ES2297228T3 - Un gen que codifica para la vitamina b6-fosfato-fosfatasa y su uso. - Google Patents

Un gen que codifica para la vitamina b6-fosfato-fosfatasa y su uso. Download PDF

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Abstract

Un DNA aislado, que codifica para la vitamina B6-fosfato-fosfatasa, seleccionado de entre el grupo consistente en: (a) una secuencia de DNA representada en la SEQ ID NO:9; (b) una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene actividad B6-fosfato-fosfatasa y que hibrida bajo condiciones standard a la secuencia de DNA definida en (a) o un fragmento de ésta, y que es por lo menos un 70% idéntica a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:9 ó un fragmento de ésta; (c) una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene actividad B6-fosfato-fosfatasa, en donde, excitado polipéptido, es por lo menos un 70% idéntica a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:10; (d) una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene actividad B 6-fosfato-fosfatasa, en donde, excitado polipéptido, es por lo menos un 70% idéntica a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:9; (e) una secuencia de DNA degenerado, de una cualquiera de (a) a (c).

Description

Un gen que codifica para la vitamina B_{6}-fosfato-fosfatasa y su uso.
La presente invención, se refiere a un nuevo gen de B_{6}-fosfato-fosfatasa (VB6P-fosfatasa) y a microorganismos recombinantes transformados con un vector que tiene el citado gen. La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento para preparar vitamina B_{6} a partir de VB6P, utilizando los microorganismos recombinantes o el polipéptido.
"Vitamina B_{6}", tal y como se utiliza en la presente invención, incluye al piridoxol (al cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como PN), al piridoxal y a la piridoxamina. La vitamina B_{6}, es una vitamina indispensable para los seres humanos u otros animales, y se utiliza como primera materia para medicina, o como aditivos para alimentos.
La presente invención, proporciona microorganismos recombinantes transformados con un nuevo gen de VB6P fosfatasa (a saber, el pdxP), el cual se clona a partir de Sinorhizobium meliloti.
La presente invención, proporciona un procedimiento para producir vitamina B_{6}, a partir de VB6P, utilizando un extracto exento de células (al cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como CFE) o los microorganismos y contactar la VB6P con (i) el CFE, o (ii) preparación de la enzima adicionalmente purificada a partir del CFE anteriormente citado, en presencia de Mn^{2+}, Mg^{2+}, Co^{2+}, Sn^{2+}, ó Ni^{2+}, y aislando la vitamina B_{6} resultante, a partir de la mezcla de reacción.
La presente invención, proporciona un ácido desoxirribonucleico aislado (DNA) que codifica VB6P-fosfatasa y microorganismos recombinantes, los cuales son capaces de producir vitamina B_{6}, a partir de VB6P, procediendo a introducir vectores que tienen el DNA aislado.
Un gen VB6P fosfatasa (pdxP) al que se hace aquí referencia, significa el gen que codifica una VB6P-fosfatasa que cataliza la desforilización de VB6P a vitamina B_{6}, con una alta especificidad del substrato en piridoxol fosfato y piridoxal fosfato.
El término "aislado", cuando se aplica al DNA, significa que, el DNA, se ha eliminado de su entorno medioambiental genético y se encuentra así, de este modo, exento de otras secuencias codificantes extrañas o no deseadas, y se encuentra en una forma apropiada para su uso en sistemas de producción de proteínas diseñadas mediante ingeniería genética. El término "un DNA aislado", se denomina, de una forma alternativa, como " DNA clonado".
El término "vector", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a una molécula de DNA, lineal o circular, la cual se deriva, de una forma general, de un plásmido o DNA vírico, o puede contener ambos elementos. El vector, puede ser uno que sea independiente de replicación de cromosomas, o uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped y se replica conjuntamente con el cromosoma o cromosomas en los que éste se encuentra integrado.
El término "microorganismo recombinante", se refiere a cualquier microorganismo transformado con un vector que comprende el DNA aislado de interés. Los microorganismos recombinantes de la presente invención, expresan un gen que codifica para la VB6P-fosfatasa para la preparación de vitamina B_{6}, a partir de VB6P.
La publicación de patente interracial WO 03/000 875, la cual ha sido publicada después de la fecha de prioridad de la presente solicitud de patente, da a conocer la purificación cromatográfica de la vitamina B_{6}-fosfato-fosfatasa. Este documento, es relevante, no obstante, únicamente en cuanto a lo referente a la novedad [Artículo 54(3) EPC].
La patente europea EP 0 950 715, da a conocer un procedimiento para la producción, exenta de células, de vitamina B_{6}, utilizando un sistema exento de células derivado de la S. meliloti.
Clonación del gen de la VB6P fosfatasa
La proteína purificada de la VB6P-fosfatasa de S. meliloti, por ejemplo, se digiere con una proteasa apropiada tal como la tripsina y los péptidos resultantes, se fraccionan utilizando cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Las secuencias de aminoácido de los péptidos, se determinan mediante la utilización de un secuenciador de proteínas y se sintetizan cebadores de degeneración en base a las secuencias de aminoácidos de los péptidos. Se obtiene un fragmento parcial de un gen de VB6P-fosfatasa, con los cebadores de degeneración. Se obtiene una longitud total del gen de VB6P-fosfatasa, procediendo al rastreo de una biblioteca genómica, utilizando el fragmento parcial resultante como una sonda.
