ES2899687T3 - Método para aumentar la precisión en la detección cuantitativa de polinucleótidos - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar la precisión y la sensibilidad de la detección cuantitativa de polinucleótidos diana en una muestra con diferentes polinucleótidos, comprendiendo el método las etapas de a) usar un primer cebador específico de la diana para marcar, mediante transcripción inversa o extensión de cebadores a una temperatura de 50 a 60 grados centígrados, un polinucleótido diana con un identificador molecular único y un sitio de unión del cebador universal para producir al menos un polinucleótido diana marcado, en donde la secuencia de nucleótidos del identificador molecular único es una secuencia generada al azar que comprende de 4 a 15 nucleótidos generados al azar; b) hibridar un segundo cebador específico de la diana unido a un segundo sitio de unión del cebador universal con el al menos un polinucleótido diana marcado a una temperatura de hibridación superior a 70 grados centígrados y extender el segundo cebador específico de la segunda diana en una reacción de extensión a una temperatura de 65 a 75 grados centígrados; y c) amplificar el al menos un polinucleótido diana marcado utilizando los cebadores universales primero y segundo para producir múltiples copias del polinucleótido diana marcado.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para aumentar la precisión en la detección cuantitativa de polinucleótidos

Campo de la invención

La invención se refiere a métodos para la detección cuantitativa de polinucleótidos en una muestra mixta de polinucleótidos. Más particularmente, la invención se refiere a métodos para aumentar la precisión y la sensibilidad de la cuantificación de los productos de amplificación de la PCR.

Antecedentes de la invención

La cuantificación del ADN, el ARN y los productos génicos es importante en una serie de aplicaciones, sobre todo en las áreas de detección microbiana y vírica en muestras clínicas y en el análisis de muestras clínicas para la inmunodiversidad. La determinación del número relativo de una bacteria potencialmente causante de enfermedades, por ejemplo, podría ser útil en el ámbito clínico para proporcionar información sobre el estado del paciente, la progresión de la enfermedad, la probabilidad de progresión de la enfermedad, etc. La cuantificación de la expresión de los receptores de linfocitos T, la producción de anticuerpos por linfocitos B, etc., puede proporcionar información sobre el estado del sistema inmunitario de un individuo, la presencia o ausencia de enfermedad, y la progresión de los cambios que pueden ser indicativos de enfermedad, o incluso conducir a ella.

Al evaluar el sistema inmunológico, los investigadores se enfrentan a una gran diversidad y a un número potencialmente muy bajo de copias de las dianas. La determinación de las cantidades relativas de cada diana (por ejemplo, receptores de linfocitos T, anticuerpos de linfocitos B) puede ser una tarea desalentadora. Los receptores de antígenos mostrados por los linfocitos B y los linfocitos T tienen dos partes principales: los linfocitos B tienen cadenas pesadas y ligeras y la mayoría de linfocitos T tienen cadenas a y p. Se estima que el cuerpo humano contiene aproximadamente 1010 linfocitos, cada uno con una combinación única de segmentos de genes que especifican la región variable, la parte del receptor que se une al antígeno. Cada persona tiene un repertorio inmunológico individualizado, condicionado por tres factores clave: (1) el polimorfismo genético en los locus del CMH; (2) el historial de exposición a antígenos; y (3) la regulación y modulación constante del sistema inmunitario. Los seres humanos son capaces de generar 1015 o más linfocitos B y T diferentes, aunque no todos de estos 1015 linfocitos B o T están presentes en un momento dado, debido al historial de exposición a diversos antígenos y al proceso de selección negativa durante la maduración de las células inmunitarias.

La recombinación aleatoria de segmentos de cadena pesada (V^h, D^h, y J^h) y segmentos de cadena ligera (V^k y J^k o Va y Ja) produce unidades codificantes V^hD^hJ^h (cadena pesada) y V^kJ^k o VaJa (cadena ligera) en los linfocitos B, y en los linfocitos T se produce un proceso similar. A la diversidad de la región variable se suma la supresión aleatoria de nucleótidos en los segmentos V, D y J en la posición de unión y la inserción aleatoria de nucleótidos en las regiones entre los segmentos DJ y VD en la cadena pesada o las regiones entre los segmentos VJ en la cadena ligera.

Un método para cuantificar la expresión génica es aislar el ARN de las muestras que se van a comparar, cuantificar el ARN por espectrofotometría UV o con un colorante fluorescente, y luego utilizar cantidades de masa iguales de ARN en la RT-PCR en tiempo real. Sin embargo, la cuantificación del ARN es propensa a errores debido a errores de calibración de la máquina o de la pipeta, o por dilución, y estos métodos suelen requerir la dilución de la muestra para una medición precisa. Para las muestras en las que ya hay un número de copias muy bajo, o al menos un número de copias relativamente bajo, dado el número total de dianas, esto es muy problemático. Además, la espectrofotometría no puede utilizarse para detectar cantidades tan pequeñas de ARN. Por lo general, se necesitan al menos 104 células para producir suficiente ARN para una cuantificación precisa mediante este método. El uso de un colorante fluorescente puede aumentar la sensibilidad hasta 100 veces, pero para muchas aplicaciones incluso ese nivel de sensibilidad no es suficiente.

