ES2903008B2 - FERTILIZER COMPOSITION THAT INCLUDES LIQUID SLURP AND OBTAINING PROCEDURE - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
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- C05F17/00—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation
- C05F17/20—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation using specific microorganisms or substances, e.g. enzymes, for activating or stimulating the treatment
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Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
COMPOSICIÓN FERTILIZANTE QUE COMPRENDE PURÍN LÍQUIDO Y FERTILIZER COMPOSITION THAT INCLUDES LIQUID SLURR AND
PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓNOBTAINING PROCEDURE
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓNTECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
La presente invención se engloba dentro del sector agrícola y más concretamente dentro de la producción de productos fertilizantes y bioestimulantes.The present invention is included within the agricultural sector and more specifically within the production of fertilizer and biostimulant products.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
Los fertilizantes bioestimulantes o biofertilizantes son productos que contienen microorganismos vivos o compuestos orgánicos derivados de microrganismos, que proporcionan a las plantas los nutrientes necesarios para su desarrollo, al mismo tiempo que mejoran la calidad del suelo. Además de nutrirlas, las protegen de patógenos del suelo y estimulan su crecimiento.Biostimulant fertilizers or biofertilizers are products that contain live microorganisms or organic compounds derived from microorganisms, which provide plants with the nutrients necessary for their development, while improving soil quality. In addition to nourishing them, they protect them from soil pathogens and stimulate their growth.
Un bioestimulante se considera una sustancia o mezcla de ellas, que pueden incluir un microorganismo, que se aplica sobre plantas de cultivo, semillas o raíces con el objetivo de estimular procesos biológicos de la planta, normalmente mejorando la disponibilidad de nutrientes y optimizando su absorción. Los fertilizantes bioestimulantes pueden incrementar la tolerancia a estrés abiótico o la calidad de cosecha.A biostimulant is considered a substance or mixture of substances, which may include a microorganism, that is applied to crop plants, seeds or roots with the aim of stimulating biological processes of the plant, normally improving the availability of nutrients and optimizing their absorption. Biostimulant fertilizers can increase tolerance to abiotic stress or crop quality.
Las microalgas son organismos fotosintéticos que se están abriendo camino en la agricultura debido a sus propiedades bioestimulantes. Las microalgas se caracterizan por tener altos niveles de macro y micronutrientes esenciales para el crecimiento y desarrollo óptimo de las plantas. El uso de microalgas en las producciones agrícolas está atrayendo el interés de los productores, ya que se consideran una alternativa ambiental amigable y económica respecto a los productos sintéticos tradicionales. Las principales especies de microalgas bioestimulantes disponibles comercialmente son Isochrysis spp., Chaetoceros spp., Chioreila spp., Arthrospira spp. y Dunaliella spp. (Priyadarshani y Rath 2012, J Algal Biomass Utln 3(4):89).Microalgae are photosynthetic organisms that are making their way into agriculture due to their biostimulant properties. Microalgae are characterized by having high levels of macro and micronutrients essential for the optimal growth and development of plants. The use of microalgae in agricultural production is attracting the interest of producers, since they are considered an environmentally friendly and economical alternative to traditional synthetic products. The main commercially available biostimulant microalgae species are Isochrysis spp., Chaetoceros spp., Chioreila spp., Arthrospira spp. and Dunaliella spp. (Priyadarshani and Rath 2012, J Algal Biomass Utln 3(4):89).
El documento ES 2693793 describe un proceso de obtención de un bioestimulante a partir de la hidrólisis enzimática de la biomasa de la microalga spirulina (Arthrospira spp). Sin embargo, este procedimiento requiere la adición de excipientes exógenos de nitrógeno (N), fosforo (P) o potasio (K) al producto de la hidrólisis enzimática. Los compuestos que se adicionan proceden de tratamientos agresivos con ácidos, como el ácido nítrico, el ácido fosfórico, el ácido sulfúrico y otros ácidos fuertes. Este tipo de productos químicos requiere un manejo y un almacenamiento que es considerado de riesgo. Evitar estas fuentes peligrosas de NPK es un objetivo desde el punto de vista medioambiental y de la sostenibilidad del proceso, tanto en la huella de carbono, como en la eliminación de residuos peligrosos.Document ES 2693793 describes a process for obtaining a biostimulant from the enzymatic hydrolysis of the biomass of the spirulina microalgae ( Arthrospira spp). However, this procedure requires the addition of exogenous excipients of nitrogen (N), phosphorus (P) or potassium (K) to the enzymatic hydrolysis product. The compounds that are added come from aggressive treatments with acids, such as nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid and other strong acids. This type of chemical products requires handling and storage that is considered risky. Avoiding these dangerous sources of NPK is an objective from the environmental point of view and the sustainability of the process, both in terms of the carbon footprint and the elimination of hazardous waste.
Los purines son compuestos de deshecho que se componen de agua y de excrementos de animales. Son similares al estiércol, pero la diferencia es que mientras este es una mezcla de excrementos de animales de granja combinados con otros vertidos (como el agua de lavado, restos de alimento o paja), el purín es una mezcla de agua, excrementos y otros vertidos que incluye al menos un 85% de agua. Los purines se han usado tradicionalmente como fertilizantes aplicados directamente sobre los cultivos cercanos a las granjas de explotación ganadera en las que se producen dichos purines. La gestión de los purines producidos en estas explotaciones obliga a su aplicación en cultivos cercanos, para a) deshacerse del residuo y b) evitar su transporte. Sin embargo, se ha comprobado que los purines derivados de la producción masiva de ganado, aves o peces en granjas o piscifactorías favorecen la contaminación por eutrofización de las aguas superficiales o acuíferos, lo que lleva consigo la contaminación de los suelos. Además de la contaminación por eutrofización, otros problemas de la acumulación y uso directo de los purines son los malos olores y la emisión de gases de efecto invernadero. El problema llega a ser más grave cuando la contaminación por nitratos procedentes de los purines pasa a las redes de agua potable de los municipios y, por tanto, son ingeridos por los ciudadanos. El riesgo no es solo de tipo medioambiental, ya que se favorece la proliferación de microorganismos tóxicos que pueden producir enfermedades. Por último, otro aspecto a tener en cuenta es que el transporte de purines para su aplicación directa o para la creación de balsas de almacenamiento de purines, tiene el inconveniente adicional del consumo combustible para transportar un material cuya composición tiene normalmente alrededor de un 90 - 85% de agua. Se considera que transportar purines a más de 100 km de la granja de explotación ganadera (distancia a la que habitualmente se encuentran las zonas aptas para el vertido) no es viable.Slurry is waste compounds that are made up of water and animal excrement. They are similar to manure, but the difference is that while this is a mixture of farm animal excrement combined with other waste (such as washing water, food scraps or straw), slurry is a mixture of water, excrement and other discharges that include at least 85% water. Slurry has traditionally been used as fertilizers applied directly to crops near the livestock farms where said slurry is produced. The management of slurry produced on these farms requires its application to nearby crops, to a) get rid of the waste and b) avoid its transportation. However, it has been proven that slurry derived from the mass production of livestock, poultry or fish on farms or fish farms favors contamination by eutrophication of surface waters or aquifers, which leads to soil contamination. In addition to pollution due to eutrophication, other problems with the accumulation and direct use of slurry are bad odors and the emission of greenhouse gases. The problem becomes more serious when nitrate contamination from slurry enters the municipal drinking water networks and, therefore, is ingested by citizens. The risk is not only environmental, since it favors the proliferation of toxic microorganisms that can cause diseases. Finally, another aspect to take into account is that the transportation of slurry for direct application or for the creation of slurry storage ponds has the additional drawback of fuel consumption to transport a material whose composition normally has around 90 - 85% water. It is considered that transporting slurry more than 100 km from the livestock farm (the distance at which areas suitable for dumping are usually found) is not viable.
