ES2901575A1 - Polinucleótido para expresión fisiológica en células T - Google Patents

Abstract

Polinucleótido para expresión fisiológica en células T. Sistema mejorado para generar células T inmunoterapéuticas que comprenden un receptor de antígeno quimérico (CAR).

Description

DESCRIPCIÓN

Polinucleótido para expresión fisiológica en células T

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a una nueva tecnología para generar células T inmunoterapéuticas. En particular, la invención proporciona un sistema mejorado para generar células T inmunoterapéuticas que comprenden un receptor de antígeno quimérico (CAR).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas de antígeno autólogo generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T utilizadas para la inmunoterapia adoptiva se pueden generar mediante la expansión de las células T específicas de antígeno o la redirección de las células T mediante ingeniería genética. La transferencia de células T específicas de antígenos virales es un procedimiento bien establecido que se utiliza para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y neoplasias malignas raras relacionadas con virus. Del mismo modo, se ha demostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor tienen éxito en el tratamiento del melanoma.

Se han generado con éxito nuevas especificidades en las células T mediante la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígenos quiméricos (CAR). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una sola molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende la luz 25 y fragmentos variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un conector flexible. Los restos de unión basados en dominios de receptor o ligando también se han usado con éxito. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas gamma del receptor CD3zeta o Fc. Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de células T, sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada y 30 actividad antitumoral in vivo. Los dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134) y 4-1BB (CD137) se han agregado solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de células T modificadas con CAR2. Los CAR han permitido redirigir con éxito las células T contra los antígenos expresados en la superficie de las células tumorales de diversas neoplasias, incluidos linfomas y tumores sólidos. CD19 se ha presentado como un objetivo atractivo para la inmunoterapia porque la gran mayoría de la leucemia linfoblástica aguda B (ALL-B) 5 expresa de manera uniforme CD19, mientras que la expresión está ausente en las células no hematopoyéticas, así como en las células mieloides, eritroides, T y hueso células madre de médula. Los ensayos clínicos dirigidos a CD19 en tumores malignos de células B están en marcha con respuestas antitumorales alentadoras. La mayoría infunde las células T genéticamente modificadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) con especificidad derivada de la región scFv de un anticuerpo monoclonal de ratón específico para CD19 FMC63. Sin embargo, todavía existe la necesidad de mejorar la construcción de CAR que muestre una mejor compatibilidad con la proliferación de células T, a fin de permitir que las células que expresan tales CAR alcancen un nivel significativo ventaja clínica. En este sentido y, a pesar del claro beneficio para los pacientes tratados con CAR-T, las tecnologías reales que utilizan 15 promotores fuertes para expresar CAR vienen con un lado negativo. Se han reportado efectos secundarios graves, incluyendo muertes de pacientes. Principalmente debido a un síndrome de liberación de citoquinas (SRC) asociado con la hiperactividad de las células CAR-T en los primeros días después de la infusión. Además, un porcentaje significativo de pacientes que respondieron inicialmente, recayeron como consecuencia de reducir la longevidad (y eficacia) de las células CAR-T administradas. Eyquem, Mansilla-Soto y col. 20 ya han demostrado que la expresión de tipo TCR mejora la actividad antileucémica de las células CAR-T utilizando sistemas de edición del genoma para expresar transgenes a través del promotor del locus TRAC. Sin embargo, las estrategias de edición del genoma utilizan tecnologías muy sofisticadas difíciles de implementar en la práctica clínica.

Por lo tanto, es necesario desarrollar polinucleótidos que imiten el patrón de expresión de TCR de una manera muy precisa, que reduzcan de 3 a 4 veces la expresión del transgén 8-24 h después de la activación de las células T, y que vuelvan a recuperar su expresión a las 48-72 h.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig. 1. LV que expresan eGFP a través de dos promotores B2M sintéticos. A) Se diseñaron dos promotores B2M combinando diferentes regiones reguladoras del locus B2M humano como se muestra en la figura. Se muestran las secuencias completas de ambos promotores sintéticos. Como se puede observar, la principal diferencia entre ambas construcciones es la inserción del potenciador B2M en el 3 '(B2M2) o en el 5' (B2M1) del TSS. B) Esquema de los LV que expresan eGFP a través de los promotores sintéticos B2M1 y B2M2. C) Control de LV que expresa eGFP a través del promotor EF1-alfa. LTR: repeticiones terminales largas; eGFP: proteína fluorescente verde mejorada; WPRE: virus de la hepatitis de la marmota (WHP) Elemento regulador postranscripcional.

Fig. 2. La expresión de la proteína CD3 / TCR disminuye en respuesta a estímulos anti-CD3 / CD28 en células T primarias. A) Se aisló una población pura de células T primarias humanas y se estimuló con anti-CD3 / CD28 (TransAct, Miltenyi) a las 0h y se determinó la expresión de CD3 (componente esencial del receptor de células T, TCR) mediante FACS y análisis de ARNm en la indicada veces. B) La expresión de pliegues indicó la relación relativa entre la mediana de la intensidad de fluorescencia de CD3 en la población de CD3 en comparación con el MeFI de CD3 en la población de CD3 dividido por esa expresión a las 0 h. Relación relativa = [CD3MeFI de puerta CD3 / CD3 MeFI de CD3- puerta en TIME] / CD3 MeFI de CD3 puerta / CD3 MeFI de CD3- puerta a 0h]. C) La expresión de pliegue se refiere a la relación relativa entre el ARNm de CD3 en comparación con el ARNm de GAPDH (utilizado como control interno) dividido a esa expresión a las 0 h. Relación relativa = [expresión de CD3 / expresión de GAPDH a la HORA] / [expresión de CD3 / expresión de GAPDH a las 0 h].

