ES2901892T3

ES2901892T3 - Sistemas y métodos para medir hematocritos en sangre completa en base a la velocidad de llenado inicial

Info

Publication number: ES2901892T3
Application number: ES10252247T
Authority: ES
Inventors: Ronald C Chatelier; Dennis Rylatt; Linda Raineri; Alastair M Hodges
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2022-03-24
Anticipated expiration: 2030-12-29
Also published as: US20110155584A1; JP2012194196A; US20150027907A1; KR101293940B1; JP2011137816A; JP5596752B2; KR101316559B1; CN102116753B; EP2341342A3; JP5189639B2; KR20120107440A; EP2341342A2; EP2341342B1; US20180195994A1; SG172562A1; AU2010257395A1; CN102116753A; US8877034B2; CA2723353A1; KR20110079525A

Abstract

Un método para determinar un valor de hematocrito de una muestra de sangre completa, el método comprendiendo: proporcionar una muestra de sangre completa a un inmunosensor (112) para proteína C reactiva, el inmunosensor teniendo un electrodo inferior (112), un electrodo superior (114) y un espacio capilar; medir un flujo de corriente inicial en la muestra en por lo menos una parte del espacio capilar, en donde medir un flujo de corriente inicial comprende: aplicar un potencial eléctrico; realizar mediciones de corriente aproximadamente cada 10 milisegundos durante aproximadamente los primeros 50 milisegundos; y calcular una corriente media sobre las mediciones de corriente; y determinar un valor de hematocrito de la muestra a partir de la corriente media calculada, en donde la muestra incluye proteína C reactiva, el método comprendiendo además calcular una concentración de la proteína C reactiva mediante: después de determinar el valor del hematocrito, invertir el potencial eléctrico; medir un cambio en la corriente durante un período de tiempo después de invertir el potencial eléctrico; y calcular la concentración de la proteína C reactiva usando el hematocrito determinado y el cambio medido en la corriente.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas y métodos para medir hematocritos en sangre completa en base a la velocidad de llenado inicial

CAMPO

La presente divulgación se refiere a métodos y sistemas para determinar un valor de hematocrito de una muestra de sangre completa.

ANTECEDENTES

La detección de analitos en fluidos fisiológicos, por ejemplo, sangre o productos derivados de la sangre, es cada vez más importante para la sociedad actual. Los ensayos de detección de analitos encuentran uso en una variedad de aplicaciones, incluyendo pruebas de laboratorio clínico, pruebas en el hogar, etc., donde los resultados de tales pruebas desempeñan un papel destacado en el diagnóstico y el tratamiento en una variedad de condiciones de enfermedad. Los analitos de interés incluyen glucosa para el control de la diabetes, colesterol y similares. En respuesta a esta creciente importancia de la detección de analitos, se han desarrollado una variedad de protocolos y dispositivos de detección de analitos para uso clínico y doméstico. Algunos de estos dispositivos incluyen celdas electroquímicas, sensores electroquímicos, sensores de hemoglobina, sensores antioxidantes, biosensores e inmunosensores.

Una característica de la sangre que puede afectar a la detección de analitos es el hematocrito. Los niveles de hematocrito pueden ser enormemente diferentes entre varias personas. A modo de ejemplo no limitativo, una persona que padece anemia puede tener un nivel de hematocrito de aproximadamente el 20%, mientras que un recién nacido puede tener un nivel de hematocrito de aproximadamente el 65%. Incluso las muestras tomadas del mismo individuo durante un período de tiempo pueden tener diferentes niveles de hematocrito. Además, debido a que un alto hematocrito también puede aumentar la viscosidad de la sangre, y la viscosidad a su vez puede afectar a otros parámetros asociados con la detección de analitos, tener en cuenta el efecto del hematocrito en una muestra puede ser importante para realizar determinaciones precisas de la concentración de analitos.

Una manera en la que se han contabilizado los niveles variables de hematocrito en una muestra de sangre es separando el plasma de la sangre y luego recalculando la concentración del antígeno con respecto al volumen de plasma ajustado. La separación se ha logrado, por ejemplo, realizando un paso de centrifugación. Otras formas en las que se han contabilizado los niveles variables de hematocrito en una muestra de sangre incluyen usar un hematocrito medio en un cálculo o medir un hematocrito en un paso separado y luego calcular la concentración del antígeno con respecto al valor en plasma. Sin embargo, se cree que estos métodos no son deseables, por lo menos porque implican una manipulación de muestras no deseada, requieren más tiempo y llevan a errores sustanciales en las determinaciones finales. Además, las temperaturas en el entorno donde se analizan las muestras también pueden tener un impacto negativo sobre la precisión de la determinación de la concentración de analito.

La WO 2009/041782 describe un método para corregir resultados de medición erróneos en un biosensor. El método incluye los pasos de: (a) aplicar un primer voltaje de un generador de voltaje a una tira reactiva cuando se aplica una muestra de sangre en la tira reactiva, y medir una corriente eléctrica generada de la tira reactiva en el plazo de un segundo de la aplicación del primer voltaje por una unidad de microcontrolador (MCU), y luego calcular un valor de hematocrito de la muestra de sangre usando el valor de corriente eléctrica medido; (b) aplicar un segundo voltaje del generador de voltaje a la tira reactiva después de calcular el valor del hematocrito de la muestra de sangre y medir una corriente eléctrica generada de la tira reactiva en un plazo de tiempo predeterminado de la aplicación del segundo voltaje y luego calcular un nivel de glucosa usando el valor de corriente eléctrica medido; y (c) corregir el nivel de glucosa en (B) usando el valor de hematocrito calculado en (a).

La WO 2005/114163 describe métodos y dispositivos para realizar ajustes de hematocrito in situ durante la prueba de glucosa usando productos de monitorización de glucosa y usando esos valores ajustados para estimar el valor de hematocrito de las muestras de sangre para reducir o eliminar el sesgo del ensayo provocado por los diferentes niveles de hematocrito de las muestras de sangre. Un método implica medir el valor de glucosa, Glum, de la muestra de sangre; medir la resistencia de la muestra de sangre (Rcélula) usando un reactivo biosensor; la medición de la resistencia del plasma (Rplasma) usando el reactivo biosensor; determinar la resistencia calculada de los glóbulos rojos, R^rbc, de la muestra de sangre de acuerdo con la relación RRBC=Rcélula-Rplasma; calcular el porcentaje de hematocrito,% Hctc, de la muestra de sangre; determinar si ajustar el valor de glucosa, Glum, a un valor de glucosa ajustado, Gluadj; y usar el porcentaje de hematocrito,%. Hctc, y el valor de glucosa, Glum, o el valor de glucosa ajustado, Gluadj, para ajustar cualquier sesgo del reactivo biosensor.

La JP2001091512A se refiere a un dispositivo de análisis de constituyentes sanguíneos para medir rápidamente un valor de hematocrito y al mismo tiempo analizar fácilmente un constituyente de sangre donde se ha corregido el valor de hematocrito, en el que se forma un canal que consiste de papel de filtro de fibra de vidrio y una membrana insoluble a anticuerpos, el potencial se aplica a un electrodo de operación y un contraelectrodo, al mismo tiempo que se inyecta sangre en una parte de introducción del espécimen, el momento en el que la sangre o el plasma ha alcanzado el contraelectrodo se mide en base al cambio en una corriente de respuesta, calculando por tanto el valor del hematocrito de la sangre, y se prepara una curva de calibración o una expresión de corrección de hematocrito para cada valor de hematocrito incluso en el análisis de un constituyente sanguíneo y se usa para corregir la influencia debida al valor de hematocrito de acuerdo con la cantidad de corriente de respuesta obtenida del electrodo de operación.

