un conservante, un estabilizador, un agente humectante, un emulsionante, un potenciador de la penetración, y similares. En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica es estéril. Además, la viscosidad de la composición farmacéutica se puede controlar y mantener seleccionando un disolvente o excipiente adecuado. En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica se formula para tener un pH de 4,5-9,0, 5,0-8,0, 6,5-7,5, o 6,5­ 7,0.
La composición farmacéutica (por ejemplo, vacuna) según la invención puede administrarse por medios bien conocidos en la técnica, por ejemplo, que incluyen, pero no se limitan a, administración oral o inyección. En algunas realizaciones preferidas, la composición farmacéutica (por ejemplo, vacuna) según la invención debe administrarse en forma de dosis unitaria.
La cantidad de la composición farmacéutica (por ejemplo, vacuna) según la invención necesaria para prevenir o tratar una afección específica depende de la vía de administración, la gravedad de la afección a tratar, el sexo, la edad, el peso corporal, y el estado general de salud de un paciente, y similares, y puede ser determinada razonablemente por un médico según las condiciones prácticas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método para preparar la proteína de rotavirus truncada, que comprende, bajo una condición que permita la expresión de la proteína truncada, cultivar la célula hospedante según la invención; y recuperar la proteína truncada expresada.
En algunas realizaciones preferidas, el método comprende usar E. coIí para expresar la proteína truncada según la invención, y después lisar la E. coIí, y purificar la proteína truncada del lisado. En algunas realizaciones preferidas, la purificación incluye cromatografía. En algunas realizaciones preferidas, la purificación incluye cromatografía de dos etapas. En algunas realizaciones preferidas, la cromatografía de dos etapas incluye: cromatografía de intercambio aniónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico usando Q-sefarosa-HP); y posterior cromatografía de afinidad hidrófoba (por ejemplo, cromatografía de afinidad hidrófoba usando fenil sefarosa-HP).
En otro aspecto, la invención se refiere además a un método para preparar una vacuna, que comprende mezclar la proteína truncada según la invención o el polímero según la invención con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente con un adyuvante tal como adyuvante de aluminio, y/o un ingrediente activo adicional, tal como un ingrediente activo adicional capaz de prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por la infección por rotavirus. En algunas realizaciones preferidas, el método para preparar una vacuna comprende la siguiente etapa: mezclar la proteína truncada según la invención o el polímero según la invención con un adyuvante (por ejemplo, adyuvante de aluminio).
Como se describió anteriormente, la vacuna obtenida es útil para prevenir o tratar una infección por rotavirus o una enfermedad causada por una infección por rotavirus, tal como gastroenteritis y diarrea por rotavirus.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un método para prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por la infección por rotavirus en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de la proteína truncada según la invención o el polímero según la invención o la composición farmacéutica según la invención. En algunas realizaciones preferidas, la enfermedad causada por la infección por rotavirus incluye, pero no se limita a, gastroenteritis y diarrea por rotavirus. En algunas realizaciones preferidas, el sujeto es un mamífero, tal como un ratón y un ser humano.
En otro aspecto, la descripción se refiere además al uso de la proteína truncada según la invención o el polímero según la invención en la fabricación de una composición farmacéutica (por ejemplo, vacuna) para prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por infección por rotavirus en un sujeto. En algunas realizaciones preferidas, la enfermedad causada por la infección por rotavirus incluye, pero no se limita a, gastroenteritis y diarrea por rotavirus. En algunas realizaciones preferidas, el sujeto es un mamífero, tal como un ratón y un ser humano.
En otro aspecto, la invención se refiere además a la proteína truncada o al polímero, para uso en la prevención o el tratamiento de una infección por rotavirus o una enfermedad causada por una infección por rotavirus en un sujeto. En algunas realizaciones preferidas, la enfermedad causada por la infección por rotavirus incluye, pero no se limita a, gastroenteritis y diarrea por rotavirus. En algunas realizaciones preferidas, el sujeto es un mamífero, tal como un ratón y un ser humano.
Definiciones y explicaciones de los términos relevantes de la invención.
En la invención, a menos que se especifique lo contrario, los términos científicos y técnicos usados aquí tienen los significados que generalmente entiende un experto en la técnica. Además, las operaciones de laboratorio de cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, e inmunología utilizadas aquí son operaciones de rutina ampliamente utilizadas en los campos correspondientes. Además, para comprender mejor la invención, las definiciones y explicaciones de los términos relevantes se proporcionan a continuación.
Según la invención, la expresión “X aminoácidos truncados en el extremo N-terminal” se refiere al reemplazo de restos de aminoácidos de las posiciones 1 a X en el extremo N-terminal de una proteína por un resto de metionina codificado por el codón de iniciación. Por ejemplo, una proteína VP4 de rotavirus que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal se refiere a una proteína obtenida por reemplazo de los restos de aminoácidos de las posiciones 1 a 25 de una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje por un resto de metionina codificado por el codón de iniciación.
Según la invención, la expresión “extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido X” se refiere a la supresión de todos los restos de aminoácidos que siguen a la posición de aminoácido X (es decir, comenzando desde la posición de aminoácido X+1). Por ejemplo, el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 441 de una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje se refiere a la eliminación de todos los restos de aminoácido después de la posición de aminoácido 441 (es decir, comenzando desde la posición de aminoácido 442) de una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje.
Según la invención, el término “variante” se refiere a una proteína tal que su secuencia de aminoácidos difiere de la secuencia de aminoácidos de la proteína VP4 de rotavirus truncada según la invención en uno o más (por ejemplo, 1 -10 o 1-5 o 1-3) aminoácidos (por ejemplo, sustitución conservativa de aminoácidos), o tiene una identidad de al menos 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% en comparación con la secuencia de aminoácidos de la proteína VP4 de rotavirus truncada según la invención, conservando al mismo tiempo la propiedad necesaria de la proteína truncada. La expresión “propiedad necesaria”, usada aquí, puede ser una o más de las siguientes propiedades:
(i) capaz de expresarse en forma soluble en E. coIí ;
(ii) capaz de purificarse fácilmente mediante cromatografía;
(iii) tener buena homogeneidad y estabilidad (no es fácil de degradar) después de la purificación;
(iv) capaz de unirse específicamente a un anticuerpo anti-VP4 que puede inhibir la infección de una célula por un virus in vitro;
(v) capaz de competir con rotavirus por la unión a un receptor celular, e inhibir la infección de una célula por el virus;
(vi) capaz de inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título contra rotavirus en un organismo; y
(vii) capaz de proteger a un sujeto (tal como un ser humano y un ratón) de la infección por rotavirus.
Preferiblemente, la “variante” según la descripción conserva todas las propiedades mencionadas anteriormente de la proteína truncada.
Como se usa aquí, el término “identidad” se refiere al grado de coincidencia entre dos polipéptidos o entre dos ácidos nucleicos. Cuando dos secuencias para comparación tienen la misma subunidad de monómero de base o aminoácido en un sitio determinado (por ejemplo, cada una de las dos moléculas de ADN tiene una adenina en un sitio determinado, o cada uno de dos polipéptidos tiene una lisina en un sitio determinado), las dos moléculas son idénticas en el sitio. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de sitios idénticos compartidos por las dos secuencias sobre el número total de sitios para comparación x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 sitios de dos secuencias coinciden, estas dos secuencias tienen una identidad del 60%. Por ejemplo, las secuencias de ADN: CTGACT y CAGGTT comparten una identidad del 50% (3 de 6 sitios coinciden). Generalmente, la comparación de dos secuencias se realiza de manera que se produzca la máxima identidad. Dicha alineación se puede realizar mediante el uso de un programa informático tal como el programa Align (DNAstar, Inc.) que se basa en el método de Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de espacio de 12, y una penalización de espacio de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar por el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado al programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6.
Como se usa aquí, la expresión “sustitución conservativa” se refiere a sustituciones de aminoácidos que no afectarían o cambiarían de manera desventajosa la actividad biológica de una proteína/polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, una sustitución conservativa se puede introducir mediante técnicas estándar conocidas en la técnica tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones en las que un resto de aminoácido se sustituye por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, por ejemplo un resto física o funcionalmente similar (tal como, que tiene un tamaño, forma, carga, propiedad química similar, incluyendo la capacidad de formar enlace covalente o enlace de hidrógeno, etc.) al resto de aminoácido correspondiente. Las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales alcalinas (por ejemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico y ácido glutámico), aminoácidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), aminoácidos que tienen cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), aminoácidos que tienen cadenas laterales b ramificadas (tales como treonina, valina, isoleucina), y aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un resto de aminoácido correspondiente se sustituye preferiblemente por otro resto de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales. Los métodos para identificar sustituciones conservativas de aminoácidos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12 (10): 879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)).
Según la invención, la expresión “sistema de expresión de E. c o i’ se refiere a un sistema de expresión que consiste en E. coli (cepas) y vectores, en el que la E. coli (cepas) incluyen, pero no se limitan a: GI698, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), BLR (DE3), y similares, que están disponibles en el mercado.
Según la invención, el término “vector” se refiere a una herramienta portadora de ácido nucleico que puede tener un polinucleótido insertado en su interior. Cuando un vector permite la expresión de una proteína codificada por un polinucleótido insertado en él, el vector se denomina vector de expresión. El “vector” puede tener el elemento genético transportado expresado en una célula hospedante mediante transformación, transducción, y transfección en la célula hospedante. Los vectores son bien conocidos por una persona experta en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, plásmidos, fagos, cósmidos, y similares.
Según la invención, las expresiones “proteína VP4”, “proteína VP4 de longitud completa”, y “proteína VP4 de rotavirus”, que pueden usarse indistintamente, se refieren a una proteína estructural que, junto con VP7, forma la cápside externa de la partícula del virus RV. La secuencia de aminoácidos de la proteína VP4 es conocida por un experto en la técnica, y se puede encontrar en diversas bases de datos públicas (por ejemplo, base de datos de GenBank). Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos ejemplares de la proteína VP4 se exponen en las SEQ ID NOs: 40 y 87-91.
Según la invención, la expresión “proteína VP4 de rotavirus truncada” se refiere a la proteína resultante de la supresión de uno o más aminoácidos en el extremo N- y/o C-terminal de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, en el que la secuencia de aminoácidos de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje se puede encontrar fácilmente en una base de datos pública (tal como la base de datos de GenBank), por ejemplo con los números de acceso de GenBank AEV53329.1, BAA03850.1, AAB94758.2, AIS93087.1, ACJ06216.1 y AAA66953.1.
En la invención, la secuencia de aminoácidos ejemplar de la proteína VP4 de LLR de rotavirus de tipo salvaje se expone en SEQ ID NO: 40. Por lo tanto, cuando la secuencia de la proteína VP4 está involucrada en la invención, se describe mediante la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 40. Por ejemplo, la expresión “posiciones de aminoácidos 276-497 de la proteína VP4” se refiere a las posiciones de aminoácidos 276-497 de SEQ ID NO: 40. Sin embargo, un experto en la técnica comprende que las mutaciones o variaciones (que incluyen, pero no se limitan a, sustitución, supresión, y/o adición) pueden ocurrir de forma natural o introducirse artificialmente en la SEQ ID NO: 40 sin afectar las propiedades biológicas de la proteína VP4. Por ejemplo, las proteínas VP4 de diferentes cepas de virus de rotavirus pueden ser naturalmente diferentes en términos de secuencia de aminoácidos, pero tienen sustancialmente las mismas propiedades biológicas. Por lo tanto, en la invención, la expresión “proteína VP4” pretende incluir todos esos polipéptidos y variantes, incluyendo el polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 40 y sus variantes naturales o artificiales, en el que las variantes retienen las propiedades biológicas de la proteína VP4. Además, cuando se describen fragmentos de secuencia y posiciones de aminoácidos de la proteína VP4, estos incluyen no solo los fragmentos de secuencia y posiciones de aminoácidos del polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 40, sino también los fragmentos de secuencia correspondientes y posiciones de aminoácidos de las variantes naturales o artificiales del polipéptido. Por ejemplo, la expresión “posiciones de aminoácidos 276-497 de la proteína VP4” pretende incluir las posiciones de aminoácidos 276-497 de SEQ ID NO: 40, y las posiciones de aminoácidos correspondientes de las variantes (variantes naturales o artificiales) del polipéptido expuesto en SEQ ID NO: 40.
En la invención, las secuencias de aminoácidos ejemplares de la proteína VP4 de SA11, EDIM, P[4], P[6] y P[8] de rotavirus de tipo salvaje se exponen en SEQ ID NO: 87-91, respectivamente.
Según la invención, la expresión “fragmentos de secuencia correspondientes” o “fragmentos correspondientes” se refiere a los fragmentos que se ubican en posiciones iguales de secuencias cuando las secuencias se someten a un alineamiento optimizado, es decir, las secuencias se alinean para obtener un mayor porcentaje de identidad. Según la invención, la expresión “posiciones de aminoácidos correspondientes” se refiere a las posiciones/restos de aminoácidos que se encuentran en posiciones iguales de secuencias cuando las secuencias se someten a un alineamiento optimizado, es decir, las secuencias se alinean para obtener un mayor porcentaje de identidad.
En la invención, la expresión “un fragmento de gen truncado de la proteína VP4 de rotavirus” se refiere a tal fragmento de gen que tiene el nucleótido o nucleótidos que codifican uno o más aminoácidos suprimidos en el extremo 5’ o 3’ en comparación con el gen de VP4 de rotavirus truncado de tipo salvaje, en el que la secuencia de longitud completa del gen VP4 de rotavirus truncado de tipo salvaje se puede encontrar fácilmente en una base de datos pública (por ejemplo, base de datos de GenBank), por ejemplo bajo los números de acceso de GenBank JQ013506.1, D16346.1, AF039219.2, KJ940075.1, FJ183356.1 y l34161.1. Por ejemplo, la secuencia nucleotídica del gen VP4 de LLR de rotavirus de tipo salvaje se expone en SEQ ID NO: 41.
Según la invención, el término “polímero” se refiere a un polímero que consiste en moléculas polipeptídicas (por ejemplo, la proteína truncada según la invención) como monómeros, que generalmente comprende al menos 2 (por ejemplo, 3, 4, 5, o más) monómeros polipeptídicos (por ejemplo, la proteína truncada según la invención). En tal polímero, las moléculas de monómero se polimerizan para formar un multímero por interacción intermolecular (por ejemplo, enlace de hidrógeno, fuerza de van der Waals, interacción hidrófoba). En algunas realizaciones de la invención, el polímero es un trímero que comprende 3 monómeros. En algunas realizaciones de la invención, el polímero es un multímero que comprende múltiples monómeros y tiene un peso molecular de al menos 600 kDa (tal multímero también se denomina polímero en el contexto).
Según la invención, la expresión “un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable” se refiere a un vehículo y/o excipiente que es farmacológica y/o fisiológicamente compatible con un sujeto e ingredientes activos, que es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Editado por Gennaro A r , 19a ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), e incluye, pero no se limita a: reguladores de pH, tensioactivos, adyuvantes, y potenciadores de la fuerza iónica. Por ejemplo, los reguladores de pH incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores de fosfato; los tensioactivos incluyen, pero no se limitan a: tensioactivos catiónicos, tensioactivos aniónicos, o tensioactivos no iónicos tales como Tween-80; los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, hidróxido de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y adyuvante de Freund (por ejemplo, adyuvante completo de Freund); y los potenciadores de la fuerza iónica incluyen, pero no se limitan a, NaCl.
Según la invención, el término “adyuvante” se refiere a un inmunopotenciador no específico, que puede mejorar la respuesta inmune a un antígeno o cambiar el tipo de respuesta inmune en un organismo cuando se administra junto con el antígeno al organismo o se administra de antemano al organismo. Hay una variedad de adyuvantes, que incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio), adyuvantes de Freund (por ejemplo, adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund), Corynebacterium parvum, lipopolisacárido, citocinas, y similares. El adyuvante de Freund es el adyuvante más utilizado en la actualidad en experimentos con animales. El adyuvante de hidróxido de aluminio se usa con más frecuencia en los ensayos clínicos. En la invención, con especial preferencia, el adyuvante es un adyuvante de aluminio.