Un ejemplo para un fragmento de DNA apropiado, se deriva de la S. meliloti, ilustrándose, la secuencia nucleótida, como SEQ ID NO:9.
En el caso de S. meliloti, la secuencia genómica completa, ha sido publicada (EMBL, nº de acceso, AL 591 688), y la búsqueda BLAST, muestra el hecho de que, la secuencia de DNA del pdxP de la S. meliloti, representada en la SEQ ID NO:9, corresponde a la región 472329 - 473036, complemento, marco de lectura abierto SMc01730, en el nº de acceso AL 591 688 (EMBL), excepto para una substitución de nucleótido, es decir, el nucleótido en la posición 163, pero la función de polipéptido representada en el marco de lectura abierto Smc01730, no ha sido identificada anteriormente.
Un equivalente funcional de la S. meliloti pdxP, puede aislarse a partir de cualquier organismo, tal como el Mesorhizobium loti, aunque no de una forma limitativa en cuanto a éste, otras bacterias, levaduras y plantas.
La presente invención, proporciona secuencias de DNA que codifican para una VB6P-fosfatasa, tal y como se representa en la SEQ ID NO:9, así como secuencias de DNA las cuales hibridan bajo condiciones estándar, con las secuencias representadas en la SEQ ID NO:9, ó fragmentos de ésta.
El término "secuencias de DNA que hibridan bajo condiciones estándar", tal y como se describe aquí, en este documento, se refiere a DNA susceptible de poder ser obtenido mediante la utilización de hibridación de colonias, hibridación de placas, o hibridación de Southern, en donde se utiliza cualquier secuencia de DNA mostrada en la SEQ ID NO:9, como sonda.
"Condiciones estándar" para la hibridación, significa, en este contexto, las condiciones que generalmente se utilizan por parte de una persona experta en el arte especializado de la técnica, para detectar la señales específicas de hibridación o, de una forma preferible, las denominadas condiciones de hibridación severa y de lavado no severo o, de una forma más preferible, las denominadas condiciones moderadamente severas o, de una forma incluso más preferible, las denominadas condiciones de hibridación severa y de lavado severo, con las que una persona experta en el arte especializado de la técnica, se encuentra familiarizado. Un ejemplo específico de éstas, es un DNA que puede identificarse procediendo a someterlo a hibridación, utilizando el equipo, a modo de "kit", de marcaje y detección de DNA de digoxigenina (a la cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como DIG) (equipo a modo de "kit" , de la firma Roche Diagnostics, Tokio, Japón), siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La solución de hibridación, contiene 50% formamida, 5 x SSC (10 x SSC, se compone de 87,65 g de NaCl y 44,1 g de citrato sódico, en 1 litro), 2% de reactivo bloqueante (Roche Diagnostics, Tokio, Japón), 0,1% de N-lauroilsarcosina, y 0,3% dodecilsulfato sódico (al cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como SDS). La hibridación, puede realizarse durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de 42ºC y, a continuación, procediendo a lavar, dos veces, en 2 x SSC, que contiene 0,1% SDS, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente, y dos veces en 0,1 x SSC que contiene 0,1% SDS, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van de 50ºC a 68ºC. La detección, puede realizarse tal y como se indica por parte del fabricante.
La presente invención, incluye, también, secuencias de DNA que son por lo menos un 70%, de una forma preferible, por lo menos un 80% y, de una forma particularmente, preferida, más de un 90% idénticas, a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:9, ó un fragmento de ésta.
Células huésped y vectores
Las células huésped apropiadas para la producción recombinante de vitamina B_{6} a partir de VB6P, mediante la expresión de VB6P-fosfatasa, puede ser, o bien ya sea procariótica, o bien ya sea eucariótica, y se limitará únicamente por su capacidad para expresar enzimas activas. En una forma de presentación, la Escherichia coli recombinante, se proporciona en la presente invención. Como cepas huésped, pueden utilizarse cualesquiera cepas pertenecientes al género Escherichia, y el microorganismo perteneciente al género Escherichia, puede aislarse a partir de fuentes naturales, o puede adquirirse de procedencia de colecciones de cultivos. De una forma preferible, para la presente invención, puede utilizarse el E. coli JM109 (Takara, Shiga, Japón). Los vectores apropiados que pueden mantenerse en E. coli, y utilizarse para la expresión de DNA recombinante, en E. coli, incluyen, pero no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a las plásmidos de la serie pUC, pBR322, y sus derivados, tales como el pKK223-3.