Existe por lo tanto un problema en el estado del arte relativo a la producción de fertilizantes bioestimulantes que a su vez ayude a la gestión de los purines de origen animal. Son necesarios procedimientos que reduzcan la cantidad de purines generados y además eliminen los olores generados durante su aplicación en el campo. La presente invención soluciona estos problemas.There is therefore a problem in the state of the art related to the production of biostimulant fertilizers that in turn helps the management of manure of animal origin. Procedures are necessary to reduce the amount of slurry generated and also eliminate odors generated during application in the field. The present invention solves these problems.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención soluciona los problemas detectados en el estado del arte, describiendo un procedimiento para la obtención de un fertilizante de uso agrícola cuya base es purín líquido.The present invention solves the problems detected in the state of the art, describing a procedure for obtaining a fertilizer for agricultural use whose base is liquid slurry.
En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de una composición fertilizante caracterizado por comprender las siguientes etapas:In one embodiment, the invention refers to a procedure for obtaining a fertilizer composition characterized by comprising the following steps:
a) obtención de un purín líquido;a) obtaining a liquid slurry;
b) introducción del purín líquido obtenido en la etapa a) en un tanque de biocatálisis;b) introduction of the liquid slurry obtained in step a) into a biocatalysis tank;
c) introducción de biomasa de una microalga en el tanque de biocatálisis; d) calentamiento de la muestra de la etapa c);c) introduction of microalgae biomass into the biocatalysis tank; d) heating the sample from step c);
e) ajustar pH de la muestra de la etapa d), añadir al menos una enzima de tipo endoproteasa, e incubar la mezcla;e) adjust the pH of the sample from step d), add at least one endoprotease-type enzyme, and incubate the mixture;
f) ajustar pH de la mezcla de la etapa e), añadir al menos una enzima de tipo exoproteasa, e incubar la mezcla;f) adjust the pH of the mixture from step e), add at least one exoprotease-type enzyme, and incubate the mixture;
g) obtención de la composición fertilizante.g) obtaining the fertilizer composition.
En otra realización, la invención se refiere a la composición fertilizante obtenido de acuerdo con el procedimiento anterior.In another embodiment, the invention relates to the fertilizer composition obtained according to the previous procedure.
En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para fertilizar un cultivo que comprende aplicar la composición fertilizante de la invención.In another embodiment, the invention relates to a method for fertilizing a crop that comprises applying the fertilizer composition of the invention.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Fotografías de bandejas de lechugas después de cada tratamiento. C-(control negativo), C+ (solución comercial), T1 (fertilizante basado en purines) y T2 (fertilizante basado en microalgas). Figure 1. Photographs of lettuce trays after each treatment. C-(negative control), C+ (commercial solution), T1 (fertilizer based on slurry) and T2 (fertilizer based on microalgae).
Figura 2. Biomasa aérea (g) de las plantas de lechuga. El valor LSD se refiere al test estadístico de Fisher. C- (control negativo), C+ (solución comercial), T1 (fertilizante basado en purines) y T2 (fertilizante basado en microalgas). a, b, c y d se refieren a las diferencias estadísticas entre los grupos de análisis. Rango de p-valor: >0.05: ns; 0.05 0.01: *; 0.01-0.001: **; <0.001: ***; ns: No significativo. Figure 2. Aboveground biomass (g) of lettuce plants. The LSD value refers to Fisher's statistical test. C- (negative control), C+ (commercial solution), T1 (fertilizer based on slurry) and T2 (fertilizer based on microalgae). a, b, c and d refer to the statistical differences between the analysis groups. p-value range: >0.05: ns; 0.05 0.01: *; 0.01-0.001: **; <0.001: ***; ns: Not significant.
Figura 3. Fotografías de las raíces de lechuga de cada tratamiento. C- (control negativo), C+ (solución comercial), T1 (fertilizante basado en purines) y T2 (fertilizante basado en microalgas). Figure 3 . Photographs of the lettuce roots from each treatment. C- (negative control), C+ (commercial solution), T1 (fertilizer based on slurry) and T2 (fertilizer based on microalgae).
Figura 4. Biomasa radicular (g) de las plantas de lechuga. El valor LSD se refiere al test estadístico de Fisher. C- (control negativo), C+ (solución comercial), T1 (biofertilizante 1) y T2 (biofertilizante 2). a, b, c y d se refieren a las diferencias estadísticas entre los grupos de análisis. Rango de p-valor: >0.05: ns; 0.05-0.01: *; 0.01-0.001: **; <0.001: ***; ns: No significativo. Figure 4. Root biomass (g) of lettuce plants. The LSD value refers to Fisher's statistical test. C- (negative control), C+ (commercial solution), T1 (biofertilizer 1) and T2 (biofertilizer 2). a, b, c and d refer to the statistical differences between the analysis groups. p-value range: >0.05: ns; 0.05-0.01: *; 0.01-0.001: **; <0.001: ***; ns: Not significant.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓNDETAILED STATEMENT OF THE INVENTION
La presente invención se refiere a una composición fertilizante de uso agrícola obtenida a partir de microalgas y cuya base es purín líquido, a su procedimiento de obtención y un procedimiento para fertilizar un cultivo aplicando la composición fertilizante de la invención.The present invention refers to a fertilizer composition for agricultural use obtained from microalgae and whose base is liquid slurry, to its method of obtaining and a procedure to fertilize a crop by applying the fertilizer composition of the invention.
En una realización de la invención se describe el procedimiento para la obtención de la composición fertilizante, que se caracteriza por comprender las siguientes etapas: a) obtención de un purín líquido;In one embodiment of the invention, the procedure for obtaining the fertilizer composition is described, which is characterized by comprising the following steps: a) obtaining a liquid slurry;
b) introducción del purín líquido obtenido en la etapa a) en un tanque de biocatálisis; c) introducción de biomasa de una microalga en el tanque de biocatálisis;b) introduction of the liquid slurry obtained in step a) into a biocatalysis tank; c) introduction of microalgae biomass into the biocatalysis tank;
d) calentamiento de la muestra de la etapa c);d) heating the sample from step c);
e) ajustar pH de la muestra de la etapa d), añadir al menos una enzima de tipo endoproteasa, e incubar la mezcla;e) adjust the pH of the sample from step d), add at least one endoprotease-type enzyme, and incubate the mixture;
f) ajustar pH de la mezcla de la etapa e), añadir al menos una enzima de tipo exoproteasa, e incubar la mezcla;f) adjust the pH of the mixture from step e), add at least one exoprotease-type enzyme, and incubate the mixture;
g) obtención de la composición fertilizante. g) obtaining the fertilizer composition.
