ES2899383T3 - Procedimiento para la detección específica de microorganismos y uso de un citómetro de flujo en el procedimiento - Google Patents

Procedimiento para la detección específica de microorganismos y uso de un citómetro de flujo en el procedimiento Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la detección de un microorganismo en una muestra, que comprende los pasos: (a) facilitar la muestra; (b) fijar las células contenidas en la muestra con un agente de fijación y separar de la muestra las células fijadas obtenidas, para facilitar células fijadas; (c) poner en contacto las células fijadas con un agente de homogeneización químico y secar las células homogeneizadas así obtenidas, para facilitar células secadas, en donde el agente de homogeneización químico comprende (i) un monosacárido o un disacárido, (ii) un poliol y (iii) agua; (d) poner en contacto las células secadas con una solución de una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, específica para el microorganismo que va a detectarse, para facilitar una primera mezcla de reacción; (e) incubar la primera mezcla de reacción, para provocar una unión de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia a la secuencia de ácido nucleico diana correspondiente en las células del microorganismo que va a detectarse; (f) poner en contacto la primera mezcla de reacción a continuación de la etapa (e) con una solución de una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, para facilitar una segunda mezcla de reacción, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador comprende un desactivador que extingue al menos parcialmente la fluorescencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y presenta una secuencia de ácido nucleico, que es esencialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de la sonda de ácido marcada con fluorescencia; (g) incubar la segunda mezcla de reacción, para provocar una unión de las moléculas de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, no unidas a la secuencia de ácido nucleico diana en las células del microorganismo que va a detectarse, a la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador; y (h) introducir la segunda mezcla de reacción a continuación de la etapa (g) en un citómetro de flujo y detectar la fluorescencia emitida por las células del microorganismo que va a detectarse, que contienen la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la detección específica de microorganismos y uso de un citómetro de flujo en el procedimiento
La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección específica de un microorganismo o de un grupo de microorganismos mediante hibridación in-situ por medio de citometría de flujo, así como al uso de un citómetro de flujo en este procedimiento.
La analítica rutinaria microbiana en la industria de alimentos está confrontada en muchos campos con un alto volumen de muestras (> 100 muestras por día), que debe procesarse rápidamente y a ser posible en paralelo. Para realizar el procesamiento de una producción de muestras grande de este tipo (alto rendimiento) con un sistema de detección rápido específico, de biología molecular, se ofrecen sistemas con evaluación automática y determinación de resultados objetiva.
Como método moderno de determinación de bacterias, que es adecuado para cumplir estos requerimientos, se ha establecido entretanto la denominada hibridación in situ de fluorescencia (FISH), en cuya forma de realización original se vuelven visibles bajo el microscopio células en un portaobjetos mediante moléculas de sonda de ácido nucleico marcadas con fluorescencia (Amann et al., Microbial. Rev. 59 (1995), 143-169). Sin embargo, la técnica FISH clásica tiene en particular el problema de que la detección por medio de microscopio requiere personal de laboratorio bien formado y un gasto de tiempo considerable, lo que limita mucho de acuerdo con la naturaleza el número de muestras analizadas por día.
Para tratar este problema, se propuso en los años posteriores una hibridación in-situ de fluorescencia a base del mecanismo de reacción de la técnica FISH clásica en fase líquida, en la que todas las etapas de la reacción de hibridación se transfirieron de manera casi invariable desde el formato de portaobjetos al formato de recipiente de reacción y se realizó una detección por medio de citómetro de flujo (documento WO 03/083131 A1). En el contexto de este procedimiento se separaron las distintas soluciones de hibridación y de lavado por medio de centrifugación.
En particular, las etapas de lavado necesarias en la hibridación de célula total para el aumento de la relación señalruido en la analítica rutinaria requieren sin embargo mucho trabajo y requieren igualmente personal de laboratorio igualmente bien formado en la manipulación. Además, las etapas necesarias en la centrifugación para la separación de los sobrenadantes acuosos representan otro parámetro de proceso que ha de tenerse en cuenta en la valoración del resultado observado y de la normalización necesaria del procedimiento.
El documento DE 10 2010 012 421 A1 da a conocer un procedimiento para la detección específica de microorganismos, que puede realizarse rápidamente y pasa sin las etapas de lavado necesarias en la técnica FISH clásica. En particular, el procedimiento comprende una realización de la reacción de hibridación en una placa de microtitulación así como la determinación de resultados siguiente a través de un lector de placas de microtitulación, en donde la señal de fluorescencia leída se corresponde con la suma de las sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia unidas de manera específica a los microorganismos.
Una condición previa decisiva para esta determinación de bacterias semicuantitativa consiste en la extinción de fluorescencia específica de molécula de sonda de ácido nucleico marcadas con fluorescencia no unidas dentro del espacio de reacción de la placa de microtitulación, para permitir una discriminación de señales específicas con respecto a no específicas. El procedimiento tiene sin embargo el inconveniente de que no se proporciona una cuantificación precisa del número de células, dado que el número de moléculas de sonda de ácido nucleico marcadas con fluorescencia unidas de manera específica por célula (y con ello el aporte de una célula a la intensidad de señal de fluorescencia medida) no puede determinarse de manera unívoca. Una célula individual puede unir a este respecto por regla general entre 5000 y 15000 sondas de oligonucleótido marcadas con fluorescencia.
Shepherd et al. (Anal. Chem. 85 (2013), 4938-4943) enseña un procedimiento para la cuantificación de ARNs de bacterias patógenas por medio de una combinación de la técnica smFISH y posterior extinción de fluorescencia. El procedimiento comprende la fijación de células de Yersinia pestis o Yersinia tuberculosis con formaldehído, la permeabilización de las células fijadas con etanol al 70 %, la puesta en contacto e incubación de las células permeabilizadas con un tapón de hibridación, que contiene una pluralidad de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia específicas para Yersinia, la captura de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia no unidas mediante puesta en contacto e incubación de la mezcla de reacción con una solución de una pluralidad de sondas de ácido nucleico marcadas con desactivador, complementarias a estas, y la detección de la fluorescencia de una muestra obtenida de esta manera con el uso de un espectrofotómetro.
Por lo tanto, la presente invención se basaba en el objetivo de facilitar un procedimiento para la detección de microorganismos en general y de un microorganismo en especial, que superara los inconvenientes anteriores del estado de la técnica. En particular debía poder realizarse el procedimiento de la manera más sencilla posible (es decir con gasto técnico a ser posible bajo y también en ausencia de personal de laboratorio formado) y ofrecer la posibilidad de analizar en el intervalo de breve tiempo una gran cantidad de muestras y garantizar al mismo tiempo una alta especificidad para microorganismos relevantes de la muestra. A este respecto debía realizarse la determinación de resultados y la evaluación de manera objetiva y normalizada. La invención está definida por las reivindicaciones.
