ES2899110T3 - Identificación de ligandos por cofraccionamiento - Google Patents

Identificación de ligandos por cofraccionamiento Download PDF

Info

Publication number
ES2899110T3
ES2899110T3 ES17725620T ES17725620T ES2899110T3 ES 2899110 T3 ES2899110 T3 ES 2899110T3 ES 17725620 T ES17725620 T ES 17725620T ES 17725620 T ES17725620 T ES 17725620T ES 2899110 T3 ES2899110 T3 ES 2899110T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ligands
macromolecules
ligand
macromolecule
determining
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17725620T
Other languages
English (en)
Inventor
Aleksandra Skirycz
Sylwia Kierszniowska
Daniel Veyel
Lothar Willmitzer
Monika Chodasiewicz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Application granted granted Critical
Publication of ES2899110T3 publication Critical patent/ES2899110T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/34—Purifying; Cleaning
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/088—Assessment or manipulation of a chemical or biochemical reaction, e.g. verification whether a chemical reaction occurred or whether a ligand binds to a receptor in drug screening or assessing reaction kinetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

Un método para determinar ligandos de macromoléculas en una muestra, en donde dicha muestra es un extracto celular sin células, dicho método comprende o consiste en (a) someter dicha muestra que comprende (i) complejos formados por dichas macromoléculas y dichos ligandos y (ii) ligandos sin unir a un método que separa dichos complejos de dichos ligandos sin unir, en donde dicho método da fracciones y en donde dicho método es cromatografía de exclusión molecular (SEC); (b) liberar ligandos de los complejos obtenidos en la etapa (a); y (c) someter los ligandos liberados obtenidos en la etapa (b) a un método de análisis químico, determinando de esta manera dichos ligandos de dichas macromoléculas; (d) determinar una o más macromoléculas que estaban unidas a los ligandos por un análisis químico; en donde dicho método comprende además la etapa de (e) determinar qué ligando se une a qué macromolécula determinando la cantidad de un ligando determinado en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicho ligando determinado, determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicha macromolécula y comparando los perfiles de elución obtenidos de ligandos con tales perfiles de elución obtenidos de macromoléculas.

Description

DESCRIPCIÓN
Identificación de ligandos por cofraccionamiento
Esta invención se refiere a un método de determinar ligandos de macromoléculas en una muestra, en donde dicha muestra es un extracto celular sin células, dicho método comprende o consiste en
(a) someter dicha muestra que comprende (i) complejos formados por dichas macromoléculas y dichos ligandos y (ii) ligandos sin unir a un método que separa dichos complejos de dichos ligandos sin unir, en donde dicho método da fracciones y en donde dicho método es cromatografía de exclusión molecular (SEC);
(b) liberar ligandos de los complejos obtenidos en la etapa (a); y
(c) someter los ligandos liberados obtenidos en la etapa (b) a un método de análisis químico, determinado mediante ello dichos ligandos de dichas macromoléculas;
(d) determinar una o más macromoléculas que estaban unidas a los ligandos por un análisis químico;
en donde dicho método comprende además la etapa de
(e) determinar qué ligando se une a qué macromolécula determinando la cantidad de un ligando determinado en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicho ligando determinado, determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de dichas fracciones, obteniendo mediante ello un perfil de elución de dicha macromolécula y comparando los perfiles de elución obtenidos de ligandos con tales perfiles de elución obtenidos de macromoléculas.
Los últimos años han traído avances significativos en las llamadas técnicas “ómicas” que permiten la cuantificación simultánea de miles de moléculas biológicas incluyendo transcritos, proteínas y metabolitos (Joyce & Palsson, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 198-210 (2006)). Estas moléculas presentan componentes básicos de vida, pero es sus interacciones lo que permite la vida. El análisis a gran escala de complejos moleculares es así uno de los siguientes grandes desafíos que se tiene que abordar. Entre estos, el análisis de los interactomas proteína-metabolito (PMI) es particularmente problemático considerando la gran diversidad de moléculas pequeñas, en particular su detección, identificación e inmovilización cuando se usan como cebo. No obstante, la importancia de los PMI, tanto para investigación académica como descubrimiento de fármacos, ha dirigido el desarrollo de métodos para el análisis de PMI (Li et al., Cell 143, 639-50 (2010); Savitski et al., Science 346, 1255784 (2014)). En general, los enfoques existentes incluyen los que usan una molécula pequeña como cebo para “pescar” proteínas que interaccionan (Maeda et al., Nat. Protoc. 9, 2256-66 (2014)) o viceversa (Hulce et al., Nat. Methods 10, 259-264 (2013); Reinhard et al., Nat. Methods 12, 1129-1131 (2015)). Tales ensayos proporcionan un modo eficaz para caracterizar complejos proteínametabolito cuando al menos uno de los compañeros de interacción es conocido. Sin embargo, están limitados en que solo permiten que se detecte interacciones uno a uno.
Los compuestos bioactivos (incluyendo fármacos) son moléculas pequeñas que ejercen una función deseada en un sistema biológico determinado modulando el estado del sistema en una dirección deseada. Representan los ingredientes clave en las industrias tanto farmacéutica, agroquímica como de bioingeniería (industria de las ciencias de la vida) superando su volumen de negocio 1 trillón de euros al año.
Con el fin de desarrollar nuevos fármacos para el mercado de las ciencias de la vida, se tienen que superar numerosos obstáculos tanto en la fase de desarrollo y entrada al mercado como en la fase de descubrimiento inicial.
Respecto a la fase de descubrimiento, se obtienen moléculas iniciales (cabezas de serie) para nuevos fármacos basados en moléculas pequeñas siguiendo una de las dos rutas principales: (1) Se aplican numerosas moléculas pequeñas a un sistema biológico determinado y se sigue la respuesta del sistema/su fenotipo. Las moléculas pequeñas que inducen la respuesta/fenotipo deseado se optimizan químicamente y su diana molecular en el sistema biológico se aclara. (2) Se identifica una diana macromolecular (en la mayoría de los casos una proteína o un ARN) que necesita ser modulada con el fin de alcanzar la respuesta del sistema/fenotipo. En el caso del segundo enfoque un reto clave está en la identificación de moléculas pequeñas que influyen la actividad de la macromolécula diana en la manera deseada. Para este fin se criban bibliotecas (químicas) exhaustivas de hasta varios millones de compuestos diversos para su capacidad para modular la actividad de la diana usando cribados de alto rendimiento (HTS).
Este proceso de identificar un compuesto que tiene la capacidad de modular la actividad de la diana macromolecular y por tanto sirve como un compuesto inicial para desarrollar el fármaco definitivo padece dos defectos.
(1) Por regla general, se aplican compuestos exógenos al sistema biológico en estudio. Los ejemplos son bibliotecas de compuestos que consisten en millones de compuestos químicamente sintetizados o (bibliotecas de) compuestos naturales que en la mayoría de los casos derivan de diferentes sistemas biológicos (por ejemplo, plantas o microorganismos). Los organismos diana en la industria farmacéutica, por el contrario, son seres humanos, respectivamente animales (en su mayor parte mamíferos) en la industria veterinaria. Una razón para este uso minoritario de compuestos endógenos como compuestos iniciales es el conocimiento muy limitado sobre los compuestos endógenos presentes en sistemas humanos que regulan la actividad de entidades macromoleculares tal como proteínas, ARN y similares.
(2) Como se ha descrito anteriormente, se han desarrollado HTS que permiten el cribado de varios millones de compuestos con respecto a su capacidad para modular la actividad de una macromolécula diana determinada (proteína, ARN). A pesar de su naturaleza de alto rendimiento, este proceso requiere mucho tiempo y como regla se hace ensayando un compuesto después de otro en ensayos distintos. Solo recientemente, se han introducido enfoques novedosos que permiten el ensayo de mezclas de compuestos. Un procedimiento ejemplar, que se basa en la adición de etiquetas de ADN al compuesto químico (véase, por ejemplo, Mullard, Nature 530, 367-369 (2016), demuestra ser de ventaja principal, sin embargo, padece de dos problemas inherentes: (i) solo es aplicable a bibliotecas de compuestos químicamente sintetizados; y (ii) la adición de la etiqueta de ADN produce un cambio en la estructura del compuesto produciendo de esta manera falsos negativos y falsos positivos durante el cribado. Con respecto a la primera limitación, esto significa que los compuestos naturales que tienen la mayor tasa de acierto en los cribados están excluidos.
El documento WO2014/082083 describe un método para seleccionar aptámeros que se unen a una molécula diana determinada. El documento WO 2006/015796 describe un método de cribado de alto rendimiento de moléculas de prueba que se unen a una molécula diana predeterminada. El documento US 2015/105280 describe un método (es decir, un inmunoensayo) para detectar una multitud de analitos predeterminados, en particular antígenos, en una muestra usando para la detección de los analitos (antígenos) anticuerpos.
En vista de los defectos del estado de la técnica, el problema técnico que subyace a la presente invención se puede ver en la provisión de medios y métodos mejorados o alternativos para esclarecer interacciones intermoleculares en sistemas biológicos o identificar moduladores de macromoléculas biológicas.
La presente invención, en un primer aspecto, se refiere a un método de determinar ligandos de macromoléculas en una muestra, en donde dicha muestra es un extracto celular sin células, dicho método comprende o consiste en
(a) someter dicha muestra que comprende (i) complejos formados por dichas macromoléculas y dichos ligandos y (ii) ligandos sin unir a un método que separa dichos complejos de dichos ligandos sin unir, en donde dicho método da fracciones y en donde dicho método es cromatografía de exclusión molecular (SEC);
(b) liberar ligandos de los complejos obtenidos en la etapa (a); y
(c) someter los ligandos liberados obtenidos en la etapa (b) a un método de análisis químico, determinado mediante ello dichos ligandos de dichas macromoléculas;
(d) determinar una o más macromoléculas que estaban unidas a los ligandos por un análisis químico;
en donde dicho método comprende además la etapa de
(e) determinar qué ligando se une a qué macromolécula determinando la cantidad de un ligando determinado en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicho ligando determinado, determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de dichas fracciones, obteniendo mediante ello un perfil de elución de dicha macromolécula y comparando los perfiles de elución obtenidos de ligandos con tales perfiles de elución obtenidos de macromoléculas.
El término “ligando” según la invención designa una molécula que es capaz de unirse a una macromolécula de la invención, las macromoléculas se definen más adelante. La unión de ligandos a macromoléculas es directa en el sentido de que se produce una interacción química y/o fisicoquímica entre ligando y macromolécula. Dichas interacciones químicas y fisicoquímicas preferiblemente se seleccionan de interacciones dipolo-dipolo, interacciones dipolo-carga, interacciones carga-carga, interacciones de van der Waals, interacciones hidrofóbicas, interacciones de apilamiento e interacciones covalentes. En términos generales, la interacción entre ligando y macromolécula puede ser covalente o no covalente. Se da preferencia a las interacciones no covalentes.
En términos generales, pero no necesariamente, un ligando es menor, preferiblemente al menos un orden de magnitud menor, que una macromolécula en términos de su masa molecular.
Los ligandos pueden ser ligandos análogos. El término “ligando análogo” designa un ligando que interacciona en condiciones fisiológicas o in vivo con una macromolécula, el ligando en general está formado por la maquinaria biosintética del sistema biológico determinado. Los ligandos según la invención pueden ser ligandos análogos, pero no tienen que serlo. Por ejemplo, se puede encontrar que un compuesto xenobiótico, es decir, un compuesto que no se produce en la naturaleza, especialmente no en un marco in vivo, es un ligando de una macromolécula.
Sin embargo, se espera que compuestos endógenos, es decir, ligandos análogos, tengan un número de ventajas tal como menor toxicología y mayor especificidad ya que son el resultado de selección evolutiva en el sistema biológico en estudio.
En términos de potencia de unión, se prefiere que la constante de disociación Kd del complejo ligando-macromolécula esté en o por debajo del intervalo micromolar de dos dígitos, es decir, menor de 100 pM. Preferiblemente, la Kd es menor de 10 pM, menor de 1 pM, menor de 100 nM, menor de 10 nM, menor de 1 nM, menor de 100 pM, o menor de El término “ligando sin unir” se refiere a ligandos que no están unidos a macromoléculas. El término comprende moléculas que no son capaces de unirse a ninguna macromolécula presente en la muestra sometida al método según el primer aspecto. Además, el término, en su sentido más amplio, se extiende a esas moléculas que son capaces de unirse a una macromolécula, pero no se producen en forma unida, por ejemplo, por razones termodinámicas tal como la presencia del ligando respectivo en exceso.
En una forma de realización preferida, el término “ligando sin unir” designa solo aquellas moléculas que no son capaces de unirse a ninguna macromolécula presente en la muestra independientemente de las cantidades de macromoléculas y ligando. Estas son moléculas, en general menores que las macromoléculas (como se ha indicado anteriormente), que no interaccionan con macromoléculas comprendidas en la muestra.
Una macromolécula según la invención es una molécula que es mayor que el ligando definido anteriormente en términos de su masa molecular. En general, la macromolécula es significativamente mayor que el ligando, preferiblemente en uno, dos o más órdenes de magnitud. El término “orden de magnitud” corresponde a un factor de 10. Se da preferencia a las macromoléculas biológicas. Las macromoléculas biológicas son moléculas grandes como se producen en sistemas biológicos. Las macromoléculas biológicas, en general, son polímeros o policondensados de componentes básicos menores. Un tipo particularmente preferido de macromolécula es un polipéptido. También son preferidos los ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos incluyen tanto ADN como ARN, siendo preferido ARN.
En un sentido estricto, el término “macromolécula” designa una única molécula. En un sentido más amplio, también están abarcadas arquitecturas moleculares más complejas por el término “macromolécula”. Los ejemplos de arquitecturas más complejas incluyen esas moléculas o ensamblajes moleculares donde más de un polímero o policondensado están unidos entre sí. La forma en que dos o más polímeros o policondensados están unidos entre sí puede ser covalente y/o no covalente. Un ejemplo de un ensamblaje molecular covalente que también está en el término “macromolécula” según la presente invención es insulina. Como se sabe en la técnica, la insulina comprende dos cadenas polipeptídicas que están unidas por puentes disulfuro. Un ejemplo de un ensamblaje molecular no covalente que también satisface los requisitos del término “macromolécula” según la presente invención es hemoglobina que un heterotetrámero no covalente a2p2. Según esto, se entiende que el término “macromolécula” incluye dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, y oligómeros de orden superior de polímeros o policondensados que son o bien idénticos entre sí o diferentes entre sí, dando lugar de esta manera a homooligómeros o heterooligómeros, respectivamente. También en este contexto particular, se da preferencia a esos policondensados que son polipéptidos.