Según la invención, la expresión “una cantidad eficaz” se refiere a una cantidad que es suficiente para lograr el efecto esperado. Por ejemplo, una cantidad eficaz para prevenir o tratar una enfermedad (tal como una infección por rotavirus) se refiere a una cantidad eficaz para prevenir, suprimir, o retrasar la aparición de una enfermedad (tal como una infección por rotavirus), o eficaz para mitigar, aliviar, o tratar el grado de gravedad de una enfermedad existente (tal como una enfermedad causada por una infección por rotavirus). La determinación de tal cantidad eficaz está dentro de la capacidad de un experto en la técnica. Por ejemplo, una cantidad eficaz para uso terapéutico depende del grado de gravedad de una enfermedad a tratar, el estado general del sistema inmunológico de un paciente, las condiciones generales de un paciente, tal como la edad, el peso corporal y el sexo, las vías de administración de fármacos, terapias adicionales utilizadas simultáneamente, y similares.
Según la invención, el término “cromatografía” incluye, pero no se limita a: cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico), cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía absorbente (por ejemplo, cromatografía de hidroxiapatita), cromatografía de filtrado en gel (cromatografía de exclusión en gel), y cromatografía de afinidad.
Según la invención, la ruptura de una célula hospedante puede llevarse a cabo mediante diversos métodos bien conocidos por un experto en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a: ruptura con homogeneizador, ruptura con máquina homogeneizadora, tratamiento ultrasónico, trituración, extrusión a alta presión, tratamiento con lisozima, y similares.
Según la invención, el término “inmunogenicidad” se refiere a la capacidad de estimular la formación de anticuerpos específicos o linfocitos sensibilizados en organismos. No solo se refiere a la propiedad de un antígeno de estimular un inmunocito específico para activar, proliferar y diferenciar el inmunocito para finalmente generar sustancias efectoras inmunológicas tales como anticuerpos y linfocitos sensibilizados, sino que también se refiere a la respuesta inmune específica que los anticuerpos o linfocitos T sensibilizados pueden formar en el sistema inmunológico de un organismo, después de estimular al organismo con un antígeno.
Según la invención, los términos “polipéptido” y “proteína” tienen los mismos significados, que pueden usarse indistintamente. Además, en la invención, los aminoácidos se expresan generalmente como códigos de una letra y códigos de tres letras. Por ejemplo, la alanina se puede expresar como A o Ala.
Como se usa aquí, el término “sujeto” se refiere a un animal, por ejemplo un vertebrado. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano, bovino, equino, felino, canino, roedor, o primate. El sujeto particularmente preferido es el ser humano. Como se usa aquí, el término “sujeto” y el término “paciente” pueden usarse indistintamente.
Efectos técnicos beneficiosos de la invención
La proteína VP4 de rotavirus truncada y la preparación de la misma como se proporciona en la invención resuelven eficazmente el problema técnico en la técnica.
En primer lugar, la proteína truncada según la invención se puede expresar en forma soluble en E. coIí, que consigue un alto rendimiento. Esto proporciona ventajas para la producción industrial a gran escala.
En segundo lugar, la purificación de la proteína truncada según la invención es relativamente sencilla, y se puede realizar fácilmente. En particular, después de que se lleva a cabo la expresión soluble en E. coIí, las E. coIí se pueden lisar, y el lisado se trata entonces mediante cromatografía (por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de afinidad hidrófoba), lo que da como resultado la proteína truncada con una alta pureza (que puede alcanzar al menos el 50% o más, por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%). Esto proporciona ventajas para la producción industrial a gran escala.
En tercer lugar, la proteína truncada de alta pureza obtenida en la invención tiene buena homogeneidad y estabilidad. En particular, la proteína truncada purificada según la invención puede estar presente en una forma homogénea, y no se degrada fácilmente. Esto proporciona ventajas para la producción en lotes, evita variaciones entre diferentes lotes, y es bueno para una medicación precisa.
En cuarto lugar, la proteína truncada según la invención puede inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título contra rotavirus en presencia de adyuvante de aluminio en un organismo. Dado que el adyuvante de aluminio en lugar del adyuvante de Freund se usa generalmente en la clínica, la proteína truncada según la invención se puede usar ventajosamente en condiciones clínicas para proteger a un sujeto de la infección por rotavirus.
En resumen, la proteína truncada según la invención no solo tiene las características de expresarse y purificarse fácilmente, sino que también tiene buena homogeneidad y estabilidad. Más importante aún, la proteína truncada según la invención tiene una fuerte inmunogenicidad, puede inducir anticuerpos neutralizantes de alto título en presencia de adyuvante de aluminio en un organismo, y por lo tanto proporciona una fuerte protección para un sujeto en condiciones clínicas. Por tanto, la proteína truncada según la invención se puede utilizar en la producción industrial a gran escala de vacunas altamente eficaces contra el rotavirus, proporcionando así una solución eficaz para resolver el problema técnico en la técnica.
Las realizaciones de la invención se ilustran en detalle con referencia a los siguientes dibujos y ejemplos. Sin embargo, los expertos en la técnica entenderán que los siguientes dibujos y ejemplos se utilizan únicamente con el fin de ilustrar la invención, en lugar de limitarla. Según la descripción detallada de los siguientes dibujos y realizaciones preferidas, son evidentes para una persona experta en la técnica diversos fines y ventajas de la invención.
Descripción de dibujos
La Fig. 1A muestra los resultados de SDS-PAGE de la proteína VP8-5 purificada. Los resultados muestran que la proteína VP8-5 purificada obtenida tenía una pureza superior al 90%.
La Fig. 1B muestra los resultados del análisis ELISA indirecto con la proteína VP8-5 y el suero inmune obtenido por inmunización de ratones Balb/c con la proteína VP8-5, en la que la abscisa representa el grupo experimental (VP8-5), el grupo de control positivo (LLR) y el grupo de control negativo (NC), y la ordenada representa la mayor dilución (es decir, título de anticuerpos) del suero inmune que tiene reactividad con la proteína VP8-5. Los resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización, VP8-5 podía inducir la generación de anticuerpos en ratones, pero su eficacia fue menor que la eficacia del virus inactivado LLR. Este resultado muestra que en presencia de adyuvante de aluminio, la proteína VP8-5 tenía inmunogenicidad y podía inducir la generación de anticuerpos en ratones, pero su capacidad para inducir la generación de anticuerpos en animales era menor que la del virus inactivado LLR.
La Fig. 1C muestra los resultados analíticos del título de anticuerpos neutralizantes del suero inmune inducido con VP8-5 en ratones Balb/c, en la que la abscisa representa el grupo experimental (VP8-5), el grupo de control positivo (LLR) y el grupo de control negativo (NC), y la ordenada representa el valor logarítmico de la mayor dilución del suero inmune que logra una tasa de inhibición de la infección del 50% (log2NT50, título de anticuerpos neutralizantes). Los resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, VP8-5 podía inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en ratones el Día 42 después de la inmunización (después de tres inmunizaciones), pero el título de anticuerpos neutralizantes (NT50) del suero inmune fue menor que el del virus inactivado LLR. Una vez finalizado el procedimiento de inmunización, el título de anticuerpos neutralizantes (NT50) del suero inmune inducido con la proteína VP8-5 apenas alcanzó alrededor de 64. Este resultado muestra que en presencia de adyuvante de aluminio, VP8-5 podía inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo; sin embargo, el título de anticuerpos neutralizantes (NT50) del suero inmune inducido con ella fue menor que el del virus inactivado LLR.
Las Figs. 2A-2C muestran los criterios de puntuación de la diarrea en experimentos protectores. Dependiendo del grado de la diarrea en ratones lactantes, las puntuaciones se dividen en tres grados: las heces normales se puntúan como 1 punto (Fig. 2C), las heces blandas se puntúan como 2 puntos (Fig. 2B), y las heces acuosas sin forma se puntúan como 3 puntos (Fig. 2A).
La Fig. 3 muestra las puntuaciones de la diarrea de los ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización después de la exposición a un virus, en la que el eje de ordenadas representa la puntuación de la diarrea; el eje de abscisas representa días después de exponer los ratones a un virus. Los resultados muestran que las puntuaciones de la diarrea de los ratones lactantes en el grupo experimental (VP8-5) no fueron significativamente diferentes de las del grupo de control negativo (NC). Esto muestra que en presencia de adyuvante de aluminio, VP8-5 tenía una baja capacidad para proteger un organismo de la infección por rotavirus (menor que la del virus inactivado), y no podía aliviar suficientemente la diarrea causada por la infección por rotavirus.
Las Figs. 4A-4D muestran los resultados de SDS-PAGE de las proteínas truncadas expresadas en E. coIí. Los resultados muestran que, excepto 26-311,26-331 y 26-381 con un nivel de expresión relativamente bajo, las otras proteínas truncadas podían expresarse en un nivel alto en E. coIí.
Las Figs. 5A-5B muestran los resultados de SDS-PAGE de las proteínas VP4 truncadas purificadas. En la Fig. 5A, los carriles de izquierda a derecha son: Marcador de Peso Molecular de Proteínas (Marcador), 1-476, 6-476, 22­ 476, 26-476, 65-476, 26-231, 26-271, 26-331 y 26-351. En la Fig. 5B, los carriles de izquierda a derecha son: Marcador de Peso Molecular de Proteínas (Marcador), 26-381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-471, 26-482, 26-487, 26-492 y 26-497. Los resultados de las Fig. 5A y 5B muestran que después de las etapas de purificación, las proteínas truncadas tenían una concentración superior a 0,2 mg/ml y una pureza superior al 80%.
La Fig. 6 muestra los resultados del análisis de tamiz molecular G3000pwxl con las proteínas truncadas 1-476, 6­ 476, 22-476, 26-476, 26-271, 26-471, 26-482, 26-487, 26-492, y 26-497. El eje de abscisas representa el tiempo de retención, y el eje de ordenadas representa el valor de absorbancia a 280 nm. Los resultados muestran que en presencia de TB8.0, la proteína truncada 1-476 estaba presente en forma de polímero en la muestra (el pico apareció a alrededor de 10-11 min); 26-271 estaba en forma de monómero (el pico apareció a alrededor de 16 min), con un contenido superior al 90%; las otras proteínas truncadas (6-476, 22-476, 26-476, 26-471,26-482, 26­ 487, 26-492, 26-497) estaban en forma de trímero (el pico apareció a alrededor de 13-14 min), casi con un contenido superior al 90%. En presencia de sales (TB8.0 NaCl 1M), las proteínas truncadas 26-476, 26-482, 26­ 487, 26-492 y 26-497 se convirtieron en monómeros (el tiempo en que apareció el pico cambió de alrededor de 13-14 min a alrededor de 15-16 min), con un contenido superior al 90%. Esto muestra que en presencia de sales, las configuraciones de 26-476, 26-482, 26-487, 26-492 y 26-497 se vieron afectadas por iones de sal, lo que dio como resultado la despolimerización de los trímeros y la formación de monómeros.
La Fig. 7 muestra los resultados del análisis de tamiz molecular G5000pwxl con las proteínas truncadas 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441 y 26-461. El eje de abscisas representa el tiempo de retención, y el eje de ordenadas representa el valor de absorbancia a 280 nm. Los resultados muestran que en presencia de TB8.0, todas estas proteínas truncadas estaban presentes en forma de polímero en la muestra (el pico apareció a alrededor de 10-11 min).
Los resultados en la Fig. 6 y Fig. 7 también muestran que los picos de absorción principales de las proteínas VP4 truncadas obtenidas representaron casi por encima del 80% o incluso por encima del 90%, lo que indica que estas proteínas truncadas tenían una buena homogeneidad.
La Fig. 8A muestra los resultados del análisis de tamiz molecular con la proteína truncada 26-476 después de reposar en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a 37°C durante 12 h. El eje de abscisas representa el tiempo de retención, y el eje de ordenadas representa el valor de absorbancia a 280 nm. Los resultados muestran que después de reposar en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a 37°C durante 12 h, la proteína truncada 26-476 podía formar un polímero homogéneo (con un tiempo de retención de 12,4 min), y el polímero representó hasta 97,2%.
La Fig. 8B muestra los resultados del microscopio electrónico de la proteína truncada 26-476 después de reposar en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a 37°C durante 12 h. Los resultados muestran que la proteína truncada 26-476 podía ensamblarse en un polímero homogéneo ín vítro.
La Fig. 9 muestra los resultados de SDS-PAGE de las proteínas truncadas 26-476, 26-482, 26-487, 26-492, y 26­ 497, escindidas por una enzima o no. En los carriles, el número “1” representa que la muestra no se trata con tripsina; y el número “2” representa que la muestra se ha tratado con 0,1 mg/ml de tripsina. Los resultados muestran que todas estas proteínas truncadas podían ser reconocidas y escindidas por la tripsina, es decir, sus sitios de corte de enzimas quedaron expuestos.
La Fig. 10 muestra que los resultados del análisis ELISA indirecto con la proteína VP4 truncada (1-476, 6-476, 22­ 476, 65-476, 26-271, 26-441, 26-461, 26-471, 26-476, 26-482, 26-487, 26-492, 26-497) y el anticuerpo neutralizante A3 (Fig. 10A), B1 (Fig. 10B), B5 (Fig. 10C), B6 (Fig. 10D), D6 (Fig. 10E), E2 (Fig. 10F), E5 (Fig. 10G), 8F6 (Fig. 10H), en la que las abscisas representan las proteínas truncadas, y las ordenadas representan los anticuerpos primarios (A3, B1, B5, B6, D6, E2, E5, 8F6) que tienen reactividad con las proteínas truncadas. Los resultados muestran que todas estas proteínas truncadas tenían buena antigenicidad (es decir, reactividad de anticuerpos).
Las Figs. 11A-11D muestran los resultados del análisis ELISA indirecto con la proteína truncada 26-476 y los sueros inmunes obtenidos inmunizando ratones Balb/c con la muestra a ensayar (1-476, 6-476, 22-476, 65-476, 26-271,26-331,26-351,26-381,26-411,26-441,26-461,26-471,26-476, 26-482, 26-487, 26-492, 26-497, trímero de 26-476, polímero de 26-476, virus inactivado), en la que la abscisa representa la muestra de proteína para producir suero inmune; la ordenada representa la mayor dilución (es decir, título de anticuerpos) del suero inmune que tiene reactividad con 26-476; RV: rotavirus inactivado; NC: control negativo (PBS); trímero: trímero de 26-476; polímero: polímero de 26-476. Las Figs. 11A, 11B, 11C y 11D muestran los resultados de diferentes lotes de inmunización. Los resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización, estas proteínas podían inducir la generación de anticuerpos en ratones (el título de anticuerpos del suero inmune (GMT) podía alcanzar 102-105 o mas alto); y, excepto 26-271, los títulos de anticuerpos inducidos por las otras muestras de proteínas fueron más altos que el título de anticuerpos inducido por RV (1-476, 6-476, 22-476, 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-471, 26-476, 26-487, 26-492, trímero de 26-476 y polímero de 26-476), o fueron al menos comparables al título de anticuerpos inducido por RV (65-476, 26-482 y 26-497).
