ES2900973T3 - Constructo genético de vector individual que comprende genes de insulina y glucoquinasa - Google Patents

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Abstract

Constructo de expresión viral que comprende los siguientes elementos: a) una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina enlazada operativamente a un primer promotor; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa enlazada operativamente a un segundo promotor; donde el primer y el segundo promotor se posicionan en la orientación inversa dentro del constructo de expresión y se sitúan adyacentes entre sí.

Description

DESCRIPCIÓN
Constructo genético de vector individual que comprende genes de insulina y glucoquinasa
Campo de la invención
[0001] La invención se refiere al campo médico, que comprende composiciones de terapia génica para su uso en el tratamiento de la diabetes de tipo 1 (T1D), la diabetes de tipo 2 (T2D) y/o la diabetes monogénica, ya sea en mamíferos superiores, particularmente animales domésticos y más particularmente perros; o en seres humanos.
Antecedentes de la invención
[0002] Las dos formas principales de diabetes mellitus son tipo 1 (TID) y tipo 2 (T2D) (Diabetes care, 1997, 20­ 1183-1197). La TID se caracteriza por una falta grave de producción de insulina debido a la destrucción específica de las células p pancreáticas. La pérdida de células p en la TID es el resultado de un proceso autoinmune mediado, donde una inflamación crónica llamada insulitis causa destrucción de células p (Eizirik D.L. et al, 2001, Diabetologia, 44:2115-2133 and Mathis D et al, 2001, Nature, 414: 792-798).
[0003] La TID es una de las afecciones endocrinas y metabólicas más comunes en la infancia; la incidencia está aumentando rápidamente, especialmente entre los niños pequeños. La TID se diagnostica cuando la destrucción de células p mediada por autoinmunidad es casi completa y los pacientes necesitan terapia de reemplazo de insulina para sobrevivir en la edad adulta puede presentarse como T2D, con un deterioro lento en el control metabólico, y la posterior progresión a la dependencia de insulina. Esta forma se llama diabetes mellitus autoinmune latente en adultos (LADA) (Diabetes Atlas 4th edition, 2009, International Diabetes Federation). El tratamiento con insulina de por vida es la terapia de elección para la TID. Si bien el tratamiento de por vida con insulina exógena gestiona con éxito la diabetes, el mantenimiento correcto de un estado normoglucémico puede resultar un desafío, la hiperglucemia crónica conduce a complicaciones micro-vasculares graves (retinopatía y nefropatía), macro-vasculares (accidente cerebrovascular, infarto de miocardio), y neurológicas. Estas devastadoras complicaciones se pueden evitar mediante la normalización de los niveles de glucosa en sangre. La diabetes frágil es un ejemplo de enfermedad difícil de controlar. Además, en muchos países subdesarrollados, especialmente en familias menos privilegiadas, el acceso a herramientas de autocuidado así como a insulina es limitado y esto puede conducir a discapacidad grave y muerte prematura en niños diabéticos (Diabetes Atlas 4th edition, 2009, International Diabetes Federation, Beran D. et al 2006, Lancet, 368: 1689-1695, and Gale E.A., et al, 2006, Lancet, 368: 1626-1628). La causa más común de muerte en un niño con diabetes, desde una perspectiva global, es la falta de acceso a la insulina; por lo tanto la disponibilidad de un enfoque de terapia genética de una sola vez podría marcar una diferencia en términos de pronóstico cuando el acceso a la insulina es limitado (Greenwood H.L. et al, 2006, PLoS Med 3.e381).
[0004] La reducción de la hiperglucemia y el mantenimiento de la normoglucemia es un objetivo de cualquier enfoque terapéutico para la TID. La terapia actual para la mayoría de los pacientes diabéticos se basa en inyecciones subcutáneas regulares de mezclas de insulina soluble (de corta duración) y preparaciones de insulina lenta (de larga duración). Otros métodos terapéuticos incluyen la terapia génica, que ofrecería la ventaja potencial de una administración de un vector viral, que podría proporcionar idealmente la insulina necesaria a lo largo de la vida del sujeto diabético. el documento WO 2012/007458 divulga la generación de dos vectores virales, uno que expresa el gen de la insulina y otro que expresa el gen de la glucoquinasa como tratamiento para la diabetes. Sin embargo, todavía existe la necesidad de contar con un tratamiento para la diabetes mejorado donde se pueda usar una dosis menor de vector, donde se proporcione una expresión concomitante de cada gen en cada célula transfectada, donde se pueda obtener un rendimiento atractivo del virus y/o donde se reduzcan los potenciales efectos secundarios inducidos debido a las propiedades inmunológicas de la cápside.
[0005] Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de diseñar tratamientos nuevos para la diabetes que no tengan todos los inconvenientes de los de tratamientos existentes.
Descripción de la invención
[0006] Los inventores diseñaron estrategias mejoradas de terapia génica basadas en la transferencia de genes de insulina/glucoquinasa muscular mediada por vectores virales adenoasociados (AAV) para contrarrestar la hiperglucemia diabética, se generaron constructos virales de gen dual que codifican insulina y glucoquinasa para asegurar la expresión concomitante de ambos transgenes en las células musculares transducidas.
[0007] La generación de vectores de gen dual también permitirá disminuir la dosis de vector, que a su vez, debería resultar en un riesgo reducido de inmunidad desencadenada por la cápside u otras toxicidades. Desde un punto de vista regulatorio, el uso de un vector dual facilitará enormemente el desarrollo del tratamiento. Además, el uso de un vector dual permitirá una reducción drástica en el coste de fabricación de vectores AAV. Sin embargo, el experto en la materia sabe que un vector dual de este tipo debido a su tamaño no puede siempre ser producido en rendimientos suficientes para usarse en un entorno terapéutico y no siempre se pueden garantizar niveles de expresión aceptables de ambos transgenes. Todos los vectores duales probados en la parte experimental pudieron producirse con títulos aceptables y se encontró que podían garantizar niveles de expresión aceptables de ambos transgenes.
[0008] Por lo tanto, la generación de tales vectores duales AAV que contienen transgenes tanto de insulina como de glucoquinasa y que potencialmente tienen une eficacia terapéutica mejorada no constituyen una rutina para un experto en la técnica, como se demuestra en la parte experimental.
Constructo de expresión viral
[0009] En un primer aspecto se proporciona un constructo de expresión viral que comprende los siguientes elementos:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina enlazada operativamente a un primer promotor; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa enlazada operativamente a un segundo promotor;
donde el primer y el segundos promotor se posicionan en la orientación inversa en el constructo de expresión y se sitúan adyacentes entre sí.
[0010] Como parte de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se proporciona un constructo de expresión viral que comprende los elementos a) y b):
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina enlazada operativamente a un primer promotor, b) una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa enlazada operativamente a un segundo promotor, y dicho constructo de expresión viral comprende al menos uno de los elementos c), d) y e) c) el primer y el segundo promotor se posicionan en la orientación inversa en el constructo de expresión, d) el primer y el segundo promotor se posicionan en la orientación inversa en el constructo de expresión y se sitúan adyacentes entre sí y
e) el primer promotor es un promotor CMV, preferiblemente un promotor mini CMV.
[0011] Las definiciones de "constructo de expresión viral", "promotor", "enlazado operativamente" se han proporcionado en la parte de la descripción titulada "definiciones generales". En el contexto de la invención, los elementos a) y b) definen el casete de expresión de un constructo de expresión viral de la invención como se explica más detalladamente en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0012] En el contexto de la invención, una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina podría ser sustituida por:
i. Una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 1;
ii. Una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i);
iii. Una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) o (ii) debido a la degeneración del código genético; o,
iv. Una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID N.°: 1.
[0013] Una secuencia de nucleótidos preferida que codifica una insulina tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:1. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales". La SEQ ID N.°:1 es una secuencia de nucleótidos que codifica la insulina humana. La secuencia de nucleótidos que codifica una insulina puede derivar de cualquier gen de insulina, preferiblemente de perro, humano o rata; o un gen de insulina mutado, o un gen de insulina de codón optimizado, preferiblemente de humano, perro o rata como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2012/007458.
[0014] Una insulina como se utiliza en este caso ejerce al menos un nivel detectable de una actividad de una insulina como la que conoce el experto en la materia. Una actividad de una insulina es la regulación de hiperglucemia. Esto podría ser evaluado utilizando cualquier técnica conocida por el experto en la materia o como se hizo en la parte experimental.
[0015] En el contexto de la invención, una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa podría ser sustituida por:
i. Una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 2;
ii. Una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria híbrida con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i);
iii. Una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) o (ii) debido a la degeneración del código genético; o,
iv. Una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID N.°: 2.
[0016] Una secuencia de nucleótidos preferida que codifica una glucoquinasa tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:2. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales". La SEQ ID N.°:2 es una secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa humana. La secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa se puede derivar de cualquier gen de glucoquinasa, preferiblemente de humano o rata; o un gen de glucoquinasa mutada, o un gen de glucoquinasa de codón optimizado, preferiblemente de humano o rata como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2012/007458.
[0017] Una glucoquinasa como se utiliza en este caso ejerce al menos un nivel detectable de una actividad de una glucoquinasa como la conoce el experto en la materia. Una actividad de una glucoquinasa es fosforilar la glucosa. Esta actividad podría ser evaluada utilizando ensayos conocidos por el experto en la materia.
[0018] En el contexto de la invención, un primer promotor es un promotor que está operativamente enlazado a la secuencia de nucleótidos de insulina definida anteriormente y un segundo promotor es un promotor que está operativamente enlazado a la secuencia de nucleótidos de glucoquinasa definida anteriormente.
[0019] En una forma de realización, el primer y el segundo promotor son diferentes. Por lo tanto, no se excluye que el primer y el segundo promotor sean idénticos. En una forma de realización, ambos promotores son específicos de la célula y/o específicos del tejido, preferiblemente ambos promotores son específicos del músculo esquelético.
[0020] Un primer promotor preferido es un promotor de CMV (elemento e).
[0021] En el contexto de la invención, una secuencia de nucleótidos de un promotor de CMV podría ser sustituida por una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 3. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:3. La identidad se puede evaluar sobre toda la SEQ ID N.° o sobre parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0022] Un primer promotor como se utiliza en este caso (especialmente cuando su secuencia está definida tiene un porcentaje de identidad mínimo con una SEQ ID N.° dada) debería ejercer al menos una actividad de un promotor como lo conoce el experto en la materia. Consulte la parte de la descripción titulada "definiciones generales" para obtener una definición de tal actividad. Preferiblemente un primer promotor definido que tiene un porcentaje de identidad mínimo con una SEQ ID N.° dada debería controlar la transcripción de la secuencia de nucleótidos a la que está operativamente enlazada (es decir, una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina para el primer promotor) según se evalúa en un ensayo conocido por el experto en la materia. Lo mismo se aplica a un segundo promotor con una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa).
[0023] Preferiblemente dicho promotor de CMV se usa junto con una secuencia intrónica. En este contexto, una secuencia intrónica se puede sustituir por una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 4. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:4. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0024] En una forma de realización más preferida, un promotor de CMV es un promotor de mini CMV. En el contexto de la invención, una secuencia de nucleótidos de un promotor de mini CMV podría ser sustituida por una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°:5. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:5. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0025] En una forma de realización más preferida, una secuencia de nucleótidos de un promotor de mini CMV comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la s Eq ID N.°: 24. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:24. Aún más preferiblemente, una secuencia de nucleótidos de un promotor de mini CMV tiene al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 24 o al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:24 y tiene una longitud de 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 109,110 nucleótidos.
[0026] La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0027] En una forma de realización, dicho promotor de mini CMV se puede usar con la secuencia intrónica definida anteriormente.
[0028] Un segundo promotor preferido es un promotor de RSV.
[0029] En el contexto de la invención, una secuencia de nucleótidos de un promotor de RSV podría ser sustituida por una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 6. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:6. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0030] Preferiblemente dicho promotor de RSV se usa junto con una secuencia intrónica. En este contexto, una secuencia intrónica se puede sustituir por una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 23. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:23. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0031] En un aspecto preferido de la divulgación pero no de la invención reivindicada, el primer y el segundo promotor se posicionan en la orientación inversa en el constructo de expresión viral (elemento c). Esta forma de realización, implica que la insulina y las secuencias de nucleótidos de glucoquinasa se leen en direcciones opuestas. Más preferiblemente según la invención, en esta configuración, el primer y el segundo promotor son adyacentes entre sí (elemento d). En este contexto, "adyacente" significa que 0, 2, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 bases están presentes entre el primer y el segundo promotor.
[0032] Por lo tanto, la presente descripción abarca varios constructos de expresión viral pero no por la invención reivindicada:
Un constructo de expresión viral que comprende los elementos a), b) y c),
Un constructo de expresión viral que comprende los elementos a), b) y e),
Un constructo de expresión viral que comprende los elementos a), b) y e), donde el promotor de CMV es un promotor de mini CMV,
La presente invención abarca varios constructos de expresión viral:
Un constructo de expresión viral que comprende los elementos a), b) y d),
Un constructo de expresión viral que comprende los elementos a), b), d) y e),
Un constructo de expresión viral que comprende los elementos a), b), d) y e), donde el promotor de CMV es un promotor de mini CMV.
[0033] Para cada uno de estos constructos de expresión viral preferidos definidos anteriormente, el segundo promotor es preferiblemente un promotor de RSV tal y como se define en el presente documento.
[0034] En un aspecto de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, se engloba un constructo de expresión viral que comprende los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e), donde el primer promotor es un promotor de CMV, preferiblemente un promotor de mini CMV y/o donde el segundo promotor es un promotor de RSV.
[0035] En una forma de realización de la invención, se engloba un constructo de expresión viral que comprende los elementos a) y b) y d), donde el primer promotor es un promotor de CMV, preferiblemente un promotor de mini CMV y/o donde el segundo promotor es un promotor de RSV.
[0036] Pueden estar presentes secuencias adicionales en el constructo de expresión viral de la invención como se explica en detalle en la parte de la descripción titulada "definiciones generales". Las secuencias adicionales preferidas incluyen ITR, SV40 (es decir, que significa señal de poliadenilación SV40) (SEQ ID N.°: 22), bGH (es decir, que significa señal de poliadenilación bGH) (SEQ ID N.°:7), señal de poliadenilación SV40 y secuencia intensificadora (SEQ ID N.°:30), SV40 secuencia intensificadora (SEQ ID N.°: 33). En el contexto de la invención, "ITR" se destina a abarcar una ITR5' y un ITR3', cada una de ellas derivada del genoma de un AAV. Las ITR preferidas son de AAV2 y se representan mediante la SEQ ID N.°: 31 (ITR5') y la SEQ ID N.°: 32 (ITR3'). En el contexto de la invención, se incluye el uso de la secuencia intensificadora de SV40 o incluida en la señal de poliadenilación de SV40 (como SEQ ID N.°:30) o como una secuencia separada (como SEQ ID N.°:33). También se incluye el uso de la señal de poliadenilación de SV40 y la secuencia intensificadora de SV40 como dos secuencias separadas (SEQ ID N.°:22 y SEQ ID N.°: 33) o como una única secuencia (SEQ ID N.°:30).
[0037] Cada una de estas secuencias adicionales puede estar presente en el constructo de expresión viral de la invención. (véase, por ejemplo como se representa en las figuras 1 (constructos de referencia), 2 (constructos de referencia), 4, 7, l3, 16).
[0038] En un aspecto, el constructo de expresión viral según la divulgación pero no la invención reivindicada comprende los elementos a) y b), y al menos uno de los elementos c), d) y e) como se ha definido anteriormente y el constructo de expresión viral según la invención comprende los elementos a) y b) y d), y adicionalmente comprenden:
- ITR que flanquean el casete de expresión de dicho constructo,
- señales de poliadenilación de SV40 o bGH que se localizan en el 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina y/o
- señales de poliadenilación de SV40 y secuencia intensificadora que se localiza en el 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina y/o
- secuencia intensificadora de SV40 que se localiza en el 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina.
[0039] En un aspecto preferido, el constructo de expresión viral según la divulgación pero no la invención reivindicada comprende los elementos a) y b), y al menos uno de los elementos c), d) y e) como se ha definido anteriormente y el constructo de expresión viral según la invención comprende los elementos a) y b) y d), y además comprenden ITR que flanquean el casete de expresión de dicho constructo y opcionalmente
- señales de poliadenilación de SV40 o bGH que se localizan en el 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina y/o
- señales de poliadenilación y secuencia intensificadora de SV40 que se localizan en el 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina y/o
- secuencia intensificadora de SV40 que se localiza en el 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina.
[0040] Si la secuencia intensificadora de SV40 no se incluye en la señal de poliadenilación de SV40, la secuencia intensificadora de SV40 se sitúa preferiblemente en el 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa o insulina.
[0041] Estas secuencias se usaron en la parte experimental en algunos de los constructos identificados en el presente documento.
[0042] Por lo tanto, en una forma de realización, para cada uno de estos constructos de expresión viral preferidos definidos anteriormente, puede estar presente una secuencia adicional seleccionada del grupo que consiste en: ITR, señal de poliadenilación de SV40, señal de poliadenilación de bGH, señal de poliadenilación y secuencia intensificadora de SV40, secuencia intensificadora de SV40.
[0043] En un aspecto preferido, se engloba un constructo de expresión viral que comprende los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) según la divulgación pero no la invención reivindicada, y que comprende los elementos a) y b) y d) según la invención, donde el primer promotor es un promotor de CMV, preferiblemente un promotor de mini CMV y/o donde el segundo promotor es un promotor de RSV y/o donde está presente una secuencia adicional que se selecciona del grupo consistente en: ITR, señal de poliadenilación de SV40, señal de poliadenilación de bGH, señal de poliadenilación y secuencia intensificadora de SV40, secuencia intensificadora de SV40.
[0044] Los ITR preferidos son los de AAV2 que se representan por la SEQ ID N.°: 31 (ITR5') y la SEQ ID N.°: 32 (ITR3').
[0045] Los constructos de expresión val preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y los constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y son tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de los elementos c), d), e) está flanqueado por un ITR5' y un ITR3'.
[0046] Otros constructos de expresión viral preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y otros constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y son tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de c), d), e) está flanqueado por un ITR5' y un ITR3'. Además, están presentes señales de poliadenilación de SV40.
[0047] Otros constructos de expresión viral preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y otros constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y son tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de c), d), e) está flanqueado por un ITR5' y un ITR3'. Además, están presentes señales poliadenilación de SV40 y bGH.
[0048] Otros constructos de expresión viral preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y otros constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y son tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de c), d), e) se flanquea por un ITR5' y un ITR3'. Además, está presente la secuencia intensificadora de SV40. Otros constructos de expresión viral preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y otros constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y son tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de c), d), e) se flanquea por un ITR5' y un ITR3'. Además, están presentes la secuencia intensificadora de SV40 y señales de poliadenilación de SV40 como dos secuencias separadas.
[0049] Otros constructos de expresión viral preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y otros constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de c), d), e) se flanquea por un ITR5' y un ITR3'. Además, la secuencia intensificadora de SV40 y las señales de poliadenilación de SV40 están presentes como dos secuencias separadas. En esta forma de realización, también están presentes señales de poliadenilación de bGH.
[0050] Otros constructos de expresión viral preferidos según la divulgación pero no la invención reivindicada comprenden los elementos a) y b) y al menos uno de los elementos c), d) y e) y otros constructos de expresión viral preferidos según la invención comprenden los elementos a) y b) y d), y son tales que el casete de expresión tal y como se define por los elementos a), b) y al menos uno de c), d), e) se flanquea por un ITR5' y un ITR3'. Además, las señales de poliadenilación de SV40 y la secuencia intensificadora están presentes junto con las señales de poliadenilación de bGH.
[0051] Los constructos de expresión viral diseñados más preferidos de la divulgación pero no de la invención reivindicada incluyen:
Constructo A (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 8), Constructo D (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 9), Constructo E (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 10), Constructo G (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 12), Constructo J (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 13), Constructo K (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 14), Constructo M (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 16).
[0052] Los constructos de expresión viral diseñados más preferidos de la invención incluyen:
Constructo F (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 11), Constructo L (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 15), Constructo Q (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 27).
Constructo S (representado por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 29).
[0053] Como comprenderá el experto en la materia, cada uno de estos constructos de expresión viral comprende ya dos ITR de AAV2 (es decir, SEQ ID N.°: 31 (ITR5') y SEQ ID N.°: 32 (ITR3') ).
[0054] Los mejores resultados se obtuvieron con los constructos F (SEQ ID N.°: 11), el constructo de referencia J (SEQ ID N.°: 13), el constructo de referencia K (SEQ ID N.°: 14), el constructo L (SEQ ID N.°: 15), el constructo de referencia M (SEQ ID N.°: 16), el constructo Q (SEQ ID N.°: 27) y el constructo S (SEQ ID N.°: 29).
[0055] Los constructos L y Q comprenden tanto la señal de poliadenilación de bGH como las secuencias de señal de poliadenilación de SV40, intercambiándose el orden de cada una de estas secuencias 3' sin traducir (véanse figuras 7 y 13).
[0056] El constructo S comprende tanto la señal de poliadenilación de bGH como la señal de poliadenilación de SV40 y la secuencias potenciadoras (veáse figura 16).
[0057] Como se explica en la parte general titulada "definiciones generales", a lo largo de esta solicitud, cada vez que se hace referencia a una secuencia de nucleótidos específica SEQ ID N.° (tomar las SEQ ID N.°: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27, 29) que representa los constructos (de referencia) preferidos diseñados en este documento, se puede reemplazar por:
i. Una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 27 o 29;
ii. Una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i);
iii. Una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) o (ii) debido a la degeneración del código genético.
[0058] Cada secuencia de nucleótido descrita en este documento en virtud de su porcentaje de identidad (al menos un 60%) con una secuencia de nucleótidos dada tiene respectivamente en otra forma de realización preferida una identidad de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más identidad con el nucleótido dado respectivamente. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se determina comparando la longitud total de las secuencias identificadas en el presente documento. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, la identidad con una SEQ iD N.° dada significa una identidad o similitud basada en la longitud total de dicha secuencia (es decir, en toda su longitud o como un todo).
[0059] Un constructo definido por su identidad mínima (es decir, al menos un 60%) con una SEQ ID N.° dada como se ha identificado anteriormente está incluido en el marco de la invención cuando este constructo o un constructo de expresión viral o un vector viral que comprende este constructo o una composición que comprende este constructo o vector es capaz de inducir la expresión de insulina y glucoquinasa en una célula, preferiblemente en una célula muscular. La expresión de ambos genes podría ser evaluada utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia. En una forma de realización preferida, dicha expresión se evalúa como se realiza en la parte experimental.
[0060] En un aspecto preferido de la divulgación, pero no de la invención reivindicada, un constructo de expresión viral es tal que el constructo se representa por una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID N.°: 8, 9, 10, 12, 13, 14 o 16 o una secuencia con al menos un 60% de identidad con la SEQ ID N.°: 8, 9, 10, 12, 13, 14 o 16. En una forma de realización preferida de la invención, un constructo de expresión viral es tal que el constructo se representa por una secuencia de nucleótidos que comprende:
- los pares de bases 1-4663 de la SEQ ID N.°: 11 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma;
- los pares de bases 1-3925 de la SEQ ID N.°: 15 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma;
- los pares de bases 87-2704 y 5302-6519 de la SEQ ID N.°: 27 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma; o
- los pares de bases 87-2658 y 5256-6740 de la SEQ ID N.°: 29 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma.
Vector Viral
[0061] En otro aspecto, se proporciona un vector viral. Un vector viral comprende un constructo de expresión viral tal como se ha definido anteriormente. Un vector viral se define posteriormente en la parte de la descripción titulada "definiciones generales". preferiblemente un vector viral es un vector de retrovirus, un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado, un vector de herpesvirus, un vector de virus de polioma o un vector de virus vaccinia. También se proporcionan más detalles en la parte de la descripción titulada "definiciones generales".
[0062] En una forma de realización, se usa un vector viral adenoasociado que comprende cada uno de los elementos definidos anteriormente en este documento y un genoma basado en rAAV que comprende las repeticiones terminales invertidas (ITR) o una parte de las mismas. Las ITR preferidas son las de AAV2 que se representan por la SEQ ID N.°: 31 (ITR5') y SEQ ID N.°: 32 (ITR3').
[0063] Preferiblemente, dicho vector viral adenoasociado es un vector de virus adenoasociado, más preferiblemente un vector de AAV1.
[0064] Preferiblemente, un constructo de expresión viral y un vector viral de la invención se usan como medicamento. El medicamento es preferiblemente para prevenir, retrasar, curar, revertir y/o tratar una diabetes. La diabetes puede ser diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o diabetes monogénica. El sujeto tratado puede ser un mamífero superior, por ejemplo gatos, roedores, (preferiblemente ratones, ratas, jerbos y conejillos de Indias, y más preferiblemente ratones y ratas), o perros, o en seres humanos.
Composición
[0065] En otro aspecto, se proporciona una composición que comprende un constructo de expresión viral o un vector viral tal y como se ha definido anteriormente en el presente documento. Esta composición se denomina preferiblemente composición de terapia génica. Preferiblemente, la composición es una composición farmacéutica comprendiendo dicha composición farmacéutica un portador, adyuvante, diluyentes, solubilizador, agente de relleno, conservante y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.
[0066] Tal portador, agente de relleno, conservante, solubilizador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable puede encontrarse por ejemplo en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
[0067] En una forma de realización preferida, dicha composición es para usarla como medicamento, preferiblemente para prevenir, retrasar, curar, revertir y/o tratar una diabetes. La diabetes puede ser diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o diabetes monogénica. El sujeto tratado puede ser un mamífero superior, por ejemplo gatos, roedores, (preferiblemente ratones, ratas, jerbos y conejillos de Indias, y más preferiblemente ratones y ratas), o perros, o en seres humanos.
[0068] Preferiblemente, se dice que dicho constructo de expresión viral, vector viral y/o composición se puede usar para prevenir, retrasar, revertir, curar y/o tratar una diabetes, cuando dicho constructo de expresión viral, vector viral y/o composición son capaces de mostrar un efecto anti-diabetes. Se puede alcanzar un efecto anti­ diabetes cuando se aumenta la eliminación de glucosa en sangre y/o cuando se mejora la tolerancia a la glucosa. Esto podría ser evaluado utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia o como se hace en la parte experimental. En este contexto, "aumento" (respectivamente "mejora") significa al menos un aumento detectable (respectivamente una mejora detectable) usando un ensayo conocido por el experto en la materia o usando ensayos como los realizados en la parte experimental.
[0069] También se puede observar un efecto anti-diabetes cuando la progresión de un síntoma típico (es decir, insulitis, pérdida de células beta, ...) se ha ralentizado según la evaluación de un médico. Una reducción de un síntoma típico puede significar una desaceleración en la progresión del desarrollo de síntomas o una desaparición completa de los síntomas. Los síntomas, y por tanto también una reducción de los síntomas, se pueden evaluar usando una variedad de métodos, en gran parte los mismos métodos que se usan en el diagnóstico de la diabetes, incluidos el examen clínico y las pruebas de laboratorio rutinarias. Tales métodos incluyen métodos tanto macroscópicos como microscópicos, así como métodos moleculares, rayos X, bioquímicos, inmunohistoquímicos y otros.
[0070] Un medicamento tal y como se define en el presente documento (constructo de expresión viral, vector viral, composición) es preferiblemente capaz de aliviar un síntoma o una característica de un paciente o de una célula, tejido u órgano de dicho paciente si después de al menos una semana, un mes, seis meses, un año o más de tratamiento usando un vector de expresión viral o una composición de la invención, dicho síntoma o característica ya no es detectable.
[0071] Un constructo de expresión viral o un vector viral o una composición tal y como se define en el presente documento para su uso según la invención se puede adaptar para administrarse a una célula, tejido y/u órgano in vivo de individuos afectados por o en riesgo de desarrollar una diabetes, y se puede administrar in vivo, ex vivo o in vitro. Dicha combinación y/o composición puede ser directa o indirectamente administrada a una célula, tejido y/u órgano in vivo de un individuo afectado por o en riesgo de desarrollar una diabetes, y se puede administrar directa o indirectamente in vivo, ex vivo o in vitro. Un modo de administración preferido es intramuscular.
[0072] Un constructo de expresión viral o un vector viral o una composición de la invención puede administrarse directa o indirectamente usando medios adecuados conocidos en el campo de la técnica. Se anticipan mejoras en los medios para proporcionar a un individuo o una célula, tejido, órgano de dicho individuo con un constructo de expresión viral o un vector viral o una composición de la invención, considerando el progreso que ya se ha logrado hasta ahora. Por supuesto, tales mejoras futuras pueden ser incorporadas para conseguir el efecto mencionado de la invención. Se puede administrar un constructo de expresión viral o un vector viral o una composición tal cual a un individuo, una célula, tejido u órgano de dicho individuo. Dependiendo de la enfermedad o afección, una célula, tejido u órgano de dicho individuo puede ser como se ha definido anteriormente en el presente documento. Cuando se administra un constructo de expresión viral o un vector viral o una composición de la invención, se prefiere que dicho constructo de expresión viral o vector o composición se disuelva en una solución que sea compatible con el método de administración. Para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular intratecal, intraarticular y/o intraventricular se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. La administración intramuscular es un modo de administración preferido. Más preferiblemente, la administración intramuscular se realiza usando una multi-aguja. Como se engloba en el presente documento, una dosis terapéuticamente efectiva de un constructo de expresión viral, vector o composición como se ha mencionado anteriormente, se administra preferiblemente en una sola dosis única y evitando así la administración periódica repetida. Más preferiblemente, la dosis individual se administra al tejido muscular, e incluso más preferiblemente por medio de una única inyección multi-aguja.
[0073] Un compuesto adicional puede estar presente en una composición de la invención. Dicho compuesto puede ayudar en la administración de la composición. A continuación se proporciona una lista de compuestos adecuados: compuestos capaces de formar complejos, nanopartículas, micelas y/o liposomas que liberan cada constituyente como se define en el presente documento, complejos o retenidos en una vesícula o liposoma a través de una membrana celular. Muchos de estos compuestos se conocen en el campo de la técnica. Los compuestos adecuados comprenden polietilenimina (PEI), o polímeros catiónicos similares, con copolímeros de polipropilenimina o polietilenimina (PEC) y derivados, anfífilos sintéticos (SAINT-18), lipofectinaTM, DOTAP.
[0074] Dependiendo de su identidad, el experto en la técnica sabrá qué tipo de formulación es la más apropiada para la composición tal y como se define en el presente documento.
[0075] En este contexto, un compuesto adicional puede ser insulina que podría inyectarse regularmente.
Método / uso
[0076] En otro aspecto se proporciona un constructo de expresión viral o vector viral o composición tal y como se define en el presente documento para su uso en un método para prevenir, retrasar, revertir, curar y/o tratar una diabetes donde un constructo de expresión viral o vector viral o composición tal y como se define en el presente documento y tal y como se define su uso en el presente documento.
[0077] Tal constructo de expresión viral o vector viral o composición para su uso en un método es preferiblemente para aliviar uno o más síntoma(s) de diabetes en un individuo, en una célula, tejido u órgano de dicho individuo o aliviar una o más característica(s) o síntoma(s) de una célula, tejido u órgano de dicho individuo, comprendiendo el método la administración a dicho individuo un constructo de expresión viral o vector viral o una composición tal y como se define en el presente documento. En otro aspecto de la divulgación pero no de la invención reivindicada se proporciona un uso de un constructo de expresión viral o vector viral o una composición tal y como se define en el presente documento para la producción de un medicamento para prevenir, retrasar, revertir, curar y/o tratar una diabetes.
[0078] La diabetes y el tipo de sujeto tratado se han definido anteriormente en el presente documento.
[0079] En una forma de realización dicho método o uso es realizado in vitro, por ejemplo usando un cultivo celular. Preferiblemente, dicho método o uso es in vivo. Cada característica de estos métodos/usos ya ha sido definida en el presente documento. En un constructo de expresión viral o vector viral o composición para su uso en un método de la invención, se puede combinar un constructo de expresión viral o vector y/o una composición con un compuesto adicional conocido por su uso para el tratamiento de la diabetes en un individuo.
[0080] En una forma de realización preferida, un tratamiento en un constructo de expresión viral o vector viral o composición para su uso en un método según la invención no debe ser repetido. Alternativamente en un constructo de expresión viral o vector viral o composición para su uso en un método según la invención dicha administración del constructo de expresión viral o de dicha composición se puede repetir cada año o cada 2, 3, 4, 5 ,6 años.
Definiciones Generales
Identidad/similitud
[0081] En el contexto de la invención, una proteína o un fragmento de proteína como la insulina o la glucoquinasa se representa por una secuencia de aminoácidos.
[0082] En el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico como una molécula de ácido nucleico que codifica una insulina o una molécula de ácido nucleico que codifica una glucoquinasa se representa por un ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un polipéptido o un fragmento de proteína o un péptido o un péptido derivado. Una molécula de ácido nucleico puede comprender una región reguladora.
[0083] Se debe entender que cada molécula de ácido nucleico o proteína o fragmento de proteína o péptido o péptido derivado o polipéptido o constructo como se identifica en el presente documento por un número de identidad de secuencia (SEQ ID N.°) dado no se limita a esta secuencia específica como se ha descrito. Cada secuencia de gen o secuencia de nucleótidos o secuencia de ácidos nucleicos como se ha identificado en el presente documento que codifica una proteína o polipéptido o constructo o fragmento de proteína o péptido o péptido derivado dado o es en sí misma una proteína o un fragmento de proteína o polipéptido o constructo o péptido o péptido derivado. A lo largo de esta solicitud, cada vez uno se refiere a una secuencia de nucleótidos específica SEQ ID N.° (tomar SEQ ID N.°: X como ejemplo) que codifica un polipéptido dado, se puede reemplazar por:
i. Una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: X;
ii. Una secuencia de nucleótidos cuya cadena complementaria hibrida a una molécula de ácido nucleico de secuencia de (i);
iii. Una secuencia de nucleótidos cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (i) o (ii) debido a la degeneración del código genético; o,
iv. Una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60% de identidad de aminoácido o similitud con una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos SEQ ID N.°: X.
[0084] A lo largo de esta solicitud, cada vez que nos referimos a una secuencia de aminoácidos específica SEQ ID N.° (tomar SEQ ID N.°: Y como ejemplo), se puede reemplazar por: un polipéptido qu comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la secuencia de aminoácidos SEQ ID N.°: Y.
[0085] Cada secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento en virtud de su porcentaje de identidad o similitud (al menos el 60%) con una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos dada tiene respectivamente en otra forma de realización preferida una identidad o una similitud de al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más identidad o similitud con la secuencia de nucleótidos o aminoácidos dada respectivamente. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia o similitud se determina comparando la longitud total de las secuencias identificadas en el presente documento. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, la identidad o similitud con una SEQ ID N.° dada significa una identidad o similitud basada en la longitud total de dicha secuencia (es decir, en toda su longitud o como un todo).
[0086] Cada secuencia de nucleótidos no codificante (es decir, de un promotor o de otra región reguladora) podría ser sustituida por una secuencia de nucleótidos que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos un 60% de identidad de secuencia o similitud con la SEQ ID N.°: A. Una secuencia de nucleótidos preferida tiene al menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100% de identidad con la SEQ ID N.°:A. La identidad se puede evaluar en toda la SEQ ID N.° o en parte de la misma como se explica en el presente documento. En una forma de realización preferida, tal secuencia de nucleótidos no codificante, tal como un promotor, presenta o ejerce al menos una actividad de dicha secuencia de nucleótidos no codificante tal como la actividad de un promotor como la conoce el experto en la materia.
[0087] La "identidad de secuencia" se define en el presente documento como una relación entre dos o más secuencias de aminoácidos (polipéptidos o proteínas) o dos o más secuencias de ácidos nucleicos (polinucleótidos), según se determina comparando las secuencias. En una forma de realización preferida, la identidad de secuencia se calcula basándose en la longitud total de dos SEQ ID N.° dadas o en parte de las mismas. Parte de las mismas significa preferiblemente al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 100% de ambas SEQ ID n° . En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, según el caso, según lo determinado por la coincidencia entre las cadenas de tales secuencias.
[0088] La "similitud" entre dos secuencias de aminoácidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. La "identidad" y la "similitud" se pueden calcular fácilmente mediante métodos conocidos, incluidos pero no limitados a los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
[0089] Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos públicamente disponibles. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen por ejemplo el paquete de programas (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BestFit, BLASTP, b La STN, and FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El programa BLAST X está disponible para el público en NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El conocido algoritmo de Smith Waterman también se puede usar para determinar la identidad.
[0090] Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes: Algorithm: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992); Gap Penalty: 12; and Gap Length Penalty: 4. Un programa útil con estos parámetros está disponible para el público en como programa "Ogap" del Genetics Computer Group, ubicado en Madison, WI. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros por defecto para comparar aminoácidos (junto con ninguna penalización por los huecos finales).
[0091] Los parámetros preferidos para la comparación de ácidos nucleicos incluyen los siguientes: algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); matriz de comparación: coincidencias=+10; discordancias=0; penalización del espacio: 50; penalización de la longitud del espacio: 3. Disponible como el programa Gap del Genetics Computer Group, situado en Madison, Wis. Los parámetros por defecto para las comparaciones de ácidos nucleicos se indican anteriormente.
[0092] Opcionalmente, al determinar el grado de similitud de aminoácidos, el experto en la materia también puede tener en cuenta sustituciones de aminoácidos denominadas "conservadoras", como resultará evidente para el experto en la materia. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tiene cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas alifáticas laterales es glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales hidróxilo-alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas aromáticas laterales es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales con azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento son aquellas en las que se ha eliminado al menos un residuo en las secuencias descritas y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Preferiblemente, el cambio de aminoácidos es conservador. Las sustituciones conservadoras preferidas para cada uno de los aminoácidos de origen natural son las siguientes: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln o His; Asp por Glu; Cys por Ser o Ala; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gln; Ile por Leu o Val; Leu por Ile o Val; Lys por Arg; Gln o Glu; Met por Leu o Ile; Phe por Met, Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; y, Val por Ile o Leu.
Gen o secuencia codificante
[0093] "Gen" o "secuencia codificante" o "ácido nucleico" o "nucleico" se refiere a una región de ADN o ARN (la región transcrita) que "codifica" una proteína particular tal como una insulina o una glucoquinasa. Una secuencia codificante se transcribe (ADN) y se traduce (ARN) en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de una región reguladora apropiada, tal como un promotor. Un gen puede comprender varios fragmentos enlazados operativamente, tales como un promotor, una secuencia líder 5', un intrón, una secuencia codificante y una secuencia no no traducida 3', que comprende un sitio de poliadenilación o una secuencia señal. Un gen quimérico o recombinante (como un gen de insulina quimérica o un gen de glucoquinasa quimérica) es un gen que normalmente no se encuentra en la naturaleza, como un gen en el que por ejemplo el promotor no se asocia en la naturaleza con parte o toda la región de ADN transcrita. "Expresión de un gen" se refiere al proceso en el que un gen se transcribe en un ARN y/o traduce en una proteína activa.