El purín líquido en la etapa a) se obtiene del lavado de las explotaciones de ganado, que incluye los excrementos sólidos y líquidos de los animales. Una vez recogido este residuo líquido, se centrifuga y se decanta o filtra, obteniendo el purín de la fracción líquida. El uso de purín líquido en la presente invención permite la reutilización de un residuo perjudicial para el suelo y los acuíferos, enriquece el fertilizante en elementos químicos como nitrógeno y potasio y además ayuda a disminuir los olores asociados a purines líquidos.The liquid slurry in stage a) is obtained from washing livestock farms, which includes solid and liquid excrement from the animals. Once this liquid residue has been collected, it is centrifuged and decanted or filtered, obtaining slurry from the liquid fraction. The use of liquid slurry in the present invention allows the reuse of a waste that is harmful to the soil and aquifers, enriches the fertilizer in chemical elements such as nitrogen and potassium and also helps reduce odors associated with liquid slurry.
En una realización preferida, el purín líquido se obtiene de una explotación de ganado porcino, lanar, vacuno, caballar o avícola. En una realización más preferida, el purín líquido se obtiene de una explotación de ganado porcino.In a preferred embodiment, the liquid slurry is obtained from a pig, sheep, cattle, horse or poultry farm. In a more preferred embodiment, the liquid slurry is obtained from a pig farm.
En la etapa b) del procedimiento, el purín líquido obtenido en la etapa a) se introduce en un tanque de biocatálisis, en el que posteriormente tendrá lugar una hidrólisis enzimática. Un tanque de biocatálisis es cualquier reactor que permita que se lleve a cabo una reacción de hidrólisis enzimática, permita un control de temperatura durante toda la reacción (termostatizado), la mantenga en agitación (por ejemplo, que tenga una pala agitadora incorporada) y controle el valor del pH de la mezcla.In stage b) of the procedure, the liquid slurry obtained in stage a) is introduced into a biocatalysis tank, in which an enzymatic hydrolysis will subsequently take place. A biocatalysis tank is any reactor that allows an enzymatic hydrolysis reaction to take place, allows temperature control throughout the reaction (thermostatting), keeps it agitated (for example, has a built-in stirring blade), and controls the pH value of the mixture.
En la etapa c) se añade la biomasa de una microalga al tanque de biocatálisis. La concentración de microalga frente al volumen total de purín es de un 5 a 30 % p/v. En una realización preferida, la concentración de microalga es del 20 % p/v respecto al volumen total de purín líquido. En una realización preferida, la microalga se selecciona entre los géneros Scenedesmus, Nanochioropsis, Chioreila y Arthrospira. En una realización más preferida, la microalga es una cianobacteria del género Arthrospira, conocida como spirulina (o espirulina). La microalga puede ser húmeda o seca, en este caso en polvo. La relación preferida entre la microalga y el agua presente en la mezcla (procedente del purín líquido) para que tenga lugar la hidrólisis, es 1:10 a 1:20. Esta relación de elementos hace posible el encuentro en las siguientes fases del procedimiento entre las enzimas y las proteínas procedentes de la microalga, sin que haya una viscosidad excesiva debido al resto de componentes de la biomasa, algo que ocurre con relaciones superiores a 1:20.In stage c) the biomass of a microalgae is added to the biocatalysis tank. The concentration of microalgae compared to the total volume of slurry is 5 to 30% w/v. In a preferred embodiment, the concentration of microalgae is 20% w/v with respect to the total volume of liquid slurry. In a preferred embodiment, the microalgae is selected from the genera Scenedesmus, Nanochioropsis, Chioreila and Arthrospira. In a more preferred embodiment, the microalga is a cyanobacteria of the genus Arthrospira, known as spirulina (or spirulina). The microalgae can be wet or dry, in this case in powder form. The preferred ratio between the microalgae and the water present in the mixture (from the liquid slurry) for hydrolysis to take place is 1:10 to 1:20. This ratio of elements makes it possible for the enzymes and proteins from the microalgae to meet in the following phases of the procedure, without excessive viscosity due to the rest of the components of the biomass, something that occurs with ratios greater than 1:20. .
En la etapa d) comienza el proceso de hidrólisis enzimática. Para ello, en primer lugar, se calienta la muestra presente en el tanque de biocatálisis (microalga y purín líquido) a una temperatura entre 50 - 65 °C en agitación entre 50 y 100 rpm. En el caso de que la biomasa de la microalga sea de origen sólido, es necesario que esté bien resuspendida en el purín líquido antes de que comience la hidrólisis. Durante esta etapa, la biomasa de la microalga se hidrata con el agua del purín y el pH de la reacción va disminuyendo por las propias interacciones entre ambos ingredientes. Esta etapa de calentamiento o de hidratación de la microalga dura entre 60 y 120 minutos.In stage d) the enzymatic hydrolysis process begins. To do this, first, the sample present in the biocatalysis tank (microalgae and liquid slurry) is heated to a temperature between 50 - 65 °C while stirring between 50 and 100 rpm. If the microalgae biomass is of solid origin, it must be well resuspended. in the liquid slurry before hydrolysis begins. During this stage, the microalgae biomass is hydrated with the slurry water and the pH of the reaction decreases due to the interactions between both ingredients. This heating or hydration stage of the microalgae lasts between 60 and 120 minutes.
A continuación, se añaden las enzimas proteolíticas o proteasas que llevarán a cabo la hidrólisis de las proteínas de la biomasa de la microalga. La concentración de cada una de ellas debe ser del 1 a 20 % (p/p) respecto a la cantidad de microalga. La relación entre el sustrato (microalga) y cada enzima es importante para que la reacción sea efectiva. En una realización más preferida, la concentración de cada enzima es del 2 -10 % (p/p) respecto a la cantidad de microalga. En una realización todavía más preferida, la concentración de cada enzima es del 2 - 4 % (p/p) respecto a la cantidad de microalga.Next, proteolytic enzymes or proteases are added that will carry out the hydrolysis of the proteins in the microalgae biomass. The concentration of each of them should be 1 to 20% (w/w) with respect to the amount of microalgae. The relationship between the substrate (microalgae) and each enzyme is important for the reaction to be effective. In a more preferred embodiment, the concentration of each enzyme is 2-10% (w/w) with respect to the amount of microalgae. In an even more preferred embodiment, the concentration of each enzyme is 2-4% (w/w) with respect to the amount of microalgae.