El término “macromolécula” también se extiende a orgánulos, especialmente a esos orgánulos que algunas veces se denominan “orgánulos menores”. Los orgánulos menores incluyen proteasomas y ribosomas. Según esto, se entiende que el término “macromolécula” se extiende a esos ensamblajes macromoleculares que comprenden tanto polipéptidos como ácidos nucleicos (en el caso del ribosoma ARN). El término también incluye orgánulos principales tal como mitocondrias y cloroplastos.
Se debe indicar que ligando y macromolécula pueden ser de la misma clase de compuesto, sin embargo, preferiblemente se diferencian en peso molecular en al menos un factor de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, más preferiblemente al menos 100. Por ejemplo, el ligando puede ser un péptido y la macromolécula un polipéptido. Habiendo dicho eso, también se prevé investigar interacciones ligando-macromolécula donde ligando y macromolécula son exclusivamente de arquitectura molecular diferente. Esto aplicaría a un escenario donde se investigan ligandos de molécula orgánica pequeña que no son de naturaleza peptídica para su capacidad de unión a una macromolécula proteinacea.
El término “muestra” empleado en el método según la presente invención es un extracto celular sin células. Debido a la definición del término “macromolécula” como se ha dado anteriormente, la muestra no tiene que ser un líquido transparente, pero puede serlo. Además, puede ser una suspensión de ensamblajes macromoleculares y/u orgánulos.
Dicha muestra puede comprender, además de los complejos y ligandos, macromoléculas sin ligandos, también denominadas macromoléculas sin unir.
Se indica que el método según el primer aspecto no requiere poner en contacto macromoléculas con ligandos. De hecho, dicha muestra es un extracto celular sin células y se puede originar de células, tejido u organismos. En estos sistemas biológicos en general hay presencia tanto de macromoléculas como de ligandos, los ligandos incluyen o están confinados a ligandos análogos de macromoléculas presentes en la muestra.
La etapa (a) del método del primer aspecto define un método analítico. La etapa (a) puede, pero no tiene que realizarse en columnas. De forma importante, el método de etapa (a) proporciona separar ligandos sin unir de ligandos unidos, los ligandos unidos están presentes en forma de los complejos enumerados.
En general, pero no necesariamente, los ligandos por una parte tienen un peso molecular pequeño en comparación tanto con los complejos como las macromoléculas sin unir. Como tal, la etapa (a) puede dar, tras la eliminación de dichos ligandos, una mezcla de complejos y macromoléculas sin unir, en la medida que las últimas están presentes.
Una vez se separan los ligandos sin unir de los complejos, el método de la invención según el primer aspecto prosigue para liberar ligandos de macromoléculas.
Dado que los ligandos sin unir ya se eliminaron en la etapa (a), se deduce que la mezcla obtenida en la etapa (b) contiene solo esos ligandos que inicialmente estaban presentes en forma de complejos, es decir, unidos a macromoléculas.
La etapa (c) del método del primer aspecto proporciona determinar dichos ligandos. Los métodos preferidos de análisis químico se divulgan posteriormente. Especialmente preferido es la espectrometría de masas (EM).
El método según el primer aspecto ni está limitado a un único ligando o un número pequeño de ligando, ni está limitado a una única macromolécula o un pequeño número de macromoléculas. Por el contrario, complejas redes de interacción ligando-macromolécula tal como interactomas proteína-metabolito (PMI) se pueden convenientemente esclarecer y mapear con el método del primer aspecto. Diferente del estado de la técnica, y bastante sorprendentemente, esto se hace sin la necesidad de cebos de proteínas específicas o cebos de ligandos.
La invención explota la observación de que moléculas pequeñas, en la medida que son ligandos de macromoléculas, coeluyen con la macromolécula cuando se separan por tamaño. Para este fin, las condiciones para la etapa (a) del método de la invención se eligen de modo que dichos complejos permanezcan estables. La estabilidad en general se dará para los valores de constante de disociación preferidos dados anteriormente. Las condiciones adecuadas incluyen soluciones acuosas tal como soluciones acuosas tamponadas.
Los ligandos (i) son ligandos que se producen de forma natural en un sistema biológico tales como metabolitos, péptidos, lípidos y ácidos nucleicos incluyendo ARN pequeños y oligonucleótidos; (ii) tienen una masa molecular entre aproximadamente 50 Da y 2000 Da; y/o (iii) son moléculas orgánicas pequeñas.
Los metabolitos ejemplares incluyen glicilprolina, FAD, AMPc, riboflavina, FMN y NAD. “AMPc” incluye 2',3' AMPc y 3',5' AMPc. El ejemplo 8 ilustra el uso de la presente invención para identificar 2',3' AMPc como un ligando de una macromolécula biológica.
Los ARN pequeños según el punto (i) incluyen microARN y ARN interferentes pequeños (ARNip). Las moléculas de ARNip típicas se describen en el documento WO02/44321 y referencias citadas en el mismo.
Un intervalo de peso molecular preferido según el punto (ii) es entre 100 Da y 1000 Da.
El término “molécula orgánica pequeña” tiene su significado establecido en la técnica y se refiere a moléculas que comprenden átomos de carbono y además uno o más de los siguientes átomos: hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y halógenos tal como F, Cl y Br. “Pequeña” designa masas moleculares según el punto (ii).
En una forma de realización más preferida, dicho sistema biológico es una célula, un tejido, un organismo, una muestra tomada de un organismo, una composición secretada por un organismo, o una muestra medioambiental. Las muestras mencionadas también son muestras preferidas según la etapa (a) del método del primer aspecto de la invención. Preferiblemente, dicho sistema biológico es la fuente de la que se origina la muestra.
Preferiblemente, dicha célula es una célula aislada, una célula in vitro, una célula ex vivo o una célula en cultivo.
Preferiblemente, dicho tejido es un tejido ex vivo, una muestra de tejido previamente tomada de un organismo o un tejido artificial.
Dicho organismo puede ser un mamífero incluyendo un ser humano. También puede ser un organismo no humano.
Habiendo dicho eso, se entiende que el sistema biológico enumerado como tal no se procesa por el método de la invención. Más bien, el sistema biológico se usa para definir una categoría de ligandos en el sentido de que dicha categoría de ligandos son esos ligandos que se originan de sistemas biológicos.
Preferiblemente, dicha muestra medioambiental es una muestra que comprende material biológico tal como una muestra de un tramo de agua que comprende organismos que viven en el mismo o una muestra de tierra que comprenden organismos que viven en la misma.
En una forma de realización preferida, un ligando determinado en la etapa (c) es un compuesto inicial candidato para desarrollar un modulador, por ejemplo, inhibidor o activador, de una macromolécula.
Como se sabe en la técnica, especialmente en el campo de la farmacología, una molécula, una vez se sabe que es capaz de unirse a una macromolécula que se considera como una molécula diana terapéutica, se puede desarrollar u optimizar con el fin de finalmente dar un medicamento. El compuesto de partida para tal proceso de desarrollo u optimización también se denomina molécula inicial (cabeza de serie).
En una forma de realización preferida adicional, dichas macromoléculas son (1) proteínas, ácidos nucleicos, membranas y/o ensamblajes macromoleculares tal como orgánulos; y/o (2) (i) un proteoma o ARNoma. Dichas macromoléculas están comprendidas en un extracto celular sin células, dicho extracto celular preferiblemente es un lisado celular.
Como se ha manifestado, dicho lisado celular no tiene células. Por ejemplo, se ha sometido a centrifugación para eliminar material insoluble. Preferiblemente, no se ha sometido a purificación adicional.
El término “proteína” incluye polipéptidos, pero no está confinado a los mismos. Un polipéptido es una cadena continua única de aminoácidos. Las proteínas pueden tener estructuras más complejas tal como homo o heterooligómeros del mismo o diferentes polipéptidos (para detalles véase más anteriormente). En términos de componentes básicos monoméricos constituyentes, se da preferencia a los 20 a-aminoácidos proteinogénicos. Habiendo dicho eso, también pueden estar presentes otros a-aminoácidos tal como ácido 2-amino-butírico, pirrolisina o selenocisteína. En lugar de a-aminoácidos, pueden estar presentes uno o más p-aminoácidos y/o D-aminoácidos.
Los aminoácidos se pueden derivatizar. Esto puede ser o bien en forma de modificaciones postraduccionales naturales tal como fosforilación o glucosilación, o se puede lograr artificialmente en aminoácidos o polipéptidos sintéticamente preparados. Los ejemplos de los últimos incluyen O-metil-serina. El extremo C de una cadena polipeptídica se puede esterificar, por ejemplo, con alcanoles de Ci a C4 y/o amidar el extremo N, por ejemplo, con alcanaminas primarias de C1 a C4.
El término “ácido nucleico” incluye ADN y ARN. El término “ácido nucleico” también se extiende a moléculas con un esqueleto que no es el esqueleto azúcar-fosfato canónico. Los ejemplos son ácidos peptidonucleicos (APN). En los ácidos nucleicos, las nucleobases pueden estar modificadas. También el azúcar puede estar modificado, especialmente en ribonucleótidos, por ejemplo, en la posición 2', por ejemplo, con O-metil o fluoro. También se pueden usar nucleótidos bloqueados (ANB).
Como se ha mencionado anteriormente, el término “macromolécula” incluye ensamblajes macromoleculares. Estos a su vez pueden comprender una o más proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Las membranas mencionadas pueden ser vesículas cerradas. Las membranas y vesículas pueden comprender una o más proteínas, en particular, proteínas transmembrana y/o asociadas a membrana.
El término “proteoma” tiene su significado establecido en la técnica y se refiere al conjunto completo de proteínas expresadas en un orgánulo, célula, tipo celular, tejido u organismo determinado. Como tal, se pueden analizar mezclas bastante complejas y se pueden esclarecer redes de interacción compleja con el método de la presente invención. Ya se han analizado proteomas completos y esto se muestra en los ejemplos adjuntados con el presente documento.
De forma similar, el término “ARNoma” tiene su significado establecido en la técnica y se refiere al conjunto completo de ARN en una célula, tipo celular, tejido u organismo determinado.
En referencia con lo anterior, las mezclas complejas se pueden analizar de forma conveniente. Un ejemplo de una mezcla compleja es un extracto celular. El extracto celular se puede obtener rompiendo células y solamente eliminando material insoluble, por ejemplo, por centrifugación, y después de ello sometiendo el extracto celular sin células restante, preferiblemente de forma directa, a análisis con el método del primer aspecto. Esto es conveniente porque cualquier purificación adicional en general es prescindible. Esto es ventajoso porque se evita cualquier sesgo o pérdida de material que se pudiera producir por etapas adicionales. Es sorprendente que el método según el primer aspecto pueda manejar convenientemente y con éxito tales muestras bastante crudas y complejas.
En una forma de realización preferida, (i) dichas fracciones cubren un intervalo de masa molecular desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 10000 kDa; y/o (ii) se recogen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones.
El método según la presente invención da fracciones. Esto puede ser el resultado de un límite de tamaño según la etapa (a), en donde las propiedades de separación de ligandos, macromoléculas y complejos formados por ligandos y macromoléculas, son una función continua de su tamaño.
Si no se indica otra cosa, se entiende que las macromoléculas, cuando no están comprendidas en un complejo, están libres de ligando.
En términos generales, el intervalo de masa molecular preferiblemente se ajusta al tipo de aplicación. Cuando se van a caracterizar proteomas enteros, especialmente proteomas desconocidos o parcialmente desconocidos con respecto a sus compañeros de interacción, el intervalo enumerado de 10 kDa a 10000 kDa es un punto de partida útil. Otros intervalos preferidos son desde 10 kDa a 1000 kDa y desde 10 kDa a 600 kDa.
Con respecto al número de fracciones, también se dirige la atención a los ejemplos adjuntos en el presente documento. Se recogen en la medida de 10 a 50, por ejemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 fracciones, se pueden obtener perfiles de elución exhaustivos de ligandos. Con respecto al término “perfil de elución”, se hace referencia a la forma de realización preferida divulgada posteriormente.
En la medida que una pluralidad de fracciones se somete a liberación en la etapa (b), y la cantidad de ligando determinado se determina para cada una de dichas fracciones, se obtiene un perfil de elución de dicho ligando determinado. Un perfil de elución es un conjunto de datos que se puede mostrar como un vector, una tabla o como un diagrama bidimensional donde la cantidad de ligandos se presenta en dependencia de la propiedad de separación de los complejos comprendidos en la muestra que se analiza, la propiedad de separación es el tamaño. Se describen perfiles de elución en los ejemplos y se muestran en las figuras. La observación de distribuciones multimodales en los perfiles de elución en general es indicativa de una pluralidad de macromoléculas uniéndose a un ligando determinado. Los términos “perfil de elución” y “perfil de fraccionamiento” se usan de forma equivalente en el presente documento.
Según la etapa (d) del método según la presente invención, se determinan una o más macromoléculas por un método de análisis químico como se describe en el presente documento, en particular EM, análisis proteómico, espectroscopia de RMN, secuenciación (secuenciación de ácidos nucleicos y/o proteínas) o detección por anticuerpos. En más detalle y con referencia a macromoléculas que son proteínas, la identificación se puede hacer en proteínas digeridas con EM acoplada a CL o MALDI, o en proteínas intactas con un instrumento de espectrometría de masas adecuado u otros métodos de identificación de proteínas como detección por anticuerpos, RMN o secuenciación de proteínas. Por ejemplo, después del corte de proteínas con proteasa específicas o sustancias químicas inespecíficas, preferentemente se someten a análisis de EM/EM para (i) secuenciación de novo en el caso de proteínas modificadas o proteomas de organismos cuyo genoma no está secuenciado, o (ii) identificación por búsqueda frente a las bases de datos disponibles.
Determinar macromoléculas preferiblemente incluye determinar tanto macromoléculas que estaban unidas a un ligando como macromoléculas que no estaban unidas a un ligando.
Una vez una macromolécula se une a un ligando, la macromolécula y el ligando coeluirán o cofraccionarán, estos dos términos se usan de forma equivalente en el presente documento. Al analizar el comportamiento de cofraccionamiento o coelución, se determina qué ligando se une a qué macromolécula. Se pueden usar métodos estadísticos para ese fin.
“Determinar” como se usa en el presente documento se refiere a esclarecer la estructura química y/o la composición y puede incluir cuantificación.
Según la etapa (e) del método de la presente invención, se determina qué ligando se une a qué macromolécula, preferiblemente determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de las fracciones según la invención y comparando los perfiles de fraccionamiento o perfiles de elución de ligandos con tales perfiles de fraccionamiento o perfiles de elución obtenidos de las macromoléculas.
