ES2899174T3 - Método y composiciones para el funcionamiento mejorado del efecto antitumoral de las células T - Google Patents

Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que está codificado por el ADN de SEQ ID NO: 39.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y composiciones para el funcionamiento mejorado del efecto antitumoral de las células T

Declaración sobre investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno en forma de Subvención de Apoyo al Centro de Cáncer núm. P30-CA33572-21 del Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos sobre la invención.

Antecedentes de la invención

1. Campo técnico

La invención se refiere al campo de la biomedicina y específicamente a métodos útiles para la terapia del cáncer. En particular, la invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico (CAR) para estrategias inmunoterapéuticas CTL específicas para el cáncer que incluyen el uso de linfocitos T modificados genéticamente que expresan inmunorreceptores quiméricos en el tratamiento de tumores cerebrales humanos y otros cánceres.

2. Descripción de la técnica anterior

Se han investigado inmunoterapias basadas en células T específicas de tumor para el tratamiento antitumoral, sin embargo, las células T adolecen del problema de no sobrevivir y permanecer activas in vivo durante un período suficientemente largo. A menudo, las células T transferidas de forma adoptiva no tienen la potencia y duración deseadas para la destrucción de las células tumorales. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de terapias contra el cáncer específicas de tumores con funcionamiento antitumoral a más largo plazo.

Las inmunoterapias dirigidas contra el cáncer tradicionalmente se centran en provocar respuestas de CTL CD8+. Sin embargo, la estimulación de las respuestas de las células T CD4+ (auxiliares) también es importante para una inmunoterapia exitosa contra el cáncer. Las células T CD4+ pueden influir en las respuestas CTL específicas de tumores naturales directa o indirectamente, mediante el acondicionamiento de células presentadoras de antígenos profesionales a través de CD40-CD40L y mediante la producción de citocinas como IL2 e IFN-y. Los mecanismos efectores citocidas utilizados por las células T CD4+ están mediados por la liberación de citocinas que activan los receptores de muerte en la superficie de la célula tumoral, o por contacto celular directo donde Fas/FasL, ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) o las rutas dependientes de granzima perforina median la apoptosis de las células tumorales. Estas células auxiliares pueden aumentar la expansión clonal temprana y la generación de efectores primarios de CTL CD8+, y también pueden afectar tanto la generación como la expansión de las células T CD8+ de memoria funcional.

La activación completa de las células T CD4+ naturales requiere una señal específica de antígeno a través del acoplamiento del complejo receptor de células T/CD3 con complejos de péptido/MHC clase II apropiados y señales coestimuladoras. Estas señales coestimuladoras suelen ser entregadas por ligandos que se expresan selectivamente en células especializadas presentadoras de antígenos. Se cree que la coestimulación de células T ayuda a mantener la tolerancia a los autoantígenos normales expresados por tejidos que no envían esta señal secundaria. Debido a que la mayoría de las células tumorales, al igual que los tejidos normales, no expresan MHC de clase II o moléculas coestimuladoras, es lógico que tampoco promuevan directamente la estimulación de las células T CD4+. Esta teoría está respaldada por varios estudios que han demostrado una mayor inmunidad antitumoral mediada por células T mediante la vacunación con células tumorales que fueron transfectadas con el ligando coestimulador B7-1.

Aunque alterar la expresión de las células tumorales de moléculas coestimuladoras es una forma de ayudar a impulsar la activación de las células T, serían muy deseables estrategias alternativas, en particular estrategias que implican permitir que las células T reciban y actúen sobre señales coestimuladoras sin la necesidad de un ligando coestimulador real (s).

El documento WO2008/095141 divulga células T reguladoras redirigidas dotadas de especificidad hacia un antígeno o ligando diana seleccionado y su uso en la supresión de enfermedades autoinmunes. El documento US2003/0171546 A1 se refiere a inmunorreceptores transmembrana quiméricos para redirigir la especificidad antigénica de las células T, con aplicación al tratamiento de una variedad de cánceres. En particular, el documento US2003/0171546 A1 divulga un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de tumor con un dispositivo de señalización coestimuladora de CD28. El documento US2005/0113564 A1 divulga un método para potenciar la actividad de un receptor de antígeno quimérico contra un tumor, que comprende añadir un dominio de señalización CD28 o 4-1BB a dicho receptor. Resumen de la invención

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) como se reivindica en la reivindicación 1 a continuación, para el funcionamiento efector antitumoral mejorado de las células T CD4+ y CD8+ para la inmunoterapia del cáncer. Los inmunorreceptores transmembrana quiméricos (denominados receptores de antígenos quiméricos o “CAR”) comprenden un dominio extracelular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El dominio extracelular está formado por un ligando de receptor soluble (que es específico para un antígeno tumoral diana u otra molécula de la superficie de la célula tumoral) unido a una región de soporte opcional capaz de unir el dominio extracelular a la superficie celular. El dominio de señalización intracelular contiene el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 humano (CD3Z) y los dominios de señalización coestimuladores de CD28 y 4-1BB. El dominio extracelular contiene un elemento de reconocimiento que permite al CAR, cuando se expresa en la superficie de una célula T, dirigir la actividad de la célula T a aquellas células que expresan un receptor o ligando para el que este elemento de reconocimiento es específico. Por ejemplo, un CAR que contiene un dominio extracelular que contiene un elemento de reconocimiento específico para un antígeno tumoral puede dirigir la actividad de las células T a las células tumorales que portan este antígeno. La región intracelular permite que la célula T reciba señales coestimuladoras. Los dominios de señalización coestimuladores son CD28 y 4-1BB. El receptor quimérico comprende una región transmembrana de CD4 humana, una Fc de IgG4 humana y un receptor o ligando de IL13 que es específico de tumor. La molécula IL13 contiene la mutación E13Y, como en IL13-CD28-41BBZ.

Las realizaciones de la invención también abarcan linfocitos T aislados que expresan el CAR discutido en el presente documento. Además, las realizaciones de la invención incluyen métodos de inmunoterapia contra el cáncer que comprenden administrar a un paciente que lo necesite tales linfocitos T, incluidos los tratamientos para cualquiera de los siguientes cánceres: glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de ovario cáncer, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena aguda y neoplasias malignas de linaje B.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación esquemática de las moléculas de proteína del receptor de antígeno quimérico (CAR) IE13Z e IL13-CD28-41BBZ.

La Figura 2 muestra las ubicaciones de cebadores ejemplares para la construcción de CAR de IE13Z en la secuencia de IL13 nativa como se indica. Las flechas indican la posición de los cebadores en la secuencia de lL13.

La Figura 3 (proporcionada como Figuras 3A-3C) proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica la zetaquina IL13 ejemplar (SEQ ID NO: 5, cadena superior; ^s E^q ID NO: 6 , cadena inferior). Los segmentos de ADN en la secuencia incluyen el péptido señal alfa de GM-CSFR (SEQ ID NO: 7), IL13 (E13Y) (SEQ ID NO: 8), IgG4 (SmP) (SEQ ID NO: 9), CD4tm (SEQ ID NO: 10) y CD3zeta (SEQ ID NO: 11). La secuencia de aminoácidos completa se proporciona como SEQ ID NO: 4.

La Figura 4 es un mapa del vector IL13zetaquina/HyTK-pMG. En la Figura 5 se proporciona una secuencia ejemplar de dicho vector.

La Figura 5 (dada como Figuras 5A-5L) proporciona la secuencia de un ejemplo de vector de ADN plasmídico (SEQ ID NO: 13, cadena superior; SEQ ID NO: 14, cadena inferior). También se indican una secuencia de aminoácidos de IL13zetaquina (SEQ ID NO: 15) y una secuencia de aminoácidos de HyTk (SEQ ID NO: 16). Los segmentos de ADN que componen la secuencia completa incluyen hEFlp (nucleótidos 6-549; SEQ ID NO: 41), IL13zetaquina (nucleótidos 690-2183; SEQ ID NO: 42), sv40pAn tardío (nucleótidos 2230-2498; SEQ ID NO: 43), Ori ColE1 (nucleótidos 2499­ 3245; SEQ ID NO: 44), SpAn (nucleótidos 3246-3432; SEQ ID NO: 45), hCMV-1Aprom (nucleótidos 3433-4075; SEQ ID NO: 46), HyTK (nucleótidos 4244-6319; SEQ ID NO: 47) y BGh pAna (nucleótidos 6320-6618; SEQ ID NO: 48).

La Figura 6 contiene dos representaciones esquemáticas de construcciones de plásmidos lineales CAR ejemplares. La Figura 6A muestra una construcción IL13Z y la Figura 6B muestra una construcción IL13-CD28-41BBZ.

La Figura 7 muestra el análisis de transferencia Western de lisados celulares derivados de células T CD4+ transfectadas con IL13Z e IL13-CD28-41BBZ para expresión de CAR usando un mAb específico de CD3Z antihumano de ratón.

La Figura 8 es un panel de ocho análisis de citometría de flujo que comparan el fenotipo de la superficie celular de las células CD4+ en volumen que expresan IL13Z e IL13-CD28-41Bb .^

La Figura 9 es un panel de seis gráficos que muestran los resultados de la citometría de flujo de la tinción de la superficie de HLA-A2 y HLA-DR (moléculas MHC), IL13Ra2 y las moléculas coestimuladoras CD80, CD86 y CD137-L (4-1BBL) (histogramas rellenos) como se indica, en comparación con controles de isotipo (histogramas abiertos) en células diana de glioma U87.

La Figura 10 es una serie de inmunotransferencias que muestran los resultados de un ensayo de quinasa para determinar la cinética de la activación de JNK y p38 (3a ) y AKT (3B), que se mide mediante la fosforilación de sus respectivos sustratos (es decir, P-cJun (protooncogén c-Jun fosforilado), p-GSK3 (glucógeno de sintasa quinasa 3 fosforilada) y P-ATF2 (factor 2 de transcripción activador fosforilado)).

La Figura 11 muestra la polarización Thi mejorada de células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ en términos de ARNm de citocina Th1 de células T (Figura 11A) y producción de proteína de citocina Th1 y Th2 (Figura 11B).

La Figura 12A proporciona datos que muestran una actividad citotóxica mejorada de las células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ (■) contra las dianas U87 en comparación con la de las células T IL13Z+ CD4+ (O) en la relación E: T indicada en un ensayo de citotoxicidad de luciferasa de 4 horas (LCA). La Figura 12B muestra datos similares para las células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ (barras negras) y las células T IL13Z+ CD4+ (barras blancas) cocultivadas durante 48 horas en una relación E: T de 2: 1, y luego nuevamente co-cultivado durante 48 horas adicionales después de la adición de dianas frescas en la misma proporción E: T. La Figura 12C proporciona datos obtenidos con imágenes de video de células T que expresan el c Ar indicado cocultivado con células U87 adherentes, lo que indica el número de células viables por imagen.

La Figura 13 proporciona datos de flujo que muestran un efecto antitumoral sostenido contra xenoinjertos de glioblastoma establecidos in vivo por células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+. También se muestran los resultados observados con células T transfectadas con IL13Z y simuladamente.