Promotor
[0094] Como se utiliza en el presente documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes (o secuencia codificante), situado cadena arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN-polimerasa dependiente del ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluidos, entre otros, los sitios de unión al factor de transcripción, los sitios de unión a la proteína represora y activadora, y cualquiera de las otras secuencias de nucleótidos conocidas por un experto en la técnica que actúan directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor. Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se regula dependiendo de las condiciones fisiológicas o de desarrollo. Un promotor "específico de tejido" está preferentemente activo en tipos específicos de células/tejidos diferenciados, como preferiblemente una célula muscular o tejido derivado de la misma.
Operativamente enlazado
[0095] "Operativamente enlazado" se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia de control, como una secuencia promotora o secuencia reguladora, se coloca apropiadamente en una posición relativa a la secuencia de nucleótidos de interés, que codifica preferiblemente una insulina o una glucoquinasa de manera que el promotor o la secuencia de control o reguladora dirige o afecta la transcripción y/o producción o expresión de la secuencia de nucleótidos de interés, que codifican preferiblemente una insulina o una glucoquinasa en una célula y/o en un sujeto. Por ejemplo, un promotor está operativamente enlazado a una secuencia codificante si el promotor es capaz de iniciar o regular la transcripción o expresión de una secuencia codificante, en cuyo caso la secuencia codificante debe entenderse como estando "bajo el control del" promotor. Cuando una o más secuencias de nucleótidos y/o elementos comprendidos en un constructo se definen en el presente documento para ser "configurados para estar operativamente enlazados a una secuencia de nucleótidos opcional de interés", se entiende que dichas secuencias de nucleótidos y/o elementos están configurados dentro de dicho constructo de tal manera que estas secuencias de nucleótidos y/o elementos están todos operativamente enlazados a dicha secuencia de nucleótidos de interés una vez que dicha secuencia de nucleótidos de interés está presente en dicho constructo.
Constructo de expresión viral
[0096] Un constructo de expresión porta un genoma que puede estabilizarse y permanecer episómico en una célula. En el contexto de la invención, una célula puede significar abarcar una célula usada para fabricar el constructo o una célula en la que se administrará el constructo. Alternativamente, un constructo es capaz de integrarse en un genoma de la célula, por ejemplo a través de una recombinación homóloga o de otro modo. Un constructo de expresión particularmente preferido es aquel en el que una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glucoquinasa tal y como se define en el presente documento, está operativamente enlazado a un primer y a un segundo promotor tal y como se define en el presente documento donde dichos promotores son capaces de dirigir la expresión de dichas secuencias de nucleótidos (es decir, secuencias codificantes) en una célula. Se dice que tal constructo de expresión preferido que comprende un casete de expresión. Un casete de expresión como se utiliza en en el presente documento comprende o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa, cada una de las cuales está operativamente enlazada a un promotor (es decir, un primer y un segundo promotor) donde dichos promotores son capaces de dirigir la expresión de dichas secuencias de nucleótidos. Un constructo de expresión viral es un constructo de expresión que se destina para su uso en terapia génica. Está diseñado para comprender parte de un genoma viral como se define más adelante en el presente documento.
[0097] Los constructos de expresión descritos en el presente documento podrían prepararse usando técnicas recombinantes en las que las secuencias de nucleótidos que codifican dicha insulina y glucoquinasa se expresan en una célula adecuada, por ejemplo células cultivadas o células de un organismo multicelular, tal como se describe en Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) and in Sambrook and Russell (2001, supra). Also see, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci.
82:488 (describing site directed mutagenesis) and Roberts et al. (1987) Nature 328:731-734 or Wells, J.A., et al. (1985) Gene 34: 315 (describing cassette mutagenesis).
[0098] Típicamente, se usa un ácido nucleico o una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glucoquinasa en un constructo de expresión o un vector de expresión. La frase "vector de expresión" generalmente se refiere a una secuencia de nucleótidos que sea capaz de efectuar la expresión de un gen en un huésped compatible con tales secuencias. Estos vectores de expresión típicamente incluyen al menos secuencias de promotor adecuadas y opcionalmente, señales de terminación de transcripción. También se puede usar un factor adicional necesario o útil para efectuar la expresión como se describe en el presente documento. Se incorpora un ácido nucleico o ADN o secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glucoquinasa en un constructo de ADN capaz de introducirse y expresarse en un cultivo celular in vitro. Específicamente, un constructo de ADN es adecuado para la replicación en un huésped procariota, tal como bacterias, por ejemplo, E. Coli, o se puede introducir en un mamífero cultivado, planta, insecto, (por ejemplo, Sf9), levadura, hongos u otras líneas de células eucariotas.
[0099] Un constructo de ADN preparado para introducirse en un huésped particular puede incluir un sistema de replicación reconocido por el huésped, un segmento de ADN previsto que codifica un polipéptido deseado, y secuencias reguladoras de iniciación y terminación de la transcripción y traducción operativamente enlazadas al segmento codificante del polipéptido. El término "operativamente enlazadas" ya se ha definido en el presente documento. Por ejemplo, un promotor o intensificador está operativamente enlazado a una secuencia codificante si estimula la transcripción de la secuencia. El ADN de una secuencia señal está operativamente enlazado al ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción de un polipéptido. Generalmente, una secuencia de ADN que está operativamente enlazada es contiguos, y, en el caso de una secuencia señal, tanto contigua como en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesitan ser contiguos a una secuencia codificante cuya transcripción controlan. La conexión se realiza por ligación en sitios de restricción convenientes o en adaptadores o conectares insertados en lugar de los mismos, o por síntesis de genes.
[0100] La selección de una secuencia promotora apropiada depende generalmente de la célula huésped seleccionada para la expresión de un segmento de ADN. Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas incluyen promotores procarióticos y eucarióticos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001, supra). Una secuencia reguladora de la transcripción incluye típicamente un intensificador o promotor heterólogo que es reconocido por el huésped. La selección de un promotor apropiado depende del huésped, pero se conocen y están disponibles promotores tales como los promotores trp, lac y fago, promotores de ARNt y promotores de enzimas glicolíticas (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell, 2001, supra). Un vector de expresión incluye el sistema de replicación y se pueden emplear secuencias reguladoras transcripción y traducción junto con el sitio de inserción para el segmento que codifica el polipéptido. En la mayoría de los casos, el sistema de replicación sólo es funcional en la célula que se usa para producir el vector (célula bacteriana como E. Coli). La mayoría de plásmidos y vectores no se replican en las células infectadas con el vector. Se describen ejemplos de combinaciones viables de líneas celulares y vectores de expresión en Sambrook y Russell (2001, supra) y en Metzger et al. (1988) Nature 334: 31-36. Por ejemplo, los vectores de expresión adecuados se pueden expresar en, levadura, por ejemplo S.cerevisiae, por ejemplo, células de insectos, por ejemplo, células Sf9, células de mamíferos, por ejemplo, células CHO y células bacterianas, por ejemplo, E. Coli. Por tanto, una célula puede ser una célula huésped procariótica o eucariótica. Una célula puede ser una célula adecuada para el cultivo en medios líquidos o sólidos.
[0101] Alternativamente, una célula huésped es una célula que forma parte de un organismo multicelular, tal como una planta o animal transgénico.
Vector viral
[0102] Un vector viral o un vector de terapia génica es un vector que comprende un constructo de expresión viral como se ha definido anteriormente.
[0103] Un vector viral o un vector de terapia génica es un vector adecuado para la terapia génica. Los vectores que son adecuados para la terapia génica se describen en Anderson 1998, Nature 392: 25-30; Walther and Stein, 2000, Drugs 60: 249-71; Kay et al., 2001, Nat. Med. 7: 33-40; Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573­ 604; Amado and Chen, 1999, Science 285: 674-6; Federico, 1999, Curr. Opin. Biotechnol.10: 448-53; Vigna and Naldini, 2000, J. Gene Med. 2: 308-16; Marin et al., 1997, Mol. Med. Today 3: 396-403; Peng and Russell, 1999, Curr. Opin. Biotechnol. 10: 454-7; Sommerfelt, 1999, J. Gen. Virol. 80: 3049-64; Reiser, 2000, Gene Ther. 7: 910­ 3; y referencias citadas en dichas publicaciones.
[0104] Un vector de terapia génica especialmente adecuado incluye un vector de virus adenoasociado (AAV) y adenoviral. Estos vectores infectan un gran número de tipos de células que se dividen y que no se dividen con células sinoviales y células hepáticas. La naturaleza episómica de los vectores adenovirales y AAV después de la introducción celular hace que estos vectores sean adecuados para aplicaciones terapéuticas. (Russell, 2000, J. Gen. Virol. 81: 2573-2604; Goncalves, 2005, Virol J. 2(1):43) como se ha indicado anteriormente. Los vectores AAV son aún más preferidos ya que se sabe que dan como resultado una expresión a largo plazo muy estable de la expresión de transgénica (hasta 9 años en perros (Niemeyer et al, Blood. 2009 Jan 22;113(4):797-806) y ~ 2 años en humanos (Nathwani et al, N Engl J Med. 2011 Dec 22,365(25):2357-65, Simonelli et al, Mol ter. 2010 Mar;18(3):643-50. publicación electrónica 2009 Dec 1.)). Los vectores adenovirales preferidos se modifican para reducir la respuesta del huésped como fueron revisados por Russell (2000, supra). Wang et al., 2005, J gen Med describen métodos para la terapia genética que utilizan vectores AAV 9 de marzo (publicación electrónica antes de la impresión), Mandel et al., 2004, Curr Mol Opin ter. 6(5):482-90, y Martin et al., 2004, ojo 18(11): 1049-55, Nathwani et al, N Engl J Med. 2011 Dec 22;365(25):2357-65, Apparailly et al, Hum Gene Ther. 2005 Apr;16(4):426-34.
[0105] Otro vector de terapia génica adecuado incluye un vector retrovírico. Un vector retrovírico preferido para su aplicación en la presente invención es un constructo de expresión basado en lentiviral. Los vectores lentivirales tienen la capacidad para infectar e integrarse de forma estable en el genoma de células de división y no división (Amado and Chen, 1999 Science 285: 674-6). Los métodos para la construcción y uso de constructos de expresión basados en lentivirales se describen en las patentes estadounidenses Nos 6,165,782, 6,207,455, 6,218,181,6,277,633 y 6,323,031 and en Federico (1999, Curr Opin Biotechnol 10: 448-53) y Vigna et al. (2000, J Gene Med 2000; 2: 308-16).
[0106] Otros vectores de terapia génica adecuados incluyen un vector del virus del herpes, un vector del virus del polioma o un vector del virus vacuna.
[0107] Un vector de terapia génica comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glucoquinasa para ser expresada, por lo que cada una de dichas secuencias de nucleótidos está operativamente enlazada a las secuencias reguladoras apropiadas. Tal secuencia reguladora comprenderá al menos una secuencia promotora. Los promotores adecuados para expresar una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glicocinasa de vectores de terapia génica incluyen por ejemplo, un promotor temprano intermedio, del citomegalovirus (CMV), promotores de repetición terminal larga viral (lTr ), tal como los virus del sarcoma de Rous de la leucemia de Moloney Murino (MMLV) , o 1 de HTLV, el promotor temprano del virus símico 40 (SV 40) y el promotor de timidina quinasa del virus del herpes simplex. Los promotores adecuados se describen a continuación.
[0108] Se han descrito varios sistemas de promotores inducibles que se pueden inducir por la administración de pequeños compuestos orgánicos s o inorgánicos. Tales promotores inducibles incluyen aquellos controlados por metales pesados, tal como el promotor de metallothionina (Brinster et al. 1982 Nature 296: 39-42; Mayo et al.
1982 Cell 29: 99-108), RU-486 (a progesterone antagonist) (Wang et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 91: 8180-8184), steroids (Mader and White, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607), tetracycline (Gossen and Bujard 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551; Patatente estadounidense No. 5,464,758; Furth et al.
1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9302-9306; Howe et al. 1995 J. Biol. Chem. 270: 14168-14174; Resnitzky et al. 1994 Mol. Cell. Biol. 14: 1669-1679; Shockett et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6522-6526) y el sistema tTAER que se basa en el transactivador multi-quimérico compuesto por un polipéptido tetR, como dominio de activación de VP16, y un dominio de unión ligando a un receptor de estrógeno (Yee et al., 2002, US 6,432,705).
[0109] Un vector de terapia génica puede comprender opcionalmente una secuencia de nucleótidos adicional que codifica otro polipéptido adicional. Otro polipéptido adicional puede ser un polipéptido marcador (seleccionable) que permite la identificación, selección y/o cribado de células que contienen el constructo de expresión. Las proteínas de marcador adecuadas para este fin son por ejemplo la proteína fluorescente GFP, y los genes marcadores seleccionables HSV timidina quinasa (para selección en medio HAT), higromicina bacteriana B fosfotransferasa (para selección en higromicina B), Tn5 fosfotransferasa de aminoglicósido (para selección en G418), y dihidrofolato reductasa (DHFR) (para selección en metotrexato), CD20, el gen de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad. Las fuentes para obtener estos genes marcadores y los métodos para su uso se han previsto en Sambrook and Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
[0110] Un vector de terapia génica se formula preferiblemente en una composición farmacéutica tal y como se define en el presente documento. En este contexto, una composición farmacéutica puede comprender un soporte farmacéutico adecuado como se ha definido anteriormente en el presente documento.
Vector de virus adenoasociado (vector AAV)
[0111] Un vector viral preferido o un vector de terapia génica preferido es un vector AAV. Un vector AAV como se utiliza en este caso comprende preferiblemente un vector AAV recombinante (rAAV). Un "vector rAAV " como se utiliza en este caso se refiere a un vector recombinante que comprende parte de un genoma AAV encapsidado en una capa de proteína de la proteína cápside derivada de un serotipo AAV como se explica en este documento. Parte de un genoma AAV puede contener el las secuencias repetidoras terminales invertidas (ITR) derivadas de un serotipo de virus adenoasociado, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5 y otros. las ITR preferidas son las de a Av 2 que se representan por las SEQ ID N.°: 31 (ITR5') y SEQ ID N.°: 32 (|Tr3').
[0112] La capa de proteína compuesta de proteína cápside se puede derivar a partir de un serotipo AAV tal como AAV1, 2, 3, 4, 5 y otros. Una cápside de AAV preferida es una cápside de AAV1. Una ITR preferida es la del AAV2. Una capa de proteína también se puede denominar capa de proteína cápside. El vector rAAV puede tener uno o preferiblemente todos los genes a Av de tipo salvaje eliminados, pero aún puede comprender secuencias de ácido nucleico ITR funcionales. Las secuencias ITR funcionales son necesarias para la replicación, rescate y embalaje de viriones AAV. Las secuencias ITR pueden ser secuencias de tipo salvaje o pueden tener al menos 80%, 85%, 90%, 95, o 100% de identidad de secuencia con secuencias de tipo salvaje o se pueden alterar, por ejemplo, en la inserción, mutación, deleción o sustitución de nucleótidos, siempre que sigan siendo funcionales. En este contexto, la funcionalidad se refiere a la capacidad para dirigir el embalaje del genoma en la capa de cápside y luego permitir la expresión en la célula huésped que se va a infectar o en la célula diana. En el contexto de la presente invención una capa de proteína cápside puede ser de un serotipo diferente a la de la ITR del genoma del vector rAAV.
[0113] Una molécula de ácido nucleico representada por una secuencia de ácido nucleico de elección se inserta preferiblemente entre el genoma de rAAV o las secuencias de ITR como se ha identificado anteriormente, por ejemplo un constructo de expresión que incluyen un elemento regulador de expresión operativamente enlazado a una secuencia codificante y una secuencia de terminación 3'. Dicha molécula de ácido nucleico también se puede denominar transgén.
[0114] Las "funciones auxiliares de AAV " generalmente se refieren a las funciones de AAV correspondientes requeridas para la replicación y el embalaje de rAAV suministradas al vector de rAAV en trans. Las funciones auxiliares de AAV complementan las funciones de AAV que faltan en el vector rAAV, pero carecen de ITR de AAV (que se proporcionan mediante el genoma del vector rAAV). Las funciones auxiliares de AAV incluyen los dos o Rf principales de AAV, es decir, la región de codificación de rep y la región de codificación de tapa o secuencias funcionales sustancialmente idénticas a las mismas. Las regiones Rep y Cap se conocen bien en la técnica, véase por ejemplo Chiorini et al. Chiorini et al. (1999, J. of Virology, Vol 73(2): 1309-1319) o US 5,139,941. Las funciones auxiliares de AAV se pueden suministrar en un constructo auxiliar de AAV. La introducción del constructo auxiliar en la célula huésped puede ocurrir por ejemplo por transformación, transfección, o transducción antes o al mismo tiempo que la introducción del genoma de rAAV presente en el vector rAAV como se ha identificado en el presente documento. Los constructos auxiliares de AAV de la invención pueden así ser elegidos de manera que produzcan la combinación deseada de serotipos para la capa de proteína cápside del vector rAAV por un lado y para el genoma de rAAV presente en dicha replicación y embalaje del vector rAAV por otro lado.
[0115] El "virus auxiliar de AAV" proporciona funciones adicionales requeridas para la replicación y el embalaje de AAV. Los virus auxiliares de a Av adecuados incluyen adenovirus, virus del herpes simple (tales como HSV de los tipos 1 y 2) y virus de la vacuna. Las funciones adicionales proporcionadas por el virus auxiliar también pueden ser introducidas en la célula huésped mediante vectores, como se ha descrito en el documento US 6,531,456.
[0116] Un "transgén" se define en el presente documento como un gen o una molécula de ácido nucleico (es decir, una molécula que codifica una insulina y una molécula que codifica una glucoquinasa) que se ha introducido recientemente en una célula, es decir, un gen que puede estar presente pero normalmente puede no expresarse o expresarse en un nivel insuficiente en una célula. En este contexto, "insuficiente" significa que aunque dichas insulina y glucoquinasa se expresen en una célula, una afección y/o enfermedad tal y como se define en el presente documento todavía podría desarrollarse. En este caso, la invención permite la sobreexpresión de una insulina y una glucoquinasa. El transgén puede comprender secuencias que son nativas de la célula, secuencias que naturalmente no ocurren en la célula y puede comprender combinaciones de ambas. Un transgén puede contener secuencias que codifican una insulina y una glucoquinasa y/o proteínas adicionales como anteriormente se ha identificado en este documento que pueden ser operativamente enlazadas a secuencias reguladoras apropiadas para la expresión de las secuencias que codifican una insulina y una glucoquinasa en la célula. Preferiblemente, el transgén no se integra en el genoma de la célula huésped.
[0117] La "transducción" se refiere a la administración de una insulina y una glucoquinasa en una célula huésped receptora por un vector viral. Por ejemplo, la transducción de una célula diana por un vector rAAV de la invención lleva a transferir del genoma de rAAV contenido en ese vector en la célula transducida. "célula huésped" o "célula diana" se refiere a la célula en la que tiene lugar la administración de ADN, como las células musculares de un sujeto. Los vectores AAV son capaces de transducir tanto células de división como células que no se dividen.
Producción de un vector AAV
[0118] El vector AAV recombinante, que incluye todas las combinaciones de ITR de cápside de serotipo de AAV y genoma de AAV, se produce usando métodos conocidos en la técnica, como se describe en Pan et al. (J. of Virology 1999, Vol 73(4):3410-3417) y Clark et al. (Human Gene Therapy, 1999, 10:1031-1039). En breve, los métodos implican generalmente (a) la introducción del genoma de rAAV en una célula huésped, (b) la introducción de un constructo auxiliar de AAV en la célula huésped, donde el constructo auxiliar comprende las funciones virales que faltan en el genoma de rAAV y (c) introducir un virus auxiliar en la célula huésped. Todas las funciones para la replicación y embalaje del vector de rAAV tienen que estar presentes, para conseguir la replicación y el embalaje del genoma de rAAV en vectores rAAV. La introducción en la célula huésped se puede realizar usando técnicas virológicas estándar y puede ser simultánea o secuencial. Finalmente, las células huésped se cultivan para producir vectores rAAV y se purifican usando técnicas estándar tales como gradientes de CsCl (Xiao et al. 1996, J. Virol. 70: 8098-8108). La actividad residual del virus de auxiliar se puede inactivar usando métodos conocidos, como por ejemplo la inactivación térmica. El vector rAAV purificado está preparado entonces para su uso en los métodos. Se pueden conseguir títulos altos de más de 1012 partículas por ml y alta pureza (libres de virus auxiliares y de tipo salvaje detectables) (Clark et al. supra and Flotte et al. 1995, Gene Ther. 2: 29-37).
[0119] El genoma de rAAV presente en un vector de rAAV comprende al menos las secuencias de nucleótidos de las regiones de repetición terminal invertida (ITR) de uno de los serotipos de AAV (preferiblemente las del serotipo AAV2 como se ha descrito anteriormente en este documento), o secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a ellos o secuencias de nucleótidos que tienen al menos un 60% de identidad con el mismo, y secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glucoquinasa (bajo el control de un elemento regulador adecuado) insertada entre las dos ITR. Un genoma de vector requiere el uso de secuencias ITR flanqueantes 5' y 3' para permitir para el embalaje eficiente del genoma del vector en la cápside de rAAV.
[0120] Se ha secuenciado el genoma completo de varios serotipos de AAV e la ITR correspondiente (Chiorini et al. 1999, J. of Virology Vol. 73, No.2, p1309-1319). Pueden clonarse o prepararse por síntesis química como se conoce en la técnica, usando por ejemplo un sintetizador oligonucleótido como el suministrado por ejemplo por Applied Biosysttems Inc. (Fosters, Ca , USA) o por técnicas de biología molecular estándar. Las ITR se pueden clonar a partir del genoma viral de AAV o escindir a partir de un vector que comprenda las ITR de AAV. Las secuencias de nucleótidos de ITR se pueden ligar en cualquier extremo a la secuencia de nucleótidos que codifica una o más proteínas terapéuticas usando técnicas de biología molecular estándar, o la secuencia de AAV de tipo salvaje entre las ITR se puede sustituir por la secuencia de nucleótidos deseada.
[0121] Preferiblemente, el genoma de rAAV tal como está presente en un vector de rAAV no comprende ninguna de las secuencias de nucleótidos que codifique proteínas virales, tales como los genes rep (replicación) o cap (cápside) de AAV. Este genoma de rAAV puede comprender además un marcador o gen reportero, tal como un gen que codifica, por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos, una proteína fluorescente (por ejemplo, gfp) o un gen que codifica un producto química, enzimática o de otro modo detectable y/o seleccionable (por ejemplo, lacZ, aph, etc.) conocido en la técnica.
[0122] El genoma de rAAV como está presente en dicho vector de rAAV comprende además una secuencia de promotor operativamente enlazada a la secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y un glucoquinasa. Las secuencias de promotor preferidas son promotores que confieren expresión en células musculares y/o tejidos musculares. Los ejemplos de tales promotores incluyen un CMV y promotores de RSV como se han definido anteriormente en el presente documento.
[0123] Una secuencia no traducida 3' adecuada también puede ser operativamente enlazada a la secuencia de nucleótidos que codifica una insulina y una glucoquinasa. Las regiones no traducidas 3' adecuadas pueden ser las naturalmente asociadas a la secuencia de nucleótidos o se pueden derivar de distintos genes, como por ejemplo la región no traducida 3' de la hormona de crecimiento bovina (señal de poliadenilación bGH (SEQ ID N.°:7), señal de poliadenilación SV40 (SEQ ID N.°:22), señal de poliadenilación SV40 y secuencia intensificadora (SEQ ID N.°: 30).
[0124] En el contexto de la invención, cuando un se refiere a "SV40", significa señal de poliadenilación SV40. Cuando un se refiere a "secuencia intensificadora SV40", significa señal de poliadenilación SV40 y secuencia intensificadora. Sin embargo, la invención abarca también el uso de la señal de poliadenilación SV40 (SEQ ID N.°:22) y la secuencia intensificadora SV40 (SEQ ID N.°:33) como dos secuencias separadas.
[0125] Estas secuencias se usaron en los constructos preferidos preparados en la parte experimental. Los constructos L y Q comprenden secuencias señal de poliadenilación tanto de poliA bGH como de SV40, intercambiándose el orden de cada una de estas secuencias no traducidas 3' (véanse las figuras 7 y 13).
[0126] El constructo S comprende tanto la señal de poliadenilación de SV40 como de bGH poliA y las secuencias intensificadoras (véase la figura 16).
[0127] Opcionalmente, se pueden enlazar operativamente secuencias de nucleótidos adicionales a la(s) secuencia(s) de nucleótidos que codifican una insulina y una glucoquinasa, tales como secuencias de nucleótidos que codifican secuencias señal, señales de localización nuclear, potenciadores de expresión y similares.
[0128] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos no específicamente mencionados no están excluidos. Además, el verbo "consistir" se puede sustituir por "consistir esencialmente en" lo que significa que un constructo de expresión viral, vector viral, composición, composición de terapia génica, tal y como se definen en el presente documento pueden comprender componente(s) adicionales a los específicamente identificados, dichos componente(s) adicionales no alteran la característica única de la invención.
[0129] Además, la referencia a un elemento por el artículo indefinido "uno" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los elementos, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "uno" o "una" normalmente significa por lo tanto "al menos uno".
[0130] La palabra "aproximadamente" o "acerca de" cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10, aproximadamente 10) significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos de un 1% del valor.
[0131] Cada forma de realización como se ha identificado en el presente documento se puede combinar a menos que se indique lo contrario.
[0132] La invención se explica posteriormente en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que sirven meramente para aclarar la invención.
Leyendas de las figuras:
Figura de referencia 1. Representación esquemática del constructo de AAV RSV-rGck-CMV-hIns de gen dual descrito en A.2. ITR: repetición terminal invertida; RSV: promotor del virus del Sarcoma de Rous; rGck: ADNc de glucoquinasa de rata; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; CMV: promotor de citomegalovirus; hINS: ADNc de insulina humana. Constructo de referencia A: RSV-rGck-CMV-hIns (tamaño: 4,9 kb) (SEQ ID N°: 8) se representa en la figura 1.
Figura de referencia 2. Representación esquemática de los constructos de AAV monogén descritos en A.2. ITR: repetición terminal invertida; CMV: promotor de citomegalovirus; hINS: ADNc de insulina humana; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; RSV: promotor de virus del Sarcoma de Rous; rGck: ADNc de glucoquinasa de rata.
Constructo de referencia B representado en la figura 2: CMV-hIns (SEQ ID N.°: 17).
Constructo de referencia C representado en la figura 2: RSV-rGck (SEQ ID N.°: 18).
Figura de referencia 3. Expresión de insulina y glucoquinasa en células HEK293. El histograma de izquierda representa la expresión de insulina en células transfectadas con plásmidos CMV-hIns (B) o RSV-rGck-CMV-hIns (A). El histograma derecho representa la expresión de glucoquinasa en células transfectadas con RSVr-Gck (C) o RSV-rGck-CMV-hIns (A).
Figura 4. Representación esquemática de los constructos de AAVsde gen dual descritos en A.3. ITR: repetición terminal invertida; CMV: promotor de citomegalovirus; hINS: ADNc de insulina humana; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; RSV: promotor del virus del Sarcoma de Rous; hGck: ADNc de glucoquinasa humana; bGH: señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
Constructo de referencia D representado en la figura 4: CMV-hIns-RSV-hGck (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N.°:9).
Constructo de referencia E representado en la figura 4: RSV-hGck-CMV-hIns (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N.°:10).
Constructo F representado en la figura 4: CMV-hIns(rev)-RSV-hGck (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N°: 11). Constructo de referencia G representado en la figura 4: RSV-hGck-CMV-hIns(rev) (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N°: 12).
Figura de referencia 5. Representación esquemática de los constructos de AAV monogén descritos en A.3. ITR: repetición terminal invertida; CMV: promotor de citomegalovirus; hINS: ADNc de insulina humana; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; RSV: promotor del virus del Sarcoma de Rous; hGck: ADNc de glucoquinasa humana; bGH: señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina.
Constructo de referencia H representado en la figura 5: CMV-hIns (SEQ ID N.°: 19).
Constructo de referencia I representado en la figura 5: RSV-hGck (SEQ ID N.°: 20).
Figura 6. Expresión de insulina y glucoquinasa en células HEK293. El histograma de la izquierda representa la expresión de insulina humana en células transfectadas con CMV-hIns (constructo H), CMV-hIns-RSV-hGck (constructo D), RSV-hGck-CMV-hIns (constructo E), CMV-hIns(rev)-RSV-hGck (constructo F) o RSV-hGck-CMV-hIns(rev) (constructo G) plásmidos. El histograma derecho representa la expresión de glucoquinasa humana en células transfectadas con RSV-hGck (constructo I), CMV-hIns-RSV-hGck (constructo D), RSV-hGck-CMV-hIns (constructo E), CMV-hIns(rev)-RSV-hGck (constructo F) o RSVh-Gck-CMV-hIns(rev) (constructo G).
Figura 7. Representación esquemática de los constructos de AAV de gen dual descritos en A.4. ITR: repetición terminal invertida; MiniCMV: promotor de minicitomegalovirus; hINS: ADNc de insulina humana; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; RSV: promotor del virus del Sarcoma de Rous; hGck: ADNc de glucoquinasa humana; bGH: señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina.
Constructo de referencia J representado en la figura 7: miniCMV-hIns-RSV-hGck (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N°: 13).
Constructo de referencia K representado en la figura 7: RSV-hGck-miniCMV-hIns (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N.°:14).
Constructo L representado en la figura 7: miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N°: 15). Constructo de referencia M representado en la figura 7: RSV-hGck-miniCMV-hIns(rev) (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N.°:16).
Figura de referencia 8. Representación esquemática del AAV monogen descrito en A.4. ITR: repetición terminal invertida; MiniCMV: promotor de minicitomegalovirus; INS: ADNc de insulina humana; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; RSV: promotor de virus del Sarcoma de Rous; Gck: ADNc de glucoquinasa humana; bGH: señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
Constructo de referencia N representado en la figura 8: miniCMV-hlns (SEQ ID N.°:21).
Constructo de referencia I representado en la figura 8: RSV-hGcK-bGH (SEQ ID N.°:20).
Figura 9. Niveles de expresión de insulina y glucoquinasa en células HEK293. El histograma de la izquierda representa la expresión de insulina humana en células transfectadas con miniCMV-Ins (constructo N), miniCMV-hIns-RSV-Gck (constructo J), RSV-hGck-miniCMV-hIns (constructo K), miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck (constructo L) o plásmidos RSV-hGck-miniCMV-hlns(rev) (constructo M). El histograma de la derecha representa la expresión de glucoquinasa humana en células transfectadas con RSV-hGck (constructo I), miniCMV-hIns-RSV-hGck (constructo J), RSV-hGck-miniCMV-hIns (constructo K), miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck (constructo L) o plásmidos RSV-hGck-miniCMV-hIns(rev) (constructo M).
Figura 10. Niveles de expresión mediados por AAV de insulina y glucoquinasa en el músculo esquelético de animales de tipo salvaje. Tres semanas después de la administración del vector, se analizó la expresión insulina (A) y glucoquinasa (B) mediante pCr cuantitativa en tiempo real en el tibial y gastrocnemio de ratones no inyectado de control (CT), o en ratones inyectados con la combinación de los vectores únicos AAV1-miniCMV-hINS y AAV1-RSV-hGck (constructos N+I) o con el vector dual AAV1-miniCMV-hINS-rev-RSV-hGck (constructo L). La cantidad de insulina y glucoquinasa se normalizó con la expresión 36B4. N.D., no detectado, a.u. unidades arbitrarias.
Figura 11. Comparación de la capacidad para eliminar glucosa después de una carga en animales inyectados con una combinación de vectores únicos o un vector de AAV de gen dual. (A) Ratones de control (CT), ratones inyectados con la combinación de vectores únicos AAV1-miniCMV-hINS y AAV1-RSV-hGck (constructo N+I) y ratones inyectados con el vector viral dual AAV1-miniCMV-hINS-rev-RSV-hGck (constructo L) recibieron una inyección intraperitoneal de 2g de glucosa/kgpeso corporal. Se tomaron muestras de sangre de la cola de los animales con en los puntos de tiempo indicados y se determinó la concentración de glucosa. (B) Se calculó el área bajo la curva (AUC) de la prueba de tolerancia a la glucosa. unidades arbitrarias a.u. *p<0,05 frente a N+I.
Figura 12. Comparación de la capacidad para disponer de glucosa después una carga en animales diabéticos inyectados con o una combinación de único vectores o un vector AAV de gen dual. Ratones sanos (ningún, ratones de control sTZ) diabético (CT), ratones diabéticos inyectados con la combinación de único vectores AAV1-miniCMV-hINS y AAV1-RSV-hGck (constructos N+I), y ratones diabéticos inyectados con el vector viral doble AAV1-miniCMV-hINS-rev-RSV-hGck (constructo L) fueron dados una inyección intraperitoneal de 1 g de peso corporal de glucosa/kg. (A) niveles de glucosa en ayunas. (B) muestras de sangre se tomaron de la cola de los animales con tiempo indicado señala y concentración de glucosa se determinó. (C) la área bajo la curva (AUC) de la prueba de tolerancia a la glucosa se calculó. a.u., unidades arbitrarias. *p < 0,05 vs N+I Figura 13. Representación esquemática del AAV de gen dual y monogén descrito en A.5. ITR: repetición terminal invertida; MiniCMV: promotor de minicitomegalovirus; iNS: ADNc de insulina humana; SV40: señal de poliadenilación de virus símico 40; RSV: promotor del virus del Sarcoma de Rous; Gck: ADNc de glucoquinasa humana; bGH: señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina.
Constructo de referencia O representado en la figura 13: miniCMV-hlns-bGH (tamaño: 1,4 kb) (SEQ ID N.°:25).
Constructo de referencia P representado en la figura 13: RSV-hGck-SV40 (tamaño: 2,9 kb) (SEQ ID N.°:26).
Constructo Q representado en la figura 13: miniCMV-hIns-bGH(rev)-RSV-hGck-SV40 (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N.°:27).
Figura 14. Niveles de expresión mediados por AAV de insulina y glucoquinasa en el músculo esquelético de animales de tipo salvaje. Tres semanas después de la administración del vector, se analizó la expresión de insulina (A) y glucoquinasa (B) mediante PCR cuantitativa en tiempo real en el tibial y gastrocnemio de ratones con no inyectados de control (CT), o en ratones inyectados con la combinación de los vectores únicos AAV1-miniCMV-hIns-bGH y AAV1-RSV-hGck-SV40 (constructo O+P) o con el vector dual AAV1-miniCMV-Insulin-bGH(rev)-RSV-Glucokinase-SV40 (constructo Q). La cantidad de insulina y glucoquinasa se normalizó con la expresión 36B4. N.D., no detectado. a.u., unidades arbitrarias. *p < 0,05 vs O+P Figura 15. Comparación de la capacidad para eliminar la glucosa después una carga en animales inyectados con una combinación de vectores únicos o un vector de AAV de gen dual. (A) ratones de control (CT), ratones inyectados con la combinación de vectores únicos AAV1-miniCMV-hIns-bGH y AAV1-RSV-hGck-SV40 (constructo O+P) y ratones inyectados con el vector viral dual AAV1-miniCMV-Insulin-bGH(rev)-RSV-Glucokinase-SV40 (constructo Q) recibieron una inyección intraperitoneal de 2g de glucosa/kg de peso corporal. Se tomaron muestras de sangre de la cola de los animales en los puntos de tiempo indicados y se determinó la concentración de glucosa. (B) Se calculó el área bajo la curva (AUC) de la prueba de tolerancia a la glucosa . a.u., unidades arbitrarias. *p < 0,05 vs O+P
Figura 16. Representación esquemática del AAV de gen dual y monogén descrito en A.6. ITR: repetición terminal invertida; MiniCMV: promotor de minicitomegalovirus; INS: ADNc de insulina humana; Intensificador de SV40: intensificador de SV40 y señal de poliadenilación del virus símico 40; RSV: promotor del virus del Sarcoma de Rous; Gck: ADNc de glucoquinasa humana; bGH: señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina.
Constructo de referencia R representado en la figura 16: intensificador miniCMV-hIns-SV40 (tamaño: 1,6 kb) (SEQ ID N.°:28).
Constructo S representado en la figura 16: intensificador miniCMV-hIns-SV40(rev)-RSV-hGck-bGH (tamaño: 4,2 kb) (SEQ ID N.°:29).
Figura 17. Niveles de expresión mediados por AAV de insulina y glucoquinasa en el músculo esquelético de animales de tipo salvaje. Tres semanas después de la administración del vector, se analizó la expresión de insulina (A) y glucoquinasa (B) mediante PCR cuantitativa en tiempo real en el tibial y gastrocnemio de ratones no inyectados de control (CT), o en ratones inyectados con la combinación de los vectores únicos AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40 y AAV1-RSV-hGck (constructo R+I) o con el vector dual AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40(rev)-RSV-hGck-bGH (constructo S). La cantidad de insulina y glucoquinasa se normalizó con la expresión 36B4. N.D., no detectado. a.u., unidades arbitrarias. *p < 0,05 vs R+I.
Figura 18. Comparación de la capacidad para eliminar glucosa después de una carga en animales inyectados con una combinación de vectores únicos o con un vector de AAV de gen dual. (A) Ratones de control (CT), ratones inyectados con la combinación de vectores únicos AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40 y AAV1-RSV-hGck (R+I) y ratones inyectados con el vector viral dual AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40(rev)-RSV-hGck-bGH (S) recibieron una inyección intraperitoneal de 2g de glucosa/kg de peso corporal. Se tomaron muestras de sangre de la cola de los animales en los puntos de tiempo indicados y se determinó la concentración de glucosa. (B) Se calculó la área bajo la curva (AUC) de la prueba de tolerancia a la glucosa . a.u., unidades arbitrarias. *p < 0,05 vs R+I.
Ejemplos
[0134] A lo largo de la solicitud, se hace referencia a constructos o vectores basados en/que comprenden los constructos A a S. La letra identifica el tipo de constructo usada y la misma letra podría ser usada para referirse a un vector basado en/ derivado de y/o que comprende dicho constructo. Ésta es la razón por la que las ITR están presentes en cada una de las figuras 1, 2, 4, 5, 7, 8, 13 ó 16 que representan cada uno de los vectores virales de AAV que comprenden dicho constructo.
A. Generación de constructos de vectores virales adenoasociados (AAV) de gen dual para la expresión concomitante de insulina y glucoquinasa.
[0135] Para desarrollar estrategias de terapia génica más eficaces basadas en la transferencia de genes de insulina/glucoquinasa muscular mediada por vectores virales adenoasociados para contrarrestar la hiperglucemia diabética, se generaron constructos virales de gen dual que codifican insulina y glucoquinasa para asegurar la expresión concomitante de ambos transgenes en células musculares transducidas.