Esto proporciona la aclaración de una o más interacciones macromolécula-ligando en el sentido de que se determina la identidad de las moléculas que interaccionan.
En una mezcla compleja de macromoléculas, por ejemplo, un lisado celular, ciertas macromoléculas pueden coeluir juntas a lo largo de varias fracciones en un método de separación determinado, por ejemplo, SEC, debido a un volumen hidrodinámico similar de los complejos macromoleculares. El compañero de interacción macromolecular más probable de una molécula pequeña liberada de una fracción particular en la etapa (c) es el que tiene el perfil de elución más similar al ligando.
Para encontrar perfiles de elución similares para cada ligando respectivo entre dichas macromoléculas, los perfiles de elución se pueden comparar visualmente. Preferiblemente, se someten a análisis matemático, más específicamente análisis estadístico, preferiblemente después de una transformación apropiada y establecida en la técnica de los datos, como escalado y/o centrado. El análisis matemático de los perfiles de elución en general abarca identificar relaciones causales con correlación o perfiles similares aplicando varias medidas de distancia entre vectores que representan perfiles de elución, como distancia euclidiana, distancia Manhattan y similares. Los resultados de tales análisis de coelución (o cofraccionamiento) se pueden mostrar como listas, diagramas bidimensionales, o redes (véase la figura 4). La macromolécula que tiene el mayor coeficiente de correlación o la menor distancia a un ligando particular representa el compañero de interacción más probable.
La etapa (e) del método, es decir, la determinación de qué ligando se une a qué macromolécula proporciona directamente información sobre qué macromolécula en dicha muestra estaba originalmente unida a un ligando. En otras palabras, se proporciona una distinción entre macromoléculas sin unir, si están presentes, y macromolécula que, en el inicio del método de la invención, estaban unidas a ligandos. Esas macromoléculas que estaban unidas a ligandos, preferiblemente ligandos de bajo peso molecular, es decir, ligandos que tienen un peso molecular de menos de o igual a un décimo del peso molecular de la respectiva macromolécula, son macromoléculas que tienen una elevada probabilidad de ser moduladas por fármacos. “Elevada” en este contexto significa una diferencia estadísticamente significativa cuando se compara con todas las macromoléculas presentes en una muestra determinada. Para explicar más, una cuestión clave en fármacos en desarrollo para una macromolécula tal como una proteína es la cuestión de la “susceptibilidad de ser modulada fármacos” de la diana, es decir, su accesibilidad general a la modulación de su actividad por una molécula pequeña. Al determinar uno, más o todos los complejos macromolécula-ligando presentes en un sistema biológico determinado, se identificarán esas macromoléculas que son modulables por fármacos, facilitando de esta manera el desarrollo y selección adicionales de dianas modulables por fármacos.
Como consecuencia, el método de la presente invención también se puede usar para identificar macromoléculas modulables por fármacos. En tal método, una macromolécula que se une a un ligando se identifica como una macromolécula modulable por fármaco.
Los ligandos enumerados en tal método para identificar macromoléculas modificables por fármacos son ligandos como se producen en la naturaleza.
El análisis divulgado anteriormente de comportamiento de coelución se puede extender. Tales métodos más complejos en general implicarán uno o más métodos analíticos adicionales además del método analítico según la etapa (a) de la forma de realización principal. En otras palabras, los métodos de la invención, según esta forma de realización preferida, pueden comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 15, o al menos 20 métodos de separación de cromatografía de exclusión molecular diferentes.
Más específicamente, las posibles implementaciones de esta forma de realización preferida incluyen realizar repetidamente el método según la primera forma de realización, en donde para cada repetición se usa un método de cromatografía de exclusión molecular diferente y/o material de cromatografía de exclusión molecular diferente.
Alternativamente o además, la etapa (a) del método de la forma de realización principal de la presente invención se puede implementar de modo que estén comprendidos al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 15, o al menos 20 métodos de cromatografía de exclusión molecular diferentes. En ese caso, y diferente de la implementación descrita anteriormente, esto no equivale a la realización en paralelo de diferentes cromatografías de exclusión molecular, sino la realización posterior de diferentes cromatografías, en donde el resultado de una primera cromatografía de exclusión molecular se alimenta a una segunda cromatografía. Como se ha mencionado anteriormente, los dos enfoques se pueden combinar.
El uso de más de una separación usando diferentes principios de separación y/o diferentes resinas cromatográficas y después determinar el comportamiento de coelución sobre más de un enfoque de separación reduce el número de potenciales candidatos para pares macromolécula-ligando. Los enfoques preferidos usan al menos 2 y hasta 20 separaciones cromatográficas diferentes y usan análisis estadístico del comportamiento de elución de macromoléculas y ligandos para determinar los complejos macromolécula-ligando más probables.
La forma de realización preferida divulgada anteriormente se considera que es particularmente adecuada en esos casos donde se van a analizar mezclas muy complejas. Las mezclas particularmente complejas pueden hacer difícil la determinación de qué ligando se une a qué macromolécula.
En tales circunstancias, además o como una alternativa a la forma de realización preferida anterior, se puede analizar más de una muestra. Tales muestras diferentes se pueden tomar de diferentes tipos celulares o diferentes tipos de tejidos de un organismo determinado, o pueden ser extractos de diferentes partes de una planta determinada. Esas interacciones ligando-macromolécula que aparecen en una pluralidad de muestras diferentes son las que tienen una mayor probabilidad de ocurrir realmente.
En la medida en que las macromoléculas en su totalidad definen un proteoma y los ligandos son moléculas naturales que se unen a las macromoléculas en dicho proteoma, el método del primer aspecto proporciona la obtención de un interactoma proteína-metabolito (PMI).
Determinar el PMI de un sistema biológico determinado proporciona un número de ventajas sobre enfoques existentes para identificación de moléculas iniciales y desarrollo de fármacos.
Primero, conocer el PMI define tanto las proteínas modulables por fármacos de ese sistema biológico como también el espacio químico de ligandos que se unen a las proteínas modulables por fármacos. Esto ayuda en seleccionar tanto mejores dianas para el desarrollo de fármacos como también proporcionar compuestos iniciales para desarrollo de fármacos.
En una forma de realización preferida, se lleva a cabo comparar los PMI de diferentes tejidos tal como tejido enfermo frente a sano. Esto permite identificar interacciones que solo se producen en células enfermas. Esto proporciona acceso directo a desarrollo de fármacos que aborda específicamente dianas modulables por fármacos en células enfermas. Una enfermedad ejemplar es cáncer.
En otra forma de realización preferida, el PMI de cloroplastos se analiza y compara a otros PMI. Los PMI específicos de cloroplastos permiten desarrollar herbicidas específicos de planta.
El término “interactoma proteína-metabolito” designa la totalidad de interacciones que se producen entre proteínas y moléculas pequeñas naturales en un sistema biológico. Este es un término establecido en la técnica. El término “metabolito” es un término genérico que designa moléculas pequeñas que se producen en sistemas biológicos y hechas por la acción de enzimas en dichos sistemas. Las moléculas pequeñas incluyen, pero no están confinadas a aminoácidos, péptidos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, ácidos grasos, monoacilgliceroles, diacilgliceroles, triacilgliceroles, fosfolípidos e intermedios del metabolismo tal como moléculas de C6 y C3 que se producen en la glucolisis o gluconeogénesis, ácidos tricarbocíclicos, piruvato, lactato; y además coenzimas, cofactores y grupos prostéticos.
En el método según la presente invención, la etapa (a) separa complejos y ligandos sin unir por tamaño mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC). En una forma de realización preferida, dicho método de análisis químico es espectrometría de masas (EM), resonancia magnética nuclear (RMN), secuenciación y/o detección por anticuerpos.
El método usado en la etapa (a) del método del primer aspecto proporciona una separación de analitos según el tamaño. La cromatografía de exclusión molecular proporciona un mayor grado de retención de analitos cuando son más pequeños. Los dispositivos y matrices preferidos para realizar la exclusión molecular se conocen bien en la técnica. Los materiales y dispositivos ejemplares o preferidos se mencionan en los ejemplos adjuntos en el presente documento.
El término “tamaño”, en una forma de realización, es la masa molecular. En otras formas de realización, “tamaño” es un tamaño aparente, el tamaño aparente es el parámetro según el cual se produce la separación en un método analítico determinado. El tamaño aparente puede ser el volumen hidrodinámico. El tamaño aparente y la masa molecular se correlacionan, la correlación está preferiblemente regida por una función monótona. El tamaño aparente y la masa molecular pueden coincidir. Preferiblemente, el tamaño es la masa molecular.
En una forma de realización preferida adicional, dicho ligando es un ligando no covalente.
En una forma de realización particularmente preferida, y en la medida que dicho ligando es un ligando no covalente, dicha liberación en la etapa (b) se realiza por desnaturalización de dichos complejos.
Una vez la etapa (a) del método del primer aspecto se ha completado, los ligandos sin unir se eliminan de la mezcla. Los ligandos están todavía presentes, sin embargo, solo en la medida que están unidos a macromoléculas. Con el fin de determinar finalmente dichos ligandos, es necesario liberarlos de los complejos. Un medio preferido es la desnaturalización. La desnaturalización interfiere con la estructura tridimensional de las macromoléculas, incluyendo su capacidad de unirse a un ligando determinado.
En una forma de realización particularmente preferida, dicha desnaturalización se realiza al (ba) calentar, preferiblemente a 100 °C; (bb) añadir sustancias químicas desnaturalizantes tal como compuestos caotrópicos incluyendo urea y clorhidrato de guanidinio y detergentes incluyendo SDS; (bc) añadir solventes orgánicos que interfieren con la interacción ligando-macromolécula tal como acetona y acetonitrilo; y/o cortar dichas macromoléculas enzimáticamente y/o químicamente. El corte enzimático se puede hacer, por ejemplo, con tripsina.
Estos medios y métodos de desnaturalización están establecidos en la técnica. En términos generales, cualquier método establecido en la técnica para desnaturalizar una macromolécula o un complejo que comprende una macromolécula es aplicable, siempre que no interfiera con la integridad del ligando.
En una forma de realización preferida adicional, dicho método además comprende una, más o todas de las siguientes etapas adicionales: (aa) antes de la etapa (a), romper las células que comprenden dichas macromoléculas y opcionalmente dichos ligandos, seguido por la eliminación de material insoluble; (ab) después de la etapa (a) y antes de la etapa (b) lavar; (ca) después de la etapa (b) y antes de la etapa (c), eliminar macromoléculas, extraer ligandos y/o realizar cromatografía líquida (CL) o cromatografía de gases (CG) de los ligandos, o, si es aplicable, de los ligandos extraídos, en donde preferiblemente dicha CL o CG, en la medida que se realiza, se lleva a cabo en un dispositivo de CL/EM en línea, un dispositivo CL/RMN en línea, y un dispositivo CG/EM en línea, o un dispositivo CG/RMN en línea; (da) después de la etapa (b) y antes de la etapa (d), en la medida en que se realiza la etapa (d), extraer macromoléculas y opcionalmente realizar CL de las macromoléculas extraídas, en donde preferiblemente la CL se efectúa en un dispositivo de CL/EM en línea, un dispositivo CL/RMN en línea.
La etapa (aa) proporciona una etapa que precede a la etapa (a) que usa células como material de partida. Estas células pueden ser células aisladas o células comprendidas en el tejido o muestra biológica. Tras romper dichas células, el material insoluble se puede eliminar, por ejemplo, por centrifugación. Etapas de purificación adicionales son menos preferidas y en general prescindibles. Según esto, la etapa (aa), mientras proporciona la eliminación de material insoluble, preferiblemente excluye cualquier procesamiento adicional, especialmente una etapa de purificación, antes de alimentar el extracto celular a la etapa (a) del método del primer aspecto. Dicho extracto celular es una muestra preferida según la etapa (a).
Lavar según la etapa (ab) es preferido porque proporciona la eliminación de cualquier material sin unir. Los materiales sin unir son analitos grandes en el caso de exclusión molecular y analitos pequeños en el caso de filtración por tamaño.
La etapa (b) del método del primer aspecto proporciona la liberación de ligandos unidos de las macromoléculas. Antes de someter los ligandos liberados a análisis en la etapa (c) es preferible eliminar macromoléculas en una etapa (ca). Esto se puede hacer, por ejemplo, por centrifugación. En particular, si se ha usado desnaturalización para el fin de liberar ligandos, las macromoléculas desnaturalizadas se eliminan fácilmente por medio de centrifugación.
Extraer los ligandos se puede hacer como se describe en Giavalisco, et al. (Plant J. 68, 364-76 (2011)). En términos generales, se pueden usar mezclas de agua con solventes polares para extraer. Una mezcla de solventes particularmente preferida para la extracción es la mezcla ternaria de metil butil terciario éter (MTBE), metanol y agua. Esto es particularmente útil para extraer ligandos semipolares. Esto también es útil para la precipitación simultánea de macromoléculas que se sedimentan posteriormente.
Extraer macromoléculas, especialmente proteínas, se puede hacer en paralelo a la extracción de ligandos usando el método del MBTE (véase anteriormente) o usando otros métodos de extracción como acetona, metanol/cloroformo, o las proteínas se pueden solubilizar directamente en una mezcla de urea/tiourea o detergentes antes del análisis químico.
Respecto al primer aspecto, la presente invención también proporciona un método de determinar ligandos de proteínas, dicho método comprende o consiste en (a) someter los complejos formados por dichas proteínas y dichos ligandos a filtración por tamaño o cromatografía de exclusión molecular; (b) desnaturalizar, para una, más o todas las fracciones obtenidas en la etapa (a), dichos complejos; (c) someter los ligandos liberados obtenidos en la etapa (b) a espectrometría de masas (EM), determinando de esta manera dichos ligandos de dichas macromoléculas; (d) someter las macromoléculas liberadas obtenidas en la etapa (b) a EM, determinado de esta manera dichas macromoléculas; y (e) comparar los perfiles de elución de ligandos con los perfiles de elución de macromoléculas, determinando de esta manera qué ligando se une a qué macromolécula.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método de identificar, de una pluralidad de compuestos de prueba, (un) ligando(s) de una pluralidad de macromoléculas, dicho método comprende o consiste en:
(a) poner en contacto dichas macromoléculas con dicha pluralidad de compuestos de prueba;
(b) someter la mezcla obtenida en la etapa (a) a un método que separa los complejos, si hay alguno, formados entre dichas macromoléculas y (un) ligando(s) de los compuestos de prueba sin unir, en donde dicho método da fracciones y en donde dicho método es cromatografía de exclusión molecular (SEC);
(c) disociar los complejos, liberando de esta manera los ligandos unidos, si hay alguno, de las macromoléculas; (d) someter el/los ligando(s) liberado(s) obtenido(s) en la etapa (c), si hay alguno, a un método de análisis químico, identificando de esta manera un ligando(s) de dichas macromoléculas;
(e) determinar una o más macromoléculas que estaban unidas a ligandos por un análisis químico;
en donde dicho método comprende además la etapa de
(f) determinar qué ligando se une a qué macromolécula determinando la cantidad de un ligando determinado en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicho ligando determinado, determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicha macromolécula y comparando los perfiles de elución obtenidos de ligandos con tales perfiles de elución obtenidos de macromoléculas.
