ES2903228T3 - Anticuerpos anti-ROR1 y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-ROR1 y usos de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2903228T3
ES2903228T3 ES17705745T ES17705745T ES2903228T3 ES 2903228 T3 ES2903228 T3 ES 2903228T3 ES 17705745 T ES17705745 T ES 17705745T ES 17705745 T ES17705745 T ES 17705745T ES 2903228 T3 ES2903228 T3 ES 2903228T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
ror1
seq
binding protein
binding
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES17705745T
Other languages
English (en)
Inventor
Ashwini Balakrishnan
Benjamin Hoffstrom
Julie Randolph-Habecker
Stanley Riddell
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fred Hutchinson Cancer Center
Original Assignee
Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fred Hutchinson Cancer Center filed Critical Fred Hutchinson Cancer Center
Application granted granted Critical
Publication of ES2903228T3 publication Critical patent/ES2903228T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4244—Enzymes
    • A61K40/4251—Kinases, e.g. Raf or Src
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Proteína de unión que se une específicamente a (i) un péptido que consiste en SEQ ID NO:3 de una proteína del receptor huérfano 1 similar a tirosina cinasa receptora (ROR1) o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3, en la que la proteína de unión es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-ROR1 y usos de los mismos
Declaración del gobierno de interés
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental con CA114536 y CA138293 concedidos por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.
Declaración sobre la lista de secuencias
La lista de secuencias asociada con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel. El nombre del archivo de texto que contiene la lista de secuencias es 360056_437WO_SEQUENCE_LISTiNg . El archivo de texto pesa 52,2 KB, se creó el 1 de febrero de 2017.
Antecedentes
La tirosina cinasa receptora ROR1 es un antígeno oncofetal que se sobreexpresa en una amplia variedad de tumores, pero que se sobreexpresa en muy pocos tejidos normales. La ROR1 se expresa altamente en leucemia linfocítica crónica (LLC) de células B, linfoma de células del manto (LCM) y en algunos cánceres epiteliales. La ROR1 humana está codificada por el gen Ror1, que codifica para dos supuestas variantes de corte y empalme: una isoforma de longitud completa de 937 aminoácidos que se localiza en la superficie celular (ROR1_v1) y una isoforma corta (truncada) de 393 aminoácidos que contiene principalmente la porción N-terminal de ROR1 de longitud completa que permanece localizada de manera intracelular (ROR1_v2) (Hudecek et al., Blood 116:4532, 2010).
Basándose en la alta expresión de ROR1 en la superficie celular de tumores y la mínima expresión de ROR1 en tejidos normales, ROR1 es un buen antígeno tumoral específico o asociado a tumor para seleccionarse como diana por agentes terapéuticos. Por ejemplo, se han diseñado células T que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) para seleccionar como diana tumores que expresan ROR1 (Hudecek et al., Blood 116: 4532-41, 2010). Para determinar si un paciente tiene una neoplasia que expresa ROR1 y es adecuado para una terapia específica de ROR1, es importante disponer de un reactivo de diagnóstico capaz de detectar la expresión de ROR1 endógena en células del sujeto, tales como aquellas en una muestra obtenida del sujeto, por ejemplo, una forma de ROR1 que se expresa en la superficie celular, tal como moléculas de ROR1 de longitud completa expresadas en la superficie celular, por ejemplo, en cortes histológicos.
La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica habitual usada en diagnóstico médico para determinar la presencia o ausencia de proteínas en tejidos. De manera rutinaria, los tejidos tumorales se fijan en formalina y se incrustan en parafina (tejidos FFPE) antes de someterlos a análisis de IHC. Por consiguiente, un anticuerpo de diagnóstico de ROR1 debe ser capaz de detectar ROR1 expresada de manera endógena en muestras histológicas. Los anticuerpos anti-ROR1 comercialmente disponibles no detectan de manera eficaz ROR1 endógena en tejidos FFPE. Además, la mayoría de anticuerpos comerciales seleccionan como diana la porción N-terminal de ROR1 y pueden no detectar la diferencia entre ROR1 de longitud completa y la isoforma corta de ROR1 que contiene sólo la porción amino-terminal de ROR1 de longitud completa.
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de anticuerpos útiles para detectar y cuantificar ROR1 expresada de manera endógena. La presente divulgación satisface tales necesidades, y proporciona además otras ventajas relacionadas. Yang et al., 2011. PLoS One. 6(6):e21018 divulgan un panel de anticuerpos que al parecer demostraron alta afinidad y especificidad por un conjunto diverso de epítopos que implican los tres dominios extracelulares de ROR1.
Daneshmanesh et al., 2008. Int J Cancer. 123(5):1190-5 tienen como objetivo analizar la expresión de genes y proteínas de ROR1 en células de leucemia linfocítica crónica y leucocitos sanguíneos normales.
Daneshmanesh: “Phone ROR1 antibody (Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor 1) (C-Term) Antigen: Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor 1 (ROR1) 2 Images available”, 31 de diciembre de 2008, disponible en www.antibodies-online.com, divulga un anticuerpo policlonal que selecciona como diana ROR1.
Anónimo: “Product Datasheet: ARP63925_P050 - ROR1 Antibody - C-terminal region (ARP63925_P050) - Aviva Systems Biology”, 1 de enero de 2016, divulga un anticuerpo policlonal que se obtuvo usando un péptido sintético dirigido hacia la región C-terminal de ROR1 humana.
Breve sumario
La presente invención proporciona una proteína de unión que se une específicamente a (i) un péptido que consiste en SEQ ID NO:3 de una proteína del receptor huérfano 1 similar a tirosina cinasa receptora (ROR1) o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3, en la que la proteína de unión es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Además, la presente invención proporciona una proteína de unión que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (Vl) tal como se expone en SEQ ID NO:15 ó 16 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (Vh) tal como se expone en SEQ ID NO:12, 13 ó 14, en la que el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a (i) un péptido que consiste en SEQ ID NO:3 de una proteína del receptor huérfano 1 similar a tirosina cinasa receptora (ROR1) o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3
La presente invención también proporciona una composición que comprende (i) la proteína de unión de la presente invención y (ii) un portador o un excipiente.
La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica para la proteína de unión según la presente invención así como un constructo de expresión que comprende el polinucleótido de la presente invención unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.
La presente invención también proporciona una célula huésped que comprende el polinucleótido o el constructo de expresión de la presente invención.
La presente invención también proporciona un procedimiento para preparar la proteína de unión según la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped que comprende el polinucleótido de la presente invención o el constructo de expresión de la presente invención, en condiciones adecuadas para expresar la proteína de unión, y opcionalmente aislar la proteína de unión a partir de la célula huésped cultivada.
La presente invención también proporciona un método de detección que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica con la proteína de unión de la presente invención o la composición de la presente invención, y (b) detectar la unión específica de la proteína de unión a un péptido o epítopo en la muestra, o la ausencia de la misma, en el que el método detecta de ese modo la presencia o ausencia de una ROR1 o un epítopo de ROR1 en la muestra.
La presente invención también proporciona un kit que comprende la proteína de unión de la presente invención o la composición de la presente invención.
En las reivindicaciones se proporcionan aspectos adicionales de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un diagrama esquemático de variantes de corte y empalme de ROR1. Ror1 se expresa como dos variantes de corte y empalme de la siguiente manera: una isoforma de longitud completa de 937 aminoácidos de ROR1 que se localiza en la superficie celular (denominada en el presente documento “ROR1_v1”); y una isoforma de corte y empalme truncada de 393 aminoácidos que sólo incluye la porción N-terminal extracelular de ROR1_v1 (es decir, falta el dominio transmembrana y la porción C-terminal intracelular que contiene el dominio tirosina cinasa) y, por tanto, no se localiza en la membrana celular (denominada en el presente documento “ROR1_v2”).
La figura 2 ilustra el nivel de expresión de transcritos de Ror1 de longitud completa en diversos tejidos diferentes de humano y macaco Rhesus normal medido mediante PCR en tiempo real. Como control positivo, se usaron células de leucemia linfocítica crónica (LLC) primarias de dos donantes diferentes y que se sabe que expresan altos niveles de ROR1 (véase Hudecek et al., Blood 116:4532, 2010).
Las figuras 3A y 3B muestran los resultados de someter a prueba anticuerpos anti-ROR1 publicados y comercialmente disponibles contra diversos tejidos mediante inmunohistoquímica (IHC). La tinción indica la unión de un anticuerpo anti-ROR1. (A) Se sometieron a prueba anticuerpos anti-ROR1 publicados y comercialmente disponibles para determinar su capacidad para unirse específicamente a ROR1 en células de tejido de amígdala normal (ROR1‘), LLC y linfoma de células del manto (LCM) (ROR1+, longitud completa), células K562 (ROR1‘) y células K562 transfectadas para sobreexpresar ROR1 de longitud completa (ROR1+, longitud completa). (B) Tinción por IHC usando anticuerpos anti-ROR1 previamente publicados y comercialmente disponibles en células K562 transfectadas para ROR1, células K562 de control, ganglios linfáticos con LLC y tejido de amígdala.
La figura 4 muestra que la unión a ROR1 mediante un anticuerpo monoclonal anti-ROR1 2A2 (Biolegend, San Diego, CA) se reduce en muestras de tejido fijadas en formalina. Se fijaron en formalina durante la noche células ROR1+ que expresan ROR1 (células LLC y K562/ROR1). El panel superior ilustra una detección reducida de ROR1 mediante análisis de citometría de flujo realizado usando un anticuerpo monoclonal anti-ROR1 2A2 en células ROR1+ fijadas en formalina en comparación con células no fijadas. El panel inferior demuestra mediante inmunotransferencia que las células K562 transfectadas para sobreexpresar ROR1 expresan niveles mucho mayores de proteína ROR1 que los expresados de manera endógena por células LLC.
La figura 5 muestra la ubicación de péptidos en la porción C-terminal de ROR1 (aminoácidos 404-937) que se usaron para la inmunización de ratones. Las secuencias de aminoácidos C-terminales representadas en la figura 5 (para humano, SEQ ID NO:51, y ratón, SEQ ID NO:53, respectivamente) están presentes sólo en ROR1 de longitud completa (ROR1_v1) (por ejemplo, una ROR1 de longitud completa correspondiente a SEQ ID NO:1 para humano o SEQ ID NO:52 para ratón). Las ubicaciones y secuencias de los péptidos usados para inmunizar ratones para la producción de anticuerpos contra ROR1 humana se indican mediante recuadros (correspondientes a las SEQ ID NO:2, 3, 54 y 55).
Las figuras 6A y 6B ilustran la identificación de sueros policlonales de ratón y clones de hibridoma para la producción de anticuerpos que se unen a la porción C-terminal de ROR1. (A) Identificación de múltiples sueros policlonales de ratón contra células ROR1 K562 y lisado de células ROR1 LLC mediante análisis de inmunotransferencia para detectar la proteína ROR1 de 130 kDa. (B) Resultados de la identificación de clones de hibridoma mediante análisis de inmunotransferencia para la producción de anticuerpos que serían capaces de unirse sólo a ROR1 de longitud completa expresada en células LLC. Se detectaron clones que producen anticuerpos anti-ROR1 por la presencia de una banda a 130 kDa en un lisado de células LLC. El clon de anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 (carril indicado por la flecha) muestra una intensa banda a 130 kDa en el lisado de células LLC. El clon 4A11 también muestra una intensa banda a 130 kDa.
La figura 7 muestra los resultados de someter a prueba el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 para determinar la especificidad de ROR1 mediante IHC, usando células que sobreexpresan ROR1 de longitud completa (células K562/ROR1+) y células que no expresan ROR1 (células K562, denominadas ROR1'). El anticuerpo 6D4 mostró una tinción clara y alta de la superficie celular de ROR1 de longitud completa sobreexpresada en células K562/ROR1+ con tinción de fondo mínima en células K562 (ROR1‘).
La figura 8 muestra los resultados de someter a prueba el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 (paneles a la derecha) en tejidos ROR1+ (ganglios linfáticos con LLC y LCM) y ROR1 (amígdala) mediante IHC. El anticuerpo 6D4 mostró una tinción clara de la superficie celular de ROR1 de longitud completa endógena en ganglios linfáticos con tumores LLC y LCM, que no pudo detectarse en tejido de amígdala normal.
Las figuras 9A y 9B muestran la tinción por IHC de células FFPE para el anticuerpo monoclonal (AcM) 6D4 en comparación con los anticuerpos monoclonales derivados de otros clones. (A) Clones representativos a partir de la identificación por IHC de sobrenadantes de hibridoma concentrados contra células K562 de control, células K562 transfectadas para ROR1 y ganglios linfáticos con LLC. (B) Tinción por IHC emparejada de PBMC con LLC procesadas mediante FFPE (n=2) con AcM 6D4 y tinción por citometría de flujo con AcM anti-ROR1 2A2.
Las figuras 10A a 10C ilustran adicionalmente la tinción por IHC de células FFPE mediante AcM 6D4 e isotipo y el análisis de inmunotransferencia de lisados celulares para la expresión de ROR1. (A) Tinción por IHC con AcM 6D4 de líneas celulares de control y transfectadas con ROR1 FFPE (paneles a la izquierda) y líneas de células tumorales ROR1+ (paneles a la derecha). La barra de escala representa 50 |im. La tinción por citometría de flujo emparejada con AcM anti-ROR1 6D4 (línea continua), anticuerpos anti-ROR2 (R&D Biosystems-FAB20641G) (línea de trazos) e isotipo (gris sombreado). (B) Tinción de tejido de amígdala y ganglios linfáticos con LLC y LCM FFPE mediante AcM 6D4 en relación con el isotipo. (C) Análisis de inmunotransferencia de líneas celulares ROR1 y ROR1+ con el AcM 6D4. La ROR1 de longitud completa se expresa como proteína de 130 kDa.
La figura 11 muestra imágenes representativas de la puntuación de IHC de tumores ROR1+. La 'puntuación 0' indica ausencia de tinción. La 'puntuación 1' indica bajo nivel de tinción con tinción de membrana visible a alto aumento. La 'puntuación 2' y la 'puntuación 3' indican alta tinción de membrana visible a bajo aumento.
La figura 12 muestra la expresión de ROR1 de longitud completa en cánceres epiteliales, tal como se analiza mediante IHC con anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4. Se observó una tinción clara de la superficie celular en cáncer de ovario, adenocarcinomas de pulmón y cáncer de mama triple negativo.
La figura 13 muestra la expresión de ROR1, tal como se detecta mediante el anticuerpo 6D4, en subtipos de cáncer de pulmón (adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico y tumor carcinoide atípico). Se observó tinción de ROR1 con este anticuerpo en cada uno de estos tipos de cáncer, en comparación con la tinción con el anticuerpo de control de isotipo.
La figura 14 muestra los resultados de la tinción usando el anticuerpo 6D4 y un control de isotipo en cortes de tejido derivados de tejidos humanos normales vitales.
La figura 15 muestra la expresión de ROR1 en un subconjunto de tejidos humanos normales (glándula paratiroidea, esófago, páncreas) tal como se detecta usando el anticuerpo 6D4.
Las figuras 16A a 16C muestran la tinción de membrana de ROR1 en cáncer de ovario usando el AcM 6D4. (A) Imágenes de IHC representativas de subtipos de muestras de cáncer de ovario teñidas con el AcM 6D4. La barra de escala representa 100 |im. Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles inferiores. (B) Porcentaje de tumores ROR1+ en diferentes subtipos de cáncer de ovario. (C) Porcentaje de tumores ROR1alta y ROR1baja en el subconjunto de cáncer de ovario ROR1+.
Las figuras 17A a 17C muestran la tinción de membrana de ROR1 en cáncer de mama usando el AcM 6D4. (A) Imágenes de IHC representativas de subtipos de muestras de tejido de cáncer de mama teñidas con el AcM 6D4. La barra de escala representa 100 |im. Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles inferiores. (B) Porcentaje de tumores ROR1 en diferentes subtipos de cáncer de mama. (C) Porcentaje de tumores ROR1alta y ROR1baja en el subconjunto de cáncer de mama ROR1+.
Las figuras 18A a 18D muestran la tinción de membrana de ROR1 en cáncer de pulmón usando el AcM 6D4. (A) Imágenes de IHC representativas de expresión de ROR1 en subtipos de muestras de cáncer de pulmón teñidas con el AcM 6D4. La barra de escala representa 100 |im Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles inferiores. (B) Porcentaje de tumores ROR1+ en diferentes subtipos de cáncer de pulmón. (C) Porcentaje de tumores ROR1altay ROR1baja en el subconjunto de cáncer de pulmón ROR1+. (D) Imágenes de IHC representativas de la expresión de ROR1 en ganglios linfáticos primarios y metastásicos emparejados de adenocarcinomas de pulmón ROR1+. La barra de escala representa 50 |im.
Las figuras 19A y 19B muestran la expresión de ROR1 en adenocarcinomas de páncreas usando el AcM 6D4. (A) Imágenes de IHC representativas de tinción de ROR1 en adenocarcinoma de páncreas. La barra de escala representa 100 |im. El panel más a la derecha es una imagen aumentada del panel central. (B) Porcentaje de tumores ROR1+ en adenocarcinomas de páncreas.
Las figuras 20A a 20F muestran la expresión de ROR1 en tejidos humanos normales tal como se indica mediante tinción por IHC con AcM 6D4, seguido de validación por inmunotransferencia. (A) Tinción de membrana de ROR1 en glándula paratiroidea e islotes pancreáticos humanos con el AcM 6D4. La barra de escala representa 100 |im. Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles inferiores. (B) Expresión de ROR1 en diferentes regiones del tracto gastrointestinal humano. La barra de escala representa 100 |im. Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles inferiores. (C) La tinción de ROR1 está ausente en cerebro, cerebelo, corazón, pulmón, bazo e hígado humanos normales. La barra de escala representa 100 |im. (D) Análisis de inmunotransferencia de ROR1 en tejidos normales usando el AcM 6D4. (E) Inmunotransferencia de análisis de tejidos normales ROR1alta usando un anticuerpo policlonal anti-ROR1. (F) Validación por inmunotransferencia de la expresión de ROR1 en tejidos normales, donde los lisados de tejidos se han tratado con PNGasa F para eliminar la glicosilación con unión a N. La ROR1 desglicosilada corre hasta 100 kDa.
La figura 21 muestra la expresión de transcritos de Ror1 (que codifica para ROR1 de longitud completa, ROR1_v1) en PBMC de LLC, adipocitos diferenciados y tejidos gastrointestinales humanos normales.