Las tecnologías de secuenciación de nueva generación han proporcionado oportunidades para aumentar significativamente la sensibilidad de la cuantificación de dianas de ADN y/o ARN. Se han desarrollado varios métodos para mejorar la precisión de la cuantificación de diferentes polinucleótidos en una muestra con polinucleótidos mezclados, incluidos métodos como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva, que se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.213.961 y la secuenciación profunda de códigos de barras mediante identificadores moleculares únicos (UMI, por sus siglas en inglés), descrita por Smith et al. (Smith, A.M., "Quantitative Phenotyping via Deep Barcode Sequencing", Genome Research (2009) 19: 1836-1842).

Los identificadores moleculares únicos, o códigos de barras moleculares, que también se describen en Glenn K Fu et al. (PNAS, 31 de mayo de 2011, páginas 9026-9031) y Hubert Hug et al. (Journal of Theoretical Biology, vol. 221, n.° 4, 1 de abril de 2003, páginas 615-624) proporcionan una ventaja en la cuantificación del número de copias en una muestra. Sin embargo, si los UMI participan en más que la primera ronda de PCR, puede introducirse el mismo UMI en diferentes dianas, lo que da lugar a errores de recuento. Asimismo, el método de UMI funciona basándose en una situación ideal, pero irreal, es decir, en la que las tecnologías de PCR y de secuenciación son perfectas y no se introducen errores. La estrategia de UMI funciona bajo el supuesto de que tanto la PCR como las etapas de secuenciación informan de las dianas subyacentes y de los fragmentos de UMI sin errores. Sin embargo, esta es una suposición errónea porque esos errores tanto en la PCR como en la secuenciación son inevitables. Sin embargo, toda plataforma de secuenciación actual está sujeta a errores de secuenciación. Dos plataformas muy populares tienen tasas de error de alrededor del uno por ciento cada una. Cuando se obtiene un gran número de secuencias, este error de secuenciación puede crear un número importante de dianas artificiales.

Lo que se necesita son métodos para mejorar la precisión de la cuantificación de diferentes polinucleótidos en una muestra con polinucleótidos mezclados.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para aumentar la precisión y la sensibilidad de la detección cuantitativa de polinucleótidos diana en una muestra con diferentes polinucleótidos, como se define en la reivindicación 1. El método puede llevarse a cabo incorporando a un número sustancial de secuencias diana individuales en un conjunto de secuencias diana al menos una secuencia generada aleatoriamente que comprenda de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 nucleótidos generados aleatoriamente, la al menos una secuencia generada aleatoriamente que forma un identificador molecular único para una secuencia diana individual, y una secuencia adaptadora universal (es decir, un sitio de unión a un cebador universal) para formar un polinucleótido diana/UMI/adaptador; uniendo la secuencia del adaptador UMI/universal a la diana en una reacción de transcripción inversa (RT) a 50-60 grados centígrados para las dianas de ARN (A), una reacción de extensión del cebador a 50-60 grados centígrados para los dianas de a Dn (B); y adjuntando un segundo adaptador universal al producto de la etapa (A) o (B) anterior mediante una reacción de extensión de ADN a aproximadamente 70 grados centígrados, y amplificando, con un cebador universal, productos con el sitio de unión del cebador universal unido en ambos extremos a una temperatura de aproximadamente 70 grados centígrados.

En diversos aspectos del método, la primera etapa de unión a una secuencia diana de un identificador molecular único y una secuencia adaptadora se realiza mediante la extensión del ADN o la transcripción inversa. En diversos aspectos, la primera etapa que utiliza la extensión del ADN o la transcripción inversa se realiza a una temperatura de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 grados centígrados. En diversos aspectos, la segunda etapa del método se realiza a una temperatura de aproximadamente 65 a aproximadamente 75 grados centígrados.

Los aspectos de la invención implican realizar la primera etapa del método mediante la transcripción inversa o la extensión del ADN, utilizando un cebador específico de la diana que comprende una secuencia identificadora molecular única de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 nucleótidos y una secuencia adaptadora.