Fig. 3. La expresión dirigida por GFP por el promotor quimérico B2M imitó el patrón fisiológico CD3 / TCR después de la activación en contraste con el promotor EF1-alfa. A) Se aislaron y activaron células T primarias humanas para la transducción con los vectores lentivirales (LV) para obtener niveles similares de expresión (~ 30-50%). Las células se dejaron reposar durante 10 días y luego se estimularon con anti-CD3 / CD28 para imitar una estimulación fisiológica del complejo de superficie TCR / CD3. La expresión de CD3 y eGFP se evaluó simultáneamente en los momentos indicados tanto a nivel de proteína (FACS) como de ARNm. ( población no transducida) dividida en esa expresión a las 0 h). C) El eje Y izquierdo indica la proporción relativa de ARNm de CD3 y el eje Y derecho se refiere a la proporción relativa de expresión de ARNm de GFP. Relación relativa = [expresión de GFP / expresión de GAPDH en el TIEMPO] / [expresión de GFP / expresión de GAPDH a las 0 h].

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los autores de la presente invención han desarrollado un sistema que permite la expresión de CAR siguiendo el patrón de expresión de TCR, evitando los altos niveles de expresión en la superficie de las células T ,que se han asociado con una terapia ineficiente a largo plazo o con efectos secundarios peligrosos que amenazan la vida, como la tormenta de citoquinas. Los autores de la invención han seleccionado LV como el mejor sistema para lograr una expresión estable y las regiones reguladoras del locus B2M como un buen candidato para expresar los CAR que imitan el patrón de expresión de TCR después de la estimulación de CD3 / CD28, tanto a niveles de proteína como de ARNm.

En base a las regiones reguladoras de B2M, los autores de la invención han creado dos promotores sintéticos que incluyen la mayoría de las regiones reguladoras de locus B2M en un tamaño reducido que nos permite insertarlo en un esqueleto LV.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido, de ahora en adelante polinucleótido de la invención, de secuencia SEQ ID NO: 1, o que presente una identidad con la SEQ ID NO: 1 de al menos:

a. Un 80%

b. Un 85%

c. Un 90%

d. Un 95%

e. Un 99%

SEQ ID NO: 1

1161 bp

aattcggcatgcttatcgatttggtccttccttacttgcccctttcggcggggagcaggggaggggtctgggggaggcgtcg cccgggaaagcctgtctgctgcagcctaaccagggcttttgcgggagcgcatggcttttggctgtaattcgtgcatttttaac aaaaacgcctgccttctgcgtgagattctccagagcaaactgggcggcatgggccctgtggtcttttcgtacacacggctt cctctttggctctttgcctggttgtttccaacatgtactgtgcctcttactttcggttttgaaaacatgagggggttgggcgtggta gcttacgcctgtaatcccagcacttagggaggccgaggcgggaggatggcttgaggtccgtagttgagaccagcctgg gctgctccggtggctgaggcgggaggatctcttgagcttaggcttttgagcagaaagagaaaagaaaagaaagaaag aagtgtgaatacaatctcacaaaatcttgccgccttccctcaatcattttcaataatcccaacactttgggaggccaaggca ggctgatcactctcaggaactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaat tgctatgtgtcctcactgttcctcttacaaaagatctgtggactccaccaccacgaaatggcggcaccttatttatggtcaca gaatgatgtacctagagggcgctggaagctctaaagccctagcagttactgcttttactattagtggtcgtttttttctcccccc cgccccccgacaaatcaacagaacaaagaaaattacctaaacacttcttaaacatcacgagactctaagaaaaggaa actgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggagacggtccctgcgggcct tgtcctgattggctgggccgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggc cgagtgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctatccagcgagagactctccta ccctcccgctggcgcgcccgg

En concreto, el polinucleótido de la invención, también llamado B2M_EWP1, es una secuencia de 1161 nucleótidos que contiene fragmentos de B2 microglobulina (B2M).

El polinucleótido se incluyen en vectores lentivirales en vista de expresarse de forma estable en las células.

Para dirigir el polipéptido transmembrana hacia la vía secretora de una célula huésped, una secuencia de señal (también conocida como secuencia líder, prepro secuencia o pre secuencia) puede ser proporcionada en la secuencia de polinucleótidos o secuencia de vector de la invención. La secuencia señal secretora está operativamente ligada a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se colocan para dirigir el nuevo polipéptido sintetizado en la vía secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en 5 'con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias señal secretoras pueden colocarse en cualquier otra parte de la secuencia de ácido nucleico de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., Patente de EE.UU. 5,037,743; Holland et al., Patente de Estados Unidos N° 5.143.830). Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, una considerable variación de secuencia es posible entre estas moléculas de polinucleótidos. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención tiene codones optimizados para la expresión en células de mamífero, preferiblemente para expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de tales especies, tales codones codificando los aminoácidos como los codones que se intercambian.

Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una construcción genética, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención. Preferiblemente, la construcción genética de la invención es un vector viral, y más preferiblemente un vector lentiviral.

Más preferiblemente, la construcción genética de la invención se encuentra operativamente unido a CAR para impulsar su expresión, y en donde, preferiblemente, que CAR, comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular.

CÉLULAS DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula, de ahora en adelante célula de la invención, que comprende el polinucleótido de la invención, o la construcción genética de la invención. En una realización preferida de este aspecto, la célula de la invención es una célula inmune. Más preferiblemente, se prefieren poblaciones de células de la invención.

En una realización particular abarcada, la invención se refiere a un método de preparación células inmunes para inmunoterapia que comprenden la introducción en dichas células inmunitarias del polinucleótido, construcción genética o vector según la presente invención, y expandir dichas células. En una realización particular, la invención se refiere a un método de ingeniería de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula y expresar en la superficie de dicha célula al menos un CAR como se ha descrito arriba. En una realización particular, el método comprende transformar o transducir la célula con al menos un polinucleótido o vector que codifica CAR como se describe anteriormente, y expresar dichos polinucleótidos en dicha célula.

En otra realización, dicho método comprende además una etapa de modificar genéticamente dicha celular inactivando al menos un gen que expresa un componente del TCR, una diana para un agente inmunosupresor, el gen HLA y/o un gen de punto de control inmunológico como PD1 o CTLA-4. En una realización preferida, dicho gen se selecciona del grupo que consiste en TCRalpha, TCRbeta, CD52, GR, PD1 y CTLA-4. En una realización preferida dicho método comprende, además, introducir en dichas células T una endonucleasa de corte raro capaz de inactivar selectivamente mediante la escisión del ADN dichos genes. En una realización más preferida, dicha endonucleasa de corte raro TALE-nucleasa o endonucleasa Cas9.