Las Figs. 12A-12D muestran los resultados analíticos del título de anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunes inducido en ratones Balb/c con las muestras de proteínas (1-476, 6-476, 22-476, 65-476, 26-271,26-331,26-351, 26-381, 26-411,26-441,26-461,26-471,26-476, 26-482, 26-487, 26-492, 26-497, trímero de 26-476, polímero de 26-476, virus inactivado), en las que la abscisa representa la muestra de proteína para producir suero inmune; la ordenada representa la mayor dilución (NT50, título de anticuerpos neutralizantes) del suero inmune que logra una tasa de inhibición de la infección del 50%; RV: rotavirus inactivado; NC: control negativo (PBS); trímero: trímero de 26-476; polímero: polímero de 26-476. Las Figs. 12A, 12B, 12C y 12D muestran los resultados de diferentes lotes de inmunización. Los resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización (después de tres inmunizaciones), todas estas muestras de proteínas podían inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en ratones, su título de anticuerpos neutralizantes (NT50) podía alcanzar 28-214 o mas alto; y, excepto 26-271, el título de anticuerpos neutralizantes inducido por las otras muestras de proteínas fue comparable al título de anticuerpos neutralizantes inducido por RV (6-476, 22-476, 26-476, 65-476, 26-471,26­ 482, 26-487, 26-492, 26-497 y trímero de 26-476), o incluso mayor que el título de anticuerpos neutralizantes inducido por RV (1 -476, 26-331,26-351,26-381,26-411,26-441,26-461 y polímero de 26-476).
Las Figs. 13A-13D muestran las puntuaciones de la diarrea de ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 22-476, 26-476, 65-476, 26-271,26-331,26-351,26-381,26-411,26-441,26-461, 26-471,26-482, 26-487, 26-492, 26-497, trímero de 26-476, polímero de 26-476, rotavirus inactivado (RV, control positivo) o PBS (NC, control negativo)) 1 -7 días después de la exposición a un virus, en las que el eje de ordenadas representa la puntuación media de la diarrea; el eje de abscisas representa días después de la exposición de los ratones a un virus; RV: rotavirus inactivado; NC: control negativo (PBS); trímero: trímero de 26-476; polímero: polímero de 26-476.
Las Figs. 14A-14D muestran la duración media de la diarrea después de la exposición a un virus y las puntuaciones medias de la diarrea 48 h después de la exposición a un virus en ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 22-476, 26-476, 65-476, 26-271,26-331,26-351,26-381,26-411,26-441,26-461, 26-471, 26-482, 26-487, 26-492, 26-497, trímero de 26-476, polímero de 26-476, rotavirus inactivado (RV, control positivo) o PBS (NC, control negativo)), en las que la duración media (días) de la diarrea se representa mediante un diagrama de barras, y la puntuación media de la diarrea se representa mediante un gráfico de curva; el eje izquierdo de ordenadas representa la duración media (días) de la diarrea; el eje derecho de ordenadas representa la puntuación de la diarrea; el eje de abscisas representa los grupos de inmunización correspondientes de las muestras de proteínas; RV: rotavirus inactivado; NC: control negativo (PBS); trímero: trímero de 26-476; polímero: polímero de 26-476.
Los resultados de las Figs. 13-14 muestran que en términos de la puntuación media de la diarrea y la duración media (días) de la diarrea, los grupos de inmunización correspondientes de las muestras de proteínas fueron superiores al grupo NC. Esto indica que las muestras de proteínas tuvieron un efecto protector significativo y podían ayudar a los ratones a combatir la infección por rotavirus y la diarrea causada por la infección por rotavirus.
Además, los resultados de las Figs. 13-14 también muestran que los efectos protectores de 26-331, 26-351, 26­ 381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-476, trímero de 26-476 y polímero de 26-476 eran comparables a los de RV, o incluso mejores que los de RV. Según los resultados experimentales del Ejemplo 1, en presencia de adyuvante de aluminio, los efectos protectores de estas muestras de proteínas fueron superiores a los de VP8-5 en animales. Además, los resultados experimentales de la Fig. 13D y la Fig. 14D también muestran que el efecto protector del polímero de la proteína truncada 26-476 fue significativamente superior al del trímero de 26-476 en animales, y podía usarse para preparar vacunas que tienen una mayor eficacia.
La Fig. 15 muestra los resultados de SDS-PAGE de la proteína 26-476 de diferentes cepas de virus, en la que los carriles de izquierda a derecha son: la proteína truncada 26-476 del rotavirus LLR; la proteína truncada 26-476-SA11 del rotavirus SA11; la proteína truncada 26-476-EDIM de rotavirus EDIM; la proteína truncada 26-476-P[8] del rotavirus P[8]; la proteína truncada 26-476-P[6] del rotavirus P[6]; la proteína truncada 26-476-P[4] del rotavirus P[4]; y, Marcador de Peso Molecular de Proteínas (Marcador). Los resultados muestran que el método según la invención era aplicable a diferentes cepas de rotavirus; la proteína VP4 truncada (26-476) de diferentes cepas de virus podía expresarse eficazmente en E. coIí , y tenía una pureza superior al 80% después de la purificación por cromatografía.
La Fig. 16 muestra los resultados del análisis de tamiz molecular con la proteína VP4 truncada 26-476 derivada de diferentes cepas de virus. El eje de abscisas representa el tiempo de retención, y el eje de ordenadas representa el valor de absorbancia a 280 nm. Los resultados muestran que en presencia de TB8.0, la proteína 26-476 derivada de diferentes cepas de virus estaba presente principalmente en forma de trímero (el pico apareció a alrededor de 13-14 min), con un contenido superior al 80%. Esto indica que en presencia de TB8.0, la proteína 26-476 derivada de diferentes cepas de virus tuvo una buena homogeneidad.
La Fig. 17 muestra los resultados del análisis ELISA indirecto con los sueros inmunes obtenidos inmunizando ratones Balb/c con las proteínas truncadas (26-476-P[4], 26-476-P[6], 26-476-P[8], 26-476-EDIM, 26-476-SA11, y 26-476 derivada de LLR) y la proteína truncada correspondiente, en la que la abscisa representa la cepa del virus de la que derivó la proteína truncada para producir suero inmune, y la ordenada representa la mayor dilución (es decir, título de anticuerpos) del suero inmune que tiene reactividad con la proteína truncada correspondiente; P[4]: 26-476-P[4]; P[6]: 26-476-P[6]; P[8]: 26-476-P[8]; SA11: 26-476-SA11; EDIM: 26-476-EDIM; LLR: 26-476 preparadas en el Ejemplo 4. Los resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización, todas estas proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus podían inducir la generación de anticuerpos en ratones, y los títulos de anticuerpos (GMT) en los sueros inmunes inducidos de ese modo eran sustancialmente comparables (el título de anticuerpos podía alcanzar 104-105 o más alto, mucho más alto que el del grupo de control negativo). Estos resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, las proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus tenían buena inmunogenicidad, podían inducir eficazmente la generación de anticuerpos en animales; y las proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus fueron sustancialmente comparables en términos de inmunogenicidad, y fueron superiores a VP8-5.
La Fig. 18 muestra los resultados analíticos del título de anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunes inducido en ratones Balb/c con las proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus (26-476-SA11, 26-476-EDIM, 26-476 derivada de LLR), en la que la abscisa representa la cepa de virus de la que derivó la muestra de proteína para producir suero inmune; la ordenada representa la mayor dilución (NT50, título de anticuerpos neutralizamtes) que logra una tasa de inhibición de la infección del 50%; SA11: 26-476-SA11; EDIM: 26-476-EDIM; LLR: 26-476 preparadas en el Ejemplo 4. Los resultados muestran que en presencia de adyuvante de aluminio, el Día 42 después de la inmunización (después de tres inmunizaciones), las proteínas 26-476 derivadas de cepas de virus SA11, EDIM y LLR podían inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título en ratones, y su título de anticuerpos neutralizantes (NT50) podía alcanzar 210-214 o mas alto; y los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por 26-476-SA11 y 26-476-EDIM fueron incluso mayores que los inducidos por 26-476 derivada de LLR.
La Fig. 19A muestra las puntuaciones de la diarrea de ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 26-476-SA11 o PBS (NC, control negativo)) 1-7 días después de la exposición al virus SA11; la Fig. 19B muestra las puntuaciones de la diarrea de ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 26-476-EDIM o PBS (NC, control negativo)) 1-12 días después de la exposición al virus EDIM; en las que la abscisa representa días después de la exposición a un virus, y la ordenada representa la puntuación media de la diarrea. Los resultados muestran que, de forma similar a la proteína 26-476 derivada de LLR, ambas proteínas 26-476 derivadas de SA11 y EDIM tuvieron un efecto protector significativo y podían ayudar a los ratones a combatir la infección por rotavirus y la diarrea causada por la infección por rotavirus.
La Fig. 19C muestra la carga viral de la muestra de suspensión de heces de los ratones inmunizados con 26-476-EDIM o PBS (NC, control negativo) 1-7 días después de la exposición a EDIM, en la que la abscisa representa los días después de la exposición a un virus, y la ordenada representa el número de copias del genoma EDIM contenido en 1 ml de muestra de suspensión de heces. Los resultados muestran que después de la exposición a un virus, se detectó una excreción significativa de virus en las heces de los ratones inmunizados con PBS, y en las heces de los ratones inmunizados con 26-476-EDIM, no se detectó excreción de virus.
Los resultados de la Fig. 19A-19C muestran que 26-476-EDIM no solo podía permitir a los ratones combatir la infección por rotavirus y la diarrea causada por la infección por rotavirus, sino también inhibir la excreción del virus en las heces de los ratones (es decir, la excreción de virus).
Información de secuencia
La información sobre las secuencias implicadas en la invención se proporciona en la siguiente Tabla 1.
Tabla 1: Descripción de la secuencia
SEC ID Descripción
NO:
1 Proteína LLR VP8 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, VP8-5
2 Proteína LLR VP4 que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 1 -476 3 Proteína LLR VP4 que tiene 5 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en 476, 6-476
4 Proteína LLR VP4 que tiene 21 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 22-476
5 Proteína LLR VP4 que tiene 64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 65-476
6 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 247, 26-247
7 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 251,26-251
8 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 261,26-261
9 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 271,26-271
10 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 281,26-281 del aminoácido
11 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 291,26-291 del aminoácido
12 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 301,26-301
13 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 311,26-311
14 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 321,26-321
15 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 331,26-331
16 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácidos 341,26-341
17 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 351,26-351
18 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 361,26-361
19 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 371,26-371
SEC ID Descripción
NO:
20 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 381,26-381
21 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminando en la posición de aminoácido 391,26-391
22 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 401,26-401
23 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 411,26-411
24 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 421,26-421
25 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 431,26-431
26 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 441,26-441
27 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 451,26-451
28 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 461,26-461
29 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 471,26-471
30 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 26-476
31 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácidos 482, 26-482
32 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácidos 487, 26-487
33 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 492, 26-492
34 Proteína LLR VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 497, 26-497
35 P[4] Proteína VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 26-476-P[4]
36 P[6] Proteína VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 26-476-P[6]
37 P[8] Proteína VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 26-476-P[8]
38 Proteína EDIM VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 26-476-EDIM
39 Proteína SA11 VP4 que tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y que tiene el extremo C-terminal terminado en la posición de aminoácido 476, 26-476-SA11
40 la secuencia de aminoácidos de LLR VP4 de tipo salvaje
41 la secuencia nucleotídica de LLR VP4 de tipo salvaje
42-86 cebadores
SEC ID Descripción
NO:
87 la secuencia de aminoácidos de SA11 VP4 de tipo salvaje
88 la secuencia de aminoácidos de EDIM VP4 de tipo salvaje
89 la secuencia de aminoácidos de P[4] VP4 de tipo salvaje
90 la secuencia de aminoácidos de P[6] VP4 de tipo salvaje
91 la secuencia de aminoácidos de P[8] VP4 de tipo salvaje
Secuencia 1 (SEQ ID NO: 1):
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Secuencia 2 (SEQ ID NO: 2):
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Secuencia 3 (SEQ ID NO: 3):
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Secuencia 4 (SEQ ID NO: 4):
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Secuencia 5 (SEQ ID NO: 5):
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Secuencia 6 (SEQ ID NO: 6):
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Secuencia 7 (SEQ ID NO: 7):
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Secuencia 8 (SEQ ID NO: 8):
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Secuencia 9 (SEQ ID NO: 9):
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Secuencia 10 (SEQ ID NO: 10):
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Secuencia 11 (SEQ ID NO: 11):
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Secuencia 12 (SEQ ID NO: 12):
