ES2899701T3 - Copolímeros multibloques termoplásticos, con separación de fases, semicristalinos, biodegradables para liberación controlada de compuestos biológicamente activos - Google Patents

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Abstract

Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable, el copolímero se caracteriza porque: a) comprende al menos un segmento de prepolímero hidrolizable (A) y al menos un segmento de prepolímero de poliéster hidrolizable (B), dicho segmento de prepolímero (A) contiene un polímero soluble en agua y es completamente amorfo a condiciones fisiológicas y tiene una Tg de 37 °C o menor bajo condiciones fisiológicas y dicho segmento de prepolímero (B) se basa en un polímero cristalino y tiene una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas, b) dicho copolímero multibloques tiene una Tg de 37 °C o menor y una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas, en el que la Tm del copolímero multibloques es menor que la Tm del segmento de prepolímero (B); c) los segmentos se conectan mediante un extensor de cadena multifuncional; d) los segmentos se distribuyen de forma aleatoria sobre la cadena de polímero; e) al menos parte del segmento de prepolímero (A) se deriva de un polímero soluble en agua, en el que el segmento de prepolímero (A) es más hidrófilo que el segmento de prepolímero (B), y en el que el contenido de prepolímero (B) es 10-90 % en peso en base al peso total del copolímero multibloques.

Description

DESCRIPCIÓN
Copolímeros multibloques termoplásticos, con separación de fases, semicristalinos, biodegradables para liberación controlada de compuestos biológicamente activos
La invención se dirige a copolímeros multibloques termoplásticos, con separación de fases, semicristalinos, biodegradables, a procesos para preparar dicho copolímero multibloques, composición para el suministro de al menos un compuesto biológicamente activo, y a métodos para suministrar un compuesto biológicamente activo a un sujeto en necesidad del mismo.
Los péptidos y las proteínas, denominados juntos polipéptidos, desempeñan una función vital en todos los procesos biológicos y han recibido una atención creciente en los últimos años como candidatos a fármacos. Los rápidos avances en la farmacología de péptidos y proteínas, junto con la producción a gran escala de estos compuestos mediante tecnología de ADN recombinante, entre otras técnicas, han alimentado un enorme interés en estos compuestos. Desafortunadamente, el desarrollo de péptidos y proteínas ha superado con creces la capacidad de suministrar estos compuestos de manera sistémica o local utilizando sistemas de suministro convenientes y efectivos.
Los polímeros biodegradables han recibido una mayor atención durante la última década para uso en sistemas de liberación controlada parenteral de acción prolongada, ya sea para el suministro de fármacos sistémico o en un sitio específico. Las formulaciones biodegradables de liberación controlada pueden mejorar significativamente la farmacocinética de los compuestos terapéuticos. Esto es especialmente relevante en el tratamiento de enfermedades crónicas y para compuestos con una ventana terapéutica estrecha, ya que las concentraciones en plasma sistémicas se pueden reducir con la reducción simultánea de los efectos secundarios indeseables. También, muchos compuestos biológicamente activos nuevos tienen semividas cortas, lo que requiere inyecciones frecuentes para alcanzar niveles en plasma terapéuticamente eficaces. El cumplimiento del paciente y los altos costes asociados con los regímenes de dosificación frecuentes para compuestos biológicamente activos administrados por vía parenteral han aumentado el interés en las formas de dosificación de liberación controlada parenteral biodegradables.
El poli(ácido D,L-láctico) (PDLLA) y los copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico, también conocidos como copolímeros de PLGA, son los polímeros biodegradables más ampliamente aplicados para uso en formulaciones de depósito de liberación controlada parenteral. Los copolímeros de PLGA se han utilizado con éxito para el desarrollo de formulaciones de depósito de liberación sostenida para moléculas pequeñas, tales como risperidona, y péptidos terapéuticos tales como leuprolida, goserelina u octreotida.
Sin embargo, los polímeros de PLGA tienen, varios inconvenientes que limitan su uso y los hacen menos adecuados para el suministro de polipéptidos. En primer lugar, los copolímeros de PLGA son polímeros relativamente hidrófobos y no proporcionan un entorno óptimo para proteínas encapsuladas. Las proteínas se pueden adsorber en el polímero, dando como resultado una liberación lenta e incompleta, un despliegue y/o agregación de proteínas. En segundo lugar, la capacidad para manipular la liberación de compuestos biológicamente activos más grandes, tales como un polipéptido encapsulado, es limitada, ya que la difusión de dichos compuestos en las matrices de PLGA relativamente rígidas y no hinchables es insignificante. Por tanto, la liberación de proteínas de los copolímeros de PLGA depende de la difusión a través de los poros presentes en la matriz y del tiempo de degradación o disolución de la matriz. Normalmente, la proteína encapsulada permanece atrapada en la matriz de polímero hasta el momento en que esta última se ha degradado hasta tal punto que pierde su integridad o se disuelve, lo que da como resultado perfiles de liberación dependientes de la degradación bifásicos o trifásicos que se obtienen normalmente para formulaciones de depósito basadas en PLGA. Finalmente, durante la degradación de los copolímeros de PLGA, se forman fracciones ácidas que se acumulan en la matriz de PLGA rígida y no hinchable, lo que da como resultado la formación de un microambiente ácido en la matriz de polímero con pH in situ que pueden ser tan bajos como 1-2. Bajo dichas condiciones ácidas, las proteínas encapsuladas pueden formar agregados que conducen a una liberación incompleta de proteínas. Más aún, el pH bajo puede tener un efecto perjudicial sobre la integridad estructural y la actividad biológica del péptido o proteína encapsulados, lo que potencialmente conduce a una eficacia terapéutica reducida y una inmunogenicidad mejorada. Se ha informado de la modificación química de proteínas y péptidos, tales como la acilación y formación de aductos.
Por tanto, subsiste la necesidad de polímeros biodegradables que sean más adecuados para el suministro de proteínas. Sin embargo, una de las ventajas del PLGA y los polímeros relacionados es que tienen un historial probado de uso clínico y generalmente se consideran altamente biocompatibles y, como consecuencia y por razones de mitigación de riesgos, han sido adoptados por las compañías farmacéuticas para desarrollar formulaciones de depósitos por sus compuestos activos. Por lo tanto, se desea que se diseñe un nuevo sistema de suministro de proteínas poliméricas biodegradables a partir de polímeros que estén compuestos de monómeros que sean bien conocidos, biológicamente seguros y clínicamente aceptables.
En un intento para proporcionar una matriz hidrófila con una compatibilidad mejorada para fármacos de proteína que permita su liberación controlada, Kissel et al. (J. Contr. Rel. 1996, 39(2), 315-326) sintetizaron copolímeros tribloque ABA que contenían bloques B de poli(óxido de etileno) hidrófilos y bloques A biodegradables, hidrófobos que consistían en poli(ácido L-láctico-co-glicólico). Kissel et al. informaron la liberación sostenida de varios compuestos proteináceos de microesferas compuestas de copolímeros de poli(ácido L-láctico-co-glicólico)-poli(etilenglicol)-poli(ácido L-láctico-co-glicólico) y poli(ácido L-láctico)-poli(etilenglicol)-poli(ácido L-láctico), es decir, polímeros de tipo ABA, donde A es un bloque hidrófobo y B es polietilenglicol. Sin embargo, estos copolímeros están limitados en su relación A/B, es decir, contenido de poli(etilenglicol) (PEG). Para evitar problemas de depuración renal asociados con el uso de PEG de alto peso molecular, el peso molecular de la fracción de PEG utilizada en estos copolímeros tribloque ABA preferiblemente no debe exceder los 5000 g/mol. Por lo tanto, para obtener un alto contenido de PEG con los polímeros tribloque descritos por Kissel et al. mientras se mantiene un peso molecular de PEG bajo, los bloques hidrófobos también deben ser cortos. Esto produciría polímeros con propiedades indeseables para uso como biomateriales, ya que en bloques de longitud corta la temperatura de transición vítrea (Tg) está por debajo de la temperatura ambiente (determinada por los inventores) y la cristalinidad (en el caso del poli(ácido L-láctico) (PLLA)) es muy baja o está ausente (De Jong, Macromolecules, 1998, 31(19), 6397-6402), produciendo de esta manera materiales pegajosos y (demasiada) liberación rápida y mal controlada del activo incorporado.
Se encuentran ejemplos de copolímeros de bloques/segmentados con separación de fases, por ejemplo, en los documentos US-A-5554 170, US-A-5066772, US-A-5236444, US-A-5 133739 y US -A-4429080. Estos materiales conocidos son copoliésteres biorreabsorbibles en los que los bloques duros están formados predominantemente por poliglicolida y/o polilactida cristalinos. Estos polímeros son rígidos y no hinchables y, por lo tanto, adolecen de las mismas desventajas y limitaciones que se mencionan para PLGA y PDLA, lo que los hace inadecuados para la liberación sostenida de proteínas.
Se han estudiado los copolímeros multibloques biodegradables que contienen un segmento de poliéster hidrolizable y un segmento hidrófilo hidrolíticamente estable por su capacidad de carga y liberación de fármaco (por ejemplo, se describen copolímeros multibloques basados en segmentos de £-caprolactona y segmentos de polietilenglicol) por Lee et al. (J. control. Rel., 2001, 73(2), 315-327). Estos polímeros contienen sólo un segmento degradable, limitando de esta manera la capacidad para controlar sus propiedades de degradación y de liberación.
Por otro lado, los copolímeros multibloques conocidos de dos tipos de prepolímeros (segmentos) biodegradables, solo se pueden fabricar en una secuencia de prepolímeros alternada, lo que da como resultado un rango limitado de posibles variables (Penco et al., J. Appl. Polym. Sci. 2000, 78 (10), 1721-1728).
En el documento WO-A-2004/007588 se describen ejemplos de copolímeros multibloques biodegradables que contienen un segmento de poliéster hidrolizable de diferente composición. Estos copolímeros multibloques comprenden copolímeros con separación de fases biodegradables con segmentos de un prepolímero amorfo, “blando”, biodegradable (A) que tiene una Tg (temperatura de transición vítrea) por debajo de 37 °C y segmentos de un prepolímero semicristalino, “duro”, biodegradable (B) que tiene una temperatura de transición de fase de 40-100 °C, en la que los segmentos están conectados por un extensor de cadena multifuncional. Para obtener copolímeros multibloques con Tm de 40-100 °C como se divulga en el documento WO-A-2004/007588, la elección de los prepolímeros que se utilizarán como segmentos B se limita a los prepolímeros compuestos de poli(£-caprolactona) (PCL) documento (WO-A-2004/007588), poli(valerolactona) (PVL) y/o polidioxanona (PDS). Cuando se utiliza PDS como segmento B, se obtienen copolímeros multibloques con una Tm de 80-90 °C (documento US-A-5 711 958). Cuando se utiliza PCL como segmento B, se obtienen copolímeros multibloques con una Tm de 40-60 °C (documento WO-A-2004/007588). Los homopolímeros de PVL tienen una Tm similar a los homopolímeros de PCL (es decir, -60 °C). Por tanto, cuando se utilizara PVL como segmento B, se obtendrían copolímeros multibloques con una Tm de 40­ 60 °C. PDS, PCL y PVL tienen Tgs relativamente bajas de -10, -60 y -60 °C, respectivamente. La Tg baja de los segmentos PDS, PCL y PVL limita el rango de Tg del copolímero multibloques (donde la Tg se origina a partir de la mezcla de fases del segmento amorfo A y la parte amorfa del segmento semicristalino B) que se puede obtener y de esta manera limitar el control sobre las propiedades de liberación y degradación.
El documento WO-A-99/02168 describe copolímeros multibloques biodegradables para aplicaciones biomédicas, en los que los prepolímeros de tipo ABA o AB son de cadena extendida. La extensión de cadena de cualquiera de los tipos de prepolímeros ABA o AB solo puede conducir a copolímeros multibloques alternos. Un copolímero de bloques alternos se representa por ABABABABAB en el caso de extensión de cadena de prepolímeros AB, o ABAABAABAABA en el caso de extensión de cadena de prepolímeros ABA.
En el documento US-A-6 160084 se han descrito copolímeros multibloques con separación de fases biodegradables que contienen un segmento duro y uno blando. Este documento describe el uso de copolímeros multibloques PCL-PLLA compuestos de prepolímeros que están conectados con trimetilhexano -1,6-diisocianato (THDI). Se menciona que estos materiales son útiles en sistemas de suministro de fármacos donde se requiere memoria de forma. El documento US-A-2006/0 140999 describe el uso de polímeros de memoria de forma similares para uso en sistemas de liberación de fármacos, en los que el material con memoria de forma comprende unidades derivadas de monómeros seleccionados del grupo que consiste en caprolactona, lactida, glicolida y dioxanona. Ejemplos incluyen los copolímeros multibloques PDS-PCL y PDS-PLGA. Estos materiales no pueden exhibir ninguna capacidad de hinchamiento significativa bajo condiciones fisiológicas (simuladas), ya que el hinchamiento induciría la pérdida de propiedades mecánicas y, por tanto, la pérdida de la forma memorizada.
Otros copolímeros multibloques segmentados y con separación de fases incluyen copolímeros de polieteréster como se describe en el documento US-A-5 980 948. Estos copolímeros consisten en segmentos aromáticos cristalinos y segmentos que contienen PEG blando conectados por enlaces éster hidrolizable. Los copolímeros tienen el inconveniente inherente de que las composiciones poco hinchables, es decir, las composiciones ricas en segmentos aromáticos hidrófobos, no son bien degradables, debido a la alta cristalinidad e hidrofobicidad de los segmentos aromáticos. Las composiciones altamente hinchables, es decir, las composiciones ricas en PEG, tampoco son bien degradables, debido a la baja concentración de enlaces éster. Por el contrario, los copolímeros multibloques de la presente invención son degradables en cada relación de segmento A/segmento B, debido a la presencia de enlaces éster en el segmento A de esta manera como en el segmento B. Adicionalmente, en contraste con los copolímeros multibloques de la presente invención, la Tg de los copolímeros de polieteréster no se puede variar y siempre es baja, alrededor de la Tg del PEG, es decir, -30 °C.
El objetivo de la invención es superar uno o más de los inconvenientes observados en la técnica anterior.
En un primer aspecto la invención se dirige a un copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable, el copolímero se caracteriza porque:
a) comprende al menos un segmento de prepolímero hidrolizable (A) y al menos un segmento de prepolímero de poliéster hidrolizable (B), dicho segmento de prepolímero (A) que contiene un polímero soluble en agua y es completamente amorfo a condiciones fisiológicas y tiene una Tg de 37 °C o menor bajo condiciones fisiológicas y dicho segmento de prepolímero (B) se basa en un polímero cristalino y tiene una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas;
b) dicho copolímero multibloques tiene una Tg de 37 °C o menor y una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas, en el que la Tm del copolímero multibloques es menor que la Tm del segmento de prepolímero (B);
c) los segmentos se conectan mediante un extensor de cadena multifuncional;
d) los segmentos se distribuyen de forma aleatoria sobre la cadena de polímero;
e) al menos parte del segmento de prepolímero (A) se deriva de un polímero soluble en agua,
en el que el segmento de prepolímero (A) es más hidrófilo que el segmento de prepolímero (B), y
en el que el contenido de prepolímero (B) es 10-90 % en peso en base al peso total del copolímero multibloques.
El copolímero multibloques de la invención puede estar compuesto por al menos dos segmentos diferentes, cada uno de los cuales tiene características físicas diferentes, que incluyen características de degradación e hinchamiento. Debido a su composición única y su morfología de fase semicristalina separada, los materiales de la invención son sorprendentemente versátiles y extremadamente adecuados para construir matrices de suministro de fármacos y recubrimientos de elución de fármacos, que se pueden utilizar para encapsular ciertos agentes terapéuticos y para la liberación sostenida del agente terapéutico encapsulado ya sea localmente o en la circulación sistémica. Como se describe en el presente documento a continuación, la composición de la invención es de particular interés para la liberación controlada de un compuesto biológicamente activo, tal como un polipéptido biológicamente activo a un anfitrión.
El término “con separación de fases” como se utiliza en el presente documento se refiere a un sistema, en particular un copolímero, construido de dos o más prepolímeros diferentes, de los cuales al menos dos son (parcialmente) incompatibles entre sí en temperatura corporal o inferior (bajo condiciones fisiológicas como en el cuerpo humano). Por tanto, los prepolímeros no forman una mezcla homogénea cuando se combinan, ni cuando se combinan como una mezcla física de los prepolímeros, ni cuando los prepolímeros se combinan en una única especie química como “mezcla química”, a saber, como copolímero.
El término “prepolímero”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a los segmentos de polímero que están conectados aleatoriamente por un extensor de cadena multifuncional, que juntos forman el copolímero de bloques múltiples de la invención. Cada prepolímero se puede obtener mediante polimerización de monómeros adecuados, monómeros que, por tanto, son las unidades químicas de cada prepolímero. Las propiedades deseadas de los prepolímeros y, por consiguiente, del copolímero multibloques de la invención, se pueden controlar al elegir un prepolímero de composición y peso molecular adecuados (en particular Mn), de tal manera que se obtiene la Tm o Tg requerida.
El término “multibloques”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la presencia de al menos dos segmentos de prepolímero distintos en una cadena de polímeros.
El término “termoplástico”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la naturaleza no entrecruzada del copolímero multibloques. Al calentarse, un polímero termoplástico se vuelve fluido, mientras que se solidifica al (re)enfriarse. Los polímeros termoplásticos son solubles en solventes adecuados.
El término “hidrolizable”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la capacidad de reaccionar con agua sobre la que se escinde la molécula. Los grupos hidrolizables incluyen grupos éster, carbonato, fosfaceno, amida y uretano. Bajo condiciones fisiológicas, solo los grupos éster, carbonato y fosfaceno reaccionan con el agua en una escala de tiempo razonable.
El término “extensor de cadena multifuncional”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la presencia de al menos dos grupos reactivos en el extensor de cadena que permiten conectar químicamente prepolímeros reactivos formando de esta manera un copolímero multibloques.
El término “copolímero multibloques aleatorio”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un copolímero multibloques en el que los distintos segmentos se distribuyen aleatoriamente sobre la cadena de polímeros.
El término “polímero soluble en agua”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polímero que tiene una buena solubilidad en un medio acuoso, preferiblemente agua, bajo condiciones fisiológicas. Este polímero, cuando se copolimeriza con fracciones más hidrófobas, hace que el copolímero resultante se hinche en agua. El polímero soluble en agua se puede derivar de un diol, una diamina o un diácido. El diol o diácido se utiliza adecuadamente para iniciar la polimerización por apertura de anillo de monómeros cíclicos.
El término “hinchable”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a la absorción de agua por el polímero. La relación de hinchamiento se puede calcular al dividir la masa del copolímero hinchado con agua por la del copolímero seco.
El término “semicristalino”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una morfología del copolímero multibloques que comprende dos fases distintivas, una fase amorfa y una fase cristalina. Preferiblemente, el copolímero multibloques se compone de una fase amorfa y una fase cristalina.
El término “compuesto biológicamente activo”, como se utiliza en el presente documento, debe interpretarse de manera amplia como cualquier agente que proporcione un efecto terapéutico o profiláctico. Dichos agentes incluyen, pero no se limitan a, agentes antimicrobianos (que incluye agentes antibacterianos y antifúngicos), agentes antivirales, agentes antitumorales, hormonas y agentes inmunogénicos.
El término “polipéptido biológicamente activo”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a péptidos y proteínas que son biológicamente activos en el cuerpo de un mamífero, más en particular en el cuerpo humano.