Las definiciones y explicaciones en relación al método del primer aspecto y las formas de realización preferidas del mismo se aplican mutatis mutandis al segundo aspecto de la presente invención.
Los complejos y ligandos según el segundo aspecto son complejos no covalentes y ligandos no covalentes, respectivamente.
El término “compuesto de prueba” según la invención es una designación funcional. Significa que, antes de realizar el método de la invención, no se sabe si dicho compuesto se une a alguna macromolécula. Un compuesto de prueba puede ser de origen sintético. Puede ser un compuesto xenobiótico, pero no tiene que ser. Según esto, el método según el segundo aspecto se puede usar para fines de cribado, en particular para la identificación de ligandos previamente desconocidos.
Por tanto, el método del segundo aspecto es un método de cribado. Diferente a los métodos del estado de la técnica, que típicamente requieren que en cada ensayo solo se ensaye un único compuesto de prueba para su potencial capacidad de unirse a una macromolécula, la presente invención proporciona el ensayo concomitante de una pluralidad de ligandos. El número de ligandos no está particularmente limitado en ese respecto y puede ser hasta 1000, hasta 10000, hasta 100000, hasta 1000000, o más. Además, también se pueden ensayar varias macromoléculas al mismo tiempo en la misma mezcla. Según esto, multiplexar con respecto a ligandos es convenientemente asequible. Además, incluso el multiplexado bidimensional, es decir, con respecto tanto a ligandos como macromoléculas es factible.
En una forma de realización preferida del segundo aspecto, (i) dicha(s) macromolécula(s) es/son (una) proteína(s) o (un) ácido(s) nucleico(s), preferiblemente ARN; (ii) dicho(s) ligando(s) es/son como se ha definido en relación al primer aspecto y las formas de realización preferidas del mismo; y/o (iii) dicha pluralidad de macromoléculas son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 macromoléculas.
En una forma de realización preferida adicional del segundo aspecto, dicho método de análisis químico de la etapa (d) es espectrometría de masas (EM) o resonancia magnética nuclear (RMN).
En una forma de realización preferida adicional, dicha disociación en la etapa (c) se lleva a cabo por desnaturalización de dichos complejos, dicha desnaturalización preferiblemente se lleva a cabo al (ca) calentar, preferiblemente a 100 °C; (cb) añadir sustancias químicas desnaturalizantes tal como compuestos caotrópicos incluyendo urea y clorhidrato de guanidinio y detergentes incluyendo SDS; y/o (cc) añadir solventes orgánicos que interfieren con la interacción ligando-macromolécula tal como acetona y acetonitrilo; y/o (cd) cortar dicha macromolécula enzimáticamente y/o químicamente.
En una forma de realización preferida adicional, dicho método además comprende una, más o todas de las siguientes etapas adicionales: (ba) después de la etapa (b) y antes de la etapa (c), lavar; (da) después de la etapa (c) y antes de la etapa (d), eliminar dicha(s) macromolécula(s), y extraer ligando(s), si hay alguno.
Con respecto a las formas de realización caracterizadas en esta especificación, en particular en las reivindicaciones, se pretende que cada forma de realización mencionada en una reivindicación dependiente se combine con cada forma de realización de cada reivindicación (independiente o dependiente) de la depende que dicha reivindicación dependiente. Por ejemplo, en el caso de una reivindicación independiente 1 que enumera 3 alternativas A, B y C, una reivindicación dependiente 2 que enumera tres alternativas D, E y F y una reivindicación 3 dependiente de las reivindicaciones 1 y 2 que enumera 3 alternativas G, H e I, se debe entender que la especificación divulga de forma inequívoca formas de realización que corresponden a las combinaciones A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, a menos que específicamente se mencione otra cosa.
De forma similar, y también en esos casos donde reivindicaciones independientes y/o dependientes no enumeran alternativas, se entiende que si las reivindicaciones dependientes remiten a una pluralidad de reivindicaciones precedentes, cualquier combinación del objeto cubierto por las mismas se considera que se divulga explícitamente. Por ejemplo, en el caso de una reivindicación independiente 1, una reivindicación dependiente 2 que se remite a la reivindicación 1, y una reivindicación dependiente 3 que se remite tanto a la reivindicación 2 como la 1, se desprende que la combinación del objeto de las reivindicaciones 3 y 1 está clara e inequívocamente divulgada como lo está la combinación del objeto de las reivindicaciones 3, 2 y 1. En el caso de que esté presente una reivindicación dependiente 4 adicional que se refiera a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, se desprende que la combinación del objeto de las reivindicaciones 4 y 1, de las reivindicaciones 4, 2 y 1, de las reivindicaciones 4, 3, 1, así como de las reivindicaciones 4, 3, 2 y 1 está calara e inequívocamente divulgada.
Las figuras muestran:
Figura 1: Flujo de trabajo experimental: Se extrajeron células usando tampón TMN nativo (etapas 1-2). La fracción soluble nativa se obtuvo por una etapa de ultracentrifugación (etapa 3). Se realizó filtración por tamaño usando columnas de centrifugación de 10 kDa. Se aplicó desnaturalización por calor para liberar moléculas pequeñas unidas a complejos (etapa 4a). Alternativamente, los complejos proteína-metabolito se separaron de los metabolitos libres usando SEC (etapa 4b). Las muestras recogidas se sometieron a extracción de metabolito y proteína en MTBE-metanol-agua todo en uno (etapa 5). Los metabolitos semipolares se cuantificaron por CL/EM (etapa 5).
Figura 2: La filtración por tamaño separa la proteína unida de moléculas pequeñas libres . Aquí se presenta el subconjunto de las que se podrían apuntar supuestamente a una fórmula suma usando información de marcaje con 15N y 13C (Giavalisco (2011), loc. cit.) y/o a un metabolito usando compuestos de referencia. Nótese que el apunte se enfocó en las características de masa presentes en el eluato y por tanto clasificadas como unido a complejo.
Figura 3: SEC separa la proteína unida de moléculas pequeñas libres. (a) Cromatogramas de la absorción a 280 nm de cuatro replicados de SEC (negro) y del control sin proteína (línea de puntos). La distribución de masa molecular aproximada determinada de una curva patrón se representa en gris. (B) Contenido de proteína de las 57 fracciones analizadas del análisis de SEC. (C) Recuento de iones sumados a través de las fracciones de SEC de 83 moléculas pequeñas seleccionadas representadas en (D) de experimentos independientes (círculos) y su media (líneas). (D) Mapa de calor de los perfiles de SEC de 83 moléculas pequeñas seleccionadas del experimento de filtración por tamaño en 42 fracciones mayores de 10 kDa (puntuación z de la media de n = 4 experimentos). Perfiles de SEC ejemplares de los cofactores FMN (E) y NAD (F).
Figura 4: Resultados del análisis de cofraccionam iento . Véase también el ejemplo 5.
Figura 5: Figura combinada que representa el perfil de elución de proteínas capturadas con las perlas de afinidad Gly-Pro a través de fracciones que contienen proteína en el experimento de SEC. También se da el patrón de elución de Gly-Pro medido en el experimento de SEC. Los datos están normalizados a la intensidad máxima medida en la separación por SEC. Se indica con un cuadro la coelución de Gly-Pro con FBA6 y FBA8.
Figura 6: Figura combinada que representa el perfil de elución de metabolitos capturados con FBA6 etiquetada de afinidad a través de fracciones que contienen proteína en el experimento de SEC. Los datos están normalizados a la intensidad máxima medida en la separación por SEC. Nótese que además de Gly-Pro y con la excepción de ácido pipecólico, todas las otras moléculas pequeñas extraídas con FBA6 coeluyen con FBA6 en el experimento de SEC. Por tanto, es probable que no uno sino un número de diferentes dipéptidos puedan interaccionar con FBA6.
Figura 7: DHAP (sustrato) y Gly-Pro, pero no Pro-Gly, se unen a FBA6 con Kd de aproximadamente 200 nM.
Figura 8: El pantotenato interacciona con 3-metil-2 oxobutanoato hidroximetil-transferasa 1 (KPHMT1). A) El pantotenato coeluye con KPHMT1 a través de fracciones que contienen proteína en el experimento de SEC, correlación de persona r = 0,93.
B) Se ensayó la interacción pantotenato-KPHMT1 por ensayo de termoforesis a microescala (MST). Los datos se presentan como diferencia en fluorescencia normalizada (AFNorm) calculada entre KPHMT1 unida y no unida con una Kd de 367,4 pM. Como péptido control se ensayó un péptido con etiqueta 6xHis en presencia de MTA, no se observó unión. Los datos son la media ± DE, n = 3.
Figura 9: La metiltioadenosina (MTA) interacciona con metiltiorribosa-1-fosfato isomerasa (MTR-1-P).
A) Coelución de MTA y MTR-1-P a través de fracciones que contienen proteína en el experimento de SEC, correlación de persona r = 0,75.
B) Se ensayó la interacción MTA-MTR-1-P por ensayo de termoforesis a microescala (MST). Los datos se presentan como diferencia en fluorescencia normalizada (AFNorm) calculada entre MTR-1-P unida y no unida con una Kd de 2,7 pM. Como péptido control se ensayó un péptido con etiqueta 6xHis en presencia de MTA, no se observó unión. Los datos son la media ± DE, n = 3.
Figura 10: 2',3'-AMPc se une a la proteína Rbp47b en extracto celular nativo.
(A ) Representación esquemática del experimento de purificación de afinidad con las cuatro etapas secuenciales de elución (panel izquierdo). El experimento se hizo en triplicado. Se definen proteínas específicas como presentes en solo una elución, en las tres muestras independientes. Se definen proteínas no específicas como presentes en más de una elución (panel derecho). (B) Representación esquemática del experimento de SEC (panel izquierdo); coelución de 2',3'-AMPc y Rbp47b a través de fracciones que contienen proteína en el experimento de SEC (panel derecho). Los datos están normalizados a la intensidad máxima y se dan como media de 3 (proteína) o 4 (metabolito) experimentos independientes. (C) Representación esquemática del ensayo de estabilidad térmica (panel izquierdo); análisis por inmunotransferencia de la abundancia de proteína Rbp47b-TAP (panel derecho). El experimento presentado se repitió tres veces.
Figura 11: 2',3'-AMPc se une a la proteína Rbp47b in vitro. (A ) Medidas de MST que ensayan la interacción entre Rbp47b y 2',3'-AMPc/3',5'-AMPc. Los datos se presentan como diferencia en fluorescencia normalizada (AFNorm) calculada entre Rbp47b unida y no unida. Los datos son la media ± DE, n = 3 (replicación técnica). La Kd de la interacción Rbp47b-2',3'-AMPc se calculó a 1,02 pM. (B) El log2 de la intensidad de 2',3'-AMPc medida en lisado nativo de Arabidopsis (cuadrado) se representó frente a la curva de calibración (puntos) usada para calcular la concentración absoluta de 2',3'-AMPc de las medidas de CL-EM del metabolito (media ± DE, n = 3). Las muestras eran de un experimento.
Figura 12: 2',3'-AMPc se acumula en respuesta a las condiciones de estrés y fomenta el autoensamblaje de Rbp47b.
(A ) Acumulación de 2',3'-AMPc en rosetas de Arabidopsis maduras en diferentes condiciones de estrés 31. Los datos se representan como media móvil de la intensidad de 2',3'-AMPc normalizado respecto al punto de tiempo 0. Las primeras muestras se tomaron a los 5, 10 y 20 min después del inicio del estrés y posteriormente cada 20 min hasta las 6 h. Las dos últimas muestras se tomaron después de 10 y 20 h después del inicio del estrés. 21: 21 °C (condición control), 32: 32 °C (estrés por calor), L: condición de luz control (150 pE m-2 sec-1), LD: luz débil (70 pE m-2 sec-1), D: oscuridad. Los datos son medias de tres medidas independientes. (B) Medida por MST del autoensamblaje de Rbp47b en presencia (Kd = 8,9 nM) o ausencia (Kd = 127,87 nM) de 2',3'-AMPc 50 pM. Los datos se presentan como proteína unida y no unida. Los datos son la media ± DE, n = 2 (replicación técnica).
Figura 13: 2',3'-AMPc se une al homólogo humano de Rbp47b - TIA1 y fomenta su oligomerización.
(A ) Medida por MST de la interacción entre TIA1 y 2',3'-AMPc/3',5'-AMPc. Los datos se presentan como diferencia en fluorescencia normalizada (AFNorm) calculada entre TIA1 unida y no unida. Los datos son la media ± DE, n = 3 (replicación técnica). La Kd de la interacción TIA1-2',3'-AMPc se calculó a 217 pM. (B) Medida por MST del autoensamblaje de TlA1 en presencia (Kd = 20,55 nM) o ausencia (Kd = 36,28 nM) de 2',3'-AMPc 500 pM. Los datos se presentan como fracción unida, lo que significa proteína unida y no unida. Los datos son la media ± DE, n = 3 (replicación técnica).
Figura 14: Papel propuesto de 2',3'-AMPc en la regulación del destino del ARN.
En condiciones óptimas se produce traducción de proteínas y TIA1/RBP47b se localiza en el núcleo. Tras el estrés y como consecuencia de traducción paralizada se desencadena la degradación del ARNm en cuerpos de procesamiento, lo que produce la acumulación de 2',3'-AMPc. También en condiciones de estrés TIA1/RBp47b se exporta al citosol, donde puede formar complejos con 2',3'-AMPc. Lo último fomenta el autoensamblaje de TlAl/RBP47b y por tanto la formación de gránulos de estrés, donde el ARN se almacena y está protegido de la degradación.
Los ejemplos ilustran la invención
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Crecimiento de cultivos de células de Arabidopsis
Se hicieron crecer cultivos de células de Arabidopsis MM2d (Menges & Murray, Plant J. 30, 203-12 (2002)) en medio MSMO suplementado con sacarosa al 3 %, quinetina 0,05 mg/l y ácido 1-naftalenoacético 0,5 mg/l en un agitador orbital a 130 rpm en la luz. Las células se pasaron semanalmente a medio reciente y se recogieron durante la fase de crecimiento logarítmico usando filtración rápida y congelación instantánea en nitrógeno líquido.