En otra forma de presentación, en la presente invención, se proporciona el S. mililoti recombinante. Como cepa huésped, puede utilizarse cualquier cepa perteneciente al género Sinorhizobium y, el microorganismo perteneciente al género Sinorhizobium, puede aislarse a partir de fuentes naturales, o puede adquirirse de colecciones de cultivos. De una forma preferible, para la presente invención, puede utilizarse el S. meliloti IFO 14782 (DSM 10226). Como vector para la expresión de DNA recombinante, en S. meliloti, puede utilizarse un vector de amplia extensión del huésped, tal como los pVK100, pRK290, pLAFR1 ó RSF1010. Un plásmido que expresa proteína recombinante en S. meliloti, puede proporcionarse procediendo a insertar un fragmento de DNA que codifica a un promotor que funciona en el S. meliloti, tal como ptac, plac, ptrc, pS1 (promotor de una pequeña subunidad ribosómica de S. meliloti), ó pNM (promotor de gen resistente a la neomicina).
Un plásmido recombinante para la incorporación del pedxP, puede introducirse en el S. meliloti IFO 14782, mediante tri-apareamiento paternal, de la forma que se describe a continuación. Se procede a cultivar separadamente y a mezclar conjuntamente, S. meliloti, como cepa destinataria, plásmido helper hospedante de E. coli, como cepa helper, y plásmido donante hospedante de E. coli, como cepa donante. Después del cultivo mezclado, en placa, puede seleccionarse la S. meliloti que recibe un plásmido recombinante, en placa de agar que contiene antibióticos apropiados. La cepa recombinante que porta los plásmidos, se selecciona, mediante la preparación de plásmidos, a partir de las colonias cultivadas en las placas y examen mediante digestión de nucleasa.
El procedimiento para construir vectores recombinantes, puede realizarse en concordancia con técnicas estándar que son conocidas en el arte especializado de la técnica. En la presente invención, se procede a emplazar el pdxP en pKK223-3, bajo el control del promotor ptac, para construir el pKKpdxP, con un vector de expresión en E. coli. En otra forma de presentación, el pdxP, se emplaza en el pVK100, bajo el control del promotor ptac, para construir el pVKptacpdxP, como un vector de expresión en S. meliloti.
Polipéptidos
La presente invención, proporciona también polipéptidos que tienen actividad VB6P-fosfatasa, y derivados funcionales de los polipéptidos. Tales tipos de derivados funcionales, se definen en base a las secuencias de aminoácidos de la presente invención, mediante adición, deleción y/o substitución de uno o más residuos de aminoácidos de tales tipos de secuencias, en donde, tales tipos de derivados, tienen todavía actividad VB6P-fosfatasa. Tales tipos de derivados funcionales, pueden realizarse, bien ya sea mediante síntesis química de péptidos, la cual es conocida en el arte especializado de la técnica, o mediante medios recombinantes en base a la secuencia de DNA, tal y como se da a conocer aquí, en este documento, mediante procedimientos conocidos en el estado actual del arte especializado de la técnica. Los cambios de aminoácidos, en proteínas y péptidos, que no alteran de una forma general la actividad de tales tipos de moléculas, son conocidos, en el estado actual del arte especializado de la técnica. Los cambios que acontecen más comúnmente, son: Ala/Ser, Val/Ile, Aps/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, así como éstos de forma inversa.
Adicionalmente, además, los polipéptidos descritos aquí, en este documento, incluyen un polipéptido en concordancia con la SEQ ID NO:10, de una forma particular, aquéllos con la actividad biológica de VB6P-fosfatasa, y también, aquéllos que son por lo menos un 70% idénticos, de una forma preferible, por lo menos un 80% idénticos, y de una forma particularmente preferible, más de un 90% idénticos, al polipéptido en concordancia con la SEQ ID NO:10, y tienen la actividad mencionada.
Producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P
Los microorganismos recombinantes obtenidos en la presente invención, pueden incubarse en un medio que contiene una fuente de carbono asimilable, una fuente de nitrógeno digestible, una sal orgánica, y otros nutrientes necesarios para su crecimiento o cultivo. Como fuente de carbono, puede emplearse, por ejemplo, glucosa, fructosa, lactosa, maltosa, galactosa, sucrosa, almidón, dextrina, o glicerol. Como fuente de nitrógeno, puede emplearse, por ejemplo, peptona, licor impregnado de maíz, judía de soja en polvo, extracto de levaduras, extracto de carnes, cloruro amónico, sulfato amónico, nitrato amónico, urea, o mezclas de éstos. Adicionalmente, además, pueden utilizarse elementos de traza (oligoelementos), sulfatos, hidrocloruros (clorhidratos), o fosfatos de calcio, magnesio, zinc, manganeso, cobalto, y hierro. Y, en caso necesario, pueden también añadirse factores nutritivos convencionales, un agente de captura del ión fosfato, o un agente antiespumante, tal como carbonato de magnesio, óxido de aluminio, alófana, aceite animal, aceite vegetal o aceite mineral, de una forma suplementaria, en un medio de fermentación. El pH del cultivo, puede ser el correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 5,0 hasta aproximadamente 9,0. La temperatura de cultivo, puede ser la correspondiente a un valor comprendido dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente 5ºC hasta aproximadamente 45ºC. El tiempo de cultivo, puede ser el correspondiente a un período que va desde aproximadamente un día hasta aproximadamente 15 días. En el proceso de cultivo, la aireación y la agitación, proporcionan, usualmente, unos resultados favorables.