Los copolímeros multibloques con separación de fases semicristalinos de la invención superan uno o más de los inconvenientes y limitaciones mencionados anteriormente. Debido a la presencia de segmentos derivados de un polímero soluble en agua (como los segmentos de PEG hidrófilos), el copolímero multibloques con separación de fases se hincha en un entorno acuoso para formar un hidrogel hinchado que proporciona un entorno natural para compuestos biológicamente activos tales como proteínas. Cuando los copolímeros multibloques de la invención se aplican como una matriz de polímeros en una formulación de liberación controlada para suministrar un compuesto biológicamente activo, la capacidad de hinchamiento de los copolímeros multibloques puede evitar la acumulación en la matriz de polímeros de productos de degradación ácidos formados durante la hidrólisis de las cadenas de polímero. En cambio, dichos productos de degradación se liberan de la matriz y por tanto previenen la formación de un microambiente ácido en la matriz de polímeros que sería perjudicial para el compuesto biológicamente activo encapsulado. Más aún, debido a la capacidad de hinchamiento de los copolímeros multibloques con separación de fases de la invención, cualquier compuesto encapsulado puede liberarse gradualmente por difusión evitando de esta manera los patrones de liberación bifásicos o trifásicos que se obtienen normalmente para poliésteres biodegradables no hinchables tales como poli(D,L-lactida) o poli(ácido láctico-co-glicólico).
Los copolímeros multibloques de la invención tienen una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas. Esto se debe al segmento B del prepolímero. El segmento B se basa en polímeros cristalizables, tal como PLLA, poli(ácido D-láctico) (PDLA), ácido poliglicólico (PGA) o polihidroxibutirato (p Hb ), o combinaciones de polímeros cristalizables. Aún más preferiblemente, el segmento B se basa en un prepolímero compuesto de PLLA. La fase amorfa de los copolímeros multibloques con separación de fases de la invención consiste predominantemente en los segmentos A blandos. Sorprendentemente, hemos descubierto que la parte amorfa de los segmentos duros B también contribuye a la fase amorfa total de los copolímeros multibloques de esta invención.
Para los copolímeros multibloques descritos en el documento WO-A-2004/007588, la elección de los prepolímeros que se utilizarán como segmentos B se limita a los prepolímeros compuestos de poli(£-caprolactona) (PCL), poli(valerolactona) (PVL) y poli(dioxanona) (PDS) debido a que la Tm del prepolímero (B) está en el rango de 40-100 °C (con respecto a los poliésteres comunes utilizados para aplicaciones biomédicas). De acuerdo con la invención, la Tm del prepolímero (B) está en el rango de 110-250 °C. Como resultado, el prepolímero (B) se puede seleccionar de una lista de prepolímeros químicamente diferentes que no se consideraron previamente. Los inventores encontraron que la química diferente para el prepolímero (B) produce copolímeros multibloques que exhiben propiedades ventajosas que no se pueden obtener con los copolímeros descritos en el documento WO-A-2004/007588.
Cuando se utiliza PDS como segmento B, se obtienen copolímeros multibloques con una Tm de 80-90 °C (documento US-A-5711 958). Cuando se utiliza PCL como segmento B, se obtienen copolímeros multibloques con una Tm de 40­ 60 °C (documento US-A-5 711 958). El homopolímero de PVL tiene una Tm de aproximadamente 60 °C, similar al homopolímero de PCL. Cuando se utilizan segmentos de PVL como segmento B, se obtienen copolímeros multibloques con una Tm de aproximadamente 40-60 °C. PDS, PCL y PVL son semicristalinos y, por tanto, poseen una Tg además de su Tm. PDS, PCL y PVL poseen todos una Tg baja de sus respectivas fases amorfas de aproximadamente -10 °C, -60 °C y -70 °C, respectivamente. El aumento del rango de temperatura para el bloque B a 110-250 °C abre la posibilidad de utilizar PLLA, PDLA, PGA y PHB. Estos polímeros tienen una Tg más alta de aproximadamente 50 °C, 35 °C y 0 °C, respectivamente. Independientemente del polímero que se utilice para los segmentos B duros, estos segmentos B duros siempre serán semicristalinos por sí mismos, es decir, parcialmente amorfos. Sorprendentemente, se encontró que la parte amorfa de los segmentos B duros se mezclará (parcialmente) en fase con los segmentos A blandos y, por tanto, ambos contribuirán a la Tg total del copolímero multibloques. Por tanto, la Tg de la fase amorfa se determina tanto por la Tg del segmento A como por la Tg del segmento B, en combinación con la relación molar del segmento A/B. La Tg se puede variar desde Tg cercana al prepolímero (A) (cuando se utiliza una relación de prepolímero A/B cercana a 1) a Tg cercana a la del prepolímero B (cuando se utiliza la relación de prepolímero A/B cercana a cero). Es importante destacar que la liberación de los activos encapsulados en la matriz de polímeros depende en gran medida de la Tg de la fase amorfa, ya que la difusión de los activos se produce a través de la fase amorfa y no de la fase cristalina densa. También, la tasa de degradación de un polímero depende en gran medida de la Tg de la fase amorfa, ya que esto influye en la tasa de afluencia de agua y, por lo tanto, en la tasa de hidrólisis. El uso de prepolímero (B) con Tm 110-250 °C que tiene una Tg relativamente alta permite cubrir un rango de Tg mucho más amplio de lo que hubiera sido posible con el prepolímero (B) que tiene una Tm 40-100 °C y una Tg relativamente baja. Tg. Como consecuencia, el uso de dichos prepolímeros (B) para preparar copolímeros multibloques con una Tm en el rango de 110-250 °C permite un rango mucho más amplio de propiedades de liberación y degradación del polímero y, por lo tanto, también permite un mejor control sobre la liberación de diferentes compuestos biológicamente activos.
Adicionalmente, la Tm más alta de los copolímeros multibloques de la presente invención permite la preparación de microesferas no pegajosas mediante un proceso de emulsión doble en condiciones ambientales, sin dejar de tener segmentos B cortos. La limitación de la longitud del segmento B cristalizable es importante para tener copolímeros multibloques que se degraden bien bajo condiciones fisiológicas, al contrario que los polímeros PLLA cristalinos de mayor peso molecular. Por el contrario, las microesferas no se pueden fabricar utilizando copolímeros multibloques en los que el segmento B está compuesto por un PCL corto, ya que los bloques de PCL cortos no forman dominios cristalinos durante la formación de las microesferas. Como consecuencia, el polímero permanece amorfo. Debido a la Tg baja del polímero amorfo, el polímero es pegajoso debido a que las microesferas se aglomeran y fusionan durante la etapa del proceso de extracción/evaporación. Dado que la PVL tiene una Tm similar a la PCL, es de esperar que no se puedan elaborar microesferas utilizando copolímeros multibloques en los que el segmento B está compuesto por un prepolímero de PVL corto. No se ha hecho referencia en la literatura a microesferas compuestas de PDS o copolímeros de PDS. Se sabe por la bibliografía que la cristalización de PDS es lenta e incompleta a velocidades de enfriamiento rápidas y/o de bajo peso molecular de PDS. Estos resultados predicen que la preparación de microesferas mediante un proceso de emulsión doble utilizando copolímeros multibloques siendo el segmento B un bloque PDS corto no es factible.
Teóricamente, la estabilidad de almacenamiento de microesferas en condiciones ambientales elaboradas con el prepolímero (B) que tiene una Tm de 110-250 °C se mejora en comparación con el prepolímero (B) que tiene una Tm de 40-100 °C. El aumento de Tm aumenta la Tc y, por lo tanto, aumenta la cristalinidad de las microesferas. Una cristalinidad más alta reducirá la movilidad molecular del compuesto biológicamente activo encapsulado en la matriz de polímeros y mejorará la estabilidad de almacenamiento del producto. Se sabe por la bibliografía que el aumento de la cristalinidad aumenta la estabilidad de almacenamiento de las partículas. También, los prepolímeros B que tienen una Tm de 110-250 °C tienen una Tg más alta en comparación con los prepolímeros (B) que tienen una Tm de 40­ 100 °C. Se sabe por la bibliografía que para las partículas semicristalinas de esta manera como para las amorfas, el aumento de Tg aumenta la estabilidad en almacenamiento.
Los copolímeros multibloques de la invención tienen adicionalmente una tasa de degradación mejorada en comparación con los copolímeros multibloques en los que el segmento cristalizable se basa en PCL, porque los segmentos B en los copolímeros multibloques de la invención son menos hidrófobos en comparación con PCL.
La síntesis de copolímeros multibloques en donde el segmento cristalizable se basa en PDS se ve obstaculizada por la polimerización limitada del monómero de PDS, p-dioxanona y la solubilidad limitada de PDS en solventes comunes. Es bien sabido que la p-dioxanona tiene una temperatura de techo relativamente baja, lo que conduce a una conversión máxima de aproximadamente el 80 %. Por el contrario, los monómeros utilizados para los copolímeros multibloques de la invención, tales como lactida y glicolida, se pueden polimerizar fácilmente a conversiones superiores al 95 %. La solubilidad limitada de los polímeros que contienen PDS también limita su uso para la preparación de formulaciones de liberación controlada.
Los copolímeros multibloques de esta invención que se componen de un segmento B basado en PLLA tienen la ventaja adicional de que el PDLA se puede agregar como un segmento B adicional, produciendo copolímeros multibloques con mayor cristalinidad y menor tasa de degradación debido a la formación de cristales estereocomplejos de PLLA/PDLA con una Tm tan alta como 220 °C, que es aproximadamente 50 °C más alta que la Tm de los segmentos cristalinos de PLLA que están compuestos únicamente por el enantiómero L-lactida.
En los copolímeros multibloques de la invención, el contenido de los segmentos derivados de un polímero soluble en agua se puede variar independientemente de la longitud del bloque del segmento hidrófobo (cristalino). Por lo tanto, se pueden obtener altos contenidos de segmentos que se derivan de un polímero soluble en agua, mientras se mantiene la cristalinidad. Adicionalmente, la viscosidad intrínseca (IV) de los copolímeros multibloques de la invención se puede variar independientemente de la composición, en contraste con los copolímeros tribloque ABA descritos por Kissel et al. El alto grado de variabilidad de los copolímeros multibloques de la invención permite ajustar fácilmente la longitud, la relación y la composición de los segmentos para obtener las características de degradación y la cinética de liberación del fármaco deseadas.
Los copolímeros multibloques de esta invención tienen ventajas adicionales sobre los copolímeros de bloques de estructura ABA como se menciona en los ejemplos de la introducción. Aunque las propiedades de los polímeros se pueden mejorar en gran medida al utilizar copolímeros de bloques con bloques de diferentes copolímeros en lugar de homopolímeros o copolímeros aleatorios, estos copolímeros ABA todavía tienen ciertas desventajas.
Para obtener un peso molecular mínimo del copolímero ABA, las secuencias A y B deben tener una cierta longitud. Los bloques pueden comportarse independientemente como homopolímeros individuales con una composición similar. Las propiedades de los copolímeros de tipo ABA solo se pueden ajustar al variar la composición de los bloques A y B. Otra desventaja es que los copolímeros de bloques se deben preparar a temperaturas relativamente altas (> 100 °C) bajo condiciones inertes para la conversión completa de todos los monómeros y para obtener un peso molecular suficiente. La primera desventaja se puede resolver al utilizar copolímeros multibloques en los que los bloques o segmentos son mucho más cortos y están conectados entre sí mediante una reacción química realizada a temperaturas por debajo de 100 °C. Propiedades tales como el comportamiento de degradación se pueden ajustar de una manera mucho mejor al elegir la combinación adecuada de longitudes de segmento, relación y composición.
Adicionalmente, debido a las temperaturas relativamente altas utilizadas en el proceso de preparación de copolímeros de bloque ABA (y derivados de los mismos), siempre existe la posibilidad de transesterificación, lo que da como resultado un cierto grado de mezcla de fases. Los copolímeros multibloques de la invención no adolecen de esta desventaja, ya que se pueden preparar al conectar prepolímeros con la composición de monómeros previamente determinada a temperaturas bastante bajas (<100 °C) evitando de esta manera la transesterificación y otras reacciones secundarias, que puede provocar la generación de degradación no deseada y otros subproductos. Esto significa que la longitud de la secuencia de monómeros del copolímero está determinada por la elección de los componentes fundamentales y no tanto por el tiempo de reacción y la temperatura, como se aplica habitualmente para la síntesis de copolímeros aleatorios. Otra ventaja de los copolímeros multibloques de esta invención preparados mediante la conexión de prepolímeros utilizando un extensor de cadena multifuncional es que los segmentos de prepolímero se distribuyen aleatoriamente en el copolímero, ofreciendo de esta manera muchas más posibilidades de ajustar las propiedades. Un copolímero multibloques aleatorio es, por ejemplo, ABBBBABAAABBAAa AA... etc. Los copolímeros multibloques aleatorios de la invención proporcionan muchas ventajas que no se pueden obtener con copolímeros multibloques alternos.
En primer lugar, los copolímeros multibloques aleatorios obtenidos por extensión de cadena de los bloques A y B tienen una relación A a B ilimitada. A: B puede, por ejemplo, ser 10:90, pero también puede ser 90:10. Por el contrario, la relación de los bloques en un copolímero multibloques alterno está limitada a la relación utilizada en el polímero de cadena extendida. Por ejemplo, en el caso de la extensión de cadena de AB, la relación A:B en el copolímero multibloques es 50:50. La naturaleza aleatoria de los copolímeros multibloques de la invención aumenta en gran medida las posibles composiciones del material y, por tanto, el control sobre sus propiedades físicas y químicas. Esto incluye un mejor control de la capacidad de hinchamiento en el agua, morfología (separación de fases, amorfa/cristalinidad) y degradación del polímero.
En segundo lugar, el método de síntesis de los copolímeros multibloques aleatorios de la invención es mucho menos laborioso en comparación con la síntesis de copolímeros multibloques alternos. En copolímeros multibloques alternos, los segmentos A y B en el caso de los dibloques AB, o los segmentos A y C en el caso de los tribloques ACA, se deben conectar antes de la extensión de la cadena (o es necesario sintetizar un macro extensor de cadena). En los copolímeros multibloques aleatorios, los bloques A y B separados se extienden en cadena con, por ejemplo, un extensor de cadena disponible comercialmente.
Otra ventaja de los copolímeros multibloques de la invención es que se basan en un extensor de cadena multifuncional (preferiblemente alifático). Al elegir el tipo y la cantidad de extensor de cadena, las propiedades de los polímeros se pueden ver afectadas (por ejemplo, el extensor de cadena puede actuar como suavizante o puede afectar el grado de separación de fases). Por tanto, el grado de libertad total para obtener polímeros con las propiedades deseadas aumenta en comparación con los polímeros del estado de la técnica.
De acuerdo con la invención, se proporcionan copolímeros multibloques con separación de fases que se hinchan lo suficiente en un entorno acuoso y bajo condiciones fisiológicas tras la administración para proporcionar un microambiente acuoso para el péptido o proteína encapsulado y permitir la liberación controlada por difusión de los péptidos y proteínas. Los materiales muestran de esta manera una disminución significativa de la resistencia mecánica. Aunque dichos materiales se pueden utilizar como materiales con memoria de forma bajo condiciones secas sin mostrar una disminución significativa en la resistencia mecánica antes de la transición a la forma memorizada, por ejemplo, por medio del uso de la temperatura o la luz como disparador externo, estos materiales muestran cambios dimensionales significativos y una disminución significativa de su resistencia mecánica bajo condiciones hidratadas, simplemente porque estos materiales absorben cantidades significativas de agua debido a su carácter hidrófilo que conduce a un extenso hinchamiento y plastificación del material. Como consecuencia, bajo condiciones hidratadas, tales como las condiciones fisiológicas que se encuentran en un cuerpo humano o animal, el tamaño de las construcciones preparadas con estos materiales cambia significativamente y las propiedades mecánicas de estos materiales cambian órdenes de magnitud. Contrariamente a los copolímeros multibloques de la presente invención, los materiales con memoria de forma descritos en el documento US-A-5711 958 apenas se hinchan bajo condiciones hidratadas, tales como las condiciones fisiológicas encontradas en un cuerpo humano o animal.
Los poliésteres o poliéstercarbonatos con separación de fases de esta invención son un grupo prometedor de biomateriales y se pueden utilizar en diversas aplicaciones de suministro de fármacos ya que proporcionan un excelente control sobre la liberación de fármacos y permiten la liberación de compuestos biológicamente activos, tales como polipéptidos.
La morfología del copolímero multibloques (o de una construcción elaborada del mismo) depende de las condiciones ambientales: se puede realizar una medición de DSC (calorimetría diferencial de barrido) bajo condiciones inertes (secas) y los resultados se pueden utilizar para determinar las propiedades térmicas de los materiales secos. Sin embargo, la morfología y propiedades bajo condiciones fisiológicas (es decir, en el cuerpo) pueden ser diferentes de la morfología y propiedades bajo condiciones ambientales (seco, temperatura ambiente). Se debe entender que las temperaturas de transición, Tg y Tm, como se utilizan en el presente documento, se refieren a los valores correspondientes de un material cuando se aplica in vivo; a saber, cuando está en equilibrio con una atmósfera saturada de vapor de agua y a temperatura corporal. Esto se puede simular in vitro al realizar la medición DSC después de permitir que el material se equilibre con una atmósfera saturada de agua. En estado seco, los materiales utilizados en la invención pueden tener valores de Tg algo más altos que en condiciones corporales de mamíferos, es decir, cuando los materiales secos son sometidos a DSC, el primer punto de inflexión puede surgir a temperaturas más altas, por ejemplo a 42 °C o 50 °C, o más. Sin embargo, tras la aplicación in vivo, la Tg y/o la Tm del material seco caerán como resultado de la absorción de agua, lo que plastifica el polímero y esta Tg final debe estar alrededor de la temperatura corporal o más baja de acuerdo con la invención. La Tm final debe estar presente a temperaturas entre 110 °C y 250 °C bajo condiciones fisiológicas.
Por ejemplo, un polímero que contiene PEG en el segmento blando puede ser cristalino bajo condiciones secas a temperatura ambiente, mientras que es amorfo bajo condiciones húmedas, dando una Tg mezclada o dos Tgs separadas del segmento blando formado por PEG ablandado amorfo y el poliéster/carbonato. El carácter con separación de fases de los copolímeros de la invención se refleja en el perfil de Tg o Tm. Los copolímeros con separación de fases se caracterizan por al menos dos transiciones de fase, cada una de las cuales está relacionada con (pero en general no es idéntica a) los correspondientes valores de Tg o Tm de los prepolímeros que están comprendidos en el copolímero. La Tg se determina al tomar el punto medio del salto de calor específico, como se puede medir, por ejemplo, mediante DSC. La Tm es el pico máximo del pico de fusión, como se ilustra esquemáticamente en la Figura 1, que muestra la endotermia del flujo de calor para un copolímero caracterizado por una Tg y una Tm. Como se define en el presente documento, los valores de Tg y Tm de un determinado prepolímero reflejan los valores medidos en el copolímero. En caso de inmiscibilidad completa de los prepolímeros, la Tg del copolímero se rige únicamente por la Tg del prepolímero “blando” amorfo. En la práctica, sin embargo, la composición de la fase cristalina y amorfa del copolímero multibloques no es la misma que la composición de los segmentos A blandos y los segmentos B semicristalinos. La parte amorfa del prepolímero que forma el segmento duro original se mezclará con el prepolímero (A) que forma el segmento blando y, por tanto, se convertirá en parte de la fase amorfa. El valor de Tg de la fase amorfa es entonces diferente del prepolímero utilizado. El grado de miscibilidad (y por lo tanto la desviación de Tg y/o Tm de aquellos de los prepolímeros correspondientes) depende de la composición del prepolímero, la relación y la longitud del segmento en el copolímero. La Tg de los segmentos de copolímero se encuentra generalmente entre el valor de Tg del copolímero de mezcla de fases y el valor de Tg de los prepolímeros separados.