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la introducción de CAR en una célula utilizando vectores de expresión. Como ejemplo no limitativo, dicho CAR puede introducirse como transgenes codificado por un vector lentiviral.

Células inmunes

La presente invención también se refiere a células o líneas celulares aisladas susceptibles de ser obtenidas por dicho método para diseñar células. En particular, dicha célula aislada comprende al menos un CAR y un promotor de B2 microglobulina, preferiblemente el polinucleótido de la invención, en particular de SEQ ID NO 1, operablemente unido al CAR para impulsar su expresión. En otra realización, dicha célula aislada comprende una población de CAR y promotores del locus B2 microglobulina, en particular de SEQ ID NO 1, operativamente enlazada a los CAR para impulsar su expresión, cada uno comprende diferentes dominios de unión a ligando extracelular. Células inmunes de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión del antígeno.

En el alcance de la presente invención también se incluye una célula inmunitaria aislada, preferiblemente una célula T obtenida según cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Dicha célula inmune se refiere a una célula de origen hematopoyético involucrada funcionalmente en la iniciación y/o ejecución de una respuesta inmune innata y/o adaptativa. Dicha célula inmune según la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de cordón umbilica, células progenitoras, células madre de la médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34 . Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica asesina, un mastocito, una célula NK, una célula B o célula T. En una realización preferida es una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares. En otra realización, dicha célula puede derivar del grupo que consiste en linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8 . Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, se puede obtener una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos. Las células se pueden obtener de una serie de fuentes no limitantes, incluidas las células mononucleares de sangre periféricas, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas realizaciones de la presente invención, se pueden emplear cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otra realización, dicha célula se puede derivar de un donante sano, de un paciente con diagnóstico de cáncer o de un paciente con diagnóstico de infección. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también está abarcada una línea celular obtenida de una célula T transformada de acuerdo con el método descrito previamente. Células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de ser obtenidas por el método anterior se engloban en el alcance de la presente invención.

Activación y expansión de células T

Ya sea antes o después de la generación de las células T transformadas o transducidas, incluso si las células inmunes modificadas de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión al antígeno, las células inmunes, en particular las células T de la presente invención se puede activar y expandir adicionalmente generalmente usando métodos como el descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 6.352.694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7.067.318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. núm. 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro o in vivo. Generalmente, las células T de la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo CD3/TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para las células T. Por ejemplo, productos químicos como el ionóforo de calcio A23187, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), o lectinas mitogénicas como fitohemaglutinina (PHA) se pueden utilizar para crear una señal de activación para la célula T.

Como ejemplos no limitantes, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro, por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de proteína quinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, Medios Esenciales Mínimos o Medio RPMI1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que pueden contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluido el suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGF y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de las células. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores como N-acetilcisteína y 2- mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea sin suero o complementado con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocinas suficiente para el crecimiento y expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen solo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se van a infundir en un sujeto. Las células diana se mantienen en las condiciones necesarias para apoyar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura adecuada (por ejemplo, 37 ° C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5% de CO2). Células T que han sido expuestas a diversos tiempos de estimulación pueden presentar diferentes características.

En otra realización particular, dichas células pueden expandirse mediante co-cultivo con tejido o células. Dichas células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo, en la sangre del sujeto después de administrar dicha célula en el sujeto.

COMPOSICIONES DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende un polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, o la célula de la invención. En una realización preferida, la composición de la invención comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición de la invención es una composición farmacéutica. En otra realización preferida, la composición de la invención comprende uno o más principios activos adicionales.

Otro aspecto de la invención se refiere al polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, para su uso en terapia.

Otro aspecto de la invención se refiere al polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida, el cáncer se selecciona de la lista que consiste en neoplasias, neoplasias de células B, linfoma, leucemia y/o mieloma.

Las células aisladas obtenidas por los diferentes métodos o la línea celular derivada de dicha célula aislada como se describió previamente, pueden usarse como un medicamento. En otra realización, dicho medicamento se puede utilizar para tratar el cáncer, particularmente para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia en un paciente que lo necesite. En otra realización, dicha célula aislada según la invención o línea celular derivada de dicha célula aislada se puede utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita.

En otro aspecto, la presente invención se basa en métodos para tratar a pacientes que necesitan del mismo, comprendiendo dicho método al menos uno de los siguientes pasos:

(a) proporcionar un polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, y preferiblmente una célula inmunitaria obtenible mediante cualquiera de los métodos anteriormente descrito;

(b) Administrar el polinucleótido de la invención, la construcción genética de la invención, la célula de la invención, o la composición de la invención, o más preferiblemente dichas células inmunes transformadas, a dicho paciente.

En una realización, dichas células T de la invención pueden experimentar una expansión sólida de células T in vivo y pueden persistir durante un período de tiempo prolongado.

Dicho tratamiento puede ser paliativo, curativo o profiláctico. Puede ser parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogas, significa que las células, la línea celular o la población de células utilizadas para tratar pacientes son procedente de dicho paciente. Por alogénico se entiende que las células o población de células utilizadas para el tratamiento de pacientes no se originan en dicho paciente, sino en un donante.

Las células que se pueden usar con los métodos descritos se describen en la sección anterior. El tratamiento se puede utilizar para tratar a pacientes diagnosticados con cáncer. Los cánceres que pueden tratarse puede comprender tumores no sólidos (como tumores hematológicos, que incluyen, entre otros, LLA pre-B (indicación pedriática), LLA del adulto, linfoma de células del manto, células B grandes difusas linfoma y similares). Tipos de cánceres a tratar con los CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, ciertas leucemias o neoplasias linfoides. También se incluyen tumores/cánceres en adultos y tumores/cánceres pediátricos. Puede ser un tratamiento en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia de anticuerpos, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia de células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

Según una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse en pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención preferiblemente se basa en células o población de células, que se han hecho resistentes al menos a un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica un receptor para tal agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debe ayudar a la selección y expansión de las células T según la invención dentro del paciente.