Por consiguiente, sería deseable desarrollar una forma de obtener mediciones de concentración de analito más precisas que tengan en cuenta un amplio espectro de niveles y temperaturas de hematocrito. También sería deseable desarrollar una manera de determinar rápidamente los niveles de hematocrito.

SUMARIO

La presente invención proporciona un método para determinar un valor de hematocrito de una muestra de sangre completa como se define en la reivindicación 1 adjunta, y un sistema electroquímico para realizar el método de la reivindicación 1 como se define en la reivindicación 5 adjunta.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Esta invención se entenderá más completamente a partir de la siguiente descripción detallada tomada junto con los dibujos acompañantes, en los que los ejemplos mostrados en las FIGS. 1 y 3-5 y descritos en sus fragmentos correspondientes no son de acuerdo con la invención y están presentes solo con propósitos ilustrativos, en los que:

La FIG. 1 ilustra una vista en perspectiva de un inmunosensor y una unidad de control que tiene un detector óptico para calcular una velocidad de llenado inicial;

La FIG. 2 ilustra una vista en despiece de un inmunosensor ejemplar usado en el método y sistema de acuerdo con la presente invención, en donde el inmunosensor está configurado para su uso con una unidad de control que tiene un sistema de detección electroquímica para calcular una velocidad de llenado inicial;

La FIG. 3 ilustra un dibujo esquemático en alzado lateral (no a escala) de una celda electroquímica;

La FIG. 4 ilustra una vista en planta, desde arriba, de la celda electroquímica de la FIG. 3;

La FIG. 5 ilustra un dibujo esquemático (no a escala), en sección transversal, de una celda electroquímica hueca; La FIG. 6 ilustra un gráfico de un transitorio de corriente frente al tiempo realizado usando el dispositivo de la FIG. 2 junto con un ejemplo ejemplar para probar una variedad de muestras de sangre proporcionadas en la presente;

La FIG. 7 ilustra un gráfico de un nivel de concentración de hematocrito para cada muestra de sangre usada en asociación con el ejemplo asociado con la FIG. 6 frente a una corriente;

La FIG. 8 ilustra un gráfico de un error porcentual de los niveles de concentración de hematocrito determinados para cada muestra de sangre asociada con la FIG. 6 frente a los niveles de concentración de hematocrito determinados de cada muestra de sangre asociada con la FIG. 6;

La FIG. 9 ilustra un gráfico de un nivel de proteína C reactiva calculado de cada muestra de sangre asociada con la FIG. 6 frente a un valor de referencia de proteína C reactiva en plasma determinado por un inmunoensayo enzimático convencional;

La FIG. 10 ilustra un gráfico de una corriente frente a una temperatura de una cámara de detección del inmunosensor en la que se disponen las muestras de sangre usando el inmunosensor de la FIG. 2 junto con otro ejemplo ejemplar para probar una variedad de muestras de sangre proporcionadas en la presente;

La FIG. 11 ilustra un gráfico de un error porcentual de los niveles de concentración de hematocrito determinados para cada muestra de sangre asociada con la FIG. 10 frente a los niveles de concentración de hematocrito determinados de cada muestra de sangre asociada con la FIG. 10;

La FIG. 12 ilustra un gráfico de una pendiente determinada en base a un cambio en la corriente a lo largo del tiempo para cada muestra de sangre asociada con la FIG. 10 frente a la temperatura de una cámara de detección del inmunosensor en la que se disponen las muestras de sangre; y

La FIG. 13 ilustra un gráfico de un nivel de proteína C reactiva calculado de muestras de sangre asociadas con la FIG. 10 que tiene aproximadamente un nivel de hematocrito del 33,5% y un nivel de hematocrito de aproximadamente el 47,5% frente a un valor de referencia de la proteína C reactiva en plasma determinado por un inmunoensayo enzimático convencional.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

A continuación, se describirán ciertas realizaciones ejemplares para proporcionar una comprensión general de los principios de la estructura, función, fabricación y uso de los dispositivos y métodos divulgados en la presente. En los dibujos acompañantes se ilustran uno o más ejemplos de estas realizaciones. Los expertos en la técnica entenderán que los dispositivos y métodos descritos específicamente en la presente e ilustrados en los dibujos acompañantes son realizaciones ejemplares no limitativas y que el alcance de la presente invención se define únicamente por las reivindicaciones. Las características ilustradas o descritas en relación con una realización ejemplar pueden combinarse con las características de otras realizaciones.

Los métodos para determinar un valor de hematocrito en una muestra y determinar una concentración de proteína C reactiva (CRP) en una muestra divulgados en la presente pueden usarse con el inmunosensor y/o sistema ejemplar descrito en la presente. El inmunosensor tiene un espacio capilar. El inmunosensor incluye por lo menos un electrodo de trabajo y un contraelectrodo entre los cuales puede aplicarse un potencial eléctrico. El inmunosensor está asociado con un medidor para aplicar el potencial eléctrico entre los electrodos. El inmunosensor está asociado con una unidad de control que es capaz de medir una velocidad de llenado inicial, más específicamente, un flujo de corriente inicial, de una muestra cuando se introduce en el inmunosensor. La unidad de control es capaz de calcular una concentración de CRP en la muestra en vista del flujo de corriente inicial. En la presente divulgación, los términos analito, antígeno y anticuerpos se usan indistintamente y, por tanto, el uso de un término es igualmente aplicable a los tres términos, amenos que se indique lo contrario o se conozca razonablemente por un experto en la técnica.

En una realización ejemplar de un método para determinar un valor de hematocrito de una muestra de sangre completa, se proporciona una muestra de sangre completa a un inmunosensor que tiene un espacio capilar. Se mide un flujo de corriente inicial de la muestra en por lo menos una parte del capilar. A continuación, se determina un valor de hematocrito de la muestra a partir del flujo de corriente inicial. Se determina una concentración de CRP en la muestra en vista del valor determinado de hematocrito. El uso del flujo de corriente inicial para calcular el valor del hematocrito puede permitir una precisión mejorada. Los métodos para determinar un valor de hematocrito también pueden tener en cuenta los efectos de la temperatura, como se analiza con mayor detalle a continuación. Por ejemplo, los niveles de hematocrito de una gota de sangre pueden determinarse en menos de un segundo simplemente dejando caer la sangre en un inmunosensor. Una vez que la sangre se deposita en el inmunosensor, puede proporcionarse una lectura digital del nivel de hematocrito casi instantáneamente. El resultado son determinaciones rápidas y precisas de los niveles de hematocrito, que son útiles para una variedad de evaluaciones médicas, por ejemplo, para realizar evaluaciones relacionadas con afecciones como la anemia.

Como el método se usa para determinar una concentración de CRP en una muestra, se proporciona una muestra que comprende CRP a un inmunosensor que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo y un espacio capilar. Se aplica un potencial eléctrico entre los electrodos de trabajo y contraelectrodos del inmunosensor y se determina una velocidad de llenado inicial, más específicamente, un flujo de corriente inicial, de la muestra al espacio capilar del inmunosensor. Se calcula una concentración de CRP en la muestra en vista del flujo de corriente inicial determinado. Al calcular la concentración en vista del flujo de corriente inicial, pueden tenerse en cuenta los errores, como los que pueden resultar de niveles de hematocrito variables entre las muestras, lo que lleva a determinaciones más precisas de las concentraciones de los analitos en las muestras. Los métodos también pueden tener en cuenta los efectos de la temperatura, como se analiza con mayor detalle a continuación.

