ES2900852T3 - Métodos de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco, en particular anticuerpos anti-fármaco que se presentan durante el tratamiento - Google Patents

Abstract

Método de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta en una muestra, que ha sido obtenido de un sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula y en donde la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula se ha administrado a un sujeto según un régimen que es tal que existe un riesgo o posibilidad de que se hayan producido anticuerpos anti-fármaco contra la proteína, el polipéptido u otro compuesto o molécula en el sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, comprendiendo dicho método al menos las etapas de: a) poner en contacto dicha muestra con un agente de captura que se inmoviliza sobre un soporte, en donde dicho agente de captura es o consiste esencialmente en dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, en condiciones tales que cualquier anticuerpo anti-fármaco contra dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula pueda unirse a dicho agente de captura; b) opcionalmente retirar cualquier componente o constituyente presente en dicha muestra que no se une al agente de captura; c) detectar o medir cualquier anticuerpo anti-fármaco que se haya unido al agente de captura, poniendo en contacto el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado con un agente de detección, en condiciones tales que dicho agente de detección pueda unirse a cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado y/o el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado, en donde o: x) dicho agente de captura es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; y (ii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)n en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I); o: y) dicho agente de detección es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; (ii) una etiqueta o marca detectable unida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula y (iii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de detección tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)n en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I), en el que dicha muestra es una muestra de sangre completa, suero, plasma, líquido ocular, líquido broncoalveolar/BALF, líquido cefalorraquídeo u otro líquido biológico.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco, en particular anticuerpos anti-fármaco que se presentan durante el tratamiento

La presente invención se refiere a métodos, ensayos y técnicas para detectar y/o medir anticuerpos anti-fármaco (ADA), y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento.

En particular, la presente invención se refiere a métodos, ensayos y técnicas para detectar y/o medir ADA (y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento) contra proteínas, polipéptidos u otros compuestos o moléculas (biológicos) que comprenden al menos un dominio variable de inmunoglobulina (como se describe adicionalmente en el presente documento), y en particular al menos un dominio variable único de inmunoglobulina (como se describe adicionalmente en el presente documento).

Más en particular, los métodos, los ensayos y las técnicas de la invención se pueden usar para detectar y/o medir ADA (y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento) contra proteínas, polipéptidos u otros compuestos o moléculas (biológicas) que comprenden al menos un dominio variable de inmunoglobulina (y en particular al menos un dominio variable único de inmunoglobulina o "ISV/ISVD") que tiene una región carboxiterminal expuesta (como se describe adicionalmente en el presente documento), incluso más en particular donde dicha región carboxiterminal expuesta puede ser unida por "anticuerpos preexistentes" (como se describe adicionalmente en el presente documento) que están (o pueden estar) presentes en la muestra que se va a probar (o donde existe un riesgo de que la muestra probada contenga dichos anticuerpos preexistentes u otros factores interferentes).

Más en general, los métodos, los ensayos y las técnicas de la invención se pueden usar para detectar y/o medir ADA (y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento) contra dichas proteínas, polipéptidos u otros compuestos o moléculas (biológicas) donde la muestra que se va a probar contiene (o puede contener y/o donde existe un riesgo de que dicha muestra contenga) uno o más anticuerpos preexistentes (u otros factores interferentes preexistentes) que pueden afectar la fiabilidad del ensayo, por ejemplo, de forma que, el ensayo no se pueda usar (o no se pueda usar de forma fiable) para medir ADA "verdaderos" (es decir, ADA "que se presentan durante el tratamiento") y/o, por una parte, para distinguir entre ADA "verdaderos" y/o que se presentan durante el tratamiento y, por otra parte, cualquiera de dichos anticuerpos preexistentes (u otros factores interferentes que incluyen factores interferentes preexistentes) presentes en la muestra.

Como se describe adicionalmente en el presente documento, los métodos, los ensayos y las técnicas de la invención se pueden usar en particular para detectar y/o medir ADA en una muestra (tal como una muestra de sangre u otra muestra biológica como se menciona en el presente documento) que ha sido obtenida de un sujeto (humano) al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido, compuesto o molécula. Por ejemplo, donde la proteína, polipéptido, compuesto o molécula sea un fármaco o terapéutico (biológico), dichas muestra pueden haber sido obtenidas de un paciente que se ha tratado con dicha proteína, polipéptido, compuesto o molécula (en particular donde el tratamiento usado conlleva un riesgo de que puedan aparecer ADA contra la proteína, polipéptido, compuesto o molécula, y/o donde es conveniente monitorizar si cualquier ADA aparece como resultado de dicho tratamiento); o de un sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido, compuesto o molécula como parte de un ensayo clínico (donde nuevamente puede ser conveniente o incluso necesario monitorizar si aparece cualquier ADA contra la proteína, polipéptido, compuesto o molécula). A este respecto, será evidente para el experto que (la aparición y/o los niveles de) ciertos ADA que se presentan durante el tratamiento pueden influir o afectar las propiedades farmacológicas de un fármaco de proteína (tal como su farmacocinética, depuración o incluso eficacia), pueden influir o afectar la eficacia terapéutica del tratamiento con el fármaco de proteína (y/o el régimen de tratamiento usado) y/o pueden ser un factor para que el médico práctico tome decisiones referentes al tratamiento o la pauta de tratamiento (por ejemplo, aumentar la dosis o cambiar el paciente a otro fármaco o tratamiento); y que, por consiguiente, existe una necesidad constante en la técnica de métodos y técnicas mejorados para detectar o medir ADA, como ahora se proporciona por la presente invención.

Aspectos adicionales, realizaciones, aplicaciones, usos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción adicional en el presente documento.

En toda la presente solicitud y las reivindicaciones adjuntas, cada vez que se hace referencia a una "proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula" (también denominados conjuntamente en el presente documento un "producto biológico”), dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula puede ser en particular (y según un aspecto de la invención, es preferentemente) un fármaco o terapéutico. Dicho fármaco o terapéutico puede, por ejemplo, después de la administración a un sujeto humano (tal como un paciente en necesidad de tratamiento con el fármaco o terapéutico), ser capaz de interactuar con y/o modular una diana terapéuticamente relevante, vía u otra interacción dentro del cuerpo humano. Por ejemplo, para este fin, la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula puede contener una o más unidades de unión o dominios de unión (tales como, por ejemplo y sin limitación, uno o más dominios variables de inmunoglobulina y en particular uno o más dominios variables únicos de inmunoglobulina, tales como uno o más Nanobodys) que se dirigen contra, son capaces de unirse (específicamente) a, interactuar con y/o modular dicha diana terapéutica, vía o interacción. Los ejemplos de los mismos serán evidentes para el experto basándose en la divulgación en el presente documento y el estado de la técnica adicional citado en el presente documento.

En toda la presente solicitud y las reivindicaciones adjuntas, cada vez que se hace referencia a una "proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula", dicho "otro compuesto o molécula" es preferentemente un compuesto o molécula biológica (incluyendo, sin limitación, cualquier complejo biológico).

Por lo tanto, en toda la memoria descriptiva, las abreviaturas "ISV" y "ISVD" se usan indistintamente para indicar dominios variables únicos de inmunoglobulina (como se define adicionalmente en el presente documento). Además, en toda la memoria descriptiva, cuando se dice que un método, aspecto, característica o elemento de la invención es "como se describe adicionalmente en el presente documento", esto se debe entender, en general, que significa que la(s) preferencia(s) que, en general, se describe(n) en el presente documento para (los métodos de) la invención también son preferencias para dicho método, aspecto, característica o elemento, a menos que el contexto específico lo requiera de otro modo.

Ha habido varios informes en el estado de la técnica de proteínas o factores (frecuentemente preexistentes) que pueden estar presentes en muestras biológicas obtenidas de sujetos humanos (tales como muestras de sangre, muestras de suero u otros líquidos o muestras biológicas) y que aparentemente pueden unirse a la región carboxiterminal de dominios variables de inmunoglobulina donde dicha región carboxiterminal se expone (es decir, donde esta región carboxiterminal no está protegida o cubierta por otra parte de la proteína o polipéptido de la que forma parte dicho dominio variable de inmunoglobulina. A este respecto, se debe observar que en un anticuerpo convencional de cuatro cadenas, las regiones carboxiterminales de los dominios variables están protegidas, en general, por los dominios constantes a los que están unidos dichos dominios variables). Por ejemplo, se describe en el documento de patente WO 12/175741 que la región carboxiterminal de un dominio VH, cuando se expone (como se define en el presente documento y en el documento de patente WO 12/175741), es parte de un posible epítope en el dominio VH que también incluye, entre otros restos, el resto de aminoácido en la posición 14 (y los restos de aminoácidos a continuación de/próximos al mismo en la secuencia de aminoácidos, tales como las posiciones 11, 13 y 15) y también puede comprender el resto de aminoácido en la posición 83 (y los restos de aminoácidos a continuación de/próximos al mismo en la secuencia de aminoácidos, tales como posiciones 82, 82a, 82b y 84) y/o el resto de aminoácido en la posición 108 (y los restos de aminoácidos a continuación de/próximos al mismo en la secuencia de aminoácidos 30, tales como las posiciones 107. Como en el documento de patente WO 12/17574, este posible epítope también se denomina conjuntamente en el presente documento la "región carboxiterminal", entendiéndose que esta región carboxiterminal comprende al menos la secuencia carboxiterminal VTVSS (es decir, cada una de las posiciones 109, 110, 111, 112 y 113) y el resto de aminoácido en la posición 14, y también puede comprender los restos de aminoácidos en las posiciones 83 y 108, y posiblemente también los restos de aminoácidos en las posiciones 13, 15, 82b, 83, 84 y 107.

También se ha descrito en la técnica que este epítope constituye un parche hidrófobo en el que un anticuerpo de tamaño completo está enterrado en la interfase entre el dominio variable y el dominio constante, pero que se expone al disolvente cuando el dominio variable no está asociado a un dominio constante (véase, por ejemplo, Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997) y Harmsen et al., Molecular Immunology (2000), 579-590).

También se conoce bien que dichos epítopes "enterrados" (también denominados en la técnica "neo-epítopes" o "epítopes crípticos") pueden activar el sistema inmunitario una vez se exponen al disolvente, por ejemplo, debido a degradación, plegamiento erróneo o agregación de la proteína implicada. Por ejemplo, en el caso de porciones hidrófobas enterradas de biomoléculas (las denominadas "hipos"), se ha indicado que éstas forman parte de un patrón molecular asociado al daño general que conduce a respuestas inmunitarias innatas una vez los hipos se exponen al disolvente (véase, por ejemplo, Seong y Matzinger, Nature Reviews 2004, 469), y se han descrito en la técnica diversos ejemplos de parches hidrófobos previamente enterrados que activan las respuestas inmunitarias (véanse, por ejemplo, David et al., JBC, 2001, 6370-6377; Matsuura et al., International Immunology, 2000, 1183-1192; Rasheed et al., Life Sciences 79 (2000), 2320-2328). Más en general, también se conoce en la técnica que los aminoácidos hidrófobos tienen una tendencia a ser parte de epítopes de linfocitos B (véanse, por ejemplo, el documento de patente WO 11/07586, página 10; y Kolaskar, FEBS 276, 172-174 (1990)). Similarmente, se ha descrito que el parche hidrófobo en el extremo C de un dominio variable de la cadena pesada (como se describe por Nieba et al. y Harmsen et al., arriba) puede formar epítopes de linfocitos B que pueden dar lugar a y/o interactuar con anticuerpos anti-fármaco (que aparecen y/o preexistentes) (documento de patente WO 11/075861). Por este motivo, se ha propuesto hacer mutaciones en algunos de los restos de aminoácidos que forman parte del extremo C de los dominios variables para reducir la hidrofobia y/o para retirar epítopes de linfocitos B. Por ejemplo, Nieba et al. indican mutar las posiciones 11, 14, 41, 84, 87 y/o 89 de una región VH (numeración según Kabat), mientras que en el documento de patente WO 11/075861 se indica mutar las posiciones 99, 101 y/o 148 (numeración AHo) de un dominio VL o las posiciones 12, 97, 98, 99, 103 y/o 144 de un dominio VH (nuevamente numeración AHo - estas posiciones corresponden a las posiciones 11,83, 84, 85, 89 y 103 según Kabat). Similarmente, Harmsen et al. indican mutar las posiciones 12 y 101 (numeración IMGT; estas son las posiciones 11 y 89 según Kabat) para compensar la ausencia de un dominio C^h1 ; y también identifican una subfamilia específica de VHH (denominada "VHH4") que contienen aminoácidos que son candidatos adecuados para sustituciones en estas posiciones.