La administración de células o población de células según la presente invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluso mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en este documento puede administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, por vía intranodal, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática, o intraperitonealmente. En una realización, las composiciones celulares de la presente invención son preferiblemente administrado por inyección intravenosa.

La administración de las células o población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluidos todos los números enteros valores de números de celda dentro de esos rangos. Las células o población de células pueden ser administradas en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad efectiva de células se administran como dosis única. En otra realización, dicha cantidad efectiva de células se administran como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración es dentro del juicio del médico responsable y depende de la condición clínica del paciente. Las células o la población de células se pueden obtener de cualquier fuente, como sangre, bancos o un donante, incluyendo el propio paciente. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los rangos óptimos de cantidades eficaces de un tipo de célula dado para una enfermedad o afecciones particulares, se encuentra dentro del conocimiento de la técnica.

Una cantidad eficaz o efectiva significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico.

La dosis administrada dependerá de la edad, salud y peso del paciente destinatario, tipo de tratamiento concurrente, si lo hubiera, frecuencia del tratamiento y naturaleza del efecto deseado. En otra realización, dicha cantidad efectiva de células o composición que comprenden esas células se administran por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En ciertas realizaciones de la presente invención, las células se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento, que incluyen, entre otros, el tratamiento con agentes como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, citarabina (también conocida como ARA-C) o nataliziimab, tratamiento para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En otras realizaciones, las células T de la invención pueden ser utilizado en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la fosfatasa dependiente del calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhibir la quinasa p70S6 que es importante para el crecimiento señalización inducida por factores (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander y col. 1993). En una realización adicional, las composiciones de células de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o a continuación de) un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando quimioterapia agentes como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos como OKT3 o CAMPATH. En otra forma de realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de una terapia ablativa de células B, como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, los sujetos pueden someterse a tratamiento estándar con quimioterapia de dosis alta seguida de un transplante de células madre de sangre periférica. En ciertas realizaciones, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunes expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

Otras definiciones

- A menos que se especifique lo contrario, "un", "uno", "el," y "al menos uno" se utilizan indistintamente y significa uno o más de uno.

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica son designado aquí según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de glutamina, R significa Arg o residuo de arginina y D significa Asp o residuo de ácido aspártico.

- Sustitución de aminoácidos significa la sustitución de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo, el reemplazo de un residuo de arginina con un residuo de glutamina en la secuencia de un péptido es una sustitución de aminoácidos.

- Los nucleótidos se designan como sigue: se utiliza el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g ó a (nucleótidos de purina), k representa g ó t, s representa g ó c, w representa a ó t, m representa a ó c, y representa t ó c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a ó t, v representa g, a ó c, b representa g, t ó c, h representa a, t ó c, yn representa g, a, t ó c.

"Como se usa en este documento," ácido nucleico "o" polinucleótidos "se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados por ligación, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se encuentran en la naturaleza (como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos naturales (p. ej., formas enantioméricas de nucleótidos naturales) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de azúcar y/o en la base de pirimidina o purina. Las modificaciones del azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o azúcares pueden ser funcionalizados como éteres o ésteres. Además, toda la fracción de azúcar se puede reemplazar con estructuras estérica y electrónicamente similares, como azúcares aza y análogos de azúcar carbocíclico. Ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas alquiladas y pirimidinas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico se pueden unir mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces.Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) se entiende moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un receptor de células T que activa el receptor intracelular dominio para generar una proteína quimérica que exhibe una inmunidad celular específica antitarget. Generalmente, CAR consiste en un anticuerpo extracelular monocatenario (scFv) fusionado aldominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo del receptor de antígeno de células T (scFv) y tienen la capacidad, cuando se expresan en células T, de redirigir el reconocimiento de antígenos en función de la especificidad del anticuerpo monoclonal.

- Por "vector de entrega" o "vectores de entrega" se entiende cualquier vector de entrega que pueda ser utilizado en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, "contactar") o liberar dentro de las células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducir") agentes/sustancias químicas y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero no se limita a, vectores liposomales de liberación, vectores de liberación viral, vectores de liberación de fármacos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipoplexes, polyplexes, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonido), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de liberación permiten el suministro de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores como plásmidos, péptidos. En estos casos, los vectores de administración son portadores de moléculas. Por "vector de liberación" o "vectores de liberación" también se entiende los métodos de liberación destinados a realizar la transfección.

- Los términos "vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha ligado. Un "vector" en la presente invención incluye, pero no se limita a, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula lineal o circular de ADN o ARN que puede constar de una molécula cromosómica, no cromosómica, semisintética o ácidos nucleicos sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/ o expresión de ácidos nucleicos a los que están ligados (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y comercialmente disponibles.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (p. Ej. Virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa como ortomixovirus (p. ej., virus de la influenza), rabdovirus (p. Ej., Rabia y virus de la estomatitis vesicular), paramixovirus (p. Ej. Sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva como picornavirus y alfavirus, y Virus de ADN de doble cadena que incluyen adenovirus, herpesvirus (p. Ej., Virus del herpes simple tipo 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (p. ej., vaccinia, viruela aviar y canarypox). Otros virus incluyen virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C de mamíferos, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo HTLVBLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: Los virus y sus replicación, In Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por "vector lentiviral" se entiende vectores lentivirales basados en el VIH que son muy prometedores para liberación debido a su capacidad de envasado relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficiencia una amplia gama de diferentes tipos de células. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envolvente y transferencia) o más plásmidos en células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de glicoproteínas de superficie viral con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN viral se somete a una transcripción inversa, que está mediada por el complejo viral de transcriptasa inversa. El producto de la transcripción inversa es una doble hebra de ADN viral lineal, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de células infectadas. Por "vectores lentivirales integradores (o LV)", se entiende vectores tales como por ejemplo, pero sin limitarse, aquellos que son capaces de integrar el genoma de una célula diana. Por el contrario, como "vectores lentivirales no integrativos (o NILV)" se refiere a vectores de suministro de genes eficientes que no se integran el genoma de una célula diana mediante la acción del virus integrasa.

- Los vectores y vectores de liberación se pueden asociar o combinar con cualquier técnica de permeabilización celular, como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células se entiende cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivados de estos organismos para cultivos in vitro.

