ES2903263T3 - Método para producir enzima mutante y alcohol aciltransferasa mutante - Google Patents

Abstract

Alcohol aciltransferasa mutante que tiene una actividad mejorada en comparación con una forma de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, en la que la alcohol aciltransferasa mutante consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, y en la que la alcohol aciltransferasa mutante tiene las siguientes sustituciones de aminoácido: (1) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 48 en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2 por otro residuo de aminoácido, y (2) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 150 en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2 por otro residuo de aminoácido.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir enzima mutante y alcohol aciltransferasa mutante

Campo técnico

La presente invención se refiere a una alcohol aciltransferasa mutante. Más específicamente, la presente invención se refiere a la alcohol aciltransferasa como una proteína recombinante soluble altamente activa, etc.

Técnica anterior

Las proteínas se pliegan en sus conformaciones únicas después de la traducción en las células para tener funciones. En el caso de expresar una proteína heteróloga usando un transformante (recombinante), puede formarse un cuerpo de inclusión sin un plegamiento normal de la proteína en las células huésped. Se sabe que una proteína en el cuerpo de inclusión se convierte en una proteína inactiva que ha perdido su actividad original y, en algunos casos, se insolubiliza. El cuerpo de inclusión se forma probablemente porque una proteína no experimenta un plegamiento normal en un entorno intracelular (temperatura, velocidad de transcripción, velocidad de traducción, etc.) de un huésped diferente al de una especie de la que se deriva la proteína.

Con el fin de solucionar este problema, se ha intentado obtener una proteína mutada expresada en forma activa introduciendo una mutación en una proteína y consiguiendo así un plegamiento normal similar al de una proteína de tipo natural en un recombinante. Por ejemplo, se ha informado, con respecto a una hidroxinitrilo liasa de origen vegetal, que pudo obtenerse una enzima que tenía una solubilidad drásticamente mejorada mediante la introducción de una mutación (documento no de patente 1).

En relación con la presente invención, se describirá la alcohol aciltransferasa (AAT). Los documentos de patente 1 a 3 proponen un método para producir éster de ácido isobutírico o éster de ácido metacrílico usando alcohol aciltransferasa (AAT) a partir de isobutiril-CoA o metacril-CoA producidas a partir de biomasa.

Los ésteres de ácido carboxílico se usan como materiales de partida para diversos productos químicos industriales, fragancias, productos farmacéuticos, etc. Por ejemplo, el éster de ácido isobutírico es normalmente un compuesto de éster importante como material de partida para ésteres para fragancias, productos farmacéuticos, peróxidos, etc. El éster de ácido metacrílico se usa normalmente como material de partida para resinas acrílicas y también se demanda a menudo como comonómero en los campos de materiales de recubrimiento, adhesivos, agentes modificadores de resina, etc.

En los últimos años, las técnicas de producción de diversos productos químicos usando biomasa en lugar de materiales fósiles convencionales como fuente de carbono han recibido atención desde el punto de vista de la prevención del calentamiento global y la protección del medioambiente. También se espera que se produzca éster de ácido isobutírico o éster de ácido metacrílico a partir de biomasa.

Un posible método para sintetizar un éster tal como éster de ácido isobutírico o éster de ácido metacrílico a partir de biomasa usando a At es la producción fermentativa usando un recombinante microbiano que alberga un grupo de genes para la síntesis de compuestos de CoA tales como isobutiril-CoA o metacril-CoA a partir de biomasa, y un gen de AAT que cataliza la reacción de los compuestos de CoA para dar ésteres.

Sin embargo, un problema de la expresión de AAT en un recombinante es, además, la formación de cuerpos de inclusión mencionada anteriormente. Particularmente, en el caso de expresar AAT de origen vegetal con E. coli como huésped, se sabe que una gran mayoría de enzimas se expresan como proteínas insolubles inactivas (documento no de patente 2).

Los documentos no de patente 3 y 4 han informado que en el caso de expresar AAT derivada de manzana en un recombinante de E. coli, se obtuvo una proteína soluble usando sólo un linaje particular (C43 (DE3)), mientras que no se obtuvo proteína soluble a partir de un linaje general (cepa derivada de BL21 (DE3)).

Lista de referencias

Bibliografía de patentes

Documento de patente 1: patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2015-116141

Documento de patente 2: publicación internacional n.°WO 2014/038214

Documento de patente 3: publicación internacional n.° WO 2014/038216

Bibliografía no de patentes

Documento no de patente 1: Protein Eng. Des. Sel. (2011) 24: 607-616

Documento no de patente 2: Metabolic Engineering (2015) 27: 20-28

Documento no de patente 3: FEBS J. (2005) 272: 3132-3144

Documento no de patente 4: Phytochemistry (2006) 67: 658-667

Sumario de la invención

Problema técnico

Tal como se mencionó anteriormente, se ha propuesto un método que logra un plegamiento normal similar al de una proteína de tipo natural en un transformante (recombinante) mediante la introducción de una mutación en una proteína, con el fin de suprimir la formación de cuerpos de inclusión. Sin embargo, un problema de este método es cómo buscar eficazmente una mutación que pueda lograr un plegamiento normal.

Por consiguiente, un objeto principal de la presente invención es proporcionar un método eficaz para expresar una proteína de interés como una proteína recombinante soluble activa en un recombinante.

Solución al problema

Con el fin de lograr el objeto, la presente invención proporciona los siguientes puntos [1] a [8]:

[1] Una alcohol aciltransferasa mutante que tiene una actividad mejorada en comparación con una forma de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, en la que la alcohol aciltransferasa mutante consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, y en la que

la alcohol aciltransferasa mutante tiene las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 48 en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2 por otro residuo de aminoácido, y

(2) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 150 en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2 por otro residuo de aminoácido.

[2] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [1], en la que el otro residuo de aminoácido es alanina o arginina.

[3] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [1], que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ó 7.

[4] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [1], en la que la alcohol aciltransferasa mutante tiene además una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina,

(2) una sustitución de lisina en la posición 117 por glutamina,

(3) una sustitución de valina en la posición 248 por alanina, y

(4) una sustitución de glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano.

[5] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [4], que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 8, 10 y 13.

[6] Un vector para la expresión de la alcohol aciltransferasa mutante según uno cualquiera de los puntos [1] a [5], conteniendo dicho vector el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la alcohol aciltransferasa mutante.

[7] Un transformante transformado por y que alberga el vector según el punto [6].

[8] Un método para producir éster de ácido metacrílico usando la alcohol aciltransferasa según uno cualquiera de los puntos [1] a [5].

En otro aspecto (no cubierto por las reivindicaciones), se divulgan los siguientes puntos [1] a [24]:

[1] Un método para producir una enzima que tiene una actividad mejorada por recombinante en comparación con una forma de referencia, que comprende las etapas de:

(1) preparar recombinantes, expresando cada uno un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de uno o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido;

(2) seleccionar mutantes que presentan el 50% o más de actividad por recombinante en comparación con la forma de referencia; y

(3) expresar un mutante en el que las correspondientes sustituciones de aminoácido se introducen en dos o más posiciones entre las respectivas posiciones de las sustituciones de aminoácido introducidas de los mutantes seleccionados en la etapa (2).

[2] El método de producción según el punto [1], en el que la enzima es alcohol aciltransferasa.

[3] El método de producción según el punto [2], en el que la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia es la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

[4] El método de producción según cualquiera de los puntos [1] a [3], en el que los otros residuos de aminoácido son alanina o arginina.

[5] Un método para producir una enzima que tiene una actividad mejorada por recombinante en comparación con una forma de referencia, que comprende la etapa de:

expresar un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de uno o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido.

[6] El método de producción según el punto [5], en el que la enzima es alcohol aciltransferasa.

[7] El método de producción según el punto [6], en el que la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia es la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID No : 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

[8] El método de producción según cualquiera de los puntos [5] a [7], en el que los otros residuos de aminoácido son alanina o arginina.

[9] Una alcohol aciltransferasa mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, en la que

la alcohol aciltransferasa mutante tiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 48 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,

(2) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 150 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,

(3) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 167 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,

(4) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 270 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,

(5) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 274 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, y

(6) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 447 por otro residuo de aminoácido alineado con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.

[10] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [9], en la que el otro residuo de aminoácido es alanina o arginina.