También se ha descrito en la técnica (véanse, por ejemplo, el documento de patente WO 12/175741 y las referencias citadas en los siguientes párrafos) que las muestras biológicas obtenidas de sujetos humanos pueden contener proteínas o factores (preexistentes) que son capaces de unirse a la región/extremo carboxiterminal expuesto de un dominio variable de inmunoglobulina (por ejemplo, la región carboxiterminal o extremo de un ISVD o de un dominio VH o VL en un scFv o diacuerpo). Por ejemplo, el documento de patente WO 2013/024059 establece que "en sueros de algunos sujetos humanos intactos sanos, están presentes autoanticuerpos anti- VH preexistentes que pueden unirse tanto a los anticuerpos del dominio VH como a moléculas VHH, así como a anti-VL (por ejemplo, autoanticuerpos V kappa (VK)) que se pueden unir a moléculas VL", y que "los ADA preexistentes que se unen a dAb VH son similares a los anticuerpos anti-bisagra en que se unen a fragmentos de IgG pero no a las mismas secuencias encontradas in situ en la IgG intacta."

Holland et al., J. Clin. Immunol. 2013, 33(7): 1192-203 describen que la sangre de aproximadamente la mitad de los seres humanos sanos normales contiene niveles variables de una nueva clase de autoanticuerpos anti-IgG que pueden unirse a las secuencias de la región estructural de anticuerpos VH de dominio completamente humano (a los que Holland et al. también se refieren como "auto-anticuerpos HAVH "). Holland et al. mencionan además que estos auto-anticuerpos parecen ser predominantemente del isotipo IgG, muestran una afinidad relativamente alta (aproximadamente 10-10 M) por secuencias VH, y que un extremo C libre parece ser importante para la unión de estos autoanticuerpos HAVH a dominios VH.

El documento de patente WO 12/175741 también describe que dichos anticuerpos preexistentes u otros factores (preexistentes) pueden interferir con los ensayos de ADA. Esto también se denomina, en general, "interferencia de proteínas" en el documento de patente WO 12/175741, y los anticuerpos preexistentes u otros factores que interfieren (pueden interferir) con los ensayos también se denominan, en general, en el documento de patente WO 12/175741 "factores de interferencia".

Los problemas relacionados con los anticuerpos reactivos con bioterapéuticos preexistentes contra moléculas bioterapéuticas y su efecto regulador también se tratan, en general, por Xue et al., AAPS J. 2013; 15(3):852-5.

El estado de la técnica anteriormente mencionado también se ha centrado en formas en las que la secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina se puede modificar para prevenir o reducir la unión de dichos anticuerpos/factor(es) preexistentes a los dominios variables. A este respecto, el documento de patente WO 2011/07586 indica hacer una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos del dominio variable en algunas posiciones específicas del dominio (posiciones que están expuestas en la superficie). El documento de patente WO 12/175741 describe que la unión de dichos anticuerpos/factores preexistentes se puede reducir añadiendo algunos restos de aminoácidos (y tan solo un resto de alanina) al extremo C del dominio VH y/o haciendo una o más sustituciones o deleciones específicas dentro de la región carboxiterminal del dominio variable, que se describe en el documento de patente WO 12/175741 como al menos que comprende la secuencia de aminoácidos carboxiterminal VTVSS y el resto de aminoácido en la posición 14 (para cuya posición el documento de patente WO 12/175741 enseña que la presencia de un resto de alanina proporciona unión reducida de anticuerpos preexistentes en comparación con la presencia del resto de aminoácido "humano" prolina), y posiblemente también los restos de aminoácidos en las posiciones 108 y 83 y los restos de aminoácidos próximos a dichas posiciones (el documento de patente WO 2013/024059 proporciona esencialmente la misma enseñanza que el documento de patente WO 12/175741).

Por ejemplo, en la investigación realizada por el solicitante/cesionario que condujo a la presentación del documento de patente WO 12/175741, se ha encontrado que la adición de un único resto de alanina a la región o extremo carboxiterminal de un dominio VH expuesto prevendrá/eliminará normalmente (esencialmente toda) la unión de anticuerpos/factores preexistentes que están presentes en muestras obtenidas de la mayoría de los sujetos humanos (véanse, por ejemplo, la página 62, líneas 20-25 y la página 57, línea 30 a página 58, líneas 3 del documento de patente WO 12/175741); y estos hallazgos se han confirmado mediante resultados adicionales que se obtuvieron por el solicitante/cesionario después de la presentación del documento de patente WO 12/175741 cuando la sustitución de alanina carboxiterminal del documento de patente WO 12/175741 se aplicó a otros Nanobodys (datos no mostrados).

Aunque la presente invención no se limita a ninguna explicación o hipótesis referente a la naturaleza de la(s) proteína(s) o factor(es) que pueden estar presentes en muestras humanas y que pueden unirse al extremo C libre de dominios variables de inmunoglobulina (y en particular de dominios variables basados en VH), parecería que es probable que la(s) proteína(s) o factor(es) interferente(s) son preexistentes y no se presentan durante el tratamiento, y es probable que sea un anticuerpo (policlonal), y en particular, una IgG. Por consiguiente, en la descripción adicional en el presente documento, el (los) factor(es) de interferencia/interferente(s) como se describe en el documento de patente WO 12/175741 también se denominarán en el presente documento "anticuerpos preexistentes". Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "factor interferente (preexistente)" se refiere en particular a dichos anticuerpos preexistentes, pero en su sentido más amplio no excluye otras proteínas, polipéptidos o factores que puedan estar presentes en la sangre o suero de sujetos/pacientes humanos y que puedan interferir con ensayos de ADA en esencialmente un modo similar como se describe en el presente documento.

El estado de la técnica anteriormente mencionado también se ha centrado en formas en las que la secuencia de un dominio variable de inmunoglobulina se puede modificar para prevenir o reducir la unión de dicho(s) anticuerpo(s)/factor(es) preexistentes a los dominios variables. A este respecto, el documento de patente WO 2011/075861 sugiere hacer una o más mutaciones en la secuencia de aminoácidos del dominio variable en algunas posiciones específicas del dominio (posiciones que están expuestas en la superficie). El documento de patente WO 12/175741 describe que la unión de dichos anticuerpos/factores preexistentes se puede reducir añadiendo algunos restos de aminoácidos (y tan solo un resto de alanina) al extremo carboxiterminal del dominio VH y/o haciendo una o más sustituciones o deleciones específicas dentro de la región carboxiterminal del dominio variable, que se describe en el documento de patente WO 12/175741 como que al menos comprende la secuencia de aminoácidos de extremo C VTVSS y el resto de aminoácido en la posición 14 (para esa posición el documento de patente WO 12/175741 enseña que la presencia de un resto de alanina proporciona la unión reducida de anticuerpos preexistentes en comparación con la presencia del resto "humano" del aminoácido prolina), y posiblemente también los restos de aminoácidos en las posiciones 108 y 83 y restos de aminoácidos próximos a dichas posiciones (el documento de patente WO 2013/024059 proporciona esencialmente la misma enseñanza que el documento de patente WO 12/175741).

Por ejemplo, en la investigación realizada por el solicitante/cesionario que condujo a la presentación del documento de patente WO 12/175741, se ha encontrado que la adición de un único resto de alanina a la región o extremo carboxiterminal de un dominio VH expuesto normalmente prevendrá/eliminará (esencialmente toda) la unión de anticuerpos/factores preexistentes que están presentes en muestras obtenidas de la mayoría de los sujetos humanos (véase, por ejemplo, la página 62, líneas 20-25 y la página 57, línea 30 a la página 58, línea 3 del documento de patente WO 12/175741); y estos resultados se han confirmado mediante resultados adicionales que se obtuvieron por el solicitante/cesionario después de la presentación del documento de patente WO 12/175741 cuando la sustitución de alanina del extremo C del documento de patente WO 12/175741 se aplicó a otros Nanobodys (datos no mostrados).

Por lo tanto, en el documento de patente WO 12/175741, así como en el documento de patente WO 12/175400 por el solicitante/cesionario, las extensiones del extremo C descritas en el documento de patente WO 12/175741 se aplican a ciertos Nanobodys que se unen a albúmina del suero (véanse, por ejemplo, los documentos de patente WO 12/175741: SEQ ID NO: 37, 51-53 y 55-64 y las construcciones mostradas en SEQ ID NO: 41, 43 y 44; y el documento de patente WO 12/175400: SEQ ID n O: 6 a 11).

Otros ejemplos de Nanobodys y otros dominios variables únicos de inmunoglobulina que tienen extensiones y/o mutaciones carboxiterminales en la región carboxiterminal se pueden encontrar, por ejemplo, en el siguiente estado de la técnica: documento de patente WO 06/129843 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 4, 6, 8 y 10); documento de patente WO 03/035695 (véanse, por ejemplo, algunas de las secuencias enumeradas en las páginas 61-64); Vu et al., Molecular Immunology, 1121-1131, 1997 (véanse, por ejemplo, algunas de las secuencias enumeradas en la Figura 2); documento de patente WO 11/003622 (véanse, por ejemplo, las secuencias dadas como SEQ ID NO: 10 a 27); documento de patente WO09/058383 (véase, por ejemplo, la secuencia TAR2h-10-27 mencionada en la página 51); documento de patente WO 10/042815 (véase, por ejemplo, las secuencias de SEQ ID NO: 15, 17, 27 y 30); y documento de patente WO 04/044204 (véanse, por ejemplo, las secuencias de SEQ ID NO: 31,35, 37, 47 y 49).

Sin embargo, e independientemente de la naturaleza del (de los) factor(es) interferente(s), sigue existiendo el problema de que la presencia de dicho(s) factor(es) interferente(s) en la muestra probada puede interferir con la detección y/o medición de ADA (específicos de fármaco, y en particular que se presentan durante el tratamiento) en ensayos de ADA, en particular donde el ensayo de ADA se usa para detectar o medir ADA contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina (tal como un dominio variable único de inmunoglobulina) con una región carboxiterminal expuesta (por ejemplo, debido a que dicho dominio variable de inmunoglobulina está presente en y/o forma la región carboxiterminal de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula). Además, puede ser útil para clasificar la unión de anticuerpos como anticuerpos que (probablemente) se presentan durante el tratamiento o anticuerpos (probablemente) preexistentes ya que las dos formas pueden ejercer distintos perfiles inmunológicos.

La invención trata este problema proporcionando un ensayo de ADA que se puede usar para medir o determinar ADA "verdaderos" (es decir, ADA específicos de fármaco, y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento) en muestras que comprenden (o pueden comprender o se sospecha que comprenden) factor(es) interferente(s), y en particular factores interferentes del tipo referido en el estado de la técnica descrito anteriormente.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Como se describe adicionalmente en el presente documento, el ensayo de ADA de la invención (que es una modificación de un formato de ensayo de puente en sí conocido del estado de la técnica, y puede en particular ser una modificación de un formato de ensayo de electroquimioluminiscencia en sí conocido del estado de la técnica) se puede usar para detectar o medir ADA en una muestra adecuada contra cualquier proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina, pero se puede usar en particular para detectar o medir ADA en una muestra adecuada contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta (como se describe adicionalmente en el presente documento).

Como también se describe adicionalmente en el presente documento, según un aspecto específico de la invención, el ensayo de ADA descrito en el presente documento se puede usar para detectar o medir ADA en una muestra adecuada contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta, en los que dicho al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta es un dominio VH, un dominio VHH o un dominio variable de inmunoglobulina que ha derivado de un dominio VH o dominio VHH (tal como los dominios variables de inmunoglobulina mencionados en el presente documento).

Como también se describe adicionalmente en el presente documento, según un aspecto particular de la invención, el ensayo de ADA descrito en el presente documento se puede usar para detectar o medir ADA en una muestra adecuada contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta, en la que dicho al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta es un dominio variable único de inmunoglobulina (como se describe adicionalmente en el presente documento). Más en particular, el ensayo de ADA descrito en el presente documento se puede usar para detectar o medir ADA en una muestra adecuada contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta, en los que dicho al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta es un dominio variable único de inmunoglobulina que es un Nanobody (como se define adicionalmente en el presente documento; y en particular, un dominio VHH, un dominio VHH humanizado o un dominio VH camelizado, tal como un dominio VH humano camelizado) u otro dominio variable único de inmunoglobulina que deriva o ha derivado de un dominio VH, tal como un dominio VH humano (nuevamente como se describe adicionalmente en el presente documento; y por ejemplo un dAb™ derivado de VH u otro anticuerpo de dominio (único) derivado de VH).