Las figuras 22A a 22D ilustran la relación entre la actividad de células T con CAR de ROR1 y la expresión de ROR1. (A) Producción de citocinas (IFN-y, GM-CSF e IL-2) por células T con CAR de ROR1 o células T transducidas de manera simulada después de 24 horas de cultivo con diferentes células diana a una razón célula T:diana de 2:1 (datos promediados a lo largo de 2 experimentos independientes). (B) Tinción de ROR1 con el AcM 6D4 de adipocitos maduros diferenciados in vitro a partir de preadipocitos. (C) Producción de IFN-y mediante células T con CAR de ROR1 o células T transducidas de manera simulada de 2 donantes diferentes después de 24 horas de cultivo con adipocitos, células de islotes pancreáticos o células acinares pancreáticas a una razón célula T:diana de 2:1. (D) Se incubaron células T con CAR de ROR1 o células T transducidas de manera simulada con dianas marcadas con CFSE a una razón célula T:diana de 5:1. Se midió el porcentaje de células con altos niveles de células diana marcadas con yoduro de propidio (PIalto) después de 24 horas.
Las figuras 23A a 23D ilustran la similitud entre ROR1 humana y de macaco Rhesus y muestran la unión del AcM 6D4 a ROR1 de macaco Rhesus. (A) Alineación de la secuencia de ROR1 humana (SEQ ID NO:3), de ratón (SEQ ID NO:57) y de macaco Rhesus (Se Q ID NO:59) reconocida por el AcM 6D4. (B) Unión del anticuerpo 6D4 contra ROR1 de macaco Rhesus. Se sometió a prueba el anticuerpo 6D4 contra (A) células K562 (ROR1-) y (B) células K562 que expresan ROR1 de macaco Rhesus mediante IHC. También se sometió a prueba el anticuerpo 6D4 contra (C) células T (ROR1-) de macaco Rhesus y (D) células T de macaco Rhesus transfectadas con ROR1 de macaco Rhesus. El anticuerpo 6D4 presentó una tinción clara de la superficie celular de ROR1 de macaco Rhesus de longitud completa cuando se sobreexpresó o bien en células K562 o bien en células T de macaco Rhesus. (C) Tinción de ROR1 en glándula paratiroidea e islotes pancreáticos de macaco Rhesus. Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles a la derecha. (D) Imágenes de IHC representativas de tinción de ROR1 en diferentes regiones del tracto gastrointestinal de macaco. Las regiones recuadradas en los paneles centrales están aumentadas 10X en los paneles a la derecha. La barra de escala representa 100 |im
Descripción detallada
La presente divulgación proporciona proteínas de unión, tales como proteínas de unión similares a inmunoglobulina, por ejemplo, anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígeno de los mismos), que son específicas de, por ejemplo que se unen específicamente a, ROR1 o epítopos de la misma o péptidos derivados de ROR1, tales como ROR1 expresada en superficie, endógena y/o de longitud completa. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican para esas proteínas de unión, células huésped que expresan esas proteínas de unión y métodos para usar las mismas. En algunos aspectos, las proteínas de unión proporcionadas en el presente documento se unen específicamente a una porción C-terminal de ROR1 y, por tanto, pueden usarse para detectar la expresión de la isoforma de longitud completa de ROR1, que se encuentra ubicada en la superficie celular, y en algunos casos, sin unión a la isoforma truncada de ROR1 que carece de su porción C-terminal, que se localiza generalmente de manera intracelular. Adicionalmente, en algunos aspectos, pueden usarse las proteínas de unión similares a inmunoglobulina para detectar la expresión de ROR1 de longitud completa, por ejemplo, en células o tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE) y, por tanto, son útiles como herramienta de diagnóstico o como diagnóstico complementario con un régimen o agente terapéutico de ROR1. Por ejemplo, las proteínas de unión similares a inmunoglobulina proporcionadas en el presente documento pueden usarse para determinar si un sujeto se beneficiaría de una terapia específica de ROR1, si tal terapia debe administrase, continuarse o ajustarse y/o si un tipo de tumor particular debe tratarse de ese modo. Ejemplos de terapias para su uso en cualquiera de los casos proporcionados son inmunoterapias, tales como una terapia con anticuerpos y/o inmunoterapia adoptiva, y/o aquellas que comprenden células modificadas con receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de ROR1, por ejemplo, células T.
También se proporcionan métodos terapéuticos, tales como los que implican la administración de terapias específicas de ROR1, tales como inmunoterapias. En determinados casos, la terapia es o comprende un anticuerpo anti-ROR1 o fragmento del mismo, tal como un CAR que comprende un fragmento de anticuerpo de este tipo. En casos adicionales, la terapia es o incluye una célula modificada con CAR en la que el CAR se une específicamente a una ROR1, tal como una porción extracelular de una ROR1 humana. En algunos casos, el CAR se une a la ROR1 a través de un dominio de unión que comprende un fragmento de anticuerpo, tal como un scFv. En algunos aspectos, el CAR comprende además un espaciador, tal como una o más regiones constantes de anticuerpo y/o una región bisagra; en algunos aspectos, comprende además un dominio transmembrana y uno o más, generalmente más de uno, dominios de señalización intracelular, tales como un dominio de señalización derivado de CD3zeta u otro dominio de señalización primario y/o un dominio de señalización coestimulador, tal como uno derivado de CD28 y/o 41BB.
En algunos casos, un CAR y/o anticuerpo es, comprende o comparte especificidad de epítopo y/o compite por la unión con el anticuerpo IgG1 anti-ROR1 designado como R12 (que se divulga, por ejemplo, en Yang et al., PloS ONE, 6:e21018, 20l1; Hudecek et al., Clin. Cancer Res, 19:3153, 2013; solicitud de patente estadounidense n.° US 2013/0251642), y/o una porción de unión a antígeno del mismo, tal como un scFv, y/o un anticuerpo que contiene las CDR del mismo. Se ha demostrado que un receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un fragmento scFv de unión a antígeno de R12 fomenta de manera eficaz la reactividad antitumoral en una terapia con CAR (Hudecek et al., 2013; publicación PCT internacional n.°WO 2014/031687).
En algunos casos, la enfermedad o el estado es o incluye un tumor, que puede ser primario o metastásico. En algunos aspectos, es un tumor hemático, que es opcionalmente LLC o LCM, y/o es un tumor sólido, que opcionalmente es un tumor de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer de páncreas, que opcionalmente es un adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico, tumor carcinoide atípico o cáncer de mama triple negativo. En algunos aspectos, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de las células en la enfermedad o el estado, o de un tejido asociado con las mismas, expresan ROR1 o un epítopo o péptido de la misma reconocidos por la terapia y/o tal proteína o epítopo o péptido se expresa de manera uniforme u homogénea en las mismas. En algunos aspectos, tal expresión se ha determinado usando los anticuerpos proporcionados y/o los métodos de detección usados con los mismos.
Antes de exponer esta divulgación con más detalle, puede ser útil para el entendimiento de la misma proporcionar definiciones de determinados términos usados en el presente documento. A lo largo de toda esta divulgación se exponen definiciones adicionales.
En la presente descripción, debe entenderse que cualquier intervalo de concentraciones, intervalo de porcentajes, intervalo de razones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones de los mismos (tales como una décima parte y una centésima parte de un número entero), a menos que se indique de otro modo. Además, debe entenderse que cualquier intervalo numérico citado en el presente documento que se refiera a cualquier característica física, tal como subunidades poliméricas, tamaño o grosor, incluye cualquier número entero dentro del intervalo citado, a menos que se indique de otro modo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” significa el 20% del intervalo, valor o la estructura indicados, a menos que se indique de otro modo.
Debe entenderse que los términos “un/uno” y “una” tal como se usan en el presente documento se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. Debe entenderse que el uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) significa o bien uno, ambos o bien cualquier combinación de los mismos de las alternativas.
Además, debe entenderse que los compuestos individuales, o grupos de compuestos, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y los sustituyentes descritos en el presente documento, se divulgan por la presente solicitud en la misma medida que si cada compuesto o grupo de compuestos se expusiera individualmente.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “ incluir”, “tener” y “comprender” se usan como sinónimos, y se pretende que los términos y las variantes de los mismos se interpreten como no limitativos.
El término “que consiste esencialmente en” limita el alcance de una reivindicación a los materiales o las etapas especificados, o a aquellos que no afectan de manera material a las características básicas de una invención reivindicada. Por ejemplo, un dominio, una región o un módulo de proteína (por ejemplo, un dominio de unión, una región bisagra, un módulo de ligador), o una proteína (que puede tener uno o más dominios, regiones o módulos), “consiste esencialmente en” una secuencia de aminoácidos particular cuando la secuencia de aminoácidos de un dominio, una región o un módulo, o una proteína, incluye extensiones, deleciones, mutaciones o una combinación de las mismas (por ejemplo, aminoácidos en los extremos amino o carboxilo-terminal o entre dominios) que, en combinación, contribuyen como máximo al 20% (por ejemplo, como máximo el 15%, el 10%, el 8%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1%) de la longitud de un dominio, una región o un módulo, o una proteína, y no afectan sustancialmente (es decir, no reducen la actividad en más del 50%, tal como no más del 40%, el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 5% o el 1%) a la actividad del/de los dominio(s), de la(s) región/regiones, del/de los módulo(s) o de la proteína (por ejemplo, la afinidad de unión a diana de una proteína de unión).
Tal como se usa en el presente documento, “ROR1” o “receptor huérfano 1 similar a tirosina cinasa receptora” es un polipéptido de la tirosina cinasa receptora de mamífero que tiene homología con la secuencia de aminoácidos de referencia humana de uno cualquiera de los n.os UniProtKB Q01973-1, Q01973-2 o Q01973-3, o una secuencia de consenso de las secuencias de aminoácidos de referencia, o una isoforma o variante o un fragmento de las mismas. Un homólogo a modo de ejemplo es la secuencia de aminoácidos de ratón del n.° UniProtKB Q9Z139-1. En su forma de longitud completa, la ROR1 comprende (1) una porción extracelular que contiene un dominio similar a inmunoglobulina, un dominio Frizzled y un dominio Kringle; (2) una porción transmembrana; y (3) una porción intracelular que contiene un dominio tirosina cinasa (figura 1), denominada en el presente documento “ROR1 de longitud completa” o “ROR1_v1”. En determinados casos, la ROR1 de longitud completa es una ROR1 de longitud completa humana, por ejemplo, que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:1. La ROR1 también puede encontrarse como isoforma intracelular, que comprende la porción N-terminal de la ROR1 de longitud completa y que carece de las porciones transmembrana e intracelular de la ROR1 de longitud completa (Hudecek et al., Blood 116:4532, 2010), denominada en el presente documento “ROR1 truncada” o “ROR1 de isoforma corta” o “ROR1_v2”.
El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto que se compone de residuos de aminoácido que están unidos mediante enlaces peptídicos. El término “proteína” puede ser sinónimo con el término “polipéptido” o puede referirse, además, a un complejo de dos o más polipéptidos. Un polipéptido puede contener además otros componentes (por ejemplo, unidos covalentemente), tales como una etiqueta, un marcador, una molécula bioactiva o cualquier combinación de los mismos. En determinados casos, un polipéptido puede ser un fragmento. Tal como se usa en el presente documento, un “fragmento” significa un polipéptido que carece de uno o más aminoácidos que se encuentran en una secuencia de referencia. Un fragmento puede comprender un dominio de unión, antígeno o epítopo encontrados en una secuencia de referencia. Un fragmento de un polipéptido de referencia puede tener al menos aproximadamente el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de referencia.
Tal como se describe en el presente documento, una especie polipeptídica “variante” tiene uno o más aminoácidos no naturales, una o más sustituciones de aminoácidos, una o más inserciones de aminoácidos, una o más deleciones de aminoácidos o cualquier combinación de los mismos en uno o más sitios en relación con un polipéptido de referencia tal como se presenta en el presente documento. En determinados casos, “variante” significa un polipéptido que tiene una actividad (por ejemplo, función enzimática, inmunogenicidad) o estructura sustancialmente similar en relación con un polipéptido de referencia. Una variante de un polipéptido de referencia puede tener una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más con la secuencia de aminoácidos para el polipéptido de referencia tal como se determina mediante parámetros y programas de alineación de secuencias conocidos en la técnica. Por ejemplo, la variante puede ser el resultado de un polimorfismo genético o manipulación humana. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se conocen bien y pueden producirse de manera natural o pueden introducirse cuando una proteína se produce de manera recombinante. Las sustituciones, deleciones y adiciones de aminoácidos pueden introducirse en una proteína usando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001). Pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio (o específica de segmento) dirigida a oligonucleótidos para proporcionar un polinucleótido alterado que tiene codones particulares alterados según la sustitución, deleción o inserción deseada. Alternativamente, pueden usarse técnicas de mutagénesis al azar o de saturación, tales como mutagénesis por barrido de alanina, mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa propensa a error y mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para preparar variantes de polipéptidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente).
Los términos “ idéntico” o “porcentaje de identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de moléculas de ácido nucleico o polipéptido, significan dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácido o nucleótidos que son los mismos en una región especificada (por ejemplo, una identidad del 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%), cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada, tal como se mide usando métodos conocidos en la técnica, tales como un algoritmo de comparación de secuencias, mediante alineación manual o mediante inspección visual. Por ejemplo, algoritmos preferidos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (Nucleic Acid Res. 25: 3389, 1977) y Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), respectivamente.
Tal como se usa en el presente documento, una “proteína de fusión” comprende un polipéptido de cadena sencilla que tiene al menos dos dominios distintos, en el que los dominios no se encuentran de manera natural juntos en una proteína. Una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína de fusión puede construirse usando PCR, diseñarse por ingeniería de manera recombinante, o tales proteínas de fusión pueden prepararse de manera sintética. Una proteína de fusión puede contener además otros componentes (por ejemplo, unidos covalentemente), tales como una etiqueta o molécula bioactiva.
Una “molécula de ácido nucleico” o un “polinucleótido” se refiere a un polinucleótido lineal o circular monocatenario o bicatenario que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que están unidos mediante enlaces 3'-5'-fosfodiéster. Una molécula de ácido nucleico incluye ARN, ADN, ADN genómico, ADN mitocondrial, ADNc o ADN de vector.
También se contemplan variantes de los polinucleótidos de esta divulgación. Los polinucleótidos variantes son al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% o el 99,9% idénticos a un polinucleótido de referencia tal como se describe en el presente documento, o que se hibrida con un polinucleótido de referencia de secuencia definida en condiciones de hibridación rigurosas de cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a aproximadamente 65°C-68°C o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50% a aproximadamente 42°C. Las variantes de polinucleótidos retienen la capacidad de codificar para una proteína de unión similar a inmunoglobulina o un fragmento de unión a antígeno de la misma que tiene la funcionalidad descrita en el presente documento.
El término “aislado” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se produce de manera natural presente en un animal vivo no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, sí es aislado. Tal polinucleótido podría formar parte de un vector y/o tal polinucleótido o polipéptido podría formar parte de una composición (por ejemplo, un lisado celular), y todavía ser aislado en el sentido de que dicho vector o dicha composición no forma parte del entorno natural del ácido nucleico o polipéptido.
El término “introducido”, en el contexto de insertar una secuencia de ácido nucleico en una célula, significa “transfección” o “transformación” o “transducción” e incluye una referencia a la incorporación de una secuencia de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota en la que la molécula de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de una célula (por ejemplo, ADN de cromosoma, plásmido, plástido o mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse de manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).
Tal como se usa en el presente documento, molécula, constructo o secuencia de ácido nucleico “heterólogos” o “exógenos” se refiere a una molécula de ácido nucleico o porción de una molécula de ácido nucleico que no es nativa de una célula huésped, pero que puede ser homóloga a una molécula de ácido nucleico o porción de una molécula de ácido nucleico de la célula huésped. La fuente de la molécula, del constructo o de la secuencia de ácido nucleico heterólogos o exógenos puede ser de un género o una especie diferente. En determinados casos, se añade una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena (es decir, no endógena o nativa) a una célula huésped o un genoma huésped mediante, por ejemplo, conjugación, transformación, transfección, electroporación, en la que la molécula añadida puede integrarse en el genoma huésped o existir como material genético extracromosómico (por ejemplo, como un plásmido u otra forma de vector autorreplicativo) y puede estar presente en múltiples copias. Además, “heterólogo” se refiere a una enzima, proteína u otra actividad no nativa codificada por una molécula de ácido nucleico exógena introducida en la célula huésped, incluso si la célula huésped codifica para una proteína o actividad homóloga.
Tal como se usa en el presente documento, el término “endógeno” o “nativo” se refiere a un gen, una proteína o actividad que normalmente está presente en una célula huésped. Además, un gen, una proteína o actividad que están mutados, sobreexpresados, permutados al azar, duplicados o alterados de otro modo en comparación con un gen, una proteína o actividad original todavía se considera que es endógeno o nativo de esa célula huésped particular. Por ejemplo, puede usarse una secuencia de control endógena de un primer gen (por ejemplo, promotor, secuencias de atenuación traduccional) para alterar o regular la expresión de un segundo gen o de una segunda molécula de ácido nucleico nativos, en la que la expresión o regulación del segundo gen o de la segunda molécula de ácido nucleico nativos difiere de la expresión o regulación normal en una célula original.
“ Inmunohistoquímica” (IHC) significa una técnica usada para detectar la presencia de un antígeno en muestras de histología, tales como muestras de tejido y células, usando un anticuerpo específico del antígeno. Las muestras de tejido o células pueden ser cualquier tejido o célula obtenidos de un sujeto o de una fuente biológica. Un “sujeto” o una “fuente biológica” puede ser, por ejemplo, un humano o animal no humano, una célula primaria, un cultivo celular o una línea celular adaptada al cultivo, incluyendo las líneas celulares genéticamente modificadas por ingeniería que pueden contener moléculas de ácido nucleico heterólogas o recombinantes episómicas o cromosómicamente integradas, líneas celulares híbridas de células somáticas, células o líneas celulares inmortalizadas o que pueden inmortalizarse, células o líneas celulares diferenciadas o que pueden diferenciarse, células o líneas celulares transformadas,
En determinados casos, una muestra biológica es de un humano. Se pretende que “paciente humano” signifique un sujeto humano que padece, o corre el riesgo de desarrollar o recaer en, cualquier enfermedad o estado asociados con la expresión o sobreexpresión de ROR1, tal como ROR1 de longitud completa.
“Inmunotransferencia” (también conocida como inmunotransferencia de tipo Western) significa una técnica usada para detectar la presencia de un antígeno (por ejemplo, ROR1) en una muestra de homogeneizado o extracto de tejido, usando electroforesis en gel para separar proteínas y tinción de las proteínas separadas con anticuerpos, o un fragmento o variantes de los mismos, específicos del antígeno.
Proteínas de unión específicas de ROR1
Se proporcionan proteínas de unión, tales como proteínas de unión a ROR1, que se unen generalmente de manera específica a la proteína ROR1 y/o a una porción de la misma. Las proteínas de unión incluyen dominios de unión y proteínas de unión divulgados en el presente documento que en algunos casos detectan específicamente ROR1 de longitud completa ya que se unen a una porción C-terminal de ROR1, que está presente en la isoforma de ROR1 de longitud completa y está ausente en la isoforma truncada de ROR1. Por lo contrario, la mayoría de anticuerpos anti-ROR1 publicados y comercialmente disponibles se dirigen contra la porción N-terminal de ROR1, que está presente tanto en la forma de ROR1 de longitud completa (ROR1_v1) como en la forma truncada de ROR1 (ROR1_v2). Por consiguiente, los dominios de unión a inmunoglobulina y las proteínas similares a inmunoglobulina de esta divulgación pueden usarse para identificar células y tejidos que expresan ROR1 de longitud completa (por ejemplo, endógena) con un alto grado de especificidad.