La adición de las enzimas tiene lugar en dos fases. En la etapa e), la primera enzima utilizada en la reacción es una endoproteasa (o una combinación de endoproteasas). La endoproteasa hidroliza los enlaces amídicos dentro de la cadena de proteína a pH 8 -9. En una realización preferida de la invención, la endoproteasa se selecciona del grupo que consiste en: una serín endoproteasa, una cisteín endoproteasa, una aspártico proteasa o una metaloproteasa. La endoproteasa puede ser de origen bacteriano, vírico, animal o vegetal. Ejemplos no limitativos de fuentes bacterianas son endoproteasas de Aspergillus oryzae, Bacillus sp., Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, E. coli, Yersinia, Salmonella, Streptococcus sp o Pseudomonas, entre otros.. Ejemplos no limitativos de fuentes animales son endoproteasas de glándulas pancreáticas, endoproteasas de membrana o endoproteasas específicas de inmunoglobulinas. En una realización más preferida, la endoproteasa pertenece a la especie Bacillus licheniformis, Bacillus sp. o es una combinación de las mismas. En una realización más preferida, endoproteasa se selecciona del grupo que consiste en una endoproteasa cuyo código enzimático de acuerdo con el esquema NC-IUBMB (Nomenclature Commitee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) es EC 3.4.1.1, EC 3.4.1.2, EC 3.4.1.3, EC 3.4.1.4, EC 3.4.4.16, EC 3.4.21.62, EC 3.4.18.1, EC 3.4.22.2 o EC 3.4.23.1.The addition of the enzymes takes place in two phases. In step e), the first enzyme used in the reaction is an endoprotease (or a combination of endoproteases). The endoprotease hydrolyzes the amide bonds within the protein chain at pH 8 -9. In a preferred embodiment of the invention, the endoprotease is selected from the group consisting of: a serine endoprotease, a cysteine endoprotease, an aspartic protease or a metalloprotease. The endoprotease can be of bacterial, viral, animal or plant origin. Non-limiting examples of bacterial sources are endoproteases from Aspergillus oryzae, Bacillus sp., Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, E. coli, Yersinia, Salmonella, Streptococcus sp or Pseudomonas, among others. Non-limiting examples of animal sources are endoproteases from pancreatic glands. , membrane endoproteases or immunoglobulin-specific endoproteases. In a more preferred embodiment, the endoprotease belongs to the species Bacillus licheniformis, Bacillus sp. or it is a combination of them. In a more preferred embodiment, endoprotease is selected from the group consisting of an endoprotease whose enzymatic code according to the NC-IUBMB ( Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) scheme is EC 3.4.1.1, EC 3.4.1.2 , EC 3.4.1.3, EC 3.4.1.4, EC 3.4.4.16, EC 3.4.21.62, EC 3.4.18.1, EC 3.4.22.2 or EC 3.4.23.1.
Antes de añadir la enzima en la etapa e) es necesario que el pH de la reacción sea entre pH 8 y 9. Por este motivo, antes de la adición de la endoproteasa se ajusta el pH de la muestra a 8 - 9 con una base (como por ejemplo hidróxido sódico). A medida que progresa la reacción, se produce una disminución del pH en la mezcla debida a la rotura de los enlaces peptídicos. La reacción tiene lugar a una temperatura ente 50 y 70 °C entre 2 y 8 horas. En una realización preferida, la reacción tiene lugar a 65 °C durante tres horas.Before adding the enzyme in step e) it is necessary that the pH of the reaction be between pH 8 and 9. For this reason, before adding the endoprotease, the pH of the sample is adjusted to 8 - 9 with a base (such as sodium hydroxide). As the reaction progresses, a decrease in pH occurs in the mixture due to breakdown of peptide bonds. The reaction takes place at a temperature between 50 and 70 °C between 2 and 8 hours. In a preferred embodiment, the reaction takes place at 65°C for three hours.
A continuación, en la etapa f), antes de añadir la enzima, es imprescindible revisar el pH de la mezcla y, en caso de ser necesario, ajustar el pH a 6-7. Esta segunda enzima proteolítica es una exoproteasa (o una combinación de exoproteasas). La exoproteasa elimina los aminoácidos terminales de las proteínas. En una realización preferida de la invención, la exoproteasa se selecciona del grupo que consiste en: una aminopeptidasa, una carboxipeptidasa, una dipeptidil-peptidasa, una peptidil-dipeptidasa, una tripeptidilpeptidasa o una dipeptidasa. La exoproteasa puede ser de origen bacteriano, vírico, animal o vegetal. Ejemplos no limitativos de fuentes bacterianas son exoproteasas de Aspergillus oryzae, Bacillus sp., Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, E. coli, Yersinia, Salmonella, Streptococcus sp o Pseudomonas, entre otros. Ejemplos no limitativos de fuentes animales son exoproteasas de glándulas pancreáticas, exoproteasas de membrana o exoproteasas específicas de inmunoglobulinas. En una realización más preferida, la exoproteasa procede de Aspergillus oryzae. En otra realización más preferida, la exoproteasa se selecciona del grupo que consiste en una exoproteasa cuyo código enzimático de acuerdo con el esquema NC-IUBMB es EC 3.4.11, EC 3.4.16, EC 3.4.17 o EC 3.4.18. En otra realización más preferida, durante la etapa f) se utiliza la combinación de proteasas cisteína proteasa (EC 3.4.22), subtilisina (EC 3.4.21.62), leucina aminopeptidasa (EC 3.4.11.1) y carboxi peptidasa ácida (EC 3.4.18.1).Next, in step f), before adding the enzyme, it is essential to check the pH of the mixture and, if necessary, adjust the pH to 6-7. This second proteolytic enzyme is an exoprotease (or a combination of exoproteases). Exoprotease removes the terminal amino acids from proteins. In a preferred embodiment of the invention, the exoprotease is selected from the group consisting of: an aminopeptidase, a carboxypeptidase, a dipeptidyl peptidase, a peptidyl dipeptidase, a tripeptidylpeptidase or a dipeptidase. The exoprotease can be of bacterial, viral, animal or plant origin. Non-limiting examples of bacterial sources are exoproteases from Aspergillus oryzae, Bacillus sp., Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, E. coli, Yersinia, Salmonella, Streptococcus sp or Pseudomonas, among others. Non-limiting examples of animal sources are pancreatic gland exoproteases, membrane exoproteases or immunoglobulin-specific exoproteases. In a more preferred embodiment, the exoprotease is derived from Aspergillus oryzae. In another more preferred embodiment, the exoprotease is selected from the group consisting of an exoprotease whose enzymatic code according to the NC-IUBMB scheme is EC 3.4.11, EC 3.4.16, EC 3.4.17 or EC 3.4.18. In another more preferred embodiment, during step f) the combination of proteases cysteine protease (EC 3.4.22), subtilisin (EC 3.4.21.62), leucine aminopeptidase (EC 3.4.11.1) and acid carboxy peptidase (EC 3.4) is used. 18.1).