Lisis celular y preparación de fracción soluble de proteínas
Las células congeladas se molieron con un mortero y mano o en un molino Retsch (Retsch GmbH, Haan, Alemania) durante 4 veces 1 min a 30 rps. Se añadieron 1,5 ml (para filtración por tamaño) o 0,7 ml (para cromatografía de exclusión molecular) de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, MgCh 1,5 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, mezcla de inhibidores de proteasas 1x (Sigma-Aldrich), Na3VO40,1 mM y NaF 1 mM) por 1 g de células. En experimentos de SEC, se usó bicarbonato de amonio-HCl 50 mM pH 7,5 en lugar de Tris como agente tamponante. Después de descongelar en hielo el extracto se filtró a través de miracloth y posteriormente se centrifugó 10 min a 3452 g, 4 °C. Se usó ultracentrifugación 45 min a 35000 rpm (max 165052 g, media 125812 g), 4 °C para preparar la fracción soluble.
Filtración por tamaño
Se filtraron 2,5-3 ml de la fracción soluble (véase anteriormente) usando unidades de filtro centrífugas Amicon 10 kDa Ultra (Millipore). En esta fase se guardaron alícuotas de 400 pl del aporte y el flujo no unido para análisis metabólico. Se aplicaron dos etapas de lavado, la primera usando 5 ml y la segunda 1,5 ml de tampón de lavado (TrisHCl 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, MgCh 1,5 mM, TNM) para eliminar los metabolitos libres restantes. Se añadieron aproximadamente 1,5 ml de tampón de lavado a la columna para cubrir el filtro y se usó un tratamiento de 10 min, 100 °C para desnaturalizar las proteínas y así disociar los complejos proteína-metabolito. Se guardaron alícuotas de 1 ml-1,2 ml de la 2a etapa de lavado y eluato para análisis metabólico. Se realizaron etapas de centrifugación a 3452 g durante 15-30 minutos.
Cromatografía de exclusión molecular
2,5 ml de fracción soluble correspondiente a 50 mg de proteína para la separación. Se realizó SEC con una columna HiLoad 16/600 Superdex 200 calidad prep (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, RU) conectada a un explorador ÁKTA 10 (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, RU) que opera a 4 °C. La velocidad de flujo se ajustó a 0,8 ml/min. Se recogieron 57 fracciones de 1,5 ml del volumen de elución de 40 a 125,5 ml de los que se secó 1 ml en una speed-vac durante la noche y se almacenó a -80 °C para análisis metabolómico. Para el experimento control sin proteína, 50 mg de proteína de la fracción soluble se precipitaron con acetona al 80 % a -20 °C durante 5 h. Después de precipitar las proteínas desnaturalizadas por centrifugación a 3452 g durante 20 min a 4 °C, el sobrenadante se secó durante la noche en una speed-vac. Todas las moléculas pequeñas no precipitadas se resuspendieron al día siguiente en el volumen original de tampón de lisis y se usaron para SEC.
Extracción de metabolitos y metabolómica por CL/EM
Las muestras se extrajeron como se define en Giavalisco (2011), loc. cit. En esencia, este método usa un sistema de solvente metil tert-butil éter (MTBE)/metanol/agua para separar proteínas, lípidos y compuestos polares en sedimento, fases orgánica y acuosa, respectivamente. Después de la extracción, la fase acosa se secó en la speed-vac y se almacenó a -80 °C hasta el análisis por CL/EM. Las muestras se midieron usando cromatografía líquida de ultrarendimiento acoplada a un espectrómetro de masas Exactive (Thermo-Fisher; http://www.thermofisher.com) en modo de ionización positiva y negativa como se describe en Giavalisco (2011), loc. cit. El procesamiento de los cromatogramas, detección de picos, e integración se realizaron usando REFINER MS 7.5 (GeneData; http://genedata.com). El procesamiento de los datos de espectrometría de masas incluía la eliminación de los picos isotópicos, así como ruido químico. Las características metabólicas obtenidas (m/z en un tiempo de retención determinado) se cuestionaron frente a una base de datos estándar interna y/o la base de datos Metlin (https://metlin.scripps.edu/index.php) (permitiendo un error de 7 ppm). Donde había información disponible sobre el número de átomos de carbono y nitrógeno en una característica determinada se retiró de los perfiles metabólicos de células marcadas con 13C o 15N (análogo a Giavalisco (2011), loc. cit.).
Ejemplo 2
Análisis de ligandos en filtración por tamaño
Se cargó lisado de cultivo de células MM2d de Arabidopsis nativo (posteriormente denominado aporte) en columnas de centrifugación de filtración por tamaño con un límite de 10 kDa para separar la fracción de proteína de la fracción de metabolito libre (flujo no unido). Posteriormente la fracción de proteína se lavó exhaustivamente con el fin de eliminar cualquier metabolito no unido (lavado). En una etapa final, se aplicó desnaturalización por calor para desnaturalizar las proteínas y liberar los metabolitos unidos de forma no covalente de las proteínas (elución). Todas las muestras se analizaron aplicando nuestra plataforma de metabolómica CL/EM para compuestos semipolares (Giavalisco (2011), loc. cit.) (Fig. 1, etapa 5). En conjunto, el análisis por CL/EM de las muestras de aporte, flujo, lavado y eluato produjo aproximadamente 8892 componentes metabólicos (definidos por masa molecular (m/z) y tiempo de retención), de los que aproximadamente 150 se pudieron apuntar putativamente como un metabolito. El flujo no unido contenía muchos metabolitos y el contenido de metabolitos disminuyó en el lavado. Notablemente, después del tratamiento con calor muchos metabolitos (aproximadamente el 50 % de todos los componentes metabólicos detectados), mientras que estaban ausentes en las muestras de lavado, eran de nuevo detectables en el eluato, mostrando de esta manera que esta gran fracción de metabolitos está en efecto formando complejos estables con proteínas. Entre estos estaban ligandos bien conocidos tal como nucleótidos cíclicos (GMPc, AMPc, CMPc), cofactores (FAD, NAD, FMN) y péptidos (Fig. 2a-b). Las proteínas se digirieron en el filtro de límite y los péptidos se liberaron para análisis adicional.
Estos resultados muestran que en el sistema biológico analizado hay numerosos metabolitos/moléculas pequeñas que forman un complejo no covalente, pero estable con proteínas.
Ejemplo 3
Prueba de principio para exclusión molecular
En una etapa posterior se usó un enfoque de fraccionamiento por tamaño alternativo. Para este fin, se ha aplicado cromatografía de exclusión molecular (Kristensen et al., Nat. Methods 9, 907-909 (2012); Olinares et al., Mol. Cell. Proteomics 9, 1594-1615 (2010)) al extracto de proteína-metabolito nativo usando una columna que separa complejos moleculares desde aproximadamente 600 kDa a 10 kDa (Fig. 1). El cromatograma de la absorción a 280 nm indica separación reproducible de complejos por SEC (Fig. 3a). El contenido de proteína en las fracciones recogidas mostró separación de complejos moleculares que contienen proteínas, mientras que no era detectable proteína en fracciones posteriores a C12 correspondiente a una masa molecular menor de 10 kDa (Fig. 3a-b).
Ejemplo 4
Análisis de ligandos encontrados en cualquiera de los enfoques
Con el fin de ver si las fracciones de proteína contenían o no metabolitos/moléculas pequeñas, se analizaron 57 fracciones para la aparición de metabolitos semipolares por CL/EM. Según los resultados obtenidos de la filtración por tamaño se detectaron la mayoría de los componentes metabólicos, es decir, ligandos, como no unidos a proteína y por tanto eluyendo después de un volumen de fase móvil total de la columna (Fig. 3c). Además, y más importante, sin embargo, se detectaron perfiles de elución específicos de moléculas pequeñas en fracciones que representan MW teóricos entre 10 a 600 kDa.
Merecen comentarse tres características de perfiles de elución de moléculas pequeñas. En primer lugar, los resultados de SEC confirmaron a un gran nivel los resultados del experimento de filtración por tamaño descrito anteriormente. Por tanto, 83 de los interactores con proteína putativamente apuntados, es decir, ligandos, del experimento de filtración por tamaño también se observaron en los datos de SEC distribuidos a lo largo del intervalo de separación entero (Fig. 3d). En segundo lugar, para la mayoría de los metabolitos/ligandos se observó su aparición en fracciones específicas del experimento de SEC y no a lo largo de todas las fracciones que es una indicación clara de una unión específica a una o más proteínas que eluyen en estas fracciones. En tercer lugar y lo más importante para la prueba de concepto, se observó que metabolitos que se sabe bien que interaccionan con proteínas lo más notablemente cofactores tal como FMN o NAD muestran distintos picos en el intervalo de separación lo que indica la presencia de unión múltiple, aunque específica a proteína(s) (Fig. 3e-f).
Para asegurar que los metabolitos de eluyen de forma diferencial son verdaderamente derivados de complejos metabolito-proteína, se realizó un experimento control con una muestra sin proteína. Para este fin, se precipitaron las proteínas de la muestra de aporte con acetona al 80 % y se reconstituyeron las moléculas pequeñas en tampón de lisis antes de aplicarlas a la columna de SEC. En línea con los complejos moleculares que se separan por SEC en base a su tamaño no se observó ningún componente metabólico diferencial significativo a través de las fracciones de SEC (Fig. 3c), sino que todos los metabolitos aparecieron después del volumen de fase móvil total como se esperaba para moléculas pequeñas libres.
Ejemplo 5
Análisis de cofraccionamiento
Se ha realizado análisis de cofraccionamiento de moléculas pequeñas y macromoléculas (proteínas). La figura 4(a) muestra un dendograma de grupos jerárquicos de proteínas y moléculas pequeñas putativamente apuntadas basado en la correlación de Pearson. Las cajas grises indican grupos que tienen un coeficiente de correlación mayor de 0,7. La figura 4(b) muestra el grupo no 5 de (a) como una red donde los pesos extremos corresponden a potencia de correlación. La figura 4(c) muestra gráficos bidimensionales individuales de perfiles de elución de moléculas pequeñas seleccionadas (líneas sólidas) y dos proteínas (líneas de puntos) con perfiles muy similares. Los gráficos de correlación se muestran en recuadros).
Ejemplo 6
Identificación de una novedosa interacción Gly-Pro:RBA6
Se demostró que aplicando cualquier tipo de separación por tamaño a un lisado biológico nativo, es posible separar moléculas pequeñas libres de las unidas a los complejos de proteínas. Usando filtración por tamaño de una única etapa encontramos evidencia de que múltiples dipéptidos estaban unidos a las proteínas de la fracción soluble aislada de un cultivo de células de Arabidopsis. Los experimentos de seguimiento, en que los complejos proteína-molécula pequeña se separaron por cromatografía de exclusión molecular, demostraron que los dipéptidos no solo se unen a proteínas sino a complejos de proteínas específicos. La mayoría de los dipéptidos medidos tenían un pico de elución específico. Nos enfocamos en uno de los dipéptidos medidos, es decir, Gly-Pro, que eluía junto con un complejo de proteína de aproximadamente 145-165 kDa (Fig. 5).
Se inmovilizó L-Gly-L-Pro en las perlas de agarosa o bien usando el grupo N terminal de la glicina o el grupo C terminal de la prolina, denominadas perlas N o C. Ambas resinas se incubaron con el lisado nativo de Arabidopsis y las proteínas capturadas en las perlas se eluyeron con alta concentración de Gly-Pro. Los experimentos de afinidad padecen una alta tasa de falsos positivos relacionado con la unión inespecífica. Para contrarrestar esto y antes de la elución con Gly-Pro se introdujo una etapa extra donde las perlas se incubaron con una mezcla de glicina y prolina. Esta etapa extra redujo el número de aciertos de cientos a 34 proteínas extraídas con las perlas N y C. Estas incluyen las fructosa bifosfato aldolasas citoplásmicas (FBA8 y FBA8) (Fig. 5). También coeluyen con Gly-Pro en el experimento de SEC (Fig. 5). Las aldolasas son enzimas en la ruta de la glucolisis y la gluconeogénesis. Catalizan la reacción reversible en la que la fructosa 1,6-bifosfato (Fru1,6bP) se corta en dos productos de tres carbonos, es decir, gliceraldehído 3-fosfato (G3P) y dihidroxiacetona fosfato (DHAP).
Posteriormente se pudo confirmar la interacción Gly-Pro:FBA6 por métodos independientes, tanto en el extracto celular como in vitro.
Razonamos que si FBA6 se puede extraer usando Gly-Pro como cebo, lo inverso también será cierto. Para ensayar esta suposición, se prepararon líneas transgénicas que expresan FBA6 junto con una etiqueta de afinidad, y se usaron en el experimento de precipitación. Como se esperaba, se encontró Gly-Pro en el complejo con la FBA6 etiquetada (Fig. 6).
La proteína FBA6 se expresó y purificó de E. coli. MST usa la tendencia intrínseca de todas las moléculas biológicas de moverse en el gradiente de temperatura. Este movimiento depende del tamaño de la molécula, la carga y la capa de hidratación. La formación de complejos afecta al menos uno de los tres parámetros que cambian el movimiento e indica un suceso de unión. Gly-Pro, pero no Pro-Gly, se une a FBA6 con la Kd de aproximadamente 200 nM, que es comparable al sustrato (DHAP). Los resultados obtenidos señalan a una interacción tanto fuerte como específica.
Ejemplo 7
En el curso de analizar proteínas y metabolitos que coeluyen del experimento de SEC, se buscaron los que están presentes en la misma ruta metabólica, dado que esto puede indicar regulación por retroalimentación.
Se pudieron conformar dos ejemplos:
• El ácido pantoténico coeluía con 3-metil-2 oxobutanoato hidroximetil-transferasa 1, una enzima anterior de la síntesis del ácido pantoténico (Figura 8)
• La metiltioadenosina coeluía con metiltiorribosa-1-fosfato isomerasa (MTR-1-P), una enzima de la ruta de rescate de metionina (Figura 9).
Ejemplo 8
Identificación y caracterización de la interacción AMPc-Rbp47b
Introducción
Las interacciones proteína-metabolito (PMI) son esenciales en todos los aspectos de la regulación celular. Recientemente, para identificar potenciales moléculas pequeñas reguladoras debido a su presencia en complejos estables con proteínas, se desarrolló in enfoque sencillo basado en cofraccionamiento que explota las diferencias de tamaño entre los complejos proteína-metabolito y los metabolitos libres (Veyel et al. (2017) System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants. Sci Rep 7: 42387).