Las propiedades fisicoquímicas (tales como degradación, hinchamiento y propiedades térmicas) de los copolímeros multibloques se pueden ajustar fácilmente al cambiar el tipo de monómeros del segmento blando y duro que forman los prepolímeros y su longitud de cadena y relación de la cadena y al elegir el tipo y la cantidad de extensor de cadena. Adicionalmente, las temperaturas de transición de fase son lo suficientemente bajas para procesar el polímero en la fusión. La relación de monómeros y la distribución del copolímero se pueden controlar fácilmente al variar las condiciones de polimerización.
Normalmente se desea un segmento cristalino B para obtener materiales no pegajosos. También, la morfología de fases separadas, con dominios amorfos y cristalinos, se debe mantener durante la exposición a condiciones fisiológicas (es decir, un entorno acuoso a temperatura corporal) para tener un hinchamiento controlado de la matriz de polímeros. El control del grado de hinchamiento es fundamental para controlar la liberación de compuestos encapsulados. Los segmentos B cristalinos actúan como enlaces cruzados físicos que controlan el hinchamiento de los segmentos blandos más hidrófilos. Además de verse afectado por el contenido del segmento B duro, el grado de hinchamiento de los polímeros depende del contenido y del peso molecular/longitud del polímero soluble en agua en el segmento A blando.
Como se mencionó anteriormente, un requisito previo del copoliéster segmentado con separación de fases es que la Tm del segmento de poliéster B esté en el rango de 110-250 °C y la Tg del segmento A esté por debajo de 37 °C bajo condiciones fisiológicas. La Tm del segmento B en el copolímero multibloques será menor que la del prepolímero no reaccionado (B) debido a la disminución de la flexibilidad de la cadena una vez que el prepolímero está incorporado en el copolímero multibloques y debido a la posible mezcla de fase de otros componentes del copolímero multibloques en la fase cristalina. Una clase importante de copoliésteres segmentados con buena separación de fases son aquellos basados en segmentos duros B compuestos de PLLA cristalino. Los inventores han demostrado que los copolímeros multibloques con segmentos B basados en PLLA tienen una Tm de al menos 110 °C bajo condiciones fisiológicas. Estos copolímeros multibloques ofrecen varias ventajas. Se puede obtener un amplio rango de tasas de degradación. El prepolímero (B) que forma el segmento duro B se puede basar en PLLA cristalino y se sabe que dichos polímeros se degradan muy lentamente. Por el contrario, el prepolímero (A) puede ser un polímero que se basa en un polímero soluble en agua y un poliéster amorfo. Se sabe que dichos polímeros se degradan relativamente rápido. La tasa de degradación final está determinada por la relación segmento A/segmento B y, por lo tanto, se puede ajustar fácilmente. Dado que la liberación se rige, entre otras cosas, por la tasa de degradación del copolímero multibloques, esto también se puede ajustar mediante la relación segmento A/segmento B. También, la cristalinidad se puede aumentar fácilmente al mezclar PLLA con PDLA para formar un estereocomplejo. La estereocomplejación conduce a una mayor cristalinidad en comparación con el enantiómero único y también a una Tm más alta (~50 °C más alta que la del enantiómero único). Adicionalmente, la Tg de los copolímeros multibloques con segmentos B basados en PLLA se puede variar en un amplio rango, desde aproximadamente -40 hasta 40 °C (medido bajo condiciones secas). Dado que la tasa de degradación y la tasa de liberación se rigen, entre otras cosas, por la Tg de la matriz, este amplio rango de Tg también ofrece un gran ajuste de las propiedades de liberación y degradación.
En general, la morfología deseada de separación de fases (reflejada por un punto de fusión y al menos un valor de Tg bajo) se puede obtener al variar la composición, por ejemplo, al elegir el peso molecular promedio en número, Mn, de los prepolímeros A y B. También es posible influir en la morfología de las fases separadas al variar la relación segmento A/segmento B.
Los copolímeros multibloques segmentados de esta invención comprenden un segmento blando A derivado del prepolímero (A) que es hidrolizable y completamente amorfo en condiciones fisiológicas (corporales). Adicionalmente, el prepolímero (A) preferiblemente tiene al menos una transición de fase que es una Tg de 37 °C o menos, preferiblemente 25 °C o menos medida bajo condiciones fisiológicas (corporales). Este segmento será parte de la fase amorfa en el copolímero multibloques, en el que la fase amorfa se denomina en el presente documento fase (A). Los copolímeros de la invención también comprenden un segmento duro B derivado del prepolímero (B), que comprende un polímero hidrolizable semicristalino normalmente con una Tm de 110-250 °C medida en condiciones fisiológicas (corporales). El segmento B contribuye principalmente a la fase (B). Los prepolímeros A y B que forman los segmentos “blando” y “duro”, respectivamente, están conectados por un extensor de cadena multifuncional. Normalmente, la fase cristalina está compuesta de segmentos duros B y la fase amorfa está compuesta de segmentos blandos A y la parte amorfa de los segmentos B. La fase cristalina y amorfa es (son) incompatibles o solo parcialmente compatibles en las condiciones corporales, a saber, se separan en fases. El extensor de cadena multifuncional es preferiblemente una molécula alifática.
Los copolímeros multibloques resultantes de la invención preferiblemente tienen una estructura de acuerdo con la fórmula (1):
-[R1-H-R1-Q1-R4-Q2]x-[R2-Q3-R4-Q4] y-[R3-Q5-R4-Q6]z-(1)
donde R1 es parte del segmento A, que es parte de la fase (A), y puede ser poliéster amorfo, polieteréster amorfo o policarbonato amorfo; o un prepolímero amorfo que se obtiene a partir de grupos éster, éter y/o carbonato combinados. H es el bloque central del segmento A y se deriva de un polímero soluble en agua. El bloque derivado del polímero soluble en agua puede ser amorfo o semicristalino a temperatura ambiente. Sin embargo, el bloque H de esta manera introducido en el segmento A se volverá amorfo en condiciones fisiológicas. Este polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en poliéteres tales como polietilenglicol (PEG), poli(óxido de tetrametileno) (PTMO) y polipropilenglicol (PPG); alcohol polivinílico (PVA) polivinilpirrolidona (PVP), polivinilcaprolactama, poli(metacrilato de hidroxietilo) (poli-(HEMA)), polifosfacenos, poliortoésteres, poliortoesteramidas o copolímeros de los polímeros anteriores. Preferiblemente, H es PEG, que es el iniciador de la polimerización por apertura de anillo de un monómero cíclico que forma R1.
R2 es el segmento B y contribuye principal o totalmente a la fase (B). R2 puede ser un poliéster, poliéteréster, policarbonato o polianhídrido cristalino o semicristalino; o prepolímeros de grupos éster, éter, anhídrido y/o carbonato combinados. Es posible que parte de la fase R2 sea amorfa, en cuyo caso esta parte de R2 contribuirá a la fase (A). Preferiblemente, R1 y R2 no son iguales. La variable z es cero o un número entero positivo. Las variables x y y son ambas un número entero positivo.
Opcionalmente, el segmento R3 está presente. Este segmento se deriva de un polímero soluble en agua que se elige a partir del grupo de polímeros mencionado para H. R3 será parte de la fase amorfa (A) bajo condiciones fisiológicas. Si R3 está presente entonces el copolímero multibloques de la invención comprende un polímero soluble en agua como un prepolímero adicional. Preferiblemente, este polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en poliéteres tales como polietilenglicol (PEG), poli(óxido de tetrametileno) (PTMO) y polipropilenglicol (PPG); alcohol polivinílico (PVA) polivinilpirrolidona (PVP), polivinilcarprolactama, poli(metacrilato de hidroximetilo) (poli-(HEMA)), polifosfacenos, poliortoésteres, poliortoesteramidas o copolímeros de los polímeros previos. Por ejemplo, dicho segmento polimérico soluble en agua se deriva de PEG que tiene un Mn de 150-5000 g/mol.
R4 se deriva del extensor de cadena y consiste en un grupo alquileno C2-C8 alifático, opcionalmente sustituido con un alquileno C1-C10, el grupo alifático es lineal o cíclico. R4 es preferiblemente un grupo butileno, -(CH2)4-. El grupo lateral alquileno C1-C10 puede contener fracciones de S, N, P u O protegidos. Los extensores de cadena que contienen grupos aromáticos generalmente no son adecuados, ya que los extensores de cadena que contienen grupos aromáticos pueden dar lugar a productos de degradación no deseados. Por tanto, se prefieren los extensores de cadena alifática.
Q1-Q6 son unidades de conexión obtenidas mediante reacción de los prepolímeros con el extensor de cadena multifuncional. Cada uno de Q1-Q6 se puede seleccionar independientemente de amina, uretano, amida, carbonato, éster y anhídrido. El caso de que todos los grupos de enlace Q sean diferentes es raro y, por lo general, no se prefiere.
Normalmente, se puede utilizar un tipo de extensor de cadena con tres prepolímeros que tienen los mismos grupos de extremo dando como resultado un copolímero de fórmula (1) con seis grupos de enlace similares.
En caso de que los prepolímeros R1 y R2 terminen de manera diferente, estarán presentes dos tipos de grupos Q: por ejemplo, Q1 y Q2 serán iguales entre dos segmentos conectados R1, pero Q1 y Q2 son diferentes cuando R1 y R2 están conectados. Los ejemplos de fórmula (1) muestran el resultado de la reacción con un extensor de cadena difuncional y prepolímeros difuncionales.
Con referencia a la fórmula (1), los poliésteres de la invención también se pueden representar como copolímeros multibloques o segmentados que tienen una distribución aleatoria de segmentos (AB)r, en la que 'A' corresponde al segmento A y 'B' corresponde al segmento B (para z = 0). En (AB)r, la relación A/B (que corresponde a x/y en la fórmula (1)) puede ser la unidad o alejarse de la unidad. Los prepolímeros se pueden mezclar en cualquier cantidad deseada y se pueden acoplar mediante un extensor de cadena multifuncional, a saber, un compuesto que tiene al menos dos grupos funcionales el cual se puede utilizar para conectar químicamente los prepolímeros. Preferiblemente, este es un extensor de cadena difuncional. En el caso de z t 0, entonces la presentación de una distribución aleatoria de todos los segmentos puede ser dada por (ABC)r si tres prepolímeros diferentes (uno es un segmento derivado de un polímero soluble en agua como PEG) se distribuyen aleatoriamente en todas las proporciones posibles.
Los prepolímeros de los que se forman los segmentos a y b (y opcionalmente c) en (AB)r y (ABC)r se conectan por el extensor de cadena multifuncional. Este extensor de cadena es preferiblemente un extensor de cadena de diisocianato, pero también puede ser un compuesto de diácido o diol. En caso de que todos los prepolímeros contengan grupos de extremo hidroxilo y se utilice un extensor de cadena de diisocianato, las unidades de conexión serán grupos uretano. En el caso de que (uno de) los prepolímeros terminen en ácido carboxílico, las unidades de conexión son grupos amida. Los copolímeros multibloques con estructura (AB)r y (ABC)r también se pueden preparar mediante la reacción de prepolímeros terminados en ácido dicarboxílico con un extensor de cadena de diol o viceversa (prepolímero terminado en diol con extensor de cadena de diácido) utilizando un agente de acoplamiento tal como DCC (diciclohexil carbodiimida) que forma enlaces éster.
Como se mencionó anteriormente, los copolímeros segmentados aleatoriamente se refieren a copolímeros que tienen una distribución aleatoria (es decir, no alterna) de los segmentos A y B. En el caso de los segmentos A y B, esto se puede representar por (AB)r, en el caso de segmentos A, B y C esto se puede representar por (ABC)r.
El segmento hidrolizable R1-H-R1 de fórmula (1) se obtiene mediante reacción del prepolímero (A).
El prepolímero (A) se puede preparar, por ejemplo, mediante polimerización con apertura de anillo. Por tanto, un prepolímero (A) puede ser un copolímero hidrolizable preparado mediante polimerización con apertura de anillo iniciada por un compuesto de diol o diácido, que tiene preferiblemente una distribución aleatoria de monómeros. El compuesto de diol es preferiblemente un diol alifático o un poliéter de bajo peso molecular tal como PEG. El poliéter es parte del prepolímero (A) al utilizarlo como iniciador y adicionalmente se puede mezclar con el prepolímero (A), que forma de esta manera un segmento hidrófilo adicional R3 en la fórmula (1). El prepolímero (A) puede ser un poliéster hidrolizable, poliéteréster, policarbonato, poliéstercarbonato, polianhídrido o copolímeros de los mismos. Por ejemplo, el prepolímero (A) comprende productos de reacción de monómeros que forman éster seleccionados entre dioles, ácidos dicarboxílicos y ácidos hidroxicarboxílicos. El prepolímero (A) puede comprender productos de reacción de monómeros cíclicos y/o monómeros no cíclicos. Los ejemplos de monómeros cíclicos incluyen glicolida, lactida, £-caprolactona, 5-valerolactona, carbonato de trimetileno, carbonato de tetrametileno, 1,5-dioxepano-2-ona, 1,4-dioxano-2-ona (para-dioxanona) y/o anhídridos cíclicos tales como oxepano-2,7-diona. En una realización, se utiliza L-lactida, D-lactida y/o D,L-lactida.
Para cumplir el requisito de una Tg por debajo de 37°C, algunos de los monómeros o combinaciones de monómeros mencionados anteriormente son más preferidos que otros. Por ejemplo, el prepolímero (A) que contiene los monómeros lactida y/o glicolida se combina preferiblemente con cualquiera de los otros comonómeros cíclicos mencionados (£-caprolactona, 8-valerolactona, carbonato de trimetileno, 1,4-dioxano-2-ona y combinaciones de los mismos). Esto por sí solo puede reducir la Tg. Alternativamente, el prepolímero se inicia con un PEG con peso molecular suficiente para reducir la Tg del copolímero multibloques.
En caso de que el prepolímero A contenga poli(D,L-lactida), la relación L/D de la lactida puede estar alejada de la unidad (distinta de 50/50). Por ejemplo, una relación L/D entre 85/15 y 15/85 da un homopolímero completamente amorfo. Adicionalmente, se sabe que un exceso de un isómero (L o D) sobre el otro aumenta la Tg de la poli(D,L-lactida). Una cantidad menor de cualquier otro de los monómeros mencionados anteriormente que constituyen la fase amorfa también puede estar presente en la fase cristalina que forma el prepolímero o bloque.
Adicionalmente, el prepolímero (A) se puede basar en (mezclas de) tipo condensación de monómeros (no cíclicos) tales como hidroxiácidos (por ejemplo, ácido láctico, ácido glicólico, ácido hidroxibutírico), diácidos (por ejemplo, ácido glutárico, adípico o succínico, ácido sebácico) y dioles tales como etilenglicol, dietilenglicol, 1,4-butanodiol o 1,6-hexanodiol, formando fracciones hidrolizables de éster y/o anhídrido.
El segmento R2 de fórmula (1) se puede obtener mediante reacción de prepolímeros (B) derivados de monómeros L-lactida, D-lactida, hidroxibutirato, glicolida o una combinación de estos monómeros dando como resultado la formación de estereocomplejos, que tienen una transición de fase entre 110 °C y 250 °C bajo condiciones fisiológicas Preferiblemente, el segmento B se obtiene mediante reacción del monómero L-lactida.
Normalmente, el prepolímero (B) tiene un Mn de 1000 g/mol o más, preferiblemente 2000 g/mol o más, más preferiblemente 3000 g/mol o más. En general, el Mn del prepolímero (B) será de 10000 g/mol o menos. El contenido de prepolímero (B) en el copolímero es del 10 al 90 % en peso basado en el peso total del copolímero multibloques, preferiblemente del 25 al 70 % en peso, aún más preferiblemente del 30 al 50 % en peso.
Los prepolímeros serán preferiblemente (co)poliésteres, poliéstercarbonatos, poliéterésteres o polianhídridos lineales y aleatorios con grupos de extrtemo reactivos. Estos grupos de extremo pueden ser hidroxilo o carboxilo. Se prefiere tener un copolímero terminado en dihidroxi, pero también se pueden utilizar polímeros terminados en hidroxicarboxilo o dicarboxilo. En caso de que el polímero tenga que ser lineal, se puede preparar con un componente difuncional (diol) como iniciador, pero en el caso de que se utilice un poliol de tres o más funciones, se pueden obtener poliésteres en forma de estrella. El diol en el prepolímero (A) puede ser un diol alifático o un poliéter de bajo peso molecular.
La síntesis del prepolímero mediante una polimerización con apertura de anillo se lleva a cabo preferiblemente en presencia de un catalizador. Un catalizador adecuado es Sn(Oct)2 con M/I = 5000-30 000 (M/I es la relación de monómero a iniciador). También es posible realizar la síntesis sin catalizador.
Las condiciones para preparar los poliésteres, policarbonatos y polianhídridos son aquellas conocidas en la técnica.
Los copolímeros de la invención son generalmente lineales. Sin embargo, también es posible preparar los copolímeros en forma ramificada. Se pueden obtener estos copolímeros no lineales de la invención al utilizar un extensor de cadena trifuncional (o funcional superior), tal como triisocianato. Los copolímeros ramificados pueden mostrar características de fluencia mejoradas.
Para el segmento duro cristalizable, la longitud (Mn) del prepolímero puede ser suficientemente grande para poder cristalizar en el copolímero. Por ejemplo, el prepolímero que forma segmentos duros de PLLA tiene preferiblemente un Mn de 700 g/mol o más, más preferiblemente 2000 g/mol o más, aún más preferiblemente 3000 g/mol o más. Se espera que una longitud de prepolímero de PLLA más grande dé como resultado una morfología con separación de fases con un contenido de segmento duro más bajo. Por tanto, la relación de prepolímero a la que se observa la separación de fases depende de las longitudes del prepolímero. En general, las longitudes de los prepolímeros que forman el segmento blando y duro dentro de un copolímero deben tener un valor en el que se observe una morfología de fases separadas, el grado de separación de fases (incompatibilidad) es favorable para las propiedades deseadas del dispositivo biomédico.
El prepolímero que forma segmentos blandos (A) puede tener un Mn de 500 g/mol o más, preferiblemente 1000 g/mol o más, más preferiblemente 2000 g/mol o más. La longitud de los prepolímeros se debe elegir de tal manera que sean tan grandes como sea necesario para obtener una buena morfología con separación de fases y buenas propiedades mecánicas y térmicas del copolímero resultante. La longitud del prepolímero debe ser lo suficientemente baja para ser miscible con el extensor de cadena a la temperatura de polimerización. Normalmente, esto se logra cuando Mn es 10000 g/mol o menos.
Generalmente, un contenido de segmento duro en el rango de 10-90 % en peso basado en el peso total del copolímero multibloques, preferiblemente de 25-90 % en peso, da como resultado materiales termoplásticos flexibles con buenas propiedades degradación e hinchamiento a la temperatura de aplicación (a saber, aproximadamente 37 °C para aplicaciones médicas).
En un aspecto adicional, la invención se dirige a un proceso para preparar los copolímeros multibloques termoplásticos con separación de fases de la invención, que comprende una reacción de extensión de cadena del prepolímero (A) y el prepolímero (B) en presencia de un extensor de cadena multifuncional, obteniendo de esta manera un copolímero multibloques segmentado aleatoriamente.