En un primer aspecto para la solución para el objetivo se refiere la invención por consiguiente a un procedimiento, tal como se ha definido en la reivindicación 1. El procedimiento de acuerdo con la invención permite la detección rápida y específica de microorganismos, sin que se requiera a este respecto una etapa de lavado como en la técnica FISH clásica. Además, con el procedimiento de acuerdo con la invención se suprime la autofluorescencia que se produce en la técnica FISH, y en particular la técnica FISH clásica e inespecífica y problemática durante la evaluación.
Además, el procedimiento de acuerdo con la invención permite, en comparación con el procedimiento de placas de microtitulación descrito en el documento DE 102010 012421 A1, una realización muy simplificada, acortándose las etapas de procedimiento convencionales a la adición de 2 soluciones de reacción a la mezcla de reacción de muestra y pudiéndose realizar la reacción en un único recipiente de reacción. Además se vuelve posible mediante el uso de un citómetro de flujo en el marco de la detección una cuantificación directa de los microorganismos detectados.
Finalmente puede automatizarse el presente procedimiento al menos y también con respecto a la realización y evaluación. El procedimiento de acuerdo con la invención es adecuado debido a ello también especialmente para una analítica con alto volumen de muestras (alto rendimiento).
La realización del procedimiento de acuerdo con la invención para la detección específica de un microorganismo o varios microorganismos en una muestra comprende las siguientes etapas:
(a) facilitar la muestra;
(b) fijar las células contenidas en la muestra con un agente de fijación y separar las células fijadas obtenidas en este sentido de la muestra, para facilitar células fijadas;
(c) poner en contacto las células fijadas con un agente de homogeneización químico y secar las células homogeneizadas obtenidas en este sentido, para facilitar células secadas, en donde el agente de homogeneización químico (i) comprende un monosacárido o disacárido, (ii) un poliol y (iii) agua;
(d) poner en contacto las células secadas con una solución de una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, específica para el microorganismo que va a detectarse, para facilitar una primera mezcla de reacción;
(e) incubar la primera mezcla de reacción, para provocar una unión de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia a la secuencia de ácido nucleico diana correspondiente en las células del microorganismo que va a detectarse;
(f) poner en contacto la primera mezcla de reacción a continuación de la etapa (e) con una solución de una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, para facilitar una segunda mezcla de reacción, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador comprende un desactivador que extingue al menos parcialmente la fluorescencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y presenta una secuencia de ácido nucleico, que es esencialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de la sonda de ácido marcada con fluorescencia;
(g) incubar la segunda mezcla de reacción, para provocar una unión de las moléculas de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, no unidas a la secuencia de ácido nucleico diana en las células del microorganismo que va a detectarse, a la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador; y
(h) introducir la segunda mezcla de reacción a continuación de la etapa (g) en un citómetro de flujo y detectar la fluorescencia que se emite por las células del microorganismo que va a detectarse, que contienen la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia.
La presente invención se refiere a la detección específica de un microorganismo individual o de varios microorganismos (es decir, al menos de dos distintos) en una muestra que se produce naturalmente o compuesta de manera sintética. Se entiende que con la detección de un microorganismo de este tipo se detecta en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención más de solo una célula individual. Por regla general se realiza la detección de una o varias células, en donde la detección se basa en la detección de la fluorescencia que sale de una célula individual.
El término "microorganismo", tal como se usa en el marco de la presente solicitud, comprende tanto microorganismos que se producen de manera natural como también generados sintéticamente, que pueden ser de naturaleza patógena o apatógena e incluyen entre otros bacterias, hongos, microalgas y protozoos. Preferentemente en el caso del al menos un microorganismo que va a detectarse se trata de una bacteria, un hongo o un organismo superior unicelular (protozoo), en donde la bacteria, el hongo o/y el organismo superior unicelular puede proceder de una unidad taxonómica discrecional y el término "unidad taxonómica" comprende entre otros dominios/reinos, divisiones/filos, clases, subclases, órdenes, subórdenes, familias, subfamilias, géneros, subgéneros, especies, subespecies, cepas y subcepas.
Ejemplos concretos de microorganismos que pueden detectarse por medio del procedimiento de acuerdo con la invención, comprenden en particular bacterias, hongos (que comprenden levaduras y mohos) y protozoos, que dañan de manera conocida la calidad del agua (incluyendo aguas residuales), bebidas (por ejemplo agua, cerveza, zumos de fruta y bebidas refrescantes no alcohólicas) y alimentos (por ejemplo productos lácteos tal como queso y yogur, así como productos cárnicos tal como charcutería) y se han mencionados entre otros en los documentos DE 101 29410 A1, d E 10160666 A1 y WO 2005/031004 A2. La detección de bacterias, levaduras y mohos se prefiere especialmente en este contexto.
Como bacterias relevantes de la muestra se tienen en consideración en este sentido en particular bacterias de los géneros Acetobacter, Achromobacter, Acinetobacter, Aerococcus, Aeromonas, Agrobacterium, Alcaligenes, Alicydobacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Aquabacterium, Arcobacter, Arthrobacter, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacillus, Brevibacterium, Brocardia, Brochothrix, Burkholderia, Caldanaerobius, Campylobacter, Carnobacterium, Cellulomonas, Chloroflexi, Chryseobacterium, Chryseobacterium, Citrobacter, Cloacibacterium, Clostridium, Colwellia, Corynebacterium, Cronobacter, Delftia, Desulfotomaculum, Dickeya, Enterobacter, Enterobacteriaceae, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Facklamia, Flavobacteriaceae, Flavobacterium, Fructobacillus, Geobacillus, Gluconacetobacter, Gluconobacter, Janthinobacterium, Jeotgalibacillus, Kocuria, Komagtaeibacter, Kuenenia, Kurthia, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Lentibacillus, Leuconostoc, Listeria, Lysinibacillus, Macrococcus, Marinilactibacillus, Megasphaera, Microbacterium, Micrococcus, Microthrix, bacterias del ácido láctico, Moorella, Moraxella, Nitrobacter, Nitrosococcus, Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrotoga, Nocardia, Nostocoida, Obesumbacterium, Oceanobacillus, Oenococcus, Paenibacillus, Pantoea, Pectinatus, Pectobacterium, Pediococcus, Pedobacter, Photobacterium, Prevotella, Propionibacterium, Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Psychrobacillus, Psychrobacter, Psychroflexus, Rhizobium, Salmonella, Scalindua, Serratia, Shewanella, Shigella, Solibacillus, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Tepidomonas, Thermoanaerobacterium, bacterias termófilas, Thiothrix, Trichococcus, Ureibacillus, Vagococcus, Vibrio, Virgibacillus, Viridibacillus, Weissella, Xanthomonas, Yersinia y Zymomonas.