Como también se describe adicionalmente en el presente documento, el ensayo de ADA de la invención se puede aplicar a cualquier muestra adecuada (como se describe adicionalmente en el presente documento) que se va a probar para la presencia de ADA contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (como se describe adicionalmente en el presente documento) y/o en el que se va a medir o determinar esa cantidad, nivel o concentración de dicho ADA. El ensayo de ADA de la invención se puede aplicar en particular a muestras adecuadas (como se describe adicionalmente en el presente documento) que han sido obtenidas de un sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (como se describe adicionalmente en el presente documento) (nuevamente, como se describe adicionalmente en el presente documento, por ejemplo como parte del tratamiento de un sujeto o paciente con dicho producto biológico o como parte de un ensayo clínico que implica la administración de dicho producto biológico a un sujeto). Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra de sangre completa, suero y plasma, líquido ocular, líquido broncoalveolar /BALF, líquido cefalorraquídeo u otro líquido biológico; y será frecuentemente una muestra de sangre, muestra de plasma o muestra de suero.

Aunque la invención no se limita nuevamente a ninguna explicación, hipótesis o mecanismo de acción (de manera que, en general, el término ADA "verdadero" como se usa en el presente documento comprende, en general, cualquier anticuerpo o factor similar, distinto de cualquier factor interferente, que es o puede estar presente en una muestra que se va a probar y que se puede unir específicamente a la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que se ha administrado al sujeto del que se ha obtenido la muestra que se va a probar), será evidente para el experto que, en cada caso diferente de dichos factores interferentes, dichos ADA "verdaderos" serán, en general, anticuerpos; y que dichos ADA "verdaderos" A pueden ser (y normalmente son) generados por el sistema inmunitario del sujeto o paciente después de (y en particular, como una respuesta a y más en particular como una respuesta inmunitaria a) la administración de y/o el tratamiento con la proteína administrada, polipéptido u otro compuesto o molécula (en particular donde dicha administración o tratamiento se repite de forma que el sistema inmunitario sea activado para generar dichos ADA).Dichos ADA también se denominan en el presente documento y en el estado de la técnica "ADA que se presentan durante el tratamiento").

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona un ensayo, método o técnica para medir ADA contra (y en particular, específicos de) una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprenden al menos un dominio variable de inmunoglobulina (y en particular, al menos un dominio VH, dominio VHH u otro dominio que ha derivado de un dominio VH o VHH); ensayo, técnica o método que es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, comprende las etapas a) a c) que se describen adicionalmente en el presente documento).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un ensayo, método o técnica para medir ADA contra (y en particular, específico para) una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprenden al menos un dominio variable de inmunoglobulina (y en particular, al menos un dominio VH, dominio VHH u otro dominio que ha derivado de un dominio VH o VHH) en una muestra (como se describe adicionalmente en el presente documento) que ha sido obtenida de un sujeto o paciente al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; ensayo, técnica o método que es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, comprende las etapas a) a c) como se describe adicionalmente en el presente documento).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un ensayo, método o técnica para medir ADA contra (y en particular, específico para) una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprenden al menos un dominio variable de inmunoglobulina (y en particular, al menos un dominio VH, dominio VHH u otro dominio que ha derivado de un dominio VH o VHH) que tiene una región carboxiterminal expuesta (como se define en el presente documento) (o que puede tener y/o se sospecha que tiene una región carboxiterminal expuesta); ensayo, técnica o método que es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, comprende las etapas a) a c) como se describe adicionalmente en el presente documento).

En un aspecto adicional, la invención proporciona un ensayo, método o técnica para medir ADA contra (y en particular, específico para) una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprenden al menos un dominio variable de inmunoglobulina (y en particular, al menos un dominio VH, dominio VHH u otro dominio que ha derivado de un dominio VH o VHH) que tiene una región carboxiterminal expuesta (como se define en el presente documento) (o que puede tener y/o se sospecha que tiene una región carboxiterminal expuesta) en una muestra (como se describe adicionalmente en el presente documento) que ha sido obtenida de un sujeto o paciente al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; ensayo, técnica o método que es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, comprende las etapas a) a c) como se describe adicionalmente en el presente documento).

En los aspectos anteriores, el al menos un dominio variable de inmunoglobulina que está presente en la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (y que, en particular, puede tener una región carboxiterminal expuesta) puede ser, en particular, un dominio VH, dominio VHH u otro dominio que ha derivado de un dominio VH o VHH. En un aspecto específico, dicho al menos un dominio variable de inmunoglobulina es un dominio variable único de inmunoglobulina (es decir, un dominio variable único de inmunoglobulina que es capaz de formar un sitio de unión al antígeno (completamente) funcional sin la interacción VH/VL que se requiere para los dominios variables de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas) y en particular un ISV que es o ha derivado de un dominio VHH o un dominio VH. Se hace referencia, por ejemplo, al documento de patente WO 09/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente w O 09/138519) y el documento de patente WO 08/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 08/020079). Más en particular, dicho ISV puede ser un dominio VHH, un Nanobody, un anticuerpo de dominio (único) o un dAb (y en particular, un anticuerpo de dominio (único) o dAb que deriva de un dominio VH, tal como un dominio VH humano).

Ejemplos de proteínas, polipéptidos u otros compuestos o moléculas que comprenden al menos dicho ISV serán evidentes para el experto, nuevamente, por ejemplo, a partir del documento de patente WO 09/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 09/138519) o documento de patente WO 08/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 08/020079).

Sin embargo, basándose en la divulgación en el presente documento y también a partir de las divulgaciones por Nieba et al. y a partir del documento de patente WO 11/075861 (ambos mencionados anteriormente), será evidente para el experto que la presente invención en su sentido más amplio no se limita a (ensayos, métodos y técnicas para medir ADA contra) proteínas, polipéptidos u otros compuestos o moléculas que comprenden al menos dicho ISV (y en particular, al menos dicho ISV con una región carboxiterminal expuesta), pero se pueden aplicar, en general, a cualquier proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que contenga un dominio variable de inmunoglobulina (y en particular dominio VH) que tenga una región carboxiterminal expuesta. Como se ilustra por Nieba et al. y por el documento de patente WO 11/075861, dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula también puede ser, por ejemplo, un scFv.

Generalmente, se dice que cualquiera de dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende un dominio variable de inmunoglobulina (como se define adicionalmente en el presente documento) con una región/extremo carboxiterminal expuesto cuando dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula experimenta una interacción de unión en dicha región/extremo carboxiterminal expuesto con uno o más del (de los) factor(es) interferente(s) denominados en el presente documento y/o en el estado de la técnica citado en el presente documento (en particular, en condiciones fisiológicas y/o en las condiciones comúnmente usadas en un ensayo de ADA, tal como las condiciones usadas en el ensayo de ADA que se describe en la Parte experimental abajo); o que en dichas condiciones es capaz de experimentar dicha interacción de unión. Basándose en la divulgación en el presente documento y en el estado de la técnica citado, el experto será capaz de determinar si una proteína dada, polipéptido u otro compuesto o molécula tiene dicha región carboxiterminal expuesta (y/o es capaz de experimentar dicha interacción de unión), por ejemplo, probando el producto biológico relevante contra una o más muestras que son conocidas o se sospecha que contienen dichos factores interfe rentes.

Frecuentemente/normalmente, dicha región carboxiterminal expuesta estará en el extremo carboxiterminal de la proteína entera, polipéptido u otro compuesto o molécula; sin embargo, la invención en su sentido más amplio no se limita a esto, ya que también puede ser que la región carboxiterminal expuesta esté en algún otro lugar dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, a condición de que dicha región carboxiterminal sea (todavía) accesible para dicha interacción de unión, por ejemplo, debido a que no está (o no está suficientemente) cubierta o protegida por otro dominio (tal como un dominio adicional que está unido al extremo carboxiterminal) en la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula. También puede ser que el extremo carboxiterminal esté unido a un conector (que a su vez está unido a uno o más dominios adicionales) que es tan flexible que la región carboxiterminal está todavía accesible para la unión por el factor(es) interferente(s).

En general, como se conoce bien para los dominios variables de inmunoglobulina, en general, la invención de ISVD comprenderá 4 regiones estructurales (FW1, FW2, FW3 y FW4) y 3 CDR (CDR1, CDR2 y CDR3). Al igual que con los dominios variables de inmunoglobulina, en general, la secuencia de las CDR dependerá del antígeno/diana(s) contra el que se ha producido el ISVD y/o se pretende unir. Las regiones estructurales pueden ser, en general, cualquier región estructural adecuada para ISVD (opcionalmente en asociación con una o más de las CDR). Por ejemplo, si la ISVD es un Nanobody, las regiones estructurales contendrán, en general, un número adecuado de restos distintivos VHH (por ejemplo, en las posiciones 11,37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y/o 108; véanse, por ejemplo, las Tablas A-3 y A-5 a A-8 del documento de patente WO 08/020079 ); uno o varios de otros restos de aminoácidos que pueden estar presentes en VHH/Nanobodys (tales como una o más sustituciones humanizantes que son en sí conocidas para VHH y Nanobodys; se hace referencia, por ejemplo, a la enseñanza en el documento de patente WO 08/020079) y/o uno o varios de otros restos o sustituciones de aminoácidos adecuados para VHH/Nanobodys; o cualquier combinación adecuada de dichos restos/sustituciones de aminoácidos.

Además, dicho ISVD o Nanobody (o una proteína/polipéptido/compuesto que comprende el mismo) puede contener además uno o más restos, sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos adecuados que son en sí conocidos para dicho ISVD o Nanobody, que incluye sin limitaciones uno o más restos de aminoácidos, sustituciones, deleciones y/o adiciones que reducen (o pretenden reducir) la unión de anticuerpos preexistentes a ISVD/Nanobodys. Estos incluyen los restos, sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos mencionados en el estado de la técnica citados en el presente documento, tales como una extensión del extremo C como se describe en documento de patente WO 12/175741 y/o una o más de las sustituciones de aminoácidos en o próximas a la región carboxiterminal como se describe en el documento de patente WO 12/175741, Harmsen et al. y Nieba et al. (tal como, por ejemplo, en o próximas a las posiciones 11, 14, 41,83, 84, 89, 108 y/o la secuencia VTVSS carboxiterminal) y/o en los documentos de patente WO 11/075861 o WO 13/024059.

Como se explica adicionalmente en el presente documento, además de dicho al menos un dominio variable de inmunoglobulina con el extremo/región carboxiterminal expuesto, el producto biológico puede contener uno o varios de otros dominios de unión, unidades de unión o restos (funcionales); en los que los diferentes dominios, unidades o restos que constituyen el producto biológico pueden unirse adecuadamente entre sí, tal como por uno o más conectores adecuados.

En un aspecto, como se explica adicionalmente en el presente documento, el producto biológico tiene una semivida (como se define en el presente documento) de al menos 1 día, preferentemente al menos 3 días, más preferentemente al menos 7 días, tal como al menos 10 días, en un sujeto humano. Como también se explica adicionalmente en el presente documento, el producto biológico puede comprender, por ejemplo, uno o más dominios de unión, unidades de unión u otros grupos funcionales o restos que confieren dicha (elevada) semivida al producto biológico.

Como se explica adicionalmente en el presente documento, un ejemplo específico, pero no limitante de dicho dominio de unión que puede estar presente en el producto biológico para conferir dicha (elevada) semivida al producto biológico es un ISVD que se dirige contra una proteína sérica, tal como la albúmina de suero (en particular, contra la albúmina de suero humano). Por lo tanto, en un aspecto específico de la invención, el producto biológico contiene al menos dicho ISVD dirigido contra una proteína sérica (humana) (tal como contra albúmina de suero humano). Según un aspecto más específico de la invención, dicho ISVD contra una proteína sérica es el ISVD con el extremo/región carboxiterminal expuesto. Por ejemplo, en un aspecto específico de la invención, dicho ISVD contra la proteína sérica está presente en y/o forma el extremo carboxiterminal del producto biológico. Algunos ejemplos no limitantes de dicho ISVD contra la albúmina de suero humano se pueden encontrar en los documentos de patente WO 06/122787 y WO 12/175400 y, por ejemplo, incluyen el Nanobody que se une a albúmina de suero llamado "Alb-1" en el documento de patente WO 06/122787 y sus variantes humanizadas (tales como el Nanobody que se une a albúmina de suero llamado "Alb-8" en el documento de patente WO 06/122787 y el Nanobody que se une a albúmina de suero llamado "Alb-23" en el documento de patente WO 12/175400).