En diversos aspectos de la invención, el método se realiza como un método automatizado en un casete cerrado. El método también puede comprender las etapas de secuenciación de los productos producidos en la etapa de amplificación y la eliminación de artefactos a través del filtrado estadístico. El filtrado estadístico incluye estimar la tasa de error específica del contexto basada en la secuenciación del ADN de control, agrupar secuencias que difieren en una sola posición, evaluar el porcentaje de error en función del contexto de la posición diferente, aplicar un modelo de Poisson para estimar la probabilidad de que la secuencia con menor recuento sea un error aleatorio y eliminar las que tengan una probabilidad superior a 0,001 de ser un error aleatorio.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una gráfica de la capacidad de codificación de secuencias aleatorias de distinta longitud que permiten que el 0,5 % de las dianas se marquen con la misma secuencia aleatoria. La gráfica se basa en los datos de 10 experimentos de simulación.

La figura 2 es un diagrama de las etapas para etiquetar una diana con un identificador molecular único (UMI), y las etapas de amplificación posteriores. Para un diana de ARN (panel izquierdo A), la UMI se introduce por la transcriptasa inversa mediante una etapa de transcripción inversa (RT) en la que se diseña el cebador específico del gen con una temperatura de fusión (Tm) de entre 50 y 60 grados centígrados. Para las moléculas de ADN bicatenarias, si las dianas sol únicamente regiones específicas de las moléculas de ADN, un UMI (panel central B) se introduce mediante la extensión de la cadena por la ADN polimerasa con cebadores específicos del gen, que están diseñados con Tm entre aproximadamente 50 y aproximadamente 60 grados centígrados. Tras una primera etapa de marcaje, un segundo cebador específico del gen y cebadores universales se añaden a la reacción con ADN polimerasa termoestable. Tanto el cebador específico del segundo gen como los cebadores universales están diseñados con una Tm superior a 70 grados centígrados. Para las dianas de ADN preseleccionadas, los UMI se introducen mediante ligamiento, donde se liga un doble adaptador con UMI a moléculas diana y los UMI se introducen en una diana en ambos extremos. Las dianas marcadas con UMI se amplifican antes de la secuenciación.

La figura 3 es un patrón de error específico del contexto derivado de secuencias de ADN de control determinado por la plataforma Illumina hiSeq2000. Para cada fila, la altura (anchura) de los bloques llenos de patrones muestran la tasa de error del último de los tripletes cambiados a A, C, G o T.

El panel A de la figura 4 muestra la fórmula para estimular la probabilidad de que una secuencia menor se genere a través de un artefacto, donde n es el recuento de la secuencia menor en un grupo, y N es el recuento de la secuencia mayor en el mismo grupo. A es el número medio esperado de secuencias idénticas a la secuencia menor, que se calcula como A = N*|j, donde j es la tasa de error estimada de GCA-GCT en el panel B y GCA-GCG en el panel C. Si el valor de P es inferior a 0,001, es poco probable que la secuencia menor se deba a artefactos. El panel B ofrece un ejemplo de secuencia menor con el recuento 878 que se considera como artefacto ya que el valor de P es 0,989, que es superior al umbral de probabilidad/error aleatorio de 0,001. Y el panel C ofrece un ejemplo de secuencias menores, considerándose que el recuento de 2698 es auténtico, ya que el valor de P es 7,4e-12, menor que 0,001.

Las figuras 5A y 5b son fotografías de geles que contienen productos de amplificación por PCR producidos mediante el método de la invención. Los primeros cuatro carriles de la figura 4A contienen productos generados utilizando cebadores universales y los segundos cuatro carriles contienen productos generados usando cebadores para añadir una secuencia de UMI y una secuencia adaptadora durante la RT-PCR, pero en condiciones de mayor temperatura de las etapas 2.a/3.a del método. Esto ilustra que la contaminación por cebadores de marcado UMI puede evitarse utilizando el método en 3 etapas de la invención. Los carriles de la figura 4B contienen productos de amplificación generados utilizando cebadores diseñados para la amplificación en condiciones de mayor temperatura de las etapas 2.a y 3.a del método.

La figura 6 es un dibujo que ilustra las etapas para añadir a una secuencia diana un identificador molecular único y una secuencia adaptadora (A); realizar una primera etapa de amplificación utilizando al menos un cebador directo que comprenda una secuencia adaptadora y una secuencia de sitio de unión del cebador universal (B); y realizar una segunda etapa de amplificación utilizando al menos un cebador universal (C).