Los hongos relevantes de muestras, que pueden detectarse por medio del procedimiento de la presente invención, comprenden en particular mohos y levaduras de los géneros Aspergillus, Candida, Debaromyces, Dekkera, Geotrichum, Hanseniaspora, Hyphopichia, Kazachstania, Kloeckera, Kluyveromyces, Lodderomyces, Penicillium, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Torulaspora, Wickerhamomyces, Yarrowia y Zygosaccharomyces.
Los organismos superiores unicelulares relevantes de muestras (protozoos), que pueden detectarse por medio del procedimiento de la presente invención, comprenden en particular Giardia, Cryptosporidium, Amoba, Trichomonas, Toxoplasma, Balantidium y Blastocystis.
En lo que se refiere a la detección de microorganismos en agua, bebidas y alimentos, son de especial relevancia entonces bacterias de los géneros Acinetobacter, Alicyclobacillus, Aquabacterium, Arcobacter, Bacillus, Campylobacter, Enterobacteriaceae, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Listeria, Microthrix, Nitrobacter, Nitrosococcus, Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrotoga, Propionibacterium, Salmonella, Shigella y Streptococcus, así como hongos de los géneros Aspergillus, Candida, Debaromyces, Dekkera, Penicillium, Pichia y Saccharomyces, por lo tanto su detección se considera especialmente preferente.
La muestra, tal como se usa en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención, es preferentemente una muestra líquida. A este respecto es suficiente cuando al menos una parte de las células individuales del microorganismo que va a detectarse se encuentra en la fase líquida. En este sentido puede usarse de acuerdo con la invención también una muestra solo parcialmente líquida o una suspensión o una dispersión, en donde se considera preferente una solución. De manera especialmente preferente se usa como muestra líquida una muestra acuosa, tal como por ejemplo una muestra de agua o una muestra de bebida, que como tal (es decir sin adición de otro líquido) se alimenta a un análisis.
La muestra que va a analizarse en el contexto de la realización del procedimiento de acuerdo con la invención puede ser a este respecto cualquiera muestra primaria, de la que se genera una muestra secundaria, que se usa entonces como muestra líquida en el procedimiento de acuerdo con la invención. Una muestra primaria puede ser una muestra sólida, pastosa, líquida o gaseosa. Normalmente se obtiene de la muestra primaria una mezcla representativa de microorganismos, que entonces se transfiere a la muestra líquida, tal como se usa en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención.
Después de que se haya facilitado una muestra que va a analizarse, se fijan las células del microorganismo contenido en la muestra o de los microorganismos contenidos en la muestra en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención usando un agente de fijación. El término "fijación", tal como se usa en el marco de la presente solicitud, es bien conocido en el campo de la biología celular y designa en general una conservación de muestras biológicas para estudios posteriores. Un procedimiento para la fijación de células, que puede usarse en el contexto de técnicas FISH, se ha descrito por ejemplo en Amann et al. (Nature Reviews Microbiology 6 (2008), 339-350).
Como consecuencia de la diversidad de los sistemas de envoltura celular y en particular también de las paredes celulares de los distintos microorganismos que van a detectarse se adaptan las condiciones de reacción para la fijación preferentemente al microorganismo que va a detectarse en cada caso. Como agente de fijación se usa en el marco de la presente invención preferentemente un alcohol, en particular un alcohol de cadena corta tal como metanol, etanol o isopropanol, o un aldehído, en particular un aldehído de cadena corta tal como formaldehído o para-formaldehído.
Las condiciones de reacción precisas de un procedimiento de fijación usando agentes de fijación de este tipo pueden determinarse por un experto en el campo del diagnóstico microbiano mediante ensayos convencionales sencillos y experimentos rutinarios.
De acuerdo con la invención se realiza la fijación de las células contenidas en la muestra antes de la puesta en contacto de las células con el reactivo de detección específico para el respectivo microorganismo. A este respecto vale por un lado conservar la integridad y, en un cierto alcance, también la forma de las células que van a detectarse así como evitar una pérdida de células del microorganismo que va a detectarse en particular mediante lisis. Por otro lado vale permeabilizar tantas células como sea posible del microorganismo que va a detectarse mediante la fijación, de modo que puedan introducirse las sondas de ácido nucleico contenidas en el reactivo de detección preferentemente de manera individual o bien como cadena sencilla en las células, para hibridarse allí con la(s) secuencia(s) diana, siempre que estén presentes.
Además del tratamiento con el agente de fijación puede comprender la etapa de la fijación de las células adicionalmente un tratamiento enzimático de las células o bien del sistema de envoltura celular, lo que puede ser interesante en particular en el caso de bacterias Gram-positivas, en el caso de levaduras o en el caso de mohos. Para elevar la permeabilidad de la pared celular para el reactivo de detección específico que va a añadirse posteriormente, puede realizarse en el caso de bacterias Gram-positivas por ejemplo una modificación de la envoltura de peptidoglicano por medio de lisozima, o puede realizarse en el caso de levaduras y mohos, por ejemplo, una modificación de la pared celular de proteínas por medio de proteasas.
Otros tratamientos pueden comprender, por ejemplo, el tratamiento breve de las células por medio de disolventes o ácido clorhídrico para la separación de capas de lavado o similares. En una forma de realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención conduce la etapa de la fijación de las células a que las células fijadas ya no sean viables y no obstante se encuentren intactas, preferentemente intactas morfológicamente.
Después de que las células se hayan fijado con un agente de fijación adecuado y dado el caso se hayan tratado adicionalmente con una enzima o similar, se separan las células fijadas de la muestra. Para ello se centrifuga la muestra de manera conveniente, a lo cual se alimentan las células sedimentadas del procesamiento posterior y se descarta el sobrenadante. Otros métodos para la separación de las células fijadas de la muestra son bien conocidos por un experto en el campo del diagnóstico microbiano y pueden aplicarse de manera correspondiente a las respectivas circunstancias de manera adecuada.
Para permitir una cuantificación de células individuales en un citómetro de flujo, es necesario en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención que las células fijadas se mezclen con un agente de homogeneización químico antes de la puesta en contacto de las células con el reactivo de detección específico para el microorganismo que va a detectarse en cada caso y a continuación se sequen. El término "agente de homogeneización químico", tal como se usa en el presente documento, designa a este respecto un reactivo químico, que impide la agregación de células fijadas durante el posterior secado, por ejemplo impidiéndose la formación de enlaces covalentes, de interacciones iónicas o similares entre las paredes celulares de dos o más células fijadas. Mediante el aislamiento de las células puede realizarse entonces una cuantificación de células individuales en un citómetro de flujo.