[11] Una alcohol aciltransferasa mutante que tiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1:

(1) una sustitución de cisteína en la posición 48 por otro residuo de aminoácido,

(2) una sustitución de cisteína en la posición 150 por otro residuo de aminoácido,

(3) una sustitución de cisteína en la posición 167 por otro residuo de aminoácido,

(4) una sustitución de cisteína en la posición 270 por otro residuo de aminoácido,

(5) una sustitución de cisteína en la posición 274 por otro residuo de aminoácido, y

(6) una sustitución de cisteína en la posición 447 por otro residuo de aminoácido.

[12] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [11], en la que el otro residuo de aminoácido es alanina o arginina.

[13] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [11], que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ó 7.

[14] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [11], en la que la alcohol aciltransferasa mutante tiene además una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina,

(2) una sustitución de lisina en la posición 117 por glutamina,

(3) una sustitución de valina en la posición 248 por alanina, y

(4) una sustitución de glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano.

[15] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [14], que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 6, 8 a 11 y 13.

[16] Una alcohol aciltransferasa mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 80% o más con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, en la que

la alcohol aciltransferasa mutante tiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de un residuo de aminoácido correspondiente a alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,

(2) una sustitución de un aminoácido correspondiente a valina en la posición 248 por alanina en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1,

(3) una sustitución de un aminoácido correspondiente a glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, y (4) una sustitución de un aminoácido correspondiente a lisina en la posición 117 por glutamina en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.

[17] Una alcohol aciltransferasa mutante que tiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1:

(1) una sustitución de alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina,

(2) una sustitución de lisina en la posición 117 por glutamina,

(3) una sustitución de valina en la posición 248 por alanina, y

(4) una sustitución de glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano.

[18] La alcohol aciltransferasa mutante según el punto [17], que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8 a 11 y 13.

[19] Un vector para la expresión de la alcohol aciltransferasa según cualquiera de los puntos [9] a [18].

[20] Un transformante transformado por el vector según el punto [19].

[21] Un método para producir una enzima de origen vegetal que tiene una actividad mejorada por recombinante en comparación con una forma de referencia, que comprende las etapas de:

(1) preparar recombinantes de células no vegetales, expresando cada uno un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de uno o dos o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido;

(2) medir la actividad enzimática por recombinante del mutante;

(3) seleccionar mutantes que presentan el 50% o más de actividad por recombinante en comparación con la forma de referencia; y

(4) expresar, en la célula no vegetal, un mutante en el que las correspondientes sustituciones de aminoácido se introducen en dos o más posiciones entre las posiciones respectivas de las sustituciones de aminoácido introducidas de los mutantes seleccionados en la etapa (3).

[22] El método de producción según el punto [21], en el que la enzima es una alcohol aciltransferasa derivada de manzana.

[23] El método de producción según el punto [21] o [22], en el que la célula no vegetal es una célula de E. coli.

[24] El método de producción según cualquiera de los puntos [21] a [23], en el que los otros residuos de aminoácido son alanina o arginina.

En el método para producir una enzima mutante según la presente invención, la “forma de referencia” significa una enzima en la que va a introducirse la sustitución de residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido. La secuencia de aminoácidos de la enzima mutante obtenida mediante el método de producción según la presente invención difiere de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia sólo en que los residuos de cisteína están sustituidos por otros residuos de aminoácido. La forma de referencia no se limita a una enzima natural (de tipo natural), y puede ser una enzima mutante que contiene una o más sustituciones de aminoácido introducidas en la secuencia de aminoácidos de la enzima de tipo natural. Además, la forma de referencia puede ser una enzima mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la enzima de tipo natural mediante la inserción o adición de uno o más aminoácidos, o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la enzima de tipo natural mediante la deleción de uno o más aminoácidos. Puede obtenerse una enzima mutante que tiene una actividad mejorada introduciendo además la sustitución de uno o dos o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido en cualquiera de estas enzimas mutantes como forma de referencia.

Efectos ventajosos de la invención

La presente invención proporciona una proteína de interés como proteína recombinante soluble activa en un recombinante.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 es un diagrama que muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de AAT derivadas de SEQ ID NO: 1 (manzana: Malus pumila), SEQ ID NO: 12 (manzana: Malus domestica), SEQ ID NO: 61 (pera asiática: Pyrus pyrifolia), SEQ ID NO: 62 (níspero: Eriobotrya japónica) y SEQ ID NO: 63 (caqui Persimmon: Diospyros kaki).

[Figura 2] La figura 2 es un diagrama que muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de AAT derivadas de SEQ ID NO: 66 (tomate (especie silvestre): Solanum pennellii), SEQ ID NO: 67 (tomate (especie cultivada): Solanum lycopersicum), SEQ ID NO: 68 (patata: Solanum tuberosum), SEQ ID NO: 69 (pimiento: Capsicum annuum) y SEQ ID NO: 70 (tabaco: Nicotiana tabacum).

[Figura 3] La figura 3 es un diagrama que muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de AAT derivadas de SEQ ID NO: 65 (fresón: Fragaria x ananassa), SEQ ID NO: 71 (fresa chilena: Fragaria chiloensis), SEQ ID NO: 72 (fresa silvestre: Fragaria vesca) y SEQ ID NO: 73 (rosa japonesa: Rosa rugosa).

[Figura 4] La figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la actividad AAT con respecto a recombinantes que expresan 15 tipos de mutantes preparados mediante la sustitución de 15 residuos de cisteína de AAT de manzana por alanina uno a uno. La ordenada indica la actividad AAT por peso de células bacterianas mediante un valor relativo cuando la actividad de un recombinante que expresa una forma de referencia (pAAT116) que no tiene sustitución de cisteína se define como 1.

[Figura 5] El diagrama superior de la figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la actividad AAT por peso de células bacterianas con respecto a recombinantes que expresan un mutante (pAAT021) que contiene una mutación cuádruple introducida en AAT de tipo natural de manzana, un mutante (pAAT024) que contiene 6 sustituciones de cisteína introducidas en el mismo, un mutante (pAAT025) que contiene una mutación cuádruple y 6 sustituciones de cisteína introducidas en el mismo, un mutante (pAAT155) que contiene una mutación cuádruple y Cys150Arg introducidas en el mismo o un mutante (pAAT154) que contiene una mutación cuádruple y 6 sustituciones de cisteína (incluyendo Cys150Arg en la posición 150) introducidas en el mismo. La ordenada indica la actividad AAT mediante un valor relativo cuando la actividad de un recombinante que expresa una forma de referencia (pAAT116) que no tiene ni una mutación cuádruple ni una sustitución de cisteína se define como 1. Los diagramas inferiores de la figura 5 son patrones electroforéticos en gel de poliacrilamida-SDS de fracciones solubles y fracciones insolubles de extractos celulares que contienen los mutantes.

[Figura 6] El diagrama superior de la figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la actividad AAT por peso de células bacterianas con respecto a recombinantes que expresan un mutante (pAAT021) que contiene una mutación cuádruple introducida en AAT de tipo natural de manzana, un mutante (pAAT025) que contiene una mutación cuádruple y 6 sustituciones de cisteína introducidas en el mismo, un mutante (pAAT151) que contiene una mutación cuádruple y 5 sustituciones de cisteína introducidas en el mismo o un mutante (pATM017, pATM018, pATM019 o pATM021) que contiene una mutación cuádruple y 4 sustituciones de cisteína introducidas en el mismo. La ordenada indica la actividad AAT mediante un valor relativo cuando la actividad de un recombinante que expresa una forma de referencia (pAAT116) que no tiene ni una mutación cuádruple ni una sustitución de cisteína se define como 1. Los diagramas inferiores de la figura 6 son patrones electroforéticos en gel de poliacrilamida-SDS de fracciones solubles y fracciones insolubles de extractos celulares que contienen los mutantes.

[Figura 7] El diagrama superior de la figura 7 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la actividad AAT por peso de células bacterianas con respecto a recombinantes que expresan 8 tipos de mutantes preparados mediante la sustitución de 8 residuos de cisteína de AAT de tomate por alanina uno a uno y un recombinante que expresa un mutante (pAAT164) que contiene 5 sustituciones de cisteína introducidas en AAT de tipo natural de tomate. La ordenada indica la actividad AAT mediante un valor relativo cuando la actividad de un recombinante que expresa una forma de referencia (pAAT032) se define como 1. Los diagramas inferiores de la figura 7 son patrones electroforéticos en gel de poliacrilamida-SDS de fracciones solubles y fracciones insolubles de extractos celulares que contienen los mutantes.