La proteína que tiene actividad VB6P-fosfatasa, puede utilizarse en forma del cultivo, en sí mismo, el cual se ha preparado de la forma anteriormente descrita, arriba, un extracto exento de células (CFE) procedente del cultivo, proteína aislada del CFE, o una enzima inmovilizada, para preparar vitamina B_{6}, a partir de VB6P. La expresión del pdxP incorporado en el plásmido, en células huésped apropiadas, pude analizarse, para preparar el CFE, a partir del cultivo de microorganismos recombinantes, y sometiéndola a electroforesis de gel de poliacrilamida en SDS (SDS-PAGE). La producción enzimática para preparar vitamina B_{6}, a partir de VB6P, puede realizarse procediendo a poner en contacto la proteína enzimáticamente activa, con VB6P, en un medio acuoso. El medio acuoso, puede ser una solución acuosa, la cual, en caso necesario, se puede tamponar. La VB6P, se disuelve en agua, y se añade al medio acuoso. La producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P, puede realizarse en el medio acuoso, con un valor pH comprendido dentro de unos márgenes de 5,5-9,0, de una forma preferible, con un valor pH comprendido dentro de unos márgenes de 7,0 - 8,0, y en unos márgenes de temperatura que van de 15ºC a 45ºC, de una forma preferible, de 30ºC a 40ºC, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a 5 horas, en presencia de Mn^{2+}, Mg^{2+}, Co^{2+}, Sn^{2+} ó
Ni^{2+}.
Después de la producción de vitamina B_{6} a partir de VB6P, la vitamina B_{6} producida, puede separarse de la mezcla de reacción y purificarse. Para este propósito, puede aplicarse un procedimiento generalmente utilizado para extraer un cierto producto de la mezcla de reacción, utilizando varias propiedades de la vitamina B_{6}. Así, por ejemplo, las proteínas, pueden desnaturalizarse procediendo a calentar o añadiendo un desnaturalizante, tal como el metanol o el etanol, y retirarse de la mezcla de reacción, mediante filtrado. La substancia deseada, en el filtrado, puede absorberse sobre carbón activo, y después, eluirse y purificarse adicionalmente, con una resina intercambiadora de iones. De una forma alternativa, el filtrado, puede aplicarse directamente a una resina intercambiadora de iones y, después de la elución, el producto deseado, pude recristalizarse a partir de una mezcla de alcohol y de agua. La cantidad de vitamina B_{6} producida en la mezcla de reacción, puede cuantificarse mediante HPLC.
La presente invención, se explicará ahora, en mayor detalle, haciendo referencia a los ejemplos que se facilitan a continuación
Procedimientos generales
Se procedió a utilizar S. meliloti IFO 14782, como una fuente de DNA cromosómico para experimentos de clonación de genes, y como una cepa huésped, para la producción de vitamina B6, a partir de VB6P, mediante transconjugantes. Los derivados de E. coli K-12, se utilizaron también como una cepa huésped para experimentos de clonación molecular y para la producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P. Se cultivaron cepas de E. coli en medio LB (al cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como LB), consistentes en 1% Baco Tryptone (Becton Dickinson Microbiology Systems, MD, USA), 0,5% extracto de levadura Bacto (Becton Dickinson Microbiology Systems, MD, USA), y 0,5% NaCl, y se cultivaron cepas de S. meliloti en LB suplementado con 0,061% MgSO_{4}\cdot7H_{2}O y 0,036% CaCl_{2}\cdot2H_{2}O (al cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como LBMC). Se procedió añadir agar Bacto (1,5%), al medio, para preparar placas de agar. Se aisló DNA plásmido a partir de E. coli o de S. meliloti, con un equipo a modo de "kit", del tipo "QIAGEN Midi kit (QIAGEN GmbH, Alemania) o sistema automático de aislamiento de DNA del tipo "Automatic DNA Isolation System PI-50 (Kurabo Industry, Ltd., Japón). Se aisló DNA cromosómico, utilizando puntas genómicas del tipo "QIAGEN genomic-tips".
Las enzimas de restricción, la fosfatasa alcalina, el kit de ligado, las células competentes de E. coli JM109 y HB101 (Takara Bio. Inc. Shiga, Japón), y el equipo de clonación a modo de kit "TOPO TA cloning kit" (Invitrogen Japan K.K., Japón), se utilizaron en concordancia con las instrucciones del fabricante. El plásmido pKK223-3, se compró en el mercado, de procedencia de la firma Amersham Biosciences Corp. Para el análisis de las enzimas de restricción, los fragmentos de DNA, se fraccionaron en gel de azarosa, y se aislaron a partir de geles, por mediación de extracción, utilizando un sistema comercialmente obtenible en el mercado, con QIAEXII (QIAGEN GmbH). La secuencia de DNA, se determinó con un secuenciador de DNA del tipo "ALF DNA sequencer" (Amersham Biosciences).