[0136] La generación de vectores AAV1-Ins+Gck de gen dual también permitirá disminuir la dosis de vector, lo que a su vez, debería dar como resultado un riesgo reducido de inmunidad activada por la cápside u otras toxicidades. Desde un punto de vista regulador, el uso de un vector dual facilitará enormemente el desarrollo del tratamiento. Además, el uso de un vector dual permitirá para una reducción drástica en el coste de fabricación de vectores de AAV.
[0137] La generación de tales vectores duales de AAV que contienen transgenes tanto de insulina como de glucoquinasa y que potencialmente tienen una eficacia terapéutica mejorada no es, sin embargo, totalmente rutinaria para un experto en la técnica, como se demuestra a continuación.
[0138] En la parte experimental, la secuencia de nucleótidos que codifica la insulina es la SEQ ID N.°:1, la secuencia de nucleótidos que codifica la glucoquinasa es la SEQ ID N.°:2. La secuencia de nucleótidos del promotor de CMV es SEQ ID N°: 3 usada con la secuencia intrónica asociada SEQ ID N.°:4 . La secuencia de nucleótidos del promotor de RSV es SEQ ID N°: 6 con secuencia intrónica asociada SEQ ID N.°:23. La secuencia de nucleótidos del promotor miniCMV es SEQ ID N.°:5. La secuencia de nucleótidos de la región reguladora de bGH es SEQ ID N°: 7. La secuencia de nucleótidos del SV40 es SEQ ID N°: 22.
Ejemplo de referencia A.1. Constructo de gen dual AAV-CMV-Insulina-CMV-Glucoquinasa.
[0139] En el método terapéutico que utilizó 2 vectores AAV1 diferentes para mediar la transferencia de genes al músculo esquelético de los genes de insulina y glucoquinasa cuando se administraron a ratones y perros (Mas, A. et al., Diabetes (2006) 55:1546-1553; Callejas, D. et al. Diabetes (2013) 62:1718-1729), la expresión de ambos transgenes fue controlada por el promotor CMV. Por lo tanto, la opción más obvia para ser considerada al generar los constructos de AAV de gen dual habría sido utilizar casetes de expresión CMV-insulina y CMV-glucoquinasa en el mismo vector. Sin embargo, esta opción fue descartada porque la presencia del mismo promotor en 2 regiones del mismo constructo aumenta drásticamente el alto riesgo de eventos de recombinación intramolecular que se observan a veces durante la producción de AAV debido a la presencia de secuencias repetidas.
Ejemplo de referencia A.2. Constructos de AAV de gen dual CMV-Insulina-RSV-Glucoquinasa.
[0140] Teniendo en cuenta las restricciones en el uso de promotores mencionadas anteriormente, se eligió el promotor ubicuo del virus del Sarcoma de Rous (RSV) para impulsar la expresión de glucoquinasa en el constructo de AAV de gen dual. Este promotor fue seleccionado porque, de manera similar al promotor de CMV, se ha reportado que media una fuerte expresión transgénica en células musculares (Yue Y. et al, 2002, Biotechniques, 33:672, p676 Development of Multiple Cloning Site cis-Vectors for Recombinant Associated Virus Production). Adicionalmente, su pequeño tamaño es conveniente dada la limitada capacidad de clonación de los vectores de AAV.
[0141] Se generó un constructo AAV1-Ins+Gck de gen dual que lleva la secuencia codificante de insulina humana controlada por el promotor CMV y la secuencia codificante de glucoquinasa de rata controlada por el promotor de RSV (figura 1). En este constructo de gen dual, la secuencia de poliA de SV40 fue clonada después de los genes de insulina y glucoquinasa:
[0142] Constructo de referencia A : RSV-rGck-CMV-hIns (tamaño: 4,9 kb) (SEQ ID N°: 8) representado en la figura 1.
[0143] Además del constructo de AAV1-Ins+Gck de gen dual previamente descrito, se generaron dos plásmidos monogén adicionales que codifican o insulina humana o glucoquinasa de rata, usando la misma estructura de AAV (figura 2), para compararla con el constructo de AAV1-Ins+Gck de gen dual:
Constructo de referencia B representado en la figura 2: CMV-hIns (SEQ ID N.°: 17).
Constructo de referencia C representado en la figura 2: C: RSV-rGck (SEQ ID N.°: 18).
[0144] La función del plásmido de gen dual RSV-rGck-CMV-hIns (constructo A) se evaluó in vitro antes de que la producción de AAV y la insulina y glucoquinasa se expresaran en niveles muy altos (figura 3).
[0145] Una vez verificada in vitro la funcionalidad del constructo RSV-rGck-CMV-hIns (constructo A), se usó el plásmido para producir el correspondiente vector AAV1 de gen dual en células HEK293. El rendimiento del lote de vector fue, sin embargo, bajo. La primera producción de AAV1-RSV-rGck-CMV-hIns no proporcionó vectores AAV y el rendimiento de la segunda producción fue de genomas virales 4E11 (vg)/roller bottle (RB), considerablemente inferior a nuestro rendimiento promedio para la producción de AAV1 (rendimiento esperado: 2E12 vg/RB). El tamaño final de los constructos AAV se acercaba al límite de capacidad de encapsidación de los AAV1, y la observación de bajos rendimientos podría estar de acuerdo con la baja eficiencia en la encapsidación de genomas de gran tamaño. Sin embargo, este resultado no era previsible porque en algunos casos los constructos AAV de aproximadamente 5 kb se han podido producir con éxito en nuestro laboratorio.
A.3. Constructos AAV de gen dual optimizados CMV-Insulina-RSV-Glucoquinasa
[0146] Dado el bajo rendimiento relativo en la producción de lotes de AAV con los constructos de gen dual anteriores, se decidió rehacer por completo los casetes para la expresión doble de insulina y glucoquinasa. Con este fin, se diseñó un sistema modular nuevo que nos permitió probar diferentes combinaciones de secuencias codificantes (optimizadas o no, y de distintas especies) y secuencias que actúan en cis (promotores, poliAs) en esfuerzo mínimo y dentro del tamaño óptimo para la encapsidación. Este nuevo enfoque ha simplificado enormemente el diseño de los vector. En primer lugar, se generaron 4 constructos "de gen dual" adicionales con la secuencia codificante de insulina humana bajo el control del promotor CMV y la secuencia codificante de glucoquinasa humana controlada por el promotor RSV. Evaluamos el efecto al posicionar el casete de expresión de insulina aguas arriba del casete de expresión de glucoquinasa y viceversa, y también en la orientación inversa (figura 4).
[0147] Además, en este nuevo conjunto de constructo, el casete CMV-hInsulin incluido en la secuencia poliA SV40 mientras que la secuencia poliA de la hormona de crecimiento bovina fue clonada en el casete RSV-hGlucokinase, como el último es más corto y media una expresión de transgén más alta que el poliA SV40 (Azzoni AR, J Gene Med. 2007: The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression). Los nuevos constructos son:
Constructo de referencia D representado en la figura 4: CMV-hIns-RSV-hGck (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N.°:9).
Constructo de referencia E representado en la figura 4: RSV-hGck-CMV-hIns (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N.°:10).
Constructo F representado en la figura 4: CMV-hIns(rev)-RSV-hGck (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N°: 11). Constructo de referencia G representado en la figura 4: RSV-hGck-CMV-hlns(rev) (tamaño: 4,7 kb) (SEQ ID N°: 12).
[0148] Además de los 4 constructos de gen dual AAV1-Ins+Gck (constructos D, E, F y G)) mencionados anteriormente, se generaron también dos plásmidos adicionales de un solo gen que codifican para insulina o glucoquinasa utilizando el mismo esqueleto AAV (figura 5) para comparar con los cuatro nuevos constructos de gen dual AAV1-Ins+Gck:
Constructo de referencia H representado en la figura 5: CMV-hIns (SEQ ID N.°:19).
Constructo de referencia I representado en la figura 5: RSV-hGck (SEQ ID N.°: 20).
[0149] Evaluamos la función de los plásmidos de los constructos D, E, F y G de gen dual in vitro en células HEK293 y el constructo F (CMV-hIns(rev)-RSV-rGck) mediaba la máxima expresión de insulina y glucoquinasa (figura 6). Por lo tanto, dicho plásmido se usó para producir el correspondiente vector AAV1 de gen dual en células HEK293. Aunque el tamaño del constructo CMV-hIns(rev)-RSV-rGck (constructo F) de genoma estaba dentro de la capacidad óptima de encapsidación de AAV, se obtuvo nuevamente un bajo rendimiento del lote de los vectores (5.5E11 vg/Rb). Basándose en observaciones anteriores con otros constructos AAV fabricados en nuestro laboratorio, postulamos que, además del tamaño del genoma del vector, la conformación del ADN también puede influir en la eficiencia de la encapsidación, lo que podría explicar potencialmente el bajo rendimiento de fabricación relativo de este nuevo constructo dual.
A.4. Constructos AAV de gen dual optimizados miniCMV-Insulina-RSV-Glucoquinasa
[0150] Dado que la producción de AAV1-CMV-hIns(rev)-RSV-hGck producía un rendimiento bajo relativo, decidimos disminuir adicionalmente el tamaño del constructo de gen dual sustituyendo el promotor CMV por una versión corta de dicho promotor, denominado promotor mini CMV. Se generaron 4 nuevos constructos de gen dual que incluían la secuencia codificante de la insulina humana bajo el control del promotor mini CMV y la secuencia codificante de glucoquinasa humana controlada por el promotor RSV. El SV40 y el poliA bGH se usaron como secuencias poliA, respectivamente. Analizamos de nuevo el efecto al posicionar el casete de expresión de la insulina antes que el casete de expresión de glucoquinasa o viceversa, y también el efecto al posicionar el casete de expresión de la glucoquinasa en la orientación inversa (figura 7). Los nuevos constructos son:
Constructo de referencia J representado en la figura 7: miniCMV-hIns-RSV-hGck (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N°: 13).
Constructo de referencia K representado en la figura 7: RSV-hGck-miniCMV-hIns (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N.°:14).
Constructo L representado en la figura 7: miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N°: 15).
Constructo de referencia M representado en la figura 7: RSV-hGck-miniCMV-hIns(rev) (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N.°:16).
[0151] Además de estos 4 nuevos constructos de gen dual AAV1-Ins+Gck (J, K, L y M), se generó un plásmido monogen adicional para codificar insulina utilizando el mismo esqueleto AAV para compararlo con los 4 nuevos constructos de gen dual AAV1-Ins+Gck. El plásmido monogén para codificar insulina Gck se mencionó previamente RSV-hGCK (constructo I) (figura 8).
Constructo de referencia N representado en la figura 8: miniCMV-hIns (SEQ ID N.°:21).
Constructo de referencia I representado en la figura 8: RSV-hGCK-bGH (SEQ ID N.°:20). Se evaluó la función de los constructos J, K, L y M plásmidos de gen dual in vitro en células HEK293 y el constructo (L), miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck, mediado por la máxima expresión de insulina y glucoquinasa (figura 9).
[0152] Este constructo (L) (miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck) y el mismo constructo (J) pero en la orientación del sentido (miniCMV-hIns-RSV-hGck doble promotor) se usaron para producir los correspondientes vectores AAV1 de gen dual en células HEK293.
[0153] En estos casos, los rendimientos de producción AAV estaban dentro de los valor esperados, siendo 2,1E12 vg/Rb para el constructo AAV1-miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck (constructo L) y 1,9E12 vg/Rb para el constructo AAV1-miniCMV-hIns-RSV-hGck (constructo J).
. - - -RSV-hGck
B.1. Expresión del transgén aumentada in vivo
[0154] Para verificar si la administración de los vectores AAVI-Ins+Gck de gen dual fue superior que la administración conjunta de dos vectores AAV monogén en mediación de la expresión de insulina y/o glucoquinasa y/o en la capacidad para mejorar la eliminación de glucosa en respuesta a una sobrecarga de glucosa, se realizó un experimento in vivo en ratones.
[0155] Se trataron dos grupos de ratones de tipo salvaje con los 2 vectores individuales juntos (constructos N+I) (AAV1-miniCMV-hINS y AAV1-RSV-hGck) o con el gen dual (constructo L) (AAV1-miniCMV-hINS-rev-RSV-hGck). Los vectores fueron administrados por vía intramuscular en los músculos tibial y gastrocnemio de ambas extremidades posteriores con una dosis de 5E10 vg/músculo de cada vector (constructos N y I o L).
[0156] Tres semanas después de la administración del vector, los animales fueron sacrificados y la expresión de ambos transgenes (insulina y glucoquinasa) se analizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real en los diferentes grupos experimentales. Se observó que la expresión tanto de insulina (figura 10A) como de glucoquinasa (figura 10B) fue mayor en los músculos obtenidos de los animales que habían recibido el vector de gen dual (constructo L), en comparación con la de la combinación de los dos vectores individuales (constructos N+I).
B.2. Eficacia aumentada in vivo
[0157] Para demostrar la eficacia de los constructos de gen dual de nuevo diseño, la capacidad del vector para mejorar la eliminación de glucosa in vivo fue evaluada en los grupos experimentales descritos anteriormente. Con este fin, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en la que a todos los grupos de ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 2 g de glucosa/kg de peso corporal, y se determinaron los niveles de glucosa en sangre en momentos diferentes.
[0158] Como se observa en la figura 11, los animales inyectados con el vector dual L mostraron una mayor tolerancia a la glucosa que los animales inyectados con la combinación de los dos vectores individuales.
B. 3. Eficacia aumentada in vivo en ratones diabéticos
[0159] Para evaluar la eficacia del vector de gen dual (constructo L) (AAV1-miniCMV-hlns(rev)-RSV-hGck) en animales diabéticos, se administró una dosis de 5E10 vg/músculo por vía intramuscular en los músculos tibial y gastrocnemio de ambas extremidades posteriores de ratones tratados con estreptozotocina (STZ) para desencadenar el proceso diabético. Como control, los 2 vectores individuales se administraron conjuntamente (constructo N+I) (AAV1-miniCMV-hINS y AAV1 -RSV-hGck).
[0160] Ocho semanas después de la administración de los AAV, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en la que a todos los grupos de ratones se inyectó por vía intraperitoneal 1 g de glucosa/kg de peso corporal, y se determinaron los niveles de glucosa en sangre en momentos diferentes.
[0161] Como se observa en la figura 12A, los animales diabéticos inyectados con el vector de gen dual L mostraron niveles reducidos de glucemia en condiciones de ayuno en comparación con los animales tratados con la combinación de los vectores individuales N+I. Visiblemente, los niveles de glucosa encontrados en los animales tratados con el vector de gen dual L eran similares a los de los ratones sanos no diabéticos (figura 12A). Además, los animales diabéticos inyectados con el vector de gen dual L mostraron una mayor tolerancia a la glucosa que los animales inyectados con la combinación de los dos vectores individuales (N+I) (figura 12B-C).
C. Expresión de transgén aumentada y eficacia del doble gen AAV1-miniCMV-Insulina-bGH(rev)-RSV-Glucoquinasa-SV40
C1. Generación de constructos de AAV de gen dual miniCMV-Insulina-bGH(rev)-RSV-Glucoquinasa-SV40 optimizados
[0162] Dado que se ha reportado que las señales de poliadenilación influyen en la expresión del transgén (Azzoni et al., J gen Med 2007,9: 392-40.), se generó un nuevo constructo de gen dual que incluye la secuencia codificante de insulina humana bajo el control del promotor mini CMV y el bGH poliA (casete de expresión en la orientación inversa) y la secuencia codificante de glucoquinasa humana controlada por el promotor de RSV y SV40 poliA (constructo Q; mismo constructo que L pero con señales poliA intercambiadas). Se generaron dos plásmidos monogen adicionales que codifican insulina y glucoquinasa (constructos O y P, respectivamente) usando el mismo esqueleto de AAV para comparar con el nuevo constructo de AAV1-Ins+Gck (Q) de gen dual (figura 13). Los nuevos constructos son:
Constructo de referencia O representado en la figura 13: miniCMV-hIns-bGH (tamaño: 1,4 kb) (SEQ ID N.°:25).
Constructo de referencia P representado en la figura 13: RSV-hGck-SV40 (tamaño: 2,9 kb) (SEQ ID N.°:26).
Constructo Q representado en la figura 13: miniCMV-hIns-bGH(rev)-RSV-hGck-SV40 (tamaño: 4 kb) (SEQ ID N.°:27).
C.2. Expresión del transgén aumentada in vivo
[0163] Dos grupos de ratones de tipo salvaje fueron tratados con los 2 vectores individuales juntos (constructos O+P) (AAV1-miniCMV-hIns-bGH y AAV1-RSV-hGck-SV40) o con el gen doble (constructo Q) (AAV1-miniCMV-Insulina-bGH(rev)-RSV-Glucoquinasa-SV40). Los vectores se administraron por vía intramuscular en los músculos tibial y gastrocnemio de ambas extremidades posteriores con una dosis de 5E10 vg/músculo de cada vector (constructos O y P o Q).
[0164] Tres semanas después de la administración del vector, los animales fueron sacrificados y la expresión de ambos transgenes (insulina y glucoquinasa) fue analizada mediante PCR cuantitativa en tiempo real en los diferentes grupos experimentales. Se observó que la expresión tanto de insulina (figura 14A) como de glucoquinasa (figura 14B) fue mayor en los músculos obtenidos de los animales que recibieron el vector de gen dual (constructo Q), en comparación con la de la combinación de los dos vectores individuales (constructos O+P).
C. 3. Eficacia aumentada in vivo
[0165] Para demostrar la eficacia del constructo de gen dual Q diseñado recientemente (AAV1-miniCMV-InsulinabGH(rev)-RSV-Glucoquinasa-SV40), la capacidad del vector para mejorar la eliminación de glucosa in vivo fue evaluada en los grupos experimentales descritos previamente en el apartado C.2. Con este fin, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en la que a todos los grupos de ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 2 g de glucosa/kg de peso corporal, y los niveles de glucosa en sangre fueron determinados en momentos diferentes.
[0166] Como se observa en la figura 15, los animales inyectados con el vector dual Q mostraron una mayor tolerancia a la glucosa que los animales inyectados con la combinación de los dos vectores individuales (O+P).
D. Expresión del transgén aumentada y eficacia de gen dual AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40(rev)-RSV-hGck-bGH
D.1. Generación de constructos de AAV de gen dual optimizados miniCMV-Insulina-PotenciadorSV40-RSV-Glucoquinasa-bGH
[0167] Para aumentar los niveles de expresión de insulina, el intensificador del SV40 fue incorporado en el extremo 3' del poliA. Un nuevo constructo de gen dual que incluye la secuencia codificante de insulina humana bajo el control del promotor mini CMV y el intensificador SV40 en el extremo 3' del SV40 poliA (casete de expresión en la orientación inversa) y se generó la secuencia codificante de glucoquinasa humana controlada por el promotor de RSV y el poliA bGH (constructo S) (figura 16). Como control, se generó un plásmido monogen que codifica insulina bajo el control del promotor mini CMV y el intensificador SV40 en el extremo 3' del SV40 poliA (constructo R) (figura 16). El plásmido monogen que codifica Gck fue el RSV-hGCK previamente mencionado (constructo I) (figura 8). Los nuevos constructos son:
Constructo de referencia R representado en la figura 16: miniCMV-hIns-PotenciadorSV40 (tamaño: 1,6 kb) (SEQ ID N°: 28).
Constructo S representado en la figura 16: miniCMV-hIns-PotenciadorSV40(rev)-RSV-hGck-bGH (tamaño: 4,2 kb) (SEQ ID N°: 29).
D.2. Expresión del transgén aumentada in vivo
[0168] Se trataron dos grupos de ratones de tipo salvaje con los 2 vectores individuales juntos (constructos R+I) (AAv1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40 y AAV1-RSV-hGck) o con el gen doble (constructo S) (AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40(rev)-RSV-hGck-bGH). Los vectores fueron administrados por vía intramuscular en los músculos tibial y gastrocnemio de ambas extremidades posteriores con una dosis de 5E10 vg/músculo de cada vector (constructos R y I o S).
[0169] Tres semanas después de la administración del vector, se sacrificaron los animales y se analizó la expresión de ambos transgenes (insulina y glucoquinasa) mediante PCR cuantitativa en tiempo real en los diferentes grupos experimentales. Se observó que la expresión tanto de la insulina (figura 17A) como de la glucoquinasa (figura 17B) fue mayor en los músculos obtenidos de los animales que recibieron el vector de gen dual (constructo S), en comparación con la de la combinación de los dos vectores individuales (constructo R+I).
D.3. Eficacia aumentada in vivo
[0170] Para demostrar la eficacia del constructo de gen dual S diseñado recientemente (AAV1-miniCMV-hIns-PotenciadorSV40(rev)-RSV-hGck-bGH), se evaluó la capacidad del vector para mejorar la eliminación de glucosa in vivo en los grupos experimentales descritos previamente en el apartado D.2. Con este fin, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en la que a todos los grupos de ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 2 g de glucosa/kg de peso corporal, y se determinaron los niveles de glucosa en sangre en momentos diferentes.
[0171] Como se observa en la figura 18, los animales inyectados con el vector dual S mostraron una mayor tolerancia a la glucosa que los animales inyectados con la combinación de los dos vectores individuales (R+I). En conclusión, creemos que el nuevo enfoque basado en el uso del vector de gen dual AAV1-INS- -Gck permite más -o al menos la misma- expresión de transgenes terapéuticos con dosis de vector considerablemente inferiores (la mitad de los genomas del vector en dual en ratones tratados con dos genes), cuando se compara con la combinación de los dos vectores individuales.
[0172] Como las acciones de la insulina y la glucoquinasa son sinérgicas por crear un sensor de glucosa en el músculo, el uso de vectores de gen dual permite la administración de cantidades adecuadas de ambos transgenes a la misma célula. Por lo tanto, el nuevo enfoque basado en el uso del vector viral de gen dual mejora la metabolización de la glucosa a mayor mediada en comparación con la combinación de los dos vectores individuales. Además, también permite niveles más altos de expresión de los transgenes utilizando la mitad de la dosis de genomas virales.
SECUENCIAS
SEC ID NO: Tipo de secuencia
1 insulina humana de ADNc
2 Glucoquinasa humana de ADNc
3 Promotor CMV
4 Secuencia intrónica asociada al promotor CMV
5 Mini promotor CMV
6 Promotor RSV
7 bGH
8 Constructo A
9 Constructo D
10 Constructo E
11 Constructo F
12 Constructo G
13 Constructo J
14 Constructo K
15 Constructo L
16 Constructo M
17 Constructo B
18 Constructo C
19 Constructo H
20 Constructo I
21 Constructo N
22 Señal de poliadenilación SV40
23 Secuencia intrónica asociada al promotor RSV
24 Promotor mini CMV equivalente
25 Constructo O
26 Constructo P
27 Constructo Q
28 Constructo R
29 Constructo S
30 Señal de poliadenilación del SV40 y secuencia
intensificadora
31 5'ITR
32 3'ITR
33 Secuencia intensificadora del SV40
Constructo de referencia A: RSV-rGck-CMV-hIns (SEQ ID
[0173]
Figure imgf000026_0001
NO:8)
Secuencia de plásmido pGG2-RSV-rGck-CMV-hIns
[0174]
CTAGACATGG CTCGACAGAT CTCAATATTG GCCATTAGCC ATATTATTCA 51 TTGGTTATAT AGCATAAATC AATATTGGCT ATTGGCCATT GCATACGTTG 101 TATCTATATC ATAATATGTA CATTTATATT GGCTCATGTC CAATATGACC 151 GCCATGTTGG CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATTACGG 201 GGTCATTAGT TCATAGCCCA TATATGGAGT TCCGCGTTAC ATAACTTACG 251 GTAAATGGCC CGCCTGGCTG ACCGCCCAAC GACCCCCGCC CATTGACGTC 301 AATAATGACG TATGTTCCCA TAGTAACGCC AATAGGGACT TTCCATTGAC 351 GTCAATGGGT GGAGTATTTA CGGTAAACTG CCCACTTGGC AGTACATCAA 401 GTGTATCATA TGCCAAGTCC GCCCCCTATT GACGTCAATG ACGGTAAATG 451 GCCCGCCTGG CATTATGCCC AGTACATGAC CTTACGGGAC TTTCCTACTT 501 GGCAGTACAT CTACGTATTA GTCATCGCTA TTACCATGGT GATGCGGTTT 551 TGGCAGTACA CCAATGGGCG TGGATAGCGG TTTGACTCAC GGGGATTTCC 601 AAGTCTCCAC CCCATTGACG TCAATGGGAG TTTGTTTTGG CACCAAAATC 651 AACGGGACTT TCCAAAATGT CGTAACAACT GCGATCGCCC GCCCCGTTGA 701 CGCAAATGGG CGGTAGGCGT GTACGGTGGG AGGTCTATAT AAGCAGAGCT 751 CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CACTAGAAGC TTTATTGCGG TAGTTTATCA 801 CAGTTAAATT GCTAACGCAG TCAGTGCTTC TGACACAACA GTCTCGAACT 851 TAAGCTGCAG TGACTCTCTT AAGGTAGCCT TGCAGAAGTT GGTCGTGAGG 901 CACTGGGCAG GTAAGTATCA AGGTTACAAG ACAGGTTTAA GGAGACCAAT 951 AGAAACTGGG CTTGTCGAGA CAGAGAAGAC TCTTGCGTTT CTGATAGGCA 1001 CCTATTGGTC TTACTGACAT CCACTTTGCC TTTCTCTCCA CAGGTGTCCA 1051 CTCCCAGTTC AATTACAGCT CTTAAGGCTA GAGTACTTAA TACGACTCAC 1101 TATAGGCTAG CCTCGAGAAT TCTGCCATGG CCCTGTGGAT GCGCCTCCTG 1151 CCCCTGCTGG CGCTGCTGGC CCTCTGGGGA CCTGACCCAG CCGCAGCCTT 1201 TGTGAACCAA CACCTGTGCG GCTCAGATCT GGTGGAAGCT CTCTACCTAG 1251 TGTGCGGGGA ACGAGGCTTC TTCTACACAC CCAGGACCAA GCGGGAGGCA 1301 GAGGACCTGC AGGTGGGGCA GGTGGAGCTG GGCGGGGGCC CTGGTGCAGG 1351 CAGCCTGCAG CCCTTGGCCC TGGAGGGGTC GCGACAGAAG CGTGGCATTG 1401 TGGAACAATG CTGTACCAGC ATCTGCTCCC TCTACCAGCT GGAGAACTAC 1451 TGCAACTAGA CGCAGCTGCA AGCTTATCGA TACCGTCGAC CCGGGCGGCC 1501 GCTTCCCTTT AGTGAGGGTT AATGCTTCGA GCAGACATGA TAAGATACAT 1551 TGATGAGTTT GGACAAACCA CAACTAGAAT GCAGTGAAAA AAATGCTTTA 1601 TTTGTGAAAT TTGTGATGCT ATTGCTTTAT TTGTAACCAT TATAAGCTGC 1651 AATAAACAAG TTAACAACAA CAATTGCATT CATTTTATGT TTCAGGTTCA 1701 GGGGGAGATG TGGGAGGTTT TTTAAAGCAA GTAAAACCTC TACAAATGTG 1751 GTAAAATCCG ATAAGGGACT AGAGCATGGC TACGTAGATA AGTAGCATGG 1801 CGGGTTAATC ATTAACTACA AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC 1851 CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG CCGGGCGACC AAAGGTCGCC 1901 CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA GTGAGCGAGC GAGCGCGCCA 1951 GCTGGCGTAA TAGCGAAGAG GCCCGCACCG ATCGCCCTTC CCAACAGTTG 2001 CGCAGCCTGA ATGGCGAATG GAATTCCAGA CGATTGAGCG TCAAAATGTA 2051 GGTATTTCCA TGAGCGTTTT TCCGTTGCAA TGGCTGGCGG TAATATTGTT 2101 CTGGATATTA CCAGCAAGGC CGATAGTTTG AGTTCTTCTA CTCAGGCAAG 2151 TGATGTTATT ACTAATCAAA GAAGTATTGC GACAACGGTT AATTTGCGTG 2201 ATGGACAGAC TCTTTTACTC GGTGGCCTCA CTGATTATAA AAACACTTCT 2251 CAGGATTCTG GCGTACCGTT CCTGTCTAAA ATCCCTTTAA TCGGCCTCCT 2301 GTTTAGCTCC CGCTCTGATT CTAACGAGGA AAGCACGTTA TACGTGCTCG 2351 TCAAAGCAAC CATAGTACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA GCGCGGCGGG 2 40 1 TGTGGTGGTT ACGCGCAGCG TGACCGCTAC ACTTGCCAGC GCCCTAGCGC 2 45 1 CCGCTCCTTT CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC TCGCCACGTT CGCCGGCTTT 2 50 1 CCCCGTCAAG CTCTAAATCG GGGGCTCCCT TTAGGGTTCC GATTTAGTGC
TTTACGGCAC CTCGACCCCA AAAAACTTGA TTAGGGTGAT GGTTCACGTA
2 60 1 GTGGGCCATC GCCCTGATAG ACGGTTTTTC GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC
í ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA CACTCAACCC
2 70 1 TATCTCGGTC TATTCTTTTG ATTTATAAGG GATTTTGCCG ATTTCGGCCT 2 75 1 ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA AATTTAACGC GAATTTTAAC
AAAATATTAA CGTCTACAAT TTAAATATTT GCTTATACAA TCTTCCTGTT
TTTGGGGCTT TTCTGATTAT CAACCGGGGT ACATATGATT GACATGCTAG
2 90 1 TTTTACGATT ACCGTTCATC GATTCTCTTG TTTGCTCCAG ACTCTCAGGC
AATGACCTGA TAGCCTTTGT AGAGACCTCT CAAAAATAGC TACCCTCTCC
3001 GGCATGAATT TATCAGCTAG AACGGTTGAA TATCATATTG ATGGTGATTT 3 05 1 GACTGTCTCC GGCCTTTCTC ACCCGTTTGA ATCTTTACCT ACACATTACT 3 10 1 CAGGCATTGC ATTTAAAATA TATGAGGGTT CTAAAAATTT TTATCCTTGC 3 15 1 GTTGAAATAA AGGCTTCTCC CGCAAAAGTA TTACAGGGTC ATAATGTTTT
TGGTACAACC GATTTAGCTT TATGCTCTGA GGCTTTATTG CTTAATTTTG
3 25 1 CTAATTCTTT GCCTTGCCTG TATGATTTAT TGGATGTTGG AATCGCCTGA 3 30 1 TGCGGTATTT TCTCCTTACG CATCTGTGCG GTATTTCACA CCGCATATGG
TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGCCCCG
3 40 1 ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG ACGGGCTTGT CTGCTCCCGG
CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT CCGGGAGCTG CATGTGTCAG
50 1 AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG AGACGAAAGG GCCTCGTGAT 55 1 ACGCCTATTT TTATAGGTTA ATGTCATGAT AATAATGGTT TCTTAGACGT 3 60 1 CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT TTGTTTATTT 3 65 1 TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA 3 70 1 AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC 3 75 1 GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT
CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC AGTTGGGTGC
ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA
3 90 1 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG
CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG
4 00 1 TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA
CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT ATGCAGTGCT
4 10 1 GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC TGACAACGAT
CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG GGGGATCATG
4 20 1 TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC CATACCAAAC 4 25 1 GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA CGTTGCGCAA 4 30 1 ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA CAATTAATAG
ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG CTCGGCCCTT
4 40 1 CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG AGCGTGGGTC
TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC TCCCGTATCG
4 50 1 TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA CTATGGATGA ACGAAATAGA 4 55 1 CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT AACTGTCAGA 4 60 1 CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT 4 65 1 TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC 4 70 1 CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT 4 75 1 CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC
AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG
; :- í CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG CGCAGATACC 4 90 1 AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT
CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT
GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA
5 051 GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC 5 10 1 AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA CCTACAGCGT 5 15 1 GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG CGGACAGGTA 5201 TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG
GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA
CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA
5 35 1 AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT 5 40 1 TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC CTGATTCTGT GGATAACCGT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC GAACGACCGA TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCCA ATACGCAAAC CGCGCGTTGG CCGATTCATT AATGCAGCAG CTGCGCGCTC TGAGGCCGCC CGGGCAAAGC CCGGGCGTCG GGCGACCTTT CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGAGAGG GAGTGGCCAA AGGGGTTCCT TGTAGTTAAT GATTAACCCG CCATGCTACT GCCATGCTCT AGGTAGCCAT GCTCTGGAAG ATCTCGACGC ACAGCTTATC ATCGCAGATC CGTATGGTGC ACTCTCAGTA TGATGCCGCA TAGTTAAGCC AGTATCTGCT CCCTGCTTGT TCGCTGAGTA GTGCGCGAGC AAAATTTAAG CTACAACAAG
Figure imgf000029_0001
ACCGACAATT GCATGAAGAA TCTGCTTAGG GTTAGGCGTT
TCGCGATGTA CGGGCCAGAT ATTCGCGTAT CTGAGGGGAC
TAGGGTGTGT TTAGGCGAAA AGCGGGGCTT CGGTTGTACG CGGTTAGGAG
* ' ! TCCCCTCAGG ATATAGTAGT TTCGCTTTTG CATAGGGAGG GGGAAATGTA
61 51 GTCTTATGCA ATACTCTTGT AGTCTTGCAA CATGGTAACG ATGAGTTAGC 62 01 AACATGCCTT ACAAGGAGAG AAAAAGCACC GTGCATGCCG ATTGGTGGAA 62 51 GTAAGGTGGT ACGATCGTGC CTTATTAGGA AGGCAACAGA CGGGTCTGAC 63 01 ATGGATTGGA CGAACCACTA AATTCCGCAT TGCAGAGATA TTGTATTTAA
GTGCCTAGCT CGATACAATA AACGCCATTT GACCATTCAC CACATTGGTG
64 01 TGCACCTCCA AGCTGGGTAC CAGCTGCTAG CAAGCTTGAG ATCTGCTTCA 6451 GCTGGAGGCA CTGGGCAGGT AAGTATCAAG GTTACAAGAC AGGTTTAAGG 65 01 AGACCAATAG AAACTGGGCT TGTCGAGACA GAGAAGACTC TTGCGTTTCT 65 51 GATAGGCACC TATTGGTCTT ACTGACATCC ACTTTGCCTT TCTCTCCACA 66 01 GGTGCAGCTG CTGCAGCGGG AATTCAACAG GTGGCCTCAG GAGTCAGGAA 66 51 CATCTCTACT TCCCCAACGA CCCCTGGGTT GTCCTCTCAG AGATGGCTAT
GGATACTACA AGGTGTGGAG CCCAGTTGTT GACTCTGGTC GAGCAGATCC
67 51 TGGCAGAGTT CCAGCTGCAG GAGGAAGACC TGAAGAAGGT GATGAGCCGG 68 01 ATGCAGAAGG AGATGGACCG TGGCCTGAGG CTGGAGACCC ACGAGGAGGC
CAGTGTAAAG ATGTTACCCA CCTACGTGCG TTCCACCCCA GAAGGCTCAG
69 01 AAGTCGGAGA CTTTCTCTCC TTAGACCTGG GAGGAACCAA CTTCAGAGTG 69 51 ATGCTGGTCA AAGTGGGAGA GGGGGAGGCA GGGCAGTGGA GCGTGAAGAC 70 01 AAAACACCAG ATGTACTCCA TCCCCGAGGA CGCCATGACG GGCACTGCCG
AGATGCTCTT TGACTACATC TCTGAATGCA TCTCTGACTT CCTTGACAAG
71 01 CATCAGATGA AGCACAAGAA ACTGCCCCTG GGCTTCACCT TCTCCTTCCC 71 51 TGTGAGGCAC GAAGACCTAG ACAAGGGCAT CCTCCTCAAT TGGACCAAGG 72 01 GCTTCAAGGC CTCTGGAGCA GAAGGGAACA ACATCGTAGG ACTTCTCCGA
GATGCTATCA AGAGGAGAGG GGACTTTGAG ATGGATGTGG TGGCAATGGT
73 01 GAACGACACA GTGGCCACAA TGATCTCCTG CTACTATGAA GACCGCCAAT
GTGAGGTCGG CATGATTGTG GGCACTGGCT GCAATGCCTG CTACATGGAG
74 01 GAAATGCAGA ATGTGGAGCT GGTGGAAGGG GATGAGGGAC GCATGTGCGT
CAACACGGAG TGGGGCGCCT TCGGGGACTC GGGCGAGCTG GATGAGTTCC
75 01 TACTGGAGTA TGACCGGATG GTGGATGAAA GCTCAGCGAA CCCCGGTCAG 75 51 CAGCTGTACG AGAAGATCAT CGGTGGGAAG TATATGGGCG AGCTGGTACG 76 01 ACTTGTGCTG CTTAAGCTGG TGGACGAGAA CCTTCTGTTC CACGGAGAGG
CCTCGGAGCA GCTGCGCACG CGTGGTGCTT TTGAGACCCG TTTCGTGTCA
77 01 CAAGTGGAGA GCGACTCCGG GGACCGAAAG CAGATCCACA ACATCCTAAG 77 51 CACTCTGGGG CTTCGACCCT CTGTCACCGA CTGCGACATT GTGCGCCGTG 78 01 CCTGTGAAAG CGTGTCCACT CGCGCCGCCC ATATGTGCTC CGCAGGACTA
GCTGGGGTCA TAAATCGCAT GCGCGAAAGC CGCAGTGAGG ACGTGATGCG
79 01 CATCACTGTG GGCGTGGATG GCTCCGTGTA CAAGCTGCAC CCGAGCTTCA 79 51 AGGAGCGGTT TCACGCCAGT GTGCGCAGGC TGACACCCAA CTGCGAAATC 8001 ACCTTCATCG AATCAGAGGA GGGCAGCGGC AGGGGAGCCG CACTGGTCTC
TGCGGTGGCC TGCAAGAAGG CTTGCATGCT GGCCCAGTGA AATCCAGGTC
81 01 ATATGGACCG GGACCTGGGT TCCACGGGGA CTCCACACAC CACAAATGCT
CCCAGCCCAC CGGGGCAGGA GACCTATTCT GCTGCTACCC CTGGAAAATG
82 01 GGGAGAGGCC CCTGCAAGCC GAGTCGGCCA GTGGGACAGC CCTAGGCTGG 82 51 ATCGGCCGCT TCGAGCAGAC ATGATAAGAT ACATTGATGA GTTTGGACAA 83 01 ACCACAACTA GAATGCAGTG AAAAAAATGC TTTATTTGTG AAATTTGTGA
TGCTATTGCT TTATTTGTAA CCATTATAAG CTGCAATAAA CAAGTTAACA
84 01 ACAACAATTG CATTCATTTT ATGTTTCAGG TTCAGGGGGA GATGTGGGAG 84 51 GTTTTTTAAA GCAAGTAAAA CCTCTACAAA TGTGGTAAAA TCGATTAGGA
8501 TCTTCCTAGA GCATGGCTAC
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Figure imgf000030_0001
[0176]
1 CAGCAGCTGC GCGCTCGCTC GCTCACTGAG GCCGCCCGGG CAAAGCCCGG 51 GCGTCGGGCG ACCTTTGGTC GCCCGGCCTC AGTGAGCGAG CGAGCGCGCA 101 GAGAGGGAGT GGCCAACTCC ATCACTAGGG GTTCCTTGTA GTTAATGATT 151 AACCCGCCAT GCTACTTATC TACGTAGCCA TGCTCTAGAC ATGGCTCGAC 201 AGATCTCAAT ATTGGCCATT AGCCATATTA TTCATTGGTT ATATAGCATA 251 AATCAATATT GGCTATTGGC CATTGCATAC GTTGTATCTA TATCATAATA 301 TGTACATTTA TATTGGCTCA TGTCCAATAT GACCGCCATG TTGGCATTGA 351 TTATTGACTA GTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCAT TAGTTCATAG 401 CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTG 451 GCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT GACGTATGTT 501 CCCATAGTAA CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGAGTA 551 TTTACGGTAA ACTGCCCACT TGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAA 601 GTCCGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA AATGGCCCGC CTGGCATTAT 651 GCCCAGTACA TGACCTTACG GGACTTTCCT ACTTGGCAGT ACATCTACGT 701 ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACACCAATG 751 GGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGTCT CCACCCCATT 801 GACGTCAATG GGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA 851 ATGTCGTAAC AACTGCGATC GCCCGCCCCG TTGACGCAAA TGGGCGGTAG 901 GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC 951 AGATCACTAG AAGCTTTATT GCGGTAGTTT ATCACAGTTA AATTGCTAAC 1001 GCAGTCAGTG CTTCTGACAC AACAGTCTCG AACTTAAGCT GCAGTGACTC 1051 TCTTAAGGTA GCCTTGCAGA AGTTGGTCGT GAGGCACTGG GCAGGTAAGT 1 10 1 ATCAAGGTTA CAAGACAGGT TTAAGGAGAC CAATAGAAAC TGGGCTTGTC 1151 GAGACAGAGA AGACTCTTGC GTTTCTGATA GGCACCTATT GGTCTTACTG 1201 ACATCCACTT TGCCTTTCTC TCCACAGGTG TCCACTCCCA GTTCAATTAC 1251 AGCTCTTAAG GCTAGAGTAC TTAATACGAC TCACTATAGG CTAGCCTCGA 1301 GAATTCTGCC ATGGCCCTGT GGATGCGCCT CCTGCCCCTG CTGGCGCTGC 1351 TGGCCCTCTG GGGACCTGAC CCAGCCGCAG CCTTTGTGAA CCAACACCTG 1401 TGCGGCTCAG ATCTGGTGGA AGCTCTCTAC CTAGTGTGCG GGGAACGAGG 1451 CTTCTTCTAC ACACCCAGGA CCAAGCGGGA GGCAGAGGAC CTGCAGGTGG 1501 GGCAGGTGGA GCTGGGCGGG GGCCCTGGTG CAGGCAGCCT GCAGCCCTTG 1551 GCCCTGGAGG GGTCGCGACA GAAGCGTGGC ATTGTGGAAC AATGCTGTAC 1601 CAGCATCTGC TCCCTCTACC AGCTGGAGAA CTACTGCAAC TAGACGCAGC 1651 TGCAAGCTTA TCGATACCGT CGACCTCGAG GAATTCACGC GTGGTACCTC 1701 TAGAGTCGAC CCGGGCGGCC GCTTCCCTTT AGTGAGGGTT AATGCTTCGA 1751 GCAGACATGA TAAGATACAT TGATGAGTTT GGACAAACCA CAACTAGAAT 1801 GCAGTGAAAA AAATGCTTTA TTTGTGAAAT TTGTGATGCT ATTGCTTTAT 1851 TTGTAACCAT TATAAGCTGC AATAAACAAG TTAACAACAA CAATTGCATT 1 90 1 CATTTTATGT TTCAGGTTCA GGGGGAGATG TGGGAGGTTT TTTAAAGCAA 1951 GTAAAACCTC TACAAATGTG GTAAAATCCG ATAAGGGACT AGAGCATGGC 2 00 1 TACGTAGATA AGTAGCATGG CGGGTTAATC ATTAACTACA AGGAACCCCT 2 05 1 AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCG CTCACTGAGG 2 10 1 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCA 2 15 1 GTGAGCGAGC GAGCGCGCCA GCTGGCGTAA TAGCGAAGAG GCCCGCACCG 2.201 ATCGCCCTTC CCAACAGTTG CGCAGCCTGA ATGGCGAATG GAATTCCAGA CGATTGAGCG TCAAAATGTA GGTATTTCCA TGAGCGTTTT TCCGTTGCAA
2 30 1 TGGCTGGCGG TAATATTGTT CTGGATATTA CCAGCAAGGC CGATAGTTTG 2 35 1 AGTTCTTCTA CTCAGGCAAG TGATGTTATT ACTAATCAAA GAAGTATTGC 2 40 1 GACAACGGTT AATTTGCGTG ATGGACAGAC TCTTTTACTC GGTGGCCTCA 2 45 1 CTGATTATAA AAACACTTCT CAGGATTCTG GCGTACCGTT CCTGTCTAAA 2 50 1 ATCCCTTTAA TCGGCCTCCT GTTTAGCTCC CGCTCTGATT CTAACGAGGA 2 55 1 AAGCACGTTA TACGTGCTCG TCAAAGCAAC CATAGTACGC GCCCTGTAGC 2 60 1 GGCGCATTAA GCGCGGCGGG TGTGGTGGTT ACGCGCAGCG TGACCGCTAC ACTTGCCAGC GCCCTAGCGC CCGCTCCTTT CGCTTTCTTC CCTTCCTTTC
2 70 1 TCGCCACGTT CGCCGGCTTT CCCCGTCAAG CTCTAAATCG GGGGCTCCCT 2 75 1 TTAGGGTTCC GATTTAGTGC TTTACGGCAC CTCGACCCCA AAAAACTTGA TTAGGGTGAT GGTTCACGTA GTGGGCCATC GCCCTGATAG ACGGTTTTTC
2 85 1 GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA 2 90 1 ACTGGAACAA CACTCAACCC TATCTCGGTC TATTCTTTTG ATTTATAAGG 2 95 1 GATTTTGCCG ATTTCGGCCT ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA 3 00 1 AATTTAACGC GAATTTTAAC AAAATATTAA CGTCTACAAT TTAAATATTT 3 05 1 GCTTATACAA TCTTCCTGTT TTTGGGGCTT TTCTGATTAT CAACCGGGGT 3 10 1 ACATATGATT GACATGCTAG TTTTACGATT ACCGTTCATC GATTCTCTTG 3 15 1 TTTGCTCCAG ACTCTCAGGC AATGACCTGA TAGCCTTTGT AGAGACCTCT 3 20 1 CAAAAATAGC TACCCTCTCC GGCATGAATT TATCAGCTAG AACGGTTGAA 3 25 1 TATCATATTG ATGGTGATTT GACTGTCTCC GGCCTTTCTC ACCCGTTTGA 3 30 1 ATCTTTACCT ACACATTACT CAGGCATTGC ATTTAAAATA TATGAGGGTT CTAAAAATTT TTATCCTTGC GTTGAAATAA AGGCTTCTCC CGCAAAAGTA
3 40 1 TTACAGGGTC ATAATGTTTT TGGTACAACC GATTTAGCTT TATGCTCTGA 3 45 1 GGCTTTATTG CTTAATTTTG CTAATTCTTT GCCTTGCCTG TATGATTTAT 3 50 1 TGGATGTTGG AATCGCCTGA TGCGGTATTT TCTCCTTACG CATCTGTGCG 3 55 1 GTATTTCACA CCGCATATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC 3 60 1 GCATAGTTAA GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG 3 65 1 ACGGGCTTGT CTGCTCCCGG CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT 3 70 1 CCGGGAGCTG CATGTGTCAG AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG 3 75 1 AGACGAAAGG GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA ATGTCATGAT 3 80 1 AATAATGGTT TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT
Figure imgf000031_0001
T TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC 3 90 1 ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT
4 00 1 TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT 4 05 1 GCTGAAGATC AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA 4 10 1 CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC
4 20 1 GCCGGGCAAG AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT 4 25 1 GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG 4 30 1 TAAGAGAATT ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC 4 35 1 AACTTACTTC TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT 4 40 1 GCACAACATG GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC 4 45 1 TGAATGAAGC CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA 4 50 1 ATGGCAACAA CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC 4 55 1 TTCCCGGCAA CAATTAATAG ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC 4 60 1 CACTTCTGCG CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT 4 65 1 GGAGCCGGTG AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA 4 70 1 TGGTAAGCCC TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA 4 75 1 CTATGGATGA ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG
4 90 1 ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG 4 95 1 TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC C TTTT TTTCT 5 00 1 GCGCGTAATC TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG 50 51 TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC 51 01 TTCAGCAGAG CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT 51 51 AGGCCACCAC TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC 52 01 TAATCCTGTT ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC 52 51 GGGTTGGACT CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG 53 01 AACGGGGGGT TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG 53 51 AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA 54 01 GGGAGAAAGG CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA 54 51 GCGCACGAGG GAGCTTCCAG GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG 55 01 TCGGGTTTCG CCACCTCTGA CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA 55 51 GGGGGGCGGA GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT 56 01 CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC 56 51 CTGATTCTGT GGATAACCGT ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT 57 01 CGCCGCAGCC GAACGACCGA GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA 57 51 AGAGCGCCCA ATACGCAAAC CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG CCGATTCATT 58 01 AATG
ITR 5': 1-136 bp
Promotor CMV: 206-1227 bp
hIns: 1304-1650
SV40 polyA: 1752-1974 bp
ITR 3': 2041-2191 bp
Constructo de referencia C: RSV-rGck (SEQ ID N.°:18)
[0177]
Figure imgf000032_0001
Secuencia de plásmido pGG2-RSV-rGck
[0178]
GTAGATAAGT AGCATGGCGG GTTAATCATT AACTACAAGG AACCCCTAGT
51 GATGGAGTTG GCCACTCCCT CTCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG
101 GGCGACCAAA GGTCGCCCGA CGCCCGGGCT TTGCCCGGGC GGCCTCAGTG 151 AGCGAGCGAG CGCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 201 GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGAA TTCCAGACGA 251 TTGAGCGTCA AAATGTAGGT ATTTCCATGA GCGTTTTTCC GTTGCAATGG 301 CTGGCGGTAA TATTGTTCTG GATATTACCA GCAAGGCCGA TAGTTTGAGT 351 TCTTCTACTC AGGCAAGTGA TGTTATTACT AATCAAAGAA GTATTGCGAC 401 AACGGTTAAT TTGCGTGATG GACAGACTCT TTTACTCGGT GGCCTCACTG 451 ATTATAAAAA CACTTCTCAG GATTCTGGCG TACCGTTCCT GTCTAAAATC 501 CCTTTAATCG GCCTCCTGTT TAGCTCCCGC TCTGATTCTA ACGAGGAAAG 551 CACGTTATAC GTGCTCGTCA AAGCAACCAT AGTACGCGCC CTGTAGCGGC 601 GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG CGCAGCGTGA CCGCTACACT 651 TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG 701 CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC TAAATCGGGG GCTCCCTTTA 751 GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT ACGGCACCTC GACCCCAAAA AACTTGATTA 801 GGGTGATGGT TCACGTAGTG GGCCATCGCC CTGATAGACG GTTTTTCGCC 851 CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTC TTTAATA GTGGACTCTT GTTCCAAACT 901 GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGTCTAT TCTTTTG ATT TATAAGGGAT 951 TTTGCCGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA TGAGCTGATT TAACAAAAAT 1001 TTAACGCGAA TTTTAACAAA ATATTAACGT CTACAATTTA AATATTTGCT 1051 TATACAATCT TCCTGTTTTT GGGGCTTTTC TGATTATCAA CCGGGGTACA 1101 TATGATTGAC ATGCTAGTTT TACGATTACC GTTCATCGAT TCTCTTGTTT 1151 GCTCCAGACT CTCAGGCAAT GACCTGATAG CCTTTGTAGA GACCTCTCAA 1 20 1 AAATAGCTAC CCTCTCCGGC ATGAATTTAT CAGCTAGAAC GGTTGAATAT 1 25 1 CATATTGATG GTGATTTGAC TGTCTCCGGC CTTTCTCACC CGTTTGAATC 1 30 1 TTTACCTACA CATTACTCAG GCATTGCATT TAAAATATAT GAGGGTTCTA 1 35 1 AAAATTTTTA TCCTTGCGTT GAAATAAAGG CTTCTCCCGC AAAAGTATTA 1 40 1 CAGGGTCATA ATGTTTTTGG TACAACCGAT TTAGCTTTAT GCTCTGAGGC 1 45 1 TTTATTGCTT AATTTTGCTA ATTCTTTGCC TTGCCTGTAT GATTTATTGG 1 50 1 ATGTTGGAAT CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT CTGTGCGGTA 1 55 1 TTTCACACCG CATATGGTGC ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA 1 60 1 TAGTTAAGCC AGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG 1 65 1 GGCTTGTCTG CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG 1 70 1 GGAGCTGCAT GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGA 1 75 1 CGAAAGGGCC TCGTGATACG CCTATTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT 1 80 1 AATGGTTTCT TAGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA 1 85 1 CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG 1 30 1 AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT
2 00 1 GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT i ’1 * GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG 2 10 1 CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA 2 15 1 GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC 2 20 1 GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA
2 30 1 GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA
2 40 1 CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA 2 45 1 ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG 2 50 1 GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC 2 55 1 CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC 2 60 1 TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA 2 65 1 GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG 2 70 1 TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA 2 75 1 TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT
2 85 1 AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA 2 90 1 ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG
3 00 1 CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC
3 10 1 AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG 3 15 1 CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG
3 25 1 TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC 3 30 1 GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CTATGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG
3 40 1 AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG 3 45 1 CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG 3 50 1 GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG 3 55 1 GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT 3 60 1 GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG 3 65 1 ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC 3 70 1 CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA 3 75 1 GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCAGCTG CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGCCCGG GCAAAGCCCG GGCGTCGGGC GACCTTTGGT CGCCCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC
3 90 1 AGAGAGGGAG TGGCCAACTC CATCACTAGG GGTTCCTTGT AGTTAATGAT t TAACCCGCCA TGCTACTTAT CTACGTAGCC ATGCTCTGGA AGATCTCGAC 4 00 1 GCGTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGCAGA TCCGTATGGT GCACTCTCAG TACAATCTGC TCTGATGCCG CATAGTTAAG CCAGTATCTG CTCCCTGCTT
4 10 1 GTGTGTTGGA GGTCGCTGAG TAGTGCGCGA GCAAAATTTA AGCTACAACA 4 15 1 AGGCAAGGCT TGACCGACAA TTGCATGAAG AATCTGCTTA GGGTTAGGCG 4 20 1 TTTTGCGCTG CTTCGCGATG TACGGGCCAG ATATTCGCGT ATCTGAGGGG 4251 ACTAGGGTGT GTTTAGGCGA AAAGCGGGGC TTCGGTTGTA CGCGGTTAGG 4301 AGTCCCCTCA GGATATAGTA GTTTCGCTTT TGCATAGGGA GGGGGAAATG 4351 TAGTCTTATG CAATACTCTT GTAGTCTTGC AACATGGTAA CGATGAGTTA 4401 GCAACATGCC TTACAAGGAG AGAAAAAGCA CCGTGCATGC CGATTGGTGG 4451 AAGTAAGGTG GTACGATCGT GCCTTATTAG GAAGGCAACA GACGGGTCTG 4501 ACATGGATTG GACGAACCAC TAAATTCCGC ATTGCAGAGA TATTG TATTT 4551 AAGTGCCTAG CTCGATACAA TAAACGCCAT TTGACCATTC ACCACATTGG 4601 TGTGCACCTC CAAGCTGGGT ACCAGCTGCT AGCAAGCTTG AGATCTGCTT 4651 CAGCTGGAGG CACTGGGCAG GTAAGTATCA AGGTTACAAG ACAGGTTTAA 4701 GGAGACCAAT AGAAACTGGG CTTGTCGAGA CAGAGAAGAC TCTTGCGTTT 4751 CTGATAGGCA CCTATTGGTC TTACTGACAT CCACTTTGCC TTTCTCTCCA 4801 CAGGTGCAGC TGCTGCAGCG GGAATTCAAC AGGTGGCCTC AGGAGTCAGG 4851 AACATCTCTA CTTCCCCAAC GACCCCTGGG TTGTCCTCTC AGAGATGGCT 4901 ATGGATACTA CAAGGTGTGG AGCCCAGTTG TTGACTCTGG TCGAGCAGAT 4951 CCTGGCAGAG TTCCAGCTGC AGGAGGAAGA CCTGAAGAAG GTGATGAGCC 5001 GGATGCAGAA GGAGATGGAC CGTGGCCTGA GGCTGGAGAC CCACGAGGAG 5051 GCCAGTGTAA AGATGTTACC CACCTACGTG CGTTCCACCC CAGAAGGCTC 5101 AGAAGTCGGA GACTTTCTCT CCTTAGACCT GGGAGGAACC AACTTCAGAG 5151 TGATGCTGGT CAAAGTGGGA GAGGGGGAGG CAGGGCAGTG GAGCGTGAAG 5201 ACAAAACACC AGATGTACTC CATCCCCGAG GACGCCATGA CGGGCACTGC 5251 CGAGATGCTC TTTGACTACA TCTCTGAATG CATCTCTGAC TTCCTTGACA 5301 AGCATCAGAT GAAGCACAAG AAACTGCCCC TGGGCTTCAC CTTCTCCTTC 5351 CCTGTGAGGC ACGAAGACCT AGACAAGGGC ATCCTCCTCA ATTGGACCAA 5401 GGGCTTCAAG GCCTCTGGAG CAGAAGGGAA CAACATCGTA GGACTTCTCC 5451 GAGATGCTAT CAAGAGGAGA GGGGACTTTG AGATGGATGT GGTGGCAATG 5501 GTGAACGACA CAGTGGCCAC AATGATCTCC TGCTACTATG AAGACCGCCA 5551 ATGTGAGGTC GGCATGATTG TGGGCACTGG CTGCAATGCC TGCTACATGG 5601 AGGAAATGCA GAATGTGGAG CTGGTGGAAG GGGATGAGGG ACGCATGTGC 5651 GTCAACACGG AGTGGGGCGC CTTCGGGGAC TCGGGCGAGC TGGATGAGTT 5701 CCTACTGGAG TATGACCGGA TGGTGGATGA AAGCTCAGCG AACCCCGGTC 5751 AGCAGCTGTA CGAGAAGATC ATCGGTGGGA AGTATATGGG CGAGCTGGTA 5801 CGACTTGTGC TGCTTAAGCT GGTGGACGAG AACCTTCTGT TCCACGGAGA 5851 GGCCTCGGAG CAGCTGCGCA CGCGTGGTGC TTTTGAGACC CGTTTCGTGT 5901 CACAAGTGGA GAGCGACTCC GGGGACCGAA AGCAGATCCA CAACATCCTA 5951 AGCACTCTGG GGCTTCGACC CTCTGTCACC GACTGCGACA TTGTGCGCCG 6001. TGCCTGTGAA AGCGTGTCCA CTCGCGCCGC CCATATGTGC TCCGCAGGAC 6051 TAGCTGGGGT CATAAATCGC ATGCGCGAAA GCCGCAGTGA GGACGTGATG 6101 CGCATCACTG TGGGCGTGGA TGGCTCCGTG TACAAGCTGC ACCCGAGCTT 6151 CAAGGAGCGG TTTCACGCCA GTGTGCGCAG GCTGACACCC AACTGCGAAA 6201 TCACCTTCAT CGAATCAGAG GAGGGCAGCG GCAGGGGAGC CGCACTGGTC 6251 TCTGCGGTGG CCTGCAAGAA GGCTTGCATG CTGGCCCAGT GAAATCCAGG 6301 TCATATGGAC CGGGACCTGG GTTCCACGGG GACTCCACAC ACCACAAATG 6351 CTCCCAGCCC ACCGGGGCAG GAGACCTATT CTGCTGCTAC CCCTGGAAAA 6401 TGGGGAGAGG CCCCTGCAAG CCGAGTCGGC CAGTGGGACA GCCCTAGGCT 6451 GGATCGGCCG CTTCGAGCAG ACATGATAAG ATACATTGAT GAGTTTGGAC 6501 AAACCACAAC TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT 6551 GATGCTATTG CTTTATTTG T AACCATTATA AGCTGCAATA AACAAGTTAA 6601 CAACAACAAT TGCATTCATT TTATGTTTCA GGTTCAGGGG GAGATGTGGG 6651 AG G TTTTTTA AAGCAAGTAA AACCTCTACA AATGTGGTAA AATCGATTAG 6701 GATCTTCCTA GAGCATGGCT AC
ITR 5': 3802-3937 bp
Promotor RSV: 4088-4803 bp
rGck: 4915-6292 bp
SV40 poIyA: 6456-6694 bp
ITR 3': 38-188 bp
Constructo de referencia D: CMV-hIns-RSV-hGck (SEQ ID N.°:9)
[0179]
Figure imgf000036_0001
Secuencia de plásmido pAAV-CMV-hIns-RSV-hGck
[0180]
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG 1 51 ATATCTGTAG TTAATGATTA ACCCGCCATG CTACTTATCT ACAGATCTCA 201 ATATTGGCCA TTAGCCATAT TATTCATTGG TTATATAGCA TAAATCAATA 25 1 TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACGTTGTATC TATATCATAA TATGTACATT 30 1 TATATTGGCT CATGTCCAAT ATGACCGCCA TGTTGGCATT GATTATTGAC 351 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA 4 01 TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG 4 51 CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT 501 AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT 55 1 AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTCCGCCC 6 01 CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA 6 51 CATGACCTTA CGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 701 TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACACCAA TGGGCGTGGA 751 TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA 80 1 TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA 85 1 ACAACTGCGA TCGCCCGCCC CGTTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTAC 9 01 GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAGTGAACCG TCAGATCACT 9 51 AGGCTAGCTA TTGCGGTAGT TTATCACAGT TAAATTGCTA ACGCAGTCAG 1001 TGCTTCTGAC ACAACAGTCT CGAACTTAAG CTGCAGTGAC TCTCTTAAGG 1051 TAGCCTTGCA GAAGTTGGTC GTGAGGCACT GGGCAGGTAA GTATCAAGGT 1101 TACAAGACAG GTTTAAGGAG ACCAATAGAA ACTGGGCTTG TCGAGACAGA 115 1 GAAGACTCTT GCGTTTCTGA TAGGCACCTA TTGGTCTTAC TGACATCCAC 1201 TTTGCCTTTC TCTCCACAGG TGTCCACTCC CAGTTCAATT ACAGCTCTTA 1251 AGGC TAGAGT ACTTAATACG AC T CAC TATA GAATACGACT CAC TATAGGG 130 1 AGACGCTAGC GTCGACCTTC TGCCATGGCC CTGTGGATGC GCCTCCTGCC 135 1 CCTGCTGGCG CTGCTGGCCC TCTGGGGACC TGACCCAGCC GCAGCCTTTG 140 1 TGAACCAACA CCTGTGCGGC TCAGATCTGG TGGAAGCTCT CTACCTAGTG 145 1 TGCGGGGAAC GAGGCTTCTT CTACACACCC AGGACCAAGC GGGAGGCAGA 1501 GGACCTGCAG GTGGGGCAGG TGGAGCTGGG CGGGGGCCCT GGTGCAGGCA 155 1 GCCTGCAGCC CTTGGCCCTG GAGGGGTCGC GACAGAAGCG TGGCATTGTG 160 1 GAACAATGCT GTACCAGCAT CTGCTCCCTC TACCAGCTGG AGAACTACTG 165 1 CAACTAGACG CAGCCGTCGA CGGTACCAGC GCTGTCGAGG CCGCTTCGAG 170 1 CAGACATGAT AAGATACATT GATGAGTTTG GACAAACCAC AACTAGAATG 1751 CAGTGAAAAA AATGCTTTAT TTGTGAAATT TGTGATGCTA TTGCTTTATT 180 1 TGTAACCATT ATAAGCTGCA ATAAACAAGT TAACAACAAC AATTGCATTC 185 1 ATTTTATG TT TCAGGTTCAG GGGGAGATGT GGGAGGTTTT TTAAAGCAAG 1901 TAAAACCTCT ACAAATGTGG TAAAATCGAT TAGGATCTTC CTAGAGCATG 195 1 GC TAC C TAGA CATGGCTCGA CAGATCAGCG CTCATGCTCT GGAAGATCTC 2001 GATTTATCCA TGTTTGACAG CTTATCATCG CAGATCCGTA TGGTGCACTC 2051 TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TCTGCTCCCT 2101 GCTTGTGTGT TGGAGGTCGC TGAGTAGTGC GCGAGCAAAA TTTAAGCTAC 2151 AACAAGGCAA GGCTTGACCG ACAATTGCAT GAAGAATCTG CTTAGGGTTA 2201 GGCGTTTTGC GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATTC GCGTATCTGA 2251 GGGGACTAGG GTGTGTTTAG GCGAAAAGCG GGGCTTCGGT TGTACGCGGT 2 30 1 TAGGAGTCCC CTCAGGATAT AGTAGTTTCG CTTTTGCATA GGGAGGGGGA 2 35 1 AATGTAGTCT TATGCAATAC TCTTGTAGTC TTGCAACATG GTAACGATGA 2 40 1 GTTAGCAACA TGCCTTACAA GGAGAGAAAA AGCACCGTGC ATGCCGATTG 2 45 1 GTGGAAGTAA GGTGGTACGA TCGTGCCTTA TTAGGAAGGC AACAGACGGG 2 50 1 TCTGACATGG ATTGGACGAA CCACTAAATT CCGCATTGCA GAGATATTGT ATTTAAGTGC CTAGCTCGAT ACAATAAACG CCATTTGACC ATTCACCACA
2 60 1 TTGGTGTGCA CCTCCAAGCT GGGTACCAGC TTCTAGAGAG ATCTGCTTCA 2 65 1 GCTGGAGGCA CTGGGCAGGT AAGTATCAAG GTTACAAGAC AGGTTTAAGG 2 70 1 AGACCAATAG AAACTGGGCT TGTCGAGACA GAGAAGACTC TTGCGTTTCT 2 75 1 GATAGGCACC TATTGGTCTT ACTGACATCC ACTTTGCCTT TCTCTCCACA M'fi GGTGCAGCTG CTGCAGCGGT CTAGAACTCG AGTCGAGACC ATGGCGATGG ATGTCACAAG GAGCCAGGCC CAGACAGCCT TGACTCTGGT AGAGCAGATC
2 90 1 CTGGCAGAGT TCCAGCTGCA GGAGGAGGAC CTGAAGAAGG TGATGAGACG GATGCAGAAG GAGATGGACC GCGGCCTGAG GCTGGAGACC CATGAAGAGG
3 00 1 CCAGTGTGAA GATGCTGCCC ACCTACGTGC GCTCCACCCC AGAAGGCTCA GAAGTCGGGG ACTTCCTCTC CCTGGACCTG GGTGGCACTA ACTTCAGGGT
3 10 1 GATGCTGGTG AAGGTGGGAG AAGGTGAGGA GGGGCAGTGG AGCGTGAAGA 3 15 1 CCAAACACCA GATGTACTCC ATCCCCGAGG ACGCCATGAC CGGCACTGCT GAGATGCTCT TCGACTACAT CTCTGAGTGC ATCTCCGACT TCCTGGACAA GCATCAGATG AAACACAAGA AGCTGCCCCT GGGCTTCACC TTCTCCTTTC
3 30 1 CTGTGAGGCA CGAAGACATC GATAAGGGCA TCCTTCTCAA CTGGACCAAG 3 35 1 GGCTTCAAGG CCTCAGGAGC AGAAGGGAAC AATGTCGTGG GGCTTCTGCG 3 40 1 AGACGCTATC AAACGGAGAG GGGACTTTGA AATGGATGTG GTGGCAATGG 3 45 1 TGAATGACAC GGTGGCCACG ATGATCTCCT GC TAC TAC GA AGACCATCAG 3 50 1 TGCGAGGTCG GCATGATCGT GGGCACGGGC TGCAATGCCT GC TACATGGA 3 55 1 GGAGATGCAG AATGTGGAGC TGGTGGAGGG GGACGAGGGC CGCATGTGCG 3 60 1 TCAATACCGA GTGGGGCGCC TTCGGGGACT CCGGCGAGCT GGACGAGTTC 3 65 1 CTGCTGGAGT ATGACCGCCT GGTGGACGAG AGCTCTGCAA ACCCCGGTCA 3 70 1 GCAGCTGTAT GAGAAGCTCA TAGGTGGCAA GTACATGGGC GAGCTGGTGC 3 75 1 GGCTTGTGCT GCTCAGGCTC GTGGACGAAA ACCTGCTCTT CCACGGGGAG GCCTCCGAGC AGCTGCGCAC ACGCGGAGCC TTCGAGACGC GCTTCGTGTC GCAGGTGGAG AGCGACACGG GC GAC C GC AA GCAGATCTAC AACATCCTGA
3 90 1 GCACGCTGGG GCTGCGACCC TCGACCACCG ACTGCGACAT CGTGCGCCGC GCCTGCGAGA GCGTGTCTAC GCGCGCTGCG CACATGTGCT CGGCGGGGCT
4 00 1 GGCGGGCGTC ATCAACCGCA TGCGCGAGAG CCGCAGCGAG GACGTAATGC GCATCACTGT GGGCGTGGAT GGCTCCGTGT ACAAGCTGCA CCCCAGCTTC
4 10 1 AAGGAGCGGT TCCATGCCAG CGTGCGCAGG CTGACGCCCA GCTGCGAGAT CACCTTCATC GAGTCGGAGG AGGGCAGTGG CCGGGGCGCG GCCCTGGTCT
4 20 1 CGGCGGTGGC CTGTAAGAAG GCCTGTATGC TGGGCCAGTG ACTCGAGCAC 4 25 1 GTGGAGCTCG CTGATCAGCC TCGACTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT 4 30 1 GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA
4 40 1 GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG CAAGGGGGAG GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGGC
4 50 1 CACGTGATTT AAATGCGGCC GCAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG
4 60 1 CCCGACGCCC GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC 4 65 1 AGCTGCCTGC AGGGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG 4 70 1 CGGTATTTCA CACCGCATAC GTCAAAGCAA CCATAGTACG CGCCCTGTAG 4 75 1 CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TAC GC GCAGC GTGACCGCTA 4 80 1 CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCG CTTTCTT CCCTTCCTTT CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC
4 90 1 TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG 4 95 1 ATTTGGGTGA TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT 5 00 1 CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA 5 05 1 AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGG CTA TTCTTTT GATTTATAAG 5 10 1 GGATTTTGCC GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA 5 15 1 AAATTTAACG CGAATTTTAA CAAAATATTA ACGTTTACAA TTTTATGGTG 5 2 01 CACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGCCCCGAC 5 25 1 ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA 5 30 1 TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG 535 1 GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC 540 1 GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGAC GTCA 545 1 GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT G TTTATTTTT 550 1 CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA 555 1 TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT 560 1 GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 565 1 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC 570 1 GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT 575 1 TTTCGCCCCG AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT 580 1 ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC 585 1 GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA 590 1 GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 595 1 CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG 600 1 GAGGACCGAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA 605 1 ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA 610 1 CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC 615 1 TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC 620 1 TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 625 1 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC 630 1 GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA 635 1 GTTATCTACA CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA 640 1 GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC 645 1 AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTA A TTT 650 1 AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC 655 1 TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA 660 1 AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA 665 1 ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT 6701 ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA 6751 ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT 680 1 GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 685 1 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGAC GATAGT 690 1 TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG 695 1 CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGC GTGA 700 1 GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC 705 1 CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG 710 1 GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 715 1 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA 7201 ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT 725 1 GCTCACATGT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor CMV: 193-1310 bp
hIns: 1318-1664 bp
SV40 polyA: 1678-1976 bp
Promotor RSV: 2092-2801 bp
hGck: 2826-4240 bp
bGH polyA: 4248-4506 bp
ITR 3': 4523-4663 bp