La Figura 14 proporciona la secuencia de IL13-IgG4-cd28tm-CD28gg-Zeta (CO)(SEQ ID NO: 36).

La Figura 15 proporciona la secuencia de IL13-IgG4-cd4tm-CD28-4-1BB-Zeta, también denominada en el presente documento IL13-CD28-41BBZ utilizada/discutida anteriormente con respecto a los ejemplos siguientes (SEQ ID NO: 37). Esta secuencia se usó para alterar genéticamente las células T para expresar el CAR de IL13-CD28-41BBZ como se describe y se usa en las Figuras 1, 6 , 7, 8 , 10, 11, 12 y 13.

La Figura 16 proporciona la secuencia de IL13-IgG4-cd28tm-CD28-Ox40-Zeta (SEQ ID NO: 38).

La Figura 17 proporciona la secuencia de IL13-IgG4-cd28tm-CD28gg-4-1BB-Zeta (SEQ ID NO: 39).

La Figura 18 proporciona la secuencia de H-13-IgG4-cd28tm-CD28ggA199-4-1BB-Zeta (SEQ ID NO: 40).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La inmunoterapia adoptiva que utiliza linfocitos T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) específicos de tumores puede ser una poderosa estrategia terapéutica para el tratamiento del cáncer. Los CAR están formados por un elemento de reconocimiento específico extracelular (como un receptor que se une a un antígeno tumoral) unido a través de un dominio transmembrana al dominio de señalización citoplásmico CD3Z. Por lo tanto, estos receptores son capaces tanto de unirse al antígeno como de transducir la activación de las células T, independientemente de la restricción del MHC. Por tanto, los CAR son inmunorreceptores “universales” que pueden tratar una población de pacientes con tumores con antígeno positivo independientemente de su genotipo HLA.

De acuerdo con las realizaciones de esta invención, los CAR contienen el dominio de señalización para CD3Z y los dominios de señalización de uno o más receptores coestimuladores que promueven aún más el reciclaje, supervivencia y/o expansión de células transferidas adoptivamente que expresan los CAR, además de receptores que permiten que las células se involucren en objetivos como los tumores. Los dominios de señalización de los receptores coestimuladores son las porciones intracelulares de cada proteína receptora que generan la señal de activación en la célula. Son ejemplos los aminoácidos 180-220 de la molécula CD28 nativa y los aminoácidos 214-255 de la molécula 4-1BB nativa. Un CAR especialmente preferido comprende un elemento de reconocimiento extracelular que es específico para un receptor de superficie de células cancerosas único, es estable in vivo y tiene baja inmunogenicidad. La derivación de una molécula de señal celular soluble de origen natural ayuda a lograr estos objetivos.

El término “CAR” se refiere a un receptor de antígeno quimérico que es una biomolécula recombinante que contiene un dominio de reconocimiento extracelular, una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular. El término “antígeno”, por lo tanto, no se limita a moléculas que se unen a anticuerpos, sino a cualquier molécula que pueda unirse específicamente a cualquier receptor. Por tanto, “antígeno” se refiere al dominio de reconocimiento del CAR. El dominio de reconocimiento extracelular (también denominado dominio extracelular o simplemente por el elemento de reconocimiento que contiene) comprende un elemento de reconocimiento que se une específicamente a una molécula presente en la superficie celular de una célula diana. La región transmembrana ancla el CAR en la membrana. El dominio de señalización intracelular comprende el dominio de señalización de la cadena zeta del complejo CD3 humano y opcionalmente comprende uno o más dominios de señalización coestimuladores.

Un CAR que contiene el dominio IL13 con la mutación E13Y (IL13 (E13Y)) y el dominio de señalización de la cadena zeta de CD3 se denomina en el presente documento “IL13Z”. Este término incluye cualquier receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un dominio de reconocimiento extracelular de IL13 (un dominio que reconoce específicamente IL13Ra2 en células tumorales), una región transmembrana y un dominio de señalización intracelular de la cadena zeta de CD3. En los Ejemplos 8-12 se proporcionan ejemplos no limitantes de tales CAR. Un CAR que contiene IL13 (E13Y) y también contiene los dominios intracelulares coestimuladores opcionales CD28 y 4-1BB se denomina en el presente documento “IL13-CD28-41BBZ”.

Los expertos reconocerán que cualquier secuencia de nucleótidos que codifique IL13 (E13Y) también sería adecuada para este mismo propósito. La secuencia no mutada del dominio de señalización de IL13 también es adecuada. Aquí se puede usar cualquier secuencia que codifique IL13 o IL13 (E13Y), incluidas variantes con 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homología con la secuencia nativa. Tales secuencias que son útiles para reconocer específicamente un antígeno tumoral del receptor de IL13 tal como IL13Ra2, por lo tanto incluyen aquellas codificadas por el ácido nucleico nativo (ver Smernov et al., Gene 155: 277-281, 1995, cuyas descripciones se incorporan aquí por referencia), la misma secuencia de ácido nucleico que carece de la mutación E13Y, secuencias que son 95 %, 98 % o 99 % homólogas a estas secuencias, secuencias más largas que comprenden esas secuencias pero que también incluyen nucleótidos adicionales en el extremo 3' o 5', por ejemplo, cualquier número de nucleótidos o codones adicionales, como 3, 6 , 9, 12 o más nucleótidos, o hasta aproximadamente 12, 20, 50 o 100 nucleótidos adicionales, y cualquier secuencia que codifique la misma secuencia de aminoácidos que estos ácidos nucleicos debido a la degeneración del código genético. En particular, las secuencias que tienen codones optimizados (CO) para la expresión del huésped deseado se contemplan como parte de la invención.

Los elementos de reconocimiento solubles como se usan en esta invención se derivan de polipéptidos sintetizados de novo, como se describe para la secuencia codificante de IL13 (E13Y) en el Ejemplo 1 o de polipéptidos de genotecas combinatorias tales como genotecas de presentación de fagos o genotecas sintetizadas químicamente. Los elementos de reconocimiento solubles preferidos son de origen humano y, por lo tanto, no son inmunogénicos, pero se pueden adaptar en afinidad o especificidad mediante mutagénesis. Tras su expresión en las células T, los elementos de reconocimiento solubles son capaces de unirse a un elemento diana en la célula diana (por ejemplo, una célula tumoral, pero no en un grado apreciable en las células no diana), de tal manera que resulta en células T activación. Por lo tanto, los elementos de reconocimiento solubles que son adecuados para esta invención tienen ciertas ventajas sobre los fragmentos de anticuerpos o las moléculas de adhesión celular para la especificidad de la diana en los CAR de la invención, ya que es más probable que sean estables en el entorno extracelular, no antigénicos y más selectivos, y por lo tanto son los preferidos. Los ejemplos de elementos receptores solubles adecuados incluyen factores de crecimiento autocrinos y paracrinos, quimiocinas, citocinas, hormonas y ligandos de moléculas pequeñas artificiales manipulados que exhiben la especificidad requerida. Las secuencias de ligandos naturales se pueden diseñar para aumentar su especificidad para una célula diana particular. La selección de un elemento de reconocimiento para su uso en un CAR particular se rige por la naturaleza de la célula diana y las cualidades discutidas anteriormente. En una realización preferida de la invención, el CAR aprovecha la expresión restringida por tumores de IL13Ra2 por glioma maligno, carcinoma de células renales y otros tumores utilizando como elemento de reconocimiento un mutante de IL13 (E13Y) para dirigir las células T específicamente a IL13Ra2 que expresan células tumorales. Se pueden crear elementos de reconocimiento análogos que son específicos para cualquiera de una variedad de tipos de células cancerosas que expresan selectivamente antígenos receptores o cualquier molécula específica en sus superficies celulares, para los cuales se conocen o pueden diseñarse elementos de reconocimiento selectivo.

Los ejemplos de regiones de soporte (transmembrana) adecuadas para su uso con la invención incluyen las regiones constantes (Fc) de inmunoglobinas, CD8a humano y enlazadores artificiales que sirven para alejar la fracción de direccionamiento de la superficie celular para mejorar el acceso y la unión en las células diana. Una región de soporte preferida es la región Fc de una IgG (tal como IgG4). Los ejemplos de dominios transmembrana adecuados incluyen los dominios transmembrana de los marcadores CD de leucocitos, preferiblemente los de CD4 o CD28. Los ejemplos de dominios de señalización del receptor intracelular incluyen el complejo de receptor de antígeno de células T, preferiblemente la cadena zeta de CD3, sin embargo, se puede usar cualquier región transmembrana suficiente para anclar el CAR en la membrana. Los expertos conocen numerosas regiones transmembrana y los elementos estructurales (tales como regiones de aminoácidos lipofílicos) que producen dominios transmembrana en numerosas proteínas de membrana y, por lo tanto, pueden sustituir cualquier secuencia conveniente. Los receptores de señalización coestimuladores de células T adecuados para mejorar la función y actividad de las células que expresan CAR incluyen, pero no se limitan a, CD28 y 4-1BB también conocidos como (CD137) y OX-40.

La señalización a través de CD28 es necesaria para la producción y proliferación de IL2, pero no cumple una función principal en el mantenimiento de la función y actividad de las células T. 4-1BB (un miembro de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral expresado después de la activación de CD28) y OX-40 están involucrados en impulsar la supervivencia a largo plazo de las células T y la acumulación de células T. Los ligandos para estos receptores se expresan típicamente en células presentadoras de antígenos profesionales, como células dendríticas y macrófagos activados, pero no en células tumorales. La expresión de un CAR que incorpora dominios de señalización CD28 y/o 4-1BB en las células T CD4+ mejora la actividad y la potencia antitumoral de esas células en comparación con las que expresan un CAR que contiene solo el dominio de señalización CD3Z. Preferiblemente, los CAR de la invención contienen dominios de señalización tanto CD28 como 4-1BB.

Para que el CAR se dirija a las células tumorales, contienen una molécula de unión extracelular que se une a un marcador de superficie tumoral y preferiblemente se une específicamente a una molécula de superficie tumoral única. Algunos cánceres expresan o sobreexpresan moléculas del sistema inmunológico. Los gliomas, por ejemplo, expresan receptores de IL13 y, en particular, receptores de IL13 de alta afinidad. Sin embargo, a diferencia del complejo trimolecular del receptor de IL13 utilizado por el sistema inmunitario (que consta de IL13Ra1, IL4Rp y yc), las células de glioma sobreexpresan una cadena única de IL13Ra2 capaz de unirse a IL13 independientemente del requisito de IL4Rp o yc44. Al igual que su homólogo IL4, IL13 tiene actividad inmunorreguladora pleotrópica fuera del SNC. Tanto la IL13 como la IL4 estimulan la producción de IgE por los linfocitos B y suprimen la producción de citocinas proinflamatorias por parte de los macrófagos.