Además, las proteínas y los dominios de unión a inmunoglobulina de esta divulgación son capaces de detectar ROR1 de longitud completa expresada de manera endógena por, por ejemplo, células cancerosas. Además, las proteínas de unión similares a inmunoglobulina divulgadas en el presente documento son útiles para detectar la expresión endógena de ROR1 de longitud completa en muestras de histología, tales como en muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE). En comparación, los anticuerpos anti-ROR1 publicados y comercialmente disponibles se unen de manera inconsistente, detectan débilmente o generalmente no detectan ROR1 expresada de manera endógena en muestras de histología. Por ejemplo, tales anticuerpos comerciales no detectan la expresión endógena de ROR1 en muestran histológicas que se han fijado en formalina e incrustado en parafina. Por tanto, las proteínas y los dominios de unión a inmunoglobulina divulgados en el presente documento también presentan mayor sensibilidad (además de mayor especificidad) para detectar ROR1 expresada de manera endógena en comparación con anticuerpos anti-ROR1 conocidos.
Un “dominio de unión” o una “región de unión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína, un polipéptido, oligopéptido o péptido (por ejemplo, anticuerpo, receptor) o una porción de los mismos que posee la capacidad de reconocer y unirse específicamente a una diana (por ejemplo, antígeno, ligando). Un dominio de unión incluye cualquier pareja de unión que se produce de manera natural, sintética, semisintética o producida de manera recombinante para una molécula biológica u otra diana de interés. Los dominios de unión a modo de ejemplo incluyen regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpos de dominio, sFv, fragmento Fv de cadena sencilla (scFv), Fab, F(ab')2), ectodominios de receptor o ligandos. Los dominios variables de inmunoglobulina (por ejemplo, scFv, Fab) se denominan en el presente documento “dominios de unión a inmunoglobulina”. Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente divulgación que se unen específicamente a una diana particular, incluyendo análisis de inmunotransferencia de tipo Western, ELISA y Biacore®.
En determinados casos, un dominio de unión forma parte de un polipéptido o una proteína más grande y se denomina “proteína de unión”. Una “proteína de unión a inmunoglobulina” o “proteína de unión similar a inmunoglobulina” se refiere a un polipéptido que contiene uno o más dominios de unión a inmunoglobulina, en el que el polipéptido puede estar en forma de cualquiera de una variedad de armazones o estructuras de proteína relacionada con inmunoglobulinas, tales como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, una proteína de fusión scFv-Fc o una proteína de fusión que comprende dos o más de tales dominios de unión a inmunoglobulina u otros dominios de unión.
Una proteína o un dominio de unión que se une de manera “C-terminal” a un dominio especificado se refiere a la proteína o al dominio de unión que se une a un epítopo ubicado dentro del dominio especificado o más cerca del extremo C-terminal de la proteína en relación con el dominio especificado. Por ejemplo, la unión “C-terminal a un dominio proteína cinasa intracelular de ROR1” se refiere a la unión a una porción de ROR1 ubicada dentro del dominio proteína cinasa intracelular, ubicada adyacente a (junto a o dentro de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 aminoácidos) y más cerca del extremo C-terminal de ROR1 en relación con el dominio proteína cinasa intracelular, o ubicada entre el extremo C-terminal y el dominio proteína cinasa intracelular de ROR1.
En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona una proteína de unión que se une específicamente a una porción C-terminal de ROR1. En algunos casos, una proteína de unión se une específicamente de manera C-terminal a un dominio proteína cinasa intracelular de ROR1. En casos particulares, una proteína de unión es una proteína de unión similar a inmunoglobulina. En casos adicionales, una proteína de unión es o comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo. En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, la ROR1 puede ser una ROR1 humana. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como 6D4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como uno que comprende una secuencia expuesta en SEQ ID NO:37 y/o 38, o un anticuerpo que comprende una o más CDR del mismo o que compite con un anticuerpo de este tipo por la unión a ROR1 o a un péptido de ROR1.
El término “epítopo” incluye cualquier secuencia de aminoácidos o determinante de proteína capaz de unirse de manera específica a una inmunoglobulina, a un receptor o a otro dominio de unión u otra proteína de unión. Los determinantes epitópicos contienen generalmente agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.
En determinados casos, una proteína de unión similar a inmunoglobulina de esta divulgación puede unirse específicamente a un epítopo ubicado dentro de la secuencia de aminoácidos que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 54 ó 55. En casos adicionales, una proteína de unión similar a inmunoglobulina de esta divulgación puede unirse específicamente a un epítopo ubicado dentro de la secuencia de aminoácidos que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o el 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:2, 3, 54 ó 55. En casos adicionales, una proteína de unión similar a inmunoglobulina de esta divulgación se une específicamente a un epítopo ubicado dentro de la secuencia de aminoácidos de N-NPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIP-C (SEQ ID NO:3).
En determinados casos, una proteína de unión de esta divulgación se une específicamente a (i) un péptido que comprende SEQ ID NO:3, en la que el péptido consiste opcionalmente en SEQ ID NO:3, y/o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que (a) está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 y/o (b) comprende uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3.
En casos específicos, una proteína de unión de esta divulgación se une a un epítopo ubicado dentro de una secuencia de aminoácidos al menos el 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3.
Las fuentes de dominios de unión incluyen regiones variables de anticuerpo de diversas especies (que pueden formatearse como anticuerpos, sFv, scFv, Fab o anticuerpos de dominio o de dominio Vh soluble), incluyendo humanos, roedores, aves, leporinos y ovinos. Las fuentes adicionales de dominios de unión incluyen regiones variables de anticuerpos de otras especies, tales como camélidos (de camellos, dromedarios o llamas; Ghahroudi et al., FEBS Letters 414: 521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284: 3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363: 446, 1993 y Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275: 413, 1998), tiburones nodriza (Roux et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95: 11804, 1998), pez rata manchado (Nguyen et al., Immunogenetics 54: 39, 2002) o lamprea (Herrin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105: 2040, 2008 y Alder et al., Nature Immunol. 9: 319, 2008). Estos anticuerpos pueden formar aparentemente regiones de unión a antígeno usando sólo una región variable de cadena pesada, es decir, estos anticuerpos funcionales son homodímeros sólo de cadenas pesadas (denominados “anticuerpos de cadena pesada”) (Jespers et al., Nature Biotechnol. 22: 1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 64: 2853, 2004; Baral et al., Nature Med. 12: 580, 2006; y Barthelemy et al., J. Biol. Chem. 283: 3639, 2008).
Cada uno de los términos entendidos por los expertos en la técnica de la tecnología de anticuerpos recibe el significado adquirido en la técnica, a menos que se defina expresamente de manera diferente en el presente documento. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro, así como a cualquier porción de unión a antígeno o fragmento de un anticuerpo intacto que tiene o retiene la capacidad de unirse a la molécula diana del antígeno reconocida por el anticuerpo intacto, tal como un fragmento scFv, Fab o Fab'2. Por tanto, el término “anticuerpo” en el presente documento se usa en el sentido más amplio e incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, incluyendo anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo funcionales (de unión a antígeno) de los mismos, fragmentos de unión a antígeno que incluyen fragmentos (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rIgG), fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla, incluyendo fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), y fragmentos de anticuerpos con un solo dominio (por ejemplo, sdAb, sdFv, nanocuerpo). El término abarca formas de inmunoglobulina genéticamente modificadas por ingeniería y/o modificadas de otro modo, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados, anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem. A menos que se indique de otro modo, debe entenderse que el término “anticuerpo” abarca fragmentos de anticuerpo funcionales del mismo. El término también abarca anticuerpos intactos o de longitud completa, incluyendo anticuerpos de cualquier clase o subclase, incluyendo IgG y las subclases de la misma, IgM, IgE, IgA e IgD.
Un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo puede ser no humano, quimérico, humanizado o humano. Por ejemplo, la estructura y función de las inmunoglobulinas se revisa en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).
Por ejemplo, los términos “Vl” y “Vh” se refieren a la región de unión variable de una cadena ligera y pesada de un anticuerpo, respectivamente. Las regiones de unión variables se componen de subregiones discretas bien definidas conocidas como “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) y “regiones de entramado” (FR). El término “CL” se refiere a una “región constante de cadena ligera de inmunoglobulina” o a una “región constante de cadena ligera”, es decir, una región constante de una cadena ligera de anticuerpo. El término “CH” se refiere a una “región constante de cadena pesada de inmunoglobulina” o a una “región constante de cadena pesada”, que puede dividirse adicionalmente, dependiendo del isotipo del anticuerpo, en dominios CH1, CH2 y CH3 (IgA, IgD, IgG), o CH1, CH2, CH3 y CH4 (IgE, IgM). Un “Fab” (fragmento de unión a antígeno) es la parte de un anticuerpo que se une a los antígenos e incluye la región variable y CH1 de la cadena pesada unidas a la cadena ligera a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
Los términos “región determinante de complementariedad” y “CDR”, sinónimos de “región hipervariable” o “HVR”, se conocen en la técnica para referirse a secuencias de aminoácidos no contiguas dentro de regiones variables de anticuerpo, que confieren especificidad de antígeno y/o afinidad de unión. En general, hay tres CDR en cada región variable de cadena pesada (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) y tres CDR en cada región variable de cadena ligera (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Se conocen en la técnica “regiones de entramado” y “FR” para referirse a las porciones distintas de CDR de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. En general, hay cuatro FR en cada región variable de cadena pesada de longitud completa (FR-H1, FR-H2, FR-H3 y FR-H4) y cuatro FR en cada región variable de cadena ligera de longitud completa (FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4).
Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR o FR dada pueden determinarse fácilmente usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos en Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, (5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (esquema de numeración de “Kabat”), Al-Lazikani et al. (J. Mol. Biol. 273:927-948, 1997) (esquema de numeración de “Chothia”), MacCallum et al. (J. Mol. Biol. 262:732-745, 1996) (esquema de numeración de “Contact”), Lefranc MP et al. (Dev. Comp. Immunol. 7:55-77, 2003) (esquema de numeración de “ IMGT”) y Honegger A y Plückthun A (J. Mol. Biol.
309:657-70, 2001) (esquema de numeración de “Aho”).
Los límites de una CDR o FR dada pueden variar dependiendo del esquema usado para la identificación. Por ejemplo, el esquema de Kabat se base en alineaciones estructurales, mientras que el esquema de Chothia se basa en información estructural. La numeración para los esquemas tanto de Kabat como de Chothia se basa en las longitudes de secuencia de regiones de anticuerpo más comunes, con inserciones acomodadas mediante letras de inserción, por ejemplo, “30a”, y deleciones que aparecen en algunos anticuerpos. Los dos esquemas colocan determinadas inserciones y deleciones (“ indel”) en diferentes posiciones, dando como resultado la numeración diferencial. El esquema de Contact se basa en el análisis de estructuras cristalinas complejas y es similar en muchos aspectos al esquema de numeración de Chothia.
La tabla 1, a continuación, enumera límites de posición a modo de ejemplo de CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 y CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 tal como se identifica mediante los esquemas de Kabat, Chothia y Contact, respectivamente. Para CDR-H1, la numeración de residuos se enumera usando los esquemas de numeración tanto de Kabat como de Chothia. Las FR están ubicadas entre las CDR, por ejemplo, con FR-L1 ubicada entre CDR-L1 y CDR-L2, y así sucesivamente. Se observa que, debido a que el esquema de numeración de Kabat coloca inserciones en H35A y H35B, el extremo del bucle de CDR-H1 de Chothia cuando se numera usando la convención de numeración de Kabat varía entre H32 y H34, dependiendo de la longitud del bucle.
Tabla 1. Límites de posición de CDR a modo de ejemplo
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
1 - Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
2 - Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948, 1997.Por tanto, a menos que se especifique de otro modo, debe entenderse que una “CDR” o “región determinante de complementariedad”, o las CDR especificadas individuales (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2), de un anticuerpo o una región del mismo dados, tal como una región variable del mismo, abarca una región determinante de complementariedad (o la específica) tal como se define mediante cualquiera de los esquemas mencionados anteriormente. Por ejemplo, cuando se indica que una CDR particular (por ejemplo, una CDR-H3) contiene la secuencia de aminoácidos de una CDR correspondiente en una secuencia de aminoácidos de Vh o Vl dada, se entiende que una CDR de este tipo tiene una secuencia de la CDR correspondiente (por ejemplo, CDR-H3) dentro de la región variable, tal como se define mediante cualquiera de los esquemas mencionados anteriormente. En algunos casos, se especifican secuencias de CDR especificadas. De manera similar, a menos que se especifique de otro modo, debe entenderse que una FR o la(s) FR especificada(s) individual(es) (por ejemplo, FR-H1, FR-H2) de un anticuerpo o una región del mismo dados, tal como una región variable del mismo, abarca una región de entramado (o la específica) tal como se define mediante cualquiera de los esquemas conocidos. En algunos casos, se especifica el esquema para la identificación de una CDR o una FR particular, o las FR o CDR, tal como la CDR tal como se define mediante el método de Kabat, Chothia o Contact. En otros casos, se da la secuencia de aminoácidos particular de una CDR o FR.
Entre los anticuerpos proporcionados se encuentran fragmentos de anticuerpo. Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla que comprenden una región variable de cadena pesada, una región variable de cadena ligera o ambas, tales como scFv.
Los anticuerpos con un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprende la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinados casos, un anticuerpo con un solo dominio es un anticuerpo con un solo dominio humano.
Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse mediante diversas técnicas, tales como, por ejemplo, digestión proteolítica de un anticuerpo intacto y producción mediante células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos de manera recombinante, tales como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de manera natural, tales como aquellas con dos o más regiones o cadenas de anticuerpo unidas por ligadores sintéticos, por ejemplo, ligadores peptídicos, y/o que no pueden producirse mediante digestión enzimática de un anticuerpo intacto que se produce de manera natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpo son scFv.
Tal como se usa en el presente documento, “porción de región Fc” se refiere al segmento de región constante de cadena pesada del fragmento Fc (la región de “fragmento cristalizable” o región Fc) de un anticuerpo, que puede incluir uno o más dominios constantes, tales como CH2, CH3, CH4 o cualquier combinación de los mismos. En determinados casos, una porción de región Fc incluye los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG, IgA o IgD, o cualquier combinación de los mismos, o los dominios CH3 y CH4 de un anticuerpo IgM o IgE, y cualquier combinación de los mismos. En otros casos, una estructura CH2CH3 o CH3CH4 tiene dominios de subregión del mismo isotipo del anticuerpo y son humanas, tal como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM humanas (por ejemplo, CH2CH3 de IgG1 humana). A modo de antecedentes, una región Fc es responsable de las funciones efectoras de una inmunoglobulina, tal como CCDA (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) y fijación del complemento, unión a receptores de Fc (por ejemplo, CD16, CD32, FcRn), mayor semivida in vivo en relación con un polipéptido que carece de una región Fc, unión a proteína A y quizás incluso transferencia placentaria (véase Capon et al., Nature 337: 525, 1989). En determinados casos, una porción de región Fc encontrada en proteínas de unión similares a inmunoglobulina de la presente divulgación será capaz de mediar una o más de estas funciones efectoras, o carecerá de una o más o de la totalidad de estas actividades por medio de, por ejemplo, una o más mutaciones conocidas en la técnica.
Además, los anticuerpos tienen una secuencia bisagra que está situada normalmente entre la región Fc y Fab (pero una sección menor de la bisagra puede incluir una porción amino-terminal de la región Fc). A modo de antecedentes, una bisagra de inmunoglobulina actúa como espaciador flexible para permitir que la porción de Fab se mueva libremente en el espacio. A diferencia de las regiones constantes, las bisagras son estructuralmente diversas, variando tanto en secuencia como en longitud entre clases e incluso entre subclases de inmunoglobulina. Por ejemplo, una región bisagra de IgG1 humana es libremente flexible, lo que permite la rotación de los fragmentos Fab sobre sus ejes de simetría y el movimiento dentro de una esfera centrada en el primero de dos puentes disulfuro entre cadenas pesadas. Por comparación, una bisagra de IgG2 human es relativamente corta y contiene una doble hélice de poliprolina rígida estabilizada por cuatro puentes disulfuro entre cadenas pesadas, lo que restringe la flexibilidad. Una bisagra de IgG3 humana difiere de las otras subclases por su región bisagra extendida única (aproximadamente cuatro veces más larga que la bisagra de IgG1), que contiene 62 aminoácidos (incluyendo 21 prolinas y 11 cisteínas), que forman una doble hélice de poliprolina inflexible y que proporciona mayor flexibilidad ya que los fragmentos Fab están relativamente lejos del fragmento Fc. Una bisagra de IgG4 humana es más corta que la de IgG1 pero tiene la misma longitud que la de IgG2, y su flexibilidad es intermedia entre la de IgG1 e IgG2.
Tal como se usa en el presente documento, a menos que se proporcione de otro modo, una posición de un residuo de aminoácido en la región constante de cadena pesada de IgG1 humana se numera suponiendo que la región variable de IgG1 humana se compone de 128 residuos de aminoácido según la convención de numeración de Kabat. Luego se usa la región constante de cadena pesada de IgG1 humana numerada como referencia para la numeración de los residuos de aminoácido en las regiones constantes de otras cadenas pesadas de inmunoglobulina. Una posición de un residuo de aminoácido de interés en una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina distinta de la cadena pesada de IgG1 humana es la posición del residuo de aminoácido en la cadena pesada de IgG1 humana con la que se alinea el residuo de aminoácido de interés. Las alineaciones entre regiones constantes de cadena pesada de IgG1 humana y otras cadenas pesadas de inmunoglobulina pueden realizarse usando programas de software conocidos en la técnica, tales como el programa Megalign (DNASTAR Inc.) usando el método Clustal W con los parámetros por defecto. Según el sistema de numeración descrito en el presente documento, por ejemplo, aunque la región Ch2 de IgG2 humana puede tener una deleción de aminoácidos cerca de su extremo amino-terminal en comparación con otras regiones Ch2, la posición de la “N” ubicada en 296 en Ch2 de IgG2 humana todavía se considera la posición 297 ya que este residuo se alinea con “N” en la posición 297 en Ch2 de IgG1 humana.