Por lo tanto, en un aspecto preferido, pero no limitante, los productos biológicos denominados en el presente documento son preferentemente adecuados y/o están previstos para administración a un sujeto humano (en particular, como un terapéutico, profiláctico, diagnóstico o fármaco); o son adecuados y/o están previstos para su uso en un modelo animal (tal como un modelo de enfermedad).

En la presente memoria descriptiva, siempre que el término "ISV" se use, se debe entender que:

- Dicho ISV es preferentemente un Nanobody, en el que el término "Nanobody" es, en general, como se define en o el documento de patente WO 08/020079 o el documento de patente WO 09/138519, y así en un aspecto específico, en general, indica un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado (tal como un VH humano camelizado) o, en general, un VHH de secuencia optimizada (tal como, por ejemplo, optimizada para la estabilidad química y/o solubilidad, superposición máxima con regiones estructurales humanas conocidas y expresión máxima). Se observa que los términos Nanobody o Nanobodys son marcas registradas de Ablynx N.V. y así también se pueden denominar Nanobody® y/o Nanobodys®);

- el término "ISV" en su sentido más amplio también incluye "productos biológicos basados en ISV" y, cuando el ISV es un Nanobody, "productos biológicos basados en Nanobody". Un "producto biológico basado en ISV" se define en el presente documento como una proteína, polipéptido u otro fármaco biológico que comprende o consiste esencialmente en al menos un ISV (tal como uno, dos o tres). Similarmente, un "producto biológico basado en Nanobody" se define como una proteína, polipéptido u otro fármaco biológico que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanobody (tal como uno, dos o tres). Al igual que con el término "ISV", siempre que se use el término "producto biológico basado en ISV", se debe entender que dicho producto biológico basado en ISV es preferentemente un producto biológico basado en Nanobody. Dentro del contexto de la presente invención, tanto un "producto biológico basado en ISV" como un "producto biológico basado en Nanobody" puede ser, por ejemplo, una construcción ISV o construcción de Nanobody monovalente, bivalente (o multivalente), biespecífica (o multiespecífica) y biparatópica (o "multiparatópica), respectivamente. Por lo tanto, cualquier producto biológico basado en ISV o basado en Nanobody puede comprender opcionalmente, por ejemplo, además del uno o más ISV o Nanobodys (tal como uno, dos o tres), opcionalmente comprende además uno o más (tal como uno o dos) de otros restos terapéuticos adicionales y/o uno o más (tal como uno o dos) de otros restos que influyen en las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas del producto biológico basado en ISV o basado en Nanobody (tal como su semivida). Ejemplos adecuados de dicho terapéutico adicional u otros restos serán evidentes para el experto y, por ejemplo, en general, pueden incluir cualquier proteína terapéuticamente activa, polipéptido u otro dominio de unión o unidad de unión, así como, por ejemplo, modificaciones tales como las descritas en las páginas 149 a 152 del documento de patente WO 09/138159. Un producto biológico basado en ISV o producto biológico basado en Nanobody es preferentemente un terapéutico o se prevé para su uso como un terapéutico (que incluye la profilaxis y el diagnóstico) y para este fin contiene preferentemente al menos un ISV contra una diana terapéuticamente relevante (tal como, por ejemplo, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 u otras interleucinas, etc.). Para algunos ejemplos específicos pero no limitantes de dichos productos biológicos basados en ISV o basados en Nanobodys, se hace referencia, por ejemplo, a las diversas solicitudes por Ablynx N.V. (tal como por ejemplo y sin limitación a los documentos de patente WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 y W o 2009/068627), así como, por ejemplo (y sin limitación) a solicitudes tales como a los documentos de patente WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 y WO 07/085814. Estas referencias también dan ejemplos de diferentes formatos de Nanobodys (tales como construcciones biespecíficas y biparatópicas) y conectores adecuados que se pueden usar para preparar dichas construcciones. Por lo tanto, como se describe adicionalmente en el presente documento, un ISVD o Nanobody como se describe en el presente documento se puede dirigir contra una proteína sérica (humana), tal como albúmina de suero (humana), y dicho ISVD o Nanobody también puede encontrar usos terapéuticos, en particular en y/o para prolongar la semivida de restos terapéuticos y compuestos (tales como en o para los productos biológicos basados en ISV descritos en el presente documento). Se hace referencia, por ejemplo, a los documentos de patente WO 2004/041865, w O 2006/122787 y WO 2012/175400 que, en general, describen el uso de Nanobodys de unión a albúmina sérica para la prolongación de semivida. Por lo tanto, en la presente memoria descriptiva, a menos que se mencione explícitamente de otro modo en el presente documento, todos los términos mencionados en el presente documento tienen el significado dado en el documento de patente WO 09/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 09/138519) o documento de patente WO 08/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 08/020079). Por lo tanto, donde un método o técnica no se describe específicamente en el presente documento, se puede realizar como se describe en los documentos de patente WO 09/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 09/138519) o WO 08/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento de patente WO 08/020079).

Por lo tanto, los siguientes términos tienen el mismo significado que se da en, y/o si procede se puede determinar en el modo descrito en las páginas 62-75 del documento de patente WO 09/138519: "agonista", "antagonista", "agonista inverso", "resto de aminoácido no polar sin carga", "resto de aminoácido polar sin carga", "resto de aminoácido polar cargado", "identidad de secuencia", "exactamente el mismo" y "diferencia de aminoácidos" (cuando se refiere a una comparación de secuencias de dos secuencias de aminoácidos), "(en) (forma) esencialmente aislada", "dominio", "dominio de unión", "determinante antigénico", "epítope", "contra" o "dirigido contra" (un antígeno), "especificidad' y "semivida". Además, los términos "modular" y "para modular", "sitio de interacción", "específico para", "bloquear de forma cruzada", "bloqueado de forma cruzada" y "bloqueo cruzado" y "esencialmente independiente del pH" son como se definen en (y/o se pueden determinar como se describe en) las páginas 74-79 del documento de patente WO 10/130832 del solicitante. Por lo tanto, cuando se refiere a una construcción, compuesto, proteína o polipéptido de la invención, términos como "monovalente", "bivalente" (o "multivalente"), "biespecííico" (o "multiespecííico") y "biparatópico" (o "multiparatópico") pueden tener el significado dado en los documentos de patente WO 09/138.519, WO 10/130832 o WO 08/020079.

El término "semivida", como se usa en el presente documento en relación con una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (y en particular, un ISV, Nanobody, producto biológico basado en ISV, producto biológico basado en Nanobody o cualquier otra secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido, se puede definir, en general como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079 y como se menciona allí se refiere al tiempo necesario para que la concentración en suero de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido se reduzca al 50 %, in vivo, por ejemplo debido a la degradación de la secuencia o compuesto y/o depuración o secuestro de la secuencia o compuesto por mecanismos naturales. La semivida in vivo de una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención se puede determinar de cualquier modo en sí conocido, tal como por análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas serán evidentes para el experto en la técnica, y pueden ser, por ejemplo, en general, como se describen en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079. Como también se menciona en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079, la semivida se puede expresar usando parámetros tales como la t1/2-alfa, t1/2-beta y el área bajo la curva (ABC). A este respecto se debe observar que el término "semivida", como se usa en el presente documento en particular, se refiere a la t1/2-beta o semivida terminal (en la que la t1 /2-alfa y/o la ABC, o ambas, se pueden mantener al margen de consideraciones). Se hace referencia, por ejemplo, a la Parte experimental más adelante, así como a los manuales habituales, tales como Kenneth, A et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a edición revisada (1982). Similarmente, los términos "incremento en la semivida" o "semivida incrementada" son también como se definen en el párrafo o) en la página 57 del documento de patente WO 08/020079 y en particular se refieren a un aumento en 11/2-beta, ya sea con o sin un aumento en t1/2-alfa y/o el ABC, o ambos.

Cuando un término no se define específicamente en el presente documento, tiene su significado usual en la técnica, que será evidente para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales habituales, tales como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2a ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2a edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6a ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10a ed. Blackwell Publishing, Uk (2001); y Janeway et al., "Immunobiology" (6a ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), así como a la técnica anterior general citada en el presente documento.

Por lo tanto, en el presente documento, los restos de aminoácidos de un Nanobody se numeran según la numeración general para los dominios VH dada por Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación N.° 91), como se aplica a los dominios VHH de camélidos en el artículo de Riechmann y Muildermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; o denomina en el presente documento. Según esta numeración, FR1 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 1 -30, CDR1 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 31-35, FR2 de un Nanobody comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 95-102 y FR4 de un Nanobody comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 103-113. [A este respecto, se debe observar que, como se conoce bien en la técnica para los dominios VH y para los dominios VHH, el número total de restos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de restos de aminoácidos indicados por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones según la numeración de Kabat puede no estar ocupada en la secuencia actual, o la secuencia actual puede contener más restos de aminoácidos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, en general, la numeración según Kabat puede o puede no corresponder a la numeración actual de los restos de aminoácidos en la secuencia actual. En general, sin embargo, se puede decir que, según la numeración de Kabat e independientemente del número de restos de aminoácidos en las CDR, la posición 1 según la numeración de Kabat corresponde al comienzo de FR1 y viceversa, la posición 36 según la numeración de Kabat corresponde al comienzo de FR2 y viceversa, la posición 66 según la numeración de Kabat corresponde al comienzo de FR3 y viceversa, y la posición 103 según la numeración de Kabat corresponde al comienzo de FR4 y viceversa.].

Métodos alternativos para la numeración de los restos de aminoácidos de dominios VH, métodos que también se pueden aplicar en un modo análogo a los dominios VHH de camélidos y a Nanobodys, son el método descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), la denominada "definición de AbM" y la denominada "definición de contacto". Sin embargo, en la presente descripción, aspectos y figuras, se seguirá la numeración según Kabat como se aplica a dominios VHH por Riechmann y Muildermans, a menos que se indique lo contrario.

También se debe observar que las Figuras, y la Parte experimental/Ejemplos, solo se dan para ilustrar adicionalmente la invención y no se deben interpretar o analizar como limitantes del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones adjuntas de ningún modo, a menos que se indique explícitamente de otro modo en el presente documento.

Como se menciona en el presente documento, los ensayos de ADA de la invención son adaptaciones de los formatos de ensayos de puente en sí conocidos del estado de la técnica.

Generalmente, dichos ensayos de ADA para determinar anticuerpos anti-fármaco contra un fármaco biológico o compuesto dado son conocimiento habitual en el campo de la farmacología y se usan rutinariamente durante el desarrollo clínico de medicamentos biológicos (además de ser requeridos por diversas autoridades sanitarias en todo el mundo). Además, se prevé que los ensayos de ADA puedan ser usados para monitorizar la aparición de anticuerpos que se presentan durante el tratamiento en pacientes tratados con un fármaco dado y basándose en los resultados se pueda modificar o cambiar el tratamiento, por lo tanto, dichos ensayos de ADA pueden ser medios de diagnóstico importantes para guiar a los médicos en el diseño del tratamiento óptimo para los pacientes. Se hace referencia, por ejemplo, a las revisiones por Wadhwa and Thorpe, Bioanalysis (2010), 2(6), 1073-1084 y por Shankar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; así como Wadwha and Thorpe, Journal of Immunotoxicology, 3:115-121, 2006; Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; y Loyet et al., J. Immunol. Meth. 345 (2009), 17-28.

También se conoce que hay diferentes ensayos, métodos y técnicas para realizar los ensayos de ADA, que incluyen (1) ELISA - formato de puente; (ii) ELISA - formato directo; (iii) formato indirecto; (iv) ensayo de radioinmunoprecipitación (RIP); (v) resonancia de plasmones superficiales; y (vi) electroquimioluminiscencia -formato de puente (también denominado en la técnica como un "ensayo de ECL" o "formato de ECL"). Se hace referencia, por ejemplo, a la Tabla 1 en la revisión anteriormente mencionada por Mire-Sluis et al., Tabla 1 en la revisión de 2010 por Wadwha y Thorpe, y Tabla 2 en el artículo de 2006 por Wadwha y Thorpe.