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Secuencia 13 (SEQ ID NO: 13):
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Secuencia 14 (SEQ ID NO: 14):
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Secuencia 15 (SEQ ID NO: 15):
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Secuencia 16 (SEQ ID NO: 16):
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Secuencia 17 (SEQ ID NO: 17):
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5 EYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSG
GLGYKWSEISFKPAN Y Q YT YIRDGEEVT AHTTC S VN GVNDFN YNGGSLPTDFVISRYEVIKEN S Y V
Secuencia 18 (SEQ ID NO: 18):
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Secuencia 19 (SEQ ID NO: 19):
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-I o VYIDYWDDSQAFRNMVYVRSL
Secuencia 20 (SEQ ID NO: 20):
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Secuencia 21 (SEQ ID NO: 21):
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15 Secuencia 22 (SEQ ID NO: 22):
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Secuencia 23 (SEQ ID NO: 23):
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Secuencia 24 (SEQ ID NO: 24):
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V YID YWDD S Q AFRNMV YVRSL AADLNEVT CAGGT YNF QLP V GQWPVMS GGS VSLRS AGVTL ST QFTDFVSL
Secuencia 25 (SEQ ID NO: 25):
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Secuencia 26 (SEQ ID NO: 26):
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Secuencia 27 (SEQ ID NO: 27):
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Secuencia 28 (SEQ ID NO: 28):
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Secuencia 29 (SEQ ID NO: 29):
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Secuencia 30 (SEQ ID NO: 30):
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Secuencia 31 (SEQ ID NO: 31):
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Secuencia 32 (SEQ ID NO: 32):
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Secuencia 33 (SEQ ID NO: 33):
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Secuencia 34 (SEQ ID NO: 34):
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Secuencia 35 (SEQ ID NO: 35):
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Secuencia 36 (SEQ ID NO: 36)
MGSEKSQNVTINPGPFAQTNYAPVTWSHGEVNDSTTIEPVLDGPYQPTNFKPPNDYWILLNPTNQ QVVLEGTNKTDIWVALLLVEPNVTNQSRQYTLFGETKQITVENNTNKWKFFEMFRSNVSAEFQH KRTLTSDTKLAGFMKFYNSVWTFHGETPHATTDYSSTSNLSEVETVIHVEFYIIPRSQESKCSEYIN T GLPPMQNTRNIYPVAL S SRS VT Y QRAQVNEDIIISKT SL WKEM Q YNRDIIIRFKFNNSIYKLGGLG YKWSEISFKAANYQYSYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGSLPTDFSVSRYEVIKENSYVYV DYWDDSQAFRNMVYVRSLAANLNSVKCSGGNYNFQIPVGAWPVMSGGAVSLHFAGVTLSTQFT DFVSLNSLRFRFSLTVEEPPFSILRTRVSGLYGLPAFNPNNGHEYYEIAGRFSLISLVPSN
Secuencia 37 (SEQ ID NO: 37):
MGSEKTQNVTINPSPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPMLDGPYQPTTFTPPNDYWILINSNTN GVVYESTNN SDFWTAVVAIEPHVNPVDRQ YTIF GESKQFNV SNDSNKWKFLEMFRSS SQNEF YNR RTLTSDTRFVGILKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISITIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNG LPPIQNTRNVVPLPLSSRSIQYKRAQVNEDIIVSKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGNSIVKMGGLGYK WSEISYKAANYQYNYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGFLPTDFGISRYEVIKENSYVYVD YWDD SKAFRNMV YVRSL AANLN S VKCTGGS YNF SIP V GAWPVMN GGAVSLHFAGVTL STQFTD FVSLNSLRFRFSLTVDEPPFSILRTRTVNLYGLPAANPNNGNEYYEISGRFSLIYLVPTN
Secuencia 38 (SEQ ID NO: 38):
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Secuencia 39 (SEQ ID NO: 39):
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Secuencia 40 (SEQ ID NO: 40):
MASLIYRQLLTNSYTVNLSDEIQLIGSEKTQRTTVNPGPFAQTGYAPVNWGPGETSDSTTVEPVLN GPYQPTTFNPPVEYWMLLAPTSEGVVVEGTNGTDRWLATILIEPNVPETTRNYTLFGETASISVAN PSQSKWRFVDVAKTTANGTYSQYGPLLSDTKLYGVMKYNGKLYTYNGETPNATTNYYSTTNYD SVNMTSYCDFYIIPRAQESKCTEYVNNGLPPIQNTRNVVPLALSSRSIVARRAAVNEDIVISKTSLW KEMQYNRDIIIRFKFANSIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYIRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFNY NGGSLPTDFVISRYEVIKENSYVYIDYWDDSQAFRNMVYVRSLAADLNEVTCAGGTYNFQLPVG QWPVMSGGSVSLRSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLAVEEPPFSISRTRISGLYGLPAANPNNGR DFYEIAGRFSLILLVPSNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLGELREEFNALSQEIAMSQLIDLALLPLD MFSMFSGIKTTIDAAKSMATNVMKKFKSSGLATSVSTLTDSLSDAASAVSRNSSIRSIGSTASAWT DISSQIVDTQASVNTLATQTSTISKRLRLKEIATQTEGMNFDDISAAVLKTKIDKSSQIGPSTLPDIV TEASEKFIPNRTYRVIDDDTVFEAGTDGRFYAYRVETFEEVPFDVQKFADLVTDSPVISAIIDFKTL KNLNDNYGITRSQALNLIRSDPRVLREFINQDNPIIRNRIEQLILQCRL
Secuencia 41 (SEQ ID NO: 41):
AT GGCTT CGCT C ATTT ACAGA CAATTACTT ACGAATT CAT ATAC AGT GAAT CTTT CAGAT GAA ATACA GTTAATTGGATCAGAAAAAACGCAGAGAACTACAGTAAATCCAGGTCCATTTGCACA AACT GGTTAT GCAC CAGT GAATT GGGGGCCT GGGGAAACGAGT GATT CC ACT ACTGTT GAGC CAGT GTT GAAT GGACCAT AT CAGCCGACGACTTT C AATCC ACC AGT AGAAT ATTGGAT GCTT C T AGCACC AAC AT C AGAAGGGGT AGTT GTT GAAGGT ACT AAT GGT ACGGAT AGAT GGCT AGCT ACAATACTTATAGAACCAAATGTGCCTGAGACGACTAGAAATTACACATTATTTGGGGAAAC AGCGAGTATATCAGTAGCAAACCCATCACAAAGTAAATGGCGTTTTGTTGACGTAGCTAAGA CC ACT GCA AAT GGAACAT ATT CACAAT AT GGACC ATT ACT AT CAGAT ACAAAACT GT AT GGA GT AAT GAAAT AC AACGGGAAGTT GTAT ACGT AT AAT GGT GAAACT CCGAAT GCT ACAAC AAA TT ATT ATT C AACT ACAAATT AT GACT CAGT GAATAT GACAT CTT ATT GCGATTTTT AC ATT AT A CC AAGAGCACAAGAAT C AAAGT GCACAGAAT ACGT AAATAAT GGATT ACCACCAAT AC AAA ACACCAGAAATGTCGTACCATTAGCTTTATCTTCACGATCAATAGTTGCTAGAAGAGCTGCAG T GAACGAAGACAT AGTT AT ATCGAAAACGT C ATT GT GGAAA GAAAT GC AATAT AAT CGAGAT AT CAT AAT AAGATTT AAGTTT GCAAACT C AATTATT AAAT C AGGT GGACT AGGGT AT AAAT GG
T CAGAGATTT C ATT C AAACCAGCAAACT AT CAATATACAT AT AT ACGT GAT GGAGAGGAAGT AACTGCACATACAACATGTTCAGTGAATGGAGTGAACGACTTCAACTATAACGGAGGATCAT T ACCAACT GACTTT GT AAT AT CACGTT AT GAA GTT AT AAAAGAGAACT CTTAT GT AT AT AT AG ATT ATT GGGAT GATT C AC AAGC ATT C AGAAACAT GGT AT AT GT GAGAT CATT AGCT GCGGACT T AAAT GAAGT GACAT GT GC AGGGGGT ACTT AT AATTTCCAACT ACC AGTT GGACAAT GGCCTG T GAT GAGT GGT GGCT CAGT AT CATT GCGTT C AGCTGGAGT AACGTT AT C AACTCAATTT AC AG ACTTTGTGTCATTAAATTCGTTAAGATTTAGGTTCAGTTTAGCAGTAGAAGAACCGCCATTCT CTATTT CAAGGAC ACGGAT AT CAGGGTT AT AT GGGTT ACCGGCAGCCAAT CC AAAT AAT GGA AGAGACTTCT AT GAAATT GCGGGT AGATTTT CATT AATTTT ATTAGT ACC AT C AAAT GAT GAT TATCAAACTCCTATAATGAACTCAGTGACGGTGAGACAGGACTTAGAGAGGCAGTTAGGAGA ATT GAGAGAAGAATTT AACGCATT AT CACA AGAGAT AGCT AT GT CAC AATT GAT AGATCT AG CTTTACTACCATTGGACATGTTCTCAATGTTTTCAGGAATTAAAACAACGATAGATGCAGCTA AAT CAAT GGCC ACT AAT GT AAT GAAGAAGTTT AAAAGCTC AGGCTTGGCC ACGT CT GT AT CCA CGTTGACAGACTCATTATCTGACGCCGCATCAGCGGTATCAAGGAACAGCTCAATAAGATCA ATT GGAT C AAC AGC AT CAGCTT GGAC AGAC ATTT CTTC ACAAATAGT GGAT ACGC AAGCAT C AGT CAAT ACGTT GGCAACT C AAACGT C AACT AT CAGCAAGAGATT AAGGTT A AAA GAAATT G CGACT CAAAC AGAGGGAAT GAATTT CGACGAC ATAT C AGC AGCT GT GTT AAAAACT AAAATT GACAAAT CAT CACAAAT AGGACCAAGT ACTTT ACC AGAT ATTGTT ACT GAAGCGT CGGAGAA GTTT AT ACCAAAT AGAACGT AT AGAGT AATT GACGAT GATACT GTGTTT GAAGCAGGAAC AG ATGGGAGATTTTACGCATATAGAGTCGAGACGTTTGAGGAAGTTCCATTTGATGTGCAAAAAT TCGCAGATTTAGTAACTGACTCTCCAGTAATCTCGGCCATTATAGACTTTAAAACGCTTAAAA ACTTGAAT GAT AACT AT GGAATT ACT CGTTCGC AAGC ATT AAAT CT AATTAGAT CAGAT CCAA GGGTT CT GCGAGAATTT AT CAAT CAAGAT AAT CC AAT AAT AAGAAACAGGAT AGAGCAGTT A ATT CT GCAAT GT AGATTGT AA
Secuencia 42 (SEQ ID NO: 42):
GGATCCCATATGATGGCTTCGCTCATTTAC
Secuencia 43 (SEQ ID NO: 43):
GGATCCCATATGTACAGACAATTACTTACGAATTC
Secuencia 44 (SEQ ID NO: 44):
GGATCCCATATGATACAGTTAATTGGATCAGAAAA
Secuencia 45 (SEQ ID NO: 45):
GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACGCAG
Secuencia 46 (SEQ ID NO: 46):
GGATCCCATATGTTGAATGGACCA
Secuencia 47 (SEQ ID NO: 47):
AAGCTTAGGTGTTTTGTATTGGTGG
Secuencia 48 (SEQ ID NO: 48):
AAGCTTATCTTCTAGCAACTATTGATCGT
Secuencia 49 (SEQ ID NO: 49):
AAGCTTAGTTCACTGCAGCTCTTCTAGC Secuencia 50 (SEQ ID NO: 50):
AAGCTTACAATGACGTTTTCGATATAACTA
Secuencia 51 (SEQ ID NO: 51):
AAGCTTAGATATCTCGATTATATTGCATTTC
Secuencia 52 (SEQ ID NO: 52):
AAGCTTAAATTGAGTTTGCAAACTTAAAT
Secuencia 53 (SEQ ID NO: 53):
AAGCTTACCATTTATACCCTAGTCCACC
Secuencia 54 (SEQ ID NO: 54):
AAGCTTAATAGTTTGCTGGTTTGAATGA
Secuencia 55 (SEQ ID NO: 55):
AAGCTTATTCCTCTCCATCACGTATATATG
Secuencia 56 (SEQ ID NO: 56):
AAGCTTAATTCACTGAACATGTTGTATGTG
Secuencia 57 (SEQ ID NO: 57):
AAGCTTATCCTCCGTTATAGTTGAAGTC
Secuencia 58 (SEQ ID NO: 58):
AAGCTTAACGTGATATTACAAAGTCAGTTG
Secuencia 59 (SEQ ID NO: 59):
AAGCTTATACATAAGAGTTCTCTTTTATAACTTC
Secuencia 60 (SEQ ID NO: 60):
AAGCTTATGCTTGTGAATCATCCCAA
Secuencia 61 (SEQ ID NO: 61):
AAGCTTATAATGATCTCACATATACCATGTTT
Secuencia 62 (SEQ ID NO: 62):
AAGCTTATGCACATGTCACTTCATTTAAG
Secuencia 63 (SEQ ID NO: 63):
AAGCTTAAACTGGTAGTTGGAAATTATAAGTA
Secuencia 64 (SEQ ID NO: 64):
AAGCTTATGAGCCACCACTCATCACA
Secuencia 65 (SEQ ID NO: 65):
AAGCTTATAACGTTACTCCAGCTGAAC
Secuencia 66 (SEQ ID NO: 66):
AAGCTTATAATGACACAAAGTCTGTAAATTG
Secuencia 67 (SEQ ID NO: 67):
AAGCTTATGCTAAACTGAACCTAAATCTTA Secuencia 68 (SEQ ID NO: 68):
AAGCTT ACCTT GAAAT AGAGAATGGCG
Secuencia 69 (SEQ ID NO: 69):
AAGCTTACGGTAACCCATATAACCCT
Secuencia 70 (SEQ ID NO: 70):
AAGCTTAGAAGTCTCTTCCATTATTTGGA
Secuencia 71 (SEQ ID NO: 71):
AAGCTTAAATTAATGAAAATCTACCCGC
Secuencia 72 (SEQ ID NO: 72):
AGATCTAAGCTTATGATGGTACTAATAAAATTAATGAAAATC
Secuencia 73 (SEQ ID NO: 73):
AGATCTAAGCTTAAGTTTGATAATCATCATTTGATGGTACTA
Secuencia 74 (SEQ ID NO: 74):
AGATCTAAGCTTATGAGTTCATTATAGGAGTTTGATAATCAT
Secuencia 75 (SEQ ID NO: 75):
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Secuencia 76 (SEQ ID NO: 76):
AGATCTAAGCTTACTGCCTCTCTAAGTCCTGTCTCA
Secuencia 77 (SEQ ID NO: 77):
GGATCCCATATGGGATCGGAGAAAACTCAA
Secuencia 78 (SEQ ID NO: 78):
AAGCTTAATTAGTTGGAACTAAAGAAATAAGT
Secuencia 79 (SEQ ID NO: 79) GGATCCCATATGGGATCAGAGAAAAGTCAAAAT
Secuencia 80 (SEQ ID NO: 80) AAGCTTAATTAGACGGTACTAATGAAA
Secuencia 81 (SEQ ID NO: 81):
GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACTCAAAATG
Secuencia 82 (SEQ ID NO: 82):
AAGCTTAGTTGGTTGGAACTAAAGAAA
Secuencia 83 (SEQ ID NO: 83):
GGATCCCATATGGGAGCAGAGAAGACACA
Secuencia 84 (SEQ ID NO: 84):
AAGCTTAATCGTTGGACGGCAC
Secuencia 85 (SEQ ID NO: 85):
GGATCCCATATGGGATCAACTAAATCACAAAATG
Secuencia 86 (SEQ ID NO: 86):
AAGCTT AT GAT GGCACT AAT GAT AT AAGT
Secuencia 87 (SEQ ID NO: 87):
MASLIYRQLLTNSYTVDLSDEIQEIGSTKSQNVTINPGPFAQTGYAPVNWGPGEINDSTTVEPLLDG PYQPMTFNPPVDYWMLLAPTTPGVIVEGTNNTDRWLATILIEPNVQSENRTYTIFGIQEQLTVSNT SQDQWKFIDVVKTTANGSIGQYGSLLSSPKLYAVMKHNEKLYTYEGQTPNARTGHYSTTNYDSV NMTAFCDFYIIPRSEESKCTEYINNGLPPIQNTRNVYPLSLTARDYIHYRAQANEDIVISKTSLWKE MQYNRDITIRFKFANTIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYTRDGEEVTAHTTCSVNGVNDFSFNG GSLPTDFVV SKFEYIKEN S YY YID YWDD S QAFRNYM YVRSL AANLN S YMCT GGS YNF SLP VGQ W PVLTGGAVSLHSAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFRLAVEEPHFKLTRTRLDRLYGLPAADPNNGKE YYEIAGRFSLISLVPSNDDYQTPIANSVTVRQDLERQLGELREEFNALSQEIAMSQLIDLALLPLDM FSMFSGIKSTIDAAKSMATNVMKKFKKSGLANSVSTLTDSLSDAASSISRGSSIRSIGSSASAWTDV STQITDISSSVSSVSTQTSTISRRLRLKEMATQTEGMNFDDISAAYLKTKIDKSTQISPNTIPDIVTEA
SEKFIPNRAYRVINNDDVFEAGIDGKFFAYKVDTFEEIPFDVOKFADLVTDSPVISAIIDFKTLKNLN DNYGITKQQAFNLLRSDPRVLREFINQDNPIIRNRIEQLIMQCRL
5 Secuencia 88 (SEQ ID NO: 88):
MASLIYRQLLTNSFTVDISDEIETIGAEKTQNVTVNPGPFAQTGYAPANWGPGETNDSTTVEPVLD GPYQPIAFSPPPEYYILLSPTAPGVIAECTNTVNRWIAIIAIEPNVSPTNRTYTLFGITEQLTVENSSV DKWKFIDFMKTPTT GS YVRYNILL S STKLCAVAKHTDNL Y S YV GETPT AGQ AY Y S SFNIFNLT AH CDFYIIPWSQQSLCTQYVNNGLPPIQNTRNVVPRHLSARSIITQRAQANEDIVVSKTSLWKEMQFN RDITIRFKFANAIIKSGGLGYKWSEISFKPANYQYTYTRDGEEVTAHTTCSVNGVNNFDFFGGSLP TDF GISRYEVIKEN SF VYID YWDD SQAFRNMV YVRSL AADLNTVECT GGA YSF SLP V GQ WPVMT GGAVSLRAAGVTL STQFTDF V SLN SLRFRFRL S VEEP SF SITRTRVS GL Y GLP AADPNN GRE Y YEIA GRFSLISLVPSNDNYQTPIMNSVTVRQDLERQLGELREEFNALSQEIALSQLVDLALLPLDMFSMFS GIKATLDVAKSMATNVMKKFKKSGLATSISAMTESLSDAASSVSRSGAIRSVSSTSSAWTDVSSR VANVENAASTVSTQTATISRRLRLKEITTQTEGMNFDDISAAVLKTKLDKSVRIAPNTLPDIVTEAS EKFIPNRSYRVINNNEAFETGTDGRFFAYRVDTLEELPFDVQKFADLVAESPVISAIIDFKTLKNLN DNYGISKEQAFSLLRSDPRVLREFINQGNPIIRNRIEQLIMQCRL
Secuencia 89 (SEQ ID NO: 89):
MASLIYRQLLTNSYSVDLHDEIEQIGSEKTQNVTVNPGPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPVL DGPYQPTTFKPPNDYWLLISSNTDGVVYESTNNSDFWTAVIAVEPHVSQTNRQYVLFGENKQFNI ENSSDKWKFLEMFRGSGQSDFSNRRTLTSNNRLVGMLKYGGRVWTFHGETPRATTDSSNTADLN NISIIIHSEFYIIPRSQESKCNEYINNGLPPIQNTRNVVPLSLSSRSIQYRRAQVNEDITISKTSLWKEM QYNRDIIIRFKFGNSVIKLGGLGYKWSEISYKAANYQYSYSRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNG GSLPTDFSISRYEVIKENSYVYIDYWDDSKAFRNMVYVRSLAANLNSVKCVGGSYDFRLPVGEWP IMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPSFSIIRTRTMNLYGLPAANPNNGNEY YEVSGRFSLISLVPTNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLNDLREEFNSLSQEIAMSQLIDLALLPLDMF SMFSGIKSTIDLTKSMATSVMKKFRKSKLATSISEMTNSLSDAASSASRSASIRSNLSTISNWSDAS KSVLNVTDSVNDVSTQTSTISKKLRLREMITQTEGISFDDISAAVLKTKIDMSTQIGKNTLPDIVTE ASEKFIPKRSYRVLKDDEVMEVNTEGKFFAYKVDTLNEIPFDINKFAELVTDSPVISAIIDFKTLKN LNDNYGITRIEALNLIKSNPNVLRNFINQNNPIIRNRIEQLILQCKL
Secuencia 90 (SEQ ID NO: 90):
MÁSLIYRQLLTNSYTVELSDEINTIGSEKSQNVTINPGPFAQTNYAPVTWSHGEVNDSTTIEPVLDG P Y QPTNFKPPND YWILLNPTNQQVVLEGTNKTDIWVALLL VEPNVTN Q SRQ YTLF GETKQIT VEN NTNKWKFFEMFRSNVNAEFQHKRTLT SDTKL AGFMKF YNS VWTFHGETPHATTD YS ST SNL SEV ETVIHVEFYIIPRSQESKCSEYINTGLPPMQNTRNIVPVALSSRSVTYQRAQVNEDIIISKTSLWKEM QYNRDIIIRFKFNNSIVKLGGLGYKWSEISFKAANYQYSYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNG GSLPTDFSVSRYEVIKENSYVYVDYWDDSQAFRNMVYVRSLAANLNSVKCSGGNYNFQIPVGA WPVMSGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVEEPPFSILRTRVSGLYGLPAFNPNNGH EYYEIAGRFSLISLVPSNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLGDLREEFNSLSQEIAMTQLIDLALLPLD MFSMFSGIKSTIDVAKSMVTKVMKKFKKSGLATSISELTGSLSNAASSVSRSSSIRSNISSISVWTD VSEQIAGSSDSVRNISTQTSAISKRLRLREITTQTEGMNFDDISAAVLKTKIDRSTHISPDTLPDIITES SEKFIPKRAYRVLKDDEVMEADVDGKFFAYKVGTFEEVPFDVDKFVDLVTDSPVISAIIDFKTLKN
-I o LNDNYGITRSQALDLIRSDPRVLRDFINQNNPIIKNRIEQLILQCRL
Secuencia 91 (SEQ ID NO: 91):
MASLIYRQLLTNSYSVDLHDEIEQIGSEKTQNVTINPSPFAQTRYAPVNWGHGEINDSTTVEPMLD GPYQPTTFTPPNDYWILINSNTNGVVYESTNNSDFWTAVVAIEPHVNPVDRQYTIFGESKQFNVSN DSNKWKFLEMFRSSSQNEFYNRRTLTSDTRFVGILKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISI
TfflSEFYIIPRSQESKCNEYINNGLPPIQNTRNVVPLPLSSRSIQYKRAQVNEDIIVSKTSLWKEMQY NRDIIIRFKFGNSIVKMGGLGYKWSEISYKAANYQYNYLRDGEQVTAHTTCSVNGVNNFSYNGGF LPTDFGISRYEVIKENSYVYVDYWDDSKAFRNMVYVRSLAANLNSVKCTGGSYNFSIPVGAWPV MNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPPFSILRTRTVNLYGLPAANPNNGNEYY EISGRFSLIYLVPTNDDYQTPIMNSVTVRQDLERQLTDLREEFNSLSQEIAMAQLIDLALLPLDMFS MFSGIKSTIDLTKSMATSVMKKFRKSKLATSISEMTNSLSDAASSASRNVSIRSNLSAISNWTNVSN DVSNVTNSLNDISTQTSTISKKFRLKEMITQTEGMSFDDISAAVLKTKIDMSTQIGKNTLPDIVTEA SEKFIPKRSYRILKDDEVMEINTEGKFFAYKINTFDEVPFDVNKFAELVTDSPVISAIIDFKTLKNLN
Modos específicos para llevar a cabo la invención
Las realizaciones de la invención se ilustran con referencia a los siguientes ejemplos. Una persona experta en la técnica entenderá que los siguientes ejemplos tienen únicamente el fin de ilustrar la invención, en lugar de considerarse como limitantes de la invención.