[Figura 8] El diagrama superior de la figura 8 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la actividad AAT por peso de células bacterianas con respecto a recombinantes que expresan 9 tipos de mutantes preparados mediante la sustitución de 9 residuos de cisteína de AAT de fresón por alanina uno a uno y un recombinante que expresa un mutante (pAAT037) que contiene 5 sustituciones de cisteína introducidas en AAT de tipo natural de fresón. La ordenada indica la actividad AAT por un valor relativo cuando la actividad de un recombinante que expresa una forma de referencia (pAAT033) se define como 1. Los diagramas inferiores de la figura 8 son patrones electroforéticos en gel de poliacrilamida-SDS de fracciones solubles y fracciones insolubles de extractos celulares que contienen los mutantes.

Descripción

1. Método para producir enzima mutante

Se divulga (pero no está cubierto por las reivindicaciones) un método para producir una enzima que tiene una actividad mejorada por recombinante en comparación con una forma de referencia, que comprende la etapa de: expresar un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de dos o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido.

Específicamente, el método para producir una enzima mutante comprende las siguientes etapas (1) a (3):

(1) preparar recombinantes, expresando cada uno un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de uno o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido;

(2) seleccionar una pluralidad de mutantes que presentan el 50% o más de actividad por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia; y

(3) expresar un mutante en el que los correspondientes residuos de aminoácido están sustituidos en dos o más posiciones entre las respectivas posiciones de los residuos de aminoácido sustituidos de los mutantes seleccionados en la etapa (2).

[Enzima]

La enzima que se somete al método para producir una enzima mutante es preferiblemente una enzima que forma un cuerpo de inclusión en un transformante (recombinante) cuando la forma de referencia se expresa en un huésped diferente de una especie de la que se deriva la enzima. La enzima que se somete al método para producir una enzima mutante puede ser, por ejemplo, cualquier enzima de origen vegetal que forme un cuerpo de inclusión en una célula recombinante cuando la forma de referencia se expresa en una célula no vegetal (por ejemplo, E. coli).

La enzima que se somete al método para producir una enzima mutante según la presente invención son las AAT derivadas de manzanas (Malus pumila, Malus domestica y Malus baccata).

En cuanto a la AAT de manzana, los ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la enzima que puede servir como “forma de referencia” en el método para producir una enzima mutante según la presente invención se muestran en las SEQ ID NO: 1 a 2. SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos de AAT de tipo natural. La AAT de tipo natural de manzana tiene 15 residuos de cisteína en la secuencia de aminoácidos. SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de AAT mutante derivada de la secuencia de aminoácidos de AAT de tipo natural mediante la sustitución de metionina en la posición 2 por lisina (AAT con mutación M2K). SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de AAT mutante derivada de la secuencia de aminoácidos de AAT de tipo natural mediante la sustitución de alanina en la posición 64 por valina, valina en la posición 248 por alanina, glutamina en la posición 363 por lisina y lisina en la posición 117 por glutamina (esta AAT mutante tiene una actividad más alta que la de AAT de tipo natural).

[Etapa (1)]

Esta etapa es la etapa de preparar recombinantes, expresando cada uno un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de uno o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido.

En esta etapa, se preparan una pluralidad de recombinantes, expresando cada uno un mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de uno o dos o más residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido. Por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia tiene N residuos de cisteína, pueden prepararse N tipos de mutantes en los que cada residuo de cisteína está sustituido por un aminoácido distinto de cisteína. Alternativamente, por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia tiene N residuos de cisteína, pueden prepararse n (n -1)/2 tipos de mutantes en los que dos residuos de cisteína cualesquiera están sustituidos por aminoácidos distintos de la cisteína.

El número de residuos de cisteína sustituidos en un mutante puede ser 1 ó 2 o más y es menor que el número total de residuos de cisteína presentes en la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia como máximo. El número de residuos de cisteína sustituidos en un mutante es preferiblemente 1. El número de residuos de cisteína sustituidos puede ser el mismo o diferente entre una pluralidad de mutantes preparados. El aminoácido por el que se sustituirá la cisteína puede ser cualquier aminoácido distinto de cisteína y no está particularmente limitado. El aminoácido puede ser, por ejemplo, alanina o arginina.

El ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del mutante puede prepararse introduciendo una mutación en el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia según un enfoque de ingeniería genética convencional conocido en la técnica. El ADN preparado que codifica para la secuencia de aminoácidos del mutante se integra en un vector de expresión convencional de uso general.

La expresión del mutante puede realizarse transfiriendo el vector de expresión a una célula huésped según un enfoque convencional conocido en la técnica.

Los ejemplos de la célula huésped incluyen, pero no se limitan particularmente a: bacterias tales como E. coli, el género Rhodococcus, el género Pseudomonas, el género Corynebacterium, el género Bacillus, el género Streptococcus y el género Streptomyces; levaduras tales como el género Saccharomyces, el género Candida, el género Schizosaccharomyces y el género Pichia; y hongos filamentosos tales como el género Aspergillus. Entre ellas, en particular, se prefiere E. coli porque E. coli se usa de manera cómoda y eficaz.

Si es necesario, puede medirse la actividad enzimática por recombinante de cada mutante preparado en la etapa (1).

La medición de la actividad enzimática por recombinante del mutante puede realizarse preparando un extracto celular o un homogeneizado celular que contiene el mutante a partir de una cantidad dada del recombinante que alberga el vector de expresión que contiene el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del mutante, y midiendo la actividad enzimática en el extracto celular o similar. El extracto celular o similar puede mezclarse con un sustrato de reacción enzimática, y la cantidad de producto de reacción producido puede detectarse mediante el uso de un enfoque conocido en la técnica, tal como cromatografía, para medir la actividad enzimática.

[Etapa (2)]

Esta etapa es la etapa de seleccionar una pluralidad de mutantes que presentan el 50% o más de actividad por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia. En este contexto, la expresión “mutantes que presentan el 50% o más de actividad por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia” significa que la cantidad de un producto de reacción catalizado por un mutante expresada a partir de una cantidad dada del recombinante es del 50% o más de la cantidad de un producto de reacción catalizado por la forma de referencia expresada a partir de la misma cantidad del recombinante en las mismas condiciones, debido a la alta actividad y solubilidad del mutante.

Por ejemplo, cuando la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia tiene 10 residuos de cisteína, estando cada uno de los cuales sustituido por un aminoácido distinto de cisteína para preparar 10 tipos de mutantes en la etapa (1), los mutantes que presentan el 50% o más de actividad por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia son, por ejemplo, de 5 tipos, todos los cuales se seleccionan.

Se considera que entre los residuos de cisteína presentes en la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia, la cisteína que mantiene una determinada actividad enzimática del mutante incluso cuando se sustituye por otro aminoácido hace una pequeña contribución al plegamiento normal de la proteína de la forma de referencia, y más bien podría interferir con el plegamiento normal de la proteína formando enlaces disulfuro en exceso a través de la expresión de la forma de referencia en células huésped diferentes de una especie de origen.

El criterio para la selección del mutante es del 50% o más de actividad por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia como índice tolerable. Puede seleccionarse un mutante que presenta una actividad más alta, por ejemplo, el 60% o más, preferiblemente el 70% o más, más preferiblemente el 80% o más, más preferiblemente el 90% o más, lo más preferiblemente el 100% o más de actividad por recombinante, en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia.

[Etapa (3)]

Esta etapa es la etapa de expresar un mutante en el que los correspondientes residuos de aminoácido están sustituidos en dos o más posiciones entre las respectivas posiciones de los residuos de aminoácido sustituidos de los mutantes seleccionados en la etapa (2).

En el ejemplo mencionado anteriormente en el que la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia tiene 10 residuos de cisteína, por ejemplo, 5 tipos de mutantes presentan el 50% o más de actividad por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia. Por tanto, se expresa un mutante que tiene dos o más sitios de mutación (dos o más sustituciones de cisteína por otros aminoácidos) entre los respectivos sitios de mutación (5 posiciones en total) de estos 5 tipos de mutantes. Se prefiere expresar un mutante que tenga 3 o más sitios de mutación, se prefiere más expresar un mutante que tenga 4 o más sitios de mutación y se prefiere aún más expresar un mutante que tenga todos los sitios de mutación.

Tal como se mencionó anteriormente, entre los residuos de cisteína presentes en la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia, la cisteína que mantiene una determinada actividad enzimática del mutante incluso cuando se sustituye por otro aminoácido podría interferir con el plegamiento normal de la proteína a través de la expresión de la forma de referencia en células huésped diferentes de una especie de origen. Se considera que el mutante en el que todos estos residuos de cisteína se sustituyen por otros aminoácidos experimenta un plegamiento normal o casi normal incluso cuando se expresa en células huésped diferentes de una especie de origen y, por tanto, tiene una mayor actividad y mayor solubilidad que las de la forma de referencia expresada en las células huésped.