Los estudios detallados que utilizan autorradiografía con IL13 radiomarcada han demostrado una unión abundante de IL13 en casi todos los tejidos de glioma maligno estudiados. Esta unión es muy homogénea dentro de las secciones tumorales y en el análisis de células individuales. Sin embargo, el análisis de sonda molecular específico para ARNm de IL13Ra2 no detectó la expresión del receptor específico de glioma por elementos cerebrales normales y la autorradiografía con IL13 radiomarcada tampoco pudo detectar la unión específica de IL13 en el SNC normal. Estos estudios sugieren que el receptor IL13Ra1/lL4p/Yc compartido no se expresa de forma detectable en el SNC normal. Por lo tanto, IL13Ra2 es una diana de la superficie celular muy específico para el glioma y es una diana muy adecuada para esta invención. Los expertos conocen otras dianas adecuadas para los CAR, que se expresan o sobreexpresan en las células que se van a dirigir y preferiblemente no se expresan, o se expresan en un grado mucho menor, en otras células. Otro ejemplo de una diana específica de tumor adecuada para dirigirse con CAR es el receptor de IL3 (IL3R; por ejemplo, expresado en células de leucemia mieloide aguda (AML).

Sin embargo, la unión de citotoxinas basadas en IL13 al complejo receptor IL13Pa1/IE4p/Yc ampliamente expresado tiene el potencial de mediar toxicidades no deseadas en tejidos normales fuera del SNC y, por tanto, limita la administración sistémica de estos agentes. Una sustitución de aminoácidos en la hélice A de IL13 alfa en el aminoácido 13 de la tirosina por el ácido glutámico nativo reduce selectivamente la afinidad de IL13 por el receptor de IL13Ra1/IL4p/Yc. Sin embargo, la unión de este mutante (denominado IL13 (E13Y) a IL13Ra2 aumentó 50 veces en relación con la IL13 de tipo silvestre. Por lo tanto, este análogo de IL13 mínimamente alterado aumenta simultáneamente la especificidad y afinidad de IL13 por las células de glioma. Por lo tanto, la invención emplea una IL13 que contiene una mutación en el aminoácido 13. Sin embargo, la IL13 que tiene la secuencia natural también puede usarse y puede ser útil, particularmente en situaciones en las que las células T modificadas deben administrarse localmente, como por inyección directamente en una masa tumoral.

Un tipo preferido de CAR para dirigirse específicamente a tumores que expresan IL13Ra2 se compone de una citoquina mutante de IL13 extracelular en la que la proteína IL13 contiene una sustitución de tirosina por el ácido glutámico natural en el aminoácido 13 de la proteína (denominado IL13 (E13Y) aquí), conectado a una región de soporte del dominio Fc bisagra de IgG4 humana que se fusiona con un dominio transmembrana de CD4 y una secuencia de señalización de CD3Z citoplásmica. Vea la Figura 1, lado izquierdo. Este CAR se denomina en el presente documento “IL13Z CAR”. Cuando este CAR también contiene los dominios de señalización CD28 y 4-1BB, se denomina IL13-CD28-41BBZ. Vea la Figura 1, lado derecho.

Un inmunorreceptor de acuerdo con la presente invención se puede producir por cualquier medio conocido en la técnica, aunque preferiblemente se produce usando técnicas de ADN recombinante. Los ácidos nucleicos que codifican las diversas regiones del receptor quimérico se pueden preparar y ensamblar en una secuencia codificante completa mediante técnicas estándar de clonación molecular conocidas en la técnica (cribado de colecciones genómicas, PCR, ligación asistida por cebadores, mutagénesis dirigida al sitio, etc.) como sea conveniente. La región codificante resultante se inserta preferiblemente en un vector de expresión y se usa para transformar una estirpe celular huésped de expresión adecuada, preferiblemente una estirpe celular de linfocitos T, y lo más preferiblemente una estirpe celular de linfocitos T autólogos.

Brevemente, se puede construir un CAR IL13Z usando métodos conocidos como sigue. El ADN mutante de IL13 IL13 (E13Y) puede sintetizarse mediante PCR con cebadores basados en la secuencia conocida de ARNm de IL13. La secuencia completa del gen IL13 se describe en Smernov et al., “Tandem arrangement of human genes for interleukin-4 and interleukin-13: resemblance in their organization”. Gene 155: 277-281, 1995, cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. La síntesis de novo de IL13 (E13Y) se realizó usando el cebador directo IL13P1 y cuatro cebadores inversos, IL13P2, IL13P3, IL13P4 e IL13P5, que se muestran en la Tabla I, a continuación, y en la Figura 2. Esta secuencia mutante de IL13 puede modificarse luego para que contenga una secuencia líder 5', si se desea. Un ancla transmembrana tal como la transmembrana IgG4-CD4 humana (IgG4-CD4tm) y las secuencias citoplásmicas de la cadena zetacadena CD3 (CD3Z) también se pueden añadir al extremo 3' mediante técnicas de fusión por PCR o cualquier método conveniente. La secuencia completa de IL13Z se muestra en la Figura 3 como ejemplo de la invención. Se pueden usar los mismos métodos para construir moléculas equivalentes usando diferentes elementos de reconocimiento. A continuación, la construcción final se puede ligar en cualquier vector de expresión de plásmido adecuado. Un vector de expresión de plásmido preferido es pMG (disponible de Invivogen™).

El CAR que contiene IL13 (E13Y) dirige específicamente a las células T para que se dirijan al receptor de IL13 a2 (denominado aquí IL13Ra2) que expresan células de glioma, células de carcinoma renal y células de cualquier cáncer que exprese IL13Ra2 de una manera independiente de MHC. Se generaron efectores de células T CD4+ antitumorales para ser redirigidos para reconocer células tumorales usando un CAR que contiene los dominios de señalización derivados de CD3-Z, CD28 y 4-1BB. Se transfectó el CAR de IL13Z o IL13-CD28-41BBZ en células T primarias humanas usando un vector plasmídico no viral (pEK) y métodos de electroporación (Nucleofector Technology_ de Amaxa Biosystems_, Gaithersburg, MD). Se compararon las células T CD4+ que expresan CAR (IL13Z o IL13-CD28-41BBZ) en cuanto a su potencial para activar vías de señalización asociadas al efector, producir citocinas, lisar células diana y controlar el crecimiento tumoral in vivo. Los resultados mostraron que la adición de los dominios de señalización CD28 y 4-1BB a IE13Z mejora las funciones efectoras antitumorales de las células T CD4-T que expresan las células T CAR Efectoras que expresan el inmunorreceptor IL13-CD28-41BBZ fueron capaces de mediar señales coestimuladoras a través de JNK , p38 y AKT quinasas en el entorno tumoral donde se esperaría que la coestimulación fuera limitante. La coestimulación forzada en las células T CD4+ primarias humanas apoya la polarización de estas células a un fenotipo Thi de una manera que se asocia con una eficacia antitumoral sostenida tanto in vitro como in vivo. Se demostraron las señales efectoras posterior del CAR en las células T CD4+. Estas señales efectoras se correlacionaron con el sesgo Thi observado y la actividad efectora antitumoral prolongada de estas células tanto in vitro como in vivo.

La señalización de CD3Z por sí sola impulsa la activación de ERK. Esto se correlaciona bien con el hallazgo aquí de que la actividad de ERK no aumenta en las células que expresan IL13-CD28-41BBZ en comparación con los controles que expresan IL13Z (ambos CAR contienen el dominio de señalización de CD3Z). La coestimulación de CD3 con CD28 impulsa la activación de JNK y p38; La coestimulación de CD3 mediada por 4-1BB también implica la activación de JNK. Tanto JNK como p38 desempeñan funciones principales en la conducción de las respuestas inmunitarias polarizadas en Thi por las células T CD4+, incluida su producción de IL2, IFN-y y TNF-a. La activación de la cinasa AKT, otro componente de señalización descendente tanto de CD28 como de 4-1BB, también participa en la regulación al alza de IL2 e INF-^y, pero no de las citocinas Th2. La asociación de un fenotipo Thi pronunciado (ver ejemplos a continuación) con una inducción mejorada de JNK y p38 MAP quinasa y activación sostenida de ATK (ver ejemplos a continuación) en células T que expresan IL13-CD28-41BBZ indica claramente que CD28 y 4-1BB los restos de señalización trabajan con el dominio de señalización de CD3Z en este receptor quimérico para retener la capacidad de transducir las vías de señalización posterior normalmente asociadas con estos receptores coestimuladores. Independientemente de cuán fuerte pueda ser el fenotipo Thi activado impulsado por señales de dominio coestimulador, la retención y reciclaje de células T CD4+ efectoras antitumorales funcionales dentro del microambiente tumoral ayuda en gran medida a lograr la potencia antitumoral.

En comparación con la activación mediada por CD3Z sola, las células T efectoras CD4+ que expresan el CAR IL13-CD28-41BBZ exhibieron actividad MAPK y AKT aumentada/sostenida, producción de citocinas Thi regulada al alza y potencia citolítica mejorada contra dianas tumorales. Además, tras la estimulación recursiva con el tumor, las células IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ retuvieron/reciclaron su función lítica mientras que las células IL13Z+ CD4+ fueron eficaces, pero antes se volvieron anérgicas/agotadas. Estas observaciones in vitro se correlacionaron con un control in vivo mejorado de xenoinjertos de glioma ortotópico del SNC establecido en ratones inmunodeficientes mediados por células T CD4+ expandidas ex vivo transferidas adoptivamente que expresan el CAR coestimulador. Estos estudios, por lo tanto, demuestran el efecto de integrar la coestimulación con eventos de señalización de CD3Z para activar completamente CD4+ células efectoras antitumorales para una función sostenida en el microambiente tumoral.

Las señales coestimuladoras de CD28 y 4-1BB mediadas a través de AKT pueden inhibir la muerte celular inducida por activación a través de la regulación al alza de proteínas antiapoptóticas. La activación mejorada de AKT observada en las células T que expresan IL13-CD28-41BBZ se asoció con un mayor reciclaje de la actividad específica del tumor in vitro, así como un control prolongado del crecimiento del tumor in vivo. Por tanto, el CAR coestimulador puede mejorar la duración y/o la retención de la actividad antitumoral de una manera que puede mejorar significativamente la eficacia clínica de los protocolos de terapia adoptiva.

Los CAR específicos de tumor que contienen sus propios dominios de señalización coestimuladores proporcionan un nuevo enfoque para activar linfocitos T contra una variedad más amplia de tumores sólidos que no expresan estos ligandos coestimuladores. El IL13Ra2, por ejemplo, se ha identificado como un objetivo de la superficie celular sobreexpresado en varios tumores humanos, que incluyen cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de ovario y sarcoma de Kaposi, así como gliomas. Por tanto, las células T que expresan un CAR que contiene una zetaquina IL13 y CD28 y 4-1BB pueden usarse para tratar glioblastomas (glioma) y cualquier cáncer, como los enumerados anteriormente, que tengan la diana IL13 en su superficie.