A menos que se indique lo contrario, los métodos experimentales de biología molecular y los ensayos inmunológicos utilizados en la invención se llevan a cabo sustancialmente según los métodos descritos en Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Segunda Edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3S Edición, John Wiley & Sons, Inc., 1995, o según las instrucciones de los productos. Los reactivos o aparatos, cuyos fabricantes no se indican, son los productos convencionales que están disponibles comercialmente. Los expertos en la técnica comprenderán que los ejemplos se utilizan para ilustrar la presente invención, pero no pretenden limitar la presente invención.
Fuentes de los materiales biológicos y reactivos utilizados en los Ejemplos:
La cepa LLR de rotavirus fue un obsequio de Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise CO., LTD; la cepa SA11 de rotavirus se adquirió en el Chinese Veterinary Culture Collection Center; las cepas de rotavirus Wa y DS-1 se adquirieron de ATCC; la cepa EDIM de rotavirus fue un obsequio del Institute of Pathogenic Biology; el vector de expresión procariota PTO-T7 se construyó por el laboratorio; Esoheriohia coli (E. coI¡) ER2566 y BL21 (DE3) se adquirieron de New England Biolabs; los cebadores utilizados se sintetizaron por Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Ejemplo 1: Estudio de inmunogenicidad e inmunoprotección de la proteína VP8 truncada (VP8-5)
Según el método descrito en la solicitud de patente china CN 201510165746.2, la proteína VP8 de rotavirus truncada, VP8-5 (cuya secuencia de aminoácidos se expuso en SEQ ID NO: 1), se expresó y se purificó. Brevemente, el ARN genómico de rotavirus se extrajo del cultivo de la cepa LLR de rotavirus, y el ADNc que codifica la proteína VP4 se obtuvo mediante transcripción inversa. Después, el ADNc obtenido se utilizó como molde, y el fragmento del gen que codifica VP8-5 se obtuvo mediante amplificación por PCR. El fragmento de gen obtenido se usó entonces para construir un vector de expresión para VP8-5, y el vector de expresión se transformó en E. coli. E. coli que contenía el vector de expresión VP8-5 se cultivó a 37°C hasta que la OD600 fue alrededor de 0,6, y después la temperatura se redujo a 25°C. Se añadió IPTG a una concentración final de 0,8 mM, y E. coli se cultivó adicionalmente durante 6 h. Después del cultivo, las bacterias se recogieron por centrifugación y se rompieron ultrasónicamente, y se recogió la fracción soluble. A continuación, la proteína VP8-5 se recogió de la fracción soluble mediante cromatografía de intercambio aniónico, en la que el sistema de instrumentos utilizado fue el sistema de cromatografía preparativa AKTA Explorer 100 producido por GE Healthcare Company; el medio cromatográfico utilizado fue Q-sefarosa-HP (GE Healthcare Company); el amortiguador usado fue Tris-HCl 50 mM pH 8,0 y Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 2 M; el programa de elución fue el siguiente: la proteína impura se eluyó con NaCl 1000 mM, la proteína de interés se eluyó con NaCl 50 mM, y se recogió el producto eluido con NaCl 50 mM. El producto eluido obtenido se identificó mediante SDS-PAGE al 13,5%, y el resultado se mostró en la Fig. 1. Los resultados en la Fig. 1 mostraron que la proteína VP8-5 purificada obtenida tenía una pureza superior al 90%.
Se ha demostrado mediante el uso de un modelo de ratón en la Solicitud de Patente China CN 201510165746.2 que, en presencia de adyuvante de Freund, la proteína VP8-5 purificada tenía buena inmunogenicidad e inmunoprotección (véanse, Ejemplo 5-8 y Figs. 4-9 de la solicitud). Con el fin de investigar adicionalmente el efecto inmunoprotector de la proteína VP8-5 en presencia de adyuvante de aluminio, se usó el modelo de ratón para evaluar la inmunogenicidad y la inmunoprotección de la proteína VP8-5 purificada adyuvante de aluminio.
La realización fue como sigue: se dividieron aleatoriamente ratones Balb/c hembra de 5-6 semanas de edad en 3 grupos, 7 ratones por grupo, en los que se usaron dos grupos como grupos de control, y un grupo se usó como grupo experimental. La proteína VP8-5 purificada, una dosis igual de la cepa LLR del virus inactivado y PBS se mezclaron por separado con adyuvante de fosfato de aluminio en una relación de 1:1 (v/v), y después los ratones se inmunizaron mediante inyección muscular, a una dosis de inmunización de 10 mg/ratón, en la que los ratones del grupo experimental se inmunizaron con VP8-5, los ratones del grupo de control positivo se inmunizaron con la LLR de virus inactivado, y los ratones del grupo de control negativo se inmunizaron con PBS. Los ratones de cada grupo se inmunizaron tres veces, con un intervalo de dos semanas para cada inmunización. En los días 0, 14, 28 y 42 del procedimiento de inmunización, se recogió sangre de los globos oculares de los ratones, respectivamente, y se determinó el título de anticuerpos y el título de anticuerpos neutralizantes.
Determinación del título de anticuerpos
El suero inmune se sometió a diluciones seriadas, y el suero inmune diluido y la VP8-5 recubierta en la placa se sometieron a análisis ELISA indirecto (en el que el anticuerpo secundario utilizado fue un anticuerpo de cabra anti­ ratón (Wanyumeilan)), para determinar la mayor dilución del suero inmune que tiene reactividad con VP8-5. Cuanto mayor era la mayor dilución del suero inmune, mayor era el título de anticuerpo anti-VP8-5 en el suero inmune, y mayor era la inmunogenicidad de la proteína para producir el suero inmune.
Los resultados del ELISA indirecto se muestran en la Fig. 1B, en la que la ordenada representa la mayor dilución (es decir, el título de anticuerpos) del suero inmune que tiene reactividad con VP8-5. Los resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización, VP8-5 podía inducir la generación de anticuerpos en ratones, pero su eficacia fue menor que la eficacia de la LLR de virus inactivado. Estos resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, la proteína VP8-5 tenía inmunogenicidad y podía inducir la generación de anticuerpos en ratones, pero su capacidad para inducir la generación de anticuerpos en animales era menor que la de la LLR de virus inactivado.
Determinación del título de anticuerpos neutralizantes
Las células MA104 se extendieron en una placa de cultivo celular de 96 pocillos (1,9*104 células/pocillo). 20 h más tarde, el título de anticuerpos neutralizantes del suero inmune se determinó mediante ELISPOT (Li, Lin, Yu, et al. J Virol Methods, 209 7-14, 2014). El método particular fue el siguiente: una muestra de suero inmune a analizar (que contenía un anticuerpo neutralizante a analizar) se sometió a una doble dilución de forma continua utilizando DMEM que contenía tripsina; a continuación, se mezclaron 100 pl de cada muestra diluida con una disolución de rotavirus diluida en DMEM (TCID50 = 1,5*105); después de la incubación a 37°C durante 1 h, la mezcla se añadió a una placa de cultivo celular de 96 pocillos esparcida previamente con células MA104, y se cultivó a 37°C durante 14 h; y después, la tasa de inhibición de la infección viral de la muestra de suero inmune se calculó como sigue.
La tasa de inhibición infecciosa = (el número de manchas de virus en un pocillo sin suero - el número de manchas de virus en un pocillo con suero)/el número de manchas de virus en un pocillo sin suero * 100%.
El título de anticuerpos neutralizantes en el suero inmune se define como: la mayor dilución del suero inmune que logra una tasa de inhibición de la infección del 50%. Si una muestra de suero inmune diluida 50 veces aún puede lograr una tasa de inhibición de la infección superior al 50%, se considera que la muestra tiene capacidad neutralizante.
Los resultados analíticos del título de anticuerpos neutralizantes de sueros inmunes se muestran en la Fig. 1C, en la que la ordenada representa la mayor dilución (NT50, título de anticuerpos neutralizantes) del suero inmune que logra una tasa de inhibición de la infección del 50%. Los resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, VP8-5 podía inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en ratones el Día 42 después de la inmunización (después de tres inmunizaciones), pero el título de anticuerpos neutralizantes (NT50) del suero inmune fue menor que el de la LLR de virus inactivado. Una vez finalizado el procedimiento de inmunización, el título de anticuerpos neutralizantes (NT50) del suero inmune inducido con la proteína VP8-5 apenas alcanzó alrededor de 64. Estos resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, VP8-5 podía inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo; sin embargo, el título de anticuerpos neutralizantes (NT50) del suero inmune inducido con ella fue menor que el de la LLR de virus inactivado.
Análisis sobre el efecto protector en animales
Una vez finalizado el procedimiento de inmunización (42 días después de la inmunización), los ratones de cada grupo se aparearon en una proporción de dos ratones hembra por un ratón macho. Alrededor de 20 días después del apareamiento, las hembras dieron a luz ratones lactantes, y los ratones lactantes se criaron durante 7 días. Los ratones lactantes de 7 días se expusieron intragástricamente a la cepa del virus LLR, a una dosis de 5*106 TCID50/ratón. Después de la exposición, se observó y registró el estado de diarrea de los ratones lactantes todos los días durante 7 días, y se puntuó según la forma y el estado de los excrementos. Los criterios de puntuación fueron los que se muestran en la Fig. 2. Dependiendo del grado de diarrea en ratones lactantes, las puntuaciones se dividen en tres grados: las heces normales se puntúan como 1 punto (Fig. 2C), las heces blandas se puntúan como 2 puntos (Fig. 2B), y las heces acuosas sin forma se puntúan como 3 puntos (Fig. 2A).
La Fig. 3 mostraba las puntuaciones de la diarrea de los ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización después de la exposición a un virus, en la que el eje de ordenadas representa la puntuación de la diarrea; el eje de abscisas representa días después de la exposición a un virus en ratones. Los resultados mostraron que las puntuaciones de la diarrea de los ratones lactantes en el grupo experimental (VP8-5) no fueron significativamente diferentes de las del grupo de control negativo (NC). Esto mostró que en presencia de adyuvante de aluminio, VP8-5 tenía una baja capacidad para proteger un organismo de la infección por rotavirus (menor que la del virus inactivado), y no podía aliviar suficientemente la diarrea causada por la infección por rotavirus.
Ejemplo 2: Construcción de vectores de expresión que codifican la proteína VP4 truncada
Las cepas LLR y SA11 de rotavirus se cultivaron con una línea celular de riñón de mono rhesus fetal (MA-104). El medio de cultivo utilizado fue DMEM, suplementado con 2 mg/ml de tripsina, 0,5 mg/ml de ampicilina, y 0,4 mg/ml de estreptomicina, 3,7 mg/ml de bicarbonato de sodio, y 0,34 mg/ml de L-glutamina.
Según las instrucciones del fabricante, el Virus DNA/RNA Kit producido por by Beijing GenMag Biotechnology Co., Ltd. se utilizó para extraer el ARN genómico de rotavirus, y el ADNc que codifica la proteína VP4 de la cepa LLR se obtuvo mediante transcripción inversa. El ADNc obtenido se utilizó como molde, y el fragmento de gen que codifica la proteína VP4 truncada de la cepa LLR de rotavirus se obtuvo mediante amplificación por PCR.