El aminoácido por el que se sustituirá la cisteína en el mutante en esta etapa es preferiblemente el mismo que el aminoácido por el que se sustituirá la cisteína en el mutante seleccionado en la etapa (2), pero puede ser diferente del mismo. La actividad del recombinante puede mejorarse adicionalmente variando los tipos de aminoácidos por los que se sustituirá la cisteína.

El ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos del mutante en esta etapa también puede prepararse introduciendo una mutación en el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia según un enfoque de ingeniería genética convencional conocido en la técnica. El ADN preparado que codifica para el mutante se integra en un vector de expresión convencional de uso general, y con él se transfecta una célula huésped para expresar el mutante, de la misma manera que en la etapa (1).

2. Alcohol aciltransferasa mutante I

La presente invención proporciona AAT mutante obtenida mediante el método mencionado anteriormente para producir una enzima mutante.

La AAT mutante según la presente invención es una alcohol aciltransferasa mutante que tiene una actividad mejorada en comparación con una forma de referencia, en la que la alcohol aciltransferasa mutante tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la forma de referencia mediante la sustitución de residuos de cisteína por otros residuos de aminoácido según se enumeran en las reivindicaciones. La forma de referencia puede ser AAT de tipo natural de manzana (SEQ ID NO: 1) o AAT mutante (SEQ ID NO: 2, con mutación M2K de manzana) que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de AAT de tipo natural de manzana mediante la sustitución de metionina en la posición 2 por lisina. El aminoácido por el que se sustituirá la cisteína puede ser cualquier aminoácido distinto de cisteína y no está particularmente limitado. El aminoácido puede ser, por ejemplo, alanina o arginina. La actividad de la AAT mutante puede mejorarse adicionalmente, en particular, mediante la sustitución de cisteína en la posición 150 por arginina.

Los ejemplos específicos de AAT mutante según la presente invención incluyen AAT mutante que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ó 7, preparada con AAT con mutación M2K de manzana (SEQ ID NO: 2) como forma de referencia. La AAT mutante que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 resulta de la sustitución de cisteína en todas de las posiciones 48, 150, 167, 270, 274 y 447 de AAT con mutación M2K de manzana (SEQ ID NO: 2) por alanina. La a At mutante que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 resulta de la sustitución de cisteína en las posiciones 48, 167, 270, 274 y 447 por alanina y cisteína en la posición 150 por arginina.

Otros ejemplos específicos de AAT mutante según la presente invención incluyen AAT mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 8, 10 y 13, preparada con AAT mutante (SEQ ID NO: 3) como forma de referencia. Las posiciones de introducción de mutaciones y sustituciones de cisteína en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 6, 8 a 11 y 13 se muestran en la “tabla 1”.

[Tabla 1]

En la tabla descrita anteriormente, la alanina en la posición 64 puede sustituirse por isoleucina o treonina. Además, la glutamina en la posición 363 puede sustituirse por prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano. También en estos casos, puede obtenerse AAT mutante altamente activa.

La presente invención proporciona AAT mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2Kde manzana), teniendo la AAT mutante las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 48 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, y

(2) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 150 por otro residuo de aminoácido en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2.

El aminoácido por el que se sustituirá la cisteína puede ser cualquier aminoácido distinto de cisteína y no está particularmente limitado. El aminoácido puede ser, por ejemplo, alanina o arginina. La actividad de la AAT mutante puede mejorarse adicionalmente, en particular, mediante la sustitución de cisteína en la posición 150 por arginina.

La secuencia de aminoácidos de AAT en la que va a introducirse la sustitución de cisteína consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2 para permitir la alineación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana).

La alineación se realiza disponiendo dos secuencias que van a compararse de tal manera que tantos residuos de aminoácido como sea posible sean idénticos entre las secuencias. Para la disposición, se inserta apropiadamente un hueco, si es necesario, en una o ambas de las dos secuencias que van a compararse. Tal alineación de las secuencias puede realizarse usando un programa bien conocido, por ejemplo, BLAST, FASTA o CLUSTALW.

La identidad de secuencia de la secuencia de aminoácidos de AAT en la que va a introducirse la sustitución de cisteína con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2 se obtiene realizando la alineación y dividiendo el número de aminoácidos idénticos entre el número total de aminoácidos. En el caso de insertar un hueco, el número total de aminoácidos es el número de residuos contados con un hueco como un residuo de aminoácido. Cuando el número total de aminoácidos así contado difiere entre las dos secuencias que van a compararse, la identidad (%) se calcula dividiendo el número de aminoácidos idénticos entre el número total de aminoácidos de la secuencia más larga.

La AAT que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una alta identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana) probablemente conserve cisteína en las posiciones 48, 150, 167, 270, 274 y 447 que se encuentran en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana). Se considera que estos residuos de cisteína pueden sustituirse por otros aminoácidos para obtener un mutante altamente activo para diversas AAT (preferiblemente diversas AAT de origen vegetal).

Por ejemplo, la AAT que presenta una identidad de secuencia del 88% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) es AAT de manzana que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12 derivada de una subespecie diferente del género Malus. Todos los residuos de cisteína en las posiciones 48, 150, 167, 270, 274 y 447 entre los residuos de cisteína que se encuentran en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) se conservan en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12.

La AAT que presenta una identidad de secuencia del 91% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) es AAT de pera asiática que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61. Todos los residuos de cisteína en las posiciones 48, 150, 167, 270 y 274 entre los residuos de cisteína encontrados en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) se conservan en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61.

La AAT que presenta una identidad de secuencia del 91% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) es AAT de níspero que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 62. Todos los residuos de cisteína en las posiciones 48, 150, 167, 270, 274 y 447 entre los residuos de cisteína encontrados en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) se conservan en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 62.

Además, la AAT que presenta una identidad de secuencia del 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) es AAT de caqui Persimmon que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63. Todos los residuos de cisteína en las posiciones 150, 167, 270, 274 y 447 entre los residuos de cisteína encontrados en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) se conservan en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63.

La alineación de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 12 y 61 a 63 se muestra en la figura 1.

3. Alcohol aciltransferasa mutante II

La presente invención también proporciona AAT mutante que tiene además una(s) sustitución/sustituciones de alanina en la posición 64, valina en la posición 248, glutamina en la posición 363 y/o lisina en la posición 117 en la secuencia de aminoácidos de AAT de tipo natural de manzana o AAT con mutación M2K de manzana. Esta AAT mutante presenta mayor actividad y solubilidad que las de la AAT de tipo natural.

Específicamente, la AAT mutante según la presente invención tiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2:

(1) una sustitución de alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina,

(2) una sustitución de lisina en la posición 117 por glutamina,

(3) una sustitución de valina en la posición 248 por alanina, y

(4) una sustitución de glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano.

Para la AAT mutante según la presente invención, se prefiere que se sustituyan en combinación 2 o más de la alanina en la posición 64, la lisina en la posición 117, la valina en la posición 248 y la glutamina en la posición 363, se prefiere más que se sustituyan 3 o más de las mismas en combinación, y lo más preferido es sustituir todos estos residuos en combinación.

Los ejemplos específicos de AAT mutante según la presente invención incluyen alcohol aciltransferasas mutantes que consisten en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 8, 10 y 13 (véase la tabla 1).

Se considera que la alta activación de la AAT mutante de manzana mencionada anteriormente mediante la introducción de una mutación también es aplicable a diversas AAT (preferiblemente diversas AAT de origen vegetal) que consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene una alta identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana).

Por tanto, la presente invención proporciona AAT mutante que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana), teniendo la AAT mutante además una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido:

(1) una sustitución de un residuo de aminoácido correspondiente a alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2,

(2) una sustitución de un aminoácido correspondiente a lisina en la posición 117 por glutamina en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2,

(3) una sustitución de un aminoácido correspondiente a valina en la posición 248 por alanina en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, y

(4) una sustitución de un aminoácido correspondiente a glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2.

Para la AAT mutante según la presente invención, se prefiere que se sustituyan en combinación 2 o más del residuo de aminoácido correspondiente a alanina en la posición 64, el residuo de aminoácido correspondiente a lisina en la posición 117, el residuo de aminoácido correspondiente a valina en la posición 248 y el residuo de aminoácido correspondiente a glutamina en la posición 363, se prefiere más que se sustituyan 3 o más de los mismos en combinación, y es más preferido sustituir todos estos residuos en combinación.