En algunos casos, una proteína de unión similar a inmunoglobulina es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, una proteína de unión comprende un anticuerpo, y el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En determinados casos, una proteína de unión similar a inmunoglobulina es un anticuerpo monoclonal 6D4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
En determinados casos, una proteína de unión de esta divulgación, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, contiene una cadena pesada o porción de la misma que comprende las secuencias expuestas en SEQ ID NO:6, 7 y 8. En algunos casos, una cadena pesada o porción de la misma comprende las secuencias de aminoácidos (por ejemplo, secuencias de CDR) expuestas en SEQ ID NO:21, 25 y 29; y/o 22, 26 y 29; y/o 23, 27 y 29; y/o 24, 28 y 30. En algunos casos, una cadena pesada o porción de la misma comprende SEQ ID NO:37 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% con la misma, y/o comprende una identidad de al menos el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99%, o una identidad del 100%, con una secuencia expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14. En algunos casos, el anticuerpo comprende la secuencia de SEQ ID NO:8, 29 ó 30 y la secuencia de SEQ ID NO: 11, 35 ó 36. En determinados casos, la proteína de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, contiene una cadena ligera o porción de la misma que comprende las secuencias expuestas en SEQ ID NO:9, 10 y 11. En algunos casos, la cadena ligera o porción de la misma comprende las secuencias de aminoácidos (por ejemplo, secuencias de CDR) expuestas en s Eq ID NO:31, 33 y 35; y/o 32, 34 y 36. En algunos casos, la cadena ligera o porción de la misma comprende SEQ ID NO:38 o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% con la misma, y/o comprende una identidad de al menos el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99%, o una identidad del 100%, con una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 15 ó 16. En algunos casos, la cadena pesada o porción de la misma es o comprende un Vh y en algunos casos la cadena ligera o porción de la misma es o comprende un Vl.
En determinados casos, una proteína de unión comprende (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada tal como se expone en SEQ ID NO:6, o una variante de SEQ ID NO:6 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO:7, o una variante de SEQ ID NO:7 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO:8, o una variante de SEQ ID NO:8 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos. En otros casos, una proteína de unión similar a inmunoglobulina de esta divulgación comprende (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO:9, o una variante de SEQ ID NO:9 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO:10, o una variante de SEQ ID NO:10 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO:11, o una variante de SEQ ID NO:11 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos. En casos adicionales, una proteína de unión similar a inmunoglobulina de esta divulgación, tal como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio variable de cadena ligera (Vl) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:15 ó 16 y un dominio variable de cadena pesada (Vh) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:12, 13 ó 14. En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, una proteína de unión similar a inmunoglobulina es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoclonal modificado por ingeniería, o fragmentos de unión de los mismos.
En determinados casos, una proteína de unión divulgada en el presente documento comprende (i) una CDR3 de cadena pesada, que tiene la secuencia de aminoácidos de una c DR3 dentro de la secuencia de dominio variable de cadena pesada (Vh) expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14; y/o (ii) una CDR3 de cadena ligera, que tiene la secuencia de aminoácidos de una CDR3 dentro de la secuencia de dominio variable de cadena ligera (Vl) expuesta en SEQ ID NO:15 ó 16. En casos adicionales, la CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:30 y/o la CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO:36. En tales casos, la proteína de unión puede comprender además (i) una CDR1 de cadena pesada y/o una CDR2 de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoácidos de una CDR1 y/o una CDR2, respectivamente, dentro de la secuencia de dominio variable de cadena pesada (Vh) expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14; y/o (ii) una CDR1 de cadena ligera y/o una CDR2 de cadena ligera, respectivamente, que tienen la secuencia de aminoácidos de una CDR3 dentro de la secuencia de dominio variable de cadena ligera (Vl) expuesta en SEQ ID NO:15 ó 16. En casos particulares, la CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:21, 22, 23 ó 24 y/o la CDR2 de cadena pesada comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:25, 26, 27 ó 28; y/o la CDR1 de cadena ligera comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:31 ó 32 y la CDR2 de cadena ligera comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:33 ó 34.
En determinados casos, una proteína de unión de la divulgación comprende un dominio variable de cadena ligera (Vl) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:15 ó 16 y un dominio variable de cadena pesada (Vh) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:12, 13 ó 14; y/o en la que la proteína de unión comprende un Vh que comprende SEQ ID NO:37 y/o un Vl que comprende SEQ iD NO:38.
En determinados otros casos, una proteína de unión comprende un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, tal como un scFv (un dominio variable de cadena pesada (Vh) y un dominio variable de cadena ligera (Vl), conectados mediante un ligador peptídico corto). Por ejemplo, una proteína de unión similar a inmunoglobulina de esta divulgación comprende un scFv que tiene un dominio variable de cadena ligera (Vl) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:15 ó 16, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:38, y un dominio variable de cadena pesada (Vh) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:37, o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% con las mismas. En determinados casos, un scFv comprende un Vh que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:12, 13 ó 14, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:37, o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% con las mismas, y un Vl que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:15 ó 16, o comprende una secuencia de SEQ ID NO:38, o una secuencia que tiene una identidad de al menos el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% con las mismas. En casos particulares, una proteína de unión de esta divulgación comprende un scFv que tiene dominios variables Vl y Vh de un anticuerpo monoclonal 6D4 o de un fragmento de unión del mismo.
En todavía casos adicionales, una proteína de unión de esta divulgación comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende un dominio variable de cadena ligera (Vl) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:15 ó 16 y un dominio variable de cadena pesada (Vh) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO:12, 13 ó 14, en la que el anticuerpo se une opcionalmente de manera específica a (i) un péptido que comprende SEQ ID NO:3, en la que el péptido consiste opcionalmente en SEQ ID NO:3, y/o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que (a) está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3 y/o (b) comprende uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3.
En todavía casos adicionales, una proteína de unión de la presente divulgación no se une a ROR2.
Tal como se usa en el presente documento, “se une específicamente a” o “específico de” puede referirse en algunos casos a una asociación o unión de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo anti-ROR1) o un dominio de unión (o una proteína de fusión del mismo) con una molécula diana con una afinidad o Ka (es decir, una constante de asociación en equilibrio de una interacción de unión particular con unidades de 1/M) igual a o mayor de 105 M-1 (que equivale a la razón de la velocidad de asociación [kon] con respecto a la velocidad de disociación [koff] para esta reacción de asociación), mientras que no se asocia ni une significativamente con cualquier otra molécula u otro componente en una muestra. Los dominios de unión (o las proteínas de fusión de los mismos) pueden clasificarse como dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “alta afinidad” y dominios de unión (o proteínas de fusión de los mismos) de “baja afinidad”. Los dominios de unión de “alta afinidad” se refieren a los dominios de unión con una Ka de al menos 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 1012 M-1 o al menos 1013 M-1, preferiblemente al menos 108 M-1 o al menos 109 M-1. Los dominios de unión de “baja afinidad” se refieren a los dominios de unión con una Ka de hasta 108 M-1, hasta 107 M-1, hasta 106 M-1, hasta 105 M-1. Alternativamente, la afinidad puede definirse como una constante de disociación en equilibrio (Kd) de una interacción de unión particular con unidades de M (por ejemplo, de 10-5 M a 10-13 M).
Se conocen una variedad de ensayos para identificar dominios de unión de la presente divulgación que se unen específicamente a una diana particular, así como para determinar afinidades de dominios de unión o proteínas de fusión, tales como análisis de inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, ultracentrifugación analítica, espectroscopia y resonancia de plasmón superficial (Biacore®) (véase, por ejemplo, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993; y las patentes estadounidenses n.os 5.283.173, 5.468.614, o el equivalente).
En determinados casos, cualquiera de las proteínas de unión mencionadas anteriormente se une a ROR1, tal como ROR1 humana, con alta afinidad. Por ejemplo, una proteína de unión similar a inmunoglobulina que tiene alta afinidad por ROR1 humana se une con una Kd de 1 * 10-7 M o menos.
En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, una proteína de unión puede unirse a ROR1 humana, y en algunos aspectos no se une o no se une específicamente a una ROR1 de otras especies, tal como una ROR1 murina, y/o no se une a una ROR1 de aún otras especies, tal como de macaco Rhesus.
En todavía casos adicionales, la presente divulgación proporciona una proteína de unión (por ejemplo, una proteína de unión similar a inmunoglobulina, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una proteína de unión de fusión) la cual compite con una proteína de unión de referencia (por ejemplo, una proteína de unión similar a inmunoglobulina, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una proteína de unión de fusión) por la unión específica a un epítopo de ROR1 ubicado de manera C-terminal en un dominio proteína cinasa intracelular de ROR1. El término “competir” cuando se usa en el contexto de proteínas de unión similares a inmunoglobulina o anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que compiten por el mismo epítopo significa la competición entre proteínas de unión similares a inmunoglobulina determinada mediante un ensayo en el que la proteína de unión a inmunoglobulina o un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que se somete a prueba previene o inhibe la unión específica de una proteína de unión similar a inmunoglobulina o un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de referencia al epítopo de ROR1. Por ejemplo, un anticuerpo de prueba que se une al mismo epítopo o a un epítopo solapante que es reconocido por un anticuerpo 6D4 o un fragmento de unión del mismo será capaz de competir por la unión a la proteína diana (ROR1) o a un fragmento de la misma que contiene el epítopo. Se conocen en la técnica ensayos de unión competitiva, e incluyen radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos competitivos (EIA) y ensayos de competencia de tipo sándwich. En algunos casos, una proteína de unión de la presente divulgación compite por la unión a ROR1 y/o a un péptido de SEQ ID NO:3, y/o se une al mismo o a un epítopo solapante de ROR1 con una proteína de referencia tal como se divulga en el presente documento. En algunos casos, una proteína de unión de referencia comprende una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada tal como se expone en SEQ ID NO:6, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada tal como se expone en SEQ ID NO:7, una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada tal como se expone en SEQ ID NO:8, una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera tal como se expone en SEQ ID NO:9, una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera tal como se expone en SEQ ID NO:10 y una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera tal como se expone en SEQ ID NO:11. En determinados casos, una proteína de unión similar a inmunoglobulina compite con una proteína de unión a inmunoglobulina de referencia por la unión específica a un epítopo de ROR1 ubicado de manera C-terminal en un dominio proteína cinasa intracelular de ROR1, en la que la proteína de unión de referencia comprende un dominio variable de cadena ligera (Vl) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:15 ó 16 y un dominio variable de cadena pesada (Vh) que es al menos el 90% idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14. En algunos casos, una proteína de unión de referencia comprende un dominio variable de cadena ligera (Vl) que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5% o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:15, 16 ó 38 y un dominio variable de cadena pesada (Vh) que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99,5%, o el 100% idéntico a una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:12, 13, 14 ó 37. En casos particulares, una proteína de unión de referencia comprende un anticuerpo monoclonal 6D4 o un fragmento de unión del mismo.
En más casos, una proteína de unión, una proteína de unión de referencia o ambas son cada una individualmente un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, una proteína de unión, una proteína de unión de referencia o ambas pueden comprender un anticuerpo, que puede ser un anticuerpo monoclonal. En casos particulares, por ejemplo, la proteína de unión de referencia es un anticuerpo monoclonal 6D4. En algunos casos, una proteína de unión, una proteína de unión de referencia o ambas pueden comprender cada una individualmente un anticuerpo quimérico o humanizado. En todavía casos adicionales, una proteína de unión, una proteína de unión de referencia o ambas comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, y el fragmento de unión a antígeno es un scFv. En todavía casos adicionales, una proteína de unión, una proteína de unión de referencia o ambas son una proteína de fusión que comprende un dominio de unión a antígeno (por ejemplo, scFv de un anticuerpo monoclonal 6D4), en la que el antígeno es ROR1, tal como ROR1 de mamífero o humana. En determinados casos, un dominio de unión a antígeno de la proteína de fusión es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, en la que el fragmento de unión a antígeno es un scFv específico de ROR1, tal como ROR1 de mamífero o humana.
En algunos casos, una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se divulga en el presente documento comprende además un marcador, tal como una enzima, un tinte, un marcador fluorescente, un código de barras de ADN (por ejemplo, que oscila desde cinco hasta 75 nucleótidos de longitud) o una etiqueta. Tal como se usa en el presente documento, “etiqueta peptídica” o “etiqueta proteica” se refiere a una secuencia peptídica única que se fija a, se fusiona con o forma parte de una proteína de interés y está unida específicamente mediante una molécula de unión relacionada heteróloga o no endógena, cuyas propiedades de unión pueden usarse para detectar, identificar, aislar o purificar, rastrear, enriquecer en o seleccionar como diana un péptido o una proteína etiquetados, o células que expresan un péptido o una proteína etiquetados, particularmente cuando un péptido o una proteína etiquetados forma parte de una población heterogénea de proteínas u otro material, o cuando las células que expresan un péptido o una proteína etiquetados forman parte de una población heterogénea de células (por ejemplo, muestra biológica).
En determinados casos, un marcador comprende un marcador fluorescente, tal como un tinte de cianina, una cumarina, una rodamina, un xanteno, una fluoresceína o derivados sulfonatados de los mismos, o una proteína fluorescente. Alternativamente, una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina puede comprender una enzima indicadora cromogénica, tal como peroxidasa del rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina (AP). En otros casos, un marcador puede ser una molécula de etiqueta. En algunos casos, un marcador puede ser una etiqueta usada para la obtención de imágenes in vitro. En casos adicionales, un marcador puede ser una etiqueta usada para aislar una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina. En todavía casos adicionales, un marcador es una etiqueta peptídica o una etiqueta proteica, tal como, por ejemplo, una etiqueta Myc, etiqueta His o etiqueta Strep®.
En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, la proteína de unión (a) puede ser capaz de unirse específicamente a la proteína, a la ROR1 y/o a un epítopo que está presente de manera endógena en una célula de una muestra biológica, muestra que opcionalmente comprende un corte de tejido fijado en formalina o congelado y/o una célula permeabilizada y/u opcionalmente deriva de un tumor de un sujeto. En algunos casos, la muestra deriva de un tejido tumoral, que se selecciona del grupo que consiste en neoplasias hemáticas y tumores sólidos. En casos particulares, la muestra (a) deriva de LLC o LCM o (b) deriva de un cáncer de ovario, un cáncer de pulmón, que opcionalmente se selecciona entre adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico y tumor carcinoide atípico, o un cáncer de mama, que opcionalmente es un cáncer de mama triple negativo. En todavía otros casos, la muestra deriva de un tejido normal seleccionado del grupo que consiste en médula ósea, tejido adiposo, glándula paratiroidea, esófago y páncreas.
En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, la proteína de unión se une opcionalmente de manera específica a una ROR1 de longitud completa.
En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, la proteína de unión puede ser capaz de detectar la expresión endógena de ROR1 en condiciones en las que un anticuerpo de referencia no detecta dicha expresión endógena, anticuerpo de referencia que opcionalmente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal contra ROR1, un anticuerpo contra ROR1 que reconoce una porción N-terminal de ROR1, ab135669, un anticuerpo policlonal de cabra anti-ROR1 humana, un anticuerpo policlonal de conejo anti-ROR1 humana, un anticuerpo anti-ROR1 4A5 y un anticuerpo anti-ROR1 2A2.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina o un anticuerpo o fragmento de unión del mismo tal como se describe en el presente documento y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables para uso diagnóstico y terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.), 18a edición, 1990) y en CRC Handbook of Food, Drug, and Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S.C. Smolinski, ed., 1992). Los portadores farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo incluyen cualquier adyuvante, portador, excipiente, deslizante, diluyente, conservante, tinte/colorante, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizador, agente isotónico, disolvente, emulsionante o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH fisiológico pueden ser portadores farmacéuticamente aceptables adecuados. También pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, tintes o similares en la composición farmacéutica. Además, también pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener diluyentes tales como agua, tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, dextrinas), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), glutatión y otros estabilizadores y excipientes. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica inespecífica son diluyentes a modo de ejemplo.
Uso de proteínas de unión anti-ROR1
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para identificar células que expresan ROR1 de longitud completa. En algunos casos, un método para identificar células que expresan ROR1 en su superficie celular y/o que expresan la ROR1 comprende poner en contacto una célula con una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento y detectar la unión específica de la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina a la célula, identificando de ese modo las células que expresan ROR1 de longitud completa. En determinados casos, la ROR1 de longitud completa que se detecta es ROR1 expresada normalmente o de manera endógena por la célula. En casos adicionales, una célula que está en contacto se ha modificado genéticamente por ingeniería para sobreexpresar una ROR1 endógena o heteróloga. En determinados casos, una célula se fija en formalina y se incrusta en parafina. En otros casos, una célula se congela y se incrusta en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Por ejemplo, tales células o tejidos preparados se exploran con sonda para determinar la presencia de ROR1 de longitud completa en la célula mediante inmunohistoquímica. En todavía otros casos, la presencia de ROR1 de longitud completa en la célula se detecta mediante inmunotransferencia realizada explorando con sonda un lisado obtenido a partir de la célula.
En aún otro aspecto, se proporciona un método de detección, comprendiendo el método de detección (a) poner en contacto una muestra biológica con una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento; y (b) detectar la unión específica de la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina a un péptido o epítopo en la muestra, o la ausencia de la misma, en el que método detecta de ese modo la presencia o ausencia de una ROR1 o un epítopo de ROR1 en la muestra. En algunos casos, el método de detección comprende además comparar un nivel de la unión específica detectada en (b) con un nivel de referencia, en el que un nivel aumentado de unión en comparación con el nivel de referencia indica la presencia de ROR1 o epítopo de ROR1 en la muestra. En casos particulares, la muestra se obtiene de un sujeto. En casos adicionales, la muestra comprende un corte de tejido y/o una célula. En determinados casos, la muestra comprende un corte de tejido fijado en formalina o congelado y/o una célula permeabilizada y/o la muestra deriva de un tumor, tumor que se selecciona del grupo que consiste en neoplasias hemáticas y tumores sólidos; y/o deriva de un tejido normal. Por ejemplo, en casos particulares, la muestra (a) deriva de LLC o LCM o (b) deriva de un cáncer de ovario, un cáncer de pulmón, que opcionalmente se selecciona entre adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico y tumor carcinoide atípico, o un cáncer de mama, que opcionalmente es un cáncer de mama triple negativo; o (c) deriva de un tejido normal seleccionado del grupo que consiste en médula ósea, tejido adiposo, glándula paratiroidea, esófago y páncreas. En algunos casos, una muestra comprende una célula que se fija en formalina y se incrusta en parafina, o la célula se congela y se incrusta en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). En algunos casos, la presencia de ROR1 de longitud completa en la célula se detecta mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia.
En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para identificar la presencia de una ROR1 en una muestra de tejido. En algunos casos, un método comprende poner en contacto una muestra de tejido con una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento y detectar la unión específica al tejido, identificando de ese modo el tejido que expresa la ROR1, que opcionalmente es ROR1 de longitud completa y/o ROR1 en la superficie celular. En determinados casos, una muestra de tejido se fija en formalina y se incrusta en parafina. En otros casos, una muestra de tejido se congela y se incrusta en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). En casos adicionales, la presencia de ROR1 de longitud completa en la muestra de tejido se detecta mediante inmunohistoquímica. En todavía casos adicionales, la presencia de ROR1 de longitud completa en la muestra de tejido se detecta mediante inmunotransferencia realizada explorando con sonda un lisado celular.