Constructo de referencia E: RSV-hGck-CMV-hIns (SEQ ID N.°:10)
[0181]
Figure imgf000040_0001
Secuencia de plásmido pAAV-RSV-hGck-CMV-hlns
[0182]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
151 ATATCCATGT TTGACAGCTT ATCATCGCAG ATCCGTATGG TGCACTCTCA
201 GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT GCTCCCTGCT
251 TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT AAGCTACAAC
301 AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGC
351 GTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCA GATATTCGCG TATCTGAGGG
401 GACTAGGGTG TGTTTAGGCG AAAAGCGGGG CTTCGGTTGT ACGCGGTTAG
451 GAGTCCCCTC AGGATATAGT AGTTTCGCTT TTGCATAGGG AGGGGGAAAT
501 GTAGTCTTAT GCAATACTCT TGTAGTCTTG CAACATGGTA ACGATGAGTT
551 AGCAACATGC CTTACAAGGA GAGAAAAAGC ACCGTGCATG CCGATTGGTG
601 GAAGTAAGGT GGTACGATCG TGCCTTATTA GGAAGGCAAC AGACGGGTCT
651 GACATGGATT GGACGAACCA CTAAATTCCG CATTGCAGAG ATATTGTATT
701 TAAGTGCCTA GCTCGATACA ATAAACGCCA TTTGACCATT CACCACATTG
751 GTGTGCACCT CCAAGCTGGG TACCAGCTTC TAGAGAGATC TGCTTCAGCT
801 GGAGGCACTG GGCAGGTAAG TATCAAGGTT ACAAGACAGG TTTAAGGAGA
851 CCAATAGAAA CTGGGCTTGT CGAGACAGAG AAGACTCTTG CGTTTCTGAT
901 AGGCACCTAT TGGTCTTACT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT
951 GCAGCTGCTG CAGCGGTCTA GAACTCGAGT CGAGACCATG GCGATGGATG
1001 TCACAAGGAG CCAGGCCCAG ACAGCCTTGA CTCTGGTAGA GCAGATCCTG
1051 GCAGAGTTCC AGCTGCAGGA GGAGGACCTG AAGAAGGTGA TGAGACGGAT
1101 GCAGAAGGAG ATGGACCGCG GCCTGAGGCT GGAGACCCAT GAAGAGGCCA
1151 GTGTGAAGAT GCTGCCCACC TACGTGCGCT CCACCCCAGA AGGCTCAGAA
1201 GTCGGGGACT TCCTCTCCCT GGACCTGGGT GGCACTAACT TCAGGGTGAT
1251 GCTGGTGAAG GTGGGAGAAG GTGAGGAGGG GCAGTGGAGC GTGAAGACCA
1301 AACACCAGAT GTACTCCATC CCCGAGGACG CCATGACCGG CACTGCTGAG
1351 ATGCTCTTCG ACTACATCTC TGAGTGCATC TCCGACTTCC TGGACAAGCA
1401 TCAGATGAAA CACAAGAAGC TGCCCCTGGG CTTCACCTTC TCCTTTCCTG
1451 TGAGGCACGA AGACATCGAT AAGGGCATCC TTCTCAACTG GACCAAGGGC
1501 TTCAAGGCCT CAGGAGCAGA AGGGAACAAT GTCGTGGGGC TTCTGCGAGA
1551 CGCTATCAAA CGGAGAGGGG ACTTTGAAAT GGATGTGGTG GCAATGGTGA
1601 ATGACACGGT GGCCACGATG ATCTCCTGCT ACTACGAAGA CCATCAGTGC
1651 GAGGTCGGCA TGATCGTGGG CACGGGCTGC AATGCCTGCT ACATGGAGGA
1701 GATGCAGAAT GTGGAGCTGG TGGAGGGGGA CGAGGGCCGC ATGTGCGTCA
1751 ATACCGAGTG GGGCGCCTTC GGGGACTCCG GCGAGCTGGA CGAGTTCCTG
1801 CTGGAGTATG ACCGCCTGGT GGACGAGAGC TCTGCAAACC CCGGTCAGCA
1851 GCTGTATGAG AAGCTCATAG GTGGCAAGTA CATGGGCGAG CTGGTGCGGC
1901 TTGTGCTGCT CAGGCTCGTG GACGAAAACC TGCTCTTCCA CGGGGAGGCC
1951 TCCGAGCAGC TGCGCACACG CGGAGCCTTC GAGACGCGCT TCGTGTCGCA
2001 GGTGGAGAGC GACACGGGCG ACCGCAAGCA GATCTACAAC ATCCTGAGCA
2051 CGCTGGGGCT GCGACCCTCG ACCACCGACT GCGACATCGT GCGCCGCGCC
2101 TGCGAGAGCG TGTCTACGCG CGCTGCGCAC ATGTGCTCGG CGGGGCTGGC
2151 GGGCGTCATC AACCGCATGC GC GAGAGC C G CAGC GAGGAC GTAATGCGCA
2201 TCACTGTGGG CGTGGATGGC TCCGTGTACA AGCTGCACCC CAGCTTCAAG
2251 GAGCGGTTCC ATGCCAGCGT GCGCAGGCTG ACGCCCAGCT GCGAGATCAC
2301 CTTCATCGAG TCGGAGGAGG GCAGTGGCCG GGGCGCGGCC CTGGTCTCGG
2351 CGGTGGCCTG TAAGAAGGCC TGTATGCTGG GCCAGTGACT CGAGCACGTG
24 01 GAGCTCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT
2451 GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC
2501 TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT
2551 GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT
2 60 1 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCCAC 2 65 1 GTGATTTATC TGTAGTTAAT GATTAACCCG CCATGCTACT TATCTACAGA 2 70 1 TCTCAATATT GGCCATTAGC CATATTATTC ATTGGTTATA TAGCATAAAT 2 75 1 CAATATTGGC TATTGGCCAT TGCATACGTT GTATCTATAT CATAATATGT ACATTTATAT TGGCTCATGT CCAATATGAC CGCCATGTTG GCATTGATTA
<*'«í TTGACTAGTT ATTAATAGTA ATCAATTACG GGGTCATTAG TTCATAGCCC 2 90 1 ATATATGGAG TTCCGCGTTA CATAACTTAC GGTAAATGGC CCGCCTGGCT GACCGCCCAA CGACCCCCGC CCATTGACGT CAATAATGAC GTATGTTCCC
3 00 1 ATAGTAACGC CAATAGGGAC TTTCCATTGA CGTCAATGGG TGGAGTATTT 3 05 1 ACGGTAAACT GCCCACTTGG CAGTACATCA AGTGTATCAT ATGCCAAGTC 3 10 1 CGCCCCCTAT TGACGTCAAT GACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCATTATGCC 3 15 1 CAGTACATGA CCTTACGGGA CTTTCCTACT TGGCAGTACA TCTACGTATT 3 20 1 AGTCATCGCT ATTACCATGG TGATGCGGTT TTGGCAGTAC ACCAATGGGC 3 25 1 GTGGATAGCG GTTTGACTCA CGGGGATTTC CAAGTCTCCA CCCCATTGAC 3 30 1 GTCAATGGGA GTTTGTTTTG GCACCAAAAT CAACGGGACT TTCCAAAATG 3 35 1 TCGTAACAAC TGCGATCGCC CGCCCCGTTG ACGCAAATGG GCGGTAGGCG 3 40 1 TGTACGGTGG GAGGTCTATA TAAGCAGAGC TCGTTTAGTG AACCGTCAGA TCACTAGGCT AGCTATTGCG GTAGTTTATC ACAGTTAAAT TGCTAACGCA
3 50 1 GTCAGTGCTT CTGACACAAC AGTCTCGAAC TTAAGCTGCA GTGACTCTCT 3 55 1 TAAGGTAGCC TTGCAGAAGT TGGTCGTGAG GCACTGGGCA GGTAAGTATC 3 60 1 AAGGTTACAA GACAGGTTTA AGGAGACCAA TAGAAACTGG GCTTGTCGAG 3 65 1 ACAGAGAAGA CTCTTGCGTT TCTGATAGGC ACCTATTGGT CTTACTGACA 3 70 1 TCCACTTTGC CTTTCTCTCC ACAGGTGTCC ACTCCCAGTT CAATTACAGC 3 75 1 TCTTAAGGCT AGAGTACTTA ATACGACTCA CTATAGAATA CGACTCACTA TAGGGAGACG CTAGCGTCGA CCTTCTGCCA TGGCCCTGTG GATGCGCCTC CTGCCCCTGC TGGCGCTGCT GGCCCTCTGG GGACCTGACC CAGCCGCAGC
3 90 1 CTTTGTGAAC CAACACCTGT GCGGCTCAGA TCTGGTGGAA GCTCTCTACC TAGTGTGCGG GGAACGAGGC TTCTTCTACA CACCCAGGAC CAAGCGGGAG
4 00 1 GCAGAGGACC TGCAGGTGGG GCAGGTGGAG CTGGGCGGGG GCCCTGGTGC AGGCAGCCTG CAGCCCTTGG CCCTGGAGGG GTCGCGACAG AAGCGTGGCA
4 10 1 TTGTGGAACA ATGCTGTACC AGCATCTGCT CCCTCTACCA GCTGGAGAAC TACTGCAACT AGACGCAGCC GTCGACGGTA CCAGCGCTGT CGAGGCCGCT
4 20 1 TCGAGCAGAC ATGATAAGAT ACATTGATGA GTTTGGACAA ACCACAACTA 4 25 1 GAATGCAGTG AAAAAAATGC TTTATTTGTG AAATTTGTGA TGCTATTGCT 4 30 1 TTATTTGTAA CCATTATAAG CTGCAATAAA CAAGTTAACA ACAACAATTG CATTCATTTT ATGTTTCAGG TTCAGGGGGA GATGTGGGAG GTTTTTTAAA
4 40 1 GCAAGTAAAA CCTCTACAAA TGTGGTAAAA TCGATTAGGA TCTTCCTAGA 4 45 1 GCATGGCTAC CTAGACATGG CTCGACAGAT CAGCGCTCAT GCTCTGGAAG 4 50 1 ATCTCGATTT AAATGCGGCC GCAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC 4 55 1 TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG 4 60 1 CCCGACGCCC GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC 4 65 1 AGCTGCCTGC AGGGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG 4 70 1 CGGTATTTCA CACCGCATAC GTCAAAGCAA CCATAGTACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TACGCGCAGC GTGACCGCTA
4 80 1 CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCG CTTTCTT CCCTTCCTTT 4 85 1 CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC 4 90 1 TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG 4 95 1 ATTTGGGTGA TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT 5 00 1 CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA 5 05 1 AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGG CTA TTCTTTT GATTTATAAG 5 10 1 GGATTTTGCC GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA 5 15 1 AAATTTAACG CGAATTTTAA CAAAATATTA ACGTTTACAA TTTTATGGTG 5 20 1 CACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGCCCCGAC ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA
5 30 1 TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC
5 40 1 GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA 5 45 1 GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT G TTTATTTTT 5 50 1 CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA 5 55 1 TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT 5 60 1 GTCGCCCTTA TTC C CTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 56 51 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC
57 01 GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT
575 1 TTTCGCCCCG AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT
58 01 ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC
58 51 GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA
5S 01 GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC
59 51 CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG
60 01 GAGGACCGAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA
60 51 ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA
61 01 CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC
61 51 TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC
62 01 TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC
62 51 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC
63 01 GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA
63 51 GTTATCTACA CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA
64 01 GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC
64 51 AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTA A TTT
65 01 AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC
65 51 TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA
66 01 AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA
66 51 ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT
67 01 ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA
67 51 ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT
68 01 GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC
68 51 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT
69 01 TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG
69 51 CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA
700 1 GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC
70 51 CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG
710 1 GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT
71 51 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA
72 01 ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT
725 1 GCTCACATGT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor RSV: 239-948 bp
hGck: 973-2387 bp
bGH polyA: 2395-2653 bp
promotor CMV: 2698-3815 bp
hIns: 3823-4169 bp
SV40 polyA: 4183-4481 bp
ITR 3': 4523-4663 bp
F: CMV-hIns(rev)-RSV-hGck (SEQ ID N.°: 11)
[0183]
Figure imgf000042_0001
Secuencia de plásmido pAAV-CMV-hlns(rev)-RSV-hGck
[0184]
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG 51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC 101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG 151 ATAAATCGAG ATCTTCCAGA GCATGAGCGC TGATCTGTCG AGCCATGTCT 201 AGGTAGCCAT GCTCTAGGAA GATCCTAATC GATTTTACCA CATTTGTAGA 25 1 GGTTTTACTT GCTTTAAAAA ACCTCCCACA TCTCCCCCTG AACCTGAAAC 3 01 ATAAAATGAA TGCAATTGTT GTTGTTAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT 3 51 GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA AAGCATTTTT 4 01 TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC 4 51 ATGTCTGCTC GAAGCGGCCT CGACAGCGCT GGTACCGTCG ACGGCTGCGT 5 01 CTAGTTGCAG TAGTTCTCCA GCTGGTAGAG GGAGCAGATG CTGGTACAGC 5 51 ATTGTTCCAC AATGCCACGC TTCTGTCGCG ACCCCTCCAG GGCCAAGGGC 6 01 TGCAGGCTGC CTGCACCAGG GCCCCCGCCC AGCTCCACCT GCCCCACCTG 6 51 CAGGTCCTCT GCCTCCCGCT TGGTCCTGGG TGTGTAGAAG AAGCCTCGTT 7 01 CCCCGCACAC TAGGTAGAGA GCTTCCACCA GATCTGAGCC GCACAGGTGT 7 51 TGGTTCACAA AGGCTGCGGC TGGGTCAGGT CCCCAGAGGG CCAGCAGCGC 8 01 CAGCAGGGGC AGGAGGCGCA TCCACAGGGC CATGGCAGAA GGTCGACGCT 8 51 AGCGTCTCCC TATAGTGAGT CGTATTCTAT AGTGAGTCGT ATTAAGTACT 3 01 CTAGCCTTAA GAGCTGTAAT TGAACTGGGA GTGGACACCT GTGGAGAGAA 3 51 AGGCAAAGTG GATGTCAGTA AGACCAATAG GTGCCTATCA GAAACGCAAG 1 0 01 AGTCTTCTCT GTCTCGACAA GCCCAGTTTC TATTGGTCTC CTTAAACCTG 1 0 51 TCTTGTAACC TTGATACTTA CCTGCCCAGT GCCTCACGAC CAACTTCTGC 1 1 01 AAGGCTACCT TAAGAGAGTC ACTGCAGCTT AAGTTCGAGA CTGTTGTGTC 1 1 51 AGAAGCACTG ACTGCGTTAG CAATTTAACT GTGATAAACT ACCGCAATAG 1 2 01 CTAGCCTAGT GATCTGACGG TTCACTAAAC GAGCTCTGCT TATATAGACC 1 2 51 TCCCACCGTA CACGCCTACC GCCCATTTGC GTCAACGGGG CGGGCGATCG 1 3 01 CAGTTGTTAC GACATTTTGG AAAGTCCCGT TGATTTTGGT GCCAAAACAA 1 3 51 ACTCCCATTG ACGTCAATGG GGTGGAGACT TGGAAATCCC CGTGAGTCAA 1 40 1 ACCGCTATCC ACGCCCATTG GTGTACTGCC AAAACCGCAT CACCATGGTA 1 4 51 ATAGCGATGA CTAATACGTA GATGTACTGC CAAGTAGGAA AGTCCCGTAA 1 5 01 GGTCATGTAC TGGGCATAAT GCCAGGCGGG CCATTTACCG TCATTGACGT 1 5 51 CAATAGGGGG CGGACTTGGC ATATGATACA CTTGATGTAC TGCCAAGTGG 1 6 01 GCAGTTTACC GTAAATACTC CACCCATTGA CGTCAATGGA AAGTCCCTAT 1 65 1 TGGCGTTACT ATGGGAACAT ACGTCATTAT TGACGTCAAT GGGCGGGGGT 1 7 01 CGTTGGGCGG TCAGCCAGGC GGGCCATTTA CCGTAAGTTA TGTAACGCGG 1 7 51 AACTCCATAT ATGGGCTATG AACTAATGAC CCCGTAATTG ATTACTATTA ATAACTAGTC AATAATCAAT GCCAACATGG CGGTCATATT GGACATGAGC CAATATAAAT GTACATATTA TGATATAGAT ACAACGTATG CAATGGCCAA
1 9 01 TAGCCAATAT TGATTTATGC TATATAACCA ATGAATAATA TGGCTAATGG CCAATATTGA GATCTGTAGA TAAGTAGCAT GGCGGGTTAA TCATTAACTA
2 00 1 CAGATATCCA TGTTTGACAG CTTATCATCG CAGATCCGTA TGGTGCACTC 2 05 1 TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGTA TCTGCTCCCT 2 10 1 GCTTGTGTGT TGGAGGTCGC TGAGTAGTGC GCGAGCAAAA TTTAAGCTAC 2 15 1 AACAAGGCAA GGCTTGACCG ACAATTGCAT GAAGAATCTG CTTAGGGTTA . 'M GGCGTTTTGC GCTGCTTCGC GATGTACGGG CCAGATATTC GCGTATCTGA GGGGACTAGG GTGTGTTTAG GCGAAAAGCG GGGCTTCGGT TGTACGCGGT
2 30 1 TAGGAGTCCC CTCAGGATAT AGTAGTTTCG CTTTTGCATA GGGAGGGGGA 2 35 1 AATGTAGTCT TATGCAATAC TCTTGTAGTC TTGCAACATG GTAACGATGA 2 40 1 GTTAGCAACA TGCCTTACAA GGAGAGAAAA AGCACCGTGC ATGCCGATTG 2 45 1 GTGGAAGTAA GGTGGTACGA TCGTGCCTTA TTAGGAAGGC AACAGACGGG 2 50 1 TCTGACATGG ATTGGACGAA CCACTAAATT CCGCATTGCA GAGATATTGT ATTTAAGTGC CTAGCTCGAT ACAATAAACG CCATTTGACC ATTCACCACA
2 60 1 TTGGTGTGCA CCTCCAAGCT GGGTACCAGC TTCTAGAGAG ATCTGCTTCA 2 65 1 GCTGGAGGCA CTGGGCAGGT AAGTATCAAG GTTACAAGAC AGGTTTAAGG 2 70 1 AGACCAATAG AAACTGGGCT TGTCGAGACA GAGAAGACTC TTGCGTTTCT 2 75 1 GATAGGCACC TATTGGTCTT ACTGACATCC ACTTTGCCTT TCTCTCCACA GGTGCAGCTG CTGCAGCGGT CTAGAACTCG AGTCGAGACC ATGGCGATGG
2 85 1 ATGTCACAAG GAGCCAGGCC CAGACAGCCT TGACTCTGGT AGAGCAGATC 2 90 1 CTGGCAGAGT TCCAGCTGCA GGAGGAGGAC CTGAAGAAGG TGATGAGACG l GATGCAGAAG GAGATGGACC GCGGCCTGAG GCTGGAGACC CATGAAGAGG 3 00 1 CCAGTGTGAA GATGCTGCCC ACCTACGTGC GCTCCACCCC AGAAGGCTCA 3 05 1 GAAGTCGGGG ACTTCCTCTC CCTGGACCTG GGTGGCACTA ACTTCAGGGT 3 10 1 GATGCTGGTG AAGGTGGGAG AAGGTGAGGA GGGGCAGTGG AGCGTGAAGA 3 15 1 CCAAACACCA GATGTACTCC ATCCCCGAGG ACGCCATGAC CGGCACTGCT 3 20 1 GAGATGCTCT TCGACTACAT CTCTGAGTGC ATCTCCGACT TCCTGGACAA ! GCATCAGATG AAACACAAGA AGCTGCCCCT GGGCTTCACC TTCTCCTTTC 3 30 1 CTGTGAGGCA CGAAGACATC GATAAGGGCA TCCTTCTCAA CTGGACCAAG GGCTTCAAGG CCTCAGGAGC AGAAGGGAAC AATGTCGTGG GGCTTCTGCG
3 40 1 AGACGCTATC AAACGGAGAG GGGACTTTGA AATGGATGTG GTGGCAATGG 3 45 1 TGAATGACAC GGTGGCCACG ATGATCTCCT GC TAC TAC GA AGACCATCAG 3 50 1 TGCGAGGTCG GCATGATCGT GGGCACGGGC TGCAATGCCT GC TACATGGA 3 55 1 GGAGATGCAG AATGTGGAGC TGGTGGAGGG GGACGAGGGC CGCATGTGCG 3 60 1 TCAATACCGA GTGGGGCGCC TTCGGGGACT CCGGCGAGCT GGACGAGTTC 3 65 1 CTGCTGGAGT ATGACCGCCT GGTGGACGAG AGCTCTGCAA ACCCCGGTCA 3 70 1 GCAGCTGTAT GAGAAGCTCA TAGGTGGCAA GTACATGGGC GAGCTGGTGC 3 75 1 GGCTTGTGCT GCTCAGGCTC GTGGACGAAA ACCTGCTCTT CCACGGGGAG GCCTCCGAGC AGCTGCGCAC ACGCGGAGCC TTCGAGACGC GCTTCGTGTC GCAGGTGGAG AGCGACACGG GCGACCGCAA GCAGATCTAC AACATCCTGA
3 90 1 GCACGCTGGG GCTGCGACCC TCGACCACCG ACTGCGACAT CGTGCGCCGC 3 95 1 GCCTGCGAGA GCGTGTCTAC GCGCGCTGCG CACATGTGCT CGGCGGGGCT 4 00 1 GGCGGGCGTC ATCAACCGCA TGCGCGAGAG CCGCAGCGAG GACGTAATGC 4 05 1 GCATCACTGT GGGCGTGGAT GGCTCCGTGT ACAAGCTGCA CCCCAGCTTC 4 10 1 AAGGAGCGGT TCCATGCCAG CGTGCGCAGG CTGACGCCCA GCTGCGAGAT 4 15 1 CACCTTCATC GAGTCGGAGG AGGGCAGTGG CCGGGGCGCG GCCCTGGTCT 4 20 1 CGGCGGTGGC CTGTAAGAAG GCCTGTATGC TGGGCCAGTG ACTCGAGCAC 4 25 1 GTGGAGCTCG CTGATCAGCC TCGACTGTGC CTTCTAGTTG CCAGCCATCT 4 30 1 GTTGTTTGCC CCTCCCCCGT GCCTTCCTTG ACCCTGGAAG GTGCCACTCC 4 35 1 CACTGTCCTT TCCTAATAAA ATGAGGAAAT TGCATCGCAT TGTCTGAGTA 4 40 1 GGTGTCATTC TATTCTGGGG GGTGGGGTGG GGCAGGACAG CAAGGGGGAG 4 45 1 GATTGGGAAG ACAATAGCAG GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGGC 4 50 1 CACGTGATTT AAATGCGGCC GCAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC 4 55 1 TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG 4 60 1 CCCGACGCCC GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC 4 65 1 AGCTGCCTGC AGGGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCT CCTTA CGCATCTGTG 4 70 1 CGGTATTTCA CACCGCATAC GTCAAAGCAA CCATAGTACG CGCCCTGTAG 4 75 1 CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TAC GC GCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCG CTTTCTT CCCTTCCTTT CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC
4 90 1 TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG 4 95 1 ATTTGGGTGA TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGG C TA TTCT TTT GATTTATAAG
5 10 1 GGATTTTGCC GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA 5 í M AAATTTAACG CGAATTTTAA CAAAATATTA ACGTTTACAA TTTTATGGTG 5 20 1 CACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGCCCCGAC 5 25 1 ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA 5 30 1 TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG 5 35 1 GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC 5 40 1 GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT
5 50 1 CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA 5 55 1 TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT 5 60 1 GTCGCCCTTA TTCC CTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 5 65 1 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC 5 70 1 GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT ’ , I TTTCGCCCCG AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC
5 85 1 GC C GC ATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA 5 90 1 GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG
6 00 1 GAGGACCGAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA
6 10 1 CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC 6 15 1 TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC 6 20 1 TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC 6 25 1 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC 6 30 1 GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA 6351 GTTATCTACA CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA 6401 GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC
6451 AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT
6501 AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC
6551 TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA
6601 AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA
6651 ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT
6701 ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA
6751 ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT
6801 GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC
6851 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT
6901 TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG
6951 CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA
7 001 GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC
7 051 CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG
7 101 GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT
7 151 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA
7 201 ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT
7 251 GCTCACATGT
ITR 5': 1-141 bp
SV40 poIyA: 182-480 bp
hIns: 494-840 bp
Promotor CMV: 4248-1965 bp
Promotor RSV: 2092-2801 bp
hGck: 2826-4240 bp
bGH polyA: 4248-4506 bp
ITR 3': 4523-4663 bp
Constructo de referencia G: RSV-hGck-CMV-hlns(rev) (SEQ ID N.°:12)
Figure imgf000046_0001
[0186]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
151 ATATCCATGT TTGACAGCTT ATCATCGCAG ATCCGTATGG TGCACTCTCA
201 GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT GCTCCCTGCT
251 TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT AAGCTACAAC
301 AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGC
351 GTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCA GATATTCGCG TATCTGAGGG
401 GACTAGGGTG TGTTTAGGCG AAAAGCGGGG CTTCGGTTGT ACGCGGTTAG
451 GAGTCCCCTC AGGATATAGT AGTTTCGCTT TTGCATAGGG AGGGGGAAAT
501 GTAGTCTTAT GCAATACTCT TGTAGTCTTG CAACATGGTA ACGATGAGTT
551 AGCAACATGC CTTACAAGGA GAGAAAAAGC ACCGTGCATG CCGATTGGTG
601 GAAGTAAGGT GGTACGATCG TGCCTTATTA GGAAGGCAAC AGACGGGTCT
651 GACATGGATT GGACGAACCA CTAAATTCCG CATTGCAGAG ATATTGTATT
70 1 TAAGTGCCTA GCTCGATACA ATAAACGCCA TTTGACCATT CACCACATTG 75 1 GTGTGCACCT CCAAGCTGGG TACCAGCTTC TAGAGAGATC TGCTTCAGCT 80 1 GGAGGCACTG GGCAGGTAAG TATCAAGGTT ACAAGACAGG TTTAAGGAGA 85 1 CCAATAGAAA CTGGGCTTGT CGAGACAGAG AAGACTCTTG CGTTTCTGAT 9 01 AGGCACCTAT TGGTCTTACT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT 9 51 GCAGCTGCTG CAGCGGTCTA GAACTCGAGT CGAGACCATG GCGATGGATG 1 00 1 TCACAAGGAG CCAGGCCCAG ACAGCCTTGA CTCTGGTAGA GCAGATCCTG 1 05 1 GCAGAGTTCC AGCTGCAGGA GGAGGACCTG AAGAAGGTGA TGAGACGGAT 1 10 1 GCAGAAGGAG ATGGACCGCG GCCTGAGGCT GGAGACCCAT GAAGAGGCCA 1 15 1 GTGTGAAGAT GCTGCCCACC TACGTGCGCT CCACCCCAGA AGGCTCAGAA 1 20 1 GTCGGGGACT TCCTCTCCCT GGACCTGGGT GGCACTAACT TCAGGGTGAT 1 25 1 GCTGGTGAAG GTGGGAGAAG GTGAGGAGGG GCAGTGGAGC GTGAAGACCA 1 30 1 AACACCAGAT GTACTCCATC CCCGAGGACG CCATGACCGG CACTGCTGAG ATGCTCTTCG ACTACATCTC TGAGTGCATC TCCGACTTCC TGGACAAGCA
1 40 1 TCAGATGAAA CACAAGAAGC TGCCCCTGGG CTTCACCTTC TCCTTTCCTG í ' i ' . í TGAGGCACGA AGACATCGAT AAGGGCATCC TTCTCAACTG GACCAAGGGC 1 50 1 TTCAAGGCCT CAGGAGCAGA AGGGAACAAT GTCGTGGGGC TTCTGCGAGA 1 55 1 CGCTATCAAA CGGAGAGGGG ACTTTGAAAT GGATGTGGTG GCAATGGTGA 1 60 1 ATGACACGGT GGCCACGATG ATCTCCTGCT ACTACGAAGA CCATCAGTGC 1 65 1 GAGGTCGGCA TGATCGTGGG CACGGGCTGC AATGCCTGCT ACATGGAGGA 1 70 1 GATGCAGAAT GTGGAGCTGG TGGAGGGGGA CGAGGGCCGC ATGTGCGTCA 1 75 1 ATACCGAGTG GGGCGCCTTC GGGGACTCCG GCGAGCTGGA CGAGTTCCTG 1 80 1 CTGGAGTATG ACCGCCTGGT GGACGAGAGC TCTGCAAACC CCGGTCAGCA GCTGTATGAG AAGCTCATAG GTGGCAAGTA CATGGGCGAG CTGGTGCGGC
1 90 1 TTGTGCTGCT CAGGCTCGTG GACGAAAACC TGCTCTTCCA CGGGGAGGCC 1 95 1 TCCGAGCAGC TGCGCACACG CGGAGCCTTC GAGACGCGCT TCGTGTCGCA 2 00 1 GGTGGAGAGC GACACGGGCG ACCGCAAGCA GATCTACAAC ATCCTGAGCA CGCTGGGGCT GCGACCCTCG ACCACCGACT GCGACATCGT GCGCCGCGCC
2 10 1 TGCGAGAGCG TGTCTACGCG CGCTGCGCAC ATGTGCTCGG CGGGGCTGGC 2 15 1 GGGCGTCATC AACCGCATGC GCGAGAGCCG CAGCGAGGAC GTAATGCGCA 2 20 1 TCACTGTGGG CGTGGATGGC TCCGTGTACA AGCTGCACCC CAGCTTCAAG 2 25 1 GAGCGGTTCC ATGCCAGCGT GCGCAGGCTG ACGCCCAGCT GCGAGATCAC 2 30 1 CTTCATCGAG TCGGAGGAGG GCAGTGGCCG GGGCGCGGCC CTGGTCTCGG 2 35 1 CGGTGGCCTG TAAGAAGGCC TGTATGCTGG GCCAGTGACT CGAGCACGTG 2 40 1 GAGCTCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 2 45 1 GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC 2 50 1 TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT
2 60 1 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCCAC 2 65 1 GTGATTTAAA TCGAGATCTT CCAGAGCATG AGCGCTGATC TGTCGAGCCA 2 70 1 TGTCTAGGTA GCCATGCTCT AGGAAGATCC TAATCGATTT TACCACATTT 2 75 1 GTAGAGGTTT TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACATCTCC CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAA TTGTTGTTGT TAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA
2 90 1 TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC 2 95 1 TTATCATGTC TGCTCGAAGC GGCCTCGACA GCGCTGGTAC CGTCGACGGC 3 00 1 TGCGTCTAGT TGCAGTAGTT CTCCAGCTGG TAGAGGGAGC AGATGCTGGT ACAGCATTGT TCCACAATGC CACGCTTCTG TCGCGACCCC TCCAGGGCCA
3 10 1 AGGGCTGCAG GCTGCCTGCA CCAGGGCCCC CGCCCAGCTC CACCTGCCCC 3 15 1 ACCTGCAGGT CCTCTGCCTC CCGCTTGGTC CTGGGTGTGT AGAAGAAGCC 3 20 1 TCGTTCCCCG CACACTAGGT AGAGAGCTTC CACCAGATCT GAGCCGCACA 3 25 1 GGTGTTGGTT CACAAAGGCT GCGGCTGGGT CAGGTCCCCA GAGGGCCAGC 3 30 1 AGCGCCAGCA GGGGCAGGAG GCGCATCCAC AGGGCCATGG CAGAAGGTCG 3 35 1 AC GC TAGCGT CTCCCTATAG TGAGTCGTAT TCTATAGTGA GTCGTATTAA 3 40 1 GTACTCTAGC CTTAAGAGCT GTAATTGAAC TGGGAGTGGA CACCTGTGGA 3 45 1 GAGAAAGGCA AAGTGGATGT CAGTAAGACC AATAGGTGCC TATCAGAAAC 3 50 1 GCAAGAGTCT TCTCTGTCTC GACAAGCCCA GTTTCTATTG GTCTCCTTAA 3 55 1 ACCTGTCTTG TAACCTTGAT ACTTACCTGC CCAGTGCCTC ACGACCAACT 3 60 1 TCTGCAAGGC TACCTTAAGA GAGTCACTGC AGCTTAAGTT CGAGACTGTT 3 65 1 GTGTCAGAAG CACTGACTGC GTTAGCAATT TAACTGTGAT AAACTACCGC 3 70 1 AATAGCTAGC CTAGTGATCT GACGGTTCAC TAAACGAGCT CTGCTTATAT 3 75 1 AGACCTCCCA CCGTACACGC CTACCGCCCA TTTGCGTCAA CGGGGCGGGC 3 30 1 GATCGCAGTT GTTACGACAT TTTGGAAAGT CCCGTTGATT TTGGTGCCAA AACAAACTCC CATTGACGTC AATGGGGTGG AGACTTGGAA ATCCCCGTGA
3 90 1 GTCAAACCGC TATCCACGCC CATTGGTGTA CTGCCAAAAC CGCATCACCA TGGTAATAGC GATGACTAAT ACGTAGATGT ACTGCCAAGT AGGAAAGTCC
4 00 1 CGTAAGGTCA TGTACTGGGC ATAATGCCAG GCGGGCCATT TACCGTCATT 4 05 1 GACGTCAATA GGGGGCGGAC TTGGCATATG ATACACTTGA TGTACTGCCA 4 10 1 AGTGGGCAGT TTACCGTAAA TACTCCACCC ATTGACGTCA ATGGAAAGTC CCTATTGGCG TTACTATGGG AACATACGTC ATTATTGACG TCAATGGGCG
4 20 1 GGGGTCGTTG GGCGGTCAGC CAGGCGGGCC ATTTACCGTA AGTTATGTAA 4 25 1 CGCGGAACTC CATATATGGG CTATGAACTA ATGACCCCGT AATTGATTAC 4 30 1 TATTAATAAC TAGTCAATAA TCAATGCCAA CATGGCGGTC ATATTGGACA 4 35 1 TGAGCCAATA TAAATGTACA TATTATGATA TAGATACAAC GTATGCAATG 4 40 1 GCCAATAGCC AATATTGATT TATGCTATAT AACCAATGAA TAATATGGCT 4 45 1 AATGGCCAAT ATTGAGATCT GTAGATAAGT AGCATGGCGG GTTAATCATT 4 50 1 AACTACAGAT AAATGCGGCC GCAGGAACCC CTAGTGATGG AGTTGGCCAC 4 55 1 TCCCTCTCTG CGCGCTCGCT CGCTCACTGA GGCCGGGCGA CCAAAGGTCG 4 60 1 CCCGACGCCC GGGCTTTGCC CGGGCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC 4 65 1 AGCTGCCTGC AGGGGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA CGCATCTGTG 4 70 1 CGGTATTTCA CACCGCATAC GTCAAAGCAA CCATAGTACG CGCCCTGTAG CGGCGCATTA AGCGCGGCGG GTGTGGTGGT TACGCGCAGC GTGACCGCTA CACTTGCCAG CGCCCTAGCG CCCGCTCCTT TCGCTTTCTT CCCTTCCTTT
4 85 1 CTCGCCACGT TCGCCGGCTT TCCCCGTCAA GCTCTAAATC GGGGGCTCCC 4 90 1 TTTAGGGTTC CGATTTAGTG CTTTACGGCA CCTCGACCCC AAAAAACTTG 4 95 1 ATTTGGGTGA TGGTTCACGT AGTGGGCCAT CGCCCTGATA GACGGTTTTT CGCCCTTTGA CGTTGGAGTC CACGTTCTTT AATAGTGGAC TCTTGTTCCA AACTGGAACA ACACTCAACC CTATCTCGGG CTA TTCTTTT GATTTATAAG
5 10 1 GGATTTTGCC GATTTCGGCC TATTGGTTAA AAAATGAGCT GATTTAACAA 5 15 1 AAATTTAACG CGAATTTTAA CAAAATATTA ACGTTTACAA TTTTATGGTG 5 20 1 CACTCTCAGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGCCCCGAC 5 25 1 ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA 5 30 1 TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG 5 35 1 GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG ACGAAAGGGC CTCGTGATAC 5 40 1 GCCTATTTTT ATAGGTTAAT GTCATGATAA TAATGGTTTC TTAGACGTCA 5 45 1 GGTGGCACTT TTCGGGGAAA TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT 5 50 1 CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA ACATTTCCGT
5 60 1 GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA 5 65 1 CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC 5 70 1 GAGTGGGTTA CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT 5 75 1 TTTCGCCCCG AAGAACGTTT TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC CGGGCAAGAG CAACTCGGTC
1 * , í GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC ACCAGTCACA 5 90 1 GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC 5 95 1 CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG 6 00 1 GAGGACCGAA GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA
€ 101 CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT GGCAACAACG TTGCGCAAAC 6 15 1 TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA ATTAATAGAC € 201 TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC € 251 GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC 6 30 1 GCGGTATCAT TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA
6 40 1 GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA GCATTGGTAA CTGTCAGACC 6 45 1 AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA TTTTTAATTT 6 50 1 AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA
6 60 1 AAGGATCTTC TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT CAAGAACTCT 68 01 GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC 68 51 TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT 69 01 TACCGGATAA GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG 69 51 CCCAGCTTGG AGCGAACGAC CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA 700 1 GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG GAGAAAGGCG GACAGGTATC 70 51 CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA GCTTCCAGGG 71 01 GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT 71 51 TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA 72 01 ACGCCAGCAA CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT 72 51 GCTCACATGT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor RSV: 239-948 bp
hGck: 973-2387 bp
bGH polyA: 2395-2653 bp
SV40 polya: 2687-2985 bp
hIns: 2999-3345 bp
Promotor CMV: 3353-4470 bp
ITR 3': 4523-4663 bp
Constructo de referencia H: CMV-hIns (SEQ ID N.°:19)
Figure imgf000049_0001
[0188]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
151 ATATCTGTAG TTAATGATTA ACCCGCCATG CTACTTATCT ACAGATCTCA
201 ATATTGGCCA TTAGCCATAT TATTCATTGG TTATATAGCA TAAATCAATA
251 TTGGCTATTG GCCATTGCAT ACGTTGTATC TATATCATAA TATGTACATT
301 TATATTGGCT CATGTCCAAT ATGACCGCCA TGTTGGCATT GATTATTGAC
351 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA
401 TGGAGTTCCG CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG
451 CCCAACGACC CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT
501 AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAG TATTTACGGT
551 AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC AAGTCCGCCC
601 CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA
651 CATGACCTTA CGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA
701 TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACACCAA TGGGCGTGGA
751 TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA
801 TGGGAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA
851 ACAACTGCGA TCGCCCGCCC CGTTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTAC
901 GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCGTT TAGTGAACCG TCAGATCACT
951 AGGCTAGCTA TTGCGGTAGT TTATCACAGT TAAATTGCTA ACGCAGTCAG
1 001 TGCTTCTGAC ACAACAGTCT CGAACTTAAG CTGCAGTGAC TCTCTTAAGG 1 051 TAGCCTTGCA GAAGTTGGTC GTGAGGCACT GGGCAGGTAA GTATCAAGGT 110.1 TACAAGACAG GTTTAAGGAG ACCAATAGAA ACTGGGCTTG TCGAGACAGA 1 15 1 GAAGACTCTT GCGTTTCTGA TAGGCACCTA TTGGTCTTAC TGACATCCAC 1 20 1 TTTGCCTTTC TCTCCACAGG TGTCCACTCC CAGTTCAATT ACAGCTCTTA 1 25 1 AGGCTAGAGT ACTTAATACG ACTCACTATA GAATACGACT CACTATAGGG 1 30 1 AGACGCTAGC GTCGACCTTC TGCCATGGCC CTGTGGATGC GCCTCCTGCC 1 35 1 CCTGCTGGCG CTGCTGGCCC TCTGGGGACC TGACCCAGCC GCAGCCTTTG 1 40 1 TGAACCAACA CCTGTGCGGC TCAGATCTGG TGGAAGCTCT CTACCTAGTG 1 45 1 TGCGGGGAAC GAGGCTTCTT CTACACACCC AGGACCAAGC GGGAGGCAGA 1 50 1 GGACCTGCAG GTGGGGCAGG TGGAGCTGGG CGGGGGCCCT GGTGCAGGCA 1 55 1 GCCTGCAGCC CTTGGCCCTG GAGGGGTCGC GACAGAAGCG TGGCATTGTG 1 60 1 GAACAATGCT GTACCAGCAT CTGCTCCCTC TACCAGCTGG AGAACTACTG 1 65 1 CAACTAGACG CAGCCGTCGA CGGTACCAGC GCTGTCGAGG CCGCTTCGAG 1 70 1 CAGACATGAT AAGATACATT GATGAGTTTG GACAAACCAC AACTAGAATG 1 75 1 CAGTGAAAAA AATGCTTTAT TTGTGAAATT TGTGATGCTA TTGCTTTATT 1 80 1 TGTAACCATT ATAAGCTGCA ATAAACAAGT TAACAACAAC AATTGCATTC ATTTTATGTT TCAGGTTCAG GGGGAGATGT GGGAGGTTTT TTAAAGCAAG