Todas de la lisina en la posición 117, la valina en la posición 248 y la glutamina en la posición 363 que se encuentran en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana) se conservan en las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ ID NO: 12, 61, 62 y 63. Por tanto, se considera que estos aminoácidos pueden estar sustituidos por isoleucina o treonina; glutamina; alanina; y lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano, respectivamente, para obtener un mutante altamente activo para diversas AAT (preferiblemente AAT de origen vegetal, de manera particularmente preferible AAT derivadas de diversas plantas del género Malus). La secuencia de aminoácidos de AAT en la que va a introducirse la sustitución del aminoácido consiste preferiblemente en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ó 2 para permitir la alineación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (AAT de tipo natural de manzana) o SEQ ID NO: 2 (AAT con mutación M2K de manzana).

4. Vector y transformante

Puede prepararse un vector de expresión para la AAT mutante según la presente invención o que tiene un inserto de ADN que codifica para la AAT mutante mediante el uso de un enfoque de ingeniería genética convencional conocido en la técnica.

El vector puede ser cualquier vector capaz de replicarse de manera autónoma en una célula huésped, y puede usarse un vector adecuado para la célula huésped. La inserción del gen de AAT mutante en el vector puede realizarse mediante el uso de una técnica de recombinación génica conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse un método que usa escisión con enzimas de restricción y un kit de ligación, un método que usa topoisomerasa, o un kit In Fusion (Takara Bio Inc.). El gen que va a insertarse en el vector se inserta uniéndolo en el sentido de 3' de un promotor que puede regular la transcripción y traducción en una proteína codificada por el gen en una célula huésped. Para la inserción, puede añadirse un ligador apropiado, si es necesario. Además, puede unirse una secuencia de terminación, una secuencia potenciadora, una secuencia señal de corte y empalme, una secuencia señal de adición de poli-A, una secuencia de unión al ribosoma (por ejemplo, una secuencia de SD y una secuencia de Kozak), un gen marcador selectivo y similares disponibles en un organismo huésped al que va a transferirse el gen, si es necesario. Los ejemplos del gen marcador selectivo pueden incluir: genes de resistencia a fármacos tales como gen de resistencia a ampicilina, gen de resistencia a tetraciclina, gen de resistencia a neomicina, gen de resistencia a kanamicina y gen de resistencia a cloranfenicol; genes implicados en la biosíntesis intracelular de nutrientes tales como aminoácidos y ácidos nucleicos; y genes que codifican para proteínas fluorescentes tales como la luciferasa. En asociación con la inserción, la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN puede estar parcialmente sustituida.

El vector se transfiere a una célula huésped mediante un método conocido por los expertos en la técnica, y se usa en la preparación de un transformante. El método para transferir el vector a la célula huésped no está particularmente limitado siempre que el método sea adecuado para la célula huésped. Los ejemplos del mismo incluyen electroporación, método de esferoplastos, método de acetato de litio y método de transferencia conjugacional.

Los ejemplos de la célula huésped incluyen, pero no se limitan particularmente a: bacterias tales como E. coli, el género Rhodococcus, el género Pseudomonas, el género Corynebacterium, el género Bacillus, el género Streptococcus y el género Streptomyces; levaduras tales como el género Saccharomyces, el género Candida, el género Schizosaccharomyces y el género Pichia; y hongos filamentosos tales como el género Aspergillus. Entre ellas, en particular, se prefiere E. coli porque E. coli se usa de manera cómoda y eficaz.

Ejemplos

[Ejemplo de referencia 1: preparación de los plásmidos pAAT012, pAAT115 y pAAT116 de expresión del gen de AAT de manzana (MpAAT1)]

Se prepararon 3 tipos de plásmidos para la expresión del gen de AAT de manzana (MpAAT1).

El plásmido pAAT012 contiene un gen que codifica para AAT de tipo natural de manzana (SEQ ID NO: 1).

El plásmido pAAT115 contiene un gen que codifica para AAT de manzana modificada por ingeniería derivada de la AAT de tipo natural de manzana mediante la sustitución de un aminoácido metionina en la posición 2 por valina.

El plásmido pAAT116 contiene un gen que codifica para AAT de manzana modificada por ingeniería (SEQ ID NO: 2) derivada de la AAT de tipo natural de manzana mediante la sustitución de un aminoácido metionina en la posición 2 por lisina.

En primer lugar, se sintetizó el gen de AAT de tipo natural de manzana (SEQ ID NO: 14) optimizado para codones de E. coli (consignado a DNA2.0). Se insertó el gen de AAT en un vector de expresión (pJexpress404). El vector resultante se denominó pAAT012.

Se transfirió el gen de AAT desde el vector de expresión (pJexpress404) que tenía el promotor T7 hasta un vector de expresión (pTrc99A) que tenía el promotor trc mediante el siguiente método.

Se amplificó un fragmento que contenía el gen de AAT mediante reacción de PCR con pAAT012 como molde usando los cebadores MMA-156 y Mm A-163. En esta operación, se convirtió el codón ATG para Met en la posición 2 del gen de AAT en GTG (Val) para introducir un sitio de enzima de restricción NcoI.

Cebador MMA-156 (SEQ ID NO: 15):

CACAGGAAACAGACCATGGTGAGCTTTTCTGTACTCCAAGTCAAACG

Cebador MMA-163 (SEQ ID NO: 16):

GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTTACTGGCTGGTGCTACGCAG

Se purificó el producto de amplificación usando un kit de extracción en gel/purificación por PCR (fabricado por FAVORGEN Biotech Corp.), y se usó el resultante como fragmento de inserción. Se mezcló un vector pTrc99A escindido de antemano con las enzimas de restricción NcoI y Sse8387I con el fragmento de inserción y se ligó con el mismo usando el kit de clonación In-Fusion HD.

Se incubó la disolución de reacción a 50°C durante 15 minutos, luego se enfrió en hielo y se usó en la transformación de una cepa de E. c o li, JM109. Se cultivó en líquido el transformante de E. coli en medio LB que contenía ampicilina 100 mg/l (medio LBAmp). Se preparó el plásmido pAAT115 de interés usando el kit de minipreparación (Qiagen N.V.).

El residuo de aminoácido en la posición 2 del producto génico del gen de AAT de manzana insertado en pAAT115 es valina. Se conoce el caso en el que el nivel de expresión de una proteína mejora mediante la sustitución del residuo de aminoácido en la posición 2 por lisina, arginina o similar (patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2008-61547). Por consiguiente, el codón para el aminoácido en la posición 2 del gen de AAT se convirtió tal como sigue.

En primer lugar, se escindió pAAT115 con NcoI y Smal para preparar un fragmento que contenía una región vectorial de aproximadamente 5,1 kb.

Se amplificó un fragmento (de aproximadamente 400 pb) que contenía el gen de AAT mediante reacción de PCR con pAAT115 como molde usando los cebadores MMA-166 y MMA-169, y se purificó mediante el método mencionado anteriormente para obtener un fragmento de inserción.

Cebador MMA-166 (SEQ ID NO: 17):

CACAGGAAACAGACCATGAAAAGCTTTTCTGTACTCCAAGTC

Cebador MMA-169 (SEQ ID NO: 18):

CGATGATACCATCGCTGCCCGGGAAGTTGTACAG

Se ligó el fragmento que contenía la región vectorial con el fragmento de inserción usando el kit de clonación In-Fusion HD, seguido de la transformación de una cepa de E. c o li, JM109. Se cultivó en líquido el transformante de E. coli (recombinante) para preparar el plásmido pAAT116 de interés. En pAAT116, el codón GTG para Val en la posición 2 del gen de AAT se sustituyó por AAA (Lys).

[Ejemplo 1: producción de AAT de manzana altamente activa]

(1) Preparación de recombinante que expresa un mutante en el que el residuo de cisteína se sustituyó por el residuo de alanina

La proteína codificada por el gen de AAT de manzana en el plásmido pAAT116 preparado en el ejemplo de referencia 1 tiene 15 residuos de cisteína. Se sintetizaron por consignación 15 plásmidos en los que cada cisteína estaba sustituida por alanina (GenScript Biotech Corp.) (tabla 2).

[Tabla 2]

Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con cada uno de los 16 plásmidos que se muestran en la “tabla 2”. Se inoculó el transformante de E. coli en medio LB (triptona Bacto al 1%, extracto de levadura Bacto al 0,5%, NaCl al 1%) que contenía ampicilina y se cultivó previamente a 37°C durante 7 horas. Se añadió una alícuota de 0,1 ml de la disolución de cultivo a 100 ml del mismo medio (que contenía IPTG 1 mM) y se cultivó con agitación a 37°C durante 15 horas. Se recuperaron las células bacterianas de la disolución de cultivo, se lavaron con una disolución tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,0) y luego se suspendieron en la misma disolución tampón.