Los CAR que contienen CD3Z, CD28 y 4-1BB (y/u otros dominios de señalización coestimuladores) pueden dirigirse a cualquier tumor al incorporar una fracción que se une a una diana tumoral expresada en la superficie celular, por ejemplo, un antígeno. Ejemplos de otros quelantes de diana específicos de tumores incluyen Her2/Neu (ErbB-2), integrina a3, CD20, CD19, EGFRVIII, IL3Ra (CD123), LEA, c D44v6 o cualquier diana específica de un tumor, preferiblemente un tumor sólido que no expresan el dominio de señalización coestimulador que está contenido en el CAR. Por lo tanto, las construcciones para atacar tumores humanos de esta manera pueden incluir aquellas con especificidades para Her2/Neu (ErbB-2), integrina a3, CD20, CD19, EGFRVIII, IL3Ra (CD123), LEA, CD44v6 o cualquier antígeno tumoral específico u otro componente de la superficie celular accesible para unirse mediante un receptor de células T quimérico. Los expertos conocen estos antígenos y receptores tumorales específicos que pueden explotarse para dirigirse a un tumor específico, y conocen los tumores que pueden dirigirse de esta manera.

Las funciones efectoras de las células T CD4+ y CD8+ pueden activarse a través de estos receptores, por lo tanto, ambos tipos de células T se contemplan para su uso con la invención. Las células T CD8+ que expresan los CAR de IL13 de esta invención pueden usarse para lisar células diana y producir IL2 en presencia de células diana, entre las otras funciones de estas células. La expresión del CAR coestimulador apropiado en cualquiera o ambas células T CD4+ y CD8+ se usaría para proporcionar la población de células más efectiva para la inmunoterapia adoptiva, que consiste, por lo tanto, en uno o ambas células T citolíticas y auxiliares profesionales que exhiben un aumento y/o largo plazo viabilidad y actividad antitumoral.

Los siguientes ejemplos tienen únicamente el propósito de ilustrar una realización de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Transfección y expresión de receptores quiméricos específicos de IL13Ra2 en linfocitos T humanos primarios.

Para activar tanto el receptor de células T (TCR) como las cascadas de señalización de tipo coestimulador tras la interacción con el antígeno de tumor de glioma IL13Ra2, se integraron elementos de señalización derivados de CD28 y 4-1BB en un receptor de antígeno quimérico de IL13-zetaquina (IL13Z) (CAR). El IL13Z CAR preferido está compuesto por la muteína extracelular de IL13 (E13Y), bisagra-Fc de IgG4 humana unida al CD3Z citoplásmico humano a través del dominio transmembrana del CD4 humano. Ver figura 1. La síntesis de novo de la secuencia codificante de IL13 (E13Y) se realizó utilizando los cebadores IL13P1, IL13P2, IL13P3, IL13P4 e IL13P5. Consulte la Tabla 1, a continuación, y la Figura 2. La secuencia final (417 pb) se digirió en los extremos con EcoRI-BamHI y se ligó en el plásmido pSK (Stratagene™) como ligación 312#3. La ligadura 312#3 se mutagenizó (kit Stratagene™, según las instrucciones del fabricante) para reparar un nucleótido eliminado usando los cebadores IL13 312#3 mut5-3 e IL13 312#3 mut3-5 y la ligadura 312#3 como plantilla, para formar la ligadura 348#1 (IL13^/pSK).

La secuencia codificante del péptido señal de la cadena alfa de GM-CSFR humana (hsp) se fusionó con el extremo 5' de IL13 (E13Y) mediante extensión de solapamiento de empalme de PCR estándar. La secuencia de hsp se obtuvo a partir de la ligación de plantilla 301#10 (hsp/pSK) usando los cebadores 5': 19hsp5' y 3': hsp-IL13FR. Véase la Tabla 1. La secuencia de IL13 se obtuvo utilizando los cebadores 5': hsp-IL13FF y 3': IL13-IgG4FR, y la ligación 312#3 como plantilla. Ver Tabla 1.

Se fusionó una secuencia que codifica las regiones citoplasmáticas de IgG4 Fc, CD4 transmembrana y CD3Z (IgG4m: zeta; nucleótidos 421-1512 de la secuencia completa de IL13Z de la Figura 3 (SEQ ID NO: 12)) al extremo 3' de la secuencia de fusión de péptido señal humano-IL13 usando los mismos métodos. La secuencia IgG4m: zeta se obtuvo usando los cebadores 5': IL13-IgG4FF y 3': ZetaN3' (ver Tabla 1), usando la secuencia R9.10 (IgG4mZeta/pSK) como plantilla. La secuencia IgG4m: zeta de 1119 pb se fusionó con la secuencia de fusión hsp-IL13 utilizando las secuencias respectivas como plantillas, y los cebadores 5': 19hsp5' y 3': ZetaN3' (ver Tabla 1), para producir una secuencia de fusión bp hsp- IL13-IgG4m: zeta. Los extremos se digirieron con XbaI-NotI y se ligaron en pSK como ligación 351#7, para crear el plásmido IL13^/pSK (4464 pb) (es decir, la secuencia de IL13Z de la Figura 3, dentro del vector de clonación pSK.

Se creó un vector de expresión que contiene la secuencia codificante de IL13Z digiriendo IL13^/pSK con XbaI-NotI y creando extremos romos con Klenow, y ligando el fragmento resultante en el plásmido pMGAPac (Invitrogen_) (preparado primero abriéndolo con SgrAI, despuntar con Klenow y desfosforilación con SAP), para producir el plásmido IL13Z/pMG. La región de resistencia a higromicina de IL13^/pMG se eliminó mediante digestión con NotI-NheI y se reemplazó por la fusión de selección/suicidio HyTK, obtenida del plásmido CE7R/HyTK-pMG por digestión con NotI-NheI, para crear el vector de expresión IL13^/HyTK-pMG (6785 pb). Este plásmido comprende el promotor del factor de elongación humano-la (hEF1p) en las bases 6-549, la secuencia codificante de IL13z en las bases 690-2183, la señal de poliadenilación tardía del virus Simian 40 (Late SV40pAN) en las bases 2230-2498, un origen de replicación de E. coli (Ori ColE1) en las bases 2499-3245, un poli A sintético y un sitio de pausa (SpAN) en las bases 3246-3432, el potenciador/promotor inmediato-temprano de c Mv (h CMV-1Aprom) en las bases 3453-4075, la fusión de la región codificadora de timidina quinasa de resistencia a higromicina (HyTK) en las bases 4244-6319, y la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino y una pausa de transcripción (BGh pAn) en las bases 6320­ 6618. El plásmido tiene un sitio de linealización PacI en las bases 3233-3240. Los elementos hEF1p, SV40pAN tardío, ori ColE1, SpAn y hCMV-1Aprom se derivaron del plásmido parental pMGAPac. En resumen, IL13^/HyTK-pMG es un esqueleto pMG modificado, que expresa el gen IE13Z del promotor hEF1 y la fusión HyTK del promotor hCMV-1A. Un mapa del plásmido IL13^/HyTK-pMG aparece en la Figura 4. La secuencia de ácido nucleico completa del plásmido se muestra en las Figuras 5A-5L (SEQ ID NO: 13 y 14. La secuencia del inserto IL13Z también se proporciona en la Figura 3 (SEQ ID NO: 5 y 6 ).

La evaluación de la integridad de la construcción expresada se confirmó mediante transferencia Western usando el clon 8D3 de anticuerpo monoclonal anti-CD3Z humano (BD PharMingen™, San Diego, CA) para sondar lisados de células completas derivados de transfectantes estables de células T Jurkat cocultivados en la presencia o ausencia de tunicamicina, un inhibidor de la glicosilación. Se obtuvieron transfectantes estables de células T Jurkat (estirpe en volumen Jurkat-IL13-pMG) por electroporación de células T Jurkat con el vector de expresión IL13^/HyTK-pMG, seguido de selección y expansión de transfectantes positivos. Se sembraron 2 x 106 células de la estirpe en volumen Jurkat-IL13-pMG por pocillo en una placa de 24 pocillos con o sin 5 pg/ml, 10 pg/ml o 20 pg/ml de tunicamicina. La placa se incubó a 37 °C durante 22 horas. Se recolectaron células de cada pocilio, y cada muestra se lavó con PBS y se resuspendió en 50 j l de tampón RIPA (PBS, NP40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0.5 %, SDS al 0.1 %) que contenía inhibidor de proteasa (1 tableta/10 ml de cóctel completo de inhibidor de proteasa). Las muestras se incubaron en hielo durante una hora, antes de centrifugarlas a 4 °C durante 20 minutos a 14.000 rpm. Se recolectaron muestras de sobrenadante de lisado centrifugado y se hirvieron en un volumen 1: 3 de tampón de muestra en condiciones reductoras, luego se sometieron a electroforesis SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12%. Después de la transferencia a nitrocelulosa, la membrana se bloqueó en una solución Blotto™ que contenía leche desnatada en polvo al 4 % en T-TBS (Tween 20 al 0.1 % en solución salina tamponada con Tris pH 8.0) durante 1 hora. A continuación, la membrana se incubó con el anticuerpo monoclonal primario anti-CD3Z humano de ratón a una concentración de 0.5 jg/m l durante una hora, se lavó y luego se incubó con una dilución 1: 3000 (en solución Blotto™) de anticuerpo secundario IgG alcalina anti-ratón de cabra conjugado con fosfatasa (kit Bio-Rad™ ImmunoStar™) durante 1 hora. Antes del revelado, la membrana se lavó 4 veces más en T-TBS y luego se incubó con 3 ml de solución de sustrato de fosfatasa (Kit Bio-Rad™ ImmunoStar™) durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se cubrió con una carpeta de revelado de plástico (Tropix™) y se expuso a una película de rayos X. De acuerdo con el patrón de glicosilación conocido de la lL13 humana de tipo silvestre, la movilidad electroforética de la zetaquina IL13 (E13Y) expresada indica una proteína muy glicosilada que, cuando se expresa en presencia de tunicamicina, se reduce a una cadena principal de aminoácidos de aproximadamente 54 kDa.

La construcción del CAR coestimulador se inició con una construcción HyTK-2A-IL13Z-pcDNA3.1 (+), que codifica el gen de fusión de selección/suicidio HyTK, el péptido 2A de la enfermedad de fiebre aftosa autoescindible sintetizada de novo (TCTAGAGGAGCATGCCAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTC GAGTCCAACCCTGGGCCC; SEQ ID NO: 49), y la molécula IL13Z (Figura 3), clonada en pcDNA3.1 (+) (Invitrogen™). Para conferir resistencia al metotrexato (MTX), el gen HyTK se reemplazó por PCR con un gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (amplificado a partir de una genoteca de ADNc derivada de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que habían sido estimuladas durante tres días con el anticuerpo OKT3 que reconoce la cadena CD3 del receptor de células T que contenía mutaciones L22F y F33S generadas usando un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange™ (Stratagene™). La construcción DHFRdm-2A-IL13Z resultante se cortó luego con NheI y NotI, se eluyó y se ligó en el vector de expresión de plásmido de mamífero digerido de manera similar pEK. El vector pEK se había modificado originalmente a partir de pcDNA3.1 (+) eliminando el promotor de CMV y el gen de ampicilina y reemplazándolos con el gen del promotor del factor de elongación 1a humano (EF1p) derivado de pMG (Invivogen™) para crear el plásmido DHFRdm-2A-IL13Z_pEK (pJ01275-9). El cDNA CD28 se compró de Invitrogen™ y la región codificante 4-1BB se amplificó mediante PCR a partir de una genoteca de cDNA derivada de p células mononucleares de sangre periférica (PBMC) que habían sido estimuladas durante tres días con el anticuerpo OKT3 (usando los cebadores 41BB5' y 41BB3', ver Tabla 1).