Aplicando análisis metabolómico de vanguardia (Giavalisco et al. (2011) Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using (13) C, (15) N and (34) S isotope labeling, in combination with high-resolution mass spectrometry. Plant J 68: 364-376) se identificó una multitud de moléculas pequeñas unidas a proteína, lo que sugiere la existencia de numerosos reguladores de molécula pequeña novedosos en células de Arabidopsis. Entre los metabolitos que cofraccionaban con proteínas se pudo identificar 2',3'-AMPc. En contraste con su isómero posicional 3',5'-AMPc, un segundo mensajero bien conocido, la función biológica de 2',3'-AMPc está lejos de ser entendida por completo. De hecho, fue solo en 2009 que (Ren et al. (2009) Identification and quantification of 2',3'-cAMP release by the kidney. J Pharmacol Exp Ther 328: 855-865) describieron la existencia de 2',3'-AMPc en material biológico. Desde entonces el 2',3'-cAMP se detectó tanto en células de mamífero como vegetales, sus niveles se corresponden con estrés y lesión (Van Damme et al. (2014) Wounding stress causes rapid increase in concentration of the naturally occurring 2',3'-isomers of cyclic guanosine- and cyclic adenosine monophosphate (cGMP and cAMP) in plant tissues. Phytochemistry 103: 59-66; Jackson et al. (2009) Extracellular 2',3'-caMp is a source of adenosine. J Biol Chem 284: 33097-33106; Verrier et al. (2012) The brain in vivo expresses the 2',3'-cAMP-adenosine pathway. J Neurochem 122: 115-125). El 2',3'-AMPc se forma durante la degradación de ARNm, cuando la hidrólisis del enlace P-O5' mediado por RNasas está acompañado por transfosforilación del ARNm para formar nucleótidos 2',3'-cíclicos (Thompson et al. (1994) Energetics of catalysis by ribonucleases: fate of the 2',3'-cyclic phosphodiester intermediate. Biochemistry 33: 7408-7414). Debido a la cola de poli-A de los ARNm, el 2',3'-AMPc es el más abundante de todos los nucleótidos 2',3'-cíclicos. Similar a su metabolismo, tampoco el papel de 2',3'-AMPc se entiende bien. En mitocondrias de cerebro de rata, se mostró que 2',3'-AMPc activa poros de transición mitocondrial (Azarashvili et al. (2009) Ca2+-dependent permeability transition regulation in rat brain mitochondria by 2',3'-cyclic nucleotides and 2',3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase. Am J Physiol Cell Physiol 296: C1428-1439), que produce apoptosis y necrosis. Para contrarrestar este efecto se sugiere que las células exportan 2',3'-AMPc al compartimento extracelular, donde se metaboliza a 2'-AMP y adenosina (Jackson et al. (2009) (loc. cit ); Jackson (2016) Discovery and Roles of 2',3'-cAMP in Biological Systems. Handb Exp Pharmacol.). Intrigados por nuestra observación de que el 2',3'-AMPc comigra con proteínas (Veyel (2017) (loc. cit.)), nos preguntamos si el 2',3'-AMPc podría o no servir como más que un simple intermedio en la ruta de rescate extracelular de 2',3'-AMPc adenosina.
En el presente documento, mostramos que 2',3'-AMPc forma un complejo con la proteína Rbp47b in vitro y en el lisado celular nativo. La proteína Rbp47p y su homólogo mamífero TIA1 están bien reconocidas como parte de la maquinaria de procesamiento de ARN (Kedersha et al. (1999) RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of elF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. Journal of Cell Biology 147: 1431-1441; Gilks et al. (2004) Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell 15: 5383-5398). En condiciones no estresadas Rbp47b/TIA1 se localiza en el núcleo, actuando como un componente de la maquinaria de ayuste del pre-ARNm (Gilks (2004) (loc. cit.); Lorkovic et al. (2000) RBP45 and RBP47, two oligouridylate-specific hnRNP-Iike proteins interacting with poly(A)+ RNA in nuclei of plant cells. RNA 6: 1610-1624). Tras el estrés Rbp47b/TIA1 se relocaliza al citoplasma, donde su agregación marca la formación de gránulos de estrés (Kedersha (1999) (loc. cit.); Weber et al. (2008) Plant stress granules and mRNA processing bodies are distinct from heat stress granules. Plant J 56: 517-530). Los SG son partículas de RNPm compuestas de grandes agregados de complejos de preiniciación de traducción paralizados, que contienen ARNm, subunidades ribosómicas de 40S, factores de iniciación de la traducción y proteínas de unión a A r N (RBP) (SG) (Kedersha (1999) (loc. cit.), Weber (2008) (loc. cit.); Kedersha et al. (2005) Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol 169:871-884; Anderson y Kedersha (2009) RNA granules: post-transcriptional and epigenetic modulators of gene expression. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 430-436; von Roretz et al. (2011) Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdiscip Rev RNA 2: 336-347; Mahboubi y Stochaj (2017) Cytoplasmic stress granules: Dynamic modulators of cell signaling and disease. Biochim Biophys Acta 1863: 884-895). El proceso de la formación de los SG es esencial para la supervivencia celular debido a su implicación en la represión de la traducción. En esencia, los SG secuestran ARNm de mantenimiento y factores reguladores de apoptosis, mientras excluyen ARNm de codifican proteínas implicadas en tolerancia a estrés. Los defectos en el ensamblaje y desensamblaje de los SG pueden contribuir a la neurodegeneración (Wolozin (2012) Regulated protein aggregation: stress granules and neurodegeneration. Mol Neurodegener 7: 56).
El ensamblaje de SG también es una diana en investigación de cáncer, ya que la presencia de SG en células cancerosas las hace más resistentes a tratamiento y propensas a metástasis (Mahboubi y Stochaj (2017) (loc. cit.)). Por el contrario, la integridad de los SG es importante para la resistencia vírica, al confinar ARN y proteínas víricos (Yoneyama et al. (2016) Regulation of antiviral innate immune signaling by stress-induced RNA granules. J Biochem 159: 279-286).
Al tener tal importancia clave para la salud humana, el ensamblaje y desensamblaje de los gránulos de estrés atrajo mucha atención en el pasado, y todavía hay mucho debate (Anderson y Kedersha (2008) Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends Biochem Sci 33:141-150; Wheeler et al. (2016) Distinct stages in stress granule assembly and disassembly. Elife 5). Los sucesos conocidos incluyen la fosforilación del factor de iniciación de la traducción eIF2 que impide la asociación de ARNtMet al complejo de preiniciación de 43S, y por tanto produce represión de la traducción. Más que experimentar traducción las moléculas de ARNm del complejo de 43S se asocian con las proteínas de unión a ARN, tal como Rbp47b y TIA1, que apoyan la agregación de proteínas y la formación de gránulos de estrés. El autoensamblaje de las proteínas Rbp47b/TIA1 depende de motivos de unión a ARN RRM, que se sabe reclutan ARNm, y en el dominio PRD de tipo prion que apoya las interacciones proteína-proteína (Gilks (2004) (loc. cit.); Weber (2008) (loc. cit.)). En línea con su actividad nucleadora de gránulos, la sobreexpresión de TIA-1 induce ensamblaje de SG, incluso en ausencia de estrés (Gilks (2004) (loc. cit.)).
Las modificaciones postraduccionales (PTM) de las proteínas de los SG pueden afectar la dinámica de los gránulos. Por ejemplo, la oxidación de la proteína TIA1 inhibe la formación de SG sensibilizando las células a apoptosis (Arimoto-Matsuzaki et al. (2016) TIA1 oxidation inhibits stress granule assembly and sensitizes cells to stress-induced apoptosis. Nat Commun 7: 10252).
Nuestra investigación indica que además de las PTM, el ensamblaje de los SG puede estar directamente regulado por un regulador de molécula pequeña, como 2',3'-AMPc, que no solo se une a Rbp47b/TIA1, sino que también fomenta su oligomerización. De esa manera, nuestra investigación es importante por un número de razones. Primero, asignamos una función reguladora importante a una novedosa molécula pequeña, que hasta la fecha solo se ha discutido como un subproducto de la degradación del ARN. Segundo, proporcionamos evidencia de la existencia de regulación por moléculas pequeñas durante la formación de gránulos de estrés, un proceso de importancia esencial durante la respuesta al estrés. Tercero, nuestros hallazgos señalan a un mecanismo conservado entre células eucariotas lo que sugiere importancia evolutiva.
Resultados
Identificación de la proteína receptora de 2',3'-AMPc en el extracto celular nativo
Para este fin nos dispusimos a identificar los compañeros proteicos de unión de 2',3'-AMPc aplicando purificación de afinidad (PA) usando perlas de agarosa con 2',3'-AMPc unido a través del grupo NH2 del anillo de purina. Después de la incubación de las perlas con los extractos de proteínas solubles totales de cultivos en suspensión de células de A. thaliana (cf. Materiales y métodos) se realizaron lavados secuenciales con ADP, GDP, 5'-AMP y por último 2',3'-AMPc, y las proteínas que eluyeron en los diferentes lavados se analizaron por proteómica de CL-EM/EM. Las proteínas que eluyeron de las perlas de agarosa exclusivamente con 2',3'-AMPc, pero estaban ausentes en cualquiera de los otros eluyentes (ADP, GDP, o 5'-AMP; Fig. 10A) se definieron como que se unen a 2',3'-AMPc. Aplicando este criterio riguroso solo una proteína permaneció: la proteína de unión a poliadenilato Rbp47b. Razonamos que la putativa formación de complejos Rbp47b-2',3'-AMPc in vivo se debe reflejar por perfiles de elución solapantes en gran parte de los dos componentes en un experimento de exclusión molecular (SEC), como en efecto era el caso (Fig. 10B). Para obtener evidencia adicional e independiente de la formación de un complejo entre Rbp47b y 2',3'-AMPc, realizamos un ensayo de desplazamiento térmico celular (CETSA) (Franken et al. (2015) Thermal proteome profiling for unbiased identification of direct and indirect drug targets using multiplexed quantitative mass spectrometry. Nat Protoc 10: 1567­ 1593). CESTA es un método usado en la investigación de fármacos para verificar la unión ligando-receptor en lisados celulares nativos, basado en la observación de que la presencia del ligando cambia la estabilidad térmica del receptor proteico. En el presente documento, adaptamos el protocolo para que fuera adecuado para el material vegetal y un metabolito endógeno 98. Usamos células de Arabidopsis que expresan una versión etiquetada de Rbp47b, de modo que el nivel de Rbp47b se pudiera detectar fácilmente con el anticuerpo anti-etiqueta. La incubación de los lisados de proteína nativos con 2',3'-AMPc 10 y 100 pM produjo desestabilización térmica de la proteína Rbp47b y cambio de su temperatura de fusión en 2,4 °C y 5,1 °C, respectivamente, lo que sugiere que el 2',3'-AMPc en efecto se une a Rbp47b (Fig. 10C). No se observó tal efecto en un experimento análogo en el que se usó el isómero posicional 3',5'-AMPc más que 2',3'-AMPc. En conjunto, tres enfoques experimentales independientes (PA, SEC y CESTA) proporcionan evidencia para la unión de 2',3'-AMPc a Rbp47b en el lisado de Arabidopsis nativo.
Confirmación in vitro de la interacción 2',3'-AMPc-Rbp47b
Aunque los resultados de la purificación de afinidad sugieren una unión específica de 2',3'-AMPc a Rbp47b, no se pudo extraer ninguna conclusión definitiva respecto a la afinidad de unión y por tanto la supuesta especificidad de unión. Por tanto, intentamos determinar la afinidad de unión in vitro biofísicamente usando termoforesis a microescala (MST) (Jerabek-Willemsen et al. (2011) Molecular interaction studies using microscale thermophoresis. Assay Drug Dev Technol 9: 342-353). MST explota el efecto del tamaño, carga y capa de hidratación en el movimiento de las moléculas en un gradiente de temperatura. La formación de complejos que produce la alteración de al menos uno de los tres parámetros lleva a movimiento diferencial, del que se puede determinar la afinidad de unión. Para los fines del experimento de MST, Rbp47b se expresó en y purificó de E. coli. Los resultados de MST muestran unión clara, con un valor de Kd de 1 pM. Lo más importante, no se observó ninguna unión para 3',5'-AMPc, lo que indica especificidad muy alta de Rbp47b para 2',3'-AMPc (Fig. 11A). El valor de Kd medido también corresponde a la concentración de ~20 pM de 2',3'-AMPc medida en el lisado de Arabidopsis nativo (Fig. 11B).
Significación biológica de la interacción 2',3'-AMPc-Rbp47b
En plantas los niveles de 2',3'-AMPc aumentan rápidamente en estrés de cicatrización (Van Damme (2014) (loc. cit.)). Para ensayar si el nivel de 2',3'-AMPc cambia en otras condiciones de estrés consultamos datos de metabolómica de evolución temporal de estrés de (Caldana et al. (2011) High-density kinetic analysis of the metabolomic and transcriptomic response of Arabidopsis to eight environmental conditions. Plant J 67: 869-884). Brevemente, se hicieron crecer rosetas Col-0 maduras (antes del rebrote) en el entorno control, se transfirieron a combinaciones de condiciones de estrés de luz (luz débil, luz fuerte, oscuridad) y temperatura (calor y frío) y se muestrearon en múltiples puntos de tiempo hasta 24 h después del inicio del estrés. 2',3'-AMPc se acumula en luz débil y oscuridad, pero lo más notablemente en estrés por calor (Fig. 12A), condiciones caracterizadas por degradación de ARN aumentada (Merret et al. (2013) XRN4 and LARP1 are required for a heat-triggered mRNA decay pathway involved in plant acclimation and survival during thermal stress. Cell Rep 5: 1279-1293; Baginsky y Gruissem (2002) Endonucleolytic activation directs dark-induced chloroplast mRNA degradation. Nucleic Acids Res 30: 4527-4533) y formación de gránulos de estrés (SG) (Kedersha (1999) (loc. cit.); Weber (2008) (loc. cit.)). En línea con la rápida acumulación de niveles de 2',3'-AMPctras el estrés por calor(en los primeros 20 min, Fig. 12A), Gutierrez-Beltran et al. (2015) (Tudor staphylococcal nuclease links formation of stress granules and processing bodies with mRNA catabolism in Arabidopsis. Plant Cell 27: 926-943) mostraron que se forman gránulos de estrés que contienen RFP-Rbp47b en los primeros 30 minutos de estrés por calor. Si la interacción tiene lugar en el citosol, donde están presentes tanto Rbp47b como 2',3'-AMPc, se esperaría que el 2',3'-AMPc pudiera influir la formación de los gránulos de estrés, lo que significa oligomerización de Rbp47b. Debido a la falta de derivado permeable a membrana de la molécula 2',3'-AMPc comercialmente disponible, no pudimos seguir la formación de gránulos de estrés in vivo. Sin embargo, ensayamos esta hipótesis directamente determinando la oligomerización de Rbp47b en presencia y ausencia de cantidades saturantes de 2',3'-AMPc por MST. Como se muestra en la figura 12B, el autoensamblaje de Rbp47b se produjo en ausencia de 2',3'-AMPc con un valor de Kd de 128 nM. Notablemente, se observó un cambio significativo en la constante de afinidad de oligomerización en presencia de cantidades saturantes (50 pM) de 2',3'-AMPc, que presentan un valor de Kd de 9 nM (Fig. 12B). Estos datos sugieren fuertemente que el 2',3'-AMPc, como resultado de su unión a Rbp47b, ejerce influencia directa en la oligomerización de esta proteína, y por tanto probablemente en el proceso de ensamblaje de los SG que requiere la oligomerización de Rbp47b. El 2',3'-AMPc, además de ser el producto de degradación de ARNm, podría desempeñar un papel regulador al influir la oligomerización de la proteína Rbp47b, que a su vez influye la formación de los SG.