La velocidad de llenado inicial puede usarse de varias formas para determinar la concentración de un analito. Por ejemplo, si la muestra incluye sangre completa y se conoce la temperatura del lugar donde se analiza la muestra en el dispositivo de análisis de muestras, la velocidad de llenado inicial puede vincularse al nivel de hematocrito determinado. Puede conocerse la temperatura de la muestra, por ejemplo, si una cámara de un dispositivo de análisis de muestras se precalienta a una temperatura deseada. Si no se conoce una temperatura, aún pueden realizarse cálculos que permitan medir o inferir la temperatura durante las reacciones. En tal caso, la temperatura y los niveles de hematocrito pueden tenerse en cuenta para proporcionar determinaciones de concentración de analito más precisas. Además, puede usarse de igual manera una velocidad de llenado inicial de varias formas para determinar un nivel de hematocrito de una muestra de sangre.

Hay una variedad de maneras de determinar la velocidad de llenado inicial asociada con la muestra que se introduce en el dispositivo de análisis de muestras. La determinación de la velocidad de llenado inicial, a su vez, puede permitir estimar la viscosidad de un líquido. La estimación de la viscosidad de un líquido puede ayudar a realizar determinaciones de concentración más precisas. La FIG. 1 muestra un inmunosensor 10 que incluye una unidad de control 50 que tiene un detector óptico 52 generalmente localizado cerca de un puerto de entrada 21 a una cámara de llenado 22 del inmunosensor 10. El detector óptico 52 puede tener cualquier forma o tamaño, y puede estar localizado, por ejemplo, en la parte superior del inmunosensor 10 o justo dentro del puerto de entrada 21 del inmunosensor 10. El sensor óptico está acoplado a una placa superior 14 del inmunosensor 10, adyacente al puerto de entrada 21. El sensor óptico 52 puede incluir una señal óptica que cambia cuando pasa una muestra por el sensor 52. Por tanto, cuando se proporciona una muestra al inmunosensor 10, puede detectarse una tasa de cambio de la señal óptica, que a su vez puede usarse para estimar la velocidad de llenado inicial. La tasa de cambio puede medirse en por lo menos una parte de un espacio capilar del inmunosensor 10. La velocidad de llenado inicial puede usarse luego para calcular una serie de parámetros diferentes. A modo de ejemplo no limitativo, la velocidad de llenado inicial puede usarse para calcular una concentración de un antígeno en una muestra o un nivel de hematocrito de una muestra de sangre completa.

Para medir la magnitud de un flujo de corriente inicial se usa un sistema de detección electroquímica. El espacio capilar puede estar localizado, por ejemplo, entre una cámara de llenado y una cámara de reacción, y/o entre una cámara de reacción y una cámara de detección. El flujo de corriente inicial puede determinarse entre la cámara de llenado y la cámara de reacción. Alternativamente, el flujo de corriente inicial puede medirse cuando la muestra cruza por primera vez a una región del espacio capilar del dispositivo de análisis de muestras donde puede generarse una señal de detección, como una cámara de detección.

Pueden usarse una serie de técnicas diferentes para medir el flujo de corriente. Por ejemplo, puede tomarse un número deseado de mediciones durante un período de tiempo deseado. De acuerdo con la presente invención, la medición se realiza aproximadamente cada 10 milisegundos durante un período de aproximadamente 50 milisegundos. Se obtienen resultados más precisos para la velocidad inicial realizando múltiples mediciones durante un corto período de tiempo.

En la FIG. 2 se ilustra una realización ejemplar de un inmunosensor 110 y se describe en la Solicitud de patente de Estados Unidos N° de serie 12/570.268 de Chatelier et al.., titulada "Adhesive Compositions for Use in an Immunosensor" y presentada el 30 de septiembre de 2009. En este ejemplo, se forman una pluralidad de cámaras dentro del inmunosensor, incluyendo una cámara de llenado, por la cual puede introducirse una muestra en el inmunosensor, una cámara de reacción, mediante la cual puede hacerse reaccionar una muestra con uno o más materiales deseados, y una cámara de detección, mediante la cual puede determinarse la concentración de un componente particular de la muestra. Estas cámaras están formadas en por lo menos una parte de un electrodo inferior, un electrodo superior y un separador del inmunosensor. El inmunosensor también incluye un orificio de ventilación para permitir que el aire entre y escape del inmunosensor según se desee, y un primer y un segundo componentes de sellado para sellar selectivamente el primer y el segundo lados del orificio de ventilación. El primer componente de sellado forma una pared de la cámara de llenado.

Como se ilustra, el inmunosensor 110 incluye un electrodo inferior 112 que tiene dos reactivos líquidos 130, 132 colocados en tiras sobre él. El electrodo inferior 112 puede formarse usando cualquier número de técnicas usadas para formar electrodos, pero en una realización, se recubre por pulverización catódica una lámina de tereftalato de polietileno (PET) que está llena de sulfato de bario con un conductor adecuado, como, por ejemplo, oro. Otro ejemplo no limitativo para formar un electrodo se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 6.521.110 de Hodges et al., titulada "Electrochemical Cell" y presentada el 10 de noviembre de 2000.

De igual manera, los reactivos líquidos 130, 132 pueden tener varias composiciones diferentes. En una realización, el primer reactivo líquido 130 incluye un anticuerpo conjugado con una enzima, como, por ejemplo, GDH-PQQ, en un tampón que contiene sacarosa, así como un poloxámero, como, por ejemplo, los copolímeros de bloque Pluronics®., un anticoagulante, como el citraconato, e iones de calcio. En una realización, el segundo reactivo líquido 132 incluye una mezcla de ferricianuro, glucosa y un segundo mediador, como etosulfato de fenazina, en un tampón ácido, como una solución diluida de ácido citracónico. El primer y el segundo reactivos líquidos 130, 132 pueden secarse sobre el electrodo inferior 112. Pueden usarse una serie de técnicas para secar los reactivos 130, 132, pero en una realización, después de colocar en tiras los reactivos 130, 132 sobre el electrodo inferior 112, pueden aplicarse uno o más secadores de infrarrojos a los reactivos 130, 132. También pueden usarse uno o más secadores de aire, por ejemplo, después de los secadores de infrarrojos. Las referencias a un primer reactivo y un primer reactivo líquido y un segundo reactivo y un segundo reactivo líquido en la presente se usan indistintamente y no son necesariamente una indicación de que los reactivos están en su forma líquida o seca en un momento dado para una realización particular. Además, algunos de los componentes asociados con el primer y segundo reactivos líquidos pueden usarse indistintamente y/o tanto en el primer como en el segundo reactivos líquidos, según se desee. A modo de ejemplo no limitativo, puede asociarse un anticoagulante con uno o ambos del primer reactivo líquido 130 y el segundo reactivo líquido 132.

Puede formarse una línea en el oro recubierto por pulverización catódica entre los reactivos 130, 132 de tal manera que un borde de uno de los reactivos 130, 132 esté muy cerca de, o toque, la línea. En la realización ilustrada, la línea se forma de tal manera que un borde del reactivo 132 toque la línea en la ventilación 124. La línea puede aplicarse usando ablación láser o con un borde metálico afilado. En una realización ejemplar, la línea puede aplicarse antes de que los reactivos 130, 132 sean colocados en tiras en el electrodo. La línea puede diseñarse para aislar eléctricamente la sección del electrodo inferior 112 debajo de la cámara de detección de la sección que estará debajo de la cámara de reacción. Esto puede proporcionar una mejor definición de un área del electrodo de trabajo durante el ensayo electroquímico.