Ejemplo 1 Clonación del gen de VB6P fosfatasa 1) Preparación de DNA cromosómico de S. meliloti IFO 14782
Se procedió a cultivar S. meliloti IFO 14782, en LBMC, a una temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 16 horas. Las células, se recolectaron mediante centrifugación y, el DNA cromosómico, se aisló utilizando puntas de QIAGEN genómicas.
2) Adquisición de un fragmento parcial del gen de VB6P-fosfatasa
Con objeto de diseñar cebadores de PCR para clonar el gen de VB6P-fosfatasa, utilizando un procedimiento de PCR degenerada, se procedió a determinar secuencias de aminoácidos de péptidos N-terminales e internos, mediante la utilización de un secuenciador de proteínas, dando como resultado los péptidos Fr60 (SEQ ID NO:1), Fr64 (SEQ ID NO:2), Fr70 (SEQ ID NO:3), y N-terminal (SEQ ID NO:4).
El DNA que codifica a la VB6P fosfatasa de S. meliloti, se obtuvo mediante el procedimiento de PCR degenerada. Como cebador delantero, se utilizó CN02 (SEQ ID NO:5), correspondiente a la secuencia de aminoácidos N-terminal de la VB6P-fosfatasa de S. meliloti (SEQ ID NO:4). Como cebador inverso, se utilizó C642 (SEQ ID NO:6), correspondiente a la secuencia de aminoácidos interna de la VB6P-fosfatasa de S. meliloti (SEQ ID NO:2).
Se utilizó PCR, en concordancia con el protocolo de Takara Shuzo. Se utilizó DNA cromosómico (0,1 \mug) de S. meliloti IFO 14782, como molde y se utilizó la ExTaq polimerasa como PCR-polimerasa. La condición de la PCR, era de la forma que sigue: 5 minutos a una temperatura de 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a una temperatura de 94ºC, 30 segundos a una temperatura de 50ºC, 30 segundos a una temperatura de 72ºC, 7 minutos a una temperatura de 72ºC. Después de la reacción, se procedió a analizar un alícuoto, mediante electroforesis en gel de azarosa, en 1,5% (peso/volumen) de geles y se purificaron productos de aproximadamente 0,5-kb, utilizando QIAEXII, y se clonaron en pCR2,1 TOPO. Se procedió a realizar la secuenciación de DNA de tres clones independientes que tenían insertos esperados, y se confirmó el hecho de que, las secuencias de DNA del fragmento del inserto de los tres clones, eran casi idénticas y que, las secuencias de aminoácidos deducidas, obtenidas de las secuencias de DNA, contenían la totalidad de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4. Uno de los clones, el phoC28, se utilizó para el siguiente estudio. A continuación, los cebadores C101 de PCR (cebador de sentido) (SEQ ID NO:7) y C101 (cebador antisentido), (SEQ ID NO:8), se sintetizaron en base a la secuencia de DNA del fragmento insertado de la phoC28, para obtener un fragmento parcial del gen de VB6P-fosfatasa, mediante PCR.
La condición de PCR, era de la forma que sigue: 5 minutos a una temperatura de 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a una temperatura de 94ºC, 30 segundos a una temperatura de 55ºC, 30 segundos a una temperatura de 72ºC, 7 minutos a una temperatura de 72ºC. Se utilizaron DNA cromosómico (0,1 \mug) de S. meliloti IfO 14782 y ExTaq polimerasa, como molde, y PCR-polimerasa, respectivamente. Se amplificaron productos de aproximadamente 0,5-kb, mediante PCR, como se esperaba y, los productos, se clonaron en pCR2.1 TOPO. Como resultado del análisis de secuenciación de DNA, se confirmó la obtención de algunos clones, los cuales tenían secuencias idénticas con pho C28. Uno de los clones, pC1, se utilizó para el siguiente test de ensayo, el cual tenía un fragmento parcial del gen de VB6P-fosfatasa de S. meliloti IFO 14782.
(3) Análisis de hibridación Southern de digestores cromosómicos de S. meliloti
Se procedió a marcar fragmentos de EcoR I de pC1, de 0,5-kb, con DIG-11-dUTP, mediante la utilización de un equipo de marcaje de DIG-DNA, del tipo "DIG-DNA labeling kit", y se utilizaron como sonda, para análisis de hibridación de Southern, para determinar una enzima de restricción apropiada, para utilizarla para construir una biblioteca genómica. El análisis de hibridación de Southern, se realizó en concordancia con el siguiente protocolo. El DNA cromosómico (3,4 \mug), se digirió con enzimas de restricción, y se sometió a electroforesis de gel de agarosa en 0,8% (peso/volumen) de geles. El DNA, se transfirió a la membrana de nylon en 10 x SSC, mediante la utilización de un absorbente de vacío del tipo "Vacum Blotter (modelo 785 - Bio-Rad)". La membrana, se pre-hibridó, en un tampón de hibridación [50% formamida, 5 x SSC, 2% reactivo de bloqueo, 0,1% N-lauroilsarcosina, y 0,3% SDS], durante un transcurso de tiempo de 6 horas y, después de la adición de la sonda desnaturalizada, durante el transcurso de toda la noche, a una temperatura de 42ºC. El producto de absorción (blot), se lavó dos veces en 2 x SSC, que contenía 0,1% DSC, durante un transcurso de tiempo de 5 minutos, a la temperatura ambiente, y dos veces en 0,1 x SSC que contenía 0,1% SDS, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a una temperatura de 68ºC. Los fragmentos de DNA, los cuales hibridaron a la sonda, se detectaron mediante la utilización de un equipo a modo de kit de detección DIG. Como resultado de ello, la sonda, hibridó a fragmentos de DNA de Sal I de 2,3-kb, de Eco R I de 3,5-kb, y de Kpn de 7,0-kb, en análisis de hibridación de Southern de digestores cromosómicos de S. meliloti.