Los copolímeros multibloques segmentados con estructura (AB)r y (ABC)r se pueden elaborar al extender la cadena de una mezcla de los prepolímeros, que contienen los segmentos duros y blandos que forman los monómeros de los segmentos R1, H y R2 y opcionalmente R3, en la relación deseada con una cantidad equivalente de un extensor de cadena multifuncional, preferiblemente una molécula alifática, más preferiblemente un diisocianato tal como diisocianato de 1,4-butano (BDI). Los copolímeros segmentados de las estructuras (AB)r o (ABC)r se elaboran preferiblemente en solución. De forma adecuada, el o los prepolímeros se disuelven en un solvente orgánico inerte y el extensor de cadena se agrega puro o en solución. La temperatura de polimerización puede ser la misma o incluso más baja que la temperatura de transición de fase más alta de los prepolímeros. Las reacciones de acoplamiento con diciclohexil carbodiimida (DCC) se llevan a cabo preferiblemente en solución. Dos (o tres) prepolímeros que son todos terminados en diol o diácido se pueden mezclar en solución con un extensor de cadena terminado en diácido o diol, respectivamente, después de lo cual se agrega DCC.
La polimerización tiene lugar durante un tiempo suficientemente largo para obtener una viscosidad intrínseca del copolímero de 0.1 dl/g o superior (medida a 25 °C en cloroformo). La baja temperatura de polimerización y el corto tiempo de polimerización evitarán la transesterificación de tal manera que se obtenga la morfología con separación de fases y la distribución de monómeros sea la misma que en los prepolímeros que constituyen el copolímero. Por el contrario, los copolímeros aleatorios de alto peso molecular se deben preparar a temperaturas más altas (> 100 °C) y durante un tiempo mucho más largo para obtener una incorporación completa de todos los monómeros. Durante ese tiempo, se producirán reacciones de transesterificación y se obtendrá una distribución de monómeros más aleatoria (es decir, menos en bloques).
Los materiales obtenidos por extensión de cadena en masa también se pueden producir in situ en una extrusora.
Si el extensor de cadena es una molécula alifática difuncional y los prepolímeros son lineales, se elabora un copolímero lineal; si uno de los reactivos (ya sea el extensor de cadena o al menos uno de los prepolímeros) o ambos tienen más de dos grupos funcionales, se pueden obtener estructuras ramificadas con una conversión suficientemente baja. El extensor de cadena puede ser un extensor de cadena alifático difuncional, preferiblemente un diisocianato tal como diisocianato de 1,4-butano.
La combinación de prepolímeros o monómeros que forman la fase cristalina y amorfa se elige de tal manera que se obtenga un copoliéster o poliéster-carbonato segmentado o en bloque con las propiedades deseables de degradación, hinchamiento, físicas y térmicas. Normalmente, la viscosidad intrínseca es mayor de 0.1 dl/g y menor de 10 dl/g (medida a 25 °C en cloroformo), preferiblemente entre 0.1-2 dl/g y más preferiblemente entre 0.2-1 dl/g.
Los copolímeros segmentados multibloques se pueden formar en formulaciones de varias conformaciones y dimensiones utilizando cualquier técnica conocida tal como, por ejemplo, procesos de emulsificación, extrusión, moldeo, fundición con solvente, secado por pulverización, secado por pulverización-congelación, electrohilado, o liofilización. La última técnica se utiliza para formar materiales porosos. La porosidad se puede ajustar mediante la adición de cosolventes, no solventes y/o lixiviables. Los copolímeros se pueden procesar (ya sea sólidos o porosos) en microesferas, micropartículas, nanoesferas, varillas, películas, hojas, aerosoles, tubos, membranas, mallas, fibras, tapones, recubrimientos y otros artículos. Los productos pueden ser sólidos, huecos o (micro) porosos. Se puede fabricar una amplia gama de implantes biomédicos para aplicaciones, por ejemplo, en el cuidado de heridas, recuperación de la piel, regeneración nerviosa, prótesis vasculares, suministro de fármacos, reconstrucción de meniscos, ingeniería de tejidos, recubrimiento de dispositivos quirúrgicos, regeneración de ligamentos y tendones, reparación dental y ortopédica. Los copolímeros se pueden utilizar solos o se pueden mezclar y/o coextruir con otros polímeros absorbibles o no absorbibles.
Adicionalmente, se pueden utilizar en aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, para el suministro de fármacos, por ejemplo, en forma de microesferas, implantes sólidos, geles, recubrimientos, películas, hojas, aerosoles, tubos, membranas, mallas, fibras, tapones y otras configuraciones.
Como se ilustrará en los ejemplos a continuación, los materiales de la invención tienen propiedades mejoradas, que incluyen el procesamiento térmico, mecánico, en comparación con los copolímeros descritos en la técnica anterior.
En aún un aspecto adicional, la invención se dirige a una composición para el suministro de al menos un compuesto biológicamente activo (por ejemplo, una molécula pequeña biológicamente activa, proteína o péptido) a un anfitrión, que comprende el al menos un compuesto biológicamente activo encapsulado en una matriz, en el que dicha matriz comprende al menos un copolímero multibloques termoplástico con separación de fases como se define en el presente documento.
Se encontró que un copolímero multibloques biodegradable de la invención es particularmente adecuado como vehículo de suministro para un polipéptido, lo que permite la liberación controlada del polipéptido desde la matriz a su entorno, por ejemplo, en el cuerpo de un sujeto.
Los copolímeros multibloques de la invención tienen muchas opciones para ajustar las propiedades de liberación de la composición de suministro para la aplicación específica. La tasa de liberación del compuesto biológicamente activo se puede aumentar, por ejemplo, al:
• aumentar el peso molecular del polímero soluble en agua en el prepolímero (A) a un peso molecular constante del prepolímero (A);
• aumentar la relación molar entre el prepolímero (A) y el prepolímero (B);
• aumentar el contenido de un monómero que da un polímero de degradación más rápida en el prepolímero (A), por ejemplo, al reemplazar £-caprolactona por D,L-lactida o glicolida o al reemplazar D,L-lactida con glicolida;
• reducir el peso molecular del prepolímero (B) a una relación molar constante entre el prepolímero (A) y el prepolímero (B) (esto aumenta el porcentaje en peso del prepolímero (A) y también disminuye la Tm del prepolímero (B) y la cantidad total de fase cristalina presente);
• reducir el peso molecular del prepolímero (A) a un peso molecular constante del polímero soluble en agua y la relación molar entre el prepolímero (A) y el prepolímero (B); y/o
• el uso de un tercer segmento adicional derivado de un polímero soluble en agua, por lo que se incrementa el contenido del polímero soluble en agua.
La tasa de liberación se puede reducir mediante los cambios opuestos mencionados anteriormente, de esta manera como al
• aumentar la Tm del segmento B, por ejemplo, mediante el uso de una mezcla de PLLA y PDLA como prepolímero (B) (en lugar de solo PLLA) en una relación tal que se produce estereocomplejamiento entre PLLA y PDLA;
• el uso de un tercer segmento adicional derivado de un diol de polímero soluble en agua, mediante el cual se utiliza un diisocianato como extensor de cadena y el contenido de polímero soluble en agua se mantiene constante o se reduce. El polímero soluble en agua en el tercer segmento se constituye en el copolímero multibloques con un enlace uretano que se degrada lentamente, en comparación con un enlace éster que se degrada más rápidamente del polímero soluble en agua en el prepolímero (A).
Los compuestos biológicamente activos que pueden estar contenidos en la matriz de copolímero multibloques, tales como una matriz de poli(D,Lácido láctico)-co-PEG-co-poli(D,L-ácido láctico)-b-PLLA ((PDLLA-co-PEG-co-pDLLA)-b-PLLA) o una matriz de poli(£-caprolactona)-co-PEG-co-poli(£-caprolactona)-b-PLLA((PcL-co-PEG-co-PCL)-b-PLLA), incluyen pero no se limitan a fármacos no peptídicos, no proteicos de tamaño pequeño que tienen un peso molecular que en general es 1000 Da o menos y polipéptidos biológicamente activos.
Ejemplos de fármacos no peptídicos, no proteicos de tamaño pequeño que pueden estar contenidos en la matriz de uretano de polieteréster tales como una matriz de (PDLLA-co-PEG-co-PDLLA)-b-PLLA o una matriz de PCL-co-PEG -co-PCL)-b-PLLA matriz, incluyen pero no se limitan a agentes antitumorales, agentes antimicrobianos, que incluyen antibióticos, cefalosporinas, aminoglucósidos; macrólidos; tetraciclinas, agentes quimioterapéuticos que incluyen sulfonamidas; antisépticos del tracto urinario; fármacos para infecciones anaeróbicas; fármacos para tuberculosis; fármacos para lepra, agentes antifúngicos, agentes antivirales, agentes antihelmintiasis, antiinflamatorios, agentes antigota, analgésicos de acción central (opoides), anestésicos locales, fármacos para la enfermedad de Parkinson, relajantes musculares de acción central, hormonas y antiagonistas hormonales, corticosteroides, glucocorticosteroides, andrógenos, esteroides androgénicos, esteroides anabólicos, antiandrógenos, estrógenos, esteroides estrogénicos, anti-estrógenos, progestinas; fármacos para la tiroides y fármacos antitiroideos.
Cuando un fármaco de tamaño pequeño, como aquellos descritos anteriormente, está contenido en una matriz de (PDLLA-co-PEG-co-PDLLA)-b-PLLA, el componente PEG del copolímero preferiblemente tiene un peso molecular desde 200 hasta 1500 g/mol, preferiblemente desde 600 hasta 1000 g/mol, y está presente en el copolímero en una cantidad desde 5 % en peso hasta 20 % en peso del peso del copolímero, preferiblemente en una cantidad desde 5 % en peso hasta 10% en peso del peso del copolímero. En general, el PLLA está presente en el copolímero en una cantidad desde 20 % en peso a 90 % en peso del peso del copolímero, preferiblemente en una cantidad desde 30 % en peso a 70 % en peso del copolímero. Al menos una molécula de fármaco de tamaño pequeño puede estar presente en la matriz en una cantidad desde 0.1 % en peso a 80 % en peso, preferiblemente desde 1.0 % en peso hasta 40 % en peso, aún más preferiblemente desde 5 hasta 20 % en peso. Si se desea aumentar la hidrofilicidad del copolímero multibloques y, por lo tanto, aumentar la tasa de degradación del copolímero y la tasa de liberación del compuesto biológicamente activo incorporado, se puede modificar el copolímero al reemplazar parcial o completamente el D,L-lactida del segmento hidrófilo por glicolida y/o utilizando un componente de PEG con un peso molecular más alto o al aumentar la fracción en peso del componente de PEG en el segmento de prepolímero. Si se desea reducir la hidrofilicidad del polímero y, por lo tanto, reducir la tasa de degradación del copolímero y la tasa de liberación del compuesto biológicamente activo incorporado, el copolímero se puede modificar al reemplazar parcial o completamente la D,L-lactida del segmento hidrófilo por £-caprolactona y/o al utilizar un componente de PEG con un peso molecular más bajo o al reducir la fracción en peso del componente de PEG en el segmento de prepolímero.
Un polipéptido consiste en aminoácidos conectados por enlaces de péptidos. Los polipéptidos cortos también se denominan péptidos, mientras que los polipéptidos más largos se denominan normalmente proteínas. Una convención es que las cadenas de polipéptidos que son lo suficientemente cortas como para ser elaboradas sintéticamente a partir de los aminoácidos constituyentes se denominan péptidos en lugar de proteínas. Sin embargo, con el advenimiento de mejores técnicas sintéticas, se pueden producir polipéptidos siempre que cientos de aminoácidos, incluyan proteínas completas como la ubiquitina. Otra convención coloca una línea divisoria informal en aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. Esta definición es algo arbitraria. Los polipéptidos largos, tales como el péptido beta amiloide conectado a la enfermedad de Alzheimer, se pueden considerar proteínas; y las proteínas pequeñas, tales como la insulina, se pueden considerar péptidos. En cualquier caso, el experto apreciará que esencialmente se puede encapsular cualquier tipo de polipéptido y posteriormente liberar desde una matriz de copolímero.
En una realización, una composición de la invención comprende un péptido biológicamente activo o una proteína biológicamente activa. Los polipéptidos encapsulados contienen preferiblemente solo aminoácidos naturales, aunque como alternativa se pueden emplear aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no se encuentran en la naturaleza pero que se pueden incorporar en una cadena de polipéptidos) y/o análogos de aminoácidos conocidos en la técnica. También, uno o más de los aminoácidos en un polipéptido se pueden modificar, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo de ácido graso, un enlazador para conjugación, funcionalización u otra modificación (por ejemplo, alfa amidación), etc.
En una realización preferida, las modificaciones del péptido conducen a un péptido más estable (por ejemplo, mayor vida media in vivo). Estas modificaciones pueden incluir la ciclación del péptido, la incorporación de D-aminoácidos, etc. Ninguna de las modificaciones debe interferir sustancialmente con la actividad biológica deseada del péptido. En ciertas realizaciones, las modificaciones del péptido conducen a un péptido más biológicamente activo.
El polipéptido biológicamente activo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en fármacos de proteína/peptídicos, enzimas, ligandos receptores, neurotransmisores, péptidos inhibidores, péptidos reguladores, péptidos activadores, citocinas, factores de crecimiento, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos monoclonales, péptidos antitumorales, antibióticos, antígenos, vacunas y hormonas. Los polipéptidos ejemplares a encapsular se mencionan en el documento US-A-5 980948 y Crommelin et al., Int. J. Pharm. 2003, 266 (1-2), 3-16. Por supuesto, también se prevé encapsular dos o más polipéptidos distintos (biológicamente activos).
El tamaño de los polipéptidos puede variar. En una realización, el polipéptido tiene un peso molecular de 10000 Da o menos. Se encontró que los polipéptidos de dicho tamaño son particularmente adecuados para ser encapsulados en la matriz de un copolímero que comprende PEG como un segmento de prepolímero (A) y/o como un prepolímero adicional, dicho PEG tiene un peso molecular promedio en número de 400 a 3000 g/mol, preferiblemente desde 600 hasta 1500 g/mol. Alternativamente, o además, dicho PEG está presente en una cantidad desde 5 % en peso hasta 60 % en peso en base al peso total del copolímero, preferiblemente desde 5 % en peso hasta 40 % en peso.
En otra realización, dicho polipéptido es una proteína biológicamente activa que tiene un peso molecular de 10000 Da o más. Estos polipéptidos más grandes se encapsulan preferiblemente en la matriz de un copolímero que contiene PEG, como un segmento de prepolímero (A) y/o como un prepolímero adicional, y en el que dicho PEG tiene un peso molecular promedio en número desde 600 hasta 5000 g/mol, preferiblemente desde 1000 hasta 3000 g/mol y/o en el que dicho PEG está presente en una cantidad desde 5 % en peso hasta 70 % en peso en base al peso total del copolímero, más preferiblemente desde 10 % en peso hasta 50 % en peso.
Una composición de la invención puede tener cualquier apariencia o forma deseable. En una realización, los copolímeros multibloques de la presente invención se procesan en forma de microesferas, micropartículas, aerosoles, un implante, un recubrimiento, un gel, una película, lámina, hoja, membrana o varilla.
Un aspecto específico se refiere a una composición en forma de microesferas. En general, las microesferas son partículas esféricas finas que tienen un diámetro de menos de 1000 pm y que contienen un compuesto biológicamente activo. La microesfera puede ser una microesfera homogénea o monolítica en la que el compuesto biológicamente activo se disuelve o se dispersa por toda la matriz de polímeros. También es posible que la microesfera sea de un tipo de reservorio en el que el compuesto biológicamente activo esté rodeado por un polímero en estado mononuclear o polinuclear. Cuando el compuesto biológicamente activo es un fármaco soluble en agua de tamaño pequeño, el fármaco se puede dispersar primero en un excipiente hidrófobo o lipófilo, cuya combinación luego se dispersa en forma de partículas, gotitas o microsuspensiones en la matriz de polímeros. A continuación, se pueden formar microesferas a partir de la emulsión.
Las microesferas se pueden preparar mediante técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan, técnicas de coacervación, extracción/evaporación con solvente, secado por pulverización o secado por congelación por pulverización.
En una realización, las microesferas se preparan mediante una técnica de extracción/evaporación con solvente que comprende disolver el copolímero multibloques en un solvente orgánico tal como diclorometano y emulsificación de la solución de copolímero multibloques en una fase acuosa que contiene un agente emulsionante, tal como alcohol polivinílico (como se describe, entre otros, por Okada, Adv. Drug Del. Rev. 1997, 28(1), 43-70).
Las características, tales como el tamaño de partícula, la porosidad y la carga de fármaco de las microesferas de esta manera formadas, dependen de los parámetros del proceso, tales como la viscosidad o concentración de la fase acuosa de alcohol polivinílico, la concentración de la solución de copolímero multibloques, la relación de diclorometano a solución acuosa de activo, relación de emulsión primaria a fase de alcohol polivinílico y tasa de agitación.
Cuando las microesferas se forman mediante un proceso de secado por pulverización, se emplea una baja concentración de copolímero multibloques desde 0.5 % en peso hasta 5 % en peso, preferiblemente alrededor de 2 % en peso, en el solvente orgánico, tal como diclorometano. El secado por pulverización da como resultado en general la formación de partículas porosas conformadas irregularmente.
A medida que se forman las microesferas, se encapsula un compuesto biológicamente activo en las microesferas o micropartículas. En general, cuando se emplea la técnica de extracción/evaporación con solvente para encapsular compuestos lipófilos, el compuesto se disuelve primero en la solución del copolímero multibloques en un solvente orgánico tal como diclorometano o acetato de etilo. A continuación, la solución orgánica se emulsiona posteriormente en una solución acuosa de alcohol polivinílico, que produce una emulsión de aceite en agua (O/W). A continuación, el solvente orgánico se extrae en la fase acuosa y se evapora para solidificar las microesferas.
En general, cuando se emplea la técnica de evaporación del solvente para encapsular un compuesto soluble en agua, primero se emulsiona una solución acuosa del compuesto en una solución del copolímero multibloques en un solvente orgánico tal como diclorometano. A continuación, esta emulsión primaria se emulsiona posteriormente en una solución acuosa de alcohol polivinílico, que produce una emulsión de agua en aceite en agua (W/O/W). El solvente orgánico, tal como diclorometano o acetato de etilo, se extrae luego de manera similar a la ruta del proceso O/W para solidificar las microesferas. Alternativamente, los agentes solubles en agua se pueden dispersar directamente en una solución del copolímero multibloques en un solvente orgánico. A continuación, la dispersión obtenida se emulsiona en una solución acuosa que comprende un tensioactivo tal como alcohol polivinílico, que produce una emulsión de sólido en aceite en agua (S/O/W). A continuación, el solvente orgánico se extrae de forma similar a la ruta del proceso O/W para solidificar las microesferas.
Cuando se utilizan las rutas de emulsificación W/O/W y S/O/W para encapsular el compuesto soluble en agua, puede resultar difícil obtener microesferas con suficiente eficacia de encapsulación. Debido al carácter soluble en agua del compuesto, parte del compuesto se puede perder en el medio de extracción acuoso, tal como una solución acuosa de alcohol polivinílico. Se puede utilizar un viscosificador, tal como gelatina, en la fase acuosa interna, para reducir la difusión del compuesto en la fase acuosa interna a la fase acuosa externa. También, se pueden agregar aditivos a la fase acuosa externa para reducir la solubilidad del compuesto en la fase acuosa externa. Para este propósito, se pueden utilizar sales o se puede ajustar el pH.