El inmunosensor 110 también puede incluir un electrodo superior 114 que tiene una o más perlas magnéticas 134 que contienen antígenos unidos a la superficie en las mismas. Los antígenos pueden configurarse para reaccionar con el anticuerpo dispuesto en el electrodo inferior 112 y la muestra dentro de una cámara de reacción 118, como se describe con más detalle a continuación. Un experto en la técnica reconocerá que los componentes dispuestos en el electrodo inferior 112 y en el electrodo superior 114 pueden ser intercambiables. Por tanto, el electrodo inferior 112 puede incluir una o más perlas magnéticas 134 y el electrodo superior 114 puede incluir dos reactivos líquidos 130, 132 colocados en tiras sobre él. Además, aunque en la realización ilustrada la longitud del electrodo 112 forma la longitud de todo el cuerpo del inmunosensor 110, en otras realizaciones, el electrodo puede ser solo una parte de una capa de un inmunosensor que sirve como electrodo inferior o superior o pueden disponerse múltiples electrodos en una sola capa de un inmunosensor. Además, debido a que el potencial aplicado al inmunosensor puede invertirse y/o alternarse, cada uno de los electrodos inferior y superior puede servir como electrodo de trabajo y como contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia en diferentes etapas. Para facilitar la descripción, en la presente solicitud el electrodo inferior se considera el electrodo de trabajo y el electrodo superior el contraelectrodo o contraelectrodo/electrodo de referencia.

Un separador 116 dispuesto entre los electrodos inferior y superior 112, 114 puede tener una variedad de formas y tamaños, pero generalmente está configurado para acoplar deseablemente con los electrodos inferior y superior 112, 114 para formar el inmunosensor 110. En una realización ejemplar, el separador 116 incluye propiedades adhesivas en ambos lados. El separador 116 puede incluir además un revestimiento desprendible en cada lado de los dos lados del separador 116. El separador 116 puede cortarse de una manera que forme por lo menos dos cavidades. Puede formarse una primera cavidad para que sirva como una cámara de reacción 118 y puede formarse una segunda cavidad para que sirva como una cámara de detección 120. En una realización, el separador 116 puede troquelarse de tal manera que la cámara de reacción 118 esté alineada con los electrodos 112, 114 para permitir una reacción antígeno-anticuerpo en el mismo mientras que la cámara de detección 120 está alineada con los electrodos 112, 114 para permitir la determinación electroquímica del ferrocianuro en la misma.

El separador 116 puede colocarse en el electrodo inferior 112 de una manera que permita que las perlas magnéticas 134 del electrodo superior 114 y el primer reactivo 130 del electrodo inferior 112 estén por lo menos parcialmente dispuestas en la cámara de reacción 118 y la combinación de ferricianuro y glucosa del segundo reactivo 132 del electrodo inferior 112 se disponga por lo menos parcialmente en la cámara de detección 120. Puede ser ventajoso incluir un anticoagulante en cada uno del primer y el segundo reactivos líquidos 130, 132 de tal manera que se asocie un anticoagulante con cada una de las cámaras de reacción y detección 118, 120. En algunas realizaciones, la combinación de uno de los electrodos superior e inferior 112, 114 y el separador 116 pueden laminarse juntos para formar un bilaminado, mientras que en otras realizaciones la combinación de cada uno del electrodo inferior 112, el electrodo superior 114 y el separador 116 pueden laminarse juntos para formar un trilaminado. Alternativamente, también pueden añadirse capas adicionales.

Una cámara de llenado 122 puede formarse perforando un orificio en uno de los electrodos inferior y superior 112, 114 y el separador 116. En la realización ilustrada, la cámara de llenado se forma perforando un orificio en el electrodo inferior 112 y el separador 116 de tal manera que el orificio del electrodo inferior 112 se solape con la cámara de reacción 118. Como se muestra, la cámara de llenado 122 puede estar separada a una distancia de la cámara de detección 120. Tal configuración permite que una muestra se introduzca en el inmunosensor 110 a través de la cámara de llenado 122 y fluya hacia la cámara de reacción 118 para hacerse reaccionar, por ejemplo, con el primer reactivo líquido 130 que incluye el anticuerpo conjugado con una enzima en un tampón en el primer electrodo 112 y las perlas magnéticas 134 colocadas en tiras en el electrodo superior 114, sin entrar en la cámara de detección 120. La entrada de una muestra en la cámara de llenado 122 puede producirse por medio de la acción capilar y, como tal, por lo menos una de la cámara de llenado 122, la cámara de reacción 118 y una localización entre ellas puede considerarse un espacio capilar. Una vez que se ha hecho reaccionar la muestra, puede fluir hacia la cámara de detección 120 para interactuar con el segundo reactivo líquido 132, por ejemplo, la mezcla de ferricianuro, glucosa y el segundo mediador en un tampón ácido.

Una ventilación 124 puede formarse perforando un orificio a través de cada uno de los dos electrodos 112, 114 y el separador 116 de tal manera que la ventilación 124 se extienda a través de la totalidad del inmunosensor 110. El orificio puede formarse de una manera como, por ejemplo, taladrado o perforado en una serie de localizaciones diferentes, pero en una realización ejemplar puede superponerse a una región de la cámara de ^{detección 120 que está separada de la cámara de reacción}118^.

La ventilación 124 puede sellarse de varias maneras diferentes. En la realización ilustrada, un primer componente de sellado 140 está localizado en el electrodo inferior 112 para sellar un primer lado de la ventilación 124 y un segundo componente de sellado 142 está localizado en el electrodo superior 114 para sellar un segundo lado de la ventilación 124. Los componentes de sellado pueden estar hechos de y/o incluir cualquier número de materiales. A modo de ejemplo no limitativo, uno o ambos componentes de sellado pueden ser cinta adhesiva hidrófila o cinta Scotch®. Los lados adhesivos de los componentes de sellado pueden estar orientados hacia el inmunosensor 110. Como se muestra, el primer componente de sellado 140 no solo puede formar un sello para la ventilación 124, sino que también puede formar una pared para la cámara de llenado 122 de tal manera que la muestra pueda ser contenida en la misma. Las propiedades incorporadas en el lado adhesivo del primer componente de sellado 140 pueden asociarse con la cámara de llenado 122. Por ejemplo, si el primer componente de sellado 140 incluye propiedades que lo hacen hidrófilo y/o soluble en agua, la cámara de llenado puede permanecer bien húmeda cuando se dispone una muestra en el mismo. Además, los componentes de sellado 140, 142 pueden asociarse y disociarse selectivamente con el inmunosensor 110 para proporcionar ventilación y/o sellado para el inmunosensor 110 y los componentes dispuestos en el mismo según se desee.

Generalmente, pueden usarse adhesivos en la construcción del inmunosensor. Ejemplos no limitativos de maneras en las que pueden incorporarse adhesivos en inmunosensores y otros dispositivos de análisis de muestras de la presente divulgación pueden encontrarse la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de Serie 12/570.268 de Chatelier et al., titulada "Adhesive Compositions for Use in an Immunosensor” y presentada el 30 de septiembre de 2009.

Aunque la presente divulgación analiza una variedad de realizaciones diferentes relacionadas con inmunosensores, los inmunosensores también se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0180814 de Hodges et al., titulada “Direct Immunosensor Assay" y presentada el 21 de marzo de 2002, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2004/0203137 de Hodges et al., tituladq "Inmunosensor" y presentada el 22 de abril de 2004, la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006/0134713 de Rylatt et al., titulada "Biosensor Apparatus and Methods of Use" y presentada el 21 de noviembre de 2005, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de serie 12/563.091, que reivindica prioridad de cada una de las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2003/0180814 y 2004/0203137.