De acuerdo con la invención, el agente de homogeneización químico incluye (a) un monosacárido o un disacárido, (b) un poliol y (c) agua. El monosacárido o bien disacárido puede ser a este respecto de origen natural o sintético, en donde como monosacárido puede usarse en particular un tetrosa, pentosa o hexosa que se encuentra en forma D o en forma L, tal como por ejemplo eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, lixosa, xilosa, alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa y fructosa. Como disacárido puede usarse en particular un compuesto seleccionado del grupo que está constituido por gentiobiosa, isomaltosa, lactosa, lactulosa, maltosa, maltulosa, rafinosa, sacarosa y trehalosa, aunque la invención no está limitada al uso de estas sustancias. Mucho más preferentemente se usa en el marco de la invención un monosacárido o disacárido seleccionado del grupo que está constituido por fructosa, galactosa, glucosa y sacarosa, y lo más preferentemente glucosa.
Como otra parte constituyente del agente de homogeneización químico usado de acuerdo con la invención sirve un poliol, en donde el término "poliol", tal como se usa en el marco de la presente solicitud, designa una sustancia orgánica de bajo peso molecular con al menos dos grupos hidroxi alcohólicos y excluye monosacáridos y disacáridos definidos anteriormente. El poliol puede ser de origen natural o sintético, y en el caso de presencia de un estereocentro o varios estereocentros puede encontrarse tanto en forma D como también en forma L. Ejemplos de polioles que van a usarse de acuerdo con la invención comprenden etilenglicol, glicerol, inositol, isomaltosa, manitol, pentaeritritol, sorbitol y xilitol, sin embargo no se limitan a estos. Mucho más preferentemente se usa en el marco de la invención un poliol seleccionado del grupo que está constituido por etilenglicol, glicerol, manitol y sorbitol, en donde glicerina es lo más preferente.
Como tercera parte constituyente, el agente de homogeneización químico comprende agua. En este sentido se ajusta la cantidad de agua habitualmente de manera que la cantidad de monosacárido o disacárido en el agente de homogeneización químico se encuentre aproximadamente en el intervalo del 10 al 70 % en peso, preferentemente de aproximadamente el 20 al 60 % en peso, mucho más preferentemente de aproximadamente el 30 al 50 % en peso, y lo más preferentemente de aproximadamente el 35 al 45 % en peso, con respecto al peso total del agente de homogeneización químico. Al cantidad de poliol en el agente de homogeneización químico se encuentra habitualmente en el intervalo de aproximadamente el 5 al 50 % en peso, preferentemente de aproximadamente el 10 al 40 % en peso, mucho más preferentemente de aproximadamente el 10 al 30 % en peso, y lo más preferentemente de aproximadamente el 15 al 25 % en peso, con respecto al peso total del agente de homogeneización químico.
Después de que se hayan homogeneizado las células fijadas usando el agente de homogeneización, se secan las células de manera adecuada, por ejemplo en un horno o armario de secado a una temperatura en el intervalo de 40 a 90 °C, preferentemente a una temperatura en el intervalo de 60 a 80 °C. A continuación se llevan a contacto las células secadas obtenidas de esta manera con un reactivo de detección específico para el microorganismo que va a detectarse en cada caso. En particular se introducen las células secadas para ello normalmente en un recipiente de reacción adecuado y entonces se mezclan en primera lugar con una solución al menos de una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, específica para el microorganismo, es decir de una sonda de ácido nucleico marcada con un colorante fluorescente, para facilitar una primera mezcla de reacción. Esta primera mezcla de reacción se incuba entonces en condiciones adecuadas, para provocar una unión de la al menos una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia a la secuencia de ácido nucleico diana correspondiente en las células del microorganismo que va a detectarse.
A continuación de esta etapa se lleva a contacto la primera mezcla de reacción con una solución al menos de una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, es decir de una sonda de ácido nucleico marcada con un desactivador que extingue al menos parcialmente la fluorescencia del colorante fluorescente de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, para facilitar una segunda mezcla de reacción, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador presenta una secuencia de ácido nucleico, que es esencialmente complementaria, y preferentemente complementaria de manera inversa a la secuencia de ácido nucleico de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia. La segunda mezcla de reacción se incuba entonces de nuevo en condiciones adecuadas, para provocar una unión de las moléculas no unidas a la secuencia de ácido nucleico diana de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia a la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador y por consiguiente extinguir al menos parcialmente la fluorescencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia eventualmente libre.
Esto significa por un lado que en el marco del procedimiento de la presente invención, la solución de la al menos una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador se añade directamente a la solución de la al menos una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, con lo que puede evitarse una separación previa de sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia eventualmente en exceso por medio de una etapa de lavado. Además, solo aquellas sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia que se han unido a la secuencia de ácido nucleico diana (es decir, en las células del microorganismo que va a detectarse de manera específica), contribuyen a la señal de fluorescencia. La señal de las sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia libres se extingue en gran parte, por el contrario, mediante hibridación con la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. Mediante este mecanismo de reacción se vuelve posible un sistema de ensayo de una sola etapa.
En lo que se refiere a la relación de cantidad de las dos sondas de ácido nucleico, es decir de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, depende esto de las condiciones de la forma de realización concreta del procedimiento de acuerdo con la invención y puede determinarse por medio de estudios rutinarios fácilmente por un experto. Sin embargo, la extinción requerida de la fluorescencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia en exceso, es decir no unida a la secuencia de ácido nucleico diana mediante la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador implica que la relación de cantidad de sonda de ácido nucleico marcada con desactivador con respecto a sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia ascienda a al menos 1:1, y preferentemente prevé un exceso de sonda de ácido nucleico marcada con desactivador.
En lo que se refiere a las condiciones de incubación para la primera y segunda mezcla de reacción, pueden determinarse entonces el tiempo de incubación y la temperatura de incubación por un experto en el campo de la analítica microbiana por medio de la longitud y el contenido en GC de las secuencias de ácido nucleico y pueden comprobarse en procedimientos de optimización sencillos. Sin embargo, la temperatura de incubación para la primera mezcla de reacción obtenida tras la adición de la solución de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia a las células secadas asciende preferentemente a aproximadamente de 60 a 120 min, y de manera especialmente preferente a aproximadamente de 80 a 100 min, mientras que la temperatura de incubación asciende preferentemente a aproximadamente de 30 °C a 50 °C, y de manera especialmente preferente a aproximadamente 40 °C. La temperatura de incubación para la segunda mezcla de reacción obtenida tras la adición de la solución de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador a la primera mezcla de reacción asciende preferentemente a aproximadamente de 5 a 30 min, y de manera especialmente preferente a aproximadamente de 10 a 20 min, mientras que la temperatura de incubación asciende a su vez preferentemente a aproximadamente de 30 °C a 50 °C, y de manera especialmente preferente a aproximadamente 40 °C.
La figura 1 ilustra esquemáticamente la realización de la reacción en la que se basa el procedimiento de acuerdo con la invención, en donde en el ejemplo concreto se encuentra tanto la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia como también la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador como molécula de ADN monocatenario. En particular, la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia difunde, tras su adición a las células fijadas y secadas de manera adecuada, hacia su secuencia diana y se une a ella. Como molécula diana en las células del microorganismo que va a detectarse actúa en este caso un ARNr, en donde la secuencia del ARNr seleccionada como diana por la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia es específica para el microorganismo que va a detectarse.
La sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia no unida (es decir, en exceso), a diferencia de la técnica FISH clásica, en la que debe separarse esta en el marco de una etapa de lavado rigurosa, se capta mediante adición de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, en donde ya no se forma híbrido de ácido nucleico fluorescente constituido por la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. Siempre que la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia se haya unido previamente a una secuencia de ácido nucleico diana adecuada, entonces esta sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia ya no contrae ningún híbrido con la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador.
En consecuencia, tras la excitación del colorante fluorescente de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia en los casos en los que la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia se ha unido a la secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo que va a detectarse, se observa una fluorescencia, mientras que en los casos en los que la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia no se ha unido a la secuencia de ácido nucleico diana, como consecuencia de la hibridación de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia con la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador no se produce ninguna fluorescencia. Por consiguiente, la fluorescencia de una partícula detectada en un citómetro de flujo es una señal directa cualitativa y cuantificable para el microorganismo, para el que es específica la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia.
Anteriormente se ha descrito el procedimiento de acuerdo con la invención por medio de sondas de ácido nucleico, que están constituidas por desoxirribonucleótidos y por tanto pueden designarse también como sondas de ADN. Sin embargo se entiende que pueden usarse básicamente también otras sondas de ácido nucleico, siempre que estas sondas de ácido nucleico muestren el comportamiento descrito anteriormente con respecto a la formación de híbridos en el microorganismo que va a detectarse.
En el marco de la presente invención, la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y/o la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador es preferentemente una sonda de ácido nucleico monocatenaria. Sin embargo es también posible en el marco de la presente invención que las sondas de ácido nucleico en cuestión estén configuradas de manera bicatenaria individualmente e independientemente entre sí. En casos en los que al menos una de las sondas de ácido nucleico este configurada de manera bicatenaria, se prefiere entretanto que únicamente una parte de la secuencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia o bien una parte de la secuencia de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador esté configurada de manera bicatenaria. La dimensión de la configuración de una cadena doble en las respectivas sondas depende de los requerimientos de la hibridación con la secuencia de ácido nucleico diana y en particular de la hibridación con la sonda en cada caso complementaria.
Una cualquiera de las sondas de ácido nucleico que van a usarse en el marco de la presente invención, y en particular la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, está configurada preferentemente como sonda de ADN, sonda de ARN, sonda de APN o sonda de ALN, o como combinaciones de dos o más de estas. La configuración o bien selección de los nucleótidos que forman las respectivas sondas de ácido nucleico se encuentra en el marco del conocimiento del experto en el campo de la invención y puede realizarse mediante procedimientos y consideraciones rutinarias a la luz de la divulgación dada en el presente documento y en particular del supuesto mecanismo en el que se basa la presente invención.
Tal como se ha descrito anteriormente, la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia es específica para el microorganismo que va a detectarse. La generación de correspondientes sondas de ácido nucleico se conoce por un experto en el campo de la analítica microbiana y se ha descrito en más detalle entre otros en el documento DE 10 2010012421 A1. La especificidad se determina preferentemente a través del grado de homología entre la sonda de ácido nucleico y su secuencia de ácido nucleico diana. Preferentemente, el grado de homología asciende al menos al 70 %, mucho más preferentemente al menos al 80 %, aún mucho más preferentemente al menos al 95 %, y lo más preferentemente al menos al 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. En una forma de realización, la sonda de ácido nucleico es con ello dentro de los valores de homología predeterminados esencialmente idéntica con la secuencia de ácido nucleico diana.
Como alternativa, la secuencia de nucleótidos de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia puede ser esencialmente complementaria de manera inversa a la secuencia de ácido nucleico diana. También entonces se consideran los valores de homología mencionados anteriormente como dimensión de la identidad o bien complementariedad de la secuencia de nucleótidos de la sonda de ácido nucleico con o bien a la secuencia de ácido nucleico diana. Como alternativa, en particular en el caso de una secuencia complementaria de manera inversa, la dimensión de la homología puede definirse también por las condiciones en las que se realiza aún una hibridación de la sonda de ácido nucleico y de la secuencia diana. La sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia es preferentemente complementaria de manera inversa a la secuencia diana, en particular cuando esta se hibrida con la secuencia de ácido nucleico diana en condiciones moderadas o rigurosas. Las correspondientes condiciones se han descrito, por ejemplo, en el documento WO 00/68421 A1.
Lo dicho en el presente documento con respecto a la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia se aplica esencialmente también para la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, en donde es evidente para el experto que la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador es esencialmente complementaria de manera inversa a la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y la dimensión de la complementariedad entre la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador y la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia puede definirse de igual manera que la dimensión de la complementariedad entre la secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo que va a detectarse y la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia.
Las secuencias de ácido nucleico diana que permiten la detección específica de un microorganismo se conocen en el campo técnico, en donde se remite a modo de ejemplo a las publicaciones Clementino et al. (J. Appl. Microbiol. 103 (2007), 141-151), Ni et al. (FEMS Microbiol. Lett. 270 (2007), 58-66), Leaw et al. (J. Clin. Microbiol. 45 (2007), 2220­ 2229) y Bhardwaj et al. (J. Med. Microbiol. 56 (2007), 185-189). Las secuencias de ácido nucleico diana preferentes son en este contexto en particular ARNr 16S, ARNr 23S, ARNr 18S, ARNt, EF-Tu, ARNm espaciador ARNr 16S-23S y espaciador ARNr 23S-5s , en donde se prefieren especialmente ARNr 16S y ARNr 23S.
La longitud de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador asciende independientemente entre sí a aproximadamente de 15 a 31 nucleótidos, preferentemente a aproximadamente de 17 a 25 nucleótidos, mucho más preferentemente a aproximadamente de 17 a 23 nucleótidos, y lo más preferentemente a 17 o 18 nucleótidos. En una forma de realización preferente son esencialmente igual de largas la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. En lo que se refiere a la selección de la longitud de las dos sondas de ácido nucleico, se remite entonces por lo demás a los criterios mencionados en el documento DE 102010012421 A1.
Las dos sondas de ácido nucleico pueden comprender otros nucleótidos, de lo que es necesario para la formación de las longitudes mencionadas anteriormente, en donde estos otros nucleótidos no contribuyen sin embargo a la formación de una estructura bicatenaria o no toman parte en esta, cuando se aparean en bases la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia con la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, en donde el apareamiento de bases es preferentemente un apareamiento de bases de Watson-Crick y se forma un complejo hibridado. En una forma de realización es igual de larga la longitud de las dos sondas de ácido nucleico y de la región complementaria una con respecto a otra.