Las rutas de emulsificación de agua en aceite en aceite (W/O/O) o sólido en aceite en aceite (S/O/O) proporcionan una alternativa interesante para obtener microesferas con suficiente eficiencia de encapsulación. En el proceso W/O/O, el compuesto biológicamente activo, similar a un proceso W/O/W, se disuelve en una solución acuosa y se emulsiona con una solución del polímero en un solvente orgánico, tal como normalmente diclorometano o acetato de etilo. Posteriormente, se agrega lentamente un precipitante de polímero, tal como aceite de silicona, bajo agitación para formar micropartículas embrionarias, que luego se vierten en heptano o hexano para extraer el aceite de silicona y el solvente orgánico y solidificar las microesferas. Las micropartículas se pueden recoger mediante filtración al vacío, enjuagar con solvente adicional y secar al vacío. En la ruta de emulsificación S/O/O, el compuesto biológicamente activo, similar a un proceso S/O/W, se dispersa como un polvo sólido en una solución del polímero en un solvente orgánico, tal como diclorometano o acetato de etilo. Posteriormente, se agrega lentamente un precipitante de polímero, tal como aceite de silicona, bajo agitación para formar micropartículas embrionarias, que luego se vierten en heptano o hexano para extraer el aceite de silicona y diclorometano y solidificar las microesferas.
Se pueden agregar agentes estabilizantes a la solución acuosa de proteína para evitar la pérdida de actividad de la proteína durante el procesamiento en microesferas. Ejemplos de dichos agentes estabilizantes son albúmina de suero humano, gelatina y carbohidratos, tales como trehalosa, inulina y sacarosa.
Cuando se emplea la técnica de secado por pulverización, se emulsiona una solución acuosa del compuesto en una solución del copolímero en un solvente orgánico tal como cloruro de metileno, como se describió anteriormente. A continuación, la emulsión de agua en aceite se seca por pulverización utilizando un secador por pulverización.
En realizaciones adicionales, la composición de la invención está en forma de un recubrimiento, un gel inyectable, un implante (preferiblemente un implante inyectable) o un implante recubierto. La composición en forma de recubrimiento se puede aplicar como recubrimiento que eluye fármaco, por ejemplo, sobre un implante médico, tal como un stent vascular o urinario, una prótesis ortopédica o un implante ocular.
Los compuestos biológicamente activos se pueden formular en implantes sólidos inyectables mediante extrusión. Normalmente, el compuesto y los polvos de copolímero multibloques se mezclan físicamente donde, después de introducir la mezcla de polvo resultante en la extrusora, se calienta y se procesa para producir formulaciones de la forma y dimensiones deseadas, tales como una varilla cilíndrica de diámetro pequeño. En lugar de mezclar físicamente el compuesto y los polvos de copolímero de bloques múltiples, el compuesto y el polímero se pueden disolver conjuntamente en un solvente adecuado o se puede preparar una dispersión del compuesto en una solución de polímero en un solvente adecuado, seguido de liofilización y extrusión del polvo liofilizado. Este último generalmente mejora la homogeneidad de la mezcla y la uniformidad del contenido de los implantes.
En otro aspecto más, la invención se dirige a un método para suministrar un compuesto biológicamente activo a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una dosis eficaz de una composición como se define en el presente documento a dicho sujeto.
El sujeto es normalmente un mamífero, preferiblemente un humano. Sin embargo, también se incluye el uso veterinario de la invención. El método puede tener un propósito terapéutico, profiláctico y/o cosmético. Se puede seleccionar cualquier modo de administración adecuado, dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la administración puede comprender la administración parenteral, oral, intraarterial, intraarticular, intravenal, intraocular, epidural, intratecal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intravaginal, rectal, tópica o administración subcutánea de la composición. En una realización, la invención proporciona un método para suministrar un polipéptido biológicamente activo de interés a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una dosis eficaz de una composición de acuerdo con la invención a dicho sujeto, en el que la composición está en forma de microesferas, un implante inyectable o un gel de formación in situ y en el que la composición se administra por vía intraocular, intraarterial, intramuscular o subcutánea.
Para la administración tópica, las microesferas pueden estar contenidas en un gel, crema o ungüento y, si se desea, pueden estar cubiertas por una barrera. Por tanto, las microesferas pueden contener uno o más compuestos biológicamente activos empleados en el tratamiento de enfermedades de la piel, tales como psoriasis, eccema, seborrea y dermatitis.
En otra realización, las microesferas pueden estar contenidas en un gel tal como un gel de ácido hialurónico o un gel de polisacárido macromolecular. Dicha realización es aplicable particularmente a aplicaciones parenterales, tal como durante y después de la cirugía.
Cuando se administran mediante inyección, las microesferas pueden estar contenidas en un portador farmacéutico como agua, solución salina (por ejemplo, 0.9 %) o una solución que contiene un tensioactivo en una cantidad desde 0.1 % p/v hasta 0.5% p/v. Ejemplos de tensioactivos que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo Tween 80. El portador farmacéutico puede contener adicionalmente un viscosificante, tal como carboximetilcelulosa de sodio.
Cuando se administran mediante inyección, las microesferas tienen un tamaño medio desde 1 pm hasta 200 pm, preferiblemente desde 5 pm hasta l00 pm, aún más preferiblemente desde 10 pm hasta 50 pm. Dichas microesferas, cuando se administran en combinación con un portador farmacéutico aceptable, se pueden emplear en el tratamiento de una variedad de enfermedades o trastornos, dependiendo del compuesto biológicamente activo que se encapsula. Por tanto, las formulaciones inyectables que incluyen las microesferas de la invención se pueden emplear en el tratamiento de enfermedades sistémicas tales como artritis reumatoide, hepatitis, diabetes o síndromes metabólicos, y enfermedades localmente confinadas tales como osteoartritis, enfermedades renales, inflamaciones, procesos de dolor local, infecciones locales, enfermedades locales de la piel, tumores (o sus sitios después de la extirpación quirúrgica como tratamiento posoperatorio para destruir cualquier célula tumoral que pueda quedar), cáncer de próstata o de mama, agromegalia, enfermedades oculares tales como la degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades cerebrales locales (por ejemplo, enfermedad de Parkinson) y enfermedades cardiovasculares tales como infarto agudo de miocardio, insuficiencia cardíaca crónica o arteroesclerosis. Dichas formulaciones inyectables también se pueden emplear en tratamientos terapéuticos a largo plazo tales como, por ejemplo, tratamientos con corticosteroides, andrógenos, antiandrógenos, estrógenos, antiestrógenos, agentes progestágenos u hormonas tiroideas, o con antituberculosos, antileprosos o fármacos contra la malaria.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1A: Termogramas DSC de 50LP10L20-LL40
Fig. 1B: Termogramas DSC de 30LP30L40-LL40
Fig. 1C: Termogramas DSC de 50CP10C20-LL40
Fig. 2: Liberación acumulada de lisozima de películas compuestas de 30LP10L20-LL40, 50LP10L20-LL40, 70LP10L20-LL40, 50CP10C20-LL40 y 30CP30C40-LL40. Las películas se cargaron con 10 % en peso de lisozima. La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 3: Liberación acumulada de albúmina de suero bovino (BSA) de películas compuestas por 30LP10L20-LL40, 50LP10L20-LL40, 70LP10L20-LL40, 30LP30L40-LL40 y 30CP30C40-LL40. Las películas se cargaron con 10% en peso de BSA. La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 4: Efecto de la composición del bloque hidrófilo de copolímeros multibloques sobre la liberación acumulativa de lisozima de las películas. Las películas estaban compuestas de 50LP10L20-LL40, 50GP10C20-LL40 o 50CP10C20-LL40 (25 % en peso de PEG1000) y se cargaron con 10 % en peso de lisozima. La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 5: Actividad de lisozima liberada de películas compuestas de 30LP10L20-LL40 o 50LP10L20-LL40 que contenían 10 % en peso de lisozima (37 °C, tampón de fosfato pH 7.4) y actividad de lisozima de soluciones de lisozima (0.01 % en peso, tampón de fosfato pH 7.4) almacenado a 4 y 37 °C en función del tiempo (n = 3).
Fig. 6: Liberación in vitro de BSA de microesferas compuestas por 30LP10L20-LL40 y 50CP10C20-LL40 cargadas con 3-4 % en peso de BSA a 37°C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 7: Liberación in vitro de IGF-1 de películas de 50c P30C40-l L40 y 30CP30C40-LL40 cargadas con IGF-1 elaboradas mediante fundición con solvente de W/O. La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.2 (n = 3). Las líneas continuas representan la liberación de IGF-1 medida por UPLC. Las líneas de puntos representan la liberación de IGF-1 medida por ELISA.
Fig. 8: Foto SEM de microesferas de 50CP10C20-LL40 cargadas con 0.2 % en peso de IGF-1 preparadas a través de una ruta de emulsión doble W/O/W.
Fig. 9: Liberación in vitro de IGF-1 a partir de microesferas cargadas con 0.2 % en peso de IGF-1 preparadas de 50CP10C20-LL40 con diferentes IV. La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.2 (n = 3 ).
Fig. 10: Resultados de SDS PAGE de IGF-1 liberado de microesferas de 50CP10C20-LL40 con 0.2% en peso de carga objetivo de IGF-1 y preparado utilizando varias velocidades ultra-turrax después de 1 y 2 semanas.
Fig.11: Proteína A de liberación in vitro (MW 15000 Da) de películas compuestas por 20Lp10L20-LL40, 30LP6L20-LL40 y 30CP10C20-LL40 (contenido de Proteína A 5 % en peso; grosor de película 80-120 pm). La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 12: Foto SEM de 3-4 % en peso de microesferas cargadas con Proteína A compuestas de 30CP10C20-LL40 (IV 0.71 dl/g) preparadas utilizando varias cantidades de inulina en la fase acuosa interna A: 0 % de inulina, B: 2 % de inulina. 1. Información general. 2: Hacer un acercamiento.
Fig.13: Liberación in vitro de Proteína A de microesferas compuestas de 30CP10C20-LL40 al 3-4 % en peso de carga objetivo de Proteína A con opcionalmente 2 o 5 % en peso de inulina coencapsulada, a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 14: Liberación in vitro de Proteína A de microesferas compuestas de 30CP10C20-LL40 al 3-4 % en peso de carga objetivo de Proteína A y diferente polímero IV, a 37°C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 15: Resultados de SDS-PAg E de Proteína A liberada de microesferas de 30CP10C20-LL40 con 4 % en peso de Proteína A y 2 % en peso de carga objetivo de inulina después de 1 (carril 4), 7 (carril 7), 14 (carril 8) y 21 (carril 9) días. Carril 5: marcadores de peso molecular. Carril 6: Proteína A estándar. Tenga en cuenta que las manchas oscuras se deben a la coloración de las sales tampón de fosfato.
Fig. 16: Liberación in vitro de péptido A (MW 2500) de películas compuestas de 20LP10L20-LL40 (carga de péptido 5 y 10 % en peso; grosor de película 80-100 pm) cargadas. La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 17: Liberación in vitro del péptido A (MW 2500) a partir de microesferas compuestas por 20LP10L20-LL40 (tamaño de partícula 30 pm; carga de péptido 10 % en peso). La liberación se midió a 37 °C en tampón de fosfato pH 7.4 (n = 3).
Fig. 18 Liberación in vitro de rapamicina a partir de microesferas compuestas por varias mezclas de 20LP1020-LL40-y 10LP10L20-LL40.
Fig. 19 Imágenes SEM de microesferas 20LP1020-LL40 cargadas con goserelina preparadas a través del método W/O/O
Fig. 20 Liberación in vitro de goserelina a partir de microesferas 20LP1020-LL40 preparadas a través del método W/O/O
Ejemplos
En los siguientes ejemplos se sintetizaron y evaluaron varios copolímeros multibloques con separación de fases, semicristalinos, biodegradables, y se evaluaron para determinar sus características de procesamiento y liberación controlada. Los polímeros estaban compuestos por un segmento B duro cristalino a base de L-lactida con un punto de fusión (Tm) y un segmento A a base de poli(etilenglicol) (PEG) hidrófilo que tenía una temperatura de transición vítrea (Tg) que estaba por debajo de la temperatura corporal bajo condiciones fisiológicas. En los siguientes ejemplos, el PEG se indica con su peso molecular (MW). Por ejemplo, PEG1000 se refiere a PEG con MW 1000 g/mol.
Ejemplo 1:
En este ejemplo, se proporcionan procedimientos generales para la preparación de prepolímero de poli(DL-lactida-co-PEG) (A). Los monómeros se pesaron en una botella de tres cuellos bajo atmósfera de nitrógeno y se secaron a 50 °C en el caso de glicolida y D,L-lactida durante al menos 16 horas bajo presión reducida. El PEG se secó a 90 °C bajo presión reducida durante al menos 16 h. Se agregó PEG al (los) monómero(s) bajo atmósfera de nitrógeno. Posteriormente, se agregó octoato estannoso y la mezcla se agitó magnéticamente y se hizo reaccionar a 140 °C durante varios días. La 1H-RMN se realizó en una máquina de RMN VXR Unity Plus (Varian) que operaba a 300 MHz. El tiempo de espera di se fijó en 20 s, y el número de barridos fue 16. Los espectros se registraron desde 0 hasta 14 ppm. La conversión y el Mn del prepolímero se determinaron a partir de 1H-RMN. Se prepararon muestras de 1H-RMN al disolver 10 mg de polímero en 1 ml de cloroformo deuterado.
Ejemplo 2:
Este ejemplo describe la preparación de poli(DL-lactida-co-PEGiooo) (pLP10L20) con Mn 2000 g/mol. Se pesaron 149.84 gramos (1.04 mol) de D,L-lactida (Purac) y se agregaron 149.21 g (0.149 mol) de PEG MW 1000 (Ineos, grado PU). Se agregaron 71.6 mg de octoato estannoso (Sigma Corp) (relación molar monómero/catalizador = 5900) y la mezcla se agitó magnéticamente y se hizo reaccionar a 140 °C durante 245 h. El 1H-RMN mostró 94.8 % de conversión de monómero. El peso molecular calculado (Mn) de los pesos fue 2000 g/mol. El peso molecular según se determinó por 1H-RMN fue 1950 g/mol.
Ejemplo 3
Este ejemplo describe la preparación de poli(DL-lactida-co-PEG3000) (pLP30L40) con Mn 4000 g/mol. Se pesaron 50.35 g (0.349 mol) de D,L-lactida (Purac) y se agregaron 151.08 g (50.4 mmol) de PEG MW3000 (Sigma Corp). Se agregaron 37.5 mg de octoato estannoso (Sigma Corp) (relación molar monómero/catalizador = 4300) y la mezcla se agitó magnéticamente y se hizo reaccionar a 140 °C durante 90 h. El 1H-RMN mostró 93.4 % de conversión de monómero. El peso molecular calculado (Mn) de los pesos fue 4000 g/mol. El peso molecular según se determinó por 1H-RMN fue 3940 g/mol.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe la preparación de prepolímero de poli(£-caprolactona-co-PEG1000) (pCP10C20) con Mn 2000 g/mol. Se pesaron 100.81 g (0.101 mol) de PEG MW1000 (Ineos, grado PU) en una botella de tres cuellos bajo atmósfera de nitrógeno y se secó a 90 °C durante al menos 16 h bajo presión reducida. Se agregaron 101.76 g (0.892 mol) de £-caprolactona (Acros, previamente seca y destilada sobre CaH2 bajo presión reducida) al PEG bajo atmósfera de nitrógeno y la mezcla se calentó a 135 °C. Se agregaron 57.9 mg de octoato estannoso (Sigma Corp) (relación molar monómero/catalizador = 6200) y la mezcla se agitó magnéticamente y se hizo reaccionar a 135 °C durante 76 h. El 1H-RMN mostró 100 % de conversión de monómero. El peso molecular calculado (Mn) de los pesos fue 2010 g/mol. El peso molecular según se determinó por 1H-RMN fue 1950 g/mol.
Ejemplo 5
Este ejemplo describe la preparación del prepolímero poli(£-caprolactona-co-PEG3000) (pCP30C40) con Mn 4000 g/mol. Se pesaron 176.60 g (58.9 mmol) de PEG MW3000 (Ineos, grado PU grade) en una botella de tres cuellos bajo atmósfera de nitrógeno y se secó a 90 °C durante al menos 16 h bajo presión reducida. Se agregaron 59.4 g (0.520 mol) de £-caprolactona (Acros, previamente seca y destilada sobre CaH2 bajo presión reducida) al PEG bajo atmósfera de nitrógeno y la mezcla se calentó a 135 °C. Se agregaron 69.6 mg de octoato estannoso (Sigma Corp) (relación molar monómero/catalizador = 3000) y la mezcla se agitó magnéticamente y se hizo reaccionar a 135 °C durante 243 h. El 1H-RMN mostró 100 % de conversión de monómero. El peso molecular calculado (Mn) de los pesos fue 2010 g/mol. El peso molecular según se determinó por 1H-RMN fue 1950 g/mol.
Ejemplo 6
Este ejemplo describe la preparación de prepolímero poli(L-ácido láctico) (LL4000) con Mn = 4000 g/mol iniciado por 1,4-butanodiol (BDO). Se pesaron 399.89 g (2.77 mol) de L-lactida (Purac) en una botella de tres cuellos bajo atmósfera de nitrógeno y se secaron a 50 °C durante al menos 16 h bajo presión reducida. Se agregaron 9.36 g (0.104 mol) de BDO (Acros, previamente destilado bajo presión reducida) a la L-lactida bajo atmósfera de nitrógeno. Se agregaron 434 ml de dioxano (Acros, previamente seco y destilado sobre alambre de sodio) para disolver la L-lactida y BDO y la mezcla se calentó a 80 °C. Se agregaron 87.8 mg de octoato estannoso (Sigma Corp) (relación molar monómero/catalizador = 12800). La mezcla se agitó magnéticamente y se hizo reaccionar a 80 °C durante 50.6 h. El polímero se recuperó de dioxano mediante liofilización durante 72 h hasta una temperatura final de 50 °C. En caso de polímero disuelto en dioxano, primero se eliminó el dioxano bajo presión reducida a 50 °C. El 1H-RMN mostró 96.5 % de conversión de monómero. El peso molecular calculado (Mn) de los pesos fue 3940 g/mol. El peso molecular según se determinó por 1H-RMN fue 3900 g/mol. Después de liofilizar, se determinó el contenido de dioxano mediante 1H-RMN (300 MHZ, 50 mg de polímero disuelto en 1 ml de cloroformo deuterado, di = 30 s, 32 barridos). Se disolvieron 5 mg de dibromobenceno (Acros) en la muestra para la cuantificación del dioxano. Se encontró que el contenido de dioxano era 1193 ppm.