La figura 7 ilustra las ventajas del marcaje con UMI de dianas utilizando el método de la invención. Las dianas en la mezcla de amplificación producida mediante el presente método se secuencian generalmente utilizando métodos de secuenciación de última generación de alto rendimiento. En una situación ideal, cada molde original (I.A) se marca con un UMI único (II.A) y se secuencia sin errores (III.A), donde el recuento de los moldes originales es el mismo que el de la combinación de diana y UMI. Si los UMI son demasiado cortos y con una capacidad de codificación limitada, el mismo UMI puede asociarse a diferentes moldes, lo que inevitablemente dará lugar a una subestimación del recuento de los moldes originales (II.B). Si los UMI se unen a las dianas según se han amplificado, el número de UMI unidos a las dianas es mayor que el recuento de moldes originales, lo que da lugar a una sobreestimación del recuento de determinadas dianas (II.C). Si la secuenciación no es sin errores, puede producirse un error en las dianas, los UMI o ambos. Cuando se producen errores en las dianas, se produce una sobreestimación del recuento de los distintos moldes. Cuando se producen errores en la región del UMI, se produce una sobreestimación del recuento de ciertas dianas (III.B). Con la técnica de filtrado estadístico de los inventores, esos errores de secuenciación pueden detectarse y eliminarse, y de este modo se restablecerá el recuento correcto de las distintas dianas y el recuento de cada diana.

Descripción detallada

Los inventores han desarrollado un método para aumentar la precisión de la detección del número de polinucleótidos de una secuencia sustancialmente igual en una muestra mixta de polinucleótidos, que pueden utilizarse en análisis tan diversos como los del repertorio inmunitario, el microbioma, los perfiles de expresión génica, los perfiles de miARN, las variaciones del número de copias, e incluso el diagnóstico prenatal de trisomías y la detección de mutaciones de resistencia a fármacos (como la detección de mutaciones de resistencia a fármacos del VIH con bajo número de copias).

La invención proporciona un método para aumentar la precisión en la detección cuantitativa de polinucleótidos, como se define en la reivindicación 1. El método puede llevarse a cabo incorporando a un número sustancial de secuencias diana individuales en un conjunto de secuencias diana al menos una secuencia generada aleatoriamente que comprenda de aproximadamente 4 a aproximadamente 15 nucleótidos generados aleatoriamente, la al menos una secuencia generada aleatoriamente que forma un identificador molecular único para una secuencia diana individual, y una secuencia adaptadora universal (es decir, un sitio de unión a un cebador universal) para formar un polinucleótido diana/UMI/adaptador; uniendo la secuencia del adaptador UMI/universal a la diana en una reacción de transcripción inversa (RT) a 50-60 grados centígrados para las dianas de ARN (A), una reacción de extensión del cebador a 50-60 grados centígrados para los dianas de ADN (B); y adjuntando un segundo adaptador universal al producto de la etapa (A) o (B) anterior mediante una reacción de extensión de ADN a aproximadamente 70 grados centígrados, y amplificando, con un cebador universal, productos con el sitio de unión del cebador universal unido en ambos extremos a una temperatura de aproximadamente 70 grados centígrados.

La determinación precisa de la composición y la cuantificación de diferentes polinucleótidos con frecuencias variables en un conjunto genético complejo es importante en una variedad de aplicaciones, sobre todo en las áreas de detección microbiana y viral en muestras clínicas y en el análisis de muestras clínicas para la inmunodiversidad. Recientemente, un nuevo método basado en códigos de barras profundos o identificadores moleculares únicos (UMI), descrito por Smith et al. (Smith, A.M., "Quantitative Phenotyping via Deep Barcode Sequencing", Genome Research (2009) 19: 1836-1842), ha demostrado ser prometedor para disminuir el sesgo de recuento introducido durante la amplificación y la secuenciación. Brevemente, cada diana en una mezcla se marca con un código de barras único mediante la unión covalente de una secuencia aleatoria de una longitud determinada (código de barras) a un polinucleótido diana antes de la amplificación y la secuenciación. La combinación del código de barras y la diana funciona como un sustituto de la diana durante la amplificación y finalmente se secuencian juntos. En la etapa final, la combinación única de código de barras y diana se cuenta solo una vez. Al hacer esto, el sesgo introducido tanto en la etapa de amplificación como en la de secuenciación puede suprimirse debido a la gran capacidad de codificación de las secuencias aleatorias de cierta longitud, que es de aproximadamente 4N (si N es la longitud del código de barras (UMI), por ejemplo, la capacidad de codificación de las secuencias aleatorias de la longitud de 10 es 410 = 1048576). Sin embargo, hay tres requisitos previos para el éxito de esta estrategia: 1) los UMI tienen que tener una longitud suficiente para proporcionar una capacidad de codificación suficiente, de tal forma que no se marquen dos dianas idénticas con el mismo UMI; 2) los u M i deben introducirse en las secuencias diana antes de las etapas de amplificación; y 3) tanto los UMI como las secuencias diana tienen que secuenciarse sin errores. El primer requisito puede cumplirse utilizando UMI más largos. Los inventores han abordado el segundo requisito desarrollando un método que incorpora UMI en una reacción de PCR en dos etapas. Los inventores abordan el tercer requisito introduciendo una nueva estrategia estadística para corregir los errores de secuenciación. Al combinar ambos métodos, hacen que la estrategia de los UMI sea más útil en la práctica y aumentan la precisión a la hora de elaborar perfiles de los polinucleótidos en una mezcla genética compleja.