Antes de añadir la enzima en la etapa f) es necesario que el pH de la reacción sea entre pH 6 y 7. Por este motivo, antes de la adición de la exoproteasa se ajusta el pH de la muestra a 6 - 7 con un ácido (como por ejemplo ácido cítrico). La reacción tiene lugar a una temperatura ente 50 y 70 °C entre 2 y 8 horas. En una realización preferida, la reacción tiene lugar a 65 °C durante tres horas.Before adding the enzyme in step f) it is necessary that the pH of the reaction be between pH 6 and 7. For this reason, before adding the exoprotease, the pH of the sample is adjusted to 6 - 7 with an acid (such as citric acid). The reaction takes place at a temperature between 50 and 70 °C between 2 and 8 hours. In a preferred embodiment, the reaction takes place at 65°C for three hours.
Para obtener una alta eficiencia en la reacción de hidrólisis, es necesaria una combinación de enzimas que trabajen a diferentes pHs y compuestos ácidos y bases fuertes que permitan regular las condiciones de la reacción.To obtain high efficiency in the hydrolysis reaction, a combination of enzymes that work at different pHs and strong acid and base compounds that allow regulating the reaction conditions is necessary.
Para finalizar la hidrólisis proteica las enzimas se inactivan con calor, mediante una disminución del pH o con una combinación de ambos. La inactivación con calor tiene lugar a temperatura superior a 80 °C. El pH de la composición fertilizante obtenida en la etapa g) se ajusta a un pH entre 3 y 4 y finalmente el producto se envasa para su almacenaje o aplicación en cultivo.To complete protein hydrolysis, the enzymes are inactivated with heat, by lowering the pH or with a combination of both. Heat inactivation takes place at a temperature above 80 °C. The pH of the fertilizer composition obtained in the stage g) is adjusted to a pH between 3 and 4 and finally the product is packaged for storage or application in cultivation.
Tener un valor de pH adecuado en las diferentes etapas de la reacción de hidrólisis es esencial en la invención para que la reacción tenga lugar. En el caso de que estos compuestos ácidos o bases usados para ajustar el pH durante la reacción queden libres en la composición una vez finalice la reacción, estos forman sales, por lo que su cantidad en el producto final es residual.Having a suitable pH value in the different stages of the hydrolysis reaction is essential in the invention for the reaction to take place. In the event that these acid or base compounds used to adjust the pH during the reaction remain free in the composition once the reaction is completed, they form salts, so their amount in the final product is residual.
El purín en la etapa a) sirve como el elemento líquido de la hidrólisis enzimática. En los procedimientos hidrolíticos descritos en el estado del arte se introduce únicamente agua. No hay ningún caso descrito en el que este elemento líquido en el que tiene lugar la hidrólisis sea purín procedente de explotaciones ganaderas. Esto es algo completamente novedoso. Además, las ventajas de introducir purín líquido como el elemento acuoso de la reacción es que se consigue aumentar la cantidad de elementos químicos NPK (nitrógeno-fósforo-potasio) en la composición fertilizante final.The slurry in step a) serves as the liquid element of the enzymatic hydrolysis. In the hydrolytic procedures described in the state of the art, only water is introduced. There is no case described in which this liquid element in which hydrolysis takes place is manure from livestock farms. This is something completely new. Furthermore, the advantages of introducing liquid slurry as the aqueous element of the reaction is that it is possible to increase the amount of NPK (nitrogen-phosphorus-potassium) chemical elements in the final fertilizer composition.
Para conseguir una composición fertilizante adecuada, es necesario una alta eficiencia de la reacción de hidrólisis, dado que el resultado de esta reacción va a determinar las características del producto final. La eficiencia de la hidrólisis depende de las condiciones de reacción utilizadas (concentración de sustrato, relación enzima/sustrato, tiempo de reacción, pH y temperatura). Las características fisicoquímicas de los purines han sido estudiadas y es necesario conocerlas para diseñar la reacción de hidrolisis y obtener un producto final adecuado que sea un fertilizante de plantas.To achieve an adequate fertilizer composition, a high efficiency of the hydrolysis reaction is necessary, since the result of this reaction will determine the characteristics of the final product. The efficiency of hydrolysis depends on the reaction conditions used (substrate concentration, enzyme/substrate ratio, reaction time, pH and temperature). The physicochemical characteristics of slurry have been studied and it is necessary to know them to design the hydrolysis reaction and obtain a suitable final product that is a plant fertilizer.
La incorporación del purín al inicio de la hidrólisis permite controlar desde el inicio la reacción, ya que la esta está afectada por la relación “medio de reacción (purines) y sustrato (microalga)” y “sustrato (microalga) y enzimas (endo- y exoproteasas)”. De esta forma se evita un efecto de dilución que surgiría si el purín fuera añadido una vez la reacción de hidrolisis hubiera comenzado.The incorporation of slurry at the beginning of hydrolysis allows the reaction to be controlled from the beginning, since it is affected by the relationship “reaction medium (slurry) and substrate (microalgae)” and “substrate (microalgae) and enzymes (endo- and exoproteases). In this way, a dilution effect that would arise if slurry were added once the hydrolysis reaction had begun is avoided.
Otra realización de la invención se refiere a la composición fertilizante (o biofertilizante) obtenida de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente.Another embodiment of the invention refers to the fertilizer (or biofertilizer) composition obtained according to the procedure described above.
El porcentaje de purín líquido respecto al total del fertilizante es desde un 75 % hasta un 95 % v/v respecto a la cantidad total de composición fertilizante obtenida. En una realización preferida, el porcentaje de purín líquido inicial en el procedimiento constituye el 80 % (v/v) de la composición fertilizante obtenida al finalizar la reacción.The percentage of liquid slurry with respect to the total fertilizer is from 75% to 95% v/v with respect to the total amount of fertilizer composition obtained. In a preferred embodiment, the percentage of initial liquid slurry in the procedure constitutes 80% (v/v) of the fertilizer composition obtained at the end of the reaction.
La composición fertilizante obtenida mediante el procedimiento descrito anteriormente tiene un contenido NPK de 1,5 - 3,0 p/v (N); 1,0 - 2,0 p/v (P) y 0,1- 0,5 p/v (K), sin necesidad de incorporar otras fuentes nutricionales. En una realización preferida, el contenido NPK del fertilizante es de 1,8:1,5:0,3. El aporte de elementos es notable en el contenido de nitrógeno y potasio, si se tiene en cuenta que un hidrolizado de microalgas en crudo, sin elementos añadidos, tiene un contenido NPK de 0,9:0,2:0,05.The fertilizer composition obtained by the procedure described above has an NPK content of 1.5 - 3.0 w/v (N); 1.0 - 2.0 w/v (P) and 0.1- 0.5 w/v (K), without the need to incorporate other nutritional sources. In a preferred embodiment, the NPK content of the fertilizer is 1.8:1.5:0.3. The contribution of elements is notable in the nitrogen and potassium content, if it is taken into account that a crude hydrolyzate of microalgae, without added elements, has an NPK content of 0.9:0.2:0.05.