(4) Construcción de una biblioteca genómica de S. meliloti IFO 14782
Se procedió a digerir parcialmente el DNA cromosómico, con EcoR I, sometido a electroforesis de gel de agarosa. Los fragmentos de DNA de 15- a 30-kb, se recuperaron a partir de geles, y se ligaron en pVK100, el cual se digirió con EcoR I, y se desfosforilizó con fosfatasa alcalina bacteriana. La mezcla de ligado, se utilizó para la reacción de envasado in vitro y, las partículas de fago, se utilizaron para infectar células de E. coli 8767, en la fase log. del crecimiento. La suspensión celular, se colocó sobre placa de LB, que contenía 10 \mug/ml de tetraciclina (a la cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como Tc). Se obtuvieron las colonias resistentes a Tc, y se almacenaron como biblioteca genómica de S. meliloti IFO 14782.
(5) Rastreo de la biblioteca genómica de S. meliloti IFO 14782
Con objeto de rastrear las colonias del gen de VB6P-fosfatasa de S. metilote, procedente de la biblioteca preparada en el ejemplo 1-(4), las colonias cultivadas en la placa de LB, con 10 \mug/ml de Tc, se transfirieron a la membrana de transferencia de nylon (Hybond® - N^{+} Amersham Pharmacia Biotech) y se sometieron a hibridación de colonias, con la sonda preparada en el ejemplo 1-(3). Entre los 3000 clones de la biblioteca genómica de S. metilote IFO 14782, se obtuvieron siete colonias positivas. Se prepararon plásmidos, mediante la utilización de puntas del tipo "QIAGEN-midi tip", a partir de colonias positivas, y se digirieron con enzimas de restricción, EcoR I y Sal I. Los plásmidos digeridos, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa en 1,0% (peso/volumen) de geles y se realizó un análisis de hibridación de Southern, tal y como se ha descrito en el ejemplo 1-(3), y se confirmó el hecho de que, la sonda, se hibridó a fragmentos de 2,3-kb de Sal I y 2,5-kb de EcoR I, de plásmidos digeridos. Uno de los plásmidos de las colonias positivas, el cual tenía un fragmento de EcoR I de 24-kb, se denominó pVECI.
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Ejemplo 2 Expresión de pdxP y producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P (1) Expresión de pdx en E. coli
Con objeto de expresar el gen de pdxP, bajo el control del promotor tac, en E. coli, se construyó el plásmido pKKpdxP. El gen del pdxP, se amplificó a partir de 100 ng de DNA cromosómico de S. meliloti IFO 14782, mediante un equipo avanzado de PCR, a modo de kit, del tipo "advantage-HF PCR kit" (Clontech, Estados Unidos de América), utilizando 10-pmol de los cebadores, Cebador P101 (SEQ ID NO.11) y Cebador P102 (SEQ ID NO:12).
Las condiciones de reacción, eran de la forma que sigue: después de mantener 15 segundos, a una temperatura de 94ºC, 30 ciclos de 15 segundos a una temperatura de 94ºC, 4 minutos a una temperatura de 68ºC. La mezcla de reacción, se sometió a electroforesis en gel de agarosa, y se recuperó un fragmento de DNA de 0,86-kb, de los geles, con QIAEXII. El fragmento de 0,86-kb obtenido, se clonó con un vector pCRII-TOPO, mediante un equipo de clonación, a modo de kit, del tipo "TOPOTA cloning kit" y, los 5 candidatos independientes obtenidos, se examinaron para las secuencia de DNA del fragmento de inserto. Como resultado de ello, unos de los candidatos, TOPpdxP105, el cual tenía una secuencia de inserto exacta, se utilizó para estudios adicionales.
El fragmento de Sma I de 0,86-kb, procedente del TOPOpdxP105, se ligó en el sitio Sma I de pKK233-3, en una orientación que permitía la trascripción de pdxP a partir del promotor tac, y el plásmido resultante, se denominó pKKpdxP (figura 2).