Un colorante fluorescente, en el presente documento también designado fluoróforo, es una molécula que absorbe luz en una longitud de onda característica, de manera ideal en su máximo de absorción, o bien se excita energéticamente por esta. Esta luz (fotón) se emite tras un tiempo determinado, por ejemplo, de nuevo en forma de fluorescencia o como energía de vibración (calor). El fluoróforo regresa a este respecto al estado de partida no excitado más favorable energéticamente. Un desactivador (aceptor) es una molécula que absorbe energía de un fluoróforo excitado (donador o donante) y con ello extingue su emisión de fluorescencia.
Generalmente se designa como desactivación de fluorescencia el debilitamiento o la extinción de una señal de fluorescencia. Para una eficacia de desactivación óptima es decisiva a este respecto una coordinación exacta del colorante fluorescente y el correspondiente desactivador (Marras et al., Methods in Molecular Biology 335 (2006), 3­ 16). En la selección de un par adecuado de colorante fluorescente y desactivador puede diferenciarse a este respecto si la extinción observada tiene como base una desactivación estática o una desactivación dinámica. El posicionamiento del colorante fluorescente y del desactivador puede realizarse dependiendo de si se trata de una desactivación estática o una desactivación dinámica.
En la denominada desactivación estática o bien desactivación por contacto se forma en el estado excitado un complejo no fluorescente entre el fluoróforo y el desactivador. El donador y el aceptor se encuentran en el caso de la desactivación estática espacialmente muy próximos (< 20 Á). Las moléculas interaccionan a este respecto directamente mediante una transferencia de electrones acoplada con protones por medio de la formación de enlaces por puente de hidrógeno (Forster, Ann. Phys. 2 (1948), 55-75; Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York, 1999).
Sin embargo es también posible que se aplique el método de la desactivación dinámica, la denominada desactivación FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). A este respecto, el fluoróforo excitado transfiere su energía al desactivador y retorna entonces sin radiación al estado base. El donador y el aceptor se encuentran a una distancia espacial de aproximadamente 40 a 100 Á (lo que se corresponde con aprox. de 3 a 30 nucleótidos dentro de un ADN bicatenario). Una condición previa para la desactivación FRET es además que el espectro de emisión de fluorescencia del donador solapa con el espectro de absorción del aceptor.
Para conseguir una desactivación de este tipo, se prefiere de acuerdo con la invención que el colorante fluorescente de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia esté dispuesto en el extremo 3' o próximo al extremo 3' de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y el desactivador de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador esté dispuesto en el extremo 5' o próximo al extremo 5' de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. Como alternativa puede estar dispuesto el colorante fluorescente de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia sin embargo también en el extremo 5' o próximo al extremo 5' de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, mientras que el desactivador de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador está dispuesto en el extremo 3' o próximo al extremo 3' de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. Para otras particularidades se remite en este contexto al documento DE 102010012421 A1.
Se entiende que la extinción de la fluorescencia emitida por el colorante de fluorescencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia mediante el desactivador de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador no debe ser forzosamente de manera completa. Más bien es suficiente para los fines de la presente invención, cuando se encuentra una diferencia de señal significativa y detectable por el sistema detector (es decir, el citómetro de flujo) entre una célula marcada con la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia del microorganismo que va a detectarse y el complejo de hibridación de sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. A este respecto asciende la dimensión de la extinción habitualmente a aproximadamente del 10 al 90 %, y preferentemente al menos al 50 %.
Los colorantes fluorescentes usados para la preparación de las sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia son en particular aquellos que se usan también en el marco de la técnica FISH clásica. El colorante fluorescente puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que está constituido por FAM, TAMRA, CY3, Alexa 350, Pacific Blue, cumarina, Cy2, Alexa 488, TET, Alexa 532, HEX, Alexa 546, TMR, Cy3.5, Alexa 568, Texas red, Alexa 594, Alexa 633, Cy5, Cy5.5 Alexa 660, Alexa 680, ATTO 490LS, Rox y Vic. Se entiende que no existe básicamente ningún tipo de limitación con respecto a la idoneidad de colorantes fluorescentes, excepto que exista al mismo tiempo un desactivador que extingue al menos parcialmente la fluorescencia del colorante fluorescente.
En cuanto a la configuración o bien la selección del desactivador tampoco existen básicamente limitaciones. Se entiende sin embargo que la selección del colorante fluorescente y del desactivador debe realizarse de modo que una extinción significativa de la señal de fluorescencia del colorante fluorescente se realice o bien directa o indirectamente tras su excitación. Una extinción suficiente se define en este caso en el sentido de que es posible una diferencia entre el estado extinguido y el estado no extinguido. En el marco de la presente invención es posible, por consiguiente, que el desactivador sea incluso un colorante fluorescente.
Algunas combinaciones a modo de ejemplo de colorante fluorescente y desactivador están indicadas en la siguiente tabla.
Figure imgf000009_0001
Otras combinaciones adecuadas de colorante fluorescente y desactivador se han descrito entre otros en Marras et al. (Nucl. Acids Res. 30 (2002), e122), a cuya divulgación se hace referencia de manera explícita en el presente documento.
Para el aumento de la especificidad del procedimiento de acuerdo con la invención pueden añadirse a la reacción, además de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, aún las denominadas sondas de competidor. Por el término "sonda de competidor", tal como se usa en el marco de la presente solicitud, se entiende en este caso en particular oligonucleótidos que cubren enlaces indeseados que se producen eventualmente, es decir en particular sitios de unión, de las sondas de ácido nucleico, en particular de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, y a este respecto presentan una similitud de secuencia con respecto a un microorganismo que no va a detectarse más alta que con respecto al/a los microorganismo/microorganismos que va a detectarse/que van a detectarse.
Mediante el uso de sondas de competidor puede impedirse que la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia se una a la secuencia de ácido nucleico de un microorganismo que no va a detectarse y por consiguiente conduzca a señales falsas positivas. La sonda de competidor normalmente no está marcada y se usa preferentemente antes de la adición de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. La sonda de competidor debía ser esencialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de uno o varios microorganismos que van a detectarse.
En el caso de sonda de competidor, tal como puede usarse en el marco de la presente invención, puede tratarse de una secuencia de ADN o ARN, que comprende por regla general entre 12 y 100 nucleótidos, preferentemente entre 15 y 50 nucleótidos, y de manera especialmente preferente entre 17 y 25 nucleótidos. Mediante la elección de una secuencia definida puede bloquearse la hibridación de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia o bien de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador con la secuencia de ácido nucleico de una unidad taxonómica o grupo combinado de manera sintética de microorganismos.
La complementariedad a la secuencia de ácido nucleico que va a bloquearse debía proporcionarse con una sonda de competidor de 15 nucleótidos por encima del 100% de la secuencia. Con sondas de competidor con más de 15 nucleótidos están permitidos dependiendo de la longitud de uno a varios sitios de apareamiento erróneo. Las sondas de competidor de este tipo se han descrito, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2005/031004 A2, a cuya divulgación se hace referencia en el presente documento.
Esta en el marco de la presente invención que puede usarse, además del par de una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador (primer par de sondas de ácido nucleico) aún al menos otro par de una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador adaptada en cada caso a esto (segundo par de sondas de ácido nucleico, tercer par de sondas de ácido nucleico, etc.). La configuración de otro par de sondas de ácido nucleico cualquiera se realiza de manera correspondiente al primer par de sondas de ácido nucleico, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia del segundo, tercer, etc. par de sondas de ácido nucleico dirige en cada caso otra secuencia de ácido nucleico diana en el microorganismo que va a detectarse distinta de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia del primer par de sondas de ácido nucleico.
Esto significa que en una variante preferente del procedimiento de acuerdo con la invención, en primer lugar en la etapa (d) se añadan varias sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia en cada caso específicas para el microorganismo que va a detectarse con distintas secuencias de ácido nucleico en forma de una solución individual o varias soluciones a las células fijadas y secadas, para hibridar de manera paralela varias sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia con secuencias de ácido nucleico diana del microorganismo que va a detectarse, y entonces en la etapa (f) se añade un número de sondas de ácido nucleico marcadas con desactivador distintas que se corresponde con el número de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia en forma de una solución individual o varias soluciones, para captar las distintas sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia y con ello extinguir al menos parcialmente sus fluorescencias.
En otra configuración del procedimiento de acuerdo con la invención contiene la muestra que va a analizarse más de un microorganismo, es decir al menos dos microorganismos distintos, que deben detectarse en paralelo. En este caso se aplica preferentemente que la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia del segundo par de sondas de ácido nucleico es específica para el segundo microorganismo que va a detectarse, la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia del tercer par de sondas de ácido nucleico es específica para el tercer microorganismo que va a detectarse, etc. Sin embargo existe lógicamente también en este caso la posibilidad de que para la detección de un microorganismo que va a detectarse cualquiera se use en cada caso más de solo una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia específica para ello.
Después de que se haya extinguido al menos parcialmente la fluorescencia de sonda(s) de ácido nucleico marcada(s) con fluorescencia eventualmente en exceso, se introduce la segunda mezcla de reacción para la detección de la fluorescencia, que se emite por las células del microorganismo que va a detectarse que incluyen la(s) sonda(s) de ácido nucleico marcada(s) con fluorescencia, en un citómetro de flujo habitual en el comercio y se analiza en este. Dado que la segunda mezcla de reacción puede introducirse como tal (es decir, sin otro procesamiento y etapas de lavado) en el citómetro de flujo, se reduce el esfuerzo de trabajo y pueden impedirse pérdidas de muestra eventuales. En este sentido, la invención se refiere en un segundo aspecto al uso de un citómetro de flujo en el procedimiento del primer aspecto, tal como se ha definido en la reivindicación 14.
La fluorescencia emitida por las células puede usarse directamente para la cuantificación del número de células, en particular de las células completas, del microorganismo que va a detectarse. Los valores de medición obtenidos con esta medición se visualizan entonces en forma de histogramas o diagramas de puntos en el ordenador y permiten la declaración eficaz sobre el tipo y la cantidad de los microorganismos contenidos en la muestra. Por consiguiente, el procedimiento de acuerdo con la invención permite una detección directa así como una cuantificación de un microorganismo o de varios microorganismos como células completas en el marco de una hibridación de células completas.
Ventajas esenciales del procedimiento de acuerdo con la invención son por consiguiente la manipulación muy fácil así como además rapidez, reproducibilidad, eficacia y objetividad, con la que es posible la detección específica de microorganismos en una muestra. Otra ventaja consiste en que ahora por primera vez puede realizarse el procedimiento ventajoso de la hibridación in-situ en solución de modo que pueda prescindirse de cualquiera etapa de lavado. Esto simplifica la manipulación del procedimiento y por consiguiente acorta el tiempo de trabajo que va a aplicarse para las etapas de preparación. Dado que adicionalmente puede tener lugar todo el desarrollo del procedimiento en solo un recipiente de reacción, están excluidas las pérdidas durante la transferencia a nuevos recipientes de reacción, de modo que es posible una cuantificación más precisa.
La presente invención se explica adicionalmente ahora por medio de los siguientes ejemplos, ejemplos comparativos y figuras.
Ejemplo 1
Procedimiento para la detección específica de microorganismos en el ejemplo de la detección de Alicyclobaccillus spec. en bebidas de zumo de fruta
Una muestra que va a someterse a estudio de un concentrado de zumo de naranja se cultivó de manera adecuada durante al menos 48 h. A continuación se transfirieron 0,9 ml de cultivo a un recipiente de reacción adecuado y se mezclaron con 0,9 ml de un agente de fijación, que contenía etanol al 80 %.
Las células fijadas se sedimentaron mediante centrifugación (4000 x g, 5 min, temperatura ambiente), entonces se mezclaron con 20 j l de un agente de homogeneización, que se había obtenido mediante mezclado de una solución de glucosa acuosa al 50 % en peso con glicerina en la relación en peso de 8:2, y finalmente se secaron durante 20 minutos a 80 °C en el horno.
A continuación se mezclaron las células secadas y homogeneizadas en un recipiente de reacción con 35 j l de una solución de hibridación, en la que se habían disuelto 20 ng de una sonda de ácido nucleico específica para Alicyclobacillus spec., marcada con FAM como colorante fluorescente en un tampón acuoso (solución de NaCl 0,9 M y Tris-HCl 0,02 M (pH 8,0) en una mezcla del 65 % en peso de agua y el 35 % en peso de formamida). La sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia tenía una longitud de 20 nucleótidos y presentaba un grado de homología a la secuencia de ácido nucleico diana del 100 %.
Después de que se había incubado la mezcla de reacción obtenida de esta manera durante 1,5 h a 40 °C, se añadieron a la mezcla de reacción 35 j l de una solución de desactivador, en la que se habían disuelto 20 ng de una sonda de ácido nucleico marcada con BHQ1 como desactivador en un tampón acuoso (solución de NaCl 0,14 M y Tris-HCl 0,04 M (pH 8,0) en agua). La sonda de ácido nucleico marcada con desactivador tenía a este respecto una longitud de 20 nucleótidos y presentaba un grado de homología a la secuencia de ácido nucleico de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia del 100 %.
La mezcla de reacción obtenida de esta manera se incubó durante otros 15 minutos a 40 °C y entonces se introdujo sin otro procesamiento en un citómetro de flujo (modelo CyFlow® Cube6 de la empresa Sysmex Deutschland GmbH) y en este se analizó y se evaluó con una velocidad de flujo de 0,5 jl/s.