El empleo de purín como fuente de nutrientes en la composición fertilizante evita el uso (manipulación y almacenamiento) de sustancias químicas nocivas, como el ácido nítrico, el ácido fosfórico, el nitrato potásico o el sulfato potásico. Además, el uso del purín también evita realizar mezclas químicas tóxicas o contaminantes para obtener al final una composición fertilizante con unos valores NPK similares a los fertilizantes obtenidos a partir de procedimientos que usan estas sustancias químicas nocivas.The use of manure as a source of nutrients in the fertilizer composition avoids the use (handling and storage) of harmful chemical substances, such as nitric acid, phosphoric acid, potassium nitrate or potassium sulfate. Furthermore, the use of slurry also avoids making toxic or polluting chemical mixtures to ultimately obtain a fertilizer composition with NPK values similar to fertilizers obtained from procedures that use these harmful chemical substances.
La composición fertilizante obtenida mediante el procedimiento de la invención tiene una cantidad de aminoácidos libres disponibles incrementados de 2 a 5 % respecto a la cantidad de aminoácidos libres presentes en fertilizantes basados en microalgas, pero sin purín líquido como base líquida de la reacción. Los aminoácidos libres son fácilmente asimilables por las plantas a nivel foliar y radicular, lo que incrementa el potencial bioestimulante de la composición fertilizante de la invención.The fertilizer composition obtained by the process of the invention has an amount of available free amino acids increased from 2 to 5% with respect to the amount of free amino acids present in fertilizers based on microalgae, but without liquid slurry as the liquid base of the reaction. Free amino acids are easily assimilated by plants at the foliar and root levels, which increases the biostimulant potential of the fertilizer composition of the invention.
La composición fertilizante además logra las mismas (e incluso mayores) tasas de producción en cultivos y benefician la floración y cuajado, mediante su aporte NPK. Durante la hidrólisis de este procedimiento se generan L-aminoácidos, fácilmente asimilables por la planta, al contrario de los aminoácidos obtenidos mediante hidrólisis ácida, que son D-aminoácidos.The fertilizer composition also achieves the same (and even higher) production rates in crops and benefits flowering and fruit set, through its NPK contribution. During the hydrolysis of this procedure, L-amino acids are generated, easily assimilated by the plant, unlike the amino acids obtained through acid hydrolysis, which are D-amino acids.
La composición fertilizante también proporciona a la planta otras moléculas esenciales para el desarrollo del organismo vegetal como fitohormonas y pigmentos antioxidantes que ayudan a la planta a realizar sus procesos internos de una manera más eficiente. Además, los minerales provenientes del purín se incorporan a la composición fertilizante debido a la disminución progresiva del pH durante la reacción de hidrólisis producida por los aminoácidos libres generados. Esto es completamente diferente a otras hidrolisis enzimáticas a partir de biomasa de microalgas, en las que les añaden componentes químicos a pH bajo para modificar el contenido NPK una vez finalizada la reacción.The fertilizer composition also provides the plant with other essential molecules for the development of the plant organism such as phytohormones and antioxidant pigments that help the plant to carry out its internal processes in a more efficient way. Furthermore, the minerals from the slurry are incorporated into the fertilizer composition due to the progressive decrease in pH during the hydrolysis reaction produced by the free amino acids generated. This is completely different from other hydrolysis enzymatic from microalgae biomass, in which chemical components are added at low pH to modify the NPK content once the reaction is complete.
Otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para fertilizar un cultivo que comprende aplicar la composición fertilizante de la invención, obtenida mediante un procedimiento que se caracteriza por comprender las siguientes etapas:Another embodiment of the invention refers to a procedure for fertilizing a crop that comprises applying the fertilizer composition of the invention, obtained by a procedure characterized by comprising the following steps:
a) obtención de un purín líquido;a) obtaining a liquid slurry;
b) introducción del purín líquido obtenido en la etapa a) en un tanque de biocatálisis; c) introducción de biomasa de una microalga en el tanque de biocatálisis;b) introduction of the liquid slurry obtained in step a) into a biocatalysis tank; c) introduction of microalgae biomass into the biocatalysis tank;
d) calentamiento de la muestra de la etapa c);d) heating the sample from step c);
e) ajustar pH de la muestra de la etapa d), añadir al menos una enzima de tipo endoproteasa, e incubar la mezcla;e) adjust the pH of the sample from step d), add at least one endoprotease-type enzyme, and incubate the mixture;
f) ajustar pH de la mezcla de la etapa e), añadir al menos una enzima de tipo exoproteasa, e incubar la mezcla;f) adjust the pH of the mixture from step e), add at least one exoprotease-type enzyme, and incubate the mixture;
g) obtención de la composición fertilizante.g) obtaining the fertilizer composition.
En una realización preferida, se aplica una cantidad de 3 a 5 ml de composición fertilizante por litro de riego. La composición fertilizante se puede aplicar sobre cualquier tipo de cultivo. En una realización preferida, el cultivo se selecciona del grupo que consiste en cultivos hortofrutícolas, pastos de forraje o cereales.In a preferred embodiment, an amount of 3 to 5 ml of fertilizer composition is applied per liter of irrigation. The fertilizer composition can be applied to any type of crop. In a preferred embodiment, the crop is selected from the group consisting of horticultural crops, forage grasses or cereals.
Otra realización de la invención se refiere a una composición fertilizante que comprende purín líquido y biomasa de una microalga.Another embodiment of the invention refers to a fertilizer composition comprising liquid slurry and biomass of a microalgae.
En una realización preferida, el porcentaje de purín líquido respecto al total de la composición fertilizante es desde un 75 % hasta un 95 %.In a preferred embodiment, the percentage of liquid slurry with respect to the total fertilizer composition is from 75% to 95%.
En otra realización preferida, la composición fertilizante tiene un contenido NPK de 1,5 - 3,0 p/v (N); 1,0 - 2,0 p/v (P) y 0,1- 0,5 p/v (K). En una realización más preferida, el contenido NPK del fertilizante es de 1,8:1,5:0,3.In another preferred embodiment, the fertilizer composition has an NPK content of 1.5 - 3.0 w/v (N); 1.0 - 2.0 p/v (P) and 0.1- 0.5 p/v (K). In a more preferred embodiment, the NPK content of the fertilizer is 1.8:1.5:0.3.
En otra realización preferida, la composición fertilizante tiene una cantidad de aminoácidos libres disponibles incrementados de 2 a 5 % respecto a la cantidad de aminoácidos libres presentes en fertilizantes basados en microalgas, pero sin purín líquido.In another preferred embodiment, the fertilizer composition has an amount of available free amino acids increased by 2 to 5% with respect to the amount of free amino acids present in microalgae-based fertilizers, but without liquid slurry.