Como se mencionó en la revisión de 2010 por Wadwha y Thorpe (véanse las páginas 1079-1080 y Figura 2), una plataforma que se usa actualmente frecuentemente en la realización de los ensayos de ECL es "Meso Scale Discovery" o "MSD platform", disponible de Meso Scale Diagnostic LLC. Es un formato de ensayo de puente que usa marcas de rutenio que emiten luz cuando se estimulan electroquímicamente para la detección.

La Figura 1 muestra esquemáticamente los principios de los formatos de ensayo del estado de la técnica (tales como el formato de puente de ELISA o el formato de puente de ECL) para detectar ADA (indicados como (1) en la Figura 1) contra un anticuerpo convencional (indicado como (2) en la Figura 1). En este formato, la muestra que se va a probar para la presencia de los ADA (1) se pone en contacto con el anticuerpo convencional (2) (también denominado el "agente de captura") que se inmoviliza sobre un soporte sólido (4) usando un agente de unión o conector covalente adecuado o normalmente no covalente (3) (tal como un par biotina-estreptavidina), en condiciones que son tales que cualquier ADA (1) en la muestra pueda unirse a/ ser capturado por el agente de captura (2).

Después de que se haya permitido que cualquier ADA (1) en la muestra se una al anticuerpo convencional inmovilizado (2) , los constituyentes no unidos de la muestra se lavan usando una o más etapas de lavado adecuadas. El soporte con el anticuerpo convencional (2) y cualquier ADA (1) unido a él se pone entonces en contacto con un "agente de detección" (que en el caso del ensayo mostrado en la Figura 1 es un segundo anticuerpo convencional (5) que o bien se une directamente o por un conector (7) adecuado con una marca o etiqueta detectable (6) tal como, en el caso de un ensayo de ECL, una marca de rutenio, tal como SULFO-TAG™ o MSD TAG, u otra marca adecuada que se puede detectar usando técnicas electroquimioluminiscentes), en condiciones tales que el agente de detección pueda unirse al complejo del anticuerpo convencional (2) y el ADA (1).

Normalmente, en un ensayo del formato descrito en la Figura 1, el agente de detección usado es una versión adecuadamente etiquetada o marcada del anticuerpo convencional (2), de manera que los anticuerpos convencionales (2) y (5) en la Figura 1 sean los mismos, siendo uno inmovilizado sobre el soporte y usado como el "agente de captura" y siendo los otros adecuadamente etiquetados o marcados y usados como el "agente de detección". Después de que se haya permitido que el agente de detección se una al complejo del agente de captura (2) y el ADA (1), entonces se lava cualquier agente de detección (es decir, por medio de una o más etapas de lavado adecuadas), después de lo cual se determina o mide la presencia del agente de detección que queda sobre el soporte sólido (es decir, como parte del complejo que comprende el agente de captura (2), el ADA (1) y el agente de detección (3)) usando la marca o etiqueta detectable (tal como, en el caso de un ensayo de ECL, por medio de electroquimioluminiscencia). La cantidad o nivel de marca o etiqueta detectable que queda es entonces una medida de la cantidad de ADA en la muestra.

Las metodologías y técnicas para realizar los ensayos de ADA anteriores (tales como las condiciones de ensayo, tampones de ensayo, etapas de lavado, soportes sólidos y conectores para la inmovilización del agente de captura y métodos para hacer lo mismo, etiquetas/marcas adecuadas y métodos para unirlos con el agente de detección, técnicas para detectar/medir la marca detectable y equipo para realizar los ensayos) son en sí conocidas (por ejemplo, del estado de la técnica citado en el presente documento o de instrucciones del fabricante) o están comercialmente disponibles.

Sin embargo, como se indica en el documento de patente WO 2012/175741, cuando dicho formato de ensayo de ADA conocido se usa para detectar o medir ADA contra polipéptidos, proteínas u otros compuestos biológicos que comprenden un dominio variable de inmunoglobulina con un extremo C expuesto, factores interferentes presentes en la muestra probada pueden interferir con (la fiabilidad de) dicho ensayo y prevenir que se obtenga una lectura apropiada (es decir, que refleja la cantidad de ADA "verdaderos" en la muestra).

Por este motivo, en el trabajo que condujo a la presente invención, los presentes han probado diferentes formatos de ensayo de ADA para ver cuáles de estos formatos son susceptibles a la interferencia de proteínas y si dichos formatos de ensayo existentes se pueden adaptar o modificar para proporcionar un ensayo, método o técnica que se puede usar para determinar/medir ADA (y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento) en muestras que contienen (o se sospecha que contienen) factores interferentes.

En particular, como se describe en la Parte experimental, los inventores han probado cinco formatos de ensayo de ADA diferentes (un formato de puente basado en ECL homogénea en sí conocido; un formato de puente basado en ECL secuencial en sí conocido; un formato de puente basado en ELISA secuencial en sí conocido; un formato de ELISA directo en sí conocido; y un formato de puente basado en ECL homogénea que ha sido modificado según la presente invención); y como resultado han encontrado que de estos formatos de ensayo diferentes, un ensayo de puente de ECL (homogénea) se puede adaptar como se explica en el presente documento (es decir, mediante el uso de un agente de detección o un agente de captura que ha sido modificado como se explica en el presente documento) para proporcionar un formato de ensayo de ADA que se puede usar para medir ADA (y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento) contra un biológico incluso en una muestra que contiene (o se sospecha que contiene) proteínas interferentes. Es (en parte) en estos resultados y hallazgos en los que se basa la presente invención.

Generalmente, en la investigación que condujo a la invención, los inventores han encontrado que un formato de ensayo de puente conocido para medir ADA contra un biológico (y en particular un biológico que contiene al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta) se puede modificar y mejorar (es decir, para permitir la detección de ADA "verdaderos" y en particular ADA que se presentan durante el tratamiento, incluso en muestras que contienen o se espera que/se sospecha que contienen factores interferentes) usando, como agente de captura o como agente de detección, el producto biológico que tiene 1-10 (y preferentemente 1-5) restos de aminoácidos añadidos al extremo carboxiterminal expuesto (en particular donde dicho extremo carboxiterminal expuesto forma el extremo carboxiterminal del biológico completo). Los 1-5 restos de aminoácidos añadidos que se añaden al extremo carboxiterminal pueden ser cualquier resto de aminoácido adecuado, y pueden ser, por ejemplo, como se describe en el documento de patente WO 12/175741. Por ejemplo, ya se ha encontrado que usando, como agente de captura o agente de detección, el producto biológico con un resto de alanina carboxiterminal ya añadido proporciona una mejora importante en el rendimiento del ensayo (véanse los datos adicionales presentados en la Parte experimental).

Una forma de realizar el ensayo según la invención se muestra esquemáticamente en las Figuras 2A a 2D (usando una construcción de ISV bivalente como un ejemplo) y la Figura 3 (usando un ISV monovalente como un ejemplo). Como se puede apreciar de estas figuras (y también la Figura 4 tratada adicionalmente en el presente documento), el ensayo según la invención se basa en los principios generales de los ensayos de puente de ADA conocidos (con algunas modificaciones novedosas como se describe en el presente documento) y se puede realizar ventajosamente usando metodologías y equipo conocidos para realizar los ensayos en formato de puente del estado de la técnica de ADA (nuevamente, con las adaptaciones mencionadas en el presente documento).

Como se describe en el presente documento, el ensayo de ADA de la invención se puede usar para detectar ADA (1) contra un ISV o construcción de ISV (y en particular, un ISV o construcción de ISV que tiene o se espera que tenga una extremo/región carboxiterminal expuesto como se describe adicionalmente en el presente documento).

En las Figuras 2A a 2D, por medio de un ejemplo no limitante, el ensayo de la invención se ilustra usando el ensayo en la detección de ADA (1) contra una construcción de ISV bivalente (8) que comprende un primer ISV (8a) y un segundo ISV (8b) que se unen por un conector (8c) adecuado, en el que el primer ISV (8a) y el segundo ISV (8b) pueden ser iguales o diferentes (en el último caso, la construcción de ISV bivalente es biespecífica o, en caso de que los ISV se dirijan contra diferentes epítopes en la misma diana, biparatópica). Sin embargo, se debe entender que el ensayo de la invención también se puede usar para medir ADA contra un ISV monovalente (véase la Figura 3) o un ISV tri- o multivalente (no mostrado).

También se debe entender que en los siguientes párrafos, los ensayos de la invención se describen en la denominada "configuración secuencial", en la que las etapas de poner en contacto la muestra que contiene los anticuerpos anti­ fármaco con el agente de captura (también denominado en el presente documento "etapa a)") y poner en contacto los anticuerpos anti-fármaco capturados con el agente de detección (también denominado en el presente documento "etapa c)") se llevan a cabo secuencialmente (es decir, una después de la otra) y se separan normalmente por una etapa de lavado (también denominada en el presente documento "etapa b)"). Sin embargo, será evidente para el experto que también serán posibles otras configuraciones o variaciones de la configuración descrita en el presente documento. Dicha configuración/variación que es importante en la práctica de la invención es la denominada configuración "homogénea", en la que las etapas a) y c) se llevan a cabo esencialmente simultáneamente, es decir, añadiendo la muestra y el agente de detección esencialmente al mismo tiempo (es decir, directamente/poco después del otro) al soporte con el agente de captura y sin la etapa intermedia de lavado b), o mezclando primero/poniendo en contacto la muestra con el agente de detección y luego poniendo en contacto/aplicándolo con/al soporte con el agente de captura. También se debe observar que los ensayos usados en los Ejemplos 1 y 2 más adelante son ejemplos de ensayos en el formato homogéneo.

En el ensayo de la invención (configuración secuencial), la construcción de ISV bivalente (8) se usa como "agente de captura" y para este fin se inmoviliza sobre el soporte sólido (4) usando un agente de unión o conector (3) adecuado, tal como un par de unión de avidina-estreptavidina u otro par de unión no covalente adecuado. La muestra que se va a probar se pone entonces en contacto con la construcción inmovilizada de ISV bivalente (8) (es decir, en condiciones tales que cualquier ADA (1) presente en dicha muestra pueda unirse a/ser capturado por el agente de captura (8)) y cualquier ADA (1) contra la construcción de ISV bivalente (8) se pueda unir a la construcción/agente de captura, después de lo cual las proteínas no unidas y otros constituyentes de la muestra se retiran por una o más etapas de lavado adecuadas (realizadas de un modo en sí conocido). El soporte sólido (4) con el complejo del agente de captura (8) y los ADA (1) se ponen entonces en contacto con el agente de detección (9) que se marca o etiqueta, ya sea directamente o por un conector adecuado (7), con una marca o etiqueta detectable (nuevamente, para el formato de ECL, se puede usar una etiqueta o marca en sí conocida para realizar ensayos de ECL, tales como SULFO-TAG™, MSD TAG u otra marca electroquimioluminiscente adecuada (basada en rutenio)); en condiciones tales que el agente de detección (9) pueda unirse al complejo del agente de captura (8) y el ADA (1). Entonces se permite que el agente de detección (9) se uniera al complejo del agente de captura (8) y el ADA (1), después de lo cual se retira a continuación el exceso de agente de detección (es decir, usando una o más etapas de lavado adecuadas en sí conocidas) y se detecta el complejo restante formado por el agente de captura (8), el ADA (1) y el agente de detección (9) y/o se mide la cantidad del mismo) por medio de detección de la presencia de/medición de la cantidad de etiqueta o marca detectable de un modo en sí conocido (es decir, en el caso de un ensayo en el formato de ECL, usando técnicas electroquimioluminiscentes adecuadas).

En el ensayo de la invención, el agente de detección (9) será normalmente el mismo (o esencialmente el mismo) que la construcción de ISV bivalente (5), a pesar de que: (a) el agente de detección (9) no se una al soporte sólido; (b) el agente de detección (9) se etiquete o marque con la etiqueta o marca detectable (6), opcionalmente por un conector adecuado (7); y (c) donde la construcción de ISV bivalente (8) tiene una región carboxiterminal expuesta, el agente de detección (9) tiene, en comparación con el agente de captura (8), 1-5 restos de aminoácidos (indicados como (8d) en la Figura 2C) añadidos a su extremo carboxiterminal (esencialmente como se describe en el documento de patente WO 13/024059 y en particular en el documento de patente WO 12/175741 mencionado anteriormente).