Las regiones de señalización intracelular de CD28 y 4-1BB (aminoácidos 180-220 y 214-255, respectivamente, de las secuencias nativas de CD28 y 4-1BB) se fusionaron mediante PCR (utilizando los cebadores CD4-CD28F, CD28- 4-1-BBR, CD28-4-1bbF y 41bb93 proporcionados en la Tabla 1) en la unión entre las regiones transmembrana CD4 y CD3Z citoplásmica (aminoácidos 52-164 de CD3Z nativa). Véase la Figura 6 , que proporciona representaciones esquemáticas de ejemplos de construcciones de plásmidos lineales IL13Z (Figura 6A) e IL13-CD28-41BBZ (Figura 6B). En Figura 6 se indica la ubicación de la muteína IL13 humana (E13Y), la bisagra-Fc de IgG4 humana (IgG4), la transmembrana CD4 humana (tm), los segmentos citoplásmicos CD3Z humanos (Zeta), citoplásmicos CD28 (28c) y citoplásmicos 4-1BB (BBc). Los sitios de enzimas de restricción que se usaron para insertar los diferentes fragmentos de PCR también se indican en la Figura 6 (Nhe I, Kpn I, Nsi I, Not I), con sus ubicaciones de pares de bases previstas entre paréntesis. Como se muestra en la Figura 6A, el CAR, IL13-CD28-41BBZ, comprende el dominio citoplásmico de CD28 y 4-1BB fusionado al de CD3Z_. Cada construcción mostrada en la Figura 6A tiene un dominio huIL13 que contiene la mutación E13Y que lo hace específico de IL13Ra2, un dominio bisagra-Fc de IgG4 humana (huY4 Fc), un dominio transmembrana de CD4 humano (huCD4tm) y un dominio citoplásmico de CD3Z humano (cyt de huCD3Z); el CAR de IL13-CD28-41BBZ tiene los dominios de señalización (sig) de CD28 y 4-1BB insertados entre los dominios transmembrana de CD4 y citoplásmicos de CD3Z. Los cebadores de PCR utilizados en la construcción de los plásmidos y utilizados en el análisis de expresión se proporcionan en la Tabla 1.

Los cultivos en volumen de células T CD4+ obtenidos por separación MACS™ usando el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec™ Inc.) se mantuvieron en medio RPMI con FCS al 10 %, L-glutamina al 1 %, tampón HEPES al 2.5 %, 50 U/ml rhIL2, 10 ng/ml de rhIL15 y MTX 0.1 jM . El aislamiento, activación y electroporación de células T humanas se realizó como sigue. Se aislaron PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque (Pharmacia Biotech™) de sangre periférica heparinizada obtenida de donantes sanos que dieron su consentimiento. Las células se resuspendieron en solución de nucleofección usando el kit Nucleofector de células T humanas Amaxa™ (Amaxa™ Inc.). Se añadió plásmido (1 jg /5 x 106 células) y las células se electroporaron usando Amaxa™ Nucleofector I (Amaxa™ Inc.), programa U-14. Luego, las células se recolectaron en medio sin rojo fenol con FCS al 10 %, se dejaron reposar durante la noche y luego se estimularon con 30 ng/ml de OKT3 y 5 ng/ml de rhIL15 en RPMI con 10 % de FCS durante tres días. Los transfectantes exitosos se seleccionaron usando medios que contenían MTX 0.1 jM y rhIL155 ng/ml.

La expresión de CAR se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo específico para CD3Z. Los lisados de células completas de células T CD4+ seleccionadas por MTX en volumen (transfectadas con IL13Z e IL13-CD28-41BBZ) se analizaron para determinar la expresión de CAR (CD3Z quimérico) utilizando métodos conocidos y un anticuerpo monoclonal específico de anti-CD3Z humano de ratón disponible comercialmente, 1D3. Como era de esperar con proteínas tan altamente glicosiladas, se observaron múltiples bandas dentro de los pesos moleculares esperados. Ver figura 7.

Los niveles de IL13Z o IL13-CD28-41BBZ CAR expresados en la superficie de las células T CD4+ se examinaron mediante la detección de IL13 unida a la membrana usando citometría de flujo. Ver figura 8. Las PBMC transfectadas con ADNc que codifica IL13Z o IL13-CD28-41BBZ CAR se propagaron durante un promedio de 10 semanas en concentraciones selectivas de MTX (0.1 ^M), se clasificaron magnéticamente para detectar células CD4+ mediante separación MACS™ y se examinaron para determinar la expresión superficial de IL13 que contienen CAR (ejes Y) y ^c D4, CD8 , TCRa/p o CD28 (ejes X) como se indica. Se utilizaron mAb fluorescentes emparejados por isotipo para establecer los cuadrantes. Estas poblaciones de células T genéticamente modificadas no solo eran predominantemente CD4+ y CD8-, como se esperaba después de la purificación MACS™ basada en perlas magnéticas de células CD4+, sino que también expresaban niveles altos y equivalentes de TCR endógeno y niveles bajos a indetectables de CD28 coestimulador. Ver figura 8.

La estirpe diana de células tumorales de glioblastoma humano IL13Ra2+ usada en estos estudios, U87, también fue fenotipada para confirmar que esas células expresan MHC clase I y clase II en su superficie y no expresan los ligandos coestimuladores CD80/86 o 4-1BBL. Consulte la Figura 9, que muestra la tinción de la superficie de las moléculas de MHC HLA-A2 y HLA-DR, IL13R y las moléculas coestimuladoras CD80, CD86 y CDl37-L (4-1BBL) (histogramas llenos) como se indica, en comparación con los controles de isotipo (histogramas abiertos) en células diana de glioma U87, analizadas por citometría de flujo.

El análisis de citometría de flujo implicó evaluar la expresión de la superficie celular de las construcciones IL13-CAR mediante tinción con anticuerpos monoclonales anti-IL13 humana conjugados con PE o conjugados con FITC (BD PharMingen™). El fenotipo de la superficie celular de los transfectantes primarios de células T humanas se ensayó con anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCR a/p conjugados con FITC o con anticuerpos anti-CD28 conjugados con PE (BD PharMingen™). El fenotipo de la superficie celular de las células de glioma U87 humano se analizó con anticuerpos anti-HLA-A2, anti-HLA-DR y anti-CD80 conjugados con FITC, o con anti-CD86 y anti-CD137-L conjugados con PE (4 -1BBL), en comparación con los controles de isotipo conjugados con FITC y Pe (BD PharMingen™). La expresión de IL13Ra2 se ensayó usando anti-IL13Ra2 humano de cabra (R&D Systems™) seguido de IgG anti-cabra de ratón conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch™).

Tabla 1. Cebadores PCR para construcción de CAR.

Ejemplo 2. Potenciación de la señalización de JNK y p38 MAPK con señalización sostenida de AKT por IL13-CD28-41BBZ.

Se sabe que las células T estimuladas por el acoplamiento del complejo TCR-CD3 junto con los receptores auxiliares CD28 o 4-1BB controlan señales a través de AKT así como las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Para investigar la capacidad de los CAR coestimuladores para influir en estas vías efectoras descendentes, se utilizaron ensayos de quinasas in vitro para evaluar y comparar la actividad de los miembros de la familia AKT y MAPK ERK, JNK y p38 en IL13Z- e IL13-CD28-41BBZ que expresan células T CD4+ después de la participación de las células diana U87. La línea de glioma humano, U87, se obtuvo de ATCC (Rockville, Md ). Todas las líneas tumorales son adherentes y se cultivaron en DMEM (Irvine Scientific™) complementado con FCS inactivado por calor al 10%, HEPES 25 mM y L-glutamina 2 mM. Se incubaron células T Cd4+ que expresan IL13Z o IL13-CD28-41BBZ CAR con células de glioma U87 durante los tiempos indicados en la Figura 10 antes del ensayo.

Después de estimular las células T CD4+ que expresan IL13Z o IL13-CD28-41BBZ con células diana tumorales durante hasta 48 horas (Figura 10A) o 72 horas (Figura 10B), los niveles de la proteína total JNK, p38 y AKT Los sustratos (es decir, cJun, ATF2 y GSK3, respectivamente) y los sustratos fosforilados (P-cJun, P-ATF2 y P-GSK3, respectivamente) se midieron mediante inmunotransferencia Western. El aumento de veces en la fosforilación de cada sustrato, como medida de la actividad quinasa, se indica en la parte inferior de cada grupo en la Figura 10.

Se realizó un ensayo de quinasa en estado sólido no radiactivo usando un método modificado de Hibi et al., “ Identification of an oncoprotein- and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain”. Genes Dev. 7: 2135-2148, 1993. Usando lisados de células T que se habían separado de las células diana mediante centrifugación suave (1000 rpm, < 3 minutos), la quinasa seleccionada se inmunoprecipitó durante la noche a 4 °C usando anticuerpos específicos para ERK1/2, JNK, p38 y AKT (Cell Signalling Technology Inc.™). Los complejos inmunoprecipitados se lavaron en tampón de lisis (PBS con NP40 al 1 %, SDS al 0.1 % y desoxicolato de sodio al 0.5 %) y tampón de quinasa (Tris 25 mM, pH 7.,5, que contenía MgCh 10 mM y EGTA 2 mM), y se realizó el ensayo a 30 °C durante 30 minutos, usando 1 |jg de sustrato en presencia de ATP 10 jM .

Proteínas de fusión de glutatión S transferasa (GST): GST-ELK, GST-ATF2 y GST-GSK3p (Cell Signaling Technology™ Inc.) y GST-cJun (1-79) (como se describe en Chang et al., Cell 124: 601-613, 2006) como sustratos para los ensayos de quinasa ERK, p38, AKT y JNK, respectivamente. Los productos resultantes se resolvieron en NuPAGE™ al 12 % (Invitrogen™) de acuerdo con métodos estándar y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando el Xcell II Blot Module™ (Invitrogen™). Las transferencias se sondaron con anticuerpos para fosfo-ELK, ATF2, cJun y GSK3p (Cell Signaling Technology™ Inc.) para detectar proteínas de fusión GST fosforiladas y anticuerpos para GST (BD PharMingen™) para detectar la cantidad total de sustrato. A continuación, las inmunotransferencias se incubaron con anticuerpos específicos de inmunoglobulina de conejo conjugados con IRDye 680 o de ratón conjugados con IRDye800 (LI-COR™). Se usó tampón de bloqueo (adquirido de LI-COR™) para pretratar las transferencias y para la dilución de anticuerpos. Las transferencias se visualizaron y registraron utilizando un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey™ (LI-COR™) y las intensidades de banda se cuantificaron utilizando el software Odyssey™ v2.0 (LI-COR™). La fosforilación del sustrato, una medida de la actividad quinasa, se cuantificó y normalizó a las cantidades detectadas correspondientes de quinasa inmunoprecipitada y sustrato quinasa total. La actividad quinasa relativa de las células T IL13Z+ CD4+ en t = 0 recibió un valor arbitrario de 1.0; los guiones (-) indican diferencias de multiplicidad <1.0 (ver Figura 10).