- Por "célula primaria" o "células primarias" se entiende las células extraídas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para crecimiento in vitro, que han sufrido muy pocas duplicaciones de población y, por lo tanto, son más representativas de los principales componentes y características de los tejidos de los que se derivan, en comparación a líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente.

Como ejemplos no limitantes, se pueden seleccionar líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; Células HEK293; Células Caco2; Células U2-OS; Células NIH 3T3; Células NSO; Células SP2; Células CHO-S; Células DG44; Células K-562, células U-937; Células MRC5; Células IMR90; Células Jurkat; Células HepG2; Células HeLa; Células HT-1080; Células HCT-116; Células Hu-h7; Células Huvec; Células Muda 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de línea celular para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también se pueden utilizar para seleccionar moléculas biológicamente activas de interés en la investigación y producción y diversos campos como químico, biocombustibles, terapéutica y agronomía, como ejemplos no limitativos.

- por "mutación" se entiende la sustitución, supresión, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/ aminoácidos en un polinucleótido (cDNA, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar la secuencia codificante de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar la estructura de la secuencia genómica o la estructura / estabilidad del ARNm codificado.

- por "variante (s)", se entiende una variante repetida, una variante, una variante de unión al ADN, una variante TALEnucleasa, una variante polipeptídica obtenida por mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula madre.

- por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o dominio de una proteína; dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína o dominio de proteína original o propiedades adicionales, o mayor o menor actividad.

- "identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar mediante la comparación de una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácidos nucléicos o aminoácidos es una función del número de nucleótodos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Se pueden usar varios algoritmos de alineación y/ o programas para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.) Y se puede utilizar con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, polipéptidos que tienen al menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad con los polipéptidos descritos en este documento y que preferiblemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como el polinucleótido que codifica dichos polipéptidos, se contemplan.

- "similitud" describe la relación entre las secuencias de aminoácidos de dos o más polipéptidos. BLASTP también puede usarse para identificar una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 87,5%, 90%, 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 99% de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia utilizando una matriz de similitud como BLOSUM45, BLOSUM62 o BLOSUM80. A menos que se indique lo contrario, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se utiliza BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de BLASTP positivos y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades BLASTP. "Identidades" de BLASTP muestra el número y fracción de residuos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y "Positivos" BLASTP muestra el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y son similares entre sí. Secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad o de similitud con las secuencias de aminoácidos descritas en este documento, se contemplan y están abarcadas por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares son deducidos utilizando el código genético y pueden obtenerse por medios convencionales. El polinucleótido que codifica una variante funcional de este tipo se produciría mediante traducción inversa de su secuencia de aminoácidos utilizando el código genético.

- "dominio transductor de señal" o "ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígenos que se une específicamente a una molécula coestimuladora análoga en una célula T, que proporciona una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, mediante la vinculación de un complejo TCR/CD3 con una molécula MHC cargada con péptido, media una respuesta de célula T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de proliferación, diferenciación y similares. El ligando coestimulador puede incluir, entre otros, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), mólecula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, tales como, pero no limitado a, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, linfocitos antígeno 1 asociado a la función (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en una célula T que específicamente se une a un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora de la célula, tales como, pero no limitado a la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limittan, a una molécula de MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando de Toll.

Una "señal coestimuladora" como se usa en este documento se refiere a una señal, que en combinación con la señal primaria, como la ligadura de TCR / CD3, conduce a la proliferación de células T y/o regulación positiva o regulación a la baja de moléculas clave.

-El término "dominio de unión a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio será capaz de interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede ser elegido para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado de enfermedad particular. Así ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con virus, bacterias e infecciones parasitarias, enfermedades autoinmunes y células cancerosas.

El término "sujeto" o "paciente" como se usa en este documento incluye a todos los miembros del reino animal, incluidos primates no humanos y humanos.

La descripción anterior de la invención permite que cualquier persona experta en esta técnica pueda hacer y usar la invención, en particular para el objeto de las reivindicaciones adjuntas, que forman parte de la descripción original.

Cuando se indica aquí un límite o rango numérico, se incluyen los puntos finales. Además, todos los valores y los subintervalos dentro de un límite o rango numérico se incluyen específicamente como si se hubieran escrito específicamente.

Varias modificaciones a las realizaciones preferidas serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y los principios genéricos definidos en este documento se pueden aplicar a otras realizaciones y aplicaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por lo tanto, esta invención no está destinada a limitarse a las realizaciones mostradas, sino que debe concederse el alcance más amplio de acuerdo con los principios y características aquí descritos.

Habiendo descrito en general esta invención, se puede obtener una mayor comprensión mediante referencia a ciertos ejemplos específicos, que se proporcionan en este documento con fines ilustrativos únicamente, y no pretenden ser limitantes a menos que se especifique lo contrario.

A menos que se defina específicamente en este documento, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado como comúnmente lo entiende un experto en los campos de la terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular. Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, con métodos y materiales adecuados que se describen en este documento. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas aquí son incorporadas por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluidas las definiciones, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no son pretende ser limitante, a menos que se especifique lo contrario. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrooket a I, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No.

4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames& S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I .Freshney, Alan R. Liss, I nc., 1987); I mmobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M . Simon, eds. -in-chief, Academic Press, I nc., New York), específicamente, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M . P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor La boratory); Immunochemical Methods I n Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental I mmunology, Volumes I -IV (D. M . Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

ESQUEMA

1. Generación in sílico de promotores quiméricos de las diferentes moléculas implicadas en la ruta de señalización del TCR.

a. Selección de las moléculas implicadas en la ruta de señalización del TCR.

b. Búsqueda en bases de datos de elementos reguladores implicados en la expresión y función promotora de las moléculas seleccionadas.

c. Diseño de las construcciones definitivas in sílico.

2. Generación de células T eGFP+, dónde eGFP se exprese bajo el control de los diferentes promotores quiméricos.

a. Clonaje de las secuencias promotoras en un vector lentiviral con GFP.

b. Producción de vectores lentivirales con las diferentes construcciones.

c. Transducción celular con los vectores virales, y estudio de la cinética de expresión de GFP, tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína.