Las ventajas del procedimiento de la presente invención son: The advantages of the process of the present invention are:
- aprovechamiento de un residuo de difícil gestión que ocasiona graves problemas de contaminación de suelos y acuíferos;- use of a waste that is difficult to manage that causes serious problems of contamination of soils and aquifers;
- buen uso de la gestión del agua, ya que permite la reutilización total del agua residual producida en granjas, lo que ahorra el 100% de agua necesaria para producir los hidrolizados de microalgas de la invención;- good use of water management, since it allows the total reuse of waste water produced on farms, which saves 100% of the water necessary to produce the microalgae hydrolysates of the invention;
- reducción de los compuestos volátiles de los purines, evitando los aromas desagradables que generan.- reduction of volatile compounds in slurry, avoiding the unpleasant aromas they generate.
- evita la manipulación de compuestos químicos nocivos durante la hidrólisis;- avoids handling harmful chemical compounds during hydrolysis;
EJEMPLOSEXAMPLES
El propósito de los ejemplos indicados a continuación sirve para ilustrar la invención, sin por ello limitar el alcance de la misma.The purpose of the examples indicated below serves to illustrate the invention, without limiting its scope.
Se han realizado una serie de ensayos en los que se ha desarrollado una metodología específica para la obtención del fertilizante bioestimulante basado en hidrólisis cuyo elemento acuoso es purín, añadiendo a la reacción biomasa de microalgas y enzimas proteolíticas. Para el desarrollo del proceso se han seleccionado las enzimas óptimas en base a su eficacia, se han tenido en cuenta las inhibiciones del purín en la reacción, se han optimizado las condiciones de hidrolisis, el escalado del proceso y se ha realizado un análisis de los productos obtenidos.A series of tests have been carried out in which a specific methodology has been developed to obtain the biostimulant fertilizer based on hydrolysis whose aqueous element is slurry, adding microalgae biomass and proteolytic enzymes to the reaction. For the development of the process, the optimal enzymes have been selected based on their effectiveness, the inhibitions of slurry in the reaction have been taken into account, the hydrolysis conditions have been optimized, the scaling of the process has been carried out and an analysis of the products obtained.
Ejemplo 1. Procedimiento de obtención de la composición fertilizanteExample 1. Procedure for obtaining the fertilizer composition
En una botella de 1 litro con agitación magnética, control de agitación, pH y temperatura, se añadieron 200 ml de purín de cerdo filtrado procedente de una granja de cerdos. A continuación, se añadieron 28 gramos de la microalga seca spirulina producida por los inventores. La spirulina se resuspendió en el purín con agitación a 300 rpm y temperatura controlada de 55 °C. Se ajustó el pH de la mezcla a 8 con 2 ml de hidróxido sódico 10 M y se mantuvo a 55 °C durante 60 minutos.In a 1 liter bottle with magnetic stirring, stirring control, pH and temperature, 200 ml of filtered pig manure from a pig farm was added. Next, 28 grams of the dried microalgae spirulina produced by the inventors were added. The spirulina was resuspended in the slurry with stirring at 300 rpm and a controlled temperature of 55 °C. The pH of the mixture was adjusted to 8 with 2 ml of 10 M sodium hydroxide and kept at 55 °C for 60 minutes.
A continuación, se añadieron 3 gramos de la endoproteasa de Bacillus sp. para romper los enlaces peptídicos de las proteínas de la microalga. La reacción tuvo lugar en agitación a 65 °C durante cuatro horas. A medida que la reacción progresaba, el pH disminuyó debido a la rotura de los enlaces peptídicos de las proteínas de la biomasa. Por este motivo el control del pH es un factor determinante para la reacción, y debe ser monitorizado y ajustado durante las cuatro horas que dura la reacción. Esta etapa del procedimiento puede realizarse con una única endoproteasa, siempre que se respeten el pH, los tiempos, y la concentración respecto a la biomasa de microalga.Next, 3 grams of the Bacillus sp endoprotease were added. to break the peptide bonds of the microalgae proteins. The reaction took place with stirring at 65 °C for four hours. As the reaction progressed, the pH decreased due to the cleavage of peptide bonds in the biomass proteins. For this reason, pH control is a determining factor for the reaction, and must be monitored and adjusted during the four hours that the reaction lasts. This step of the procedure can be carried out with a single endoprotease, as long as the pH, times, and concentration with respect to the microalgae biomass are respected.
A continuación, se ajustó el pH a 7 con ácido cítrico. Se añadió la exoproteasa de Bacillus oryzae. Tras seis horas de reacción a 65 °C, se inactivaron las enzimas con calor a 80 grados centígrados. Por último, se ajustó el pH a 3,4. Esta etapa del procedimiento puede realizarse con una única exoproteasa.The pH was then adjusted to 7 with citric acid. Bacillus oryzae exoprotease was added. After six hours of reaction at 65 °C, the enzymes were inactivated with heat at 80 degrees Celsius. Finally, the pH was adjusted to 3.4. This step of the procedure can be performed with a single exoprotease.
Hay que destacar que también se han obtenido fertilizantes adecuados usando la reacción cócteles de endoproteasas y/o cócteles con exoproteasas.It should be noted that suitable fertilizers have also been obtained using the reaction of endoprotease cocktails and/or cocktails with exoproteases.
Ejemplo 2. Procedimiento a escala industrialExample 2. Industrial scale procedure
En un reactor de 1000 litros con pala agitadora, control de agitación, pH y temperatura se introdujeron 900 litros de purín de cerdo filtrado.900 liters of filtered pig manure were introduced into a 1000 liter reactor with stirring blade, stirring control, pH and temperature.
Se añadieron 110 kg de microalga spirulina seca, que se resuspendió con agitación a 300 rpm a temperatura controlada de 65 °C. Tras una hora de hidratación, se ajustó el pH a 8 con 4 litros de hidróxido sódico10 M.110 kg of dried spirulina microalgae were added, which was resuspended with stirring at 300 rpm at a controlled temperature of 65 °C. After one hour of hydration, the pH was adjusted to 8 with 4 liters of 10 M sodium hydroxide.
A continuación, se añadieron 3 kg de una endoproteasa y se monitorizó el pH 8 de la reacción durante tres horas a 65 °C. Finalizada la primera fase de ruptura, se ajustó el pH a 7 con ácido cítrico. Se añadieron 3 kg de una exoproteasa y tras 3 horas de incubación a 65 °C se inactivaron las enzimas a 80 °C, y se ajustó el pH a 3,4 y el producto se envasó.Next, 3 kg of an endoprotease was added and the pH 8 of the reaction was monitored for three hours at 65 °C. Once the first rupture phase was completed, the pH was adjusted to 7 with citric acid. 3 kg of an exoprotease were added and after 3 hours of incubation at 65 °C, the enzymes were inactivated at 80 °C, and the pH was adjusted to 3.4 and the product was packaged.