Como se puede apreciar de los datos mostrados en la Parte experimental, según la invención, se ha descubierto de manera sorprendente que cuando se usa un agente de detección (9) que es el mismo que la construcción de ISV (8), pero que tiene dichos 1-5 restos de aminoácidos añadidos a su extremo carboxiterminal, que el ensayo se puede usar para medir o determinar los ADA "verdaderos" incluso en presencia de factores interferentes en la muestra. Por el contrario, cuando se usa un agente de detección (9) que es el mismo que el agente de captura (8) y que no tiene dichos 1-5 restos de aminoácidos adicionales añadidos a su extremo carboxiterminal, entonces el (los) factor(es) interferente(s) pueden interferir con el ensayo y hacer que sea más difícil o incluso imposible medir (solo) los ADA verdaderos (1) contra la construcción de ISV bivalente (8).

Similarmente, la Figura 3 muestra esquemáticamente el uso del ensayo de la invención en la medición de ADA (1) contra un ISV monovalente (10). Nuevamente, el ISV monovalente (10) se usa como agente de captura y para este fin se inmoviliza adecuadamente mediante un conector (3) al soporte (4). El ISV monovalente inmovilizado (10) se pone nuevamente en contacto con la muestra (es decir, en condiciones tales que permitan que cualquier ADA (1) presente en dicha muestra se una a/sea capturado por el agente de captura (10)) y cualquier ADA (1) presente en la muestra se pueda unir al agente de captura (10). Los otros constituyentes de la muestra se retiran por medio de una o más etapas de lavado adecuadas.

Los ADA (1) capturados por el ISV monovalente (10) se detectan entonces usando un agente de detección (11), que es el mismo que el ISV monovalente (10), aunque: (a) el agente de detección (11) no se une al soporte sólido; (b) el agente de detección (11) se etiqueta o marca con la etiqueta o marca detectable (6), opcionalmente por un conector adecuado (7); y (c) el agente de detección (11) tiene, en comparación con el agente de captura (10), 1 a 5 restos de aminoácidos (indicados como (12) en la Figura 3) añadidos a su extremo carboxiterminal (esencialmente como se describe en documento de patente WO 13/024059 y en particular en el documento de patente WO 12/175741 mencionado anteriormente). Nuevamente, para este fin, el complejo del agente de captura (10) y el ADA (1) se pone en contacto con el agente de detección (11) en condiciones tales que se permita que el agente de detección (11) se una al complejo del agente de captura (10) y el ADA (1). En la configuración secuencial, entonces se retira el exceso de agente de detección (es decir, usando una o más etapas de lavado adecuadas en sí conocidas), después de lo cual la etiqueta/marca detectable que queda se detecta/mide de un modo en sí conocido. En la configuración homogénea, se permite que se equilibre una mezcla de componentes del suero y detector marcado y agente de captura tal que se formen los complejos de anticuerpos (u otros componentes de la matriz) con los agentes marcados. La mezcla que contiene complejos preformados se añade a placas de captura, donde los complejos se unen próximos a las placas y una lectura de ECL permite la detección de una corriente de electroluminiscencia que hace que las múltiples etapas de lavado sean superfluas. Los componentes no capturados de la muestra no darán una señal de detección significativa).

Una forma alternativa de realizar los ensayos de la invención se muestra esquemáticamente en las Figuras 4A a 4C (usando una construcción de ISV bivalente como un ejemplo). El ensayo de las Figuras 4A a 4C se realiza esencialmente del mismo modo que los ensayos mostrados en las Figuras 2A a 2D y en la Figura 3; sin embargo, en esta realización de los ensayos de la invención, en lugar del agente de detección (9) que tiene 1 a 10 (y preferentemente 1-5) restos de aminoácidos añadidos en su extremo carboxiterminal, dichos 1 a 10 restos de aminoácidos (8d en la Figura 4B) se han añadido al extremo carboxiterminal del agente de captura (8). Por lo tanto, como se puede apreciar de las Figuras 4B y 4C, el agente de captura (8) comprende un primer y un segundo ISV ((8a) y (8b) en la Figura 4A, respectivamente), del que el primer ISV (8a) se une al soporte sólido (4) por medio del conector (3), del que y el segundo ISV (8b) (que se une adecuadamente al primer ISV (8a) por medio del conector (8c)) tiene 1 a 10 restos de aminoácidos en su extremo carboxiterminal (indicado como (8d) en la Figura 4B), esencialmente como se describe en el documento de patente WO 2013024059 y en particular en el documento de patente WO2012/175741 mencionado anteriormente. El agente de detección (9) puede ser esencialmente nuevamente el mismo que el agente de captura (8), a pesar de que (a) el agente de detección (9) no se une al soporte sólido (4); (b) el agente de detección (9) se etiqueta o marca con la etiqueta o marca detectable (6), opcionalmente por un conector adecuado (7); y (c) en comparación con el agente de captura (8), el agente de detección (9) no tiene 1-5 restos de aminoácidos (indicados como (8d) en la Figura 2C) añadidos a su extremo carboxiterminal (en otras palabras, el agente de detección en lugar del agente de captura tiene un extremo carboxiterminal expuesto, por ejemplo, que termina con los restos de aminoácidos carboxiterminales VTVSS).

El ensayo mostrado en las Figuras 4A a 4C se puede realizar esencialmente de la misma forma que los ensayos mostrados en las Figuras 2A a 2D y en la Figura 3. La muestra que se va a probar se pone en contacto con el vehículo/soporte (4) sobre el que se inmoviliza el agente de detección (8) (es decir, por el conector (3), que puede ser, por ejemplo, un par de unión de avidina-estreptavidina), en condiciones tales que los ADA (1) en la muestra puedan unirse a/ser capturados por el agente de captura (8). En la configuración secuencial, después de que se haya permitido que los ADA (1) se unan al agente de captura (8), los constituyentes adicionales de la muestra se retiran por una o más etapas de lavado adecuadas (en la configuración homogénea, como se describe en más detalle en el presente documento, la etiqueta/marca se mide después de que se hayan puesto en contacto entre sí el soporte en contacto con el agente de captura, la muestra y el agente de detección. Los componentes no capturados de la muestra no darán una señal de detección significativa). Después de eso, el complejo de los ADA (1) y el agente de captura (8) inmovilizados sobre el soporte sólido (4) se ponen en contacto con el agente de detección (9) en condiciones tales que el agente de detección (9) pueda unirse a dicho complejo. Después de que se haya permitido que el agente de detección (9) se una a dicho complejo, se retira el exceso de agente de detección (9) lavando después de que se detecte o mida la presencia o cantidad, respectivamente, de la etiqueta o marca detectable (7) unida al complejo, respectivamente, usando nuevamente un modo adecuado en sí conocido (tal como donde la etiqueta o marca detectable (7) es una etiqueta o marca que se puede detectar o medir usando técnicas electroquimioluminiscentes, una técnica electroquimioluminiscente adecuada).

Con respecto a las Figuras 2A, 2B, 3, 4A y 4B, se debe observar que, cuando el agente de captura se une al soporte sólido por un par de unión de avidina-estreptavidina (que es la forma preferida de unir el agente de captura al soporte sólido), el agente de captura se puede unir al soporte por uno o más conectores (3), dependiendo del número de restos de biotina que se unen al agente de captura (normalmente por restos de lisina que están presentes en el agente de captura). Por ejemplo, como se muestra esquemáticamente en la Figura 2D para la situación donde el agente de captura es una construcción de Nanobody bivalente, cada uno de los Nanobodys en la construcción se puede unir al soporte por uno o más conectores de avidina-estreptavidina (3), nuevamente dependiendo del número de biotinas unidas a cada Nanobody (en caso de la construcción bivalente mostrada como ejemplo no limitante en la Figura 2D, el Nanobody (8a) se une al soporte por un conector de avidina-estreptavidina (3) y el Nanobody (8b) se une al soporte por dos conectores de avidina-estreptavidina (3)). Ventajosamente, las etapas anteriores se pueden realizar usando metodologías y técnicas en sí conocidas para realizar ensayos de ECL (tales como condiciones de ensayo, tampones de ensayo, etapas de lavado, soportes sólidos y conectores para inmovilizar el agente de captura y métodos para hacer lo mismo, etiquetas/marcas adecuadas y métodos para unirlas con el agente de detección, técnicas para detectar/medir la marca detectable y equipo para realizar los ensayos todos en sí conocidos para realizar ensayos de ECL) o solo con modificaciones menores de dichas metodologías o técnicas conocidas (que pueden ser fácilmente determinadas y aplicadas por el experto en la técnica de ensayos de ADA, opcionalmente después de un grado limitado de ensayo y error). Por ejemplo y sin limitación, al igual que con los ensayos de ECL descritos en la Figura 1, los ensayos de la invención se pueden realizar usando la plataforma Meso Scale Discovery, comercialmente disponible de Meso Scale Discovery LLC (véase www.mesoscale.com). Otras técnicas incluyen, por ejemplo, técnicas basadas en ELISA e inmunoensayos Delfia® (lo último también es muy apto para su uso en una configuración homogénea, como se describe en el presente documento).

Además, después de que la cantidad de marca (es decir, correspondiente a la cantidad de complejo formado) se haya medido/detectado (los diferentes componentes correspondientes a), las diferentes señales pueden ser caracterizadas adicionalmente, y/o los resultados/lectura obtenidos se pueden comparar con los resultados obtenidos de otros ensayos o mediciones realizados en la(s) muestra(s) (o en otras muestras obtenidas, por ejemplo, del mismo sujeto o grupo de sujetos). En un aspecto, la invención se refiere a un método de detección y/o medición de anticuerpos anti­ fármaco (tales como, en particular pero sin limitación, ADA que se presentan durante el tratamiento) contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (tal como, en particular pero sin limitación, un compuesto biológico) que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta (y en particular, al menos un ISV con una región carboxiterminal expuesta) en una muestra, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra con un agente de captura que se inmoviliza sobre un soporte, en donde dicho agente de captura es o consiste esencialmente en dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, en condiciones tales que cualquier anticuerpo anti-fármaco contra dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula pueda unirse a dicho agente de captura;

b) (opcionalmente) retirar cualquier componente o constituyente presente en dicha muestra que no se une al agente de captura;

c) detectar o medir cualquier anticuerpo anti-fármaco que se haya unido al agente de captura, poniendo en contacto el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado con un agente de detección, en condiciones tales que dicho agente de detección pueda unirse a (el complejo del agente de captura y) a cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado,

en donde o:

x) dicho agente de captura es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (inmovilizado sobre el soporte sólido); y (ii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; y el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)n en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1,2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

o:

y) dicho agente de detección es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; (ii) una etiqueta o marca detectable unida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (ya sea directamente o por un conector adecuado) y (iii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de detección tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)n en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

Como se indica en el presente documento, en la configuración secuencial de los métodos de la invención, las etapas anteriores a) a c) se llevarán a cabo secuencialmente (y normalmente incluirán la etapa de lavado b); mientras que en la configuración homogénea, las etapas a) y c) se llevarán a cabo esencialmente simultáneamente (como se describe en el presente documento) y sin la etapa de lavado b).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco (tal como, en particular pero sin limitación, ADA que se presentan durante el tratamiento) contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (tal como, en particular pero sin limitación, un compuesto biológico) que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta (y en particular, al menos un ISV con una región carboxiterminal expuesta) en una muestra, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra con un agente de captura que se inmoviliza sobre un soporte, en donde dicho agente de captura es o consiste esencialmente en dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, en condiciones tales que cualquier anticuerpo anti-fármaco contra dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula pueda unirse a dicho agente de captura;

b) (opcionalmente) retirar cualquier componente o constituyente presente en dicha muestra que no se une al agente de captura;

c) detectar o medir cualquier anticuerpo anti-fármaco que se haya unido al agente de captura, poniendo en contacto el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado con un agente de detección, en condiciones tales que dicho agente de detección pueda unirse a (el complejo del agente de captura y) cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado,

en donde dicho agente de captura es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (inmovilizado sobre el soporte sólido); y (ii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que comprende la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

Nuevamente, en la configuración secuencial de los métodos de la invención, las etapas anteriores a) a c) se llevarán a cabo secuencialmente (y normalmente incluirán la etapa de lavado b); mientras que en la configuración homogénea, las etapas a) y c) se llevarán a cabo esencialmente simultáneamente (como se describe en el presente documento) y sin la etapa de lavado b).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco (tal como, en particular pero sin limitación, ADA que se presentan durante el tratamiento) contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (tal como, en particular pero sin limitación, un compuesto biológico) que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta (y en particular, al menos un ISV con una región carboxiterminal expuesta) en una muestra, comprendiendo dicho método al menos las etapas de: a) poner en contacto dicha muestra con un agente de captura que se inmoviliza sobre un soporte, en donde dicho agente de captura es o consiste esencialmente en dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, en condiciones tales que cualquier anticuerpo anti-fármaco contra dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula pueda unirse a dicho agente de captura;

b) (opcionalmente) retirar cualquier componente o constituyente presente en dicha muestra que no se une al agente de captura;

c) detectar o medir cualquier anticuerpo anti-fármaco que se haya unido al agente de captura, poniendo en contacto el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado con un agente de detección, en condiciones tales que dicho agente de detección pueda unirse a (el complejo del agente de captura y) cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado,

en donde dicho agente de detección es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; (ii) una etiqueta o marca detectable unida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (ya sea directamente o por un conector adecuado) y (iii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de detección tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)n en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

Nuevamente, en la configuración secuencial de los métodos de la invención, las etapas anteriores a) a c) se llevarán a cabo secuencialmente (y normalmente incluirán la etapa de lavado b); mientras que en la configuración homogénea, las etapas a) y c) se llevarán a cabo esencialmente simultáneamente (como se describe en el presente documento) y sin la etapa de lavado b).