El inmunosensor 110 puede configurarse para colocarse en un medidor que está configurado para aplicar un potencial a los electrodos 112, 114 y medir una corriente que resulta de la aplicación del potencial. En una realización, el inmunosensor incluye una o más pestañas 117 para acoplar un medidor. También pueden usarse otras características para conectar el inmunosensor 110 con un medidor. El medidor puede incluir varias funciones diferentes. Por ejemplo, el medidor puede incluir un imán que está configurado para mantener ciertos componentes del inmunosensor 110 en una cámara mientras otros componentes fluyen hacia la otra. En una realización ejemplar, el imán del medidor está localizado de tal manera que, tras colocar el inmunosensor 110 en el medidor, el imán se dispone por debajo de la cámara de reacción 118. Esto puede permitir que el imán ayude a retener las perlas magnéticas 134, y más particularmente cualquier conjugado anticuerpo-enzima que se una a las perlas 134, de fluir hacia la cámara detección 120.

Un elemento calefactor puede ayudar a acelerar la velocidad de reacción y ayudar a que la muestra fluya a través del inmunosensor 110 de la manera deseada al reducir la viscosidad. Un elemento calefactor también puede permitir que una o más cámaras y/o una muestra dispuesta en las mismas se calienten a una temperatura predeterminada. Calentar a una temperatura predeterminada puede ayudar a proporcionar precisión, por ejemplo, al disminuir o eliminar los efectos del cambio de temperatura a medida que se producen las reacciones.

Además, también puede asociarse un instrumento de perforación con el medidor. El instrumento de perforación puede configurarse para perforar por lo menos uno de los componentes del primer y el segundo componentes de sellado en el momento deseado de tal manera que el aire pueda fluir fuera del orificio de ventilación y el líquido pueda fluir desde la cámara de reacción hacia la cámara de detección.

El inmunosensor 110 está configurado para asociarse con una unidad de control. La unidad de control puede configurarse para realizar una variedad de funciones. La unidad de control es capaz de medir una velocidad de llenado inicial, más específicamente, un flujo de corriente inicial, de una muestra que comprende CRP cuando se introduce la muestra en el dispositivo. La unidad de control está configurada para determinar un valor de hematocrito de una muestra de sangre. La unidad de control está configurada para calcular una concentración de CRP en la muestra en vista del flujo de corriente inicial.

Como el sistema de acuerdo con la presente invención está diseñado para medir un flujo de corriente inicial, la unidad de control incluye un detector de flujo de corriente. El detector de flujo de corriente mide un flujo de corriente inicial en base a un cambio en la corriente que se produce como resultado de la entrada de la muestra en el inmunosensor. La cadencia de este cambio puede producirse de varias maneras diferentes, pero en una realización ejemplar, la corriente se mide después de que la muestra pase a una región de un espacio capilar del inmunosensor donde se genera una señal de detección, por ejemplo, cuando la muestra pasa de la cámara de reacción a la cámara de detección.

La unidad de control también puede medir otros aspectos del sistema. A modo de ejemplo, la unidad de control puede configurarse para medir la temperatura de una o más cámaras del inmunosensor. También puede configurarse para medir la temperatura de la muestra, por ejemplo directamente o midiendo una temperatura ambiente y usándola para inferir la temperatura de la muestra, un color de la muestra o una variedad de otras características y/o propiedades de la muestra y/o el sistema. A modo de ejemplo, la unidad de control puede configurarse para comunicar los resultados de la determinación de la velocidad de llenado inicial, los resultados de la determinación del valor del hematocrito y/o los resultados de la determinación de la concentración de analito a un equipo externo. Esto puede lograrse de varias maneras. A modo de ejemplo, la unidad de control puede estar cableada a un microprocesador y/o un dispositivo de visualización. A modo de otro ejemplo, la unidad de control puede configurarse para transmitir datos de manera inalámbrica desde la unidad de control a un microprocesador y/o un dispositivo de visualización.

También pueden configurarse otros componentes del sistema para realizar tales mediciones. Por ejemplo, el inmunosensor o el medidor pueden configurarse para medir la temperatura de una o más cámaras del inmunosensor, medir o inferir la temperatura de una muestra, o medir, determinar o inferir una variedad de otras características y/o propiedades de la muestra y/o el sistema. Además, un experto en la técnica reconocerá que estas características de una unidad de control pueden intercambiarse y combinarse selectivamente en una única unidad de control. Por ejemplo, una unidad de control puede tanto determinar una velocidad de llenado inicial como medir una temperatura de una cámara. En otras realizaciones, pueden usarse múltiples unidades de control juntas para realizar varias funciones, en base por lo menos en parte a las configuraciones de las varias unidades de control y las funciones deseadas a realizar.

En las FIGS. 3 y 4 se ilustra una celda electroquímica. La celda puede incluir una membrana de tira delgada 201 que tiene superficies superior e inferior 202, 203, y también puede incluir una zona de celda 204 definida entre un electrodo de trabajo 206 dispuesto en la superficie inferior 203 y un contraelectrodo/electrodo de referencia 205 dispuesto en la superficie superior 202. El espesor de la membrana puede seleccionarse para lograr un resultado deseado, como que los productos de reacción de un contraelectrodo lleguen a un electrodo de trabajo. Por ejemplo, el espesor de la membrana puede seleccionarse de tal manera que los electrodos estén separados por una distancia t, que puede estar lo suficientemente cerca como para que los productos de la reacción electroquímica en el contraelectrodo puedan migrar al electrodo de trabajo durante el tiempo de la prueba y puede lograrse sustancialmente un perfil de difusión en estado estacionario. Típicamente, t puede ser inferior a aproximadamente 500 micrómetros, alternativamente en el intervalo de aproximadamente 10 micrómetros a aproximadamente 400 micrómetros, y más particularmente en el intervalo de aproximadamente 80 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros. Puede seleccionarse una separación entre los electrodos de tal manera que los productos de la reacción de un contraelectrodo lleguen a un electrodo de trabajo.

Los electrodos también pueden tener una variedad de configuraciones. Por ejemplo, los electrodos pueden ser planos. Además, en la realización ilustrada, los electrodos 205, 206 están uno frente al otro y están sustancialmente opuestos. Ejemplos de diferentes configuraciones de electrodos pueden encontrarse por lo menos en la Patente de Estados Unidos N° 7.431.820 de Hodges, titulada "Electrochemical Cell" presentada el 14 de octubre de 2003.

Puede definirse un depósito de muestra o área "objetivo" 207 en la superficie superior 202 de la membrana 201 y puede espaciarse a una distancia mayor que el espesor de la membrana desde la zona de celda 204. La membrana 201 puede tener una zona de difusión 208 que puede se extiende entre el área objetivo 207 y la zona de celda 204. Un reactivo adecuado puede incluir un mediador redox M, una enzima E y un tampón de pH B, cada uno de los cuales puede estar contenido dentro de la zona de celda 204 de la membrana y/o entre la zona de celda 204 y el área objetivo 207. El reactivo también puede incluir estabilizantes y similares.

En el uso del sensor, puede colocarse una gota de sangre en la zona objetivo 207 y los componentes sanguíneos pueden moverse hacia la zona de celda 204. La velocidad inicial a la que la sangre cubre la zona objetivo 207 puede depender por lo menos del hematocrito.

Cada uno de los electrodos 205, 206 puede tener un área predefinida. En las realizaciones de las FIGS. 3 y 4 la zona de celda 204 puede estar definida por los bordes 209, 210, 211 de la membrana, que pueden corresponder con los bordes de los electrodos 205, 206 y por los bordes delanteros 212, 213 de los electrodos (con respecto al área objetivo 207). En el presente ejemplo, los electrodos pueden tener un espesor de aproximadamente 600 angstrom y pueden tener una anchura de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 5 mm, aunque pueden usarse una variedad de otras dimensiones y parámetros sin apartarse del alcance de la presente invención.