En algunos casos, se proporciona un método para cuantificar la cantidad de ROR1 de longitud completa en una célula o muestra de tejido. En determinados casos, un método comprende poner en contacto una célula o un tejido con una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento y cuantificar la unión específica de la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina a la célula, cuantificando de ese modo la cantidad de ROR1 de longitud completa de una célula o un tejido. En algunos casos, la ROR1 de longitud completa expresada por la célula es ROR1 expresada normalmente de manera endógena. En otros casos, una célula se ha modificado genéticamente por ingeniería para sobreexpresar ROR1. En casos adicionales, una célula o muestra de tejido se fija en formalina y se incrusta en parafina. En otros casos, una célula o muestra de tejido se congela y se incrusta en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). En todavía casos adicionales, la cantidad de ROR1 de longitud completa en la célula o muestra de tejido se detecta mediante inmunohistoquímica. En aún otros casos, la cantidad de ROR1 de longitud completa en la célula se detecta mediante inmunotransferencia realizada explorando con sonda un lisado celular.
Todavía otro aspecto de la presente divulgación es un método para identificar a un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 de longitud completa. En determinados casos de esta divulgación, puede sospecharse que un sujeto o una fuente biológica tiene o está en riesgo de tener una enfermedad, un trastorno o estado, incluyendo una enfermedad, un trastorno o estado malignos. Tal como se usa en el presente documento, “riesgo” es la posibilidad (probabilidad) de que un sujeto desarrolle una enfermedad o un estado especificados. El riesgo es una representación de la posibilidad de que el sujeto desarrolle una enfermedad dentro de un periodo de tiempo (tal como 1, 2, 3, 4 ó 5 años). Un “riesgo alto” indica una oportunidad mayor del 50% de que el sujeto desarrolle una enfermedad o un estado especificados. A la inversa, un “riesgo bajo” indica una oportunidad menor del 50% de que el sujeto desarrolle una enfermedad o un estado especificados. En algunos casos, el método para identificar un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 de longitud completa comprende poner en contacto una muestra de tejido del sujeto con una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento y detectar la unión específica de la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina al tejido, identificando de ese modo un sujeto que tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 o ROR1 de longitud completa.
Por ejemplo, puede identificarse que un sujeto tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 de longitud completa si una muestra de prueba de células o tejido tomada del sujeto tiene un nivel detectable o aumentado de ROR1 de longitud completa en comparación con una muestra de control. En determinados casos, puede identificarse que un sujeto tiene, o está en riesgo de tener, una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 de longitud completa cuando ROR1 de longitud completa está presente en una muestra de prueba pero está ausente o no es detectable en un control. En ejemplos adicionales, la diferencia entre los niveles de prueba y de control puede ser de aproximadamente 2 veces, aproximadamente 2,5 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 3,5 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 4,5 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 5,5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 6,5 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 7,5 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 8,5 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 9,5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 30 veces o más. Una muestra biológica se denomina “muestra de prueba” cuando se somete a prueba o se compara con un “control”. Un “control”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra sin enfermedad del mismo paciente y del mismo tejido, una muestra de un sujeto que no tiene o no sospecha que tiene la enfermedad de interés, un conjunto de muestras (por ejemplo, incluyendo muestras de desde dos hasta aproximadamente 100.000 sujetos) de diversos sujetos que no tienen o no sospecha que tienen la enfermedad de interés, o datos de uno o más sujetos que no tienen o no sospecha que tienen la enfermedad de interés (por ejemplo, un base de datos que contiene información sobre los niveles de biomarcadores de desde uno hasta aproximadamente 5.000 hasta aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 100.000 hasta aproximadamente 1.000.000 o más sujetos). En determinados casos, se analiza una “muestra de prueba” y se comparan los resultados (es decir, la expresión de ROR1) con un “control” que comprende un nivel inicial identificado determinado o promedio calculado a partir de una base de datos que tiene datos derivados de una pluralidad de muestras sin enfermedad o normales analizadas.
En algunos casos, opcionalmente puede incluirse una “referencia” o un “patrón” en un ensayo, que proporciona una medida de un nivel inicial patrón o conocido de una molécula diana (por ejemplo, nivel “normal”). En determinados casos, una muestra de referencia es un conjunto de muestras (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más muestras combinadas) de individuos sanos (es decir, que no tienen o no sospecha que tienen la enfermedad de interés). En determinados casos, una “muestra de prueba” y una “muestra de control” se examinarán en un ensayo junto con una muestra de referencia. En estos casos, las muestras de “prueba” y de “control” pueden denominarse de manera colectiva “muestras diana” ya que están comparándose con una muestra de referencia.
En determinados casos, puede sospecharse que un sujeto tiene o está en riesgo de tener una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 de longitud completa, y en determinados otros casos de esta divulgación puede saberse que el sujeto está libre de riesgo o presencia de tal enfermedad. En algunos casos, se sospecha que un sujeto tiene o está en riesgo porque el sujeto pertenece a una subpoblación identificada por características específicas, tales como edad, sexo, dieta, etnia, antecedentes familiares o una combinación de los mismos. En algunos casos, se sospecha que el sujeto está en riesgo si el sujeto tiene una mutación en un gen o una enfermedad hereditaria. En algunos casos, una enfermedad asociada con células que expresan ROR1 de longitud completa es una enfermedad o un estado hiperproliferativos. Por ejemplo, en determinados casos, una enfermedad o un estado hiperproliferativos es un tumor. En algunos casos, un tumor puede ser un tumor hemático, tal como LLC o LCM. En casos adicionales, un tumor puede ser un tumor sólido, tal como un tumor de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer de páncreas. Por ejemplo, en algunos casos, un cánceres un adenocarcinoma, un carcinoma epidermoide, un carcinoma microcítico o un tumor carcinoide atípico. En determinados casos, un cáncer de pulmón es un adenocarcinoma de pulmón. En determinados otros casos, un cáncer de mama es un cáncer de mama triple negativo. En algunos casos, el tumor comprende un tumor primario, un tumor metastásico o ambos.
En cualquiera de los métodos mencionados anteriormente que comprenden detectar la unión específica de la proteína de unión, el método comprende además identificar el sujeto o la muestra como candidato para el tratamiento con una terapia anti-ROR1 (por ejemplo, una inmunoterapia, tal como una terapia celular adoptiva) si la unión específica se detecta en al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% del área de superficie del tejido o de las células en el tejido, que se determinan mediante el método para expresar la ROR1 o el epítopo.
En los métodos mencionados anteriormente que comprenden detectar la unión específica de la proteína de unión, el método comprende además identificar el sujeto o la muestra como candidato para el tratamiento con una terapia anti-ROR1 (por ejemplo, una inmunoterapia, tal como una terapia celular adoptiva) si se encuentra que el tejido del que deriva la muestra expresa de manera uniforme y homogénea la ROR1 o el epítopo de la misma, tal como se determina mediante el método.
En aún otros aspectos de la presente divulgación, se proporciona un método para identificar si un sujeto que tiene una enfermedad o un estado hiperproliferativos se beneficiaría de un tratamiento específico de ROR1, que comprende poner en contacto una muestra de tejido del sujeto con una proteína de unión tal como se describe en el presente documento y detectar la unión específica de la proteína de unión al tejido, identificando de ese modo un sujeto que se beneficiaría de un tratamiento específico de ROR1. En algunos casos, un tratamiento específico de ROR1 es una inmunoterapia, tal como una terapia con células T que comprende administrar células T que expresan un CAR de ROR1, tal como el CAR de ROR1 descrito en Hudecek et al. (Blood 116: 4532-41, 2010). Los CAR de ROR1 seleccionan como diana la porción extracelular de ROR1, y por tanto seleccionan como diana la isoforma de ROR1 de longitud completa pero no la isoforma intracelular. Por consiguiente, en algunos casos, se proporciona un método para identificar un sujeto que se beneficiaría de una terapia con células T con CAR de ROR1, en el que la expresión de ROR1 de longitud completa, tal como se indica por la unión específica de la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina al tejido, identifica un sujeto que puede beneficiarse de la terapia. En determinados casos, el tratamiento es una inmunoterapia, que opcionalmente es una terapia celular adoptiva, que opcionalmente comprende un receptor de antígeno quimérico que comprende un anticuerpo anti-ROR1, que opcionalmente es o compite por la unión con el anticuerpo designado como R12. El anticuerpo R12 se divulga en Yang et al. (PLoSONE 6:e21018, 2011) y Hudecek et al. (Clin. Cancer Res. 19:3153, 2013). En algunos casos, se identifica un sujeto como un sujeto que se beneficiaría del tratamiento específico de ROR1 si la unión específica se detecta en al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% o al menos el 95%, u oscila desde al menos el 60% hasta al menos el 85% o desde al menos el 50% hasta al menos el 90%, del área de superficie del tejido o de las células en el tejido, que se determinan mediante el método para expresar la ROR1 o el epítopo de la misma. En algunos casos, se identifica el sujeto como un sujeto que se beneficiaría del tratamiento específico de ROR1 si el tejido del que deriva la muestra se determina mediante el método para expresar de manera uniforme u homogénea la ROR1 o el epítopo de la misma. En casos particulares, el tratamiento específico de ROR1 es una inmunoterapia, tal como una terapia celular adoptiva. En cualquiera de los casos mencionados anteriormente, el tratamiento específico de ROR1 comprende un receptor de antígeno quimérico que comprende un anticuerpo o una proteína de unión anti-ROR1, tal como un anticuerpo que es el anticuerpo designado como R12 o una proteína de unión o un anticuerpo que compite por la unión con el anticuerpo R12.
En todavía más aspectos de la divulgación, se proporciona un método para determinar el pronóstico de un sujeto que tiene una enfermedad o un estado hiperproliferativos asociados con células que expresan ROR1 de longitud completa, que comprende poner en contacto una muestra de tejido del sujeto con una proteína de unión tal como se describe en el presente documento y detectar la unión específica de la proteína de unión al tejido, en el que identificar la unión específica de ROR1 de longitud completa al tejido identifica el sujeto como que tiene un mal pronóstico en ausencia de un tratamiento específico de ROR1. Tal como se usa en el presente documento, “pronóstico” es la posibilidad del desenlace clínico para un sujeto afectado con una enfermedad, un trastorno o estado específicos. Con respecto al cáncer, el pronóstico es una representación de la posibilidad (probabilidad) de que el sujeto sobreviva (tal como durante 1, 2, 3, 4 ó 5 años) o la posibilidad de que el tumor experimente metástasis. Un “mal pronóstico” indica una oportunidad mayor del 50% de que el sujeto no sobreviva hasta un punto de tiempo especificado (tal como 1, 2, 3, 4 ó 5 años) o una oportunidad mayor del 50% de que el tumor experimente metástasis. A la inversa, un “buen pronóstico” indica una oportunidad mayor del 50% de que el sujeto sobreviva hasta un punto de tiempo especificado (tal como 1, 2, 3, 4 ó 5 años) o una oportunidad mayor del 50% de que el tumor no experimente metástasis.
En algunos casos, detectar ROR1 de longitud completa, indicada por la unión específica de la proteína de unión a un tejido, identifica que el sujeto tiene un tumor, metástasis tumoral o ambos. En algunos casos, un método para determinar el pronóstico de un sujeto que tiene una enfermedad o un estado hiperproliferativos asociados con células que expresan ROR1 de longitud completa comprende poner en contacto una muestra de tejido del sujeto con una proteína de unión tal como se describe en el presente documento y detectar la unión específica de la proteína de unión al tejido, en el que detectar la ROR1 de longitud completa en el tejido identifica que el sujeto tiene un mal pronóstico en ausencia de un tratamiento específico de ROR1. En cualquiera de estos casos, la muestra de tejido se fija en formalina y se incrusta en parafina, o la muestra de tejido se congela y se incrusta en OCT. En determinados casos, la presencia de ROR1 de longitud completa en una muestra de tejido se detecta mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia.
En cualquiera de los casos mencionados anteriormente que comprenden detectar la unión específica de la proteína de unión, el método comprende además tratar al sujeto con una terapia anti-ROR1, tal como una inmunoterapia. En determinados casos, la inmunoterapia comprende una terapia celular adoptiva. En cualquiera de estos casos, la terapia anti-ROR1 comprende un receptor de antígeno quimérico específico de ROR1, en la que el receptor de antígeno quimérico específico de ROR1 comprende un proteína de unión o un dominio de unión de anticuerpo anti-ROR1. En determinados casos, el receptor de antígeno quimérico específico de ROR1 comprende el dominio de unión del anticuerpo designado como R12 o comprende un dominio de unión que compite por la unión con el anticuerpo R12.
En determinados casos, se proporcionan en el presente documento métodos de evaluación de la eficacia de una terapia en un sujeto humano administrando la terapia y determinando la eficacia de la terapia. La “eficacia” es una medida de cómo de bien una terapia trata o reduce la carga de morbimortalidad, tal como el tamaño o número de tumores. Una reducción en la ROR1 detectable es una indicación de la reducción en la carga de morbimortalidad y buena eficacia. Ningún cambio en los niveles detectables de ROR1 o una tasa reducida de los niveles detectables de ROR1 puede ser una indicación de que una terapia es tumorostática. Ningún efecto sobre una tasa de aumento estadísticamente significativa en los niveles detectables de ROR1 es una indicación de eficacia escasa, eficacia mínima o ausencia de eficacia. En determinados casos, la eficacia puede correlacionarse con el tiempo de supervivencia. Por ejemplo, la terapia que aumenta el tiempo de supervivencia en pacientes de una manera estadísticamente significativa en comparación con un control se correlaciona con una mayor eficacia. A la inversa, una terapia que no aumenta el tiempo de supervivencia de una manera estadísticamente significativa en comparación con un control se correlaciona con una eficacia escasa, mínima o nula.
En algunos casos, la eficacia de una terapia se evalúa midiendo la expresión de ROR1 de longitud completa en una célula o muestra de tejido en comparación con un control o con niveles previamente medidos. En algunos casos, la célula o muestra de tejido se fija en formalina y se incrusta en parafina, o la célula se congela y se incrusta en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). El nivel de ROR1 de longitud completa en la muestra se mide detectando la cantidad de proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina que se une específicamente a ROR1 de longitud completa. En algunos casos, la unión específica de una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina a una célula o a un tejido se detecta mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia. En algunos aspectos del método, la terapia que está evaluándose es cirugía, quimioterapia, terapia citotóxica, terapia inmunitaria, terapias dirigidas, radioterapia o quimioradioterapia, o cualquier combinación de las mismas. En algunos casos, la terapia trata un trastorno o estado hiperproliferativos, tal como el cáncer. En algunos casos, la terapia es una inmunoterapia, tal como una terapia con células T que comprende administrar células T que expresan un CAR de ROR1, tal como el CAR de ROR1 descrito en Hudecek et al. (Blood 116: 4532-41,2010).
En aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento que comprenden administrar una terapia anti-ROR1 a un sujeto que tiene una enfermedad o un estado, en los que un tejido o una muestra de la enfermedad o el estado en el sujeto se ha identificado como que tiene una expresión uniforme u homogénea de ROR1 expresada en la superficie. En determinados casos, la enfermedad o el estado es un tumor, tal como un tumor sólido o un tumor hemático (por ejemplo, el tumor es un tumor de LLC, LCM, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario o cáncer de páncreas; o el tumor es un adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico, tumor carcinoide atípico o un cáncer de mama triple negativo). En determinados casos, un método de tratamiento comprende administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o un estado seleccionados entre adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico, tumor carcinoide atípico y cáncer de mama triple negativo. En casos particulares, la terapia anti-ROR1 comprende una inmunoterapia, tal como una terapia celular adoptiva o una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico que comprende un fragmento de anticuerpo anti-ROR1, tal como el anticuerpo designado como R12 (véase Yang et al., PLoSOne 6:e21018, 2011, y Hudecek et al., Clin. Cancer Res. 19:3153, 2013).
En algunos casos, se proporciona un método de tratamiento que comprende administrar a un sujeto que tiene una enfermedad o un estado una terapia anti-ROR1, en el que un tejido o una muestra de la enfermedad o el estado en el sujeto se ha identificado como que tiene una expresión uniforme u homogénea de ROR1 expresada en la superficie. En determinados casos, la enfermedad o el estado es un tumor, que opcionalmente es un tumor sólido o un tumor hemático. En algunos casos adicionales, el tumor se selecciona del grupo que consiste en LLC, LCM, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y cáncer de páncreas. En casos particulares, el tumor es un adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico, tumor carcinoide atípico o un cáncer de mama triple negativo. En algunos casos, la terapia anti-ROR1 comprende una inmunoterapia, tal como una terapia celular adoptiva. En algunos casos, la inmunoterapia comprende una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico que comprende un fragmento de anticuerpo anti-ROR1. En casos particulares, el receptor de antígeno quimérico comprende un fragmento de anticuerpo anti-ROR1 derivado de un anticuerpo designado como R12, un anticuerpo que contiene la región de unión a antígeno del mismo o un anticuerpo que compite por la unión con el anticuerpo designado como R12. En todavía casos adicionales, la célula que expresa un receptor de antígeno quimérico comprende una célula T o un linfocito citolítico natural. En los casos mencionados anteriormente, la expresión de ROR1 expresada en la superficie se ha determinado usando los métodos divulgados en el presente documento.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona kits que comprenden materiales útiles para llevar a cabo los métodos de diagnóstico según la presente divulgación. En determinados aspectos, se proporciona un kit que comprende una proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento. En algunos casos, el kit se usa para detectar la presencia de ROR1 de longitud completa en una célula o muestra de tejido. En algunos de tales casos, el kit se usa para detectar la presencia de ROR1 de longitud completa en una muestra de tejido, y la muestra de tejido se fija en formalina y se incrusta en parafina. En otros casos, la muestra de tejido se congela y se incrusta en OCT. En algunos casos, la presencia de ROR1 de longitud completa en una muestra de tejido se detecta mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia. En algunos casos, el kit incluye un anticuerpo secundario que comprende HRP.
En todavía otros aspectos, se proporciona un kit que comprende una composición, en el que la composición comprende una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento y un portador o excipiente. En algunos casos, se usa un kit para detectar la presencia de ROR1 de longitud completa en una célula o muestra de tejido. En algunos casos, la muestra es una muestra de tejido que se fija en formalina y se incrusta en parafina. En otros de tales casos, la muestra de tejido se congela y se incrusta en OCT. En algunos casos, la presencia de ROR1 de longitud completa en una muestra de tejido se detecta mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia. En algunos casos, el kit incluye un anticuerpo secundario que comprende HRP.
Los métodos para identificar la presencia de ROR1 de longitud completa descritos en el presente documento pueden ser realizados por laboratorios de diagnóstico, laboratorios de experimentación o médicos. La divulgación proporciona kits, que pueden usarse en estos diferentes ámbitos. Los materiales y reactivos para caracterizar muestras biológicas y diagnosticar una enfermedad o un estado hiperproliferativos en un sujeto según los métodos en el presente documento pueden ensamblarse juntos en un kit. En determinados aspectos, un kit comprende una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento e instrucciones para usar el kit según un método de esta divulgación.