3. Generación de células T-CAR-CD19, dónde el CAR se exprese bajo el control de los diferentes promotores quiméricos.

a. Clonaje de las secuencias promotoras en un esqueleto lentiviral que contenga el CAR.

b. Producción de vectores lentivirales con las diferentes construcciones.

c. Transducción celular con los vectores virales, y estudio de la cinética de expresión del CAR, tanto a nivel de ARNm como a nivel de proteína.

Materiales y métodos

1. Diseño de los promotores quiméricos

Se ha generado una construcción (B2M) que contiene un promotor definido por Genecopoeia (chr15:45002449-45003706). También se añadió un promotor definido por EPD (chr15:45003666-45003725) aguas abajo, y el promotor 3 definido por Switchgear. Estos dos últimos solapan parcialmente con el exón 1 de la B2M. Aguas abajo se ha colocado una región definida por Ensembl como enhancer (chr15:45004699-45004998), y en la región 3’, otro promotor definido por Switchgear que solapa con el exón 2. La construcción B2M TetO es idéntica, pero colocando la secuencia TetO aguas abajo del TSS, mientras que en la construcción B2M Enh5’, cambiamos la posición del enhancer definida por Ensembl de la región 3’ a la 5’

2. Clonaje molecular de los vectores

Las construcciones se reconstituyeron en 20 ^L de agua de agua ultrapura en condiciones de esterilidad.

a. Plásmido SEWP con los promotores quiméricos

SEWP es un plásmido que permite la expresión de eGFP bajo el control del promotor viral SFFV (del inglés spleen focus-forming virus). Se modificó este plásmido (disponible en el laboratorio) para sustituir el promotor por las construcciones quiméricas. Se realizaron las digestiones combinadas de todas las construcciones con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI (New England Biolabs) usando el buffer 2.1 (New England Biolabs) durante 1 hora y media a 37°C. Se realizó la electroforesis en gel de agarosa ultrapura, y se aislaron las bandas mediante el kit QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). Paralelamente, se digirió el esqueleto SEWP con las mismas enzimas para obtener el fragmento sin promotor. Se realizó la ligación de los promotores con los fragmentos de SEWP utilizando la DNA ligasa T4 (New England Biolabs) en una proporción inserto:vector de 7:1. La reacción se llevó a cabo durante toda la noche a 16°C. Se transformaron bacterias competentes E. coli Stbl3 (Life Technologies) con el producto de ligación, y se comprobaron las colonias positivas por PCR de colonias, con el siguiente programa: 1x (95°C, 10 min); 35x (95°C, 30 seg / 62°C, 30 seg / 72°C, 30 seg); 1x (72°C, 10 min), mediante el kit KAPA Taq PCR (Kapa Biosystems) y los siguientes cebadores (Sigma): Fw-cPPT (5’-ACAGCAGAGATCCAGTTTGG-3’) y Rv-eGFP (5’-TCACTCTCGGCATGGACG-3’) (Fig. 5). Se realizó una miniprep usando el kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) de las colonias positivas para la ligación, y el ADN plasmídico se chequeó por patrón de HindlII y por secuenciación.

b. CAR 3G con los promotores quiméricos

Para generar los plásmidos de interés, se partió de un CAR de tercera generación frente a CD19 (Creative Biolabs) que presenta el promotor EF1-a (factor de elongación 1 a, del inglés Elongation Factor 1 a). Se clonaron 4 construcciones: CD247, LCK, B2M y CD4 P1 en el esqueleto lentiviral del CAR. Para ello, se realizaron las digestiones con las enzimas Clal y EcoRI y el buffer 3.1 (New England Biolabs) en el plásmido original del CAR para liberar el promotor, y en las construcciones en pUC57 para obtener los promotores quiméricos, a 37°C durante 1 hora y media. Se aislaron las bandas de un gel de agarosa ultrapura y se realizó la ligación de igual manera. Se transformaron bacterias competentes y se volvió a chequear colonias positivas por PCR de colonias, con los cebadores Fw cPPT-clínico (5’-GTGCAGGGGAAAGAATAGTAG-3’) y Rv CD19 (5’-TACAGGACTTTCTTTCTGCC-3’). Se realizaron minipreps de las colonias positivas con el mismo kit, y se chequearon por patrón Hindlll (Fig. 8) y por secuenciación.

3. Cultivo celular

a. Cultivo de líneas celulares

Se realizó el cultivo de 4 líneas celulares. La línea celular utilizada para la producción de vectores lentivirales fue la HEK-293T (células embrionarias procedentes de riñón humano, ATCC® CRL-11268™). Son células adherentes que se cultivaron en frascos T175 con medio DMEM (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco, del inglés Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Biowest) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y un 1% de penicilina/estreptomicina (P/S; 0,5% de cada uno) (Biowest). La línea BxPC-3 (células de adenocarcinoma pancreático humano, ATCC® CRL-1687™) es también una línea celular adherente que se cultivó en frascos T25 con medio RPMI-1640 (del inglés Roswell Park Memorial Institute) (Biowest) suplementado con un 10% de FBS y un 1% de P/S. Las líneas Jurkat (de leucemia de células T aguda, ATCC® TIB-152™) y Namalwa (de linfoma de Burkitt, ATCC® CRL-1432™) son células en suspensión que se cultivan también con medio RPMI-1640 suplementado con un 10% de FBS y un 1% de P/S, ambas cultivadas en frascos T25.