Para una diana de ARN, se introduce un UMI en una diana mediante transcripción inversa (RT) utilizando una retrotranscriptasa (figura 2, panel izquierdo A). Se sintetizan un cebador específico del gen, un UMI, y un adaptador universal para formar una única molécula, donde la temperatura de hibridación entre el cebador específico del gen y una diana está diseñada para que sea de entre 50 y 60 grados centígrados. Después de la etapa de RT, un segundo cebador específico del gen que se une a un segundo adaptador universal, el cebador universal se añade a la reacción, donde la temperatura de hibridación entre el segundo cebador específico del gen y las dianas se diseña para que sea superior a 70 grados centígrados. La segunda temperatura de hibridación y extensión se fija preferentemente en 70 grados centígrados. Después de esta etapa, se lleva a cabo una reacción PCR preferentemente a 95 grados centígrados durante 15 segundos y a 72 grados durante 30-40 ciclos.

Para dianas de ADN incluidas en grandes moléculas de ADN, se introduce un UMI en la diana mediante una etapa convencional de extensión del cebador con ADN polimerasa (figura 2, panel central B). Se sintetizan un cebador específico del gen, un UMI y un adaptador universal, formando una sola molécula, donde la temperatura de hibridación entre el cebador específico del gen y las dianas se diseña entre 50 y 60 grados centígrados. Después de la reacción de extensión del cebador, se une un segundo cebador específico del gen a un segundo adaptador universal, y el cebador universal se añade a la reacción, la temperatura de hibridación entre el segundo cebador específico del gen y las dianas se diseña para que sea superior a 70 grados centígrados. La segunda temperatura de hibridación y extensión se establece preferentemente a unos 70 grados centígrados. Después de esta etapa, una reacción de PCR se realiza preferentemente a 95 grados centígrados durante 15 segundos y a 72 grados centígrados durante 30-40 ciclos.

La estrategia de UMI, cuando se utiliza en ausencia de las etapas añadidas proporcionadas por los inventores, funciona bajo el supuesto de que tanto las etapas de la PCR como las de secuenciación informan de la diana subyacente y del fragmento del UMI sin errores. Sin embargo, esta es una suposición incorrecta porque los errores tanto en la PCR como en la secuenciación son inevitables.

Es comúnmente conocido que las tres plataformas de secuenciación de nueva generación más populares del mercado actual (Illumina HiSeq, Life Technologies Ion Torrent PGM y el sistema 454 FLX) producen secuencias con un número significativo de errores de secuenciación. La figura 3 muestra el patrón de error de la versión de sobremesa de las tres plataformas.

Para la elaboración de perfiles de secuencias en un conjunto genético complejo, como la secuenciación del ARNr 16S y los estudios de inmunodiversidad, la distribución de los moldes en una muestra varía. Los artefactos de secuenciación distorsionan inevitablemente el resultado de la elaboración de perfiles de ácidos nucleicos en un fondo genético mediante secuenciación. Por ejemplo, los errores en la región UMI provocan una sobreestimación del recuento de dianas correspondientes y los errores en las secuencias diana provocan una sobreestimación del número de dianas diferentes en el fondo genético. Tras estudiar los patrones de error de los múltiples intentos de secuenciación, destacan varios patrones. En primer lugar, la tasa de error de cualquier plataforma de secuenciación de nueva generación está en el intervalo entre el 0,1 % y el 5 %. En segundo lugar, los errores se producen de forma diferente en distintos contextos (es decir, los errores son específicos del contexto). La figura 3 muestra un patrón de error específico del contexto por la plataforma Illumina HiSeq2000.

Para suprimir los artefactos introducidos tanto por la PCR como por la secuenciación, los inventores desarrollaron un método estadístico para identificar esos artefactos. Este método comprende las etapas de 1) estimar las tasas de error mezclando productos de amplificación de dianas marcadas con UMI con una pequeña cantidad de ADN de control, cuya secuencia se ha determinado previamente, secuenciar juntos la diana y el control, y comparar las secuencias amplificadas del ADN de control con secuencias conocidas, para estimar el patrón de error específico del contexto; 2) organizar las secuencias diana contando la distribución de secuencias únicas, donde dos secuencias únicas se agrupan si las dos secuencias difieren en una sola posición; y 3) estimar las probabilidades de la secuencia menor en un grupo de artefactos según el modelo de Poisson (figura 4A).

Los inventores observaron que si el segmento del marcador aleatorio tiene una longitud de 15 nucleótidos, puede crear aleatoriamente aproximadamente 10756894 identificadores moleculares únicos para marcar aproximadamente un 99,5 % de aproximadamente 107 polinucleótidos diana.