Los kits que comprenden una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento pueden comprender además uno o más sustratos para anclar las moléculas de unión a antígeno, incluyendo portaobjetos de microalineamientos, perlas, tubos de plástico u otras superficies, anticuerpos secundarios, tampones o reactivos de marcaje, tampones o reactivos de lavado, tampones o reactivos de inmunodetección y medios de detección. Los protocolos para usar estos tampones y reactivos para realizar las diferentes etapas del procedimiento pueden incluirse en el kit. Los reactivos pueden suministrarse en forma sólida (por ejemplo, liofilizados) o líquida. Los kits de la presente divulgación pueden comprender opcionalmente diferentes recipientes (por ejemplo, un portaobjetos, un vial, una ampolla, un tubo de ensayo, un matraz o un frasco) para cada tampón o reactivo individual. Cada componente será adecuado generalmente como alícuotas de su respectivo recipiente o se proporcionará en forma concentrada. También pueden proporcionarse otros recipientes adecuados para realizar determinadas etapas de los métodos divulgados. Los recipientes individuales del kit se mantienen preferiblemente en un espacio cerrado para la venta comercial.
En determinados casos, los kits de la presente divulgación incluyen además muestras de control, portaobjetos de control, muestras de referencia, portaobjetos de referencia o cualquier combinación de los mismos. Las instrucciones para usar el kit, según uno o más métodos de esta divulgación, pueden comprender instrucciones para procesar la muestra biológica obtenida de un sujeto, realizar la prueba o instrucciones para interpretar los resultados, o cualquier combinación de los mismos. Los kits de la presente divulgación pueden incluir además un aviso prescrito por parte de una agencia gubernamental (por ejemplo, la FDA) que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos.
Ácidos nucleicos y células huésped para la producción de proteína de unión anti-ROR1
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado que codifica para un dominio de unión a inmunoglobulina o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento. En determinados casos, los polinucleótidos que codifican para dominios o proteínas de unión a inmunoglobulina pueden tener codones optimizados para potenciar o maximizar la expresión en determinados tipos de células (por ejemplo, Scholten et al., Clin. Immunol. 119: 135-145, 2006). Tal como se usa en el presente documento, un polinucleótido “que tiene codones optimizados” es un polipéptido heterólogo que tiene codones modificados con mutaciones silenciosas correspondientes a las abundancias de niveles de ARNt de células huésped.
En algunos casos, una molécula de ácido nucleico codifica para una proteína de unión (por ejemplo, cadenas pesada y ligera de un anticuerpo, o un dominio de unión de anticuerpo que comprende regiones de unión Vh y Vl) en la que dos o más dominios están separados mediante un sitio de escisión. En determinados casos, un sitio de escisión comprende desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20 aminoácidos amino-terminales al Vh o Vl, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20 aminoácidos carboxilo-terminales al Vh o Vl, una secuencia de aminoácidos de autoescisión o una combinación de los mismos. En determinados casos, el sitio de escisión comprende desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 15, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 5 aminoácidos en el extremo aminoterminal o carboxilo-terminal de los dominios de proteína de unión. En algunos casos, el sitio de escisión es una secuencia de aminoácidos de autoescisión que comprende un péptido 2A de teschovirus-1 porcino (P2A) (tal como la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:17), virus de la rinitis equina A (E2A) (tal como la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:19), virus Thosea asigna (T2A) (tal como la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:18), virus de la fiebre aftosa (F2A) (tal como la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:20) o cualquier combinación de los mismos (véase, por ejemplo, Kim et al., PLOS One 6:e18556, 2011).
En aún otro aspecto, se proporciona un constructo de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento. La divulgación también proporciona un constructo de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina y una etiqueta peptídica o etiqueta proteica. En algunos casos, un polinucleótido puede estar unido operativamente a una secuencia de control de la expresión. Tal como se usa en el presente documento, “constructo de expresión” se refiere a un constructo de ADN que contiene una molécula de ácido nucleico que está unida operativamente a una secuencia de control adecuada capaz de efectuar la expresión de la molécula de ácido nucleico en un huésped adecuado. Un constructo de expresión puede estar presente en un vector (por ejemplo, un vector bacteriano, un vector viral) o puede integrarse en un genoma. El término “unido operativamente” se refiere a la asociación de dos o más polinucleótidos en un único fragmento de polinucleótido de modo que la función de uno se ve afectada por la del otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). El término “secuencia de control de la expresión” (también denominada secuencia reguladora) se refiere a secuencias de polinucleótido que efectúan la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las que están unidas operativamente. Por ejemplo, las secuencias de control de la expresión pueden incluir secuencias potenciadoras, promotoras, de iniciación y terminación de transcripción; señales de procesamiento eficiente de ARN tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficiencia de traducción (es decir, secuencias de consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y posiblemente secuencias que potencian la secreción de proteínas.
En algunos casos, un constructo de expresión está presente en un vector. Un “vector” es una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico. Los vectores pueden ser, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, virus, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN linear o circular que puede incluir ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Vectores a modo de ejemplo son aquellos capaces de realizar la replicación autónoma (vector episómico) o la expresión de ácidos nucleicos a los que se unen (vectores de expresión). Los vectores virales a modo de ejemplo incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario incluyendo adenovirus, virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen el virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C de mamíferos, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo VLTH-VLB, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Campos et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996). En algunos casos, un vector es un plásmido. En algunos otros casos, un vector es un vector viral. En algunos de tales casos, el vector viral es un vector lentiviral o un vector y-retroviral.
En determinados otros aspectos, la divulgación proporciona una célula huésped que comprende un vector o constructo de expresión, o un polinucleótido proporcionado por un constructo de expresión tal como se describe en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “huésped” se refiere a una célula o a un microorganismo seleccionado como diana para la modificación genética con una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena para producir un polipéptido de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-ROR1 o fragmento de unión a antígeno del mismo). En determinados casos, una célula huésped opcionalmente ya puede poseer o puede modificarse para incluir otras modificaciones genéticas que confieren propiedades deseadas relacionadas o no relacionadas con la biosíntesis de la proteína heteróloga o exógena (por ejemplo, inclusión de un marcador detectable). Puede introducirse más de una molécula de ácido nucleico heteróloga o exógena en una célula huésped como moléculas de ácido nucleico independientes, como una pluralidad de genes controlados individualmente, como molécula de ácido nucleico policistrónica, como molécula de ácido nucleico única que codifica para una proteína de fusión, o cualquier combinación de los mismos. Cuando se introducen dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas en una célula huésped, se entiende que las dos o más moléculas de ácido nucleico exógenas pueden introducirse como molécula de ácido nucleico única (por ejemplo, en un vector único), en vectores independientes, integrados en el cromosoma huésped en un único sitio o en múltiples sitios. El número de moléculas de ácido nucleico heterólogas o actividades de proteína referenciadas se refiere al número de moléculas de ácido nucleico codificantes o al número de actividades de proteína, no al número de moléculas de ácido nucleico independientes introducidas en una célula huésped.
En todavía aspectos adicionales, la presente divulgación proporciona un procedimiento para preparar una proteína de unión o una proteína de unión similar a inmunoglobulina tal como se describe en el presente documento, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un vector o constructo de expresión, o un polinucleótido proporcionado por un constructo de expresión tal como se describe en el presente documento, en condiciones adecuadas para expresar la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina, y opcionalmente aislar la proteína de unión o proteína de unión similar a inmunoglobulina del cultivo.
Ejemplos
EJEMPLO 1
DISTRIBUCIÓN DE TEJIDOS DE EXPRESIÓN DE TRANSCRITOS DE ROR1
Se caracterizó la expresión de transcritos de Ror1 en un panel de diversos tejidos diferentes humanos y de macaco Rhesus mediante PCR en tiempo real cuantitativa. Se usó un ensayo de RT-qPCR para determinar la expresión de ROR1 en tejidos humanos y de macaco. Se obtuvo ADNc de la mayoría de los tejidos de BioChain®, y se prepararon muestras de ADNc adicionales usando el kit de síntesis de primera cadena SuperScript-III comenzando con ARN (1 |ig) de páncreas y colon humanos (Clontech) y de células B-LLC primarias. Se usó ADNc (2 |il) en una reacción de 10 |il usando la mezcla de PCR Power-SYBR-Green en el sistema de PCR en tiempo real 7900HT Fast (Life Technologies). Se normalizó la expresión de ROR1 a la media geométrica de los genes constitutivos de GAPDH y proteína de unión a TATA (TBP) usando cebadores directos (F) e inversos (R) específicos de genes, que incluyen: ROR1-F humano: 5'-AGCGTGCGATTCAAAGGATT-3' [SEQ ID NO:39],
ROR1-R humano: 5'-GACTGGTGCCGACGATGACT-3' [SEQ ID NO:40],
GAPDH-F humano: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' [SEQ ID NO:41],
GAPDH-R humano: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' [SEQ ID NO:42],
TBP-F humano: 5'-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3' [SEQ ID NO:43],
TBP-R humano: 5'-CACATCACAGCTCCCCACCA-3' [SEQ ID NO:44],
ROR1-F de macaco Rhesus: 5'-AGCTTGCGATTCAAAGGATT-3' [SEQ ID NO:45],
ROR1-R de macaco Rhesus: 5'-GACTGGTGGTGATGATGACT-3' [SEQ ID NO:46],
GAPDH-F de macaco Rhesus: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' [SEQ ID NO:47],
GAPDH-R de macaco Rhesus: 5'-GAAGATGGTGATGGGGCTTC-3' [SEQ ID NO:48],
TBP-F de macaco Rhesus: 5'-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3' [SEQ ID NO:49], y
TBP-R de macaco Rhesus: 5'-CACATCACAGCTCCCCACCA-3' [SEQ ID NO:50].
Se determinaron la eficiencia del cebador y los cambios en veces usando el método Pfaffl (Nucleic Acids Res. 29: e45, 2001), y se determinó la expresión en relación con las células B-LLC primarias.
Tal como se muestra en la figura 2, los niveles de expresión de transcritos de Ror1 eran esencialmente indetectables en la mayoría de los tejidos normales. Sin embargo, eran detectables bajos niveles de transcritos de Ror1 en el tejido adiposo y el páncreas en comparación con las células LLC, que se sabe que expresan altos niveles de ROR1. Por tanto, en vista de la alta expresión de ROR1 en tumores, mientras que los tejidos normales muestran una expresión de ROR1 de mínima a indetectable, ROR1 sería una buena diana terapéutica ya que es esencialmente un antígeno asociado a tumor y tales agentes terapéuticos tendrían probablemente una toxicidad de mínima a indetectable. EJEMPLO 2
OTROS ANTICUERPOS ANTI-ROR1 SON INCAPACES DE DETECTAR ROR1 DE MANERA INMUNOHISTOLÓGICA
Se sometieron a prueba varios anticuerpos anti-ROR1 publicados o comercialmente disponibles como reactivos de inmunohistoquímica (IHC) en diversas líneas celulares y tejidos para examinar su capacidad para detectar específicamente la expresión de ROR1. Los ensayos de IHC se realizaron en células y tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE) usando los protocolos específicos publicados para cada anticuerpo. Los anticuerpos anti-ROR1 humana sometidos a prueba fueron anticuerpo anti-ROR1 humana ab135669 (anticuerpo policlonal de conejo de Abcam®, Cambridge, MA) (Zhang et al., Sci. Rep. 24: 5811, 2014), anticuerpo anti-ROR1 humana (anticuerpo policlonal de cabra AF2000 de R&D Systems, Mineápolis, MN) (Dave et al., PLoS One 7: e52655, 2012), anticuerpo anti-ROR1 humana #4102 (anticuerpo policlonal de conejo de Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) (Yamaguchi et al., Cancer Cell 21: 348, 2012), anticuerpo anti-ROR1 humana 4A5 (anticuerpo monoclonal de ratón) (Zhang et al., Am. J. Pathol. 181: 1903, 2012) y anticuerpo anti-ROR1 humana 2A2 (anticuerpo monoclonal de ratón de BioLegend, San Diego, CA).
La tinción por IHC con anticuerpos específicos de ROR1 comercialmente disponibles usó protocolos publicados (véase Zhang et al., 2014; Dave et al., 2012; Yamaguchi et al., 2012; Zhang et al., 2012). Para el anticuerpo monoclonal 4A5, la recuperación del antígeno (Trilogy-30 minutos, tampón con alto contenido de sal-30 minutos) se siguió por anticuerpo primario (8 |ig/ml) durante la noche y o bien amplificación de CSA (protocolo del investigador) o bien polímero anti-IgG de ratón. La tinción de todos los anticuerpos se visualizó con DAB.
En un primer experimento, se determinó la expresión de ROR1 en las siguientes células: (1) células K562 (ROR1‘) (control negativo); (2) tejido de amígdala (ROR1‘) (control negativo); (3) células K562 transfectadas con Ror1, que sobreexpresan ROR1 de longitud completa (ROR1+) (control positivo); (4) ganglio linfático con LLC (ROR1+, de longitud completa); y ganglios linfáticos con LCM (ROR1+, de longitud completa). Varios de los anticuerpos publicados fueron capaces de detectar la sobreexpresión de ROR1 de longitud completa en células K562 (evidenciada por la tinción marrón), pero ninguno de los anticuerpos conocidos sometido a prueba fue capaz de detectar ROR1 de longitud completa expresada de manera endógena en los ganglios linfáticos con LLC y LCM (figura 3A).
En un segundo experimento, se determinó la expresión de ROR1 en (1) células K562 transfectadas con Ror1 (ROR1+); (2) células K562 (ROR1-); (3) tejido de ganglios linfáticos con LLC (ROR1+, de longitud completa); y (4) tejido de amígdala (ROR1-). Similar al primer experimento, la mayoría de los anticuerpos anti-ROR1 sometidos a prueba tiñeron células transducidas que sobreexpresaban ROR1 pero no tiñeron muestras de ganglios linfáticos con LLC FFPE (figura 3B). A pesar de los intentos de usar una variedad de condiciones de tinción y recuperación de antígenos, no se identificaron condiciones para la detección reproducible de ROR1 en los ganglios linfáticos con LLC con un fondo mínimo en amígdalas normales (datos no mostrados).
El fracaso de los reactivos disponibles para teñir ROR1 pudo deberse a varios motivos. El epítopo reconocido por anticuerpos en la región N-terminal en ROR1 de longitud completa puede destruirse mediante la fijación en formalina, y los procedimientos de recuperación de antígenos en la etapa de IHC pueden ser incapaces de recuperar suficiente epítopo para el reconocimiento de anticuerpos. De acuerdo con esta posibilidad, la fijación en formalina de células LLC o células K562 transfectadas para sobreexpresar ROR1 de longitud completa redujo la detección de ROR1 mediante análisis de citometría de flujo (figura 4, panel superior). Además, se detectaron niveles mucho más altos de ROR1 mediante inmunotransferencia de células K562 transfectadas para sobreexpresar ROR1 en comparación con las células LLC (figura 4, panel inferior). Por tanto, los reactivos anti-ROR1 actualmente disponibles pueden no ser lo suficientemente sensibles para detectar niveles de ROR1 endógena expresada en tejido canceroso.
Por consiguiente, determinados anticuerpos anti-ROR1 disponibles no son del todo satisfactorios, por ejemplo, en la capacidad para detectar la expresión de ROR1 endógena en tumores y/u otros tejidos, por ejemplo, en tejidos fijados en formalina u otros tejidos preparados, de una manera óptimamente sensible y específica.
EJEMPLO 3
ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE ROR1 DE LONGITUD COMPLETA
Se generó un anticuerpo, que en algunos aspectos es útil como reactivo de diagnóstico, detección y/o pronóstico, que es capaz de detectar Ro r 1 de longitud completa endógena (ROR1_v1) sin tener una reacción cruzada con la isoforma corta de ROR1 intracelular (ROR1_v2). En particular, se usó la porción C-terminal de ROR1, que está presente sólo en ROR1 de longitud completa (y generalmente es la única isoforma que se localiza en la superficie celular de, por ejemplo, una célula cancerosa), para generar un panel de anticuerpos. En resumen, se inmunizaron ratones BALB/c y CD1 hembra con un conjunto de cuatro péptidos correspondientes a aminoácidos ubicados en la región C-terminal de ROR1 humana (figura 5). Debido a que ROR1 está altamente conservada entre ratones y humanos (97% de homología de aminoácidos), se eligieron péptidos de la región intracelular de ROR1_v1 que tienen las máximas diferencias de aminoácidos entre ROR1 humana y de ratón (pero que tienen una homología mínima con otras secuencias en el proteoma humano) para facilitar la obtención de una respuesta inmunitaria en ratones. Se acoplaron los cuatro péptidos sintéticos a KLH. Se sometieron a prueba sueros policlonales de ratones inmunizados para identificar ratones con títulos altos de anticuerpos anti-ROR1. Se seleccionaron sueros policlonales mediante inmunotransferencia contra lisados celulares ROR1+ LLC y ROR1 K562 usando el dispositivo de inmunotransferencia WES (ProteinSimple, Bio-Techne). Luego, usando métodos convencionales, se prepararon hibridomas a partir de esplenocitos de ratones que tenían un alto título de anticuerpo anti-ROR1 para generar anticuerpos monoclonales, y se seleccionaron 1222 clones basándose en la unión al antígeno diana marcado con fluorescencia. Se seleccionaron y clasificaron los hibridomas en función de la unión peptídica usando una matriz de perlas citométricas que porta el cóctel peptídico de ROR1.
Se examinaron los sobrenadantes de los 133 clones de hibridoma superiores usando análisis de inmunotransferencia e inmunohistoquímica (IHC). Se usó el análisis de inmunotransferencia en el examen inicial de los sobrenadantes para determinar anticuerpos específicos de ROR1. Se prepararon lisados celulares totales usando tampón de lisis [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), NaCl 130 mM, Triton X-100 al 1% (v/v), EDTA 5 mM y cóctel inhibidor de proteasas (Roche)]. Se resuspendieron los sedimentos celulares en tampón de lisis a 1 x 107 células/ml y se incubaron durante 10 minutos en hielo, seguido de centrifugación a 13.000 rpm y 4°C durante 15 minutos. Se determinó la concentración de proteína en el sobrenadante usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific Pierce). Se procesaron los lisados celulares de células LLC en el sistema de inmunotransferencia WES (Altogen Labs, Austin, TX) usando protocolos convencionales y se visualizaron con anticuerpo anti-HRP de ratón. Se examinaron sueros policlonales de ratones inmunizados mediante inmunotransferencia contra lisados de células LLC primarias (ROR1+) y células ROR1 K562, para identificar sueros que detectaron una banda a 130 kDa correspondiente a ROR1 de longitud completa (figura 6A). Se identificaron varios clones que reconocieron la banda a 130 kDa de ROR1 (ROR1_v1) en lisados de células LLC (figura 6B). El clon 6D4 detectó específicamente una banda clara a 130 kDa de ROR1 mediante inmunotransferencia (figura 6B). El hibridoma 6D4 se sometió a dos rondas posteriores de subclonación con validación repetida para la unión peptídica.