El ensayo de quinasa fue capaz de detectar actividad mejorada de JNK y p38 MAPK y actividad prolongada de quinasa de AKT en células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ después de cocultivo con células de glioma U87. Como se muestra en la Figura 10, la activación de JNK y p38 fue más fuerte en las células T CD4+ que expresan IL13-CD28-41BBZ que en las que expresan IL13Z. Ver figura 10. Por el contrario, la activación de otra MAPK, ERK, fue comparable entre los dos tipos de células. La activación de AKT se observó en ambas poblaciones de células T, pero se elevó solo hasta 24 horas en las células IL13Z+ mientras que las células IL13-CD28-41BBZ+ mostraron una actividad de AKT elevada durante hasta 72 horas o más. Vea la Figura 10B. Por tanto, ambos CAR fueron eficaces, pero los dominios coestimuladores dentro del CAR de IL13-CD28-41BBZ produjeron una actividad de AKT más sostenida en comparación con la observada con el CAR de IL13Z.

Ejemplo 3. Las señales de coestimulación refuerzan la polarización Thi de los efectores CD4+ redirigidos por el tumor.

Debido a que se ha detectado actividad de p38 en células Thi pero no en células Th2, y se sabe que la activación de JNK/p38 induce la producción de Thi de citocinas de TNF-a e IFN-y asociadas, el efecto de la función coestimuladora de CD28 y 4-1BB en CAR Se investigó la inducción mediada por las citocinas asociadas a Thi. Se cocultivaron células T CD4+ genéticamente modificadas (106 células) que expresan IL13Z o IL13-CD28-41BBZ en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos con diferentes células estimulantes (5 x 105 células) en 2 ml de medio de cultivo. Las células estimuladoras fueron células de glioma U87 (U87), células de mieloma de ratón NS0 parentales (NS0), células NS0 que expresan de manera estable IL13Ra2 de superficie (NS0-IL13Ra2) o células NS0 que expresan de manera estable OKT3 unido a membrana (NS0-OKT3) como se indica en la Figura 11A.

Se usó RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para medir los niveles relativos de ARNm después del cultivo. Para el análisis de la expresión génica, se aisló el ARN celular total de los transfectantes de células T CD4+ usando un kit RNeasy™ (Qiagen™). Se utilizó transcripción inversa de 5 |jg de ARN total en un volumen de 30 ml (que contiene 1x de tampón de transcriptasa inversa, oligo dT 2.5 mM, dNTP 0.25 mM, ditiotreitol 0.01 M, 20 U de Rnasina y 200 U de SuperScript™ II RNasa H- transcriptasa inversa (Invitrogen™)) para sintetizar ADNc. Las muestras se incubaron a 42 °C durante 1 hora y luego se inactivó la transcriptasa inversa calentando 5 minutos a 70 °C. El ADNc resultante, equivalente a 0.2 jg de ARN total, se sometió a análisis de qPCR utilizando la mezcla maestra de PCR SYBR Green™ (Applied Biosystems™) y cebadores diseñados por el sistema de detección de PCR en tiempo real DNA Engine Opticon 2™ (MJ Research Inc.™). Las secuencias de cebadores de los genes analizados IL2 e IFN-y son las siguientes: IL2 directo: CAAGAATCCCAAACTCACCAG, SEQ ID NO: 50; IL2 inversa: CGTTGATATTGCTGATTAAGTCC, SEQ ID NO: 51; IFN-y directo: ATCCCAGTAATGGTTGTCCTGCCT, SEQ ID NO: 52; IFN-y inverso: TCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGT, SEQ ID NO: 53. El valor de umbral de ciclo medio (CT) del ARNm de ciclofilina (como se describe en Chang et al., “The E3 ubiquitin ligase itch couples JAK activation to TNFalpha-induced cell death by inducing c-FLIP(L) turnover”. Cell 124: 601-613, 2006) se utilizó para normalizar los genes probados. Los valores medios de CT se determinaron mediante mediciones de qPCR por triplicado para cada gen en cada condición experimental.

El ARNm total de células T se recogió a las 0 horas (Figura 11A, barras blancas), 7 horas (Figura 11A, barras negras) y 24 horas (Figura 11A, barras sombreadas) para el análisis de qPCR de los ARNm humanos indicados. *indica una p < 0.05 en comparación con los valores de 7 horas de células T CD4+ que expresan IL13Z utilizando una prueba t de Student no apareada. La línea de mieloma de ratón NS0 se sometió a electroporación con IL13Ra2-IMPDH2_pMG (pJ00659), que confiere expresión del antígeno diana IL13Ra2 y resistencia al ácido micofenólico (MPA) o OKT3-IMPDH2_pcDNA3.1 (+) (pj01056), que confiere expresión de la molécula de OKT3 reticulante con CD3 (y por tanto estimulante de células T) junto con resistencia a MPA, y luego clonada en presencia de ácido micofenólico (MPA) 6 jM y seleccionada para expresión del transgén de IL13Ra2 humano. Para los experimentos que utilizan células tumorales U87 y NS0-IL13Ra2, n = 3; para el experimento que usa células tumorales NS0-OKT3 y NS0, n = 1.

Los niveles de ARNm de IL2 e INF-y fueron mayores en las células T IE13-CD28-41BBZ- que en las células T IL13Z_ después del cultivo con células de glioblastoma U87. Vea la Figura 11A. No se observó inducción de ARNm de IL2 o INF-y con ninguna población de células T cuando se cultivaron conjuntamente con células NS0. La estimulación por células NS0 que expresan el transgén IL13Ra2 restauró la inducción de ARNm de IL2 e INF-y en IL13-CD28-41BBZ-pero no en células T que expresan IL13Z, lo que indica que los genes de inducción de citocinas eran dependientes de IL13Ra2. Las cantidades relativas de ARNm de IL2 e iNF-y inducidos se correlacionan directamente con los niveles de expresión de superficie de IL13Ra2 en células U87 y células NSO que expresan transgenes; el nivel de U87 es más alto que el de las células NS0-IL13Ra2. Por el contrario, la inducción de los genes IL2 e INF-y en las células T IL13Z- fue similar a la observada en las células T IL13-CD28-41BBZ- cuando cada población se cocultivó con células NS0 que expresaban de manera estable OKT3 unido a la membrana, un agonista Molécula de inmunoglobulina que activa las células T mediante la participación de CD3e. Estos resultados indican que la menor inducción de ARNm de IL2 e INF-y mediada por el acoplamiento de IL13Z con IL13Ra2 no se debe a un defecto intrínseco en estas células T, sino a la falta de dominios coestimuladores de c D28 y 4-1BB dentro del CAR.

Para cuantificar las cantidades de proteínas de citocina Th1 frente a Th2 liberadas de estas células T que expresan CAR, se ensayó el contenido de citocinas de los sobrenadantes de estos cocultivos. Después de una incubación de 24 horas, se recolectaron los sobrenadantes de cultivo de IL13Z+ (barras blancas) o IL13-CD28-41BBZ+ (barras negras) y se analizaron las citocinas Th1 y Th2 mediante una matriz de microesferas citométricas múltiples utilizando el kit 17-Plex Panel™ humano según las instrucciones del fabricante (Laboratorios Bio-Rad™). Ver Figura 11B.

El glioma U87 o las células IL13Ra2+ NS0 estimularon más liberación de citocinas Th1 (IL2, IFN-^y, TNF-a y GM-CSF) y menos liberación de citocinas Th2 (IL5, IL10 e IL13) de las células T IL13-CD28-41BBZ- que de las células T IL13Z-. Se produjeron niveles equivalentes de citocinas Th1 y Th2 mediante células T CD4+ que expresan IL13Z e IL13-CD2841BBZ cultivadas con células NS0 que expresan OKT3, lo que indica que estas células permanecen sin polarizar tras la activación policlonal mediante CD3 endógena. Los niveles de citocinas eran todos de bajos a indetectables cuando las células T se cultivaron con células NS0 parentales. Los niveles de la citoquina Th2 IL4 también fueron de bajos a indetectables cuando las células T se cultivaron con cualquiera de las estirpes de células tumorales. En general, estos datos muestran que la presencia de dominios coestimuladores CD28 y 4-1BB dentro del CAR ayudan a impulsar la transcripción de células T CD4+ y la secreción de citocinas similares a Thi.

Ejemplo 4. Aumento de la actividad lítica antitumoral de reciclaje en células T IL13-CD28-41BBZ- CD4+.

Para determinar si el CAR coestimulador afectaba a la actividad citotóxica específica del tumor de las células T CD4-T, se realizaron ensayos citolíticos luminiscentes (LCA) para detectar la actividad de luminiscencia del transgén de luciferasa de luciérnaga (ffLuc) de células tumorales in vitro. Este ensayo se realizó como lo describen Brown et al., “Biophotonic cytotoxicity assay for high-throughput screening of cytolytic killing”. J. Immunol. Meth. 297: 39-52, 2005, con 0.14mg/ml de D-luciferina y usando un luminómetro Victor2™. Brevemente, la actividad de luminiscencia del transgén ffLuc de las células tumorales in vitro se analizó mediante LCA con 0.14 mg/ml de D-luciferina (Xeonogen™) usando un luminómetro Victor2™. Consulte la Figura 12A, que muestra una actividad citotóxica mejorada de las células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ (■) contra los objetivos U87 en comparación con las células T IL13Z+ CD4+ (O) a la relación E: T indicada después de 4 horas. Se indica la media EE de valores triplicados; * indica una p < 0.05 utilizando una prueba t de Student para datos no apareados.

Después de 4 horas de cocultivo con células diana U87 transfectadas con ffLuc, las células IL13-CD28-41BBZ-_ mostraron una mejora estadísticamente significativa en la actividad lítica en comparación con las células IL13Z. Si el cocultivo se extendió a 48 horas, no se observó diferencia en la actividad citotóxica entre las células que expresan IL13Z e IL13-CD28-41BBZ (se alcanzó una lisis específica del 100 % con ambas células). Los datos en la Figura 12B indican lisis específica por ensayo de LCA después de 48 horas de co-cultivo en una relación E: T de 2: 1, y luego nuevamente después de la adición de nuevos objetivos para otras 48 horas de co-cultivo en una relación E: T de 2: 1. Se indica la media EE de valores triplicados; * indica una p <0.05 (prueba t de Student pareada) comparando células T IL13-CD28-41BBZ+ CD4+ (barras negras) con células T IL13Z+ c D4+ (barras blancas) en el cocultivo indicado.