La expresión "un polinucleótido diana" se utiliza con frecuencia en el presente documento, pero debe entenderse que generalmente existen múltiples polinucleótidos diana dentro de cualquier muestra clínica. Estos pueden representar secuencias derivadas de, por ejemplo, las mismas o diferentes bacterias, linfocitos T, linfocitos B, virus, etc. La expresión, por consiguiente, abarca el marcado de tantos polinucleótidos diana individuales como puedan marcarse eficazmente dentro de una muestra. En algunos casos, como en el caso de un análisis de un repertorio inmunitario, los polinucleótidos diana pueden ser fácilmente millones. En definitiva, los polinucleótidos diana marcados con UMI que comprenden copias de las mismas secuencias de ADN se marcarán individualmente con diferentes códigos de barras, y cada código de barras se cuenta solo una vez para proporcionar una representación más precisa del número de copias de polinucleótidos diana en una muestra. Por lo tanto, es importante introducir el marcador de UMI en el método, de tal forma que no se utilizará para cebar las amplificaciones posteriores e introducir sesgo de amplificación en la muestra.

El método de la invención puede llevarse a cabo de forma muy eficaz utilizando un casete cerrado y métodos automatizados como los descritos en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 20100291668A1. El tipo de cuantificación para el que el método de la invención es especialmente útil (es decir, dianas muy diversas, bajo número de copias en las muestras) también es especialmente sensible al riesgo de contaminación, lo que tendrá un impacto negativo en la cuantificación precisa. El sistema cerrado creado por el casete divulgado en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos número 20100291668A1 reduce significativamente el riesgo de contaminación, al tiempo que aumenta la eficacia con la que se pueden procesar muchas muestras.

Cuando se utiliza el método automatizado descrito en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos número 20100291668A1, un casete puede insertarse en una máquina de base ("unidad de base") que interactúa operativamente con el casete para proporcionar el movimiento necesario de una serie de piezas diseñadas para proporcionar un movimiento vertical ascendente y descendente, un movimiento horizontal de ida y vuelta, y la manipulación de fluidos mediante una pipeta de casete que opera dentro de los límites de la zona delimitada por la parte superior, la parte inferior, los extremos y los lados del casete, denominándose estas piezas como barra de levas, un tornillo de arrastre y un conjunto de bomba de pipeta, respectivamente. También es posible proporcionar un mecanismo que permita el movimiento de la pipeta del casete en cualquier dirección en el plano x-y-z, o que permita el movimiento circular/rotatorio a lo largo del casete cerrado.

Al menos una de las cámaras de reactivos del casete puede formar una cámara de reacción de PCR para realizar la primera etapa de amplificación deseada (PCR1) y la segunda etapa de amplificación (PCR2) de la presente invención. Dicha cámara de reacción puede construirse con un diámetro, una profundidad y un espesor de las paredes diferentes en comparación con otras cámaras de reactivos. Por ejemplo, la cámara de reacción será preferiblemente una cámara de paredes finas para ayudar a la conducción térmica entre los termocicladores externos situados en la unidad base y el fluido dentro de la cámara de reacción. Las paredes deben ser cónicas para encajar fácilmente en el termociclador y realizar un contacto térmico con el termociclador sin adherirse a su superficie. La cámara de reacción debe tener una profundidad y una forma que permita colocar su volumen de fluido dentro del termociclador. La profundidad de la cámara de PCR debe ser compatible con el movimiento vertical de la pipeta de casete. Preferentemente, la cámara también será accesible para la punta de la pipeta de un usuario si se inserta en la cámara a través del puerto de llenado del casete, y el material utilizado para formar la cámara de PCR puede ser ópticamente clara para que el usuario pueda ver cuando la punta de la pipeta ha llegado al fondo de la cámara.

Los códigos de barras o identificadores moleculares únicos (UMI) permiten cuantificar los productos de la PCR. Sin embargo, los experimentos de los inventores con la simple adición de secuencias de UMI en ensayos controlados en los que se conocía el número de dianas iniciales y las concentraciones relativas de cada uno de ellos demostraron que la simple adición de las UMI no proporciona una evaluación precisa del número de dianas en, por ejemplo, una muestra clínica obtenida de un ser humano o de un animal. La hipótesis es que la utilización de los cebadores necesarios para la incorporación de las secuencias de UMI en los polinucleótidos derivados de la diana podría dar lugar a rondas adicionales de amplificación en las que se añadieron ciertos UMI a más de una diana. Esto podría dar lugar a UMI que representen múltiples dianas, pero que se cuentan como parte de una única diana, inflando artificialmente las cifras de algunas dianas. Propusieron desarrollar un método en el que el marcaje/etiquetado de las moléculas diana se realizara en una primera etapa, con etapas posteriores diseñadas para limitar la influencia de los cebadores que contienen UMI, de modo que los cebadores que queden en la mezcla no marquen moléculas adicionales en una medida apreciable. El recuento de los productos se realiza como se muestra en la figura 7, donde las dianas pueden separarse en función de sus respectivas secuencias y pueden cuantificarse por el número de UMI asociados a ellas en los resultados de la secuenciación resultante.