(2) Preparación de extracto celular que contiene un mutante

Se ajustó la suspensión de células bacterianas obtenida a una DO630 de 10. Se homogeneizaron las células mediante tratamiento ultrasónico y se retiraron las fracciones de membrana y células bacterianas mediante centrifugación para preparar un extracto celular.

(3) Medición de la actividad AAT del extracto celular que contiene un mutante

Se añadieron 0,2 ml del extracto celular a 0,8 ml de una disolución de reacción que contenía metacril-CoA 1 mM y nbutanol 40 mM para iniciar la reacción de producción de éster de ácido metacrílico. Se realizó la reacción en un frasco de muestra con septo de 10 ml (para CG). Se incubó el frasco de muestra a 30°C durante de 1 a 2 horas para que avanzara la reacción. Una vez completada la reacción, se añadió 1 ml de acetonitrilo a la disolución de reacción en el frasco de muestra y se mezcló con la misma. Luego, se filtró la mezcla a través de un filtro de jeringa DISMIC (tamaño de poro: 0,45 |im, fabricado por Advantec) y luego se sometió a análisis por HPLC.

Condiciones del análisis por HPLC:

Aparato: Waters 2695

Columna: Shiseido CAPCELL PAK C18 UG120 5 |im

Fase móvil: 65% de MeOH y 0,2% de ácido fosfórico

Velocidad de flujo: 0,25 ml/min

Temperatura de la columna: 35°C

Detección: UV 210 nm

Volumen de inyección: 10 |il

Los resultados se muestran en la figura 4. Se obtuvieron ocho mutantes que presentaban el 50% o más de actividad AAT por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116, y entre ellos, los mutantes expresados a partir de pAAT116C48A, pAAT116C150A, pAAT116C167A, pAAT116C270A, pAAT116C274Ay pAAT116C447A presentaron el 70% o más de actividad AAT por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116. Por consiguiente, se preparó un mutante que contenía todas las sustituciones de aminoácido c 48A, C150A, C167A, C270A, C274A y C447A de estos 6 mutantes. En este contexto, la “actividad AAT” significa la actividad de catalizar la producción de un éster a partir de un compuesto de CoA. La expresión “mutantes que presentan el 50% o más de actividad AAT por recombinante en relación al 100% de actividad de la forma de referencia” significa que la cantidad del éster producido a través de la catálisis de un mutante expresado a partir de una cantidad dada del recombinante de E. coli es el 50% o más de la cantidad del éster producido a través de la catálisis de la forma de referencia expresada a partir del recombinante de E. coli en las mismas condiciones, debido a la alta actividad y solubilidad del mutante.

(4) Preparación de recombinante que expresa un mutante en el que 6 residuos de cisteína se sustituyeron por residuos de alanina

Se sintetizó por consignación el gen de AAT que codifica para un mutante en el que todos los residuos de cisteína 48, 150, 167, 270, 274 y 447 se sustituyeron por alanina (GenScript Biotech Corp.) y se insertó en un vector pTrc99A para obtener un plásmido pAAT024.

Se preparó un extracto celular que contenía el mutante mediante el método mencionado anteriormente y se midió la actividad AAT del extracto celular. Además, se separaron el extracto celular (fracción soluble) y una fracción insoluble (fracciones de membrana y células bacterianas) separada del extracto celular por centrifugación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se detectó una banda de la proteína AAT recombinante.

Los resultados se muestran en la figura 5. La ordenada del gráfico indica la actividad AAT por peso de células bacterianas cuando la actividad AAT de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116 se define como 1. El mutante expresado a partir de pAAT024 presentó una actividad AAT por recombinante de aproximadamente 5 veces la actividad de la forma de referencia. Además, el mutante expresado a partir de pAAT024 era más abundante en la fracción soluble en comparación con la forma de referencia. Estos resultados demostraron que la sustitución de los residuos de cisteína 48, 150, 167, 270, 274 y 447 por alanina potencia la solubilidad de AAT y mejora la actividad por recombinante.

[Ejemplo de referencia 2: selección de mutantes altamente solubles usando proteína de fusión AAT-cloranfenicol (CAT)]

Con el fin de obtener un mutante altamente soluble de AAT de manzana, se preparó en primer lugar una biblioteca de mutación aleatoria del gen de AAT. A continuación, se preparó una biblioteca de plásmidos de expresión que incluía un gen de fusión AAT mutado-CAT uniendo el gen de AAT mutante al gen de resistencia a cloranfenicol (CAT). Los transformantes de E. coli obtenidos mediante transformación con la biblioteca se seleccionaron para determinar AAT altamente soluble con resistencia a cloranfenicol como índice. Siempre que se mejore la solubilidad de la proteína AAT, también se mejora la solubilidad de la proteína de fusión AAT-cloranfenicol y, como resultado, se mejora la resistencia a cloranfenicol del transformante de E. coli. Específicamente, se realizaron los siguientes procedimientos. (1) Preparación de la biblioteca de genes de mutación aleatoria

Se obtuvo un fragmento de amplificación (de 1,4 kb) mediante PCR con pAAT116 como molde usando el kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II (Stratagene California) y los cebadores MMA-185 y MMA-157.

Cebador MMA-185 (SEQ ID NO: 19):

GGATCATGAAAAGCTTTTCTGTACTCCAAGTC

Cebador MMA-157 (SEQ ID NO: 20):

GTGATTTTTTTCTCCGCACTAGTCTACTGGCTGGTGCTACGCAG

Se trató el fragmento de amplificación con las enzimas de restricción BspHI y SpeI. Se separó el fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa y luego se extrajo del gel usando el kit de extracción en gel/purificación por PCR (FAVORGEN Biotech Corp.). Se usó el resultante como biblioteca de genes de mutación aleatoria (biblioteca del gen de AAT mutado (M2K)).

(2) Preparación del plásmido pAAT113 de expresión que contiene el gen de fusión AAT-CAT

Preparación del vector plasmídico pSTV28N

Se derivó el gen CAT usado de un vector plasmídico pSTV28 (Takara Bio Inc.). Este gen CAT tiene un sitio de enzima de restricción NcoI que, sin embargo, es inconveniente para la preparación posterior de una biblioteca. Por tanto, la secuencia del sitio NcoI se convirtió en una secuencia no escindible por NcoI. La conversión se realizó mediante reacción de PCR con un plásmido pSTV28 como molde tal como sigue.

Cebador directo MMA-152 (SEQ ID NO: 21):

GCCCCCGTTTTCACGATGGGCAAATAT

Cebador inverso MMA-153 (SEQ ID NO: 22):

ATATTTGCCCATCGTGAAAACGGGGGC

Se añadieron 0,5 |il de DpnI a 12,5 |il de la disolución de reacción de PCR y se incubó la mezcla a 37°C durante 1 hora. Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con la disolución de reacción así tratada. Se preparó un plásmido a partir del transformante de E. coli y se denominó pSTV28N.

Preparación del plásmido pAAT113 para la expresión del gen de fusión AAT-CAT

Se amplificó un fragmento del gen de AAT mediante PCR con el plásmido pAAT012 descrito en el ejemplo de referencia 1 como molde usando los cebadores MMA-156 y MMA-157, y luego se purificó.

Cebador MMA-156 (SEQ ID NO: 23):

CACAGGAAACAGACCATGGTGAGCTTTTCTGTACTCCAAGTCAAACG

Cebador MMA-157 (SEQ ID NO: 24):

GTGATTTTTTTCTCCGCACTAGTCTACTGGCTGGTGCTACGCAG

Se amplificó un fragmento del gen CAT mediante PCR con pSTV28N como molde usando los cebadores MMA-159 y MMA-160, y luego se purificó.

Cebador MMA-159 (SEQ ID NO: 25):

CTGCGTAGCACCAGCCAGTAGACTAGTGCGGAGAAAAAAATCAC

Cebador MMA-160 (SEQ ID NO: 26):

GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCG

Se mezclaron el fragmento del gen de AAT y el fragmento del gen CAT con un vector pTrc99A escindido de antemano con NcoI y Sse8387I, y se ligaron estos 3 fragmentos usando el kit de clonación In-Fusion HD. Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con la disolución de reacción. Se preparó un plásmido a partir del transformante de E. coli y se denominó pAAT113. El aminoácido en la posición 2 de la proteína codificada por el gen de AAT en pAAT113 es valina.