Los dos clones independientes JM109 que tenían el pKKpdxP (a saber, JM109/pKKpdxP-1 y JM109/pKKpdxP-7), se cultivaron en LB, con 100 \mug/ml de ampicilina (Amp) y 1 mg/ml de pirodoxamina. Después de un tiempo de cultivo de 1,5 horas, se indujo la expresión de pdxP, mediante la adición de 1 mM isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosa (IPTG). Después del cultivo durante un transcurso de tiempo adicional de otras 4,5 horas, las células, se recoltaron y se suspendieron en un tampón 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, el cual contenía 15% sucrosa, 1 mM ditiotreitol (DDT), 1 mM MnCl_{2}, 1 mM MgCl_{2}, y 0,1 mM fenilmetilsulfonilo fluoruro (PMSF). La suspensión de las células, se sometió a un prensado en prensa French, a una presión de 800 kg/cm^{2} y, el lisado resultante, se centrifugó a 35.000 x g, durante un transcurso de tiempo de 60 minutos, a una temperatura de 4ºC, con objeto de retirar los fragmentos de las células. El sobrenadante, se utilizó como CFE, después de diálisis con el mismo tampón. Con objeto de confirmar la expresión de PdxP, el CFE, se sometió a SDS-PAGE en 12,5% (peso/volumen) de geles, y se marcó con Cromassie Brilliant Blue (equipo a modo de kit del tipo Rapad Satín CBB Kit, Nacalai Teske, Japón). Se detectó la sobreproducción de polipéptidos, con el tamaño molecular esperado (29,0 kDa), en el E. coli JM 109/pKKpdxP-1, pero no en el E. coli JM 109/pKKpdxP-7. A continuación, el CFE de E. coli JM 109/pKKpdxP-1, se utilizó para estudios adicionales.
(2) Producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P en CFE de E. coli recombinante
La producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P, se realizó mediante la utilización del CFE preparado en el Ejemplo 2-(1). La mezcla de reacción, contenía un tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM piridoxol 5'-fosfato (PNP), 1 mM MnCl_{2} y CFE (0,5 mg proteína) en 125 \mul. La reacción, se realizó a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos y, la cantidad de PN, se cuantificó mediante HPLC, mediante el procedimiento interno standard, con 4'-desoxipridoxol, tal y como se describe abajo, a continuación. Para preparar las muestras para HPLC, se procedió a añadir 200 \mul de 100 mg/l de 4'-desoxipiridoxol como sustancia interna, 50 \mul de ácido perclórico al 60%, y 950 \mul de agua desionizada, a 50 \mul de la solución standard de piridoxol o la mezcla de reacción y, a continuación, la mezcla, se colocó sobre el hielo, durante un transcurso de tiempo de 10 minutos. A continuación, la mezcla se centrifugó a 15.000 rpm y, el sobrenadante, se puso en la siguiente columna. Las condiciones analíticas, eran según la forma que sigue: columna: carga del tipo "Capcell pak C18 SF120 (4,6 x 250 mm)" (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japón); fase móvil: 0,1 M perclorato sódico, 0,1 M fosfato potásico, y 2% acetonitrilo (pH 3,5); temperatura de la columna: 30ºC; caudal, 1,0 ml/minuto; y detector: ultravioleta (a 292 nm). Los resultados obtenidos, se muestran en la tabla 5 que se facilita a continuación. La concentración del PN formado, en la mezcla de reacción que contenía CFE de JM109/pKKpdxP, era de 50 mM, y era 1,4 veces mayor que el de JM109/pKK223-3 (0,37 mM).
TABLA 5 Cantidad de PN formado en CFE de JM109/pKKpdxP
1
(3) Expresión del pdxP en S. meliloti
El cósmido movilizable pVK100, se digirió con Bgl II, y a continuación, se recuperaron fragmentos de 21,3-kb. Después de que los fragmentos de trataran con fosfatasa alcalina bacteriana, se ligaron fragmentos de BamH I, de 1,1-kb, procedentes de pKKpdxP, en el fragmento de Bgl II digerido y desfosforilizado, para proporcionar un plásmido pVKPtacpdxP (Figura 3). A continuación, se obtuvo la S. mililoti IFO 14782 que tenía el pKPtacpdxP, mediante conjugación tri-paternal y, las células, se cultivaron en el medio de sembrado, que contenía 1% glucosa, 0,5% polipeptona, 0,2% extracto de levadura Bacto, 0,1% KH_{2}PO_{4}, 0,05% MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,001% MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, y 0,001% FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, y el cultivo de siembra, se transfirió a un medio de glucosa-polipeptona, el cual contenía 4% glucosa, 2% polipeptona, 0,2% extracto de levadura Bacto, 0,05% MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,05% MnSO_{4}\cdot5H_{2}O, y 0,001% FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, y se cultivó a una temperatura de 20ºC, durante un transcurso de tiempo de 3 días. Las células, se recolectaron mediante centrifugación, y se lavaron con solución salina, y se suspendieron con 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, tampón que contenía 15% sucrosa, 1 mM DDT, 1 mM MnCl_{2}, 1 mM MgCl_{2}, y 0,1 mM PMSF.