Conservación evolutiva de la interacción 2',3'-AMPc-Rbp47b
Esperando que tal papel básico del 2',3'-AMPc esté conservado, realizamos un análisis similar con TIA1, el homólogo funcional humano de Rbp47b. Se marcó TIA1 y su interacción con 2',3'-AMPc se determinó usando MST. En línea con los resultados de Rbp47b, TIA1 recombinante formó un complejo con 2',3'-AMPc (Kd = 217 pM), pero no con 3',5'-AMPc (Fig. 13A). Lo más importante, aquí también el 2',3'-AMPc disminuyó la Kd para el autoensamblaje de TIA1, esta vez en un factor de 2 (de Kd = 36 nM a Kd = 20 nM en presencia de 2',3'-AMPc 50 pM; Fig. 13B), lo que demuestra un mecanismo notablemente conservado.
Discusión
2',3'-AMPc un regulador novedoso del ensamblaje de gránulos de estrés (SG)
El principal hallazgo de la investigación presentada en el presente documento es la unión específica y de alta afinidad de 2',3'-AMPc a la proteína Rbp47b de Arabidopsis, y su homólogo animal la proteína TIA1. Un valor de Kd de 1 pM, medido para la interacción Rbp47b-2',3'-AMPc está dentro del intervalo de afinidad de unión descrito para varias interacciones receptor-ligando, tal como entre el receptor de giberelina GID1 y 16,17-dihidro-GA4 (Kd = 1,4 pM), y entre ácido abscísico y el receptor PYR1 (Kd = 97 pM) (Ueguchi-Tanaka et al. (2005) GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature 437: 693-698; Dupeux et al. (2011) A thermodynamic switch modulates abscisic acid receptor sensitivity. EMBO J 30: 4171-4184). De esa manera, y en primer lugar asignamos una función reguladora importante a una novedosa molécula pequeña, que hasta la fecha solo se ha discutido como un subproducto de la degradación del ARN (Thompson (1994) (loc. cit.)). En las células la descomposición del ARNm se asocia con focos de RNPm citoplásmico, denominados cuerpos de procesamiento (cuerpos P, PB). La degradación del ARN relacionada con traducción paralizada se induce en condiciones de estrés tanto en animales como en plantas, por ejemplo, (Merret (2013) (loc. cit.); Heikkinen et al. (2003) Initiation-mediated mRNA decay in yeast affects heat-shock mRNAs, and works through decapping and 5'-to-3' hydrolysis. Nucleic Acids Res 31: 4006-4016; Soma F, Mogami J, Yoshida T, Abekura M, Takahashi F, et al. (2017) ABA-unresponsive SnRK2 protein kinases regulate mRNA decay under osmotic stress in plants. Nat Plants 3: 16204). Esto está acompañado por un número y tamaño aumentado de los PB (Sheth y Parker (2003) Decapping and decay of messenger r Na occur in cytoplasmic processing bodies. Science 300: 805-808; Xu et al. (2006) Arabidopsis d Cp2, DCP1, and VARICOSE form a decapping complex required for postembryonic development. Plant Cell 18: 3386-3398). También los niveles de 2',3'AMPc aumentan en estrés y lesión, por ejemplo, van Damme (2014) (loc. cit.), lo que encaja con el origen especulado de los nucleótidos 2',3'-cíclicos. Pudimos mostrar que el tratamiento con calor produce la acumulación de 2',3'-AMPc en los primeros 30 min después del inicio del estrés. Esta línea temporal coincide con la formación de gránulos de estrés (SG) desencadenada por calor (Kedersha (1999) (loc. cit.); Weber (2008) (loc. cit.)), desempeñando los focos de RNPm citoplásmicos un papel en la represión de la traducción, por estabilización selectiva y almacenamiento de los ARNm (Kedersha (1999) (loc. cit.); Weber (2008) (loc. cit.); Kedersha (2005) (loc. cit.); Anderson (2009) (loc. cit.)).
La agregación de Rbp47b/TIA1 es una clave incluso es la formación de SG y pudimos demostrar además que el autoensamblaje está facilitado por la unión de 2',3'-AMPc. De esa manera y en segundo lugar, proporcionamos evidencia para la existencia de regulación por moléculas pequeñas durante la formación de gránulos de estrés, además de las ya descritas PTM de las proteínas de los SG, por ejemplo, Arimoto-Matsuzaki (2016) (loc. cit.). Un producto de degradación del ARN, 2',3'-AMPc, es muy adecuado para tal papel, proporcionando un medio de regulación por retroalimentación negativa entre la degradación del ARN y el almacenamiento. Especulamos que en condiciones control la localización nuclear de Rbp47b/TIA1 previene que la interacción tenga lugar. En condiciones de estrés, con frecuencia acompañadas por un aumento rápido en los niveles de 2',3'-AMPc, Rbp47b/TIA1 migra al citoplasma, donde la interacción puede tener lugar, fomentando la formación de SG. Concluyendo, nuestros resultados sugieren que tanto en seres humanos como en plantas el 2',3'-AMPc podría ser un regulador clave del equilibrio entre degradación y almacenamiento de ARN.
Cromatografía de exclusión molecular como un punto de partida para estudios de receptores
La identificación de la diana de moléculas pequeñas es una tarea vital, pero aun formidable para la comunidad de bilogía química. Recientemente, propusimos la filtración por tamaño como un enfoque eficaz para la identificación global de moléculas pequeñas unidas de complejos de proteínas en un extracto celular nativo. Como tal este enfoque permite el cribado rápido de múltiples muestras biológicas para encontrar condiciones en que la molécula de elección está presente en un complejo de proteínas. Cuando se sigue por cromatografía de exclusión molecular (SEC), la identidad de un receptor proteico se puede inferir del perfil de coelución. Este estudio constituye una prueba de concepto para nuestro enfoque. Seleccionamos la molécula 2',3'-AMPc basado en su presencia en complejos de proteínas de cultivos de células de Arabidopsis en experimentos tanto de filtración por tamaño sencilla como SEC. El 2',3'-AMPc coeluyó con varios cientos de proteínas (datos no mostrados), y por tanto para restringir el número de compañeros proteicos candidatos, seguimos con la cromatografía de afinidad. La superposición de los dos enfoques produjo una proteína candidata, que se unía específicamente a la resina de 2',3'-AMPc y coeluía con 2',3'-AMPc en el experimento de SEC. La interacción Rbp47b-2',3'-AMPc se validó después por enfoques dirigidos (CETSA y MST). La tubería experimental presentada aquí tiene un número de ventajas (1) es eficaz respecto al tiempo (menos de un año) y trabajo (2) combina múltiples líneas de evidencia (3) combina enfoques in situ (extracto celular) e in vitro.
Materiales y métodos
Cultivos de células de Arabidopsis
Se hicieron crecer cultivos de células de Arabidopsis (Menges y Murray (2002), Synchronous Arabidopsis suspension cultures for analysis of cellcycle gene activity. Plant J. 30, 203-12) en medio MSMo suplementado con sacarosa al 3 %, quinetina 0,05 mg/l y ácido 1-naftalenoacético 0,5 mg/l en un agitador orbital a 130 RPM en la luz. Las células se pasaron semanalmente a medio reciente y se recogieron durante la fase de crecimiento logarítmico usando filtración rápida y congelación instantánea en nitrógeno líquido.
Preparación de lisado de Arabidopsis nativo
Se recogió material de células vegetales como se ha descrito anteriormente y se pulverizó a homogeneidad en nitrógeno líquido con mortero y mano, seguido por resuspensión en 1 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 25 mM pH 7,5; NaCl 0,5 M; MgCl2 15 mM; DTT 0,5 mM; NaF 1 mM; Na3VO40,1 mM; mezcla de inhibidores de proteasas 1x, Sigma-Aldrich P9599, Steinheim, Alemania) por 1 g de material vegetal. Los restos celulares se separaron por 10 min de centrifugación a 4 °C, 14.000 RPM. El lisado crudo se sometió a ultracentrifugación (45 min, 4 °C, 35.000 RPM) para obtener una fracción soluble denominada el lisado de Arabidopsis nativo.
Purificación de afinidad
Se compraron perlas de agarosa con 2',3'-AMPc personalizadas de Cube Biotech (Monheim, Alemania). El 2',3'-AMPc se acopló a las perlas usando el grupo amino (NH2) del anillo de purina y un brazo separador de 14 carbonos. Antes del uso, las perlas se equilibraron con tampón de lisis. Se combinaron 3 ml de lisado nativo (aproximadamente 90 mg de proteína total) con 150 pl de resina de agarosa (véase anteriormente), se incubó durante 1 h en una rueda giratoria a 4 °C (unión), se transfirió a una columna Mobicol “Classic” (filtro de tamaño de poro de 35 pM) y se lavó con 10 ml de tampón de lavado (Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5; NaCl 0,5 M). Se añadieron 400 pl de adenosina difosfato (Sigma 01905) 1 mM disuelta en tampón de lisis a las perlas, seguido por incubación de 1h a 4 °C en un agitador de mesa (1.000 RPM). Se recogió el eluato y las perlas se lavaron con 10 ml de tampón de lavado. El procedimiento se repitió usando guanosina difosfato (Sigma G7127) 1 mM, 5'-adenosina monofosfato (Sigma A2252) 1 mM, y 2',3'-AMPc (Sigma A9376) 1 mM. Las proteínas se precipitaron usando 2,5 volúmenes de acetona previamente enfriada. Los precipitados de proteína se secaron en un concentrador de vacío y se almacenaron a -20 °C.
Cromatografía de exclusión molecular
Se realizó como se describe en Veyel (2017) (loc. cit.). Brevemente, se usaron 2,5 ml de fracción soluble correspondiente a 50 mg de proteína para las separaciones en experimento de SEC. La separación se realizó usando una columna HiLoad 16/600 Superdex 200 calidad prep (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, RU) conectada a un explorador ÁKTA 10 (GE Healthcare Life Science, Little Chalfont, RU) que opera a 4 °C. Con la velocidad de flujo 0,8 ml/min se recogieron 57 fracciones de las que se secó 1 ml en una speed-vac durante la noche y se almacenó a -80 °C para análisis metabolómico y proteómico. Como experimento control sin proteína, 50 mg de proteína de la fracción soluble se precipitaron con acetona al 80 % a -20 °C. Las proteínas desnaturalizadas se sedimentaron por centrifugación y el sobrenadante se secó durante la noche en una speed-vac. Las moléculas pequeñas se resuspendieron al día siguiente en el volumen original de tampón de lisis y se usaron para separación por tamaño.
Proteómica: preparación de la muestra e identificación de proteína.
Realizada como se describe en Veyel (2017) (loc. cit.).
Ensayo de desplazamiento térmico celular y análisis por inmunotransferencia
Se prepararon líneas con Rbp47b etiquetada con TAP y con vector vacío como se describe por (Van Leene et al. (2015) An improved toolbox to unravel the plant cellular machinery by tandem affinity purification of Arabidopsis protein complexes. Nat Protoc 10: 169-187) usando el vector binario pKCS y transformación de Agrobacterium estándar. El lisado de Arabidopsis nativo se incubó con 2',3'-AMPc 10 o 100 pM y con DMSO (usado para la preparación de la solución de AMPc) como control durante 30 min a temperatura ambiente con mezclado. Se adaptaron etapas adicionales de Franken (2015) (loc. cit.). Brevemente, con el fin de aplicar un tratamiento de temperatura de 3 min usamos un termociclador de PCR (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) con las siguientes temperaturas: 39,9; 41,7; 43,5; 45,8; 48,4; 51,1; 53,8; 56,2; y 59,9 °C. Las proteínas desnaturalizadas se sedimentaron por centrifugación (1 min, 14.000 RPM). Las proteínas solubles restantes se precipitaron usando 2,5 volúmenes de acetona previamente enfriada. Los precipitados de proteínas, resuspendidos en urea 6 M/tiourea 2 M, pH 8, se separaron por SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 10 %, seguido por transferencia a una membrana de difluoruro de polivinilideno (BioRad, Múnich, Alemania). Se realizaron después incubaciones con el anticuerpo del complejo soluble anti-peroxidasa peroxidasa (Sigma P1291) y etapas de lavado con solución salina tamponada en Tris/Tween 20 al 1 %. Se usó el kit SuperSignal™ West Pico Chemiluminiscent Substrate (Thermo Fisher 340802, Bremen, Alemania) como un sistema de detección.
Análisis de datos del experimento de evolución temporal
Las muestras de Arabidopsis de calor y oscuridad son del experimento de evolución temporal (Caldana (2001) (loc. cit.)). Se detectó 2',3'-AMPc usando cromatografía líquida de ultra-rendimiento acoplada a un espectrómetro de masas Exactive (Thermo Fisher) en modo de ionización positiva y negativa como se ha descrito previamente (Giavalisco (2011) (loc. cit.)). Se hizo la anotación permitiendo desviación de 0,1 RT y 5 ppm 265 del compuesto de referencia, apoyado por los datos de fragmentación.
Cuantificación absoluta de 2',3'-AMPc
Se añadió compuesto de referencia 2',3'-AMPc (Sigma A9376) en extracto celular (fracción soluble; véase anteriormente) en concentraciones que variaban desde 100 pM a 1 mM. Para poder distinguir entre el 2',3'-AMPc endógeno y el compuesto de referencia, el lisado se obtuvo de células marcadas con 15N (Kierszniowska et al. (2009) Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection of candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics 9: 1916-1924). El 2',3'-AMPc endógeno se detectó con m/z = 333,03 (M-H) mientras el compuesto de referencia con m/z = 328,05 (M-H), la diferencia corresponde a cinco átomos de nitrógeno. Todas las muestras se extrajeron mediante un sistema de solventes metil-tert-butil éter (MTBE)/metanol/agua para separar proteínas, lípidos y compuestos polares en sedimento, fases orgánica y acuosa, respectivamente (Giavalisco (2011) (loc. cit.)). Las muestras se midieron usando cromatografía líquida de ultrarendimiento acoplada a un espectrómetro de masas Exactive (Thermo Fisher) en modo de ionización positiva y negativa como se ha descrito previamente (Giavalisco (2011) (loc. cit.)). Se usó la intensidad relativa medida para concentraciones crecientes de estándar de 2',3'-AMPc para representar una curva de calibración; lineal en el intervalo de 100 nM a 100 pM.