El método que diseñaron utiliza cebadores que comprenden secuencias específicas de la diana para promover la unión a las dianas para iniciar la extensión del cebador, así como UMI y adaptadores generados aleatoriamente. El propósito de los adaptadores es formar un sitio de unión para los cebadores utilizados en las etapas posteriores, y estos cebadores se utilizan para añadir a los polinucleótidos resultantes secuencias de nucleótidos que forman sitios de unión para cebadores universales, y se seleccionan en función de su capacidad de promover eficazmente la amplificación a temperaturas de o de aproximadamente 65 a aproximadamente 75 grados centígrados. Cuando los cebadores que comprenden secuencias específicas de diana se diseñan para su uso a temperaturas menores, puede limitarse su influencia en las etapas posteriores de amplificación. Utilizando cebadores universales en la tercera etapa (2.a etapa de amplificación), puede limitarse adicionalmente el sesgo de amplificación.

Los métodos para diseñar cebadores con las temperaturas de hibridación deseadas son conocidos por los expertos en la materia. Los métodos para generar secuencias aleatorias de nucleótidos que pueden utilizarse como identificadores moleculares únicos se han descrito anteriormente y también son conocidos por los expertos en la materia.

El presente método también puede comprender la etapa de eliminar una porción de la mezcla de reacción, que contiene los productos de la transcripción inversa de la primera etapa del método, y utilizar esa porción para la segunda reacción de amplificación. Esta etapa puede utilizarse para reducir adicionalmente la influencia de los cebadores marcados con UMI específicos de diana en las dos etapas posteriores.

Los métodos de secuenciación, incluidos los métodos de secuenciación de alto rendimiento de próxima generación, son propensos a los errores, que puede limitarse a un pequeño porcentaje, pero que puede producir un nivel de variación significativo e inaceptable cuando se secuencian grandes cantidades de nucleótidos. El método también puede comprender las etapas de secuenciar los productos producidos por las etapas a a c y corregir los errores de secuenciación mediante una etapa de filtrado estadístico utilizando la fórmula I:

Especialmente cuando se utiliza en el análisis de un inmunorrepertorio humano o animal o de la población microbiana de, por ejemplo, el intestino humano, la combinación de marcaje individual de las moléculas diana, la amplificación semicuantitativa de las moléculas marcadas utilizando la amplificación en dos etapas de la presente invención, el uso de cebadores universales para reducir el sesgo de amplificación y mejorar la eficacia de la amplificación y la corrección estadística de los resultados de secuenciación, se obtendrá un resultado mucho más preciso y permitirá a los investigadores determinar mejor los tipos y números de células del sistema inmunitario, anticuerpos, bacterias, etc. que están presentes en una muestra determinada.

La invención puede describirse adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Se utilizaron los siguientes cebadores para incorporar a cada secuencia diana un identificador molecular único: milgHC_1: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNNNNNNNTCTGACGTCAGTGGGTAGATGGTGGG (SEQ ID NO: 1); milgHC_2:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTCTG ACTGGATAGACTG ATGGGGGTG (SEQ ID NO: 2); milgHC_3:ACACTCTTTCCCTACAC GACGCTCTT CCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTCTGACGTGGATAGACAGATGGGGGT (SEQ ID NO: 3); milgHC_4:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNN NNNNNNNNNNNTCTG ACAAGGGGTAGAGCTGAGGGTT (SEQ ID NO: 4); milgHC_5: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN NNNNNNNNNNNN NTCTGACTGGAT AGACCGATGGGGCTG (SEQ ID NO: 5); milgHC_6: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTCTGACGGGGAAGACATTTGGGAAGG

(SEQ ID NO: 6); milgHC_7: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN NNNNNTCTGACAGA GGAGGAACATGTCAGGT (SEQ ID NO: 7); y milgHC_8: ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT CCGATCTNNNNNNNNNNNNNNTCTGACGGG ATAGACAGATGGGGCTG (SEQ ID NO: 8).

Se evaluaron las Tm de los segmentos de UMI dirigidos para su uso como secuencias de hibridación. Los resultados se muestran en la tabla 1, en orden de menor a mayor Tm.

Tabla 1

_________________________ (continuación)_________________________

SEQ ID NO: 1 | milgHC 1 | 53,6 °C | GTCAGTGGGTAGATGGTGGG

Los moldes que contenían UMI se generaron utilizando reactivos como los mostrados en la tabla 2, en condiciones como las mostradas en la tabla 3.