Ejemplo 3. Análisis de la composición fertilizanteExample 3. Analysis of the fertilizer composition
Se realizaron analíticas de perfil de aminoácidos libres y de valor NPK de la composición fertilizante obtenida el procedimiento descrito en el ejemplo 1.Analyzes of the free amino acid profile and NPK value of the fertilizer composition obtained by the procedure described in example 1 were carried out.
Los L-aminoácidos generados contienen la concentración suficiente y en una buena proporción para lograr mayores tasas de producción que en cultivos agrícolas (datos disponibles, pero no mostrados). La concentración de aminoácidos presente en la composición fertilizante se analizó mediante el método ISO 13903. El resultado se muestra en la Tabla 1: The L-amino acids generated contain sufficient concentration and in a good proportion to achieve higher production rates than in agricultural crops (data available, but not shown). The concentration of amino acids present in the fertilizer composition was analyzed using the ISO 13903 method. The result is shown in Table 1:
Tabla 1: concentración de aminoácidos libres en la composición fertilizante Table 1 : concentration of free amino acids in the fertilizer composition
También se midió la concentración NPK (relación nitrógeno/fósforo/potasio). El resultado se indica en la Tabla 2:The NPK concentration (nitrogen/phosphorus/potassium ratio) was also measured. The result is indicated in Table 2:
Tabla 2: Determinación NPK de la composición fertilizante Table 2: NPK determination of the fertilizer composition
Como se puede observar en las tablas anteriores, la composición fertilizante de la invención tiene aminoácidos libres que pueden captar las raíces y hojas de las plantas, y un contenido NPK aumentado (especialmente en nitrógeno y potasio), lo que supone una ventaja. As can be seen in the previous tables, the fertilizer composition of the invention has free amino acids that can be captured by the roots and leaves of plants, and an increased NPK content (especially in nitrogen and potassium), which is an advantage.
Ejemplo 4. Ensayo de campo: lechugaExample 4. Field trial: lettuce
Con el fin de verificar el efecto del bioestimulante en un cultivo, se realizó un ensayo en lechuga (variedad Romana).In order to verify the effect of the biostimulant on a crop, a test was carried out on lettuce (Roman variety).
Para la realización del ensayo, se evaluaron cuatro tratamientos:To carry out the trial, four treatments were evaluated:
- Control positivo (solución nutritiva comercial con npk 20:20:20 y micronutrientes pata comparar los tratamientos con una fertilización intensiva que tiene un contenido en nutrientes de 10 a 20 veces superior).- Positive control (commercial nutrient solution with npk 20:20:20 and micronutrients to compare the treatments with intensive fertilization that has a nutrient content 10 to 20 times higher).
- Tratamiento T1: fertilizante con base de purín y biomasa de microalgas (invención).- Treatment T1: fertilizer based on slurry and microalgae biomass (invention).
- Tratamiento T2: fertilizante comercial a partir de biomasa de spirulina.- Treatment T2: commercial fertilizer from spirulina biomass.
- Control negativo (C-): agua.- Negative control (C-): water.
Se comparó la eficacia de los tratamientos T1 y T2 en el desarrollo de las plantas de lechuga, para establecer si la base de purín en el producto T1 tenía algún efecto.The effectiveness of treatments T1 and T2 on the development of lettuce plants was compared, to establish if the slurry base in the T1 product had any effect.
Se han realizaron dos aplicaciones radiculares de cada tratamiento a través de riego. Las dosis de los tratamientos se indican en la tabla 3.Two root applications of each treatment were carried out through irrigation. The doses of the treatments are indicated in table 3.
Tabla 3: Productos testados con sus dosis correspondientes Table 3 : Products tested with their corresponding doses
Se realizó un muestreo final después de 20 días de ensayo y se midieron los siguientes parámetros: biomasa aérea y biomasa radicular en relación con el crecimiento de la planta.A final sampling was carried out after 20 days of testing and the following parameters were measured: aerial biomass and root biomass in relation to plant growth.
La Figura 1 muestra fotografías de las plantas del ensayo.Figure 1 shows photographs of the test plants.
Se midió la biomasa aérea de las plantas después de cortar las lechugas en la base del tallo y pesarlas en una balanza de precisión SARTORIUS. La Figura 2 muestra el gráfico que representa el resultado del análisis de la biomasa de las plantas. Para ver la relevancia de los datos se realizó un ANOVA simple y se usó el test LSD (Least Significance Difference) de Fisher para comparar las medias. Las letras a, b, c y d indican las diferencias significativas entre los valores de cada tratamiento. Se observa que las plantas con el tratamiento T1 tienen una mayor biomasa aérea respecto al control negativo (50 %) y respecto al tratamiento T2 sin purines (28 %) y además este incremento es estadísticamente significativo (*** p<0,001).The aboveground biomass of the plants was measured after cutting the lettuces at the base of the stem and weighing them on a SARTORIUS precision scale. Figure 2 shows the graph that represents the result of the analysis of plant biomass. To see the relevance of the data, a simple ANOVA was performed and Fisher's LSD ( Least Significance Difference) test was used to compare the means. The letters a, b, c and d indicate the significant differences between the values of each treatment. It is observed that the plants with the T1 treatment have a greater aerial biomass compared to the negative control (50%) and compared to the T2 treatment without slurry (28%) and this increase is also statistically significant (*** p <0.001).
La Figura 3 muestra fotografías de las raíces de las plantas del ensayo. Se midió la biomasa radicular de las raíces. Para ello se cortó cada raíz en la base del tallo, se limpió bien para eliminar los restos de vermiculita de la planta, se dejaron secar y se pesaron en una balanza de precisión. La Figura 4 muestra el gráfico que representa el resultado. El análisis estadístico fue el mismo que en el caso de la biomasa aérea de las plantas. La figura muestra que las raíces plantas con el tratamiento T1 tienen una mayor biomasa radicular respecto al control negativo (42 %) y al tratamiento T2 sin purines (16 %).Figure 3 shows photographs of the roots of the test plants. The root biomass of the roots was measured. To do this, each root was cut at the base of the stem, cleaned well to remove the remains of vermiculite from the plant, allowed to dry and weighed on a precision scale. Figure 4 shows the graph representing the result. The statistical analysis was the same as in the case of the aboveground biomass of the plants. The figure shows that plant roots with treatment T1 have a greater root biomass compared to the negative control (42%) and treatment T2 without slurry (16%).
De estos datos se concluye que la composición fertilizante de la invención (T1) con base de purines tiene un efecto positivo en el crecimiento y desarrollo de las plantas de lechuga, y muestra un incremento en el crecimiento aéreo y radicular en relación con otros biofertilizantes basados en microalgas (T2). From these data it is concluded that the fertilizer composition of the invention (T1) based on slurry has a positive effect on the growth and development of lettuce plants, and shows an increase in aerial and root growth in relation to other biofertilizers based in microalgae (T2).
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BA2A | Patent application published |
Ref document number: 2903008 Country of ref document: ES Kind code of ref document: A1 Effective date: 20220330 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2903008 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B2 Effective date: 20231117 |