(2) Producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P mediante CFE de S. meliloti recombinante
La producción de vitamina B_{6}, a partir de VB6P, se examinó mediante la utilización del CFE preparado en el Ejemplo 2-(3). La mezcla de reacción, contenía un tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM PNP, 1 mM MnCl_{2} y CFE (0,4 mg proteína) en 125 \mul. La reacción, se realizó a una temperatura de 37ºC, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos y, la cantidad de PN, se cuantificó mediante HPLC, tal y como se muestra en el Ejemplo 2-(2). Los resultados obtenidos, se muestran en la tabla 6 que se facilita a continuación. La concentración del PN formado, en la mezcla de reacción que contenía CFE de S. meliloti IFO 14782/pVKPtacpdxP, era de 166 mM, y era 4 veces mayor que la S. meliloti IFO 14782 (0,41 mM).
TABLA 6 Cantidad de PN formado en CFE de JM109/pKKpdxP
2
<110> Roche Vitamins AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un gen que codifica para la vitamina B_{6}-fosfato-fosfatasa y su uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NDR5234
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> sinorhizobium meliloti 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly}
\sac{Glu Ala Ile Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Thr Ala Asn Ala Val Met Phe Glu Asp Leu Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp His Gly Thr Thr Leu Gln Gly Leu Met Leu His His Gly Ile Asp}
\sac{Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18).418)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es inosina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaaraary tngaymgnat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c, ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)412)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c, ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcytcraaca tncangcrtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgaattcg cccatgtcac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgtgtcg atgcggtgaa g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 708
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)4(708)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
3
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagcttccc gggccgtgtc ataaacccgc cc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagcttccc gggatcatcg ccgggtttta cg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
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<110> DSM IP ASSETS B.V.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Un gen que codifica para la vitamina B6-fosfato-fosfatasa y su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NDR5234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP03/10575
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 2003-09-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 02021622.2
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2002-09-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\sa{Ala His Ala Ile Asp Tyr Ser Val Val Pro Ala Asp Pro Ala Leu Gly}
\sac{Glu Ala Ile Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Asp Thr Ala Asn Ala Val Met Phe Glu Asp Leu Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\sa{Asp His Gly Thr Thr Leu Gln Gly Leu Met Leu His His Gly Ile Asp}
\sac{Pro Asn Asp Phe Leu Glu Arg}
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<210> 4
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> secuencia artificial
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Lys Leu Asp Arg Met Pro Thr His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CNO2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaaraary tagaymgaat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 0842
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n as a. g, c, t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, g, c, ó t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcytcraaca tncangcrtt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador C101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgaattcg cccatgtcac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador C102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgtgtcg atgcggtgaa g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 708
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(708)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> alarmada artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador P101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaagcttccc gggccgtgtc ataaacccgc cc 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebadar P102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagcttccc gggatcatcg ccgggtttta cg 
\hfill
32

Claims (5)

1. Un DNA aislado, que codifica para la vitamina B_{6}-fosfato-fosfatasa, seleccionado de entre el grupo consistente en:
(a) una secuencia de DNA representada en la SEQ ID NO:9;
(b) una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene actividad B_{6}-fosfato-fosfatasa y que hibrida bajo condiciones standard a la secuencia de DNA definida en (a) o un fragmento de ésta, y que es por lo menos un 70% idéntica a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:9 ó un fragmento de ésta;
(c) una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene actividad B_{6}-fosfato-fosfatasa, en donde, excitado polipéptido, es por lo menos un 70% idéntica a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:10;
(d) una secuencia de DNA que codifica un polipéptido que tiene actividad B_{6}-fosfato-fosfatasa, en donde, excitado polipéptido, es por lo menos un 70% idéntica a la secuencia de DNA de la SEQ ID NO:9;
(e) una secuencia de DNA degenerado, de una cualquiera de (a) a (c).
2. Un vector o plásmido que comprende el DNA aislado de la reivindicación 1.
3. Un microorganismo recombinante del género Sinorhizobium o Escherichia, capaz de producir vitamina B_{6} a partir de B_{6}-fosfato, en donde, el citado organismo, se transforma con el DNA de la reivindicación 1 ó el vector o plásmido de la reivindicación 2.
4. Un procedimiento para preparar extracto exento de células, que tiene actividad B_{6}-fosfato-fosfatasa, el cual comprende el cultivar el microorganismo según la reivindicación 3, en donde, el microorganismo, se cultiva bajo unas condiciones en un medio que contiene una fuente de carbono asimilable, una fuente de nitrógeno digestible, sales inorgánicas, y otros nutrientes necesarios para el crecimiento o cultivo del microorganismo, a un valor pH comprendido dentro de unos márgenes que van de 5,0 a 9,0 y a una temperatura de comprendida dentro de unos márgenes que van de 5ºC a 45ºC, y durante un transcurso de tiempo de 1 día a 15 días, bajo condiciones aeróbicas, y romper células del microorganismo.
5. El procedimiento, para producir vitamina B_{6}, a partir de B_{6}-fosfato, el cual comprende el poner en contacto vitamina B_{6}-fosfato, con el extracto exento de células del microorganismo según la reivindicación 3, en una mezcla de reacción, y recuperar la vitamina B_{6} resultante de la mezcla de reacción.
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