Las cuatro líneas celulares se mantuvieron en incubadores con una temperatura de 37°C. Las HEK-293T se mantuvieron en una atmósfera al 10% de dióxido de carbono (CO2), mientas

que las 3 líneas restantes se mantuvieron con una atmósfera al 5% de CO2. Las células fueron pasadas 3 veces por semana, manteniendo una densidad celular aproximada de 1*106 células/mL.

b. Cultivo de células T primarias

Las células T primarias se obtuvieron a partir sangre periférica movilizada de un donante sano. Partiendo de la sangre periférica, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs, del inglés Peripheral Blood Mononuclear Cells) por centrifugación por gradiente de densidad, utilizando para ello Lymphosep (Biowest), un medio específico para separar linfocitos. La centrifugación se llevó a cabo con una duración de 30 minutos a 400g sin freno ni aceleración. Se realizaron sucesivos lavados, y se aislaron los linfocitos T de todo el cóctel celular usando el kit MACSxpress® Pan T Cell Isolation (Miltenyi Biotec), que consta de una mezcla de anticuerpos frente a la mayoría de marcadores de superficie de PBMCs a excepción de CD3, conjugados con microesferas magnéticas, por lo que constituye un método de separación magnética basado en la depleción negativa de todos los tipos celulares a excepción de las células T (CD3+). Las células T aisladas se cultivaron con medio TexMACSTM (Miltenyi Biotec), un medio específico de células T, suplementado con un 5% de suero humano AB (Biowest), un 1% de P/S y 20 UI/mL de interleuquina-2 (IL-2) (Miltenyi Biotec), mantenidas en un incubador a 37°C y 5% de CO2. Para favorecer el crecimiento celular, estas se estimularon vía TCR con T Cell TransAct™ (Miltenyi Biotec), una nanomatriz polimérica anti-CD3/anti-CD28. Las células se pasaron entre 2 y 3 veces por semana, manteniendo una densidad celular de 1*106 células/mL.

4. Producción de vectores lentivirales

La producción de vectores se realizó utilizando las células HEK-293T como células empaquetadoras. Se sembraron las células en placas de 6 pocillos (Life Sciences) presentando una confluencia mayor del 90%.

a. Transfección

Se utilizó un sistema de empaquetamiento de segunda generación, lo que implica la utilización de 3 plásmidos derivados del genoma lentiviral: 1) Plásmido de transferencia (B2M-SEWP y B2M-CAR); 2) Plásmido empaquetador (pCMV8.9) del virus del VIH, y 3) Plásmido de envuelta (pMD2.G) VSV-G, que presenta el mayor rango de infectividad. Se mantuvo entre ellos la proporción 10:7:3 respectivamente. El agente transfectante elegido fue la LipoD293TM (SigmaGen Laboratories). La transfección se realizó en DMEM sin suero y, 5 horas post-transfección, se realizó un cambio de medio con Optimen (Gibco) para eliminar la toxicidad a largo plazo de VSV-G y facilitar la posterior concentración.

b. Recogida del sobrenadante viral y concentración

Se realizaron 3 recogidas, la primera se realizó 24 horas después de la transfección, la segunda 48 horas después y la tercera, 72 horas después. Las partículas virales presentes en el sobrenadante se recogieron utilizando jeringas estériles de 5 mL (Terumo), y se filtró utilizando filtros con un tamaño de poro de 0,45 ^m (Life Sciences). La concentración de las partículas virales se llevó a cabo utilizando filtros Amicon Ultra - 15 de 100 kD (Milipore), mediante centrifugación a 1800g a 4°C. Los vectores se almacenaron a -80°C.

c. Titulación

La titulación de los vectores (unidades de transducción/mililitro; UT/mL) se realizó por cálculo de partículas eficientes mediante citometría de flujo (FACS Canto II, BD Biosciences).

5. Transducción celular

En el caso de los vectores GFP, realizó la transducción de 5 tipos celulares: Jurkat, Namalwa, HEK-293T, BxPC-3 y células T primarias. Respecto a las células Jurkat y Namalwa, se plaqueron 100.000 células por pocillo, en placas de 48 pocillos y se añadieron los vectores virales. Para mejorar la eficacia de transducción, las células se espinocularon. La espinoculación es un proceso de centrifugación a 800g, 32°C durante 1 hora para favorecer el contacto célula - vector. En el caso de las células 293T, se plaquearon también 100.000 células. Respecto a las células BxPC-3, se plaqueron 50.000 células por pocillo una placa de 24 pocillos. Finalmente, en el caso de las células T, se plaquearon 200.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y, previo a la transducción, se activaron vía TCR utilizando T Cell TransAct™ durante 24h. La transducción se realizó mediante espinoculación. En todos los casos, 5 horas post - transducción se realizó un cambio de medio y, 3 días después, se determinó el porcentaje de células transducidas mediante citometría de flujo.

En el caso de los vectores CAR, la transducción se llevó a cabo en células Jurkat y en células T primarias, siguiendo el mismo procedimiento.

6. RT-PCR

Para realizar esta técnica, se partió de aproximadamente 700.000 células T de las cual se extrajo ARN mensajero con Trizol (Ambion). Una vez obtenido el ARN mensajero, se llevó a cabo la retrotranscripción del mismo, poniendo la misma cantidad de ARNm en todas las muestras. Tras esto, se diluyó el ADN complementario (ADNc), y se llevó a cabo la PCR en tiempo real de todas las muestras por duplicado, utilizando los cebadores adjuntados en la Tabla 1.

7. Citometría de flujo

Para los experimentos de citometría de flujo, se tiñeron entre 20.000 y 50.000 células con diferentes anticuerpos, que se adjuntan en la Tabla 2.

Tabla 2 | Anticuerpos utilizados previo a la lect ^t ura por citometría de flujo.

8. Análisis estadístico de datos

El análisis estadístico de los datos se llevó a cabo utilizando GraphPad Prism 6, utilizando la media, la desviación estándar asociada a la media (SEM), y el test T de Student para datos no pareados, con dos colas y con una significancia *** para p<0,001.

Resultados

Diseño in sílico de los promotores quiméricos

El primer paso para la consecución de este trabajo fue diseñar los promotores que utilizaríamos posteriormente para regular la expresión de eGFP y del CAR.

P-2 microglobulina (B2M), se ha visto que puede presentar un patrón de expresión similar al del TCR. B2M es una proteína estructural del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I, presente en todas las células nucleadas. Su presencia es fundamental para la estabilidad de la unión antigénica a este complejo, mientras que su ausencia hace que no se puedan desarrollar las células T CD8+.

Los promotores derivados de B2M se diferencian en la presencia o ausencia de la región TetO, así como en la posición del enhancer definido por Ensembl.

Tras esto, clonamos los promotores en esqueletos lentivirales GFP y seleccionamos las construcciones para clonarlos en esqueletos lentivirales que contienen el CAR (Fig. 1A).