Alternativamente, pueden cubrirse ambos lados de la membrana con la excepción del área objetivo 207 laminando capas que pueden servir para evitar la evaporación del agua de la muestra y para proporcionar robustez mecánica al aparato. Se cree que la evaporación del agua es indeseable ya que concentra la muestra, permite que los electrodos se sequen y permite que la solución se enfríe, afectando al coeficiente de difusión y ralentizando la cinética de la enzima, aunque el coeficiente de difusión puede estimarse como se ha indicado anteriormente.

La FIG. 5 muestra una celda electroquímica hueca. Los electrodos 305, 306 pueden estar soportados por paredes de polímero espaciadas 330 para definir una celda hueca. Puede proporcionarse una abertura 331 en un lado de la celda, por la que puede admitirse una muestra en la cavidad 332. No se usa una membrana en el dispositivo mostrado en la FIG. 5, aunque puede incluirse una membrana. Los electrodos pueden tener una variedad de configuraciones, por lo menos como se ha analizado anteriormente. A modo de ejemplo no limitativo, los electrodos pueden estar separados por menos de aproximadamente 500 micrómetros, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 10 micrómetros o de aproximadamente 20 micrómetros a aproximadamente 400 micrómetros, y más preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 100 micrómetros a aproximadamente 200 micrómetros. El volumen de la celda efectivo puede ser de aproximadamente 1,5 microlitros o menos.

Divulgaciones adicionales relacionadas con las celdas electroquímicas de las FIGS 3-5 se encuentran en la Patente de Estados Unidos N° 6.284.125 de Hodges et al., titulada "Electrochemical cell" presentada el 17 de abril de 1998. Por ejemplo, las celdas electroquímicas pueden tener dos pares de electrodos. Los pares de electrodos pueden incluir cualquier combinación de electrodos de trabajo, contraelectrodo, contraelectrodo/de referencia, y de referencia separados.

EJEMPLO 1

El siguiente ejemplo demuestra el uso de un sistema electroquímico para medir una velocidad de llenado inicial basándose en la medición de un flujo de corriente inicial. En el siguiente ejemplo de acuerdo con la presente invención, el sistema incluía un inmunosensor que tiene un electrodo superior, un electrodo inferior y un espacio capilar, como el inmunosensor 110 de la FIG. 2, un medidor configurado para aplicar un potencial y una unidad de control configurada para determinar el flujo de corriente inicial. En particular, se aplicó un potencial a los electrodos del inmunosensor 110, se determinó un nivel de hematocrito y luego se invirtió el potencial. Posteriormente se determinó la concentración de PCR en vista del nivel de hematocrito determinado. El nivel de hematocrito se determinó en vista de un flujo de corriente inicial calculado.

Las muestras eran muestras de sangre que contenían proteínas C reactivas y, por tanto, la concentración del analito que se determinaba era la concentración de proteínas C reactivas. Las muestras contenían cuatro niveles diferentes de hematocrito, que se conocían, por lo que las comparaciones de los resultados de las pruebas podían compararse con los resultados reales para determinar la precisión de los sistemas, dispositivos y métodos. Los cuatro niveles de hematocrito fueron aproximadamente el 33%, aproximadamente el 41,5%, aproximadamente el 47,5% y aproximadamente el 55%. La prueba de cuatro niveles de hematocrito permitió confirmar la precisión de los sistemas, dispositivos y métodos divulgados en un amplio espectro de niveles de concentración.

En este primer ejemplo, se precalentó un inmunosensor a aproximadamente 37° C antes de introducir una muestra. El medidor asociado al inmunosensor se configuró para realizar el precalentamiento, aunque se podrían haber usado otras alternativas. Luego, se introdujeron muestras en el inmunosensor. Aunque la introducción de muestras en el inmunosensor podría haberse realizado de varias maneras, en el ejemplo cada muestra se admitió individualmente mediante acción capilar en la cámara de llenado.

Después de que hubieran transcurrido aproximadamente dos minutos, se accedió a la ventilación del inmunosensor perforando el primer componente de sellado. Se usó un instrumento de perforación del medidor para realizar la acción de perforación, que a su vez permitió que la sangre fluyese desde la cámara de reacción del inmunosensor hacia la cámara de detección del inmunosensor. Tan pronto como la sangre comenzó a introducirse en la cámara de detección, se aplicó un potencial de aproximadamente 300 mV a los electrodos por medio del medidor durante aproximadamente cuatro segundos. Alternativamente, el potencial podría haberse aplicado antes o mientras la sangre llegaba a la cámara de detección. Posteriormente, el potencial se interrumpió y se invirtió durante aproximadamente 10 segundos. En la FIG. 6 se ilustra un gráfico de la corriente frente al tiempo transitorio resultante de este ejemplo. La corriente inicial para cada muestra, que en la presente invención se midió aproximadamente cada 10 milisegundos y luego se promedió durante aproximadamente los primeros 50 milisegundos, está relacionada con el nivel de hematocrito de la muestra particular. Un nivel de hematocrito se determina a partir de la corriente inicial durante la primera aplicación de potencial eléctrico, mientras que un nivel de proteína C reactiva se calcula siguiendo el potencial inverso, en base a la pendiente del gráfico de corriente frente al tiempo y el nivel de hematocrito determinado.

Aunque en el presente ejemplo esta determinación se realiza como resultado de una aplicación potencial de cuatro segundos, la determinación real del nivel de hematocrito puede determinarse tan rápidamente como pueda calcularse la corriente inicial. Por tanto, si la corriente inicial se calcula en base a una media durante aproximadamente los primeros 50 milisegundos, como en la presente invención, el nivel de hematocrito puede determinarse después de aproximadamente los primeros 50 milisegundos. Por tanto, las mediciones del nivel de hematocrito de una muestra de sangre pueden realizarse en menos de un segundo.

El nivel de hematocrito de cada muestra que se determinó se ilustra mediante FIG. 7. La FIG. 7 ilustra un gráfico del nivel de concentración del hematocrito para cada muestra frente a la corriente inicial determinada. El gráfico muestra claramente que se analizaron muestras que contenían cuatro niveles diferentes de hematocrito, lo que se correlaciona con los niveles de concentración conocidos. Además, como se ilustra, niveles más altos de hematocrito llevaron generalmente a valores absolutos más bajos de las corrientes iniciales medidas. Por ejemplo, las muestras que tenían una concentración de hematocrito de aproximadamente el 33% tenían valores absolutos de corriente inicial que estaban aproximadamente en el intervalo de aproximadamente 38 microamperios a aproximadamente 33 microamperios, mientras que las muestras que tenían una concentración de hematocrito de aproximadamente el 47,5% tenían valores absolutos de corriente inicial que estaban aproximadamente en el intervalo de aproximadamente 31 microamperios a aproximadamente 26 microamperios. Se determinó una línea de mejor ajuste de los resultados, que también se ilustra en la FIG. 7. La ecuación que se correlaciona con la línea de mejor ajuste es:

H = 97.6 - 1.7658/, ^{(Ec. 1)}

donde H es el nivel de hematocrito y |//| es la corriente inicial. El error entre la ecuación que ilustra los resultados del nivel de hematocrito frete a la corriente inicial y los resultados reales se ilustra en la FIG. 8. Más particularmente, la FIG. 8 representa el porcentaje de error que existía en cada muestra de prueba frente al nivel de hematocrito medido real. Todos los resultados reales excepto dos estuvieron dentro de aproximadamente el ± 5% del intervalo calculado, con una cantidad sustancial en el intervalo de aproximadamente ± 2,5%.