Los niveles de ARNm de perforina y granzima B se regularon positivamente por igual en las células IL13Z e IL13-CD28-41BBZ, lo que sugiere que estas células T que expresan CAR pueden usar mecanismos similares de destrucción. Sin embargo, si se añadieron dianas ffLuc-frescas para una segunda ronda de cocultivo de 48 horas con las mismas células T CD4-T que expresan CAR, las células IL13-CD28-41BBZ-_ exhibieron una actividad lítica significativamente mayor que las células IL13Z-(Figura 12B). Esto sugiere que el CAR coestimulador afecta de manera beneficiosa la duración y/o el reciclaje de la actividad letal de las células T CD4.

Para examinar más a fondo este fenómeno, se analizó la viabilidad de las células tumorales U87 durante el cocultivo con células T IL13Z- o IL13-CD28-41BBZ-_ utilizando microscopía de lapso de tiempo de video (VTLM) de cocultivos de 6 x 105 células de glioma U87 adherente con 1.2 x 106 células T ^c D4+ que expresan IL13Z o IL13-CD28-41BBZ. Los cultivos se lavaron 45 horas más tarde y luego se volvieron a cultivar con células de glioma U87 frescas (6 x 105). Se representaron gráficamente los números de células tumorales viables durante 42 horas (la primera destrucción) y de 45 horas a 139 horas (la segunda destrucción). Vea la Figura 12C.

Se tomaron imágenes simultáneamente en una habitación cálida a 37 °C en cuatro microscopios Eclipse TS100™ (Nikon™ Inc.), cada uno equipado con una lámpara de tungsteno-halógeno, filtro GIF (verde), condensador ELWD 0.3 NA, Lente objetivo con corrección infinita PhL Dl 4x/0.13 Plan Fluor™, adaptador de montura C sin lente D10NLC 1x (Diagnostic Instruments™) y cámara de vídeo CCD de 1^ ” RS-170 B/N v Cb -3524 (Sanyo™ North America Corp.). Para recolectar datos, se añadieron 1.2 x 106 células T (en 200 pl de solución salina equilibrada de Hank suplementada con albúmina de suero humano al 0.1 %) a matraces T-25 que contenían 6 x 105 células U87 adherentes (sembradas 1 día antes a 3 x 105 células/matraz). Se permitió que los matraces se equilibraran en la platina del microscopio durante 30 minutos antes de la obtención de imágenes. La velocidad de adquisición por lapso de tiempo fue a intervalos de 2 minutos. Se adquirieron varios fotogramas de células tumorales solas en cada video, seguido de la adición de células T. Las células combinadas luego se registraron continuamente durante 80 horas. Después de agregar las células T, cada matraz se gaseó con 5 % CO2 durante 10 segundos y sellado con parafilm para asegurar un buen control del pH (bicarbonato en HBSS) y un enfoque estable, respectivamente. Las imágenes se adquirieron utilizando el organizador de cámara COH VTLF y se digitalizaron a 640 x 480 píxeles utilizando una placa de captura de fotogramas de 4 canales Matrox™. Se realizaron recuentos de células tumorales viables a intervalos de <10 horas usando el comando “Recuento manual de objetos” en MetaMorph™ 6.33 (Universal Imaging/Molecular Devices™ Corp.). Todos los conjuntos de datos se importaron a MetaMorph™ y se guardaron como pilas de MetaMorph™ y películas AVI.

La capacidad de cualquiera de las células T CD4+ modificadas genéticamente para destruir células tumorales durante las primeras 42 horas de cocultivo fue sustancialmente la misma (casi el 100 % de las células U87 murieron a las 30 horas). Sin embargo, en el segundo encuentro con las células tumorales U87, las células T IL13-CD28-41BBZ-recuperadas retuvieron una mayor actividad citolítica que las células T IL13Z-. Es importante destacar que la enumeración de las células T antes de la adición de las células U87 por segunda vez reveló que no había diferencias significativas en el número de células. Además, los ensayos basados en CFSE realizados durante 72 horas de cocultivo con células U87 no revelaron diferencias en la proliferación de células T IL13Z o IL13-CD28-41BBZ-_ in vitro. Esto demuestra que la mayor actividad citolítica tras la adición de nuevos objetivos no se debió a la presencia de más citolíticos, sino a una mayor capacidad de funcionamiento de los citolíticos individuales. Juntos, estos datos muestran que el CAR coestimulador apoya el reciclaje y la retención de la función de las células T CD4.

Ejemplo 5. Aclaramiento de tumores in vivo mejorado por células T IL13-CD28-41BBZ- CD4+.

Se evaluó la capacidad de los CAR con dominios de señalización CD28 y 4-1BB para mejorar la eficacia antitumoral de las células T CD4+ usando tumores U87 establecidos en un modelo de xenoinjerto murino ortotópico. Para los estudios in vivo, las células U87 se transfectaron con ffluc-zeocin_pcDNA3.1 (+) (pJ00778, un plásmido que expresa una fusión de proteínas de la enzima luciferasa de luciérnaga y el gen de resistencia al fármaco zeocina) e lL2 (2) _HyTk-pMG (pJ00976, un plásmido que expresa la citoquina IL2 y el gen de fusión de selección/suicidio HyTK) usando oligofectimina (Invitrogen™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y luego clonado en presencia de 0.2 mg/ml de zeocina y 0.1 mg/ml de higromicina.

Para producir el modelo de xenoinjerto de glioma ortotópico, los ratones se trataron como sigue. Un día después de la irradiación con 250 rads, se anestesiaron ratones NOD-scid machos de 6 a 8 semanas de edad, se afeitaron e inmovilizaron en un dispositivo de sujeción estereotáctico Cunningham™ Mouse/Neonatal Rat Adapter (Stoelting™). Luego, los ratones recibieron una inyección estereotácticamente guiada de tumor (glioma U87) 2 mM lateral y 0.5 mM anterior a Bregma sobre 3-5 mM. Se inyectaron células tumorales U87-ffLucZeo/IL2 (2 x 105 células/ratón), suspendidas en 2 pl de RPMI sin fenol (Irvine Scientific, Irvine, CA) a una profundidad de 2.5 mM desde la dura. Siete días después de la inoculación del tumor, se administraron 106 células T que expresaban IE13Z o IE13-CD28-41BBZ (transferidas adoptivamente) en 2 pl a las coordenadas del tumor en el cerebro. Los animales de control recibieron solo PBS (“control simulado”). Los orificios de las rebabas se sellaron con cera para huesos y la incisión se cerró con pegamento Nexaband™. Los animales recibieron una inyección subcutánea de 0.1 mg/kg de Buprenex™ para la recuperación posquirúrgica. En este modelo, los tumores comienzan a retroceder espontáneamente a los 13-14 días después de la inyección debido a la recuperación del sistema inmunológico endógeno, por lo que los experimentos se completaron el día 12.

El crecimiento de tumores ortotópicos se puede cuantificar de forma no invasiva controlando las señales de flujo de ffLuc derivadas de tumores en células de glioblastoma U87 establecidas que expresan de manera estable luciferasa de luciérnaga (ffLuc) e IL2 humana. La actividad luciferasa in vivo se detectó usando imágenes tumorales biofotónicas in vivo en ratones con el sistema Xenogen™ In Vivo Imaging System (IVIS) como se describió previamente por Kahlon et al. “Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells”. Cancer Res. 64: 9160-9166, 2004. Brevemente, para monitorizar el flujo de ffLuc, los ratones fueron inyectados intraperitonealmente con 4.29 mg de D-luciferina, anestesiados (1.5 L/min de oxígeno 4 % de isoflurano) y se midió la emisión de luz durante un tiempo de integración de 1 minuto a los 14 minutos después de la inyección de luciferina. El flujo (fotones/segundo) se cuantificó como recuentos totales medidos a lo largo del tiempo en la región de interés. Vea los resultados en la Figura 13. Los valores en el eje Y representan la media I DE que pertenece a los niveles de flujo total de tumores ffLuc+ de los grupos simulados y tratados (n = 6 para cada grupo) en los días indicados después del injerto del tumor. “Tx” indica tratamiento con células T transferidas adoptivamente.

Antes de la transferencia adoptiva de células T CD4+ que expresan CAR, todos los ratones exhibieron niveles crecientes de señales de flujo de ffLuc derivadas de tumores como se esperaba (ver Figura 13; comparar los días 2 y 6 después del injerto del tumor). Dos días después de la transferencia adoptiva (Tx), los niveles de flujo de ffLuc tumoral se redujeron en los ratones tratados con células T que expresan IL13Z o IL13-CD28-41BBZ, en comparación con los ratones tratados de forma simulada. Sin embargo, 5 días después del tratamiento con células T (día 12 después del injerto), las señales de flujo tumoral en los ratones tratados con células T IL13-CD28-41BBZ- permanecieron bajas, mientras que las señales de flujo de los ratones tratados con células T IL13Z- habían aumentado a un nivel similar a la del grupo tratado de forma simulada (control). Los dominios de señalización coestimuladores de CD28 y 4-1BB mejoraron y/o prolongaron así el control del crecimiento tumoral por las células T genéticamente redirigidas.

Ejemplo 6. Preparación de células T adecuadas para terapia

Se obtuvieron linfocitos T de un paciente mediante leucoféresis, y las células T autólogas se alteraron genéticamente para expresar el CAR, luego se volvieron a administrar al paciente para lograr la terapia anticancerosa.

Para preparar células T IL13Z+ adecuadas para uso terapéutico, las células mononucleares se separaron de la sangre sometida a leucoféresis mediante centrifugación sobre Ficoll™ de grado clínico. Las PBMC se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato estéril que contenía EDTA 0.526 mM y luego una vez en PBS estéril, y se suspendieron en medio de cultivo que consistía en RPMI 1640 HEPES, FCS inactivado por calor al 10 % y L-glutamina 4 mM. Las células T presentes en las PBMC del paciente se activaron policlonalmente mediante la adición de Orthoclone™ OKT3 (30 ng/ml) al cultivo. A continuación, los cultivos celulares se incubaron en matraces de cultivo de tejidos T-75 ventilados en la incubadora designada por el sujeto del estudio. Veinticuatro horas después del inicio del cultivo, se añadió rhIL2 a 25 U/ml. Tres días después del inicio del cultivo, se recolectaron PBMC, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de electroporación hipotónica a 20 x 106 células/ml. Se añadieron veinticinco microgramos del plásmido IL13^/HyTK-pMG, junto con 400 |jl de suspensión celular, a una cubeta de electroporación estéril de 0.2 cm. Cada cubeta se sometió a un único pulso eléctrico de 250 V/40 js y se incubó de nuevo durante diez minutos a temperatura ambiente. Las células supervivientes se recogieron de cubetas, se agruparon y se resuspendieron en medio de cultivo que contenía 25 U/ml de rhIL2. Los matraces se colocaron en la incubadora de cultivo de tejidos designada por el paciente. Tres días después de la electroporación, se añadió higromicina a las células a una concentración final de 0.2 mg/ml. Se cultivaron PBMC electroporadas durante un total de 14 días con medio y suplementación con IL2 cada 48 horas.