La invención se refiere en particular a un método como se describe en el presente documento, en el que la muestra es una muestra de sangre completa, suero, plasma, líquido linfático, líquido ocular, líquido broncoalveolar/BALF, líquido cefalorraquídeo u otro líquido biológico (tal como esputo o lavados nasales); y en particular una muestra de sangre completa, suero o plasma. Dicha muestra también puede ser/haber sido preparada adecuadamente para su uso en el ensayo de la invención (por ejemplo, por métodos de dilución o extracción adecuados, si procede).

La invención también se refiere a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que la muestra ha sido obtenida de un sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula y en donde (i) la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula tiene una semivida que es tal que existe un riesgo o posibilidad de que los anticuerpos anti-fármaco contra la proteína, el polipéptido u otro compuesto o molécula se hayan producido en el sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (por ejemplo, dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula puede tener una semivida que es como se ha indicado adicionalmente en el presente documento); y/o (i) la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula se ha administrado a un sujeto según un régimen que es tal que existe un riesgo o posibilidad de que anticuerpos anti-fármaco contra la proteína, el polipéptido u otro compuesto o molécula se hayan producido en el sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (por ejemplo, en donde la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula se ha administrado repetidamente en intervalos relevantes, como será evidente por el experto/médico práctico).

Donde dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un fármaco o terapéutico, la muestra puede haber sido obtenida, por ejemplo, de un paciente que se ha tratado con dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula. Alternativamente, la muestra puede haber sido obtenida, por ejemplo, de un sujeto al que se ha administrado dicho biológico en el transcurso de un ensayo clínico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con el extremo/región carboxiterminal expuesto que está comprendido dentro del producto biológico es un dominio VH o ha derivado de un dominio VH. Nuevamente, dicho dominio variable de inmunoglobulina es preferentemente un ISV y más en particular un ISV que es un dominio VH, un dominio VHH o un ISV que ha derivado de un dominio VH o un dominio VHH.

En particular, el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con el extremo/región carboxiterminal expuesto tiene la secuencia de aminoácidos carboxiterminal VTVSS (que significa que los últimos 5 restos de aminoácidos carboxiterminales del dominio variable de inmunoglobulina con el extremo/región carboxiterminal expuesto son VTVSS, como es normalmente el caso para dominios VH y VHH).

Más en particular, la invención se refiere a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta comprendida dentro de dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un Nanobody (tal como, en particular, un dominio VHH, un dominio VHH humanizado o un dominio VH camelizado, tal como un dominio VH humano camelizado), un dAb o un anticuerpo de dominio (único); y preferentemente un Nanobody.

Sin embargo, se debe entender que la invención en su sentido más amplio no se limita a proteínas, polipéptidos y otros compuestos o moléculas que comprenden y/o se basan en ISV, sino que también comprende otras biologías que pueden comprender uno o más dominios variables de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta, tal como fragmentos scFv o diacuerpos.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el (al menos un) dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta (y en particular, el al menos un ISV con la región carboxiterminal expuesta) está presente en (es decir, forma) la región carboxiterminal de dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula. En particular, donde dicho al menos un dominio variable de inmunoglobulina tiene la secuencia de aminoácidos carboxiterminal VTVSS, dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula también puede tener la secuencia de aminoácidos carboxiterminal VTVSS (que significa que los últimos 5 restos de aminoácidos carboxiterminales del producto biológico son VTVSS).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es o consiste esencialmente en un dominio variable único de inmunoglobulina monovalente.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende al menos un dominio variable único de inmunoglobulina y al menos otro resto terapéutico o entidad (ya sea unido directamente o por un conector adecuado).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende al menos dos (tal como dos, tres, cuatro o cinco) dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende al menos dos dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado) que son los mismos.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en al menos dos (tal como dos, tres, cuatro o cinco) dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado) que son diferentes.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en al menos dos (tal como dos, tres, cuatro o cinco) dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado) que se dirigen cada uno a una diana diferente (es decir, de forma que la proteína resultante, polipéptido u otro compuesto o molécula sea una construcción bi- o multiespecífica).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en al menos dos (tal como dos, tres, cuatro o cinco) dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado) que se dirigen cada uno a un epítope diferente en cada diana (es decir, de forma que la proteína resultante, polipéptido u otro compuesto o molécula sea un construcción bi- o multiparatópica).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en dos dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en tres dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en cuatro dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende además al menos un resto, dominio de unión o unidad de unión que confiere un aumento de semivida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula (es decir, en comparación con la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula correspondiente sin dicho resto, dominio de unión o unidad de unión).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicho al menos un resto, dominio de unión o unidad de unión que confiere un aumento de semivida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un dominio variable único de inmunoglobulina.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicho al menos un resto, dominio de unión o unidad de unión que confiere un aumento de semivida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un dominio variable único de inmunoglobulina que se dirige contra una proteína sérica, y en particular contra una proteína sérica humana.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicho al menos un resto, dominio de unión o unidad de unión que confiere un aumento de semivida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un dominio variable único de inmunoglobulina que se dirige contra albúmina de suero, y en particular contra albúmina de suero humano.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicho al menos un resto, dominio de unión o unidad de unión que confiere un aumento de semivida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un Nanobody, dAb o un anticuerpo de dominio (único).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicho al menos un resto, dominio de unión o unidad de unión que confiere un aumento de semivida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un Nanobody, y en particular un Nanobody que se dirige contra una proteína sérica (y en particular una proteína sérica humana) y en particular contra albúmina de suero (y más en particular contra albúmina de suero humano).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en al menos dos (tal como dos, tres, cuatro o cinco) dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado), al menos uno de los cuales se dirige contra una proteína sérica, y en particular contra una proteína sérica humana.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en al menos dos (tal como dos, tres, cuatro o cinco) dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado), al menos uno de los cuales se dirige contra albúmina de suero, y en particular contra albúmina de suero humano (que puede estar en el extremo aminoterminal, en el extremo carboxiterminal, o si el compuesto en total (es decir, que incluye el ISVD de unión a albúmina de suero) comprende más de tres ISVD, en alguna parte en el centro del compuesto).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el al menos un dominio variable único de inmunoglobulina que se dirige contra una proteína sérica (y en particular contra una proteína sérica humana) y en particular contra albúmina de suero (y más en particular contra albúmina de suero humano) tiene un extremo/región carboxiterminal expuesto (es decir, es el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con un extremo/región carboxiterminal expuesto que está presente en la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el al menos un dominio variable único de inmunoglobulina que se dirige contra una proteína sérica (y en particular contra una proteína sérica humana) y en particular contra albúmina de suero (y más en particular contra albúmina de suero humano) está presente en y/o forma el extremo/región carboxiterminal de dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el extremo/región carboxiterminal del al menos un dominio variable único de inmunoglobulina que se dirige contra una proteína sérica (y en particular contra una proteína sérica humana) y en particular contra albúmina de suero (y más en particular contra albúmina de suero humano) tiene la secuencia VTVSS (es decir, los últimos 5 restos de aminoácidos carboxiterminales de dicho dominio variable de inmunoglobulina son VTVSS).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula comprende o consiste esencialmente en o:

- dos dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado), es decir, (dicho) dominio variable único de inmunoglobulina (tal como un Nanobody) que confiere un aumento de semivida y otro dominio variable único de inmunoglobulina (tal como un Nanobody) que se puede dirigir en particular contra una diana terapéutica

- tres dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado), es decir, (dicho) dominio variable único de inmunoglobulina (tal como un Nanobody) que confiere un aumento de semivida y otros dos dominios variables únicos de inmunoglobulina (tal como dos otros Nanobodys) que se pueden dirigir en particular contra una diana terapéutica (en la que dichos dos otros dominios variables únicos de inmunoglobulina se pueden dirigir contra la misma diana, contra dos dianas diferentes o contra dos epítopes diferentes en la misma diana); o

- cuatro o cinco dominios variables únicos de inmunoglobulina (ya sea unidos directamente o por un conector adecuado), es decir, (dicho) dominio variable único de inmunoglobulina (tal como un Nanobody) que confiere un aumento de semivida y tres o cuatro otros dominios variables únicos de inmunoglobulina (tal como tres de cuatro otros Nanobodys) que se pueden dirigir en particular contra una diana terapéutica (en la que dichos tres o cuatro otros dominios variables únicos de inmunoglobulina se pueden dirigir contra la misma diana, contra dianas diferentes y/o contra epítopes diferentes en la misma diana, o cualquier combinación de los mismos).

La invención se refiere a un método en el que o el agente de detección o el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 (y preferentemente 1 o 2, tal como 1), y en la que cada X es un resto de aminoácido (preferentemente que existen de forma natural); y en la que cada X se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que el agente de captura y el agente de detección tienen esencialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, pero con 1 a 10, preferentemente 1 a 5 (tal como 1, 2, 3, 4 o 5) restos de aminoácidos (se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I)) añadidos en el extremo carboxiterminal de 0 el agente de captura o el agente de detección.

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS en su extremo carboxiterminal y en que o el agente de detección o el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1,2, 3, 4 o 5 (y preferentemente 1 o 2, tal como 1), y en la que cada X es un resto de aminoácido (preferentemente que existe de forma natural) que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

La invención se refiere además a un método como se describe adicionalmente en el presente documento, en el que la etiqueta o marca detectable comprendida dentro del agente de detección es una etiqueta o marca que se puede detectar usando electroquimioluminiscencia u otras técnicas adecuadas (por ejemplo, Delfia®, Luminex®, FRET u otras marcas detectables/ técnicas de detección adecuadas para su uso con ensayos de unión de ligandos basados en ELISA.

La invención se ilustrará ahora por medio de los siguientes ejemplos no limitantes y figuras, en las que:

La Figura 1 muestra esquemáticamente los principios de los formatos del ensayo de puente del estado de la técnica (tales como el formato de puente de ELISA o el formato de puente de ECL) para detectar ADA contra un anticuerpo convencional.

Las Figuras 2A a 2D muestran esquemáticamente el uso de un ensayo de la invención para detectar ADA contra una construcción de ISV bivalente, usando un agente de detección extendido por alanina.

La Figura 3 muestra esquemáticamente el uso de un ensayo de la invención para detectar ADA contra un ISV monovalente.

Las Figuras 4A a 4C muestran esquemáticamente el uso de un ensayo de la invención para detectar ADA contra una construcción de ISV bivalente, usando un agente de captura extendido por alanina.

La Figura 5 es una tabla que resume los diferentes formatos de ensayo que se compararon en el Ejemplo 1.

La Figura 6 muestra el cribado y los resultados de confirmación de 171 muestras de prueba obtenidas en el Ejemplo 2 para un formato de puente basado en ECL homogénea convencional (estado de la técnica) y el formato de puente modificado de la invención usando un agente de detección extendido por alanina.

La Figura 7 muestra una comparación del formato de puente basado en ECL homogénea convencional con el formato de puente basado en ECL homogénea modificada en ausencia de anticuerpos preexistentes.