Fuente de proteínas recombinantes
La proteína TIA1 se compró de Origene (Herford, Alemania). Rbp47b se clonó como una fusión GFP C-terminal (para aumentar la solubilidad de la proteína) en el vector de expresión de E. coli pDEST14 que contiene etiqueta His6 en el extremo N del casete Gateway (Karlsruhe, Alemania). Se hicieron crecer células de roseta que expresan His6-Rbp47b-GFP a 28 °C durante la noche y al día siguiente se movieron al medio Terrific Broth suministrado con sacarosa al 1 % y antibióticos relevantes. Los cultivos a DO 0,4 se indujeron por la adición de IPTG 0,1 mM y se transfirieron a 16 °C para incubación durante la noche.
Al día siguientes, las células se rompieron con un homogenizador Avestin (Mannheim, Alemania) EmulsiFlex C3 y la proteína se purificó usando purificación con gradiente de imidazol en Ni-NTA agarosa (Qiagen 34080, Hilden, Alemania). A continuación, se realizó cromatografía de exclusión molecular y se recogieron doce fracciones de proteína. Rbp47b eluyó en dos fracciones, primero como fusión His6-Rbp47b-GFP, segundo como fusión His6-Rbp47b: el corte espontáneo de la etiqueta GFP es un fenómeno documentado (Bird et al. (2015) Green fluorescent proteinbased expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp: e52357). Se usó His6-Rbp47b para medidas de MST. La pureza de la proteína se evaluó por SDS-PAGE y la identificación de la proteína se hizo usando inmunotransferencia usando anticuerpos anti-His6.
Termoforesis a microescala
Las medidas de MST se realizaron usando un instrumento Monolith NT.115 (NanoTemper, Múnich, Alemania). Los capilares se cargaron en el instrumento como conjuntos de 13-16 titulaciones de ligando puntuales. Las proteínas (Rbp47b y TIA1) se marcaron en tampón fosfato (PBS) usando el kit de marcaje de proteínas Monolith™ RED-NHS (amino reactivo; MO-L001) según las instrucciones del fabricante. La excitación se optimizó variando la potencia LED para dar intensidades de emisión por encima de 200 UA, correspondientes a proteína marcada 10-50 nM. La potencia de Monolith se ajustó al 60 %. Los ligandos [2',3'-AMPc (Sigma A9376)] y [3',5'-AMPc (Sigma A6885)] se disolvieron en PBS. Se usaron Tween al 0,5 % y capilares recubiertos superiores para prevenir la adhesión. Se usaron TIA1 y Rbp47b sin marcar como ligandos en los experimentos de autoensamblaje. Se usó software de análisis de afinidad m O para analizar (cálculo de Kd) y visualizar los datos. Los datos presentados son de 2-3 replicados técnicos.

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método para determinar ligandos de macromoléculas en una muestra, en donde dicha muestra es un extracto celular sin células, dicho método comprende o consiste en
    (a) someter dicha muestra que comprende (i) complejos formados por dichas macromoléculas y dichos ligandos y (ii) ligandos sin unir a un método que separa dichos complejos de dichos ligandos sin unir, en donde dicho método da fracciones y en donde dicho método es cromatografía de exclusión molecular (SEC);
    (b) liberar ligandos de los complejos obtenidos en la etapa (a); y
    (c) someter los ligandos liberados obtenidos en la etapa (b) a un método de análisis químico, determinando de esta manera dichos ligandos de dichas macromoléculas;
    (d) determinar una o más macromoléculas que estaban unidas a los ligandos por un análisis químico; en donde dicho método comprende además la etapa de
    (e) determinar qué ligando se une a qué macromolécula determinando la cantidad de un ligando determinado en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicho ligando determinado, determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicha macromolécula y comparando los perfiles de elución obtenidos de ligandos con tales perfiles de elución obtenidos de macromoléculas.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho extracto celular es un lisado celular.
  3. 3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde
    (i) dichas fracciones cubren un intervalo de masa molecular desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 10000 kDa; y/o
    (ii) se recogen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones.
  4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es para identificar macromoléculas modulables por fármacos y en el que una macromolécula que se une a un ligando se identifica como que es una macromolécula modulable por fármacos.
  5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho método de análisis químico es espectrometría de masas (EM), resonancia magnética nuclear (RMN), secuenciación y/o detección por anticuerpos.
  6. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho ligando es un ligando no covalente.
  7. 7. El método de la reivindicación 6, en donde dicha liberación en la etapa (b) se efectúa por desnaturalización de dichos complejos.
  8. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho método además comprende una, más o todas de las siguientes etapas adicionales:
    (aa) antes de la etapa (a), romper las células que comprenden dichas macromoléculas y opcionalmente dichos ligandos, seguido por eliminación del material insoluble;
    (ab) después de la etapa (a) y antes de la etapa (b), lavar;
    (ca) después de la etapa (b) y antes de la etapa (c), eliminar macromoléculas, extrayendo los ligandos y/o realizando cromatografía líquida (CL) o cromatografía de gases (CG) de los ligandos, o, si es aplicable, de los ligandos extraídos, en donde preferiblemente dicha CL o CG, en la medida que se realiza, se efectúa en un dispositivo de CL/EM en línea, un dispositivo de CL/RMN en línea, y un dispositivo de CG/EM en línea, o un dispositivo de CG/RMN en línea;
    (da) después de la etapa (b) y antes de la etapa (d), extraer macromoléculas y opcionalmente realizar CL de las macromoléculas extraídas, en donde preferiblemente la CL se efectúa en un dispositivo de CL/EM en línea o un dispositivo de CL/RMN en línea.
  9. 9. Un método de identificar, de una pluralidad de compuestos de prueba, (un) ligando(s) de una pluralidad de macromoléculas, dicho método comprende o consiste en:
    (a) poner en contacto dichas macromoléculas con dicha pluralidad de compuestos de prueba;
    (b) someter la mezcla obtenida en la etapa (a) a un método que separa complejos, si hay alguno, formados entre dichas macromoléculas y (un) ligando(s) de los compuestos de prueba sin unir, en donde dicho método da fracciones y en donde dicho método es cromatografía de exclusión molecular (SEC);
    (c) disociar los complejos, liberando de esta manera ligandos unidos, si hay alguno, de las macromoléculas; (d) someter el/los ligando(s) liberado(s) obtenido(s) en la etapa (c), si hay alguno, a un método de análisis químico, identificando de esta manera un(os) ligando(s) de dichas macromoléculas;
    (e) determinar una o más macromoléculas que estaban unidas a los ligandos por un análisis químico; en donde dicho método además comprende la etapa de
    (f) determinar qué ligando se une a qué macromolécula determinando la cantidad de un ligando determinado en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicho ligando determinado, determinando la cantidad de una macromolécula determinada en cada una de dichas fracciones, obteniendo de esta manera un perfil de elución de dicha macromolécula y comparando los perfiles de elución obtenidos de ligandos con tales perfiles de elución obtenidos de macromoléculas
  10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde
    (i) dicha(s) macromolécula(s) es/son (una) proteína(s) o (un) ácido(s) nucleico(s), preferiblemente ARN; y/o (ii) dicha pluralidad de macromoléculas son 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 macromoléculas.
  11. 11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde dicho método de análisis químico de la etapa (d) o (e) es espectrometría de masas (EM) o resonancia magnética nuclear (RMN).
ES17725620T 2016-05-30 2017-05-29 Identificación de ligandos por cofraccionamiento Active ES2899110T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16172000 2016-05-30
PCT/EP2017/062841 WO2017207460A1 (en) 2016-05-30 2017-05-29 Ligand identification by co-fractionation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2899110T3 true ES2899110T3 (es) 2022-03-10

Family

ID=56119308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17725620T Active ES2899110T3 (es) 2016-05-30 2017-05-29 Identificación de ligandos por cofraccionamiento

Country Status (15)

Country Link
US (1) US10976310B2 (es)
EP (1) EP3465207B1 (es)
KR (1) KR102346785B1 (es)
CN (1) CN109219750B (es)
AU (1) AU2017272493B2 (es)
BR (1) BR112018074856A2 (es)
DK (1) DK3465207T3 (es)
ES (1) ES2899110T3 (es)
HU (1) HUE056359T2 (es)
LT (1) LT3465207T (es)
PL (1) PL3465207T3 (es)
PT (1) PT3465207T (es)
SG (1) SG11201810531TA (es)
SI (1) SI3465207T1 (es)
WO (1) WO2017207460A1 (es)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3115315A1 (en) 2018-10-15 2020-04-23 Anthony A. HYMAN Compounds for treatment of diseases and methods of screening therefor
US11493519B2 (en) 2019-02-08 2022-11-08 Dewpoint Therapeutics, Inc. Methods of characterizing condensate-associated characteristics of compounds and uses thereof
JP2022548695A (ja) 2019-09-18 2022-11-21 デューポイント セラピューティクス， インコーポレイテッド 凝縮体関連特異性のスクリーニング方法及びその使用
JP7327096B2 (ja) * 2019-11-13 2023-08-16 株式会社島津製作所 分子の分離方法
KR20220137672A (ko) * 2020-02-13 2022-10-12 에프. 호프만-라 로슈 아게 핵 자기 공명 이완법으로 aav 입자의 부하 상태를 결정하는 방법
CN113528497B (zh) * 2021-07-22 2022-06-24 中国林业科学研究院林业研究所 Fba8基因或fba8蛋白在制备具有磷酸转移活性和/或蛋白水解活性的试剂中的应用
WO2024112940A1 (en) * 2022-11-26 2024-05-30 Enveda Therapeutics, Inc. Methods and systems for identifying compounds for forming, stabilizing or disrupting molecular complexes
CN118685492A (zh) * 2024-03-08 2024-09-24 西湖实验室(生命科学和生物医学浙江省实验室) 微量新鲜样本六组学连续提取方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4459359A (en) 1981-11-19 1984-07-10 New York Blood Center, Inc. Sensitive immunoassays of antigens or antibodies sequestered within immune complexes
CA2369868A1 (en) * 1999-04-15 2000-10-26 The University Of Virginia Patent Foundation Proteome mining
JP2005535727A (ja) * 2002-08-14 2005-11-24 ブランシェット・ロックフェラー・ニューロサイエンスィズ・インスティテュート タンパク質−タンパク質相互作用に関与するタンパク質亜集団の単離方法
WO2006015796A1 (en) * 2004-08-09 2006-02-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for high-throughput screening of test molecules binding to target molecules
US20150105280A1 (en) 2010-03-10 2015-04-16 Perfinity Biosciences, Inc. Selector based recognition and quantification system and method for multiple analytes in a single analysis
AU2013347838A1 (en) 2012-11-26 2015-06-11 Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh Biomarker compositions and methods

Also Published As

Publication number Publication date
CA3025711A1 (en) 2017-12-07
BR112018074856A2 (pt) 2019-03-06
KR20190013999A (ko) 2019-02-11
EP3465207B1 (en) 2021-09-01
SG11201810531TA (en) 2018-12-28
SI3465207T1 (sl) 2022-01-31
PT3465207T (pt) 2021-11-30
US10976310B2 (en) 2021-04-13
LT3465207T (lt) 2021-12-10
AU2017272493B2 (en) 2021-07-22
EP3465207A1 (en) 2019-04-10
AU2017272493A1 (en) 2018-12-20
HUE056359T2 (hu) 2022-02-28
WO2017207460A1 (en) 2017-12-07
KR102346785B1 (ko) 2022-01-04
PL3465207T3 (pl) 2022-01-17
DK3465207T3 (da) 2021-11-15
CN109219750B (zh) 2022-05-31
CN109219750A (zh) 2019-01-15
US20190361012A1 (en) 2019-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2899110T3 (es) Identificación de ligandos por cofraccionamiento
Albanese et al. How paired PSII–LHCII supercomplexes mediate the stacking of plant thylakoid membranes unveiled by structural mass-spectrometry
Shchepachev et al. Defining the RNA interactome by total RNA‐associated protein purification
González-Prieto et al. Global non-covalent SUMO interaction networks reveal SUMO-dependent stabilization of the non-homologous end joining complex
Strunk et al. Powering through ribosome assembly
Watts et al. Interactome analyses identify ties of prpc and its mammalian paralogs to oligomannosidic n-glycans and endoplasmic reticulum-derived chaperones
Valverde et al. A cyclin-dependent kinase-mediated phosphorylation switch of disordered protein condensation
Pallotta et al. Native protein complexes in the cytoplasm of red blood cells
Burkhead et al. COMMD1 forms oligomeric complexes targeted to the endocytic membranes via specific interactions with phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate
US9434765B2 (en) High affinity SUMO traps
Li et al. Spatiotemporal protein interactome profiling through condensation-enhanced photocrosslinking
Bronkhorst et al. An extended Tudor domain within Vreteno interconnects Gtsf1L and Ago3 for piRNA biogenesis in Bombyx mori
Francisco-Velilla et al. Phosphorylation of T897 in the dimerization domain of Gemin5 modulates protein interactions and translation regulation
Corradini et al. Alterations in the cerebellar (Phospho) proteome of a cyclic guanosine monophosphate (cGMP)-dependent protein kinase knockout mouse
CN116375780B (zh) 一种用于识别gtp结合蛋白的光亲和探针及其制备方法和应用
Luerman et al. Identification of phosphoproteins associated with human neutrophil granules following chemotactic peptide stimulation
WO2024261269A1 (en) Method for detecting ligand-target interactions using solvent- induced precipitation in intact cells
CA3025711C (en) Ligand identification by co-fractionation
Zhang et al. Towards the N-terminal acetylome: an N-terminal acetylated peptide enrichment method using CNBr-activated sepharose resin
Farley et al. Assessing the components of the eIF3 complex and their phosphorylation status
CN104072618B (zh) 人工构建的杂种泛素结合结构域多肽及其应用
Hunke et al. Approaches to analyze protein–protein interactions of membrane proteins
Fernández et al. A strong cation exchange chromatography protocol for examining N-terminal proteoforms
Kejiou et al. Pyruvate kinase M links glucose availability to protein synthesis
Wu et al. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells