JPH0746101B2 - 粘液溶解性を具備した細胞固定・保存液 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞固定・保存液に関し、特に粘液性の細胞診
検体の固定及び保存に好適な、粘液溶解性を具備した細
胞固定・保存液に関する。

〔従来の技術〕

喀痰や子宮膣部から綿棒で採取された粘液性の検体中に
は無数の細胞が含まれており、その中に前癌状態の異型
細胞や癌細胞が含まれていないかどうかを検査するのが
細胞診であり、この細胞診は、現代の癌の早期発見に重
要な役割を担っている。この細胞診には顕微鏡が用いら
れてきたが、近年はそれに加えて、細胞を秒速数百個ま
たはそれ以上のスピードで流して測定するところの自動
細胞分析・分離装置でありフローサイトメトリー（flow
cytometry）を用いて行う自動化細胞診も適用されよう
としている。顕微鏡あるいはフローサイトメトリーを用
いた細胞診のいずれかの場合でも、細胞が正確に診断さ
れるためには、検体中の細胞が良好な状態に固定される
ことが極めて重要で、固定が不良の場合は、癌細胞が見
落とされたり、逆に癌細胞でないものが癌細胞と見誤ら
れたりする。

細胞診の検体の一般的な固定法は、検体をスライドグラ
スに直接塗抹してそれが乾かぬうちに迅速に固定液に入
れて固定する方法（塗抹標本の湿潤固定法）がとられ、
その固定液としては95％エタノールが用いられる。しか
し、入院していない患者や集団検診の被検者について肺
癌の喀痰細胞診を行う場合は、病院を受診した際に直ち
に痰が喀出できるとは限らない。むしろ痰は起床時に出
やすく、またこの起床時の痰は、就寝中に肺内から遊離
した細胞を豊かに蓄えているので細胞診に最も適してい
る。この起床時の痰を病院に持参した後に固定を行うの
では時間が経ち過ぎ、細胞に変性が加わっていて固定が
不良であり、細胞診が不正確となる。このような場合、
適切な喀痰用の細胞固定液があって細胞を直ちに固定で
きれば、起床時の喀痰を自宅でその固定液に入れて保存
し、後日病院に持参出来るので好都合である。しかし、
喀痰を95％エタノール固定液に入れると、喀痰の粘液が
表層から凝固し、凝固した表層は、固定液が内部へ浸透
するのを妨害して内部の細胞の固定を不良とするばかり
でなく、喀痰をスライドグラスに薄く延ばして塗抹する
ことをも妨げて更に標本の質を悪くする。また、フロー
サイトメトリーによる自動化細胞診の場合には、細胞の
固定状態が不均一なために測定誤差が大きくなったり、
凝固した粘液塊が装置のノズルを詰らせて分析不能とな
るなどの重大の支障を生ずる。

肺癌検診のために、喀痰用の固定液を最初に導入したの
は米国のサコマノ（Saccomanno、1963）であり、我が国
においても、このサコマノ液がしばしば用いられてい
る。このサコマノ液は、50％エタノール水にカーボワッ
クス（ポリエチレングリコール1540）が２％の割りに添
加された簡単な組成のものである。この液の中に喀痰を
吐き出して一定時間固定したあと、検査室においてブレ
ンダーにかけて強く撹拌して粘液を機械的に破壊して細
胞を遊離させ、遊離した細胞を遠心沈澱して収集し、こ
れをスライドグラスに塗抹して塗抹標本を作り、染色を
施して顕微鏡診断を行うことになる。この液は、エタノ
ール濃度が50％と少し高い上にカーボワックスを含むた
め、固定中に細胞の収縮や核の濃縮が起り、そのため細
胞の詳細な内部構造が読み取り難く、慣れないと細胞診
断に支障を来す欠点がある。また、フローサイトメトリ
ーによる自動化細胞診においては、この液が粘液溶解剤
を含まないために、溶けずに残っている粘液が装置のノ
ズルを詰らせて測定が不能となったり、また細胞集塊が
生じ易いために、細胞一個一個の測定が不能となるなど
の重大な支障をきたす。従って、このサコマノ液は、フ
ローサイトメトリーによる自動化細胞診にとっては特に
不適切な固定液である。

近年、我が国において、粘液溶解性の喀痰用固定液が開
発されて市販されるようになったが、これらはいずれも
サコマノ液と同様に２％のカーボワックスを含む50％エ
タノール水を基本とし、粘液溶解剤を添加したものであ
る。粘液溶解剤として、東北大学抗酸菌研究所式（サー
マル社発売）はＮアセチル−Ｌシスティン（Ｎ−acetyl
−Ｌ−cysteine）を用い、大阪府成人病センター式（松
浪ガラス社発売）はジチオトレイトール（dithiotreito
l）を用い、またYM式喀痰固定液（武藤純薬社製、特許
出願中）はジハイドロキシ ジチオールブタン（dihydr
oxy dithiolbuthan）や酵素を加えたものとされてい
る。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

近年、肺癌患者の急増に関連して喀痰細胞診への需要も
急増し、老人医療法の改正によって昭和62年度から成人
の肺癌検診が義務付けられることになると、喀痰細胞診
への需要増加にさらに拍車がかかる情勢である。しか
し、肺癌検診のための喀痰細胞診は、子宮癌検診の細胞
診に比べて、正常細胞の数が著しく多くて異常細胞の含
有率は少ない特徴のために、顕微鏡による診断は著しく
労力がかかる作業である上、この技術に習熟した細胞診
士や指導医の数も少ない。そこで労力節減のため、近年
は、フローサイトメトリーを用いた自動化細胞診の開発
が強力に推進されている。これは、バラバラにした細胞
を螢光染色して溶液中に浮遊させておき、この細胞を装
置の中を高速で流しながらレーザー光線を当てて螢光を
発色させ、細胞一個ずつからの螢光量を測定して細胞を
定量するものであるから、喀痰などの粘液性の検体の場
合はその粘液を溶解し、細胞を分散した浮遊状態として
固定（浮遊固定）し得る固定液が不可欠である。また、
集団検診において多数被検者の喀痰をそれぞれ固定液に
入れて回収する場合は、通常は数日間は固定液に入れた
まま保存されることが多いので、この間に細胞の変性が
進行する危険もある。そのような場合に、細胞の固定性
と共に細胞構造の保存性も良好な固定・保存液が望まれ
る。そのような液があれば、肺癌の集団検診にも便利に
利用出来るし、また子宮癌についての集団検診において
も、検診医は、綿棒を一々その場でスライドグラスに塗
抹をせずとも、綿棒を固定液に投入しておけばよいので
手間も省け、かつ塗抹時に起り易い塗抹標本の乾燥とい
う重大の障害からも逃れることが出来て好都合である。

細胞の固定・保存性の良否は細胞の診断精度に重大な影
響を及ぼし、これが不良の検体では診断が不能となった
り、誤診が生じたりするので、細胞診を担当する関係者
には非常に関心が高い。このような細胞の固定・保存液
に関して要求される事項を纒めると以下の通りである。

1.粘液溶解性： 検体中の粘液は、一般に固定液に触れると凝固し、凝固
した粘液は、固定液の粘液塊内浸透を阻害して細胞の固
定を不均等として細胞分析上の誤差を生み、また粘液塊
がフローサイトメトリーのノズルを詰らせて分析を不能
とする。従って、固定中に粘液が溶解される固定液が望
まれる。

2.DNAと蛋白質の固定： 顕微鏡による診断に際しては、核の大きさやその内部構
造、および核／細胞質比が診断の対象となり、またフロ
ーサイトメトリーによる自動化細胞診に際しては、核の
DNA量および細胞のDNA量／蛋白量比が定量の対象となる
ので、核（DNA）と細胞質（蛋白質）との両者が共に良
く固定され、かつ保存されなければならない。

3.固定による細胞の収縮や凝集の防止： 細胞の固定は確実でなければならないが、固定を強化す
ると、細胞が収縮あるいは濃縮して顕微鏡的診断が困難
になったり、また細胞同士が凝集して細胞集塊を作り、
これがフローサイトメトリーのノズルを詰らせて測定が
不能になったりするので、固定の強度はほどほどでなけ
ればならない。

4.固定液の毒性： 肺癌の集団検診の際は、喀痰の固定液を容器に入れて被
検者に配布することになるが、家庭に配布された固定液
を誤って子供などが飲むという万一の事故を考慮する
と、その固定液の毒性は低くなければならない。

5.固定した細胞の保存性： 集団検診の際は、大量の検体が一時に集められ、これら
が順次検査されるので、その間の数日から２週間ぐらい
は固定液の中で細胞構造が保存されねばならない。

近年わが国で市販されている各種の喀痰固定液を検討し
たが、0.2％アセチルシスティンを50％エタノール水に
添加した東北大学抗酸菌研究所式の固定液は、追試の結
果、粘液溶解性は良好であるが、本出願者がフローサイ
トメトリーによる自動化細胞診用に開発したDNA蛋白同
時定量用螢光染色液の成分であるヘマトポルフィリンえ
アセチルシスティンとが反応を起して褐色の絮状沈澱物
を生じ、該染色液による染色が障害されることが欠点で
あった。次にジハイドロキシ ジチオールブタンを用い
たYM喀痰固定液（武藤純薬株式会社製、特許出願中）を
検討したが、これは粘液溶解性の点ではＮアセチルＬシ
スティン使用の固定液と同等と思われたが、独特の悪臭
があり、痰を吐きだそうとして口を容器に近づけると、
卵が腐ったような悪臭が鼻をつく。ある地域の集団検診
で、これを配られた被検者のうちには、この固定液の悪
臭から固定液が腐っていると思い、固定液を捨てたもの
がいたとする報告も伝えられた。またジハイドロキシ
ジチオールブタンの毒性が不明な点、酵素を用いている
ので約３カ月の有効期間しかなく高価であるなどの点に
も問題がある。ジチオトレイトールを用いた大阪成人病
センター式の喀痰固定液については今回は実験していな
いが、ジチオトレイトールはＮアセチルＬシスティン同
様去痰剤として用いられる薬物であり、使用量も少ない
ので毒性面では問題がないものと思われるが、高価であ
る点、価格面での問題がある。

本発明は、上述のような欠点の無い、粘液溶解性を具備
した細胞固定・保存液を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、フローサイトメトリーと細胞の螢光染色に
よる細胞診の自動化を開発している途上に、当該染色液
と反応しない粘液溶解剤を種々検討した結果、メチルシ
スティンを見出した。メチルシスティン塩酸塩は、化学
的にはメチルβ−メルカプトアラニン塩酸塩（methylβ
−mercaptoalanine hydrochloride）,HSCH₂CH（NH₂）CO
OCH₃・HClであり、かっては去痰剤として用いられたこ
とがある。多数の患者の喀痰を用いて検討の結果、固定
液にメチルシスティンを0.1〜0.2％添加したものでは、
粘液がよく溶け、細胞固定効果も良好で、固定液に特に
悪臭もなく、また長期の保存にも変質や効力減退を示さ
なかった。

また、粘液溶解剤のメチルシスティンは、去痰剤として
も用いられる薬物であり、本固定液に用いられる量がご
く僅かなので毒性面からは問題にならない。

即ち、本発明は粘液っ溶解剤として、メチルシスティン
を含有することを特徴とする細胞固定・保存液であり、
これは喀痰のような粘液性の細胞診検体の固定・保存液
として利用価値が高いものであり、また、用いる粘液溶
解剤が螢光染色を阻害しない特徴もあるので、フローサ
イトメトリーと細胞螢光染色法とを用いた自動化細胞心
にも適している。

固定・保存液の主剤及び他の成分は特に限定されない
が、本発明者が新たに見出したエチルアルコールと食塩
と庶糖又はプロピレングリコールのいずれか一方を含む
緩衝液を用いれば、細胞の収縮や凝集を引きおこさず細
胞診に適した状態に核及び細胞質を固定しうる固定・保
存液とすることができる。そのような固定・保存液の例
としては0.8〜0.9％の食塩を含む0.01モル燐酸緩衝液
（0.01モル燐酸緩衝生理的食塩水、phosphate buffered
saline solution）（以下、PBSと略称）にメチルシス
ティンを0.2％、庶糖もしくはプロピレングリコールを
２％、水溶性アンチフォームを10ppm、エタノールを40
％、それぞれ最終濃度になるように加えたものがある。

さらに、フローサイトメトリーによる分析の際には、粘
液溶解と細胞分散の目的で、検体を入れた固定液を高速
ブレンダーで激しく振盪するが、その層に無数の細かな
気泡が生じ、これが粘液塊を覆ったり粘液塊の中にとじ
こめられたりして粘液と粘液溶解剤との接触を妨害する
ので、シリコンレジン製剤であるアンチフォームを消泡
剤として加え、良い結果を得た。シリコンレジンは消泡
剤として、ビール、ブドー酒、しょうゆ、乳製品、果物
ジュースなどの各種の食品の濃縮、発酵、および蒸溜工
程などに用いられ、作業の能率化や製品の均一化などに
役立っており、食品中の本品の残留量は50ppm以下と定
められている。実験の結果、シリコンレジンの消泡作用
は10ppmで充分に発現し、30ppm以上ではシリコンレジン
の不溶解部分が残るので無駄であった。

本固定液の使用法 喀痰の固定の場合は、喀痰を本固定液中に吐き出したあ
と、手でよく振盪しておく。２日〜１週間の固定の後、
高速ブレンダーで約２分間振盪し、遠心沈澱し、顕微鏡
標本作成の場合は、残渣をピペットでスライドグラスに
移し、一昼夜乾燥した後、95％エタノールまたはスプレ
ー式により再固定を行う。フローサイトメトリーによる
自動化細胞診の場合は、残渣を１回燐酸緩衝液で洗浄し
たのち、螢光染色を施して分析を供する。

〔実施例〕

実験例１ 喀痰の粘液溶解剤のメチルシスティンの濃度
を定める実験： 喀痰の粘液溶解のための固定液に添加する粘液溶解剤メ
チルシスティンの適正濃度を知るため、30％エタノール
・PBSに、メチルシスティンを０、0.05、0.1、0.2、0.5
％それぞれ添加したものを準備し、これに患者の喀痰を
入れ、室温で３日間放置したものを手で約20病間振盪
し、粘液の溶解性を目で観察した。

〔結 果〕 メチルシスティンの濃度が０および0.05％
のものでは粘液の溶解は不十分で（第１図）、0.1％以
上の濃度で粘液溶解が発現した（第２図）。

第１図の写真はメチルシスティンを添加しない固定液
（30％エタノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色標
本の顕微鏡写真（100倍）である。

画面の下1/3に横に走る線条は粘液で、これに細胞がか
らめられていて、分散していない。

第２図の写真はメチルシスティンを0.2％添加した固定
液（30％エタノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色
標本の顕微鏡写真（100倍）である。

粘液が溶解して、細胞は良く分散している。ひときわ大
型の細胞は肺癌細胞である。

実験例２ 固定液の消泡剤として添加するシリコン製剤
の効果をみる実験： 固定液に固定した喀痰は、それの粘液溶解と細胞分散の
目的のため、容器ごと高速ブレンダーにかけて毎分約60
00回の振動を与えるが、この際に固定液が強く泡立ち、
この気泡が喀痰の周囲を取り巻き、固定液との接触を妨
害する。そこでシリコン製剤の消泡剤を用いることに
し、その商品であるアンチフォームを食品添加剤として
認可されている濃度以下の10ppm添加した固定液（２％
庶糖を添加した30％エタノール・PBS）と、アンチフォ
ームを添加してない固定液とを準備し、これらに喀痰を
入れて高速ブレンダーにより２分間振盪したところ、ア
ンチフォームを添加したものが明らかに気泡の発生が少
なく、また消泡も速く、粘液溶解も優れていた。

実施例 固定液（0.2％メチルシスティン、２％プロピ
レングリコールおよび10ppmアンチフォームを含有した4
0％エタノール・PBS）（固定液に喀痰を吐き出すと、唾
液が加わって固定液のエタノール濃度が薄まるので、エ
タノール濃度は４％とした）の喀痰の粘液溶解性、細胞
凝集性および細胞固定効果をみる実験： 完成した固定液の総合的な効果をみるため、126名の患
者の喀痰につき、喀痰を入れた直後にこれを手で振盪し
た時と３日後に高速ブレンダーで振盪した場合の喀痰溶
解性、細胞の分散および固定効果などの検討した。（表
１） 〔結果〕高速ブレンダーで振動語は、１例の喀痰を除
き、粘液溶解が認められた。粘液溶解が不能であった１
例は、高度に血性であったために血液が粘液をまき込ん
で凝固したものであった。また、顕微鏡所見上、細胞の
分散は良好で、細胞質および核の構造は１カ月以上保存
したものでも優れていた（第３〜第６図）。

第３〜６図の写真は完成した本固定液で固定し、40日間
冷蔵庫で保存された喀痰中の肺癌細胞の顕微鏡写真（40
0倍）である。細胞質も核もその構造が極めてよく保た
れている。第３図と第４図は肺の扁平上上皮癌細胞の写
真で、第５図と第６図は肺の肺癌細胞の写真である。

〔発明の効果〕

以上述べたように、本発明によれば細胞固定・保存液に
おいて粘液溶解剤としてメチルシスティンを用いること
により、喀痰等の粘液性検体の細胞診における細胞固定
の際に、粘液の溶解が良好であって細胞が分散した浮遊
した状態として固定することができ、また、悪臭もなく
毒性の点でも問題のない固定・保存液を提供しうる。さ
らに、フローサイトメトリーと細胞螢光染色を用いた自
動化細胞診において、粘液溶解剤が螢光染色を阻害しな
いという効果も有する。

【図面の簡単な説明】

第１図はメチルシスティンを添加しない固定液（30％エ
タノール・PBS）で固定した喀痰の塗抹染色標本の顕微
鏡写真（100倍）。 第２図はメチルシスティンを0.2％添加した固定液（30
％エタノール/PBS）で固定した喀痰の塗抹染色標本の顕
微鏡写真（100倍）。 第３〜６図は、本発明固定液で固定し、40日間冷蔵庫で
保存された喀痰中の肺癌細胞の顕微鏡写真（400倍）。
第３図と第４図は肺の扁平上皮癌細胞の写真で、第５図
と第６図は肺の腺癌細胞の写真。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粘液溶解性としてメチルシスティンを含有
   することを特徴とする細胞固定・保存液。
2. 【請求項２】メチルシスティンの含有量が0.1〜0.2％で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞
   固定・保存液。
3. 【請求項３】さらにシリコン性消泡剤を含有することを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞固定・保存
   液。
4. 【請求項４】シリコン性消泡剤の含有量が10〜30ppmで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の細胞
   固定・保存液。