Ejemplo 7
Este ejemplo describe los procedimientos generales utilizados para la preparación de copolímeros multibloques. Se calentaron prepolímeros de £-caprolactona-co-PEG-co-£-caprolactona (CPC) o D,L-lactida-co-PEG-co-D,L-lactida (LPL) (Mn 2000 g/mol) a 50-80 °C hasta que se volvieron más líquidos. Las cantidades apropiadas de prepolímero LL4000 (Mn 4000 g/mol) y prepolímero de CPC o LPL se pesaron en una ampolla de vidrio con entrada de nitrógeno y se secaron a 50 °C durante al menos 48 h. Posteriormente, la ampolla de vidrio se suministró con un agitador mecánico. Se agregó 1,4-dioxano (Acros, destilado sobre sodio) hasta una concentración de polímero del 30% en peso y los contenidos de la ampolla se calentaron a 80 °C para disolver los prepolímeros. Se agregaron 0.900-0.990 equivalentes (con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) de diisocianato de 1,4-butano (Bayer, destilado a presión reducida) y la mezcla de reacción se agitó mecánicamente durante 16-22 h. Se agregó dioxano no destilado a una concentración de polímero del 20 % en peso para detener los grupos isocianato que no habían reaccionado. La mezcla de reacción se diluyó adicionalmente con dioxano no destilado hasta una concentración de polímero del 10 % en peso. La ampolla se enfrió a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió en una bandeja y se congeló a -18°C. Posteriormente, se eliminó el dioxano al colocar la mezcla de reacción congelada al vacío a 30 °C. El polímero se almacenó en un paquete sellado a -18 °C. Se analizó una pequeña parte del lote para determinar las propiedades térmicas (mDSC), el contenido de dioxano (cromatografía de gases), la viscosidad intrínseca y la composición del polímero (1H-RMN). El análisis térmico se realizó mediante Calorimetría Diferencial Modulada de Barrido (mDSC). Se pesaron muestras de 5 a 10 mg en una bandeja de DSC. La medición se realizó en un DSC Q1000- (TA Instruments) utilizando un programa de temperatura modulada. La amplitud se fijó en 1 °C, el período de modulación en 60 s y la tasa de calentamiento en 5 °C/min. Las muestras se calentaron de -80 °C a 100-200 °C (dependiendo del tipo de polímero). La viscosidad intrínseca se midió utilizando un Viscosímetro Ubbelohde (DIN), tipo 0C, 0a o I, Schott Gerate suministrado con un Viscosímetro Schott AVS-450 que incluye un baño de agua. Las medidas se realizaron en cloroformo a temperatura ambiente. La concentración de polímero en cloroformo era tal que la viscosidad relativa estaba en el rango de 1.2 a 2.0. El contenido de dioxano se determinó utilizando un método de espacio de cabeza GC-FID. Las mediciones se realizaron en un muestreador combinado GC-FID suministrado con una columna Agilent, DB-624/30 m/0.53 mm. Las muestras se prepararon en DMSO. El contenido de dioxano se determinó utilizando estándares de calibración de dioxano.
Ejemplo 8
Este ejemplo describe la preparación de
20(D,L-Lactida-co-PEG-i000-co-D,L-lactida)2000-80(L-lactida)4000 (20LP10L20-LL40). Se pesaron 42.02 g de prepolímero LL40 (Mn 4040 g/mol, 10.40 mmol) y 10.16 g de
prepolímero D,L-lactida-co-PEG1000-D,L-lactida (Mn 2000 g/mol, 5.08 mmol) y se disolvieron en 100 ml de 1,4-dioxano a 80 °C. Se agregaron 1.8466 g (13.2 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (0.851 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) con 20 ml de 1,4-dioxano. Después de 17 h la reacción se detuvo con 88 ml de dioxano no destilado y adicionalmente se diluyó con 255 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 9
Este ejemplo describe la preparación de
30(D,L-lactida-co-PEG-i000-co-D,L-lactida)2000-70(L-lactida)4000 (30LP10L20-LL40). Se pesaron 34.44 g de prepolímero LL40 (Mn 4020 g/mol, 8.57 mmol) y 14.95 g de prepolímero D,L-lactida-co-PEG-i000-D,L-lactida (Mn 2040 g/mol, 7.33 mmol) y se disolvieron en 100 ml de 1,4-dioxano a 80 °C. Se agregaron 2.7386 g (19.5 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (1.231 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) con 20 ml de 1,4-dioxano Después de 20 h la reacción se detuvo con 85 ml de dioxano no destilado y adicionalmente se diluyó con 240 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 10
Este ejemplo describe la preparación de
50(D,L-lactida-co-PEG-i000-co-D,L-lactida)2000-50(L-lactida)4000 (50LP10L20-LL40). Se pesaron 19.59 g de prepolímero LL40 (Mn 4060 g/mol, 4.83 mmol) y 19.57 g de prepolímero D,L-lactida-co-PEGiooo-D,L-lactida (Mn 2040 g/mol, 9.59 mmol) y se disolvieron en 78 ml de 1,4-dioxano a 80 °C. Se agregaron 2.0018 g (14.3 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (0.991 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) en 20 ml de 1,4-dioxano. Después de 20 h la reacción se detuvo con 67 ml de dioxano no destilado y adicionalmente se diluyó con 189 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 11
Este ejemplo describe la preparación de
70(D,L-lactida-co-PEG-i000-co-D,L-lactida)2000-30(L-lactida)4000 (70LP10L20-LL40). Se pesaron 8.59 g de prepolímero LL40 (Mn 4020 g/mol, 2.14 mmol) y 19.96 g de prepolímero D,L-lactida-co-PEG-i000-D,L-lactida (Mn 2040 g/mol, 9.78 mmol) y se disolvieron en 48 ml de 1,4-dioxano a 80 °C. Se agregaron 1.648 g (11.8 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (0.986 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) con 20 ml de 1,4-dioxano. Después de 21 h la reacción se detuvo con 49 ml de dioxano no destilado, y adicionalmente se diluyó con 147 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 12
Este ejemplo describe la preparación de 30(D,L-lactida-co-PEG3ooo-co-D,L-lactida)4ooo-70(L-lactida)4ooo (30LP30L40-LL40). Se pesaron 29.96 g de prepolímero l L4o (Mn 4o3o g/mol, 7.43 mmol) y 14.oi g del prepolímero D,L-lactida-co-PEGiooo-D,L-lactida (Mn 4000 g/mol, 3.50 mmol) y se disolvieron en 83 ml de 1,4-dioxano a 80 °C. Se agregaron 1.52 g (10.8 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (0.992 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) con 20 ml de 1,4-dioxano. Después de 21 h la reacción se detuvo con 74 ml de dioxano no destilado y adicionalmente se diluyó con 222 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 13
Este ejemplo describe la preparación de 50(£-caprolactona-co-PEG1ooo-co-£-caprolactona)2ooo-50(L-lactida)4ooo (50CP10C20-LL40). Se pesaron 24.34 g de prepolímero LL40 (Mn 4030 g/mol, 6.04 mmol) y 23.87 g del prepolímero £-caprolactona-co-PEG1ooo-£-caprolactona (Mn 2010 g/mol, 11.9 mmol) y se disolvieron en 95 ml de 1,4-dioxano a 80 °C. Se agregaron 2.4098 g (17.2 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (0.960 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) con 20 ml de 1,4-dioxano. Después de 18 h la reacción se detuvo con 82 ml de dioxano no destilado y adicionalmente se diluyó con 246 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 14
Este ejemplo describe la preparación de 30(£-caprolactona-co-PEG3ooo-co-£-caprolactona)4ooo-70(L-lactida)4ooo (30CP30C40-LL40). Se pesaron 35.84 g de prepolímero LL40 (Mn 4030 g/mol, 8.89 mmol) y 14.79 g del prepolímero £-caprolactonaco- PEG3ooo-£-caprolactona (Mn 4010 g/mol, 3.69 mmol) y se disolvieron en 100 ml de 1,4- dioxano a 80 °C. Se agregaron 1.7428 g (12.4 mmol) de diisocianato de 1,4-butano (0.988 equivalentes con respecto a los grupos hidroxilo del prepolímero) con 20 ml de 1,4-dioxano. Después de 18 h la reacción se detuvo con 83 ml de dioxano no destilado y adicionalmente se diluyó con 240 ml de dioxano no destilado. El dioxano se eliminó al colocar la mezcla de reacción congelada bajo vacío a 30 °C.
Ejemplo 15
Se analizaron los copolímeros multibloques sintetizados para determinar la composición química, el peso molecular y el contenido de dioxano residual. La Tabla 1 muestra los resultados del análisis recopilado para 20LP10L20-LL40, 30LP10L20-LL40, 50LP10L20-LL40, 70LP10L20-LL40, 30LP30L40-LL40, 50CP10C20-LL40, 30CP30C40-LL40. La composición real de los copolímeros, determinada por 1H-RMN a partir de las relaciones molares L/P y C/P, se parecía bien a la composición objetivo. Todos los polímeros tenían una viscosidad intrínseca entre 0.7 y 1.1 dl/g. Los contenidos de dioxano estaban muy por debajo de 1000 ppm, lo que indica una eliminación eficaz del dioxano mediante secado al vacío.
Los copolímeros multibloques se analizaron en cuanto a sus propiedades térmicas para confirmar su morfología con separación de fases. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La Figura 1 muestra termogramas DSC típicos de copolímeros multibloques 50LP10L20-LL40 (Figura 1A), 30LP30L40-LL40 (Figura 1B) y 50CP10C20-LL40 (Figura 1C). Todos los copolímeros multibloques exhibieron una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 120-133 °C, debido a la fusión del segmento LL40. Como se esperaba, la entalpía de fusión (AHm) del segmento de LLA40 cristalino aumentó al aumentar la cantidad del segmento. 70LP10L40-LL40, 50CP10C20-LL40 también exhibieron una Tm a aproximadamente 85 °C, que se atribuye a la fusión de cristales menos perfectos de LL40. Los copolímeros que contienen PEG3000 mostraron una Tm a aproximadamente 40 °C, debido a la fusión del PEG. La temperatura de transición vítrea (Tg) de los copolímeros multibloques está en general entre la del prepolímero (A) y el prepolímero (B), lo que indica la mezcla de fases del prepolímero amorfo (A) con el contenido amorfo de prepolímero (B). La Tg de los copolímeros multibloques de tipo LP10L20-LL40 aumentó desde -18 hasta 50 °C cuando se incrementó el segmento LLA40 de 30 a 80 % en peso. La Tg de estos copolímeros multibloques se encuentra entre aquella del prepolímero (A) (pLP10L20, Tg -37 °C) y el prepolímero (B) (LL40, Tg ~50 °C) y, por lo tanto, se atribuye a la mezcla de polilactida amorfa del bloque LL40 semicristalino y PEG. 50CP10C20-LL40 tenía una Tg de -48 °C, que se atribuye de manera similar a la mezcla de PEG amorfo, policaprolactona y polilactida. La Tabla 3 muestra el grado de hinchamiento de los copolímeros multibloques. Para medir las características de hinchamiento de los polímeros, se elaboraron películas de polímero al verter una solución de polímero al 13% en peso en diclorometano (aproximadamente 300 mg de polímero con 1.5 ml de diclorometano), sobre una placa de vidrio y esparciendo la solución de polímero con una cuchilla de fundición o vertido en un molde de Teflon™. El diclorometano se dejó evaporar lentamente durante la noche y el diclorometano residual se eliminó mediante secado al vacío a 20 °C. Las películas resultantes tenían un grosor de 100-200 pm. Para las pruebas de hinchamiento, se pesaron 15-40 mg de películas circulares con un diámetro de aproximadamente 25 mm y se sumergieron en un matraz que contenía 10 ml de tampón de fosfato pH 7.4 (ISO-15814). Las muestras se almacenaron en un horno a 37 °C. En cada punto de tiempo de muestreo, se recolectaron muestras y se eliminó el exceso de solución tampón de la superficie, después de lo cual se pesaron las muestras en una balanza de 4 decimales. Todas las pruebas se realizaron por duplicado. Se encontró que el grado de hinchamiento aumentaba gradualmente con el contenido de PEG de los copolímeros y con PEG MW a un contenido de PEG aproximadamente constante.
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Tabla 3: Composición e hinchamiento de los copolímeros multibloques 20LP10L20-LL40, 30LP10L20-LL40, 50LP10L20-LL40 70LP10L20-LL40 30LP30L40-LL40 50CP10C20-LL40 30CP30C40-LL40.
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Ejemplo 16
En este ejemplo, se evaluaron varios copolímeros multibloques con separación de fases hidrófilos descritos en los ejemplos anteriores para determinar sus características de liberación de proteínas utilizando albúmina de suero bovino (BSA, 69 kDa) y lisozima (14 kDa) como proteínas modelo.
Se prepararon películas cargadas de proteína que contenían 10 % en peso de proteína al mezclar aproximadamente 150 |jl de 20 % en peso de solución de proteína con 1.5 ml de diclorometano que contenía 300 mg de polímero durante 30 s con un Ultra turrax a 18000 rpm. La emulsión se esparció sobre una placa de vidrio con un cuchillo de fundición o se vertió en un molde de Teflon™. El diclorometano se dejó evaporar lentamente durante la noche y el diclorometano residual se eliminó mediante secado al vacío a 20 °C. Las películas resultantes tenían un grosor de 80-120 jm .
Para las pruebas de liberación, se pesaron 20 mg de película cargada con proteína y se sumergieron en viales que contenían 5 ml de tampón de fosfato pH 7.4 y se almacenaron en un horno a 37°C. En cada punto de muestreo, se tomó una muestra de 1 ml de medio de liberación y se reemplazó con 1 ml de tampón nuevo. El contenido de proteína de las muestras de liberación se determinó con un ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce) utilizando un lector de placas de 96 pocillos Easys Expert.
La actividad biológica de la lisozima liberada se midió mediante una prueba de lisis bacteriana. Las películas cargadas con lisozima se prepararon como se describió anteriormente. Se preparó una solución de 0.01 % en peso de lisozima para que sirviera como control al pesar 2.1 mg de lisozima y agregar 20 ml de tampón de fosfato. Las películas cargadas con lisozima se pesaron y se sumergieron en viales que contenían 5 ml de tampón de fosfato pH 7.4. Los viales que contenían películas cargadas con lisozima, de esta manera como soluciones de lisozima recién preparadas, se almacenaron en un horno a 37°C. En cada punto de muestreo, se muestreó de 1 ml de medio de liberación y se reemplazó con 1 ml de tampón nuevo. El contenido de proteína de las muestras de liberación se determinó mediante BCA como se describió anteriormente. La actividad de la lisozima (liberada) se determinó al seguir el cambio de turbidez a 450 nm durante 3 min de una dispersión de bacterias (Micrococcus lysodeikticus, Sigma, 0.21 mg/ml) a la que se agregaron 10 j l de muestra. Se utilizó un espectrómetro UV-VIS (Varian) para este propósito. Las muestras se diluyeron si era necesario para obtener una concentración de lisozima de 5-100 jg/ml. La actividad de la lisozima de las muestras se calculó al comparar la pendiente de las curvas obtenidas (la pendiente se relaciona con la actividad de la lisozima) con la pendiente de una curva obtenida con una solución de lisozima reciente.
Las Figuras 2 y 3 muestran la liberación de lisozima y albúmina de suero bovino respectivamente de las películas. Los resultados muestran que al cambiar el contenido de PEG y el PEG MW, se puede variar la tasa y el perfil de liberación. La lisozima se liberó durante períodos que variaban desde unos pocos días hasta aproximadamente 3 meses. Debido a su mayor tamaño, la tasa de liberación de BSA fue menor, lo que resultó en una liberación durante períodos que varían desde unos pocos días hasta aproximadamente 4 meses. Adicionalmente, la liberación de lisozima podría ajustarse al introducir diferentes (combinaciones de) monómeros adyacentes al grupo PEG en el bloque hidrófilo de los copolímeros multibloques. Los copolímeros multibloques resultantes (50LP10L20-LL40, 50GP10C20-LL40 y 50CP10C20-LL40) contenían 25 % en peso de PEG1000 y exhibían grados de hinchamiento similares, pero diferentes tasas de degradación que conducían a varios perfiles de liberación para la lisozima encapsulada. (Figura 4).
La Figura 5 muestra la actividad de la lisozima liberada a partir de 10 % en peso de películas cargadas con lisozima de 30LP10L20-LL40 o 50LP10L20-LL40 (tampón de fosfato pH 7.4, 37°C). Como control, se midió la actividad de la lisozima de 0.01 % en peso de las 4 soluciones de lisozima almacenadas a 4 o 37°C (tampón de fosfato pH 7.4). Los resultados muestran que la lisozima liberada de las películas durante un período de aproximadamente un mes retuvo su actividad biológica, lo que indica que la integridad estructural y la actividad biológica de la lisozima no solo se conservaron durante el proceso de encapsulación sino también durante la presencia a largo plazo de lisozima en la matriz de polímero hidratada e hinchada a 37 °C antes de su liberación.
Ejemplo 17
En este ejemplo se utilizaron copolímeros de tipo con separación de fases 30LP10L20-LL40 (IV 0.85 dl/g) y 50CP10C20-LL40 (IV 1.06 dl/g) para formular BSA en microesferas.
Se prepararon microesferas cargadas con BSA de copolímeros multibloques con separación de fase hidrófilos 50CP10C20-LL40 (IV 1.06 dl/g) y 30LP10L20-LL40 (IV 0.85 dl/g) mediante un método de evaporación de solvente utilizando procedimientos como se divulgó por Kissel et al. al., J. Contr. Rel. 1996, 39(2), 315-326 y Meinel et al., J. Contr. Rel. 2001, 70(1-2), 193-202. Se disolvió BSA (25-50 mg de) en aproximadamente 150 mg de agua ultrapura y se emulsionó con 2-3 ml de una solución de 50CP10C20-LL40 (15% p/v) o 30LP10L20-LL40 (23% p/v) en diclorometano durante 60 s utilizando un Ultra turrax IKA T18 operado a 20 000 rpm produciendo una emulsión de agua en aceite (W/O). La emulsión primaria de esta manera obtenida se emulsionó luego en aproximadamente 80­ 130 ml de agua UP que contenía 4.0 % en peso de PVA durante 30 s utilizando un Ultra turrax IKA T18 operado a 14000 rpm produciendo una emulsión agua en aceite en agua (W/O/W). La emulsión secundaria de esta manera obtenida se agitó suavemente durante 2 h a 600 rpm a temperatura ambiente. Debido a la evaporación del diclorometano, el polímero se precipitó de la solución para producir microesferas. Después de 3 h (el tiempo necesario para lograr la evaporación casi completa del diclorometano) las microesferas formadas se recolectaron por centrifugación y las microesferas se lavaron tres veces con 100-200 ml de una solución acuosa de 0.05 % en peso de Tween 20 en agua ultra-pura. Finalmente, se liofilizaron las microesferas.
Para las pruebas de IVR, 2 ml de tampón de fosfato 100 mM (pH 7.4, 0.02% en peso de NaN3) en el caso de microesferas de 30LP10L20-LL40 y tampón NaPi 25 mM (pH 7.2, NaCl 105 mM, 0.01 % en peso de Tween 80, 0.02 % en peso de NaN3) en el caso de microesferas de 50CP10C20-LL40 se agregaron a 20 mg de microesferas. La muestra se incubó a 37 °C y en cada punto de muestreo se tomaron 1.8 ml de muestra y se refrescaron con tampón de liberación. El contenido de BSA se midió con un ensayo de proteína BCA en el caso de microesferas de 30LP10L20-LL40 y con UPLC (eluyente A: 1 % en peso de TFA en agua UP, eluyente B: 0.085 % en peso de TFA en acetonitrilo, 95/5 v/v A/B a 5/95 A/B en 25 min) en el caso de microesferas de 50CP10C20-LL40.
La distribución del tamaño de partícula de las microesferas se midió mediante un contador Coulter. Se dispersaron aproximadamente 1 mg de microesferas en 50-100 ml de solución de Isotron II al agitar suavemente y se midió el tamaño de partícula con un contador Coulter equipado con una celda de medición de 100 pm.
El contenido de BSA de las microesferas se determinó al disolver 5-10 mg de microesferas, pesadas con precisión, en 5.0 ml de acetonitrilo. Después de la centrifugación, se eliminaron 4 ml de sobrenadante y se agregaron 5 ml de PBS. El contenido de BSA se midió con UPLC (eluyente A: 0.1 % en peso de TFA en agua UP, eluyente B: 0.1 % en peso de TFA en acetonitrilo, 90/10 v/v A/B a 10/90 v/v A/B en 4 min).