Generación de células T GFP+ con los promotores quiméricos

Una vez tenemos nuestros promotores clonados en un esqueleto lentiviral GFP+, generamos vectores lentivirales para poder transducir células T primarias, lo que nos permitirá generar células T que expresen nuestro gen reportero eGFP bajo cada uno de los promotores previamente diseñados.

Generamos los vectores lentivirales siguiendo el procedimiento explicado con anterioridad y, paso previo a transducir células T, se calculó el título de nuestros vectores. Una vez titulados nuestros vectores virales, seguimos el mismo proceso para transducir células T primarias previamente aisladas, partiendo de una población de células T (CD3+) mayor del 70%.

B2M mimetiza el patrón de expresión del TCR

Para estudiar la expresión de GFP bajo el control de los promotores derivados de B2M, se estudiaron tanto la proteína como el ARN mensajero. Así, generamos las cinéticas de proteína y de mensajero de GFP y CD3.

Los datos se analizaron a partir de la mediana de fluorescencia tanto de GFP como del fluorocromo conjugado con el anticuerpo que va dirigido frente a CD3 en los diferentes puntos temporales

Respecto a los promotores derivados de B2M, a nivel de proteína, podemos observar en la que en B2M Enh5’, la expresión de GFP replica fielmente la expresión fisiológica de CD3. En el caso de B2M, GFP aumenta su expresión en el intervalo de 0 a 8 horas, al contrario que en el caso de CD3. Curiosamente, los vectores B2M TetO, donde la única diferencia con B2M es la inserción del operón TetO a 10 pb del sitio de inicio de transcripción, el patrón de expresión de GFP es más similar al de CD3, al observarse ese incremento de expresión a las 8 horas.

A nivel de ARN mensajero se observa un patrón muy parecido al de proteína, siendo el vector B2M Enh5’ el que mejor mimetiza el patrón de CD3, seguido del promotor B2M TetO. Aunque en ambos casos, la bajada de expresión de eGFP a las 8 horas es más pronunciada que la observada en CD3. A partir de las 8 horas, el patrón entre eGFP y CD3 es prácticamente idéntico.

El fenotipo de las células T GFP+ cambia con el tiempo hacia un estado de mayor diferenciación.

De manera paralela al estudio de la cinética de expresión de GFP bajo el control de los promotores quiméricos en las células T, se realizó un estudio de la evolución temporal del fenotipo celular, utilizando para ello dos anticuerpos, uno frente a CD62L, y otro frente a CD45RA, una isoforma de CD45 que conserva los 3 exones, por lo que presenta el mayor peso molecular de todas las isoformas. La expresión selectiva en membrana de estos marcadores nos permite distinguir 4 fenotipos propios de células T: células T troncales memoria, células T memoria central, células T efectoras y células T efectoras memoria.

En el caso del promotor B2M la población celular a 7 días sigue siendo en gran medida troncal memoria.

Generación de células T CAR+ con el promotor quimérico B2M.

Una vez obtenidos los resultados utilizando GFP como transgén, clonamos el promotor BM2 en el vector CAR. Una vez clonado el promotor en el esqueleto lentiviral del CAR de tercera generación, y generados los vectores lentivirales tal y como se detalla en la sección materiales y métodos, se transdujeron las células T con los vectores CAR.

En esta construcción (Fig. 1 y Fig. 2), los LTRs permiten la integración. EGFRt codifica para el receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado, que permite deplecionar las células CAR+ en caso de ser necesario (utilizando un anticuerpo monoclonal, cetuximab) y permite la detección indirecta del CAR utilizando un anticuerpo frente a este EGFRt conjugado con un fluorocromo. T2A es un péptido de autoescisión, que permite cortar un péptido largo en dos péptidos cortos (pues el CAR y EGFRt se codifican juntos como una proteína recombinante, y se separan gracias a este mecanismo). WPRE es un elemento de regulación post-transcripcional que potencia tanto el título del vector viral como la expresión del transgén.

Se utilizaron células T frescas, procesadas por inmunoselección magnética negativa a partir de sangre periférica movilizada de un donante sano. La transducción se llevó a cabo mediante espinoculación, utilizando 50 ^L de vector en 100.000 células T. La expresión del CAR se determinó 72 horas post - transducción. Con el promotor B2M, se observó un porcentaje de expresión del CAR del 18%. Se utilizó CAR3G (el vector lentiviral original en el que el CAR se expresa bajo el control del promotor EF1-a) como control positivo de tinción y de transducción. Las células NTD se utilizaron como control negativo.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 1, o que presente una identidad con la SEQ ID NO: 1 de al menos:

a. Un 80%

b. Un 85%

c. Un 90%

d. Un 95%

e. Un 99%

2. Una construcción genética (B2MEWP_1) que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1.

3. La construcción genética según la reivindicación 2 que es un vector viral.

4. La construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, que es un vector lentiviral.

5. La construcción genética o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 2­ 4, donde el promotor, de secuencia nucleotídica como se describe en la reivindicación 1, se encuentra operativamente unido a CAR para impulsar su expresión, y en el que CAR, comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y al menos un dominio de señalización intracelular

6. Una célula que comprende un polinucleótido según la eivindicación 1, o una construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

7. La célula según la reivindicación 6, que es una célula inmune.

8. Una célula o la célula inmune según cualquiera de las reivindicaciones 6-7, que expresan en la membrana de la superficie celular un CAR que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular y al menos un dominio de señalización intracelular, donde dicha célula inmune se transduce con la construcción genética o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 2-4.

9. La célula inmune según la reivindicación 8 derivada de linfocitos inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos auxiliares.

10. La célula según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde las células son recuperadas de los donantes.

11. El polinucleótido según la reivindicación 1, la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, o la célula según cualquiera de las reivindicaciones 5-10, para su uso en terapia.

12. El polinucleótido según la reivindicación 1, la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, o la célula según cualquiera de las reivindicaciones 5-10, para su uso en el tratamiento de cáncer.

13. El polinucleótido, la construcción genética, o la célula para su uso según la reivindicación 12, donde el cáncer se selecciona de la lista que consiste en neoplasias, neoplasias de células B, linfoma, leucemia y/o mieloma.