Preparación del plásmido pAAT117 para la expresión del gen de fusión AAT (V2K)-CAT

Se convirtió el aminoácido valina en la posición 2 de la proteína codificada por el gen de AAT en pAAT113 en lisina para preparar un plásmido pAAT117. Se realizó la sustitución de aminoácido según la preparación de pAAT116 a partir de pAAT115 en el ejemplo de referencia 1.

(3) Preparación de la biblioteca de plásmidos del gen de fusión AAT mutado-CAT

Se escindió pAAT113 con NcoI y SpeI y luego se trató con SAP (fosfatasa alcalina de gamba). Se purificó el fragmento de ADN usando electroforesis en gel de agarosa y un kit de extracción en gel/purificación por PCR (FAVORGEN Biotech Corp.). Se ligó el fragmento de ADN con la biblioteca de genes de mutación aleatoria obtenida en el párrafo anterior (1) usando el kit de ligación de ADN ver. 2 (Takara Bio Inc.). Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con la disolución de reacción.

Se cultivó el transformante de E. coli en medio LBAmp-agar. Se recuperaron aproximadamente 12.000 colonias y se preparó una suspensión de células bacterianas. Se prepararon los plásmidos a partir de una alícuota de la suspensión de células bacterianas usando el kit de minipreparación (Qiagen N.V.) y se usaron como una biblioteca de plásmidos del gen de fusión AAT mutado (M2K)-CAT.

(4) Detección de AAT altamente soluble con resistencia a cloranfenicol como índice e identificación de posición de la mutación

Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con la biblioteca de plásmidos del gen de fusión AAT mutado (M2K)-CAT obtenida en el párrafo anterior (3). Se extendió la disolución de cultivo del transformante de E. coli sobre medio de LB-agar que contenía cloranfenicol 30 mg/l e IPTG 0,4 mM y se cultivó durante la noche a 37°C. Se cultivaron en líquido las colonias obtenidas y se prepararon los plásmidos. Se analizaron las secuencias del gen de AAT en los plásmidos para identificar las posiciones de mutación (tabla 3).

[Tabla 3]

(5) Evaluación de la actividad AAT del mutante que contiene la mutación identificada

Se prepararon plásmidos para la expresión de mutantes que contenían las mutaciones que se muestran en la “tabla 3” (tabla 4).

En primer lugar, se realizó PCR con pAAT116 como molde usando los conjuntos de cebadores que se muestran en la “tabla 4” a continuación. Se añadió 1 |il de Dpnl a cada disolución de reacción y se incubó la mezcla a 37°C durante 1 hora. Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con la disolución tratada con Dpnl. Se preparó un plásmido que contenía cada gen de AAT mutante a partir del transformante de E. coli.

[Tabla 4]

Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con cada plásmido que se muestra en la “tabla 4” y se midió la actividad AAT de un homogeneizado celular del transformante de E. coli mediante el método descrito en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la “tabla 5”. En la tabla, el valor de actividad se indica mediante un valor relativo cuando la actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116 se define como 1.

[Tabla 5]

N.T.: no medido

La mejora de la actividad AAT se confirmó mediante la introducción de las mutaciones A64V, V248A y Q363K. La mutación K117Q también presentó una ligera mejora de la actividad. Aunque no se muestra en la tabla, también se confirmó que la sustitución del residuo de alanina 64 por isoleucina o treonina y la sustitución del residuo de glutamina 363 por prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano ofrece el 120% o más de actividad en relación con la actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116.

A continuación, se preparó un mutante cuádruple de A64V, K117Q, V248Ay Q363K.

(6) Preparación y evaluación de la actividad del mutante cuádruple

Se sintetizó por consignación el gen de AAT que tenía 4 mutaciones A64V, K117Q, V248Ay Q363K(GenScript Biotech Corp.) y se insertó en un vector pTrc99A para obtener un plásmido pAAT021. Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con el plásmido pAAT021 y se midió la actividad AAT de un homogeneizado celular del transformante de E. coli mediante el método descrito en el ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la figura 5. El mutante cuádruple presentó una actividad de aproximadamente 6 veces la actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116.

[Ejemplo 2: preparación y evaluación de la actividad del mutante cuádruple con sustitución de 6 cisteínas]

Se sintetizó por consignación el gen de AAT que codifica par un mutante en el que todos los residuos de cisteína 48, 150, 167, 270, 274 y 447 de AAT se sustituyeron por alanina y había presentes 4 mutaciones A64V, K117Q, V248A y Q363K (GenScript Biotech Corp.), y se insertó en un vector pTrc99A para obtener un plásmido pAAT025. Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con el plásmido pAAT025 y se midió la actividad AAT de un homogeneizado celular del transformante de E. coli mediante el método descrito en el ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la figura 5. El mutante cuádruple con sustitución de 6 cisteínas presentó una actividad por recombinante de aproximadamente 2,8 veces la actividad de la forma de referencia (mutante cuádruple) expresada a partir de pAAT021.

[Ejemplo 3: preparación y evaluación de la actividad del mutante cuádruple con sustitución de 6 cisteínas - 2] Se prepararon un plásmido pAAT155 derivado del plásmido pAAT021 (mutante cuádruple) mediante la sustitución del residuo de cisteína 150 de AAT por arginina y un plásmido pAAT154 derivado de pAAT025 (mutante cuádruple con sustitución de 6 cisteínas) mediante la sustitución del residuo de cisteína 150 de AAT por arginina.

El plásmido pAAT155 contiene un gen que codifica para AAT mutante que tiene la sustitución del residuo de cisteína 150 de AAT por arginina y una mutación cuádruple de A64V, K117Q, v 248A y Q363K.

El plásmido pAAT154 contiene un gen que codifica para AAT mutante que tiene la sustitución de todos los residuos de cisteína 48, 167, 270, 274 y 447 de AAT por alanina, la sustitución del residuo de cisteína 150 por arginina y una mutación cuádruple de A64V, K117Q, V248A y Q363K.

La sustitución de aminoácido se realizó según la preparación de pAAT116 a partir de pAAT115 en el ejemplo de referencia 1. Se realizó la reacción de PCR con pAAT021 o pAAT025 como molde usando los cebadores MMA-380 y MMA-381.

Cebador MMA-380 (SEQ ID NO: 59):

CTGATTCAAGTCACTCGTCTGACGTGTGGTGG

Cebador MMA-381 (SEQ ID NO: 60):

CCACCACACGTCAGACGAGTGACTTGAATCAG

Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con el plásmido pAAT155 o pAAT154 y se midió la actividad AAT de un homogeneizado celular del transformante de E. coli mediante el método descrito en el ejemplo 1. Se separaron un extracto celular (fracción soluble) y una fracción insoluble (fracciones de membrana y células bacterianas) separada del extracto celular por centrifugación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, y se detectó una banda de la proteína AAT recombinante.

Los resultados se muestran en la figura 5. Los recombinantes que expresan AAT mutante a partir de pAAT155 y pAAT154 presentaron una actividad AAT por recombinante de aproximadamente 3,7 veces y aproximadamente 5 veces, respectivamente, la actividad de la forma de referencia (mutante cuádruple) expresada a partir de pAAT021. Además, las proteínas expresadas por los recombinantes que expresan AAT mutante a partir de pAAT155 y pAAT154 eran más abundantes en la fracción soluble en comparación con el recombinante que expresaba la forma de referencia. Estos resultados demostraron que la sustitución del residuo de cisteína 150, en particular, por arginina potencia adicionalmente la solubilidad de la forma de referencia y mejora adicionalmente la actividad.

[Ejemplo 4: preparación y evaluación de la actividad de un mutante cuádruple con sustitución de 4 ó 5 cisteínas] Se sintetizó por consignación el gen de AAT que codifica para un mutante en el que 5 ó 4 de los 6 residuos de cisteína 48, 150, 167, 270, 274 y 447 de AAT se sustituyeron por alanina y había presentes 4 mutaciones A64V, K117Q, V248A y Q363K (GenScript Biotech Corp.), y se insertó en un vector pTrc99A para obtener los plásmidos que se muestran en la “tabla 6”. Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con cada plásmido y se midió la actividad AAT de un homogeneizado celular del transformante de E. coli mediante el método descrito en el ejemplo 1.

[Tabla 6]

Los resultados se muestran en la figura 6. La ordenada del gráfico indica la actividad AAT por peso de células bacterianas cuando la actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT116 se define como 1. Todos del mutante cuádruple con sustitución de 5 cisteínas y los mutantes cuádruples con sustitución de 4 cisteínas presentaron mayor solubilidad y actividad por recombinante que los de la forma de referencia (mutante cuádruple) expresada a partir de pAAT021.