Una vez que se determinó el nivel de hematocrito, se usó ese resultado, junto con la pendiente de la corriente frente al transitorio temporal de la FIG. 6 aproximadamente entre aproximadamente 9 segundos y aproximadamente 14 segundos, para calcular el valor de proteína C reactiva en la muestra. El nivel de proteína C reactiva se determinó mediante la ecuación:

C0 - -3.5 0.866exp(j) (Ec. 2)

donde Co es la concentración de proteína C reactiva e y se basa en la pendiente mencionada anteriormente y el nivel de hematocrito. Más particularmente, y eliminó el efecto del hematocrito en la pendiente y se calculó mediante la siguiente ecuación:

m

y (Ec. 3)

( 1 - O . O l t f ) 083

donde m es la pendiente de la corriente frente al tiempo transitorio aproximadamente entre aproximadamente 9 segundos y aproximadamente 14 segundos y H es el nivel de hematocrito determinado. La FIG. 9 ilustra un gráfico del nivel de proteína C reactiva calculado de cada una de las muestras frente al valor de referencia de la proteína C reactiva en plasma determinado por un inmunoensayo enzimático convencional. La mejor línea de ajuste en la FIG.

9 ilustra una correlación precisa entre el nivel determinado de proteína C reactiva y el valor de referencia equivalente.

EJEMPLO 2

Se demostró con otro ejemplo el uso de un sistema electroquímico para medir una velocidad de llenado inicial en base a la medición del flujo de corriente. El dispositivo de análisis de muestras que se usó en este ejemplo fue también el inmunosensor 110 de la FIG. 2, un medidor configurado para aplicar un potencial, y una unidad de control configurada para determinar la velocidad de llenado inicial. En particular, se aplicó un potencial a los electrodos del inmunosensor 110, se determinó un nivel de hematocrito y luego se invirtió el potencial. Posteriormente se calculó la concentración del analito en vista del nivel determinado de hematocrito. De manera similar al ejemplo anterior, se usaron varias muestras con niveles de hematocrito variables con el sistema para demostrar las capacidades del sistema. Los niveles conocidos de concentración de hematocrito fueron de aproximadamente el 33,5%, aproximadamente el 41%, aproximadamente el 47,5% y aproximadamente el 56,5%.

Se introdujo una muestra en un inmunosensor sin calentar mediante acción capilar. La muestra se introdujo en la cámara de llenado y se trasladó a la cámara de reacción, donde permaneció durante aproximadamente cinco minutos. La ventilación del inmunosensor se abrió posteriormente perforando el primer componente de sellado, permitiendo de este modo que la sangre de la muestra dispuesta en el inmunosensor fluyera desde la cámara de reacción del inmunosensor hacia la cámara de detección del inmunosensor. Dejar que la muestra espere más antes de perforar por lo menos uno de los componentes de sellado proporcionó un tiempo adecuado para que el antígeno y el conjugado anticuerpo-enzima del inmunosensor se difundiesen y reaccionasen, particularmente a la vista de la cámara de reacción sin calentar. El precalentamiento del inmunosensor puede acelerar este tiempo, como se demostró en el Ejemplo 1 anterior. En el presente ejemplo, sin embargo, no se incluyó ningún componente de calentamiento, lo que proporcionó los beneficios de eliminar las complicaciones y los costes asociados con la incorporación de un elemento de calentamiento con el sistema. Sin embargo, en los casos en los que la temperatura de una cámara no se conoce o es constante, los cálculos realizados para determinar los niveles de hematocrito y/o los niveles de proteína C reactiva deben tener en cuenta el efecto de diferentes temperaturas ambientales para proporcionar resultados más precisos. Esta explicación se proporcionó en este segundo ejemplo. En una realización, puede inferirse la temperatura de la muestra.

De manera similar al ejemplo anterior, a medida que la sangre comenzó a introducirse en la cámara de detección, se aplicó un potencial de aproximadamente 300 mV a los electrodos por medio del medidor durante aproximadamente 4 segundos. Posteriormente, el potencial se interrumpió y se invirtió durante aproximadamente 10 segundos. Se creó un gráfico de la corriente resultante frente al transitorio temporal de una manera similar al gráfico ilustrado en la FIG. 6. A partir del gráfico resultante, se determinó un nivel de hematocrito a partir de la corriente inicial durante la primera aplicación de potencial eléctrico. Posteriormente, se calculó un nivel de proteína C reactiva siguiendo el potencial inverso. El nivel calculado de proteína C reactiva se basó en la pendiente del gráfico de corriente frente al tiempo y el nivel de hematocrito determinado. Tener en cuenta la temperatura en este ejemplo proporcionó mayor precisión, como se muestra a continuación.

La corriente inicial que se determinó para cada muestra se ilustra mediante la FIG. 10. La FIG. 10 ilustra un gráfico de la corriente inicial determinada frente a la temperatura de la cámara de detección del inmunosensor en el que se dispuso la muestra. Las corrientes iniciales para los cuatro tipos de muestras (es decir, los cuatro niveles diferentes de hematocrito) se midieron en un intervalo de aproximadamente 20° C a aproximadamente 37° C. Generalmente, niveles más altos de hematocrito llevan a valores absolutos más bajos de la corriente inicial. A medida que aumentaban las temperaturas en la cámara, los valores absolutos de la corriente inicial también aumentaban generalmente. Como se muestra, la corriente inicial varió linealmente con la temperatura cuando se fijó el hematocrito. En vista de la temperatura de la cámara y la corriente inicial, el nivel de hematocrito se determinó mediante la siguiente ecuación:

H = H A - 2. \ \ i \ Q).15T (Ec. 4)

donde H es el nivel de hematocrito, |//| es la corriente inicial y T es la temperatura de la cámara de detección. De manera similar al ejemplo anterior, los errores en los niveles estimados de hematocrito estaban aproximadamente dentro del ± 5%, como se muestra en la FIG. 11. La FIG. 11 representa el porcentaje de error que existía en cada muestra de prueba frente a un nivel de hematocrito de referencia de esa muestra. También de manera similar al ejemplo anterior, en algunas realizaciones solo se realiza una determinación del valor del hematocrito, lo que permite evaluaciones rápidas de varias afecciones médicas que pueden evaluarse basándose en determinaciones del valor del hematocrito.

Una vez que se determinó el nivel de hematocrito, se usó ese resultado junto con la pendiente de la corriente frente al transitorio de tiempo aproximadamente de aproximadamente 9 segundos a aproximadamente 14 segundos y la temperatura de la cámara de detección para calcular el valor de la proteína C reactiva en la muestra. El nivel de proteína C reactiva se determinó mediante la ecuación:

C0 = -5.7 1.78 e x p ( /) (Ec. 5)

donde Co es la concentración de proteína C reactiva e y' se basa en la temperatura de la cámara de detección y una variable y, que a su vez se basa en la pendiente mencionada anteriormente y el nivel de hematocrito. Más particularmente, y' eliminó el efecto de la temperatura en la pendiente y se calculó mediante la siguiente ecuación:

y = y (Ec. 6)

1 0.068(T -25 )

donde T es la temperatura de la cámara de detección del inmunosensor e y es un término que elimina el efecto del hematocrito sobre la pendiente. La ecuación para y' supone que la pendiente cambia en un cierto porcentaje, típicamente aproximadamente en el intervalo de aproximadamente el cuatro a aproximadamente el siete por ciento, por aproximadamente cada cambio de un grado °C en la temperatura. Además, el término T-25 corrige todos los valores de y' a una temperatura estándar de 25° C. Si se debe corregir una temperatura diferente, este término puede ajustarse en consecuencia. De hecho, un experto en la técnica reconocerá muchas maneras de manipular esta ecuación, y las otras ecuaciones divulgadas a lo largo de esta divulgación, para otras muestras, temperaturas, etc.