Los cebadores de PCR utilizados son los siguientes:
cebadores en dirección 5’:
5’-GGATCCCATATGATGGCTTCGCTCATTTAC-3’ (SEQ ID NO: 42)
5’-GGATCCCATATGTACAGACAATTACTTACGAATTC-3’ (SEQ ID NO: 43)
5’-GGATCCCATATGATACAGTTAATTGGATCAGAAAA-3’ (SEQ ID NO: 44)
5’-GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACGCAG-3’ (SEQ ID NO: 45)
5’-GGATCCCATATGTTGAATGGACCA-3’ (SEQ ID NO: 46)
cebadores en dirección 3’:
5’-MGC7TAGGTGTTTTGTATTGGTGG-3’ (SEQ ID NO: 47)
5’-AAGCTTATCTTCTAGCAACTATTGATCGT-3’ (SEQ ID NO: 48)
5’-AAGC7TAGTTCACTGCAGCTCTTCTAGC-3’ (SEQ ID NO: 49)
5’-AAGCTTACAATGACGTTTTCGATATAACTA-3’ (SEQ ID NO: 50)
5’-AAGCTTAGATATCTCGATTATATTGCATTTC-3’ (SEQ ID NO: 51)
5’-AAGCTTA AATTGAGTTTGCAAACTTAAAT-3’ (SEQ ID NO: 52)
5’-AAGCTTACCATTTATACCCTAGTCCACC-3’ (SEQ ID NO: 53)
5’-AAGCTTAATAGTTTGCTGGTTTGAATGA-3’ (SEQ ID NO: 54)
5’-AAGCTTATTCCTCTCCATCACGTATATATG-3’ (SEQ ID NO: 55)
5’-AAGCTTAATTCACTGAACATGTTGTATGTG-3’ (SEQ ID NO: 56)
5’-AAGCTTATCCTCCGTTATAGTTGAAGTC-3’ (SEQ ID NO: 57)
5’-AAGCTTAACGTGATATTACAAAGTCAGTTG-3’ (SEQ ID NO: 58)
5’-AAGCTTATACATAAGAGTTCTCTTTTATAACTTC-3’ (SEQ ID NO: 59)
5’-AAGCTTATGCTTGTGAATCATCCCAA-3’ (SEQ ID NO: 60)
5’-AAGCTTATAATGATCTCACATATACCATGTTT-3’ (SEQ ID NO: 61)
5’-AAGCTTATGCACATGTCACTTCATTTAAG-3’ (SEQ ID NO: 62)
5’-AAGCTTAAACTGGTAGTTGGAAATTATAAGTA-3’ (SEQ ID NO: 63)
5’-AAGCTTATGAGCCACCACTCATCACA-3’ (SEQ ID NO: 64)
5’-AAGCTTATAACGTTACTCCAGCTGAAC-3’ (SEQ ID NO: 65)
5’-AAGCTTATAATGACACAAAGTCTGTAAATTG-3’ (SEQ ID NO: 66)
5’-AAGCTTATGCTAAACTGAACCTAAATCTTA-3’ (SEQ ID NO: 67)
5’-AAGCTTACCTTGAAATAGAGAATGGCG-3’ (SEQ ID NO: 68)
5'-AAGCTTACGGTAACCCATATAACCCT (SEQ ID NO: 69)
5’-AAGCTTAGAAGTCTCTTCCATTATTTGGA-3’ (SEQ ID NO: 70)
5’-AAGCTTAAATTAATGAAAATCTACCCGC-3’ (SEQ ID NO: 71)
5’-AGATCTAAGCTTATGATGGTACTAATAAAATTAATGAAAATC-3’ (SEQ ID NO: 72)
5’-AGATCTAAGCTTAAGTTTGATAATCATCATTTGATGGTACTA-3’ (SEQ ID NO: 73)
5’-AGATCTAAGCTTATGAGTTCATTATAGGAGTTTGATAATCAT-3’ (SEQ ID NO: 74)
5’-AGATCTAAGCTTATGTCTCACCGTCACTGAGTTCA-3’ (SEQ ID NO: 75)
5’-AGATCTAAGCTTACTGCCTCTCTAAGTCCTGTCTCA-3’ (SEQ ID NO: 76)
en los que las secuencias subrayadas indican los sitios de restricción enzimática, y las letras en cursiva indican los codones terminadores introducidos.
Mediante el uso de los cebadores mencionados anteriormente, el gen que codifica la proteína VP4 truncada se amplificó mediante PCR, y el sistema de PCR utilizado es el siguiente:
Muestra Volumen
Amortiguador 10 x 5 mL
F (cebador en dirección 5’) 0,5 mL
R (cebador en dirección 3’) 0,5 mL
enzima rTaq 0,5 mL
mezcla de dNTP 0,5 mL
ADNc (producto de transcripción inversa) 5 mL
Agua DEPC 38 mL
Los pares de cebadores para la amplificación del gen que codifica la proteína VP4 truncada se muestran en la Tabla 2:
Tabla 2: Cebadores para la amplificación de los genes que codifican las proteínas VP4 truncadas Nombre de la proteína
Figure imgf000029_0001
Cebador en dirección 5’
Figure imgf000029_0002
Cebador en dirección 3’
1-476 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 72
6-476 SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 72
22-476 SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 72
26-476 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 72
65-476 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 72
26-247 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 48
26-251 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 49
26-261 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 50
26-271 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 51
26-281 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 52
26-291 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 53
26-301 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 54
Nombre de la proteína
Figure imgf000030_0001
Cebador en dirección 5’
Figure imgf000030_0002
Cebador en dirección 3’
26-311 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 55
26-321 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 56
26-331 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 57
26-341 SEQ ID1 NO: 45 SEQ ID NO: 58
26-351 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 59
26-361 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 60
26-371 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 61
26-381 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 62
26-391 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 63
26-401 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 64
26-411 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 65
26-421 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 66
26-431 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 67
26-441 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 68
26-451 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 69
26-461 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 70
26-471 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 71
26-476 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 72
26-482 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 73
26-487 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 74
26-492 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 75
26-497 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 76
Las condiciones de PCR fueron las siguientes: desnaturalización previa a 952C durante 5 min, 35 ciclos de (952C, 40 s; 55°C, 80 s; 72°C, 1 min), y extensión final a 72°C durante 10 min. El producto de amplificación obtenido se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
El producto de amplificación por PCR se ligó en el vector pMD18-T, y se transformó en E. coIí DH5a. A continuación, se examinó la colonia bacteriana positiva, se extrajo el plásmido, y se identificó mediante escisión con enzimas Nde I/Hind III, y se obtuvieron los plásmidos clonales positivos, en los que se insertaron los fragmentos de genes de interés. Se secuenciaron los plásmidos clonales positivos obtenidos. Los resultados de la secuenciación mostraron que las secuencias nucleotídicas de los fragmentos de interés que se insertaron en los plásmidos clonales positivos eran idénticas a las secuencias esperadas, y las secuencias de aminoácidos codificadas de ese modo se exponen en SEQ ID NOs: 2-34.
Los plásmidos clonales positivos se escindieron por enzimas Nde I/Hind III, respectivamente, para obtener los fragmentos génicos que codifican las proteínas VP4 truncadas, que se ligaron al vector de expresión de no fusión pTO-T7 escindido con enzimas Nde I/Hind III (Luo Wenxin et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16: 53-57), y el vector se transformó en E. coIí DH5a. Se seleccionó la colonia bacteriana positiva, se extrajo el plásmido, y el vector de expresión positivo, en el que se insertó el fragmento del gen de interés, se identificó mediante escisión con enzimas Nde I/Hind III.
Se usó 1 pl de vector de expresión positivo para transformar 40 pl de E. coIí B121 (DE3) competente (adquirida de NEB Company). La E. coIí transformada se revistió sobre medio de cultivo LB sólido (los componentes del medio de cultivo LB: peptona 10 g/l, polvo de levadura 5 g/l, y NaCl 10 g/l, los mismos más abajo) que contenía kanamicina (concentración final de 25 mg/ml, la misma más abajo), y se sometió a cultivo estático a 37°C durante 10-12 h hasta que las colonias individuales fueron claras y discernibles. Se recogieron colonias individuales y se colocaron en 4 ml de medio de cultivo LB líquido (que contenía kanamicina), y después se cultivaron a 37°C, con agitación a 200 r/min durante 10 h. Después del cultivo, a 1 ml de disolución bacteriana, se añadió glicerol a una concentración final del 10%, y la mezcla resultante se almacenó a -70°C.
Ejemplo 3: Expresión de las proteínas VP4 truncadas
La disolución de E. coIí , que porta el vector de expresión positivo preparado en el Ejemplo 2, se tomó de un refrigerador a -70°C, se sembró en 50 ml de medio de cultivo líquido LB que contenía kanamicina, y se cultivó a 180 rpm, 37°C durante alrededor de 4 h; y después se transfirió a 10 botellas de 500 ml de medio de cultivo LB que contenía kanamicina (500 ul de disolución bacteriana para cada botella). Cuando el valor de absorbancia del cultivo alcanzó 0,5 a una longitud de onda de 600 nm, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM, y se cultivó adicionalmente a 180 rpm, 25°C durante 6 h.
Se centrifugó 1 ml de dicha disolución bacteriana, y el precipitado bacteriano se recogió. Al precipitado bacteriano se añadieron 100 ml de agua desionizada, y las bacterias se resuspendieron. A continuación, se añadieron 20 ml de amortiguador de carga 6x, y la mezcla resultante se mezcló homogéneamente y se incubó en un baño de agua hirviendo durante 10 min, para lisar las células. La muestra de 10 ml se sometió a análisis SDS-PAGE al 12%. Los resultados de SDS-PAGE se muestran en la Fig. 4A-4D. Los resultados mostraron que, excepto 26-311,26-331 y 26­ 381 con un nivel de expresión relativamente bajo, las otras proteínas truncadas podían expresarse en un nivel alto en E. coIí.
Ejemplo 4: Purificación y caracterización de las proteínas VP4 truncadas
La disolución de E. coIí obtenida en el Ejemplo 3 se centrifugó, y el precipitado bacteriano se recogió. En una relación de 15 ml/g de bacterias húmedas, se usó TB8.0 50 mM para resuspender las bacterias que expresan las proteínas VP4 truncadas. Las células de E. coIí se rompieron después ultrasónicamente, y la condición para la ruptura ultrasónica fue la siguiente: ultrasonidos durante 2 s y pausa durante 4 s, con un período de ultrasonidos de 4 min para la ruptura de un gramo de bacterias. Después de la ruptura ultrasónica, la mezcla se centrifugó a 25000 g, y el sobrenadante se recogió (es decir, la fracción soluble del lisado de E. coIí que contiene la proteína VP4 truncada expresada de forma recombinante).
La proteína VP4 truncada en la fracción soluble del lisado de E. coIí se pudo purificar mediante cromatografía de dos etapas. Para 26-331, 26-351,26-381, 26-411, 26-441 y 26-461, antes de la cromatografía de dos etapas, la fracción soluble del lisado de E. coIí se trató con sulfato de amonio al 40%, y después se centrifugó para recoger el precipitado de proteína; el precipitado de proteína obtenido se disolvió después en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, y se aplicó a la cromatografía de dos etapas. El método de cromatografía de dos etapas fue el siguiente.
En primer lugar, la purificación primaria se realizó mediante cromatografía de intercambio aniónico Q-HP, para obtener la proteína VP4 truncada con una pureza de alrededor de 60%, en la que las condiciones de purificación fueron las siguientes:
Sistema de instrumento: Sistema de cromatografía de líquidos preparativa AKTA Explorer 100 producido por GE Healthcare Company (la Amershan Pharmacia Company original).
Medio cromatográfico: Q-sefarosa-HP (GE Healthcare Company).
Volumen de la columna: 5,5 cm * 20 cm.
Amortiguador: bomba A: Tris-HCl 50 mM pH 8,0;
bomba B: Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 2 M
Caudal: 6 ml/min.
Longitud de onda del detector: 280 nm.
La muestra era el sobrenadante que contenía la proteína VP4 truncada expresada de manera recombinante, como se preparó anteriormente (es decir, la fracción soluble del lisado de E. coIí o la muestra de proteína disuelta en Tris-HCl 50 mM pH 8,0).
El programa de elución fue el siguiente: la proteína de interés se eluyó con NaCl 50 mM, y la proteína impura se eluyó con NaCl 1 M. La fracción eluida con NaCl 50 mM se recogió, y se obtuvieron 30 ml de muestra primaria purificada que contenía la proteína truncada expresada de manera recombinante (Nota: durante la purificación primaria, las proteínas truncadas 1-476, 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441 y 26-461 no estaban unidas a la columna cromatográfica, y estaban contenidas en la fracción de flujo continuo. Por lo tanto, las fracciones de flujo continuo que contenían las proteínas truncadas se recolectaron y utilizaron como muestras primariamente purificadas).
La muestra purificada primariamente mediante cromatografía de intercambio aniónico se dializó en amortiguador TB8.0 que contenía NaCl 2 M, y después se sometió a purificación secundaria mediante cromatografía de afinidad hidrófoba con fenil sefarosa-HP.
Medio cromatográfico: Fenil sefarosa-HP (GE Healthcare Company).
Volumen de la columna: 5,5 cm * 20 cm.
Amortiguador: bomba A: Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 2 M;
bomba B: Tris-HCl 50 mM pH 8.0
Caudal: 6 ml/min.
Longitud de onda del detector: 280 nm.
La muestra fue el producto purificado por columna cromatográfica Q-HP y dializado frente a una disolución de NaCl 2M.
El programa de elución fue el siguiente: la proteína impura se eluyó con NaCl 1,5 M, la proteína de interés se eluyó con NaCl 1 M, y la proteína impura se eluyó con NaCl 50 mM. La fracción eluida con NaCl 1 M se recogió, y se obtuvieron 30 ml de la proteína VP4 truncada purificada expresada recombinantemente (Nota: durante la purificación secundaria, las proteínas truncadas 1 -476, 26-331,26-351,26-381,26-411,26-441,26-461 y 26-471 se eluyeron con TB8.050 mM, y se recogieron las fracciones eluidas con TB8.0 50 mM).
A la muestra (150 pl) purificada mediante el método mencionado anteriormente, se añadieron 30 pl de amortiguador de carga 6X, y la mezcla se mezcló homogéneamente y se incubó en un baño de agua a 100°C durante 10 min; y la mezcla (10 pl) se sometió después a electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida al 13,5% a un voltaje de 120 V durante 120 min; y las tiras de electroforesis se mostraron entonces mediante tinción con azul brillante de Coomassie. Los resultados de la electroforesis se muestran en la Fig. 5.
Las Fig. 5A-5B muestran los resultados de SDS-PAGE de las proteínas VP4 truncadas purificadas. En la Fig. 5A, los carriles de izquierda a derecha son: Marcador de Peso Molecular de Proteínas (Marcador), 1-476, 6-476, 22-476, 26­ 476, 65-476, 26-231, 26-271, 26-331 y 26-351. En la Fig. 5B, los carriles de izquierda a derecha son: Marcador de Peso Molecular de Proteínas (Marcador), 26-381,26-411,26-441,26-461,26-471,26-482, 26-487, 26-492 y 26-497. Los resultados de las Figs. 5A y 5B mostraron que después de las etapas de purificación, las proteínas truncadas 1­ 476, 6-476, 22-476, 26-476, 65-476, 26-231, 26-271, 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-471, 26­ 482, 26-487, 26-492 y 26-497 tenían todas una concentración superior a 0,2 mg/ml y una pureza superior a 80%.
Además, también se utilizó HPLC para analizar la homogeneidad de las muestras purificadas en diferentes condiciones de amortiguación. El aparato utilizado fue un aparato de Cromatografía de Líquidos de Altas Prestaciones Agilent 1200, en el que la columna cromatográfica fue G3000pwxl o G5000pwxl, el volumen de la columna fue 7,8*300 mm, el caudal fue 0,5 ml/min, y la longitud de onda de detección fue 280 nm; en el que la homogeneidad de 26-331,26-351,26-381,26-411,26­ 441 y 26-461 se determinó usando G5000pwxl; y las otras proteínas se detectaron usando G3000pwxl. Los resultados analíticos de SEC-HPLC se muestran en la Fig. 6 y la Fig. 7.