1 90 1 TAAAACCTCT ACAAATGTGG TAAAATCGAT TAGGATCTTC CTAGAGCATG 1 95 1 GCTACCTAGA CATGGCTCGA CAGATCAGCG CTCATGCTCT GGAAGATCTC 2 00 1 GATTTAAATG CGGCCGCAGG AACCCCTAGT GATGGAGTTG GCCACTCCCT CTCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG GGCGACCAAA GGTCGCCCGA
2 10 1 CGCCCGGGCT TTGCCCGGGC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG CGCGCAGCTG 2 15 1 CCTGCAGGGG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT CTGTGCGGTA 2 20 1 TTTCACACCG CATACGTCAA AGCAACCATA GTACGCGCCC TGTAGCGGCG 2 25 1 CATTAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC CGCTACACTT 2 30 1 GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT CCTTTCTCGC 2 35 1 CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGG CTCCCTTTAG 2 40 1 GGTTCCGATT TAGTGCTTTA CGGCACCTCG ACCCCAAAAA ACTTGATTTG 2 45 1 GGTGATGGTT CACGTAGTGG GCCATCGCCC TGATAGACGG TTTTTCGCCC 2 50 1 TTTGACGTTG GAGTCCACGT TCTTTAATAG TGGACTCTTG TTCCAAACTG 2 55 1 GAACAACACT CAACCCTATC TCGGGCTATT CTTTTGATTT ATAAGGGATT TTGCCGATTT CGGCCTATTG GTTAAAAAAT GAGCTGATTT AACAAAAATT
2 65 1 TAACGCGAAT TTTAACAAAA TATTAACGTT TACAATTTTA TGGTGCACTC 2 70 1 TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGCC CCGACACCCG 2 75 1 CCAACACCCG CTGACGCGCC CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC 2 80 1 TTACAGACAA GCTGTGACCG TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT 2 85 1 CACCGTCATC ACCGAAACGC GCGAGACGAA AGGGCCTCGT GATACGCCTA 2 90 1 TTTTTATAGG TTAATGTCAT GATAATAATG GTTTCTTAGA CGTCAGGTGG CACTTTTCGG GGAAATGTGC GCGGAACCCC TATTTGTTTA TTTTTCTAAA
3 00 1 TACATTCAAA TATGTATCCG CTCATGAGAC AATAACCCTG ATAAATGCTT 30 51 CAATAATATT GAAAAAGGAA GAGTATGAGT ATTCAACATT TCCGTGTCGC 3 10 1 CCTTATTCCC TTTTTTGCGG CATTTTGCCT TCCTG TTTTT GCTCACCCAG 3 15 1 AAACGCTGGT GAAAGTAAAA GATGCTGAAG ATCAGTTGGG TGCACGAGTG 3 20 1 GGTTACATCG AACTGGATCT CAACAGCGGT AAGATCCTTG AGAGTTTTCG CCCCGAAGAA CGTTTTCCAA TGATGAGCAC TTTTAAAGTT CTGCTATGTG
3 30 1 GCGCGGTATT ATCCCGTATT GACGCCGGGC AAGAGCAACT CGGTCGCCGC 3 35 1 ATACACTATT CTCAGAATGA CTTGGTTGAG TACTCACCAG TCACAGAAAA 3 40 1 GCATCTTACG GATGGCATGA CAGTAAGAGA ATTATGCAGT GCTGCCATAA CCATGAGTGA TAACACTGCG GCCAACTTAC TTCTGACAAC GATCGGAGGA
3 50 1 CCGAAGGAGC TAACCGCTTT TTTGCACAAC ATGGGGGATC ATGTAACTCG 3 55 1 CCTTGATCGT TGGGAACCGG AGCTGAATGA AGCCATACCA AACGACGAGC 3 60 1 GTGACACCAC GATGCCTGTA GCAATGGCAA CAACGTTGCG CAAACTATTA 3 65 1 ACTGGCGAAC TACTTACTCT AGCTTCCCGG CAACAATTAA TAGACTGGAT 3 70 1 GGAGGCGGAT AAAGTTGCAG GACCACTTCT GCGCTCGGCC CTTCCGGCTG 3 75 1 GCTGGTTTAT TGCTGATAAA TCTGGAGCCG GTGAGCGTGG GTCTCGCGGT ATCATTGCAG CACTGGGGCC AGATGGTAAG CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT
3 85 1 C TAC AC GAC G GGGAGTCAGG C AAC TATGGA TGAACGAAAT AGACAGATCG 3 90 1 CTGAGATAGG TGCCTCACTG ATTAAGCATT GGTAACTGTC AGACCAAGTT 3 95 1 TACTCATATA TACTTTAGAT TGATTTAAAA CTTCATTTTT AATTTAAAAG 4 00 1 GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA ATCCCTTAAC 4 05 1 GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA 4 10 1 TCTTCTTGAG A TCCTTTTTT TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA 4 15 1 AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGCTACCAA 420 1 CTCTTTTTCC GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT 425 1 GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC 430 1 ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG GCTGCTGCCA 435 1 GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG 440 1 GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG 445 1 CTTGGAGCGA ACGACOTACA CCGAACTGAG ATACCTACAG CGTGAGCTAT 450 1 GAGAAAGCGC CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA 455 1 AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA 460 1 CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC TGACTTGAGC 465 1 GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC 470 1 AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGCC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA 475 1 CATGT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor CMV: 193-1310 bp
hIns: 1318-1664 bp
SV40 polyA: 1678-1976 bp
ITR 3': 2018-2158 bp
Constructo de referencia I: RSV-hGck (SEQ ID N.°:20)
[0189]
Figure imgf000051_0001
Secuencia de plásmido pAAV-RSV-hGck
[0190]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GC GAGC GAGC
101 GC GCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
151 ATATCCATGT TTGACAGCTT ATCATCGCAG ATCCGTATGG TGCACTCTCA
201 GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT GCTCCCTGCT
O K I.Áv> TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT AAGCTACAAC
301 AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGC
351 GTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCA GATATTCGCG TATCTGAGGG
401 GACTAGGGTG TGTTTAGGCG AAAAGCGGGG CTTCGGTTGT ACGCGGTTAG
451 GAGTCCCCTC AGGATATAGT AGTTTCGCTT TTGCATAGGG AGGGGGAAAT
501 GTAGTCTTAT GCAATACTCT TGTAGTCTTG CAACATGGTA ACGATGAGTT
C C 1 AGCAACATGC CTTACAAGGA GAGAAAAAGC ACCGTGCATG CCGATTGGTG
601 GAAGTAAGGT GGTACGATCG TGCCTTATTA GGAAGGCAAC AGACGGGTCT
651 GACATGGATT GGACGAACCA CTAAATTCCG CATTGCAGAG ATATTG TATT
701 TAAGTGCCTA GCTCGATACA ATAAACGCCA TTTGACCATT CACCACATTG
751 GTGTGCACCT CCAAGCTGGG TACCAGCTTC TAGAGAGATC TGCTTCAGCT
801 GGAGGCACTG GGCAGGTAAG TATCAAGGTT ACAAGACAGG TTTAAGGAGA
851 C CAATAGAAA CTGGGCTTGT CGAGACAGAG AAGACTCTTG CGTTTCTGAT
901 AGGCACCTAT TGGTCTTACT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT
951 GCAGCTGCTG CAGCGGTCTA GAACTCGAGT CGAGACCATG GCGATGGATG
1 001 TCACAAGGAG CCAGGCCCAG ACAGCCTTGA CTCTGGTAGA GCAGATCCTG 1 051 GCAGAGTTCC AGCTGCAGGA GGAGGACCTG AAGAAGGTGA TGAGACGGAT 1 10 1 GCAGAAGGAG ATGGACCGCG GCCTGAGGCT GGAGACCCAT GAAGAGGCCA 1 15 1 GTGTGAAGAT GCTGCCCACC TACGTGCGCT CCACCCCAGA AGGCTCAGAA 1 20 1 GTCGGGGACT TCCTCTCCCT GGACCTGGGT GGCACTAACT TCAGGGTGAT 1 25 1 GCTGGTGAAG GTGGGAGAAG GTGAGGAGGG GCAGTGGAGC GTGAAGACCA 1 30 1 AACACCAGAT GTACTCCATC CCCGAGGACG CCATGACCGG CACTGCTGAG 1 35 1 ATGCTCTTCG ACTACATCTC TGAGTGCATC TCCGACTTCC TGGACAAGCA 1 40 1 TCAGATGAAA CACAAGAAGC TGCCCCTGGG CTTCACCTTC TCCTTTCCTG 1 45 1 TGAGGCACGA AGACATCGAT AAGGGCATCC TTCTCAACTG GACCAAGGGC 1 50 1 TTCAAGGCCT CAGGAGCAGA AGGGAACAAT GTCGTGGGGC TTCTGCGAGA 1 55 1 CGCTATCAAA CGGAGAGGGG ACTTTGAAAT GGATGTGGTG GCAATGGTGA 1 60 1 ATGACACGGT GGCCACGATG ATCTCCTGCT ACTACGAAGA CCATCAGTGC 1651 , GAGGTCGGCA TGATCGTGGG CACGGGCTGC AATGCCTGCT ACATGGAGGA 1 70 1 GATGCAGAAT GTGGAGCTGG TGGAGGGGGA CGAGGGCCGC ATGTGCGTCA 1 75 1 ATACCGAGTG GGGCGCCTTC GGGGACTCCG GCGAGCTGGA CGAGTTCCTG CTGGAGTATG ACCGCCTGGT GGACGAGAGC TCTGCAAACC CCGGTCAGCA
1 85 1 GCTGTATGAG AAGCTCATAG GTGGCAAGTA CATGGGCGAG CTGGTGCGGC 1 90 1 TTGTGCTGCT CAGGCTCGTG GACGAAAACC TGCTCTTCCA CGGGGAGGCC TCCGAGCAGC TGCGCACACG CGGAGCCTTC GAGACGCGCT TCGTGTCGCA GGTGGAGAGC GACACGGGCG ACCGCAAGCA GATCTACAAC ATCCTGAGCA CGCTGGGGCT GCGACCCTCG ACCACCGACT GCGACATCGT GCGCCGCGCC
2 10 1 TGCGAGAGCG TGTCTACGCG CGCTGCGCAC ATGTGCTCGG CGGGGCTGGC 2 15 1 GGGCGTCATC AACCGCATGC GCGAGAGCCG CAGCGAGGAC GTAATGCGCA TCACTGTGGG CGTGGATGGC TCCGTGTACA AGCTGCACCC CAGCTTCAAG GAGCGGTTCC ATGCCAGCGT GCGCAGGCTG ACGCCCAGCT GCGAGATCAC
2 30 1 CTTCATCGAG TCGGAGGAGG GCAGTGGCCG GGGCGCGGCC CTGGTCTCGG 2 35 1 CGGTGGCCTG TAAGAAGGCC TGTATGCTGG GCCAGTGACT CGAGCACGTG 2 40 1 GAGCTCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 2 45 1 GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC 2 50 1 TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT - ■ u GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT 2 60 1 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCCAC GTGATTTAAA TGCGGCCGCA GGAACCCCTA GTGATGGAGT TGGCCACTCC
2 70 1 CTCTCTGCGC GCTCGCTCGC TCACTGAGGC CGGGCGACCA AAGGTCGCCC 2 75 1 GACGCCCGGG CTTTGCCCGG GCGGCCTCAG TGAGCGAGCG AGCGCGCAGC 2 80 1 TGCCTGCAGG GGCGCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATACGTC AAAGCAACCA TAGTACGCGC CCTGTAGCGG
2 90 1 CGCATTAAGC GCGGCGGGTG TGGTGGTTAC GCGCAGCGTG ACCGCTACAC TTGCCAGCGC CCTAGCGCCC GCTCCTTTCG CTTTCTTCCC TTCCTTTCTC
3 00 1 GCCACGTTCG CCGGCTTTCC CCGTCAAGCT CTAAATCGGG GGCTCCCTTT AGGGTTCCGA TTTAGTGCTT TACGGCACCT CGACCCCAAA AAACTTGATT
3 10 1 TGGGTGATGG TTCACGTAGT GGGCCATCGC CCTGATAGAC GGTTTTTCGC 3 15 1 CCTTTGACGT TGGAGTCCAC GTTCTTTAAT AGTGGACTCT TGTTCCAAAC TGGAACAACA CTCAACCCTA TCTCGGGCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA TTTTGCCGAT TTCGGCCTAT TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA
3 30 1 TTTAACGCGA ATTTTAACAA AATATTAACG TTTACAATTT TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG CCCCGACACC
3 40 1 CGCCAACACC CGCTGACGCG CCCTGACGGG CTTGTCTGCT CCCGGCATCC GCTTACAGAC AAGCTGTGAC CGTCTCCGGG AGCTGCATGT GTCAGAGGTT
3 50 1 TTCACCGTCA TCACCGAAAC GCGCGAGACG AAAGGGCCTC GTGATACGCC TATTTTTATA GGTTAATGTC ATGATAATAA TGGTTTCTTA GACGTCAGGT
3 60 1 GGCACTTTTC GGGGAAATGT GCGCGGAACC CCTATTTGTT TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC
3 70 1 TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA GTATTCAACA TTTCCGTGTC 3 75 1 GCCCTTATTC CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT
3 90 1 CGCCCCGAAG AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTA TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC
4 00 1 GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG AGTACTCACC AGTCACAGAA 4 05 1 AAGCATCTTA CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA GTGCTGCCAT 4 10 1 AACCATGAGT GATAACACTG CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG 41 51 GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT
42 01 CGCCTTGATC GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA
42 51 GCGTGACACC ACGATGCCTG TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT
43 01 TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC GGCAACAATT AATAGACTGG
43 51 ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG CCCTTCCGGC
44 01 TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG
4 451 GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT
45 01 ATCTACACGA CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT
45 51 CGCTGAGATA GGTGCCTCAC TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG
46 01 TTTACTCATA TATACTTTAG ATTG ATTTAA AACTTCATTT TTAATTTAAA
46 51 AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA
4 701 ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG
47 51 GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA
48 01 AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC
48 51 AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA
49 01 CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA GAACTCTGTA
49 51 GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC
50 01 CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC
505 1 CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC
51 01 AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCT
51 51 ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG
52 01 TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA
52 51 AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA
53 01 GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG
53 51 CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT
54 01 CACATGT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor RSV: 239-948 bp
hGck: 973-2387 bp
bGH polyA: 2395-2653 bp
ITR 3': 2670-2810 bp
Constructo de referencia J: miniCMV-hIns-l -hGck (SEQ ID N.°:13)
[0191]
Figure imgf000053_0001
Secuencia de plásmido pAAV-miniCMV-hIns-RSV-hGck
[0192]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
151 ATATCTATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC
201 CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC
251 AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG
301 CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG
351 TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC
401 GGGACTTTCC AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC
4 51 GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC 50 1 TAGAGAACCC ACTGCTTAAC TGGCTTATCG AAATTAATAC GACTCACTAT 55 1 AGGGAGACCC AAGCTTGCTA GCGTCGACCT TCTGCCATGG CCCTGTGGAT 6 01 GCGCCTCCTG CCCCTGCTGG CGCTGCTGGC CCTCTGGGGA CCTGACCCAG 6 51 CCGCAGCCTT TGTGAACCAA CACCTGTGCG GCTCAGATCT GGTGGAAGCT 70 1 CTCTACCTAG TGTGCGGGGA ACGAGGCTTC TTCTACACAC CCAGGACCAA 75 1 GCGGGAGGCA GAGGACCTGC AGGTGGGGCA GGTGGAGCTG GGCGGGGGCC 80 1 CTGGTGCAGG CAGCCTGCAG CCCTTGGCCC TGGAGGGGTC GCGACAGAAG 85 1 CGTGGCATTG TGGAACAATG CTGTACCAGC ATCTGCTCCC TCTACCAGCT 9 01 GGAGAACTAC TGCAACTAGA CGCAGCCGTC GACGGTACCA GCGCTGTCGA 9 51 GGCCGCTTCG AGCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT TGGACAAACC 1 00 1 ACAACTAGAA TGCAGTGAAA AAAATGCTTT ATTTGTGAAA TTTGTGATGC 1 05 1 TATTGCTTTA TTTGTAACCA TTATAAGCTG CAATAAACAA GTTAACAACA 1 10 1 ACAATTGCAT TCATTTTATG TTTCAGGTTC AGGGGGAGAT GTGGGAGGTT 1 15 1 TTTTAAAGCA AGTAAAACCT CTACAAATGT GGTAAAATCG ATTAGGATCT 1 20 1 TCCTAGAGCA TGGCTACCTA GACATGGCTC GACAGATCAG CGCTCATGCT 1 25 1 CTGGAAGATC TCGATTTATC CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGCAGATCCG 1 30 1 TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG TATCTGCTCC CTGCTTGTGT GTTGGAGGTC GCTGAGTAGT GCGCGAGCAA
1 40 1 AATTTAAGCT ACAACAAGGC AAGGCTTGAC CGACAATTGC ATGAAGAATC 1 45 1 TGCTTAGGGT TAGGCGTTTT GCGCTGCTTC GCGATGTACG GGCCAGATAT 1 50 1 TCGCGTATCT GAGGGGACTA GGGTGTGTTT AGGCGAAAAG CGGGGCTTCG GTTGTACGCG GTTAGGAGTC CCCTCAGGAT ATAGTAGTTT CGCTTTTGCA
1 60 1 TAGGGAGGGG GAAATGTAGT CTTATGCAAT ACTCTTGTAG TCTTGCAACA 1 65 1 TGGTAACGAT GAGTTAGCAA CATGCCTTAC AAGGAGAGAA AAAGCACCGT 1 70 1 GCATGCCGAT TGGTGGAAGT AAGGTGGTAC GATCGTGCCT TATTAGGAAG 1 75 1 GCAACAGACG GGTCTGACAT GGATTGGACG AACCACTAAA TTCCGCATTG 1 80 1 CAGAGATATT GTATTTAAGT GCCTAGCTCG ATACAATAAA CGCCATTTGA 1 85 1 CCATTCACCA CATTGGTGTG CACCTCCAAG CTGGGTACCA GCTTCTAGAG 1 90 1 AGATCTGCTT CAGCTGGAGG CACTGGGCAG GTAAGTATCA AGGTTACAAG 1 95 1 ACAGGTTTAA GGAGACCAAT AGAAACTGGG CTTGTCGAGA CAGAGAAGAC 2 00 1 TCTTGCGTTT CTGATAGGCA CCTATTGGTC TTACTGACAT CCACTTTGCC TTTCTCTCCA CAGGTGCAGC TGCTGCAGCG GTCTAGAACT CGAGTCGAGA
2 10 1 CCATGGCGAT GGATGTCACA AGGAGCCAGG CCCAGACAGC CTTGACTCTG 2 15 1 GTAGAGCAGA TCCTGGCAGA GTTCCAGCTG CAGGAGGAGG ACCTGAAGAA GGTGATGAGA CGGATGCAGA AGGAGATGGA CCGCGGCCTG AGGCTGGAGA CCCATGAAGA GGCCAGTGTG AAGATGCTGC CCACCTACGT GCGCTCCACC
2 30 1 CCAGAAGGCT CAGAAGTCGG GGACTTCCTC TCCCTGGACC TGGGTGGCAC TAACTTCAGG GTGATGCTGG TGAAGGTGGG AGAAGGTGAG GAGGGGCAGT
2 40 1 GGAGCGTGAA GACCAAACAC CAGATGTACT CCATCCCCGA GGACGCCATG 2 45 1 ACCGGCACTG CTGAGATGCT CTTCGACTAC ATCTCTGAGT GCATCTCCGA 2 50 1 CTTCCTGGAC AAGCATCAGA TGAAACACAA GAAGCTGCCC CTGGGCTTCA 2 55 1 CCTTCTCCTT TCCTGTGAGG CACGAAGACA TCGATAAGGG CATCCTTCTC 2 60 1 AACTGGACCA AGGGCTTCAA GGCCTCAGGA GCAGAAGGGA ACAATGTCGT 2 65 1 GGGGCTTCTG CGAGACGCTA TCAAACGGAG AGGGGACTTT GAAATGGATG 2 70 1 TGGTGGCAAT GGTGAATGAC ACGGTGGCCA CGATGATCTC CTGCTACTAC 2 75 1 GAAGACCATC AGTGCGAGGT CGGCATGATC GTGGGCACGG GCTGCAATGC 2 80 1 CTGCTACATG GAGGAGATGC AGAATGTGGA GCTGGTGGAG GGGGACGAGG GCCGCATGTG CGTCAATACC GAGTGGGGCG CCTTCGGGGA CTCCGGCGAG
2 90 1 CTGGACGAGT TCCTGCTGGA GTATGACCGC CTGGTGGACG AGAGCTCTGC 2 551 AAACCCCGGT CAGCAGCTGT ATGAGAAGCT CATAGGTGGC AAGTACATGG 3 00 1 GCGAGCTGGT GCGGCTTGTG CTGCTCAGGC TCGTGGACGA AAACCTGCTC 3 05 1 TTCCACGGGG AGGCCTCCGA GCAGCTGCGC ACACGCGGAG CCTTCGAGAC 3 10 1 GCGCTTCGTG TCGCAGGTGG AGAGCGACAC GGGCGACCGC AAGCAGATCT 3 15 1 ACAACATCCT GAGCACGCTG GGGCTGCGAC CCTCGACCAC CGACTGCGAC 3 20 1 ATCGTGCGCC GCGCCTGCGA GAGCGTGTCT ACGCGCGCTG CGCACATGTG 3 25 1 CTCGGCGGGG CTGGCGGGCG TCATCAACCG CATGCGCGAG AGCCGCAGCG 3 30 1 AGGACGTAAT GCGCATCACT GTGGGCGTGG ATGGCTCCGT GTACAAGCTG CACCCCAGCT TCAAGGAGCG GTTCCATGCC AGCGTGCGCA GGCTGACGCC
3 40 1 CAGCTGCGAG ATCACCTTCA TCGAGTCGGA GGAGGGCAGT GGCCGGGGCG CGGCCCTGGT CTCGGCGGTG GCCTGTAAGA AGGCCTGTAT GCTGGGCCAG 3 50 1 TGACTCGAGC ACGTGGAGCT CGCTGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT TGCCAGCCAT CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC GTGCCTTCCT TGACCCTGGA
3 60 1 AGGTGCCACT CCCACTGTCC TTTCCTAATA AAATGAGGAA ATTGCATCGC ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT TCTATTCTGG GGGGTGGGGT GGGGCAGGAC
3 70 1 AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC AGGCATGCTG GGGATGCGGT GGGCTCTATG GCCACGTGAT TTAAATGCGG CCGCAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC
3 85 1 GACCAAAGGT CGCCCGACGC CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC 3 90 1 GAGCGAGCGC GCAGCTGCCT GCAGGGGCGC CTGATGCGGT ATTTTCTCCT TACGCATCTG TGCGGTATTT CACACCGCAT ACGTCAAAGC AACCATAGTA
4 00 1 CGCGCCCTGT AGCGGCGCAT TAAGCGCGGC GGGTGTGGTG GTTACGCGCA GCGTGACCGC TACACTTGCC AGCGCCCTAG CGCCCGCTCC TTTCGCTTTC
4 10 1 TTCCCTTCCT TTCTCGCCAC GTTCGCCGGC TTTCCCCGTC AAGCTCTAAA TCGGGGGCTC CCTTTAGGGT TCCGATTTAG TGCTTTACGG CACCTCGACC
4 20 1 CCAAAAAACT TGATTTGGGT GATGGTTCAC GTAGTGGGCC ATCGCCCTGA 4 25 1 TAGACGGTTT TTCGCCCTTT GACGTTGGAG TCCACGTTCT TTAATAGTGG 4 30 1 ACTCTTGTTC CAAACTGGAA CAACACTCAA CCCTATCTCG GGCTATTCTT 4 35 1 TTGATTTATA AGGGATTTTG CCGATTTCGG CCTATTGGTT AAAAAATGAG 4 40 1 CTGATTTAAC AAAAATTTAA CGCGAATTTT AACAAAATAT TAACGTTTAC 4 45 1 AATTTTATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA 4 50 1 GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG ACGGGCTTGT CTGCTCCCGG CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT CCGGGAGCTG
4 60 1 CATGTGTCAG AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG AGACGAAAGG 4 65 1 GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA ATGTCATGAT AATAATGGTT 4 70 1 TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT TTGTTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT
4 85 1 CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC 4 90 1 TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 4 95 1 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT
05 1 TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG 10 1 AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC 5 15 1 TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT 5 20 1 ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 5 25 1 TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG 5 30 1 GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC 5 35 1 CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA 5 40 1 CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA 5 45 1 CAATTAATAG ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG 5 50 1 CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG 5 55 1 AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC 5 60 1 TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA CTATGGATGA 5 65 1 ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT 5 70 1 AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC
5 90 1 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG
6 00 1 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC 6 05 1 TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT 6 10 1 ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT 6 15 1 CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT 6 20 1 TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG
6 30 1 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG 6 35 1 GAGCTTCCAG GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG 6 40 1 CCACCTCTGA CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA 6 45 1 GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT € 501 TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor miniCMV: 156-566 bp
hIns: 580-926 bp
SV40 polyA: 940-1238 bp
Promotor RSV: 1354-2063 bp
hGck: 2088-3502 bp
bGH polyA: 3510-3768 bp
ITR 3': 3785-3925 bp
Constructo de referencia K: RSV-hGck-miniCMV-hIns (SEQ ID N.°:14)
[0193]
Figure imgf000056_0001
Secuencia de plásmido pAAV-RSV-hGck-miniCMV-hIns
[0194]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
151 ATATCCATGT TTGACAGCTT ATCATCGCAG ATCCGTATGG TGCACTCTCA
201 GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT GCTCCCTGCT
251 TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT AAGCTACAAC
301 AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGC
351 GTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCA GATATTCGCG TATCTGAGGG
401 GACTAGGGTG TGTTTAGGCG AAAAGCGGGG CTTCGGTTGT ACGCGGTTAG
451 GAGTCCCCTC AGGATATAGT AGTTTCGCTT TTGCATAGGG AGGGGGAAAT
501 GTAGTCTTAT GCAATACTCT TGTAGTCTTG CAACATGGTA ACGATGAGTT
551 AGCAACATGC CTTACAAGGA GAGAAAAAGC ACCGTGCATG CCGATTGGTG
601 GAAGTAAGGT GGTACGATCG TGCCTTATTA GGAAGGCAAC AGACGGGTCT
651 GACATGGATT GGACGAACCA CTAAATTCCG CATTGCAGAG ATATTG TATT
701 TAAGTGCCTA GCTCGATACA ATAAACGCCA TTTGACCATT CACCACATTG
751 GTGTGCACCT CCAAGCTGGG TACCAGCTTC TAGAGAGATC TGCTTCAGCT
801 GGAGGCACTG GGCAGGTAAG TATCAAGGTT ACAAGACAGG TTTAAGGAGA
851 CCAATAGAAA CTGGGCTTGT CGAGACAGAG AAGACTCTTG CGTTTCTGAT
9 01 AGGCACCTAT TGGTCTTACT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT 9 51 GCAGCTGCTG CAGCGGTCTA GAACTCGAGT CGAGACCATG GCGATGGATG 1 00 1 TCACAAGGAG CCAGGCCCAG ACAGCCTTGA CTCTGGTAGA GCAGATCCTG 1 05 1 GCAGAGTTCC AGCTGCAGGA GGAGGACCTG AAGAAGGTGA TGAGACGGAT 1 10 1 GCAGAAGGAG ATGGACCGCG GCCTGAGGCT GGAGACCCAT GAAGAGGCCA 1 15 1 GTGTGAAGAT GCTGCCCACC TACGTGCGCT CCACCCCAGA AGGCTCAGAA 1 20 1 GTCGGGGACT TCCTCTCCCT GGACCTGGGT GGCACTAACT TCAGGGTGAT 1 25 1 GCTGGTGAAG GTGGGAGAAG GTGAGGAGGG GCAGTGGAGC GTGAAGACCA 1 30 1 AACACCAGAT GTACTCCATC CCCGAGGACG CCATGACCGG CACTGCTGAG 1 35 1 ATGCTCTTCG ACTACATCTC TGAGTGCATC TCCGACTTCC TGGACAAGCA 1 40 1 TCAGATGAAA CACAAGAAGC TGCCCCTGGG CTTCACCTTC TCCTTTCCTG 1 45 1 TGAGGCACGA AGACATCGAT AAGGGCATCC TTCTCAACTG GACCAAGGGC 1 50 1 TTCAAGGCCT CAGGAGCAGA AGGGAACAAT GTCGTGGGGC TTCTGCGAGA 1 55 1 CGCTATCAAA CGGAGAGGGG ACTTTGAAAT GGATGTGGTG GCAATGGTGA 1 60 1 ATGACACGGT GGCCACGATG ATCTCCTGCT ACTACGAAGA CCATCAGTGC 1 65 1 GAGGTCGGCA TGATCGTGGG CACGGGCTGC AATGCCTGCT ACATGGAGGA 1 70 1 GATGCAGAAT GTGGAGCTGG TGGAGGGGGA CGAGGGCCGC ATGTGCGTCA 1 75 1 ATACCGAGTG GGGCGCCTTC GGGGACTCCG GCGAGCTGGA CGAGTTCCTG CTGGAGTATG ACCGCCTGGT GGACGAGAGC TCTGCAAACC CCGGTCAGCA GCTGTATGAG AAGCTCATAG GTGGCAAGTA CATGGGCGAG CTGGTGCGGC
1 90 1 TTGTGCTGCT CAGGCTCGTG GACGAAAACC TGCTCTTCCA CGGGGAGGCC 1 95 1 TCCGAGCAGC TGCGCACACG CGGAGCCTTC GAGACGCGCT TCGTGTCGCA GGTGGAGAGC GACACGGGCG ACCGCAAGCA GATCTACAAC ATCCTGAGCA
2 05 1 CGCTGGGGCT GCGACCCTCG ACCACCGACT GCGACATCGT GCGCCGCGCC 2 10 1 TGCGAGAGCG TGTCTACGCG CGCTGCGCAC ATGTGCTCGG CGGGGCTGGC 2 15 1 GGGCGTCATC AACCGCATGC GCGAGAGCCG CAGCGAGGAC GTAATGCGCA 2 20 1 TCACTGTGGG CGTGGATGGC TCCGTGTACA AGCTGCACCC CAGCTTCAAG i I GAGCGGTTCC ATGCCAGCGT GCGCAGGCTG ACGCCCAGCT GCGAGATCAC 2 30 1 CTTCATCGAG TCGGAGGAGG GCAGTGGCCG GGGCGCGGCC CTGGTCTCGG 2 35 1 CGGTGGCCTG TAAGAAGGCC TGTATGCTGG GCCAGTGACT CGAGCACGTG 2 40 1 GAGCTCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 2 45 1 GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC 2 50 1 TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT 2 55 1 GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT 2 60 1 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCCAC GTGATTTATC TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA
2 70 1 TGGCCCGCCT GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG ACTTTCCTAC 2 75 1 TTGGCAGTAC ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA CATCAATGGG CGTGGATAGC GGTTTGACTC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGTTTT GGCACCAAAA
2 90 1 TCAACGGGAC TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA TTGACGCAAA 2 95 1 TGGGCGGTAG GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCTCTGG 3 00 1 CTAACTAGAG AACCCACTGC TTAACTGGCT TATCGAAATT AATACGACTC 3 05 1 ACTATAGGGA GACCCAAGCT TGCTAGCGTC GACCTTCTGC CATGGCCCTG 3 10 1 TGGATGCGCC TCCTGCCCCT GCTGGCGCTG CTGGCCCTCT GGGGACCTGA í 5 CCCAGCCGCA GCCTTTGTGA ACCAACACCT GTGCGGCTCA GATCTGGTGG AAGCTCTCTA CCTAGTGTGC GGGGAACGAG GCTTCTTCTA CACACCCAGG ACCAAGCGGG AGGCAGAGGA CCTGCAGGTG GGGCAGGTGG AGCTGGGCGG
3 30 1 GGGCCCTGGT GCAGGCAGCC TGCAGCCCTT GGCCCTGGAG GGGTCGCGAC AGAAGCGTGG CATTGTGGAA CAATGCTGTA CCAGCATCTG CTCCCTCTAC
3 40 1 CAGCTGGAGA ACTACTGCAA CTAGACGCAG CCGTCGACGG TACCAGCGCT 3 45 1 GTCGAGGCCG CTTCGAGCAG ACATGATAAG ATACATTGAT GAGTTTGGAC 3 50 1 AAACCACAAC TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT 3 55 1 GATGCTATTG CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCAATA AACAAGTTAA 3 60 1 CAACAACAAT TGCATTCATT TTATGTTTCA GGTTCAGGGG GAGATGTGGG 3 65 1 AGGTTTTTTA AAGCAAGTAA AACCTCTACA AATGTGGTAA AATCGATTAG 3 70 1 GATCTTCCTA GAGCATGGCT ACCTAGACAT GGCTCGACAG ATCAGCGCTC 3 75 1 ATGCTCTGGA AGATCTCGAT TTAAATGCGG CCGCAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC
3 90 1 GAGCGAGCGC GCAGCTGCCT GCAGGGGCGC CTGATGCGGT A TTTTCTCCT 3951 TACGCATCTG TGCGGTATTT CACACCGCAT ACGTCAAAGC AACCATAGTA 4001 CGCGCCCTGT AGCGGCGCAT TAAGCGCGGC GGGTGTGGTG GTTACGCGCA 4051 GCGTGACCGC TACACTTGCC AGCGCCCTAG CGCCCGCTCC TTTCGCTTTC 4101 TTCCCTTCCT TTCTCGCCAC GTTCGCCGGC TTTCCCCGTC AAGCTCTAAA 4151 TCGGGGGCTC CCTTTAGGGT TCCGATTTAG TGCTTTACGG CACCTCGACC 4201 CCAAAAAACT TGATTTGGGT GATGGTTCAC GTAGTGGGCC ATCGCCCTGA 4251 TAGACGGTTT TTCGCCCTTT GACGTTGGAG TCCACGTTCT TTAATAGTGG 4301 ACTCTTGTTC CAAACTGGAA CAACACTCAA CCCTATCTCG GGCTATTCTT 4351 TTG ATTTATA AGGGATTTTG CCGATTTCGG CCTATTGGTT AAAAAATGAG 4401 CTGATTTAAC AAAAATTTAA CGCGAATTTT AACAAAATAT TAACGTTTAC 4451 AATTTTATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA 4501 GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG ACGGGCTTGT 4551 CTGCTCCCGG CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT CCGGGAGCTG 4601 CATGTGTCAG AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG AGACGAAAGG 4651 GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA ATGTCATGAT AATAATGGTT 4701 TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT 4751 TTG TTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT 4801 AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT 4851 CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC 4901 TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC 4951 AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG 5001 ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT 5051 TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG 5101 AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC 5151 TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT 5201 ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC 5251 TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG 5301 GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC 5351 CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA 5401 CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGC GAAC TAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA 5451 CAATTAATAG ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG 5501 CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG 5551 AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC 5601 TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA CTATGGATGA 5651 ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT 5701 AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT 5751 CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT 5801 GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG 5851 TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC C TTTTTTTC T GCGCGTAATC 5901 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC 5951 GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG 6001 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC 6051 TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT 6101 ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT 6151 CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT 6201 TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA 6251 CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 6301 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG 6351 GAGCTTCCAG GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG 6401 CCACCTCTGA CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA 6451 GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT 6501 TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor RSV: 239-948 bp
hGck: 973-2387 bp
bGH polyA: 2395-2653 bp
Promotor miniCMV: 2661-3071 bp
hIns: 3085-3431 bp
SV40 polyA: 3445-3743 bp
ITR 3': 3785-3925 bp
L: miniCMV-hIns(rev)-RSV-hGck (SEQ ID N.°: 15)
[0195]
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000059_0002
Secuencia de plásmido pAAV-miniCMV-hlns(rev)-RSV-hGck
[0196]
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG 151 ATAAATCGAG ATCTTCCAGA GCATGAGCGC TGATCTGTCG AGCCATGTCT 201 AGGTAGCCAT GCTCTAGGAA GATCCTAATC GATTTTACCA CATTTGTAGA 251 GGTTTTACTT GCTTTAAAAA ACCTCCCACA TCTCCCCCTG AACCTGAAAC 301 ATAAAATGAA TGCAATTGTT GTTGTTAACT TGTTTATTGC AGCTTATAAT 351 GGTTACAAAT AAAGCAATAG CATCACAAAT TTCACAAATA AAGCATTTTT 401 TTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC 451 ATGTCTGCTC GAAGCGGCCT CGACAGCGCT GGTACCGTCG ACGGCTGCGT 501 CTAGTTGCAG TAGTTCTCCA GCTGGTAGAG GGAGCAGATG CTGGTACAGC 551 ATTGTTCCAC AATGCCACGC TTCTGTCGCG ACCCCTCCAG GGCCAAGGGC 601 TGCAGGCTGC CTGCACCAGG GCCCCCGCCC AGCTCCACCT GCCCCACCTG 651 CAGGTCCTCT GCCTCCCGCT TGGTCCTGGG TGTGTAGAAG AAGCCTCGTT 701 CCCCGCACAC TAGGTAGAGA GCTTCCACCA GATCTGAGCC GCACAGGTGT 751 TGGTTCACAA AGGCTGCGGC TGGGTCAGGT CCCCAGAGGG CCAGCAGCGC 801 CAGCAGGGGC AGGAGGCGCA TCCACAGGGC CATGGCAGAA GGTCGACGCT 851 AGCAAGCTTG GGTCTCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC GATAAGCCAG 901 TTAAGCAGTG GGTTCTCTAG TTAGCCAGAG AGCTCTGCTT ATATAGACCT 951 CCCACCGTAC ACGCCTACCG CCCATTTGCG TCAATGGGGC GGAGTTGTTA 1001 CGACATTTTG GAAAGTCCCG TTGATTTTGG TGCCAAAACA AACTCCCATT 1051 GACGTCAATG GGGTGGAGAC TTGGAAATCC CCGTGAGTCA AACCGCTATC 1101 CACGCCCATT GATGTACTGC CAAAACCGCA TCACCATGGT AATAGCGATG 1151 ACTAATACGT AGATGTACTG CCAAGTAGGA AAGTCCCATA AGGTCATGTA 1201 CTGGGCATAA TGCCAGGCGG GCCATTTACC GTCATTGACG TCAATAGGGG 1251 GCGTACTTGG CATAGATATC CATGTTTGAC AGCTTATCAT CGCAGATCCG 1301 TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG 1351 TATCTGCTCC CTGCTTGTGT GTTGGAGGTC GCTGAGTAGT GCGCGAGCAA 1401 AATTTAAGCT ACAACAAGGC AAGGCTTGAC CGACAATTGC ATGAAGAATC 1451 TGCTTAGGGT TAGGCGTTTT GCGCTGCTTC GCGATGTACG GGCCAGATAT 1501 TCGCGTATCT GAGGGGACTA GGGTGTGTTT AGGCGAAAAG CGGGGCTTCG 1551 GTTGTACGCG GTTAGGAGTC CCCTCAGGAT ATAGTAGTTT CGCTTTTGCA 1601 TAGGGAGGGG GAAATGTAGT CTTATGCAAT ACTCTTGTAG TCTTGCAACA 1651 TGGTAACGAT GAGTTAGCAA CATGCCTTAC AAGGAGAGAA AAAGCACCGT 1701 GCATGCCGAT TGGTGGAAGT AAGGTGGTAC GATCGTGCCT TATTAGGAAG 1751 GCAACAGACG GGTCTGACAT GGATTGGACG AACCACTAAA TTCCGCATTG 1801 CAGAGATATT GTATTTAAGT GCCTAGCTCG ATACAATAAA CGCCATTTGA 1851 CCATTCACCA CATTGGTGTG CACCTCCAAG CTGGGTACCA GCTTCTAGAG 1901 AGATCTGCTT CAGCTGGAGG CACTGGGCAG GTAAGTATCA AGGTTACAAG 1951 ACAGGTTTAA GGAGACCAAT AGAAACTGGG CTTGTCGAGA CAGAGAAGAC 2001 TCTTGCGTTT CTGATAGGCA CCTATTGGTC TTACTGACAT CCACTTTGCC 2051 TTTCTCTCCA CAGGTGCAGC TGCTGCAGCG GTCTAGAACT CGAGTCGAGA 2 10 1 CCATGGCGAT GGATGTCACA AGGAGCCAGG CCCAGACAGC CTTGACTCTG 2 15 1 GTAGAGCAGA TCCTGGCAGA GTTCCAGCTG CAGGAGGAGG ACCTGAAGAA 2 20 1 GGTGATGAGA CGGATGCAGA AGGAGATGGA CCGCGGCCTG AGGCTGGAGA CCCATGAAGA GGCCAGTGTG AAGATGCTGC CCACCTACGT GCGCTCCACC