[Ejemplo de referencia 5: producción de AAT de tomate altamente activa]

(1) Preparación de recombinante que expresa un mutante en el que el residuo de cisteína se sustituyó por el residuo de alanina

Se sintetizó por consignación un plásmido pAAT032 para la expresión del gen de AAT de tomate (SpAAT) (GenScript Biotech Corp.; lo mismo es válido para la descripción a continuación). pAAT032 contiene un gen que codifica para AAT con mutación A2K de tomate (especie silvestre) (SEQ ID NO: 64) en el que el aminoácido alanina en la posición 2 de AAT de tipo natural de tomate (especie silvestre) (SEQ ID NO: 66) se sustituyó por lisina. La proteína codificada por este gen tiene 8 residuos de cisteína. Se sintetizaron por consignación 8 plásmidos en los que cada cisteína se sustituyó por alanina (tabla 7).

[Tabla 7]

Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con cada uno de los 9 plásmidos que se muestran en la “tabla 7”.

(2) Medición de la actividad AAT del extracto celular que contiene un mutante

Se cultivó el transformante de E. coli de la misma manera que en el ejemplo 1. Se recuperaron las células bacterianas y se preparó un extracto celular, seguido de la medición de la actividad AAT. Los resultados se muestran en la figura 7.

Se obtuvieron cinco mutantes que presentaron el 50% o más de actividad AAT por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT032 (mutantes expresados a partir de pATM104, pATM105, pATM106, pATM107 y pATM108).

(3) Preparación de recombinante que expresa un mutante en el que 5 residuos de cisteína se sustituyeron por residuos de alanina

Por consiguiente, se sintetizó por consignación un plásmido pAAT164 que contiene un gen que codifica para un mutante que contiene todas las sustituciones de aminoácido C206A, C209A, C256A, C269A y C322A de estos 5 mutantes. Los resultados de la medición de la actividad AAT se muestran en la figura 7.

El mutante expresado a partir de pAAT164 presentó una actividad AAT por recombinante de aproximadamente 3 veces la actividad de la forma de referencia. Además, el mutante expresado a partir de pAAT164 era más abundante en la fracción soluble en comparación con la forma de referencia. Estos resultados demostraron que la sustitución de los residuos de cisteína 206, 209, 256, 269 y 322 por alanina potencia la solubilidad de AAT y mejora la actividad por recombinante.

[Ejemplo de referencia 6: producción de AAT de fresón altamente activa]

(1) Preparación de recombinante que expresa un mutante en el que el residuo de cisteína se sustituyó por el residuo de alanina

Se sintetizó por consignación un plásmido pAAT033 para la expresión de un gen de AAT de fresón (SAAT) (SEQ ID NO: 65). La proteína codificada por este gen tiene 9 residuos de cisteína. Se sintetizaron por consignación 9 plásmidos en los que cada cisteína se sustituyó por alanina (tabla 8).

[Tabla 8]

Se transformó una cepa de E. coli, JM109, con cada uno de los 10 plásmidos que se muestran en la “tabla 8”. (2) Medición de la actividad AAT del extracto celular que contiene un mutante

Se cultivó el transformante de E. coli de la misma manera que en el ejemplo 1. Se recuperaron las células bacterianas y se preparó un extracto celular, seguido de la medición de la actividad AAT. Los resultados se muestran en la figura 8.

Se obtuvieron siete mutantes que presentaron el 50% o más de actividad AAT por recombinante en relación con el 100% de actividad de la forma de referencia expresada a partir de pAAT033 (mutantes expresados a partir de pATM202, pATM203, pATM204, pATM205, pATM206, pATM207 y pATM208).

(3) Preparación de recombinante que expresa un mutante en el que 5 residuos de cisteína se sustituyeron por residuos de alanina

Se sintetizó por consignación un plásmido pAAT037 que contenía un gen que codifica para un mutante que contiene C115A, C167A, C179A, C325A y C356A entre las sustituciones de aminoácido de estos 7 mutantes. Los resultados de la medición de la actividad AAT se muestran en la figura 8.

El mutante expresado a partir de pAAT037 presentó una actividad AAT por recombinante de aproximadamente 1,7 veces la actividad de la forma de referencia. Estos resultados demostraron que la sustitución de los residuos de cisteína 115, 167, 179, 325 y 356 por alanina mejora la actividad por recombinante.

Texto libre de la lista de secuencias

SEQ ID NO: 1: AAT de tipo natural de manzana (Mp-AAT1_manzana)

SEQ ID NO: 2: AAT con mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 3: AAT que contiene una mutación cuádruple introducida en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 4: AAT que contiene 6 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana SEQ ID NO: 5: AAT que contiene una mutación cuádruple y 6 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 6: AAT que contiene una mutación cuádruple y Cys150Arg introducida en la mutación M2K de manzana SEQ ID NO: 7: AAT que contiene una mutación cuádruple y 6 sustituciones de cisteína (incluyendo Cys150Arg en la posición 150) introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 8: AAT que contiene una mutación cuádruple y 5 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 9: AAT que contiene una mutación cuádruple y 4 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 10: AAT que contiene una mutación cuádruple y 4 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 11: AAT que contiene una mutación cuádruple y 4 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 12: secuencia de aminoácidos de AAT derivada de manzana (Md-AAT2_manzana)

SEQ ID NO: 13: AAT que contiene una mutación cuádruple y 4 sustituciones de cisteína introducidas en la mutación M2K de manzana

SEQ ID NO: 14: gen de AAT de tipo natural de manzana optimizado para codones de E. coli

SEQ ID NO: 15: cebador MMA-156

SEQ ID NO: 16: cebador MMA-163

SEQ ID NO: 17: cebador MMA-166

SEQ ID NO: 18: cebador MMA-169

SEQ ID NO: 19: cebador MMA-185

SEQ ID NO: 20: cebador MMA-157

SEQ ID NO: 21: cebador MMA-152

SEQ ID NO: 22: cebador MMA-153

SEQ ID NO: 23: cebador MMA-156

SEQ ID NO: 24: cebador MMA-157

SEQ ID NO: 25: cebador MMA-159

SEQ ID NO: 26: cebador MMA-160

SEQ ID NO: 27: cebador MMA-207

SEQ ID NO: 28: cebador MMA-208

SEQ ID NO: 29: cebador MMA-215

SEQ ID NO: 30: cebador MMA-216

SEQ ID NO: 31: cebador MMA-217

SEQ ID NO: 32: cebador MMA-218

SEQ ID NO: 33: cebador MMA-219

SEQ ID NO: 34: cebador MMA-220

SEQ ID NO: 35: cebador MMA-221

SEQ ID NO: 36: cebador MMA-222

SEQ ID NO: 37: cebador MMA-223

SEQ ID NO: 38: cebador MMA-224

SEQ ID NO: 39: cebador MMA-225

SEQ ID NO: 40: cebador MMA-226

SEQ ID NO: 73

Claims (8)

REIVINDICACIONESi. Alcohol aciltransferasa mutante que tiene una actividad mejorada en comparación con una forma de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, en la que la alcohol aciltransferasa mutante consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2, y en la quela alcohol aciltransferasa mutante tiene las siguientes sustituciones de aminoácido:
1. (1) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 48 en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2 por otro residuo de aminoácido, y

   (2) una sustitución de cisteína correspondiente a cisteína en la posición 150 en alineación con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 ó 2 por otro residuo de aminoácido.

   2. Alcohol aciltransferasa mutante según la reivindicación 1, en la que el otro residuo de aminoácido es alanina 0 arginina.

   3. Alcohol aciltransferasa mutante según la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 ó 7.

   4. Alcohol aciltransferasa mutante según la reivindicación 1, en la que la alcohol aciltransferasa mutante tiene además una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de las siguientes sustituciones de aminoácido: (1) una sustitución de alanina en la posición 64 por valina, isoleucina o treonina,
2. (2) una sustitución de lisina en la posición 117 por glutamina,
3. (3) una sustitución de valina en la posición 248 por alanina, y
4. (4) una sustitución de glutamina en la posición 363 por lisina, prolina, alanina, arginina, glicina o triptófano.
5. 5. Alcohol aciltransferasa mutante según la reivindicación 4, que consiste en una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 8, 10 y 13.
6. 6. Vector para la expresión de la alcohol aciltransferasa mutante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, conteniendo dicho vector el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos de la alcohol aciltransferasa mutante.
7. 7. Transformante transformado por y que alberga el vector según la reivindicación 6.
8. 8. Método para producir éster de ácido metacrílico usando la alcohol aciltransferasa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.