La clonación de CTL CD8+ resistentes a higromicina de PBMC de pacientes activadas con OKT3 electroporadas se inició el día 14 de cultivo. Brevemente, se agregaron PBMC de pacientes viables a una mezcla de 100 x 106 PBMC alimentadores irradiados criopreservados y 20x 106 TM-LCL (células linfoblastoides transformadas con EBV que actúan como células alimentadoras) irradiadas en un volumen de 200 ml de medio de cultivo que contiene 30 ng/ml de OKT3 y 50 U/ml de rhIL2. Esta mezcla se sembró en placas de 0.2 ml en cada pocillo de diez placas de clonación de 96 pocillos. Las placas se envolvieron en papel de aluminio para disminuir la pérdida por evaporación y se colocaron en la incubadora de cultivo de tejidos designada por el paciente. El día 19 de cultivo, cada pozo recibió higromicina hasta una concentración final de 0.2 mg/ml. Los pocillos se inspeccionaron visualmente en busca de excrecencia celular en un microscopio invertido el día 30 y los pocillos positivos se marcaron para reestimulación.

Los contenidos de cada pocillo de clonación con crecimiento celular se transfirieron individualmente a matraces T-25 que contenían 50 x 106 PBMC irradiadas, 10 x 106 LCL irradiadas y 30 ng/ml de OKT3 en 25 ml de medio de cultivo de tejidos. En los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y/o 13 después de la reestimulación, los matraces recibieron 50 U/mL de rhIL2 y 15 ml de medio fresco cuando fue necesario. El día 5 del ciclo de estimulación, los matraces también se suplementaron con higromicina 0.2 mg/ml. Catorce días después de la siembra, las células se recolectaron, contaron y reestimularon en matraces T-75 que contenían 100 x 106 PBMC irradiados, 20 x 106 TM-LCL irradiados y 30 ng/ml de OKT3 en 50 ml de medio de cultivo tisular. Los matraces recibieron adiciones al cultivo de rhIL2 e higromicina como se describió anteriormente.

Los CTL seleccionados para la expansión para su posible uso en terapia se analizaron por inmunofluorescencia en un clasificador de células activado por fluorescencia, utilizando anticuerpos monoclonales conjugados con FITC WT/31 (apTCR), Leu 2a (CD8) y OKT4 (CD4) para confirmar el fenotipo del clon (apTCRd+, CD4', CD8+ e IL13+). Los criterios para la selección de clones para uso clínico incluyeron TCRap+, CD4-, CD8+ e IL13+ uniformes en comparación con el anticuerpo conjugado con FITC/PE de control de isotipo. Se confirmó un único sitio de integración cromosómica del vector plásmido mediante análisis de transferencia Southern. El ADN de los clones de células T modificadas genéticamente se cribó con una sonda de ADN específica para el vector plasmídico.

La expresión de IL13-CD28-41BBZ se determinó mediante transferencia Western para detectar la proteína receptora quimérica utilizando el anticuerpo anti-CD3Z de cadena zeta descrito anteriormente de acuerdo con métodos estándar. En resumen, se generaron lisados de células completas de clones de células T transfectadas mediante la lisis de 2 x 107 células lavadas en 1 ml de tampón RIPA (PbS, NP40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0.5 %, SDS al 0.1 %) que contenía 1 comprimido/10 ml de Cóctel inhibidor de proteasa completo. Después de una incubación de 80 minutos en hielo, se recogieron alícuotas de sobrenadante de lisado celular completo centrifugado y se hirvieron en un volumen igual de tampón de carga en condiciones reductoras y luego se sometieron a electroforesis SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12 % prefabricado. Después de la transferencia a nitrocelulosa, la membrana se bloqueó en solución Blotto™ que contenía leche desnatada en polvo al 4 % en T-TBS (Tween 20™ al 0.1 % en solución salina tamponada con Tris, pH 8.0) durante una hora. Las membranas se lavaron en T-TBS, luego se incubaron con anticuerpo monoclonal primario de ratón anti-CD3Z humano 8D3 (Pharmingen™) a una concentración de 0.5 jg/m l durante una hora. Después de cuatro lavados adicionales en T-TBS, las membranas se incubaron con una dilución 1: 3000 (en solución Blotto™) de anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina IgG anti-ratón de cabra durante 1 hora. Antes de agregar el sustrato, las membranas se enjuagaron en T-TBS, luego se incubaron con 3 ml de solución de sustrato de fosfatasa (kit Bio-Rad™ ImmunoStar™) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las dosis adecuadas para un efecto terapéutico están entre aproximadamente 106 y aproximadamente 109 células por dosis, preferiblemente en una serie de ciclos de dosificación. Un régimen de dosificación preferido consiste en cuatro ciclos de dosificación de una semana de dosis crecientes, comenzando con aproximadamente 107 células el día 0 , aumentando gradualmente hasta una dosis objetivo de aproximadamente 108 células el día 5. Los modos de administración adecuados incluyen administración intravenosa, subcutánea, intracavitaria (por ejemplo, mediante un dispositivo de acceso al reservorio), inyección intraperitoneal y directa en una masa tumoral.

Ejemplo 7. Tratamiento de glioma recidivante intracraneal en pacientes humanos.

El tratamiento de glioma o cualquier otro cáncer como se describe en el presente documento usando células T que expresan IL13-CD28-41BBZ de acuerdo con esta invención se realizó como sigue. Los clones de células T, preferiblemente como se describe en el Ejemplo 6 , se seleccionaron por:

a. Fenotipo de la superficie celular TCRa/p+, CD4- CD8+, IL13+;

b. la presencia de una única copia del ADN del vector plasmídico integrado cromosómicamente;

c. expresión de la proteína IL13-CD28-41BBZ;

d. lisis específica de dianas IL13Ra2+ humanas;

e. dependencia de IL2 exógena para el crecimiento in vitro;

f. micoplasma, esterilidad fúngica y bacteriana y niveles de endotoxinas inferiores a 5 UE/ml; y

g. sensibilidad in vitro de clones al ganciclovir.

Las células mononucleares de sangre periférica se obtuvieron del paciente mediante leucoféresis, preferiblemente después de la recuperación de la cirugía de resección inicial y en un momento de al menos tres semanas después de disminuir gradualmente los esteroides y/o su quimioterapia sistémica más reciente. El rendimiento de células mononucleares de leucoféresis diana fue generalmente de 5x109 y el número diana de clones de células T citolíticas resistentes a higromicina fue 25. En general, se identificaron al menos cinco clones que cumplían todos los parámetros de control de calidad para la expansión in vitro. Los clones se criopreservaron y los pacientes se controlaron mediante exámenes clínicos y radiográficos seriados. Cuando se documentó la recurrencia de la progresión de la enfermedad, los pacientes se sometieron a una nueva resección y/o la colocación de un dispositivo de acceso al reservorio para administrar células T a la cavidad de resección del tumor.

Después de la recuperación de la cirugía y la disminución gradual de los esteroides, si corresponde, el paciente comenzó la terapia con células T de la siguiente manera. El paciente recibió una diana de al menos cuatro ciclos de terapia de una semana. Durante el primer ciclo, el aumento de la dosis celular procedió desde una dosis inicial el día 0 de aproximadamente 107 células, seguida de aproximadamente 5 x 107 células el día 3 hasta una dosis objetivo de aproximadamente 108 células el día 5. El ciclo 2 comenzó tan pronto como una semana después comienzo del ciclo 1. En los días de la administración de células T, los clones expandidos se procesaron asépticamente lavándolos dos veces en 50 cc de PBS y luego se resuspendieron en solución salina normal sin conservantes farmacéuticos en un volumen que dio como resultado la dosis de células para el suministro del paciente en 2 ml. Preferiblemente, las células T se instilaron durante 5 a 10 minutos, seguido de 2 ml de PFNS administrado durante 5 minutos. La respuesta a la terapia se evaluó mediante resonancia magnética /- gandolinio, con espectroscopia.

En general, las dosis de células fueron al menos un logaritmo menor que las dosis administradas en estudios que emplean células LAK intracavitarias (dosis de células individuales de hasta 109y números de células acumulativas de hasta 2.75 x 1010), TIL expandidos ex vivo (hasta 109 células/dosis) y linfocitos alorreactivos (dosis celular inicial 108 con dosis celulares acumulativas hasta 51.5 x 108). Se favorece la dosificación repetitiva de dosis baja para evitar respuestas inflamatorias potencialmente peligrosas que podrían ocurrir con instilaciones de un solo gran número de células. Cada infusión consistió preferiblemente en un solo clon de células T, y el mismo clon se administró preferiblemente a lo largo del curso de tratamiento de un paciente.

Aquellos pacientes que demuestren regresión tumoral con enfermedad residual en la resonancia magnética pueden tener cursos adicionales de terapia que comiencen no antes de la semana 7, que consisten en la repetición de los ciclos 3 y 4 seguidos de una semana de descanso/reestadificación, siempre que estos tratamientos sean bien tolerados hasta que tiempo en que se documenta la progresión de la enfermedad o se logra una respuesta completa (RC) basada en la evaluación radiográfica. Las toxicidades máximas generalmente aceptadas son inferiores al grado 3, sin embargo, esto queda a criterio del médico tratante.

El tratamiento con ganciclovir conduce a la ablación de los clones CAR+ HyTK+ CD8+ CTL. Por lo tanto, cualquier efecto secundario asociado con la terapia (dolor de cabeza, fiebre, escalofríos, náuseas, etc.) que pueda ocurrir se puede controlar mediante tratamientos establecidos apropiados para la afección. Por ejemplo, el paciente puede recibir ganciclovir si se observa cualquier nueva toxicidad de grado 3 que progresa a grado 4, o cualquier toxicidad de grado 4 relacionada con el tratamiento que, en opinión del médico tratante, pone al paciente en un peligro médico significativo. El ganciclovir administrado por los padres se dosifica a 10mg/kg/día divididos cada 12 horas. Los pacientes deben ser hospitalizados durante las primeras 72 horas de tratamiento con ganciclovir con fines de seguimiento. Si los síntomas no responden al ganciclovir dentro de las 48 horas, se pueden agregar agentes inmunosupresores adicionales, incluidos, entre otros, corticosteroides y ciclosporina, a discreción del médico tratante. Si las toxicidades son graves, el decadrón y/u otros fármacos inmunosupresores junto con ganciclovir también pueden usarse a discreción del médico tratante.

Los estudios preliminares de seguridad que utilizaron el protocolo descrito anteriormente, donde se administraron clones de CTL que expresaban IL13-CAR a pacientes humanos con glioma intracraneal recurrente, indicaron que de los eventos adversos que tenían una posible correlación con la administración intracavitaria de células T, los únicos eventos de grado 3 han sido dolores de cabeza que se produjeron con la administración de 108 células en cada uno de los dos pacientes tratados hasta la fecha. En ningún momento se encontró que los eventos adversos de Grado 4

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que está codificado por el ADN de SEQ ID NO: 39.

2. Un linfocito T aislado que expresa el CAR de la reivindicación 1.

3. Un linfocito T que expresa el CAR de la reivindicación 1 para uso en inmunoterapia contra el cáncer.

4. Un linfocito T de la reivindicación 3, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, meduloblastoma, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñón, cáncer de ovario, sarcoma de Kaposi, leucemia mielógena aguda y neoplasias malignas de linaje B.