2 30 1 CCAGAAGGCT CAGAAGTCGG GGACTTCCTC TCCCTGGACC TGGGTGGCAC 2 35 1 TAACTTCAGG GTGATGCTGG TGAAGGTGGG AGAAGGTGAG GAGGGGCAGT 2 40 1 GGAGCGTGAA GACCAAACAC CAGATGTACT CCATCCCCGA GGACGCCATG 2 45 1 ACCGGCACTG CTGAGATGCT CTTCGACTAC ATCTCTGAGT GCATCTCCGA 2 50 1 CTTCCTGGAC AAGCATCAGA TGAAACACAA GAAGCTGCCC CTGGGCTTCA 2 55 1 CCTTCTCCTT TCCTGTGAGG CACGAAGACA TCGATAAGGG CATCCTTCTC 2 80 1 AACTGGACCA AGGGCTTCAA GGCCTCAGGA GCAGAAGGGA ACAATGTCGT 2 65 1 GGGGCTTCTG CGAGACGCTA TCAAACGGAG AGGGGACTTT GAAATGGATG 2 70 1 TGGTGGCAAT GGTGAATGAC ACGGTGGCCA CGATGATCTC CTGCTACTAC 2 75 1 GAAGACCATC AGTGCGAGGT CGGCATGATC GTGGGCACGG GCTGCAATGC CTGCTACATG GAGGAGATGC AGAATGTGGA GCTGGTGGAG GGGGACGAGG GCCGCATGTG CGTCAATACC GAGTGGGGCG CCTTCGGGGA CTCCGGCGAG
2 90 1 CTGGACGAGT TCCTGCTGGA GTATGACCGC CTGGTGGACG AGAGCTCTGC 2 95 1 AAACCCCGGT CAGCAGCTGT ATGAGAAGCT CATAGGTGGC AAGTACATGG 3 00 1 GCGAGCTGGT GCGGCTTGTG CTGCTCAGGC TCGTGGACGA AAACCTGCTC 3 05 1 TTCCACGGGG AGGCCTCCGA GCAGCTGCGC ACACGCGGAG CCTTCGAGAC 3 10 1 GCGCTTCGTG TCGCAGGTGG AGAGCGACAC GGGCGACCGC AAGCAGATCT 3 15 1 ACAACATCCT GAGCACGCTG GGGCTGCGAC CCTCGACCAC CGACTGCGAC 3 20 1 ATCGTGCGCC GCGCCTGCGA GAGCGTGTCT ACGCGCGCTG CGCACATGTG CTCGGCGGGG CTGGCGGGCG TCATCAACCG CATGCGCGAG AGCCGCAGCG AGGACGTAAT GCGCATCACT GTGGGCGTGG ATGGCTCCGT GTACAAGCTG
3 35 1 CACCCCAGCT TCAAGGAGCG GTTCCATGCC AGCGTGCGCA GGCTGACGCC 40 1 CAGCTGCGAG ATCACCTTCA TCGAGTCGGA GGAGGGCAGT GGCCGGGGCG 45 1 CGGCCCTGGT CTCGGCGGTG GCCTGTAAGA AGGCCTGTAT GCTGGGCCAG 3 50 1 TGACTCGAGC ACGTGGAGCT CGCTGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT 3 55 1 TGCCAGCCAT CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC GTGCCTTCCT TGACCCTGGA 3 60 1 AGGTGCCACT CCCACTGTCC TTTCCTAATA AAATGAGGAA ATTGCATCGC 3 65 1 ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT TCTATTCTGG GGGGTGGGGT GGGGCAGGAC 3 70 1 AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC AGGCATGCTG GGGATGCGGT 3 75 1 GGGCTCTATG GCCACGTGAT TTAAATGCGG CCGCAGGAAC CCCTAGTGAT 3 80 1 GGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC
3 90 1 GAGCGAGCGC GCAGCTGCCT GCAGGGGCGC CTGATGCGGT ATTTTCTCCT TACGCATCTG TGCGGTATTT CACACCGCAT ACGTCAAAGC AACCATAGTA
4 00 1 CGCGCCCTGT AGCGGCGCAT TAAGCGCGGC GGGTGTGGTG GTTACGCGCA 4 05 1 GCGTGACCGC TACACTTGCC AGCGCCCTAG CGCCCGCTCC TTTCGCTTTC 4 10 1 TTCCCTTCCT TTCTCGCCAC GTTCGCCGGC TTTCCCCGTC AAGCTCTAAA 4 15 1 TCGGGGGCTC CCTTTAGGGT TCCGATTTAG TGCTTTACGG CACCTCGACC 4 20 1 CCAAAAAACT TGATTTGGGT GATGGTTCAC GTAGTGGGCC ATCGCCCTGA TAGACGGTTT TTCGCCCTTT GACGTTGGAG TCCACGTTCT TTAATAGTGG
4 30 1 ACTCTTGTTC CAAACTGGAA CAACACTCAA CCCTATCTCG GGCTATTCTT TTGATTTATA AGGGATTTTG CCGATTTCGG CCTATTGGTT AAAAAATGAG
4 40 1 CTGATTTAAC AAAAATTTAA CGCGAATTTT AACAAAATAT TAACGTTTAC 4 45 1 AATTTTATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA 4 50 1 GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG ACGGGCTTGT 4 55 1 CTGCTCCCGG CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT CCGGGAGCTG 4 60 1 CATGTGTCAG AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG AGACGAAAGG 4 65 1 GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA ATGTCATGAT AATAATGGTT 4 70 1 TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT 4 75 1 TTGTTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT
4 85 1 CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC 4 90 1 TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC V í * i AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT
5 05 1 TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG 5 10 1 AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC 51 51 TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT 52 01 ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC
52 51 TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG
53 01 GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC
53 51 CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA
54 01 CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA
545 1 CAATTAATAG ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG
55 01 CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG
555 1 AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC
56 01 TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA CTATGGATGA
56 51 ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT
57 01 AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT
575 1 CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT
58 01 GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG
585 1 TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC C TTTTTTTC T GCGCGTAATC
59 01 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC
59 51 GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG
60 01 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC
60 51 TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT
61 01 ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT
61 51 CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT
62 01 TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA
62 51 CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG
63 01 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG
63 51 GAGCTTCCAG GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG
64 01 CCACCTCTGA CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA
64 51 GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT
65 01 TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GT
ITR 5': 1-141 bp
SV40 poIyA: 182-480 bp
hIns: 494-840 bp
Promotor miniCMV: 854-1264 bp
Promotor RSV: 1354-2063 bp
hGck: 2088-3502 bp
bGH polyA: 3510-3768 bp
ITR 3': 3785-3925 bp
Constructo de referencia M: RSV-hGck-miniCMV-hlns(rev) (SEQ ID N.°: 16)
[0197]
Figure imgf000062_0001
Secuencia de plásmido pAAV-RSV-hGck-miniCMV-hlns(rev)
[0198]
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG
1 51 ATATCCATGT TTGACAGCTT ATCATCGCAG ATCCGTATGG TGCACTCTCA 20 1 GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT GCTCCCTGCT 25 1 TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT AAGCTACAAC 30 1 AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGC 35 1 GTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCA GATATTCGCG TATCTGAGGG 4 01 GACTAGGGTG TGTTTAGGCG AAAAGCGGGG CTTCGGTTGT ACGCGGTTAG 4 51 GAGTCCCCTC AGGATATAGT AGTTTCGCTT TTGCATAGGG AGGGGGAAAT 50 1 GTAGTCTTAT GCAATACTCT TGTAGTCTTG CAACATGGTA ACGATGAGTT 55 1 AGCAACATGC CTTACAAGGA GAGAAAAAGC ACCGTGCATG CCGATTGGTG 6 01 GAAGTAAGGT GGTACGATCG TGCCTTATTA GGAAGGCAAC AGACGGGTCT 6 51 GACATGGATT GGACGAACCA CTAAATTCCG CATTGCAGAG ATATTGTATT 70 1 TAAGTGCCTA GCTCGATACA ATAAACGCCA TTTGACCATT CACCACATTG 75 1 GTGTGCACCT CCAAGCTGGG TACCAGCTTC TAGAGAGATC TGCTTCAGCT 80 1 GGAGGCACTG GGCAGGTAAG TATCAAGGTT ACAAGACAGG TTTAAGGAGA 85 1 CCAATAGAAA CTGGGCTTGT CGAGACAGAG AAGACTCTTG CGTTTCTGAT 9 01 AGGCACCTAT TGGTCTTACT GACATCCACT TTGCCTTTCT CTCCACAGGT 9 51 GCAGCTGCTG CAGCGGTCTA GAACTCGAGT CGAGACCATG GCGATGGATG 1 00 1 TCACAAGGAG CCAGGCCCAG ACAGCCTTGA CTCTGGTAGA GCAGATCCTG 1 05 1 GCAGAGTTCC AGCTGCAGGA GGAGGACCTG AAGAAGGTGA TGAGACGGAT 1 10 1 GCAGAAGGAG ATGGACCGCG GCCTGAGGCT GGAGACCCAT GAAGAGGCCA 1 15 1 GTGTGAAGAT GCTGCCCACC TACGTGCGCT CCACCCCAGA AGGCTCAGAA 1 20 1 GTCGGGGACT TCCTCTCCCT GGACCTGGGT GGCACTAACT TCAGGGTGAT 1 25 1 GCTGGTGAAG GTGGGAGAAG GTGAGGAGGG GCAGTGGAGC GTGAAGACCA 1 30 1 AACACCAGAT GTACTCCATC CCCGAGGACG CCATGACCGG CACTGCTGAG 1 35 1 ATGCTCTTCG ACTACATCTC TGAGTGCATC TCCGACTTCC TGGACAAGCA 1 40 1 TCAGATGAAA CACAAGAAGC TGCCCCTGGG CTTCACCTTC TCCTTTCCTG 1 45 1 TGAGGCACGA AGACATCGAT AAGGGCATCC TTCTCAACTG GACCAAGGGC 1 50 1 TTCAAGGCCT CAGGAGCAGA AGGGAACAAT GTCGTGGGGC TTCTGCGAGA 1 55 1 CGCTATCAAA CGGAGAGGGG ACTTTGAAAT GGATGTGGTG GCAATGGTGA 1 60 1 ATGACACGGT GGCCACGATG ATCTCCTGCT AC TAC GAAGA CCATCAGTGC 1 65 1 GAGGTCGGCA TGATCGTGGG CACGGGCTGC AATGCCTGCT ACATGGAGGA 1 70 1 GATGCAGAAT GTGGAGCTGG TGGAGGGGGA CGAGGGCCGC ATGTGCGTCA 1 75 1 ATACCGAGTG GGGCGCCTTC GGGGACTCCG GCGAGCTGGA CGAGTTCCTG 1 80 1 CTGGAGTATG ACCGCCTGGT GGACGAGAGC TCTGCAAACC CCGGTCAGCA 1 85 1 GCTGTATGAG AAGCTCATAG GTGGCAAGTA CATGGGCGAG CTGGTGCGGC 1 90 1 TTGTGCTGCT CAGGCTCGTG GACGAAAACC TGCTCTTCCA CGGGGAGGCC 1 95 1 TCCGAGCAGC TGCGCACACG CGGAGCCTTC GAGACGCGCT TCGTGTCGCA 2 00 1 GGTGGAGAGC GACACGGGCG ACCGCAAGCA GATCTACAAC ATCCTGAGCA CGCTGGGGCT GCGACCCTCG ACCACCGACT GCGACATCGT GCGCCGCGCC
2 10 1 TGCGAGAGCG TGTCTACGCG CGCTGCGCAC ATGTGCTCGG CGGGGCTGGC 2 15 1 GGGCGTCATC AACCGCATGC GCGAGAGCCG CAGCGAGGAC GTAATGCGCA 2 20 1 TCACTGTGGG CGTGGATGGC TCCGTGTACA AGCTGCACCC CAGCTTCAAG 2 25 1 GAGCGGTTCC ATGCCAGCGT GCGCAGGCTG ACGCCCAGCT GCGAGATCAC 2 30 1 CTTCATCGAG TCGGAGGAGG GCAGTGGCCG GGGCGCGGCC CTGGTCTCGG 2 35 1 CGGTGGCCTG TAAGAAGGCC TGTATGCTGG GCCAGTGACT CGAGCACGTG 2 40 1 GAGCTCGCTG ATCAGCCTCG ACTGTGCCTT CTAGTTGCCA GCCATCTGTT 2 45 1 GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC CTGGAAGGTG CCACTCCCAC 2 50 1 TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT
2 60 1 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCCAC 2 65 1 GTGATTTAAA TCGAGATCTT CCAGAGCATG AGCGCTGATC TGTCGAGCCA 2 70 1 TGTCTAGGTA GCCATGCTCT AGGAAGATCC TAATCGATTT TACCACATTT 2 75 1 GTAGAGGTTT TACTTGCTTT AAAAAACCTC CCACATCTCC CCCTGAACCT GAAACATAAA ATGAATGCAA TTGTTGTTGT TAACTTGTTT ATTGCAGCTT
2 85 1 ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA 2 90 1 TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC 2 95 1 TTATCATGTC TGCTCGAAGC GGCCTCGACA GCGCTGGTAC CGTCGACGGC 3 00 1 TGCGTCTAGT TGCAGTAGTT CTCCAGCTGG TAGAGGGAGC AGATGCTGGT ACAGCATTGT TCCACAATGC CACGCTTCTG TCGCGACCCC TCCAGGGCCA
3 10 1 AGGGCTGCAG GCTGCCTGCA CCAGGGCCCC CGCCCAGCTC CACCTGCCCC 3 15 1 ACCTGCAGGT CCTCTGCCTC CCGCTTGGTC CTGGGTGTGT AGAAGAAGCC 3 20 1 TCGTTCCCCG CACACTAGGT AGAGAGCTTC CACCAGATCT GAGCCGCACA 3 25 1 GGTGTTGGTT CACAAAGGCT GCGGCTGGGT CAGGTCCCCA GAGGGCCAGC 3 30 1 AGCGCCAGCA GGGGCAGGAG GCGCATCCAC AGGGCCATGG CAGAAGGTCG 3 35 1 ACGCTAGCAA GCTTGGGTCT CCCTATAGTG AGTCGTATTA ATTTCGATAA 3 40 1 GCCAGTTAAG CAGTGGGTTC TCTAGTTAGC CAGAGAGCTC TGCTTATATA 3 45 1 GACCTCCCAC CGTACACGCC TACCGCCCAT TTGCGTCAAT GGGGCGGAGT 3 50 1 TGTTACGACA TTTTGGAAAG TCCCGTTGAT TTTGGTGCCA AAACAAACTC 3 55 1 CCATTGACGT CAATGGGGTG GAGACTTGGA AATCCCCGTG AGTCAAACCG 3 60 1 CTATCCACGC CCATTGATGT ACTGCCAAAA CCGCATCACC ATGGTAATAG 3 65 1 CGATGACTAA TACGTAGATG TACTGCCAAG TAGGAAAGTC CCATAAGGTC 3 70 1 ATGTACTGGG CATAATGCCA GGCGGGCCAT TTACCGTCAT TGACGTCAAT 3 75 1 AGGGGGCGTA CTTGGCATAG ATAAATGCGG CCGCAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC CCGGGCTTTG CCCGGGCGGC CTCAGTGAGC
3 90 1 GAGCGAGCGC GCAGCTGCCT GCAGGGGCGC CTGATGCGGT A TTTTCTCCT TACGCATCTG TGCGGTATTT CACACCGCAT ACGTCAAAGC AACCATAGTA
4 00 1 CGCGCCCTGT AGCGGCGCAT TAAGCGCGGC GGGTGTGGTG GTTACGCGCA 4 05 1 GCGTGACCGC TACACTTGCC AGCGCCCTAG CGCCCGCTCC TTTCGCTTTC 4 10 1 TTCCCTTCCT TTCTCGCCAC GTTCGCCGGC TTTCCCCGTC AAGCTCTAAA TCGGGGGCTC CCTTTAGGGT TCCGATTTAG TGCTTTACGG CACCTCGACC
4 20 1 CCAAAAAACT TGATTTGGGT GATGGTTCAC GTAGTGGGCC ATCGCCCTGA 4 25 1 TAGACGGTTT TTCGCCCTTT GACGTTGGAG TCCACGTTCT TTAATAGTGG 4 30 1 ACTCTTGTTC CAAACTGGAA CAACACTCAA CCCTATCTCG GGCTATTCTT 4 35 1 TTGATTTATA AGGGATTTTG CCGATTTCGG CCTATTGGTT AAAAAATGAG 4 40 1 CTGATTTAAC AAAAATTTAA CGCGAATTTT AACAAAATAT TAACGTTTAC 4 45 1 AATTTTATGG TGCACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA 4 50 1 GCCAGCCCCG ACACCCGCCA ACACCCGCTG ACGCGCCCTG ACGGGCTTGT 4 55 1 CTGCTCCCGG CATCCGCTTA CAGACAAGCT GTGACCGTCT CCGGGAGCTG 4 60 1 CATGTGTCAG AGGTTTTCAC CGTCATCACC GAAACGCGCG AGACGAAAGG 4 65 1 GCCTCGTGAT ACGCCTATTT TTATAGGTTA ATGTCATGAT AATAATGGTT 4 70 1 TCTTAGACGT CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT 4 75 1 TTGTTTATTT TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC
4 90 1 TGTTTTTGCT CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC í ‘ ' '<£ AGTTGGGTGC ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG 5 00 1 ATCCTTGAGA GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG
5 10 1 AGCAACTCGG TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT
5 20 1 ATGCAGTGCT GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC TGACAACGAT CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCG CTTTTTT GCACAACATG
5 30 1 GGGGATCATG TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC CATACCAAAC GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA
5 40 1 CGTTGCGCAA ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA CAATTAATAG ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG
5 50 1 CTCGGCCCTT CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG 5 55 1 AGCGTGGGTC TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC 5 60 1 TCCCGTATCG TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA CTATGGATGA 5 65 1 ACGAAATAGA CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT 5 70 1 AACTGTCAGA CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG
5 85 1 TAGAAAAGAT CAAAGGATCT TCTTGAGATC C T T T T T T T C T GCGCGTAATC 5 90 1 TGCTGCTTGC AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG
6 00 1 CGCAGATACC AAATACTGTC CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC 6 05 1 TTCAAGAACT CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT 6 10 1 ACCAGTGGCT GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT € 151 CAAGACGATA GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT € 201 TCGTGCACAC AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA 6 251 CCTACAGCGT GAGCTATGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG 6 301 CGGACAGGTA TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG 6 351 GAGCTTCCAG GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG 6 401 CCACCTCTGA CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA 6 451 GCCTATGGAA AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT 6 501 TGCTGGCCTT TTGCTCACAT GT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor RSV: 239-948 bp
hGck: 973-2387 bp
bGH polyA: 2395-2653 bp
SV40 polyA: 2687-2985 bp
hIns: 2999-3345 bp
Promotor miniCMV: 3359-3769 pb
ITR 3': 3785-3925 bp
Constructo de referencia N: miniCMV-hIns (SEQ ID N.°:21)
Figure imgf000065_0001
1 CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG
51 CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC
101 GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TGCGGCCGCG 151 ATATCTATGC CAAGTACGCC CCCTATTGAC GTCAATGACG GTAAATGGCC 201 CGCCTGGCAT TATGCCCAGT ACATGACCTT ATGGGACTTT CCTACTTGGC 251 AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGTGAT GCGGTTTTGG 301 CAGTACATCA ATGGGCGTGG ATAGCGGTTT GACTCACGGG GATTTCCAAG 351 TCTCCACCCC ATTGACGTCA ATGGGAGTTT GTTTTGGCAC CAAAATCAAC 401 GGGACTTTCC AAAATGTCGT AACAACTCCG CCCCATTGAC GCAAATGGGC 451 GGTAGGCGTG TACGGTGGGA GGTCTATATA AGCAGAGCTC TCTGGCTAAC 501 TAGAGAACCC ACTGCTTAAC TGGCTTATCG AAATTAATAC GACTCACTAT 551 AGGGAGACCC AAGCTTGCTA GCGTCGACCT TCTGCCATGG CCCTGTGGAT 601 GCGCCTCCTG CCCCTGCTGG CGCTGCTGGC CCTCTGGGGA CCTGACCCAG 651 CCGCAGCCTT TGTGAACCAA CACCTGTGCG GCTCAGATCT GGTGGAAGCT 701 CTCTACCTAG TGTGCGGGGA ACGAGGCTTC TTCTACACAC CCAGGACCAA 751 GCGGGAGGCA GAGGACCTGC AGGTGGGGCA GGTGGAGCTG GGCGGGGGCC 801 CTGGTGCAGG CAGCCTGCAG CCCTTGGCCC TGGAGGGGTC GCGACAGAAG 851 CGTGGCATTG TGGAACAATG CTGTACCAGC ATCTGCTCCC TCTACCAGCT S O I GGAGAACTAC TGCAACTAGA CGCAGCCGTC GACGGTACCA GCGCTGTCGA
951 GGCCGCTTCG AGCAGACATG ATAAGATACA TTGATGAGTT TGGACAAACC 1001 ACAACTAGAA TGCAGTGAAA AAAATGCTTT ATTTGTGAAA TTTGTGATGC 1051 TATTGCTTTA TTTGTAACCA TTATAAGCTG CAATAAACAA GTTAACAACA 1101 ACAATTGCAT TCATTTTATG TTTCAGGTTC AGGGGGAGAT GTGGGAGGTT 1151 TTTTAAAGCA AGTAAAACCT CTACAAATGT GGTAAAATCG ATTAGGATCT 1201 TCCTAGAGCA TGGCTACCTA GACATGGCTC GACAGATCAG CGCTCATGCT 1251 CTGGAAGATC TCGATTTAAA TGCGGCCGCA GGAACCCCTA GTGATGGAGT 1301 TGGCCACTCC CTCTCTGCGC GCTCGCTCGC TCACTGAGGC CGGGCGACCA 1351 AAGGTCGCCC GACGCCCGGG CTTTGCCCGG GCGGCCTCAG TGAGCGAGCG 1401 AGCGCGCAGC TGCCTGCAGG GGCGCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC 1451 ATCTGTGCGG TATTTCACAC CGCATACGTC AAAGCAACCA TAGTACGCGC 1501 CCTGTAGCGG CGCATTAAGC GCGGCGGGTG TGGTGGTTAC GCGCAGCGTG 1551 ACCGCTACAC TTGCCAGCGC CCTAGCGCCC GCTCCTTTCG CTTTCTTCCC 1601 TTCCTTTCTC GCCACGTTCG CCGGCTTTCC CCGTCAAGCT CTAAATCGGG 1651 GGCTCCCTTT AGGGTTCCGA TTTAGTGCTT TACGGCACCT CGACCCCAAA 170 1 AAACTTGATT TGGGTGATGG TTCACGTAGT GGGCCATCGC CCTGATAGAC 1751 GGTTTTTCGC CCTTTGACGT TGGAGTCCAC G TTCTTTAAT AGTGGACTCT 1801 TGTTCCAAAC TGGAACAACA CTCAACCCTA TCTCGGGCTA TTCTTTTGAT 1851 TTATAAGGGA TTTTGCCGAT TTCGGCCTAT TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT 1901 TTAACAAAAA TTTAACGCGA ATTTTAACAA AATATTAACG TTTACAATTT 1951 TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG 2001 CCCCGACACC CGCCAACACC CGCTGACGCG CCCTGACGGG CTTGTCTGCT 2051 CCCGGCATCC GCTTACAGAC AAGCTGTGAC CGTCTCCGGG AGCTGCATGT 2101 GTCAGAGGTT TTCACCGTCA TCACCGAAAC GCGCGAGACG AAAGGGCCTC 2151 GTGATACGCC TA TTTTTA TA GGTTAATGTC ATGATAATAA TGGTTTCTTA 2201 GACGTCAGGT GGCACTTTTC GGGGAAATGT GCGCGGAACC CCTATTTGTT 2251 TA TTTTTC TA AATACATTCA AATATGTATC CGCTCATGAG ACAATAACCC 2301 TGATAAATGC TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA GTATTCAACA 2351 TTTCCGTGTC GCCCTTATTC CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT 2401 TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA AAGATGCTGA AGATCAGTTG 2451 GGTGCACGAG TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG GTAAGATCCT 2501 TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG 2551 TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTA TTGACGCCGG GCAAGAGCAA 2601 CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG AGTACTCACC 2651 AGTCACAGAA AAGCATCTTA CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA 2701 GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG CGGCCAACTT ACTTCTGACA 2751 ACGATCGGAG GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA ACATGGGGGA 2801 TCATGTAACT CGCCTTGATC GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC 2851 CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG TAGCAATGGC AACAACGTTG 2901 CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC GGCAACAATT 2951 AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG 3001 CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT 3051 GGGTCTCGCG GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG 3101 TATCGTAGTT ATCTACACGA CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA 3151 ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC TGATTAAGCA TTGGTAACTG 3201 TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG ATTG ATTTAA AACTTCATTT 3251 TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTG ATAAT CTCATGACCA 3301 AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA 3351 AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG 3401 CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC 3451 AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG 3501 ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA 3551 GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG 3601 TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA 3651 CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG 3701 CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC 3751 AGCGTGAGCT ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC 3801 AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT 3851 TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC 3901 TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA 3951 TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG 4001 GCCTTTTGCT CACATGT
ITR 5': 1-141 bp
Promotor miniCMV: 156-566 bp
hIns: 580-926 bp
SV40 poIyA: 940-1238 bp
ITR 3': 1280-1420 bp
SEQ ID N.°: 24 Promotor miniCMV equivalente
[0201] TAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTAAC
TG G CTT AT CG AAATT AAT ACG ACTCA
Constructo de referencia O: miniCMV-hlns-bGH (SEQ ID N.°:25)
[0202]
Figure imgf000068_0001
Secuencia de plásmido pAAV-miniCMV-hlns-bGH
[0203]
1 GCTCATGCTC TGGAAGATCT CGATTTAAAT GCGGCCGCAG GAACCCCTAG
51 TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC
1 01 GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT 15 1 GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGGG GCGCCTGATG CGGTATTTTC 201 TCCTTACGCA TCTGTGCGGT ATTTCACACC GCATACGTCA AAGCAACCAT 251 AGTACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG 30 1 CGCAGCGTGA CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC 35 1 TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC 4 01 TAAATCGGGG GCTCCCTTTA GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT ACGGCACCTC 4 51 GACCCCAAAA AACTTGATTT GGGTGATGGT TCACGTAGTG GGCCATCGCC 50 1 CTGATAGACG GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTCTTTAATA 551 GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGGCTAT 6 01 TCTTTTG ATT TATAAGGGAT TTTGCCGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA 6 51 TGAGCTGATT TAACAAAAAT TTAACGCGAA TTTTAACAAA ATATTAACGT 70 1 TTACAATTTT ATGGTGCACT CTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCATAG 75 1 TTAAGCCAGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC 301 TTGTCTGCTC CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA 85 1 GCTGCATGTG TCAGAGGTTT TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGACGA 90 1 AAGGGCCTCG TGATACGCCT ATTTTTATAG GTTAATGTCA TGATAATAAT 95 1 GGTTTCTTAG ACGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC 1001 CTATTTG TTT ATTTTTC TA A ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA 1051 CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG 1101 TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC 1151 TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA 1201 GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG 1251 TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA 1301 CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG 1351 CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA 1401 GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG 1451 AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA 1501 CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA 1.551 CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG 1601 AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA 1651 ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG 1701 GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC 1751 TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC 1801 GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA 1851 GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG 1901 ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT 1951 TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA 2001 ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC 2051 TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC 2101 CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT 2151 AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT 2201 TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC 2251 AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA 2301 CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC 2351 TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG 2401 GACTCAAGAC GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG 2451 GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA 2501 rafe» GATACCTACA GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA < O£* w C 1 C <*«* 1 JL. AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC 2601 GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT 2651 TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG 2701 CGGAGCCTAT GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC 2751 CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTCCTG CAGGCAGCTG CGCGCTCGCT 2801 CGCTCACTGA GGCCGCCCGG GCAAAGCCCG GGCGTCGGGC GACCTTTGGT 2851 CGCCCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC AGAGAGGGAG TGGCCAACTC 2901 CATCACTAGG GGTTCCTGCG GCCGCGATAT CTATGCCAAG TACGCCCCCT 2951 ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG CCCAGTACAT 3001 GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCATCG 3051 CTATTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACATCAATGG GCGTGGATAG 3101 CGGTTTGACT CACGGGGATT TCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG 3151 GAGTTTGTTT TGGCACCAAA ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAACA 3201 ACTCCGCCCC ATTGACGCAA ATGGGCGGTA GGCGTGTACG GTGGGAGGTC 3251 TATATAAGCA GAGCTCTCTG GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTAACTGGC 3301 TTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TTGCTAGCGT 3351 CGACCTTCTG CCATGGCCCT GTGGATGCGC CTCCTGCCCC TGCTGGCGCT 3401 GCTGGCCCTC TGGGGACCTG ACCCAGCCGC AGCCTTTGTG AACCAACACC 3451 TGTGCGGCTC AGATCTGGTG GAAGCTCTCT ACCTAGTGTG CGGGGAACGA 3 501 raS» GGCTTCTTCT ACACACCCAG GACCAAGCGG GAGGCAGAGG ACCTGCAGGT 3551 GGGGCAGGTG GAGCTGGGCG GGGGCCCTGG TGCAGGCAGC CTGCAGCCCT 3601 TGGCCCTGGA GGGGTCGCGA CAGAAGCGTG GCATTGTGGA ACAATGCTGT 3651 ACCAGCATCT GCTCCCTCTA CCAGCTGGAG AACTACTGCA ACTAGACGCA 3701 GCCGTCGACG GTACCAGCGT GGAGCTCGCT GATCAGCCTC GACTGTGCCT 3751 TCTAGTTGCC AGCCATCTGT TGTTTGCCCC TCCCCCGTGC CTTCCTTGAC 3801 CCTGGAAGGT GCCACTCCCA CTGTCCTTTC CTAATAAAAT GAGGAAATTG 3851 CATCGCATTG TCTGAGTAGG TGTCATTCTA TTCTGGGGGG TGGGGTGGGG 3901 CAGGACAGCA AGGGGGAGGA TTGGGAAGAC AATAGCAGGC ATGCTGGGGA 3951 TGCGGTGGGC TCTATGGCCA C
ITR 5': 2777-2917 bp
Promotor miniCMV: 2932-3342 bp
hIns: 3356-3702 bp
bGH polyA: 3719-3971 bp
ITR 3': 39-179 bp
Constructo de referencia P: RSV-hGck-SV40 (SEQ ID N.°:26)
[0204]
Figure imgf000070_0001
Secuencia de plásmido pAAV-RS-hGck-SV40
[0205]
1 GTGATTTAAA TGCGGCCGCA GGAACCCCTA GTGATGGAGT TGGCCACTCC 51 CTCTCTGCGC GCTCGCTCGC TCACTGAGGC CGGGCGACCA AAGGTCGCCC 101 GACGCCCGGG CTTTGCCCGG GCGGCCTCAG TGAGCGAGCG AGCGCGCAGC 151 TGCCTGCAGG GGCGCCTGAT GCGGTATTTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG 201 TATTTCACAC CGCATACGTC AAAGCAACCA TAGTACGCGC CCTGTAGCGG 25 1 CGCATTAAGC GCGGCGGGTG TGGTGGTTAC GCGCAGCGTG ACCGCTACAC 30 1 TTGCCAGCGC CCTAGCGCCC GCTCCTTTCG CTTTCTTCCC TTCCTTTCTC 35 1 GCCACGTTCG CCGGCTTTCC CCGTCAAGCT CTAAATCGGG GGCTCCCTTT 40 1 AGGGTTCCGA TTTAGTGCTT TACGGCACCT CGACCCCAAA AAACTTGATT 45 1 TGGGTGATGG TTCACGTAGT GGGCCATCGC CCTGATAGAC GGTTTTTCGC 50 1 CCTTTGACGT TGGAGTCCAC GTTCTTTAAT AGTGGACTCT TGTTCCAAAC 55 1 TGGAACAACA CTCAACCCTA TCTCGGGCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA 60 1 TTTTGCCGAT TTCGGCCTAT TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA 65 1 TTTAACGCGA ATTTTAACAA AATATTAACG TTTACAATTT TATGGTGCAC 70 1 TCTCAGTACA ATCTGCTCTG ATGCCGCATA GTTAAGCCAG CCCCGACACC 75 1 CGCCAACACC CGCTGACGCG CCCTGACGGG CTTGTCTGCT CCCGGCATCC 80 1 GCTTACAGAC AAGCTGTGAC CGTCTCCGGG AGCTGCATGT GTCAGAGGTT 85 1 TTCACCGTCA TCACCGAAAC GCGCGAGACG AAAGGGCCTC GTGATACGCC 30 1 TATTTTTATA GGTTAATGTC ATGATAATAA TGGTTTCTTA GACGTCAGGT 35 1 GGCACTTTTC GGGGAAATGT GCGCGGAACC CCTATTTGTT TATTTTTCTA 1 00 1 AATACATTCA AATATGTATC CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC 1 05 1 TTCAATAATA TTGAAAAAGG AAGAGTATGA GTATTCAACA TTTCCGTGTC 1 10 1 GCCCTTATTC CCTTTTTTGC GGCATTTTGC CTTCCTGTTT TTGCTCACCC 1 15 1 AGAAACGCTG GTGAAAGTAA AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG 1 20 1 TGGGTTACAT CGAACTGGAT CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT 1 25 1 CGCCCCGAAG AACGTTTTCC AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG 1 30 1 TGGCGCGGTA TTATCCCGTA TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT GACTTGGTTG AGTACTCACC AGTCACAGAA
1 40 1 AAGCATCTTA CGGATGGCAT GACAGTAAGA GAATTATGCA GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG
1 50 1 GACCGAAGGA GCTAACCGCT TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT 1 55 1 CGCCTTGATC GTTGGGAACC GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA 1 60 1 GCGTGACACC ACGATGCCTG TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT 1 65 1 TAACTGGCGA ACTACTTACT CTAGCTTCCC GGCAACAATT AATAGACTGG 1 70 1 ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC AGGACCACTT CTGCGCTCGG CCCTTCCGGC 1 75 1 TGGCTGGTTT ATTGCTGATA AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG GTATCATTGC AGCACTGGGG CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA CGGGGAGTCA GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT
1 90 1 CGCTGAGATA GGTGCCTCAC TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG ATTGATTTAA AACTTCATTT TTAATTTAAA
2 00 1 AGGATCTAGG TGAAGATCCT TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA 2 05 1 ACGTGAGTTT TCGTTCCACT GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG 2 10 1 GATCTTCTTG AGATCCTTTT TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA 2 15 1 AAAAAACCAC CGCTACCAGC GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC . 'M AACTCTTTTT CCGAAGGTAA CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG TAGTTAGGCC ACCACTTCAA GAACTCTGTA
2 30 1 GCACCGCCTA CATACCTCGC TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC 2 35 1 CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC 2 40 1 CGGATAAGGC GCAGCGGTCG GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC 2 45 1 AGCTTGGAGC GAACGACCTA CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCT 2 50 1 ATGAGAAAGC GCCACGCTTC CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA
2 60 1 AACGCCTGGT ATCTTTATAG TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA 2 65 1 GCGTCGATTT TTGTGATGCT CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG 2 70 1 CCAGCAACGC GGCCTTTTTA CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT 2 75 1 CACATGTCCT GCAGGCAGCT GCGCGCTCGC TCGCTCACTG AGGCCGCCCG GGCAAAGCCC GGGCGTCGGG CGACCTTTGG TCGCCCGGCC TCAGTGAGCG