Los resultados mostraron: en presencia de TB8.0, las proteínas truncadas 1-476, 26-331,26-351,26-381,26-411,26­ 441 y 26-461 tenían un tiempo de retención de alrededor de 11 min y un peso molecular superior a 600 kDa; esto indica que estas proteínas truncadas estaban presentes principalmente en forma de polímero. La proteína truncada 26-271 tuvo un tiempo de retención de alrededor de 16 min; esto indica que la proteína estaba presente principalmente en forma de monómero. Las otras proteínas (6-476, 22-476, 26-476, 26-471,26-482, 26-487, 26-492, 26-497) tenían un tiempo de retención de alrededor de 13-14 min, que era comparable al tiempo de retención de IgG (150 kDa); esto indicó que estas proteínas estaban presentes principalmente en forma de trímero.
Además, en presencia de TB8.0 NaCl 1 M, las proteínas VP4 truncadas 26-476, 26-482, 26-487, 26-492 y 26-497 tenían un tiempo de retención de alrededor de 15 min, que era comparable al del dímero VP8 (40 kDa); esto indicó que estas proteínas truncadas estaban presentes principalmente en forma de monómero en presencia de TB8.0 NaCl 1 M. Esto indicó además que en presencia de sales, las configuraciones de 26-476, 26-482, 26-487, 26-492 y 26-497 se vieron afectadas por iones de sal, dando como resultado la despolimerización del trímero y la formación de monómeros.
Además, los resultados de la Fig.6 y la Fig.7 también mostraron que los picos de absorción principales de las proteínas VP4 truncadas obtenidas representaban casi por encima del 80% o incluso por encima del 90%. Esto indicó que estas proteínas truncadas tenían buena homogeneidad, eran adecuadas para la producción industrial en lotes, y eran buenas para una medicación precisa.
Los resultados experimentales de la Fig. 6 y la Fig. 7 también se resumen en la siguiente Tabla 3.
Tabla 3
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Ejemplo 5: Ensamblaje in v itro y caracterización de la proteína VP4 truncada
El ensamblaje in vitro de la proteína truncada 26-476 se realizó mediante el siguiente método. A temperatura ambiente, la proteína truncada 26-476 se dializó desde el amortiguador TB8.0 al amortiguador de diálisis especificado en la Tabla 4, el amortiguador de diálisis se cambió una vez cada 6 h. Después de la diálisis, la disolución se centrifugó a 12000 rpm durante 10 min, y se recogió el sobrenadante. Posteriormente, el sobrenadante se dejó reposar a la temperatura especificada en la Tabla 4 durante un período de 30 min a 24 h. Después de reposar, el sobrenadante se colocó rápidamente en un baño de hielo, y se centrifugó a 12000 rpm/min durante 10 min. El sobrenadante (que contiene la 26-476 ensamblada in vitro) se recogió después de la segunda centrifugación, para su análisis adicional.
Se empleó HPLC para analizar la homogeneidad del polímero formado mediante ensamblaje in vitro de la proteína truncada 26-476 en el sobrenadante obtenido. El aparato utilizado en el análisis de HPLC fue un aparato de cromatografía de líquidos de altas prestaciones 1200 producido por Agilent o un aparato de cromatografía de líquidos de altas prestaciones E2695 producido por Waters, en el que la columna cromatográfica era G5000pwxl, el volumen de la columna fue 7,8*300 mm, el caudal fue 0,5 ml/min, y la longitud de onda de detección fue 280 nm. Los resultados analíticos de SEC-HPLC se muestran en la Tabla 4 y la Fig. 8A.
Tabla 4: Condiciones y resultados del ensamblaje in vitro de la proteína truncada Concentración de NaCl Tiempo de Porcentaje de Sistema amortiguador Temperatura (°C) (M) reposo polímero Amortiguador de
fosfato 20mM pH 7,4 0 37 12h 93,6%
0 4 12h 0%
0 25 12h 0%
0 37 0,5h 90,5%
0 37 1 h 91,5%
0 37 2h 95,4%
0 37 6h 96,8% Tris-HCl 50 mM pH 8,0 0 37 12h 97,2%
0 37 24h 98,1%
0 45 12h 100%
0 50 12h 100% 0,15 37 12h 26,6%
0,5 37 12h 18,4%
1 37 12h 5,3% Amortiguador de
carbonato 50mM pH 0 37 12h 98,7%
9,6
La Fig. 8A mostró los resultados del análisis de tamiz molecular con la proteína truncada 26-476 después de reposar en Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) a 37°C durante 12 h. Los resultados mostraron que después de reposar en Tris-HCl 50 mM (pH 8.0) a 37°C durante 12 h, la proteína truncada 26-476 podía formar un polímero homogéneo (con un tiempo de retención de 12,4 min), y el polímero representó hasta 97,2%.
Puede verse en los resultados de la Tabla 4 y la Fig. 8A que después de reposar a una temperatura de 372C-502C a un pH en un intervalo de 7,4-9,6, la proteína truncada 26-476 podía ensamblarse para formar un polímero homogéneo, y el porcentaje del polímero puede ser superior al 90%. Además, los resultados de la Tabla 4 también mostraron que la presencia de iones de sal (por ejemplo, NaCl) puede inhibir la proteína truncada 26-476 para formar un polímero. Cuanto mayor era la concentración de iones de sal (por ejemplo, NaCl), menor era el porcentaje del polímero formado. Además, también se utilizó microscopio electrónico para observar el polímero formado por ensamblaje in vitro de la proteína truncada 26-476, y el aparato utilizado fue el microscopio electrónico G2 Spirit producido por FEI Company. En resumen, la muestra se fijó en una rejilla de cobre y se tiñó negativamente con ácido fosfotúngstico al 2% (pH 7,4) durante 30 min, y después se observó con el microscopio electrónico. Los resultados se muestran en la Fig. 8B, en la que se observó un gran número de partículas asimétricas con un radio de alrededor de 10 nm. Los resultados mostraron que la proteína truncada 26-476 podía ensamblarse in vitro en un polímero homogéneo.
Ejemplo 6: Identificación de la proteína VP4 truncada mediante escisión enzimática
La proteína VP4 truncada purificada obtenida en el Ejemplo 4 se escindió con tripsina a 37°C durante 1 h. Al componente escindido enzimáticamente (100 ul), se añadieron 20 pl de amortiguador de carga 6X, y la mezcla resultante se mezcló homogéneamente y se incubó en un baño de agua a 100°C durante 10 min. La mezcla (10 pl) se sometió después a electroforesis en SDS-gel de poliacrilamida al 13,5% a un voltaje de 120 V durante 120 min; y las tiras de electroforesis se mostraron entonces mediante tinción con azul de Coomassie. Los resultados de la electroforesis se muestran en la Fig.9.
La Fig. 9 mostró los resultados de SDS-PAGE de la proteína truncada 26-476, 26-482, 26-487, 26-492, 26-497 escindida por enzima o no. En los carriles, el número “1 ” representa que la muestra no se trata con tripsina; y el número “2” representa que la muestra se ha tratado con 0,1 mg/ml de tripsina. La muestra utilizada en el carril más a la derecha fue VP8-5, como control. Los resultados de la Fig. 9 mostraron que todas estas proteínas truncadas podían ser reconocidas y escindidas por la tripsina, es decir, sus sitios de reconocimiento enzimáticos estaban expuestos.
Ejemplo 7: Análisis de antigenicidad de las proteínas VP4 truncadas
La proteína VP4 truncada purificada obtenida en el Ejemplo 4 se recubrió sobre una placa para obtener una placa recubierta. Los anticuerpos neutralizantes A3, B1, B5, B6, D6, E2, E5, y 8F6 (preparados por tecnología de hibridomas en el laboratorio, a una concentración de 1 mg/ml) se sometieron a dilución en gradiente, y después se detectaron mediante el método ELISA indirecto como se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados de la detección se muestran en la Fig. 10, en la que la abscisa representa las proteínas truncadas, y la ordenada representa la menor concentración de anticuerpo capaz de reaccionar con las proteínas truncadas (OD450/620 mayor que 0,2). Los resultados mostraron que las proteínas VP4 truncadas tenían buena antigenicidad (es decir, reactividad de anticuerpos).
Ejemplo 8: Análisis de la inmunogenicidad de las proteínas VP4 truncadas
La proteína truncada purificada 26-476 obtenida en el Ejemplo 4 se recubrió en una placa, para obtener la placa recubierta. Según el método descrito en el Ejemplo 1, en presencia de adyuvante de aluminio, se inmunizaron ratones Balb/c con la muestra a ensayar (la proteína VP4 truncada, y el trímero de 26-476 obtenido en el Ejemplo 4, el polímero de 26-476 obtenido en el Ejemplo 5, el virus inactivado (RV, como control positivo) y PBS (NC, control negativo)), respectivamente, y los sueros de los ratones se recogieron. Posteriormente, según el método descrito en el Ejemplo 1, el título de anticuerpos en el suero de ratón se determinó mediante ELISA indirecto utilizando la placa recubierta con 26-476.
Los resultados de ELISA indirecto se muestran en las Figs. 11A-11D, en las que la abscisa representa la muestra de proteína para preparar suero inmune, y la ordenada representa la mayor dilución (es decir, título de anticuerpos) del suero inmune que tiene reactividad con 26-476; y las Figs. 11A, 11B, 11C y 11D mostraron los resultados de diferentes lotes de inmunización. Los resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización, estas proteínas podían inducir la generación de anticuerpos (el título de anticuerpos del suero inmune (GMT) podía alcanzar 102-105 o más alto) en ratones; y, excepto 26-271, los títulos de anticuerpos inducidos por las otras muestras de proteínas fueron más altos que el título de anticuerpos inducido por RV (1-476, 6-476, 22-476, 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-471, 26-476, 26-487, 26-492, trímero de 26-476 y polímero de 26-476), o eran al menos comparables al título de anticuerpos inducido por RV (65-476, 26-482 y 26-497).
Puede observarse al combinar los resultados experimentales del Ejemplo 1 que, en presencia de adyuvante de aluminio, todas las muestras de proteínas (excepto 26-271) tenían buena inmunogenicidad y podían estimular la generación de anticuerpos de alto título en ratones; su inmunogenicidad fue significativamente mayor que la de VP8-5, y el título de anticuerpos en el suero inmune fue significativamente mayor que en el suero de los ratones inmunizados con VP8-5. Además, los resultados experimentales de la Fig. 11D también muestran que la inmunogenicidad del polímero de la proteína truncada 26-476 fue significativamente mayor que la del trímero de 26-476 (p = 0,005).
Ejemplo 9: Análisis de la actividad inmuno neutralizante de la proteína VP4 truncada
Mediante el método descrito en el Ejemplo 1, los ratones Balb/c del grupo experimental (7 ratones por grupo) se inmunizaron con la muestra a ensayar (las proteínas VP4 truncadas y el trímero de 26-476 obtenido en el Ejemplo 4, el polímero de 26-476 obtenido en el Ejemplo 5, el virus inactivado (RV, como control positivo) y PBS (NC, control negativo)), respectivamente, y los sueros inmunes se recogieron.
Posteriormente, según el método de detección como se describe en el Ejemplo 1, las muestras de suero inmune recogidas se evaluaron para determinar el título de anticuerpos neutralizantes. Los resultados analíticos del título de anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunes se muestran en las Figs. 12A-12D, en las que la abscisa representa la cepa de virus de la que derivó la muestra de proteína para preparar suero inmune; la ordenada representa la mayor dilución (NT50, título de anticuerpos neutralizantes) del suero inmune que logra una tasa de inhibición de la infección del 50%. Las Figs. 12A, 12B, 12C y 12D mostraron los resultados de diferentes lotes de inmunización. Los resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización (después de tres inmunizaciones), todas estas muestras de proteínas podían inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en ratones, y su título de anticuerpos neutralizantes (NT50) podía alcanzar 28-214 o mas alto; y, excepto 26-271, el título de anticuerpos neutralizantes inducido por las otras muestras de proteínas fue comparable al título de anticuerpos neutralizantes inducido por RV ((6-476, 22-476, 26-476, 65-476, 26-471,26-482, 26-487, 26-492, 26-497 y trímero de 26-476), o incluso mayor que el título de anticuerpos neutralizantes inducido por RV (1 -476, 26-331, 26-351,26-381, 26-411, 26-441,26-461 y polímero de 26-476).
Puede verse al combinar los resultados experimentales en el Ejemplo 1 que, en presencia de adyuvante de aluminio, todas las muestras de proteínas (excepto 26-271) tenían una fuerte capacidad para inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo, y podían inducir suero inmune que tiene un alto título de anticuerpos neutralizantes en animales, y el suero inmune podía inhibir eficazmente la infección por rotavirus. Las muestras de proteínas (excepto 26-271) fueron superiores a VP8-5 en términos de la capacidad para inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo, y por lo tanto tenían una mayor capacidad para combatir/prevenir la infección por RV. Además, los resultados experimentales de la Fig. 12D también mostraron que el polímero de la proteína truncada 26-476 era significativamente superior al trímero de 26-476 en términos de la capacidad para inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo (p<0,001), y tenía una capacidad significativamente mayor para combatir/prevenir la infección por RV.
Ejemplo 10: Evaluación del efecto protector de la proteína VP4 truncada en animales
Utilizando el método como se describe en el Ejemplo 1, ratones Balb/c (7 ratones por grupo) se inmunizaron con las muestras a ensayar (las proteínas VP4 truncadas y el trímero de 26-476 obtenido en el Ejemplo 4, el polímero de 26­ 476 obtenido en el Ejemplo 5, el virus inactivado (RV, como control positivo) y PBS (NC, control negativo)), respectivamente, y los sueros se recogieron.
Según el método como se describe en el Ejemplo 1, la muestra de proteína se evaluó para determinar su efecto protector en el animal. Excepto los grupos inmunizados con 1-476 y 6-476 (el apareamiento de los animales en los dos grupos no fue exitoso), los resultados experimentales de los otros grupos de inmunización se muestran en las Figs. 13-14.
Las Figs. 13A-13D mostraron las puntuaciones de la diarrea de ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 22-476, 26-476, 65-476, 26-271,26-331,26-351,26-381,26-411,26-441, 26-461,26-471,26-482, 26-487, 26-492, 26-497, trímero de 26-476, polímero de 26-476, rotavirus inactivado (RV, control positivo) o PBS (NC, control negativo)) 1 -7 días después de la exposición a un virus, en las que el eje de ordenadas representa la puntuación media de la diarrea; el eje de abscisas representa días después de la exposición a un virus en ratones; RV: rotavirus inactivado; NC: control negativo (PBS); trímero: trímero de 26-476; polímero: polímero de 26-476. Las Figs. 14A-14D mostraron la duración media de la diarrea después de la exposición a un virus y las puntuaciones medias de la diarrea 48 h después de la exposición a un virus en los ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 22-476, 26-476, 65-476, 26-271, 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-471, 26-482, 26-487, 26­ 492, 26-497, trímero de 26-476, polímero de 26-476, rotavirus inactivado (RV, control positivo) o PBS (NC, control negativo)), en las que la duración media (días) de la diarrea se representa mediante un diagrama de barras; la puntuación media de la diarrea está representada por un gráfico de curva; el eje izquierdo de ordenadas representa la duración media (días) de la diarrea; el eje derecho de ordenadas representa la puntuación de la diarrea; el eje de abscisas representa los grupos de inmunización correspondientes con las muestras de proteínas.