Luego se sometieron a prueba los clones que detectaron ROR1_v1 contra un panel de diferentes tejidos FFPE (líneas celulares K562/ROR1+, células K562, ganglios linfáticos con LLC y múltiples tejidos de amígdala normales) mediante análisis de IHC. Se realizaron cortes de tejido de cuatro micrómetros y se tiñeron con Leica Bond Rx (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Se pretrataron los portaobjetos con tampón h 2 durante 20 minutos. Se bloqueó la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 minutos. Se aplicó un bloque de proteínas durante 10 minutos (suero de cabra al 15%, suero humano al 5% en diluyente de anticuerpos). Para el anticuerpo monoclonal de ratón anti-ROR1 6D4, se usó el anticuerpo a una dilución 1:50 y se aplicó al tejido durante 30 minutos, y luego se detectó cualquier anticuerpo 6D4 unido usando polímero específico de ratón con HRP Leica PowerVision (PV6110) durante 12 minutos y se visualizó la tinción con Refine DAB (Leica Biosystems) y una contratinción de hematoxilina. Se incluyeron portaobjetos de control de isotipo (IgG) para cada serie (Jackson ImmunoResearch Laboratories). La unión específica se indicó por el color marrón del sustrato DAB.
Se sometió a prueba el anticuerpo monoclonal purificado del clon 6D4 contra muestras FFPE de los siguientes tipos de células: (1) células K562 (ROR1-); y (2) células K562 transfectadas para sobreexpresar ROR1 de longitud completa (K562/ROR1+). El anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 demostró una tinción clara de la membrana a niveles altos contra K562/ROR1+ y sin tinción de fondo en células ROR1 K562 (figura 7). El anticuerpo anti-ROR1 humana 6D4 también se sometió a prueba contra un panel de ganglios linfáticos con tumores LLC y l Cm humanos primarios para determinar si podía detectar la expresión de ROR1 de longitud completa endógena, con tejido de amígdala humana normal (ROR1-) como control negativo. El anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 demostró una clara tinción de membrana específica en células de tumores LLC y LCM sin tinción de fondo en tejido de amígdala normal (figura 8). Estos resultados demuestran que, además de detectar la sobreexpresión de ROR1 en células transfectadas, el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 purificado es capaz de detectar de manera sensible ROR1 expresada de manera endógena en al menos dos tipos de tumores diferentes.
Por el contrario, los sobrenadantes de muchos otros clones tiñeron las células K562 que sobreexpresaban ROR1 pero no pudieron detectar ROR1 endógena en el ganglio linfático con LLC FFPE (figuras 9A y 9B).
A partir de la mezcla de cuatro péptidos de ROR1 diferentes que se usó para inmunizar ratones, un fragmento de péptido de ROR1 se unió específicamente por el clon 6D4 del anticuerpo monoclonal anti-ROR1. Se encontró que el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 se une a un epítopo dentro del péptido de ROR1 humana 786-NPRYPNYMFPSQGITPQGQIAGFIGPPIP-814 (SEQ ID NO:3), que está ubicado en la región C-terminal de ROR1 de longitud completa (ROR1_v1) (véase la figura 5). Se sometió a mapeo el epítopo usando una matriz de perlas citométricas (CBA) para la deconvolución de la diana secundaria (BD™ Elispot, San José, CA).
En conjunto, estos estudios demuestran que el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 puede detectar de manera específica y sensible ROR1 de longitud completa expresada de manera endógena en células y tejidos humanos, tal como en el cáncer.
EJEMPLO 4
VALIDACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD DEL ANTICUERPO MONOCLONAL 6D4
Se evaluó adicionalmente la unión del anticuerpo monoclonal 6D4 purificado a ROR1 y ROR2. En resumen, se clonaron moléculas de ácido nucleico que codifican para ROR1_v1 humana (NP_005003.2) y ROR2 (pDOMR223-ROR2-Addgene) en un vector retroviral tal como describen Leisegang et al. (J. Mol. Med. 86: 573, 2008). Las líneas celulares K562, JeKo-1, MDA-MB-231, NCI-H1975 y 293T se obtuvieron de la ATCC. Se transdujeron las células K562 con vectores retrovirales que expresan péptidos de ROR1_v1 humana, ROR2 humana (SEQ ID NO:56) y ROR1_v1 de macaco Rhesus (SEQ ID n O:58). Se realizó la tinción de flujo con anticuerpo anti-ROR1 (clon 2A2-Miltenyi) y anticuerpo anti-ROR2 (R&D Biosystems-FAB20641G) o isotipos tal como se describió anteriormente (véase Berger et al., Cancer Immunol. Res. 3: 206, 2015).
El anticuerpo 6D4 tiñó K562/ROR1 con un fondo mínimo contra células K562 no transducidas o K562 que expresan ROR2 humana, y tiñó líneas celulares tumorales epiteliales y hematopoyéticas, incluyendo JeKo-1, MDA-MB-231 y NCI-H1975, que también muestran la tinción de ROR1 en la superficie celular mediante citometría de flujo usando el clon 2A2 bien caracterizado (figura 10A). No se observó tinción en las células K562 que expresaban ROR2 humana (figura 10A, parte inferior izquierda). También se sometió a prueba 6D4 purificado para teñir PBMC y ganglios linfáticos con LLC y lCm , y se observó una tinción uniforme de la membrana con un fondo mínimo en amígdala humana normal (figura 10b ). La inmunotransferencia de lisados de K562/ROR1, células LLC y LCM primarias y líneas tumorales ROR1+ con 6D4 detectó una banda a 130 kDa consistente con ROR1 de longitud completa (figura 10C).
Estos resultados demuestran que el anticuerpo monoclonal 6D4 detecta específicamente la expresión endógena en la superficie celular de ROR1 de longitud completa en tumores primarios con mayor sensibilidad que los reactivos anteriores y sin reactividad cruzada contra ROR2.
EJEMPLO 5
USO DEL ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-ROR1 6D4 PARA IDENTIFICAR TUMORES SÓLIDOS QUE EXPRESAN ROR1
Para determinar si el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 podía detectar ROR1 endógena en tejidos tales como tejidos enfermos, tal como la expresión de ROR1 en la superficie celular en tumores sólidos, se usó el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 purificado 6D4 en ensayos de inmunohistoquímica (IHC) de muestras de cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y cáncer de páncreas fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE).
Se prepararon muestras de IHC tal como se describió anteriormente en el ejemplo 3. Dos patólogos independientes certificados por la junta calificaron los tejidos tumorales para determinar ROR1 en la superficie celular y se promediaron las puntuaciones. Los tejidos se puntuaron como “0-negativa”, “1 -tinción baja de membrana con anticuerpo”, “2 ó 3-tinción alta de membrana con anticuerpo” (figura 11). Se definieron la tinción homogénea y focal como tinción en más del 50% y menos del 30% de las células tumorales, respectivamente.
Sensibilidad y especificidad del anticuerpo 6D4 para células tumorales de cánceres epiteliales
En un primer estudio, se encontró que el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 es capaz de unirse de manera sensible y específica a células tumorales que expresan ROR1 de longitud completa, en comparación con el control de isotipo. En particular, se encontró que ROR1 se expresaba altamente en un subconjunto de pacientes con tejidos de cáncer de mama triple negativo, adenocarcinoma de pulmón y cáncer de ovario (figura 12). En este estudio, se observó que el 50%, el 75% y el 50% de los cánceres de ovario, adenocarcinomas de pulmón y cánceres de mama triple negativo, respectivamente, tenían una expresión homogénea de ROR1. Tal como se muestra en la figura 13, también se observó tinción en diversos tipos de cáncer de pulmón, incluyendo adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma microcítico y tumor carcinoide atípico. Tal como se muestra en las figuras 14 y 15, el anticuerpo detectó niveles bajos de ROR1 en sólo un subconjunto de tejidos humanos normales (incluyendo glándula paratiroidea, islotes pancreáticos y regiones del esófago).
Expresión de ROR1 en cánceres epiteliales
a. Cáncer de ovario
En un estudio previamente publicado, se encontró que aproximadamente el 50% de los cánceres de ovario expresan transcritos de Ror1, y pacientes con tumores que tenían altos niveles de transcritos de Ror1 tenían una supervivencia libre de enfermedad y libre de metástasis desfavorables (Zhang et al., Scientific Reports 4:5811, 2014). Sin embargo, en ese estudio, el análisis de IHC de ROR1 localizó la tinción principalmente en el citoplasma y el núcleo de las células tumorales, que era distinta de la expresión en la superficie celular de ROR1_v1 de longitud completa en líneas de células tumorales.
Por tanto, se examinaron dos microalineamientos de tejidos compuestos por 159 cánceres de ovario de una variedad de histologías usando los anticuerpos monoclonales 6D4 en IHC. El cincuenta por ciento (50%) de los cánceres de ovario mostraron predominantemente tinción de membrana y citoplásmica con 6D4 (figura 16A). En el 92% de los tumores, ROR1 se expresó de manera homogénea, definida como una tinción membranosa definida de más del 50% de las células, y la intensidad de tinción en tumores positivos pudo clasificarse como alta o baja basándose en la intensidad de la tinción de la superficie celular (figura 11). Cuando se agruparon en subtipos histológicos, aproximadamente el 90% de los adenocarcinomas endometrioides eran ROR1 y el 60% de los tumores positivos eran ROR1alta, el 74% de los carcinomas papilares serosos eran ROR1 con el 50% calificados como ROR1alta, el 44% de los adenocarcinomas mucinosos eran ROR1+ (el 31% de ROR1alta); y el 37% de los adenocarcinomas serosos eran ROR1+(el 50% de ROR1alta) (figuras 16B, 16C). La ROR1 en la superficie celular era baja o estaba ausente en determinados subtipos de cáncer de ovario, tales como carcinomas de células claras y adenocarcinoma papilar mucinoso. Se examinó un pequeño número de muestras metastásicas (1 de adenocarcinomas de células claras, 4 de adenocarcinomas papilares serosos y 7 de adenocarcinomas serosos), y el 75% de los adenocarcinomas papilares serosos metastásicos y el 40% de los adenocarcinomas serosos eran ROR1+. Estos resultados demuestran que el AcM 6D4 detecta ROR1 de longitud completa en la superficie celular en una gran fracción de cánceres de ovario, y puede ser útil tanto para determinar implicaciones de pronóstico de la expresión de ROR1 como para identificar pacientes elegibles para terapias dirigidas a ROR1.
b. Cáncer de mama
Se examinó previamente la expresión del gen ROR1 en cáncer de mama usando conjuntos de datos de GEO públicamente disponibles, y la alta expresión de ROR1 se correlacionó con una firma de genes de transición epitelialmesenquimal (e Mt ) y una menor supervivencia libre de metástasis (Zhang et al., PloS One 7:e31127, 2012; Cui et al., Cancer Research 73:3649, 2013). Uno de estos informes observó expresión de proteína ROR1 en el 70% de los cánceres primarios mediante IHC (el 75% de los cánceres de mama lobulares y el 70% de los cánceres de mama ductales eran ROR1+), aunque la tinción con el reactivo usado en ese estudio se localizó en el núcleo y el citoplasma, lo que sugiere que la proteína detectada puede no ser la variante de ROR1 de longitud completa en la superficie celular (Zhang et al., 2012). Un grupo independiente examinó ROR1 mediante IHC en cáncer de mama triple negativo (TNBC) y encontró que el 22% eran ROR1 y estos pacientes tenían una supervivencia libre de enfermedad más corta (chien et al., Virchows Archiv 468:589, 2016)
En este estudio, se analizaron 24 muestras de ER/PR+, 12 muestras de Her2+ y 60 muestras de TNBC para determinar ROR1 usando el AcM 6D4 (figuras 17A-17C). Se observó baja tinción de ROR1 en un pequeño porcentaje de los tumores ER/PR+ (el 12% de ROR1+) y no se observó expresión de ROR1 en tumores HER2+. Sin embargo, ROR1 se expresó altamente en TNBC, en el que el 57% de las muestras eran ROR1+ con el 56% calificadas como ROR1alta y el 74% mostraban tinción homogénea (figuras 17B-17C).
c. Cáncer de pulmón
En estudios anteriores, se identificaron transcritos de Ror1 en cáncer de pulmón no microcítico mediante microalineamientos y PCR (Yamaguchi et al., Cancer Cell 21: 348, 2012; Karachaliou et al., Translational Lung Cancer Research 3: 122, 2014). La IHC con diferentes anticuerpos policlonales y monoclonales mostró tinción de ROR1 en el 24-90% de los adenocarcinomas de pulmón, que constituyen el 40% de todos los cánceres de pulmón (Zhang et al., The American Journal of Pathology 181: 1903, 2012; Yamaguchi et al., Cancer Cell 21: 348, 2012; Liu et al., PloS One 10: e0127092, 2015). La expresión de ROR1 en otros subtipos de cáncer de pulmón no se ha caracterizado bien.
Se examinó la expresión de ROR1 en 137 cánceres de pulmón primarios de diferentes tipos histológicos usando el AcM 6D4. La expresión de ROR1 era más frecuente en adenocarcinomas de pulmón (el 42% eran ROR1+ con el 38% calificados como ROR1alta) con una minoría (12%) de tinción de carcinomas epidermoides ROR1+ (figuras 18A-18C). También se observó tinción de ROR1 en carcinomas adenoescamosos, carcinomas macrocíticos, carcinomas microcíticos y tumores carcinoides atípicos, aunque se examinaron muy pocos de estos tumores como para determinar una estimación precisa de la frecuencia de positividad (figuras 18B-18C). Todos los tumores de pulmón ROR1 presentaron tinción homogénea.
Debido a que se ha informado que ROR1 desempeña un papel en la EMT y en la migración tumoral, se evaluó la expresión de ROR1 en lesiones metastásicas emparejadas para determinar si se mantenía la expresión de ROR1 en tumores primarios. Se examinó la expresión de ROR1 en 30 ganglios linfáticos primarios y metastásicos emparejados de pacientes con adenocarcinoma de pulmón, el 50% de los cuales tenían tumores ROR1+. En pacientes con tumores primarios ROR1+, el 60% de los ganglios linfáticos emparejados permanecieron ROR1+, y el 40% eran ROR1- (figura 18D). En dos pacientes, el tumor primario era ROR1- pero los ganglios linfáticos metastásicos eran ROR1+. Estos resultados sugieren que puede no haber una correlación directa entre la expresión de ROR1 aumentada y el potencial metastásico en adenocarcinomas de pulmón, o que el mantenimiento de la expresión de ROR1 puede no requerirse para el crecimiento tumoral en un sitio metastásico distante.
d. Cáncer de páncreas
En un estudio se informó previamente que el adenocarcinoma de páncreas expresa ROR1 de manera frecuente (83%) (Zhang et al., The American Journal of Pathology 181:1903, 2012).
Se determinó la expresión de ROR1 en la superficie celular en 38 casos de adenocarcinoma de páncreas usando el AcM 6D4 (figura 19A). Sorprendentemente, se encontró ROR1 expresada a bajos niveles en una pequeña fracción de tumores (15%) (figura 19B).
Resumen
En general, el presente análisis de cánceres epiteliales comunes muestra que los altos niveles de ROR1 de longitud completa expresada en la superficie celular están presentes en una fracción significativa de cánceres de ovario, TNBC y adenocarcinomas de pulmón. La tinción de ROR1 es normalmente homogénea, lo que sugiere que la gran mayoría de tales células tumorales pueden ser susceptibles a terapias dirigidas a ROR1.
Estos resultados respaldan la utilidad de ROR1 como diana de antígenos asociados a tumor, que van a seleccionarse como diana con terapias específicas de ROR1, tales como inmunoterapias, incluyendo células inmunitarias que expresan receptores de antígeno quimérico (CAR) anti-ROR1 en sus superficies celulares, incluyendo en tumores hemáticos o sólidos que expresan ROR1 en sus superficies. Además, el anticuerpo monoclonal anti-ROR1 6D4 es útil como reactivo de diagnóstico sensible y específico o como diagnóstico complementario para terapias específicas de ROR1.
EJEMPLO 6
EXPRESIÓN DE ROR1 EN TEJIDOS NORMALES DE MACACO RHESUS Y HUMANOS
Humano
Una preocupación por las terapias con anticuerpos o células T adoptivas que seleccionan como diana ROR1 es el potencial para toxicidades dentro de la diana, fuera del tumor debido a la expresión de ROR1 en tejidos normales (Morgan et al., Molecular Therapy 18:843, 2010; Lamers et al., Molecular Therapy 21:904, 2013; Hassan et al., Clinical Cancer Research 13:5144, 2007). Estudios anteriores que han analizado la expresión de ROR1 en tejidos normales mediante PCR en tiempo real o inmunotransferencia de lisados de tejidos completos encontraron que ROR1 está ausente o se expresa a niveles bajos en la mayoría de los tejidos normales (Baskar et al., Clinical Cancer Research 14:396, 2008; Hudecek et al., Blood 116:4532, 2010; Dave et al., PloS One 7:e52655, 2012; Fukuda et al., PNAS 105:3047, 2008). Los lisados o conjuntos de ADNc de tejidos completos son una importante primera etapa en la detección de ROR1, pero no pueden detectar la expresión si está localizada en una minoría de células o una región del tejido. Se ha usado citometría de flujo para mostrar que la ROR1 de longitud completa expresada en la superficie celular está presente en adipocitos diferenciados de precursores de adipocitos in vitro y en una etapa temprana de la diferenciación de células B normales en la médula ósea (Hudecek et al., 2010). Varios estudios han examinado la expresión de ROR1 en tejidos normales usando IHC con reactivos de anticuerpos previamente disponibles pero no han informado ROR1 expresada en la superficie celular en tejidos normales, excepto para los adipocitos (Dave et al., 2012; Choi et al., Clinical Lymphoma, Myeloma & Leukemia 15 Supl: S167, 2015).
El AcM 6D4 es sensible y específico de ROR1 y podría detectar ROR1 en tejidos normales que previamente se pensaba que eran negativos para ROR1 cuando se sometieron a prueba con otros anticuerpos. Por tanto, se evaluó la expresión de ROR1 mediante IHC usando dos paneles de microalineamientos de tejido normal de múltiples órganos humanos. La ROR1 estaba ausente en cerebro, corazón, pulmón e hígado, pero se detectó una tinción significativa en la superficie celular en glándula paratiroidea, células de islotes pancreáticos y múltiples regiones del tracto gastrointestinal normales (figuras 20A-20C). Se expresó ROR1 en la superficie celular en la mucosa epitelial basal del esófago, en la células epiteliales superficiales y foveolares de la mucosa antral gástrica y en la mucosa duodenal (células absorbentes, células caliciformes y epitelio de las criptas) (figura 20B). La expresión de ROR1 en la mucosa del intestino pareció ser mayor en el epitelio luminal y entre uniones célula-célula (figura 20B). No se observó ROR1 en la superficie celular en el yeyuno ni en el íleo y se observaron bajos niveles en la superficie y el epitelio de las criptas del colon ascendente y descendente (figura 20B).