La Figura 8 muestra el resultado de una evaluación comparativa del impacto de interferencia sobre la detección de ADA en un ensayo de ADA de puente convencional frente al ensayo de ADA de puente modificado. Los gráficos muestran la detección de control positivo enriquecido en muestras que contienen interferencia, para tanto el ensayo convencional (Panel A) como el ensayo modificado (Panel B).

PARTE EXPERIMENTAL

Ejemplo 1: Comparación de diferentes formatos de ensayo

Se evaluaron 5 formatos de ensayo de ADA diferentes para detectar ADA (mostrados esquemáticamente en la Figura 5) para la influencia de la interferencia de proteínas sobre el rendimiento del ensayo respectivo (cuando se usa para medir ADA contra un Nanobody), usando un conjunto de 171 muestras de prueba que comprenden plasma o muestras de suero de 121 voluntarios sanos y 50 pacientes con artritis reumatoide (ninguno de los cuales había sido previamente expuesto a los Nanobodys). La proteína basada en Nanobody usada fue SEQ ID No. 417 del documento de patente WO 06/122786.

Se evaluó cada uno de los formatos de ensayo sobre la prevalencia y la magnitud de la interferencia en los ensayos respectivos, así como la influencia de cualquier interferencia sobre el rendimiento del ensayo, que incluye el cribado y el ajuste del punto de corte confirmatorio, la sensibilidad del ensayo y el grado al que era posible detectar de forma fiable los ADA que se presentan durante el tratamiento en presencia de interferencia.

Se encontró que el formato de puente basado en ECL modificada proporcionaba/permitía: (i) sensibilidad del ensayo inferior a 500 ng/ml, como se recomendó por las pautas aplicables para ensayos de ADA; (ii) ajuste del punto de corte adecuado (tanto de cribado como confirmatorio) usando estadística apropiada, nuevamente como se recomienda por las normas habituales para ensayos de ADA; y (iii) que incluso cantidades relativamente bajas de ADA "verdaderos" se pudieran detectar en muestras probadas que (también) contuvieron factores interferentes (también se espera que la detección de ADA que se presentan durante el tratamiento sea aún posible en niveles relativamente altos de factores interferentes, aunque a niveles muy altos la sensibilidad puede ser (algo) reducida.

Los otros cuatro formatos de ensayo estuvieron afectados por un grado mucho mayor por la interferencia, de forma que la detección de ADA estuvo muy impedida en la mayoría de las muestras que contenían interferencia. Solo en muestras que presentaban niveles bajos/muy bajos de interferencia, los ADA pudieron ser detectados de forma fiable.

La cantidad de ADA que se pudo detectar era además dependiente de la sensibilidad del ensayo: el formato de puente basado en ECL secuencial mostró la sensibilidad más baja (que se estimó que era superior a 5 pg/ml), mientras que se encontró el formato de puente basado en ELISA secuencial y el formato de ELISA directo tenían una sensibilidad estimada que era de 600 ng/ml, que es superior a la sensibilidad recomendada por pautas aplicables. Por lo tanto, para todos los formatos de ensayo probados, se encontró que existe un cierto grado de correlación entre el nivel de interferencia (o señal de ECL basal) y la cantidad de ADA que se puede detectar. Esto puede hacer posible definir valores umbral (basados en las lecturas de ECL) para los máximos niveles de interferencia a cuyos bajos niveles de ADA puede todavía ser detectado de forma fiable.

Los resultados también se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: visión general de diferentes formatos de ensayo evaluados para

el impacto de la interferencia sobre el rendimiento del ensayo.

Ejemplo 2: Comparación del formato de puente basado en ECL homogénea usando un agente de detección modificado carboxiterminal modificado con un formato de puente basado en ECL homogénea usando un agente de detección no modificado.

Se compararon dos formatos de puente basados en ECL homogéneas. En un formato, el agente de captura (biotinilado para unirse al soporte) y el agente de detección (etiquetado con sulfo para la detección de ECL) tuvieron esencialmente la misma secuencia (SEQ ID NO. 417 del documento de patente WO 06/122786). En el otro formato, se usó el mismo agente de captura y agente de detección que se usó para el primer formato, pero el agente de detección se había modificado añadiendo un resto de alanina adicional al extremo C de la secuencia de proteínas basada en Nanobody.

Las mismas 171 muestras de prueba usadas en el Ejemplo 1 se probaron nuevamente en una configuración de cribado y confirmatoria.

Cuando se usó el formato de puente modificado homogéneo según la invención, se encontró que el número de muestras de prueba que presentaban altas señales de ECL se redujo enormemente (Figura 6). Además, la variación en las señales ECL es menor; variando desde 180 hasta < 2.500. Se podría usar un método estadístico comúnmente usado (análisis de gráfico de cajas para la identificación de valores atípicos) para definir satisfactoriamente puntos de corte en el conjunto de datos de cribado y confirmatorio.

El panel A en la Figura 6 muestra los resultados de cribado de las 171 muestras de prueba en ambos formatos de ensayo. Los puntos de corte de cribado se indican por líneas de puntos. Las muestras representativas que tienen altos niveles de interferencia en el ensayo de puente basado en ECL homogénea (muestras que también se usaron en experimentos denominados en el Ejemplo 1) se indican por asteriscos o cuadrados, respectivamente, estando todas las otras muestras indicadas por puntos.

El panel B en la Figura 6 muestra los resultados de la configuración confirmatoria en comparación con valores de cribado del ensayo de puente basado en ECL homogénea: se representaron los resultados de cribado (señal de ECL) frente al % de reducción obtenido en el ensayo confirmatorio. Se encuentra una correlación positiva entre la señal de ECL de cribado y el % de reducción obtenido del ensayo confirmatorio.

Los resultados confirmatorios obtenidos muestran una distribución continua (es decir, el % de reducción varía desde <20 % hasta >90 % de reducción), que indica que la interferencia está presente en cantidades variables en muchas muestras de prueba. Esto dificulta definir una población de interferencia negativa distinta que es un requisito previo para los métodos estadísticos comúnmente usados que definen los puntos de corte de cribado y confirmatorios. Como el ajuste de los puntos de corte de cribado y confirmatorios se basa en el centil 95/intervalo de confianza y centil 99/intervalo de confianza, respectivamente, de la respuesta de la población no tratada de blanco, el punto de corte calculado será muy dependiente de la distribución de las señales de ECL dentro del conjunto de muestras de validación y, por lo tanto, el ajuste del punto de corte se vuelve arbitrario.

El panel C en la Figura 6 muestra los resultados de los resultados de cribado y confirmatorios en el formato de puente modificado (es decir, usando un agente de detección extendido por alanina): se representaron los resultados del cribado (señal de ECL) frente al % de reducción obtenido en el ensayo confirmatorio. El número de muestras de prueba que muestran altos valores de ECL de cribado es menor, lo que permite el ajuste del punto de corte por métodos estadísticos comúnmente usados.

Los datos de la Figura 6 muestran que mientras que un formato de puente de ECL convencional es afectado significativamente por interferencia, el ensayo de puente modificado usando un agente de captura extendido por alanina es afectado a un grado mucho menor. Por lo tanto, mientras que para un formato de ensayo de ADA de puente convencional el ajuste del punto de corte sería en gran medida más o menos arbitrario, puntos de corte relevante podrían ser establecidos para el formato de ADA de puente modificado usando métodos estadísticos comúnmente usados.

Por lo tanto, se comparó la sensibilidad de ambos formatos de ensayo en ausencia de interferencia, usando datos obtenidos para un suero de control positivo (suero de conejo producido contra SEQ ID NO. 417 del documento de patente WO 06/122786) como una referencia. En ausencia de interferencia, la sensibilidad de ambos ensayos fue comparable como se muestra en la Figura 7. Esto confirma que las diferencias entre los dos formatos de ensayo en presencia de interferencia son de hecho debidas a la presencia de la interferencia.

Los resultados anteriores se confirmaron adicionalmente por un experimento separado en el que diferentes muestras de prueba con niveles variables de interferencia se enriquecieron con el suero de control positivo de conejo usado para obtener los datos mostrados en la Figura 7 y se evaluaron en ambos formatos de ensayo (los resultados mostrados en la Figura 8). Nuevamente, se encontró que para el formato de ensayo de puente convencional, no fue posible detectar (de forma fiable) los ADA en muestras con alto nivel de interferencia; mientras que para el formato de puente modificado que implica el uso de un agente de captura extendido por alanina se encontró que este ensayo podría detectar satisfactoriamente bajas cantidades de ADA en presencia de interferencia (véanse los datos mostrados en la Figura 8). Las barras indican la señal de ECL de diferentes muestras de matriz enriquecidas con suero policlonal de control positivo enriquecido en concentraciones de 0 y 620 y 5580 ng/ml. Las barras negras representan los resultados obtenidos con la matriz de interferencia negativa. Las barras grises numeradas 1-6 representan señales de ECL de pAb de control positivo enriquecido en 3 concentraciones diferentes en muestras de ejemplo que contienen cantidades variables de interferencia. El panel A muestra los resultados obtenidos en el ensayo de puente homogéneo y el panel B los resultados obtenidos en el ensayo de puente modificado homogéneo. La línea negra horizontal muestra un ejemplo de valores de ECL umbral adecuados para cada uno de estos ensayos, es decir, el valor de ECL de la muestra de prueba que todavía permite la detección de una cantidad aceptable de ADA en presencia de interferencia).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Método de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco contra una proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina con una región carboxiterminal expuesta en una muestra, que ha sido obtenido de un sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula y en donde la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula se ha administrado a un sujeto según un régimen que es tal que existe un riesgo o posibilidad de que se hayan producido anticuerpos anti-fármaco contra la proteína, el polipéptido u otro compuesto o molécula en el sujeto al que se ha administrado dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:

a) poner en contacto dicha muestra con un agente de captura que se inmoviliza sobre un soporte, en donde dicho agente de captura es o consiste esencialmente en dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, en condiciones tales que cualquier anticuerpo anti-fármaco contra dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula pueda unirse a dicho agente de captura;

b) opcionalmente retirar cualquier componente o constituyente presente en dicha muestra que no se une al agente de captura;

c) detectar o medir cualquier anticuerpo anti-fármaco que se haya unido al agente de captura, poniendo en contacto el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado con un agente de detección, en condiciones tales que dicho agente de detección pueda unirse a cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado y/o el complejo del agente de captura y cualquier anticuerpo anti-fármaco capturado,

en donde o:

x) dicho agente de captura es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; y (ii) 1 -10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1,2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I);

o:

y) dicho agente de detección es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; (ii) una etiqueta o marca detectable unida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula y (iii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula,

y el agente de detección tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1,2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I),

en el que dicha muestra es una muestra de sangre completa, suero, plasma, líquido ocular, líquido broncoalveolar/BALF, líquido cefalorraquídeo u otro líquido biológico.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho agente de captura es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; y (ii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de captura tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho agente de detección es o consiste esencialmente en: (i) dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula; (ii) una etiqueta o marca detectable unida a dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula y (iii) 1-10 restos de aminoácidos que se unen al extremo carboxiterminal expuesto del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta que está comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula, y el agente de detección tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)ⁿ en su extremo carboxiterminal, en la que n es 1 a 10, preferentemente 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y preferentemente 1 o 2, tal como 1; y en la que cada X es un resto de aminoácido, preferentemente un resto de aminoácido natural que se elige independientemente, y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I).

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula tiene una semivida de al menos 1 día, preferentemente al menos 3 días, más preferentemente al menos 7 días, tales como al menos 10 días, en un sujeto humano.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un dominio VH o ha derivado de un dominio VH.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un dominio variable único de inmunoglobulina.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el al menos un dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta comprendida dentro de la proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula es un Nanobody, tal como, en particular, un dominio VHH, un dominio VHH humanizado o un dominio VH camelizado, tal como un dominio VH humano camelizado, un dAb o un anticuerpo de dominio único.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta está presente en el extremo carboxiterminal de dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el extremo carboxiterminal del dominio variable de inmunoglobulina con la región carboxiterminal expuesta tiene la secuencia VTVSS.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el extremo carboxiterminal de dicha proteína, polipéptido u otro compuesto o molécula tiene la secuencia VTVSS.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etiqueta o marca detectable comprendida dentro del agente de detección es una etiqueta o marca que se puede detectar usando técnicas de electroquimioluminiscencia.