Los resultados mostraron que en términos de la puntuación media de la diarrea y la duración media (días) de la diarrea, los grupos de inmunización correspondientes con las muestras de proteínas fueron superiores al grupo NC. Esto indicó que las muestras de proteínas tenían un efecto protector significativo y podían ayudar a los ratones a combatir la infección por rotavirus y la diarrea causada por la infección por rotavirus. Además, los resultados mostraron adicionalmente que los efectos protectores de 26-331, 26-351, 26-381, 26-411, 26-441, 26-461, 26-476, trímero de 26-476 y polímero de 26-476 eran comparables a los de RV, o incluso mejores que los de RV. Según los resultados experimentales del Ejemplo 1, en presencia de adyuvante de aluminio, los efectos protectores de estas muestras de proteínas fueron superiores a los de VP8-5 en animales. Además, los resultados experimentales de las Figs. 13D y la Fig. 14D también mostraron que el efecto protector del polímero de la proteína truncada de 26-476 fue significativamente superior al del trímero de 26-476 en animales, y podía usarse para preparar vacunas que tengan una mayor eficacia.
Ejemplo 11: Evaluación de la expresión, purificación e inmunoprotección de las proteínas VP4 truncadas de diferentes cepas de virus
Basado en la secuencia del gen VP4 de la cepa del virus EDIM (Número de Acceso: AF039219.2) como se proporciona en Gene bank, el fragmento del gen que codifica 26-476 de la cepa EDIM del rotavirus se sintetizó por Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Además, basado en la secuencia del gen VP4 del rotavirus P[6] (Número de Acceso: : FJ183356.1) como se proporciona en Gene bank, el fragmento del gen que codifica 26-476 del rotavirus P[6] se sintetizó por Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Posteriormente, los fragmentos de genes sintetizados se utilizaron como moldes, y los fragmentos de genes que codifican la proteína truncada 26-476 de rotavirus P[6] y EDIM se obtuvieron mediante amplificación por PCR.
Además, como se describe en el Ejemplo 2, la cepa de rotavirus SA11 se cultivó con una línea celular de riñón de mono rhesus fetal (MA-104), para obtener el cultivo de virus de rotavirus SA11. Los rotavirus P[4] y P[8] derivaron de las muestras de diarrea recolectadas por el Children’s Hospital of Chongqing Medical University, con un número de muestra de 20131281 (P[4]) y un número de muestra de 20131028 (P[8]).
Según las instrucciones del fabricante, el Virus DNA/RNA Kit producido por Beijing GenMag Biotechnology Co., Ltd. se utilizó para extraer los ARN genómicos de rotavirus SA11, P[4] y P[8] de cultivos de virus o muestras de virus, y los ADNc que codifican las proteínas VP4 de diferentes cepas de virus se obtuvieron mediante transcripción inversa. Los ADNc obtenidos se utilizaron como moldes, y los fragmentos de genes que codifican la proteína truncada 26-476 de las cepas de rotavirus SA11, P[4] y P[8] se obtuvieron mediante amplificación por PCR.
Según el método como se describe en el Ejemplo 2, se construyeron plásmidos clonales y vectores de expresión, en los que los cebadores de PCR utilizados fueron los siguientes:
cebador en dirección 5’:
5’-GGATCCCATATGGGATCGGAGAAAACTCAA-3’ (SEQ ID NO: 77)
5’-GGATCCCATATGGGATCAGAGAAAAGTCAAAAT-3’(SEQ ID NO: 79)
5’-GGATCCCATATGGGATCAGAAAAAACTCAAAATG-3’(SEQ ID NO: 81)
5’-GGATCCCATATGGGAGCAGAGAAGACACA-3’(SEQ ID NO: 83)
5’-GGATCCCATATGGGATCAACTAAATCACAAAATG-3’ (SEQ ID NO: 85)
cebador en dirección 3’:
5’-AAGC7TAATTAGTTGGAACTAAAGAAATAAGT-3’ (SEQ ID NO: 78)
5’-AAGCTTAATTAGACGGTACTAATGAAA-3’ (SEQ ID NO: 80)
5’-AAGCTTAGTTGGTTGGAACTAAAGAAA-3’ (SEQ ID NO: 82)
5’-AAGCTTAATCGTTGGACGGCAC-3’ (SEQ ID NO: 84)
5’-AAGCTTATGATGGCACTAATGATATAAGT-3’ (SEQ ID NO: 86)
en los que las secuencias subrayadas indican los sitios de reconocimiento enzimático, y las letras en cursiva indican los codones terminadores introducidos.
Los pares de cebadores para la amplificación de fragmentos de genes se muestran en la Tabla 5:
Tabla 5: Pares de cebadores para la amplificación de fragmentos de genes que codifican 26-476 de diferentes cepas de virus
Proteína Cebador en dirección 5’ Cebador en dirección 3’
26-476-P[4] SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 78
26-476-P[6] SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 80
26-476-P[8] SEQ ID NO: 81 SEQ ID NO: 82
26-476-EDIM SEQ ID NO: 83 SEQ ID NO: 84
26-476-SA11 SEQ ID NO: 85 SEQ ID NO: 86
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas truncadas 26-476-P[4], 26-476-P[6], 26-476-P[8], 26-476-EDIM, and 26-476-SA11 se exponen en SEQ ID NOs: 35-39, respectivamente.
Según los métodos descritos en los Ejemplos 3-4, la proteína truncada 26-476 de diferentes cepas de virus (es decir, 26-476-P[4], 26-476-P[6], 26-476-P[8], 26-476-EDIM, 26-476-SA11) se expresó en E. coIí, y se purificó por cromatografía de dos etapas; y la proteína purificada se identificó mediante SDS-PAGE.
Los resultados de SDS-PAGE se muestran en la Fig. 15, en la que los carriles de izquierda a derecha son: la proteína truncada 26-476 del rotavirus LLR; la proteína truncada 26-476-SA11 del rotavirus SA11; la proteína truncada 26-476­ EDIM del rotavirus EDIM; la proteína truncada 26-476-P[8] del rotavirus P[8]; la proteína truncada 26-476-P[6] del rotavirus P[6]; la proteína truncada 26-476-P[4] del rotavirus P[4]; y Marcador de Peso Molecular de Proteínas (Marcador).
Los resultados mostraron que el método según la invención era aplicable a diferentes cepas de virus. La proteína VP4 truncada (26-476) de diferentes cepas de virus podía expresarse eficazmente en E. coIí, y tenía una pureza superior al 80% después de la purificación por cromatografía.
Además, según el método descrito en el Ejemplo 4, se usó HPLC para analizar la homogeneidad de la proteína truncada 26-476 purificada en presencia de TB8.050 mM. Los resultados analíticos de SEC-HPLC se muestran en la Fig. 16.
Los resultados mostraron que en presencia de TB8.0, las proteínas VP4 truncadas 26-476 de diferentes cepas de virus tenían un tiempo de retención de alrededor de 13-14 min, que era comparable al tiempo de retención de IgG (150 kDa); esto indicó que estas proteínas estaban presentes principalmente en forma de trímero. Además, los resultados de la Fig. 16 también mostraron que los principales picos de absorción de las proteínas truncadas 26-476 obtenidas representaron casi más del 80%, lo que indica que estas proteínas truncadas tenían buena homogeneidad, eran adecuadas para la producción industrial en lotes, y eran buenas para medicación precisa.
Además, la proteína truncada 26-476 de diferentes cepas de rotavirus se recubrió sobre una placa, para obtener la placa recubierta. Según el método como se describe en el Ejemplo 1, se inmunizaron ratones Balb/c con la proteína 26-476 truncada purificada obtenida anteriormente (es decir, 26-476-P[4], 26-476-P[6], 26-476-P[8], 26-476-EDIM, 26-476-SA11,26-476 de LLR, y PBS (control negativo)), y los sueros de los ratones se recogieron. Posteriormente, según el método como se describe en el Ejemplo 1, los títulos de anticuerpos en los sueros de ratones se determinaron mediante ELISA indirecto utilizando la placa recubierta.
Los resultados del ELISA indirecto se muestran en la Fig. 17, en la que la abscisa representa la cepa del virus de la que derivó la proteína truncada para preparar el suero inmune, y la ordenada representa la mayor dilución (es decir, el título de anticuerpos) del suero inmune que tiene reactividad con la proteína truncada correspondiente; P[4]: 26-476-P[4]; P[6]: 26-476-P[6]; P[8]: 26-476-P[8]; SA11: 26-476-SA11; EDIM: 26-476-EDIM; LLR: 26-476 preparadas en el Ejemplo 4.
Los resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización, todas estas proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus podían inducir la generación de anticuerpos en ratones, y los títulos de anticuerpos (GMT) en los sueros inmunes inducidos de ese modo fueron comparables (el título de anticuerpos podía alcanzar 104-105 o más alto, mucho mayor que el del grupo de control negativo). Estos resultados indicaron que en presencia de adyuvante de aluminio, las proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus tenían buena inmunogenicidad y podían inducir eficazmente la generación de anticuerpos en animales; y las proteínas 26-476 derivadas de diferentes cepas de virus fueron sustancialmente comparables en términos de inmunogenicidad, y fueron superiores a VP8-5.
Además, utilizando el método como se describe en el Ejemplo 1, se inmunizaron ratones Balb/c (7 ratones por grupo) en el grupo experimental con la proteína 26-476 de diferentes cepas de virus (26-476-SA11; 26-476-EDIM; 26-476 de LLR), y los sueros inmunes se recogieron. Posteriormente, según el método descrito en el Ejemplo 1, cada muestra de suero inmune recogida se evaluó para determinar el título de anticuerpos neutralizantes. Los resultados analíticos del título de anticuerpos neutralizantes de los sueros inmunes se muestran en la Fig. 18, en la que la abscisa representa la cepa de virus de la que se obtuvo la muestra de proteína para preparar el suero inmune; y la ordenada representa la mayor dilución (NT50, título de anticuerpos neutralizantes) del suero inmune que logra una tasa de inhibición de la infección del 50%; SA11: 26-476-SA11; EDIM: 26-476-e DiM; LLR: 26-476 preparadas en el Ejemplo 4.
Los resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, en el Día 42 después de la inmunización (después de tres inmunizaciones), todas las proteínas 26-476 derivadas de las cepas de virus SA11, EDIM y LLR podían inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título en ratones, y su título de anticuerpos neutralizantes (NT50) podía alcanzar 210-214 o mas alto; y los títulos de anticuerpos neutralizantes inducidos por 26-476-SA11 y 26-476-EDIM fueron incluso mayores que los inducidos por 26-476 derivada de LLR. Por lo tanto, la actividad inmuno neutralizante de la proteína 26-476 de la cepa del virus SA11 y la cepa del virus EDIM fue incluso superior a la de la proteína 26-476 de LLR.
Además, también se puede demostrar mediante métodos similares que la proteína 26-476 del rotavirus P[4], P[6] y P[8] tenía una buena actividad inmuno neutralizante, y podía inducir la generación de anticuerpos neutralizantes de alto título en ratones.
Estos resultados mostraron que en presencia de adyuvante de aluminio, la proteína 26-476 de diferentes cepas de virus tenía una fuerte capacidad para inducir la generación de anticuerpos neutralizantes en un organismo, y podía inducir que el suero inmune tuviera un alto título de anticuerpos neutralizantes en el animal.
Además, utilizando el método como se describe en el Ejemplo 1, se inmunizaron ratones Balb/c (7 ratones por grupo) con la proteína 26-476 de diferentes cepas de virus (26-476-SA11 ,26-476-EDIM, y PBS (NC, control negativo)), y los sueros se recogieron. Posteriormente, según el método como se describe en el Ejemplo 1, la muestra de proteína se evaluó para determinar su efecto protector en el animal. Los resultados experimentales se muestran en las Figs. 19A-19B.
La Fig. 19A mostró las puntuaciones de la diarrea de ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados con 26-476-SA11 o PBS (NC, control negativo)) 1 -7 días después de la exposición al virus SA11; la Fig. 19B muestra las puntuaciones de la diarrea de ratones lactantes en diferentes grupos de inmunización (inmunizados

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína VP4 de rotavirus truncada, en la que, en comparación con una proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25-64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a cualquier posición entre las posiciones de aminoácidos 276-497 de SEQ ID NO: 40.
2. La proteína VP4 de rotavirus truncada según la reivindicación 1, en la que, en comparación con la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25-64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal; y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a cualquier posición entre las posiciones de aminoácidos 281-497, 291-497, 301 -497, 311 -497, 321 -497, 331 -497, 341 -497, 351 -497, 361 -497, 371 -497, 381 -497, 391 -497, 401 -497, 411 -497, 421 -497, 431-497, 441-497, 451-497, 461-497, 471-497, 476-497, 482-497, 487-497, o 492-497 de SEQ ID NO: 40.
3. La proteína VP4 de rotavirus truncada según la reivindicación 1, en la que, en comparación con la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25 o 64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición de la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje: una posición correspondiente a la posición de aminoácido 281, 291, 301, 311,321,331,341, 351, 361,371, 381,391,401,411,421,431,441,451,461,471,476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40.
4. La proteína VP4 de rotavirus truncada según la reivindicación 1, en la que, en comparación con la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición: una posición correspondiente a la posición de aminoácido 331,351,381,411,441,461,471,476, 482, 487, 492 o 497 de SEQ ID NO: 40; o, la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene 25 o 64 aminoácidos truncados en el extremo N-terminal, y tiene el extremo C-terminal terminado en la siguiente posición: una posición correspondiente a la posición de aminoácido 476 de la SEQ ID NO: 40.
5. La proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje es una proteína VP4 derivada de la cepa LLR, cepa SA11 o cepa EDIM de rotavirus, o una proteína VP4 derivada de un rotavirus de genotipo P[4], P[6] o P[8].
6. La proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la proteína VP4 de rotavirus de tipo salvaje tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 40 y 87-91.
7. La proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la proteína VP4 de rotavirus truncada tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 5 y 10-39.
8. Un ácido nucleico aislado, que codifica la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado según la reivindicación 8.
10. Una célula hospedante que comprende el ácido nucleico aislado según la reivindicación 8 o el vector según la reivindicación 9.
11. Un polímero que consiste en la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicho polímero es opcionalmente un trímero.
12. Una composición que comprende la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o el ácido nucleico aislado según la reivindicación 8, o el vector según la reivindicación 9, o la célula hospedante según la reivindicación 10, o el polímero según la reivindicación 11.
13. Una composición farmacéutica, que comprende la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el polímero según la reivindicación 11, y opcionalmente, un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable,
preferiblemente, la composición farmacéutica se caracteriza además por uno o más de los siguientes apartados:
(1) la composición farmacéutica comprende además un adyuvante, por ejemplo, adyuvante de aluminio;
(2) la proteína truncada o el polímero está presente en una cantidad eficaz para prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por la infección por rotavirus; y
(3) la composición farmacéutica comprende además un ingrediente activo adicional, tal como un ingrediente activo adicional capaz de prevenir o tratar la infección por rotavirus o una enfermedad causada por la infección por rotavirus.
14. Una vacuna, que comprende la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 o el polímero según la reivindicación 11, y opcionalmente un adyuvante, por ejemplo adyuvante de aluminio.
15. Un método para preparar la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende, en una condición que permite la expresión de la proteína truncada, cultivar la célula hospedante según la reivindicación 10; y recuperar la proteína truncada expresada,
preferiblemente, el método comprende las siguientes etapas de: usar E. coIí para expresar la proteína truncada, y después lisar E. coIí, y purificar la proteína truncada del lisado, preferiblemente, la purificación incluye cromatografía.
16. Un método para preparar una vacuna, que comprende mezclar la proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el polímero según la reivindicación 11 con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, con un adyuvante, preferiblemente adyuvante de aluminio y/o un ingrediente activo adicional, tal como un ingrediente activo adicional capaz de prevenir o tratar una infección por rotavirus o una enfermedad causada por una infección por rotavirus.
17. La proteína VP4 de rotavirus truncada según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el polímero según la reivindicación 11, para uso en la prevención o el tratamiento de una infección por rotavirus o una enfermedad causada por una infección por rotavirus en un sujeto,
preferiblemente, la enfermedad causada por la infección por rotavirus es gastroenteritis o diarrea por rotavirus;
preferiblemente, el sujeto es un mamífero, tal como un ratón y un ser humano.
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