La Tabla 4 enumera el tamaño de partícula, la eficiencia de encapsulación (EE) de las microesferas cargadas con BSA preparadas. La Figura 6 muestra la liberación in vitro de BSA a partir de microesferas de 30LP 10L20-LL40 con 5 % en peso de carga objetivo de BSA y microesferas de 50CP10C20-LL40 con 10 % en peso de carga objetivo de BSA. Se liberó BSA de las microesferas de 30LP 10L20-LL40 durante casi 3 meses de forma lineal sin un estallido significativo. Las microesferas de 50CP10C20-LL40 liberan BSA durante casi ~3 meses de forma lineal sin un estallido significativo, donde después de una liberación más lenta sigue durante otros ~1.5 meses.
Tabla 4: Tamaño promedio de partícula, contenido de BSA y eficacia de encapsulación de microesferas de 50CP10C20-LL40 30LP10L20-LL40 car adas con BSA.
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Ejemplo 18
En este ejemplo, se utilizaron varios copolímeros multibloques separados en fase hidrófilos preparados como se describe en los ejemplos anteriores para preparar formulaciones de película y microesferas cargadas con factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-1).
Las películas cargadas con IGF-1 se prepararon mediante la disolución de 0.18 g de polímero en 1.46 g de diclorometano y la posterior emulsión mediante Ultra turraxing con IGF-1 disuelto en agua ultrapura a 18 000 rpm durante 30 s o utilizando ultrasonidos a 100 W durante 5 s. La emulsión se vertió en un molde de Teflon™. El diclorometano se dejó evaporar durante la noche y el diclorometano residual se eliminó mediante secado al vacío durante la noche. Se cortaron películas de 20 mg y se liberaron a 37°C con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, 25 M pH 7.2, NaCl 105 mM, 0.01 % en peso de Tween 80 y 0.02 % en peso de NaN3). En puntos de tiempo predeterminados, se tomaron muestras y la cantidad muestreada se refrescó con tampón reciente.
Las microesferas cargadas con IGF-1 se prepararon mediante un proceso de emulsificación W/O/W basado en extracción con solvente/evaporación. Se disolvieron 2.78 mg de IGF-1 y 51.8 mg de BSA en 143 ml de agua UP en una taza Eppendorf y se emulsionaron en una solución de 0.47 g de 50CP10C20-LL40 (IV 1.05 dl/g) en 2.62 g de diclorometano utilizando un Ultra turrax (20000 rpm, 60 s). La emulsión primaria de esta manera obtenida se emulsionó luego en 81 ml de agua UP que contenía 4.0 % en peso de PVA utilizando una Ultra turrax (14000 rpm durante 60 s), y se agitó durante 2 ha 600 rpm a temperatura ambiente. Las microesferas resultantes se recolectaron en un filtro de membrana de 5 |jm y se lavaron con 11 de agua UP que contenía 0.05 % en peso de Tween 80. Finalmente, las microesferas se liofilizaron.
Se dispersaron aproximadamente 1 mg de microesferas en 50-100 ml de solución de Isotron II al agitar suavemente y se midió el tamaño de partícula con un contador Coulter equipado con una celda de medición de 100 jm .
El contenido de IGF-1 y BSA se determinó al disolver 5 mg de microesferas, pesadas con precisión, en 0.3 ml de acetonitrilo. Posteriormente, se agregaron 1.2 ml de PBS y se agitó suavemente. Después de la centrifugación, se determinaron el contenido de IGF-1 y BSA en el sobrenadante mediante UPLC. El procedimiento se realizó por triplicado.
Utilizando un ELISA tipo intercalado comercial (R&D Systems), se midió la concentración de Factor de Crecimiento I similar a la insulina humana (IGF-1) en una muestra para confirmar que el IGF-1 microencapsulado y liberado todavía era capaz de unirse con el anticuerpo de captura y detección después de la liberación y, por tanto, no se ha producido degradación de proteínas a ese nivel. El anticuerpo de captura y detección del kit fue específico para IGF-1 natural y recombinante y como IGF-1 recombinante estándar.
Para investigar la integridad estructural del IGF-1 liberado, se desnaturalizaron 100-300 ng de IGF-1 recolectados de las muestras de liberación utilizando tampón Laemli/p-mercapto-etanol y se cargaron sobre un minigel prefundido de 'cualquier KD TGX' y se separó bajo condiciones de desnaturalización a 100-200 V utilizando 1 X Tris/glicina/SDS como tampón de separación, y se tiñó durante la noche en agente de tinción CBB coloidal. Se utilizó un marcador Dual Xtra Protein (Bio-Rad) para determinar el tamaño de la proteína de las proteínas separadas.
La Figura 7 muestra la liberación in vitro de IGF-1 a partir de películas de polímero 50CP30C40-LL40 y 30CP30C40-LL40 cargadas con 0.6 % en peso de IGF-1 medido por UPLC y ELISA. Se liberó IGF-1 de las películas de 50CP30C40-LL40 en aproximadamente 7 días, mientras que IGF-1 se liberó lentamente de las películas de polímeros 30CP30C40-LL40 con una liberación acumulada de aproximadamente 40 % después de 28 días. Dado que la liberación acumulada de IGF-1 medida por UPLC fue casi idéntica a la liberación acumulada de IGF-1 medida por ELISA, se concluyó que el IGF-1 liberado estaba estructuralmente intacto y biológicamente activo.
Se prepararon microesferas con 0.5% en peso de cargas objetivo de IGF-1 de 50CP10C20-LL40 con IV 1.05 y 0.68 dl/g mediante un proceso de emulsificación doble. Las microesferas tenían una superficie lisa (Figura 8) y eficiencias de encapsulación que variaban entre el 40 y el 60 %. El tamaño de partícula promedio en volumen (d50) medido con un contador Coulter equipado con una celda de medición de 100 jm fue de 54.4 jm con un CV (coeficiente de variación) del 61 %. La Figura 9 muestra la liberación de IGF-1 de estas microesferas in vitro. Se obtuvo la liberación completa de IGF-1 en 2 días para microesferas compuestas de 50CP10C20-LL40 con IV 0.68 dl/g. La liberación de IGF-1 a partir de microesferas compuestas de 50CP10C20-LL40 con IV 1.05 dl/g fue más lenta y se logró la liberación completa después de aproximadamente 6 días. El IGF-1 liberado estaba estructuralmente intacto, como se pudo concluir a partir de los resultados de SDS-PAGE (Figura 10), que no mostró ninguna degradación ni agregación de la proteína.
Ejemplo 19
En este ejemplo, varios copolímeros multibloques con separación de fases hidrófilos (20LP10L20-LL40 (IV 0.58 dl/g), 30LP6L20-LL40 (IV 0.60 dl/g) y 30CP10C20-LL40 (IV 0.71 dl/g)) preparados como se describió en los ejemplos anteriores se utilizaron para preparar formulaciones de película cargadas con un polipéptido biológicamente activo altamente soluble en agua con un peso molecular de 15 kDa (Proteína A). Adicionalmente, se utilizaron copolímeros multibloques 30CP10C20-LL40 con varios IV (0.81, 0.71 y 0.65 dl/g) para formular la Proteína A en formulaciones de microesferas.
Se prepararon películas cargadas con Proteína A mediante un método de fundición con solvente. Se disolvieron 10 mg de Proteína A en 123 mg de agua UP y se emulsionaron en una solución de 0.18 g de polímero en 1.46 g de diclorometano utilizando un Ultra turrax (18 000 rpm, 60 s). La emulsión primaria de esta manera obtenida se vertió en un molde de Teflon™ y el diclorometano se evaporó durante la noche. El diclorometano residual se eliminó mediante secado al vacío.
Se prepararon microesferas cargadas con Proteína A mediante un proceso de emulsificación w/O/W basado en extracción/evaporación con solvente. Se disolvieron 21 mg de Proteína A (5 % en peso de carga objetivo) en 156 j l de agua UP que contenía opcionalmente inulina en una taza Eppendorf y se emulsionó en una solución de 0.4 g de polímero en 2.1 g de diclorometano utilizando un Ultra turrax (20000 rpm, 60 s). La emulsión primaria de esta manera obtenida se emulsionó luego en 70 ml de agua UP que contenía 4.0 % en peso de PVA utilizando un ultraturrax (14 000 rpm durante 60 s) y se agitó durante 2 h a 600 rpm a temperatura ambiente. Las microesferas resultantes se recolectaron en un filtro de membrana de 5 jm y se lavaron tres veces con 100 ml de agua UP que contenía 0.05 % en peso de Tween 80. Finalmente, las microesferas se liofilizaron.
Se dispersaron aproximadamente 10 mg de microesferas en 50-100 ml de solución de Isotron II al agitar suavemente y se midió el tamaño de partícula con un contador Coulter equipado con una celda de medición de 100 pm.
El contenido de Proteína A se determinó al disolver 5 mg de microesferas, pesadas con precisión, en 0.3 ml de acetonitrilo. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y se evaporó el ACN residual. Se agregó 1.95 ml de PBS. El contenido de Proteína A se midió con UPLC (eluyente A: 0.1 % en peso de TFA en agua UP, eluyente B: 0.1 % en peso de TFA en acetonitrilo, 80/20 v/v A/B a 10/90 A/B en 3 min).
Para la formación de imágenes SEM, se adhirió una pequeña cantidad de microesferas a una cinta conductora de carbono y se recubrió con oro durante 3 min. Se obtuvieron imágenes de la muestra utilizando un haz de electrones de 10 kV.
Se midió la cinética de liberación in vitro de películas y microesferas cargadas con Proteína A en 100 mM de tampón de fosfato pH 7.4 (20 mg de película en 2 ml). Las muestras se incubaron a 37 °C. En cada punto de muestreo, se tomaron 1.8 ml de muestra y se renovó con 1.8 ml de tampón de fosfato. El contenido de Proteína A se midió con UPLC (eluyente A: 0.1 % en peso de TFA en agua UP, eluyente B: 0.1 % en peso de TFA en acetonitrilo, 80/20 v/v A/B a 10/90 A/B en 3 min).
Se realizó SDS-PAGE en modo reductor con 4-20 % de geles de Tris-HCl. Por ranura, se aplicaron 20 pl de solución de proteína para las muestras y el estándar de Proteína A. Para el marcador, se aplicaron 2 pl en la ranura. La cantidad de proteína agregada por ranura fue de 75 o 150 ng. Las muestras se prepararon mediante dilución con PBS 12 mM pH 7.4 o agua UP hasta una concentración de Proteína A de 150 o 300 ng/20 pl. Posteriormente, se agregó solución de trabajo de Laemmli (tampón de Laemmli que contenía 1 % de mercaptoetanol) en una relación de 1: 1 v/v. Las muestras se calentaron a ~90 °C durante 5 min y se aplicaron a los geles. Los geles se sujetaron en la celda de electroforesis y se agregó tampón de funcionamiento (Tris/Glicina/SDS pH 8,3). Las muestras y los estándares se aplicaron a los geles y los geles se procesaron durante 15 min a 100 kV. Posteriormente se fijó el voltaje en 200 kV y se pasaron los geles hasta que se obtuvo una buena separación de los patrones de peso molecular. Los geles se lavaron con agua UP y se tiñeron con reactivo de plata.
La Figura 11 muestra la liberación in vitro de la Proteína A de 20LP10L20-LL40 (10 % en peso de PEG MW 1000), 30LP6L20-LL40 (9 % en peso de PEG MW 600) y 30CP10C20-LL40 (15 % en peso de PEG MW 1000). Las películas basadas en 30CP10C20-LL40 liberaron Proteína A relativamente rápido con una liberación acumulada de Proteína A del 100% después de 3 meses. Al reemplazar PEG1000 por PEG600, que conduce a la reducción del grado de hinchamiento, la liberación de Proteína A se podría ralentizar y se obtuvieron cinéticas de liberación controlada por difusión de primer orden que condujeron a una liberación acumulada de ~75 % después de 4 meses. La reducción de la tasa de liberación de la Proteína A también se podría lograr al reducir la fracción en peso del bloque LP10L20 hidrófilo en el polímero. Al utilizar 20LP10L20-LL40 (10 % en peso de PEG1000), la liberación podría ralentizarse aún más y, después de una pequeña explosión inicial de menos del 15%, se obtuvo una cinética de liberación bien controlada de la Proteína A con una liberación acumulada de ~65 % en 6 meses. Los datos muestran claramente que la cinética de liberación de la Proteína A se puede controlar mediante la elección del polímero.
Se prepararon microesferas cargadas con Proteína A de 30CP10C20-LL40 cargadas con 3-4 % en peso de Proteína A. Opcionalmente, se co-encapsuló 2 o 5 % en peso de inulina para mejorar la tasa de liberación de la Proteína A. El efecto del peso molecular del polímero sobre la cinética de liberación de proteínas se estudió al estudiar la cinética de liberación de la Proteína A a partir de microesferas compuestas por polímeros 30CP10C20-LL40 con diferente viscosidad intrínseca. Para todas las microesferas cargadas con Proteína A, se obtuvieron microesferas esféricas. Para microesferas con inulina coencapsulada, la porosidad de la superficie aumentó al aumentar el contenido de inulina, como se muestra en las imágenes SEM en la Figura 12. La Tabla 5 enumera el tamaño de partícula y la eficiencia de encapsulación (EE) de la Proteína A de las microesferas. La Figura 13 muestra que después de un pequeño estallido inicial, la Proteína A se liberó a una velocidad constante. Se observó que el estallido disminuyó y la linealidad aumentó con la disminución del contenido de inulina. Sin inulina presente, aproximadamente el 70 % se liberó en 3 meses, mientras que el 90-100 % se liberó cuando se coencapsuló 2 o 5 % en peso de inulina. La liberación de Proteína A de las películas de 30CP10C20-LL40 que contenían 2 o 5 % en peso de inulina coencapsulada fue similar. Los datos de liberación se muestran hasta ~4 meses. La duración prevista de la liberación de la Proteína A de las microesferas de 30CP10C20-LL40 es de aproximadamente 6 meses.
La Figura 14 muestra la cinética de liberación de la Proteína A de películas de 30CP 10C20-LL40 con diferente viscosidad intrínseca (IV) del polímero. La tasa de liberación de la Proteína A aumentó al aumentar el polímero IV. Para los polímeros 30CP 10C20-LL40 con una IV de 0.71 o 0.81 dl/g, se obtuvo una liberación sostenida de Proteína A con una liberación acumulada del 60-70 % después de 2 meses. La cinética de liberación de la Proteína A de las microesferas compuestas por 30CP 10C20-LL40 con una VI de 0.58 dl/g fue significativamente diferente. La tasa de liberación inicial hasta un mes fue significativamente menor, pero la liberación de Proteína A se aceleró entre 1 y 3 meses, donde luego se desaceleró nuevamente, dando una duración total de liberación de aproximadamente 5 meses. Los datos muestran claramente que la Proteína A se puede liberar de las microesferas de forma lineal durante al menos 4 meses y que la cinética de liberación se puede controlar mediante la coencapsulación de azúcares, tales como la inulina, de esta manera como mediante la viscosidad intrínseca del polímero.
La integridad estructural de la Proteína A liberada de las microesferas se estudió mediante SDS-PAGE. SDS-PAGE confirmó que la Proteína A liberada durante al menos 21 días consistía principalmente en Proteína nativa (Figura 15). Estos resultados muestran que las microesferas de 30CP10C20-LL40 proporcionan una matriz adecuada para la liberación a largo plazo de la Proteína A estructuralmente intacta.
Tabla 5: Descripción general de las características de las microesferas cargadas con Proteína A con 3-4 % en peso r iv Pr ín A.
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Ejemplo 20
En este ejemplo se utilizó el copolímero multibloques con separación de fases hidrófilo 20LP10L20-LL40 (IV 0.73 dl/g) preparado como se describe en los ejemplos anteriores para preparar formulaciones de películas y microesferas cargadas con un polipéptido biológicamente activo con un peso molecular de 2.5 kDa (Péptido A).
Se prepararon películas cargadas con péptido A mediante un método de fundición con solvente. Se disolvieron 10 (para una carga del 5 % en peso) o 20 mg (para una carga del 10 % en peso) del Péptido A en 123 mg de agua UP y se emulsionó en una solución de 0.18 g de 20LP10L20-LL40 (IV 0.76 dl/g) en 1.46 g de diclorometano utilizando un Ultra turrax (18 000 rpm, 30 s). La emulsión primaria de esta manera obtenida se vertió en un molde de teflón y el diclorometano se evaporó durante la noche. El diclorometano residual se eliminó mediante secado al vacío.
Se prepararon microesferas cargadas con Péptido A mediante un proceso de doble emulsión basado en evaporación de solvente. Se disolvieron 50 mg de péptido A en PBS y se emulsionaron en una solución de 0.5 g de 20LP10L20-LL40 (IV 0.73 dl/g) en 2 g de diclorometano utilizando un Ultra turrax (24000 rpm, 60 s). La emulsión primaria de esta manera obtenida se emulsionó luego en 200 ml de agua UP que contenía 4.0 % en peso de alcohol polivinílico utilizando un ultraturrax (14 000 rpm durante 30 s) y se agitó durante 3 h a 600 rpm a temperatura ambiente. Las microesferas resultantes se centrifugaron, el sobrenadante se eliminó y las microesferas se lavaron tres veces con 200 ml de agua UP que contenía 0.05 % en peso de Tween 20. Finalmente, las microesferas se liofilizaron. La distribución del tamaño de partícula se midió con un contador Coulter. Se dispersaron aproximadamente 10 mg de microesferas en 50-100 ml de solución de Isotron II al agitar suavemente y se midió el tamaño de partícula con una celda de medición de 100 pm.
El contenido del Péptido A de microesferas se determinó al disolver 5-10 mg de microesferas, pesadas con precisión, en 5.0 ml de acetonitrilo. Después de la centrifugación, se eliminaron 4 ml de sobrenadante y se agregaron 5 ml de PBS. El contenido de péptido A se midió con HPLC (eluyente A: 1 % en peso de TFA en agua Up , eluyente B: 0.085 % en peso de TFA en acetonitrilo, 95/5 v/v A/B a 5/95 A/B en 25 min).
Se midió la cinética de liberación in vitro del Péptido A de películas y microesferas en PBS pH a 37°C. Se pesaron películas o microesferas que contenían péptido A (5-20 mg) en un vial y se agregaron 2 ml de PBS. Los viales se incubaron a 37 °C y se muesrearon en puntos de tiempo predeterminados. En cada punto de muestreo, se recolectó el 75-90 % del medio de liberación y se reemplazó por PBS fresco. El contenido de péptido A de las muestras de liberación se determinó con HPLC (eluyente A: 1 % en peso de TFA en agua UP, eluyente B: 0.085 % en peso de TFA en acetonitrilo, 95/5 v/v A/B a 5/95 A/B en 25 min).
La Figura 16 muestra la liberación in vitro del Péptido A de películas de 20LP 10L20-LL40. El péptido A se liberó de películas de 20LP 10L20-LL40 cargadas al 5 % en peso de forma lineal durante al menos 5 meses sin un estallido significativo. Para las películas 20LP 10L20-LL40 con una carga de Péptido A más alta (10 % en peso), la liberación por estallido aumentó al 15 %. Después de aproximadamente 2 meses, la liberación fue similar a las películas cargadas al 5 % en peso.
Las microesferas 20LP 10L20-LL40 cargadas con Péptido A tenían un tamaño medio de partícula de 30 pm y un contenido de Péptido A de 10.3 % en peso, lo que representa una eficacia de encapsulación del 100 %. La Figura 17 muestra que el Péptido A MSP exhibió una liberación de estallido baja de aproximadamente el 10 % en peso seguido de una cinética de liberación de orden cero durante al menos 40 días.