2 85 1 AGCGAGCGCG CAGAGAGGGA GTGGCCAACT CCATCACTAG GGGTTCCTGC 2 90 1 GGC C GC GATA TCCATGTTTG ACAGCTTATC ATCGCAGATC CGTATGGTGC l ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA TAGTTAAGCC AGTATCTGCT 3 00 1 CCCTGCTTGT GTGTTGGAGG TCGCTGAGTA GTGCGCGAGC AAAATTTAAG 3 05 1 CTACAACAAG GCAAGGCTTG ACCGACAATT GCATGAAGAA TCTGCTTAGG 3 10 1 GTTAGGCGTT TTGCGCTGCT TCGCGATGTA CGGGCCAGAT ATTCGCGTAT 3 15 1 CTGAGGGGAC TAGGGTGTGT TTAGGCGAAA AGCGGGGCTT CGGTTGTACG 3 20 1 CGGTTAGGAG TCCCCTCAGG ATATAGTAGT TTCGCTTTTG CATAGGGAGG 1 ! GGGAAATGTA GTCTTATGCA ATACTCTTGT AGTCTTGCAA CATGGTAACG 330 1 ATGAGTTAGC AACATGCCTT ACAAGGAGAG AAAAAGCACC GTGCATGCCG 335 1 ATTGGTGGAA GTAAGGTGGT ACGATCGTGC CTTATTAGGA AGGCAACAGA 340 1 CGGGTCTGAC ATGGATTGGA CGAACCACTA AATTCCGCAT TGCAGAGATA 345 1 TTG TATTTAA GTGCCTAGCT CGATACAATA AACGCCATTT GACCATTCAC 350 1 CACATTGGTG TGCACCTCCA AGCTGGGTAC CAGCTTCTAG AGAGATCTGC 355 1 TTCAGCTGGA GGCACTGGGC AGGTAAGTAT CAAGGTTACA AGACAGGTTT 3601 AAGGAGACCA ATAGAAACTG GGCTTGTCGA GACAGAGAAG ACTCTTGCGT 365 1 TTCTGATAGG CACCTATTGG TCTTACTGAC ATCCACTTTG CCTTTCTCTC 3701 CACAGGTGCA GCTGCTGCAG CGGTCTAGAA CTCGAGTCGA GACCATGGCG 3751 ATGGATGTCA CAAGGAGCCA GGCCCAGACA GCCTTGACTC TGGTAGAGCA 3801 GATCCTGGCA GAGTTCCAGC TGCAGGAGGA GGACCTGAAG AAGGTGATGA 3851 GACGGATGCA GAAGGAGATG GACCGCGGCC TGAGGCTGGA GACCCATGAA 3901. GAGGCCAGTG TGAAGATGCT GCCCACCTAC GTGCGCTCCA CCCCAGAAGG 395 1 CTCAGAAGTC GGGGACTTCC TCTCCCTGGA CCTGGGTGGC ACTAACTTCA 400 1 GGGTGATGCT GGTGAAGGTG GGAGAAGGTG AGGAGGGGCA GTGGAGCGTG 4051 AAGACCAAAC ACCAGATGTA CTCCATCCCC GAGGACGCCA TGACCGGCAC 410 1 TGCTGAGATG CTCTTCGACT ACATCTCTGA GTGCATCTCC GACTTCCTGG 415 1 ACAAGCATCA GATGAAACAC AAGAAGCTGC CCCTGGGCTT CACCTTCTCC 420 1 TTTCCTGTGA GGCACGAAGA CATCGATAAG GGCATCCTTC TCAACTGGAC 425 1 CAAGGGCTTC AAGGCCTCAG GAGCAGAAGG GAACAATGTC GTGGGGCTTC 430 1 TGCGAGACGC TATCAAACGG AGAGGGGACT TTGAAATGGA TGTGGTGGCA 435 1 ATGGTGAATG ACACGGTGGC CACGATGATC TCCTGCTACT ACGAAGACCA 440 1 TCAGTGCGAG GTCGGCATGA TCGTGGGCAC GGGCTGCAAT GCCTGCTACA 445 1 TGGAGGAGAT GCAGAATGTG GAGCTGGTGG AGGGGGACGA GGGCCGCATG 450 1 TGCGTCAATA CCGAGTGGGG CGCCTTCGGG GACTCCGGCG AGCTGGACGA 455 1 GTTCCTGCTG GAGTATGACC GCCTGGTGGA CGAGAGCTCT GCAAACCCCG 460 1 GTCAGCAGCT GTATGAGAAG CTCATAGGTG GCAAGTACAT GGGCGAGCTG 465 1 GTGCGGCTTG TGCTGCTCAG GCTCGTGGAC GAAAACCTGC TCTTCCACGG 470 1 GGAGGCCTCC GAGCAGCTGC GCACACGCGG AGCCTTCGAG ACGCGCTTCG 475 1 TGTCGCAGGT GGAGAGCGAC ACGGGCGACC GCAAGCAGAT CTACAACATC 480 1 CTGAGCACGC TGGGGCTGCG ACCCTCGACC ACCGACTGCG ACATCGTGCG 485 1 CCGCGCCTGC GAGAGCGTGT CTACGCGCGC TGCGCACATG TGCTCGGCGG 490 1 GGCTGGCGGG CGTCATCAAC CGCATGCGCG AGAGCCGCAG CGAGGACGTA 495 1 ATGCGCATCA CTGTGGGCGT GGATGGCTCC GTGTACAAGC TGCACCCCAG 500 1 CTTCAAGGAG CGGTTCCATG CCAGCGTGCG CAGGCTGACG CCCAGCTGCG 5051 AGATCACCTT CATCGAGTCG GAGGAGGGCA GTGGCCGGGG CGCGGCCCTG 510 1 GTCTCGGCGG TGGCCTGTAA GAAGGCCTGT ATGCTGGGCC AGTGACTCGA 5151 GCACGCTGTC GAGGCCGCTT CGAGCAGACA TGATAAGATA CATTGATGAG 520 1 TTTGGACAAA CCACAACTAG AATGCAGTGA AAAAAATGCT TTATTTGTGA 525 1 AATTTGTGAT GCTATTGCTT TATTTGTAAC CATTATAAGC TGCAATAAAC 530 1 AAGTTAACAA CAACAATTGC A TTC ATTTTA TGTTTCAGGT TCAGGGGGAG 535 1 ATGTGGGAGG TTTTTTAAAG CAAGTAAAAC CTCTACAAAT GTGGTAAAAT 540 1 CGATTAGGAT CTTCCTAGAG CATGGCTACC TAGACATGGC TCGACAGATC 545 1 AGC
ITR 5': 2758-2898 bp
Promotor RSV: 2996-3705 bp
hGck: 3730-5144 bp
SV40 polyA: 5155-5450 bp
ITR 3': 20-160 bp
Q: miniCMV-hIns-bGH(rev)-RSV-hGck-SV40 (SEQ ID N.°:27)
[0206]
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000073_0002
Secuencia de plásmido pAAV-miniCMV-hlns-bGH(rev)-RSV-hGck-SV40
[0207]
1 ATCCATGTTT GACAGCTTAT CATCGCAGAT CCGTATGGTG CACTCTCAGT 51 ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGTATCTGC TCCCTGCTTG 101 TGTGTTGGAG GTCGCTGAGT AGTGCGCGAG CAAAATTTAA GCTACAACAA 151 GGCAAGGCTT GACCGACAAT TGCATGAAGA ATCTGCTTAG GGTTAGGCGT 201 TTTGCGCTGC TTCGCGATGT ACGGGCCAGA TATTCGCGTA TCTGAGGGGA 251 CTAGGGTGTG TTTAGGCGAA AAGCGGGGCT TCGGTTGTAC GCGGTTAGGA 301 GTCCCCTCAG GATATAGTAG TTTCGCTTTT GCATAGGGAG GGGGAAATGT 351 AGTCTTATGC AATACTCTTG TAGTCTTGCA ACATGGTAAC GATGAGTTAG 401 CAACATGCCT TACAAGGAGA GAAAAAGCAC CGTGCATGCC GATTGGTGGA 451 AGTAAGGTGG TACGATCGTG CCTTATTAGG AAGGCAACAG ACGGGTCTGA 501 CATGGATTGG ACGAACCACT AAATTCCGCA TTGCAGAGAT ATTGTATTTA 551 AGTGCCTAGC TCGATACAAT AAACGCCATT TGACCATTCA CCACATTGGT 601 GTGCACCTCC AAGCTGGGTA CCAGCTTCTA GAGAGATCTG CTTCAGCTGG 651 AGGCACTGGG CAGGTAAGTA TCAAGGTTAC AAGACAGGTT TAAGGAGACC 701 AATAGAAACT GGGCTTGTCG AGACAGAGAA GACTCTTGCG TTTCTGATAG 751 GCACCTATTG GTCTTACTGA CATCCACTTT GCCTTTCTCT CCACAGGTGC 801 AGCTGCTGCA GCGGTCTAGA ACTCGAGTCG AGACCATGGC GATGGATGTC 851 ACAAGGAGCC AGGCCCAGAC AGCCTTGACT CTGGTAGAGC AGATCCTGGC 901 AGAGTTCCAG CTGCAGGAGG AGGACCTGAA GAAGGTGATG AGACGGATGC 951 AGAAGGAGAT GGACCGCGGC CTGAGGCTGG AGACCCATGA AGAGGCCAGT 1001 GTGAAGATGC TGCCCACCTA CGTGCGCTCC ACCCCAGAAG GCTCAGAAGT 1051 CGGGGACTTC CTCTCCCTGG ACCTGGGTGG CACTAACTTC AGGGTGATGC 1101 TGGTGAAGGT GGGAGAAGGT GAGGAGGGGC AGTGGAGCGT GAAGACCAAA 1151 CACCAGATGT ACTCCATCCC CGAGGACGCC ATGACCGGCA CTGCTGAGAT 1201 GCTCTTCGAC TACATCTCTG AGTGCATCTC CGACTTCCTG GACAAGCATC 1251 AGATGAAACA CAAGAAGCTG CCCCTGGGCT TCACCTTCTC CTTTCCTGTG 1301 AGGCACGAAG ACATCGATAA GGGCATCCTT CTCAACTGGA CCAAGGGCTT 1351 CAAGGCCTCA GGAGCAGAAG GGAACAATGT CGTGGGGCTT CTGCGAGACG 140 1 CTATCAAACG GAGAGGGGAC TTTGAAATGG ATGTGGTGGC AATGGTGAAT 1451 GACACGGTGG CCACGATGAT CTCCTGCTAC TACGAAGACC ATCAGTGCGA 1501 GGTCGGCATG ATCGTGGGCA CGGGCTGCAA TGCCTGCTAC ATGGAGGAGA 1551 TGCAGAATGT GGAGCTGGTG GAGGGGGACG AGGGCCGCAT GTGCGTCAAT 1601 ACCGAGTGGG GCGCCTTCGG GGACTCCGGC GAGCTGGACG AGTTCCTGCT 1651 GGAGTATGAC CGCCTGGTGG ACGAGAGCTC TGCAAACCCC GGTCAGCAGC 1.701 TGTATGAGAA GCTCATAGGT GGCAAGTACA TGGGCGAGCT GGTGCGGCTT 1751 GTGCTGCTCA GGCTCGTGGA CGAAAACCTG CTCTTCCACG GGGAGGCCTC 1801 CGAGCAGCTG CGCACACGCG GAGCCTTCGA GACGCGCTTC GTGTCGCAGG 1851 TGGAGAGCGA CACGGGCGAC CGCAAGCAGA TCTACAACAT CCTGAGCACG 1 S 01 CTGGGGCTGC GACCCTCGAC CACCGACTGC GACATCGTGC GCCGCGCCTG 1951 CGAGAGCGTG TCTACGCGCG CTGCGCACAT GTGCTCGGCG GGGCTGGCGG 2001 GCGTCATCAA CCGCATGCGC GAGAGCCGCA GCGAGGACGT AATGCGCATC 2051 ACTGTGGGCG TGGATGGCTC CGTGTACAAG CTGCACCCCA GCTTCAAGGA 2101 GCGGTTCCAT GCCAGCGTGC GCAGGCTGAC GCCCAGCTGC GAGATCACCT 2151 TCATCGAGTC GGAGGAGGGC AGTGGCCGGG GCGCGGCCCT GGTCTCGGCG 2201 GTGGCCTGTA AGAAGGCCTG TATGCTGGGC CAGTGACTCG AGCACGCTGT 2251 CGAGGCCGCT TCGAGCAGAC ATGATAAGAT ACATTGATGA GTTTGGACAA 2301 ACCACAACTA GAATGCAGTG AAAAAAATGC TTTATTTGTG AAATTTGTGA 2351 TGCTATTGCT TTATTTGTAA CCATTATAAG CTGCAATAAA CAAGTTAACA 2401 ACAACAATTG CATTCATTTT ATGTTTCAGG TTCAGGGGGA GATGTGGGAG 2451 GTTTTTTAAA GCAAGTAAAA CCTCTACAAA TGTGGTAAAA TCGATTAGGA 2501 TCTTCCTAGA GCATGGCTAC CTAGACATGG CTCGACAGAT CAGCGTGATT 2551 TAAATGCGGC CGCAGGAACC CCTAGTGATG GAGTTGGCCA CTCCCTCTCT 2601 GCGCGCTCGC TCGCTCACTG AGGCCGGGCG ACCAAAGGTC GCCCGACGCC 2651 CGGGCTTTGC CCGGGCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGCTGCCTG 2701 CAGGGGCGCC TGATGCGGTA TTTTCTCCTT ACGCATCTGT GCGGTATTTC 2 7 51 ACACCGCATA CGTCAAAGCA ACCATAGTAC GCGCCCTGTA GCGGCGCATT , . ? ¡ní AAGCGCGGCG GGTGTGGTGG TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA f 5 J GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACG 2 9 01 TTCGCCGGCT TTCCCCGTCA AGCTCTAAAT CGGGGGCTCC CTTTAGGGTT 2 95 1 CCGATTTAGT GCTTTACGGC ACCTCGACCC CAAAAAACTT GATTTGGGTG 3 0 01 ATGGTTCACG TAGTGGGCCA TCGCCCTGAT AGACGGTTTT TCGCCCTTTG 3 0 51 ACGTTGGAGT CCACGTTCTT TAATAGTGGA CTCTTGTTCC AAACTGGAAC 3 10 1 AACACTCAAC CCTATCTCGG GCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTGC 3 15 1 CGATTTCGGC CTATTGGTTA AAAAATGAGC TGATTTAACA AAAATTTAAC 3 2 01 GCGAATTTTA ACAAAATATT AACGTTTACA ATTTTATGGT GCACTCTCAG TACAATCTGC TCTGATGCCG CATAGTTAAG CCAGCCCCGA CACCCGCCAA
3 3 01 CACCCGCTGA CGCGCCCTGA CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC ATCCGCTTAC 3 3 51 AGACAAGCTG TGACCGTCTC CGGGAGCTGC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC 3 4 01 GTCATCACCG AAACGCGCGA GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT 3 4 51 TATAGGTTAA TGTCATGATA ATAATGGTTT CTTAGACGTC AGGTGGCACT 3 50 1 TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TG TTTA TTTT TCTAAATACA 3 55 1 TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT 3 60 1 AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT >' ' í ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC 3 70 1 GCTGGTGAAA GTAAAAGATG CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT 3 75 1 ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC 3 80 1 GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC 3 85 1 GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 3 90 1 ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT 3 95 1 CTTACGGATG GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT 4 00 1 GAGTGATAAC ACTGCGGCCA A CTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG GGGATCATGT AACTCGCCTT
4 10 1 GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG ACGAGCGTGA 4 15 1 CACCACGATG CCTGTAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 4 20 1 GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG 4 25 1 GCGGATAAAG TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG 4 30 1 GTTTATTGCT GATAAATCTG GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA 4 35 1 TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT CCCGTATCGT AGTTATCTAC 4 40 1 ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA 4 45 1 GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 4 50 1 CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ATTTTTA ATT TAAAAGGATC 4 55 1 TAGGTGAAGA TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA 4 60 1 GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT 4 65 1 CTTGAGATCC TTTTTTTCTG CGCGTAATCT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA 4 70 1 C C AC C GC TAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TACCAACTCT 4 75 1 TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC 4 80 1 TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG 4 85 1 CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG 4 90 1 CGATAAGTCG TGTCTTACCG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA 4 95 1 AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG 5 00 1 GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG AGCTATGAGA 5 05 1 AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 5 10 1 GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCCAGG GGGAAACGCC 5 15 1 TGGTATCTTT ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG c c t a t g g a a a a a c g c c a g c a ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT GCTGGCCTTT TGCTCACATG
5 3 01 TCCTGCAGGC AGCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG CCCGGGCAAA 5 3 51 GCCCGGGCGT CGGGCGACCT TTGGTCGCCC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG 5 40 1 CGCGCAGAGA GGGAGTGGCC AACTCCATCA CTAGGGGTTC CTGCGGCCGC 5 4 51 GATAAATCGA GATCTTCCAG AGCATGAGCG TGGCCATAGA GCCCACCGCA 5 50 1 TCCCCAGCAT GCCTGCTATT GTCTTCCCAA TCCTCCCCCT TGCTGTCCTG 5 5 51 CCCCACCCCA CCCCCCAGAA TAGAATGACA CCTACTCAGA CAATGCGATG 5 6 01 CAATTTCCTC ATTTTATTAG GAAAGGACAG TGGGAGTGGC ACCTTCCAGG 5 6 51 GTCAAGGAAG GC AC GGGGGA GGGGCAAACA ACAGATGGCT GGCAACTAGA 5 7 01 AGGCACAGTC GAGGCTGATC AGC GAGCTC C AC GC TGGTAC CGTCGACGGC 5 7 51 TGCGTCTAGT TGCAGTAGTT CTCCAGCTGG TAGAGGGAGC AGATGCTGGT 580 1 ACAGCATTGT TCCACAATGC CACGCTTCTG TCGCGACCCC TCCAGGGCCA 585 1 AGGGCTGCAG GCTGCCTGCA CCAGGGCCCC CGCCCAGCTC CACCTGCCCC 590 1 ACCTGCAGGT CCTCTGCCTC CCGCTTGGTC CTGGGTGTGT AGAAGAAGCC 595 1 TCGTTCCCCG CACACTAGGT AGAGAGCTTC CACCAGATCT GAGCCGCACA 600 1 GGTGTTGGTT CACAAAGGCT GCGGCTGGGT CAGGTCCCCA GAGGGCCAGC 605 1 AGCGCCAGCA GGGGCAGGAG GCGCATCCAC AGGGCCATGG CAGAAGGTCG 610 1 ACGCTAGCAA GCTTGGGTCT CCCTATAGTG AGTCGTATTA ATTTCGATAA 615 1 GCCAGTTAAG CAGTGGGTTC TCTAGTTAGC CAGAGAGCTC TGCTTATATA 620 1 GACCTCCCAC CGTACACGCC TACCGCCCAT TTGCGTCAAT GGGGCGGAGT 625 1 TGTTACGACA TTTTGGAAAG TCCCGTTGAT TTTGGTGCCA AAACAAACTC 630 1 CCATTGACGT CAATGGGGTG GAGACTTGGA AATCCCCGTG AGTCAAACCG 635 1 CTATCCACGC CCATTGATGT ACTGCCAAAA CCGCATCACC ATGGTAATAG 640 1 CGATGACTAA TACGTAGATG TACTGCCAAG TAGGAAAGTC CCATAAGGTC 645 1 ATGTACTGGG CATAATGCCA GGCGGGCCAT TTACCGTCAT TGACGTCAAT 650 1 AGGGGGCGTA CTTGGCATAG AT
ITR 5': 5302-5442 bp
Promotor miniCMV: 6109-6519 bp
hIns: 5749-6095 bp
bGH polyA: 5480-5732 bp
Promotor RSV: 87-796 bp
hGck: 821-2235 bp
SV40 polyA: 2246-2541 bp
ITR 3': 2564-2704 bp
Constructo de referencia R: miniCMV-hIns- potenciador SV40 (SEQ ID N.°:28)
[0208]
Figure imgf000075_0001
pAAV-miniCMV-hlns- potenciador SV40 secuencia de plásmido
[0209]
GCTCATGCTC TGGAAGATCT CGATTTAAAT GCGGCCGCAG GAACCCCTAG
51 TGATGGAGTT GGCCACTCCC TCTCTGCGCG CTCGCTCGCT CACTGAGGCC
101 GGGCGACCAA AGGTCGCCCG ACGCCCGGGC TTTGCCCGGG CGGCCTCAGT 151 GAGCGAGCGA GCGCGCAGCT GCCTGCAGGG GCGCCTGATG CGGTATTTTC 201 TCCTTACGCA TCTGTGCGGT ATTTCACACC GCATACGTCA AAGCAACCAT 251 AGTACGCGCC CTGTAGCGGC GCATTAAGCG CGGCGGGTGT GGTGGTTACG 301 CGCAGCGTGA CCGCTACACT TGCCAGCGCC CTAGCGCCCG CTCCTTTCGC 351 TTTCTTCCCT TCCTTTCTCG CCACGTTCGC CGGCTTTCCC CGTCAAGCTC 401 TAAATCGGGG GCTCCCTTTA GGGTTCCGAT TTAGTGCTTT ACGGCACCTC 451 GACCCCAAAA AACTTGATTT GGGTGATGGT TCACGTAGTG GGCCATCGCC 501 CTGATAGACG GTTTTTCGCC CTTTGACGTT GGAGTCCACG TTCTTTAATA 551 GTGGACTCTT GTTCCAAACT GGAACAACAC TCAACCCTAT CTCGGGCTAT 601 TCTTTTGATT TATAAGGGAT TTTGCCGATT TCGGCCTATT GGTTAAAAAA 651 TGAGCTGATT TAACAAAAAT TTAACGCGAA TTTTAACAAA ATATTAACGT 701 TTACAATTTT ATGGTGCACT CTCAGTACAA TCTGCTCTGA TGCCGCATAG 751 TTAAGCCAGC CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC 801 TTGTCTGCTC CCGGCATCCG CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA 851 GCTGCATGTG TCAGAGGTTT TCACCGTCAT CACCGAAACG CGCGAGACGA 901 AAGGGCCTCG TGATACGCCT ATTTTTATAG GTTAATGTCA TGATAATAAT 951 GGTTTCTTAG ACGTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC 1001 CTATTTGTTT ATTTTTC TA A ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA 1051 CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG 1 10 1 TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC 1 15 1 TTCCTG TTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA 1 20 1 GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG 1 25 1 TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA 1 30 1 CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG 1 35 1 CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA 1 40 1 GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG 1 45 1 AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA 1 50 1 CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA 1 55 1 CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG 1 60 1 AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA 1651 , ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG 1 70 1 GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC 1 75 1 TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA
1 85 1 GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG 1 90 1 ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC
2 10 1 CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT 2 15 1 AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA AGAGCTACCA A CTCTTTTTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA
2 30 1 CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC 2 35 1 TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG 2 40 1 GACTCAAGAC GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG 2 45 1 GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA 2 50 1 GATACCTACA GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA - ■ u AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC 2 60 1 GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG
2 70 1 CGGAGCCTAT GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC 2 75 1 CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTCCTG CAGGCAGCTG CGCGCTCGCT 2 80 1 CGCTCACTGA GGCCGCCCGG GCAAAGCCCG GGCGTCGGGC GACCTTTGGT CGCCCGGCCT CAGTGAGCGA GCGAGCGCGC AGAGAGGGAG TGGCCAACTC
2 90 1 CATCACTAGG GGTTCCTGCG GCCGCGATAT CTATGCCAAG TACGCCCCCT ATTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG CCCAGTACAT
3 00 1 GACCTTATGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCATCG CTATTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACATCAATGG GCGTGGATAG
3 10 1 CGGTTTGACT CACGGGGATT TCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG 3 15 1 GAGTTTGTTT TGGCACCAAA ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAACA ACTCCGCCCC ATTGACGCAA ATGGGCGGTA GGCGTGTACG GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTCTCTG GCTAACTAGA GAACCCACTG CTTAACTGGC
3 30 1 TTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TTGCTAGCGT CGACCTTCTG CCATGGCCCT GTGGATGCGC CTCCTGCCCC TGCTGGCGCT
3 40 1 GCTGGCCCTC TGGGGACCTG ACCCAGCCGC AGCCTTTGTG AACCAACACC TGTGCGGCTC AGATCTGGTG GAAGCTCTCT ACCTAGTGTG CGGGGAACGA
3 50 1 GGCTTCTTCT ACACACCCAG GACCAAGCGG GAGGCAGAGG ACCTGCAGGT GGGGCAGGTG GAGCTGGGCG GGGGCCCTGG TGCAGGCAGC CTGCAGCCCT
3 60 1 TGGCCCTGGA GGGGTCGCGA CAGAAGCGTG GCATTGTGGA ACAATGCTGT ACCAGCATCT GCTCCCTCTA CCAGCTGGAG AACTACTGCA ACTAGACGCA
3 70 1 GCCGTCGACG GTACCAGCGC TGAGTCGGGG CGGCCGGCCG CTTCGAGCAG 3 75 1 ACATGATAAG ATACATTGAT GAGTTTGGAC AAACCACAAC TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT GATGCTATTG CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCAATA AACAAGTTAA CAACAACAAT TGCATTCATT
3 90 1 TTATGTTTCA GGTTCAGGGG GAGGTGTGGG AGGTTTTTTA AAGCAAGTAA AACCTCTACA AATTTGGTAA AATCGATAAG GATCTGAACG ATGGAGCGGA
4 00 1 GAATGGGCGG AACTGGGCGG AGTTAGGGGC GGGATGGGCG GAGTTAGGGG 4 05 1 CGGGACTATG GTTGCTGACT AATTGAGATG CATGCTTTGC ATACTTCTGC 4 10 1 CTGCTGGGGA GCCTGGGGAC TTTCCACACC TGGTTGCTGA CTAATTGAGA 4151 TGCATGCTTT GCATACTTCT GCCTGCTGGG GAGCCTGGGG ACTTTCCACA 4201 CCCTAACTGA CACACATTCC ACAGCGGCAA ATTTGAGC
ITR 5': 2777-2917 bp
Promotor miniCMV: 2932-3342 bp
hIns: 3356-3702 bp
Potenciador SV40 y polyA SV40: 3719-4238 bp
ITR 3': 39-179 bp
S: miniCMV-hIns- potenciador SV40 (rev)-RSV-hGck-bGH (SEQ ID N.°:29)
[0210]
Figure imgf000078_0001
Secuencia de plásmido pAAV-miniCMV-hlns-potenciador SV40 (rev)-RSV-hGck-bGH
[0211]
ITR 5': 5256-5396 bp
Promotor miniCMV: 6330-6740 bp
hIns: 5970-6316 bp
Promotor SV40 y polyA SV40: 5434-5953 bp
Promotor RSV: 87-796 bp
hGck: 821-2235 bp
bGH polyA: 2243-2501 bp
ITR 3': 2518-2658 bp
1 ATCCATGTTT GACAGCTTAT CATCGCAGAT CCGTATGGTG CACTCTCAGT
51 ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGTATCTGC TCCCTGCTTG
101 TGTGTTGGAG GTCGCTGAGT AGTGCGCGAG CAAAATTTAA GCTACAACAA
151 GGCAAGGCTT GACCGACAAT TGCATGAAGA ATCTGCTTAG GGTTAGGCGT
201 TTTGCGCTGC TTCGCGATGT ACGGGCCAGA TATTCGCGTA TCTGAGGGGA
251 CTAGGGTGTG TTTAGGCGAA AAGCGGGGCT TCGGTTGTAC GCGGTTAGGA
301 GTCCCCTCAG GATATAGTAG TTTCGCTTTT GCATAGGGAG GGGGAAATGT
351 AGTCTTATGC AATACTCTTG TAGTCTTGCA ACATGGTAAC GATGAGTTAG
401 CAACATGCCT TACAAGGAGA GAAAAAGCAC CGTGCATGCC GATTGGTGGA
451 AGTAAGGTGG TACGATCGTG CCTTATTAGG AAGGCAACAG ACGGGTCTGA
501 CATGGATTGG ACGAACCACT AAATTCCGCA TTGCAGAGAT ATTG TATTTA
551 AGTGCCTAGC TCGATACAAT AAACGCCATT TGACCATTCA CCACATTGGT
601 GTGCACCTCC AAGCTGGGTA CCAGCTTCTA GAGAGATCTG CTTCAGCTGG
651 AGGCACTGGG CAGGTAAGTA TCAAGGTTAC AAGACAGGTT TAAGGAGACC
701 AATAGAAACT GGGCTTGTCG AGACAGAGAA GACTCTTGCG TTTCTGATAG
751 GCACCTATTG GTCTTACTGA CATCCACTTT GCCTTTCTCT CCACAGGTGC
801 AGCTGCTGCA GCGGTCTAGA ACTCGAGTCG AGACCATGGC GATGGATGTC
851 ACAAGGAGCC AGGCCCAGAC AGCCTTGACT CTGGTAGAGC AGATCCTGGC
901 AGAGTTCCAG CTGCAGGAGG AGGACCTGAA GAAGGTGATG AGACGGATGC
951 AGAAGGAGAT GGACCGCGGC CTGAGGCTGG AGACCCATGA AGAGGCCAGT
1 001 GTGAAGATGC TGCCCACCTA CGTGCGCTCC ACCCCAGAAG GCTCAGAAGT 1 05 1 CGGGGACTTC CTCTCCCTGG ACCTGGGTGG CACTAACTTC AGGGTGATGC 1 10 1 TGGTGAAGGT GGGAGAAGGT GAGGAGGGGC AGTGGAGCGT GAAGACCAAA 1 15 1 CACCAGATGT ACTCCATCCC CGAGGACGCC ATGACCGGCA CTGCTGAGAT 1 20 1 GCTCTTCGAC TACATCTCTG AGTGCATCTC CGACTTCCTG GACAAGCATC 1 25 1 AGATGAAACA CAAGAAGCTG CCCCTGGGCT TCACCTTCTC CTTTCCTGTG 1 30 1 AGGCACGAAG ACATCGATAA GGGCATCCTT CTCAACTGGA CCAAGGGCTT 1 35 1 CAAGGCCTCA GGAGCAGAAG GGAACAATGT CGTGGGGCTT CTGCGAGACG 1 40 1 CTATCAAACG GAGAGGGGAC TTTGAAATGG ATGTGGTGGC AATGGTGAAT 1 45 1 GACACGGTGG CCACGATGAT CTCCTGCTAC TACGAAGACC ATCAGTGCGA 1 50 1 GGTCGGCATG ATCGTGGGCA CGGGCTGCAA TGCCTGCTAC ATGGAGGAGA 1 55 1 TGCAGAATGT GGAGCTGGTG GAGGGGGACG AGGGCCGCAT GTGCGTCAAT 1 60 1 ACCGAGTGGG GCGCCTTCGG GGACTCCGGC GAGCTGGACG AGTTCCTGCT 1 65 1 GGAGTATGAC CGCCTGGTGG ACGAGAGCTC TGCAAACCCC GGTCAGCAGC 1 70 1 TGTATGAGAA GCTCATAGGT GGCAAGTACA TGGGCGAGCT GGTGCGGCTT 1 75 1 GTGCTGCTCA GGCTCGTGGA CGAAAACCTG CTCTTCCACG GGGAGGCCTC CGAGCAGCTG CGCACACGCG GAGCCTTCGA GACGCGCTTC GTGTCGCAGG TGGAGAGCGA CACGGGCGAC CGCAAGCAGA TCTACAACAT CCTGAGCACG
1 90 1 CTGGGGCTGC GACCCTCGAC CACCGACTGC GACATCGTGC GCCGCGCCTG 1 95 1 CGAGAGCGTG TCTACGCGCG CTGCGCACAT GTGCTCGGCG GGGCTGGCGG 2 00 1 GCGTCATCAA CCGCATGCGC GAGAGCCGCA GCGAGGACGT AATGCGCATC ACTGTGGGCG TGGATGGCTC CGTGTACAAG CTGCACCCCA GCTTCAAGGA
2 10 1 GCGGTTCCAT GCCAGCGTGC GCAGGCTGAC GCCCAGCTGC GAGATCACCT 2 15 1 TCATCGAGTC GGAGGAGGGC AGTGGCCGGG GCGCGGCCCT GGTCTCGGCG GTGGCCTGTA AGAAGGCCTG TATGCTGGGC CAGTGACTCG AGCACGTGGA GCTCGCTGAT CAGCCTCGAC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT
2 30 1 TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT
2 40 1 CATTCTATTC TGGGGGGTGG GGTGGGGCAG GACAGCAAGG GGGAGGATTG 2 45 1 GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGATGC GGTGGGCTCT ATGGCCACGT 2 50 1 GATTTAAATG CGGCCGCAGG AACCCCTAGT GATGGAGTTG GCCACTCCCT 2 55 1 CTCTGCGCGC TCGCTCGCTC ACTGAGGCCG GGCGACCAAA GGTCGCCCGA 2 60 1 CGCCCGGGCT TTGCCCGGGC GGCCTCAGTG AGCGAGCGAG CGCGCAGCTG 2 65 1 CCTGCAGGGG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT CTGTGCGGTA 2 70 1 TTTCACACCG CATACGTCAA AGCAACCATA GTACGCGCCC TGTAGCGGCG 2 75 1 CATTAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC CGCTACACTT 2 80 1 GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT CCTTTCTCGC 2 85 1 CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGG CTCCCTTTAG 2 90 1 GGTTCCGATT TAGTGCTTTA CGGCACCTCG ACCCCAAAAA ACTTGATTTG GGTGATGGTT CACGTAGTGG GCCATCGCCC TGATAGACGG TTTTTCGCCC
3 00 1 TTTGACGTTG GAGTCCACGT TCTTTAATAG TGGACTCTTG TTCCAAACTG GAACAACACT CAACCCTATC TCGGGCTATT CTTTTGATTT ATAAGGGATT
3 10 1 TTGCCGATTT CGGCCTATTG GTTAAAAAAT GAGCTGATTT AACAAAAATT 3 15 1 TAACGCGAAT TTTAACAAAA TATTAACGTT TACAATTTTA TGGTGCACTC TCAGTACAAT CTGCTCTGAT GCCGCATAGT TAAGCCAGCC CCGACACCCG CCAACACCCG CTGACGCGCC CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC
3 30 1 TTACAGACAA GCTGTGACCG TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT 3 35 1 CACCGTCATC ACCGAAACGC GCGAGACGAA AGGGCCTCGT GATACGCCTA 3 40 1 TTTTTATAGG TTAATGTCAT GATAATAATG GTTTCTTAGA CGTCAGGTGG 3 45 1 CACTTTTCGG GGAAATGTGC GCGGAACCCC TATTTGTTTA TTTTTCTAAA 3 50 1 TACATTCAAA TATGTATCCG CTCATGAGAC AATAACCCTG ATAAATGCTT 3 55 1 CAATAATATT GAAAAAGGAA GAGTATGAGT ATTCAACATT TCCGTGTCGC 3 60 1 CCTTATTCCC TTTTTTGCGG CATTTTGCCT TCCTG TTTTT GCTCACCCAG 3 65 1 AAACGCTGGT GAAAGTAAAA GATGCTGAAG ATCAGTTGGG TGCACGAGTG 3 70 1 GGTTACATCG AACTGGATCT CAACAGCGGT AAGATCCTTG AGAGTTTTCG 3 75 1 CCCCGAAGAA CGTTTTCCAA TGATGAGCAC TTTTAAAGTT CTGCTATGTG 3 80 1 GCGCGGTATT ATCCCGTATT GACGCCGGGC AAGAGCAACT CGGTCGCCGC ATACACTATT CTCAGAATGA CTTGGTTGAG TACTCACCAG TCACAGAAAA
3 90 1 GCATCTTACG GATGGCATGA CAGTAAGAGA ATTATGCAGT GCTGCCATAA CCATGAGTGA TAACACTGCG GCCAACTTAC TTCTGACAAC GATCGGAGGA
4 00 1 CCGAAGGAGC TAACCGCTTT TTTGCACAAC ATGGGGGATC ATGTAACTCG 4 3 , ! CCTTGATCGT TGGGAACCGG AGCTGAATGA AGCCATACCA AACGACGAGC 4101 GTGACACCAC GATGCCTGTA GCAATGGCAA CAACGTTGCG CAAACTATTA 4151 ACTGGCGAAC TACTTACTCT AGCTTCCCGG CAACAATTAA TAGACTGGAT 4201 GGAGGCGGAT AAAGTTGCAG GACCACTTCT GCGCTCGGCC CTTCCGGCTG 4251 GCTGGTTTAT TGCTGATAAA TCTGGAGCCG GTGAGCGTGG GTCTCGCGGT 4301 ATCATTGCAG CACTGGGGCC AGATGGTAAG CCCTCCCGTA TCGTAGTTAT 4351 CTACACGACG GGGAGTCAGG CAACTATGGA TGAACGAAAT AGACAGATCG 4401 CTGAGATAGG TGCCTCACTG ATTAAGCATT GGTAACTGTC AGACCAAGTT 4451 TACTCATATA TACTTTAGAT TGATTTAAAA CTTC ATTTTT AATTTAAAAG 4501 GATCTAGGTG AAGATCCTTT TTGATAATCT CATGACCAAA ATCCCTTAAC 4551 GTGAGTTTTC GTTCCACTGA GCGTCAGACC CCGTAGAAAA GATCAAAGGA 4601 TCTTCTTGAG ATC C TTTTTT TCTGCGCGTA ATCTGCTGCT TGCAAACAAA 4651 AAAACCACCG CTACCAGCGG TGGTTTGTTT GCCGGATCAA GAGC TAC CAA 4701 CTCTTTTTCC GAAGGTAACT GGCTTCAGCA GAGCGCAGAT ACCAAATACT 4751 GTCCTTCTAG TGTAGCCGTA GTTAGGCCAC CACTTCAAGA ACTCTGTAGC 4801 ACCGCCTACA TACCTCGCTC TGCTAATCCT GTTACCAGTG GCTGCTGCCA 4851 GTGGCGATAA GTCGTGTCTT ACCGGGTTGG ACTCAAGACG ATAGTTACCG 4901 GATAAGGCGC AGCGGTCGGG CTGAACGGGG GGTTCGTGCA CACAGCCCAG 4951 CTTGGAGCGA AC GAC C TACA CCGAACTGAG ATAC C TACAG CGTGAGCTAT 5001 GAGAAAGCGC CACGCTTCCC GAAGGGAGAA AGGCGGACAG GTATCCGGTA 5051 AGCGGCAGGG TCGGAACAGG AGAGCGCACG AGGGAGCTTC CAGGGGGAAA 5101 CGCCTGGTAT CTTTATAGTC CTGTCGGGTT TCGCCACCTC TGACTTGAGC 5151 GTCGATTTTT GTGATGCTCG TCAGGGGGGC GGAGCCTATG GAAAAACGCC 5201 AGCAACGCGG CCTTTTTACG GTTCCTGGCC TTTTGCTGGC CTTTTGCTCA 5251 CATGTCCTGC AGGCAGCTGC GCGCTCGCTC GCTCACTGAG GCCGCCCGGG 5301 CAAAGCCCGG GCGTCGGGCG ACCTTTGGTC GCCCGGCCTC AGTGAGCGAG 5351 CGAGCGCGCA GAGAGGGAGT GGCCAACTCC ATCACTAGGG GTTCCTGCGG 5401 CCGCGATAAA TCGAGATCTT CCAGAGCATG AGCGCTCAAA TTTGCCGCTG 5451 TGGAATGTGT GTCAGTTAGG GTGTGGAAAG TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG 5501 CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA GTCAGCAACC AGGTGTGGAA 5551 AGTCCCCAGG CTCCCCAGCA GGCAGAAGTA TGCAAAGCAT GCATCTCAAT 5601 TAGTCAGCAA CCATAGTCCC GCCCCTAACT CCGCCCATCC CGCCCCTAAC 5651 TCCGCCCAGT TCCGCCCATT CTCCGCTCCA TCGTTCAGAT CCTTATCGAT 5701 TTTACCAAAT TTGTAGAGGT TTTACTTGCT TTAAAAAACC TCCCACACCT 5751 CCCCCTGAAC CTGAAACATA AAATGAATGC AATTGTTGTT GTTAACTTGT 5801 TTATTGCAGC TTATAATGGT TACAAATAAA GCAATAGCAT CACAAATTTC 5851 ACAAATAAAG CATTTTTTTC ACTGCATTCT AGTTGTGGTT TGTCCAAACT 5901 CATCAATGTA TCTTATCATG TCTGCTCGAA GCGGCCGGCC GCCCCGACTC 5951 AGCGCTGGTA CCGTCGACGG CTGCGTCTAG TTGCAGTAGT TCTCCAGCTG 6001 GTAGAGGGAG CAGATGCTGG TACAGCATTG TTCCACAATG CCACGCTTCT 6051 GTCGCGACCC CTCCAGGGCC AAGGGCTGCA GGCTGCCTGC ACCAGGGCCC 6101 CCGCCCAGCT CCACCTGCCC CACCTGCAGG TCCTCTGCCT CCCGCTTGGT 6151 CCTGGGTGTG TAGAAGAAGC CTCGTTCCCC GCACACTAGG TAGAGAGCTT 6201 CCACCAGATC TGAGCCGCAC AGGTGTTGGT TCACAAAGGC TGCGGCTGGG 6251 TCAGGTCCCC AGAGGGCCAG CAGCGCCAGC AGGGGCAGGA GGCGCATCCA 6301 CAGGGCCATG GCAGAAGGTC GACGCTAGCA AGCTTGGGTC TCCCTATAGT 6351 GAGTCGTATT AATTTCGATA AGCCAGTTAA GCAGTGGGTT CTCTAGTTAG 6401 CCAGAGAGCT CTGCTTATAT AGACCTCCCA CCGTACACGC CTACCGCCCA 6451 TTTGCGTCAA TGGGGCGGAG TTGTTACGAC ATTTTGGAAA GTCCCGTTGA 6501 TTTTGGTGCC AAAACAAACT CCCATTGACG TCAATGGGGT GGAGACTTGG 6551 AAATCCCCGT GAGTCAAACC GCTATCCACG CCCATTGATG TACTGCCAAA 6601 ACCGCATCAC CATGGTAATA GCGATGACTA ATACGTAGAT GTACTGCCAA 6651 GTAGGAAAGT CCCATAAGGT CATGTACTGG GCATAATGCC AGGCGGGCCA 6701 TTTACCGTCA TTGACGTCAA TAGGGGGCGT ACTTGGCATA GAT

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Constructo de expresión viral que comprende los siguientes elementos:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica una insulina enlazada operativamente a un primer promotor; b) una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa enlazada operativamente a un segundo promotor;
donde el primer y el segundo promotor se posicionan en la orientación inversa dentro del constructo de expresión y se sitúan adyacentes entre sí.
2. Constructo de expresión viral según la reivindicación 1, donde el primer promotor es un promotor CMV, preferiblemente un promotor mini CMV y/o donde el segundo promotor es un promotor RSV.
3. Constructo de expresión viral según la reivindicación 1 ó 2, donde está presente una secuencia adicional que se selecciona del grupo que consiste en: ITR, señal de poliadenilación de SV40, secuencia intensificadora de SV40, señal de poliadenilación de bGH y señal de poliadenilación y secuencia intensificadora de SV40.
4. Constructo de expresión viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la secuencia de nucleótidos que codifica una insulina tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID N.°: 1 y donde la secuencia de nucleótidos que codifica una glucoquinasa tiene al menos un 80% de identidad con la SEQ ID N.°: 2.
5. Constructo de expresión viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el constructo está representado por una secuencia de nucleótidos que comprende:
- pares de bases 1-4663 de la SEQ ID N.°: 11 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma;
- pares de bases 1-3925 de la SEQ ID N.°: 15 o una secuencia con al menos un 90% de identidad de la misma;
- pares de bases 87-2704 y 5302-6519 de la SEQ ID N.°: 27 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma; o
- pares de bases 87-2658 y 5256-6740 de la SEQ ID N.°: 29 o una secuencia con al menos un 90% de identidad con la misma.
6. Vector viral que comprende un constructo de expresión viral como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho vector viral es un vector de retrovirus, un vector de adenovirus, un vector de virus adenoasociado, un vector de herpesvirus, un vector de virus de polioma o un vector de virus vaccinia.
7. Vector viral que comprende un constructo de expresión viral según la reivindicación 5, donde dicho vector viral es un vector de virus adenoasociado.
8. Vector viral según la reivindicación 7, donde dicho vector viral es un vector AAV1.
9. Constructo de expresión viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para su uso como un medicamento.
10. Constructo de expresión viral o vector viral para su uso según la reivindicación 9, donde el medicamento es para prevenir, retrasar, curar, revertir y/o tratar una diabetes.
11. Composición que comprende un constructo de expresión viral o un vector viral según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la composición es preferiblemente una composición farmacéutica, dicha composición farmacéutica comprende un portador, adyuvante, diluyentes, solubilizador, relleno, conservante y/o excipiente farmacéuticamente aceptables.
12. Composición según la reivindicación 11, donde dicha composición se utiliza como medicamento, preferiblemente para prevenir, retrasar, curar, revertir y/o tratar una diabetes.
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