La variable y se calculó mediante la siguiente ecuación:

m

y = ⁽1^-0.0 IH) ^1.55(Ec. 7)

donde m es la pendiente de la corriente frente al tiempo transitorio aproximadamente entre aproximadamente 9 segundos y aproximadamente 14 segundos y H es el nivel de hematocrito determinado. El término (1-0.01H) representa una fracción del volumen de plasma que luego se eleva a una potencia arbitraria. La potencia puede obtenerse como coeficiente de calibración.

La pendiente del transitorio aproximadamente entre aproximadamente 9 segundos y aproximadamente 14 segundos fue una función de la proteína C reactiva, un nivel de hematocrito y la temperatura. Cuando la concentración de proteína C reactiva se fijó en aproximadamente 0,15 mg/l, todavía había una variación considerable de la pendiente con respecto al hematocrito y la temperatura, como se muestra en la FIG. 12. La FIG.

12 ilustra un gráfico de la pendiente determinada frente a la temperatura de la cámara de detección del inmunosensor en el que se dispuso la muestra. Se midieron las corrientes iniciales para cada una de las cuatro muestras de nivel de hematocrito en un intervalo de aproximadamente 20° C a aproximadamente 37° C. Generalmente, cuanto mayor es el nivel de hematocrito en una muestra, menor es el valor de la pendiente. A medida que aumentaban las temperaturas en la cámara, generalmente aumentaban los valores de la pendiente.

La FIG. 13 ilustra un gráfico del nivel de proteína C reactiva calculado de cada una de las muestras que tiene un nivel de hematocrito de aproximadamente el 33,5% o aproximadamente el 47,5%, frente al valor de referencia de proteína C reactiva en plasma determinado por un inmunoensayo enzimático convencional. La mejor línea de ajuste en la FIG. 13 ilustra una correlación precisa entre el nivel determinado de proteína C reactiva y el valor de referencia equivalente.

Un experto en la técnica apreciará que estos dos ejemplos son simplemente dos de los muchos ejemplos de cómo pueden realizarse y usarse las enseñanzas contenidas en la presente. Además, aunque los métodos y sistemas divulgados en la presente se usan principalmente junto con la determinación de una concentración de CPR de una muestra de sangre, y se enfocan principalmente en dar cuenta de los errores que pueden resultar de los niveles variables de hematocrito en las muestras de sangre, un experto en la técnica reconocerá que las divulgaciones contenidas en la presente también pueden usarse para una variedad de otras muestras que contienen CRP.

Un experto en la técnica también reconocerá que en la medida en que varios métodos y sistemas se basan en una ecuación particular, las ecuaciones proporcionadas se basan generalmente en los ejemplos a los que se aplicaron las ecuaciones. Un experto en la técnica, en vista de la presente divulgación, será capaz de realizar ajustes a las ecuaciones divulgadas para otras situaciones.

Además, los métodos analizados en la presente, como los relacionados con la determinación de una concentración y el uso de los sistemas, tampoco están limitados por los pasos o el orden de los pasos en particular, excepto donde se indique. Un experto en la técnica reconocerá varios órdenes en los que pueden realizarse los métodos y, además, reconocerá que pueden modificarse o añadirse pasos.

Pueden adaptarse y cambiarse varios aspectos de los sistemas y métodos según se desee para varias determinaciones. Además, un experto en la técnica apreciará características y ventajas adicionales de la invención en base a las realizaciones descritas anteriormente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar un valor de hematocrito de una muestra de sangre completa, el método comprendiendo:

proporcionar una muestra de sangre completa a un inmunosensor (112) para proteína C reactiva, el inmunosensor teniendo un electrodo inferior (112), un electrodo superior (114) y un espacio capilar;

medir un flujo de corriente inicial en la muestra en por lo menos una parte del espacio capilar, en donde medir un flujo de corriente inicial comprende:

aplicar un potencial eléctrico;

realizar mediciones de corriente aproximadamente cada 10 milisegundos durante aproximadamente los primeros 50 milisegundos; y

calcular una corriente media sobre las mediciones de corriente; y

determinar un valor de hematocrito de la muestra a partir de la corriente media calculada,

en donde la muestra incluye proteína C reactiva, el método comprendiendo además calcular una concentración de la proteína C reactiva mediante:

después de determinar el valor del hematocrito, invertir el potencial eléctrico;

medir un cambio en la corriente durante un período de tiempo después de invertir el potencial eléctrico; y calcular la concentración de la proteína C reactiva usando el hematocrito determinado y el cambio medido en la corriente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la medición de un flujo de corriente inicial en la muestra se produce después de que la muestra pase a una región del espacio capilar del inmunosensor donde se genera una señal de detección.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además por lo menos uno de medir la temperatura de la muestra o inferir una temperatura de la muestra.

4. El método de la reivindicación 3, en el que calcular una concentración de proteína C reactiva comprende además calcular la concentración de proteína C reactiva usando el hematocrito determinado, el cambio en la corriente durante el período de tiempo y la temperatura de la muestra.

5. Un sistema electroquímico para realizar el método de la reivindicación 1, que comprende:

un inmunosensor (110) para proteína C reactiva, el inmunosensor teniendo un electrodo inferior (112), un electrodo superior (114) y un espacio capilar;

un medidor configurado para aplicar un potencial entre el electrodo inferior y el electrodo superior del inmunosensor; y

una unidad de control conectada al medidor y configurada para realizar los siguientes pasos:

aplicar un potencial eléctrico;

calcular una corriente media sobre las medidas de corriente; y

en donde la muestra incluye proteína C reactiva, en donde la unidad de control está configurada además para calcular una concentración de la proteína C reactiva mediante:

medir un cambio en la corriente durante un período de tiempo después de invertir el potencial eléctrico; y calcular la concentración de la proteína C reactiva usando el hematocrito determinado y el cambio medido en la corriente, y

en donde la unidad de control comprende un detector de flujo de corriente configurado para medir el flujo de corriente inicial.

6. El sistema electroquímico de la reivindicación 5, que comprende además un elemento calefactor configurado para calentar por lo menos una parte del inmunosensor.

7. El sistema electroquímico de la reivindicación 5 o 6, en el que el inmunosensor comprende además:

un primer reactivo líquido (130) que comprende un anticuerpo conjugado con una enzima en un tampón, en donde el primer reactivo líquido se coloca en tiras sobre el electrodo inferior y se seca;

un segundo reactivo líquido (132) que comprende ferricianuro, un sustrato para la enzima y un mediador en una solución de ácido diluida, en donde el segundo reactivo líquido se coloca en tiras sobre el electrodo inferior y se seca;

perlas magnéticas (134) conjugadas con un antígeno, en donde las perlas magnéticas se colocan en tiras sobre el electrodo superior y se secan sobre el mismo;

un separador (116) dispuesto entre los electrodos superior e inferior;

una cámara de reacción (118) formada en el separador y que tiene el primer reactivo y las perlas magnéticas conjugadas con el antígeno dispuesto en la misma;

una cámara de detección (120) formada en el separador y que tiene el segundo reactivo dispuesto en la misma; una cámara de llenado (122) formada por lo menos parcialmente en el separador y uno de los electrodos inferior y superior, separada una distancia de la cámara de detección, y solapando por lo menos una parte de la cámara de reacción;

una ventilación (124) formada por lo menos parcialmente en cada uno del separador, el electrodo inferior y el electrodo superior, espaciada a una distancia de la cámara de reacción, y solapando por lo menos una parte de la cámara de detección;

un primer componente de sellado (140) que tiene un anticoagulante incorporado acoplado a uno de los electrodos superior e inferior, dispuesto sobre la ventilación y configurado para formar una pared de la cámara de llenado y sellar la ventilación; y

un segundo componente de sellado (142) acoplado al otro de los electrodos inferior y superior, dispuesto sobre la ventilación y configurado para sellar la ventilación.