La figura 2 muestra el resultado de la medición. La señal de fluorescencia de las células está representada gráficamente en el diagrama de puntos en dirección Y frente a la dispersión, que es una medida del tamaño de la partícula, en dirección X.
Ejemplo comparativo 1
El ejemplo 1 descrito anteriormente se repitió, excepto que antes del secado de las células fijadas no se añadió agente de homogeneización. Los resultados están representados en la figura 3.
Debido a la falta del agente de homogeneización se detectaron solo algunas partículas, sin embargo muy grandes para ello, que estaban constituidas en cada caso por agrupaciones de un número distinto de células individuales coherentes. Mediante la formación de agrupaciones ya no era posible una cuantificación del número de células por medio del número de partículas detectada en el citómetro de flujo.
Otro inconveniente de la formación de agrupaciones resulta de la distribución muy divergente de las partículas detectadas con respecto al tamaño (eje X del diagrama de puntos) y la intensidad de la señal de fluorescencia detectada (eje Y del diagrama de puntos), dado que una agrupación que se forma de un número mayor de células individuales, se percibe por el detector como partículas con una intensidad de la señal de fluorescencia más alta que una agrupación que está constituida por un número más bajo de células individuales. De manera correspondiente a esto, la distribución de las partículas detectadas en el diagrama de puntos diverge mucho, lo que limita mucho una determinación diferenciada de los organismos.
Ejemplo comparativo 2
El ejemplo 1 descrito anteriormente se repitió esencialmente, excepto que se aplicó el procedimiento descrito en el documento WO 03/083131 A1 y no se usó ninguna sonda de ácido nucleico marcada con desactivador. El resultado está representado en la figura 4.
Debido a la falta del desactivador no se extinguió la fluorescencia de las sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia no unidas. Los restos de las sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia no unidas, que no pudieron separarse completamente mediante lavado, contribuyeron a un aumento del ruido de fondo en la medición y condujeron a una peor separación de la señal de fluorescencia del ruido de fondo.
Ejemplo 2 (no de acuerdo con la invención)
El ejemplo 1 descrito anteriormente se repitió, excepto que en lugar del agente de homogeneización usado en el ejemplo 1 se usó etanol al 70 % como agente de homogeneización. Los resultados están representados en la figura 5.
Debido al uso de etanol al 70 % como agente de homogeneización se consiguió una clara mejora de la distribución de las partículas detectadas en comparación con el ejemplo comparativo 1, en el que antes del secado de las células fijadas no se añadió agente de homogeneización.
Tal como puede distinguirse por medio de un número relativamente alto de partículas grandes con señal de fluorescencia intensiva, se formaron, sin embargo también con el uso de etanol al 70 % como agente de homogeneización, agrupaciones que estaban constituidas por varias células individuales coherentes.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la detección de un microorganismo en una muestra, que comprende los pasos:
(a) facilitar la muestra;
(b) fijar las células contenidas en la muestra con un agente de fijación y separar de la muestra las células fijadas obtenidas, para facilitar células fijadas;
(c) poner en contacto las células fijadas con un agente de homogeneización químico y secar las células homogeneizadas así obtenidas, para facilitar células secadas, en donde el agente de homogeneización químico comprende (i) un monosacárido o un disacárido, (ii) un poliol y (iii) agua;
(d) poner en contacto las células secadas con una solución de una sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, específica para el microorganismo que va a detectarse, para facilitar una primera mezcla de reacción;
(e) incubar la primera mezcla de reacción, para provocar una unión de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia a la secuencia de ácido nucleico diana correspondiente en las células del microorganismo que va a detectarse;
(f) poner en contacto la primera mezcla de reacción a continuación de la etapa (e) con una solución de una sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, para facilitar una segunda mezcla de reacción, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador comprende un desactivador que extingue al menos parcialmente la fluorescencia de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y presenta una secuencia de ácido nucleico, que es esencialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico de la sonda de ácido marcada con fluorescencia;
(g) incubar la segunda mezcla de reacción, para provocar una unión de las moléculas de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia, no unidas a la secuencia de ácido nucleico diana en las células del microorganismo que va a detectarse, a la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador; y
(h) introducir la segunda mezcla de reacción a continuación de la etapa (g) en un citómetro de flujo y detectar la fluorescencia emitida por las células del microorganismo que va a detectarse, que contienen la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde en el caso de la muestra se trata de una muestra líquida.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 o 2, en donde en el caso del microorganismo se trata de una bacteria, un hongo o un organismo superior unicelular (protozoo).
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en donde en el caso de la bacteria se trata de una bacteria de los géneros Acinetobacter, Alicydobacillus, Aquabacterium, Arcobacter, Bacillus, Campylobacter, Enterobacteriaceae, Escherichia, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Listeria, Microthrix, Nitrobacter, Nitrosococcus, Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrotoga, Propionibacterium, Salmonella, Shigella o Streptococcus.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en donde en el caso del hongo se trata de un hongo de los géneros Aspergillus, Candida, Debaromyces, Dekkera, Penicillium, Pichia o Saccharomyces.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde en el caso del monosacárido o del disacárido se trata de una sustancia seleccionada del grupo que está constituido por fructosa, galactosa, glucosa y sacarosa.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde en el caso del poliol se trata de una sustancia seleccionada del grupo que está constituido por etilenglicol, glicerina, manitol y sorbitol.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la secuencia de ácido nucleico diana en las células del microorganismo que va a detectarse se selecciona del grupo que está constituido por ARNr 16S, ARNr 23S, ARNr 18S, ARNt, EF-Tu, ARNm espaciador ARNr 16S-23S y espaciador ARNr 23S-5S.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia (i) es esencialmente idéntica o (ii) esencialmente complementaria de manera inversa a la secuencia de ácido nucleico diana en las células del microorganismo que va a detectarse.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia se selecciona de una sonda de ADN, sonda de ARN, sonda de APN y sonda de ALN marcadas con fluorescencia.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en donde (i) el colorante fluorescente de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia está dispuesto en el extremo 3' o próximo al extremo 3' de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y el desactivador de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador está dispuesto en el extremo 5' o próximo al extremo 5' de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador, o (ii) el colorante fluorescente de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia está dispuesto en el extremo 5' o próximo al extremo 5' de la sonda de ácido nucleico marcada con fluorescencia y el desactivador de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador está dispuesto en el extremo 3' o próximo al extremo 3' de la sonda de ácido nucleico marcada con desactivador.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en donde en la etapa (d) se añaden varias sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia con distintas secuencias de ácido nucleico, cada una de ellas específica para el microorganismo que va a detectarse, y en la etapa (f) se añade un número de sondas de ácido nucleico marcadas con desactivador distintas que se corresponde con el número de sondas de ácido nucleico marcadas con fluorescencia.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la muestra contiene más de un microorganismo y se detectan al mismo tiempo varios microorganismos distintos.
14. Uso de un citómetro de flujo en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 13.
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