Ejemplo 21
En este ejemplo, se utilizaron copolímeros multibloques con separación de fases hidrófilos 20LP10L20-LL40 (Ejemplo 8) y 10LP10L20-LL40 para preparar microesferas cargadas con rapamicina (MW 914 Da). El componente de polietilenglicol de los polímeros tenía un peso molecular de 1000 g/mol.
Se prepararon microesferas cargadas con rapamicina con una carga objetivo de 20 % en peso de rapamicina mediante un método de evaporación de solvente utilizando una única ruta de emulsión de aceite en agua (O/W). Los polímeros se disolvieron en diversas relaciones de mezcla en diclorometano hasta una concentración de aproximadamente 20 % en peso y se agregó la cantidad requerida de rapamicina. La solución de polímero/rapamicina se emulsionó luego en 200 ml de agua UP que contenía 4.0 % en peso de alcohol polivinílico (PVA) utilizando un Ultra turrax (14000 rpm durante 30 s), y luego se agitó con un agitador magnético durante 3 h a 300 rpm a temperatura ambiente. La dispersión de microesferas se concentró por centrifugación y las microesferas se lavaron tres veces con 50 ml de solución acuosa de 0.05 % en peso de Tween 20. Finalmente, se liofilizaron las microesferas.
La distribución del tamaño de partícula se midió con un Contador Coulter. Se dispersaron aproximadamente 10 mg de microesferas en 50-100 ml de solución de Isotron II al agitar suavemente y se midió el tamaño de partícula con una celda de medición de 100 pm.
El contenido de rapamicina de las microesferas se determinó al disolver 5-10 mg de microesferas, pesadas con precisión, en 5.0 ml de acetonitrilo. Después de la centrifugación, se eliminaron 4 ml de sobrenadante y se agregaron 5 ml de PBS. El contenido de rapamicina se midió con HPLC (eluyentes: acetonitrilo/agua 70/30 v/v; 278 nm).
Se midió la cinética de liberación in vitro de rapamicina a partir de microesferas a 37°C en PBS 10 mM pH 7.4 que contenía 0.5% en peso de SDS. Se pesaron microesferas que contenían rapamicina (5-20 mg) en un vial y se agregaron 2 ml de medio de liberación. Los viales se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras en puntos de tiempo predeterminados. En cada punto de muestreo, se recogió el 75-90 % del medio de liberación y se reemplazó por p Bs fresco. El contenido de rapamicina de las muestras de liberación se determinó con HPLC.
Las microesferas de rapamicina de esta manera preparadas tenían un tamaño promedio de 35 pm y un contenido de rapamicina que variaba desde 17 hasta 20 % en peso, lo que representaba eficiencias de encapsulación del 89 % al 100 %. La Figura 18 muestra la liberación de rapamicina a partir de microesferas compuestas por varias mezclas de 20LP10L20-LL40 y 10LP10L20-LL40. La liberación de rapamicina a partir de microesferas basadas en 20LP10L20-LL40 fue relativamente rápida, mientras que la liberación de rapamicina a partir de microesferas basadas en 10LP10L20-LL40 fue muy lenta. Al mezclar los dos polímeros se obtuvieron microesferas con perfiles de liberación intermedios.
Ejemplo 22
En este ejemplo, se prepararon microesferas cargadas con acetato de goserelina del copolímero multibloques con separación de fases hidrófilo 20LP10L20-LL40 por medio de un proceso de agua en aceite en aceite. Se disolvieron 62,6 mg de acetato de goserelina en 150 pl de agua UP (29,4 % en peso) y se emulsionó con una solución de 0.5 g de polímero 20LP10-LLA40 en 7.4 g de diclorometano en un vial de centelleo (Ultra turrax, 20 000 rpm, 60 s). A continuación, se agregaron lentamente 13.5 g del precipitante de polímero (aceite de silicona, 350 cSt) (2-5 min) bajo agitación constante (12 000 rpm) para formar micropartículas embrionarias. A continuación, se vertieron las micropartículas embrionarias en 550 ml de heptano a temperatura ambiente (relación 13.5:1 de diclorometano a solvente heptano). El recipiente de extracción se cerró para evitar una evaporación excesiva del medio de extracción. Después de aproximadamente 3 h de extracción, las micropartículas se recolectaron mediante filtración al vacío, se enjuagaron con más heptano y se secaron al vacío. Las microesferas tenían un tamaño promedio de 67 pm y un contenido de goserelina del 8.3 %, lo que representa una eficacia de encapsulación del 88 %.
La distribución del tamaño de partículas se midió con un Contador Coulter. Se dispersaron aproximadamente 10 mg de microesferas en 50-100 ml de solución de Isotron II al agitar suavemente y se midió el tamaño de partícula con una celda de medición de 100 pm.
El contenido de goserelina de las microesferas se determinó al disolver 5-10 mg de microesferas, pesadas con precisión, en 5.0 ml de acetonitrilo. Después de la centrifugación, se eliminaron 4 ml de sobrenadante y se agregaron 5 ml de PBS. El contenido de goserelina se midió con HPLC (eluyentes: agua/acetonitrilo/ácido trifluoroacético 72/28/0.1, 220 nm).
Se midió la cinética de liberación in vitro de goserelina a partir de microesferas en PBS (192 mM, pH 7.4, que contenía 0.01 % de Tween 80 y 0.02 % de azida de sodio) a 37°C. Se pesaron microesferas que contenían goserelina (5-20 mg) en un vial y se agregaron 2 ml de medio de liberación. Los viales se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras en puntos de tiempo predeterminados. En cada punto de muestreo, se recogió el 75-90 % del medio de liberación y se reemplazó por PBS fresco. El contenido de goserelina de las muestras de liberación se determinó con HPLC.
Las microesferas 20LP10-LLa40 cargadas con goserelina de esta manera preparadas tenían un aspecto esférico y liso (Figura 19), un tamaño promedio de 71 pm (CV 47 %) y un contenido de goserelina del 8.3 %, lo que representa una eficacia de encapsulación del 88 %. La Figura 20 muestra la liberación de goserelina de las microesferas.
Ejemplo 23
En este ejemplo, se prepararon microesferas cargadas con lisozima del copolímero multibloques con separación de fases hidrófilo 30CP10L20-LL40 por medio de un proceso sólido en aceite en aceite (S/O/O). Se disolvieron 0.43 g de 30CP10L20-LL40 en 7.4 g de diclorometano en un vial de centelleo (5.4% en peso) y se agregaron 0.074 g de micropartículas de lisozima estabilizadas con inulina secadas por aspersión (relación lisozima/inulina: 1: 2 p/p) con un tamaño de partícula de 1-2 pm a la solución de polímero y la dispersión se homogeneizó mediante Ultra turrax (20000 rpm, 60 s). A continuación, se agregaron lentamente 11.46 g del precipitante de polímero (aceite de silicona, 350 cSt) (2-5 min) bajo agitación constante (12000 rpm) para formar micropartículas embrionarias. A continuación, se vertieron las micropartículas embrionarias en 550 ml de heptano a temperatura ambiente (relación 13.5:1 de diclorometano a solvente heptano). El recipiente de extracción se cerró para evitar una evaporación excesiva del medio de extracción. Después de aproximadamente 3 h de extracción, las micropartículas se recolectaron mediante filtración al vacío, se enjuagaron con heptanos adicionales y se secaron mediante filtración al vacío. Las microesferas tenían un tamaño promedio de 59 pm y un contenido de lisozima del 4.1 al 5.6 %, lo que representa una eficacia de encapsulación del 80 al 100 %.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable, el copolímero se caracteriza porque:
a) comprende al menos un segmento de prepolímero hidrolizable (A) y al menos un segmento de prepolímero de poliéster hidrolizable (B), dicho segmento de prepolímero (A) contiene un polímero soluble en agua y es completamente amorfo a condiciones fisiológicas y tiene una Tg de 37 °C o menor bajo condiciones fisiológicas y dicho segmento de prepolímero (B) se basa en un polímero cristalino y tiene una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas,
b) dicho copolímero multibloques tiene una Tg de 37 °C o menor y una Tm de 110-250 °C bajo condiciones fisiológicas, en el que la Tm del copolímero multibloques es menor que la Tm del segmento de prepolímero (B);
c) los segmentos se conectan mediante un extensor de cadena multifuncional;
d) los segmentos se distribuyen de forma aleatoria sobre la cadena de polímero;
e) al menos parte del segmento de prepolímero (A) se deriva de un polímero soluble en agua,
en el que el segmento de prepolímero (A) es más hidrófilo que el segmento de prepolímero (B), y
en el que el contenido de prepolímero (B) es 10-90 % en peso en base al peso total del copolímero multibloques.
2. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho extensor de cadena es un extensor de cadena alifático difuncional, preferiblemente un diisocianato, tal como diisocianato de 1,4-butano.
3. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el prepolímero (A) comprende productos de reacción de monómeros cíclicos y/o monómeros no cíclicos, en el que dichos monómeros no cíclicos se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido sebácico, ácido láctico, ácido glicólico, ácido hidroxibutírico, etilenglicol, dietilenglicol, 1,4-butanodiol y/o 1,6-hexanodiol, y en el que dichos monómeros cíclicos se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en glicolida, lactida, £-caprolactona, 8-valerolactona, carbonato de trimetileno, carbonato de tetrametileno, 1,5-dioxepano-2-ona, 1,4-dioxano-2-ona (para-dioxanona) y/o anhídridos cíclicos tales como oxepano-2,7-diona.
4. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho polímero soluble en agua se selecciona del grupo que consiste en poliéteres tales como polietilenglicol (PEG), poli(óxido de tetrametileno) (PTMO) y polipropilenglicol (PpG); alcohol polivinílico (PVA) polivinilpirrolidona (PVP), polivinilcaprolactama, poli(metacrilato de hidroxietilo) (poli-(HEMA)), polifosfacenos, poliortoésteres, poliortoesteramidas o copolímeros de los polímeros previos, preferiblemente dicho polímero soluble en agua se deriva de poli(etilenglicol) (PEG) que tiene un Mn de 150-5000 g/mol.
5. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que un polímero soluble en agua está presente como un prepolímero adicional.
6. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho segmento de prepolímero (B) comprende un polímero cristalizable derivado de hidroxialcanoato, glicolida, L-lactida o D-lactida, preferiblemente dicho segmento de prepolímero (B) comprende prepolímeros de L-lactida y prepolímeros de D-lactida en tales cantidades y relación que se logra la estereocomplejación entre L-lactida y D-lactida, preferiblemente dicho prepolímero (B) es poli(L-ácido láctico) con un Mn de 1000 g/mol o más, preferiblemente 2000 g/mol o más, más preferiblemente 3000 g/mol o más.
7. Copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que tiene
i) una relación de hinchazón bajo condiciones fisiológicas que varía desde 1 hasta 4, más preferiblemente 1 a 2, aún más preferiblemente de 1 a 1.5; y/o
ii) una viscosidad intrínseca de al menos 0.1 dl/g, y preferiblemente entre 0.2 y 2 dl/g.
8. Proceso para preparar un copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende
i) realizar una reacción de extensión en cadena de prepolímero hidrolizable (A) y prepolímero de poliéster hidrolizable (B) en presencia de un extensor de cadena multifuncional, en el que el prepolímero (A) y (B) son ambos diol o diácido terminado y el extensor de cadena es ácido dicarboxílico o diol terminado; o
ii) realizar una reacción de extensión en cadena utilizando un agente de acoplamiento, en el que el prepolímero (A) y (B) son ambos diol o diácido terminado y el agente de acoplamiento es preferiblemente diciclohexil carbodiimida, en el que el prepolímero (A) contiene un polímero soluble en agua y es completamente amorfo en condiciones fisiológicas y tiene una Tg de 37 °C o menor bajo condiciones fisiológicas, y en el que el prepolímero (B) es cristalino y tiene una Tm de 110-250 °C según se mide a condiciones fisiológicas, y en el que al menos parte del prepolímero (A) se deriva de un polímero soluble en agua,
en el que el segmento de prepolímero (A) es más hidrófilo que el segmento de prepolímero (B), y en el que el contenido de prepolímero (B) en el copolímero multibloques es 10-90% en peso en base al peso total del copolímero multibloques.
9. Uso de un copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para suministro de fármaco, preferiblemente en la forma de microesferas, micropartículas, nanopartículas, nanoesferas, varillas, implantes, geles, recubrimientos, películas, hojas, pulverizadores, tubos, membranas, mallas, fibras, o tapones.
10. Una composición para el suministro de al menos un compuesto biológicamente activo a un anfitrión, que comprende al menos un compuesto biológicamente activo encapsulado en una matriz, en la que dicha matriz comprende al menos un copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho al menos un compuesto biológicamente activo es un fármaco de pequeño tamaño no peptídico ni proteico, en el que dicho fármaco de pequeño tamaño no peptídico ni proteico preferiblemente comprende uno o más seleccionados del grupo que consiste en un agente antitumoral, un agente antimicrobiano, una cefalosporina, un aminoglucósido, un macrólido, una tetraciclina, un agente quimioterapéutico, un antiséptico del tracto urinario, un fármaco para infecciones anaeróbicas, un fármaco para la tuberculosis, un fármaco para la lepra, un agente antifúngico, un agente antiviral, un agente antihelmintiasis, un agente antiinflamatorio, un agente antigota, un analgésico de acción central (opioide), un anestésico local, un fármaco para la enfermedad de Parkinson, un relajante muscular de acción central, una hormona o anti-agonista de hormona, un corticosteroide, un glucocorticosteroide, un andrógeno, un esteroide androgénico, un esteroide anabólico, un antiandrógeno, un estrógeno, un esteroide estrogénico, un antiestrógeno, una progestina, un fármaco para la tiroides y un fármaco antitiroideo.
12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que dicho al menos un compuesto biológicamente activo es un polipéptido biológicamente activo, en la que dicho polipéptido biológicamente activo preferiblemente comprende uno o más seleccionado del grupo que consiste en un fármaco de proteína/péptido, una enzima, un ligando del receptor, un neurotransmisor, un péptido inhibidor, un péptido regulador, un péptido activador, una citocina, un factor de crecimiento, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo monoclonal, un péptido antitumoral, un antibiótico, un antígeno, una vacuna y una hormona.
13. Composición de acuerdo con la reivindicación 10 o 11, en la que dicho compuesto biológicamente activo es una molécula pequeña no peptídica ni proteica que tiene Un Mn que tiene 1000 Da o menos, preferiblemente dicho copolímero multibloques contiene poli(etilenglicol), como un segmento del prepolímero (A) y/o como un prepolímero adicional, en el que dicho poli(etilenglicol)
i) tiene un peso molecular desde 200 hasta 1500 g/mol, preferiblemente desde 600 hasta 1000 g/mol; y/o ii) está presente en una cantidad desde 5 % en peso hasta 20 % en peso, preferiblemente desde 5 % en peso hasta 10 % en peso.
14. Composición de acuerdo con la reivindicación 10 o 12, en la que dicho compuesto biológicamente activo es un polipéptido biológicamente activo que tiene un peso molecular que es 10000 Da o menos,
preferiblemente dicho copolímero multibloques contiene poli(etilenglicol), como un segmento del prepolímero (A) y/o como un prepolímero adicional, y en el que dicho poli(etilenglicol)
i) tiene un peso molecular desde 400 hasta 3000 g/mol, preferiblemente desde 600 hasta 1500 g/mol; y/o ii) está presente en una cantidad desde 5 % en peso hasta 60 % en peso, preferiblemente desde 5 % en peso hasta 40 % en peso.
15. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 o 12, en la que dicho compuesto biológicamente activo es un polipéptido biológicamente activo que tiene un peso molecular de 10 000 Da o más, preferiblemente dicho copolímero multibloques contiene poli(etilenglicol), como un segmento del prepolímero (A) y/o como un prepolímero adicional, y en el que dicho poli(etilenglicol)
i) tiene un peso molecular de desde 600 hasta 5000 g/mol, preferiblemente desde 1000 hasta 3000 g/mol; y/o ii) está presente en una cantidad desde 5 % en peso hasta 70 % en peso, más preferiblemente desde 10 % en peso hasta 50 % en peso.
16. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en la forma de microesferas, micropartículas, nanopartículas, nanoesferas, varillas, implantes, geles, recubrimientos, películas, hojas, pulverizadores, tubos, membranas, mallas, fibras, o tapones, preferiblemente dicha composición está en la forma de microesferas y/o micropartículas, en la que el diámetro promedio de las microesferas y/o micropartículas está preferiblemente en el rango de 0.1-1000 pm, más preferiblemente en el rango de 1-100 pm, incluso más preferiblemente en el rango de 10-50 pm.
17. Composición de acuerdo con la reivindicación 16, en la que el compuesto biológicamente activo se disuelve o se dispersa a través de la matriz de polímero o en la que la microesfera comprende un reservorio en el que está contenido el compuesto biológicamente activo, rodeado por un polímero en estado mononuclear o polinuclear.
18. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-17 para tratar artritis reumatoide, hepatitis, diabetes, síndromes metabólicos, osteoartritis, enfermedad renal, inflamación, procesos de dolor local, infecciones locales, enfermedades locales de la piel, tumores (o sus sitios después de la extirpación quirúrgica como tratamiento posoperatorio para destruir cualquier célula tumoral que pueda quedar), cáncer de próstata o de mama , acromegalia, enfermedades oculares tales como degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades cerebrales locales tales como enfermedad de Parkinson, y enfermedades cardiovasculares tales como infarto agudo de miocardio, insuficiencia cardiaca crónica o artroesclerosis.
19. Un método para suministrar un compuesto biológicamente activo a un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una dosis efectiva de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-17 a dicho sujeto.
20. Un método para fabricar una composición de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, que comprende
I) las etapas sucesivas de
la) emulsificar una solución acuosa de un compuesto biológicamente activo soluble en agua en una solución de un copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un solvente orgánico, tal como diclorometano o acetato de etilo;
lb) posteriormente emulsificar la emulsión resultante de a) en una solución acuosa que comprende un tensioactivo tal como alcohol polivinílico, produciendo de esta manera una emulsión de agua en aceite en agua (W/O/W); y lc) extraer el solvente orgánico para solidificar microesferas;
II) las etapas sucesivas de
lla) dispersar el compuesto biológicamente activo como un polvo sólido en una solución de un copolímero multibloques termoplástico, separado en fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un solvente orgánico, tal como diclorometano o acetato de etilo;
llb) emulsificar la dispersión resultante de a) en una solución acuosa que comprende un tensioactivo tal como alcohol polivinílico, produciendo de esta manera una emulsión de sólido en aceite en agua (S/O/W); y
llc) extraer el solvente orgánico para solidificar las microesferas;
III) las etapas sucesivas de
llla) emulsificar una solución acuosa de un compuesto biológicamente activo soluble en agua en una solución de un copolímero multibloques termoplástico, con separación de fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un solvente orgánico, tal como diclorometano o acetato de etilo;
lllb) agregar un precipitante de polímero, tal como aceite de silicona, a la emulsión resultante de a) para formar micropartículas embriónicas; y
lllc) extraer el precipitante de polímero y el solvente orgánico para solidificar las microesferas; o
IV) las etapas sucesivas de
IVa) dispersar el compuesto biológicamente activo como un polvo sólido en una solución de un copolímero multibloques termoplástico, separado en fases, semicristalino, biodegradable de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un solvente orgánico, tal como diclorometano o acetato de etilo;
IVb) agregar un precipitante de polímero, tal como aceite de silicona, a la dispersión resultante de a) para formar micropartículas embriónicas; y
IVc) extraer el precipitante de polímero y el solvente orgánico para solidificar las microesferas.
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