En vista del hecho de que estudios anteriores no habían detectado ROR1 en tejidos normales mediante IHC, se realizó un análisis de inmunotransferencia para confirmar que la tinción de la superficie celular observada con 6D4 no reflejaba reactividad cruzada con otra proteína. Se obtuvieron muestras ultracongeladas de los tejidos positivos y se prepararon lisados celulares para el análisis de inmunotransferencia con 6D4 y el anticuerpo policlonal de cabra anti-ROR1 publicado anteriormente (Dave et al., 2012). Adicionalmente, se preparó ADNc para PCR en tiempo real con cebadores específicos de ROR1_v1 (Berger et al., Cancer Immunology Research 3:206, 2015). Se detectó una banda a 130 kDa consistente con la proteína ROR1 de longitud completa mediante inmunotransferencia en lisados de células LLC y en lisados de glándula paratiroidea, islotes pancreáticos, antro pilórico y cuerpo gástrico del estómago, esófago, duodeno y colon, usando tanto 6D4 como el anticuerpo policlonal de cabra anti-ROR1 (figuras 20D y 20E). La banda de ROR1 tenía un peso molecular ligeramente superior en los lisados de tejidos tales como la glándula paratiroidea en comparación con LLC, posiblemente debido a diferencias en las modificaciones postraduccionales tales como la glicosilación con unión a N (figura 20D). Al tratar los lisados con PNGasaF, que elimina la glicosilación con unión a N, se detectó una banda de proteína ROR1 desglicosilada a 100 kDa en tejidos positivos tal como informaron previamente Kaucka et al. (Acta Physiologica 203: 351, 2011) (figura 20F). La medición de los transcritos de Ror1_v1 en tejidos intestinales humanos mediante PCR en tiempo real reveló importantes transcritos de Ror1 en el estómago y los adipocitos, aunque los niveles de transcritos de estos tejidos eran menores que en las muestras de sangre periférica de pacientes con LLC (figura 21).
Estos estudios muestran que el anticuerpo 6D4 era lo suficientemente sensible para detectar ROR1 de longitud completa expresada en la superficie celular en varios tejidos adultos normales. Aparte de los adipocitos (véase la patente estadounidense n.° 9.163.258), los informes anteriores no detectaron ROR1 en glándula paratiroidea, islotes pancreáticos ni regiones del tracto gastrointestinal (incluyendo el esófago, el estómago y el duodeno).
Macaco Rhesus
A pesar de los hallazgos mencionados anteriormente en tejido humano, la seguridad de las células T con CAR de ROR1 se ha demostrado previamente en un modelo preclínico de macaco Rhesus (Macacca mulata), que se creía adecuado porque el epítopo reconocido por el CAR de ROR1 se conserva y los tejidos de macacos normales expresan niveles similares de transcritos de Ror1 (Berger et al., Cancer Immunology Research 3: 206, 2015). No se observaron toxicidades en los macacos ni siquiera con la infusión de dosis muy altas de células T con CAR funcionales (Berger et al., 2015).
Para evaluar adicionalmente si la proteína ROR1 se expresa en los mismos tejidos normales en macacos que en humanos, se sometió a prueba la capacidad del AcM 6D4 para reconocer ROR1 de macaco Rhesus (por ejemplo, SEQ ID NO:58). El epítopo de ROR1 de macaco Rhesus correspondiente a SEQ ID NO:59 difiere en 1 aminoácido de la secuencia correspondiente en ROR1 humana (figura 23A). En primer lugar, se transdujeron células T de macaco Rhesus y K562 con ROR1 de macaco Rhesus (XP_014996735) tal como se describe en Berger et al. (2015) y se tiñeron con el AcM 6D4. Las células transducidas para expresar ROR1 de macaco Rhesus presentaron una tinción marrón, lo que indica la unión del anticuerpo 6D4 (figura 23B). Adicionalmente, la IHC se realizó en un panel de tejido

Claims (20)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Proteína de unión que se une específicamente a (i) un péptido que consiste en SEQ ID NO:3 de una proteína del receptor huérfano 1 similar a tirosina cinasa receptora (ROR1) o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3, en la que la proteína de unión es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
  2. 2. Proteína de unión que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (Vl) tal como se expone en SEQ ID NO:15 ó 16 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (Vh) tal como se expone en SEQ ID NO:12, 13 ó 14, en la que el anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a (i) un péptido que consiste en SEQ ID NO:3 de una proteína del receptor huérfano 1 similar a tirosina cinasa receptora (ROR1) o (ii) un epítopo de una proteína ROR1, epítopo que está dentro de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO:3.
  3. 3. Proteína de unión según la reivindicación 1 ó 2, en la que la proteína ROR1 es una ROR1 humana.
  4. 4. Proteína de unión según la reivindicación 1 ó 3, en la que la proteína de unión comprende:
    (1) (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena pesada tal como se expone en SEQ ID NO:6, o una variante de SEQ ID NO:6 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO:7, o una variante de SEQ ID NO:7 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO:8, o una variante de SEQ ID NO:8 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; y
    (2) (a) una secuencia de aminoácidos de CDR1 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO:9, o una variante de SEQ ID NO:9 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; (b) una secuencia de aminoácidos de CDR2 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO:10, o una variante de SEQ ID NO:10 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos; y (c) una secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO:11, o una variante de SEQ ID NO:11 que tiene 1 ó 2 sustituciones de aminoácidos.
  5. 5. Proteína de unión según la reivindicación 1 ó 3, en la que la proteína de unión comprende (i) una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada, que tienen la secuencia de aminoácidos de una CDR1, una CDR2 y una CDR3, respectivamente, dentro de la secuencia de dominio variable de cadena pesada (Vh) expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14; y (ii) una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera, que tienen la secuencia de aminoácidos de una CDR1, una CDR2 y una CDR3, respectivamente, dentro de la secuencia de dominio variable de cadena ligera (Vl) expuesta en SEQ ID NO:15 ó 16.
  6. 6. Proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 4 y 5, en la que la CDR1 de cadena pesada comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:21, 22, 23 ó 24, la c DR2 de cadena pesada comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:25, 26, 27 ó 28 y la CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:29 ó 30; y la CDR1 de cadena ligera comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:31 ó 32, la CDR2 de cadena ligera comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:33 ó 34 y la CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO:35 ó 36.
  7. 7. Proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-6, en la que la proteína de unión comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera (Vl) expuesta en SEQ ID NO:15 ó 16 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada (Vh) expuesta en SEQ ID NO:12, 13 ó 14; o en la que la proteína de unión comprende un Vh que comprende SEQ ID NO:37 y un Vl que comprende SEQ ID n O:38.
  8. 8. Proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en la que la proteína de unión comprende un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
  9. 9. Proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la proteína de unión no se une a ROR2.
  10. 10. Composición, que comprende (i) la proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y (ii) un portador o un excipiente.
  11. 11. Polinucleótido que codifica para la proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
  12. 12. Constructo de expresión, que comprende el polinucleótido según la reivindicación 11 unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.
  13. 13. Célula huésped, que comprende el polinucleótido según la reivindicación 11 o el constructo de expresión según la reivindicación 12.
  14. 14. Procedimiento para preparar la proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende cultivar una célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 11 o el constructo de expresión según la reivindicación 12, en condiciones adecuadas para expresar la proteína de unión, y opcionalmente aislar la proteína de unión a partir de la célula huésped cultivada.
  15. 15. Método para identificar una célula que expresa ROR1 de longitud completa, que comprende (a) poner en contacto una célula con la proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición según la reivindicación 10; y (b) detectar la unión específica de la proteína de unión a la célula, identificando de ese modo las células que expresan ROR1 de longitud completa.
  16. 16. Método de detección que comprende (a) poner en contacto una muestra biológica con la proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición según la reivindicación 10; y (b) detectar la unión específica de la proteína de unión a un péptido o epítopo en la muestra, o la ausencia de la misma, en el que método detecta de ese modo la presencia o ausencia de una ROR1 o un epítopo de ROR1 en la muestra.
  17. 17. Método de detección según la reivindicación 16, en el que la muestra se obtiene de un sujeto.
  18. 18. Método de detección según la reivindicación 17, en el que:
    la muestra comprende un corte de tejido fijado en formalina o congelado o una célula permeabilizada;
    la muestra deriva de un tumor, tumor que se selecciona del grupo que consiste en neoplasias hemáticas y tumores sólidos; o
    la muestra deriva de un tejido normal.
  19. 19. Método de detección según una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en el que, si se determina mediante el método que el tejido del que deriva la muestra expresa de manera uniforme u homogénea la ROR1 o el epítopo de ROR1, se identifica el sujeto como candidato para el tratamiento con una terapia anti-ROR1, que opcionalmente es una inmunoterapia, que opcionalmente es una terapia celular adoptiva.
  20. 20. Kit, que comprende la proteína de unión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición según la reivindicación 10.
ES17705745T 2016-02-02 2017-02-02 Anticuerpos anti-ROR1 y usos de los mismos Active ES2903228T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662290337P 2016-02-02 2016-02-02
US201662324876P 2016-04-19 2016-04-19
PCT/US2017/016300 WO2017136607A1 (en) 2016-02-02 2017-02-02 Anti-ror1 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2903228T3 true ES2903228T3 (es) 2022-03-31

Family

ID=58054529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES17705745T Active ES2903228T3 (es) 2016-02-02 2017-02-02 Anticuerpos anti-ROR1 y usos de los mismos

Country Status (9)

Country Link
US (3) US10968275B2 (es)
EP (2) EP4006056A1 (es)
JP (2) JP7029401B2 (es)
CN (1) CN108699149B (es)
AU (1) AU2017213844A1 (es)
CA (1) CA3012827A1 (es)
ES (1) ES2903228T3 (es)
MX (1) MX2018009011A (es)
WO (1) WO2017136607A1 (es)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2818103T3 (es) 2015-01-16 2021-04-09 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para ROR1
SG11201803098VA (en) 2015-10-30 2018-05-30 Nbe Therapeutics Ag Anti-ror1 antibodies
UA125718C2 (uk) 2016-01-20 2022-05-25 Зе Скріппс Ресеарч Інстітьют Композиції антитіл до ror1 і пов'язані з ними способи
EP4006056A1 (en) 2016-02-02 2022-06-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
MX2019009552A (es) 2017-02-17 2019-10-02 Hutchinson Fred Cancer Res Terapias de combinacion para el tratamiento de canceres relacionados con el antigeno de maduracion de celulas b (bcma) y trastornos autoinmunitarios.
KR20230008269A (ko) 2017-08-07 2023-01-13 엔비이-테라퓨틱스 아게 생체 내 내성이 높은 항체 약물 결합체
PT3703750T (pt) 2017-11-01 2025-01-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recetores de antigénio quimérico específicos para o antigénio de maturação das células b e polinucleótidos codificantes
MX2020004568A (es) 2017-11-06 2020-10-05 Juno Therapeutics Inc Combinación de una terapia celular y un inhibidor de gamma secretasa.
GB201721802D0 (en) 2017-12-22 2018-02-07 Almac Discovery Ltd Ror1-specific antigen binding molecules
EP3936523A4 (en) * 2019-01-08 2022-09-07 Shenzhen University DETECTION OF ANTIBODIES AGAINST MALIGNANT TUMOR CELLS AND THEIR USES
SG11202107976SA (en) 2019-01-29 2021-08-30 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1 (ror1)
US12144827B2 (en) 2021-02-25 2024-11-19 Lyell Immunopharma, Inc. ROR1 targeting chimeric antigen receptor
TW202320858A (zh) 2021-07-19 2023-06-01 美商薩諾管理公司 免疫接合物及方法
US11806405B1 (en) 2021-07-19 2023-11-07 Zeno Management, Inc. Immunoconjugates and methods
IL312204A (en) 2021-10-28 2024-06-01 Lyell Immunopharma Inc Methods for culturing cells expressing ror1-binding protein
CN118974090A (zh) * 2022-04-02 2024-11-15 山东先声生物制药有限公司 抗ror1的抗体及其用途
KR20240016216A (ko) * 2022-07-26 2024-02-06 (주)에임드바이오 항-ror1 항체 및 이의 용도
WO2024064952A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun
WO2024064958A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
CN115724973B (zh) * 2022-09-26 2023-07-11 普健生物（武汉）科技有限公司 抗人ror1高亲和力兔单克隆抗体及其应用
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
CN115894691B (zh) * 2022-12-27 2026-03-03 上海医药集团生物治疗技术有限公司 靶向ror1的抗原结合蛋白
JP2026500705A (ja) * 2022-12-27 2026-01-08 上海医藥集團生物治療技術有限公司 Ｒｏｒ１を標的とする抗原結合タンパク質
CN116183472B (zh) * 2023-04-25 2023-08-18 上海益诺思生物技术股份有限公司 Cba法检测非人类灵长类动物细胞因子的验证方法
WO2025007910A1 (en) * 2023-07-04 2025-01-09 TJ Biopharma (Shanghai) Co., Ltd. Anti-ror1 antibodies and uses thereof
WO2025217398A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells with improved culture medium

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA114536A (en) 1908-09-18 1908-10-13 Adolphe Chalas Nickel recovering process
CA138293A (en) 1911-11-06 1912-02-06 Charles E. Archie Variable speed gearing
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
PT2281843T (pt) 2000-06-16 2017-01-02 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
AU2003218456A1 (en) 2002-04-01 2003-10-20 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to gmad
US20050009136A1 (en) 2003-02-19 2005-01-13 Dyax Corporation PAPP-A ligands
EP2060270A3 (en) 2003-10-16 2009-12-09 Imclone LLC Fibroblast growth factor receptor-1 inhibitors and methods of treatment thereof
US7973139B2 (en) 2004-03-26 2011-07-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against nogo receptor
US10611835B2 (en) 2008-07-10 2020-04-07 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for treatment and prevention of cancer
JO3382B1 (ar) 2008-12-23 2019-03-13 Amgen Inc أجسام مضادة ترتبط مع مستقبل cgrp بشري
CA2759733C (en) 2009-04-23 2019-09-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-human ror1 antibodies
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
US9242014B2 (en) 2010-06-15 2016-01-26 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ROR1) single chain Fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
US9163258B2 (en) 2010-07-23 2015-10-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for the treatment of obesity
EP3828205A1 (en) 2010-10-01 2021-06-02 Oxford BioTherapeutics Ltd Anti-ror1 antibodies
ES2657970T3 (es) 2010-12-01 2018-03-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anticuerpos contra ROR1 de conejo/ser humano quiméricos
GB201020995D0 (en) 2010-12-10 2011-01-26 Bioinvent Int Ab Biological materials and uses thereof
US9987308B2 (en) 2011-03-23 2018-06-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
CN103906532B (zh) 2011-08-09 2018-01-26 阿瑟拉生物技术公司 结合磷酰胆碱（pc）和/或pc结合物的抗体
MX353958B (es) 2011-09-22 2018-02-07 Amgen Inc Proteinas de union al antigeno cd27l.
BR122020002986A8 (pt) 2012-08-20 2023-04-18 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapia celular
ES2702315T3 (es) 2012-08-24 2019-02-28 Univ California Anticuerpos y vacunas para su uso en tratar cánceres ROR1 e inhibir metástasis
WO2014164554A1 (en) 2013-03-10 2014-10-09 Baylor College Of Medicine Chemotherapy-resistant immune cells
WO2016016344A1 (en) 2014-07-29 2016-02-04 Cellectis Ror1(ntrkr1)specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
HK1243631A1 (zh) 2014-10-27 2018-07-20 Fred Hutchinson Cancer Research Center 用於提高过继细胞免疫疗法效力的组合物和方法
ES2818103T3 (es) 2015-01-16 2021-04-09 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores de antígenos quiméricos específicos para ROR1
WO2016187216A1 (en) 2015-05-18 2016-11-24 Bluebird Bio, Inc. Anti-ror1 chimeric antigen receptors
EP4006056A1 (en) 2016-02-02 2022-06-01 Fred Hutchinson Cancer Research Center Anti-ror1 antibodies and uses thereof
CA3024725A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Juno Therapeutics, Inc. Methods for the treatment of b cell malignancies using adoptive cell therapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017136607A1 (en) 2017-08-10
US10968275B2 (en) 2021-04-06
EP4006056A1 (en) 2022-06-01
CA3012827A1 (en) 2017-08-10
US20190040132A1 (en) 2019-02-07
CN108699149A (zh) 2018-10-23
JP2019511904A (ja) 2019-05-09
US11932691B2 (en) 2024-03-19
US20210147540A1 (en) 2021-05-20
JP2022028918A (ja) 2022-02-16
US20240352119A1 (en) 2024-10-24
CN108699149B (zh) 2023-01-06
EP3411408A1 (en) 2018-12-12
EP3411408B1 (en) 2021-12-08
AU2017213844A1 (en) 2018-08-02
MX2018009011A (es) 2018-11-19
JP7029401B2 (ja) 2022-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2903228T3 (es) Anticuerpos anti-ROR1 y usos de los mismos
US12162950B2 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ROR1 cancers and inhibiting metastasis
CN104168916B (zh) 抗上皮细胞黏着分子(EpCAM)抗体及其使用方法
KR102056137B1 (ko) 암의 검출 방법
CA2960466C (en) Cancer cell-specific antibody, anticancer drug and cancer testing method
CN107011439A (zh) 抗叶酸受体α抗体及其应用
CN104823054A (zh) 对修饰后自体表位的抗肿瘤免疫应答
CN111936158A (zh) Cd19变体
CN109970859B (zh) Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞
ES2818948T3 (es) Composiciones para la supresión del cáncer por inhibición de TMCC3
WO2021121373A1 (zh) 抗人程序死亡因子-1单克隆抗体
JP2025501307A (ja) 最初の細胞を標的とする二重特異性分子
HK40075786A (en) Anti-ror1 antibodies and uses thereof
JP2023530997A (ja) Ｂｓｔ２ロングアイソフォームを標的化する抗ｂｓｔ２抗体
HK40000385B (en) Anti-ror1 antibodies and uses thereof
JP2021046362A (ja) 細胞外のＰＫＣδを標的とする肝癌細胞増殖抑制剤及びそれを含む新規肝癌治療薬
NL2021034B1 (en) TEIPP neoantigens and uses thereof
WO2025097322A1 (zh) 靶向b7h3抗原结合蛋白及其应用
CN120329439A (zh) 一种单克隆抗体及其应用
HK40005045B (zh) 用於治疗ror1癌症并抑制转移的抗体和疫苗
WO2018034259A1 (ja) Ｔｍｅｍ１３２ａに結合する抗体、抗がん剤、およびがんの検査方法