Tabla 2

Tabla 3

Se sintetizó una primera secuencia de cebadores (SEQ ID NO: 9: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCC, la letra en negrita indica la secuencia del adaptador). También se sintetizó una segunda secuencia de cebadores (SEQ ID NO: 10: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCG GTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTTCC (la letra en negrita indica la secuencia del adaptador).

Los cebadores de Illumina (SEQ ID NO: 11: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTAC ACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT y SEQ ID NO: 12: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCG ATCT) sirvieron como cebadores universales.

Los cebadores se probaron en reacciones PCR tanto de 2 etapas como de 3 etapas para determinar su rendimiento en el método de la invención. Las condiciones de reacción se muestran en las tablas 4, 5 y 6. Los resultados se muestran en la figura 4A.

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6

Los cebadores universales se probaron utilizando las siguientes combinaciones: (1) SEQ ID NO: 12 como cebador directo, SEQ ID NO: 11 como cebador inverso; (2) SEQ ID NO: 12 como cebador directo, Cebador UMI 1 con la SEQ ID NO: 11 como cebador inverso; (3) SEQ ID NO: 12 como cebador directo, Cebador UMI 2 con la SEQ ID NO: 11 como cebador inverso; (4) SEQ ID NO: 12 como cebador directo, Cebador UMI 3 con la SEQ ID NO: 11 como cebador inverso; y (5) SEQ ID NO: 12 como cebador directo, Cebador UMI 5 con la SEQ ID NO: 11 como cebador inverso. Los resultados se muestran en la figura 4B.

Existen claros errores en la tecnología actual

Los inventores comenzaron con 4 clones distintos, que luego se añadieron a una muestra de fondo a diferentes concentraciones. Tras la amplificación y la secuenciación, los resultados indicaron que en realidad había unos 50.000 clones diferentes en la muestra, un aumento de 12.500 veces, un resultado inaceptable si el propósito del trabajo es cuantificar la cantidad de ADN diana para evaluar una muestra clínica.

Ejemplo de uso de la fórmula I para evaluar los resultados

Para la secuenciación de VDJ, se mezcló ADN de control (1-5 %) (por ejemplo, ADN PhiX) con amplicones VDJ y se secuenciaron todos juntos. Las lecturas extraídas para el ADN de control se basaron en las coincidencias entre las lecturas y la secuencia de referencia para el ADN de control. Las secuencias de ADN de control se alinearon con las correspondientes secuencias de referencia. El contexto de los patrones de error específicos se resumió contando la diferencia en el alineamiento entre las lecturas y el ADN de referencia (control), estimando la tasa de error específica del contexto. Por ejemplo, si para un fragmento pequeño (de tres nucleótidos) GCA, hay 1000 GCA en todas las alineaciones: 991 GCA-> GCA, 3 GCA->GCC, 2 GCA->GCG, 2 GCA->GCT, 1 GCA->GC- (eliminación) y 1 GCA->GCAx (inserción, x es cualquiera de A, C, G y T), entonces la tasa de error para GCA->GCC es de 0,003, GCA->GCG es 0,002 y GCA->GCT es 0,002, GCA->GC- es 0,001 y GCA->GCAx es 0,001.

Para dos pares cualesquiera de CDR3 (secuencias de nucleótidos, por ejemplo A y B, y frecuencia(A) > frecuencia(B)) que son diferentes en una sola posición (debido a un emparejamiento erróneo, una inserción o una supresión), se puede consultar la tasa de error calculada anteriormente según el contexto de esta diferencia. Suponiendo que el error de la secuencia se genera a través de una distribución de Poisson, frecuencia(A) = N y frecuencia(B) = n, la probabilidad de que dicha B se produzca n o más veces si se trata de un error de secuenciación puede calcularse mediante la fórmula I.

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1. Un método para aumentar la precisión y la sensibilidad de la detección cuantitativa de polinucleótidos diana en una muestra con diferentes polinucleótidos, comprendiendo el método las etapas de

a) usar un primer cebador específico de la diana para marcar, mediante transcripción inversa o extensión de cebadores a una temperatura de 50 a 60 grados centígrados, un polinucleótido diana con un identificador molecular único y un sitio de unión del cebador universal para producir al menos un polinucleótido diana marcado, en donde la secuencia de nucleótidos del identificador molecular único es una secuencia generada al azar que comprende de 4 a 15 nucleótidos generados al azar;

b) hibridar un segundo cebador específico de la diana unido a un segundo sitio de unión del cebador universal con el al menos un polinucleótido diana marcado a una temperatura de hibridación superior a 70 grados centígrados y extender el segundo cebador específico de la segunda diana en una reacción de extensión a una temperatura de 65 a 75 grados centígrados; y

c) amplificar el al menos un polinucleótido diana marcado utilizando los cebadores universales primero y segundo para producir múltiples copias del polinucleótido diana marcado.